KR20220136461A - 약제로 사용하기 위한 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물 및 이들의 의약 용도, 특히 염증성 질병(inflammatory driven disease), 신경 퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 면역/자가면역 질병, 심혈관계 질병, 피부 질병(dermatologic disease), 정형외과 질환(orthopedic disease), 조직 재생 약제, 종양학적 질병(oncologic diseases), 감염성 질병, 이식 거부 반응, 뇌졸중, 허혈 또는 이식편대 숙주병(Graft-versus-Host Disease)의 예방 및/또는 치료를 위한 약제에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제에 첨가하는 단계를 포함하는 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 혈소판 용해물 (Human platelet lysate, hPL)은 인간 세포 배양에서 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)에 대한 대안적인 보충물(alternative supplement)로 알려져 있다. 이는 실험적인 목적 및 임상적인 목적을 위한 인간 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 배양에서 기본 배지(basal media)의 보충물로 통상적으로 사용된다. HPL이 제노겐(xenogen)이 없기 때문에 전통적으로 사용된 FBS에 비하면 유리하며-따라서, 세포 요법에 사용하기 위한 치료물(therapeutic product)의 제조에 적합하다. HPL은 동결/융해 사이클(들)[freezing/thawing cycle(s)]에 의한 인간 혈액 혈소판의 용해로부터 수득된 탁한, 미황색의 액체로 보인다. 이들의 생리적 조직 회복 기능(physiological tissue repair function)으로 인해, 혈소판은 성장 인자, 케모카인과 인터루킨을 포함한 사이토카인, 다른 대사 산물 및 세포외 소포 (extracellular vesicle, EV)와 같은 많은 생활성 분자(bioactive molecule)의 풍부한 공급원이다. 저장 및 용해시, 혈소판은 크기가 약 40-1000 nm에 이르는 많은 양의 성장 인자와 세포외 소포 [EV, 예를 들어, 엑소좀, 마이크로 소포, 세포 사멸체(apoptotic bodies)]를 방출한다. 이러한 분비된 소포는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포 (human platelet lysate derived extracellular vesicle, hPLEV)로 표기된다. 지난 해, 세포 배양 시스템에서 사용을 목적으로 하는 몇몇 hPL-관련의 GMP 제품, 예를 들어, 스템 셀 테크놀러지스(Stem Cell Technologies), 마코파마(Macopharma), 컴파스 바이오메디컬(COMPASS Biomedical), 및 PL 바이오사이언스즈(PL BioSciences)의 제품이 시판되었다. 최근, 튀빙겐(Tubingen) 소재의 센터 포 클리니컬 트랜스퓨젼 메디슨(Center for Clinical Transfusion Medicine)은 인간 혈소판 용해물에 대한 제조 허가(manufacturing license)를 튀빙겐의 지방 관청(local governmental office)에 의한 독일 약품 법률[German Drug Law (AMG)]에 따라 획득하였다. 이러한 hPL 제품은 인간에서 이들의 사용에 대한 규제 요건(regulatory requirement)을 따른 줄기세포의 배양을 위해 요구된다. 한편, hPL은 인간 줄기세포, 특히 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 최적 표준(gold standard)이다. GMP 클린룸-조건하에서 수득된 인간 혈소판 용해물은-임상시험에 사용하기 위한 또는 세포 요법을 위한 허가된 의약품(medicinal product)을 제조하기 위한 바와 같은-약제학적 제조를 위한 "인간 기원의 원료"로서 고려된다.
줄기세포의 배양에서 hPL의 가치가 인정되나, hPL로부터의 성장 인자 및 EV와 같은 단일 인자의 특성은 아직 상세히 분석되지 않았다. hPL으로부터 EV가 임상적 관심(clinical interest)이 있는 것으로 간주되지 않는 반면, MSC와 같은 상이한 줄기세포로부터 유래된 EV는 더욱 더 임상적 관심 및 치료학적 관심의 초점에 맞춰진다.
EV는 세포들, 기관들 및 심지어 유기체들 사이에서 정보를 전송하는 것으로 알려져 있으며, 혈액, 소변, 뇌척수액, 모유, 및 타액과 같은 다양한 체액에서 검출되었다. 엑소좀과 마이크로 소포는 EV의 가장 현저히 기술된 종류(class)를 포함한다. 이들은 인지질막에 의해 둘러싸여 있고, 지질, 암호화 및 비-암호화 RNA, mRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 또는 심지어 소량의 DNA, 및 대사산물 뿐만 아니라, 효소 성장인자, 수용체 및 사이토카인을 포함하는 단백질의 세포-유형 특이적 배합물(cell-type-specific combination)을 함유한다. 엑소좀은 70-170 nm 크기의 (+/- 20 nm, 이는 분석의 문헌 및 기술에 따라 다름) 엔도좀 구획(endosomal compartment)의 유도체로 정의된다. 100-1000 nm의 평균 크기의 마이크로 소포는 원형질 막(plasma membrane)의 밖으로 향하는 출아(outward budding)에 의해 형성된 큰 EV의 종류를 대표한다. 본 출원에서, 용어 EV는 상기 언급된 소포의 전부를 포함한다.
현재로서는, 오직 줄기세포 유래의 EV만 치료학적 목적에 따른 치료학적 잠재성(therapeutic potential)을 갖는 것으로 널리 알려져 있고 논의되는 것으로 보인다. 국제특허공보 WO 제2012/053976호는 모발-성장과 상처-치료를 촉진하기 위해, 인간 중간엽 줄기세포에 의해 분비된 엑소좀의 용도를 개시한다. 이러한 효과는 엑소좀 면역 조절성 수송 대상(exosomal immunomodulatory cargo)과 관련되어 개시된다. 국제특허공보 WO 제2012/053976호는 엑소좀-제제의 면역조절 효과(immunomodulatory effect)에 대해 추측한다.
국제공개공보 WO 제2014013029 A1호는 뇌의 출생 전 및 출생 후 획득된 손상 (즉, 신경 손상) 또는 줄기세포 이식 후 면역학적 합병증(immunologic complication) ["이식편 대 숙주병(Graft versus Host-Disease)", GvHD]과 같은 염증성 질환(inflammatory condition)의 예방 또는 치료를 위한 신생아 조직-유래 또는 성인 조직-유래의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem-cell, MSC)로부터 유래된 엑소좀-제제의 용도에 관한 것이다.
2015년, Thomas Leneret 등에 의해 세포외 소포 학술지(Journal of Extracellular Vesicles)에서 국제 세포외 소포 학회(The International Society of Extracellular Vesicles, ISEV)에 의해 발간된 최신의 성명서(Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials. 4: 30087)는 치료학적 잠재성이 있는 EV의 최근에 논의된 공급원을 기술한다. 재생의학(regenerative medicine)에 대한 연구 하에서, 세포 공급원은 제정맥(umbilical vein)으로부터 인간 내피 세포와 후기 내피 세포(late endothelial cell)를 포함하는 내피 콜로니 형성 세포(endothelial colony forming cell)와 내피세포이다. 또한, 골수성 세포(myeloid cell) 및 림프성 세포(lymphoid cell)로 분화가 가능한 조혈 전구체(haematopoietic progenitor)는 전-혈관 신생 기능(pro-angiogenic function)을 발휘할 수 있다. 뇌졸중(stroke), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS) 또는 척수 손상(spinal cord injury)과 같은 다양한 신경계 질환(neurologic disorder) 및 신경 염증성 질환(neuroinflammatory disorder)에서, 신경 줄기세포(Neural stem cell, NSC)는 전임상 모델(preclinical model)에서 사용되어왔다. 그러나, MSC와 NSC에 대한 유도체가 병변 부위로 이동하기 보다는 주변 분비 방식(paracrine manner) 및 전신성 방식(systemic manner)에서 이들의 치료학적 효과를 발휘하는 것이 분명해졌다. 이와 관련해서, NSC-유래의 EV는 숙주의 면역-시스템과 상호작용하여, 신경 보호(neuroprotection)와 면역 조절(immunomodulation)을 매개하는 것으로 여겨진다. 또한, 신경 보호와 신경 재생(neuroregeneration)은 신경계의 상주하는 신경 아교세포(resident glia cell)로부터 방출된 EV에 의해 매개될 수 있다. 마지막으로, 매우 최근의 연구는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로부터 EV의 분리, RNA와 단백질을 심장-세포(heart-cell)로 수송하는 이들의 능력, 및 허혈성 심근(ischaemic myocardia)에서 이들의 생체 내 치유 능력을 기술한다. 또한, iPSC는 큰-규모의 EV-생산을 위해 규모가 조정된 방식(scaled manner)으로 체세포 줄기세포(somatic stem cell)를 키우기 위한, 또는 인간 NSC와 같은 1차 제공재(primary donor material)로부터 거의 획득될 수 없는 EV 공급원으로서 세포를 획득하기 위한 공급원으로서 사용될 수도 있다. 이와 관련해서, iPSC-유래의 MSC로부터 EV는 사지-허혈증(limb-ischaemia)을 약화시키는 것으로 이미 나타났다. 미래에 iPSC와 EV-기술의 병용이 신규한 치료학적 선택을 제공할 수도 있음이 논의된다.
상기의 언급된 최근의 성명서(세포외 소포 학술지 2015, 4: 30087)의 기정 사실을 검토하기 위해, hPL로부터 유래된 EV의 치료학적 잠재성이 고려되지 않은 것이 강조되어야 한다.
MSC, NSC 또는 iPSC와 같은 인간 줄기세포로부터 유래된 EV는 줄기세포 배양이 복잡하고 고가이며, 공급원이 약제학적 대규모 생산에 제한되기 때문에 용이하게 입수할 수 없다.
Torreggiani 등의 출판물에서 (2014, European Cells and Materials Vol.28, 137-151), hPL-유래의 엑소좀이 인간 혈소판 용해물 활성에서 신규한 이펙터(effector)로서 고려될 수도 있음이 논의된다. Torreggiani 등은 골 재형성(bone regeneration)을 위한 혈소판-유래의 엑소좀의 용도를 논의한다. 이들의 연구에서, MSC-세포 배양 지지체와 관련된 PL-유래의 엑소좀의 역할이 연구되었다. 그러나, Torreggiani 등에 의해 기술된 제제는 EV의 신뢰할 수 있는 추출에 대한 품질 기준을 준수하는 것으로 보이지 않는다.
더욱이, MSC-유래의 EV를 이용한 대부분의 임상 연구에서, MSC는 hPLEV의 잠재적 상승 효과가 다뤄지거나 논의되지 않는 hPL-보충 배지에서 배양된다. 종래기술에서, hPL이 중간엽 줄기세포 배양에서 기본 배지의 보충물로서 사용되었으나, MSC-유래의 EV 연구에서 관찰된 효과는 MSC-유래-EV 덕분이다.
게다가, 예를 들어, Eppley BL et al. (2006) in Plast Reconstr Surg 118(6): 147e-159e, Mishra AK et al. (2012) in Curr Pharm Biotechnol 13(7):1185-1195 및 Carlson NE et al. (2002) in J Am Dent Assoc 133(10):1388-1386와 같은, 혈소판이 풍부한 혈장 (Platelet Rich Plasma, PRP)의 용도에 관한 많은 과학 논문, 특허 출원 및 특허가 있다. PRP는 적혈구와 다른 원치 않는 구성요소를 제거하기 위해 원심 분리된 환자의 전혈로부터 유래된 농축된 살아있는 혈소판과 혈장으로 구성된다. 이는 전혈보다 더 큰 농도의 성장 인자를 가지며, 치의학(dentistry), 정형외과(orthopedic surgery), 및 스포츠 의학(sports medicine)을 비롯한 다양한 학문 분야에서 조직 주입(tissue injection)에 사용되었다.
그러나, 2016년 현재까지, 기초과학 및 전임상 연구의 결과는 대규모의 무작위 대조 시험(randomized controlled trial)에서 아직 확인되지 않았다. 2009년부터 검토에서, 과학문헌은 체계적으로 스크리닝 되었고, PRP 치료의 안정성과 효능을 적절히 평가한, 발견된, 소수의 무작위 대조 시험이 있었다. PRP는 "유망하나, 증명되지 않은 관절, 힘줄, 인대, 및 근육 손상을 위한 치료 선택(treatment option)"인 것으로 결론 내려졌다 (또한, Foster et al. (2009). Am J Sports Med 37 (11): 2259-72을 참조).
PL의 용도에 관하여, 혈소판 용해물을 포함하는 약제학적 조성물과 상처, 치열(anal fissure), 질 위축증(vaginal atrophy) 또는 주름을 치료하기 위한 이의 용도를 기술한 국제특허공보 WO 제20130765507호에서와 같이, 상처 치유의 분야에서 특정한 적용이 기술되었다. Fontana et al. (2016) ASC Appl Mater Interfaces 8(1): 988-996에서는, 상처 치유 분야에서 향상된 세포 증식을 위한 PL이 변형된 실리콘 마이크로 입자(PL-modified silicon microparticle)가 기술된다.
요약하자면, PRP-관련 종래기술에서, 상처 치유 적용을 능가하는 임상적 적용을 위한 hPL 또는 hPLEV의 용도는 기술되지 않는 것으로 보인다.
기술분야에 관하여, 따라서, PRP과 PL를 공급원으로 이용한, 용이하고, 저렴하며, 신뢰할 수 있고 효율적인 치료를 수행하는 것을 허용하는 수단 및 방법에 대한 중대한 필요성이 있다. 복잡하고 비싼 줄기세포 배양 시스템에 기초하지 않은 EV에 기초한 치료에 대해 동일한 필요성이 존재한다.
본 발명의 목적은 상기에 언급된 필요성 및 의학에서, 특히 치료학적인, 재생의학 및 예방의학에서 신규한 도구로서 본 발명의 hPL-유래의 EV를 따르는 것이다.
본 발명은 특히 급성 및/또는 만성 염증성 질병(inflammatory driven disease) 및 면역 질병(자가 면역 질병 및 이식 거부 반응으로부터 발생하는 질병, 예컨대 GvHD을 포함함), 신경학적 및 신경 퇴행성 질병(뇌졸중, 허혈), 피부 질병(dermatologic disease), 심혈관계 질병, 정형외과 질환(orthopedic disease), 감염성 질병, 암-질병, 조직 재생(고형 장기, 중공 구조, 손상)의 예방 및/또는 치료를 위한 약제로 사용하기 위한 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물(이 분획물은 다음에서 hPLEVs로 축약되기도 함)을 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물의 화장품 적용에 관한 것이다. 이 적용은, 화장품 피부 관련 항염증 치료, 손상 또는 화상 후 피부 재생, 피부 항노화 요법 및 모발 손실의 예방 및 치료를 포함한다.
또한, 본 발명은 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물의 진단 적용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제로 첨가하는 단계를 포함하는 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제의 제조방법에 관한 것이다.
줄기 세포 유래된 EVs의 hPLEVs로의 치환에 의한 생물학적 중요성, 비용 및 노력의 관점에서 다수의 이점이 존재하지만, 이러한 치환은 선행 기술에 제시되지 않았었다. hPL이 인간 혈액/혈장으로부터 유래하기 때문에, 소스는 재생적이고, MSCs, ESCs, NSCs 또는 다른 줄기 세포 유형과 반대로 접근이 쉽다. 따라서, hPLEVs는 쉽게 접근 가능하고, 줄기 세포 배양액으로부터 유래하는 EVs보다 덜 고가이다. 대응하는 줄기 세포 배양-유래된 EVs에 대한 본 발명의 다른 이점은, 혈소판이 클림-조건을 필요로 하지 않고, 세포 개체(cellular entities)의 시간 소모적이고, 고가의 유세포 분석 특성을 필요로 하지 않는다는 점이다. 추가로, 병원에서 적용을 위해 제조되고, 며칠 후 만료되는 과도한 인간 혈소판 농축물은 이들을 버리는 대신에 hPL의 제조를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 혈소판의 유효 성분을 즉시 공급하고, 살아 있는 혈소판의 지연된 방출 방식이 아닌 특히 수집 후 7일 이내에 만료된, 동결된 및 저장된 혈소판에서 생성되는 hPL에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 중요한 측면은 살아 있는 혈소판을 사용하는 것보다 놀라운 이점을 보여주는 것 대신에 의학적 또는 화장품 치료를 위해 hPL- 또는 hPLEV를 사용하는 것에 관한 것이고, 예컨대 혈소판 풍부한 혈장 요법, hPL- 또는 hPLEV-요법은 놀라운 이점을 갖는다.
주목할 것은, 본 발명은 특히 급성 및/또는 만성 염증성 질병(inflammatory driven disease) 및 면역 질병(자가 면역 질병 및 이식 거부 반응으로부터 발생하는 질병, 예컨대 GvHD), 신경학적 및 신경 퇴행성 질병(뇌졸중, 허혈), 피부 질병(dermatologic disease), 심혈관계 질병, 정형외과 질환(orthopedic disease), 감염성 질병, 암-질병, 조직 재생(고형 장기, 중공 구조, 손상) 및 항균 치료가 유리한 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제에서 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 직접 사용하는 것을 처음으로 기재하는 것이다.
본 발명은 약제로서 및 화장품 적용을 위해 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 직접 사용하는 것을 처음으로 교시한다. 이러한 적용은 화장품 피부 관련 항염증 치료, 항균 치료, 손상 또는 화상 후 피부 재생, 피부 항노화 요법 및 모발 손실의 예방 및 치료를 포함한다.
본 발명은 저비용으로 제조될 수 있고, 의학적 품질이 높은 이종 교배(xenogeny) 및 세포 없는(cell-free) 제품이며, 임상적 세포 배양 중간체(clinical cell culture intermediate)를 요구하지 않는 약제로서 hPL 또는 hPLEVs의 신규 사용을 처음으로 제시한다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 몇 가지 용어가 이하에 정의된다. 달리 언급되지 않으면, 본 명세서에 사용되는 전체 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질은 청구항의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 본 명세서에 기재된다.
또한, 불명료한 관사 "a" 또는 "an"에 의한 구성 요소에 대한 언급은 문맥이 하나 및 오직 하나의 구성 요소를 명확하게 요구하지 않는 한, 하나 이상의 구성 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 불명확한 관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
용어 "약(about)"은 정해진 농도, 길이, 분자량, pH, 시간 프레임, 온도, 압력 또는 체적과 같은 값 또는 값들의 통계적으로 유의미한 범위 내인 것을 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 일반적으로 제공된 값 또는 범위의 20% 이내, 더욱 일반적으로 10% 이내, 더욱 일반적으로 5% 이내의 크기의 한도 내에 있을 수 있다. "약"에 의해 포함되는 허용되는 편차는 연구 하에서 특정 시스템에 따라 달라질 것이다.
용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)", 및 "함유하는(containing)"은 달리 언급되지 않는 한 확장 가능한 용어(즉, "이하를 포함하지만, 이에 한정되지 않는"을 의미함)로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 값들의 범위의 열거는 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 참조하는 단축된 방법으로 작용하기 위한 것이며, 범위를 정의하는 종말점 경계를 포함하며, 각각의 별도의 값은 명세서에 개별적으로 인용되는 것처럼 명세서에 포함된다.
본 발명의 맥락에서, hPL은 유리한 치료적 또는 미용적 효과를 갖는 인간 혈소판 용해물의 임의의 종류/풀(pool)을 의미한다. 트롬보사이트(thrombocytes)라고도 하는 혈소판은 혈액-응고를 돕는 혈액에서 불규칙적인, 디스크-형상의 구성 요소이다. 보통의 혈액-응고 동안, 혈소판은 응집(aggregation)에 의해 교착된다(agglutinate). 혈소판이 종종 혈구(blood-cell)로 분류되지만, 혈소판은 핵을 갖지 않는다. 이들은 골수에 위치한 거핵세포라 불리는 대형 세포로부터 유래된다. hPL의 생성을 위해, 혈소판은 용해되고, 이것에 의해, 내부의 내용물이 주변 혈장으로 방출된다. 혈소판의 용해는 동결 및 융해 주기에 의해 달성될 수 있다. 적합한 프로토콜은 선행기술에서 확인될 수 있다.
인간 혈소판 용해물에 고농도로 함유되는 하나의 생물학적 구성 요소는 EVs이다. EVs가 대부분의 체액에 존재하기 때문에, 혈장-유래된 EVs는 다양한 세포-유형, 예컨대, 백혈구, 적혈구, 수지상 세포(dendritic cell, DCs), 혈소판, 비만 세포(mast cell), 상피 세포, 내피 세포, 및 뉴런으로부터 생성될 수 있다. 한편으로, hPL은 헌혈 시에 혈장에 이미 존재하는 혈장-유래된 EVs를 함유할 수 있다. 다른 한편으로, hPL은 혈소판-농축-제품의 저장 시간 동안 살아 있는 트롬보사이트에 의해 분비되는 다량의 특이적인 혈소판-유래된 EVs를 함유할 수 있다. 20-24 ℃에서 거의 일주일의 저장 시간 동안, 세포는 이들의 특이적 EVs를 주변 혈장으로 분비하는 것을 계속한다. 트롬보사이트-농축물의 만기일에 도달되고, 혈액-제품(blood-product)이 혈소판-용해물-제품의 제조와 같은 다른 목적을 위해 사용될 수 있는 경우, 이러한 특이적인-EV-농축(enrichment)은 hPLEVs가 농축된 분획물을 증가시키도록 더 가공될 수 있는 용해물에 여전히 존재해야 한다. 추가로, 혈소판은 용해물에 의해 터지고, 가용성 내부 구성 요소를 혈장으로 방출한다.
EVs의 단백질-프로파일은 이들의 세포 기원에 따라 달라진다.
혈소판의 특성화를 위한 특이적 CD 마커는 활성화 전에 혈소판 표면 상에 나타나는 표면 마커 CD9, CD41b, CD42a, CD42b 및 CD61이다.
또한, PAC-1, CD62P, CD31, CD63 및 신테닌과 같이 활성화 동안 혈소판 표면 상에 나타나는 마커가 존재한다.
혈소판 또는 내피 세포로부터의 엑소좀은, 예컨대 일반적인 표면 마커(예컨대, CD31 = 혈소판 내피 세포 접착 분자(platelet endothelial cell adhesion molecule)-1 또는 CD62P = P-셀렉틴(selectin))의 발현에 의해 확인될 수 있다. 이들 마커는 분비하는 세포 개체 상에 표면 마커에 대응한다. 혈장-EVs는 다양한 세포-부분 모집단으로부터 유래될 수 있고, 따라서 다양한 마커-부분 집합을 함유할 수도 있다.
다른 점은, hPL은 4-6일 후 만기일에 도달되기 전에 트롬보사이트-농축물(20-24 ℃)의 저장 기간 동안 살아 있는 트롬보사이트로부터 방출되는 EVs를 함유한다는 점이다. 따라서, hPL은 인간 혈소판으로부터 생성되는 EVs의 상당한 분획물을 함유한다. 보통의 혈장-제품과 비교하여, 만기된 트롬보사이트-농축물로부터 생성되는 혈소판-용해물은 혈소판-EVs가 매우 농축되어 있다. 이후 처리된 용해 시점에, 농축물의 전체 가용인 파라크린(paracrine) 인자는 세포 및 다른 세포 성분을 제거하면서 저장된다.
EVs는 지질, 단백질(예컨대 전사 인자, 사이토카인, 성장 인자) 및 mRNA, microRNA (miRNA) 또는 꽤 적은 양의 DNA와 같은 핵산을 포함하는 다양한 생분자에 대한 운반체로서 기능을 한다.
엑소좀의 지질 성분은 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 강글리오시드(gangliosides) (GM3), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 프로스타글란딘(prostaglandins) 및 리소비스포스파티드산(lysobisphosphatidic acid)과 같은 막 지질을 포함한다.
또한, 지질 및 단백질 이외에, 엑소좀은 mRNA, miRNA 및 단백질 코딩 영역, 반복 단위, 구조적 RNAs, tRNA, rRNA, 볼트(vault) RNA, Y RNA, 및 작은 간섭 RNA와 중첩되는 RNA 전사 물을 포함하는 다양한 다른 작은 논코딩(non-coding) RNA 종 뿐만 아니라 미토콘드리아 DNA 및 레트로트랜스포존의 짧은 DNA 서열을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산(nucleic acid)"은 일반적으로 하이브리드 분자를 포함하여 각각 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 형태로, 선형 또는 원형으로, 또는 이들의 혼합물로 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 포함한다. RNAs는 제한 없이 메신저(messenger) RNAs (mRNA), 비코딩(non-coding) (nc-RNAs-포함 안티-센스-RNAs), 사이렌서(silencer) RNAs, 마이크로(micro)-RNAs (miRNAs), 짧은 헤어핀(short hairpin) RNAs (shRNAs), 작은 간섭(small interfering) RNAs (siRNAs), 반복-관련 작은 간섭(repeat-associated small interfering) RNA (rasiRNA), piwi-상호작용(interacting) RNAs (piRNA), Y RNA, 긴 비코딩(Long non-coding) RNAs (긴 ncRNAs, lncRNA)), 트랜스퍼(transfer) RNAs (tRNA), 리보좀의(ribosomal) RNAs (rRNA), 작은 핵(small nuclear) RNA (snRNA), 작은 핵소체의 리보핵산(small nucleolar ribonucleic acid) (snoRNA), 스플라이싱된 리더(spliced leader) RNAs (SL RNA)를 포함할 수 있다. 상술된 RNAs 전체는 원리적으로 EV 구성으로 가능하고, 본 발명의 방법 내에서 이용될 수 있다.
또한, EVs는 단백질 및 펩티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 본 명세서에서 상호 교환하여 사용된다. 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예컨대 적어도 50개의 아미노산을 함유하거나 아미노산으로 구성되는 단백질 또는 펩티드를 말한다. 용어 "펩티드"는 적어도 2개의 아미노산 내지 약 19개의 아미노산을 함유하거나 아미노산으로 구성되는 올리고머를 말한다.
EVs 중 가장 빈번히 확인되는 단백질은 물질 수송체(membrane transporter) 및 융합-단백질(예컨대, GTPases, 예컨대 Rab5, annexins, and flotillins), 열 충격 단백질(예컨대, HSC70), 테트라스파닌(예컨대, CD9, CD63, 및 CD81), MVB-생물 발생(biogenesis)로부터의 단백질(예컨대, Alix 및 TSG101), 지질-관련 단백질 및 포스포리파아제(phospholipase), 세포 골격 단백질(액틴, 코피린(cofilin)-1, 에즈린(ezrin)/라디신(radixin)/모에신(moesin), 프로필린(profilin)-1, 및 튜블린(tubulin)), 대사 효소, 및 리보좀 단백질이다. 몇 개의 단백질은 엑소좀의 마커로서 인식되며, 이들 중에서 테트라스파닌(예컨대, CD63, CD81) 및 TSG101, ESCRT-복합체의 단백질이 검출을 위해 가장 일반적으로 사용되는 마커이다.
후자가 엑소좀 마커로서 일반적으로 사용되지만, 엑소좀에 배타적이지 않을 수 있으며, 다른 세포외 소포 상에 발견될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, hPL은 치료적, 진단적 또는 화장품 적용의 맥락에서 유용할 수 있는 임의의 인간 혈소판 용해물을 포함한다. 바람직하게는, GMP-조건에 따라 생성된 hPL이고, 바람직하게는 German Drug Law (AMG)에 따라 제조된 것이다. hPL의 기원은 단일 또는 공동 공여자로부터 기증된 혈소판으로부터 유래된다. 소정 연령의 공여자로부터, 예컨대 10-60세, 18-50세, 18-40세, 18-30세, 또는 18-20세의 혈액 공여자로부터 유래되는 hPL을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 정밀 의료(precision medicine)의 맥락에서, 헌혈로부터 유래되는 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래된 세포외 소포가 농축된 분획물로 환자를 치료하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라서, hPL은 건강한 개체들로부터 유래된다.
착오를 피하기 위해, hPL은 임의의 EV-농축, 분리 또는 정제 방법 전에 혈장-EVs와 비교하여 인간 혈소판-유래의 세포외 소포로 대체로 농축된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "인간 혈소판 용해물-유래된 세포외 소포가 농축된 분획물(fraction that is enriched for human platelet lysate-derived extracellular vesicles)"은 hPL이 EV-농축, 분리 또는 정제 방법 중 적어도 하나의 단계에 의해 처리되는 것을 의미한다. 이러한 농축, 분리 또는 정제 단계 후, "인간 혈소판 용해물-유래된 세포외 소포가 농축된 분획물"은 비-EV 오염물질을 덜 함유한다.
HPL 또는 HPL이 농축된 분획물은 선행 기술, 예컨대 혈소판을 활성화시켜, 본 발명의 제제의 품질을 향상시키는 PRP 요법과 관련된 선행 기술로부터 트롬보사이트 활성화제로서 공지된 하나 이상의 화합물로 용해 전에 배양되는 혈소판으로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL은 인간 제대혈(Human Umbilical Cord Blood)로부터 유래될 수 있다. 인간 제대혈 혈소판 용해 제제는 선행 기술에 공지된다(예컨대 US 8501170 B2, Parazzi, V., C. Lavazza, et al. (2015) 또는 Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015)).
본 발명의 목적을 위해, 모든 문법적 형태에서 용어 "분리(isolation)" 및 "분리하는(isolating)"은 이들의 환경, 예컨대 혈청 또는 혈장 시료로부터 EVs를 분리(separating) 또는 회복(recovering)하는 작용을 말한다. 모든 문법적 형태에서 용어 "정제하는" 및 "정제"는 바람직한 EVs로부터 (비-EV) 오염물질을 (실질적으로)감소/격감시키는 작용을 말한다. 모든 문법적 형태에서 용어 "농축하는(enriching)" 및 "농축(enrichment)"은 각각의 용매에서 EVs의 비율을 증가시키는 것을 의미한다.
현재 기재되는 hPL 또는 hPLEVs가 농축되는 분획물은 약제로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs가 농축되는 분획물은 염증성 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다. 염증성 이상은 다양한 인간 질병의 기저를 이루는 대규모 그룹의 질병을 포함한다. 면역 시스템은 알러지 반응과 일부 근육병 모두에서 입증된 염증성 질환과 관련되며, 많은 면역계 질환으로 비정상적인 염증의 발생과 관련된다. 염증 과정에서 병인 기원(etiological origin)을 갖는 비-면역 질병은 암, 동맥경화 및 허혈성 심장 질환을 포함한다. 다양한 단백질은 염증 과정과 관련된다. 이들 중 누구도 정상 단백질 기능 또는 단백질 발현의 장애 또는 조절장애를 일으키는 유전적 돌연변이로 인해 변형될 수 있다. 염증과 관련된 질병의 예는, 여드름(acne vulgaris), 천식, 자가면역 질병, 셀리악 병(celiac disease), 만성 전립선염(chronic prostatitis), 사구체신염(glomerulonephritis), 과민증(hypersensitivities), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases), 골반염(pelvic inflammatory disease), 허혈재관류 손상(reperfusion injury), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 사르코이드증(sarcoidosis), 이식 거부증, 혈관염(vasculitis), 및 간질성 방광염(interstitial cystitis)을 포함한다. 다수의 질병이 염증과 관련이 있거나 자가면역 질병으로 분류된다. 일부 다양한 유형의 염증성 질병은, 통풍(gout), 루푸스(lupus), 천식, 흉막염(pleurisy), 습진(eczema), 관절염, 위염(gastritis), 비장염(splenitis), 부비강염(sinusitis), 간염(hepatitis), 신장염(nephritis), 건선(psoriasis), 혈관염, 후두염(laryngitis), 갑상선염, 전립선염, 인두염(pharyngitis), 사르코이드증(sarcoidosis), 죽상경화증(atherosclerosis), 알러지 반응, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 근육병(some myopathies), 류마티스 관절염, 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 과민성 대장증후군(irritable bowel syndrome, IBS; 크론병(Crohn's disease)), 궤양성대장염(ulcerative colitis), 게실염(diverticulitis)을 포함한다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases), 예컨대 이에 한정되지 않지만, 알츠하이머병, 근위축성측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 전두측두엽치매(frontotemporal dementia), HIV-관련 인지 기능 장애, 헌팅턴병, 레비소체병(Lewy body dementias), 경도 인지 장애(mild cognitive impairment), 후두피질위축증(posterior cortical atrophy), 원발진행성실어증(primary progressive aphasia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 혈관성 치매(vascular dementia)의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 면역/자가면역 질병, 예컨대 이에 한정되지 않지만, 애디슨병(Addison disease), 셀리악병-스프루(sprue) (글루텐-민감 소장병(gluten-sensitive enteropathy)), 피부근염(dermatomyositis), 그레이브스병(graves disease), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성 경화증, 중증근무력증(myasthenia gravis), 악성빈혈(pernicious anemia), 반응성 관절염(reactive arthritis), 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus) 및 타입 I 당뇨병의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 심혈관계 질환, 예컨대 이에 한정되지 않지만, 관상동맥 심질환(coronary heart disease), 뇌혈관 질환(cerebrovascular disease), 말초 동맥 질환(peripheral arterial disease), 류마티스성 심질환(rheumatic heart disease), 선천성 심장병(congenital heart disease), 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis) 및 폐색전증(pulmonary embolism)의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 피부 질환, 예컨대 이에 한정되지 않지만, 여드름, 습진 (아토피 습진), 손톱의 진균증(fungal infections of nails), 헤르페스(herpes) 및 건선의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 정형외과 질환, 예컨대 이에 한정되지 않지만, 류마티스 관절염, 윤활낭염(bursitis), 팔꿈치 통증 및 문제, 주관 증후군(cubital tunnel syndrome), 상과염(lateral epicondylitis) (테니스 엘보), 상과염(medial epicondylitis) (골퍼 또는 야구 엘보), 섬유근육통(fibromyalgia), 발 통증 및 문제, 골절, 고관절 골절(hip fracture), 요통(low back pain), 손 통증 및 문제, 손목 터널 증후군(carpal tunnel syndrome), 무릎 통증 및 문제, 무릎 인대 부상(ligament injuries to the knee), 반월상연골판 파열(torn meniscus), 척추후만증(kyphosis), 목 통증 및 문제, 골다공증(osteoporosis), 뼈의 파제트명(paget's disease of the bone), 척추측만증(scoliosis), 어깨 통증 및 문제, 연조직 손상(soft-tissue Injuries)의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
본 발명의 일 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 조직 재생 약제의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다. 조직 공학(Tissue engineering)은 생체 물질 개발 분야에서 진화했으며, 스캐폴드, 세포 및 생체 활성 분자를 기능 조직에 결합시키는 실행을 말한다. 조직 공학의 목표는 손상된 조직 또는 전체 장기를 복구, 유지 또는 개선하는 기능적 구조물을 어셈블리하는 것이다. 인공 피부 및 연골은 FDA에 의해 승인받은 공학 조직의 예이지만, 이들은 현재 인간 환자에서 용도가 제한된다. 재생 의학(Regenerative medicine)은 조직 공학을 포함하고 자가-힐링에 대한 연구를 포함하는 광범위한 분야이다-신체는 자체 시스템을 사용하여 세포를 재생하고 때로는 외래/동종 생물학적 물질에 의해 뒷받침되는 조직과 기관을 재건한다. 용어 "조직 공학" 및 "재생 의학"은 이 분야가 복잡하고 흔히 만성 질환 치료 대신 치료법에 초점을 맞추기를 희망하기 때문에 대체로 상호 교환이 가능해졌다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 종양학적 질병, 예컨대 이에 한정되지 않지만, 방광암, 뼈암, 유방암, 대장/직장암, 호지킨병(Hodgkin disease), 백혈병, 간암, 폐암, 피부 림프종(lymphoma of the skin), 다발성골수종(multiple myeloma), 비인두암, 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma), 골육종(osteosarcoma), 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종- 성인 연조직암, 피부암, 소장암(small intestine cancer), 및 위암의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 이식 거부 반응의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다. 본 발명의 다른 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 뇌졸증, 허혈 또는 이식편대 숙주병(Graft-versus-Host Disease)의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다.
바람직한 양태에 따라서, 질병은 현재 세포-요법, 예컨대 이에 한정되지 않지만 동종이계 세포 요법(allogeneic cell therapy), 인간 배아 줄기 세포 요법, 신경 줄기 세포 요법, 간충직 줄기 세포 요법 및 조혈 줄기 세포 이식 적용으로 치료되는 질병군으로부터 선택될 수 있다.
동종이계 세포 요법은 크론병 및 다양한 혈관 질환(vascular condition)을 포함하는 질환을 치료하기 위해 이러한 제품을 개발하는 것을 시도한다. 인간 배아 줄기 세포 연구는 당뇨병 및 파킨슨병의 가능한 치료를 포함하는 다수의 치료적 적용의 기초로 사용되었다. 신경 줄기 세포 요법에서, 신경 줄기 세포(NSCs)는, 예컨대 파킨슨씨병 및 헌팅턴병과 같은 다양한 신경 장애를 치료하기 위해 가능한 치료 적용을 위해 계속 진행 중인 연구의 주제이다. 간충진 줄기 세포 요법은 면역 요법, 뼈 및 연골 재생, 심근 재생 및 후를러(Hurler) 증후군, 뼈 질환 및 신경 질환의 치료를 포함하는 광범위한 치료에 사용된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs이 농축된 분획물이 특히 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충에 의해 야기되는 감염성 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 사용된다. 하나의 바람직한 양태는 봉소염(cellulitis), 단독(erysipelas), 화농땀샘염(hidradenitis suppurativa), 농가진(impetigo) 및 심상성농창(ecthyma), 림프절염(lymphadenitis), 림프관염(lymphangitis), 괴사성 피부 감염(necrotizing skin infections) 또는 포도구균성 열상 피부증후군(staphylococcal scalded skin syndrome)과 같은 피부학에서 감염성 질병의 치료이다.
본 발명의 제제의 또 다른 바람직한 적용은 혈소판 치료 또는 혈소판이 풍부한 혈장 치료(platelet rich plasma-treatmnet)가 긍정적인 효과를 갖는 것으로 선행 기술에 기재되어 있는 적응증(indication)의 맥락에서의 적용이다. 선행 기술로부터, 건강 및 질병에 혈소판의 중요한 면역- 및 염증-관련 기능에 대한 인식이 커지고 있는 것으로 알려져 있다. 다수의 연구는, 염증 과정에서 혈소판의 영향이 죽상경화증(atherosclerosis)에서 감염성 질병의 범위에 이르고, 혈소판이 면역 기능을 갖는 가장 많은 순환하는 세포 유형이 되도록 하는 것을 입증했다. 혈소판은 접촉-의존 메카니즘에 의해 직접적으로 및 분비된 면역-중재자(immune-mediator)의 메카니즘에 의해 간접적으로 백혈구 및 혈관 내피 세포와 상호 작용한다. 따라서, 혈소판 중재된 면역 효과는 혈소판 활성 및 침적 부위에 국부적으로, 또는 혈소판 활성화로부터 멀리 떨어진 위치에서 전신적으로 발생한다.
혈소판은 혈전증의 세포 매개체로서 가장 잘 알려져 있다(Craig N. Morrell et al. 2014 "Emerging roles for platelets as immune and inflammatory cells" Blood: 123 (18) 참조). 이 문헌에서, 건강 및 질병에서 혈소판의 중요한 면역 및 염증 역할의 인식이 커지고 있는 것으로 기재된다. 다수의 연구는 염증 과정에서 혈소판의 영향이 죽상경화증에서 감염성 질병의 범위에 이르고, 혈소판이 면역 기능을 갖는 가장 많은 순환하는 세포 유형이 되도록 하는 것을 입증했다. 혈소판은 접촉-의존 메카니즘에 의해 직접적으로 및 분비된 면역-중재자의 메카니즘에 의해 간접적으로 백혈구 및 혈관 내피 세포와 상호 작용한다. 따라서, 혈소판 면역 효과는 혈소판 활성 및 침적 부위에 국부적으로, 또는 혈소판 활성으로부터 멀리 떨어진 위치에서 전신적으로 발견된다. Craig N. Morrell 등은 염증 세포와 혈소판의 상호 작용은 염증전 결과를 중재할 수 있지만, 이러한 상호작용은 감염을 제한하는데 유리하도록 진화했을 것이라 결론 내렸다. 예컨대, 피부에 침범한 경우, 병원균에 노출되어 있고, 혈전 및 면역 회복 기능을 결합함으로써, 혈소판이 병원균 침입을 방지하기 위해 잠재적 감염 인자에 대한 지혈과 면역 반응을 집중시키는 데 도움이 될 수 있다. 그러나, 백혈구 또는 내피 세포와의 계속되거나 만성의 혈소판 상호작용은 과도한 면역 자극 및 염증 손상(inflammatory insult)에 역효과를 야기하는데, 이는 Craig N. Morrell et al. (2014)를 참조한다. 혈소판이 엑손-재생, 상처-치료, 및 통증-경감의 맥락에서 긍정적인 효과를 갖는다는 것은 선행 기술로부터 알려져 있다(Kuffler DP et al. in Mol Neurobiol. 2015 Oct; 52(2):990-1014).
본 발명에 따라서, 혈소판의 중요한 면역 및 염증 역할이 부분적으로 대체될 수 있고, 재생 특성이 살아 있는 혈소판 대신에 hPL 또는 hPLEV의 사용에 의해 개선될 수 있는 것을 발견했다.
따라서, 바람직한 적응증은 상처-치료, 조직-재생, 신경-손상, 건염(tendinitis), 퇴행성 관절염, 심근 손상(cardiac muscle injury), 뼈-복구 및 재생 및 성형 수술 및 구강 수술을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 제제는 세포가 없다(cell-free). 본 발명의 맥락에서 세포가 없다는 것은 제제가 살아 있는 온전한 세포 및 세포 단편이 사실상 없다는 것을 의미한다. 본 발명의 hPLEV-분획물은 바람직하게는 다른 성분이 감소되고 EVs가 농축된 세포가 없는 제제이다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, hPL 또는 hPLEVs가 농축된 분획물은 제제에서 본질적으로 약학적 활성 성분이다.
본질적으로 약학적 활성 성분이라는 것은 hPL 또는 hPLEVs가 농축된 분획물이 인간에게 투여될 때 치료적 값 또는 다른 값을 갖는다는 것을 의미한다. 또한, 본질적으로 약학적으로 활성인 성분이라는 것은 제제가 인간 혈소판 용해물, hPL-성분 또는 인간 혈소판 유래된 세포외 소포가 농축된 분획물을 제외한 다른 약제학적 활성 성분이 사실상 없는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 제제는 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물-유래된 세포외 소포가 농축된 분획물 이외에 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 부형제는, 예컨대 장기간 안정화, 강력한 활성 성분(따라서 종종 "벌크제(bulking agent)", "충전제(fillers)" 또는 "희석제"라고도 함)을 함유하는 제제의 벌크 업(bulking up), 또는 약제 흡수를 촉진시키거나, 점도를 감소시키거나, 용해도를 증가시키는 것과 같은 최종 투여 형태의 활성 성분에 대한 치료 향상을 부여하기 위해, 활성 성분과 함께 제형화된 천연 또는 합성 물질일 수 있다. 또한, 부형제는 파우더 유동성 또는 비점착성을 촉진시킴과 같은 관련된 활성 물질의 처리를 돕기 위해, 또한 기대되는 유통 기한을 넘어 변성 또는 응고를 예방하는 것과 같은 시험관내 안정성을 돕기 위해 제조 공정에서 유용할 수 있다. 또한, 적절한 부형제의 선택은 투여 경로 및 투여 형태 및 활성 성분 및 다른 인자들에 따라 달라진다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 인간 혈소판 용해물 유래된 세포외 소포(엑소좀)이 농축된 분획물의 세포외 소포는 크기가 약 70 내지 200 nm, 바람직하게는 약 70 내지 140 nm, 또는 바람직하게는 약 70 내지 120 nm이다. "약"은 +/- 20% 편차를 의미한다. 더욱 바람직하게는, 엑소좀은 특징적인 EV- 또는 엑소좀-마커에 대해 양성이고, 보다 더욱 바람직하게는 약제학적 제제의 단백질 함량은 0.5 mg/ml 초과, 바람직하게는 1 mg/ml 초과이다.
hPLEV 마커는 열 충격 단백질(예컨대, HSC70), 테트라스파닌(예컨대, CD9, CD10, CD26, CD53, CD63, CD82), MVB-생물 발생으로부터의 단백질(예컨대, 알릭스(Alix) 및 TSG101), EpCAM 또는 Rab5를 포함하지만, 사실상 CD81 (보통 일반적인 EV 표면 마커임), CD2, CD8, CD11a 및 CD25이 부족하다(Koliha et al, 2016).
본 발명의 다른 양태에 따라서, 세포외 소포는 CD9, CD41a, CD41b, CD42b, CD61, CD62P 및 CD63의 군으로 이루어진 EV- 또는 엑소좀-마커 중 적어도 하나에 대해 양성이다. 바람직하게는, 세포외 소포는 상기 언급된 EV- 또는 엑소좀-마커의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개에 대해 양성이다.
본 발명에 따라 양성이라는 것은 Koliha, Nina et al. (2016)에 기재된 방법에 따라 다중 비드-기반 플랫폼 분석을 수행하는 경우 상기 언급된 양성 표면 마커 중 하나의 백그라운드 중간 형광 강도가 NK 세포로부터 유래하는 세포외 소포와의 비교예보다 높은 것을 의미한다.
상기 언급된 마커의 특이적 단백질 검출을 위해 웨스턴 블롯 분석과 같은 대안적으로 다른 기술이 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 세포외 소포는 CD81, CD3, CD4, CD19, CD20, CD2, CD8, CD11a 및 CD25의 군으로 이루어진 표면-마커 중 적어도 하나에 대해 음성이다. 바람직하게는 세포외 소포는 상기 언급된 세포의 엑소좀 마커의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개에 대해 음성이다.
hPLEV-농축된 분획물의 품질을 입증하기 위해, 함유된 EVs의 생물학적 및 생물 물리학적 특성에 대한 몇 가지 일반적인 특성화 기준을 충족해야 한다. 이러한 특성화를 위한 최신 기술은 ISEV(International Society for Extracellular Vesicles)에 의해 추천되는 기준 및 표준이다. EV-분야에서 최근의 과학적 지식에 기초하여, 이들 기준은 임의의 특정 생물학적 수송 대상(biological cargo) 또는 기능을 EVs에 적용하는데 사용해야 한다.
기본 품질 기준/표준:
1. BCA-검정, 브래드포드-검정과 같은 유사한 검정, 또는 분광법("나노드롭"과 같음)에 기초한 도구를 사용하는 표준 단백질 정량법에 의한 단백질 함량 [mg/ml]의 결정.
2. Nanosight 및 Zetaview와 같은 NTA(Nanoparticle Tracking Analysis) 플랫폼, 또는 단일 입자 수준에서 EVs의 분석을 허용하는 Amnis와 같은 이미지-스트림 유세포 분석기(Image-Stream Flow Cytometry)를 사용하여 평균 입자 크기 [nm] 및 크기 분포 [곡선] 결정.
3. EV- 또는 엑소좀 단백질을 포함하는 일반적인 EV-마커 단백질의 반정량적 검출(SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 특정 항체의 검출, 신호 검출). 일반적으로, EV 함량은 세포의 기원, 세포주를 생성하는 예비 조건 및 제조 방법에 따라 매우 달라진다. 그러나, 엑소좀과 같은 EVs는 그 특성화를 위해 사용될 수 있는 일반적으로 기대되는 마커의 일반적인 세트가 존재한다. 가장 일반적으로 사용되는 마커는 테트라스파닌(CD9, CD63, CD81), 엔도좀-유래 또는 막결합 단백질(TSG101, 아넥신(annexins), 랩스(Rabs), 신테닌(Syntenin), 플로틸라인(flotillines)), 및 샤프롱 단백질(HSC70, HSP90)이다. PL-EVs의 경우에, 특질상 이들은 CD81이 부족하다.
4. 세포 용해물 및 PL-EV 분획물의 반정량적 비교에 의한 순도의 결정. PL-EV 분획물은 소포체(endoplasmic reticulum)(예컨대, Grp94, 칼넥신(Calnexin)), 골지체(예컨대, GM130), 또는 미토콘드리아(예컨대, 프로히비틴(prohibitin), 사이토크롬 C)로부터 단백질과 같은 세포 잔기를 함유하지 않아야 한다. 이러한 마커는 음성 마커로 사용될 수 있다. 추가로, 핵산 단백질(히스톤, 아르고너트(argonaute)/RISC 복합체)은 음성 대조군의 예로서 사용될 수 있다.
3+4에 대해서: 일반적인 EV-마커의 검출에 대한 분석적 접근법은 웨스턴 블롯(WB), (고해상도-) 유세포 측정기, 또는 질량 분광법 기술을 사용한 글로벌 단백체 분석을 포함할 수 있다. PL-EV-농축된 분획물의 추가 특성은 다음 방법에 기초한다:
프로테오믹스(Proteomic)
웨스턴 블롯(WB), (고해상도-) 유세포 측정기, 또는 질량 분광법 기술을 사용한 글로벌 단백체 분석을 포함하는 hPLEVs의 단백질-프로파일링에 대한 분석적 접근법은 면역 마커, 신호 마커, 사이토카인 및 다른 관련 생활성적 단백질 함량과 같은 다른 EV-마커의 특성화에 대한 최신 기술이다.
hPLEVs로부터 RNA의 마이크로어레이 분석
hPLEV RNA의 프로파일링을 위해, 마이크로어레이 기술이 적용될 수 있다. 마이크로어레이는 슬라이드 또는 칩-기반 매체를 사용하여 핵산의 공지된 단편의 발현을 분석하기 위한 잘 확립된 기술이다. 마이크로어레이는 mRNA, miRNA 및 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 종들을 스크리닝 하기 위해 이용 가능하다.
리피도믹스(Lipidomics)
소포성 멤브레인에서 지질 및 지질-뗏목-관련 단백질(lipid-raft-associated protein)은 안정성 및 구조적 온전성을 갖는 세포외 소포를 제공한다. 기원의 이들 세포와 비교하여, hPL-EVs는 유사한 지질 조성이 존재해야 한다.
PL-EVs는 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 디포화된 포스파티딜에탄올아민(disaturated phosphatidylethanolamine), 디포화된 포스파티딜콜린(disaturated phosphatidylcholine), 스핑고마이엘린(sphingomyelin), 강글리오시드(ganglioside) 및 콜레스테롤이 농축될 수 있다. 지질 성분 및 비의 확인을 위해, 질량-분광법, 유세포 측정, 또는 다른 종래의 검정이 사용될 수 있다.
사이토카인-어레이(Cytokine-array)
ELISA-검정에 기초한 EV가 농축된 분획물의 사이토카인-분석
HPLEV을 함유한 분획물을 사이토카인-프로파일을 위해, 예를 들어, 시판중인 막에 기초한 사이토카인-어레이를 이용하여 반정량적으로 분석할 수 있다. 사이토카인은 케모카인, 종양-괴사-인자(tumor-necrosis-factor), 인터루킨, 인터페론 및 콜로니-자극 인자(colony-stimulating factor)를 포함한다. 기법은 많은 상이한, 정의된 단백질의 동시 검출을 위한 매우 민감한 방법을 제공한다 (예, 200개의 사이토카인). 단지 몇 피코그램(picogram)의 단백질 양도 검출될 수 있다. 검정은 고정된, 특이적인 1차 항체가 결합된 막에 기초한다. 주변 용액에 함유된 사이토카인은 배양 동안에 이러한 1차 항체에 결합한다. 다음의 반응에서, 비오틴(biotin)이 결합된 2차 항체가 1차 항체에 결합된 소위 샌드위치-복합체(sandwich-complex)"가 형성된다. 결과적으로, 항체-사이토카인-복합체(antibody-cytokine-complex)가 비오틴-표지된다. HRP가 결합된 스트렙트아비딘(Streptavidin) 또는 다른 마커-분자는 비오틴에 결합할 수 있으며, 덕분에 이는 복합체를 화학발광(chemiluminescence), 열량측정법 또는 적외선(IR-light)에 의해 검출 가능하도록 만든다. 검출 신호는 공지된 표준으로부터의 신호와 비교될 수 있고, 화학발광의 경우에서, 신호의 밀도 측정(densiometric measurement)을 수행하여 분석된 단백질을 비교할 수 있다.
기능적인 시험관내-검정
면역 세포에 대한 hPLEV의 영향을 분석하기 위한 시험관내-검정
농축된-EV 분획물의 잠재적인 면역 조절 능력(Potential immunomodulatory capability)은 인간 면역계로부터 세포(예, PBMC)를 이용한 적어도 하나의 기능적인 시험관내-검정에서 정의되어야 한다. 이러한 검정의 원리는 hPLEV의 존재 및 부재하의 면역세포 상에서 면역 조절 효과(immunomodulatory effect)의 검정이다. 이 문제에 대해서, 유동 세포-분석(flow cytometric-analysis)을 이용한다. 면역-반응을 유도하기 위해, 세포를, 예를 들어, 피토헤마글루티닌 (phytohaemagglutinin, PHA), 포볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbolmyristateacetate, PMA), 이오노마이신(ionomycin), 단일클론 항체(monoclonal antibody), 항원 [칸디다(candida) 또는 박테리아 단백질과 같은], 또는 심지어 시판중인 활성화 키트(activation kit)로부터의 다른 가능한 구성요소를 추가함으로써 촉진한다. 또한, 혼합된-림프구-반응 (mixed-lymphocyte-reaction, MLR)과 같은 방법이 적용 가능할 수도 있다. 활성화는 모든 PBMC 상에서 비특이적이거나 (예를 들어, PHA를 사용하여) 특이적으로, 예를 들어, 선택적으로 T-세포 또는 다른 정의된 PBMC-계군(subpopulation) 상에서만 유도될 수도 있다. 촉진에 의해, 세포의 표면-마커의 발현-프로파일의 변화에 의해 다른 것들 사이에서 검출될 수 있는 면역세포가 활성화된다. 촉진이 충분히 강한 경우, 후에, 증가한 증식-활성 또한 검출 가능할 수도 있다 (예를 들어, T-세포의 경우에서). hPLEV이 농축된 분획물의 존재하에서, EV가 없는 세포 대조군에 대한 차이점 (T 세포 증식의 억제 및 활성 마커 발현과 같은)이 검출 가능해야 한다.
이러한 검정에 대한 예시: "PBMC-CFSE-PHA-검정":
"PBMC-CFSE-PHA-검정"을 hPLEV가 농축된 분획물의 존재하에서 PHA-유도의 세포 증식의 검정에 이용할 수 있다. 카르복시플루오레세인-석신이미딜에스테르 (carboxyfluorescein-succinimidylester, CFSE)는 분석을 위한 유동 세포분석기(flow-cytometer)를 이용한 세포-추적에 사용될 수 있는 형광염료이다. 트롬보사이트-분자 카르복시플루오레세인-디아세테이트-석시니미딜에스테르(carboxyfluorescein-diacetate-succinimidylester, CFSE-SE)는 세포내로 소극적으로(passively) 분산되어 세포내 효소에 의해 절단되고 형광에 의해 검출될 수 있다. 모든 세포 분열로 인해, 증식하는 CFSE가 표지된 세포는 이들의 형광 광도가 50% 희미해진다.
RPMI-배지 + 10% 인간 AB-혈청에서, EV의 존재 또는 부재하에 현탁-세포를 위해, 분리된 CFSE가 염색된 PBMC를 5일 동안 24-웰 플레이트에서 배양한다. 웰 당 200-300 ng PHA (0 일)에 의해 배양을 시작 후에, 세포 촉진이 직접적으로 유도된다. 400 μl의 부피 내의 200000개의 세포들을 웰 당 배양한다. 5일 후에, 세포를 유동 세포적으로 분석할 수 있다. 0일에 비해, 형광의 감소가 높은 증식률(proliferation-rate)을 나타내고, 안정한 형광은 EV-효과로 인한 증식의 억제를 보인다. 추가적으로, 활성 마커의 발현도 상이한 시점에서 분석할 수 있다. 특이적으로 컨쥬게이팅된 항체 염색에 의해, 면역 세포의 세포 계군을 별도로 판별(discrimination) 및 분석할 수 있다.
혈관 신생에 대한 hPLEV의 효과를 분석하기 위한 시험관내-검정:
혈관 신생은 성장 및 발달의 모든 단계에서 뿐만 아니라, 허혈성 혈관 질병(ischemic vascular disease)에서 상처 치유 및 조직 재생에 근본적인 과정이다. 혈관 신생 절차에서, 새로운 모세혈관은 이전에 존재하는 맥관구조(vasculature)로부터 발생하며 이 과정은 전-혈관신생 인자 및 항-혈관신생 인자의 민감한 균형(sensitive balance)에 의해 제어된다. 내피세포는 상처, 염증, 및 저산소증(hypoxia)과 같은 혈관신생 자극에 반응하여 활성화된다.
유사관 형성 검정 (tube-like formation assay)
혈관 신생 단계를 모델링 하기 위해 가장 널리 사용되는 시험관내-검정 중 하나는 관 형성 검정이다. 이 검정은 내피 세포의 유사 모세관 구조(capillary-like structure) (관)를 형성하는 능력을 측정한다. 관 형성은 이러한 유사 모세관 구조의 개수, 길이, 또는 면적을 측정함으로써 배양 접시의 2차원 현미경 이미지에서 전형적으로 정량된다.
상처 치유 검정
스크래치 검정(scratch assay)을 이용하여 시험관내 세포 이동을 측정한다. 기초적 단계는 "스크래치"를 동종 집단의 세포 단층 (cell monolayer)에서 생성하는 단계, 스크래치를 봉합(closing)하기 위해 세포 이동 동안에 초기 및 주기적인 간격에서 이미지를 캡쳐하는 단계, 및 세포의 이동률(migration rate)을 정량하기 위한 이미지를 라이프 이미징 현미경(life imaging microscopy)으로 비교하는 단계를 수반한다.
이러한 검정을 이용하여 세포간 상호작용(cell-to-cell interaction)에서 혈관 신생에 대한 hPL-EV의 효과와 시험관내에서 상처 치유 동안 세포 이동을 모방할 수 있는 세포 이동을 연구할 수 있다.
임상에서 hPLEV의 사용을 위한 기본적인 안전 기준/표준:
안전, 잠재적인 독성 및 면역원성(immunogenicity)은 임상에서 hPLEV의 적용을 위해 모니터링 될 필요가 있다. 조직과 세포를 위한 제정법과 ATMPs ("Arzneimittel fur neuartige Therapien")에 따르면, 임상 시험에 사용 전에, 인간 세포에 기초한 의약품을 특성화 하는 최소한의 기준의 플랫폼이 고려될 필요가 있다. 요약하자면, 제품이 (a) 자가유래(autologous), 동종(allogeneic), 또는 이종(xenogeneic)인지; (b) 시험관내에서 광범위하게 조작되는지 최소한으로 조작되는지; 및 (c) 면역학적으로 활성인지 중성(neutral)인지에 대한 여부가 검토되어야 한다. 게다가, (d) 세포의 증식 능력 및 (e) 유사 세포 조직화 또는 유사 조직 조직화(tissue-like organization) 뿐만 아니라 구조적 구성요소가 있는 세포 사이의 동적 상호작용(dynamic interaction) 및 (f) 의도된 용도가 정의되어야 한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 hPL은 혈소판을 포함하는 임의의 생각할 수 있는 혈소판을 포함하는 인간 혈액 시료로부터 생성한다. 본 발명의 다른 양태에 따라서, 인간 혈소판 용해물은, 예컨대 이른바 혈소판 풍부 혈장(PRP)과 같은 혈소판 농축물로부터 생성한다. PRP는 환자의 전혈로부터 혈장-유도되고, 원심분리하여 적혈구 및 다른 원하지 않는 성분을 제거한 혈소판의 농축물이다. PRP는 전혈보다 성장 인자의 농도가 높으며, 치과, 정형 외과 수술 및 스포츠 의학을 포함한 다양한 분야에서 조직 주사로 사용된다. 혈소판-농축물은, 예컨대 백혈구 연층 추출된 농축물(buffy-coat extracted platelet concentrates) 또는 성분 채집 혈소판으로부터 생성될 수 있다.
본 발명에 따라서, 세포외 소포는 유전적 물질, 예컨대 mRNA, microRNA (miRNA), 소량의 DNA, 지질 및 전사 인자, 사이토카인 및 성장 인자를 포함하는 단백질과 같은 생물학적 인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제는 혈소판으로부터 유래되기 때문에, 일반적으로 다양한 성장 인자, 특히 바람직하게는 다음 성장 인자: PDGF, VEGF, FGF, EGF, TGF, 특히 TGF-β, 및 CTGF 모두 중 하나 이상을 포함한다. 조성물은 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 이들 성장 인자를 포함한다. 혈소판-유래된 성장 인자(PDGFs)는 세포 성장 및 생성, 혈관의 복구 및 콜라겐-생성을 증진한다. 혈관 내피 성장 인자(VEGFs)는 혈관 내피 세포의 성장 및 생성을 증진한다. 섬유아세포 성장 인자(FGFs)는 조직 복구, 세포 성장, 콜라겐-생성 및 히알루론산 생성을 증진한다. 상피 성장 인자(Epithelial growth factor, EGF)는 상피 세포 성장, 혈관 신생(angiogenesis) 및 상처 치료를 증진한다. 전환 성장 인자(Transforming growth factor, TGFs), 특히 TGF-β는 상피 세포 및 상처 치료의 성장 및 신생(neogenesis)을 증진한다. 결합 조직 성장 인자(Connective tissue growth factor, CTGFs)는 상처-복구를 증진한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 제제는 새로운 섬유아세포의 형성을 증진한다. 이러한 새로운 섬유아세포는 탄력 있고, 건강하게 시작하여, 새로운 콜라겐을 생성하고, 메탈로프로테아제를 줄인다. 섬유아세포(구조 골격을 합성, 유지 및 제공하는 주요 세포)의 복원은 건강하고, 복원된 피부를 만든다. 또한, PDGF는 섬유아세포의 운동성을 증가시켜, 섬유아세포가 투여 부위를 이전시키는 것을 보였다. 혈소판의 알파-과립제에서 발견되는 천연 성장 인자(예컨대, PDGF, VEGF, FGF, EGF, 및 TGF)는 콜라겐 및 히알루론산 생성, 조직 복구, 내피 세포 및 상피 세포의 성장 및 재생, 및 새로운 혈관 형성(산소를 복원하고 바람직하지 않은 분자들을 제거하는)을 증진한다. 이들 인자들 전체는 주름지고, 손상된 세포외 매트릭스(ECM)를 다시 건강한 상태로 재생시키는 것을 돕는다. 이들 성장 인자 각각은 개별적으로 및 부가적으로 서로 협력하여 피부 재생 및 복원 내에서 역할을 한다. 새롭고, 비단편화된 콜라겐의 생성을 자극하는 치료는 연령의 외관 및 건강에 실질적인 개선을 제공할 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 예컨대 본 발명의 hPLEV-농축된 분획물은 단백질, 사이토카인(예컨대, IFN-γ, IL-8, IL-10, TGF-βI, 및 HLA-G, RANTES, Nap-2) 및/또는 핵산, 예컨대 microRNAs와 같은 생물학적 인자를 포함한다.
본 발명에 따른 제제는 항미생물 특성을 갖는 사이토카인을 함유할 것이다. 본 발명의 제제는 특히 본 발명의 다른 사이토카인의 수준과 비교하여 사이토카인 RANTES 또는 사이토카인 NAP-2 또는 이둘 사이토카인을 다량으로 포함할 것이다.
사이토카인 RANTES 및 NAP-2는 이들의 항미생물 특성이, 예컨대 문헌 Mariani et al. (2015) (BMC Microbiology 15:149)에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 제제의 항미생물 특성은 Mariani et al.의 도 2-도 7 아래의 방법에 따라 측정될 수 있고, 참조 방법으로 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 제제는 정맥 투여 또는 주입(infusion), 복강내 주사, 피하 주사, 뼈 내 주사(intra bone injection), 뇌혈관 내 주사(intracerebroventricular injection), 근육 내 주사, 안내 주사, 또는 국소 투여에 적합한 것으로 예상된다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 인간 혈소판 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다:
a) 단일 공여자 기증된 혈소판으로부터 또는 적어도 15명의 공여자, 바람직하게는 적어도 20명 또는 적어도 30명 또는 적어도 40명의 공여자의 공동 공여자 기증된 혈소판으로부터 인간 혈소판 용해물을 제공하는 단계,
b) 인간 혈소판 용해물로부터 유래되는 세포외 소포를 농축시키는 단계,
c) 임의로, 예컨대, 감소된 IL-Iβ, TNF-a, T-세포 증식에 의해 상기 농축된 세포외 소포의 면역 조절 효과, 특히 항염증 효과 및/또는 면역 억제 효과와 같은 시험관내 효과를 측정하는 단계, 및
d) 임의로, 면역 조절 효과, 특히 항염증 효과 및/또는 면역 억제 효과와 같은 시험관내 효과를 보이는 농축된 세포외 소포를 선택하는 단계, 및
e) 임의로, 세포외 소포가 EV/엑소좀 마커 CD 81에 대해 음성을 보이고, EV/엑소좀 마커 CD9에 대해 양성을 보이는 단계 b)의 농축된 세포외 소포를 선택하는 단계, 및
f) 임의로, 단계 b), d) 또는 e)의 상기 농축된 세포외 소포와 적어도 하나의 적합한 약제학적 부형제 및/또는 담체를 혼합하는 단계.
본 발명의 일 양태에 따라서, 단계 a의 hPL은 선행 기술, 예컨대 혈소판을 활성화시켜, 본 발명의 제제의 품질을 향상시키는 PRP 요법과 관련된 선행 기술로부터 트롬보사이트 활성화제로서 공지된 하나 이상의 화합물로 용해 전에 배양되는 혈소판으로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따라서, 단계 a의 hPL은 인간 제대혈(Human Umbilical Cord Blood)로부터 유래될 수 있다. 인간 제대혈 혈소판 용해 제제는 선행 기술에 공지된다(예컨대 US 8501170 B2, Parazzi, V., C. Lavazza, et al. (2015) or Forte, D., M. Ciciarello, et al. (2015)).
상기 정의된 본 발명의 방법의 단계 a)에서, 인간 혈소판 용해물은 단일 공여자 기증된 혈소판으로부터 또는 적어도 15명의 공여자, 바람직하게는 적어도 20명 또는 적어도 30명 또는 적어도 40명의 공여자의 공동 공여자 기증된 혈소판으로부터 유래되어 사용되어야 한다.
정밀 의료 치료가 요구되는 경우, 환자 자신의 혈액으로부터 유래하는 인간 혈소판 용해물을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 일반적인 치료가 요구되는 경우, 적어도 40명의 공동 공여자로부터 유래된 인간 혈소판 용해물과 비교하여 인간 혈소판 용해물의 가능한 개인적 편차를 억제하기 위해, 적어도 15명의 공여자, 바람직하게는 적어도 20명 또는 적어도 30명 또는 적어도 40명의 공동 공여자의 것을 사용하는 것이 유리하다.
상기 언급되는 단계 a)로부터 hPL이 성분 채집 혈소판 또는 백혈구 연층 혈소판, 더욱 바람직하게는 성분 채집 혈소판으로부터 제공되는 것이 바람직할 수 있다.
hPLEV-농축된 분획물에 의해 조절되는 면역 조절 효과는 이하 언급되는 시험관내-검정 및 대응하는 리드 아웃으로 검출가능한 면역 억제 효과일 수 있다. hPLEV-분획물은 면역 세포의 증식을 억제하는 능력을 가져 면역을 억제하는 것으로 관찰되었다. 자극된 PBMCs의 증식에 대한 억제 효과는 CD3 양성 세포 (T-세포) 및 CD3 음성 세포 (예컨대, B-세포, NK-세포를 포함함)와 같은 부분 모집단에 대한 시험관내-검정에서 관찰될 수 있다. 추가로, hPLEV-분획물의 존재 하에 T-세포 활성화 마커 프로파일의 발현에 대한 억제 효과(CD69 또는 CD25의 하향 조절).
본 발명에 따른 약제학적 제제의 제조방법은 EVs의 특이적인 농축 단계를 포함한다. 앞서 설명한 바와 같이, EVs는 주로 신체 조직 및 체액에 풍부한 것으로 확인되며, 분별 초원심분리법(differential ultracentrifugation)을 사용하여 성공적으로 정제된다(Raposo, G. et al. J. Exp. Med. 1996;183(3):1161-1172). 또한, 다른 연구는 EVs가 슈크로오스의 연속 밀도 기울기(continuous density gradient)로 초원심분리법을 사용하여 분리될 수 있음을 보여준다(Escola JM et al., J Biol Chem. 1998 Aug 7; 273(32):20121-7). 또한, 엑소좀은 CD63, CD81, EpCAM, 또는 Rab5와 같은 엑소좀 하우스 홀드 마커에 대한 렉틴 또는 항체를 사용하여 항체친화성 포획법에 의해 분리된다(Barres C et al., Blood. 2010 Jan 21; 115(3):696-705 and Chen, Lab Chip. 2010 Feb 21; 10(4):505-11).
일반적으로, 정제 및/또는 농축을 위한 임의의 적합한 방법은 PEG-침전, 모놀리식 기술, 자분(magnetic particle), 여과, 투석, 초원심분리, ExoQuick™(Systems Biosciences, CA, USA), 크로마토그래피 또는 접선 유동 여과(tangential flow-filtration)를 포함하는 방법과 같이 사용될 수 있다. 그러나, 분리 방법에 따라, 다양한 EV-아형이 농축될 수 있고, 동일한 세포형으로부터 유래되는 경우에도 이들의 기능적 특성이 달라질 수 있음을 명심하는 것이 중요하다.
그럼에도 불구하고, 폴리에틸렌글리콜 침전을 포함하는 방법이 바람직하다.
본 발명에 따른 약제학적 제제의 제조를 위해, EV-농축된 분획물이 본 발명에 따른 가장 적합한 분획물을 식별하기 위해 미생물 시험, 균력 시험(virulence test), 단백질 함량, 파이로젠 검사, 및 입자 크기가 더 분석되는 방법이 바람직하다.
hPLEVs가 농축된 분획물이 시험관내 활성 시험에서 강력한 면역 조절 효과를 보이는 경우에 본 발명에 따른 방법에서 특히 유용하다는 것이 확인될 수 있다.
hPLEVs가 농축된 분획물이 공여자의 이펙터 세포의 감소된 IL-Iβ, TNF-a 및/또는 IFN-γ 사이토카인 반응을 보이는 경우에 본 발명에 따른 방법에서 특히 유용하다는 것이 확인될 수 있다.
엑소좀이 크기가 약 약 70 내지 200 nm, 바람직하게는 약 70 내지 140 nm, 또는 바람직하게는 약 70 내지 120 nm인 본 발명에 따른 방법이 더욱 바람직하다. "약"은 +/- 20% 편차를 의미한다. 더욱 바람직하게는, 엑소좀은 특징적인 EV/엑소좀-마커에 대해 양성적이고, 보다 더욱 바람직하게는 약제학적 제제의 단백질 함량은 0.5 mg/ml 초과, 바람직하게는 1 mg/ml 초과이다(최종 재현탁액/희석액 체적 및 가공되는 최초 PL-체적에 따라 달라짐).
hPLEV 농축된 분획물은 활성화 시험에서 강력한 시험관내 면역 조절 효과를 보이고, 상기 EV-분획물의 투여 후 공여자의 이펙터 세포의 감소된 IL-Iβ, TNF-a 및/또는 IFN-γ 사이토카인 반응이 확인되는 경우, 본 발명에 따른 방법에서 특히 유용하다는 것이 확인되었다. ELISpot 검정은, 이펙터 세포의 IL-Iβ, TNF-a 및/또는 IFN-γ 사이토카인 반응이 엑소좀 함유 분획물의 존재 하에 동종 이계 세포에 대해 손상되는 것을 보인다. 잠재적인 시험관내 면역 조절 효과를 분석하기 위해, 예를 들어 Luminex, ELISA, 및/또는 유세포 측정을 포함하는 다른 방법이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 예컨대 생명 유지 장치와 연결된 환자의 염증 조건 및 반응의 예방, 및 수술 전 또는 수술 동안 염증 반응을 억제하기 위해, 특히 염증성 질병(inflammatory driven disease), 신경 퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 면역/자가면역 질병, 심혈관계 질병, 피부 질병(dermatologic disease), 이식 거부 반응, GvHD, 뇌졸중, 허혈 또는 관련 합병증의 위험으로부터 고통 받는 환자의 질병의 개선된 예방 및 치료를 위한 새로운 개념에 기초한다. 일 양태에서, 질병은, 예컨대 저산소증, 염증, 및/또는 허혈과 관련된 뇌 손상과 같은 신경계의 출생전 또는 출생후 손상으로부터 선택될 수 있다. 다른 양태에서, 질병은 각각 이식편대 숙주병(Graft-versus-Host Disease), 또는 장기 이식 후 이식 거부 반응으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 폴리에틸렌글리콜 침전 프로토콜을 사용하여 농축된 hPL로부터 유래된 EV-농축된 분획물은 환자, 특히 신생아 및/또는 이식 받은 환자 및/또는 수술한 환자로 예방학적으로 및/또는 치료학적으로 주입된다.
본 발명에 따른 약제학적 제제는 바람직하게는, 예컨대 항염증 사이토카인, IL-10, TGF-βI, 및 HLA-G와 같은 단백질, 및/또는 핵산, 예컨대 miRNA와 같은 생물학적 인자를 포함하는 EVs가 농축된다. 이는 a) 다양한(복합체) 개재(intervention)가 수행되고, b) 생물학적 생리학적 ("자가") 물질이 사용되고, c) 제제의 원하지 않는 부작용이 감소되는 것을 야기하는 본 발명에 따른 이점을 야기한다.
본 발명은 다양한 개재를 구성한다. 따라서, 특이적 인자가 사용될 뿐만 아니라(및 캐스케이드의(또는 아래에 있는 임상적-표현형의) 오직 일부), 생물학적으로 복잡하고, 내생의 중재자 및 조절자가 사용된다. 이들 성분은 인간마다 발견되므로, 현저한 역효과는 예상되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 이하 단계를 포함하는 본 발명에 따른 약제학적 제제의 제조방법에 관한 것이다: a) hPL을 제공하는 단계, b) 임의로 폴리에틸렌글리콜 침전을 포함하는 hPLEVs에 대해 상기 hPL를 농축시키는 단계, c) 예컨대, 공여자의 이펙터 세포의 감소된 IL-Iβ, TNF-a, T-세포 증식, 및/또는 IFN-γ 사이토카인 반응에 의해 상기 hPLEV 농축된 분획물의 시험관내 면역 조절 효과, 특히 항염증 효과 및/또는 면역 억제 효과를 측정하는 단계, d) 면역 조절 효과, 특히 항염증 효과 및/또는 면역 억제 효과를 보이는 hPLEV 농축된 분획물을 선택하는 단계, 및 e) 단계 d)의 상기 농축된 엑소좀과 적어도 하나의 적합한 약제학적 부형제 및/또는 담체를 혼합하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 투여는, 예컨대 정맥 투여 또는 주입(infusion), 복강내 주사, 피하 주사, 뼈 내 주사(intra bone injection), 뇌혈관 내 주사(intracerebroventricular injection), 근육 내 주사, 안내 주사, 또는 국소 투여에 적합하다. 국소 투여는, 예컨대 화장 피부 제품 또는 포장(pavements), 상처 패드 등에 의해 적용되고, 본 발명의 제제가 미리 제조되거나 미리 처리되거나 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래된 세포외 소포가 농축된 분획물을 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제에 첨가하는 단계를 포함하는, 약제학적 제제 또는 화장품 제제 또는 진단 제제의 제조방법이다.
본 발명은 활성 성분으로서 hPL 또는 hPLEVs의 분획물의 치료학적 유효량을 단독으로 또는 약제학적 담체 또는 희석제와의 조합으로 함유하는 범위 내의 제제를 포함한다. 바람직한 투여 형태에 따라서, 당업자는 적합한 담체를 선택할 수 있다. 복용 형태는, 예컨대 타블렛, 과립, 캡슐, 액체 복용 형태, 겔, 좌약, 크림, 연고, 찜질제 또는 패치를 포함한다. 하나의 바람직한 양태는, 예컨대 WO2013076507에 기재된 적합한 폴리머 매트릭스와 hPLEVs의 분획물의 조합이다. 0.9 % NaCl 용액의 정맥 내 적용이 더욱 바람직하다.
본 발명의 제제의 화장품 적용은 적합한 부형제로 제형될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래된 세포외 소포가 풍부한 분획물은 화장품에 적용되는 PRP를 대체할 수 있다. PRP 요법은 성형 수술, 치과 진료, 스포츠 약물 및 통증 관리와 같은 다양한 의학 분야에 적용된다. PRP는, 예컨대 얼굴 및 피부 회춘을 위해 매우 인기가 있는 비수술적 절차가 된다. PRP 요법은 세포 성장을 자극하도록 혈액 공여자 자체의 혈액 혈소판을 사용하는 치료로서, 안색, 살결을 개선하고, 잃어버린 얼굴 체적을 복구하는 것을 돕는다.
본 발명의 일 양태에 따라서, PRP-요법은 PRP 대신에 hPL 또는 hPLEV의 분획물을 포함하는 화장품 제제로 대체될 수 있다. 자가 조직의 hPL 또는 혈액-공여자 자신으로부터의 hPLEV의 분획물이 콜라겐 및 새로운 피부 세포를 자극하기 위해 피부로 재주입된다. hPL 또는 hPLEV의 분획물은 환자 자체의 혈소판의 유리한 기능을 이용하고, 따라서 치료의 알러지 또는 거부의 위험이 없다. 또한, hPL 또는 hPLEV의 분획물은 얇아진 모발 및 모발 손실 특히 대머리를 치료하는데 성공적으로 사용될 수 있다. 환자가 일찍 치료를 시작하는 것이 중요할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 항노화 요법, 일광 화상, 곤충에 물린 후 알러지 반응, 자가 면역 또는 알러지 피부 반응, 여드름-염증과 같은 피부 재생에서 hPL 또는 hPLEVs의 분획물의 적용이다. hPL 또는 hPLEV의 분획물은 피부 또는 모발 치료를 위한 화장품 조성물의 일부일 수 있다. 본 발명은 피부 및 그 아래 있는 스캐폴드를 향상하고, 주름과 관련된 문제 각각을 직접적으로 다루는 재생 요법을 제공한다. 본 발명에 기재되는 제제로 치료하거나 손상된 피부의 퇴행성 주기를 정상 피부에서 발견되는 건강한 생리로 바꾼다. 본 발명의 제제는 연결 조직 내에서 세포를 재균형을 맞추고, 분자 시그널링의 평형을 맞추고 세포외 매트릭스를 복구시킴으로써 작용한다. 자연 치료 및 조직 재생 과정은 증가된 콜라겐 합성, 콜라겐 세포외 매트릭스의 재생 및 매트릭스 내 섬유아세포의 증식을 야기한다.
진단 용도
본 발명에 따르면, hPLEV에 기초한, 시험관내 진단 테스트를 질병의 실시간 모니터링 및 진단 적용에서 사용하기 위해 입증할 수 있다. HPLEV를 비침습성 혈액-검사를 통한 질병의 진단 바이오마커로 이용할 수 있다. 개별적인 공여자의 hPLEV 제제의 특정한 내용물을 종양 질병 또는 염증성 질병에 관련된 질병을 위한 바이오 마커로서 이용할 수 있다.
본 발명의 보다 나은 이해와 이의 이점을 얻기 위해, 하기의 실시예가 단지 설명적인 목적을 위해 언급된다. 이 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것을 의도하지 않는다.
실시예
본 발명의 실시가, 다르게 명시되지 않는 한, 화학, 분자 생물학, 미생물학, DNA-재조합 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 것이며, 이는 통상적인 기술자의 역량내에 있다. 이러한 기법은 문헌에서 설명된다. 예를 들어, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; 및 Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3을 참고한다. 이러한 일반적인 텍스트 각각은 참조로 본 명세서에 포함된다.
실시예 1: 혈소판이 풍부한 혈장의 제조 방법-실시예
1.1. 혈소판 농축물 (Platelet concentrate) (PRP-PC)
450 ml의 전혈을 CPDA1 항응고제를 함유한 450-ml 삼중백(triple bag) [인도, 트리반드룸, 풀리야라코남 소재의 테루모 펜폴(TERUMO PENPOL), Ltd.]에 수집한다. 혈소판이 풍부한 혈장을 전혈로부터 독일제 냉동 원심분리기 헤라우스(Heraeus) 6000i에 의한 라이트 스핀 원심분리(light spin centrifugation)에 의해 1750 rpm에서 11분 동안 21 ℃에서 각각 5 및 4의 가속 및 감속 커브(acceleration and deceleration curve)로 분리하고, 혈소판을 헤비 스핀 원심분리(heavy spin centrifugation)에 의해 3940 rpm에서 5분 동안 21 ℃에서, 각각 9 및 5의 가속 및 감속 커브로 상청 혈장(supernatant plasma)의 후속 제거(subsequent removal)하여 농축한다. 혈소판 농축물 백(platelet concentrate bag)을 라벨 쪽이 아래로 향한채로 실온에서 약 1 시간 동안 고정한다. 혈소판이 부족한 혈장을 즉시 동결하여 신선 냉동 혈장(fresh frozen plasma, FFP)으로 30 ℃ 이하에서 1년 동안 저장한다.
백혈구 연층(buffy coat)의 제조 방법 - 혈소판 농축물 (BC-PC)
450 ml의 전혈을 63 ml의 CPD 항응고제와 보존액(additive solution) (SAGM)을 함유한 450-ml 사중백(quadruple bag)에 수집한다. [인도, 트리반드룸, 풀리야라코남 소재의 테루모 펜폴(TERUMO PENPOL), Ltd.]. 첫째로, 전혈을 3940 rpm에서 5분 동안 21 ℃에서 각각 9 및 4의 가속 및 감속 커브로 "하드 스핀(hard spin)" 원심분리 한다. 전혈을 구성요소의 비중(specific gravity)에 따라 상이한 구성요소로 분리한다.
·
상층 - 혈소판이 부족한 상청 혈장 (150-200 ml).
·
중간층 - 혈소판의 약 90%, WBC의 70% 및 적혈구의 10%를 함유하는 백혈구 연층.
·
하층 - 팩킹된 적혈구(packed red cell).
혈소판이 부족한 상청액을 하나의 부속백(satellite bag)으로 압착하고(expressing) 백혈구 연층을 다른 부속백으로 압착한다. 잔여 세포로부터 배관을 클리닝하고 BC에서 적정량의 혈장을 획득하는 것을 목적으로 약 20-30 ml의 혈장을 백혈구 연층으로 되돌려 보낸다(returning). SAGM 용액을 적혈구에 추가한다. 이어서, 적혈구와 혈장을 함유한 백을 제거한다. 적혈구를 4 ℃의 냉장실에 두고 혈소판이 부족한 혈장을 -40 ℃의 초저온 냉동고(deep freezer)에 신선 냉동 혈장(fresh frozen plasma, FFP)으로 둔다. 백혈구 연층을 혈장과 약하게 혼합하고, 다시 1,100 rpm에서 6분 동안 21 ℃에서 각각 5 및 4의 가속 및 감속 커브로 하나의 빈 부속백과 함께 "라이트 스핀" 원심분리를 한다. 상청액, 혈소판이 풍부한 혈장을 빈 혈소판 저장 백으로 압착한 뒤, 배관을 실링하였다(sealing). 잔여 WBC와 적혈구가 있는 혈소판 저장 백을 폐기하였다.
1.2.
단일 공여자 혈소판 (Single donor platelet, SDP)-성분 채집(apheresis)-PC
자동 세포 분리 장비(automated cell separator equipment)는 단일 정맥 접근(single venous access) 또는 이중 정맥 접근(double venous access)을 이용한 간헐적 흐름 세포 기법(intermittent flow cell technique) 또는 연속적 흐름 세포 기법(continuous flow cell technique) 일 수 있다. 연속적 흐름, 이중 정맥 접근, 자동 세포 분리기 - 미국, 14 60015, 디어필드(Deerfield) 소재의 백스터(Baxter), 펜월 디비젼(Fenwal division), CS3000 ® 플러스를 이용할 수 있다.
1.
상세한 절차, 소요 시간 및 가능한 위험과 이익을 설명한 후에 공여자의 서면 동의를 받는다.
2.
하기의 이유 때문에, 성분 채집 공여자(apheresis donor)에서 정맥 접근은 중요한 고려사항이며, 선택 시 정맥을 검사한다 -
·
장기간의 절차
·
장기적 유량(prolonged flow rate)
·
연속 흐름 장비(continuous flow equipment)를 이용한 2회의 정맥천자(two venipuncture)에 대한 빈번한 필요성.
3.
공여자의 나이를 문서화한다.
4.
성분 채집 절차 전에, 혈소판 성분 채집 (plateletpheresis)-공여자의 ABO / Rh 혈액형 검사 및 감염성 질병 마커 (HIV, HBV, HCV, VDRL 및 말라리아)에 대한 테스트를 완료한다.
5.
혈소판 기능에 영향을 미칠 가능성이 있는 아스피린 또는 다른 NSAIDS을 복용한 공여자는 연기된다.
6.
1.5 × 105/μl 보다 큰 혈소판 수를 갖는 공여자를 혈소판 성분 채집을 위해 취했다.
1.3.
절차
절차를 닫힌계(closed system)에서 수행한다. 일회용 키트를 연속적 흐름 분리기(continuous flow separator)에 설치한 다음, 기계를 준비시킨다. 공여자를 양 팔의 전박 부위(antecubital area)에서 두 개의 정맥천자 부위를 베타딘(betadine)으로 클리닝하여 준비하고 스피릿 채혈(spirit phlebotomy)을 공여자에게 최소의 외상(minimal trauma)으로 완료한다. 절차 동안에, 인출 지점(the point of withdrawal)에서 제어된 방식으로 혈액을 항응고화하고, 전혈과 항응고제 (ACD)의 비율을 9:1 내지 11:1에서 유지한다. 항응고화된 혈액을 스피닝 분리 용기(spinning separation container)로 펌핑(pumping)한다. 적혈구를 스피닝 분리 용기의 외측 가장자리(outer edge)로 향하는 원심력(centrifugal force)에 의해 팩킹(packing)한 다음, 적혈구는 분리 용기(separation container)를 나간다. 혈장, 혈소판, 또는 WBC와 같은 저밀도 구성요소를 혈장 펌프(plasma pump)에 의해 제거하고, 이들은, 혈소판이 용기의 외측 가장자리로 향하는 원심력에 의해 패킹된 스피닝 채집 용기(spinning collection container)로 들어간다. 분리된 혈소판을 용기에 패킹된 채로 유지하는 반면, 혈액의 다른 구성성분은 공여자로 돌려보낸다. 수집 절차의 말에서, 혈소판 수집 백(platelet collection bag)을 세게 진탕(shaing)하여 혈소판 수집 백의 벽으로부터 혈소판을 분리하고(detaching), 1 시간 동안 실온에 두어 이를 균등한 현탁액(even suspension)으로 만든다. 이 전체적인 절차는 1.5-2.5 시간을 필요로 한다. 성분 채집-PC의 최종 부피는 200-300 ml의 범위에 이른다.
실시예 2: 인간 트롬보사이트 용해물의 생성 (
human
thrombocyte lysate,
h
PL)
인간 트롬보사이트 용해물 (= 인간 혈소판 용해물 (human platelet lysate, hPL))의 생성은 기한이 지난 인간 트롬보사이트 농축물 (= 인간 혈소판 농축물 (hPC/hTC)의 추가 가공에 기초한다. hTC를 획득하기 위해, 대개 두개의 상이한 처리 방법(proceeding method)이 사용된다. 하나는 몇몇 공여자의 전혈 헌혈로부터 유래된 공동 백혈구 연층 생성물(pooled buffy coat product)의 사용에 의해 정의되고, 다른 하나에서는, 성분 채집-농축물이 사용된다. 이 기법에서, 공여자는 체외순환 세포-분리기(extracorporal cell-separator)에 연결되고, 적혈구, 백혈구 및 혈장과 같은 다른 혈액 구성요소는 공여자에게 돌려주는 반면, 트롬보사이트는 필터링되어 나온다(filtered out). 두 경우 모두에서, 결과적인 혈액 생성물은 백혈구가 제거된 TC이다. 이러한 생성물은 적어도 4-5일 동안 살아있는 트롬보사이트를 함유하고, 예를 들어, 혈소판 감소증(thrombocytopenia)이 있는 환자에서 결핍된 트롬보사이트 대체에 사용될 수 있다.
만료일(date of expiry) 후, 초과 생성물(excess product)을 hPL의 제조에 사용할 수 있다. 동결 및 융해-사이클 (-20 ℃ 및 RT)에 의해, 혈소판을 파쇄하고(breaking up)/분해하여(cracking) 이들의 내부 내용물을 주변 액체 (혈장)으로 방출한다. 상이한 프로토콜이 존재하며, 3200 내지 10 000 g 사이에서 약 1시간 동안의 원심분리 단계를 포함한다. 용해된 세포, 세포 단편(cellular fragment) 및 다른 잔사물(debris)을 원심분리에 의해 제거한다. 결과물은 혈소판 용해물과 혈장으로 이루어진 투명하고, 점성이 있는, 노란색 액체이다. 또한, 처리후에 생성물을 살균하기 위해, 200 nm 필터를 선택적으로 사용할 수 있다. 동시에, 200 nm보다 큰 입자를 제거하며, 이는 엑소좀의 크기가 아닌 세포외 소포를 포함한다.
실시예 3: 피콜-밀도 기울기 원심분리(Ficoll-density gradient centrifugation)를 이용한 말초 단핵구 (peripheral mononuclear cell, PBMC)의 분리 및 시험관내 세포의 배양
말초 단핵구를 전혈 헌혈(full-blood donation)로부터 유래된 백혈구-연층 생성물로부터 수득한다. PBMC의 분리를 피콜-밀도 기울기 원심분리를 이용하여 하기의 기술에 따라 수행하였다:
1. 약 100 ml의 백혈구 연층 생성물을 3개의 50 ml 폴리프로필렌 튜브에 등분한다. 필요한 경우, 손실된 부피(missing volume)를 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 대체하였다.
2. 3개의 추가의 50 ml PP-튜브를 10 ml의 피콜(Ficoll)로 채운다.
3. 35 ml의 혈액을 10 ml의 피콜 위에 조심스럽게 부어서, 두개의 별개의 층을 형성한다.
4. 밀도-기울기 원심분리를 900 g에서 20분 동안 10 ℃의 온도에서 수행한다(0 또는 1에 브레이크를 설정).
5. 기울기의 형성 후에, PBMC-함유 간기(PBMC-containing interphase)를 새 50 ml PP-튜브로 옮긴다.
6. 수집된 PBMC가 있는 분획물을 PBS를 이용하여 50 ml의 부피까지 채운다.
7. 혈소판의 제거를 위해, 650 g에서 5분 동안 원심분리를 수행한다.
8. 혈소판을 함유한 상청액을 버린다.
9. 적혈구의 용해를 위해, 세포를 20-25 ml의 용해-완충액에서 재현탁(resuspension)한 뒤, 4 ℃에서 7분 동안 배양한다.
10. PBS로 50 ml의 부피까지 채움으로써, 용해 반응을 중지시킨다.
11. 900 g에서 5분 동안 원심분리에 의해 용해된 단편의 제거.
12. 상청액을 버리고 세포를 50 ml PBS에서 재현탁한다.
13. 세포를 뉴바우어-챔버(Neubauer-chamber)를 이용하여 수동으로 계수하거나 대안적으로는 자동적으로, 예를 들어, 시스멕스-혈구계수기(Sysmex-haemocytometer)를 이용하여 계수한다.
14. PBMC를 배양-배지 [RPMI, 10%의 가열 불활성화 hAB-혈청(heat inactivated hAB-Serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민 (penicillin/streptomycin/L-Glutamin, PSG)]에서 재현탁하고 하기의 시험관내-검정에 따라서 적정 농도로 설정한다.
실시예 4: 분자 수준에서 세포외 소포-제제의 분석 및 특성화
1. BCA-검정 [또는 브래드포드-검정(Bradford-Assay) 같은 대안적 표준 방법(alternative standard method)]을 이용한 전체 단백질 농도의 연산
EV가 농축된 분획물의 전체 단백질 농도를 표준 방법(standard method)을 이용하여 연산할 수 있다. 이 목적을 위해, 다양한 시판 키트 및 제제가 입수 가능하다. 예를 들어, 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific)의 제품 BCA 단백질 검정 키트(BCA Protein Assay Kit)를 사용하였다. 비신코닌산(bicinchoninacid, BCA) 두 분자는 킬레이트 복합체(chelate complex)를 하나의 구리 이온 (1+)과 함께 형성한다. 구리 환원은 알칼리 환경(alkaline environment)에서 단백질의 존재에 의해 야기된다. 킬레이트 복합체의 형성은 분석된 용액의 초록색에서 보라색으로의 색상 변화에 대응한다. 색상 변화의 강도를 562 nm의 흡광에서 광도적으로(photometrically) 측정할 수 있다. 상이한 BSA-농도의 캘리브레이션 값(calibration value)의 공지된 값에 비교하여, EV 분획물의 단백질-농도를 연산할 수 있다.
2. 평균 입자 크기 [nm]와 크기 분포 [곡선] 및 입자 수 [나노사이트(Nanosite) 또는 제타뷰(Zetaview) 같은 NTA-플랫폼을 이용한]의 연산
세포외 나노 소포(extracellular nanovesicle)의 특성화를 위해, 나노입자 추적 분석 (NanoparticleTracking Analysis, NTA)을 사용하였다. 이 물리적 기법은 빛의 파장 보다 작은 크기의 입자를 추적하는데 적합하다. 이 방법은 입자가 움직이기 시작하는 전기장(electric field)의 유도(induction)에 기초한다. 이 움직임 덕분에, 이들의 브라운 운동(Brownian motion)을 이들의 확산 동안 분석 큐벳(analysis cuvette)을 통해 추적할 수 있다. 분획물에서 입자의 크기와 크기-분포를 정의할 수 있으며, 또한, 입자 농도(particle concentration)의 값을 획득한다. 브라운 운동의 추적 분석이 비디오 현미경(video microscope)에 연결된 스크린 상에서 뒤따를 수 있다. 데이터를 디지털 방식으로 소프트웨어에 의해 데이터로 변환한다. 크기의 연산을 입자의 확산 상수(diffusion constant)에 의해 계산하고 유체역학적 입자 크기(hydrodynamic particle size)로 변환한다. 입자 농도를 비디오 섹션(video section)의 분석으로부터 추정하며, 이는 산란광(scatter light)의 측정량(measured amount)에 관한 것이다.
분리 방법
분리 방법은 초원심분리 [분별 원심분리(differential centrifugation)], 크기-배제 크로마토그래피[아이존(Izon) 및 엑소스핀(Exospin) 컬럼], 폴리머에 기초한 침전 [PEG 1000, PEG 6000, PEG 8000 EV, 엑소퀵-퀴아젠(Exoquick-Qiagen)], 멤브레인 어피니티(membrane affinity) [엑소이지-퀴아젠(Exoeasy-Qiagen)], 및 유동 여과(flow filtration)에 기초할 수 있다. 치료학적 적용 또는 기초 연구를 위한 EV를 분리하기 위한 표준화된 첨단기술은 없다. 정제 방법의 선택에 대한 기준은 가공되어야 하는 혈소판 용해물의 초기의 부피 뿐만 아니라 농축된 PL-EV 분획물의 높은 순도와 회수(recovery)이다.
정제 방법의 선택은 재현성(reproducibility), 순도, 불순물, 및 hPLEV의 기능적 특성의 지속에 관하여 표준화될 필요가 있다. 적용된 방법은 이들의 확장성(scalability)과 재현성의 맥락에서 평가되어야 한다. hPLEV 표면에 부착된 구성요소 또는 공동-분리된 비-hPLEV 관련의 공동-인자가 정제 동안 손실될 수도 있다는 사실 때문에, 가장 높은 hPLEV 순도를 수득하는 방법이 치료학적으로 가장 효과적인 EV 분획물을 회수하는데 반드시 최적인 것은 아니다.
EV 저장
EV의 저장을 위한, 현재 입수가능한 표준화된 프로토콜은 없다. 저장 조건은 이들이 EV의 안정성에 영향을 끼칠 수 있기 때문에, 반드시 확인(validation)되어야 한다. 많은 통상적인 사용된 용매와 완충액은 염화나트륨 내지 PBS, 트리스-HCl, 헤페스(HEPES) 및 글리콜(glycerol)에 이른다.
실시예 5: 원심분리의 원리
원심분리를 구성요소, 세포를 분리하는데 사용하고 세포 소기관(cell organelle)의 분리에 사용한다. 이는 원심력으로 인한 액체에서 입자의 움직임에 기초한다. 이 기법의 주요 구성요소는 로터(rotor)이다. 고정-각 로터(fixed-angle rotor), 수직 로터(vertical rotor) 또는 스윙 로터(swing rotor)와 같은 상이한 유형이 존재한다. 초원심분리기는 고속 원심분리기(high-speed centrifuge)의 군에 속한다. 공기 항력(aerodynamic drag)으로 인한 마찰열(frictional heat)의 발달을 피하기 위해, 진공을 설정한다. 물리 법칙(physical principle)에 따르면, 구성성분의 분리는 크기와 밀도에 의해 발생한다. 입자는 밖으로 향하는 방향(outward-direction)에서 원심력에 의해 가속된다. 이 가속은 입자의 각속도(angular velocity)와 이의 회전축과의 거리에 좌우된다. 가속도는 중력 g를 의미한다.
스베드베리-방정식(Svedberg-equation)에 의해, 점성 유체에서 구형 입자(spherical particle)의 침강-속력(sedimentation-speed)를 기술한다. 생물학적 물질로부터 S-값 (스베드베리-단위): 침강계수 s는 원심력장(centrifugal field)에서 특정한 기하학적인 조건하에 달성된 침강-속력으로 정의된다. 침강-계수 s의 단위는 S-값으로 정의된다. 다양한 기법의 원심분리가 존재한다: 분별 원심분리, 띠 원심분리(zonal centrifugation), 등밀도 원심분리(isopycnic centrifugation), 밀도 기울기 원심분리(density gradient centrifugation).
분별 원심분리:
분별 원심분리는 입자의 상이한 침강-속력에 기초한다.
이를 입자의 농축과 감소된 부피에서 입자의 보다 높은 농도 획득에 이용한다. 고정-각 로터를 이용한다.
따라서, 원심분리된 입자의 침강-속력이 서로 충분이 상이한 것이 요구된다.
세포와 이들의 구성요소에 관하여, 분리를 허용하는 하기의 차이점들이 존재한다:
완전 세포(Complete cell)가 첫번째로 침강하고(1000 g, 2 분), 이어서 핵과 같은 높은 중량의 보다 큰 크기의 세포 구성요소 (1000 g, 5-10 분)가 침강한다. 그 후에, 핵막과 원형질막이 침강하고 (1500 g, 15 분), 이어서 골지체(golgi apparatus) (2000 g, 20 분), 미토콘드리아, 리소좀 및 퍼옥시좀 (10000 g, 25 분)이 침강한다. 마이크로좀은 100000 g, 60분 이상에서 침강한다. 이는 엑소좀을 포함하는 EV에도 알맞다. 이들은 최종 펠렛에서 발견된다.
분별 원심분리에 의해 수득된 분획물의 순도:
기술된 구성요소는 100%로 분리되고 정제될 수 없다. 빠르게 침강하는 입자로 이루어진 침강물은 원심분리 튜브의 바닥에 가깝게 위치된 느리게 침강하는 입자를 항상 포함할 것이다. 이 오염 때문에, 완전한 순도는 달성될 수 없다.
EV/엑소좀의 농축에 사용된 분별 원심분리:
첫번째 원심분리 단계에서, EV-함유 액체 (세포 배양 상청액, 희석된 혈장-함유 액체 또는 희석된 hPL과 같은)를 2000 g에서 15분 동안 원심분리한다. 세포, 사멸된 세포, 세포 잔사물 (핵, 핵막, 원형질막, 골지체) 펠렛은 바닥에 있으며 이를 제거할 수 있다. 10000g에서 45분 동안 4 ℃에서의 두번째 원심분리 단계에서, 단계 1의 상청액은 미토코드리아, 리소좀 및 퍼옥시좀으로부터 제거한다. 엑소좀을 포함하는 EV와 같은 마이크로좀은 상청액에 있으며 이를 초원심분리에 의해 (110000 g, 1-2 시간) 최종적으로 제거할 수 있다.
PEG-침전
폴리에틸렌글리콜-침전(polyethyleneglycol-precipitation)을 위해, PEG 6000을 사용할 수 있다. 이 물질은 에틸렌-글리콜로부터 유래된 폴리머이고, 수용성이며, 비활성 및 비독성이다. PEG를 이용하여 단백질 (또한 바이러스-입자 및 EV)와 같은 고분자 물질(high-molecular substance)을 침전시킬 수 있다. PEG의 존재하에, 단백질은 침전하는 반면에 저분자 물질(low-molecular substance)은 가용성을 유지한다. 선택된 침전-조건에 따라, 고분자 물질과 저분자 물질을 정의하기 위한 경계는 어느 정도 달라질 수 있다 (PEG의 분자량, PEG-농도 및 침전 온도). 친수성인 경우, 비전하(uncharged) PEG와 단백질이 수용액에서 함께 혼합되며, 단백질의 수화 수(hydration water)에 대해 발생한 동시 발생이 있다. 정의된 PEG-농도에 도달되면, 단백질은 가역적인 방식으로 침전한다. 이 침전은 침전의 매우 온화한 방식을 대표한다 (Polson et al., 1964에서 처음으로 기술됨).
EV의 PEG-침전:
예를 들어, 0,9% NaCl에서 희석된 EV-함유 액체를 10% v/v PEG 6000의 존재하에 밤새 배양하여 (16 h, 4 ℃) EV를 침전시킨다. 배양 후, 침전된 입자를 1500 g에서 30분 동안 (4 ℃) 펠렛으로 만든다. 상청액은 버린다. 펠렛을, 예를 들어, 0,9% NaCl에서 재현탁하여 초원심분리 (110 000 g, ca. 2 시간)한다. 이 단계는 추가의 세척 단계로서 대안적으로 반복될 수 있다.
바람직한 양태에서, 재생성 질병(regenerative disease), 염증성 질병(inflammatory driven disease), 신경 퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 면역/자가면역 질병, 심혈관계 질병, 피부 질병(dermatologic disease), 감염성 질병, 이식 거부 반응, 뇌졸중, 허혈 또는 이식편 대 숙주병(Graft-versus-Host Disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법이 제공되며, 이는 하기 양태 1 내지 13 중 어느 한 양태에 기재된 약제학적 제제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 이 방법은 상기 투여가 정맥 투여 또는 주입(infusion), 또는 복강내 주사, 피하 주사, 뼈 내 주사(intra bone injection), 뇌혈관 주사(intracerebroventricular injection), 근육 내 주사, 안내 주사, 또는 국소적 투여에 적합한 방법이다.
바람직하게는, 인간 혈소판 용해물 또는 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제에 첨가하는 단계를 포함하는 약제학적 제제 또는 진단 제제 또는 화장품 제제의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 구체 양태로, 하기 양태 1 내지 15가 제시된다.
[양태 1]
약제로 사용하기 위한 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 포함하는 약제학적 제제.
[양태 2]
양태 1에 있어서,
염증성 질병(inflammatory driven disease), 신경 퇴행성 질병(neurodegenerative disease), 면역/자가면역 질병, 심혈관계 질병, 피부 질병(dermatologic disease), 감염성 질병, 이식 거부 반응, 뇌졸중, 허혈 또는 이식편대 숙주병(Graft-versus-Host Disease)의 예방 또는 치료를 위한 것인, 약제학적 제제.
[양태 3]
양태 1에 있어서,
상기 제제는 세포가 없는 것인, 약제학적 제제.
[양태 4]
양태 1에 있어서,
상기 인간 혈소판 용해물 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물은 상기 제제의 필수적인 약제학적 활성 성분인 것인, 약제학적 제제.
[양태 5]
양태 1에 있어서,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포는 크기가 10-1000 nm, 특히 크기가 50 내지 200 nm인 것인, 약제학적 제제.
[양태 6]
양태 1에 있어서,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포는 CD9, CD41a, CD41b, CD42b, CD61, CD 62P, CD63 및 신테닌(Syntenin)의 군으로 이루어진 세포 엑소좀 마커 중 적어도 하나에 대해 양성인 것인, 약제학적 제제.
[양태 7]
양태 1에 있어서,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포는 CD 81, CD3, CD4, CD19, CD20, CD2, CD8, CD11a 및 CD25의 군으로 이루어진 세포 엑소좀 마커 중 적어도 하나에 대해 음성인 것인, 약제학적 제제.
[양태 8]
양태 1에 있어서,
항미생물학적 적용을 위한 것이고,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포는 사이토카인 RANTES 또는 사이토카인 NAP-2 또는 이들 모두에 대해 양성인 것인, 약제학적 제제.
[양태 9]
양태 1에 있어서,
상기 약제학적 제제의 단백질 함량은 0.5 mg/ml 초과인 것인, 약제학적 제제.
[양태 10]
양태 1에 있어서,
상기 인간 혈소판 용해물은 단일 공여자로부터 기증된 혈소판 또는 공동 공여자로부터 기증된 혈소판(aingle or pooled donor-donated platelet)으로부터 유래되는 것인, 약제학적 제제.
[양태 11]
양태 1에 있어서,
상기 인간 혈소판 용해물은 백혈구연층(buffy-coat) 추출된 혈소판 농축물로부터 또는 성분 채집 혈소판(platelet apheresis)으로부터 유래되는 것인, 약제학적 제제.
[양태 12]
양태 1에 있어서,
상기 세포외 소포는 mRNA, microRNA (miRNA), 소량의 DNA와 같은 유전 물질과 같은 생물학적 인자, 지질, 및 전사 인자, 사이토카인, 성장 인자를 포함하는 단백질을 포함하는 것인, 약제학적 제제.
[양태 13]
양태 1에 있어서,
상기 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것인, 약제학적 제제.
[양태 14]
양태 1에 있어서,
상기 제제는 정맥 투여 또는 주입(infusion), 복강내 주사, 피하 주사, 뼈 내 주사(intra bone injection), 뇌혈관 내 주사(intracerebroventricular injection), 근육 내 주사, 안내 주사, 또는 국소 투여에 적합한 것인, 약제학적 제제.
[양태 15]
하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 양태 1 내지 14 중 어느 한 양태에 기재된 인간 혈소판 유래의 세포외 소포가 농축된 분획물을 포함하는 약제학적 제제:
a. 단일 공여자 기증된 혈소판으로부터 또는 적어도 15명의 공여자의 공동 공여자 기증된 혈소판으로부터 인간 혈소판 용해물을 제공하는 단계,
b. 인간 혈소판 용해물로부터 유래되는 세포외 소포를 농축시키는 단계,
c. 면역 조절 효과와 같은 시험관내 효과를 측정하는 단계, 및
d. 임의로, 면역 조절 효과와 같은 시험관내 효과를 보이는 농축된 세포외 소포를 선택하는 단계, 및
e. 임의로, 세포외 소포가 세포 엑소좀 마커 CD 81에 대해 음성을 보이고, 세포 엑소좀 마커 CD9에 대해 양성을 보이는 단계 b)의 농축된 세포외 소포를 선택하는 단계, 및
f. 임의로, 단계 a)의 인간 혈소판 용해물 또는 단계 b), d) 또는 e)의 상기 농축된 세포외 소포와 적어도 하나의 적합한 약제학적 부형제 및 담체를 혼합하는 단계.
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Claims (12)
- 하기 단계를 포함하는, 인간 혈소판 유래의 세포외 소포의 농축되고 선택된 분획물을 포함하는 제제를 제조하는 방법:
a) 인간 혈소판 용해물로부터 유래되는 세포외 소포의 농도를 증가시켜 농축시키는 단계로서, 상기 단계는, 적어도 하나의 열 충격 단백질(heat shock protein) 및 적어도 하나의 테트라스파닌 마커에 대해 양성이고, Grp94, 칼넥신(Calnexin), GM130, 프로히비틴(prohibitin) 및 사이토크롬 C 중에서 선택된 적어도 하나의 마커에 대해 음성인 인간 혈소판 유래의 세포외 소포의 농축된 분획물을 수득하도록, 200 nm보다 큰 입자들을 제거하는 것을 포함하는 것인, 단계;
b) 상기 농축된 분획물의 시험관내 효과를 측정하는 단계로, 여기서 시험관내 효과는 항염증 효과 및 면역 억제 효과 중에서 선택된 하나 이상인 면역 조절 효과인 것인, 단계, 및
c) 인간 혈소판 유래의 세포외 소포의 농축된 분획물이 상기 시험관내 효과를 보이는 경우 상기 농축된 분획물을 선택하는 단계.
- 제1항에 있어서,
단계 a)가, 200 nm보다 큰 입자들을 제거하기 전에, 용해된 세포, 세포 단편(cellular fragment) 및 다른 잔사물(debris)을 제거하는 것을 더 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포가 CD9, CD41a, CD41b, CD42b, CD61, CD62P 및 CD63으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 3개의 마커에 대해 양성인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포가 CD81, CD3, CD4, CD19, CD20, CD2, CD8, CD11a 및 CD25의 군으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 마커에 대해 음성인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
200 nm보다 큰 입자를 제거하는 것인 여과(filtration)을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제제가 약제학적 제제이고, 하기 단계를 더 포함하는, 방법.
d) 단계 c)의 상기 농축된 세포외 소포와 적어도 하나의 적합한 약제학적 부형제 및 담체 중 한 종 이상을 혼합하는 단계.
- 제1항에 있어서,
상기 인간 혈소판 용해물이 단일 공여자 기증된 혈소판으로부터, 또는 적어도 15명의 공여자의 공동 공여자 기증된 혈소판(pooled donor-donated platelet)으로부터, 또는 적어도 40명의 공여자의 공동 공여자 기증된 혈소판으로부터 제공되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제제에는 세포가 없는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 분획물의 세포외 소포는 크기가 50 내지 200 nm 사이, 또는 70 내지 140 nm 사이인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제제의 단백질 함량은 0.5 mg/ml 초과인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 인간 혈소판 용해물은 백혈구연층(buffy-coat) 추출된 혈소판 농축물로부터 또는 성분 채집 혈소판(platelet apheresis)으로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 세포외 소포는 적어도 하나의 암호화 및 비-암호화 RNA, mRNA 및 마이크로 RNA (miRNA)를 포함한 RNA, 및 DNA 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
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