ES2856210T3

ES2856210T3 - Dosificación intermitente de inhibidor de mdm2

Info

Publication number: ES2856210T3
Application number: ES15733926T
Authority: ES
Inventors: Stephane Ferretti; Sebastien Jeay
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2021-09-27
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: SG11201609853VA; EP3160463B1; CN106456635A; MX2016017075A; RU2017102319A3; US20190209561A1; TW201613576A; KR20220151027A; BR112016029750A2; AU2015278765A1; KR102462177B1; RU2695228C2; US11419870B2; RU2017102319A; AU2015278765B2; IL249138B; IL249138A0; WO2015198266A1; PH12016502556A1; US20170196866A1

Abstract

Un MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el MDM2i se ha de administrar a un sujeto de forma intermitente en al menos 3 dosis consecutivas y el periodo entre cada dos dosis consecutivas es de al menos 3 semanas y no superior a 60 días.

Description

DESCRIPCIÓN

Dosificación intermitente de inhibidor de mdm2

Campo de la divulgación

La presente divulgación se refiere a inhibidores de mdm2 para su uso en pautas posológicas específicas, teniendo en cuenta que la presente invención se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la divulgación

La proteína p53 es un factor de transcripción que controla la expresión de una multitud de genes diana que intervienen en la reparación del daño al ADN, la apoptosis y la interrupción del ciclo celular, que son todos ellos fenómenos importantes que contrarrestan el crecimiento maligno de tumores. P53 es, por tanto, fundamental para mantener la estabilidad genética y prevenir el desarrollo de tumores. El gen TP53 es uno de los genes mutados con mayor frecuencia en los cánceres humanos. Hay constancia de que en aproximadamente la mitad de todos los cánceres hay inactivación de p53, debido a una mutación directa. En los cánceres en los que el gen de p53 no está mutado, se ha demostrado que existe inactivación funcional a nivel proteínico. Uno de los mecanismos de inactivación de p53 descritos es debido a su interacción con un homólogo humano de MDM2 (siglas en inglés de doble minuto murino 2). Mdm2 es, por lo tanto, un regulador negativo importante del supresor tumoral p53. La proteína Mdm2 funciona tanto como una ligasa de ubicuitina E3, que conduce a la degradación proteosómica de p53, como un inhibidor de la activación transcripcional de p53. Se suele observar Mdm2 amplificado en los tumores sin mutación de p53.

Se han desarrollado inhibidores de Mdm2 que inhiben la interacción de p53-mdm2 y pueden provocar un efecto antineoplásico.

El documento US2013/0245089 da a conocer un método de tratamiento de un paciente que padece cáncer administrando al paciente Ácido 4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-cloro-2-fluorofenil)-3-(3-cloro-2-fluorofenil)-4-ciano-5-(2,2-dimetilpropil)pirrolidin-2-carbonil]amino}-3-metoxibenzoico en una cantidad de aproximadamente 800 a aproximadamente 3000 mg/día durante un periodo de administración de hasta aproximadamente 7 días, los días 1-7, de un ciclo de tratamiento de 28 días, seguido por un periodo de descanso de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 días.

El artículo «Preclinical Optimization of MDM2 Antagonist Scheduling for Cancer Treatment by Using a Model-Based Approach», Clinical Cancer Research, tomo 20, n.° 14, mayo de 2014, páginas 3742-3752, B. Higgins et al., da a conocer una pauta de un ciclo de 28 días, donde se administra RG7388 una vez por semana tres veces a lo cual siguen 13 días de descanso (pauta de un ciclo de 28 días) o donde el fármaco se administra durante 5 días consecutivos de una pauta de 28 días.

El documento US2013/0245039A1, Higgins et al., se refiere a una terapia combinada para tratar a un paciente que padece un trastorno proliferativo, que comprende administrar el inhibidor de b-Raf vemurafenib y un inhibidor de MDM2, y da a conocer pautas de administración para ambos.

Se dan a conocer inhibidores de Mdm2 y cómo prepararlos, por ejemplo, en los documentos WO2013111105 o WO2011076786.

Sumario de la divulgación

Se ha descubierto inesperadamente que se puede diseñar un régimen de dosificación ventajoso para un inhibidor de Mdm2 (en lo sucesivo «Mdm2i») entendiendo la biología de la diana del fármaco y el modo en que la concentración de Mdm2i puede alterar la señalización de la vía posterior para influir en la eficacia antitumoral y la tolerabilidad. Sorprendentemente, se ha descubierto que si se utiliza un Mdm2i suficientemente potente o, como alternativa, una dosis suficientemente alta de un Mdm2i, se puede ocasionar un efecto antineoplásico mediante la activación de un mecanismo antiproliferativo mucho más duradero en las células. Cuando una célula cancerosa se expone a una concentración suficientemente alta del respectivo Mdm2i durante tan solo 8 horas (y proporcionalmente más tiempo si se utiliza una concentración inferior), el Mdm2i hace que la expresión del ARNm de p21 y Puma se dispare en un plazo de las 48 a las 72 horas siguientes, lo cual conduce a una inducción significativa de actividad de caspasa 3/7 y, por tanto, a una apoptosis considerable. Se observó el mismo efecto en animales en los que se habían implantado subcutáneamente células cancerosas después de tratar al animal con una dosis única suficientemente alta. Esto provocó una reducción considerable del volumen tumoral. No se detectó nada de esto cuando la exposición al Mdm2i estaba por debajo de cierto umbral por debajo del cual no se activaba esta segunda modalidad de Mdm2i. El conocimiento de la segunda modalidad de Mdm2i puede ayudar a planear los ensayos clínicos de un modo que se reduzcan los efectos secundarios debidos a un efecto específico del fármaco.

Curiosamente, se observó que se puede mantener un efecto duradero durante varias semanas después de una dosis única, lo cual suprime la necesidad de un tratamiento diario y permite administrar el fármaco de forma intermitente. Durante los descansos sin administración de un fármaco, un organismo puede recuperarse de los posibles efectos específicos o efectos secundarios; particularmente se pueden recuperar los números de leucocitos (WBC, por sus siglas en inglés), neutrófilos y trombocitos. Administrar el Mdm2i en dosis que desencadenan el efecto duradero hace que el Mdm2i sea al menos tan eficaz como cuando se administra a diario en dosis inferiores y se puede tolerar mejor. Una dosificación menos frecuente también puede dar lugar a una mejor aceptación del paciente, cumplimiento terapéutico del paciente y, particularmente cuando el fármaco se administra por vía intravenosa, puede tener beneficios significativos para el paciente. Por ejemplo, las irritaciones en el punto de inyección local pueden curarse bien antes de que toque la siguiente dosis.

La dosificación intermitente de un Mdm2i con un efecto mantenido se puede combinar con un régimen de dosificación que comprende una administración diaria de una dosis inferior en comparación con la dosis utilizada para conseguir un efecto mantenido. La combinación de la dosificación intermitente de una primera dosis y la dosificación diaria de una segunda dosis produce un efecto sinérgico en lo que respecta a la eficacia del compuesto, que se observa, por ejemplo, como una reducción del volumen tumoral o remisión tumoral. Además, debido a la mejor tolerabilidad de Mdm2i cuando se administra de forma intermitente, el fármaco se puede utilizar en combinación con otros agentes antineoplásicos. La combinación de un Mdm2i y otro agente antineoplásico puede aprovechar la mejor tolerabilidad del Mdm2i cuando se administra de forma intermitente, incrementando a la vez la eficacia global de la terapia combinada con un segundo agente antineoplásico.

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones:

1. Un MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el MDM2i se ha de administrar a un sujeto de forma intermitente en al menos 3 dosis consecutivas y el periodo entre cada dos dosis consecutivas es de al menos 3 semanas y no superior a 60 días.

2. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la realización 1, en donde el MDM2i se ha de administrar a un sujeto de forma intermitente y el periodo entre administraciones consecutivas es de 3 semanas.

3. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la realización 1 o 2, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, mama, cerebro, cabeza y cuello, hígado, bucal, de las vías biliares, leucemia linfocítica aguda y crónica, leucemia mielógena aguda y crónica, leucemia mielomonocítica crónica, colorrectal, gástrico, estromal gastrointestinal, hepatocelular, glioma, linfoma, melanoma, mieloma múltiple, enfermedad mieloproliferativa, neuroendocrino, de pulmón, de pulmón no microcítico, pancreático, ovárico, prostático, de las células renales, sarcoma, liposarcoma y tiroideo.

4. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la realización 1 o 2, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón o neuroblastoma.

5. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la realización 4, en donde el cáncer es melanoma.

6. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 5, en donde el MDM2i se administra a un ser humano.

7. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en donde el MDM2i se selecciona del grupo que consiste en:

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(6-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-fransciclohexilmetil]amino}piridin-3-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(6-{metil-[4-(3-metil-4-oxoimidazolidin-1-il)-fransciclohexilmetil]amino}piridin-3-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(5-{metil-[4-(3-metil-4-oxoimidazolidin-1-il)-fransciclohexilmetil]amino}pirazin-2-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-5-(5-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona,

4-[(S)-5-(3-Cloro-2-fluorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-isopropil-6-oxo-3,4,5,6-tetrahidropirrolo[3,4-d]imidazol-4-il]benzonitrilo,

(S)-5-(5-Cloro-2-oxo-1,2-d¡h¡drop¡r¡d¡n-3-¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-¡soprop¡l-5,6-d¡h¡dro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona,

(S)-5-(3-cloro-4-fluorofen¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-((R)-1-metox¡propan-2-¡l)-5,6-d¡h¡dropirrolo[3,4-d]¡m¡dazol-41/-/ -ona,

(S)-5-(5-cloro-1-met¡l-2-oxo-1,2-d¡h¡drop¡r¡d¡n-3-¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡-d6-p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-((R)-1-metox¡propan-2-¡l)-5,6-d¡h¡drop¡rrolo[3,4-d]¡m¡dazol-4(1H)-ona.

8. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con una cualqu¡era de las real¡zac¡ones 1 a 5, en donde el MDM2¡ es

(S)-5-(5-Cloro-1-met¡l-2-oxo-1,2-d¡h¡drop¡r¡d¡n-3-¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-¡soprop¡l-5,6-d¡h¡dro-1 H-p¡rrolo[3,4-d]¡m¡dazol-4-ona o

(S)-1-(4-Clorofen¡l)-7-¡sopropox¡-6-metox¡-2-(4-{met¡l-[4-(4-met¡l-3-oxop¡peraz¡n-1-¡l)-frans-c¡clohex¡lmet¡l]am¡no}fen¡l)-1,4-d¡h¡dro-2H-¡soqu¡nol¡n-3-ona.

9. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con una cualqu¡era de las real¡zac¡ones 1 a 5, en donde el MDM2¡ es (S)-5-(5-Cloro-1-met¡l-2-oxo-1,2-d¡h¡drop¡r¡d¡n-3-¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-¡soprop¡l-5,6-d¡h¡dro-1H-p¡rrolo[3,4-d]¡m¡dazol-4-ona.

10. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con una cualqu¡era de las real¡zac¡ones 1 a 9, en donde el MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer comprende además otro ¡ngred¡ente farmacéut¡co que se ha de adm¡n¡strar a un pac¡ente.

11. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con la real¡zac¡ón 10, en donde el otro ¡ngred¡ente farmacéut¡co es otro agente ant¡neoplás¡co.

El térm¡no «¡nh¡b¡dor de Mdm2» o «Mdm2¡» denota en la presente cualqu¡er compuesto que ¡nh¡be la ¡nteracc¡ón de HDM-2/p53 o HDM-4/p53 con una CI50 de menos de 10 pM, preferentemente menos de 1 pM, preferentemente en el ¡ntervalo de nM, med¡da med¡ante un ensayo de transferenc¡a de energía entre fluorocromos con resoluc¡ón temporal (TR-FRET, por sus s¡glas en ¡nglés). La ¡nh¡b¡c¡ón de las ¡nteracc¡ones de p53-Hdm2 y p53-Hdm4 se m¡de med¡ante transferenc¡a de energía entre fluorocromos con resoluc¡ón temporal (TR-FRET). La transferenc¡a de energía entre fluorocromos (o transferenc¡a de energía por resonanc¡a de Foerster) describe una transferenc¡a de energía entre moléculas fluorescentes 5 dadoras y aceptoras. Para este ensayo, se ut¡l¡zan la proteína MDM2 (am¡noác¡dos 2-188) y la proteína MDM4 (am¡noác¡dos 2-185), marcadas con un resto de b¡ot¡na carbox¡term¡nal, en comb¡nac¡ón con una estreptav¡d¡na marcada con Europ¡o (Perk¡n Elmer, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) que s¡rve de fluoróforo dador. El pépt¡do Cy5-TFSDLWKLL (aa18-26 de p53) marcado con Cy5 y derivado de p53 es el aceptor de energía. Tras la exc¡tac¡ón de la molécula 10 dadora a 340 nm, la ¡nteracc¡ón de un¡ón entre MDM2 o MDM4 y el pépt¡do de p53 ¡nduce una transferenc¡a de energía y una respuesta ¡ntens¡f¡cada a la long¡tud de onda de em¡s¡ón del aceptor a 665 nm. La alterac¡ón de la formac¡ón del complejo de p53-MDM2 o p53-MDM4 deb¡do a la un¡ón de una molécula de ¡nh¡b¡dor al s¡t¡o de un¡ón a p53 de MDM2 o MDM4 da como resultado una mayor em¡s¡ón del dador a 615 nm. La lectura rat¡ométr¡ca del ensayo FRET se calcula a part¡r de los datos no procesados 15 de las dos señales de fluorescenc¡a d¡ferentes med¡das en un modo de resoluc¡ón temporal (veloc¡dad de recuento a 665 nm/veloc¡dad de recuento a 615 nm x 1000). El ensayo se puede real¡zar de acuerdo con el s¡gu¡ente proced¡m¡ento: La prueba se real¡za en placas de microvaloración de 1536 pocilios (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemania) en un volumen total de 3,1pl combinando 100nl de compuestos diluidos en 90% de DMSO/10% de H2O (concentración final en DMSO del 3,2%) con 2pl de estreptavidina marcada con Europio 20 (concentración final de 2,5nM) en tampón de reacción (PBS, NaCl 125mM, Novexin al 0,001% (consiste en polímeros de carbohidratos (polímeros Novexin), diseñados para incrementar la solubilidad y estabilidad de proteínas; Novexin Ltd., Ambridgeshire, Reino Unido), 0,01% de Gelatina, Pluronic al 0,2% (copolímero en bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, BASF, Ludwigshafen, Alemania), DTT 1 mM), tras lo cual se añaden 0,5pl de MDM2-Bio o MDM4-Bio diluidos en tampón de ensayo (concentración final de 10nM). Dejar que la disolución se preincube durante 15 minutos a temperatura ambiente, tras lo cual se añaden 0,5pl de péptido Cy5-p53 en tampón de ensayo (concentración final de 20nM). Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de leer la placa. Para medir las muestras, se utiliza un lector de microplacas multimodal Analyst GT (Molecular Devices) con los siguientes ajustes 30: Espejo dicroico 380nm, Excitación 330nm, Emisión del dador 615nm y Emisión del aceptor 665nm. Los valores de CI50 se calculan mediante un ajuste de la curva utilizando XLfit. Si no se especifica, los reactivos se adquirieron en Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, EE. UU.

De acuerdo con una realización, un inhibidor de Mdm2 puede ser, por ejemplo, un compuesto de cualquiera de las siguientes fórmulas:

S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(6-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-fransciclohexilmetil]amino}piridin-3-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(6-{metil-[4-(3-metil-4-oxoimidazolidin-1-il)-/ransciclohexilmetil]amino}piridin-3-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(5-{metil-[4-(3-metil-4-oxoimidazolidin-1-il)-/ransciclohexilmetil]amino}pirazin-2-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona

(S)-5-(5-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1 H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona

4-[(S)-5-(3-Cloro-2-fluorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-3-isopropil-6-oxo-3,4,5,6-tetrahidropirrolo[3,4-d]imidazol-4-il]benzonitrilo

(S)-5-(5-Cloro-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona

(S)-5-(3-cloro-4-fluorofenil)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-((R)-1-metoxipropan-2-il)-5,6-d¡h¡dropirrolo[3,4-d]¡m¡dazol-41/-/ -ona,

o

(S)-5-(5-cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxi-d6-pirimidin-5-il)-1-((R)-1-metoxipropan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona.

En una realización particular, el MDM2i es (S)-5-(5-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona (en lo sucesivo compuesto A) o una sal farmacéuticamente aceptable de esta.

En otra realización, el MDM2¡ es (S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (en lo sucesivo compuesto B).

El término «sujeto» o «paciente», tal como se utiliza en la presente, incluye animales que pueden padecer o estar afectados por un cáncer o cualquier trastorno que implique, directa o indirectamente, un cáncer. Los ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, p. ej., seres humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos. En la realización preferida, el sujeto es un ser humano, p. ej., un ser humano que padece, que corre el riesgo de padecer o que puede padecer potencialmente cáncer. En una realización particular, el sujeto o paciente es un ser humano.

El término «tratar» o «tratamiento», tal como se utiliza en la presente, denota detener, retrasar el inicio (es decir, el periodo previo a la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad, o comprende mitigar, reducir o aliviar al menos un síntoma en un sujeto o conseguir un retraso del avance de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento puede ser la disminución de uno o varios síntomas de un trastorno o la erradicación completa de un trastorno, tal como el cáncer.

El término «agente antineoplásico» es un ingrediente farmacéutico activo que presenta actividad antiproliferativa o anticancerosa. Los posibles agentes antineoplásicos adecuados para el tratamiento combinado incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de BRAF (p. ej., (S)-metil-1-(4-(3-(5-cloro-2-fluoro-3-(metilsulfonamido)fenil)-1-isopropil-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilcarbamato o vemurafenib); inhibidores de la cinasa de linfoma anaplásico (ALK) (p. ej., ceritinib, AE684, Alectinib, Crizotinib, AP26113, ASP3026, ADZ3463); inhibidores de la aromatasa (p. ej., atamestano, exemestano y formestano, aminoglutetimida, rogletimida, piridoglutetimida, trilostano, testolactona, ketoconazol, vorozol, fadrozol, anastrozol o letrozol); antiestrógenos (tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno o clorhidrato de raloxifeno); antiandrógeno (p. ej., bicalutamida); inhibidores de la topoisomerasa I (p. ej., topotecán, gimatecán, irinotecán, camptotecina y sus análogos, 9-nitrocamptotecina y el conjugado de camptotecina macromolecular PNU-166148 (compuesto A1 en el documento WO99/17804); inhibidores de la topoisomerasa II (p. ej., doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, nemorrubicina, mitoxantrona, losoxantrona, etopósido o tenipósido); compuestos activos que actúan en los microtúbulos (p. ej., paclitaxel, docetaxel, vinblastina, sulfato de vinblastina, vincristina, sulfato de vincristina, vinorelbina, discodermolidas, colquicina); compuestos alquilantes (p. ej., ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán o nitrosourea); inhibidores de la histona-desacetilasa; compuestos que inducen procesos de diferenciación celular; inhibidores de ciclooxigenasas; inhibidores de MMP; inhibidores de mTOR; antimetabolitos antineoplásicos; compuestos derivados del platino; compuestos que actúan sobre/disminuyen una actividad de proteína- o lípido-cinasa; compuestos antiangiogénicos; compuestos que actúan sobre, disminuyen o inhiben la actividad de una proteína - o lípido-fosfatasa; agonistas de gonadorelina (p. ej., abarelix, goserelina y acetato de goserelina); inhibidores de la metionina-aminopeptidasa; bisfosfonatos; modificadores de la respuesta biológica; anticuerpos antiproliferativos; inhibidores de la heparanasa; inhibidores de isoformas oncogénicas de Ras; inhibidores de la telomerasa; inhibidores del proteasoma; compuestos utilizados en el tratamiento de neoplasias hemáticas malignas; compuestos que actúa sobre, disminuyen o inhiben la actividad de Flt-3; inhibidores de Hsp90; inhibidores de la proteína cinesina del huso; inhibidores de MEK; leucovorina; compuestos fijadores a EDG; compuestos antileucémicos; inhibidores de la ribonucleótido-reductasa; inhibidores de la S-adenosilmetionina-descarboxilasa; esteroides angiostáticos; corticosteroides; otros compuestos quimioterápicos (como los definidos más adelante); compuestos fotosensibilizantes (p. ej., VISUDYNE y porfímero sódico).

Breve descripción de las figuras

FIGURA 1 PK (siglas en inglés de farmacocinética) del Compuesto A en rata con tumor SJSA-1 después de un único tratamiento intravenoso (i.v.)

FIGURA 2 PK y PD (siglas en inglés de farmacodinámica) del Compuesto A en rata con tumor SJSA-1 después de un único tratamiento i.v.

FIGURA 3 Crecimiento tumoral después de un único tratamiento i.v. con el compuesto A de rata atímica con tumor SJSA-1

FIGURA 4 Cambio en el peso corporal (BW, por sus siglas en inglés) después de un único tratamiento i.v. con el compuesto A de rata atímica con tumor SJSA-1

FIGURA 5 Eficacia del compuesto A después de un único tratamiento i.v. de rata atímica con tumor SJSA-1 - datos individuales

FIGURA 6 Recuperación de la médula ósea después de un único tratamiento i.v.

FIGURA 7 Correlación entre el recuento de leucocitos en sangre y en corte de médula ósea del esternón

La FIGURA 8 muestra el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días después del tratamiento i.v. (q3w, es decir, una vez cada tres semanas) de rata atímica con tumor SJSA-1.

FIGURA 9 Efecto del tratamiento i.v. (q3w) sobre el recuento de leucocitos (WBC), neutrófilos y trombocitos La FIGURA 10 muestra el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días después del tratamiento i.v. q3w con el Compuesto A en dosis de 13,7 y 18,2 mg/kg

FIGURA 11 Efecto del tratamiento i.v. (q3w) con el Compuesto A en dosis de 13,7 y 18,2 mg/kg sobre el recuento de leucocitos (WBC), neutrófilos y trombocitos

FIGURA 12 Estudio de PK en rata con tumor SJSA-1 después de un único tratamiento con el compuesto A por vía oral

La FIGURA 13 muestra la concentración de fármaco y la respuesta PD en el tumor después de una única administración del compuesto A por vía oral

La FIGURA 14 muestra el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días después del tratamiento v.o. q3w con el compuesto A

La FIGURA 15 muestra el recuento de leucocitos y trombocitos a lo largo de 42 días de tratamiento v.o. q3w con el compuesto A

FIGURA 16 Una dosis baja de Mdm2i no desencadena el mismo efecto bioquímico que una dosis alta

FIGURA 17 La combinación de un régimen de dosificación intermitente y más frecuente de Mdm2i tiene un efecto sinérgico sobre la eficacia

FIGURA 18 Eficacia en rata con tumor SJSA-1 después de administrar el Compuesto A de forma intermitente en una dosis alta, a diario en una dosis baja y la combinación de ambas pautas posológicas

FIGURA 19 Tolerabilidad en rata con tumor SJSA-1 después de administrar el Compuesto A de forma intermitente en una dosis alta, a diario en una dosis baja y la combinación de ambas pautas posológicas

FIGURA 20 Eficacia de Mdm2i en una dosis de 27 mg/kg q3w por vía oral en rata con PTX de melanoma. «Cmp A» es la abreviatura de «Compuesto A».

FIGURA 21 Tolerabilidad de Mdm2i en una dosis de 27 mg/kg q3w por vía oral en rata con PTX de melanoma FIGURA 22 Eficacia del compuesto A administrado de forma intermitente en combinación con ceritinib en ratones con tumor SHSY5Y. «Cmp A» es la abreviatura de «Compuesto A»

Descripción detallada de la divulgación

En la actualidad, los inhibidores de Mdm2 se administran a diario, opcionalmente con interrupciones temporales del tratamiento. El descanso después de una serie de tratamientos diarios con Mdm2i se han prolongado en ciertos casos debido a problemas de tolerabilidad. Excepcionalmente, los inhibidores de Mdm2 se administran en intervalos semanales. Ahora, se ha descubierto que la (S)-5-(5-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona (compuesto A) en una dosis única más alta administrada por vía intravenosa o por vía oral facilitó, por primera vez, una fuerte inducción de ARNm de Puma (Emáx para la inducción con un factor de multiplicación > 70) que nunca se había alcanzado antes con una dosis por vía oral (v.o.) inferior del compuesto A o la (S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (compuesto B). Es interesante destacar que Mdm2, el inhibidor de p53, tuvo la inducción de ARNm más baja. Dicha inducción alta de ARNm de Puma en el tumor fue seguida de una fuerte activación de la caspasa-3 24h después del tratamiento, lo cual se tradujo en una disminución drástica de la densidad de células tumorales 48 y 72h después del tratamiento. La fuerte inducción de la vía apoptótica se identificó claramente como el motor principal de la inesperada y sorprendente remisión tumoral inducida por un único tratamiento en una dosis alta. De hecho, un único tratamiento i.v. con el compuesto A en una dosis de 20 mg/kg indujo una respuesta completa del tumor SJSA-1 (100% de remisión) en el 82% (9/11) de las ratas tratadas durante 42 días. Además, el tratamiento v.o. una vez cada 3 semanas (q3w) con el compuesto A en una dosis de 27 mg/kg indujo un 88 y un 27% de remisión del tumor SJSA-1 después de uno y dos ciclos, respectivamente.

Se ha descubierto que para desencadenar una apoptosis prolongada o un efecto antiproliferativo mantenido con una fuerte inducción de Puma (es decir, una inducción con un factor de multiplicación de al menos 20 para la expresión de ARNm en comparación con la expresión de ARNm en células cancerosas sin tratar), el compuesto A se ha de administrar en una dosis suficientemente alta. Dicha dosis permite administrar el fármaco de forma intermitente sin que se produzca una pérdida significativa de eficacia y mejorando potencialmente la tolerabilidad. Las dosis únicas del Compuesto A se pueden administrar cada 2 semanas. También los descansos de 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas o incluso una intermitencia de 60 días pueden seguir mostrando un efecto significativo sobre el tumor. Por debajo de dicha dosis alta, el compuesto A solamente induce la expresión de ARNm de Puma hasta un factor de multiplicación de aproximadamente 5-6 y, en consecuencia, es necesario que se administre de forma continua, por ejemplo, a diario, para conseguir un efecto antiproliferativo continuo. Una vez que el fármaco se ha administrado suficiente tiempo, incluso en una dosis inferior, se puede realizar un descanso del tratamiento, pero el ciclo de tratamiento se ha de repetir dentro al menos aproximadamente 2 semanas, de lo contrario se deja de observar efecto antiproliferativo.

Otro Mdm2¡ distinto del compuesto A también puede conseguir una fuerte inducción de Puma, pero la dosis que se ha de utilizar depende de la potencia del compuesto. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que la dosis de un Mdm2¡ para generar un efecto prolongado mediante una inducción muy marcada de Puma necesita ser inferior cuando el Mdm2¡ es más potente. Pero, en principio, también un Mdm2¡ poco potente puede activar esta modalidad de segundo nivel que conduce a un efecto duradero, si tan solo se administra en una dosis que alcance una exposición plasmática suficiente. Se puede conseguir una remisión tumoral de aproximadamente el 26% si el Mdm2¡ está por encima de la concentración de GI80 durante al menos 8 horas, y de más del 90% si la exposición a Mdm2i persiste por encima de la GI80 durante al menos 17 horas. GI80 es la dosis necesaria para provocar un 80% de inhibición del crecimiento de las células tumorales. Por lo tanto, generalmente, la dosis alta o dosis mayor de un Mdm2i es la dosis que hace que el Mdm2i persista durante al menos 8 horas, preferentemente al menos 10 horas, en plasma in vivo al menos en una concentración que en cualquier otra situación provoca GI-80 al exponer las células tumorales in vitro al Mdm2i durante 8 horas. La concentración de GI-80 se puede medir mediante cualquier prueba de proliferación. Por ejemplo, se utiliza un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® . Por ejemplo, se tratan células in vitro con el Mdm2i durante 8 horas, a continuación las células se lavan para retirar el compuesto del medio y se realiza una determinación del número de células viables después de 72 horas. Esto se repite con diferentes concentraciones para identificar la concentración de GI-80. La dosis alta ha de alcanzar o superar in vivo dicha concentración de GI-80 del Mdm2i durante al menos 8 horas. La dosis baja es inferior a la dosis alta más baja. Desafortunadamente, administrar dosis más altas de Mdm2i no siempre se traduce en una exposición plasmática suficiente simplemente debido a la farmacocinética específica del compuesto, particularmente si se administra por vía oral, ya que, por ejemplo, una baja biodisponibilidad puede impedir que el fármaco consiga niveles en plasma suficientemente altos. Este inconveniente de la administración oral se supera cuando se administra el Mdm2i por vía intravenosa.

La «dosis» tal como se menciona en la presente en el contexto de una dosis administrada también puede significar concentración.

Por tanto, es un objetivo de esta divulgación proporcionar un MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el MDM2i se ha de administrar a un sujeto de forma intermitente y el periodo entre al menos tres dosis consecutivas es de al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 6 semanas o al menos 60 días y no superior a 60 días. El MDM2i se ha de administrar a un sujeto de forma intermitente en al menos tres dosis consecutivas y el periodo entre cada dos dosis consecutivas de las tres dosis es de al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 6 semanas o 60 días. El límite superior se fija en función de los datos disponibles, pero se contempla la posibilidad, de que incluso una administración menos frecuente pueda conducir a un desenlace aceptable desde un punto de vista clínico y podría ser útil. Para mejorar el cumplimiento terapéutico del paciente, el régimen de administración para el Mdm2i puede ser una vez cada 3 semanas o 4 semanas, particularmente una vez cada 3 semanas.

Se ha descubierto que se puede resolver el problema de la exposición subóptima del Mdm2i en un cuerpo, particularmente si tiene una CI50 de la proliferación celular de más de 1 ^|j M, administrando el fármaco por vía intravenosa. Como ejemplo, se ha descubierto que se pueden administrar dosis inferiores del compuesto A (20 mg/kg) por vía intravenosa, mientras que se necesitaban 27 mg/kg por vía oral para estimular la misma respuesta. Por lo tanto, administrar Mdm2i por vía intravenosa brinda la posibilidad a un Mdm2i de potencia inferior de alcanzar la segunda etapa de reactividad mencionada anteriormente con efecto antiproliferativo prolongado. De este modo, existe la posibilidad de administrar el fármaco con menos frecuencia, ya que solamente la administración intravenosa conducirá a la exposición requerida. Además, administrar Mdm2i por vía intravenosa en una dosis inferior en comparación con la dosis que se requeriría para la administración oral puede ofrecer al menos alguna ventaja en cuanto a la tolerabilidad.

Por lo tanto, en una realización, se proporciona Mdm2i para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el MDM2i se ha de administrar por vía intravenosa.

En otro aspecto de la divulgación, pero sin formar parte de la invención, la dosificación intermitente de un MDM2i se puede complementar con otro régimen de dosificación de una segunda dosis del MDM2i que es diferente a la dosis utilizada en la dosificación intermitente de una dosis única. Combinar la pauta posológica intermitente con otra pauta más frecuente permite reducir la dosis de Mdm2i utilizada en cada una de las pautas y, por tanto, mejora aún más la tolerabilidad. Administrar una dosis alta de un Mdm2i de forma intermitente al mismo tiempo que se dosifica también el Mdm2i con más frecuencia, p. ej., a diario en una dosis inferior, permite reducir las dosis para ambas pautas hasta el nivel que en cualquier otra situación no sería eficaz, al menos en una de las dos pautas posológicas, si dicha pauta posológica se utilizase sola. Combinar el tratamiento con una dosis alta y una baja en pautas diferentes también resultó ser sinérgicamente eficaz. En un aspecto de la divulgación, pero sin formar parte de la invención, la dosificación intermitente, donde se administra Mdm2i al menos cada 2 semanas, se puede superponer el tratamiento diario del Mdm2i. Se ha descubierto que combinar dos regímenes de dosificación del compuesto A, más concretamente el tratamiento una vez cada 3 semanas con una dosis más alta y un tratamiento diario de 2 semanas con una dosis inferior con un descanso de 2 semanas cada ciclo de 28 días, conducen a un efecto antitumoral sinérgico de ambos tratamientos. El segundo régimen de dosificación que se añade al tratamiento intermitente puede comenzar el mismo día, un día consecutivo u otro día. El segundo régimen de dosificación puede ser, por ejemplo, a diario, opcionalmente con un descanso. El descanso después de una serie de tratamientos diarios puede durar al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 1 semana, 2 semanas o 3 semanas y a lo sumo 26 días. En un aspecto, la dosis del segundo régimen de dosificación se ha de administrar de 1 a 14 días después de que se haya administrado la primera dosis. En un aspecto específico, la segunda pauta posológica con una dosis inferior de Mdm2i comienza al día siguiente después de que se haya administrado la dosis única alta. La dosis que se administra a diario se puede administrar durante dos semanas, seguidas de un periodo de dos semanas sin tratamiento y a continuación se puede repetir el ciclo de tratamiento. Generalmente, la dosis utilizada para la dosificación intermitente será más alta que la segunda dosis utilizada en dosificación más frecuente que se añade a la dosificación intermitente. El Mdm2i se puede administrar ya sea por vía oral o intravenosa, o en una combinación de estas. Por ejemplo, la dosis intermitente al menos cada 2, 3, 4, 6 semanas o 60 días se puede administrar por vía intravenosa, mientras que la segunda dosis diaria se puede administrar por vía oral. Sin embargo, ambas dosis se pueden administrar por vía intravenosa o ambas por vía oral. En un aspecto, la primera dosis que se administra de forma intermitente se puede administrar con periodos entre dos administraciones consecutivas de al menos 2 semanas.

En un aspecto, la segunda pauta posológica que se añade a la pauta posológica intermitente puede comprender administrar el Mdm2i durante un periodo de al menos 5 días seguido de un periodo de 1 día o más, y repetir el ciclo mientras el paciente se trata de forma intermitente con el Mdm2i en la dosis diferente. Sin embargo, las segundas pautas posológicas adicionales incluyen, por ejemplo, ciclos de 2 semanas con (tratamiento), 1 o 2 semanas sin (tratamiento); 3 semanas con 1,2 o 3 semanas sin; 4 semanas con 1,2, 3 o 4 semanas sin; 1 semana con, 3 semanas sin; 3 semanas con, 1 semana sin; 4 semanas con, 1 semana sin.

Además de añadir una segunda pauta posológica a la dosificación intermitente, se puede mejorar un desenlace clínico de un tratamiento de MDM2i con la dosificación intermitente mediante la administración de un ingrediente farmacéutico adicional al sujeto. El ingrediente farmacéutico adicional puede ser otro Mdm2i, pero lo más habitual será que sea un fármaco con un mecanismo de acción diferente. Se contempla en la presente que la administración de otro agente antineoplásico además del Mdm2i administrado de forma intermitente puede conseguir un efecto antitumoral mejorado. Además, la dosificación intermitente ofrece más flexibilidad para combinar Mdm2i con otro agente antineoplásico, ya que al reducir la frecuencia de dosificación de Mdm2i, la tolerabilidad puede mejorar y posibilita así más opciones de añadir otro fármaco anticanceroso. En una realización, el Mdm2i se administra de forma intermitente, tal como se describe en la presente, en combinación con un inhibidor de BRAF o un inhibidor de ALK. Específicamente, el otro ingrediente farmacéutico es (S)-metil-1-(4-(3-(5-cloro-2-fluoro-3-(metilsulfonamido)fenil)-1-isopropil-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilcarbamato. En otra realización, la combinación se hace con Ceritinib. En los casos en que el Mdm2¡ se combina con otro ingrediente farmacéutico, el Mdm2¡ se puede administrar de forma intermitente siendo los periodos entre dosis únicas de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 6 semanas o 60 días y no superiores a 60 días.

La presente divulgación proporciona también el compuesto A para su uso en el tratamiento, en donde el compuesto A se administra de forma intermitente, p. ej., el periodo entre cada dos dosis de al menos tres dosis es de al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 6 semanas o 60 días y no más de 60 días, y también se utilizan (S)-metil-1-(4-(3-(5-cloro-2-fluoro-3-(metilsulfonamido)fenil)-1-isopropil-1H-pirazol-4-il)pirimidin-2-ilamino)propan-2-ilcarbamato o Ceritinib. Particularmente, el compuesto A se administra como una dosis única al menos cada semana o al menos cada tres semanas.

El Mdm2¡ y el ingrediente farmacéutico adicional pueden aplicarse o formularse de los compañeros separados con o sin, preferentemente con, instrucciones para el uso combinado o a productos de combinación. Por tanto, los compuestos de la combinación se pueden administrar completamente por separado o ser formas farmacéuticas completamente separadas. Los compañeros de la combinación pueden ser composiciones farmacéuticas que también se venden de forma independiente la una de la otra y donde solamente se proporcionan instrucciones para su uso combinado en el material del envase, p. ej., folleto o similar, o en otra información, p. ej., proporcionada a los médicos y personal facultativo (p. ej., mensajes orales, mensajes por escrito o similares), para el uso simultáneo o secuencial para que sean activos de forma conjunta. El Mdm2¡ y otro ingrediente farmacéutico activo se pueden proporcionar como una combinación fija o no fija de los ingredientes activos. El término «combinación fija» significa que los ingredientes activos, p. ej., un inhibidor de Mdm2 y un agente antineoplásico, se administran ambos a un paciente simultáneamente en forma de una única entidad o dosificación. En otras palabras: los ingredientes activos están presentes en una forma farmacéutica, p. ej., en un comprimido o en una cápsula. El término «combinación no fija» significa que los ingredientes activos se administran ambos a un paciente como entidades separadas, ya sea de forma simultánea, concurrente o secuencial sin límites de tiempo específicos, en donde dicha administración proporciona niveles terapéuticamente eficaces de los dos compuestos en el cuerpo del paciente.

Los cánceres tratados mediante el uso de Mdm2¡ tal como se describe en la presente incluyen cáncer tal como, pero sin limitarse a, cáncer de vejiga, mama, cerebro, cabeza y cuello, hígado, bucal, de las vías biliares, leucemia linfocítica aguda y crónica, leucemia mielógena aguda y crónica, leucemia mielomonocítica crónica, colorrectal, gástrico, estromal gastrointestinal, hepatocelular, glioma, linfoma, melanoma, mieloma múltiple, enfermedad mieloproliferativa, neuroendocrino, de pulmón, de pulmón no microcítico, pancreático, ovárico, prostático, de las células renales, sarcoma, liposarcoma y tiroideo. En una realización específica, el cáncer es melanoma. En otra realización el cáncer es neuroblastoma. En otra realización más, el cáncer es leucemia.

A partir de los datos obtenidos con el Compuesto A y conociendo también la respuesta bioquímica de (S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-frans-ciclohexilmeti]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona (Compuesto B), cabe esperar que los regímenes de dosificación propuestos se podrían utilizar para proporcionar una eficacia o tolerabilidad ventajosa con al menos el Mdm2¡ indicado anteriormente.

El Mdm2i se puede suministrar al sujeto en una composición farmacéutica. Las formas farmacéuticas orales que se van a utilizar son, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, sobres, microesferas, gránulos o similares. Las formas farmacéuticas orales pueden comprender además del Mdm2i, otros portadores o excipientes convencionales utilizados para fármacos. Los ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen, pero no se limitan a, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, estabilizantes y rellenos, diluyentes, colorantes, sabores y conservantes. Un experto en la técnica puede seleccionar uno o más de los portadores mencionados anteriormente con respecto a las propiedades particulares deseadas de la forma farmacéutica mediante experimentación rutinaria y sin ninguna dificultad excesiva. La cantidad de cada uno de los portadores utilizados puede variar dentro de los intervalos convencionales en la técnica. Las siguientes referencias dan a conocer técnicas y excipientes utilizados para formular formas farmacéuticas orales. Véanse The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4.a edición, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); y Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 20.a edición, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2003). Las formas farmacéuticas se preparan, por ejemplo, mediante ligado, granulación, compresión, compactación, llenado, tamizado, mezcla y/o prensado en comprimidos.

El Mdm2i se puede aplicar in vivo por vía intravenosa, p. ej., como una disolución. Generalmente, la forma farmacéutica se esterilizaría en autoclave o utilizando otro proceso antes de la administración. El fármaco se puede administrar por vía intravenosa mediante inyección o infusión. Preferentemente, el Mdm2i se infunde por vía intravenosa a lo largo de un periodo de menos de 3 horas, más preferentemente en hasta 2 horas, particularmente en aproximadamente 1 hora.

Se puede utilizar Mdm2i para la preparación de un medicamento, donde se prepara una forma farmacéutica. Esta última además se puede envasar y complementar con un prospecto para el paciente.

El Mdm2i se administra en la cantidad terapéuticamente eficaz. El término «una cantidad terapéuticamente eficaz» del Mdm2i se refiere a una cantidad del compuesto que provocará la respuesta médica o biológica de un sujeto, por ejemplo, mejorar síntomas, aliviar dolencias, ralentizar o retrasar la evolución de la enfermedad, ralentizar el crecimiento del tumor o hacer que el tumor remita, o similar.

En una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz in vivo puede variar en función de la vía de administración entre aproximadamente 0,1-500 mg/kg o entre aproximadamente 1-100 mg/kg. Por ejemplo, para el compuesto A, la cantidad eficaz in vivo es de entre 100 y 1500 mg cada tres semanas, particularmente entre 100 y 800 mg cada tres semanas, o entre 50 y 600 mg a diario, cuando se administra por vía oral. Para el compuesto B, la cantidad eficaz es de entre 500 y 4000 mg, particularmente entre 1500 y 4000 mg, cuando se administra por vía oral. Las dosis intravenosas necesitarían reducirse según corresponda.

Los siguientes Ejemplos ilustran la divulgación de la presente.

Método y materiales utilizados en los ejemplos

Compuesto A - (S)-5-(5-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona

Compuesto B - (S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(4-{metil-[4-(4-metil-3-oxopiperazin-1-il)-transciclohexilmetil]amino}fenil)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona

Cultivo celular

Las células de osteosarcoma SJSA-1 (CRL-2098, ATCC) no tienen mutación en p53 y presentan amplificación de Mdm2 (16,9 copias, SNP 6,0) pero no de Mdm4. Se cultivaron en RPMI 1640 (n.° 1-41F01-I, AMIMED) complementado con un 10% de FCS (n^ 2-01F16-I, AMIMED), L-glutamina 2 mM (n^ 5-10K00-H, AMIMED). Las células se sometieron a pases lavando primero con PBS de Dulbecco sin Ca2+/Mg2+ (n^ 3-05F29-I, AMIMED), tripsinizando las células con Tripsina al 0,05% en PBS con EDTA (n^ 5-51F00-H, AMIMED), centrifugando en los respectivos medios de cultivo y separando las células en medios recién preparados en una proporción de 1:8, 2 veces por semana.

Animales

Se permitió que todas las ratas atímicas (Hsd:RH-Fox1rnu, Harlan Sprague Dawley; SF480) se adaptaran durante 4 días y se alojaron en un entorno sometido a control patogénico (5 ratones/jaula de tipo III) con acceso libre a comida y agua. Los animales se identificaron con transpondedores. Los estudios descritos en este informe se llevaron a cabo de acuerdo con procedimientos contemplados por el número de autorización 1975 concedida por la oficina Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt, y acatando estrictamente las normas Eidgenossisches Tierschutzgesetz y Eidgenossische Tierschutzverordnung. Todos los experimentos se realizaron con de 4 a 7 ratas. Se utilizaron ratones para los experimentos con combinaciones de compuestos.

Modelo tumoral

Se indujeron tumores subcutáneos concentrando 1,0x107 células SJSA-1 en 50% de Matrigel® e inyectándolas en el costado derecho de ratas atímicas Harlan. El experimento de eficacia pudo comenzar 14 días después de la inyección de células. El Compuesto A se preparó en el momento para cada administración. Para la inyección i.v. (4 ml/kg), se disolvió el Compuesto A en 30% de PEG300, 10% de Solutol HS 15, 6% de Pluronic F68 y 54% de agua. Para la inyección por vía oral (v.o.) (5 ml/kg), se disolvió el Compuesto A en metilcelulosa al 0,5% p/V en tampón fosfato de pH 6,8 50 mM. Los animales se trataron ya sea con una dosis alta (20 mg/kg i.v. o 27 mg/kg v.o.) una vez cada 3 semanas (q3w) o con una dosis alta (15 mg/kg v.o.) seguida 24h después por un tratamiento diario de dosis baja (3 mg/kg v.o., 2 semanas con/2 semanas sin).

El volumen tumoral (TVol, por sus siglas en inglés) y el peso corporal (BW) del animal se midieron tres veces por semana, lo que permitió el cálculo en cualquier punto temporal particular respecto al día de inicio del tratamiento (día 0) del porcentaje de cambio en el TVol (A%TVol). La respuesta del tumor se cuantificó según el cambio en el volumen

A TVol A

f.ármaco x 1 QQ

A TVol_vehículo

tumoral (valor final menos valor inicial en mm3) como T/C, es decir, _j

_{En el caso de una remisión}tumoral o para evaluar el porcentaje de cambio en TVol, la respuesta del tumor se cuantificó según el porcentaje de

A TVol _f , _{ármaco x l 0 ( )}

TVol,_Día ₀

_{remisión del TVol inicial, es decir, y}

De forma similar, el peso corporal (BW) del animal se midió tres veces por semana, lo que permitió el cálculo en cualquier punto temporal particular respecto al día de inicio del tratamiento (día 0) del porcentaje de cambio en el BW (A%BW).

Se contaron los leucocitos (WBC), neutrófilos y trombocitos utilizando un Sysmex (XT-2000i). Se extrajo sangre a microtubos recubiertos con EDTA preparados comercialmente (BD Microtainer, n.° de cat. 365975).

Farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD)

En los momentos indicados, los animales se anestesiaron mediante exposición a isoflurano al 2-3% v/v en oxígeno medicinal:

O bien el animal se sacrificó sin que se recupera de la anestesia después de la extracción de sangre. Se extrajo sangre a tubos recubiertos con EDTA preparados comercialmente (Milian, nT de cat. TOM-14C) para extraer plasma. Los tejidos se extirparon, pesaron y congelaron rápidamente en nitrógeno líquido.

O bien se recogió una biopsia del tumor utilizando una pistola para biopsias y evacuando la jeringa con tampón RLT a tubos Barney rubble (Covaris, nT de cat. 520048). Además, pueden haberse recogido 20 pl de sangre de la vena de la cola y diluido en 20 pl de agua. Tras recuperarse de la anestesia, los animales se transfirieron a sus respectivas jaulas.

Se guardaron muestras de tejido, sangre y plasma congeladas a -80°C hasta su análisis.

Preparación de tejido

Los tejidos congelados se criopulverizaron en seco y las biopsias se sonicaron utilizando el sistema CryoPrep™ (modelo CP-02) de Covaris. Más específicamente, se transfirieron los tejidos congelados a tubos desechables denominados TissueTubes™, se introdujeron en el sistema CryoPrep™ y a continuación se pulverizaron utilizando el ajuste de impacto apropiado. El polvo resultante se recogió con una espátula y se pesó para su procesamiento posterior (purificación de ARNm o cuantificación del compuesto en tejidos). Las biopsias se evacuaron a un tubo de vidrio con 350 pl de tampón RLT y se introdujeron en el Covaris para su sonicación (1 min por biopsia). El lisado resultante se transfirió a una columna QIAshredder (79654, Qiagen) para la extracción de ARN.

Farmacodinámica (qRT-PCR)

Se purificó el ARN total a partir de sedimentos celulares utilizando el QIAshredder (79654, Qiagen) y el minikit RNeasy (74106, Qiagen) según las instrucciones del fabricante, con la excepción de que no se realizó digestión de ADN. El ARN total se eluyó con 50 pL de agua sin ribonucleasa. El ARN total se cuantificó utilizando el espectrofotómetro ND-1000 Nanodrop®. La qRT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con retrotranscripción previa) se preparó por triplicado para cada muestra utilizando la mezcla maestra plus para RT qPCR de un paso (RT-QPRT-032X, Eurogentec), con ya sea cebadores de control y cebadores para la diana, más concretamente los ensayos de expresión génica TaqMan (20x colorante de sonda FAM™ (o VIC)-TAMRA (o MGB); Applied Biosystems) enumerados en la Tabla 1.

Gen Especie Kit de expresión génica TaqMan®

GUS beta Ser humano 4310888E-1012026

Gapdh Ser humano 4310884E-0904043

Cdkn1 a (p21) Ser humano Hs00355782 m1

BBC3 (puma) Ser humano Hs00248075_m1

Mdm2 Ser humano Hs01066930 m1

Farmacocinética

Preparación de muestras y método bioanalítico

Se determinaron las concentraciones del compuesto A en plasma y tejidos de forma simultánea mediante un ensayo de UPLC/MS-MS. Los tejidos se homogeneizaron en el mismo volumen de agua para HPLC (agua para cromatografía, Merck) utilizando el sistema Fast Prep®-24 (M.P. Biomedicals, Irvine, CA, EE. u U.). Tras la adición de 25 |jl de mezcla de patrón interno (1jg/ml) a alícuotas analíticas (25jl) de homogeneizados de plasma o tejidos, las proteínas se hicieron precipitar mediante la adición de 200jl de acetonitrilo. Los sobrenadantes se transfirieron a un vial nuevo. Tras la evaporación a sequedad, las muestras se redisolvieron en 60 jl de acetonitrilo/agua (1/1 v/v). Se separó una alícuota (5 jl) de esta disolución en una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (Waters™ con un tamaño de partícula de 1,7jm, 2,1 x 50mm) con una fase móvil que consistía en una mezcla de ácido fórmico al 0,1% en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (disolvente B). Se utilizó programación del gradiente con un flujo de 600jl/min. Después de equilibrar con un 95% de disolvente A, se inyectaron 5 jl de muestra. Tras un periodo de latencia de 0,25min, la muestra se eluyó con un gradiente lineal de un 5 - 100% de disolvente B a lo largo de un periodo de 0,65minutos que después se mantuvo durante 0,35minutos. La columna se preparó para la siguiente muestra reequilibrando a lo largo de 0,25minutos hasta las condiciones iniciales. El eluyente de la columna se introdujo directamente en la fuente de iones del espectrómetro de masas de cuadrupolo triple TQD™ (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.) controlado por el programa informático Masslynx™ 4.1. Se utilizó monitorización de reacciones múltiples con ionización por electronebulización en modo positivo (ESI ) para la detección por MS/MS del analito. Se utilizaron transiciones iónicas de precursor a producto de m/z 555,3 --□ m/z 329,2 para el compuesto A. Se fijó el límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) para el compuesto en 0,7ng/mL (CV y sesgo global menor del 30%). Se realizaron análisis de regresión y cálculos adicionales utilizando QuanLynx™ 4.1 (Micromass) y Excel™ 2007 (Microsoft). Las concentraciones de muestras desconocidas se retrocalcularon a partir de las relaciones de área de pico de analito/PI de una curva de calibrado construida utilizando muestras para el calibrado enriquecidas de plasma o tejido en blanco obtenido de animales tratados con vehículo.

Cálculo de los parámetros farmacocinéticos

Se calcularon las áreas bajo las curvas (AUC, por sus siglas en inglés) de la concentración plasmática frente al tiempo a partir de los valores medios con la regla del trapecio lineal y parámetros relevantes adicionales utilizando un modelo no compartimental para la dosificación extravascular (WinNonlin® Professional Versión 5.2, Pharsight corp., CA, EE. UU.).

Inmunohistoquímica

Todos los tejidos se procesaron hasta FFIP de acuerdo con procedimientos rutinarios y tras su fijación, se descalcificó el esternón de rata en tampón de Citrato/EDTA durante 5 días, con reemplazo del tampón cada 24h. Se realizaron cortes de 3 jm utilizando un micrótomo. Se realizó una inmunohistoquímica de la Caspasa-3 escindida y p21 en un inmunoteñidor automatizado XT de Ventana Discovery utilizando el reactivo OmniMap de anticuerpo secundario anti-Ig de ratón o conejo conjugado con HRP y el sistema cromogénico DAB ChromoMap (Ventana/Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). La recuperación del antígeno se realizó utilizando la disolución Cell Conditioning Discovery CC1 (Ventana/Roche Diagnostics) en condiciones suaves (95° 8min 100° 20min, para la Caspasa-3 escindida) o estándar (95° 8min 100° 36min, para p21). El anticuerpo primario se aplicó manualmente con la dilución deseada en diluyente de anticuerpo Dako y a continuación se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los controles negativos correspondientes se incubaron con AbD únicamente. La contratinción de los cortes se realizó utilizando hematoxilina (Ventana/Roche Diagnostics). Después del experimento de tinción automatizado, los portaobjetos se deshidrataron en una serie graduada de etanol, se clarificaron en xileno y se montaron en un medio de montaje Pertex.

En la Tabla 2 se describen los anticuerpos primarios utilizados para la inmunohistoquímica.

Tabla 2 Anticuerpos utilizados para la inmunohistoquímica___________________________

Anticuerpos Especie Clon Referencias Intervalo de dilución Mdm2 mAb de ratón SMP14 SC, cat. 965 1/200

p21 mAb de ratón SX118 Dako, cat. M7202 1/50

p21 mAb de ratón F-5 SC, cat.6246 1/50

Caspasa-3 escindida Ab policlonal - CST, cat. 9661 1/2000

de conejo (n.° de lote 37)

Caspasa-3 escindida mAb de 5A1E CST, cat.9664 1/200

conejo

Esta tabla muestra la fuente de los anticuerpos utilizados para la inmunohistoquímica, así como su dilución.

Hibridación de ARNm in situ

La hibridación in situ se realizó utilizando el kit de ensayo en FFIP QuantiGene ViewRNA (Affymetrix/Panomics) siguiendo el protocolo del fabricante. Affymetrix diseñó por encargo y sintetizó lotes de sondas específicas para un gen para los ARNm de Bbc3 (PUMA) y Ubc (Ubicuitina C) de rata. Se utilizaron sondas para Bbc3 en el tipo 1/Fast Red y sondas para Ubc en el tipo 6/Fast Blue. Los portaobjetos se procesaron siguiendo estrictamente el protocolo de QuantiGene. Se comprobó que las condiciones de prehibridación eran óptimas con 10min de ebullición en la disolución de pretratamiento (Affymetrix) y 10min de digestión con Proteasa QF (Affymetrix) a 40°C. Resumiendo, se realizaron cortes de cinco micrómetros, se fijaron en formaldehído al 10%, se desparafinaron y se rehidrataron. Con el fin de aumentar la accesibilidad a los ARNm, a continuación se hirvieron los portaobjetos en la solución de pretratamiento (Affymetrix) y se digirieron con proteasa QF (Affymetrix) en las condiciones óptimas. Posteriormente se hibridaron los cortes durante 3h a 40°C con sondas QuantiGene ViewRNA diseñadas por encargo contra Bbc3 y el gen de control Ubc. Se utilizó muestra sin sonda como control negativo según las recomendaciones del manual de Affymetrix. Después de la hibridación, las sondas libres se retiraron a continuación lavando con tampón de lavado (Affymetrix) mientras que las sondas unidas se amplificaron entonces según el protocolo de Affymetrix (amplificación de ADN ramificado) utilizando PreAmp (25mn a 40°C), a continuación moléculas de Amp (15mn a 40°C) y por último múltiples oligonucleótidos Label Probe conjugados con fosfatasa alcalina (LP-AP) para 15mn a 40°C. La detección de la señal de la sonda LP-AP de tipo 6 se realizó con sustrato Fast Blue (puntos azules, fluorescencia de Cy5) para 30mn a TA en la oscuridad, seguida de la detección de la señal de la sonda LP-AP de tipo 1 con sustrato Fast Red (puntos rojos, fluorescencia de Cy3) para 30mn a 40°C. Después de la detección de la señal, los portaobjetos se contratiñeron posteriormente con hematoxilina de Mayer, se lavaron y se montaron/taparon con cubreobjetos utilizando medio de montaje acuoso Ultramount (DAKO). Las imágenes se tomaron con un microscopio BX51 de Olympus equipado con una cámara en color ColorViewIII (Soft Imaging Sytem).

En la Tabla 3 se describen las sondas utilizadas para la HIS (hibridación in situ) de ARNm.

Tabla 3 Sondas utilizadas para la HIS de ARNm_________________________________________________________ Sondas__________________________________________Referencias______________________________________ Ubc (Ubicuitina C) de rata Affimetrix, cat.VC6-10047-1

Bbc3 (PUMA) de rata_______________________________ Affimetrix, cat. VC1-13801-1________________________

Ejemplo 1

Farmacocinética (PK) del compuesto A después de una única inyección i.v. en una dosis de 20 mg/kg

La Figura 1 muestra la concentración del Compuesto A en plasma, tumor e hígado a lo largo de 144 horas después de una única inyección i.v. El Tmáx para el compuesto fue de 5 min en plasma e hígado y de 1h en tumor. El Compuesto A tuvo una exposición del doble en tumor (AUC0-144h dn= 16,5 h.nmol/g) en comparación con plasma (AUC0-144h dn= 8,1 h.|jM). La Figura 2 muestra la concentración del Compuesto A en el tumor y la respuesta farmacodinámica (PD) en el tumor. Puma y p21 tuvieron una inducción de ARNm muy similar que alcanzaba una expresión máx con un factor de multiplicación de 180 y 20024h después del tratamiento, respectivamente.

Ejemplo 2

PK, PD, eficacia y tolerabilidad del compuesto A (i.v., una vez) en rata con tumor SJSA-1

Las Figuras 3 y 4 muestran, respectivamente, el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días. El tratamiento i.v. único con el compuesto A en una dosis de 20 mg/kg (la dosis más alta) indujo un 92% de remisión tumoral 14 días después del tratamiento. Se tuvo que sacrificar una rata el día 9 después del tratamiento debido a una pérdida de peso corporal (BW) excesiva. A pesar de una ligera disminución en el BW 3 días después del tratamiento para todas las demás ratas, estas se recuperaron rápidamente y engordaron durante todo el experimento. Solamente 2 de los 11 tumores tuvieron una respuesta incompleta y volvieron a crecer (Figura 5). Estos 2 animales se volvieron a tratar i.v. con una dosis de 15 mg/kg y los tumores seguían siendo sensibles. Sin embargo, la remisión tumoral se atenuó lo cual se pudo deber al mayor tamaño del tumor. Después del primer tratamiento, la expresión del ARNm de p21 y Puma en el tumor alcanzó un aumento con un factor de multiplicación de más de 50 en la expresión del ARNm. Mdm2 tuvo una inducción de ARNm mucho menor (Emáx= factor de multiplicación de 10). El día 59 después del primer tratamiento, todas las ratas se trataron i.v. con una dosis de 20 mg/kg con el fin de evaluar el efecto del fármaco sobre el hospedador. La exposición del compuesto A fue similar en el corazón, yeyuno, bazo, hígado y médula ósea pero el doble en el plasma (Cmáx desconocida). El máximo aumento en p21, Mdm2 y la Caspasa-3 escindida en el yeyuno y la médula ósea (esternón) siempre se observó 3 h después del tratamiento. Todas las tinciones volvieron a la situación inicial 7 días después del tratamiento. El aumento en la caspasa-3 escindida en el corte del yeyuno mostró una fuerte correlación con la inducción de ARNm de Puma (Bbc3) detectada mediante HIS de ARNm. De hecho, se observó el máximo aumento en Puma 3 horas después del último tratamiento con un retorno a la situación inicial 7 días después del tratamiento. La HIS del ARN mostró claramente que solo se tiñeron células crípticas en el corte de yeyuno. Ocurría lo mismo en el bazo y el corazón. Por último, se pudo observar mielodepresión grave 14 días después del tratamiento con recuperación parcial el día 22 (Figura 6). El recuento de leucocitos mostró que estaba correlacionado significativamente con la mielodepresión (R2=0,59, P=0,006, Figura 7). Esto indica que la dosificación intermitente puede mejorar la tolerabilidad debido a que permite que la médula ósea se recupere.

Ejemplo 3

PK, PD, eficacia y tolerabilidad del compuesto A (i.v., q3w) en rata con tumor SJSA-1

La Figura 8 muestra el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días. Tres semanas después del primer tratamiento con una dosis de 20 mg/kg, el compuesto A indujo un 6% de remisión tumoral en promedio. Sin embargo, los datos individuales muestran que 3 ratas tuvieron una respuesta completa (100% de remisión), 2 tuvieron una respuesta parcial (más del 50% de remisión), 1 tuvo cáncer estable y 1 tuvo progresión tumoral a pesar de una remisión inicial del 80% 1 semana después del tratamiento. Después del segundo tratamiento, el Compuesto A indujo el 100% de remisión tumoral pero solamente 2/7 animales sobrevivieron los 2 ciclos completos. De hecho, se tuvieron que sacrificar 5 ratas después del segundo tratamiento debido a una pérdida de BW excesiva: la primera 10 días después del segundo tratamiento y las otras cuatro otros 8 días después. La Figura 9 muestra el recuento de leucocitos (WBC), neutrófilos y trombocitos a lo largo de los 42 días del experimento. El Compuesto A indujo una disminución drástica en los WBC, neutrófilos y trombocitos después del primer tratamiento y la mayoría de las ratas solo se recuperaron parcialmente el día 21 después del tratamiento. En consecuencia, el segundo tratamiento hizo que los WBC, neutrófilos y trombocitos se redujeran hasta un nivel extremadamente bajo cercano a 0.

Ejemplo 4

La Figura 10 muestra el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días. El tratamiento con el Compuesto A en una dosis de 13,7 y 18,2 mg/kg pudo inducir una remisión tumoral del 66 y el 88% en promedio una semana después del tratamiento. Después de dos semanas, todos los tumores tratados con una dosis de 13,7 mg/kg habían vuelto a crecer y se decidió interrumpir este grupo de tratamiento. Tres semanas después del tratamiento con una dosis de 18,2 mg/kg, los tumores seguían remitiendo en un 36% con 2 respuestas completas. El efecto sobre el crecimiento tumoral tendía a ser menor después del segundo tratamiento, por término medio, los tumores evolucionaban en un 118% (Tabla 4) y los dos mismos tumores tuvieron respuestas completas. En consecuencia, el segundo tratamiento no incrementó el número de respuestas completas. En cuanto a la tolerabilidad, las ratas tuvieron una ligera pérdida de BW 3 días después del tratamiento, pero se recuperaron rápidamente y habían engordado para el siguiente tratamiento. De hecho, solamente una rata tuvo una pérdida de BW drástica durante el último día del experimento y no se puede determinar si estaba relacionada con el tratamiento. La Figura 11 muestra el recuento de leucocitos, neutrófilos y trombocitos a lo largo de los 42 días del experimento. El Compuesto A indujo una fuerte disminución en los WBC, neutrófilos y trombocitos después del primer tratamiento pero todas las ratas medidas se habían recuperado por completo el día 21 después del tratamiento. El segundo tratamiento tuvo un efecto similar sobre el recuento de células pero las ratas solamente se habían recuperado parcialmente el día 21 después del segundo tratamiento.

Tabla 4 Eficacia y tolerabilidad del Compuesto A después del tratamiento i.v. (q3w) de rata atímica con tumor SJSA-1 (SF480)___________________________________________________________________________________________ Tratamiento Tumor Hospedador

i.v., q3w 13,7 mg/kg 18,2 mg/kg 13,7 mg/kg 18,2 mg/kg Semana

después del ATvol RC ATvol (%) RC ABW (%) ^SuperviveABW (%) Supervive tratamiento (%) _nciancia 1 -66 ± 9 1/6 -80 ± 2 0/5 2,7 ± 0,9 6/6 2,5 ± 2,6 5/5 2 4 ± 37 0/6 -79 ± 11 2/5 7,5 ± 1,0 6/6 9,1 ± 1,9 5/5 3 - - -36 ± 37 2/5 - - 11,9 ± 2,7 5/5 5 - - 22 ± 63 2/5 - - 10,6 ± 2,3 5/5 6 - - 118± 104 2/5 - - 5,9 ± 7,9 5/5

Ejemplo 5

PK y PD con el Compuesto A en rata con tumor SJSA-1 después de una única administración oral (27 mg/kg) La Figura 12 muestra la concentración de fármaco en plasma, tumor e hígado a lo largo de 144 horas después de una única inyección oral del Compuesto A. El Tmáx para el compuesto fue de 3 horas (h) en todas las matrices. El Compuesto A mostró una exposición más alta en el tumor (AUC0-144h= 277,7 h.nmol/g) en comparación con el plasma (AUC0-144h= 111,5 h.|jM). La Figura 13 muestra la concentración de fármaco y la respuesta PD en el tumor. Puma y p21 tuvieron una inducción de ARNm similar que alcanzaba una Emáx con un factor de multiplicación de 162 y 180 48h después del tratamiento. Con dicha dosis v.o., Mdm2 tuvo una Emáx mucho menor (factor de multiplicación de 34).

Ejemplo 6

Eficacia en rata con tumor SJSA-1 con un régimen de dosificación 3qw (v.o.)

La Figura 14 muestra el crecimiento tumoral y el cambio en el peso corporal de ratas atímicas a lo largo de 42 días de tratamiento v.o. q3w con el compuesto A. Tres semanas después del primer tratamiento, ambas dosis pudieron inducir una remisión tumoral (27 y 88% para las dosis de 20 y 27 mg/kg respectivamente). Sin embargo, el efecto sobre el crecimiento tumoral tendía a mitigarse después del segundo tratamiento ya que solamente la dosis más alta pudo seguir induciendo una remisión tumoral (27% con la dosis de 27 mg/kg). Después del primer tratamiento, la Cmáx y AUC0-24h del compuesto A en sangre, y la expresión del ARNm de p21 y Puma en el tumor aumentaron positivamente y de forma dependiente de la dosis. Ambas dosis indujeron una ligera disminución en el peso corporal (BW) 3 días después de cada tratamiento pero todos los animales se recuperaron rápidamente y habían engordado 3 semanas después del tratamiento. La Figura 15 muestra el recuento de leucocitos y trombocitos a lo largo de los 42 días del experimento. El Compuesto A indujo una disminución dependiente de la dosis en los WBC, neutrófilos y trombocitos. Los WBC y los trombocitos se recuperaron por completo antes del segundo tratamiento con una dosis de 20 mg/kg. Para el tratamiento con una dosis de 27 mg/kg, los trombocitos también se recuperaron por completo pero los WBC solo parcialmente.

Ejemplo 7

Efecto de una dosis baja frente a una dosis alta

Se realizaron experimentos para evaluar la respuesta a una dosis alta y una dosis baja. Los animales se trataron con una dosis baja de 5 mg/kg v.o. o una dosis alta de 27 mg/kg v.o. o 20 mg/kg i.v. Una dosis baja de Mdm2i no desencadena el mismo efecto bioquímico que la dosis alta (Figura 16).

Ejemplo 8

La combinación del tratamiento con dosis alta y baja es muy sinérgica

Los experimentos se repitieron en ratas con tumor SJSA-1 con la combinación de dos pautas posológicas de compuesto A, una intermitente (15mg/kg una vez) y la dosificación diaria (1,5 mg/kg). En la Figura 17 se muestra que la combinación de dos regímenes de dosificación tiene un efecto muy sinérgico. Esta es una presentación esquemática de múltiples experimentos. También se puede observar una sinergia clara en las Figuras 18 y 19. La eficacia (Figura 18) en rata con tumor SJSA-1 y la tolerabilidad (Figura 19) se evaluó además con otras dosis y pautas posológicas diferentes (15 mg/kg q4w (día 0) 3mg/kg q24h 2sem con/2sem sin (día 1); 21 mg/kg q4w (día 0) 1,5mg/kg q24h 3sem con/1sem sin (día 1). Se mostró que la combinación de las pautas posológicas mejoraba la eficacia y podía incrementar la tolerabilidad, particularmente ya que se pueden utilizar dosis más bajas para conseguir aun así una mejor reducción del tamaño tumoral.

Ejemplo 9

Eficacia y tolerabilidad en rata con xenoinjerto derivado de un paciente (PDX, por sus siglas en inglés) de melanoma (vía oral)

Se repitieron los mismos experimentos en rata con PTX de melanoma. La eficacia (Figura 20) y la tolerabilidad (Figura 21) del compuesto A se evaluó con una dosis de 27 mg/kg q3w. La dosificación intermitente también mostró eficacia en modelos de melanoma.

Ejemplo 10

Eficacia del compuesto A administrado de forma intermitente en combinación con ceritinib en ratones con tumor SHSY5Y

Se llevaron a cabo experimentos similares con la administración de una combinación de Ceritinib y compuesto A a ratones. Los experimentos mostraron (Figura 22) que el Compuesto A se puede administrar cada semana cuando se combina con otro compuesto. Ceritinib con el Compuesto A semanalmente en una dosis de 120 mg/kg (40mg/kg x 3 cada 3 horas) dio como resultado un mejor efecto antitumoral en comparación con ceritinib solo o en comparación con una combinación de ceritinib Compuesto A a diario en una dosis de 20 mg/kg (n=5). Los ratones tienen una farmacocinética diferente a las ratas. Por lo tanto, la dosis se tuvo que administrar 3 veces cada 3 horas para conseguir las exposiciones requeridas. Teniendo en cuenta esta especificidad del modelo murino, particularmente un aclaramiento mucho mayor, los experimentos en ratones se pueden extrapolar a ratas y otros sujetos, y se cree que el modelo murino prueba que se podría conseguir al menos el mismo efecto en ratas u otros sujetos, particularmente seres humanos, incluso si el compuesto A se administrase al menos cada tres semanas.

Claims

REIVINDICACIONES

2. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el MDM2i se ha de administrar a un sujeto de forma intermitente y el periodo entre administraciones consecutivas es de 3 semanas.

3. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, mama, cerebro, cabeza y cuello, hígado, bucal, de las vías biliares, leucemia linfocítica aguda y crónica, leucemia mielógena aguda y crónica, leucemia mielomonocítica crónica, colorrectal, gástrico, estromal gastrointestinal, hepatocelular, glioma, linfoma, melanoma, mieloma múltiple, enfermedad mieloproliferativa, neuroendocrino, de pulmón, de pulmón no microcítico, pancreático, ovárico, prostático, de las células renales, sarcoma, liposarcoma y tiroideo.

4. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón o neuroblastoma.

5. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el cáncer es melanoma.

6. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el MDM2i se administra a un ser humano.

7. El MDM2i para su uso en el tratamiento del cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el MDM2i se selecciona del grupo que consiste en:

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(6-{metil-[4-(3-metil-4-oxoimidazolidin-1-il)-/ransciclohexilmetil]amino}piridin-3-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-1-(4-Clorofenil)-7-isopropoxi-6-metoxi-2-(5-{metil-[4-(3-metil-4-oxoimidazolidin-1-il)-/ransciclohexilmetil]amino}pirazin-2-il)-1,4-dihidro-2H-isoquinolin-3-ona,

(S)-5-(5-Cloro-1-metil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-ÍH-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona,

(S)-5-(5-Cloro-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-isopropil-5,6-dihidro-1H-pirrolo[3,4-d]imidazol-4-ona,

(S)-5-(3-cloro-4-fluorofenil)-6-(4-clorofenil)-2-(2,4-dimetoxipirimidin-5-il)-1-((R)-1-metoxipropan-2-il)-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-ona,

y

8. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con una cualqu¡era de las re¡v¡nd¡cac¡ones 1 a 5, en donde el MDM2¡ es

(S)-5-(5-Cloro-1-met¡l-2-oxo-1,2-d¡h¡drop¡r¡d¡n-3-¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-¡soprop¡l-5,6-d¡h¡dro-1H-p¡rrolo[3,4-d]¡m¡dazol-4-ona o

9. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con una cualqu¡era de las re¡v¡nd¡cac¡ones 1 a 5, en donde el MDM2¡ es (S)-5-(5-Cloro-1-met¡l-2-oxo-1,2-d¡h¡drop¡r¡d¡n-3-¡l)-6-(4-clorofen¡l)-2-(2,4-d¡metox¡p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)-1-¡soprop¡l-5,6-d¡h¡dro-1H-p¡rrolo[3,4-cf]¡m¡dazol-4-ona.

10. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con una cualqu¡era de las re¡v¡nd¡cac¡ones 1 a 9, en donde el MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer comprende además otro ¡ngred¡ente farmacéut¡co que se ha de adm¡n¡strar a un pac¡ente.

11. El MDM2¡ para su uso en el tratam¡ento del cáncer de acuerdo con la re¡v¡nd¡cac¡ón 10, en donde el otro ¡ngred¡ente farmacéut¡co es otro agente ant¡neoplás¡co.