ES2835124T3 - Péptido para la regeneración de la piel o el tratamiento de heridas y utilización del mismo - Google Patents

Abstract

Péptido que consiste en aminoácidos representados mediante SEC ID nº 1 o 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido para la regeneración de la piel o el tratamiento de heridas y utilización del mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un péptido para la regeneración de la piel o la curación de heridas y a la utilización del mismo.

La presente invención se llevó a cabo mediante el número de proyecto 1711030975 bajo el apoyo del departamento gubernamental de Corea, la organización de gestión de investigación del proyecto es la Korea Research Foundation, el nombre del negocio de investigación es el de negocio de descubrimiento de materiales creativos, el nombre del proyecto de investigación es el desarrollo de materiales de regeneración de la piel biodegradables basados en tecnología inmunitaria funcional, y el periodo de investigación es de 4 de diciembre de 2015 a 30 de abril de 2016.

Antecedentes de la técnica

La piel es la barrera principal del cuerpo humano y protege los órganos corporales de la estimulación causada por medios externos, tales como la temperatura, un cambio en la humedad, la radiación ultravioleta y los contaminantes, y desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis, tal como la regulación de la temperatura corporal. La queratina, que está situada en la parte más externa de la piel, es un tejido formado por una modificación de las células de la piel y consiste en células completamente muertas. Las capas celulares gruesas formadas en el tejido conectivo dérmico de la dermis no presentan la vitalidad de las células hacia la epidermis y resultan modificadas en capas celulares sólidas y uniformes. La piel, con esta estructura, sirve de línea de defensa que preserva la humedad del cuerpo desde la cara más externa y lo defiende de la entrada de diversas sustancias desde el exterior. Es decir, al lesionar la superficie de la piel, la capacidad de regeneración rápida de la epidermis estimula la recuperación de la herida, evitando de esta manera una infección adicional a través de la herida y reduciendo la cicatrización de la superficie de la piel.

Al reconstruir el tejido dañado de la piel, se producen diversas reacciones y, particularmente, participan la migración, la proliferación y diferenciación de los queratinocitos, el desprendimiento de las células dañadas y la producción de tejido epitelial. El proceso de cicatrización de heridas es una reacción muy compleja que implica diversas células y factores y, en primer lugar, se agregan las plaquetas en el sitio de la herida y se liberan diversos factores de proliferación celular, tales como un factor de transfección, un factor proliferativo derivado de plaquetas y un factor proliferativo de las células epiteliales, estimulando células del endotelio vascular, fagocitos, fibroblastos y células epiteliales, estimulando de esta manera la proliferación celular. Simultáneamente, mientras estas células mismas producen de manera autosecretora y secretan sustancias tales como factores de proliferación fibroblástica, factores de crecimiento transformante, interleucinas y otras sustancias, se produce el mecanismo de cicatrización de la herida.

Actualmente, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se utiliza ampliamente como agente terapéutico de heridas debido a sus diversas actividades, se obtiene mediante purificación o se obtiene mediante sobreexpresión en bacterias. Conseguir la purificación directa requiere mucho tiempo, dinero y trabajo. Además, el método de sobreexpresión en bacterias adolece del problema de que el rendimiento de recuperación es muy bajo debido al bajo nivel de expresión en las células y los enzimas proteolíticos de las bacterias. Además, el EGF se ha informado de que muestra un bajo efecto terapéutico sobre los sitios de herida crónica y ha resultado difícil de comercializar debido al elevado precio, por una eficiencia dependiente de la temperatura, y una corta semivida debido a los enzimas proteolíticos.

Bajo dichos antecedentes, se ha requerido el desarrollo de un nuevo agente terapéutico con un efecto terapéutico eficaz, que minimice simultáneamente los efectos secundarios de los fármacos convencionales para la regeneración de la piel y la cicatrización de las heridas y se ha estudiado activamente (publicación de patente coreana n° 10-2015-0135743), aunque todavía no resulta suficiente.

Divulgación

Problema técnico

La presente invención se ha llevado a cabo en un esfuerzo por resolver los problemas anteriormente indicados y los presentes inventores han realizado estudios exhaustivos sobre formulaciones para la generación de piel o la cicatrización de heridas a fin de preparar un péptido que consiste en 15 aminoácidos o menos y han confirmado la potenciación de la cantidad producida de colágeno en fibroblastos dérmicos, la cantidad producida de melanina en células de melanoma y el efecto de inhibición de la actividad de tirosinasa bajo tratamiento con el péptido, y han completado la presente invención basada en lo anterior.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un péptido para la regeneración de la piel o cicatrización de heridas, que consiste en el aminoácido representado por la SEC ID n° 1 o n° 2.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para la cicatrización de heridas, que contiene el péptido o un polinucleótido que codifica el péptido como principio activo.

Todavía otro objetivo de la presente invención es proporcionar una composición cosmética para la mejora de la regeneración de la piel que contiene el péptido como un principio activo.

Solución técnica

Para conseguir el objetivo, en un aspecto, la presente invención proporciona un péptido que consiste en el aminoácido representado mediante la SEC ID n° 1 o n° 2.

En una forma de realización preferida, un extremo N o C del péptido puede unirse a un grupo protector que se selecciona de entre el grupo que consiste en un grupo acetilo, un grupo fluorenilmetoxi-carbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoílo, un grupo miristilo, un grupo estearilo y un grupo polietilenglicol (PEG).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la cicatrización de heridas, que contiene el péptido o un polinucleótido que codifica el péptido como un principio activo.

En una forma de realización preferida, el péptido puede encontrarse contenido a una concentración de entre 1 y 500 ng/ml.

En otra forma de realización preferida, la herida puede ser un corte.

En todavía otra forma de realización preferida, la composición puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable.

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una composición cosmética para la mejora de la regeneración de la piel que contiene el péptido como un principio activo.

En una forma de realización preferida, la composición puede encontrarse en forma de suspensión, emulsión, pasta, gel, crema, loción, polvos, cera o pulverización.

En otra forma de realización preferida, la composición puede presentar una actividad blanqueadora de la piel. Efectos ventajosos

El nuevo péptido según la presente invención no sólo estimula la cicatrización de heridas mediante el incremento de la cantidad producida de colágeno en fibroblastos dérmicos, sino que también presenta un excelente efecto blanqueador mediante la inhibición de la cantidad producida de melanina y de la actividad de tirosinasa de las células de melanoma, y consiste en péptidos con un tamaño muy pequeño para minimizar los efectos secundarios de acuerdo con la administración de sustancias externas de péptidos muy pequeños. Como resultado, se espera que el nuevo péptido pueda utilizarse como una sustancia activa que pueda sustituir la regeneración de la piel existente o los agentes terapéuticos de heridas.

Descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra el resultado de medición de la cantidad de procolágeno producida en fibroblastos dérmicos humanos según el tratamiento con péptido 1 de la presente invención.

La figura 2 ilustra el resultado de medición de la cantidad de Col1A1 producida en fibroblastos dérmicos humanos según el tratamiento con péptido 1 de la presente invención.

La figura 3 ilustra el resultado de medición de la cantidad de melanina producida en células de melanoma según el tratamiento con péptido 1 de la presente invención.

La figura 4 ilustra el resultado de la evaluación de la actividad de tirosinasa de células de melanoma según el tratamiento con péptido 1 de la presente invención.

La figura 5 ilustra el resultado de confirmación del efecto de cicatrización de heridas en un modelo in vitro de herida según el tratamiento con péptido 1 de la presente invención.

La figura 6 ilustra el resultado de confirmación del efecto de cicatrización de heridas en un modelo in vitro de herida según el tratamiento con péptido 2 de la presente invención.

La figura 7 ilustra el resultado de la cuantificación y evaluación del efecto de cicatrización de heridas en un modelo in vitro de herida según el tratamiento con péptido 1 de la presente invención.

La figura 8 ilustra el resultado de la cuantificación y evaluación del efecto de cicatrización de heridas en un modelo in vitro de herida según el tratamiento con péptido 2 de la presente invención.

La figura 9 ilustra el resultado de confirmación del efecto de cicatrización de heridas en un modelo animal de corte agudo según el tratamiento con péptido 1 o 2 de la presente invención.

La figura 10 ilustra el resultado de la cuantificación y evaluación del efecto de cicatrización de heridas en un modelo animal de corte agudo según el tratamiento con péptido 1 o 2 de la presente invención.

La figura 11 ilustra el resultado de confirmación de un cambio en el tejido de la piel mediante tinción H+E en un modelo animal de corte agudo según el tratamiento con péptido 1 o 2 de la presente invención.

Modos de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. A continuación en la presente memoria se describe en detalle la presente invención.

La presente invención proporciona un péptido que consiste en el aminoácido representado mediante la SEC ID n° 1 o n °2.

En la presente invención, el “péptido” se refiere a un polímero que consiste en dos o más aminoácidos unidos mediante un enlace amida (alternativamente, un enlace peptídico) y se refiere a un péptido que presenta actividad de regeneración de la piel o de cicatrización de heridas para el propósito de la presente invención. En los diversos estudios sobre un agente terapéutico peptídico, existe la desventaja de que el péptido es excesivamente grande para introducirse eficazmente en tejidos o células diana, o presenta una corta semivida y desaparece en el cuerpo en un periodo corto. En consecuencia, la presente invención presenta el significado técnico de que se establece por primera vez un nuevo péptido que consiste en 20 aminoácidos o menos y que además presenta un efecto terapéutico eficaz.

El péptido de la presente invención puede consistir en un aminoácido representado mediante la SEC ID n° 1 o n° 2 y adicionalmente puede incluir una secuencia de aminoácidos preparada para el propósito específico de incrementar una secuencia de direccionamiento, una etiqueta, un residuo marcado, la semivida o la estabilidad del péptido. Por ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales en la secuencia de aminoácidos o polinucleótida del péptido a fin de mejorar adicionalmente la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del péptido. Entre dichas modificaciones se incluyen la deleción, la inserción y/o la sustitución de residuos de la secuencia de aminoácidos del péptido y se llevan a cabo basándose en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la carga, el tamaño y similares. Mediante el análisis del tamaño, carga y tipo de sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, puede observarse que la arginina, la lisina y la histidina son todos residuos de carga positiva; la alanina, la glicina y la serina presentan tamaños similares, y la fenilalanina, el triptófano y la tirosina presentan formas similares. De acuerdo con lo anterior, basándose en dichas consideraciones, la arginina, lisina e histidina; la alanina, glicina y serina, y la fenilalanina, triptófano y tirosina pueden referirse a equivalentes biológicamente funcionales.

Además, el péptido de la presente invención puede obtenerse mediante diversos métodos bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, el péptido puede prepararse mediante recombinación del polinucleótido y sistemas de expresión de proteínas o síntesis in vitro mediante síntesis química, tal como síntesis peptídica y síntesis de proteínas libre de células.

Además, para obtener una mejor estabilidad química, propiedades farmacológicas potenciadas (semivida, capacidad de absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un espectro amplio de actividad biológica) y antigenicidad reducida, un grupo protector puede unirse a un extremo N o C del péptido. Preferentemente, el grupo protector puede ser un grupo acetilo, un grupo fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoílo, un grupo miristilo, un grupo estearilo o un grupo polietilenglicol (PEG), aunque puede incluir cualquier ingrediente capaz de potenciar la modificación del péptido, particularmente la estabilidad del péptido, sin limitación. El término “estabilidad” utilizado en la presente invención se refiere a la estabilidad de almacenamiento (por ejemplo, la estabilidad de almacenamiento a temperatura ambiente), así como la estabilidad in vivo que protege el péptido de la presente invención del ataque un enzima de corte proteico in vivo.

En la presente invención, “polinucleótido” es un polímero al que se une un nucleótido y sirve para transmitir información genética. Para el propósito de la presente invención, el polinucleótido codifica el péptido de la SEC ID n° 1 o n° 2.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la cicatrización de heridas, que contiene el péptido o un polinucleótido que codifica el péptido como un principio activo: un uso cosmético para la regeneración de la piel.

El término “tratamiento” utilizado en la presente invención se refiere a todas las acciones para mejorar o modificar beneficiosamente los síntomas de la herida mediante la administración de la composición farmacéutica según la presente invención.

En la presente invención, el “sujeto” se refiere a un sujeto que requiere tratamiento de la herida, y más específicamente, se refiere a primates humanos o no humanos, y a mamíferos, tales como ratones, perros, gatos, caballos y vacas.

La expresión “regeneración de la piel” utilizada en la presente invención se refiere a una serie de reacciones en las que se reconstituye un tejido de la piel en respuesta a un envejecimiento global de la piel y un estímulo externo inducido en la piel, y a título de un ejemplo, muestra un blanqueamiento de la piel, una mejora de la elasticidad de la piel y efectos de mejora de las arrugas. El “blanqueamiento de la piel” se refiere no sólo a que proporciona mayor brillo a la piel mediante la inhibición de la síntesis del pigmento melanina, aunque también mejorando la hiperpigmentación de la piel, tal como manchas o pecas causadas por radiación ultravioleta, hormonas o factores hereditarios.

El término “herida” utilizado en la presente invención se refiere a un fenómeno en el que los tejidos resultan dañados por estímulos externos y la cicatrización general de las heridas habitualmente es acompañada por procesos tales como la degeneración y muerte de células, planocitos de tejidos circundantes, efusión de líquidos tisulares y precipitación de fibrina y formación de tejido de granulación. Para el propósito de la presente invención, el tratamiento de la herida se refiere a ayudar a la reconstitución de tejido de piel normal mediante la estimulación de los procesos indicados anteriormente. Además, la herida puede ser preferentemente un corte, aunque no se encuentra limitada al mismo.

Según una forma de realización de la presente invención, se prepararon dos tipos de péptido (péptido 1 y péptido 2) (ver el ejemplo 1) y mediante el tratamiento con el péptido, se incrementó la cantidad producida de colágeno para estimular la cicatrización de heridas y se inhibieron la producción de melanina y la actividad de tirosinasa de la estirpe celular de melanoma B16F10, confirmando un excelente efecto blanqueador (ver los ejemplos 2 a 4). Además, mediante la utilización de un ensayo de raspado y un modelo animal de corte agudo, pudo confirmarse un excelente efecto de tratamiento de las heridas (reducción de las heridas) del péptido (ver los ejemplos 5 y 6) y el péptido puede ser ampliamente utilizado como sustancia activa y agente blanqueador de la piel que puede sustituir a las formulaciones actuales para la regeneración de la piel o la cicatrización de heridas.

Además, el péptido o el polinucleótido codificante del péptido de la presente invención puede administrarse en un portador farmacéuticamente aceptable, tal como una suspensión coloidal, polvos, solución salina, lípido, liposoma, microesferas o partículas nanoesféricas. El péptido o el polinucleótido puede formar un complejo con un portador o asociado con el portador y puede administrarse in vivo utilizando un sistema de administración que sea conocido de la técnica, tal como lípidos, liposomas, micropartículas, oro, nanopartículas, polímeros, reactivos de condensación, polisacáridos, poliaminoácidos, dendrímeros, saponinas, potenciadores de adsorción o ácidos grasos.

Además, el portador farmacéuticamente aceptable incluye lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, acacia, caucho, fosfato cálcico, alginato, gelatina, silicato cálcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio, aceite mineral y similares, que se utilizan generalmente en formulación, aunque sin limitarse a los mismos. Además, la composición farmacéutica puede incluir además lubricantes, agentes humectantes, edulcorantes, saborizantes, emulsionantes, suspensiones, conservantes y similares, además de los ingredientes.

Para el propósito de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención puede contener preferentemente el péptido de la presente invención a una concentración de entre 1 y 500 ng/ml para el efecto de regeneración de la piel, aunque no se encuentra limitada al mismo, con la condición de que la concentración pueda predecir un efecto terapéutico eficaz sin citotoxicidad.

La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral (por ejemplo, por vía intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o tópica) dependiendo del método deseado, y la dosis varía según el estado y el peso del paciente, el grado de la enfermedad, el tipo de fármaco y la vía y tiempo de administración, aunque puede ser seleccionado convenientemente por el experto en la materia.

En particular, en el caso de que se utilice la composición farmacéutica de la presente invención como preparación externa dérmica, la composición farmacéutica puede contener adicionalmente un adyuvante comúnmente utilizado en el campo de la dermatología, tal como cualquier otro ingrediente utilizado comúnmente en una preparación externa dérmica, incluyendo una sustancia grasa, un solvente orgánico, un solubilizador, un espesante y un agente gelificante, un suavizante, un antioxidante, un agente de suspensión, un estabilizador, un agente espumante, un perfume, un tensioactivo, agua, un emulsionante iónico, un emulsionante no iónico, un relleno, un agente de secuestro, un agente quelante, un conservante, vitaminas, un agente de bloqueo, un agente humectante, aceite esencial, un tinte, un pigmento, un agente activo hidrófilo, un agente activo lipófilo o una vesícula lipídica. Además, los ingredientes pueden introducirse con cantidades utilizadas comúnmente en el campo de la dermatología. Además, la composición farmacéutica se proporciona como la preparación externa dérmica, aunque no se encuentra limitada a la misma, y puede ser una formulación, tal como una pomada, un parche, un gel, una crema o una pulverización.

La composición farmacéutica de la presente invención se administra con una dosis farmacéuticamente eficaz. En la presente invención, la “dosis farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad que resulta suficiente para tratar las enfermedades en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable al tratamiento médico, y un nivel de dosis eficaz puede determinarse según elementos entre los que se incluyen el tipo de enfermedad del paciente, la gravedad, la actividad del fármaco, la sensibilidad al fármaco, el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de emisión, la duración del tratamiento y los fármacos utilizados simultáneamente y otros elementos bien conocidos en el campo médico. La composición farmacéutica según la presente invención puede administrarse en forma de un agente terapéutico individual o en combinación con otros agentes terapéuticos; puede administrarse simultánea, separada o secuencialmente con agentes terapéuticos existentes, y puede administrarse en una o en múltiples dosis. Resulta importante administrar una cantidad capaz de obtener el efecto máximo con la mínima cantidad de efectos secundarios, mediante consideración de todos los elementos, y la cantidad podrá ser fácilmente determinada por el experto en la materia.

En particular, la dosis eficaz de la composición farmacéutica según la presente invención puede variar según la edad, género, estado y peso del paciente, la absorción de los principios activos en el cuerpo, la tasa de inactivación, la tasa de excreción, el tipo de enfermedad y los fármacos agrupados, y puede incrementarse o reducirse según la vía de administración, la gravedad de la obesidad, el género, el peso, la edad y similares.

Además, en todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una composición alimentaria/cosmética nutracéutica para la mejora del envejecimiento de la piel o las heridas, que contiene el péptido o un polinucleótido codificante del péptido como un principio activo.

El término “mejora” utilizado en la presente invención se refiere a todas las acciones que por lo menos reducen los parámetros asociados a una afección tratada, por ejemplo el grado de los síntomas. En este momento, la composición cosmética puede utilizarse simultánea o separadamente con el fármaco para el tratamiento antes o después de la aparición de las enfermedades relacionadas, a fin de prevenir o mejorar el envejecimiento de la piel o una herida.

La composición cosmética de la presente invención puede prepararse mediante cualquier formulación que se prepare generalmente en la técnica y, por ejemplo, puede formularse en una solución, una suspensión, una emulsión, una pasta, un gel, una crema, una loción, unos polvos, un jabón, un limpiador que contiene tensioactivo, un aceite, una base de polvos, una base de emulsión, una base de cera, pulverización y similares, aunque no se encuentra limitada a los mismos. Más particularmente, la composición cosmética de la presente invención puede prepararse mediante la formulación de loción en emulsión, loción nutritiva, crema nutritiva, crema de masaje, esencia, crema ocular, crema limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, paquete, pulverización o polvos.

El portador eficaz contenido en la composición cosmética de la presente invención puede utilizarse como un portador utilizado generalmente en la técnica dependiendo de la formulación. En el caso de que la formulación de la presente invención sea una pasta, crema o gel, como ingrediente portador, puede utilizarse aceite animal, aceite vegetal, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, silicona, bentonita, sílice, talco, óxido de cinc o similares.

En el caso de que la formulación de la presente invención sean polvos o una pulverización, como ingrediente portador puede utilizarse lactosa, talco, sílice, hidróxido de aluminio, silicato cálcico o polvos de poliamida. Particularmente, en el caso de la pulverización, puede incluirse adicionalmente un propelente, tal como clorofluorocarbono, propano/butano o éter dimetílico.

En el caso de que la formulación de la presente invención sea una solución o emulsión, como ingrediente portador se utiliza un solvente, un agente de disolución o un agente emulsionante y se incluye, por ejemplo, agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilglicol, éster alifático de glicerol, polietilenglicol o éster de ácido graso de sorbitán.

En el caso de que la formulación de la presente invención sea una suspensión, como ingrediente portador, puede utilizarse un diluyente líquido, tal como agua, etanol o propilenglicol, una suspensión tal como alcohol isostearílico etoxilado, éster de sorbitol polioxietilenado y éster de sorbitán polioxietilenado, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agarosa o tragacanto.

En el caso de que la formulación de la presente invención sea un limpiador que contiene tensioactivo, como ingrediente portador puede utilizarse sulfato de alcohol alifático, éter sulfato de alcohol alifático, monoéster de sulfosuccinato, isetionato, derivados de imidazolinio, taurato de metilo, sarcosinato, éter sulfato de amida de ácido graso, alquil-amido-betaína, alcohol alifático, glicérido de ácido graso, dietanolamida de ácido graso, aceite vegetal, derivados de lanolina, éster de ácido graso de glicerol etoxilado o similar.

Los ingredientes contenidos en la composición cosmética de la presente invención pueden contener ingredientes que se utilizan generalmente en la composición cosmética además de los principios activos y los ingredientes portadores y, por ejemplo, puede contener adyuvantes generales, tales como antioxidantes, estabilizadores, solubilizadores, vitaminas, pigmentos y fragancias.

En adelante en la presente memoria, se proponen ejemplos preferidos para ayudar a la comprensión de la presente invención. Sin embargo, los ejemplos siguientes se proporcionan a fin de entender mejor la presente invención y el contenido de la presente invención no se encuentra limitado por los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de péptido.

En el ejemplo 1, se prepararon los péptidos en la tabla 1. Después, los péptidos sintetizados se purificaron utilizando una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC SHIMADZU Prominence) y la columna utilizada fue una columna C18 Shiseido capcell pak (4,6 x 50 mm). Además, se confirmó la masa del péptido sintetizado utilizando un espectrómetro de masas (LC/MSD serie HP 1100).

Habla 11

Ejemplo 2. Evaluación de la capacidad de producción de colágeno de fibroblastos dérmicos humanos.

El colágeno es el ingrediente principal de los tejidos conectivos de la piel y una expresión incrementada de colágeno resulta esencial en la cicatrización de heridas, tales como un corte, o la regeneración de la piel. Como resultado, en el ejemplo 2, se evaluó la capacidad de producción de colágeno de los fibroblastos dérmicos humanos (FDH) según el tratamiento con el péptido (péptido 1) preparado en el ejemplo 1, mediante el método experimental dado a conocer en el documento existente (J. Biol.Chem. 268(14): 9941-9944, 1993). En primer lugar, se cultivaron fibroblastos dérmicos humanos en un medio DMEM con adición de albúmina de feto bovino al 10% (FBS) y las células en cultivo se dividieron en una placa de 6 pocillos a una concentración de 2x105 células/pocillo y se cultivaron durante 24 horas y después se sustituyó el medio por FBS al 2%. Transcurridas 24 horas desde lo anterior, las células se trataron con el péptido (100, 10, 1 ng/ml) de la presente invención y después se midió la cantidad de procolágeno secretada al medio de cultivo mediante la utilización de un kit de EIA de péptido C del procolágeno de tipo I (PIP), se extrajo el ARN con un reactivo de Trizol y después se confirmó la expresión de ARNm de Col1A1 (colágeno de tipo I, alfa 1) en los fibroblastos dérmicos humanos mediante PCR en tiempo real. Además, un grupo no tratado por separado (Control) se utilizó como un grupo de control y un grupo tratado con TGF (TGF-) se utilizó como grupo de control positivo.

Como resultado, tal como se ilustra en las figuras 1 y 2, puede observarse que en el grupo tratado con el péptido de la presente invención, la cantidad secretada de procolágeno se incrementó respecto al grupo de control y el grupo tratado con TGF, y la expresión de Col1A1 se incrementó significativamente a una concentración de 10 ng/ml o superior. A partir del resultado puede observarse que el péptido de la presente invención indujo la generación de colágeno, contribuyendo a la estimulación de la generación de la piel o la cicatrización de heridas.

Ejemplo 3. Evaluación de la capacidad de producción de melanina de los melanocitos.

El color de la piel está determinado por la cantidad de pigmento melanina producido por los melanocitos y se han llevado a cabo muchos estudios para mejorar la pigmentación anormal de la piel. En particular, la pigmentación excesiva causada por cortes crónicos se considera un problema médico importante, aunque todavía no se ha desarrollado ningún método de tratamiento definitivo. De esta manera, en el ejemplo 2, se ha evaluado la capacidad de producción de melanina de una estirpe celular de melanoma según el tratamiento con el péptido (péptido 1) preparado en el ejemplo 1, mediante el método experimental dado a conocer en el documento existente (Life Sci.

93(5-6):226-32, 14 de agosto, 2013). La estirpe celular de melanoma B16F10 se cultivó en medio DMEM con adición de albúmina de feto bovino al 10% y las células en cultivo se dividieron en una placa de 12 pocillos a una concentración de 1*105 células/pocillo. Tras el cultivo durante 24 horas, se trataron con a-MSH (10 pM) estimulante de la síntesis de melanina y el péptido (1, 10 y 100 ng/ml) de la presente invención y se cultivaron nuevamente durante 24 horas; se añadieron 200 pl de una solución de NaOH 1 N tras el lavado de cada pocillo con PBS y después se disolvieron a 100°C durante 30 minutos. Después, se midió la absorbancia a 405 nm con un lector ELISA para confirmar la cantidad de melanina producida a partir de la estirpe celular de melanoma. Además, un grupo no tratado se utilizó como un grupo de control y un grupo tratado con a-MSH se utilizó como grupo de control positivo.

Como resultado, tal como se ilustra en la figura 3, se produjo una gran cantidad de melanina a partir de la estirpe celular de melanoma en el grupo tratado con a-MSH, mientras que la cantidad producida de melanina se redujo en gran medida en el grupo tratado con el péptido de la presente invención y particularmente no se observó ninguna diferencia significativa respecto a un grupo no tratado con a-MSH. A partir del resultado pudo observarse que el péptido de la presente invención presentaba un efecto blanqueador de la piel de acuerdo con la inhibición de la producción de melanina.

Ejemplo 4. Evaluación de la actividad de tirosinasa de las células de melanoma.

La tirosinasa, un enzima regulador de la velocidad que cataliza la reacción en el proceso de biosíntesis de la melanina, es conocido que desempeña un papel crucial en la regulación de la cantidad de melanina en las células. De esta manera, en el ejemplo 4, la capacidad de la estirpe celular de melanoma según el tratamiento con el péptido (péptido 1) preparado en el ejemplo 1 se evaluó mediante un método experimental dado a conocer en el documento existente (Life Sci. Sci.Vol. 57:170-177, 2010). La estirpe celular de melanoma B16F10 se dividió en una placa de 12 pocillos a una concentración de 1x105 células/pocillo y se cultivó durante 24 horas y después se trató con a-MSH (1M) y el péptido de la presente invención (1, 10 y 100 ng/ml), se cultivó nuevamente durante 24 horas y después se lavó con PBS y se suspendió en un tampón de fosfato 50 mM (pH 6,8) que contenía Triton X-100 al 1% tras el lavado de cada pocillo con PBS. Tras agitar con vórtex, las células se congelaron a 80°C durante 30 minutos, se disolvieron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 1000 g durante 10 minutos y después se añadieron 40 pl de un sobrenadante y 100 pl de L-DOPA 10 mM a una placa de 96 pocillos y se hicieron reaccionar a 37°C. Después, la absorbancia se midió a 405 nm con un lector ELISA a fin de confirmar la actividad de tirosinasa de la estirpe celular de melanoma. Además, un grupo no tratado separado se utilizó como un grupo de control y un grupo tratado con a-MSH y se utilizó como grupo tratado con ácido de Kojic a modo de grupo de control positivo.

Como resultado, tal como se ilustra en la figura 4, la actividad de tirosinasa de la estirpe celular de melanoma se incrementó mucho en el grupo tratado con a-MSH, mientras que la actividad enzimática se redujo en gran medida en el grupo tratado con el péptido de la presente invención y no se observó ninguna diferencia significativa respecto al grupo tratado con ácido de Kojic que presentaba actividad de inhibición de tirosinasa. A partir del resultado pudo observarse que el péptido de la presente invención presentaba un efecto blanqueador de la piel de acuerdo con la inhibición de la actividad de tirosinasa.

Ejemplo 5. Confirmación del efecto de tratamiento de heridas utilizando un modelo in vitro de cicatrización de heridas.

En el ejemplo 5, el efecto de tratamiento de heridas de acuerdo con el tratamiento con los péptidos (péptidos 1 y 2) preparados en el ejemplo 1 se confirmó mediante un ensayo de raspado. Una estirpe celular epitelial humana, HaCaT, se cultivó durante 2 horas mediante la adición de mitomicina C (10 pg/ml) en un medio sin suero para inducir una herida por arañazo. Tras tratar las células con el péptido (1 o 10 ng/ml) y TGF-p (1 ng/ml) como grupo de control positivo en un medio con adición de FBS al 10%, se observó la capacidad de migración de las células durante el tiempo y se cuantificó la reducción del tamaño de la herida.

Como resultado, tal como se ilustra en las figuras 5 y 6, se confirmó que la migración de las células HaCaT se incrementaba de manera dependiente de la concentración de péptido en el grupo tratado con el péptido de la presente invención. Además, como resultado de la cuantificación y evaluación del tamaño de la herida, tal como se ilustra en las figuras 7 y 8, se confirmó una reducción significativa del tamaño de la herida de acuerdo con el tratamiento con péptido 1 o péptido 2 y, particularmente, el efecto del péptido 2 fue más notable y se observó un efecto definitivo de reducción de las heridas incluso a una concentración relativamente baja (1 ng/ml), así como a una concentración elevada (10 ng/ml).

Ejemplo 6. Confirmación del efecto de tratamiento de heridas utilizando un modelo animal de herida aguda.

En el ejemplo 6, el efecto de tratamiento de heridas de acuerdo con el tratamiento con los péptidos (péptidos 1 y 2) preparados en el ejemplo 1 se confirmó in vivo utilizando un modelo animal de heridas agudas.

6-1. Confirmación del cambio de tamaño de las heridas.

Tras anestesiar un ratón desnudo Balb/c de 8 semanas de edad con avertina (al 2,5%), se cortó la piel del lomo del animal mediante la utilización de un punzón circular de 10 mm de diámetro a fin de inducir una herida aguda. Se trató con péptido (500 ng/una vez) el sitio de corte en total 5 veces a intervalos de 24 horas en el sitio de la corte y se midió la reducción de la superficie de herida con el tiempo durante 14 días y se utilizó un EGF (factor de crecimiento epidérmico) como grupo de control positivo (10 pg/una vez). En dicho caso, el péptido se trató con Pluronic F-127 al 20% (PBS) en un estado de mezcla y se midieron los tamaños de las heridas durante el tiempo y se digitalizaron utilizando una cámara digital y el programa ImageJ y se compararon entre sí.

Como resultado, tal como se ilustra en las figuras 9 y 10, podía observarse que, al tratar con péptido 1 o péptido 2, se obtenía una reducción del tamaño de la herida similar o mejor al del control positivo. En particular, debido a que el péptido 2 presenta un peso molecular dos veces mayor que la forma dimérica del péptido 1, aunque se utilizó el péptido 2 a una concentración más baja que el péptido 1 en el tratamiento, pudo observarse que el péptido 2 presentaba un efecto excelente en comparación con el caso tratado con el péptido 1 y un excelente efecto de tratamiento de la herida en comparación con el grupo de control positivo.

6-2. Confirmación del cambio histológico.

Se indujo una herida aguda de la misma manera que en el ejemplo 6-1 y se cortó el tejido de la piel el día 5 después de la inducción de la herida aguda a fin de preparar fragmentos de tejido. Después, se observaron los cambios histológicos de acuerdo con el tratamiento con péptido, mediante tinción de H+E y observación de la tinción de H+E con un microscopio. Además, se utilizó EGF como un grupo de control positivo.

Como resultado, tal como se ilustra en la figura 11, en los tejidos tratados con péptido 1 y péptido 2, los grosores de las capas de epidermis y dermis eran mayores que los de un grupo de control negativo de PBS, al igual que el grupo de control positivo. Además, la epitelización también avanzó activamente, y se confirmaron las opiniones histológicas relativas a la cicatrización o recuperación de la herida.

Al resumir los resultados, puede observarse que los péptidos (péptido 1 y péptido 2) de la presente invención pueden acelerar notablemente la velocidad de recuperación de la herida y pueden utilizarse como sustancias activas para la cicatrización de heridas.

La descripción anteriormente indicada de la presente invención es una ejemplificación y el experto en la materia podrá apreciar que las características requeridas de la presente invención pueden ser fácilmente modificadas en otras formas detalladas que todavía se encuentren comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones. Por lo tanto, debería apreciarse que las formas de realización ejemplificativas mencionadas anteriormente son ilustrativas de todos los aspectos y no limitativas de la presente invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Péptido que consiste en aminoácidos representados mediante SEC ID n° 1 o 2.

2. Péptido según la reivindicación 1, en el que un extremo N o C del péptido se une a un grupo protector seleccionado de entre el grupo que consiste en un grupo acetilo, un grupo fluorenilmetoxi carbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoílo, un grupo miristilo, un grupo estearilo o un grupo polietilenglicol (PEG).

3. Composición farmacéutica para la utilización en la cicatrización de heridas que comprende un péptido que consiste en los aminoácidos representados mediante SEC ID n° 1 o 2 o un polinucleótido que codifica el péptido como un principio activo.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, en la que un extremo N o C del péptido se une a un grupo protector seleccionado de entre el grupo que consiste en un grupo acetilo, un grupo fluorenilmetoxi carbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoílo, un grupo miristilo, un grupo estearilo o un grupo polietilenglicol (PEG).

5. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 3, en la que el péptido está contenido a una concentración de 1 a 500 ng/ml.

6. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 3, en la que la herida es un corte.

7. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 3, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Composición farmacéutica que comprende un péptido según la reivindicación 1 o 2 o un polinucleótido que codifica el péptido como un principio activo.

9. Composición cosmética según la reivindicación 8, en la que la composición se encuentra en forma de suspensión, emulsión, pasta, gel, crema, loción, polvos, cera o pulverización.

10. Composición cosmética según la reivindicación 8, en la que la composición presenta una actividad blanqueadora de la piel.

11. Utilización de una composición cosmética según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para mejorar la regeneración de la piel.

12. Utilización según la reivindicación 11, en la que dicha regeneración de la piel es blanqueamiento de la piel, mejora de la hiperpigmentación de la piel, mejora de la elasticidad de la piel y efectos de mejora de las arrugas.