ES2832727T3 - Vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano para su uso en medicina - Google Patents

Abstract

Preparación farmacéutica que comprende una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano para su uso en medicina.

Description

DESCRIPCIÓN

Vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano para su uso en medicina

Antecedentes

El lisado plaquetario humano (hPL) se conoce como un complemento alternativo para suero bovino fetal (FBS) en cultivo celular humano. Se usa comúnmente para la complementación de medio basal en cultivo de células madre mesenquimatosas humanas para fines experimentales y clínicos. El hPL es ventajoso en comparación con el FBS usado tradicionalmente ya que está libre de xenógenos y, por tanto, es adecuado para la generación de productos terapéuticos para su uso en terapia celular. El hPL aparece como un líquido turbio de color amarillo claro que se obtiene a partir de la lisis de plaquetas de sangre humana mediante ciclo(s) de congelación/descongelación. En virtud de su función de reparación de tejidos fisiológica, las plaquetas son una fuente rica en numerosas moléculas bioactivas como factores de crecimiento, citocinas incluyendo quimiocinas e interleucinas, otros metabolitos y vesículas extracelulares (EV). Durante el almacenamiento y la lisis, las plaquetas liberan una gran cantidad de factores de crecimiento y vesículas extracelulares (EV, por ejemplo exosomas, microvesículas, cuerpos apoptópicos), que oscilan entre aproximadamente 40 y 1000 nm de tamaño. Estas vesículas secretadas se designan vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano (hPLEV). En los últimos años, varios productos de BPF relacionados con hPL salieron al mercado con el objetivo de su uso en sistemas de cultivo celular, por ejemplo, productos de Stem Cell Technologies, Macopharma, COMPASS Biomedical y PL BioSciences. Recientemente, el Centro para la Medicina Transfusional Clínica en Tübingen ha obtenido una autorización de fabricación para lisado plaquetario humano según la Ley de Fármacos Alemana (Germán Drug Law, AMG) por la oficina gubernamental local de Tübingen. Tales productos de hPL se requieren para el cultivo de células madre según los requisitos regulatorios para su uso en seres humanos. Mientras tanto, hPL es el método de referencia para el cultivo de células madre humanas, especialmente células madre mesenquimatosas. El lisado plaquetario humano obtenido en condiciones de condiciones de sala estéril de BPF se considera la “materia prima de origen humano” para la fabricación farmacéutica, tal como para su uso en ensayos clínicos o para la fabricación de especialidades farmacéuticas con licencia para terapia celular.

Aunque el valor de hPL en el cultivo de células madre es reconocido, las propiedades de los factores individuales en el hPL tal como los factores de crecimiento y las EV aún no se analizan en detalle. Mientras que las EV del hPL no se han considerado de interés clínico, las EV derivadas de diferentes células madre, tales como las MSC, son cada vez más objeto de interés clínico y terapéutico.

Se sabe que las EV transmiten información entre células, órganos e incluso entre organismos, y se han detectado en diversos líquidos corporales, tales como sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, leche materna y saliva. Los exosomas y las microvesículas comprenden las clases de EV descritas más prominentemente. Están rodeadas por una membrana fosfolipídica y contienen combinaciones de proteínas específicas del tipo celular, que incluyen enzimas, factores de crecimiento, receptores y citocinas, así como lípidos, ARN codificantes y no codificantes, ARNm, microARN (miARN) o incluso pequeñas cantidades de ADN y metabolitos. Los exosomas se definen como derivados del compartimento endosómico con un tamaño de 70-170 nm (+/- 20 nm, esto varía dependiendo de la bibliografía y la técnica de análisis). Con tamaños promedio de 100-1000 nm, las microvesículas representan una clase de EV más grandes que se forman por la gemación hacia afuera de la membrana plasmática. En la presente solicitud, el término EV comprende todas las vesículas mencionadas anteriormente. Por ahora, parece que solo se considera y se discute ampliamente que las EV derivadas de células madre tienen potencial terapéutico según los fines terapéuticos. El documento WO 2012/053976 da a conocer el uso de exosomas que se secretan por células madre mesenquimatosas humanas para promover el crecimiento del cabello y la cicatrización de heridas. Estos efectos se dan a conocer en relación con la carga inmunomoduladora exosómica. El documento WO 2012/053976 especula sobre un efecto inmunomodulador de la preparación de exosomas.

El documento WO 2014013029 A1 se refiere al uso de preparaciones de exosomas derivadas de células madre mesenquimatosas (MSC) derivadas de tejidos neonatales o adultos para la prevención o terapia de estados inflamatorios, tales como daños adquiridos prenatales y posnatales del cerebro (es decir, daños neuronales) o complicaciones inmunológicas después de un trasplante de células madre ("enfermedad de injerto contra huésped", GvHD).

El último documento de opinión publicado por ISEV (The International Society of Extracellular Vesicles) en Journal of Extracellular Vesicles de Thomas Leneret et al., 2015 (Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials. 4: 30087) describen fuentes de EV con potencial terapéutico discutidas recientemente. Las fuentes celulares bajo investigación para la medicina regenerativa son las células endoteliales y las células formadoras de colonias endoteliales, que incluyen células endoteliales humanas de la vena umbilical y células endoteliales tardías. Además, los progenitores hematopoyéticos que pueden diferenciarse en células mieloides y linfoides pueden ejercer funciones proangiogénicas. Las células madre neurales (NSC) se han usado en modelos preclínicos en una variedad de trastornos neurológicos y neuroinflamatorios tales como accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple (EM) o lesiones de la médula espinal. Sin embargo, se hizo evidente que, de manera análoga a las MSC, también las NSC ejercen sus efectos terapéuticos de una manera paracrina y sistémica en lugar de migrar a los sitios de la lesión. En este contexto, se considera que las EV derivadas de NSC interactúan con el sistema inmunitario del huésped para mediar en la neuroprotección y la inmunomodulación. La neuroprotección y la neuroregeneración también pueden estar mediadas por EV liberadas por los neurogliocitos residentes del sistema nervioso. Finalmente, estudios muy recientes describen el aislamiento de las EV a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), su capacidad para transferir ARN y proteínas a las células cardiacas y sus capacidades curativas in vivo en la miocardia isquémica. Además, las iPSC podrían usarse como fuente para generar células madre somáticas a escala para la producción de EV a gran escala o para obtener células como fuente de EV que difícilmente puede obtenerse de material de donante primario, como NSC humanas. En este contexto, ya se ha demostrado que las EV de las MSC derivadas de iPSC atenúan la isquemia de las extremidades. Se comenta que la combinación de tecnologías iPSC y EV podría proporcionar opciones terapéuticas novedosas en el futuro.

Para resumir lo proporcionado en el documento de opinión reciente mencionado anteriormente (Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 30087) hay que subrayar que el potencial terapéutico de las EV derivadas de hPL no es considerado. Las EV derivadas de células madre humanas tales como las MSC, NSC o iPSC no son fácilmente accesibles ya que el cultivo de células madre es complejo, costoso y las fuentes son limitadas para la fabricación farmacéutica a gran escala.

En una publicación de Torreggiani et al. (2014, European Cells and Materials vol. 28, 137-151) se discute que los exosomas derivados de hPL puedan considerarse efectores novedosos en la actividad del lisado plaquetario humano. Torreggiani et al. discuten el uso de exosomas derivados de plaquetas para la regeneración ósea. En su estudio, se investigó el papel de los exosomas derivados de PL en relación con el soporte del cultivo de células MSC. Sin embargo, la preparación descrita en Torreggiani et al. no parece cumplir con la norma de calidad para una extracción confiable de EV.

Además, en la mayoría de los estudios clínicos que usan EV derivadas de MSC, las MSC se cultivan en medios complementados con hPL, en los que los posibles efectos sinérgicos de las hPLEV no se tratan ni se discuten. En la técnica anterior, los efectos observados en los estudios de EV derivadas de MSC se atribuyen a las EV derivadas de MSC, aunque se usó hPL como complemento de medio basal en cultivos de células madre mesenquimatosas. El documento US20120156306A1 se refiere a un extracto de plaquetas inocuo para virus, a su preparación y uso. El documento EP2389942A1 se refiere a factores de crecimiento viralmente inactivos que contienen lisado plaquetario reducido en PDGF y VEGF y la preparación y el método del mismo.

El documento WO2010064267A1 se refiere a lisados plaquetarios y composiciones bioadhesivas de los mismos para el tratamiento de la mucositis.

El documento WO2014013029A1 se refiere al uso de preparaciones que comprenden exosomas derivados de células madre mesenquimatosas (MSCS) en la prevención y terapia de estados inflamatorios.

Además, existen numerosos artículos científicos, solicitudes de patente y patentes sobre el uso de plasma rico en plaquetas (PRP) como por ejemplo Eppley BL et al. (2006) en Plast Reconstr Surg 118(6): 147e-159e, Mishra AK et al. (2012) en Curr Pharm Biotechnol 13(7): 1185-1195 y Carlson NE et al. (2002) en J Am Dent Assoc 133(10): 1388­ 1386. El PRP consiste en plaquetas vivas concentradas y plasma derivado de la sangre completa de un paciente, centrifugado para eliminar los glóbulos rojos y otros componentes no deseados. Tiene una mayor concentración de factores de crecimiento que la sangre completa y se ha usado en inyecciones de tejido en una variedad de disciplinas, incluyendo la odontología, la cirugía ortopédica y la medicina deportiva.

Sin embargo, hasta ahora en 2016, los resultados de la ciencia básica y los ensayos preclínicos aún no se han confirmado en ensayos controlados aleatorizados a gran escala. En una revisión de 2009, la bibliografía científica se examinó sistemáticamente y solo se encontraron unos pocos ensayos controlados aleatorizados que evaluaron adecuadamente la seguridad y eficacia de los tratamientos con PRP. Se concluyó que el PRP es “una opción de tratamiento prometedora, pero no probada, para lesiones de articulaciones, tendones, ligamentos y músculos” (véase también Foster et al. (2009). Am J Sports Med 37 (11): 2259-72).

En cuanto al uso de PL se han descrito aplicaciones particulares en el campo de la cicatrización de heridas como en el documento WO20130765507 que describe una composición farmacéutica que comprende un lisado plaquetario y su uso para tratar una herida, una fisura anal, una atrofia vaginal o una arruga. En Fontana et al. (2016) ASC Appl Mater Interfaces 8 (1): 988-996 se describen micropartículas de silicio modificadas con PL para mejorar la proliferación celular en aplicaciones de cicatrización de heridas.

Resumiendo, parece que, en la técnica anterior relacionada con el PRP, el uso de hPL o hPLEV no se describe para aplicaciones clínicas más allá de las aplicaciones de cicatrización de heridas.

En cuanto a la técnica, existe por tanto una necesidad crítica de medios y métodos que permitan realizar terapias fáciles, económicas, fiables y eficientes utilizando PRP y PL como fuente. Lo mismo ocurre con las terapias basadas en EV que no se basan en sistemas de cultivo de células madre complejos y costosos.

El objeto de la presente invención es cumplir con las necesidades mencionadas anteriormente y presentar EV derivadas de hPL como herramienta novedosa en medicina, particularmente en medicina terapéutica, regenerativa y preventiva.

Sumario

La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano (esta fracción también se abrevia hPLEV en lo sucesivo) para su uso en medicina, particularmente para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias y trastornos inmunitarios agudos y/o crónicos (incluyendo también enfermedades autoinmunitarias y enfermedades que resultan de rechazos de trasplantes, por ejemplo, GvHD), enfermedades neurológicas y neurodegenerativas (accidente cerebrovascular, isquemia), enfermedades dermatológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades ortopédicas, enfermedades infecciosas, enfermedades cancerosas, regeneración de tejidos (órganos sólidos, estructuras huecas, lesiones).

La presente invención se refiere además a aplicaciones cosméticas de lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano. Estas aplicaciones incluyen: tratamientos cosméticos antinflamatorios relacionados con la piel, regeneración de la piel después de una lesión o quemadura, terapias antienvejecimiento de la piel, así como la prevención y el tratamiento de la alopecia.

La presente invención también se refiere a aplicaciones de diagnóstico de lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano.

La presente invención se refiere además a un método de fabricación de una preparación farmacéutica o una preparación de diagnóstico o una preparación cosmética que comprende la etapa de añadir lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano a la preparación farmacéutica o una preparación de diagnóstico o una preparación cosmética.

Aunque hay varias ventajas en términos de importancia biológica, costes y esfuerzos al sustituir las EV derivadas de células madre por hPLEV, una sustitución de este tipo nunca se sugirió en la técnica anterior. Como hPL deriva de sangre/plasma humano, la fuente es regenerativa y de fácil acceso a diferencia de las MSC, ESC, NSC u otros tipos de células madre. Así las hPLEV son más accesibles y menos costosas que las EV derivadas de cultivos de células madre. Una ventaja adicional de la presente invención sobre las correspondientes EV derivadas del cultivo de células madre es el hecho de que las plaquetas no requieren condiciones de sala estéril y que no se requiere una caracterización citométrica de flujo costosa y que requiere mucho tiempo de las entidades celulares. Además, los productos concentrados de plaquetas humanas en exceso, que se produjeron para su aplicación en hospitales y clínicas y caducan después de varios días, todavía pueden usarse para la producción de hPL en lugar de descartarlos.

Además, la invención se refiere a hPL que se produce a partir de plaquetas caducadas, congeladas y almacenadas, particularmente no más tarde de siete días después de la recogida, proporcionando los componentes activos de las plaquetas inmediatamente y no en la forma de liberación retardada de las plaquetas vivas. Por tanto, un aspecto importante de la presente invención se refiere al uso de hPL- o hPLEV para un tratamiento médico o cosmético en vez de usar que muestra una ventaja sorprendente sobre el uso de plaquetas vivas, por ejemplo, terapia con plasma rico en plaquetas, una terapia con hPL- o hPLEV tiene una ventaja sorprendente.

Cabe destacar que la presente invención describe por primera vez el uso directo de lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano en medicina, particularmente para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias y trastornos inmunitarios agudos y/o crónicos (incluyendo enfermedades autoinmunitarias y enfermedades que resultan de rechazos de trasplantes, por ejemplo GvHD), enfermedades neurológicas y neurodegenerativas (accidente cerebrovascular, isquemia), enfermedades dermatológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades ortopédicas, enfermedades infecciosas, enfermedades cancerosas, regeneración de tejidos (órganos sólidos, estructuras huecas, lesiones) y enfermedades en las que un tratamiento antimicrobiano es ventajoso.

La presente invención enseña por primera vez el uso directo de lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano como medicamento y para aplicaciones cosméticas. Estas aplicaciones incluyen tratamientos cosméticos antinflamatorios relacionados con la piel, tratamientos antimicrobianos, regeneración de la piel después de una lesión o quemadura, terapias antienvejecimiento de la piel, así como la prevención y el tratamiento de la alopecia.

La presente invención presenta por primera vez el uso novedoso de hPL o las hPLEV como medicamento, que pueden fabricarse a bajo coste, son un producto xenógeno y libre de células de alta calidad médica y, sin embargo, no se requiere ningún producto intermedio de cultivo celular clínico.

Descripción detallada

Para apoyar la comprensión de la invención, a continuación se definen varios términos. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de las reivindicaciones, los métodos y materiales a modo de ejemplo se describen en el presente documento.

Además, la referencia a un elemento en el artículo indefinido “un/uno” o “una” no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo un elemento. Por tanto, el artículo indefinido “un/uno” o “una” significa habitualmente “al menos uno”.

El término “aproximadamente” significa dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor o valores tales como una concentración, longitud, peso molecular, pH, trama de tiempo, temperatura, presión o volumen establecidos. Un valor o intervalo de este tipo puede estar dentro de un orden de magnitud, normalmente dentro del 20%, más normalmente dentro del 10% e incluso más normalmente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. La variación permitida abarcada por “aproximadamente” dependerá del sistema particular en estudio.

Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significa “que incluye, pero no se limita a”) a menos que se indique lo contrario.

La enumeración de intervalos de valores en el presente documento tiene como único objetivo servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, e incluye los límites de los puntos finales que definen el intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento.

En el contexto de la presente invención, el hPL significa cualquier clase/grupo de lisado plaquetario humano que tiene un efecto terapéutico o cosmético beneficioso. Las plaquetas, también denominadas trombocitos, son elementos irregulares en forma de disco en la sangre que ayudan en la coagulación de la sangre. Durante la coagulación sanguínea normal, las plaquetas se aglutinan por agregación. Aunque las plaquetas a menudo se clasifican como células sanguíneas, no tienen núcleo. Se derivan de células grandes llamadas megacariocitos localizados/ubicados en la médula ósea. Para la producción de hPL, las plaquetas se lisan y liberan su contenido interno en el plasma que las rodea. La lisis de las plaquetas puede lograrse mediante ciclos de congelación y descongelación. Pueden encontrarse protocolos adecuados en la técnica anterior.

Un componente biológico que está contenido en un alto contenido en lisados plaquetarios humanos es EV. Como las EV están presentes en la mayoría de los líquidos corporales, las EV derivadas de plasma pueden originarse a partir de diferentes tipos de células, tales como leucocitos, eritrocitos, células dendríticas (DC), plaquetas, mastocitos, células epiteliales, células endoteliales y neuronas. Por un lado, hPL puede contener EV derivadas de plasma que ya estaban presentes en el plasma sanguíneo en el momento de la donación de sangre. Por otro lado, hPL puede contener grandes cantidades de EV específicas derivadas de plaquetas, secretadas por trombocitos vivos durante el tiempo de almacenamiento de productos concentrados de plaquetas. Durante el tiempo de almacenamiento de casi una semana a 20-24°C, las células continúan secretando sus EV específicas en el plasma que las rodea. Cuando se alcanza la fecha de caducidad de los concentrados de trombocitos y los hemoderivados pueden usarse para otros fines, como la producción de productos de lisados plaquetarios, este enriquecimiento específico de EV debe estar todavía presente en el lisado, que puede procesarse adicionalmente para obtener fracciones enriquecidas con hPLEV. Además, las plaquetas estallan por lisis y liberan sus componentes internos solubles en el plasma.

Los perfiles de proteínas de las EV difieren según su origen celular.

Los marcadores de CD específicos para la caracterización de plaquetas son los marcadores de superficie CD9, CD41b, CD42a, CD42b y CD61 que aparecen en la superficie de las plaquetas antes de la activación.

También existen marcadores que aparecen en la superficie de las plaquetas durante la activación tal como PAC-1, CD62P, CD31, CD63 y sintenina. Los exosomas de plaquetas o células endoteliales pueden identificarse, por ejemplo, mediante la expresión de marcadores de superficie típicos (por ejemplo, CD31 = molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias 1 o CD62P = P-selectina). Estos marcadores corresponden a marcadores de superficie en las entidades celulares secretoras. Las EV en plasma pueden derivar de diferentes subpoblaciones de células y, por tanto, también pueden contener diferentes subconjuntos de marcadores.

Otro punto es que hPL contiene EV que se liberaron de los trombocitos vivos durante el período de almacenamiento de concentrados de trombocitos (20-24°C) antes de alcanzar la fecha de caducidad después de 4-6 días. Por tanto, el hPL contiene una fracción significativa de EV procedentes de plaquetas humanas. En comparación con los productos plasmáticos normales, los lisados plaquetarios producidos a partir de concentrados de trombocitos caducados están altamente enriquecidos en EV de plaquetas. En el momento de la lisis y el procesamiento posterior, todos los factores paracrinos solubles de los concentrados se guardan mientras se eliminan las células y otros componentes celulares.

Las EV funcionan como un vehículo para diversas biomoléculas, incluyendo lípidos, proteínas (por ejemplo, factores de transcripción, citocinas, factores de crecimiento) y ácidos nucleicos como ARNm, microARN (miARN) o incluso pequeñas cantidades de ADN.

Los componentes lipídicos de los exosomas incluyen lípidos de membrana tales como esfingomielina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, gangliósidos (GM3), fosfatidilinositol, prostaglandinas y ácido lisobisfosfatídico.

Además, junto con lípidos y proteínas, los exosomas también pueden contener ácidos nucleicos incluyendo ARNm, miARN y una gran variedad de otras especies pequeñas de ARN no codificantes, incluyendo los transcriptos de ARN que se superponen con regiones codificantes de proteínas, secuencias repetidas, ARN estructurales, ARNt, ARNr, ARN de la bóveda, ARN Y y ARN de interferencia pequeño (ARNip), así como ADN mitocondrial y secuencias cortas de ADN de retrotransposones.

El término “ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento comprende generalmente polirribonucleótidos (ARN) y polidesoxirribonucleótidos (ADN), cada uno en forma monocatenaria y/o bicatenaria, lineal o circular, o mezclas de los mismos, incluyendo moléculas híbridas. Los ARN pueden incluir, sin limitación, ARN mensajeros (ARNm), ARN no codificantes (ARNnc, incluyendo ARN antisentido), ARN silenciadores, microARN (miARN), ARN de horquilla corta (ARNhc), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de interferencia pequeño asociado a repetición (ARNipar), ARN que interactúa con piwi (piAR), ARN Y, ^a Rⁿ largo no codificante (ARNnc largo, ARNlnc)), a Rn de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ARN pequeño nuclear (ARNpn), ácido ribonucleico pequeño nucleolar (ARNpno), ARN líder de corte y empalme (ARN SL). Todos los ARN mencionados anteriormente son, en principio, concebibles como constituyentes de EV y pueden utilizarse dentro de los métodos de la presente invención.

Las EV también comprenden proteínas y péptidos. Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento. El término “polipéptido” se refiere a una proteína o péptido que contiene o consiste normalmente en al menos 20, y preferiblemente al menos 30, tal como al menos 50 aminoácidos. El término “péptido” se refiere a un oligómero que contiene o consiste en al menos 2 aminoácidos a aproximadamente 19 aminoácidos.

Las proteínas identificadas con mayor frecuencia de las EV son transportadores de membrana y proteínas de fusión (por ejemplo, GTPasas tales como Rab5, anexinas y flotilinas), proteínas de choque térmico (por ejemplo, HSC70), tetraspaninas (por ejemplo, CD9, CD63 y CD81), proteínas de la biogénesis de MVB (por ejemplo, Alix y TSG101), proteínas relacionadas con lípidos y fosfolipasas, proteínas del citoesqueleto (actinas, cofilina-1, ezrina/radixina/moesina, profilina-1 y tubulinas), enzimas metabólicas y proteínas ribosómicas. Varias proteínas se reconocen como marcadores exosomales, entre los cuales las tetraspaninas (por ejemplo, CD63, CD81) y TSG101, una proteína del complejo ESCRT, son los marcadores más comúnmente usados para la detección.

Aunque estas últimas se usan comúnmente como marcadores de exosomas, pueden no ser exclusivas de los exosomas y pueden encontrarse en otras vesículas extracelulares.

En el contexto de la presente invención, hPL comprende cualquier lisado plaquetario humano que podría ser útil en el contexto de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico o cosméticas. Preferiblemente se produce hPL según las condiciones de BPF y preferiblemente ha sido fabricado según la Ley de Fármacos Alemana (Germán Drug Law, AMG). El origen del hPL puede originarse a partir de plaquetas únicas o agrupadas donadas por donantes. Podría ser preferible usar hPL procedente de donantes de sangre de determinada edad, por ejemplo, de donantes de sangre entre 10 y 60 años, 18 y 50 años, 18 y 40 años, 18 y 30 años o 18 y 20 años. En el contexto de la medicina de precisión, podría ser ventajoso tratar a un paciente con lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano que se originan a partir de su propia donación de sangre. Según una realización preferida de la presente invención, el hPL proviene individuos sanos. Para evitar malentendidos, el hPL se enriquece generalmente con vesículas extracelulares derivadas de plaquetas humanas en comparación con las EV de plasma antes de cualquier método de enriquecimiento, aislamiento o purificación de EV. En el contexto de la presente invención, el término “fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano” significa que el hPL se procesó mediante al menos un paso del método de enriquecimiento, aislamiento o purificación con EV. Después de esta etapa de enriquecimiento, aislamiento o purificación, la “fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano” contienen menos contaminantes no EV.

Puede obtenerse hPL o una fracción enriquecida con hPL a partir de plaquetas que se han incubado antes de la lisis con uno o más compuestos conocidos como activadores de trombocitos de la técnica anterior, por ejemplo, la técnica relacionada con la terapia con PRP, que activan las plaquetas y, por tanto, mejoran la calidad de la preparación de la invención.

Según una realización de la invención hPL podría derivarse de sangre de cordón umbilical humano. Las preparaciones de lisis de plaquetas de sangre de cordón umbilical humano se conocen de la técnica anterior (por ejemplo, los documentos US 8501170 B2, Parazzi, V., C. Lavazza, et al. (2015) o Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015).

Para los fines de la presente invención, los términos “aislamiento” y “aislar” en todas sus formas gramaticales se refieren al acto de separar o recuperar EV de su entorno, por ejemplo, una muestra de suero o plasma. Los términos “purificar” y “purificación” en todas sus formas gramaticales se refieren al acto de reducir/reducir (sustancialmente) los contaminantes (no EV) de las EV deseadas. Los términos “enriquecer” y “enriquecimiento” en todas sus formas gramaticales significan aumentar la proporción de las EV en su(s) respectivo(s) disolvente(s).

El hPL actualmente descrito o una fracción enriquecida con las hPLEV puede usarse en medicina. Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción enriquecida con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades impulsadas por inflamación. Las anomalías inflamatorias comprenden un gran grupo de trastornos que subyacen a una amplia variedad de enfermedades humanas. El sistema inmunitario a menudo está involucrado con trastornos inflamatorios, demostrados tanto en reacciones alérgicas como en algunas miopatías, con muchos trastornos del sistema inmunitario que dan como resultado una inflamación anómala. Las enfermedades no inmunitarias con orígenes etiológicos en procesos inflamatorios incluyen cáncer, arteriosclerosis y cardiopatía isquémica. En los procesos inflamatorios intervienen una gran variedad de proteínas. Cualquiera de ellas podría verse modificada debido a mutaciones genéticas que dan como resultado deficiencias o desregulaciones de la función proteica normal o de la expresión proteica. Los ejemplos de trastornos asociados con la inflamación incluyen: acné común, asma, enfermedades autoinmunitarias, enfermedad celíaca, prostatitis crónica, glomerulonefritis, hipersensibilidad, enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad pélvica inflamatoria, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, sarcoidosis, rechazo de trasplantes, vasculitis y cistitis intersticial. Se considera que muchas enfermedades acompañan a la inflamación o se clasifican como enfermedades autoinmunitarias. Algunos tipos de enfermedades inflamatorias incluyen: gota, lupus, asma, pleuresía, eccema, artritis, gastritis, esplenitis, sinusitis, hepatitis, nefritis, psoriasis, vasculitis, laringitis, tiroiditis, prostatitis, faringitis, sarcoidosis, aterosclerosis, reacciones alérgicas, esclerosis múltiple, algunas miopatías, artritis reumatoide, dermatitis seborreica, granulomatosis de Wegener, síndrome del intestino irritable (SII; enfermedad de Crohn), colitis ulcerosa, diverticulitis.

Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, pero sin limitarse a, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, degeneración corticobasal, demencia frontotemporal, deterioro cognitivo relacionado con el VIH, enfermedad de Huntington, demencias con cuerpos de Lewy, deterioro cognitivo leve, atrofia cortical posterior, afasia progresiva primaria, parálisis supranuclear progresiva y demencia vascular.

Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inmunitarias/autoinmunitarias, por ejemplo, pero sin limitarse a, enfermedad de Addison, enfermedad celiaca - celiaquía (enteropatía sensible al gluten), dermatomiositis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, anemia perniciosa, artritis reactiva, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico y diabetes tipo I.

Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, pero sin limitarse a, cardiopatía coronaria, enfermedad cerebrovascular, arteriopatía periférica, cardiopatía reumática, cardiopatía congénita, trombosis venosa profunda y embolia pulmonar.

Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades dermatológicas, por ejemplo, pero sin limitarse a acné, eccema (eccema atópico), infecciones fúngicas de las uñas, herpes y psoriasis.

Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades ortopédicas, por ejemplo, pero sin limitarse a artritis reumatoide, bursitis, dolor y problemas en el codo, síndrome del túnel cubital, epicondilitis lateral (codo de tenista), epicondilitis medial (codo de golfista o de béisbol), fibromialgia, dolor y problemas en el pie, fracturas, fractura de cadera, dolor lumbar, dolor y problemas de manos, síndrome del túnel carpiano, dolor y problemas de rodilla, lesiones de ligamentos de la rodilla, menisco desgarrado, cifosis, dolor y problemas de cuello, osteoporosis, enfermedad ósea de Paget, escoliosis, dolor y problemas de hombro, lesiones de tejidos blandos.

Según una realización de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de la medicina regenerativa de tejidos. La ingeniería de tejidos evolucionó del campo del desarrollo de biomateriales y se refiere a la práctica de combinar andamios, células y moléculas bioactivas en tejidos funcionales. El objetivo de la ingeniería de tejidos es ensamblar constructos funcionales que restauran, mantienen o mejoran tejidos u órganos completos dañados. La piel y el cartílago artificiales son ejemplos de tejidos modificados por ingeniería que han sido aprobados por la FDA; sin embargo, actualmente tienen un uso limitado en pacientes humanos. La medicina regenerativa es un campo amplio que incluye la ingeniería de tejidos, pero también incorpora la investigación sobre la autocuración, en la que el cuerpo usa sus propios sistemas para recrear células y reconstruir tejidos y órganos, a veces con el apoyo de material biológico extraño/alogénico. Los términos “ingeniería de tejidos” y “medicina regenerativa” se han vuelto en gran medida intercambiables, ya que el campo espera centrarse en curas en lugar de tratamientos para enfermedades complejas y a menudo crónicas.

Según una realización adicional de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades oncológicas, por ejemplo, pero sin limitarse a cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de mama, cáncer de colon/recto, enfermedad de Hodgkin, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma de piel, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, sarcoma: cáncer de tejidos blandos en adultos, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado y cáncer de estómago.

Según una realización adicional de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de rechazos de trasplantes. Según una realización adicional de la presente invención, hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV se usan para la prevención y/o el tratamiento de accidente cerebrovascular, isquemia o enfermedad injerto contra huésped.

Según una realización preferida, la enfermedad puede seleccionarse del grupo de enfermedades que se tratan actualmente mediante terapia celular, por ejemplo, pero sin limitarse a aplicaciones de terapia celular alogénica, terapia con células madre embrionarias humanas, terapia con células madre neurales, terapia con células madre mesenquimatosas y aplicaciones de trasplante de células madre hematopoyéticas.

Las terapias con células alogénicas intentan desarrollar tales productos para tratar estados que incluyen enfermedad de Crohn y una variedad de afecciones vasculares. La investigación con células madre embrionarias humanas se ha usado como base para varias aplicaciones terapéuticas, incluyendo posibles tratamientos para la diabetes y la enfermedad de Parkinson. En las terapias con células madre neurales, las células madre neurales (NSC) son objeto de investigación en curso para posibles aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, para tratar varios trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. La terapia con células madre mesenquimatosas se usa para una amplia gama de tratamientos incluyendo terapias inmunomoduladoras, regeneración ósea y cartilaginosa, regeneración del miocardio y el tratamiento del síndrome de Hurler, un trastorno esquelético y neurológico. Según una realización adicional de la presente invención hPL o una fracción que se enriquece con las hPLEV puede usarse para la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente provocadas por bacterias, virus, hongos o parásitos. Una realización preferida es el tratamiento de enfermedades infecciosas en dermatología, tales como celulitis, erisipela, hidradenitis supurativa, impétigo y ectima, linfadenitis, linfangitis, infecciones cutáneas necrotizantes o dermatitis exfoliativa estafilocócica. Una aplicación preferida adicional de la preparación de la invención es la aplicación en el contexto de indicaciones en las que un tratamiento con plaquetas o un tratamiento con plasma rico en plaquetas se describe en la técnica anterior para tener un efecto positivo. De la técnica anterior se sabe que existe una apreciación creciente de las importantes funciones de las plaquetas relacionadas con la inflamación y la inmunidad, tanto en la salud como en la enfermedad. Varios estudios han demostrado que el impacto de las plaquetas en los procesos inflamatorios oscila desde la aterosclerosis hasta las enfermedades infecciosas, lo que convierte a las plaquetas en el tipo de célula circulante más numerosa que tiene una función inmunológica. Las plaquetas interactúan con los glóbulos blancos y las células endoteliales vasculares, directamente por mecanismos dependientes del contacto e indirectamente por mecanismos de mediadores inmunitarios secretados. Por tanto, los efectos inmunitarios mediados por plaquetas se producen localmente en los sitios de activación y deposición de las plaquetas, o sistémicamente en ubicaciones distantes de la propia activación plaquetaria misma.

Las plaquetas son más conocidas como mediadores celulares de la trombosis (véase Craig N. Morrell et al. 2014. “Emerging roles for platelets as immune and inflammatory cells” Blood: 123 (18)). En este artículo se describe que ahora existe una creciente apreciación de los importantes papeles inmunitarios e inflamatorios de las plaquetas tanto en la salud como en la enfermedad. Varios estudios han demostrado que el impacto de las plaquetas sobre los procesos inflamatorios oscila entre la aterosclerosis y las enfermedades infecciosas, lo que convierte a las plaquetas en el tipo de célula circulante más numerosa que tiene una función inmunitaria. Las plaquetas interactúan con los glóbulos blancos y las células endoteliales vasculares tanto directamente por mecanismos dependientes del contacto como indirectamente a través de mecanismos secretados impulsados por mediadores inmunitarios. Por tanto, los efectos inmunitarios de las plaquetas se observan tanto localmente en los sitios de activación y deposición plaquetaria como sistémicamente en ubicaciones distantes de la propia activación plaquetaria misma. Craig N. Morrell et al. concluyen que las interacciones de las plaquetas con las células inflamatorias pueden mediar en las respuestas proinflamatorias, pero es probable que estas interacciones hayan evolucionado para ser beneficiosas para limitar la infección. Por ejemplo, con una brecha en la piel existe exposición a patógenos, y al combinar las funciones de reclutamiento inmunitario y trombótico, las plaquetas pueden ayudar a enfocar la hemostasia y las respuestas inmunitarias contra posibles agentes infecciosos para prevenir la invasión de patógenos. Sin embargo, las interacciones continuas o crónicas de las plaquetas con los glóbulos blancos o las células endoteliales pueden conducir a efectos adversos por una estimulación inmunitaria excesiva y una lesión inflamatoria, véase Craig N. Morrell et al. (2014). Se sabe de la técnica anterior que las plaquetas tienen un efecto positivo en el contexto de la regeneración de axones, la curación de heridas y la reducción del dolor (Kuffler DP et al. en Mol Neurobiol. Octubre de 2015; 52 (2): 990-1014).

Según la presente invención, se ha encontrado que los importantes papeles inmunitarios e inflamatorios de las plaquetas pueden sustituirse en parte y las propiedades regenerativas pueden mejorarse mediante el uso de hPL o hPLEV en lugar de las plaquetas vivas.

Las indicaciones preferidas comprenden, por tanto, cicatrización de heridas, regeneración de tejidos, lesión nerviosa, tendinitis, osteoartritis, lesión del miocardio, reparación y regeneración ósea y también cirugía plástica y cirugía oral. Según una realización adicional de la presente invención, la preparación está libre células. Estar libre de células en el contexto de la presente invención significa que la preparación está sustancialmente libre de células vivas intactas y fragmentos de células. Las fracciones con hPLEV de la invención son preferiblemente preparaciones libres de células, que están enriquecidas con EV mientras que se reducen otros componentes.

Según una realización adicional de la presente invención, el hPL o la fracción que se enriquece con las hPLEV es el principio farmacéuticamente activo esencial en la preparación.

Ser el principio farmacéuticamente activo esencial significa que el hPL o la fracción que se enriquece para las hPLEV poseen un valor terapéutico o de otro tipo cuando se administran a un ser humano. Ser el principio farmacéuticamente activo esencial significa también que la preparación está sustancialmente libre de otros principios farmacéuticamente activos excepto el lisado plaquetario humano, componentes del hPL o la fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de plaquetas humanas.

La preparación según la presente invención puede comprender uno o más excipientes además del lisado plaquetario humano o la fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano. Un excipiente de este tipo podría ser una sustancia natural o sintética formulada junto con el principio activo, por ejemplo, con el propósito de estabilizar a largo plazo, aumentando el volumen de formulaciones sólidas que contienen principios activos potentes (por tanto, a menudo denominados “agentes de carga”, “cargas”, o “diluyentes”), o para conferir una mejora terapéutica sobre el principio activo en la forma de dosificación final, tal como facilitar la absorción del fármaco, reducir la viscosidad o mejorar la solubilidad. Los excipientes también pueden ser útiles en el procedimiento de fabricación, para ayudar en la manipulación del principio activo en cuestión, tal como facilitando la capacidad de flujo del polvo o las propiedades antiadherentes, además de ayudar a la estabilidad in vitro tal como prevención de desnaturalización o agregación a lo largo de la vida útil de almacenamiento esperada. La selección de excipientes apropiados también depende de la vía de administración y la forma de dosificación, así como del principio activo y otros factores.

Según una realización adicional de la presente invención las vesículas extracelulares de la fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano (exosomas) tienen un tamaño de entre aproximadamente 70 y 200 nm, preferiblemente entre aproximadamente 70 y 140 nm, o más preferiblemente entre aproximadamente 70 y 120 nm. “Aproximadamente” significará una desviación de /- 20%. Más preferido, los exosomas son positivos para marcadores de EV o de exosomas característicos, e incluso más preferido, el contenido de proteína de la preparación farmacéutica es mayor de 0,5 mg/ml, preferiblemente mayor de 1 mg/ml. Los marcadores de hPLEV comprenden proteínas de choque térmico (por ejemplo, HSC70), tetraspaninas (por ejemplo, CD9, CD10, CD26, CD53, CD63, CD82), proteínas de la biogénesis de m Vb (por ejemplo, Alix y TSG101), EpCAM o Rab5, pero que carecen sustancialmente de CD81 (que es habitualmente un marcador de superficie de EV general), CD2, CD8, CD11a y CD25 (Koliha et a/, 2016).

Según una realización adicional de la presente invención, las vesículas extracelulares son positivas para al menos uno de los marcadores de EV o de exosomas que consisten en el grupo: CD9, CD41a, CD41b, CD42b, CD61, CD62P y CD63. Preferiblemente las vesículas extracelulares son positivas para 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 de los marcadores de EV o de exosomas mencionados anteriormente.

Ser positivo según la presente invención significa que la intensidad de fluorescencia media del fondo de uno de los marcadores superficiales positivos mencionados anteriormente cuando se lleva a cabo un análisis de plataforma multiplex basado en perlas según el método descrito en Koliha, Nina et al. (2016) es superior a un ejemplo comparativo con vesículas extracelulares derivadas de linfocitos T citotóxicos.

Alternativamente, pueden aplicarse otras técnicas para la detección de proteínas específicas de los marcadores mencionados anteriormente, tal como el análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Según una realización adicional de la presente invención, las vesículas extracelulares son negativas para al menos uno de los marcadores de superficie que consisten en el grupo CD81, CD3, CD4, CD19, CD20, CD2, CD8, CD11 a y CD25. Preferiblemente, las vesículas extracelulares son negativas para 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 de los marcadores de exosomas celulares mencionados anteriormente.

Para demostrar la calidad de las fracciones enriquecidas con hPLEV, deben cumplirse varios criterios de caracterización general sobre las propiedades biológicas y biofísicas de las EV contenidas. El estado de la técnica para tal caracterización son los criterios y normas recomendados por la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV). Basándose en los últimos conocimientos científicos en el campo de las EV, estos criterios deben usarse para atribuir cualquier carga o función biológica específica a las EV.

Criterios/normas básicos de calidad:

1. Determinación del contenido de proteínas [mg/ml] mediante métodos convencionales de cuantificación de proteínas usando ensayos de BCA, ensayos similares como el ensayo Bradford o instrumentos basados en espectrometría (como el “NanoDrop”).

2. Determinación del tamaño medio de partícula [nm] y la distribución del tamaño [curvas] usando la plataforma de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), tal como Nanosight y Zetaview, o la citometría de flujo de corriente de imágenes, tal como “Amnis”, que permite el análisis de EV en un solo nivel de partículas.

3. Detección semicuantitativa de proteínas marcadoras de EV típicas, incluyendo proteínas EV o exosomales (SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo Western, detección con anticuerpos específicos, detección de la señal). En general, el contenido de EV depende en gran medida del origen celular, del preacondicionamiento de las líneas celulares productoras y del método de preparación. Sin embargo, las EV tales como los exosomas, presentan un conjunto común de marcadores generalmente esperados que pueden usarse para su caracterización. Los marcadores más usados son las tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), proteínas de unión a membrana o derivadas de endosomas (TSG101, anexinas, Rabs, sintenina, flotilinas) y proteínas chaperonas (HSC70, HSP90). En el caso de Las PL-EV, carecen característicamente de CD81.

4. Determinación de la pureza mediante comparación semicuantitativa de lisados celulares y fracciones de PL-EV. Las fracciones de PL-E^v no deben contener residuos celulares como proteínas del retículo endoplásmico (por ejemplo, Grp94, calnexina), del aparato de Golgi (por ejemplo, GM130) o de las mitocondrias (por ejemplo, prohibitina, citocromo C). Estos marcadores pueden usarse como marcadores negativos. Además, las proteínas nucleicas (histonas, complejo argonauta/RISC) podrían usarse como ejemplos para controles negativos.

Para 3 4: Los enfoques analíticos para la detección de marcadores de EV típicos pueden incluir inmunotransferencia de tipo Western (WB), citometría de flujo (de alta resolución) o análisis proteómico global utilizando técnicas de espectrometría de masas. La caracterización adicional de las fracciones enriquecidas con PL-EV se basa en los siguientes métodos:

Proteómica

Los enfoques analíticos para el perfil de proteínas de las hPLEV que incluyen inmunotransferencias de tipo Western (WB), citometría de flujo (de alta resolución) o análisis proteómico global mediante espectrometría de masas también están en el estado de la técnica para la caracterización de otros marcadores de EV, tales como marcadores inmunológicos, marcadores de señalización, citocinas y otros contenidos de proteínas bioactivas asociadas.

Análisis de microalineamiento de ARN de las hPLEV

Para obtener el perfil del ARN de hPLEV, puede aplicarse tecnología de microalineamiento. Los microalineamientos son una técnica bien establecida para analizar la expresión de fragmentos conocidos de ácidos nucleicos usando medios basados en portaobjetos o chips. Hay microalineamientos disponibles para cribar especies de ARNm, miARN y ARN largo no codificante (ARNlnc).

Lipidómica

Los lípidos y las proteínas asociadas a las balsas lipídicas en las membranas vesiculares dotan a las vesículas extracelulares de estabilidad e integridad estructural. Comparado con sus células de origen, las hPL-EV deberían presentar una composición lipídica similar.

Las PL-EV pueden estar enriquecidas en fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina disaturada, fosfatidilcolina disaturada, esfingomielina, gangliósido y colesterol. Para la identificación de la composición y razón lipídica, pueden usarse espectrometría de masas, citometría de flujo u otros ensayos convencionales.

Matrices de citocinas

Análisis de citocinas de fracciones enriquecidas con EV basándose en ensayos ELISA

Las fracciones que contienen hPLEV pueden analizarse de manera semicuantitativa para determinar los perfiles de citocinas usando, por ejemplo, matrices de citocinas basadas en membranas disponibles comercialmente. Las citocinas incluyen quimiocinas, factores de necrosis tumoral, interleucinas, interferones y factores estimulantes de colonias. La técnica proporciona un método muy sensible para la detección de muchas proteínas definidas diferentes en paralelo (por ejemplo, 200 citocinas). Pueden detectarse cantidades de proteína de solo unos pocos picogramos. El ensayo se basa en membranas a las que se unen anticuerpos primarios específicos inmovilizados. Las citocinas contenidas en el líquido circundante se unen a estos anticuerpos primarios durante la incubación. En una reacción siguiente, se forma un denominado “complejo sándwich” en el que los anticuerpos secundarios unidos a biotina se unen a los anticuerpos primarios. Como resultado, el complejo anticuerpo-citoquina está marcado con biotina. La estreptavidina unida a HRP u otras moléculas marcadoras pueden unirse a biotina y, debido a esto, hacer que el complejo sea detectable por quimioluminiscencia, calorimetría o luz IR. Las señales de detección pueden compararse con señales de un patrón conocido; en el caso de la quimioluminiscencia, pueden realizarse mediciones densitométricas de las señales para comparar las proteínas analizadas.

Ensayos funcionales in vitro

Ensayos in vitro para analizar el impacto de las hPLEV sobre las células inmunitarias

Las posibles capacidades inmunomoduladoras de las fracciones de EV enriquecidas deben definirse al menos en un ensayo in vitro con células del sistema inmunitario humano (por ejemplo, PBMC). El principio de un ensayo de este tipo es el análisis de los efectos inmunomoduladores sobre las células inmunitarias en presencia o ausencia de las hPLEV. Para este problema, se usan análisis citométricos de flujo. Para inducir una respuesta inmunitaria, las células se estimulan añadiendo, por ejemplo, PHA (fitohemaglutinina), PMA (forbolmiristatoacetato), ionomicina, anticuerpos monoclonales, antígenos (como cándida o proteínas bacterianas) u otros posibles componentes incluso de los kits de activación disponibles comercialmente. También podrían ser aplicables métodos como la reacción mixta de linfocitos (MLR). La activación podría inducirse de manera inespecífica (usando, por ejemplo, PHA) en todas las PBMC, o específicamente, por ejemplo, selectivamente sólo en células T u otras subpoblaciones de PBMC definidas. Mediante la estimulación, se activan las células inmunitarias, que pueden detectarse, entre otras cosas, mediante un cambio en el perfil de expresión de los marcadores de superficie de las células. Más tarde, también podría detectarse una actividad de proliferación creciente (en el caso de células T, por ejemplo), si el estímulo es lo suficientemente fuerte. En presencia de las fracciones enriquecidas con hPLEV, las diferencias (tal como la supresión de la proliferación de células T y la expresión de marcadores de activación) en el control celular sin las EV deberían ser detectables.

Ejemplo para un ensayo de este tipo: “ensayo PBMC-CFSE-PHA”:

El “ensayo PBMC-CFSE-PHA” puede usarse para el análisis de la proliferación celular inducida por PHA en presencia de fracciones enriquecidas con hPLEV. CFSE (carboxifluoresceína-succinimidiléster) es un tinte fluorescente que puede usarse para el seguimiento celular mediante un citómetro de flujo para el análisis. La molécula precursora CFSE-SE (carboxifluoresceína-diacetato-succinimidiléster) se difunde pasivamente en las células, es escindida por enzimas intracelulares y puede detectarse por fluorescencia. Debido a cada división celular, las células marcadas con CFSE en proliferación disminuyen en su intensidad de fluorescencia en un 50%. Las PBMC aisladas teñidas con CFSE se cultivan durante 5 días en placas de 24 pocillos para células en suspensión en medio RPMI suero AB humano al 10%, en presencia o ausencia de EV. La estimulación celular se induce directamente después de comenzar el cultivo con 200-300 ng de PHA (día 0) por pocillo. Se cultivan 200000 células en un volumen de 400 pl por pocillo. Después de 5 días, las células pueden analizarse mediante citometría de flujo. En comparación con el día 0, una disminución de la fluorescencia indica altas tasas de proliferación, la fluorescencia estable muestra la supresión de la proliferación debido a los efectos de las EV. De manera adicional, también puede analizarse la expresión de marcadores de activación en diferentes puntos de tiempo. Mediante tinción de anticuerpos conjugados específicos, las subpoblaciones celulares de células inmunitarias pueden discriminarse y analizarse por separado.

Ensayos in vitro para analizar el impacto de las hPLEV sobre la angiogénesis:

La angiogénesis es un proceso fundamental en todas las fases de crecimiento y desarrollo, así como en la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos en las enfermedades vasculares isquémicas. En el procedimiento angiogenético, surgen nuevos capilares a partir de la vasculatura preexistente y el proceso está controlado por un equilibrio sensible de factores proangiogénicos y antiangiogénicos. Las células endoteliales se activan en respuesta a estímulos angiogénicos tales como lesiones, inflamación e hipoxia.

El ensayo de formación de tipo tubo

Uno de los ensayos in vitro más usados para modelar la etapa de reorganización de la angiogénesis es el ensayo de formación de tubos. El ensayo mide la capacidad de las células endoteliales para formar estructuras de tipo capilar (tubos). La formación de tubos se cuantifica normalmente midiendo el número, la longitud o el área de estas estructuras de tipo capilar en imágenes microscópicas bidimensionales de la placa de cultivo.

El ensayo de cicatrización de heridas

El ensayo de raspado se usa para medir la migración celular in vitro. Las etapas básicas implican crear un “raspado” en una monocapa celular de una población homogénea, capturar las imágenes al principio y a intervalos regulares durante la migración celular para cerrar el raspado y comparar las imágenes para cuantificar la tasa de migración de las células microscopía de obtención de imágenes en vivo. Estos ensayos pueden usarse para estudiar el efecto de las hPL-EV sobre la angiogénesis en interacciones de célula a célula y las migraciones de células que pueden imitar la migración de células durante la cicatrización de heridas in vivo.

Criterios/normas de seguridad básicos para el uso de las hPLEV en las clínicas:

Es necesario controlar la seguridad, la posible toxicidad y la inmunogenicidad para la aplicación de las hPLEV en las clínicas. Según la legislación para tejidos y células, y ATMP (“Arzneimittel für neuartige Therapien", “fármacos para terapias novedosas”) es necesario considerar una plataforma de criterios mínimos para caracterizar las especialidades farmacéuticas a base de células humanas antes de su uso en ensayos clínicos. En resumen, debe abordarse si los productos (a) son de origen autólogo, alogénico o xenogénico; (b) se manipulan extensa o mínimamente in vitro y (c) son inmunológicamente activos o neutros. Además, debe definirse (d) la capacidad proliferativa de las células y e) la organización celular o similar a un tejido, así como la interacción dinámica entre las células con componentes estructurales y (f) el uso pretendido.

Generalmente, el hPL según la presente invención se origina a partir de cualquier muestra de sangre humana imaginable que comprenda plaquetas. Según una realización adicional de la presente invención, el lisado plaquetario humano proviene de concentrados de plaquetas tales como, por ejemplo, el denominado plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP es un concentrado de plaquetas en derivado de plasma de la sangre completa de un paciente, centrifugado para eliminar los glóbulos rojos y otros componentes no deseados. Tiene una mayor concentración de factores de crecimiento que la sangre completa y se ha usado como inyección de tejido en una variedad de disciplinas, incluida la odontología, la cirugía ortopédica y la medicina deportiva. Los concentrados de plaquetas pueden, por ejemplo, provenir de concentrados de plaquetas extraídos de la capa leucocitaria o de trombocitaféresis.

Según la presente invención, las vesículas extracelulares pueden comprender factores biológicos, tales como material genético, por ejemplo, ARNm, microARN (miARN), pequeñas cantidades de ADN, lípidos y proteínas, incluyendo factores de transcripción, citocinas y factores de crecimiento.

Dado que la preparación farmacéutica de la invención deriva de plaquetas, comprende normalmente diversos factores de crecimiento, particularmente uno o más de, preferiblemente todos los siguientes factores de crecimiento: PDGF, VEGF, FGF, EGF, TGF, especialmente TGF-p y CTGF. La composición comprende preferiblemente 2, 3, 4, 5 ó 6 de estos factores de crecimiento. Los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) promueven el crecimiento y la generación celular, la reparación de los vasos sanguíneos y la producción de colágeno. Los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) promueven el crecimiento y la generación de células endoteliales vasculares. Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) promueven la reparación de tejidos, el crecimiento celular, la producción de colágeno y la producción de ácido hialurónico. El factor de crecimiento epitelial (EGF) promueve el crecimiento de las células epiteliales, la angiogénesis y la cicatrización de heridas. Los factores de crecimiento transformantes (TGF), especialmente el TGF-p, promueven el crecimiento y la neogénesis de las células epiteliales y la cicatrización de heridas. Los factores de crecimiento del tejido conjuntivo (CTGF) promueven la reparación de heridas. Por tanto, la preparación farmacéutica de la invención promueve la formación de nuevos fibroblastos. Estos nuevos fibroblastos comienzan elásticos y saludables, produciendo nuevo colágeno y menos metaloproteasas. La restauración de los fibroblastos (las principales células que sintetizan, mantienen y proporcionan el marco estructural) da como resultado una piel más sana y restaurada. También se ha demostrado que el PDGF aumenta la motilidad de los fibroblastos, lo que permite que los fibroblastos se reubiquen en el sitio de administración. Los factores de crecimiento naturales encontrados en los gránulos alfa de las plaquetas (tales como PDGF, VEGF, FGF, EGF y TGF) promueven la producción de colágeno y ácido hialurónico, la reparación de tejidos, el crecimiento y la regeneración de células endoteliales y células epiteliales, y la formación de nuevos vasos sanguíneos. (que restaura el oxígeno y elimina las moléculas no deseadas). Todos estos factores ayudan a regenerar la matriz extracelular (MEC) arrugada y dañada a su estado saludable. Cada uno de estos factores de crecimiento desempeñan un papel en la regeneración y restauración de la piel, tanto individual como aditivamente en concierto entre sí. Los tratamientos que estimulan la producción de colágeno nuevo y no fragmentado mejorarán sustancialmente el aspecto y la salud de la edad.

Según una realización adicional, la preparación de la presente invención, por ejemplo, las fracciones enriquecidas con hPLEV de la invención comprenden factores biológicos, tales como proteínas, citocinas (por ejemplo, IFN-y, IL-8, IL-10, TGF-pI y HLA-G, RANTES, Nap-2) y/o ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, microARN.

Una preparación según la presente invención podría contener citocinas con propiedades antimicrobiológicas. Una preparación de la invención podría comprender particularmente altas cantidades de la citocina RANTES o la citocina NAP-2 o de ambas citocinas en comparación con los niveles de otras citocinas presentes.

Las citocinas RANTES y NAP-2 se han descrito por sus propiedades antimicrobiológicas, por ejemplo. en el artículo Mariani et al. (2015) (BMC Microbiology 15:149). Las propiedades antimicrobiológicas de la preparación según con la presente invención pueden medirse según el método subyacente en la figura 2-figura 7 de Mariani et al. y sirve como método de referencia.

En el contexto de la presente invención, se prevé que la preparación sea adecuada para, por ejemplo, la administración o infusión intravenosa, o para inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraósea, inyección intracerebroventricular, inyección intramuscular, inyección intraocular o para administración tópica.

La presente invención también se refiere a una preparación farmacéutica que comprende una fracción enriquecida de vesículas extracelulalres derivadas de plaquetas humanas que puede obtenerse a partir de un método que comprende las etapas de:

a) proporcionar lisado plaquetario humano a partir de plaquetas donadas por un único donante o a partir de plaquetas donadas por donantes agrupados de al menos 15 donantes, preferiblemente de al menos 20 o de al menos 30 o de al menos 40 donantes.

b) enriquecer las vesículas extracelulares que provienen del lisado plaquetario humano

c) opcionalmente, determinar un efecto in vitro tal como un efecto inmunomodulador, en particular un efecto antiinflamatorio y/o efecto inmunosupresor, de dichas vesículas extracelulares enriquecidas mediante, por ejemplo, una proliferación reducida de IL-Ip, TNF-a, células T, y

d) opcionalmente, seleccionar las fracciones de vesículas extracelulares enriquecidas que presentan el efecto in vitro tal como un efecto inmunomodulador, en particular un efecto antiinflamatorio y/o efecto inmunosupresor, e) opcionalmente, seleccionar las vesículas extracelulares enriquecidas de la etapa b) que presentan vesículas extracelulares negativas para el marcador de EV/exosomas CD81 y positivas para el marcador de EV/exosomas CD9, y

f) opcionalmente, mezclas dichas vesículas extracelulares enriquecidas de la etapa b), d) o e) con al menos un excipiente y/o portador farmacéutico adecuado.

Según una realización de la invención hEl PL de la etapa a podría derivar de plaquetas que se hayan incubado antes de la lisis con uno o más compuestos conocidos como activadores de trombocitos de la técnica anterior, por ejemplo, técnica anterior relacionada con la terapia con PRP, que activan las plaquetas y, por tanto, mejoran la calidad de la preparación de la invención.

Según una realización de la invención el hPL de la etapa a podría derivarse de la sangre del cordón umbilical humano. Las preparaciones de lisis de plaquetas de sangre de cordón umbilical humano se conocen de la técnica anterior (por ejemplo, los documentos US 8501170 B2, Parazzi, V., C. Lavazza, et al. (2015) o Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015).

En la etapa a) del método de la invención tal como se definió anteriormente debe usarse lisado plaquetario humano que se deriva o bien de plaquetas donadas por un único donante o bien de plaquetas donadas por donantes agrupados de al menos 15 donantes, preferiblemente de al menos 20 o de al menos 30 o de al menos 40 donantes. Si se desea un tratamiento de medicina de precisión, podría ser una ventaja usar lisado plaquetario humano que proviene de la propia sangre del paciente. Si se desea un tratamiento general, es ventajoso usar un grupo de al menos 15 donantes, preferiblemente de al menos 20 o de al menos 30 o de al menos 40 donantes para evitar posibles desviaciones individuales del lisado plaquetario humano en comparación con un lisado plaquetario humano que proviene de un grupo de al menos 40 donantes.

Podría ser preferible que el hPL de la etapa a) del método tal como se mencionó anteriormente se proporcione a partir de trombocitaféresis o de plaquetas de capa leucocitaria, más preferiblemente de trombocitaféresis.

Los efectos inmunomoduladores mediados por fracciones enriquecidas con hPLEV pueden tener efectos inmunosupresores, que son detectables con los ensayos in vitro mencionados a continuación y la lectura de salida correspondiente. Se observaron fracciones de hPLEV que tenían la capacidad de suprimir la proliferación de células inmunitarias y, por tanto, son inmunosupresoras. Los efectos inhibidores sobre la proliferación de PBMC estimuladas pueden observarse en un ensayo in vitro de este tipo, también para subpoblaciones como células positivas para CD3 (células T) y células negativas para CD3 (incluyendo, por ejemplo, células B, linfocitos T citotóxicos). De manera adicional, los efectos inhibidores sobre la expresión del perfil del marcador de activación de células T (regulación por disminución de CD69 o CD25 en presencia de fracciones de hPLEV.

El método para producir una preparación farmacéutica según la presente invención comprende la etapa de enriquecimiento específico para EV. Tal como se explicó anteriormente, se encontró que las EV abundan en muchos tejidos y líquidos corporales y se han purificado con éxito mediante ultracentrifugación diferencial (Raposo, G. et al. J. Exp. Med. 1996; 183(3):1161-1172). Otros estudios también han demostrado que las EV pueden aislarse usando ultracentrifugación en un gradiente de densidad continuo de sacarosa (Escola JM et al., J Biol Chem. 7 de agosto de 1998; 273(32):20121-7). Los exosomas también se han aislado mediante métodos de captura por inmunoafinidad usando lectinas o anticuerpos contra marcadores domésticos exosomales tales como CD63, CD81, EpCAM o Rab5 (Barres C et al., Blood. 21 de enero de 2010; 115(3):696-705 y Chen, Lab Chip. 21 de febrero de 2010; 10(4):505-11).

Generalmente, puede usarse cualquier método adecuado para purificar y/o enriquecer, tales como métodos que comprenden precipitación con PEG, técnicas monolíticas, partículas magnéticas, filtración, diálisis, ultracentrifugación, ExoQuick™ (Systems Biosciences, CA, EE.UU.), cromatografía o filtración de flujo tangencial. Sin embargo, es importante tener en cuenta que, dependiendo del método de aislamiento, los diferentes subtipos de EV pueden enriquecerse e, incluso cuando se derivan de los mismos tipos de células, pueden diferir en sus propiedades funcionales. No obstante, se prefiere un método que comprenda la precipitación de polietilenglicol. Para la producción de una preparación farmacéutica según la presente invención, se prefiere un método en el que las fracciones enriquecidas con EV se analizan adicionalmente en pruebas microbiológicas, pruebas de virulencia, contenido de proteínas, pruebas de pirógenos y tamaño de partícula, con el fin de identificar la fracción más adecuada según la invención.

Pudo encontrarse que las fracciones enriquecidas con las hPLEV fueron particularmente útiles en los métodos según la presente invención, si presentaban fuertes efectos inmunomoduladores en las pruebas de actividad in vitro. Pudo encontrarse que las fracciones enriquecidas con las hPLEV fueron particularmente útiles en los métodos según la presente invención, si presentaban una respuesta reducida de citocinas de IL-Ip, TNF-a y/o IFN-y de las células efectoras de un donante.

Se prefiere además un método según la presente invención, en el que dichos exosomas tienen un tamaño de entre aproximadamente 70 y 200 nm, preferiblemente entre aproximadamente 70 y 140 nm, o más preferiblemente entre aproximadamente 70 y 120 nm. “Aproximadamente” significará una desviación de /- 20%. Más preferido, los exosomas son positivos para marcadores de EV/exosomas, y aún más preferido, el contenido de proteína de la preparación farmacéutica es mayor de 0,5 mg/ml y más preferido mayor de 1 mg/ml (dependiendo del volumen de resuspensión/elución final y el volumen de PL inicial que se procesa).

Se encontró que las fracciones enriquecidas con hPLEV fueron particularmente útiles en los métodos según la presente invención, si presentaban fuertes efectos inmunomoduladores in vitro en las pruebas de actividad, y en los que, tras la adición de dicha fracción de EV, pudo encontrarse una respuesta reducida de citocinas de IL-ip, TNF-a y/o IFN-y de las células efectoras de un donante. Los ensayos ELISpot mostraron que la respuesta de las citocinas IL-ip, TNF-a y/o IFN-y de las células efectoras se alteran hacia las células alogénicas en presencia de fracciones que contienen exosomas. Otros métodos que podrían usarse para analizar los posibles efectos inmunomoduladores in vitro, que incluyen, por ejemplo, Luminex, ELISA y/o citometría de flujo.

Por tanto, la presente invención se basa en el concepto novedoso para una prevención y tratamiento mejorados de enfermedades, particularmente en pacientes que padecen un riesgo de enfermedades impulsadas por inflamación, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades inmunitarias/autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades dermatológicas, rechazos de trasplantes, EICH, accidente cerebrovascular e isquemia y complicaciones asociadas, por ejemplo, para evitar reacciones inflamatorias antes o durante la cirugía, y la prevención de estados y reacciones inflamatorios de pacientes que están conectados a una máquina de soporte vital. En una realización, las enfermedades pueden seleccionarse entre daños prenatales o posnatales del sistema nervioso, tal como, por ejemplo, daños cerebrales relacionados con hipoxia, inflamación y/o isquemia. En otra realización, las enfermedades pueden seleccionarse entre enfermedad de injerto contra huésped o rechazos de trasplantes después de trasplantes de órganos, respectivamente.

En una realización particularmente preferida de la invención, las fracciones enriquecidas con EV derivadas del hPL que fueron enriquecidos usando un protocolo de precipitación de polietilenglicol, se transfunden profiláctica y/o terapéuticamente a pacientes, en particular neonatos y/o pacientes que reciben trasplantes y/o pacientes que se someten a cirugía.

La preparación farmacéutica según la presente invención se enriquece preferiblemente con EV que comprenden factores biológicos, tales como por ejemplo proteínas, tales como citocinas antiinflamatorias, IL-10, TGF-pI y HLA-G, y/o ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, miARN. Esto conduce a la ventaja adicional según la invención de que a) se realiza una intervención multimodal (compleja), b) se usan sustancias biológicas fisiológicas (“propias”) y c) se reducen los efectos secundarios no deseados de la preparación.

La presente invención constituye una intervención multimodal. Por tanto, no sólo se usa un factor específico (y sólo se intervendría con una parte de la cascada (o del fenotipo clínico subyacente)), sino que se usan mediadores y moduladores biológicamente complejos y endógenos. Estos componentes se encuentran en todos los seres humanos, y por tanto no se esperan efectos secundarios adversos significativos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la producción de una preparación farmacéutica según la presente invención, que comprende las siguientes etapas de: a) proporcionar hPL, b) enriquecer dicho hPL con hPLEV, que comprenden opcionalmente precipitación de polietilenglicol, c) determinar un efecto inmunomodulador in vitro, en particular un efecto antiinflamatorio y/o efecto inmunosupresor, de dicha fracción enriquecida con hPLEV mediante, por ejemplo, proliferación reducida de IL-Ip, TNF-a, células T y/o respuesta de citocinas IFN-y de las células efectoras de un donante, d) seleccionar aquellas fracciones enriquecidas con hPLEV que presentan un efecto inmunomodulador, en particular un efecto antiinflamatorio y/o un efecto inmunosupresor, y e) mezclar dichos exosomas enriquecidos de la etapa d) con al menos un excipiente y/o portador farmacéutico adecuado.

Según una realización adicional de la presente invención, la administración es adecuada, por ejemplo, para la administración o infusión intravenosa, o para inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraósea, inyección intracerebroventricular, inyección intramuscular, inyección intraocular o para administración tópica. La administración tópica podría ser, por ejemplo, aplicada mediante productos cosméticos para la piel o esparadrapos, compresas para heridas, etc. prefabricados o pretratados o dotados de una preparación de la invención.

Un aspecto adicional de la presente invención es un método de fabricación de una preparación farmacéutica o una preparación de diagnóstico o una preparación cosmética que comprende la etapa de añadir lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano a la preparación farmacéutica o una preparación de diagnóstico o una preparación cosmética.

La presente invención incluye dentro de su alcance preparaciones que contienen como principio activo una cantidad terapéuticamente eficaz de hPL o una fracción con hPLEV, solos o en combinación con un portador o diluyente farmacéutico. Según las formas de dosificación deseadas, el experto en la técnica podría elegir el portador adecuado. Las formas de dosificación comprenden, por ejemplo, comprimidos, gránulos, cápsulas, formas de dosificación líquidas, gel, supositorio, crema, pomada, apósito o parche. Una realización preferida es la combinación de una fracción con las hPLEV con una matriz polimérica adecuada, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO2013076507. Se prefiere además la aplicación intravenosa en una disolución de NaCl al 0,9%.

Las aplicaciones cosméticas de la preparación de la presente invención podrían formularse con excipientes adecuados. Generalmente lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano según la presente invención pueden sustituir al PRP cuando se aplica en cosméticos. La terapia con PRP se ha aplicado a muchos campos médicos diferentes, tales como cirugía estética, odontología, medicina deportiva y analgesia. El PRP se ha convertido, por ejemplo, en un procedimiento no quirúrgico muy solicitado para el rejuvenecimiento facial y cutáneo. La terapia con PRP es un tratamiento que usan las propias plaquetas de los donantes de sangre para estimular el crecimiento de nuevas células, lo que ayuda a mejorar la tez, la textura de la piel y restaurar el volumen facial perdido.

Según una realización de la presente invención, la terapia con PRP puede sustituirse por una preparación cosmética que comprenda hPL o una fracción de las hPLEV en lugar de PRP. El hPL autólogo o una fracción de hPLEV del propio donante de sangre se vuelven a inyectar en la piel para estimular el colágeno y las nuevas células cutáneas. El hPL o una fracción de las hPLEV aprovechan las funciones beneficiosas de las propias plaquetas del paciente y, por tanto, no existe riesgo de alergia o rechazo del tratamiento. El hPL o una fracción de las hPLEV también pueden usarse con éxito para tratar el debilitamiento del cabello y la alopecia, especialmente la calvicie de patrón masculino. Puede ser importante que un paciente comience un tratamiento temprano.

Una realización preferida de la presente invención es la aplicación de hPL o una fracción de las hPLEV en la regeneración de la piel, tal como terapias antienvejecimiento, quemaduras solares, reacciones alérgicas tras una picadura de insecto, reacciones cutáneas autoinmunitarias o alérgicas, inflamaciones por acné. El hPL o una fracción de las hPLEV pueden formar parte de composiciones cosméticas para el tratamiento de la piel o el cabello. La invención proporciona una terapia regenerativa que aborda directamente cada uno de los problemas asociados con las arrugas y mejora la piel y el armazón subyacente. El tratamiento con una preparación descrita en la invención revierte el ciclo degenerativo de la piel dañada a la fisiología saludable encontrada en la piel normal. La preparación de la invención funciona reequilibrando las células dentro de los tejidos conjuntivos, equilibrando la señalización molecular y restaurando la matriz extracelular. El proceso natural de cicatrización y regeneración de tejidos conduce a una mayor síntesis de colágeno, regeneración de la matriz extracelular de colágeno y proliferación de los fibroblastos dentro de la matriz.

Uso diagnóstico

Según la presente invención basada en las hPLEV, pueden establecerse pruebas de diagnóstico in vitro para su uso en aplicaciones de diagnóstico y monitorización de enfermedades en tiempo real. Las hPLEV pueden usarse como biomarcadores de diagnóstico de enfermedades a través de un análisis de sangre no invasivo. El contenido específico de la preparación de hPLEV de un donante individual puede usarse como biomarcador para enfermedades tumorales o enfermedades relacionadas con enfermedades inflamatorias.

Para obtener una mejor comprensión de la presente invención y de sus ventajas, el siguiente ejemplo se menciona únicamente con fines ilustrativos. El ejemplo no pretende limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplos

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, recombinación de ADN e inmunología, que están dentro de las capacidades de experto habitual en la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, ADN Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: ADN Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of ADN Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual por Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; y Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, ad Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams y Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3.

Ejemplo 1: ejemplos de métodos de preparación de plasma rico en plaquetas

1.1. Concentrado de plaquetas (PRP-PC)

Se recogen 450 ml de sangre completa en una bolsa triple de 450 ml que contiene anticoagulante CPDA1 (TERUMO PENPOL, Ltd. Puliyarakonam, Trivandrum, India). Se separa el plasma rico en plaquetas de la sangre completa mediante centrifugación ligera mediante una centrifuga refrigerada Heraeus 6000i, Alemania a 1750 rpm durante 11 minutos a 21°C, con curvas de aceleración y desaceleración de 5 y 4 respectivamente, y se concentran las plaquetas mediante centrifugación intensa a 3940 rpm durante 5 minutos a 21°C, con curvas de aceleración y desaceleración de 9 y 5 respectivamente con la eliminación posterior del plasma sobrenadante. Se deja estacionaria la bolsa de concentrado de plaquetas con la etiqueta hacia abajo a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Se congela rápidamente el plasma pobre en plaquetas y se almacena como plasma fresco congelado (FFP) a -30°C o menos durante un año.

Método de preparación de concentrado de plaquetas de la capa leucocitaria (BC-PC)

Se recogen 450 ml de sangre completa en una bolsa cuádruple de 450 ml que contiene 63 ml de anticoagulante CPD, con disolución aditiva (SAGM). (TERUMO PENPOL, Ltd., Puliyarakonam, Trivandrum, India). Se somete primero la sangre completa a centrifugación de “centrifugado fuerte” a 3940 rpm durante 5 minutos a 21°C con curvas de aceleración y desaceleración de 9 y 4 respectivamente. Se separa la sangre completa en diferentes componentes según su densidad relativa.

• La fase superior - plasma sobrenadante pobre en plaquetas (150-200 ml).

• Fase media - capa leucocitaria, que contiene aproximadamente el 90% de plaquetas, el 70% de WBC (white blood cells, glóbulos blancos) y el 10% de glóbulos rojos.

• Fase inferior - concentrado de hematíes.

Se expresa el sobrenadante pobre en plaquetas en una bolsa satélite y la capa leucocitaria en otra bolsa satélite. Se devuelven aproximadamente 20-30 ml de plasma a la capa leucocitaria con el objetivo de limpiar el tubo de las células residuales y obtener una cantidad adecuada de plasma en la BC. Se añade la disolución de SAGM a los glóbulos rojos. Luego se retiran las bolsas que contienen glóbulos rojos y plasma. Se colocan los glóbulos rojos a 4°C en una cámara fría y el plasma pobre en plaquetas en un congelador a -40°C como plasma fresco congelado (FFP). Se mezcla suavemente la capa leucocitaria con el plasma y se somete nuevamente a centrifugación de “centrifugado ligero” a 1100 rpm durante 6 minutos a 21°C, con curvas de aceleración y desaceleración de 5 y 4 respectivamente, junto con una bolsa satélite vacía. Se expresó el sobrenadante, plasma rico en plaquetas, en una bolsa de almacenamiento de plaquetas vacía y luego se selló el tubo Se desechó la bolsa con WBC y glóbulos rojos residuales.

1.2. Trombocitoaférisis de donante único (SDP)-PC

El equipo separador de celdas automatizado puede ser una técnica de flujo intermitente o de celda de flujo continuo, usando acceso venoso simple o doble. Flujo continuo, doble acceso venoso, separador de células automatizado: puede usarse CS3000 ® plus, Baxter, división Fenwal, Deerfield, 1460015, EE.UU.

1. Se obtiene el consentimiento por escrito del donante después de explicarle el procedimiento en detalle, el tiempo que toma y los posibles riesgos y beneficios.

2. El acceso venoso es una consideración importante en los donantes mediante aféresis y las venas se examinan en el momento de la selección debido a las siguientes razones:

^o Larga duración del procedimiento

^o Velocidad de flujo prolongada

^o Necesidad frecuente de dos venopunciones con un equipo de flujo continuo.

3. Se documenta la edad de los donantes.

4. Antes del procedimiento de aféresis, se realiza la determinación del grupo sanguíneo ABO/Rh y las pruebas para determinar marcadores de enfermedades infecciosas (VIH, VHB, VHC, VDRL y malaria) de los donantes de trombocitaféresis.

5. Los donantes que han tomado aspirina u otros AINE, que probablemente afecten la función plaquetaria, se aplazan.

6. Aquellos donantes que tienen un recuento de plaquetas > 1,5 x 105/pl se tomaron para trombocitoaféresis.

1.3. Procedimiento

Se realiza el procedimiento en un sistema cerrado. Se instala un kit desechable en el separador de flujo continuo, luego se ceba la máquina. Se prepara el donante mediante la limpieza de dos sitios de venopunción en el área antecubital de ambos brazos con Betadine y se realiza una flebotomía con alcohol con un traumatismo mínimo para el donante. Durante el procedimiento, se anticoagula la sangre en el punto de extracción de manera controlada y se mantiene la proporción de sangre completa y anticoagulante (ACD) en de 9:1 a 11:1. Se bombea la sangre anticoagulada a un recipiente de separación giratorio. Se concentran los glóbulos rojos mediante fuerza centrífuga hacia los bordes exteriores del recipiente y luego los glóbulos rojos salen del recipiente de separación. Los componentes de menor densidad, como el plasma, las plaquetas o los WBC, se retiran mediante una bomba de plasma y entran en el recipiente de recogida giratorio donde se concentran las plaquetas mediante la fuerza centrífuga hacia los bordes exteriores del recipiente. Las plaquetas separadas permanecen concentradas en el recipiente, mientras que otros constituyentes de la sangre se devuelven al donante. Al final del procedimiento de extracción, se agita vigorosamente la bolsa de recogida de plaquetas para separar las plaquetas de la pared de la bolsa y se mantiene durante 1 hora a temperatura ambiente para que quede una suspensión uniforme. Todo este procedimiento requiere de 1,5 a 2,5 horas. El volumen final de la aféresis-PC osciló entre 200 y 300 ml.

Ejemplo 2: producción de lisados de trombocitos humanos (hPL)

La producción de lisado de trombocitos humanos (= lisado plaquetario humano (hPL)) se basa en el procesamiento adicional de concentrados de trombocitos humanos caducados (= concentrados plaquetarios humanos (hPC/hTC). Para obtener los hTC se usan habitualmente dos métodos de procesamiento diferentes. Uno se define mediante el uso de productos de la capa leucocitaria agrupados que derivan de donaciones de sangre completa de varios donantes, en la otra se usan concentrados de aféresis. En esta técnica se conecta el donante a un separador celular extracorporal y se separan por filtración los trombocitos, mientras otros componentes sanguíneos como eritrocitos, leucocitos y plasma se devuelven al donante. En ambos casos los productos sanguíneos resultantes son TC reducidos en leucocitos. Estos productos contienen trombocitos vivos durante al menos 4-5 días y pueden usarse, por ejemplo, para reemplazar los trombocitos que faltan en pacientes con trombocitopenia. Después de la fecha de caducidad, el exceso de productos puede usarse para la producción de hPL. Mediante ciclos de congelación y descongelación (-20°C y TA) las plaquetas se rompen/agrietan y liberan su contenido interno en el líquido circundante (plasma). Existen diferentes protocolos que incluyen etapas de centrifugación entre 3200 y 10.000 g durante aproximadamente 1 hora. Las células lisadas, los fragmentos celulares y otros restos se reducen mediante centrifugación. El resultado es un líquido amarillo transparente, intenso, que consiste en lisados plaquetarios y plasma. Para esterilizar el producto después de proceder, pueden usarse opcionalmente filtros de 200 nm. En paralelo, se eliminan las partículas mayores de 200 nm, incluidas las vesículas extracelulares, que no tienen el tamaño de los exosomas.

Ejemplo 3: aislamiento de células mononucleares periféricas (PBMC) usando centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll y cultivo de células in vitro

Se obtienen las células mononucleares periféricas a partir de productos de la capa leucocitaria derivados de una donación de sangre completa. Se realizó el aislamiento de las PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll según la siguiente descripción:

1. Se distribuyeron aproximadamente 100 ml de un producto de la capa leucocitaria en tres tubos de polipropileno de 50 ml a partes iguales. Si fue necesario, el volumen faltante se reemplazó por PBS (solución salina tamponada con fosfato).

2. Se llenan tres tubos de PP de 50 ml adicionales con 10 ml de Ficoll.

3. Vertiendo cuidadosamente 35 ml de sangre en 10 ml de Ficoll, se forman dos fases separadas.

4. Se realiza la centrifugación en gradiente de densidad a 900 g durante 20 minutos a temperaturas de 10°C (intervalo establecido en 0 o 1).

5. Después de la formación del gradiente, se transfiere la interfase que contiene las PBMC a un nuevo tubo de PP de 50 ml.

6. Se llena la fracción recolectada con PBMC hasta 50 ml de volumen usando PBS.

7. Para la reducción de las plaquetas, se realiza una centrifugación a 650 g durante 5 minutos.

8. Se descartan los sobrenadantes que contienen plaquetas.

9. Para la lisis de eritrocitos, las células se resuspenden en 20-25 ml de tampón de lisis seguido por 7 minutos de incubación a 4°C.

10. Se detiene la reacción de lisis llenando PBS hasta un volumen de 50 ml con PBS.

11. Reducción de los fragmentos lisados por centrifugación a 900 g durante 5 min.

12. Se descarta el sobrenadante y se resuspenden las células en 50 ml de PBS.

13. Se cuentan manualmente las células usando una cámara Neubauer o alternativamente de manera automática, por ejemplo, usando el hemocitómetro Sysmex.

14. Se resuspenden las PBMC en medio de cultivo (RPMI, 10% de suero de hAB inactivado con calor, PSG al 1% (penicilina/estreptomicina/L-glutamina) y establecer una concentración apropiada según los siguientes ensayos in vitro.

Ejemplo 4: análisis y caracterización de preparaciones de vesículas extracelulares a nivel molecular

1. Determinación de la concentración de proteína total usando un ensayo BCA (o métodos convencionales alternativos como el ensayo Bradford)

Las concentraciones de proteína total de las fracciones enriquecidas con EV pueden determinarse usando métodos convencionales. Existe una variedad de kits y agentes disponibles comercialmente para este fin. Por ejemplo, se usó el kit de ensayo de proteínas BCA de Thermo Scientific. Dos moléculas de ácido bicinconínico (BCA) forman un complejo de quelato junto con un ión de cobre (1+). La reducción de cobre se produce por la presencia de proteínas en un ambiente alcalino. La formación de complejos de quelatos corresponde a un cambio de color de los líquidos analizados de verde a púrpura. La intensidad del cambio de color puede medirse fotométricamente a una absorción de 562 nm. En comparación con los valores conocidos de los valores de calibración de diferentes concentraciones de BSA, puede determinarse la concentración de proteína de las fracciones de EV.

2. Determinación del tamaño de partícula medio [nm] y distribución de tamaño [curvas] y números de partículas (usando plataformas de NTA como Nanosite o Zetaview)

Para la caracterización de nanovesículas extracelulares, se usó el análisis de rastreo de nanopartículas {Nanoparticle Tracking Analysis, NTA). Esta técnica física es adecuada para rastrear partículas de un tamaño más pequeño que la longitud de onda de la luz. El método se basa en la inducción de un campo eléctrico, en el que las partículas comienzan a moverse. Debido a este movimiento, su movimiento browniano puede rastrearse durante su difusión a través de la cubeta de análisis. Puede definirse el tamaño y la distribución de tamaño de las partículas en una fracción y también se proporcionan valores para las concentraciones de partículas. El análisis de rastreo del movimiento browniano puede seguirse en una pantalla conectada al microscopio de vídeo. El software convierte los datos digitalmente en datos. La determinación del tamaño se calcula mediante la constante de difusión de partículas y se convierte en tamaños de partículas hidrodinámicos. Las concentraciones de partículas se deducen del análisis de las secciones de video y están relacionadas con la cantidad medida de luz dispersa.

Métodos de aislamiento

Los métodos de aislamiento pueden basarse en ultracentrifugación {centrifugación diferencial), cromatografía de exclusión molecular (columnas Izon y Exospin), precipitación basada en polímeros (PEG 1000, PEG 6000, PEG 8000 EV, Exoquick-Qiagen), afinidad de membrana (Exoeasy-Qiagen) y filtración de flujo. No existe una tecnología de punta estandarizada en el estado de la técnica para aislar las EV, ya sea para aplicaciones terapéuticas o para investigación básica. Los criterios para la selección del método de purificación son el volumen inicial del lisado plaquetario que debe procesarse, así como la alta pureza y recuperación de las fracciones de PL-EV enriquecidas. La selección del método de purificación debe estandarizarse con respecto a la reproducibilidad, pureza, impurezas y mantenimiento de las propiedades funcionales de las h PLEV. Los métodos aplicados deben evaluarse en el contexto de su escalabilidad y reproducibilidad. Los métodos que producen la mayor pureza de h PLEV no serán necesariamente óptimos para recuperar las fracciones de EV terapéuticamente más eficaces debido al hecho de que los componentes unidos a la superficie de la hPLEV o aislado conjuntamente con cofactores asociados a no hPLEV pueden perderse durante la purificación.

Almacenamiento de EV

Para el almacenamiento de las EV, actualmente no se dispone de un protocolo estandarizado. Las condiciones de almacenamiento deben validarse porque pueden afectar la estabilidad de las EV. Varios disolventes y tampones de uso común van desde cloruro de sodio hasta PBS, TRIS-HCI, HEPES y glicerol.

Ejemplo 5: principios de centrifugación

La centrifugación se usa para separar componentes, células y para el aislamiento de orgánulos celulares. Se basa en el movimiento de partículas en un líquido provocado por la fuerza centrífuga. El componente principal de esta técnica es el rotor. Existen diferentes tipos como rotores de ángulo fijo, rotores verticales o rotores oscilantes. Las ultracentrífugas pertenecen al grupo de las centrífugas de alta velocidad. Para evitar el desarrollo de calor por fricción debido a la resistencia aerodinámica, se establece un vacío. Según el principio físico, la separación de componentes se produce debido al tamaño y la densidad. Las partículas son aceleradas por fuerzas centrífugas en dirección hacia afuera. Esta aceleración depende de la velocidad angular de una partícula y su distancia al eje de rotación. La aceleración se refiere a la fuerza de gravedad g.

Mediante la ecuación de Svedberg, se describe la velocidad de sedimentación de partículas esféricas en un fluido intenso. Valor S (unidades de Svedberg) del material biológico: el coeficiente de sedimentación s se define como la velocidad de sedimentación que se alcanza en condiciones geométricas especiales en un campo centrífugo. La unidad del coeficiente de sedimentación s se define como valor S. Existen diversas técnicas de centrifugación: centrifugación diferencial, centrifugación zonal, centrifugación isopícnica, centrifugación en gradiente de densidad. Centrifugación diferencial:

La centrifugación diferencial se basa en diferentes velocidades de sedimentación de partículas. Se usa para el enriquecimiento de partículas y para obtener una mayor concentración de partículas en un volumen reducido. Se usan rotores de ángulo fijo. Por tanto, se requiere que las velocidades de sedimentación de las partículas centrifugadas difieran lo suficiente entre sí.

En relación con las células y sus componentes existen las siguientes diferencias, que permiten la separación: las células completas sedimentan primero (1000 g, 2 min), seguidas de los componentes celulares de mayor tamaño de alto peso como los núcleos (1000 g, 5-10 min). Posteriormente se sedimentan las membranas nucleares y las membranas plasmáticas (1500 g, 15 min), seguidas del aparato de Golgi (2000 g, 20 min), mitocondrias, lisosomas y peroxisomas (10000 g, 25 min). Los microsomas sedimentan a 100 000 g, 60 min o más. A estos pertenecen también las EV, incluidos los exosomas. Se encuentran en el sedimento final.

Pureza de fracciones obtenidas por centrifugación diferencial:

Los componentes descritos no pueden separarse y purificarse al 100%. Los sedimentos que consisten en partículas que sedimentan rápidamente siempre incluirán partículas que se sedimentan lentamente, que se colocaron cerca del fondo del tubo de centrífuga. Debido a esta contaminación, no puede lograrse una pureza completa.

Centrifugación diferencial usada para el enriquecimiento de las EV/exosomas;

En una primera etapa de centrifugación, los líquidos que contienen EV (como los sobrenadantes de cultivos celulares, los líquidos que contienen plasma diluido o hPL diluido) se centrifugan a 2000 g durante 15 min. Las células, las células muertas, los restos celulares (núcleos, membranas nucleares, membranas plasmáticas, aparato de Golgi) se sedimentan en la parte inferior y pueden eliminarse. En una segunda etapa de centrifugación a 10000 g durante 45 min a 4°C, los sobrenadantes de la etapa 1 se reducen a partir de mitocondrias, lisosomas y peroxisomas. Los microsomas como las EV, incluyendo los exosomas, permanecen en el sobrenadante y pueden sedimentarse finalmente mediante ultracentrifugación (110000 g, 1-2 horas).

Precipitación de PEG

Para la precipitación de polietilenglicol, puede usarse PEG 6000. La sustancia es un polímero derivado del etilenglicol y es soluble en agua, inerte y no tóxico. El PEG puede usarse para precipitar sustancias de alto peso molecular como proteínas (también partículas de virus y EV). En presencia de PEG, las proteínas precipitan mientras que las sustancias de bajo peso molecular permanecen solubles. Dependiendo de las condiciones de precipitación elegidas, el límite para definir sustancias de alto peso molecular y bajo peso molecular puede variar hasta determinado grado (peso molecular de PEG, concentración de PEG y temperatura de precipitación). Si el PEG hidrófilo, sin carga y las proteínas se mezclan juntas en disoluciones acuosas, se produce una concurrencia por el agua de hidratación de las proteínas. Si se alcanza una concentración de PEG definida, las proteínas precipitan de forma reversible. Esta precipitación representa una forma muy suave de precipitación (descrita por primera vez: Polson et al., 1964).

Precipitación de PEG de EV;

Los líquidos que contienen EV, diluidos, por ejemplo, en NaCl al 0,9%, se incuban en presencia de PEG 6000 al 10% v/v durante la noche (16 h, 4°C) para precipitar las EV. Después de la incubación, se sedimentan las partículas precipitadas a 1500 g durante 30 min (4°C). Se descartan los sobrenadantes. Se resuspenden los sedimentos, por ejemplo, en NaCl al 0,9% y se lleva a ultracentrifugación (110 000 g, aproximadamente 2 h). Esta etapa puede repetirse alternativamente como una etapa de lavado adicional.

En una realización preferida se proporciona un método para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedades regenerativas, enfermedades impulsadas por inflamación, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades inmunitarias/autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades dermatológicas, enfermedades infecciosas, rechazos de trasplantes, accidente cerebrovascular, isquemia o enfermedad injerto contra huésped, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de una preparación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

Preferiblemente, este método es un método, en el que dicha administración es adecuada para la administración o infusión intravenosa, o para inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraósea, inyección intracerebroventricular, inyección intramuscular, inyección intraocular o para administración tópica.

Preferiblemente, se proporciona un método de fabricación de una preparación farmacéutica o una preparación de diagnóstico o una preparación cosmética que comprende la etapa de añadir lisado plaquetario humano o una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano a la preparación farmacéutica una preparación de diagnóstico o una preparación cosmética.

Bibliografía

1. Thomas Lener et al. in ISEV position paper in the Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 30087

2. Torreggiani et al. (European Cells and Materials vol.28, 2014137-151

3. Foster TE, Puskas BL, Mandelbaum BR, Gerhardt MB, Rodeo SA (2009). Am J Sports Med 37 (11 ):2259-72) 4. Koliha, Nina et al. Journal of Extracellular Vesicles, [S.I.], febrero de 2016.

5. Craig N. Morrell et al., 1 de mayo de 2014; Blood: 123 (18)

6. Kuffler DP et al. in Mol Neurobiol. Octubre de 2015; 52(2):990-1014. doi:10.1007/s12035-015-9251-x. Epub de 6 de junio de 2015

7. Raposo, G. et al. J. Exp. Med.1996;183(3):1161-1172

8. Escola JM et al., J Biol Chem. 7 de agosto de 1998; 273(32):20121 -7).

9. Barres C. et al., Blood. 21 de enero de 2010; 115(3):696-705

10. Chen, Lab Chip. 21 de febrero de 2010; 10(4):505-11).

11. Mariani et al. BMC Microbiology (2015) 15:149

12. Eppley, B. L., W. S. Pietrzak, et al. (2006) Plast Reconstr Surg 118(6): 147e-159e.

13. Mishra, A., K. Harmon, et al. (2012) Curr Pharm Biotechnol 13(7): 1185-1195 Carlson, N. E. and R. B. Roach, Jr. (2002) J Am Dent Assoc 133(10):1383-1386.

14. Fontana, F., M. Mori, et al. (2016) ACS Appl Mater Interfaces 8(1): 988-996.

15. Naaijkens, B. A., H. W. Niessen, et al. (2012) Cell Tissue Res 348(1): 119-130.

16. Govindasamy, V., V. S. Ronald, et al. (2011) Cytotherapy 13(10): 1221 -1233.

17. Parazzi, V., C. Lavazza, et al. (2015). “Extensive Characterization of Platelet Gel Releasate From Cord Blood in Regenerative Medicine”. Cell Transplant 24(12): 2573-2584.

18. Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015). “Human cord blood-derived platelet lysate enhances the therapeutic activity of adipose-derived mesenchymal stromal cells isolated from Crohn’s disease patients in a mouse model of colitis.” Stem Cell Res Ther 6:170.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Preparación farmacéutica que comprende una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano para su uso en medicina.

2. Preparación farmacéutica que comprende una fracción que se enriquece con vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades impulsadas por inflamación, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades inmunitarias/autoinmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades dermatológicas, enfermedades infecciosas, rechazos de trasplantes, accidente cerebrovascular, isquemia o enfermedad injerto contra huésped.

3. Preparación para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que la preparación está libre de células.

4. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la fracción enriquecida de vesículas extracelulares derivadas de lisado plaquetario humano es el principio farmacéuticamente activo esencial en la preparación.

5. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que las vesículas extracelulares de la fracción enriquecida tienen un tamaño de entre 10 y 1000 nm, particularmente un tamaño de entre 50 y 200 nm preferiblemente entre 70 y 140 nm.

6. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las vesículas extracelulares de la fracción enriquecida son positivas para al menos uno de los marcadores de exosomas celulares que consisten en el grupo: CD9, CD41 a, CD41 b, CD42b, CD61, CD 62P, CD63 y sintenina.

7. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las vesículas extracelulares de la fracción enriquecida son negativas para al menos uno de los marcadores de exosomas celulares que consisten en el grupo CD81, CD3, CD4, CD19, CD20, CD2, CD8, CD11a y CD25.

8. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para aplicaciones antimicrobiológicas, en la que las vesículas extracelulares de la fracción enriquecida son positivas para la citocina RANTES o la citocina NAP-2 o para ambas.

9. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el contenido de proteína de la preparación farmacéutica es mayor de 0,5 mg/ml.

10. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el lisado plaquetario humano proviene de plaquetas únicas o agrupadas donadas por donantes.

11. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el lisado plaquetario humano proviene de concentrados de plaquetas extraídos de la capa leucocitaria o de la trombocitaféresis.

12. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que las vesículas extracelulares comprenden factores biológicos, tales como material genético tal como ARNm, microARN (miARN), pequeñas cantidades de ADN, lípidos y proteínas incluyendo factores de transcripción, citocinas, factores de crecimiento.

13. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha preparación comprende un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un polímero farmacéuticamente aceptable.

14. Preparación para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicha preparación es adecuada para la administración o infusión intravenosa, para inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraósea, inyección intracerebroventricular, inyección intramuscular, inyección intraocular o para administración tópica.