KR20170113156A - 피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 펩타이드는 섬유아세포의 콜라겐 생성량을 증진시켜 상처의 치유를 촉진시킬 뿐만 아니라, 흑색종 세포의 멜라닌 생성량 및 티로시나제 활성을 억제시켜 우수한 미백 효과를 나타내며, 매우 작은 크기의 펩타이드로 이루어져 외부 물질의 투여에 따른 부작용을 최소화시킬 수 있는바, 기존의 피부 재생 또는 상처 치료용 제제를 대체할 수 있는 유효 물질로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드 및 이의 용도 {Peptides for skin regenerating or wound healing and use thereof}

본 발명은 피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도, 습도 변화, 자외선, 공해 물질 등 외부환경에 의한 자극으로부터 보호해 주며, 체온 조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 피부의 가장 외측에 존재하는 각질은 피부의 세포가 변화되어 생긴 조직이며, 완전히 죽은 세포로 구성되어 있다. 진피층의 피부 결합조직 안에 성기게 형성된 세포층은 표피층으로 올라가면서 세포의 생명력이 없어지며, 견고하고 규칙적인 세포층으로 변하게 된다. 이러한 구성으로 이루어진 피부는 가장 외부에서 우리 몸의 수분을 지켜주고 밖에서 들어오는 여러 가지 물질들을 방어하는 방어선과 같은 역할을 한다. 즉, 피부의 표면에 상처가 생길 경우, 표피의 빠른 재생 능력은 상처의 회복을 촉진하여 상처를 통한 추가 감염을 방지하며, 피부 표면의 흉터를 줄여주는 역할을 할 수 있다.

상처받은 피부 조직이 재구성되는 경우, 여러 가지 반응들이 관여하며 구체적으로, 각질세포의 이동, 증식, 분화, 손상세포의 탈락, 외피조직의 생산이 관여되어 있다. 상처치유의 과정은 각종 세포와 인자가 관여하여 매우 복잡한 반응으로서, 먼저 상처부위에 혈소판이 응집하고 형질전환 증식인자, 혈소판 유래 증식인자, 상피세포 증식인자 등의 여러 가지 세포증식인자가 유리됨에 따라 혈관내피, 탐식세포, 섬유아세포, 상피세포 등에 자극을 주어 세포 증식을 촉진하게 되며, 이와 동시에 이들 세포 자신도 자기 분비적으로 섬유아세포 증식, 형질전환 증식인자, 인터류킨 등의 물질을 생산, 방출하면서 상처치유 기전이 진행된다.

현재, 다양한 활성을 가지고 있어 상처 치료 제제로 널리 사용되고 있는 EGF (표피성장인자, Epidermal growth factor)는 정제하여 얻거나 또는 박테리아에서 과량 발현하여 얻는 방법이 사용되고 있다. 직접 정제하여 얻을 경우 시간, 돈, 그리고 노동력이 많이 소요되고, 또한 박테리아에서 과량 발현 방법은 세포 내에서의 낮은 발현량과 박테리아의 단백질 분해 효소 등에 의하여 회수 수율이 매우 낮다는 문제점이 있다. 또한, EGF는 만성의 상처 부위에는 낮은 치료 효과를 나타낸다는 보고가 있으며, 온도 및 단백질 분해 효소에 의한 짧은 반감기로 인하여 효율 대비 가격이 비싸다는 문제로 인해 상용화에 어려움을 겪고 있는 실정이다.

이러한 배경 하에서, 종래 피부 재생 또는 상처 치료용 제제의 문제점을 최소화시키면서 유효한 치료 효과를 갖는 새로운 치료제의 개발이 요구되는 실정으로, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 (한국 공개특허 제2015-0135743), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 피부 재생 또는 상처 치료용 제제에 대해서 예의 연구한 결과, 15개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 제조하였으며, 상기 펩타이드를 처리한 경우, 섬유아세포의 콜라겐 생성량 증진, 흑색종 세포의 멜라닌 생성량 및 티로시나제 활성 억제 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 피부 재생 또는 상처 치료용 펩타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 재생 또는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 또는 상처 개선용 건강기능식품/화장품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 펩타이드의 N- 또는 C- 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 펩타이드는 1 내지 500ng/ml 농도로 함유되어 있을 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 상처는 창상에 의한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 또는 상처 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 왁스 또는 스프레이 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 피부 미백 활성을 가지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 재생 또는 상처 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드의 피부 재생 또는 상처 치료용도를 제공한다.

본 발명에 따른 신규 펩타이드는 섬유아세포의 콜라겐 생성량을 증진시켜 상처의 치유를 촉진시킬 뿐만 아니라, 흑색종 세포의 멜라닌 생성량 및 티로시나제 활성을 억제시켜 우수한 미백 효과를 나타내며, 매우 작은 크기의 펩타이드로 이루어져 외부 물질의 투여에 따른 부작용을 최소화시킬 수 있는바, 기존의 피부 재생 또는 상처 치료용 제제를 대체할 수 있는 유효 물질로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, 본 발명의 펩타이드 1 처리에 따른 인간 섬유아세포로부터 생성된 Procollagen의 양을 측정한 결과이다.
도 2는, 본 발명의 펩타이드 1 처리에 따른 인간 섬유아세포로부터 생성된 Col1A1의 양을 측정한 결과이다.
도 3은, 본 발명의 펩타이드 1 처리에 따른 흑색종 세포로부터 생성된 멜라닌의 양을 측정한 결과이다.
도 4는, 본 발명의 펩타이드 1 처리에 따른 흑색종 세포의 티로시나제 (Tyrosinase) 활성을 평가한 결과이다.
도 5는, 본 발명의 펩타이드 1 처리에 따른 in vitro 상처 모델에서의 상처 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 6은, 본 발명의 펩타이드 2 처리에 따른 in vitro 상처 모델에서의 상처 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 7은, 본 발명의 펩타이드 1 처리에 따른 in vitro 상처 모델에서의 상처 치료 효과를 정량화하여 평가한 결과이다.
도 8은, 본 발명의 펩타이드 2 처리에 따른 in vitro 상처 모델에서의 상처 치료 효과를 정량화하여 평가한 결과이다.
도 9는, 본 발명의 펩타이드 1 또는 2 처리에 따른 급성 창상 동물모델에서의 상처 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 10은, 본 발명의 펩타이드 1 또는 2 처리에 따른 급성 창상 동물모델에서의 상처 치료 효과를 정량화하여 평가한 결과이다.
도 11은, 본 발명의 펩타이드 1 또는 2 처리에 따른 급성 창상 동물모델에서의 피부조직 변화를 H&E 염색을 통해 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서, "펩타이드 (peptide)"는 아마이드 결합 (또는 펩타이드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미하며, 본 발명의 목적상, 피부 재생 또는 상처 치유 활성을 가지는 펩타이드를 의미한다. 펩타이드 치료제에 대한 다양한 연구에도 불구하고, 펩타이드 자체 크기가 너무 커서 표적 조직 또는 세포에 효과적으로 유입되지 못하거나 반감기가 짧아 단기간에 체내에서 소멸되는 단점을 드러내었는바, 본 발명은 유효한 치료 효과를 가짐과 동시에 20개 이하의 아미노산으로 이루어진, 신규 펩타이드를 최초로 규명하였다는 점에 기술적 의의가 있다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어질 수 있고, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드에 대한 기능성 변이체도 포함할 수 있다. 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 기재된 펩타이드 서열 (서열번호 1 또는 2)의 생물학적 균등물들을 포함한다. 예를 들면, 펩타이드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 개선시키기 위하여 펩타이드의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 펩타이드의 아미노산 서열 잔기의 결실. 삽입, 및/또는 치환을 포함하며, 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적인 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신 등은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.

또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성 (반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 바람직하게, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "안정성"은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.

본 발명에서, "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)"는 뉴클레오티드가 결합된 중합체로서, 유전 정보를 전달하는 역할을 한다. 본 발명의 목적상, 서열번호 1 또는 2의 펩타이드를 코딩하며, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 각각 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 상기 "상동성"은 야생형 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율 (%)로 계산할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 유효성분으로 포함하는, 피부 재생 또는 상처 치료용 치료용 약학적 조성물; 피부 재생 또는 상처 치료를 위한 상기 펩타이드의 용도; 및 치료상 유효량의 상기 펩타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부 재생 또는 상처 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 상처에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, "개체"는 상처의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "피부 재생"은 전반적인 피부 노화 및 피부에 유발된 외부 자극에 대응하여 피부 조직이 재구성되는 일련의 반응을 일컫는 것으로서, 한 구체예로서 피부 미백, 피부 탄력 증진, 주름 개선 효과를 나타낸다. 상기 "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어, 상처 (wound)는 외부 자극에 의해 조직이 손상되는 현상을 의미하는 것으로서, 일반적인 상처의 치유는 대개 세포의 변성 및 사멸, 주위의 조직으로부터 유주세포, 조직액의 유출, 및 섬유소의 석출과 육아조직의 형성 등의 과정을 거치게 된다. 본 발명의 목적상, 상기 상처 치료는 전술한 바와 같은 과정을 촉진시켜 정상 피부 조직으로의 재구성을 돕는 것을 일컫는다, 한편, 상기 상처는 바람직하게 창상에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 2 종류의 펩타이드 (펩타이드 1 및 펩타이드 2)를 제조하였으며 (실시예 1 참조), 상기 펩타이드를 처리함으로써, 콜라겐 생성량을 증진시켜 상처 치유를 촉진시킬 수 있었고, B16F10 흑색종 세포주의 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제시켜 우수한 미백 효과를 확인할 수 있었다 (실시예 2 내지 4 참조). 또한, HaCaT 세포의 이동능을 평가하기 위한 scratch assay, 및 급성 창상 동물모델을 이용하여, 상기 펩타이드의 우수한 상처 치료 효과 (상처 감소)를 확인할 수 있었는바 (실시예 5 및 6 참조), 기존의 피부 재생 또는 상처 치료용 제제를 대체할 수 있는 유효 물질 및 피부 미백 제제로 폭 넓게 활용될 수 있을 것이다.

한편, 본 발명의 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체 microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.

이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 목적상, 피부 재생 효과를 위하여 바람직하게 본 발명의 펩타이드를 1 내지 500ng/ml 농도로 함유할 수 있으나, 세포 독성이 없이 유효한 치료 효과를 기대할 수 있는 농도라면, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

특히, 본 발명의 약학적 조성물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 또는 상처 개선용 건강기능식품/화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때, 상기 건강기능식품/화장품 조성물은 피부 노화 또는 상처의 예방 또는 개선을 위하여, 관련 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 함유된 유효한 담체는 제형에 따라, 당업계에서 통상적으로 이용되는 담체가 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 펩타이드의 제조

본 실시예에서는, 하기 표 1의 펩타이드를 제조하였다. 이후, 고성능액체크로마토그래피 (SHIMADZU Prominence HPLC)를 이용하여 합성된 펩타이드를 순수 분리하였으며, 컬럼은 Shiseido capcell pak C18 Column (4.6 x 50mm)을 이용하였다. 또한, 질량분석기 (HP 1100 series LC/MSD)를 이용하여, 합성된 펩타이드의 질량을 확인하였다.

실시예 2. 인간 섬유아세포의 콜라겐 생성능 평가

콜라겐은 피부 결합조직의 주성분으로서, 창상 등의 상처 치료 또는 피부 재생 과정에서 콜라겐의 발현 증가는 필수적이라 할 수 있다. 이에, 본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드 (펩타이드 1)의 처리에 따른 인간 섬유아세포 (Human dermal fibroblast, HDF)의 콜라겐 생성능을 종래 문헌 (J. Biol. Chem. 1993 268(14): 9941-9944)에 개시된 실험법을 통하여 평가하였다. 우선, 인간 섬유아세포를 10% Fetal Bovine Albumin (FBS)이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였으며, 상기 배양된 세포를 6 well-plate에 각 2×10⁵ cell/well 농도로 분주하고, 이를 24시간 배양한 후, 2% FBS로 배지를 교체하였다. 이로부터 24시간 경과 후, 본 발명의 펩타이드 (100, 10, 1 ng/ml)를 처리하고 다시 24시간 배양하였으며, 이후 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit를 사용하여 배양 배지로 분비된 procollagen의 양을 측정하였고, Trizol reagent로 RNA 추출한 뒤, real-time PCR을 통해 인간 섬유아세포의 Col1A1 (collagen type I, alpha 1) mRNA의 발현을 확인하였다. 한편, 대조군으로 별도의 처리를 가하지 않은 군 (Control), 양성 대조군으로는 TGF-β를 처리한 군 (TGF-β)을 이용하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군은 대조군 및 TGF-β를 처리한 군에 비해 procollagen의 분비량이 증가하였으며, Col1A1의 발현도 10ng/ml 이상의 농도에서 유의적으로 증가함을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 펩타이드는 콜라겐 생성을 유도하여 피부 재생 또는 상처 치유의 촉진에 기여함을 알 수 있었다.

실시예 3. 흑색종 세포의 멜라닌 생성능 평가

피부의 색은 맥라닌 세포에 의해 생성된 멜라닌 색소의 양에 따라 결정되며, 비 정상적인 피부의 색소 침착을 개선하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다. 특히, 만성창상에서 발생하는 과도한 색소침착은 중요한 의학적 문제로 다뤄지고 있으나, 아직까지 확실한 치료방법이 개발되어 있지 않은 실정이다. 이에, 본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드 (펩타이드 1)의 처리에 따른 흑색종 세포주의 멜라닌 생성능을 종래 문헌 (Life Sci. 2013 Aug 14; 93(5-6): 226-32) 에 개시된 실험법을 통하여 평가하였다. 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 10% Fetal Bovine Albumin이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였으며, 상기 배양된 세포를 12 well-plate에 각 1×10⁵ cell/well 농도로 분주하였다. 이를 24시간 배양한 후, 멜라닌 합성을 촉진시키는 α-MSH (10uM)와 본 발명의 펩타이드 (1, 10, 100 ng/ml)를 처리하고 다시 24시간 배양하였으며, 각 well을 PBS로 세척한 뒤, 200㎕의 1N NaOH 용액을 첨가하고 100℃에서 30분간 용해하였다. 이후, ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하여 흑색종 세포주로부터 생성된 멜라닌의 양을 확인하였다. 한편, 대조군으로 별도의 처리를 가하지 않은 군, 양성 대조군으로는 α-MSH만을 처리한 군을 이용하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, α-MSH만을 처리한 군에서는 흑색종 세포주로부터 다량의 멜라닌이 생성되었던 반면, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 멜라닌 생성량이 크게 감소하였으며, 특히, α-MSH를 처리하지 않은 군과 비교해서도 큰 차이를 보이지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 생성 억제에 따른 피부 미백 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 흑색종 세포의 티로시나제 활성 평가

티로시나제 (Tyrosinase)는 멜라닌 생합성 과정에서 반응을 촉매하는 속도 조절 효소로서, 세포 내 멜라닌의 양을 조절함에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드 (펩타이드 1)의 처리에 따른 흑색종 세포주의 티로시나제 활성을 종래 문헌 (J. Dermatol. Sci. Vol.57 (2010) 170-177)에 개시된 실험법을 통하여 평가하였다. 흑색종 세포주인 B16F10 세포를 12 well-plate에 각 1×10⁵ cell/well 농도로 분주하고 24시간 배양한 후, -MSH (1M)와 본 발명의 펩타이드 (1, 10, 100ng/ml)를 처리하고, 다시 24시간 배양하였으며, 각 well을 PBS로 세척한 후 1% Triton X-100을 함유한 50mM Phosphate buffer (pH 6.8)에 현탁하였다. Vortexing 후, -80℃에서 30분 동결한 후, 실온에서 융해시키고, 1000g에서 10분간 원심분리 후 40㎕의 상층액과 10mM L-DOPA 100㎕를 96 well-plate에 넣고 37℃에서 반응시켰다. 이후, ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하여 흑색종 세포주의 티로시나제 활성을 확인하였다. 한편, 대조군으로 별도의 처리를 가하지 않은 군, 양성 대조군으로는 -MSH만을 처리한 군, 및 Kojic acid를 처리한 군을 이용하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, α-MSH만을 처리한 군에서는 흑색종 세포주의 티로시나제 활성이 크게 증가했던 반면, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서는 효소 활성이 크게 감소하였으며, 티로시나제 활성 억제능을 지닌 Kojic acid를 처리한 군과 비교해서도 큰 차이를 보이지 않았다. 상기 결과로부터 본 발명의 펩타이드는 티로시나제 활성 억제에 따른 피부 미백 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. In vitro 상처치료 모델을 이용한 상처 치료 효과 확인

본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드 (펩타이드 1 및 2)의 처리에 따른 상처 치료 효과를 scratch assay를 통해 확인하였다. serum free 배지에 mitomycin C (10 ug/ml)를 첨가하여 인간 상피 세포주인 HaCaT 세포를 2 시간 동안 배양하고 scratch 상처 유발시켰다. 10 % FBS가 첨가된 배지에서 펩타이드 (1 또는 10 ng/ml), 양성 대조군으로서 TGF-β (1 ng/ml)를 처리한 뒤, 시간의 경과에 따른 세포의 이동능을 관찰하고, 상처 크기의 감소를 정량화하였다.

그 결과 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 군에서, HaCaT 세포의 이동이 펩타이드 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 상처 크기를 정량화하여 평가한 결과, 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 펩타이드 1 또는 펩타이드 2 처리에 따른 유의적인 상처 크기의 감소를 확인할 수 있었으며, 특히, 펩타이드 2의 효과가 보다 현저하여, 고농도 (10 ng/ml) 뿐만 아니라 상대적으로 저농도 (1 ng/ml)인 경우에도 뚜렷한 상처 감소 효과를 관찰할 수 있었다.

실시예 6. 급성 창상 동물 모델을 이용한 상처 치료 효과 확인

본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드 (펩타이드 1 및 2)의 처리에 따른 상처 치료효과를 급성 창상 동물모델을 이용하여 in vivo에서 확인하였다.

6-1. 상처 크기의 변화 확인

8주령 Balb/c nude 마우스를 Avertin (2.5%)를 이용해 마취한 후, 10 mm 지름의 원형 punch를 사용해 동물 등 부위의 피부를 절개하여 급성 창상을 유발시켰다. 적출 부위에 24시간 간격으로 총 5회 펩타이드를 처리하고 (500 ng/1회), 시간에 따른 상처 넓이의 감소를 14일 동안 측정하였으며, 양성 대조군으로 EGF를 이용하였다 (10 ug/1회). 이 때, 펩타이드는 20 % pluronic F-127 (PBS)과 mixture 상태로 처리하였으며, 디지털 카메라와 ImageJ 프로그램을 이용하여 시간의 경과에 따른 상처 크기를 측정하여 수치화하고, 이를 비교하였다.

그 결과, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 처리한 경우, 양성 대조군과 근사하거나 보다 우수한 상처 크기의 감소를 확인할 수 있었다. 특히, 펩타이드 2는 펩타이드 1의 이량체 형태로서 2배의 분자량을 지니므로, 펩타이드 1에 비해 더 낮은 농도로 처리되었음에도 불구하고, 펩타이드 1을 처리한 경우보다 그 효과가 우수하였을 뿐만 아니라, 양성 대조군에 비해서도 더욱 우수한 상처 치료 효과를 확인할 수 있었다.

6-2. 조직학적 변화 확인

상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 급성 창상을 유발시켰으며, 급성창상을 유발시킨지 5일째의 피부 조직을 절개하여 조직 절편을 제작하였다. 이후, H&E 염색을 실시하고 이를 현미경을 관찰함으로써, 펩타이트 처리에 따른 조직학적 변화를 관찰하였다. 한편, 양성 대조군으로 EGF를 이용하였다.

그 결과, 도 11에서 나타낸 바와 같이, 펩타이드 1 및 펩타이드 2가 처리된 조직은, 양성 대조군과 마찬가지로 표피 (epidermis), 진피 (dermis) 층의 두께가 PBS 음성대조군에 비해 두꺼워져 있었으며, 상피화 (epithelialization) 역시 활발하게 진행되고 있었는바, 상처의 치료 또는 회복과 관련된 조직학적 소견을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 종합하여 볼 때, 본 발명의 펩타이드 (펩타이드 1 및 펩타이드 2)는 상처의 회복 속도를 현저하게 촉진시킬 수 있었는바, 상처의 치료를 위한 유효물질로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BIO PEP CO., LTD. <120> Peptides for skin regenerating or wound healing and use thereof <130> P17E10C0272 <150> KR 10-2016-0034327 <151> 2016-03-23 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 1 <400> 1 Arg Glu Gly Arg Thr 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide 2 <400> 2 Arg Glu Gly Arg Thr Arg Glu Gly Arg Thr 1 5 10

Claims (10)

1. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 N- 또는 C- 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
   
3. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 피부 재생 또는 상처 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드의 N- 또는 C- 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기, 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드는 1 내지 500ng/ml 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. 제3항에 있어서, 상기 상처는 창상에 의한 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
7. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진, 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 노화 또는 상처 개선용 화장품 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 왁스 또는 스프레이 형태임을 특징으로 하는, 화장품 조성물.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 화장품 조성물.
    
    
    

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