ES2930249T3 - Uso de sedoheptulosa para la prevención o el tratamiento de la inflamación - Google Patents

Abstract

La invención describe la sedoheptulosa para su uso en la prevención o el tratamiento de la inflamación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de sedoheptulosa para la prevención o el tratamiento de la inflamación

El sector técnico de la presente invención es la prevención o el tratamiento de la inflamación.

La inflamación es parte de la respuesta biológica compleja de los tejidos vasculares a estímulos perjudiciales, tales como patógenos, células dañadas o agentes irritantes. Los signos clásicos de la inflamación aguda son dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón y pérdida de la función. La inflamación es un intento protector por parte del organismo de eliminar los estímulos perjudiciales y de iniciar el proceso de curación. La inflamación es una respuesta estereotipada y, por lo tanto, se considera como un mecanismo de inmunidad innata, si se compara con la inmunidad adaptativa, que es específica de cada patógeno.

La inflamación se puede clasificar como aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del cuerpo a estímulos perjudiciales y se consigue mediante el movimiento aumentado del plasma y los leucocitos (especialmente granulocitos) de la sangre hacia los tejidos dañados. Una cascada de eventos bioquímicos propaga y madura la respuesta inflamatoria, implicando el sistema vascular local, el sistema inmunológico y varias células dentro del tejido dañado. La inflamación prolongada, conocida como inflamación crónica, conduce a un desplazamiento progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de la inflamación y se caracteriza por la destrucción y curación simultáneas del tejido del proceso inflamatorio.

Las anomalías inflamatorias (trastornos inflamatorios) son un grupo grande de trastornos que subyacen a una gran variedad de enfermedades humanas. El sistema inmunitario a menudo está implicado en trastornos inflamatorios, demostrados tanto en las reacciones alérgicas como en algunas miopatías, y muchos trastornos del sistema inmunitario dan como resultado una inflamación anormal. Entre las enfermedades no inmunes con orígenes etiológicos en procesos inflamatorios se incluyen el cáncer, la aterosclerosis y la cardiopatía isquémica. Entre los ejemplos de trastornos asociados con la inflamación se incluyen acné vulgar, asma, enfermedades autoinmunes, enfermedad celíaca, prostatitis crónica, glomerulonefritis, hipersensibilidades, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, sarcoidosis, rechazo al trasplante, vasculitis, cistitis intersticial, aterosclerosis, alergia, miopatías, defectos leucocitarios y cáncer.

El tratamiento médico de la inflamación aguda y crónica se ha realizado con corticoides o fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, non-steroidal anti-inflammatory drugs).

También se han sugerido alimentos antiinflamatorios para tratar o prevenir la inflamación. Las prostaglandinas son sustancias similares a las hormonas que afectan al organismo de diversas formas, regulando también la mediación inflamatoria. Una dieta antiinflamatoria incluye menos alimentos que crean prostaglandinas que causan inflamación (PGE2) en el cuerpo y más alimentos que crean prostaglandinas antiinflamatorias (PGE1 y PGE3). Entre las dietas sugeridas para prevenir la inflamación se incluyen aquellas ricas en vegetales y bajas en hidratos de carbono y grasas simples, tales como grasas saturadas y grasas trans. Entre los alimentos antiinflamatorios se incluyen la mayoría de frutas y verduras coloridas, pescado azul (que contiene niveles más altos de ácidos grasos omega-3), nueces, semillas y determinadas especias, tales como jengibre. El aceite de oliva virgen extra contiene el oleocantal químico que actúa de manera similar al ibuprofeno. Se ha demostrado que los ácidos grasos omega-3 alteran las vías de señalización de las células inflamatorias al unirse al receptor GPR120.

Sin embargo, todavía existe la necesidad de prevención y tratamiento de la inflamación, especialmente la inflamación crónica. Dicha prevención y tratamiento deberían proporcionarse sin efectos secundarios graves o, de forma preferente, sin el riesgo de desarrollos adversos a largo plazo, tales como adicción, trastornos metabólicos, disminución de la eficacia, etc.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer sedoheptulosa para su uso en la prevención o el tratamiento de la inflamación, en el que la inflamación se selecciona entre

- inflamación crónica;

- un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS, systemic inflammatory response syndrome) o sepsis, definido como una inflamación sistémica masiva, especialmente en respuesta a politraumatismos o infecciones, que incluye todas las manifestaciones específicas de órganos, especialmente el síndrome de dificultad respiratoria aguda (A^r D^s , acute respiratory distress syndrome) o el síndrome de disfunción multiorgánica (MODS, múltiple organ dysfunction syndrome);

- una inflamación implicada en el rechazo agudo o crónico al trasplante, especialmente el rechazo a trasplantes alogénicos de pulmón, hígado, riñón, corazón, intestino o células de los islotes pancreáticos o, por el contrario, en la enfermedad de injerto contra huésped, aguda o crónica, después de trasplantes autólogos, singénicos o alogénicos de médula ósea, de células madre de sangre periférica (PBSC, peripheral blood stem cel) o de sangre del cordón umbilical, o en el que la inflamación es una inflamación del tejido adiposo, una inflamación del sistema nervioso, una inflamación de los vasos sanguíneos o una inflamación del peritoneo, especialmente como consecuencia de la diálisis peritoneal, tal como la utilizada para la terapia de reemplazo renal; o

- una metainflamación o “inflammaging”, definida como inflamación sistémica crónica (de bajo grado) reflejada por niveles aumentados de citocinas proinflamatorias, especialmente factor de necrosis tumoral alfa o interleucina-6, u otros marcadores de inflamación, especialmente proteína c reactiva o alfa amiloide sérica, en sangre periférica e implicados en el envejecimiento, la adiposidad, la aterosclerosis, la tolerancia alterada a la glucosa y la diabetes tipo 2, trastornos neurodegenerativos, especialmente la demencia, el trastorno depresivo mayor (MDD, major depressive disorder) y el cáncer.

La sedoheptulosa (número CAS: -74-7; PubChem: 5459879; ChemSpider: 4573620; MeSH: sedoheptulose; ChEBI: CHEBI:16802) o D-altro-heptulosa es una cetoheptosa, un monosacárido con siete átomos de carbono y un grupo funcional cetona. Es una de las pocas heptosas encontradas en la naturaleza. La sedoheptulosa se puede producir por extracción de fuentes naturales o por síntesis química. Se puede purificar con altos grados de pureza (por ejemplo > 60% de pureza, preferentemente > 85% de pureza, más preferente, > 90% de pureza, más preferente > 95% de pureza, aún más preferente, > 99% de pureza, especialmente > 99,9% de pureza).

La sedoheptulosa es un metabolito relativamente desconocido en comparación con su forma fosforilada, sedoheptulosa-7-fosfato (S7P), que se reconoce como una molécula intermedia del metabolismo de la glucosa primario. Al principio se informó de la existencia natural de la sedoheptulosa, una cetoheptosa, en plantas y posteriormente se identificó en orina humana, manchas de sangre y, recientemente, dentro de células de ratón. La S7P se deriva de la conversión catalizada por transcetolasa de ribosa-5-fosfato (R5P) y xilulosa-5-fosfato (X5P). Esta reacción ocurre en la fase no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato y genera gliceraldehído-3-fosfato (G3P), un intermediario glicolítico clave, además de S7P. La G3P y S7P también se producen por transaldolasa utilizando fructosa-6-fosfato (F6P) y eritrosa-4-fosfato (E4P) como sustratos. La S7P, de esta forma, es un intermediario crucial en la p Pp no oxidativa y la biodisponibilidad de S7P y, por lo tanto, contribuye al flujo de carbono celular. Recientemente, los datos de varios grupos han indicado que la sedoheptulosa cinasa también puede producir S7P por medio de la fosforilación directa de la sedoheptulosa (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). Este hallazgo demostró la existencia inesperada de una fuente de carbono adicional, sedoheptulosa, que participa activamente en el metabolismo del carbono celular.

Una sedoheptulosa libre puede derivarse de frutas y vegetales de la dieta o formarse enzimáticamente por la desfosforilación de la S7P producida endógenamente. De esta forma, hasta la fecha, no se ha informado de un transportador de sedoheptulosa específico o fosfatasa específica de S7P. Otras heptosas bioactivas incluyen el compuesto fenólico 7-O-galoil-sedoheptulosa (GS), manoheptulosa y glucoheptosa. Se informó de la GS como protector en lesión diabética del riñón aliviando las respuestas inflamatorias. La manoheptulosa (varias patentes pendientes) es un isómero de la sedoheptulosa y un potente inhibidor de la hexocinasa comúnmente encontrada en los aguacates. La glucoheptosa, a pesar de que sigue sin identificarse la naturaleza química de este compuesto, ha demostrado que sirve como una fuente de hidrato de carbono accesible en conejos. Sedoheptulosan es el anhídrido de la sedoheptulosa y también podría servir como una fuente de sedoheptulosa libre.

La sedoheptulosa libre puede aislarse, por ejemplo, de la planta sedum spectabile y se ha informado previamente de que contiene altas cantidades de hidratos de carbono heptosa.

La sedoheptulosa cinasa fosforila la sedoheptulosa libre, lo que permite que las células dirijan directamente la sedoheptulosa hacia el metabolismo de los hidratos de carbono, similar a la hexocinasa y la glucosa. Según la presente invención, la sedoheptulosa es una fuente directa de carbono que alimenta el catabolismo y anabolismo primarios de los hidratos de carbono, con lo cual CARKL constituye su punto de entrada. La sedoheptulosa, por consiguiente, de forma sorprendente se compara con la glucosa y la fructosa porque estos compuestos todos existen como hidratos de carbono libres y formas fosforiladas. Para entrar en el metabolismo, los hidratos de carbono libres se activan enérgicamente por un evento de fosforilación inicial. La hexocinasa fosforila la glucosa para formar G6P y es un determinante clave del flujo de glucosa celular. La fructosa se fosforila por la cetohexocinasa para formar fructosa-1-fosfato (F1P), que primero debe convertirse por adolasa a gliceraldehído y dihidroxiacetona fosfato (DHAP). A continuación, el DHAP puede entrar directamente en el ciclo del carbono, mientras el gliceraldehído debe fosforilarse adicionalmente. La formación de S7P a partir de sedoheptulosa por sedoheptulosa cinasa, en una forma análoga a la formación de G6P de glucosa por hexocinasa, permite que la sedoheptulosa libre entre rápidamente en el sistema catabólico. También se informó de que en presencia de altas concentraciones de S7P tiene lugar una inhibición competitiva de la fosforilación de F6P. De forma interesante, también se informa de que las fracciones que contienen fructosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa) poseen actividad de 1,7-bisfosfatasa (SBPasa).

La presente invención, por consiguiente, también se basa en una coexistencia de las lanzaderas (shunts) de hexosa-(bis)fosfato y heptosa-(bis)fosfato. En particular, los altos niveles de glucosa o la incubación con F2,6bP aumentaron la formación de S1,7bP en hígado de rata perfundido, y en citosol de hígado de rata, respectivamente. El glucagón, en contraste con alta glucosa, favoreció la desfosforilación de S1,7bP y, por lo tanto, la formación de S7P. Estos resultados muestras que el metabolismo de la sedoheptulosa es sensible al control hormonal.

El metabolismo de la sedoheptulosa participa en la regulación metabólica; de hecho, la sedoheptulosa dirige los flujos metabólicos proporcionando un suministro de S7P independientemente de la glucosa. La expresión aumentada de C^a R^k L (y, por lo tanto, el consumo aumentado de sedoheptulosa) en una línea de células macrófagas de ratón resultó en niveles en estado estacionario reducidos de G3P, X5P y R5P, mientras que CARKL con expresión reducida (knockdown) mostró el efecto inverso. En particular, los niveles basales de sedoheptulosa no cambiaron por la perturbación de CARKL. Los niveles de S7P no cambiaron por la sobreexpresión, pero disminuyeron significativamente por la pérdida de CARKL, indicando la fosforilación de sedoheptulosa como un factor limitante del grado por la distribución G3P derivada de la glicólisis. Por consiguiente, la regulación de la disponibilidad de S7P podría ser el mecanismo a través del cual CARKL o las cantidades excesivas de sedoheptulosa modulan el metabolismo celular.

La presente invención, por consiguiente, da a conocer el uso de C7, por ejemplo, para equilibrar el (sobre)consumo de C6, la obesidad, la diabetes, la función inmunitaria y generalmente, la utilización de la energía de los vertebrados. El suplemento de C7, por lo tanto, también proporciona una estrategia efectiva para gestionar la regulación redox fisiológica y, por lo tanto, también los trastornos relacionados. Con la presente invención, resulta que tanto la alta sedoheptulosa como la alta sedoheptulosa cinasa dan como resultado una producción mejorada de sedoheptulosa. Además, la expresión tisular de la sedoheptulosa cinasa revela que los órganos metabólicos, tales como el hígado o el tejido adiposo, tienen la capacidad de consumir sedoheptulosa. Adicionalmente, el tejido adiposo pardo (que quema altas cantidades de lípidos) expresa significativamente más (~2,5x) sedoheptulosa cinasa que el tejido adiposo blanco.

La sedoheptulosa (y/u otras heptosas), administradas a pacientes con inflamación o que están en riesgo de sufrir inflamación, minimiza la carga glucémica y contribuye positivamente a prevenir, por ejemplo, la obesidad inducida por la dieta y/o diabetes. Además, los datos de animales con sedoheptulosa cinasa transgénica, como modelo del metabolismo de sedoheptulosa aumentado, muestran que el alto metabolismo de la sedoheptulosa aumenta la oxidación lipídica (indicada por valores RQ inferiores). Esto es un efecto beneficioso de la producción mejorada de sedoheptulosa. También el gasto de energía es menor en animales con el metabolismo de la sedoheptulosa. Además, parece que los ratones CARKL son más sensibles a la insulina que los animales de control. En su conjunto, esto de nuevo muestra que el metabolismo de la sedoheptulosa es un medio efectivo para regular el fenotipo metabólico en vertebrados.

Con la presente invención, pudo mostrarse que se causan efectos antiinflamatorios específicos y sorprendentes mediante el alto metabolismo de la sedoheptulosa: La inflamación aumentada juega un papel importante en el desarrollo de enfermedades, tales como trastornos relacionados con la obesidad como resistencia a insulina. En un escenario de cinasa funcional para nuevos reguladores de la activación de macrófagos, se encontró que la sedoheptulosa cinasa reprime la secreción del factor a de necrosis de tumor inducido por lipopolisacárido (LPS). En el mismo escenario, la sobreexpresión de hexocinasa, cetohexocinasa y fosfofructocinasa (metabolismo de alta glucosa/fructosa) tuvo el efecto opuesto. Esto mostró los efectos opuestos del metabolismo de los hidratos de carbono hexosa y heptosa: la heptosa inhibe la inflamación. Además, la expresión aumentada de CARKL reprimió la activación de macrófagos inducida por LPS y resultó en una formación de superóxido intracelular mitigada, mientras la pérdida de CARKL (imita el metabolismo de sedoheptulosa reducido) aumentó la respuesta inflamatoria de esas células.

Además de estos efectos, en el transcurso del establecimiento de la presente invención, se demostró que la producción de citocinas disminuye después de la inflamación (provocada por inyecciones de LPS) en animales que sobreexpresan CARKL, en comparación con controles de tipo salvaje, así como en tejido adiposo de ratones CARKL, o mediante suplementación con sedoheptulosa del anterior tejido ex vivo. Conjuntamente, esto demostró que la administración de sedoheptulosa reduce la inflamación y, por lo tanto, afecta positivamente aspectos relacionados con la salud de pacientes que tienen o están en riesgo de tener enfermedades inflamatorias, especialmente enfermedades inflamatorias crónicas. Las enfermedades inflamatorias crónicas, según la presente invención, se definen como inflamación persistente, local o sistémica, de cualquier etiología, conocida (tal como, por ejemplo, infección persistente) o actualmente desconocida (tal como, por ejemplo, sarcoidosis o la mayor parte de casos de rinosinusitis crónica).

La Patente US 2007/098818 A1 da a conocer soluciones para lentes oftálmicas y de contacto que contienen sacáridos simples como potenciadores de la conservación. La Patente WO 2009/066822 A1 da a conocer un procedimiento para producir sedoheptulosa utilizando enzimas termoestables. La Patente JP 2007 137797 A da a conocer una formulación farmacéutica oral que contiene extracto seco de hoja de gayuba. Nagy et al. (Biochemical Society Transactions 240 (2013), 674-680) da a conocer que la sedoheptulosa cinasa regula el metabolismo celular de los hidratos de carbono mediante el suministro de sedoheptulos-7-fosfato. La Patente EP 0221 728 A2 da a conocer una composición para la cicatrización de heridas que comprende, como mínimo, un monosacárido aceptable farmacéuticamente que contiene de aproximadamente 3 a 7 átomos de carbono y un agente formador de película aceptable farmacéuticamente. Sirianni et al. (Regulatory Peptides 38 (1992): 79-87) se refieren a la modulación de la actividad asesina natural humana por el polipéptido intestinal vasoactivo. García-Leme et al. (Mediators of Inflammation 2 (1993): 181-198) se refieren al control hormonal de las respuestas inflamatorias. Agawa (Chemical Abstracts no. 1983.588245) se refiere al efecto de disacáridos, heptosa y ácido siálico sobre la liberación de glucagón del páncreas de rata perfundido aislado. La Patente CN 101 919 872 A da a conocer el uso de sedoheptulosán en la preparación de un medicamento contra la hepatitis B. Kardon et al. (FEBS letters 582 (2008): 3330-3334) se refiere a la caracterización de la sedoheptulocinasa de mamíferos y al mecanismo de formación de eritritol en la deficiencia de sedoheptulocinasa.

Las inflamaciones preferentes para prevenir o tratar, según la presente invención, son el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), la sepsis, la metainflamación, el “inflammaging”, la inflamación en la patogénesis de un trastorno relacionado con la inflamación, la inflamación en la patogénesis y la inflamación en el curso de rechazo agudo o crónico del trasplante. Por consiguiente, una inflamación preferente, según la presente invención, es aquella en la que la inflamación es SIRS o sepsis, definida como inflamación sistémica masiva, especialmente en respuesta a un politraumatismo o una infección, incluidas todas las manifestaciones específicas de órganos, especialmente el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) o el síndrome de disfunción multiorgánica (MODS).

Otra inflamación preferente, según la presente invención, es aquella en la que la inflamación es una metainflamación o “inflammaging”, definida como una inflamación sistémica crónica (de bajo grado) reflejada por niveles aumentados de citocinas proinflamatorias (tal como, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral alfa o la interleucina-6). ) u otros marcadores de inflamación (tales como, por ejemplo, la proteína c reactiva o el alfa amiloide sérico) en la sangre periférica e implicados en el envejecimiento, la adiposidad, la aterosclerosis, la tolerancia alterada a la glucosa y la diabetes tipo 2, los trastornos neurodegenerativos, tales como la demencia, el trastorno depresivo mayor (MDD) y el cáncer.

Otra inflamación preferente, según la presente invención, es aquella en la que la inflamación está implicada, de forma causal o de otra forma, en la patogénesis de un trastorno relacionado con la inflamación, especialmente adiposidad, tolerancia alterada a la glucosa, diabetes mellitus y complicaciones diabéticas, síndrome metabólico, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y entidades más raras), enfermedad hepática inflamatoria crónica, que incluye hepatitis viral crónica, hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria y enfermedad del hígado graso en todas las etapas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y asma bronquial, enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central, que incluyen esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y Parkinson, o del sistema nervioso periférico, que incluyen polineuropatía diabética, síndrome de Guillain-Barre y síndromes relacionados y neuritis/neuropatías asociadas con enfermedades autoinmunes del tejido del colágeno o infección crónica, tal como, por ejemplo, enfermedad de Lyme, osteoporosis, osteoartritis, artritis, tales como la artritis reumatoide o la espondilitis anquilosante y otros trastornos reumáticos, que incluyen todo el espectro de trastornos autoinmunes del tejido conectivo y miositis, vasculitis de cualquier etiología y manifestación, degeneración macular relacionada con la edad (AMD, age-related macular degeneration), trastornos inflamatorios crónicos de la piel, tales como psoriasis y dermatitis atópica, periodontitis, trastorno depresivo mayor y cáncer.

Otra inflamación preferente, según la presente invención, es aquella en la que la inflamación está implicada en la patogénesis del cáncer, que incluye la causalidad del cáncer, la progresión, la metástasis, la resistencia a la terapia, la recaída después de la terapia y las manifestaciones del cáncer, especialmente la caquexia, anemia, fatiga y depresión relacionadas con el cáncer. Dada la implicación universal de la inflamación en la patogénesis del cáncer, la presente invención es aplicable a todas las entidades cancerosas independientemente del origen, la diferenciación o la localización del tejido, incluyendo todos los tipos de carcinoma y sarcoma, melanoma y otros tumores de células derivadas de la cresta neural, tumores del sistema nervioso central, leucemia y linfoma.

Otra inflamación preferente, según la presente invención, es aquella en la que la inflamación está implicada en el rechazo agudo o crónico al trasplante, especialmente el rechazo de trasplantes alogénicos de pulmón, hígado, riñón, corazón, intestino o células de los islotes pancreáticos o, por el contrario, en la enfermedad de injerto contra huésped, aguda o crónica, después de trasplantes autólogos, singénicos o alogénicos de médula ósea, de células madre de sangre periférica (PBSC) o de sangre del cordón umbilical.

Otras inflamaciones preferentes, según la presente invención, se seleccionan entre el grupo que consiste en una inflamación del tejido adiposo, una inflamación del sistema nervioso (neuroinflamación), una inflamación de los vasos sanguíneos (inflamación vascular) y una inflamación del peritoneo, especialmente como consecuencia de diálisis peritoneal, tal como se utiliza para la terapia de reemplazo renal.

Por otro lado, la presente invención también da a conocer la prevención y tratamiento de todas las clases de déficits de sedoheptulosa, es decir, tratar un déficit de sedoheptulosa de tal forma que los trastornos que se deben a tal déficit de sedoheptulosas puedan prevenirse. Con el fin de tratar tales déficits de sedoheptulosa, una composición que contiene la sedoheptulosa puede administrarse a un paciente que tiene o que está en riesgo de desarrollar tal déficit de sedoheptulosa (o síndrome del déficit de sedoheptulosa), por ejemplo, como suplemento nutricional o en combinación con alimentos y/o bebidas.

La sedoheptulosa no es tóxica; es una fuente natural de hidratos de carbono para el metabolismo humano. Por lo tanto, puede administrarse prácticamente de todas las formas médicamente razonables sin riesgo de efectos secundarios inesperados o reacciones adversas. Según las dosis de administración preferentes, especialmente las formas de dosificación individuales, de la presente invención, la sedoheptulosa se administra en una cantidad de 0,001 a 300 g por dosis diaria, preferentemente, en una cantidad de 0,5 a 200 g por dosis diaria, especialmente en una cantidad de 1 a 100 g por dosis diaria.

La administración preferente de sedoheptulosa se realiza por vía parenteral, subcutánea, por inyección intravenosa, intratumoral, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal, especialmente cuando la sedoheptulosa se administra por vía oral.

La sedoheptulosa se puede incluir prácticamente en casi cualquier forma de formulación farmacéutica, incluyendo los excipientes aceptables farmacéuticamente. Preferentemente, la sedoheptulosa se administra en forma de polvo, granulado, comprimido, gránulo (“pellet”), cápsula o jarabe que contiene sedoheptulosa.

Según una realización preferente, la sedoheptulosa se administra en una cantidad de 0,001 a 300 g, preferentemente, en una cantidad de 0,5 a 200 g, especialmente en una cantidad de 1 a 100 g. Estas dosis de administración son, por ejemplo, para un individuo humano normal de 70 a 80 kg, pero se pueden adaptar fácilmente según el sexo, el grado de inflamación (o el riesgo), otro régimen terapéutico, estado fisiológico/estado físico del paciente, etc.

Según una realización preferente, la sedoheptulosa se administra en combinación con inhibidores de hexocinasa, preferentemente, manoheptulosa o 2-desoxi-D-glucosa. Los inhibidores de hexocinasa son bien conocidos en la técnica y se pueden aplicar en la presente invención en las cantidades y dosis ya conocidas o sugeridas en la técnica anterior para el paciente. Por ejemplo, el inhibidor se puede añadir en una cantidad del 0,0001 % al 50 % p/p, especialmente del 0,001 % al 1 %, en relación con el contenido de sedoheptulosa (por ejemplo, de 0,0001 a 50 mg, si se administran 100 mg de sedoheptulosa).

Según otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para el almacenamiento de órganos humanos con fines de trasplante, en el que el órgano que se va a trasplantar a un paciente se almacena en una solución de almacenamiento que comprende sedoheptulosa. Este aspecto se basa en la capacidad antiinflamatoria de la sedoheptulosa y tiene el mismo objetivo de reducir la inflamación en el paciente trasplantado (al que también se le puede aplicar sedoheptulosa). La propiedad antiinflamatoria de la solución de almacenamiento de sedoheptulosa que se utiliza para impregnar el órgano a trasplantar también protege la reducción o prevención de procesos inflamatorios en el propio órgano aislado durante el almacenamiento y también después del trasplante, de manera que no sólo está presente la protección antiinflamatoria en el paciente, sino también en el órgano que ha sido trasplantado.

En una realización preferente de este procedimiento, la solución de almacenamiento comprende sedoheptulosa en una concentración de 0,001 a 500 mg/ml, preferentemente, en una concentración de 0,01 a 300 mg/ml, especialmente en una concentración de 0,1 a 150 mg/ml, definida como la concentración de todo el material líquido adherido o que cubre el órgano que se va a trasplantar (es decir, la solución que permanece en el contenedor de almacenamiento de órganos después de sacar el órgano del contenedor).

Según otro aspecto, la presente invención también se refiere a una solución de diálisis peritoneal que contiene sedoheptulosa en una concentración de 0,001 a 500 mg/ml, preferentemente en una concentración de 0,01 a 300 mg/ml, especialmente en una concentración de 0,1 a 150 mg/ml.

La presente invención se describe de forma adicional en los siguientes ejemplos y figuras, y sin que se limite a los mismos.

Figura 1: (A) Se analizaron muestras agrupadas de zanahorias u hojas de plantas Sedum Spectabile cultivadas en interiores por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas para medir específicamente los niveles de glucosa (C6) y sedoheptulosa (C7) relativos. La proporción de C6/C7 se calculó dividiendo su área de pico respectiva. (B) Los niveles de sedoheptulosa y glucosa se evaluaron de forma adicional por GC-MS en el suero de individuos antes y después de la ingesta de alimentos para investigar si C7 derivado de la dieta puede entrar en la corriente sanguínea humana. El nivel de la sedoheptulosa y glucosa de cuatro individuos que ayunaron durante la noche (ayunas) (barras vacías) se comparó con los niveles medidos dos horas después de una comida (alimentación con dieta, barras grises) conteniendo principalmente zanahorias (~700g) con algo de aceite de oliva, sal y pimienta. El cambio en los niveles de hidratos de carbono en el suero se expresó como el cambio múltiplo medio (n=4, /- D.E.). (C) Las concentraciones de glucosa, fructosa y sedoheptulosa se midieron en los extractos de hidratos de carbonos de las bebidas indicadas. Los valores medios de cuatro replicados técnicos agrupados se representaron gráficamente para demostrar las concentraciones de azúcar extraídas. Además (D), la proporción de C6/C7 (sedoheptulosa) se estableció dividiendo la suma de las moléculas de glucosa y fructosa (C6) o el peso por unidad de sedoheptulosa (C7) respectiva (N.A.= no aplicable).

Figura 2: (A) La transferencia de los niveles de expresión normalizados de ARNm de sedoheptulosa cinasa (CARKL) en hígado de ratón durante un período de 48 horas se obtuvo de la “Base de datos de expresión génica circadiana - CIRCA” disponible públicamente. El eje Y representa la expresión génica normalizada y el eje X el tiempo en horas. (B y C) Los niveles del nucleótido de nicotamida adenina reducido y oxidado de células con expresión de CARKL perturbada se calcularon de datos metabolómicos previamente registrados (Haschemi et al., (2012), 813-826). La línea de células RAW264.7 (B) que expresaba altos niveles de CARKL por sobreexpresión o bien (C) bajos niveles de CARKL por la expresión de mirARNsh se compararon con las líneas de células de control individuales para ilustrar la regulación del dinucleótido de nicotinamida adenina mediada por CARKL. Los datos representan el cambio múltiplo medio de tres experimentos individuales /- EEM. (D) Los niveles de ARNm de CARKL se midieron en una biblioteca de tejido de ADNc de ratón. Los datos representan la expresión de CARKL media normalizada (para p-actina) con relación a la expresión de CARKL en timo en cambio múltiplo (todos los tejidos n=3, D.E.).

Figura 3: (A-E) Los adipocitos humanos primarios de obtuvieron por diferenciación de las células de la fracción vascular estromal en presencia de glucosa y fructosa (GF, 1,5 g/l de cada azúcar; total de hidratos de carbono 3 g/l) o medio suplementado con sedoheptulosa, que se denominó GFS (1 g/l de cada azúcar; total de hidratos de carbono 3 g/l), durante ocho días. Posteriormente los niveles de ARNm de (A) CARKL, (B) adiponectina y (C) proteína 1 sin acoplar (UCP-1) se evaluaron por RT-PCR y compararon entre los grupos. (D) Las tasas de consumo de oxígeno celular (OCR, celular oxygen consumption rafes) y (E) tasas de acidificación extracelular (ECAR, extracelular acidification rafes) de adipocitos se registraron en presencia de la mezcla de hidratos de carbono indicada (media /- D.E., n=9-11). (F) Los niveles de expresión del ARNm de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y (G) interleucina 6 (IL-6) de adipocitos murinos maduros cultivados durante tres días en medio de cultivo celular conteniendo mezcla de hidratos de carbono GF o bien GFS, o (H) la expresión de IL-6 en hepatocitos murinos primarios, así como niveles de ARNm de (I) TNFa y (J) IL-6 en macrófagos primarios derivados de la médula espinal, ambos tipos de célula se precultivaron durante dos días en medio ^g F o GFS, se compararon entre grupos respectivos. La secreción de (K) TNFa y (L) citocinas IL-6 durante el período de dos días se midió por ELISA en el sobrenadante de los macrófagos derivados de la médula espinal La secreción inducida por LPS (100 ng/ml) de (M) TNFa 2 horas después de la activación y (N) IL-6, 6 horas después de la activación en el medio respectivo y los macrófagos también se midieron por ELISA. Los datos representan la media /- D.E., n=3)

Figura 4: En un ensayo de cinasa in vitro, que emplea la formación de ADP como la lectura de la actividad, se aumentó la tasa de metabolización de sedoheptulosa a concentración de ATP constante (150 pMI) (A) aumentando la concentración de sedoheptulosa o bien (B) aumentando la cantidad de la enzima sedoheptulosa cinasa (CARKL) limitante de la tasa. (C-E) Los hepatocitos de ratones de tipo silvestre (WT, wild type) y que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa CARKL se precultivaron durante dos días en medio que contenía g Fs antes de registrar la (C) ECAR y (D) OCR basales de estas células. (E) Los hepatocitos de ambos linajes genéticos (controles CARKL y WT) se cultivaron en medio que contenía GF o GFS y, a continuación, se dejaron sin alimentos previamente (sin hidratos de carbono) durante 1 hora para medir la ECAR inducida por glucosa después de la adición de glucosa para alcanzar una concentración final de 1 g/l en el medio de cultivo, media /- D.E., n=7-11). Como indicadores metabólicos in vivo se determinaron (F) el coeficiente respiratorio (RQ) y (G) el gasto energético (EE, kcal/día/kgA0,75) por actividad mediante calorimetría indirecta y se compararon CARKL con respecto a crías de tipo silvestre (WT) durante el día (de las 8 de la mañana a las 4 de la tarde) y la noche (de las 8 de la tarde a las 4 de la mañana). Los datos representan valores medios, n=3, /- D.E. (H) La prueba de tolerancia a insulina en ratones se llevó a cabo en controles transgénicos CARKL hembra previamente sin alimentos (4 h) y crías del tipo silvestre por medio de, por ejemplo, inyección i.p. de 0,75 U insulina/kg de peso corporal. La glucosa en sangre se midió después de la inyección (control) y 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección y se representaron gráficamente como el valor relativo en % del control. Los datos representan los valores medios /- D.E., n=3-4.

Figura 5: (A) La deposición de lípidos en hepatocitos aislados de ratones WT o bien que sobreexpresaban CARKL y cultivados en medio de control (GF) se visualizó por tinción con rojo aceite. Se adquirieron micrografías representativas con un objetivo 20x. (B) La actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa se midió en hepatocitos aislados de ratones WT o que sobreexpresaban CARKL y cultivados en medio de control (GF) durante dos días. Las flechas indican la relocalización de la actividad de G6PD. Se adquirieron micrografías representativas con un objetivo 10x. (C y D) Se diferenciaron osteoclastos de ratones WT o que sobreexpresaban CARKL y se cultivaron durante 7 días en placas de ensayo Corning Osteo en medio con GF o GFS. Su actividad de resorción se evaluó contando todas las lagunas por pocillo que fueron visibles a una amplificación de 20x. Los datos representan valores medios, n=2-3, /- D.E. (D) Se muestran dos imágenes representativas de las lagunas de resorción más grandes en el osteoclasto WT cultivado en medio con GF o GFS. Las micrografías se adquirieron por una amplificación de 40x.

Figura 6: (A) El sistema inmunitario de ratones que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa (CARKL) y las crías de control se desafió con una inyección de lipopolisacárido subletal (LPS, 7 mg/kg) y un panel de 19 citocinas se midió 24 horas después de la activación inmunitaria en suero. Los datos representan las intensidades de fluorescencia medias relativas (MFI, mean iluorescence intensities) de citocinas individuales medidas en suero de tipo silvestre (WT=100%) y CARKL por medio del perfilador de citocina de ratón del mapa miliplexado (n=3, /- D.E.). La expresión de ARNm de la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP- 1) y TNFa de adipocitos maduros murinos aislados de tejido adiposo blanco (B y C) subcutáneo o (D y E) epididimal de ratones WS y CARKL. Los datos representan valores medios, n=3, /- D.E. (F) Incidencia de accidente cerebrovascular y genotipo rs465563. Los datos se compararon por las pruebas de Pearson %2. **...p<0,01. (G) La duración de la supervivencia sin accidente cerebrovascular inicial se evaluó por gráficas Kaplan-Meier. Homocigotos individuales para rs465563: el alelo-[G] muestra tiempos libres de eventos significativamente más cortos que los portadores del alelo-[A].

Ejemplos

Materiales y Procedimientos

Hidratos de carbono

La glucosa y la fructosa se compraron de Sigma Aldrich. La sedoheptulosa se asiló de la planta sedum Spectabile o sedum telephium (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826) y además se purificó por cromatografía.

Mediciones de la glucosa y sedoheptulosa en zanahorias y suero humano

Zanahorias frescas con un “certificado orgánico” austríaco se cortaron en pequeñas piezas y congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El mismo procedimiento se aplicó a las hojas recién recogidas de plantas Sedum Spectabile cultivadas en el interior. Se agruparon tres muestras de cada tejido y homogeneizaron en polvo por medio de perlas de vidrio. Las fracciones ricas en hidratos de carbono de las muestras se aislaron mediante una solución de extracción al 20% de H2O y el 80% de MeOH marcada con patrones 13C y procesada por cromatografía de gases estándar acoplada a espectrometría de masas (GC- MS). La glucosa y la sedoheptulosa se identificaron por sus masas individuales y su cantidad relativa se derivó del área de pico de cada analito individual normalizado para el contenido de 13C. La glucosa y la sedoheptulosa también se midieron en volúmenes iguales de suero de individuos sin alimentos durante la noche o alimentados con zanahorias. Las zanahorias se cocieron al vapor y se utilizó algo de aceite de oliva, sal y pimienta para darles sabor. Dos horas antes y dos horas después de la comida que contenía zanahorias se preparó suero humano en tubos VACUETTE® Z Serum Sep de la sangre. Las muestras de suero se procesaron tal como se describió anteriormente y también se analizaron por GC-MS, tal como se detalló anteriormente y en Ruiz-Matute AI et al., Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. (2011) 15 de mayo 879(17-18).

Concentración de glucosa, fructosa y sedoheptulosa en bebidas

Las bebidas indicadas se compraron de una tienda de comestibles local y todas estaban preenvasadas. Se extrajo una alícuota de 1 ml de cada bebida (para cada uno de los cuatro replicados) y se concentró al vacío en un SpeedVac. Esto fue seguido por precipitación con MeOH/H2O (80:20) y un paso de centrifugación para aclarar la fracción de los hidratos de carbono en el sobrenadante del precipitado. Cada sobrenadante se liofilizó de nuevo en un SpeedVac, se rehidrató en volúmenes iguales de agua y los replicados técnicos se agruparon. Para el análisis de los hidratos de carbono se utilizó un sistema libre de metal Dionex ICS- 3000 DC con una columna CarboPac PA1 (250x4 mm) y una columna de guardia CarboPac PA1 (ambas de Dionex) a una velocidad de flujo de 1 ml min-1. La elución se llevó a cabo isocráticamente con NaOH 16 mM durante los primeros 20 minutos. A continuación, se aplicó un gradiente lineal hasta NaOH 100 mM de 20 a 40 minutos seguido por un aumento durante 2 minutos hasta 200 mM sostenido hasta los 47 minutos. La condición de partida con NaOH 16 mM se alcanzó de nuevo a los 49 minutos y se mantuvo hasta los 70 minutos. Los parámetros de la detección amperométrica pulsada son exactamente como se recomienda en la Nota Técnica 21 (Parámetros óptimos para la detección amperométrica pulsada de los hidratos de carbono utilizando el detector electromecánico Dionex ED40) de Dionex. Los cromatogramas se evaluaron según los cromatogramas de patrones de glucosa, fructosa y sedoheptulosa auténticas, cada uno de 100 p.M.

Cultivo de adipocitos Humanos

Se aislaron células de fracción vascular estromal (SVF, stromal vascular fraction) de tejido adiposo blanco subcutáneo de un paciente que experimentó cirugía abdominal, tal como se describió anteriormente (Lindroos et al, Cell Metab. (2013), 2 de julio;18(1):62-74.). En resumen, el tejido adiposo se digirió con colagenasa II (Worthington) y se filtró. Las SVF se separaron de adipocitos maduros por centrifugación, seguido por la lisis de eritrocitos en la fracción SVF (Buffer EL, Qiagen). Las SVF purificados se cultivaron en DMEM/F12, 10% de FBS (Gibco, Life Technologies). Tan pronto como las células alcanzaron la confluencia, se lavaron con DMEM/F12 sin glucosa (Biowest) y el medio se reemplazó con DMEM/F12 con una carga total de hidratos de carbono de 3 g/l, con 1,5 g/l de glucosa y fructosa o 1 g/l de cada una de glucosa, fructosa, y sedoheptulosa, respectivamente. Dos días después de la confluencia (día 0), se indujo la diferenciación por la adición de dexametasona 1 p.M, insulina 1,74 p.M, troglitazona 5 p.M, IBMX 0,5 p.M, ácido pantoténico 17 p.M y biotina 33 p.M. Después de dos días, la IBMX y la dexametasona se omitieron, mientras la insulina y la troglitazona se retiraron en el día 4. El 50 % del medio se reemplazó en el día 6. Dos días después, las células se recogieron para aislamiento de ARN (RNeasy mini kit, Qiagen).

Cultivo ceiling de adipocitos murinos maduros

El tejido adiposo subcutáneo anterior y posterior y el tejido adiposo blanco epididimal se aislaron de ratones transgénicos CARKL y de controles de crías de tipo silvestre. El tejido adiposo se digirió como se describió anteriormente para la muestra humana. Después de la centrifugación, la capa de adipocitos maduros flotantes se retiró y recentrifugó a 100 rcf durante 10 minutos. Se cultivaron 150 p.l de adipocitos empaquetados bajo un cubreobjetos en placas de seis pocillos, en DMEM/F12, 15% de suero de ternero (PAA). Veinticuatro horas después del aislamiento, los pocillos se lavaron dos veces con PBS y el medio se cambió a DMEM/F12 con una carga total de hidratos de carbono de 3 g/l, con 1,5 g/l de glucosa y fructosa, o 1 g/l de cada una de glucosa, fructosa y sedoheptulosa, respectivamente. Tres días después, las células se recogieron para aislamiento del ARN utilizando TRIreagent (Sigma).

Cultivo de hepatocitos

Los hepatocitos se aislaron de ratones macho de tipo silvestre y ratones que sobreexpresaban CARKL después de sacrificar los ratones por perfusión de colagenasa hepática in situ. Después de la perfusión, el hígado se retiró rápidamente, se cortó en pedacitos, y filtró a través de un filtro de células (Fisher Scientific, Inc) en un tubo estéril de 50 ml. Los hepatocitos en el filtrado resultante se purificaron de las células no parenquimales mediante etapas de centrifugación. Los hepatocitos aislados se sembraron en placas a una concentración de 0,25 x 10A6/ml en medio DMEM respectivo que contenía el 10% de FBS y las mezclas de hidratos de carbono indicadas a 3 g/l (glucosa y fructosa (Gf), o glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS)), como mínimo, dos días antes de realizar los experimentos.

Cultivo de macrófagos y osteoclastos derivados de médula espinal

Los huesos de ratón se aislaron de ratones macho de tipo silvestre y ratones que sobreexpresaban CARKL y la médula espinal se enjuagó, lavó y aclaró de glóbulos sanguíneos por lisis y, posteriormente, se diferenció en DMEM que contenía glucosa 25 mM y 20 ng/ml de M-CSF. Después de 4 días, las células para la diferenciación osteoclástica se cosecharon y sembraron en placas de ensayo de Corning Osteo con medio de diferenciación (véase, a continuación), y para macrófagos derivados de médula espinal (BMDM) el medio se renovó y se suplementó adicionalmente con M-SCF durante dos días. A continuación, el BMDM diferenciado se sembró en medio DMEM respectivo que contenía el 10% de FBS y mezclas de hidratos de carbono indicadas a 3 g/l (glucosa y fructosa (GF), o glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS)), como mínimo, dos días antes de realizar los experimentos.

Ensayo de resorción ósea in vitro

Las células precursoras de osteoclastos (células de médula espinal tratadas con 20 ng/ml de M-CSF durante 4 días) se colocaron en un placa de ensayo de 24 pocillos Corning Osteo en la presencia de 10 ng/ml de M-CSF y 100 ng/ml de RANKL en medio alfa-MEM que contenía el 10% de FBS y 3 g/l ya fuese de glucosa y fructosa (GF), o glucosa, fructosa, y sedoheptulosa (GFS). El medio se renovó cada tercer día. Después de 7 días, las células se retiraron con blanqueador y lavaron tres veces con agua antes de la tinción Von Kossa según los protocolos estándar de Corning (revisión técnica) que se realizó para mejorar el contraste entre la superficie de ensayo intacta y el pozo de resorción. Cada pocillo se fotografió completamente por TissueFax con un objetivo de x20 y todos los pozos de resorción visibles se contaron y analizaron de forma ciega.

Grados de acidificación extracelular y grados de consumo de oxígeno

Se utilizó el analizador XF (Seahorse Bio.) para medir los cambios en el metabolismo celular inducido por diferentes hidratos de carbono. Las tasas de acidificación extracelular (ECAR, mpH/min) y las tasas de consumo de oxígeno (OCR, pmoles/min) se registraron en adipocitos humanos primarios y hepatocitos murinos primarios según las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se sembraron en placas de células Seahorse a una densidad de 10A4 células por pocillo para adipocitos y 0,5x10A5 células por pocillo para hepatocitos. En el día de los experimentos las células se lavaron con medio libre de hidratos de carbono y se incubaron durante una hora en el medio indicado que contenía mezclas de hidratos de carbono a una concentración de 3 g/l (glucosa y fructosa (GF), o glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS)). Para medir la ECAR inducida por la glucosa, las células se dejaron sin alimento durante una hora en medio libre de carbono antes de adicionar la glucosa (1 g/l) al pocillo por inyección automática. La ECAR inducida por la glucosa se normalizó a la ECAR respectiva antes de la adición de la glucosa (basal = 100%). Los cambios inducidos por diferentes fuentes de hidratos de carbono se expresaron como el cambio relativo en % para ilustrar el efecto de cada fuente de carbono.

Análisis de la expresión génica

En resumen, el ARN total se extrajo y transcribió de forma inversa utilizando kits comerciales (QIAGEN, Applied Biosystems). Las PCR en tiempo real cuantitativas se llevaron a cabo en un ciclador en tiempo real AbiPRISM 7900HT utilizando la Supermezcla Verde iTaq SYBR con ROX (BioRad) para medir la expresión de CARKL, adiponectina, UCP-1, TNFa, IL-6, MCP-1, y beta-actina, tal como se describió anteriormente (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). La expresión del gen diana se normalizó a la expresión de beta-actina. La expresión relativa del gen diana se calculó por el procedimiento CT delta-delta.

Ensayo de sedoheptulosa cinasa

Se utilizó el Ensayo ADP Quest (DiscoveRx) para medir indirectamente la formación de S7P por acumulación de ADP con el transcurso del tiempo, según las instrucciones del fabricante. La sedoheptulosa cinasa recombinante se produjo previamente en E.coli y purificó por purificación por afinidad (Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). Calorimetría Indirecta

El coeficiente respiratorio (producción de VCO2 / consumo de VO2) y el gasto energético (EE, energy expenditure, kcal/día/kgA0,75) por actividad de ratones se midió en jaulas metabólicas (Harvard Apperatus) por calorimetría indirecta. Uno de ratones transgénicos CARKL o bien cría de tipo silvestre, se alojó por jaula durante un día antes de iniciar el registro del coeficiente respiratorio medio y el gasto energético por actividad durante el día (de las 8 de la mañana a las 4 de la tarde) y la noche (de las 8 de la tarde a las 4 de la mañana).

Prueba de tolerancia a la insulina

Ratones transgénicos CARKL hembra sin alimentos previamente durante cuatro horas y controles de crías de tipo silvestre se inyectaron i.p. con 0,75 U de insulina / kg del peso corporal. La glucosa en la sangre se midió antes de la inyección y 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección utilizando tiras de glucosa One-Touch (Accu Check, Roche).

Tinción de rojo aceite

En resumen, los hepatocitos de cultivaron tal como se indicó anteriormente, antes de retirar el medio y que las células se fijaran con el 10% de formalina. Después de un lavado con isopropanol al 60%los pocillos se incubaron con solución de rojo aceite O (Sigma-Aldrich) y se tiñeron durante 10 minutos, se lavaron 4 veces con agua antes de tomar las fotografías a una amplificación de x20.

Ensayo de la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

Las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio tratados con cultivo de tejido de envase de poliestireno, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y mantuvieron a -80 °C. El procedimiento histoquímico enzimático se basó en el procedimiento de la sal de tetrazolio, tal como describen Van Noorden y Frederiks. El medio de incubación para la demostración de la actividad de G6PD contenía el 18% (p/v) de alcohol polivinílico (peso molecular promedio 70.000-100.000) en tampón de pH Tris-Maleato 0,1 M, pH 7,5, glucosa-6-fosfato 15 mM, NADP 0,8 mM, cloruro de magnesio 0,4 mM, metosulfato de 1-metoxifenazina 0,45 mM, azida de sodio 5 mM y cloruro de tetranitroazul de tetrazolio 5 mM. El medio se preparó inmediatamente antes de la incubación. Las reacciones de control adicionalmente contenían glucosamina-6-fosfato 40 mM. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos bajo mezclado continuo por medio del agitador orbital. Después de la incubación, las células se lavaron 3 veces durante 5 minutos en solución salina con tampón fosfato a 60 °C, se secaron y se montaron en gelatina de glicerol, y fotografiaron dentro de un día a una amplificación de x10.

Análisis del desafío inmunitario y la respuesta a citocinas in vivo

Para la endotoxemia murina subletal in vivo, se inyectaron 7 mg/kg de LPS (Sigma Aldrich) intraperitonealmente en crías macho transgénicas CARKL o de tipo silvestre. El suero se asiló por medio de tubos VACUETTE® mini Z Serum Sep de sangre entera. Las citocinas se midieron mediante el analizador de citocinas de ratón de mapa miliplexado según las instrucciones del fabricante (Millipore). Todos los experimentos en animales se llevaron a cabo según el protocolo y contrato con licencia ético en animales aprobado por la Universidad Médica de Viena (BMWF-66.009/0140- II/10b/2010).

Estudio en asociación con polimorfismo de nucleótido único (SNP, single nucleotide polymorphism) de CARKL con riesgo de accidente cerebrovascular

Diseño del estudio: 578 pacientes neurológicamente asintomáticos del Estudio de inflamación y arteria carótida - riesgo de ateroesclerosis (ICARAS, Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.)), reclutados hasta 03/2003, se incluyeron en el presente análisis; los criterios de inclusión y exclusión se ha sido publicado previamente. En resumen, la enfermedad de arteria carótida asintomática, que representa el criterio de inclusión primario, se definió como la ausencia de ataques isquémicos temporales (TIA, transient ischemic attacks), amaurosis fugaz y accidente cerebrovascular dentro de los últimos 12 meses o de síntomas residuales, respectivamente. Además del reconocimiento médico exhaustivo (incluyendo anamnesia, estado físico y pruebas sanguíneas), los pacientes se sometieron a sonografía de las arterias carótidas en la línea base y un seguimiento de 6-9 meses después de la inclusión en el estudio, tal como se describió anteriormente (Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209.). Se registró la incidencia de eventos cardiovasculares hasta el 01/2006. Este análisis se aprobó por el comité ético local (EC-No. 1933/2012) y se ha llevado a cabo según las normas éticas especificadas por la Declaración de Helsinki y sus enmiendas.

Definiciones: la hipertensión arterial se define como una presión sanguínea en reposo repetitiva por encima de 140/90 mm Hg y se asumió que estaba presente en pacientes con medicamento antihipertensivo. La hiperlipidemia se diagnosticó en pacientes con un colesterol sérico total de >200 mg/dl o colesterol LDL de >130 mg/dl y se consideró que estaba presente en todos los pacientes que tomaban fármacos para reducción de lípidos. La diabetes mellitus se diagnosticó según las suposiciones del Comité experto en el diagnóstico y clasificación de la diabetes mellitus. La enfermedad de arteria periférica se clasifica utilizando el sistema de clasificación de Fontaine, la enfermedad de arteria coronaria se define según la clasificación de la Sociedad cardiovascular canadiense (CCS, Canadian Cardiovascular Society). El infarto al miocardio anamnésico se define según Alpert. El accidente cerebrovascular se define por un déficit neurológico persistente >24 horas y se evaluó según la escala de accidente cerebrovascular Rankin modificada. El avance de la ateroesclerosis de arteria carótida se definió como un aumento en la estenosis, como mínimo, en un grado angiográfico NASCET.

Determinación del genotipo: se asiló el ADN de sangre entera anticoagulada con EDTA por medio de purificación con ácido nucleicos basada en columna giratoria. La determinación del genotipo se hizo en un termociclador rápido en tiempo real ABI TaqMan® 7900HT (Applied Biosystems, Rotkreuz, Suiza) utilizando el ensayo de 5’-nucleasa [7]. Este ensayo incluye la unión específica de la secuencia de sondas de ADN marcadas. Durante la fase de alineación de cada etapa, las sondas específicas de secuencia con un fluoróforo en sus extremos 5’ se unen a su alelo respectivo. La fluorescencia del fluoróforo se enmascara por un extintor 3’, hasta que la 5’-Taq-polimerasa separa estos compuestos por su actividad de 5’-exonucleasa durante la fase de alargamiento. La medición del punto final de la intensidad de la fluorescencia específica de secuencia indica la presencia del alelo correspondiente. En el presente estudio, se analizó rs465563 en un volumen de reacción total de 10 p.l utilizando el ensayo de clasificación del genotipo comercialmente disponible TaqMan® SNP (Assay ID: C 717358_1_, Applied Biosystems) y la mezcla maestra para la determinación del genotipo TaqMan® (Applied Biosystems) de acuerdo con el protocolo estándar suministrado por el fabricante. Los resultados se interpretaron utilizando el software de detección de secuencia SDS 2.4 (Applied Biosystems).

Análisis Estadístico: se dan datos continuos con respecto a su distribución como desviación media y estándar o intervalo medio e intercuartílico. Los datos categóricos se presentan como conteos y porcentaje. La presencia de distribución normal dentro de los subgrupos se evaluó mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov. Las variables métricas se compararon por las pruebas U de Mann-Whitney. Las conexiones entre los genotipos y los puntos finales del estudio, así como los riesgos relativos se estimaron por medio de tablas de contingencia y pruebas de Pearson %2. La supervivencia libre de eventos se estimó mediante el análisis Kaplan-Meier, los datos se compararon por pares por las pruebas Log Rank (Mantel-Cox). Los modelos multivariables se calcularon por medio de regresión logística binaria y evaluaron haciendo gráficas ROC (receptor-operador-características). Los resultados se consideraron estadísticamente significativos a p<0,05, a menos que de indicase algo diferente. Todos los valores p se interpretaron bilaterales a menos que se indicase lo contrario. Todos los cálculos estadísticos se hicieron utilizando IBM SPSS 20.0 (IBM Corporation, Armonk, USA).

Resultados

Absorción de sedoheptulosa derivada de la dieta en humanos

Para determinar si la sedoheptulosa nutricional se absorbe de la dieta a través del tracto digestivo en la sangre humana, que es un paso crítico para que la sedoheptulosa se convierta en un hidrato de carbono activo metabólico, los niveles de glucosa (C6) y sedoheptulosa (C7) se midieron en zanahorias y suero humano. Para determinar proporción de C6/C7 de las zanahorias el tejido de la planta se homogenizó, se extrajeron las fracciones moleculares pequeñas y se midieron simultáneamente las cantidades de glucosa y sedoheptulosa relativas por GC-MS (figura 1A). Las hojas de la Sedum Spectabile, una suculenta planta que contiene altos niveles de sedoheptulosa, se analizaron en paralelo como control positivo. Las hojas de la Sedum Spectabile contenían glucosa y aproximadamente el doble de sedoheptulosa, que resultó en una proporción de C6/C7 de aproximadamente 0,5. En zanahorias orgánicas de grado alimenticio frescas se detectaron casi iguales cantidades de glucosa y sedoheptulosa y, por lo tanto, una proporción de C6/C7 de aproximadamente 1. A diferencia de las zanahorias, se informó que las patatas no contenían sedoheptulosa (Kardon et al., FEBS Lett. (2008) 15 de octubre, 582(23-24)) y por consiguiente se esperaba que tuvieran una alta proporción (o incluso infinita) de C6/C7. A continuación, se prestó a tención a si la sedoheptulosa derivada de la dieta, que se origina de las zanahorias, llega a la sangre humana monitoreando el nivel sérico de la glucosa y la sedoheptulosa antes y después de una comida que contenía principalmente zanahorias al vapor (~700 g por adulto macho) con algo de aceite de oliva, sal y pimienta. Dos horas después del alimento, se observó un aumento de aproximadamente dos veces en los niveles séricos de sedoheptulosa en humanos (figura 1B). Este resultado claramente indicó que la sedoheptulosa nutricional se absorbe por el tracto digestivo humano y que entra en la sangre para hacerse disponible como un hidrato de carbono para el posterior metabolismo. Los niveles de glucosa sérica se normalizaron ya dentro de dos horas después de del consumo de alimentos y, por lo tanto, sugiere que los humanos metabolizan la sedoheptulosa y la glucosa de forma diferente.

Estos resultados indican que las zanahorias, que se consideran como vegetales sanos y constituyentes de dietas alrededor del mundo, son una fuente natural de sedoheptulosa para los humanos. Es interesante mencionar que las zanahorias, a pesar de contener hidratos de carbono, tales como glucosa, son adecuadas y bien toleradas por diabéticos y aún protegen a las personas con factores de riesgo genéticos para diabetes de tipo 2 (Patel CJ et al., Hum Genet. 132 (2013): 495-508).

La proporción de C6/C7 en productos alimenticios para humanos naturales y fabricados

A continuación, la concentración de glucosa, fructosa y sedoheptulosa se midió en extractos de hidratos de carbono de Coca- Cola®, Red Bull®, zumo de naranja, manzana, tomate y zanahoria para establecer el índice C6/C7 de bebidas comunes y, por lo tanto, estimar la exposición real a sedoheptulosa de los humanos. Los refrescos y bebidas energéticas contenían glucosa y fructosa, pero no sedoheptulosa (figura 1C). Los zumos de fruta contenían cantidades similares de C6 (la suma de glucosa y fructosa) a las bebidas refrescantes/energéticas (intervalo de 100 mM), pero a diferencia de las anteriores también contenían sedoheptulosa en el intervalo de 100 pMI. En zumos de vegetales los niveles de glucosa y fructosa se redujeron, mientras las concentraciones de sedoheptulosa se encontraron mayormente aumentadas (intervalo mM). Las proporciones de C6/C7 de las bebidas individuales, calculadas como relaciones molares, así como en peso se dan en la figura 1D. En dos zumos de frutas se encontraron proporciones de C6/C7 de aproximadamente 2000/1. En los zumos de tomate y zanahoria la proporción fue de 75/1 y 20/1, respectivamente; Coca-Cola® y Red Bull® no contenían cantidades detectables de sedoheptulosa. Por lo tanto, las proporciones de C6/C7 de estas bebidas no se pudieron calcular y por lo tanto no son aplicables (N.A.) para tales productos alimenticios si no está adicionalmente suplementados con C7. Estos descubrimientos claramente indican que los productos alimenticios fabricados carecen de la complejidad de los hidratos de carbono y, por lo tanto, también de sedoheptulosa. De forma notable, en números absolutos, estos datos indican que se consume 1 kg de sedoheptulosa derivada de la dieta por 9 kg de glucosa derivada de la dieta si la mezcla de carbono natural del zumo de zanahoria se seleccionara sobre las bebidas refrescantes/energéticas; actualmente se desconocen las consecuencias de la carencia de sedoheptulosa crónica por una nutrición humana desequilibrada.

La sedoheptulosa cinasa oscila y se expresa altamente en tejido metabólicamente activo.

Para entender cómo la sedoheptulosa cinasa CARKL y por lo tanto el metabolismo de la sedoheptulosa se distribuye y controla en varios tejidos de mamífero, se ensayaron los niveles de expresión de ARNm de diferentes tejidos. La expresión de CARKL, en una base de datos públicamente disponible para perfiles de expresión circadiana (CircaDB), se encontró oscilante en hígado de ratón (período 20.0, figura 2A) y la glándula adrenal (período 24.0, datos no mostrados). Anteriormente se informó de que los niveles de sedoheptulosa-7P oscilaban en plantas, llegando a picos durante la fase regenerativa de la fijación del carbono para reconvertirse en fracciones de ribosa. El reloj circadiano de mamífero en parte se determina por el estado redox. Células RAW264.7 que sobreexpresaban CARKL indicaron que la alta expresión de sedoheptulosa cinasa induce un incremento de 4 veces los factores redox como dinucleótido de nicotamida adenina reducido, (NADH) y también el incremento del nivel de glutatión (GSH) (figura 2B y Haschemi et al., Cell Metab. (2012), 813-826). La deficiencia de CARKL y, por consiguiente, también la falta de producción metabólica de sedoheptulosa mostró el efecto opuesto (figura 2C). Estos datos indican que el metabolismo de la sedoheptulosa está bajo el control del ritmo circadiano y actúa simultáneamente como modulador de los estados redox celulares. Con el fin de especificar qué tejido consume sedoheptulosa nutricional, se midieron los niveles de ARNm de sedoheptulosa cinasa (CARKL) en una biblioteca de tejidos de ADNc de ratón (figura 2D). La sedoheptulosa cinasa es la enzima que limita la tasa de metabolismo de la sedoheptulosa y fue altamente expresada en hígado, riñón, tejido adiposo marrón y blanco (BAT, brown adipose tissue y WAT, white adipose tissue), órganos digestivos, en glándulas, en el sistema reproductor del hombre así como en el cerebro. Estos resultados demuestran que la sedoheptulosa derivada de la dieta puede convertirse en una fuente de hidrato de carbono sistémica para muchos tejidos, pero especialmente para órganos metabólicamente activos, tales como hígado, riñón y tejido adiposo.

El metabolismo de la sedoheptulosa es importante para la función y salud metabólica de las células.

Para investigar las consecuencias metabólicas de la exposición a sedoheptulosa, se expusieron células humanas y murinas en el medio de cultivo a glucosa en combinación con fructosa (GF) o bien a glucosa, fructosa y sedoheptulosa (GFS), mientras se mantuvo la carga total de hidratos de carbono constante. La función del adipocitos, hepatocitos y macrófagos se ensayó para evaluar la importancia de la sedoheptulosa en complementar cargas de hidrato de carbono nutricional. La sedoheptulosa utilizada en estos experimentos se asiló de plantas sedum telephium.

En el cuerpo humano, los adipocitos cumplen con la función crucial de almacenar energía en forma de lípidos y por lo tanto son células muy importantes para mantener la salud. En pacientes metabólicamente no sanos o en la mayor parte de los pacientes mórbidamente obesos los adipocitos no funcionan de forma adecuada, aumentan su tamaño de célula para representar cargas excesivas de lípidos, se inflaman (metainflamación, un tipo de inflamación de bajo grado pero crónica) y finalmente contribuyen al desarrollo de trastornos como resistencia a insulina o enfermedades cardiovasculares. En los adipocitos humanos, diferenciados de células precursoras subcutáneas, se encontró un aumento en la expresión de ARNm de sedoheptulosa cinasa CARKL si la sedoheptulosa se adicionaba al medio de cultivo (figura 3A). Además, se observó un aumento en la expresión de la adiponectina y UCP-1, dos genes marcadores de adipocitos relevantes funcionales, en células tratadas con GFS en comparación con las de GF (figura 3B y 3C). Para ensayar los cambios en el metabolismo celular, se midieron las tasas de consumo de oxígeno celular (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) como indicadores para respiración mitocondrial y fermentación del ácido láctico, respectivamente. Los adipocitos humanos, diferenciados y cultivados en medio que contenía sedoheptulosa, mostraron una ECAR comparable con controles WS, mientras sus tasas de consumo de oxígeno celular aumentaron (figura 3D y 3E).

Conjuntamente, estos datos muestran que los adipocitos subcutáneos mantienen y mejoran su función (aumento en la adiponectina, UCP-1 y consumo de oxígeno) en la presencia de sedoheptulosa en comparación con una situación en la que solamente está presente glucosa y fructosa como biocombustible.

Para definir mejor el papel beneficioso de la sedoheptulosa en la prevención de estados metabólicamente no saludables, como inflamación de bajo grado crónica, se midieron los perfiles de citocina de adipocitos murinos maduros primarios, hepatocitos murinos primarios, y macrófagos no expuestos así como primarios activados inducidos por lipopolisacárido (LPS) cultivados en medio GF o GFS. Los adipocitos maduros, que se cultivaron en medio que contenía sedoheptulosa, produjeron menos ARNm de TNFa e IL-6 que los adipocitos cultivados con glucosa y fructosa solamente (figura 3F y 3G). De forma similar a esto, los hepatocitos también produjeron menos IL-6 si se cultivaron con sedoheptulosa (figura 3H). En macrófagos primarios la expresión basal de ARNm de TNFa e IL-6, y la secreción de citocinas se encontraron bloqueadas por medio que contenía sedoheptulosa (figura 3I-3L). La activación de macrófagos inducida por LPS resultó en una secreción de TNF-a e IL-6 fuertemente aumentada en células cultivadas en GF (figura 3M y 3N). Los macrófagos inducidos por LPS cultivados en medio GFS aumentaron IL-6 a niveles comparables con macrófagos tratados con GF, pero redujeron su secreción de TNFa en aproximadamente el 40%. Esto muestra que la adición de sedoheptulosa a macrófagos por un lado reduce su estado inflamatorio basal, medido por TNFa e IL-6, pero por el otro retiene su función natural en inmunidad como se ve para IL-6.

Para concluir, la adición de sedoheptulosa al medio de cultivo aumentó significativamente la función del adipocito subcutáneo y redujo el estado inflamatorio de las células y, por lo tanto, podría tener una influencia positiva en la patogénesis de la obesidad, diabetes de tipo II y enfermedades cardiovasculares también resumidas en parte por el síndrome metabólico.

Sobreexpresión de sedoheptulosa cinasa CARKL

Se generaron ratones transgénicos que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa ubicuamente en el cuerpo entero para aislar células primarias diseñadas por ingeniería genética aisladas que sobreexpresaban CARKL y para probar el metabolismo de la sedoheptulosa in vivo. Los ratones transgénicos CARKL no mostraron ningún fenotipo obvio y el peso de sus órganos no fue diferente del peso de los órganos de animales de control de crías WT (datos no mostrados). Se hipotetizó que el metabolismo aumentado de la sedoheptulosa puede lograrse aumentando la concentración del sustrato de sedoheptulosa, o bien elevando el nivel de su enzima sedoheptulosa cinasa que limita la tasa (CARKL). Para probar esto en un ensayo de cinasa in vitro, se incubó una cantidad constante de proteína CARKL recombinante con dosis crecientes de sedoheptulosa. Esto dio como resultado tasas de producción metabólica de sedoheptulosa aumentadas, medidas por formación de ADP (figura 4A). Se observó el mismo efecto aumentando la concentración de la proteína CARKL, mientras la concentración de la sedoheptulosa se mantuvo constante (figura 4B). Estos resultados demuestran que la sobreexpresión de CARKL es un modelo válido para investigar los efectos del metabolismo de sedoheptulosa aumentado. A continuación, los hepatocitos primarios, dado que el tejido hepático parecía que metabolizaba endógenamente la sedoheptulosa (FIGURA 2D), se aislaron para estudiar los efectos del metabolismo de C7 y C6 a niveles de expresión aumentados de CARKL.

Los hepatocitos se cultivaron en medio con una proporción de azúcar C6/C7 de 2:1 y se evaluaron metabólicamente comparando la ECAR y OCR como parámetros metabólicos más generales. Los hepatocitos de ratones que sobreexpresaban CARKL aumentaron significativamente su tasa metabólica, tal como los niveles de ECAR y o Cr aumentados indicaron, si se comparaban con células de control WT (figura 4C y 4D). Pareció que la sedoheptulosa indujo un metabolismo más eficiente en estas células. Para probar la relevancia de la expresión de sedoheptulosa y sedoheptulosa cinasa juntas, los hepatocitos aislados de ratones WT y CARKL se incubaron en medio que contenía GF y GFS y su ECAR inducida por glucosa se comparó (después de 1 hora de privación de hidratos de carbono) como una medida para controlar la glucólisis celular. En hepatocitos de WT la EcAr inducida por glucosa se redujo por la administración de sedoheptulosa (figura 4E). En línea con estos datos, los hepatocitos estimulados con glucosa de animales WT cultivados en GF (sin sedoheptulosa) llevaron una gran parte de la glucosa a la fermentación del ácido láctico, mientras las células de ratones que sobreexpresaban CARKL pareció que equilibraban el mismo bolo de glucosa más eficientemente.

Estos resultados, además, soportaron los datos previos y claramente indicaron que el metabolismo de sedoheptulosa aumentado tiene efectos diferentes y beneficiosos en las células, lo que es importante para la salud metabólica.

Metabolismo de sedoheptulosa in vivo

Después de validar los fenotipos celulares de la sobreexpresión de sedoheptulosa cinasa en hepatocitos, el efecto metabólico de la producción aumentada de sedoheptulosa para un organismo completo se investigó mediante la comparación del coeficiente respiratorio (RQ, respiratory quotient; RQ = CO2 exhalado/consumo de oxígeno), así como el consumo energético por actividad física de ratones de control y transgénicos con sedoheptulosa cinasa, medidos por calorimetría indirecta durante el día y la noche como indicadores sistémicos del metabolismo (figura 4F y 4G). Los animales que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa (CARKL) tienen valores de RQ inferiores comparados con las crías de tipo silvestre (WT). Los ratones CARKL mostraron un consumo de oxígeno aumentado y, por lo tanto, valores de RQ más bajos, y parcialmente replicaron los efectos de la sedoheptulosa en las células. Además, los ratones CARKL también tienden a tener un EE inferior por actividad si se compara con los ratones de control. La sensibilidad a insulina de ratones hembra transgénicos CARKL y ratones WT también se compararon mediante una prueba de tolerancia a insulina (ITT, insulin tolerance test), para investigar si el metabolismo de la sedoheptulosa también afecta la señalización de la insulina in vivo. La inyección de insulina (i.p.) redujo el nivel de glucosa en sangre en ratones que sobreexpresaban sedoheptulosa cinasa más rápido que los controles WT, indicando que la sensibilidad a insulina también aumentó en estos animales al aumentar el metabolismo de la sedoheptulosa (figura 4H). En este contexto es importante mencionar que la inducción de la resistencia a insulina en adipocitos maduros, por tratamiento con TNFa e hipoxia, resultó en pérdida de sedoheptulosa cinasa (datos generales de expresión génica disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc=GSM1261655). Conjuntamente, estos experimentos mostraron que el metabolismo de sedoheptulosa aumentado no solamente altera el metabolismo in vitro sino también in vivo. Los valores de RQ más bajos observados en ratones CARKL combinados con la tendencia de un EE inferior por actividad física y la sensibilidad aumentada a insulina son indicativos de un programa metabólico más eficiente y sostenible que puede ser inducido mediante el aumento del metabolismo de la sedoheptulosa.

La deposición lipídica hepática se reduce por CARKL

La extensiva deposición lipídica en hepatocitos resulta en la enfermedad de hígado graso y puede estar acompañada por inflamación (es decir, esteatohepatitis no alcohólica (NASH, non-alcoholic steatohepatitis)) que causa fibrosis hepática, cirrosis, y eventualmente carcinoma hepatocelular. Se comparó el contenido lipídico de los hepatocitos de ratones que sobreexpresaban CARKL y WT y se encontró que los hepatocitos de ratones CARKL contenían menos gotas lipídicas que sus controles WT. (figura 5A).

En conclusión, el alto contenido de grasa en el hígado, especialmente en combinación con inflamación, incluyendo el mal funcionamiento de los adipocitos, aumenta el riesgo de muchas enfermedades incluyendo diabetes de tipo 2 o cáncer, de esta forma tanto la reducción de la inflamación como la acumulación de lípidos en hepatocitos por la sedoheptulosa podría ser especialmente valiosa para la nutrición humana (véanse los vegetales, que contienen altos niveles de C7).

CARKL regula la actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), la enzima limitante de la tasa del brazo oxidativo de la ruta de pentosa fosfato (PPP, pentose phosphate pathway) que genera cuerpos C5, es decir, para la síntesis de nucleótidos y equivalentes redox, se mostró anteriormente que se inhibía directamente por p53 (supresor tumoral) (Jiang et al., Nat Cell Biol. (2011) Mar; 13(3):310-6). La mutación en p53, el gen más frecuentemente mutado en tumores humanos, resulta en la hiperactivación de G6PD y la acumulación de lípidos en hepatocitos. La sedoheptulosa cinasa es la cinasa que limita la tasa del brazo no oxidativo de la PPP y se mostró anteriormente que reducía el flujo de la PPP oxidativo, como mínimo, en macrófagos. Para probar una posible regulación de la actividad de G6PD en hepatocitos por el metabolismo de sedoheptulosa, se comparó la actividad enzimática de células WT y de las que sobreexpresaban CARKL (FIGURA 5B). En células de control WT se observó que la actividad de la G6PD estaba distribuida uniformemente, mientras en células de ratones CARKL se observó una relocalización de G6PD y, por lo tanto, una actividad reducida del espacio interior de las células. De forma interesante, se obtuvo el mismo fenotipo incubando células WT en medio de cultivo celular con sedoheptulosa (no mostrado). Si la relocalización y/o la inhibición de G6PD por la sobreexpresión de sedoheptulosa cinasa y la incubación de sedoheptulosa fueron la causa de la acumulación reducida de lípidos en hepatocitos (figura 4A), queda por establecerse. Sin embargo, estos datos, en combinación con datos de macrófagos muestran que un elevado nivel de sedoheptulosa puede actuar como una contramedida para la pérdida de p53 en células cancerígenas, como mínimo, por la actividad de G6PD negativamente regulada en algunos casos. Otro ejemplo son las células cancerígenas de pecho dependientes de estrógeno que reducen la expresión de CARKL en respuesta al factor de crecimiento del estrógeno (datos del depósito GeneChip públicos disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/; ID: 53372898; GDS3285/219713_at/SHPK), que a su vez podrían resultar en una actividad G6PD aumentada y, posteriormente, el crecimiento del tumor.

Estos datos también implementan el metabolismo de sedoheptulosa como un objetivo adecuado para regular la actividad de G6DP y para estrategias anticancerígenas futuras.

Sedoheptulosa y metabolismo óseo

Es hueso es un tejido extremadamente dinámico. El equilibrio fino de la formación ósea y la resorción es esencial para la estabilidad mecánica del hueso apropiada. El desequilibrio entre la formación ósea y la resorción es la causa de la osteoporosis, una afección altamente prevalente de densidad ósea reducida y microarquitectura ósea alterada que dan como resultado fragilidad ósea y fracturas patológicas. Como los osteoclastos, las células responsables de la resorción ósea se derivan del linaje de monocitos, cuya función está fuertemente impactada por el metabolismo de sedoheptulosa, también se ensayó si la función del osteoclasto puede modularse por la relación C6/C7.

Las células de médula espinal se diferenciaron in vitro a los osteoclastos mediante la exposición de las células a M-CSF en combinación con RANKL. Las células se cultivaron en placas, precubiertas con una matriz mineral ósea en el fondo del pocillo, para proporcionar sustrato a su actividad de resorción ósea. El análisis de la resorción del sustrato claramente demostró que tanto la sobreexpresión de CARKL como el aumento del contenido de C7 en el medio de cultivo, redujeron la formación de lagunas por los osteoclastos (figura 5C). De forma interesante, las lagunas de resorción más grandes se encuentran solamente en la ausencia de sedoheptulosa (figura 5D).

De nuevo, estos datos soportan el concepto de la presente invención de que una proporción C6/C7 bien equilibrada es crucial para mantener la salud y que C7 tiene el potencial de aliviar las situaciones patofisiológicas de la osteoporosis en humanos.

La sedoheptulosa cinasa regula la respuesta inmunitaria de animales

Los datos de la sobreexpresión de CARKL y sus efectos en el sistema inmunitario de ratón en un modelo de activación inmunitaria aguda y en la inflamación de tejido adiposo maduro en bajo grado se presentan con los presentes ejemplos. En ratones CARKL se provocó la inflamación aguda mediante una inyección subletal de lipopolisacárido (LPS), que resultó en una respuesta suprimida de citocina comparada con los controles de tipo silvestre (figura 6A). Se midió un panel de 19 citocinas en suero de ratón WT y CARKL, que se aislaron 24 horas después de la inyección de LPS (7 mg/kg, IP), mediante un perfilador de citocina de ratón. Doce citocinas alcanzaron el umbral del 50% de cambio medio, que se definió como el punto de corte para resaltar las citocinas reguladas por la sobreexpresión de CARKL in vivo. IL-13, MIP1a, RNAt Es , IL-12 (p70), IL-2, TNF- a, MCP1, KC, GM-CSF, IL-6, IL-17 e IL-15 se redujeron, como mínimo, en el 50% de cambio medio en ratones CARKL comparados con crías de tipo silvestre. Las citocinas IL-6, IL-17 e IL-15 aún alcanzaron un umbral de 75% de cambio medio. Además de la inflamación aguda, los niveles basales de citocinas proinflamatorias en tejido adiposo murino también se evaluaron de dos depósitos diferentes (tejido adiposo subcutáneo y epididimal) de ratones CARKL y de control WT. De forma coherente con la reducción de la inflamación inducida por LPS, los niveles de ARNm de TNFa y MCP1, una adipocina primaria que recluta macrófagos para el tejido adiposo y que pertenece a las citocinas proinflamatorias, se encontraron atenuados por la sobreexpresión de CARKL (FIGURA 6B-E).

Esto indica que un suplemento nutricional que contiene sedoheptulosa podría amortiguar la inflamación aguda y crónica de bajo grado. Por lo tanto, la activación del metabolismo de C7, por sedoheptulosa nutricional o clínicamente aplicada parece que es una medida efectiva para reducir inflamación y los trastornos asociados.

Un solo polimorfismo de nucleótido (SNP) en 3’-UTR del gen CARKL está asociado con el riesgo de accidente cerebrovascular.

Se clasificaron por genotipo 535 pacientes neurológicamente asintomáticos del Estudio de inflamación y arteria carótida - riesgo para ateroesclerosis (ICARAS, Schillinger et al., (2005) Circulation 111 (17):2203-2209) para la sustitución de rs465563 [A] a [G] en 3’-UTR del gen CARKL. Treinta y tres (6,2%) pacientes sufrieron un accidente cerebrovascular dentro del período de observación. En esos pacientes, la distribución de alelos rs465563 fue significativamente diferente en comparación con las frecuencias de alelos del resto de la población del estudio (%2=12,639, df=2, p=0,002, véase figura 6F). En detalle, los portadores de homocigotos del alelo-[G] tienen un riesgo relativo de 3,93 (95% CI: 1,72 - 9,01) comparado con el homocigoto-[A], y 3,10 (95% CI: 1,40 - 6,87) en comparación con los individuos heterocigotos, respectivamente. La independencia estadística de la información del genotipo rs465563 se evaluó por medio de un modelo de regresión logística binaria que proporciona edad, sexo, historial de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular y, consumo de nicotina, índice de masa corporal, así como ciertas comorbilidades (hiperlipidemia, hipertensión, diabetes mellitus) como covariables (modelo: ^=30,476, df=11, p=0,001). Dentro de este modelo, el estado del portador del genotipo [G];[G] se presentó como un pronosticador significativo (relaciones posibles = 5,015, 95% CI: 1.803 - 13.943) cuando se compara con pacientes homocigotos para el alelo-[A]. Además, se ha evaluado por la elaboración de gráficas Kaplan-Meier si el tiempo de supervivencia libre de accidente cerebrovascular inicial depende del estado del portador rs465563. Ciertamente, los portadores homocigotos del alelo-[G] (1518,3 días, 95% CI: 1419,2 - 1617,4) presentaron una supervivencia libre de eventos significativamente más corta que los individuos heterocigotos (1619,1 días, 95% CI: 1584,8 - 1653,3, p=0,005) y los portadores del genotipo-[A];[A] (1788,1 días, 95% CI: 1755,7 - 1820,4, p=4,910-4) (figura 6G). Los individuos homocigotos para el rs465563: alelo-[G] muestran tiempos libres de eventos significativamente más cortos de que los portadores del alelo-[A].

Los antecedentes mecánicos de esta asociación clínica permanecen sin clarificar. Sin embargo, dada la habilidad de la CARKL para modular la polarización de macrófagos y el papel clave de lo anterior en la formación y progresión de las placas ateroescleróticas, parece probable que el polimorfismo rs465563 pueda tener un impacto en el riesgo de eventos cerebrovasculares a través de la modulación de la polarización de macrófagos dentro de las placas ateroescleróticas. Esta noción está soportada por la observación según la presente invención de que 3’- ^uT^r del gen CARKL principalmente se transcribe en macrófagos.

En conclusión, esta asociación y los datos provistos sobre el metabolismo y la función de los adipocitos, hepatocitos, y macrófagos, en combinación con inflamación reducida y sensibilidad a insulina aumentada in vitro e in vivo fuertemente indica que la sedoheptulosa (azúcar C7) es un constituyente crítico para la nutrición humana y simultáneamente un medicamento altamente relevante para tratar deficiencias en C7 u otros estados de enfermedad metabólicos no saludables.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Sedoheptulosa para su uso en la prevención o el tratamiento de la inflamación, en el que la inflamación se selecciona entre:

- inflamación crónica;

- un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) o sepsis, definido como una inflamación sistémica masiva, especialmente en respuesta a un politraumatismo o una infección, que incluye todas las manifestaciones específicas de órganos, especialmente el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) o el síndrome de disfunción multiorgánica (MODS);

- una inflamación implicada en el rechazo al trasplante agudo o crónico, especialmente el rechazo a trasplantes alogénicos de pulmón, hígado, riñón, corazón, intestino o células de los islotes pancreáticos o, por el contrario, en la enfermedad de injerto contra huésped, aguda o crónica, después de trasplantes autólogos, singénicos o alogénicos de médula ósea, de células madre de sangre periférica (PBSC) o de sangre del cordón umbilical, o en el que la inflamación es una inflamación del tejido adiposo, una inflamación del sistema nervioso, una inflamación de los vasos sanguíneos o una inflamación del peritoneo, especialmente como consecuencia de la diálisis peritoneal, tal como la utilizada para la terapia de reemplazo renal; o - una metainflamación o “inflammaging”, definida como inflamación sistémica crónica (de bajo grado) reflejada por niveles aumentados de citocinas proinflamatorias, especialmente factor de necrosis tumoral alfa o interleucina-6, u otros marcadores de inflamación, especialmente proteína c reactiva o alfa amiloide sérica, en sangre periférica e implicados en el envejecimiento, la adiposidad, la aterosclerosis, la tolerancia alterada a la glucosa y la diabetes tipo 2, los trastornos neurodegenerativos, especialmente la demencia, el trastorno depresivo mayor (Md D) y el cáncer.

2. Sedoheptulosa para su uso, según la reivindicación 1, en el que la inflamación está implicada, de forma causal o de otra forma, en la patogénesis de un trastorno relacionado con la inflamación, preferentemente adiposidad, tolerancia alterada a la glucosa, diabetes mellitus y complicaciones diabéticas, síndrome metabólico, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal, especialmente enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y entidades más raras, enfermedad hepática inflamatoria crónica, que incluye hepatitis viral crónica, hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria y enfermedad del hígado graso en todas las etapas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y asma bronquial, enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central, especialmente esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y Parkinson, o del sistema nervioso periférico, especialmente polineuropatía diabética, síndrome de Guillain-Barre y síndromes relacionados y neuritis/neuropatías asociadas con enfermedades autoinmunes del tejido del colágeno o infección crónica, especialmente, enfermedad de Lyme, osteoporosis, osteoartritis, artritis, especialmente artritis reumatoide o espondilitis anquilosante y otros trastornos reumáticos, especialmente trastornos autoinmunes del tejido conectivo y miositis, vasculitis de cualquier etiología y manifestación, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), trastornos inflamatorios crónicos de la piel, especialmente psoriasis y dermatitis atópica, periodontitis, trastorno depresivo mayor y cáncer.

3. Sedoheptulosa para su uso, según la reivindicación 1 o 2, en el que la inflamación está implicada en la patogénesis del cáncer, que incluye la causalidad del cáncer, la progresión, la metástasis, la resistencia a la terapia, la recaída después de la terapia y las manifestaciones del cáncer, especialmente la caquexia, anemia, fatiga y depresión relacionadas con el cáncer.

4. Sedoheptulosa para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sedoheptulosa se administra en una cantidad de 0,001 a 300 g por dosis diaria, preferentemente, en una cantidad de 0,5 a 200 g por dosis diaria, especialmente en una cantidad de 1 a 100 g por dosis diaria.

5. Sedoheptulosa para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sedoheptulosa se administra por vía parenteral, subcutánea, inyección intravenosa, intratumoral, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal, especialmente en el que la sedoheptulosa se administra por vía oral.

6. Sedoheptulosa para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sedoheptulosa se administra como un polvo, granulado, comprimido, gránulo, cápsula o jarabe, que contiene sedoheptulosa en una cantidad de 0,001 a 300 g, preferentemente, en una cantidad de 0,5 a 200 g, especialmente en una cantidad de 1 a 100 g.

7. Sedoheptulosa para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 6, en el que la sedoheptulosa se administra combinada con inhibidores de hexocinasa, preferentemente, manoheptosa o 2-desoxi-D-glucosa.

8. Procedimiento para almacenar órganos con fines de trasplante, en el que el órgano que se va a trasplantar a un paciente se almacena en solución de almacenamiento que comprende sedoheptulosa.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que la solución de almacenamiento comprende sedoheptulosa en una concentración de 0,001 a 500 mg/ml, preferentemente, en una concentración de 0,01 a 300 mg/ml, especialmente en una concentración de 0,1 a 150 mg/ml, definida como la concentración de todo el material líquido adherido al órgano que se va a trasplantar o que cubre el mismo.

10. Solución de diálisis peritoneal que contiene sedoheptulosa en una concentración de 0,001 a 500 mg/ml, preferentemente, en una concentración de 0,01 a 300 mg/ml, especialmente en una concentración de 0,1 a 150 mg/ml.