ES2813927T3

ES2813927T3 - Anticuerpos que neutralizan potencialmente el virus de la Hepatitis B y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2813927T3
Application number: ES16779075T
Authority: ES
Inventors: Davide Corti
Original assignee: Humabs Biomed SA
Current assignee: Humabs Biomed SA
Priority date: 2015-10-07
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2021-03-25
Anticipated expiration: 2036-10-07
Also published as: MX2018004127A; JP2023011809A; BR112018002406A2; US11390664B2; JP2018535650A; JP2024097078A; CY1123462T1; EA201890874A1; HRP20201345T1; EA038301B1; US20230303663A1; US20190016785A1; JP6869968B2; HK1256869A1; IL258326B; KR20180056777A; JP2021121188A; PT3359564T; EP3753949A1; US12037381B2

Abstract

Un anticuerpo aislado, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que se enlaza a la región de bucle antigénico de HBsAg y neutraliza la infección con el virus de hepatitis B y el virus de hepatitis delta, donde el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDRH1, DRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-38 y 40, respectivamente; o (ii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-37, 39 y 40, respectivamente; o (iii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-38 y 58, respectivamente; o (iv) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-37, 39 y 58, respectivamente; o (v) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-38, y 40, respectivamente; o (vi) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-37, 39 y 40, respectivamente; o (vii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-38 y 58, respectivamente; o (viii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-37, 39 y 58, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que neutralizan potencialmente el virus de la Hepatitis B y usos de los mismos

La presente invención se refiere al campo de anticuerpos contra el virus de la hepatitis B (HBV) y contra el virus de la hepatitis delta (HDV) y a usos de los mismos. Los potentes anticuerpos anti-hepatitis B de la presente invención se unen a un epítopo localizado en la región de bucle del dominio S de las proteínas de envoltura HBV (HBsAg) antigénicas, tal se identifica en la presente invención. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican células B inmortalizadas y células plasmáticas cultivadas que producen estos anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. Además, la invención se refiere al uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención en métodos de screening, así como en la diagnosis, profilaxis y tratamiento de enfermedades, en particular de la hepatitis B y la hepatitis D.

El virus de la hepatitis B (HBV) consiste en (i) una envoltura que contiene tres proteínas de superficie relacionadas (antígeno superficial de la hepatitis B, HBsAg) y lípidos y (ii) una nucleocápside icosaédrica que encierra el genoma de a Dn viral y ADN polimerasa. La cápside de HBV se forma en el citosol de la célula infectada durante el empaquetamiento de un complejo de replicación de pre-genoma de ARN y tiene la capacidad de surgir durante la síntesis del genoma de ADN viral por transcripción inversa del pre-genoma en el lumen de la partícula. Las tres proteínas de envoltura del HBV S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg forman un plegamiento transmembrana complejo en el retículo endoplásmico y forman homo- y hetero-dímeros enlazados a disulfuro. Durante el brote en una membrana intracelular, un dominio lineal corto en la región preS citosólica interactúa con los sitios de enlace en la superficie de la cápside. Los viriones son entonces secretados a la sangre. Además, las proteínas superficiales pueden surgir en ausencia de cápsides y formar partículas subvirales (SVP) que también son secretadas en un exceso logarítmico de 3-4 sobre los viriones. El alto nivel de HBsAg puede agotar la respuesta de las células T específica de HBsAg y se propone como un factor importante para la inmunotolerancia viral en pacientes con hepatitis B crónica (CHB) (Chisari FV, Isogawa M, Wieland SF, Pathologie Biologie, 2010;58:258-66).

El virus de hepatitis B causa infecciones hepáticas agudas y crónicas de potencial peligro para la vida. La hepatitis B aguda se caracteriza por viremia, con o sin síntomas, con el riesgo de hepatitis fulminante (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 3 de agosto de 2015. doi: 10.1002/hep.28025. [Publicación electrónica disponible]). A pesar de que se dispone de una vacuna eficaz contra la hepatitis B desde 1982, la OMS reporta que 240 millones de personas se infectan de manera crónica de hepatitis B y que más de 780.000 personas mueren cada año debido a complicaciones de la hepatitis B. Aproximadamente un tercio de los pacientes con hepatitis B crónica (CHB) desarrollan cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular, lo que representa 600.000 muertes al año (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 3 de agosto de 2015. doi: 10.1002/hep.28025. [Publicación electrónica disponible]).

Los tratamientos actualmente disponibles para la hepatitis B crónica incluyen interferón-alfa (pegilado) (IFN-a o pegIFN-a) y Antivirales de Acción Directa de análogos de nucleósidos o nucleótidos (DAA) que inhiben la ADN polimerasa del virus de la hepatitis B (HBV) (“ inhibidores de polimerasa”). Los inhibidores de polimerasa incluyen Lamivudina, Adefovir, Entcavir, Telbivudina y Tenofovir. Los inhibidores de polimerasa (Lamivudine, Adefovir, Entecavir, Telbivudina, Tenofovir) suprimen la función de la transcriptasa inversa de la HBV ADN polimerasa y, por tanto, interfieren en la síntesis de ADN viral a partir del ARN pre-genómico. Este tratamiento no impide la propagación viral, la formación de ADNccc y no afecta a la liberación de HBsAg. Además, los inhibidores de polimerasa limitan la progresión de la enfermedad, pero raras veces eliminan el virus. Así, la habitualmente se observa una recaída viral después de detener el tratamiento y, por tanto, los inhibidores de la polimerasa se deben utilizar durante toda la vida. Además, se generan mutantes resistentes al fármaco después del tratamiento prolongado. PEG-IFN-a inhibe el HBV indirectamente a través de efectos moduladores inmunitarios y directamente reduciendo los niveles de equilibrio de los transcriptos de HBV (acetilación incrementada de histonas ligadas a ADNccc). Sin embargo, el PEG-IFN-a tiene una eficacia limitada y provoca serios efectos secundarios.

Mientras que el pegIFN-a es efectivo en aproximadamente un tercio de los pacientes tratados, los inhibidores de polimerasa reducen significativamente la carga viral en la gran mayoría de los tratados (Timothy M. Block, Robert Gish, Haitao Guo, Anand Mehta, Andrea Cuconati, W. Thomas London, Ju-Tao Guo, Chronic hepatitis B: What should be the goal for new therapies?, Antiviral Research 98 (2013) 27-34). El interferón a está asociado con muchas reacciones adversas y no se puede utilizar en pacientes con cirrosis avanzada o con contraindicaciones médicas/psiquiátricas (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, ^{Locarnini S, Zoulim F, Chang} kM, ^{Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure.}Hepatology. 3 de agosto de 2015. doi: 10.1002/hep.28025. [Publicación electrónica disponible]). Aunque inhibidores de polimerasa tales como entecavir y tenofovir parecen tener efectos menos adversos, las tasas de seroconversión de HBeAG y la pérdida de HBsAg son bajas para esos fármacos. Por tanto, la mayoría de pacientes con frecuencia requiere un tratamiento permanente, con el coste y riesgo asociado de reacciones adversas, resistencia a fármacos y no adherencia. Así, el tratamiento actualmente disponible para la hepatitis B crónica es aún deficiente por varias limitaciones y no se puede considerar como curativo. Por tanto - aunque el tratamiento para HBV ha mejorado - los pacientes con HBV con frecuencia requieren terapias permanentes y la cura es aún un objetivo difícil (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology.

3 de agosto de 2015. doi: 10.1002/hep.28025. [Publicación electrónica disponible]).

La WO 2006/076640 A1 describe el aislamiento y la caracterización de un anticuerpo monoclonal de chimpancé neutralizante de HBV, HBV#8, que se una al antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg).

Qui et al. 1996 (Journal of Immunology vol. 156(9) páginas 3350-3356) describe un anticuerpo que reconoce un amplio espectro de antígenos de superficie de la hepatitis B.

Forough et al. 2014 (Journal of Gastroenterology and Hepatology vol. 29(5) páginas 1083-1091) proporcionan un panel de anticuerpos que reconocen antígenos de superficie de HBV.

El enfoque más certero para curar la hepatitis B crónica (CHB) y un punto final ideal del tratamiento sería lograr una pérdida del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), lo que, sin embargo, aún no se ha conssguido de forma eficiente con los tratamientos actualmente disponibles de la hepatitis B crónica (para revisión véase Gish R.G. et al., 2015, Antiviral Research 121:47-58).

Los pacientes de HBV gravemente descompensados con hepatitis aguda o carcinoma hepatocelular son indicados para el trasplante de hígado ortotópico (OLT). Después del OLT, la tasa de recurrencia de la hepatitis B es >80% sin prevención, mientras que >90% de los receptores del trasplante se controlan clínicamente con un tratamiento con inmunoglobulina de hepatitis B (HBIG) y análogos de nucleósidos o nucleótidos. Las inmunoglobulinas de hepatitis B (HBIG) son inmunoglobulinas policlonales purificadas a partir de donantes vacunados. Sin embargo, la administración de HBIG a largo plazo está asociada a diversos problemas no resueltos, incluyendo una disponibilidad limitada y un coste extremadamente alto (Takaki A, Yasunaka T, Yagi T. Molecular mechanism to control post-transplantation hepatitis B recurrence. Int J Mol Sci. 30 de julio de 2015; 16(8):17494-513). Por otra parte, deben administrarse dosis extremadamente altas, en particular se administran 10 gramos (que contienen 10.000 IU, según ensayos de enlace) al receptor durante el trasplante mediante infusión intravenosa. Posteriormente, se administran 2 gramos vía intravenosa diariamente durante 8 días y se administran además infusiones cada 1-3 meses con el fin de mantener los niveles en suero de anti-HB por encima de 100 lU/ml. Nuevamente, se requiere un tratamiento permanente.

Se observan complicaciones aún más graves cuando se trata de co-infección o superinfección con el virus de hepatitis delta (HDV). De acuerdo con la OMS, la hepatitis D infecta aproximadamente 15 millones de personas en el mundo. El HDV se considera un satélite subviral debido a que solo puede propagarse en presencia de HBV. El HDV es uno de los virus animales más pequeños (40 nm), siendo su genoma de solo 1,6 kb y codificando para S- y L- HDAg. Todas las otras proteínas necesarias para la replicación del genoma de1HDV, incluyendo la ARN polimerasa, son proporcionadas por la célula huésped y la envoltura de HDV es proporcionada por el HBV. En otras palabras, el HDV es un virus defectuoso que requiere una co-infección con HBV para su replicación, puesto que utiliza las proteínas de envoltura de la hepatitis B (HBsAg) como su propia cubierta de viriones. Cuando se introduce en las células permisivas, el genoma de HDV ARN se replica y asocia con varias copias de las proteínas del HDV codificado para ensamblar un complejo de ribonucleoproteína (RNP). La RNP es exportada desde la célula por las proteínas de envoltura HBV, capaces de ensamblar vesículas de lipoproteínas que se desarrollan en el lumen de un compartimiento pre-Golgi antes de ser secretadas. Por otra parte, las proteínas de envoltura HBV también proporcionan un mecanismo para la orientación del HDV a una célula no infectada, asegurando así la propagación de1HDV.

Las complicaciones provocadas por el HDV incluyen una mayor probabilidad de experimentar insuficiencia hepática en infecciones agudas y una rápida progresión hacia cirrosis hepática, con una mayor probabilidad de desarrollar cáncer hepático en las infecciones crónicas. En combinación con el virus de la hepatitis B, la hepatitis D tiene la tasa de fatalidad más alta de todas las infecciones por hepatitis, un 20% (Fattovich G, ^{Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm} sW. ^{Influence of hepatitis delta virus}infection on morbidity and mortality in compensated cirrhosis type B. Gut. Marzo 2000; 46(3):420-6). La única terapia probada para la infección crónica por HDV es con interferón alfa. Sin embargo, el tratamiento de HDV con interferón-alfa es relativamente ineficiente y no es bien tolerado. El tratamiento con interferón-alfa da como resultado un post-tratamiento de seis meses de respuesta virológica sostenida en un cuarto de los pacientes. Igualmente, se han ensayado en gran medida análogos de nucleósidos o nucleótidos (NA) en la hepatitis delta, pero parece que son ineficaces. El tratamiento de combinación de NA con el interferón también se ha demostrado desalentador y, por ello, hay una necesidad de nuevas opciones terapéuticas (Zaigham Abbas, Minaam Abbas Management of hepatitis delta: Need for novel therapeutic Options. World J Gastroenterol 28 de agosto de 2015; 21(32): 9461-9465).

En vista de lo anterior, es el objeto de la presente invención proporcionar un producto basado en anticuerpos capaz de neutralizar tanto el virus de la hepatitis B (HBV) como el virus de hepatitis delta (HDV), que permita una mejor prevención y tratamiento de la hepatitis B. Además, no existe actualmente ningún tratamiento para la hepatitis D y, por ello, también es objeto de la presente invención proporcionar un producto basado en anticuerpos para la prevención y el tratamiento de la hepatitis D. Es además un objeto de la presente invención proporcionar un producto basado en anticuerpos que permita un mejor tratamiento de la hepatitis B crónica. Para ello, es ventajoso que un único producto basado en anticuerpos actúe de diferentes formas (i) neutralizando potencialmente el HBV, (ii) promoviendo la eliminación de HBsAg y HBV e (iii) induciendo la seroconversión, es decir una respuesta inmune al virus. Por otra parte, los anticuerpos también pueden ventajosamente promover una presentación mejorada del antígeno, facilitando así la restauración de una respuesta de las células T anti-HBV. Además, es objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que se enlaza a diferente genotipos - preferentemente todos conocidos - de antígeno superficial de virus de hepatitis B y a diferentes mutantes infecciosos - preferentemente todos conocidos - del antígeno superficial de virus de la hepatitis B. En resumen, es objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos mejorados, o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico, vectores y células relacionados y composiciones farmacéuticas que superen las desventajas discutidas de la técnica anterior.

El objeto que subyace a la presente invención se resuelve mediante el contenido establecido a continuación y en las reivindicaciones adjuntas.

A continuación, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se citan con realizaciones específicas; sin embargo, se debe entender que se pueden combinar de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Se debe entender que esta descripción soporta y abarca realizaciones que combinan las realizaciones explícitamente descritas con cualquier número de los elementos descritos y/o preferentes. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud se deben considerar descritos en la descripción de la presente solicitud, a menos que el contexto lo indique de otra manera.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el significado como es entendido comúnmente por un experto medio en la técnica.

En esta descripción y reivindicaciones adjuntas, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, el término “comprende” y variaciones como “comprendiendo” y “que comprende” se entenderá que implican la inclusión de un número establecido, un entero o un paso, pero no la exclusión de cualquier otro miembro no establecido, número entero o paso. El término “consiste en” es una realización particular del término “comprende”, donde cualquier otro miembro no establecido, número entero o paso está excluido. En el contexto de la presente invención, el término “comprende” abarca el término “consiste en”. Así, el término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste en”, por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X Y.

Los términos “un” y “uno/una”, “el/la” y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (en especial en el contexto de las reivindicaciones) se consideran abarcando tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí de otra manera o el contexto lo contradiga claramente. La cita aquí de intervalos de valores se propone simplemente como una abreviatura para referirse individualmente a cada valor separado dentro del intervalo. A menos que se indique aquí de otra manera, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se hubiera citado aquí individualmente. Ningún lenguaje en la descripción debe considerarse que como indicando cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

La palabra “esencialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo una composición “esencialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra “esencialmente” se puede omitir de la definición de la invención.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa x ± 10%.

El término “enfermedad” tal como se utiliza aquí se entiende en general como sinónimo y se utiliza de forma intercambiable con los términos “trastorno” y “condición” (como en una condición médica), reflejando toda condición anormal del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que impide el funcionamiento normal, se manifiesta típicamente distinguiendo signos y síntomas y provoca que el humano o animal tenga una vida reducida o una menor calidad de vida.

Tal como se utiliza aquí, la referencia a “tratamiento” de un sujeto o paciente incluye la prevención, la profilaxis, la atenuación, la mejora y la terapia. Los términos “sujeto” o “paciente” se utilizan aquí de forma intercambiable para abarcar todos los mamíferos, incluyendo humanos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, vacas, perros, gatos, caballos, cabras, ovejas, cerdos y conejos. En una realización, el paciente es humano.

Tal como se utilizan aquí, los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” y variaciones de esos términos se refieren a una molécula, en particular un péptido, oligopéptido, polipéptido o proteína, incluyendo proteína de fusión, respectivamente, que comprende al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace peptídico normal o mediante un enlace peptídico, por ejemplo en el caso de péptidos isostéricos. Por ejemplo, un péptido, polipéptido o proteína preferentemente está compuesto por aminoácidos seleccionados de los 20 aminoácidos definidos por el código genético, unidos entre sí por un enlace peptídico normal (polipéptido “clásico”). Un péptido, polipéptido o proteína puede estar compuesto por L-aminoácidos y/o D-aminoácidos. En particular, los términos “péptido”, “polipéptido”, “proteína” también incluyen “péptidos miméticos”, que se definen como análogos de péptido que contienen elementos estructurales no peptídicos, los cuales son capaces de imitar o antagonizar la(s) acción(es) biológica(s) de un péptido precursor natural. Un péptido mimético carece de características peptídicas clásicas, tales como enlaces peptídicos enzimáticamente escindibles. En particular, un péptido, polipéptido o proteína puede comprender aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos definidos por el código genético además de estos aminoácidos o puede estar compuesto por aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos definidos por el código genético. En particular, un péptido, polipéptido o proteína en el contexto de la presente invención pueden estar también compuesto por aminoácidos modificados por procesos naturales, tales como procesos de maduración post-traducción, o por procesos químicos bien conocidos por el experto en la técnica. Estas modificaciones están bien detalladas en la literatura. Estas modificaciones pueden estar presentes en cualquier lugar del polipéptido: en el esqueleto peptídico, en la cadena de aminoácidos o incluso en los extremos carboxi- o amino-terminales. En particular, un péptido o polipéptido pueden estar ramificado después de una ubiquitinación o ser cíclico, con o sin ramificaciones. Ese tipo de modificación puede ser resultado de procesos post-traduccionales naturales o sintéticos bien conocidos por el experto en la técnica. En particular, los términos “péptido”, “polipéptido”, “proteína” en el contexto de la presente invención también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas modificadas. Por ejemplo, las modificaciones de los péptidos, polipéptidos o proteínas pueden incluir acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o de un derivado lipídico, fijación covalente de un fosfatidilinositol, reticulación covalente o no covalente, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, glicosilación, incluyendo pegilación, hidroxilación, yodización, metilación, miristoilación, oxidación, procesos proteolíticos, fosforilación, prenilación, racemización, seneloilación, sulfatación, adición de aminoácidos, tal como arginilación o ubiquitinación. Estas modificaciones están bien detalladas en la literatura (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2a Ed., T. E. Creighton, New York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983), B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter y col. (1990), Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol.

182: 626-646 y Rattan y col. (1992), Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). Por consiguiente, los términos “péptido”, “polipéptido”, “proteína” preferentemente incluyen, por ejemplo, lipopéptidos, lipoproteínas, glicopéptidos, glicoproteínas y similares.

Tal como se utiliza aquí, un “(poli)péptido” comprende una cadena única de monómeros aminoácidos unidos por enlaces peptídicos como se explica anteriormente. Una “proteína”, tal como se utiliza aquí, comprende uno o más, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (poli)péptidos, es decir una o más cadenas de monómeros aminoácidos unidos por enlaces peptídicos como se explica anteriormente. De manera preferente, una proteína de acuerdo con la presente invención comprende 1, 2, 3 o 4 polipéptidos.

El término “recombinante”, tal como se utiliza aquí (por ejemplo un anticuerpo recombinante, una proteína recombinante, un ácido nucleico recombinante, etc.) se refiere a cualquier molécula (anticuerpo, proteína, ácido nucleico, etc.) que se prepara, se expresa, se crea o se aísla por medios recombinantes y que no es de origen natural.

Tal como se utiliza aquí, los términos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico” y “polinucleótido” son intercambiables y se proponen para incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser mono o bicatenaria, pero preferentemente es un ADN bicatenario.

Tal como se utiliza aquí, los términos “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se utilizan indistintamente y todas estas denominaciones incluyen su progenie. Así, las palabras “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica tal como se clasifica para la célula originalmente transformada está incluida. Cuando se proponen denominaciones distintas, será claro a partir del contexto.

Tal como se utiliza aquí, los términos “fragmento enlazante a antígeno”, “fragmento” y “fragmento de anticuerpo” se utilizan de forma intercambiable para referirse a cualquier fragmento de un anticuerpo de la invención que retiene la actividad de enlace a antígeno del anticuerpo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo de una cadena, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Además, el término “anticuerpo” tal como se utiliza aquí incluye tanto anticuerpos como fragmentos de enlace a antígeno de los mismos.

Tal como se utiliza aquí, un “anticuerpo neutralizante” es aquel que puede neutralizar, es decir, prevenir, inhibir, reducir, impedir o interferir con la capacidad de un patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un huésped. Los términos “anticuerpo neutralizante” y “anticuerpo que neutraliza” o “anticuerpos que neutralizan” se utilizan aquí indistintamente. Estos anticuerpos se pueden utilizar solos o en combinación, como agentes profilácticos o terapéuticos en una formulación apropiada, en asociación con una vacunación activa, como herramienta de diagnóstico o como herramienta de producción tal como se describe aquí.

Las dosis a menudo se expresan en relación al peso corporal. Así, una dosis expresada como [g, mg u otra unidad]/kg (o g, mg, etc.) normalmente se refiere a [g, mg u otra unidad] “por kg (o g, mg, etc.) de peso corporal”, aunque el término “peso corporal” no se mencione explícitamente.

Los términos “enlace” y “se enlaza específicamente” y referencias similares no abarcan la adhesión no específica.

El término “vacuna” tal como se utiliza aquí se entiende típicamente como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno, preferentemente un inmunógeno. El antígeno o inmunógeno se puede derivar de cualquier material adecuado para la vacunación. Por ejemplo, el antígeno o inmunógeno se puede derivar de un patógeno, tal como de partículas bacterianas o virales, etc., o de un tejido tumoral o canceroso. El antígeno o inmunógeno estimula el sistema inmunitario adaptivo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptiva. En particular, un “antígeno” o un “inmunógeno” se refiere típicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmunitario, preferentemente por el sistema inmunitario adaptivo, y que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria específica de antígeno, por ejemplo por formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptiva. Típicamente, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que puede ser presentado por las MHC a las células T.

Tal como se utiliza aquí, el término “variante de secuencia” se refiere a cualquier secuencia que tiene una o más alteraciones en comparación con una secuencia de referencia, siendo una secuencia de referencia cualquiera de las secuencias citadas en la “Tabla de Secuencias y Números SEQ ID” (listado de secuencias), es decir las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 88. Así, el término “variante de secuencia” incluye variantes de secuencia de nucleótidos y variantes de secuencia de aminoácidos. Para una variante de secuencia en el contexto de una secuencia de nucleótidos, la secuencia de referencia también es una secuencia de nucleótidos, mientras que para la variante de secuencia en el contexto de una secuencia de aminoácidos, la secuencia de referencia también es una secuencia de aminoácidos. Una “variante de secuencia” tal como se utiliza aquí es al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y de manera particularmente preferente al menos un 98% o un 99% idéntica a la secuencia de referencia. La identidad de secuencia se calcula habitualmente con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia (es decir la secuencia citada en la solicitud). El porcentaje de identidad, como es referido aquí, se puede determinar, por ejemplo, utilizando BLAST, que utiliza los parámetros por omisión especificados por el NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [matriz Blosum 62; penalización de abertura gap =11 y penalización de extensión gap =1 ].

Una “variante de secuencia” en el contexto de una secuencia de ácido nucleico (nucleótidos) tiene una secuencia alterada donde uno o más de los nucleótidos de la secuencia de referencia se ha eliminado o se ha sustituido, o se han insertado uno o más nucleótidos en la secuencia de la secuencia de nucleótidos de referencia. Los nucleótidos son referidos aquí por la denominación de una letra estándar (A, C, G o T). Debido a la degeneración del código genético, una “variante de secuencia” de una secuencia de nucleótidos puede dar como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos de referencia respectiva, es decir, en una “variante de secuencia” o no. Las variantes de secuencia de nucleótidos que no dan como resultado variantes de secuencia de aminoácidos son preferentes (mutaciones silenciosas). Sin embargo, las variantes de secuencia de nucleótidos que conducen a mutaciones “no silenciosas” también están dentro del alcance, en particular aquellas variantes de secuencias de nucleótidos que dan como resultado una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% idénticas a las secuencias de aminoácidos de referencia.

Una “variante de secuencia” en el contexto de una secuencia de aminoácidos tiene una secuencia alterada donde uno o más de los aminoácidos se ha eliminado, sustituido o se ha insertado en comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia. Como resultado de las alteraciones, esta variante de secuencia tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, una variante de secuencia no tiene más de 10 alteraciones por 100 aminoácidos de la secuencia de referencia, es decir cualquier combinación de deleciones, inserciones o sustituciones es “al menos un 90% idéntica” a la secuencia de referencia.

Si bien son posibles las sustituciones de aminoácidos no conservadoras, es preferente que las sustituciones sean sustituciones de aminoácidos conservadoras en las que el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares a las del aminoácido correspondiente en la secuencia de referencia. A modo de ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservadoras implican la sustitución de un aminoácido alifático o hidrofóbico por otro, por ejemplo alanina, valina, leucina e isoleucina; la sustitución de un aminoácido que contiene hidroxilo, por ejemplo serina y treonina, por otro; la sustitución de un residuo ácido, por ejemplo ácido glutámico, ácido aspártico, por otro; el reemplazo de un residuo que contiene amida, por ejemplo asparagina y glutamina, por otro; el reemplazo de un residuo aromático, por ejemplo fenilalanina y tirosina, por otro; el reemplazo de un residuo básico, por ejemplo lisina, arginina e histidina, por otro; y el reemplazo de un aminoácido pequeño, por ejemplo alanina, serina, treonina, metionina y glicina, por otro.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminal que varían en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos individuales o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la fusión al terminal N o C de una secuencia de aminoácidos de una molécula reportera o de una enzima.

De manera importante, las alteraciones en las variantes de secuencia no anulan la funcionalidad de la secuencia de referencia respectiva, en el presente caso, por ejemplo la funcionalidad de una secuencia de un anticuerpo o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo de enlazarse al mismo epítopo y/o de neutralizar lo suficientemente una infección por HBV y HDV. Las directrices para determinar que nucleótidos y qué residuos aminoácidos respectivamente se pueden sustituir, insertar o suprimir sin anular esta funcionalidad se pueden encontrar empleando programas de ordenador bien conocidos en la técnica.

Tal como se utiliza aquí, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos “derivada de” un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína determinados se refiere al origen del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína. Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que se deriva de una secuencia particular tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a aquella secuencia, o a parte de la misma, de la cual se deriva, donde “esencialmente idéntico” incluye variantes de secuencia como se definen anteriormente. De manera preferente, la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos que se deriva de un péptido o proteína particular se deriva del dominio correspondiente del péptido o de la proteína particular. Así, “que corresponde” se refiere, en particular, a la misma funcionalidad. Por ejemplo, un “dominio extracelular” corresponde a otro “dominio extracelular” (de otra proteína) o un “dominio transmembrana” corresponde a otro “dominio transmembrana” (de otra proteína). Las partes “correspondientes” de péptidos, proteínas y ácidos nucleicos son así fácilmente identificables para el experto medio en la técnica. Igualmente, las secuencias “derivadas de” otra secuencia son normalmente fácilmente identificables para el experto medio en la técnica, ya que tiene su origen en la secuencia.

Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser idéntica al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva). Sin embargo, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína también puede tener una o más mutaciones con respecto al ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva), en particular una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos derivada de otro ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína puede ser una variante de secuencia funcional tal como se describe anteriormente del ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína de partida (del cual se deriva). Por ejemplo, en un péptido/proteína, uno o más residuos de aminoácidos se pueden sustituir con otros residuos aminoácidos o pueden estar presentes una o más inserciones o deleciones de residuos aminoácidos.

Tal como se utiliza aquí, el término “mutación” se refiere a un cambio en la secuencia de ácido nucleico y/o en la secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia de referencia, por ejemplo una secuencia genómica correspondiente. Una mutación, por ejemplo en comparación con una secuencia genómica, puede ser, por ejemplo, una mutación somática (de origen natural), una mutación espontánea, una mutación inducida, por ejemplo inducida por enzimas, sustancias químicas o radiación, o una mutación obtenida por mutagénesis dirigida a sitio (métodos de biología molecular para hacer cambios específicos e intencionales en la secuencia de ácido nucleico y/o en la secuencia de aminoácidos). De esta manera, los términos “mutación” o “mutar” se debe entender incluyendo la realización física de una mutación, por ejemplo en una secuencia de ácido nucleico o en una secuencia de aminoácidos. Una mutación incluye la sustitución, deleción e inserción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, así como la inversión de varios nucleótidos o aminoácidos sucesivos. Preferentemente, para lograr una mutación en una secuencia de aminoácidos, se puede introducir una mutación en la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos con el fin de expresar un polipéptido mutado (recombinante). Por ejemplo, se puede conseguir una mutación alterando, por ejemplo por mutagénesis dirigida a sitio, un codón de una molécula de ácido nucleico que codifica un aminoácido, lo que da como resultado un codón que codifica un aminoácido diferente, o sintetizando una variante de secuencia, por ejemplo conociendo la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido y diseñando la síntesis de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante del polipéptido sin necesidad de mutar uno o más nucleótidos de una molécula de ácido nucleico.

La presente invención se basa, entre otros, en el descubrimiento y aislamiento de anticuerpos que son sumamente potentes en neutralizar el virus de hepatitis B y de la hepatitis delta, así como de epítopos a los cuales se enlazan los anticuerpos de la invención. Estos anticuerpos son deseables, ya que solamente se requieren pequeñas cantidades de anticuerpos para neutralizar el virus de la hepatitis B. Por otra parte, no existe actualmente tratamiento disponible para la hepatitis D. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son sumamente eficaces para prevenir, así como tratar o atenuar, e1HBV y e1HDV. Por otra parte, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se enlazan a genotipos diferentes -preferentemente todos conocidos - del antígeno superficial del virus de la hepatitis B y a diferentes mutantes infecciosos -preferentemente todos conocidos - de antígenos de superficie del virus de la hepatitis B.

Anticuerpos y fragmentos de enlace a antígeno de los mismos

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que se enlaza a la región bucle antigénica de HBsAg y neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta, donde el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) según las SEQ ID NO: 34 - 38 y 40, respectivamente; o (ii) según las SEQ ID NO: 34 - 37, 39 y 40, respectivamente; o (iii) según las SEQ ID NO: 34 - 38 y 58, respectivamente; o (iv) según las SEQ ID NO: 34 - 37, 39 y 58, respectivamente; o (v) según las SEQ ID n O: 34, 66, 36 - 38 y 40, respectivamente; o (vi) según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 37, 39 y 4o, respectivamente; o (vii) según las Se Q ID No : 34, 66, 36 -38 y 58, respectivamente; o (viii) según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 37, 39 y 58, respectivamente.

Tal como se utiliza aquí, el término “anticuerpo” abarca varias formas de anticuerpos incluyendo, sin limitarse a, anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpos, en particular fragmentos de enlace a antígeno, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes y anticuerpos modificados genéticamente (anticuerpos variantes o mutantes), siempre y cuando las propiedades características de acuerdo con la invención se mantengan. Los anticuerpos humanos y los anticuerpos monoclonales son preferentes y en especial los anticuerpos monoclonales humanos, en particular como anticuerpos monoclonales humanos recombinantes.

Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M. A. y van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir, por inmunización, un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. La transferencia de la matriz de genes de la inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos por la estimulación del antígeno (véase, por ejemplo, Jakobovits, A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. y col., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. y col., Year Immunol. 7 (1993) 3340). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en librerías de presentación de fagos (Hoogenboom, H. R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D. y col., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Las técnicas de Cole y col. y Boerner y col. también son adecuadas para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); y Boerner, P. y col., J. Immunol.

147 (1991) 86-95). Preferentemente, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan utilizando la inmortalización de células EBV-B mejoradas como se describe en Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5. El término “anticuerpo humano” tal como se utiliza aquí también comprende estos anticuerpos que están modificados, por ejemplo en la región variable, para generar las propiedades de acuerdo con la invención como se describe aquí. Tal como se utiliza aquí, el término “región variable” (región variable de una cadena ligera (V^l), región variable de una cadena pesada (V^h)) denota cada uno del par de cadena ligera y pesada implicado directamente en el enlace del anticuerpo al antígeno.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo IgA, IgG, IgM, es decir una cadena pesada a, y o |j), pero preferentemente son IgG. Dentro del isotipo IgG, los anticuerpos pueden ser de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferentemente IgG1. Los anticuerpos de la invención pueden tener una cadena ligera k o A. Los anticuerpos específicos de HBsAg del tipo IgG ventajosamente también pueden bloquear la liberación de HBV y HBsAg de las células infectadas - basado en la captación dependiente de antígeno de IgG en los receptores FcRN-IgG de los hepatocitos. Por tanto, los anticuerpos específicos de HBsAg del tipo IgG se pueden enlazar intracelularmente y bloquear así la liberación de viriones h Bv y HBsAg.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, es un anticuerpo purificado, un anticuerpo de cadena única, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

Los anticuerpos de la invención pueden así ser preferentemente anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos recombinantes o anticuerpos purificados. La invención también proporciona fragmentos de los anticuerpos de la invención, en particular fragmentos que retienen la actividad de enlace a antígeno de los anticuerpos. Tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos de cadena única, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv. Aunque en algunos lugares la especificación, incluyendo las reivindicaciones, puede referirse explícitamente a fragmento(s) de enlace a antígeno, fragmento(s) de anticuerpo, variante(s) y/o derivado(s) de anticuerpos, se entiende que el término “anticuerpo” o “anticuerpo de la invención” incluye todas las categorías de anticuerpos, en particular fragmento(s) de enlace a antígeno, fragmento(s) de anticuerpo, variante(s) y derivado(s) de anticuerpos.

Los fragmentos de los anticuerpos de la presente invención se pueden obtener a partir de los anticuerpos por métodos que incluyen la digestión con enzimas, como pepsina o papaína, y/o por escisión de enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos se pueden obtener por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los “fragmentos” de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La invención también abarca fragmentos Fv monocatenarios (scFv) derivados de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la invención. También se incluyen monómeros de cadena pesada o ligera y dímeros, anticuerpos de cadena pesada de un dominio, anticuerpos de cadena ligera de un dominio, así como anticuerpos de una cadena, por ejemplo Fv monocatenario donde los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos mediante un enlazante peptídico.

Los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden proporcionar interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en diversas estructuras como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv se pueden sintetizar para crear un “triacuerpo” trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc, dando como resultado minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias de la invención pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas donde las secuencias de la invención tienen como diana los epítopos de la invención y otras regiones de la molécula enlazada a otras dianas. Moléculas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico y diacuerpos (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

Los anticuerpos según la presente invención se pueden proporcionar en forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), normalmente menos del 60% y más típicamente menos del 50% de la composición está constituida por otros polipéptidos.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunogénicos en huéspedes humanos y/o no humanos (o heterólogos), por ejemplo en ratones. Por ejemplo, los anticuerpos pueden tener un idiotipo que es inmunogénico en huéspedes no humanos, pero no en el huésped humano. Los anticuerpos de la invención para uso humano incluyen aquellos que no se pueden aislar fácilmente de huéspedes tales como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc., y generalmente no se puede obtener por humanización o a partir de xeno-ratones.

El anticuerpo, y el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención se enlazan a la región bucle antigénica de HBsAg. La envoltura del virus de la hepatitis B contiene tres “proteínas de envoltura HBV” (también conocido como “HBsAg”, “antígeno superficial de hepatitis B”): proteína S (por “pequeña”, también referida como S-HBsAg), proteína M (por “media”, también referida como M-HBsAg) y proteína L (por “grande”, también referida como L-HBsAg). S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg comparten el mismo extremo C-terminal (también referido como “dominio S”, 226 aminoácidos), que corresponde a la proteína S (S-HBsAg) y que es crucial para el montaje del virus y la infectividad. S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg se sintetizan en el retículo endoplásmico (ER), se ensamblan y se secretan como partículas a través del aparato de Golgi. El dominio S comprende cuatro dominios transmembrana predichos (TM), mediante los cuales tanto, el N-terminal como el C-terminal del dominio S quedan expuestos al lumen. Los dominios transmembrana TM1 y TM2 son ambos necesarios para la integración de la proteína co-traduccional en la membrana del ER y los dominios transmembrana t M3 y TM4 se sitúan en el tercer C-terminal del dominio S. La “región bucle antigénica” de HBsAg se sitúa entre los dominios transmembrana TM3 y TM4 predichos del dominio S de HBsAg, comprendiendo la región bucle antigénica los aminoácidos 101 - 172 del dominio S, que contiene 226 aminoácidos en total (Salisse J. y Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328). Es importante señalar que un determinante de la infectividad reside en la región bucle antigénica de las proteínas de envoltura HBV. En particular, los residuos entre 119 y 125 del HBsAg contenían un motivo CXXC, que se había demostrado como la secuencia más importante requerida para la infectividad de HBV y HDV (Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005;79:10460-6).

Cuando se refieren aquí posiciones en la secuencia de aminoácidos del dominio S de HBsAg, se refiere a una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: 3 (mostrada a continuación) o a variantes de secuencia naturales o artificiales de la misma.

MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSC PPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCL1FLLVLLDYOGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAOGTS MYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVOWFVGLSPTVWLSV1 WMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI

(SEQ ID NO: 3; los aminoácidos 101 - 172 se muestran subrayados)

Por ejemplo, la expresión “aminoácidos 101 - 172 del dominio S” se refiere a los residuos aminoácidos de las posiciones 101 - 172 del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. Sin embargo, el experto en la técnica entiende que pueden estar presentes mutaciones o variaciones (incluyendo, pero sin limitarse a, sustitución, deleción y/o adición, por ejemplo HBsAg de un genotipo diferente o un mutante HBsAg diferente como se describe aquí) de forma natural en la secuencia de aminoácidos del dominio S de HBsAg o pueden introducirse artificialmente en la secuencia de aminoácidos del dominio S de HBsAg sin afectar a sus propiedades biológicas. Por tanto, en la invención, el término “dominio S de HBsAg” comprende todos estos polipéptidos, por ejemplo incluyendo el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y sus mutantes naturales o artificiales. Además, cuando se describen aquí fragmentos de secuencia del dominio S de HBsAg (por ejemplo aminoácidos 101 - 172 o aminoácidos 120 -130 del dominio S de HBsAg), se incluyen no solo los fragmentos de secuencia correspondientes de SEQ ID NO: 3, sino también fragmentos de secuencia correspondientes de sus mutantes naturales o artificiales. Por ejemplo, la expresión “residuos aminoácidos de las posiciones 101 -172 del dominio S de HBsAg” comprende los residuos aminoácidos de las posiciones 101 - 172 de la SEQ ID NO: 3 y los fragmentos correspondientes de sus mutantes (mutantes naturales o artificiales). De acuerdo con la invención, la expresión “fragmentos de secuencia correspondientes” o “fragmentos correspondientes” se refiere a fragmentos que se sitúan en posiciones de secuencia iguales cuando las secuencias se someten a alineación optimizada, en particular, cuando se alinean las secuencias para obtener un porcentaje más alto de identidad.

La proteína M (M-HBsAg) corresponde a la proteína S extendida mediante un dominio N-terminal de 55 aminoácidos denominado “pre-S2”. La proteína L (L-HBsAg) corresponde a la proteína M extendida mediante un dominio N-terminal de 108 aminoácidos denominado “pre-S1” (genotipo D). Los dominios pre-S1 y pre-S2 de la proteína L pueden estar presentes ya sea en la superficie interior de las partículas virales (en el lado citoplásmico del Er ), desempeñando una función importante en el montaje del virus, o en la superficie exterior (en el lado luminal del ER), disponibles para la interacción con células diana y necesarias para la infectividad viral. Además, las proteínas superficiales de HBV (HBsAgs) no solo están incorporadas en las envolturas de los viriones, sino también brotan espontáneamente de las membranas del compartimiento intermedio ER-Golgi formando “partículas subvirales” vacías (SVPs) que son liberadas de la célula por secreción.

Dado que estas tres proteínas de envoltura de HBV S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg comprenden el dominio S, las tres proteínas de envoltura de HBV S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg también comprenden la “región bucle antigénica”. Por consiguiente, un anticuerpo o un fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, que neutraliza el HBV y se enlaza a la región bucle antigénica de HBsAg, se enlaza a las tres proteínas de envoltura de HBV S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg.

Además, un anticuerpo o un fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención neutraliza la infección por el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis delta. En otras palabras, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención reduce la infectividad viral del virus de la hepatitis B y del virus de la hepatitis delta.

Para estudiar y cuantificar la infectividad del virus (o la “neutralización”) en el laboratorio, el experto en la técnica conoce varios “ensayos de neutralización” estándar. Para un ensayo de neutralización, los virus animales se propagan típicamente en células y/o en líneas celulares. En el contexto de la presente invención es preferente un ensayo de neutralización, donde las células cultivadas se incuban con una cantidad fija de HBV o HDV en presencia (o ausencia) del anticuerpo que se somete a ensayo. Como lectura de los niveles de antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg) o de la hepatitis B se puede utilizar el antígeno (HBeAg) secretado en el sobrenadante del cultivo celular y/o se puede evaluar la tinción de HBcAg. Para e1HDV, por ejemplo, se puede evaluar la tinción de inmunofluorescencia de antígeno delta.

En una realización preferente de un ensayo de neutralización de HBV, células cultivadas, por ejemplo células HepaRG, en particular células HepaRG diferenciadas, se incuban con una cantidad fija de HBV en presencia o ausencia del anticuerpo a ensayar, por ejemplo durante 16 horas, a 37 °C. Esta incubación preferentemente se lleva a cabo en un medio (por ejemplo complementado con un 4% de PEG 8000). Después de la incubación, las células se pueden lavar y cultivar adicionalmente. Para medir la infectividad del virus, se pueden determinar los niveles de antígeno superficial de hepatitis B (HBsAg) y de antígeno de hepatitis B (HBeAg) secretados en el sobrenadante del cultivo, por ejemplo del día 7 al día 11 post-infección, mediante el ensayo de inmunoabsorción de unión a enzimas (ELISA). Adicionalmente, la tinción de HBcAg se puede evaluar en un ensayo de inmunofluorescencia. En una realización preferente de un ensayo de neutralización de HDV, se puede emplear esencialmente el mismo ensayo de HBV, con la diferencia de que los sueros de vehículo de HDV se pueden utilizar como inóculos de infección de HDV en células HepaRg diferenciadas (en lugar de HBV). Para la detección, la tinción de inmunofluorescencia de antígeno delta se puede utilizar como lectura.

El anticuerpo y el fragmento de enlace a antígeno de la invención tienen una alta potencia neutralizante. La concentración del anticuerpo de la invención requerida para un 50% de neutralización del virus de la hepatitis B (HBV) y del virus de la hepatitis delta (HDV), es, por ejemplo, aproximadamente de 10 pg/ml o inferior. Preferentemente, la concentración del anticuerpo de la invención requerida para un 50% de neutralización de HBV y HDV es de aproximadamente 5 pg/ml, de manera más preferente la concentración del anticuerpo de la invención requerida para un 50% de neutralización de HBV y HDV es de aproximadamente 1 pg/ml, de manera aún más preferente la concentración del anticuerpo de la invención requerida para un 50% de neutralización de HBV y HDV es de aproximadamente 750 ng/ml. Con mayor preferencia, la concentración del anticuerpo de la invención requerida para un 50% de neutralización de h Bv y HDV es 500 ng/ml o inferior, por ejemplo 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 o aproximadamente 50 ng/ml o inferior. Esto significa que solo son necesarias concentraciones bajas del anticuerpo para un 50% de neutralización de HBV y HDV. La especificidad y la potencia se pueden medir utilizando ensayos estándares conocidos por el experto en la técnica.

El anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, que neutraliza potencialmente tanto HBV como HDV, es útil en la prevención y el tratamiento de la hepatitis B y de la hepatitis D. En este contexto, es de señalar que la infección con HDV se presenta típicamente de manera simultánea o subsecuente a la infección con h Bv (la inoculación con HDV en ausencia de HBV no provoca hepatitis D, puesto que HDV requiere el soporte de HBV para su propia replicación) y se observa hepatitis D típicamente en portadores de h Bv crónicos.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, promueve la eliminación de HBsAg y HBV. En particular, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, promueve la eliminación tanto de HBV como de partículas subvirales del virus de la hepatitis B (SVP). La eliminación de HBsAg o de partículas subvirales se puede evaluar midiendo el nivel de HBsAg, por ejemplo en una muestra de sangre, por ejemplo de un paciente con hepatitis B. De forma similar, la eliminación de h Bv se puede evaluar midiendo el nivel de HBV, por ejemplo en una muestra de sangre, por ejemplo de un paciente con hepatitis B.

En los sueros de pacientes infectados con HBV, además de partículas infecciosas (HBV), típicamente existe un exceso (típicamente 1.000- a 100.000-veces) de partículas subvirales vacías (SVP) compuestas solamente por proteínas de envoltura de HBV (HBsAg) en forma de esferas relativamente más pequeñas y filamentos de longitud variable. Se ha demostrado que las partículas subvirales mejoran en gran medida la replicación viral intracelular y la expresión génica de HBV (Bruns M. y col. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). Esto es también importante en el contexto de la infectividad de los sueros que contienen HBV, puesto que la infectividad depende no solo en el número de virus, sino también del número de SVP (Bruns M. y col. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). Además, un exceso de partículas subvirales puede servir como señuelo mediante la absorción de anticuerpos neutralizantes y, por tanto, para retrasar la eliminación de la infección. Típicamente, se considera así que la pérdida del antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg) es un punto final ideal del tratamiento y el resultado más cercano para curar la hepatitis B crónica (CHB).

Por consiguiente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que promueve preferentemente la eliminación de HBsAg, en particular la eliminación de partículas subvirales del virus de la hepatitis B, y el HBV, permite un mejor tratamiento de la hepatitis B, en particular en el contexto de la hepatitis B crónica. Así, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, puede ejercer sus propiedades de neutralización aún más potentes, dado que menos anticuerpo es absorbido por las SVP que actúan como señuelo. Además, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que promueve preferentemente la eliminación de partículas subvirales del virus de la hepatitis B disminuye la infectividad de los sueros que contienen HBV.

De manera preferente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, comprende una porción Fc. En especial, la porción Fc se deriva de un origen humano, por ejemplo de IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humana, siendo la IgG1 humana particularmente preferente.

Tal como se utiliza aquí, el término “porción Fc” se refiere a una secuencia derivada de la porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que comienza en la región bisagra justo aguas arriba del sitio de escisión de papaína (por ejemplo el residuo 216 en la IgG nativa, tomando el primer residuo de la región constante de cadena pesada como 114) y que termina en el C-terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Por consiguiente, una porción Fc puede ser una porción Fc completa o una parte (por ejemplo un dominio) de la misma. Una porción Fc completa comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 (por ejemplo las posiciones de aminoácidos EU 216-446). A veces está presente un residuo de lisina adicional (K) en el extremo C-terminal de la porción Fc, pero con frecuencia se escinde a partir de un anticuerpo maduro. Cada una de las posiciones de aminoácidos dentro de una porción Fc se cita de acuerdo con el sistema de numeración E.U. de Kabat, reconocido en la técnica, véase, por ejemplo, por Kabat y col., en “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 y 1987.

Preferentemente, en el contexto de la presente invención, una porción Fc comprende al menos uno de: un dominio bisagra (por ejemplo la región bisagra superior, media y/o baja), un dominio CH2, un dominio CH3, o una variante, porción o fragmento de los mismos. En realizaciones preferentes, una porción Fc comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3. De manera más preferente, la porción Fc es una porción Fc completa. La porción Fc también puede comprender una o más inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos con respecto a una porción Fc de origen natural. Por ejemplo, al menos uno de un dominio bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3 (o de parte de los mismos) se puede suprimir. Por ejemplo, una porción Fc puede comprender o consistir en: (i) un dominio bisagra (o parte del mismo) fusionado a un dominio CH2 (o a parte del mismo), (ii) un dominio bisagra (o parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o a parte del mismo), (iii) un dominio CH2 (o parte del mismo) fusionado a un dominio CH3 (o a parte del mismo), (iv) un dominio bisagra (o parte del mismo), (v) un dominio CH2 (o parte del mismo), o (vi) un dominio CH3 o parte del mismo.

En experto medio en la técnica entenderá que la porción Fc se puede modificar de forma que varíe en la secuencia de aminoácidos de la porción Fc completa de una molécula de inmunoglobulina de origen natural, a la vez que mantiene al menos una función deseable conferida por la porción Fc de origen natural. Estas funciones incluyen el enlace al receptor Fc (FcR), la modulación de la vida media de anticuerpo o función ADCC, el enlace a la proteína A, el enlace a la proteína G y el enlace de complemento. Las partes de las porciones Fc de origen natural que son responsables y/o esenciales para estas funciones son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, para activar la cascada del complemento, C1q se enlaza al menos a dos moléculas de IgG1 o a una molécula de IgM, unidas a la diana antigénica (Ward, E. S., y Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). Burton, D. R., describió (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206) que la región de cadena pesada que comprende los residuos aminoácidos 318 a 337 está implicada en la fijación de complemento. Duncan, A. R. y Winter, G. (Nature 332 (1988) 738-740), utilizando la mutagénesis dirigida a sitio, reportaron que Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sito de enlace a C1q. El papel de los residuos Glu318, Lys320 y Lys 322 en el enlace de C1q se confirmó por la capacidad de un péptido sintético corto que contiene estos residuos de inhibir la lisis mediada por complemento.

Por ejemplo, el enlace a FcR puede estar mediado por la interacción de la porción Fc (de un anticuerpo) con los receptores Fc (FcR), que son receptores de la superficie celular especializados de las células hematopoyéticas. Los receptores Fc pertenecen a la superfamilia de la inmunoglobulina y se ha demostrado que median tanto la eliminación de patógenos recubiertos con anticuerpos por fagocitosis de complejos inmunitarios, como la lisis de eritrocitos y varias otras dianas celulares (por ejemplo células tumorales) recubiertas con el anticuerpo correspondiente, vía citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC; Van de Winkel, J. G., y Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Las FcR se definen por su especificidad para las clases de inmunoglobulina; los receptores Fc para los anticuerpos IgG son referidos como FcyR, para IgE como FceR, para IgA como FcaR y así sucesivamente y los receptores Fc neonatales son referidos como FcRn. El enlace al receptor Fc se describe, por ejemplo, en Ravetch, J. V. y Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J. y col., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M. y col., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; y Gessner, J. E. y col., Ann. Hematol. 76 (1998) 231 248.

La reticulación de los receptores mediante el dominio Fc de los anticuerpos IgG nativos (FcyR) desencadena una amplia variedad de funciones efectoras, incluyendo fagocitosis, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y liberación de mediadores inflamatorios, así como la eliminación y regulación del complejo inmune de la producción de anticuerpos. Por tanto, las porciones Fc proporcionan la reticulación de los receptores (FcyR) que son preferentes. En los humanos, se han caracterizado tres clases de FcyR, que son: (i) FcyRI (CD64), que enlaza la IgG monomérica con alta afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos; (ii) FcyRII (CD32), que enlaza la IgG complejada con medio para reducir la afinidad, se expresa ampliamente, en particular en leucocitos, se sabe juega un papel central en la inmunidad mediada por anticuerpo y que se puede dividir en FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIC, que llevan a cabo diferentes funciones en el sistema inmunitario, pero se enlaza con afinidad baja similar a la IgG-Fc, y los ectodominios de estos receptores son sumamente homólogos; y (iii) FcyRIII (CD16), que enlaza IgG con afinidad media a baja y existe como dos tipos: FcyRIIIA, encontrada en células NK, macrófagos, eosinófilos y algunos monocitos y células T y median ADCC, y FcyRIIIB, que se expresa en gran medida en neutrófilos. FcyRIIA se encuentra en muchas células implicadas en la muerte (por ejemplo macrófagos, monocitos, neutrófilos) y parece capaz de activar el proceso de muerte. FcyRIIB parece que desempeña una función en procesos inhibidores y se encuentra en las células B, macrófagos y en los mastocitos y eosinófilos. De manera importante, un 75% de todos los FcyRIIB se encuentran en el hígado (Ganesan, L. P. y col., 2012: FcYRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988). El FcyRIIB se expresa abundantemente en el Endotelio Sinusoidal del Hígado, llamado LSEC, y en las células de Kupffer hepáticas y el LSEC, los puntos principales de eliminación de complejos inmunitarios pequeños (Ganesan, L. P. y col., 2012: FcYRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988).

Por consiguiente, en la presente invención, son preferentes estos anticuerpos y fragmentos de enlace a antígeno de los mismos que son capaces de enlazarse a FcYRIIb, por ejemplo anticuerpos que comprenden una porción Fc para el enlace a FcYRIIb, en particular una región Fc, tal como, por ejemplo, anticuerpos tipo IgG. Además, es posible modificar la porción Fc para mejorar el enlace a FcyRIIB introduciendo las mutaciones S267E y L328F como se describen en Chu, S. Y. y col., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933. Por tanto, se puede mejorar la eliminación de los complejos inmunitarios (Chu, S., y col., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcYRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, son preferentes los anticuerpos, o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos, que comprenden una porción Fc modificada con las mutaciones S267E y L328F, en particular como se describe en Chu, S. Y. y col., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933.

En las células B, parece que operan suprimiendo la producción de inmunoglobulina adicional y el cambio de isotipo, digamos por ejemplo la clase IgE. En los macrófagos, FcyRIIB actúa inhibiendo la fagocitosis tal como es mediada a través de FcyRIIA. En los eosinófilos y los mastocitos, la forma B puede ayudar a suprimir la activación de estas células a través del enlace IgE a su receptor separado.

Con respecto al enlace de FcyRI, la modificación en la IgG nativa de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327 y P329 reduce el enlace a FcyRI. Los residuos IgG2 en las posiciones 233-236, sustituidas en IgG1 y IgG4, reducen en enlace a FcyRI en 103 veces y eliminan la respuesta de monocitos humanos a los glóbulos rojos sintetizados con anticuerpos (Armour, K. L. y col., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624). Con respecto al enlace de FcyRII, se encuentra un enlace reducido para FcyRIIA por ejemplo para la mutación IgG de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 y K414. Con respecto al enlace de FcyRIII, el enlace reducido a FcyRIIIA se encuentra por ejemplo para la mutación de al menos uno de E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 y D376. El mapeo de los sitios de enlace en la IgG1 humana para los receptores Fc, los sitios de mutación mencionados anteriormente y métodos para medir el enlace a FcyRI y FcyRIIA se describen en Shields, R. L. y col., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604.

Con respecto al crucial enlace a FcyRII, dos regiones de IgG Fc nativas parecen ser críticas para las interacciones de FcyRII e IgG, en particular (i) el sito bisagra más bajo de IgG Fc, en particular los residuos aminoácidos L, L, G, G (numeración E.U.A. 234 - 237) y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de IgG Fc, en particular un bucle y hebras en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra inferior, por ejemplo en una región de P331 (Wines, B.D. y col., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318). Además, el FcyRI parece que se enlaza al mismo sitio en IgG Fc, mientras que FcRn y la Proteína A se enlazan a un sitio diferente en IgG Fc, que parece estar en la interface CH2-CH3 (Wines, B.D. y col., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318).

Por ejemplo, la porción Fc puede comprender o consistir en al menos la parte de una porción Fc que es conocida en la técnica por ser requerida para el enlace a FcRn o para una vida media prolongada. Alternativa o adicionalmente, la porción Fc del anticuerpo de la invención comprende al menos la porción conocida en la técnica requerida para el enlace a la proteína A y/o la porción Fc del anticuerpo de la invención comprende al menos la parte de una molécula Fc conocida en la técnica por ser requerida para el enlace a la proteína G. Preferentemente, la función que se mantiene es la eliminación de HBsAg y HBV, que se asume que es mediada por el enlace a FcyR. Por consiguiente, una porción Fc preferente comprende al menos la porción conocida en la técnica requerida para el enlace a FcyR. Como se describe anteriormente, una porción Fc preferente puede así comprender al menos (i) el sito bisagra más bajo de IgG Fc nativo, en particular los residuos aminoácidos L, L, G, G (234 -237, numeración E.U.) y (ii) la región adyacente del dominio CH2 de IgG Fc nativo, en particular un bucle y hebras en el dominio CH2 superior adyacente a la región bisagra más baja, por ejemplo en una región de P331, por ejemplo una región de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos consecutivos en el dominio CH2 superior del IgG Fc nativo alrededor de P331, por ejemplo entre los aminoácidos 320 y 340 (numeración E.U) del IgG Fc nativo.

Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una región Fc. Tal como se utiliza aquí, el término “región Fc” se refiere a la parte de una inmunoglobulina formada por dos o más porciones Fc de las cadenas pesadas del anticuerpo. Por ejemplo, la región Fc puede ser monomérica o una región Fc “monocadena” (es decir, una región scFc). Las regiones Fc monocadena están compuestas por porciones Fc ligadas dentro de una única cadena polipeptídica (por ejemplo codificada en una única secuencia de ácido nucleico contigua). Regiones scFc ilustrativas se describen en la WO 2008/143954 A2. De manera preferente, la región Fc es una región Fc dimérica. Una “región Fc dimérica” o “dcFc” se refiere al dímero formado por las porciones Fc de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina individuales. La región Fc dimérica puede ser un homodímero de dos porciones Fc idénticas (por ejemplo una región Fc de una inmunoglobulina de origen natural) o un heterodímero de dos porciones Fc no idénticas.

Las porciones Fc de la región Fc pueden ser de la misma o de diferente clase y/o subclase. Por ejemplo, las porciones Fc se pueden derivar de una inmunoglobulina (por ejemplo una inmunoglobulina humana) de una subclase IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Preferentemente, las porciones Fc de la región Fc son de la misma clase y subclase. Sin embargo, la región Fc (o una o más porciones Fc de una región Fc) también pueden ser quiméricas, donde una región Fc quimérica puede comprender porciones Fc derivadas de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulina. Por ejemplo, al menos dos de las porciones Fc de una región Fc dimérica o de cadena única pueden ser de diferentes clases y/o subclases de inmunoglobulina. Adicional o alternativamente, las regiones Fc quiméricas pueden comprender una o más porciones Fc quiméricas. Por ejemplo, la región Fc quimérica o la porción puede comprender una o más porciones derivadas de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2, o IgG3), mientras que el resto de la región Fc o de la porción es de una subclase diferente. Por ejemplo, una región Fc o una porción de un polipéptido Fc puede comprender un dominio CH2 y/o CH3 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG4) y una región bisagra de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo la subclase IgG3). Por ejemplo, la región Fc o la porción puede comprender un dominio bisagra y/o CH2 derivado de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo la subclase IgG4) y un dominio CH3 de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2, o IgG3). Por ejemplo, la región Fc quimérica puede comprender una porción Fc (por ejemplo una porción Fc completa) de una inmunoglobulina de una primera subclase (por ejemplo la subclase IgG4) y una porción Fc de una inmunoglobulina de una segunda subclase (por ejemplo una subclase IgG1, IgG2 o IgG3). Por ejemplo, la región Fc o la porción puede comprender un dominio CH2 de una inmunoglobulina IgG4 y un dominio CH3 de una inmunoglobulina IgG1. Por ejemplo, la región Fc o la porción puede comprender un dominio CH1 y un dominio CH2 de una molécula IgG4 y un dominio CH3 de una molécula IgG1. Por ejemplo, la región Fc o la porción puede comprender una porción de un dominio CH2 de una subclase particular de anticuerpo, por ejemplo las posiciones EU 292-340 de un dominio CH2. Por ejemplo, una región Fc o una porción puede comprender los aminoácidos en las posiciones 292-340 de CH2 derivadas de una porción IgG4 y el resto de CH2 derivado de una porción IgG1 (alternativamente 292-340 de CH2 se puede derivar de una porción IgG1 y el resto de CH2 derivado de una porción IgG4).

Además, una región Fc o una porción puede (adicional o alternativamente) por ejemplo comprender una región bisagra quimérica. Por ejemplo, la bisagra quimérica se puede derivar de, por ejemplo, en parte de una molécula IgG1, IgG2, o IgG4 (por ejemplo una secuencia bisagra intermedia superior e inferior) y, en parte, de una molécula IgG3 (por ejemplo una secuencia bisagra intermedia). En otro ejemplo, una región Fc o una porción puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula IgG1 y, en parte, de una molécula IgG4. En otro ejemplo, la bisagra quimérica puede comprender los dominios bisagra superiores e inferiores de una molécula IgG4 y un dominio bisagra medio de una molécula IgG1. Esta bisagra quimérica se puede obtener, por ejemplo, introduciendo una sustitución de prolina (Ser228Pro) en la posición E.U. 228 en el dominio bisagra intermedio de una región bisagra IgG4. En otra realización, la bisagra quimérica puede comprender aminoácidos en las posiciones E.U. 233-236 que son de un anticuerpo IgG2 y/o la mutación Ser228Pro, donde los aminoácidos restantes de la bisagra son de un anticuerpo IgG4 (por ejemplo una bisagra quimérica de secuencia ESKYGPPCPPCPAPPVAGP). Bisagras quiméricas adicionales que se pueden utilizar en la porción Fc del anticuerpo de acuerdo con la presente invención se describen en la Us 2005/0163783 A1.

En la presente invención es preferente que la porción F, o la región Fc comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de inmunoglobulina humana (por ejemplo de una región Fc o de una porción Fc de una molécula IgG). Sin embargo, los polipéptidos pueden comprender uno o más aminoácidos de otra especie de mamífero. Por ejemplo, una porción Fc de primate o un sitio de primate se puede incluir en los polipéptidos. Alternativamente, uno o más aminoácidos murinos pueden estar presentes en la porción Fc o en la región Fc.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende, en particular, además de una porción Fc como se describe anteriormente, otras partes derivadas de una región constante, en particular de una región constante de IgG, de manera preferente de una región constante de IgG1, de manera más preferente de una región constante de IgG1 humana. De manera especialmente preferente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende, en particular, además de una porción Fc como se describe anteriormente, todas las otras partes de las regiones constantes, en particular todas las otras partes de las regiones constantes de IgG, preferentemente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1, de manera más preferente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1 humana.

Como se ha indicado anteriormente, un anticuerpo particularmente preferente de acuerdo con la presente invención comprende una región Fc (completa) derivada de IgG1 humana. Con especial preferencia, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención comprende en particular, además de una región Fc (completa) derivada de IgG1, también todas las otras partes de las regiones constantes de IgG, preferentemente todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1, con especial preferencia todas las otras partes de las regiones constantes de IgG1 humana.

También es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlace a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los genotipos HBsAg A, B, C, D, E, F, G, H, I, y J. Ejemplos para los diferentes genotipos de HBsAg incluyen los siguientes: número de acceso de GenBank J02203 (HBV-D, ayw3), número de acceso de GenBank FJ899792.1 (HBV-D, adw2), número de acceso de GenBank AM282986 (HBV-A), número de acceso de GenBank D23678 (HBV-B1 Japón), número de acceso de GenBank AB117758 (HBV-C1 Cambodia), número de acceso de GenBank AB205192 (HBV-E Ghana), número de acceso de GenBank X69798 (HBV-F4 Brasil), número de acceso de GenBank AF160501 (HBV-G EUA), número de acceso de GenBank AY090454 (HBV-H Nicaragua), número de acceso de GenBank AF241409 (HBV-I Vietnam) y número de acceso de GenBank AB486012 (HBV-J Borneo). Las secuencias de aminoácidos de la región de bucle antigénica del dominio S de HBsAg de los diferentes genotipos se muestra en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 5 - 15).

Más preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a al menos 6, con especial preferencia a al menos 8 y con particular preferencia a todos los 10 genotipos HBsAg A, B, C, D, E, F, G, H, I, y J. El HBV es diferenciado en numerosos genotipos, de acuerdo con la secuencia del genoma. Hasta la fecha se han definido ocho genotipos bien conocidos (A-H) del genoma HBV. Además, también se han identificado dos nuevos genotipos, I y J (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434). El genotipo es conocido por afectar a la progresión de la enfermedad y por diferencias entre los genotipos en respuesta al tratamiento antiviral que se ha determinado. Por ejemplo, el genotipo A tiene una tendencia a la cronicidad, mientras que en el genotipo C con frecuencia se encuentran mutaciones virales. Tanto la cronicidad como la frecuencia de mutación son comunes en el genotipo D. Por otra parte, los genotipos de HBV se distribuyen de forma diferente en todo el mundo (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434). Proporcionando un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que se enlaza preferentemente a al menos 6, preferentemente a al menos 8, de manera más preferente a los 10 genotipos de HBsAg A, B, C, D, E, F, G, H, I, y J, se proporciona un anticuerpo que se enlaza ampliamente a los diferentes genotipos.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los mutantes HBsAg que tienen las mutaciones en la región bucle antigénica: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A. Estos mutantes son mutantes de origen natural basados en el dominio S del genotipo D de HBsAg, número de acceso de Genbank FJ899792 (SEQ ID NO: 4), donde el residuo(s) aminoácido(s) mutado se indica en el nombre.

SEQ ID NO: 4:

MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTS CPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAOGT SMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVOWFVGLSPTVWLSVI WMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI

(la región de bucle antigénica, es decir los aminoácidos 101 - 172, se muestra subrayada).

Las secuencias de aminoácidos de la región de bucle antigénica del dominio S de HBsAg de los diferentes mutantes se muestran en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 16 - 33).

De manera más preferente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza al menos a 12, de manera aún más preferente a al menos 15 y con particular preferencia a todos los 18 mutantes HBsAg infecciosos con mutaciones en la región bucle antigénica: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a un epítopo que comprende al menos uno, de manera preferente al menos dos, con mayor preferencia al menos tres aminoácidos, con especial preferencia al menos cuatro aminoácidos de la región bucle antigénica de HBsAg, donde los al menos dos, preferentemente los al menos tres, de manera más preferente los al menos cuatro aminoácidos se seleccionan de los aminoácidos 115 - 133 del dominio S de HBsAg, preferentemente de los aminoácidos 120 - 133 del dominio S de HBsAg, con mayor preferencia de los aminoácidos 120 - 130 del dominio S de HBsAg. Cabe destacar que la posición de los aminoácidos (por ejemplo 115 - 133, 120 - 133, 120 - 130) se refiere al dominio S de HBsAg como se describe anteriormente, que está presente en las tres proteínas de envoltura de HBV S-HBsAg, M-HBsAg y L-HBsAg, donde S-HBsAg corresponde típicamente al dominio S de HBsAg.

En particular, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a un epítopo en la región bucle antigénica de HBsAg, donde el epítopo está típicamente formado por uno o más aminoácidos situados en posiciones seleccionados de las posiciones de aminoácidos 115 -133, preferentemente seleccionados de las posiciones de aminoácidos 120 -133, con mayor preferencia seleccionados de las posiciones de aminoácidos 120 -130 del dominio S de HBsAg.

El término “formado por” tal como se utiliza aquí en el contexto de un epítopo significa que el epítopo al cual se enlaza el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, puede ser lineal (continuo) o conformacional (discontinuo). Un epítopo lineal o secuencial es un epítopo que es reconocido por los anticuerpos por su secuencia lineal de aminoácidos, o estructura primaria. Por el contrario, un epítopo conformacional tiene una forma tridimensional específica y estructura proteica. Por consiguiente, si el epítopo es un epítopo lineal y comprende más de un aminoácido situado en posiciones seleccionadas de las posiciones de aminoácidos 115 -133, preferentemente seleccionadas de las posiciones de aminoácidos 120 -133 del dominio S de HBsAg, los aminoácidos comprendidos por el epítopo se sitúan típicamente en posiciones adyacentes de la estructura primaria (es decir, aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos). En el caso de un epítopo conformacional (estructura 3D), por el contrario, la secuencia de aminoácidos típicamente forma una estructura 3D como epítopo y, así, los aminoácidos que forman el epítopo (o los aminoácidos “comprendidos por” el epítopo) pueden o no estar situados en posiciones adyacentes de la estructura primaria (es decir pueden ser o no aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos).

Preferentemente, el epítopo al cual se enlaza el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, está formado únicamente por aminoácido(s) seleccionado(s) de las posiciones de aminoácidos 115 133, de manera preferente de las posiciones de aminoácidos 120-133, con mayor preferencia de las posiciones de aminoácidos 120-130 del dominio S de HBsAg. En otras palabras, es preferente que ninguno de los aminoácidos (adicionales) - que se sitúan fuera de las posiciones 115 -133, preferentemente las posiciones 120 - 133, con mayor preferencia las posiciones 120 -13o - sean necesarios para formar el epítopo al cual se enlaza el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo.

Preferentemente, el epítopo en la región bucle antigénica de HBsAg al cual se enlaza el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, está formado por dos o más aminoácidos situados en posiciones seleccionados de las posiciones de aminoácidos 115 -133, de manera preferente de las posiciones de aminoácidos 120 - 133, con mayor preferencia de las posiciones de aminoácidos 120 -130 del domino S de HBsAg. De manera más preferente, el epítopo en la región bucle antigénica de HBsAg al cual se enlaza el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, está formado por tres o más aminoácidos situados en posiciones seleccionadas de las posiciones de aminoácidos 115 - 133, de manera preferente de las posiciones de aminoácidos 120 - 133, con mayor preferencia de las posiciones de aminoácidos 120 - 130 del dominio S de HBsAg. De manera aún más preferente, el epítopo en la región bucle antigénica de HBsAg al cual se enlaza el anticuerpo de la invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, está formado por cuatro o más aminoácidos situados en posiciones seleccionadas de las posiciones de aminoácidos 115 - 133, de manera preferente de las posiciones de aminoácidos 120 - 133, con mayor preferencia de las posiciones de aminoácidos 120 - 130 del dominio S de HBsAg. En otras palabras, es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlace a al menos uno, preferentemente a al menos dos, con mayor preferencia a al menos tres, con aún mayor preferencia a al menos cuatro aminoácidos de la región bucle antigénica de HBsAg seleccionada desde el aminoácido 115 al aminoácido 133 del dominio S de HBsAg, con mayor preferencia del aminoácido 120 al aminoácido 133 del dominio S de HBsAg, aún con mayor preferencia de los aminoácidos 120 -130 del dominio S de HBsAg.

Con mayor preferencia, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a un epítopo que comprende al menos dos, preferentemente al menos tres, de manera más preferente al menos cuatro aminoácidos de la región bucle antigénica de HBsAg, donde los al menos dos, preferentemente los al menos tres, de manera más preferente los al menos cuatro aminoácidos se seleccionan del aminoácido 120 - aminoácido 133, preferentemente de los aminoácidos 120 - 130 del dominio S de HBsAg y donde los al menos dos, preferentemente los al menos tres, de manera más preferente los al menos cuatro aminoácidos se sitúan en posiciones adyacentes (es decir, son aminoácidos consecutivos en la secuencia de aminoácidos/estructura primaria).

Preferentemente, el epítopo al cual se enlaza el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, es un epítopo conformacional. Por consiguiente, es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlace a un epítopo que comprende al menos dos, preferentemente al menos tres, de manera más preferente al menos cuatro aminoácidos de la región bucle antigénica de HBsAg, donde los al menos dos, preferentemente los al menos tres, de manera más preferente los al menos cuatro aminoácidos se seleccionen de los aminoácidos 120 - 133, preferentemente de los aminoácidos 120 - 130 del dominio S de HBsAg y donde al menos dos, preferentemente al menos tres, de los al menos dos, preferentemente los al menos tres, de manera más preferente los al menos cuatro aminoácidos no estén en posiciones adyacentes (de la estructura primaria).

En otras palabras, (i) ninguno de los aminoácidos a los cuales se enlaza el anticuerpo (es decir, los aminoácidos que forman el epítopo) se sitúan en posiciones adyacentes de la estructura primaria o (ii) algunos, por ejemplo dos o tres, de los aminoácidos a los cuales se enlaza el anticuerpo (es decir, los aminoácidos que forman el epítopo) se sitúan en posiciones adyacentes (de la estructura primaria), mientras que otros aminoácidos a los cuales se enlaza el anticuerpo (es decir, los aminoácidos que forman el epítopo) no se localizan en posiciones adyacentes (de la estructura primaria).

Los aminoácidos a los cuales se enlaza el anticuerpo (es decir, los aminoácidos que forman el epítopo) que no se encuentran en posiciones adyacentes de la estructura primaria típicamente están separados por uno o más aminoácidos a los que no se enlaza el anticuerpo. Preferentemente, al menos uno, de manera más preferente al menos dos, de manera aún más preferente al menos tres, con mayor preferencia al menos cuatro, con particular preferencia al menos cinco aminoácidos pueden estar situados entre los menos dos, preferentemente los menos tres aminoácidos comprendidos en el epítopo y que no se sitúan en posiciones adyacentes.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a un epítopo que comprende al menos los aminoácidos P120, C121, R122 y C124 del dominio S de HBsAg. Con especial preferencia, el anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno del mismo se enlaza a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 88:

PCRXC

donde X es cualquier aminoácido o no es un aminoácido; preferentemente X es cualquier aminoácido; con mayor preferencia X es T, Y, R, S o F; con especial preferencia X es T, Y o R; con total preferencia X es T o R. De manera aún más preferente, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo se enlaza a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 80:

TGPCRTC

o a una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, de manera más preferente al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 80.

De manera especialmente preferente, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo se enlaza a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 85:

STTSTGPCRTC

o a una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, de manera más preferente al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 85.

También es preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo se enlace a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos los aminoácidos 145 - l5 l del dominio S de HBsAg:

GNCTCIP

(SEQ ID NO: 81).

Con especial preferencia, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo se enlaza a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 80 y una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 81.

Con mayor preferencia, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo se enlaza a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 85 y/o una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 87.

Tal y como se describe anteriormente, el epítopo al cual se enlazan los anticuerpos de la invención puede ser lineal (continuo) o conformacional (discontinuo). De manera preferente, el anticuerpo y los fragmentos de anticuerpo de la invención se enlazan a un epítopo conformacional, con mayor preferencia el epítopo conformacional está presente solo bajo condiciones no reductoras.

Sin embargo, también es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de anticuerpo del mismo, se enlace a un epítopo lineal, de manera más preferente el epítopo lineal está presente tanto bajo condiciones no reductoras como reductoras.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a un epítopo en el bucle antigénico de HBsAg formado por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ iD NO: 1:

Xi X2 X3 TC X4 X5 XaA X7G

donde X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 puede ser cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 1).

Preferentemente, Xi, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son aminoácidos que se han sustituido de forma conservativa en comparación con los aminoácidos 120 - 130 de la SEQ ID NO: 3. También es preferente que X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 sean aminoácidos que se han sustituido de forma conservativa en comparación con los aminoácidos 20 - 30 de cualquiera de las SEQ ID NO: 5 - 33 (véase la Tabla 1; con referencia a las secuencias de región bucle antigénica, es decir aa 101 - 172 del dominio S de diferentes variantes de HBsAG).

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X1 es un aminoácido pequeño. Un aminoácido “pequeño” tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en alanina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, glicina, prolina, serina, treonina y valina. Con mayor preferencia, X1 es prolina, serina o treonina.

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X2 es un aminoácido pequeño. En especial, X2 es cisteína o treonina.

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X3 es un aminoácido cargado o un aminoácido alifático. Un aminoácido “cargado” tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico e histidina. Un aminoácido “alifático” tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en alanina, glicina, isoleucina, leucina y valina. De manera más preferente, X3 es arginina, lisina, ácido aspártico o isoleucina.

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X4 es un aminoácido pequeño y/o un aminoácido hidrofóbico. Un aminoácido “hidrofóbico” tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, valina, triptófano, tirosina, metionina, prolina y glicina. De manera más preferente, X4 es metionina o treonina.

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X5 es un aminoácido pequeño y/o un aminoácido hidrofóbico. De manera más preferente, X5 es treonina, alanina o isoleucina.

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X6 es un aminoácido pequeño y/o un aminoácido hidrofóbico. De manera más preferente, X6 es treonina, prolina o leucina.

Preferentemente, en la SEQ ID NO: 1 X7 es un aminoácido polar o un aminoácido alifático. Un aminoácido “polar” tal como se utiliza aquí se refiere a cualquier aminoácido seleccionado del grupo consistente en ácido aspártico, asparagina, arginina, ácido glutámico, histidina, lisina, glutamina, triptófano, tirosina, serina y treonina. De manera más preferente, X7 es glutamina, histidina o leucina.

Por consiguiente, es especialmente preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlace a un epítopo en el bucle antigénico de HBsAg formado por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2:

X1 X2 X3 TC X4 X5 XaA X7G

donde X1 es P, T o S,

X2 es C o S,

X3 es R, K, D o I

X4 es M o T,

X5 es T, A o I,

X6 es T, P o L, y

X7 es Q, H o L

(SEQ ID NO: 2).

Con respecto a los epítopos preferentes formados por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1 o 2, cabe destacar que el término “formado por” tal como se utiliza aquí en particular no pretende implicar que el anticuerpo se enlace necesariamente a cada uno y todos los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o 2. En el caso particular del epítopo conformacional preferente, el anticuerpo puede enlazarse solamente a algunos de los aminoácidos de las SEQ ID NO: 1 o 2, pudiendo actuar los otros residuos aminoácidos simplemente como “espaciadores”, proporcionando así la estructura 3D del epítopo.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a un epítopo en el bucle antigénico de HBsAg formado por uno o más, preferentemente por dos o más, con mayor preferencia por tres o más y con especial preferencia por cuatro o más aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO 5 - 33 mostrada a continuación en la Tabla 1.

Con mayor preferencia, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a una región bucle antigénica de HBsAg que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 5 - 33 mostradas a continuación en la Tabla 1 o a una variante de secuencia de las mismas. De manera aún más preferente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, se enlaza a todas las variantes de bucle antigénico de HBsAg con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 5 - 33 mostradas a continuación en la Tabla 1. En otras palabras, es particularmente preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, sea capaz de enlazarse a todas las diferentes regiones bucle antigénico de HBsAg que tienen una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 5 - 33.

Tabla 1: Secuencias de aminoácidos ejemplares de la región bucle antigénica del dominio S de HBsAg (residuos 101-172 del dominio S de HBsAg - excepto para SEQ ID NO: 16, que se refiere a los residuos 100 172 del dominio S de HBsAg a fin de incluir la mutación relevante) de diferentes genotipos y mutantes como se utilizan a uí

En general, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, comprende (al menos) tres regiones determinadoras de complementariedad (CDR) en una cadena pesada y (al menos) tres CDR en una cadena ligera. En general, las regiones determinadoras de complementariedad (CDR) son las regiones hipervariables presentes en los dominios variables de cadena pesada y los dominios variables de cadena ligera. Típicamente, las CDR de una cadena pesada y la cadena ligera conectada de un anticuerpo forman juntos el receptor de antígeno. Usualmente, las tres CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) se disponen de forma no consecutiva en el dominio variable. Dado que los receptores de antígeno están típicamente compuestos por dos dominios variables (en dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir la cadena pesada y la ligera), hay seis CDR para cada receptor de antígeno (cadena pesada: CDRH1, CDRH2 y CDRH3; cadena ligera: CDRL1, CDRL2 y CDRL3). Una única molécula de anticuerpo normalmente tiene dos receptores de antígeno y, por tanto, contiene doce CDR. Las CDR en la cadena pesada y/o ligera pueden estar separadas por regiones estructurales, donde región estructural (FR) es una región en el dominio variable que es menos “variable” que la CDR. Por ejemplo, una cadena (o cada cadena, respectivamente) puede estar compuesta por cuatro regiones estructurales separadas por tres CDR.

Se determinaron las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo ilustrativo de la invención, que comprende tres CDR diferentes en la cadena pesada y tres CDR diferentes en la cadena ligera. La posición de los aminoácidos CDR se define según el sistema de numeración IMGT (IMGT: http://www.imgt.org/; véase Lefranc, M.-P. y col. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012).

La Tabla 2 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y l “ ”

Así, es preferente que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, comprenda las secuencias CDR para los seis CDR o la secuencia VH y la secuencia VL mostradas en la Tabla 2.

La Tabla 3 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo ilustrativo adicional según la presente invención “HBC34v7”:

Así, también es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias CDR para las seis CDR o la secuencia VH y la secuencia VL mostradas en la Tabla 3.

La Tabla 4 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo ilustrativo adicional según la presente invención “HBC34v23”:

Así, también es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias CDR para las seis CDR o la secuencia VH y la secuencia VL mostradas en la Tabla 4.

La Tabla 5 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo ilustrativo adicional según la presente invención (“HBC34v31”:

Así, es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias CDR para las seis CDR o la secuencia VH y la secuencia VL mostradas en la Tabla 5.

La Tabla 6 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo ilustrativo adicional según la presente invención “HBC34v32”:

Así, también es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias CDR para las seis CDR o la secuencia VH y la secuencia VL mostradas en la Tabla 6.

La Tabla 7 muestra las secuencias de aminoácidos de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo ilustrativo adicional según la presente invención “HBC34v33”:

Así, también es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias CDR para las seis CDR, la secuencia VH y la secuencia VL mostradas en la Tabla 7.

La Tabla 8 proporciona una visión general de las modificaciones de VH y VL de las variantes de anticuerpo ilustrativas “HBC34v7”, “HBC34v23”, “HBC34v31”, “HBC34v32” y “HBC34v33” del anticuerpo de tipo natural (WT) “HBC34” y de las SEQ ID NO respectivas de las secuencias de aminoácidos correspondientes CDR y VH/VL:

Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una cadena pesada que comprende al menos una CDRH1, al menos una CDRH2 y al menos una CDRH3 y una cadena ligera que comprende al menos una CDRL1, al menos una CDRL2 y al menos una CDRL3, donde la al menos una cadena pesada CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 34, la al menos una CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 35 y la al menos una cadena pesada CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 36. El anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la presente invención comprende una cadena pesada que comprende al menos una CDRH1, al menos una CDRH2 y al menos una CDRH3 y una cadena ligera que comprende al menos una CDRL1, al menos una CDRL2 y al menos una CDRL3, donde la al menos una cadena pesada CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 34, la al menos una CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 35 o 66 y la al menos una cadena pesada CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 36.

Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende una cadena pesada que comprende al menos una CDRH1, al menos una CDRH2 y al menos una CDRH3 y una cadena ligera que comprende al menos una CDRL1, al menos una CDRL2 y al menos una CDRL3, donde la al menos una cadena ligera CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 37, la al menos una CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 38 o 39 y la al menos una CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 40. Es también preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la presente invención comprenda una cadena pesada que comprende al menos una CDRH1, al menos una CDRH2 y al menos una CDRH3 y una cadena ligera que comprende al menos una CDRL1, al menos una CDRL2 y al menos una CDRL3, donde la al menos una cadena ligera CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 37, la al menos una CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 38 o 39 y la al menos una cadena ligera CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 58.

Por consiguiente, es también preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, c Dr L2 y CDRL3 según las SEQ ID NO: 34 - 38 y 40 o según las SEQ ID NO: 34 - 37 y 39 - 40. Es también preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprenda las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2, y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2, y CDRL3 según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 38 y 40 o según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 37 y 39 - 40. Es también preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprenda las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y Cd Rh 3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2, y CDRL3 según las SEQ ID NO: 34 - 38 y 58 o según las s Eq ID NO: 34 - 37, 39 y 58. Además, es preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprenda las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 38 y 58 o según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 37, 39 y 58.

El anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende las secuencias de aminoácidos CDRH1, CDRH2, y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) según las SEQ ID NO: 34 - 38 y 40, respectivamente; o (ii) según las SEQ ID NO: 34 - 37, 39 y 40, respectivamente; o (iii) según las SEQ ID NO: 34 - 38 y 58, respectivamente; o (iv) según las SEQ ID NO: 34 - 37, 39 y 58, respectivamente; o (v) según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 38 y 40, respectivamente; o (vi) según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 37, 39 y 40 , respectivamente; o (vii) según las SEQ ID NO: 34, 66, 36 - 38 y 58, respectivamente; o (viii) según las s Eq ID NO: 34, 66, 36 - 37, 39 y 58, respectivamente.

Además, también es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO: 4 l o una variante de secuencia funcional de la misma y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO: 42 o una variante de secuencia funcional de la misma. Por consiguiente, es preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprenda una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 41, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42. De forma especialmente preferente, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO: 41 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO: 42.

Además, también es preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO: 41 o 67 o una variante de secuencia funcional de la misma y/o una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO: 42 o una variante de secuencia funcional de la misma. Así, es preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprenda una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 41 o 67, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42. Con mayor preferencia, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO: 41 o 67 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO: 42.

Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO: 41 o 67 o una variante de secuencia funcional de la misma y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO: 59 o 65 o una variante de secuencia funcional de la misma. Así, es preferente que el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprenda (i) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 41 o 67; y (ii) una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 59 o 65. Con especial preferencia, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) según la SEQ ID NO: 41 o 67 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) según la SEQ ID NO: 59 o 65.

Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprende al menos una secuencia de aminoácidos de al menos una región variable de cadena pesada (VH) y de al menos una región variable de cadena ligera (VL) que es al menos un 80%, por ejemplo un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 41 -42.

Es también preferente que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda al menos una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) y al menos una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) que es al menos un 80%, por ejemplo un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 41 y 59.

También se prefiere que el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención comprenda al menos una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) y al menos una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VL) que es al menos un 80%, por ejemplo un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 41 y 65.

Los presentes inventores han aislado un anticuerpo monoclonal (mAb) de acuerdo con la presente invención, que se denomina aquí HBC34 (véase el Ejemplo 1). Los presentes inventores han identificado un anticuerpo monoclonal adicional (mAb) de acuerdo con la presente invención, que se denomina aquí HBC34v7 (véase el Ejemplo 11). Los presentes inventores han identificado un anticuerpo monoclonal adicional (mAb) de acuerdo con la presente invención que se denomina aquí HBC34v23 (véase el Ejemplo 12). Los presentes inventores han identificado un anticuerpo monoclonal adicional (mAb) de acuerdo con la presente invención que se denomina aquí HBC34v31 (véase el Ejemplo 12). Los presentes inventores han identificado un anticuerpo monoclonal adicional (mAb) de acuerdo con la presente invención que se denomina aquí HBC34v32 (véase el Ejemplo 12). Los presentes inventores han identificado un anticuerpo monoclonal adicional (mAb) de acuerdo con la presente invención que se denomina aquí HBC34v33 (véase el Ejemplo 12).

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, es un anticuerpo humano, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal humano, un anticuerpo purificado, un anticuerpo de una sola cadena, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

Los anticuerpos de la invención pueden así ser anticuerpos humanos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos recombinantes o anticuerpos purificados. La invención también proporciona fragmentos de los anticuerpos de la invención, en particular fragmentos que retienen la actividad de enlace a antígeno de los anticuerpos. Estos fragmentos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de una sola cadena, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

Los fragmentos de los anticuerpos de la invención se pueden obtener a partir de anticuerpos por métodos que incluyen la digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o por escisión de enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos se pueden obtener por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. Los “fragmentos” de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La invención también abarca fragmentos Fv de una sola cadena (scFv) derivados de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la invención. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio, anticuerpos de cadena ligera de un solo dominio, así como anticuerpos de una cadena, por ejemplo Fv de una cadena donde los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un enlazador peptídico.

Los fragmentos de anticuerpo de la invención pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en diversas estructuras tal como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas scFv se pueden sintetizar para crear un “triacuerpo” trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas scFv pueden incluir un dominio de la región Fc, resultadondo en minicuerpos divalentes. Además, las secuencias de la invención pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas en las que las secuencias de la invención fijan como diana los epítopos de la invención y otras regiones de la molécula que se enlaza a otras dianas. Moléculas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Fab2 biespecífica, Fab3 triespecífica, scFv biespecífica y diacuerpos (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

En otro aspecto, la presente invención proporciona el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención como se describe aquí para el uso como un medicamento. Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención como se describe aquí es para su uso en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o de la hepatitis D. Una descripción detallada del aspecto se proporciona a continuación, en “Tratamiento médico y usos” y en el contexto de la composición farmacéutica de la presente invención.

Molécula de ácido nucleico

En otro aspecto, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención como describe anteriormente. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico y/o polinucleótidos incluyen, por ejemplo, un polinucleótido recombinante, un vector, un oligonucleótido, una molécula de ARN, tal como ARNr, ARNm, ARNmi, ARNsi o ARNt, o una molécula de ADN, tal como ADNc. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas ligera y pesada y las CDR de los anticuerpos de la presente invención son preferentes. Las Tablas 2 - 8 proporcionan los números de SEQ ID para las secuencias de aminoácidos de las CDR y VH y VL de anticuerpos ilustrativos según la presente invención, que preferentemente son codificados por las secuencias de polinucleótidos/ácidos nucleicos como se describen aquí. De manera preferente, se proporcionan aquí secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas ligeras y pesadas, en particular las secuencias VH y VL y las CDR de los anticuerpos ilustrativos de la invención. La siguiente Tabla 9 proporciona los números de SEQ ID para las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDR y VH y VL de un anticuerpo ilustrativo de acuerdo con la presente invención. Debido a la redundancia del código genético, la presente invención también comprende variantes de secuencia de estas secuencias de ácido nucleico y, en particular, tales variantes de secuencia que codifican las mismas secuencias de aminoácidos.

Una molécula de ácido nucleico es una molécula que comprende, preferentemente que consiste en componentes ácidos nucleicos. Preferentemente, el término molécula de ácido nucleico se refiere a moléculas de ADN o ARN. En particular, se utiliza como sinónimo con el término “polinucleótido”. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico es un polímero que comprende o consiste en monómeros nucleótido que están unidos covalentemente entre sí por enlaces fosfodiéster de una cadena principal azúcar/fosfato. El término “molécula de ácido nucleico” también abarca moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como moléculas de ADN o ARN modificadas en las bases, modificadas en los azúcares o modificadas en su esqueleto, etc.

La Tabla 9 muestra las secuencias de ácido nucleico de las CDR y la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) de los anticuerpos ilustrativos de acuerdo con la presente invención “HB 4” “HB 4v7” “HB 4v2 ” “HB 4v 1” “HB 4v 2” “HB 4v ”:

Preferentemente, la secuencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las SEQ ID NO: 43 - 51 o una variante de secuencia funcional de las mismas. También es preferente que la secuencia de la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención comprenda o consista en una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 43 - 51,60 - 64 y 68 - 78.

También es preferente que las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención incluyan secuencias de ácido nucleico con al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con el ácido nucleico que codifica una CDR, una secuencia VH y/o una secuencia VL utilizadas en un anticuerpo (ilustrativo) según la presente invención, por ejemplo las secuencias mostradas en la Tabla 9. Así, es preferente una molécula de ácido nucleico donde la secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las SEQ ID NO.

43 - 51 o una variante de secuencia funcional de la misma. Una molécula de ácido nucleico donde la secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 43 - 51, 60 - 64 y 68 - 78 también es preferente. En especial, la secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las SEQ ID NO: 43 -51, 60 -64 y 68 - 78.

Con especial preferencia, la secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, de manera aún más preferente al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 70 - 78. Las SEQ ID NO: 70 - 78 son secuencias de ácido nucleico optimizadas con codón (véase la Tabla 9). Con particular preferencia, la secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 70 - 78.

En general, la molécula de ácido nucleico se puede manipular para insertar, suprimir o alterar ciertas secuencias de ácido nucleico. Los cambios de esta manipulación incluyen, pero no se limitan a, cambios para introducir sitios de restricción, para enmendar el uso de codón, para agregar u optimizar secuencias reguladoras de la transcripción y/o traducción, etc. También es posible cambiar el ácido nucleico para alterar los aminoácidos codificados. Por ejemplo, puede ser útil introducir una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. Estas mutaciones puntuales pueden modificar las funciones efectoras, la afinidad de enlace a antígeno, modificaciones postraduccionales, inmunogenicidad, etc., pueden introducir aminoácidos para la unión de grupos covalentes (por ejemplo etiquetas) o pueden introducir marcas (por ejemplo con propósitos de purificación). Las mutaciones se pueden introducir en sitios específicos o se pueden introducir de forma aleatoria, seguido por selección (por ejemplo evolución molecular). Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las regiones CDR, una secuencia VH y/o una secuencia VL de un anticuerpo (ilustrativo) de la invención se puede mutar aleatoriamente o direccionalmente para introducir diferentes propiedades en los aminoácidos codificados. Estos cambios pueden ser resultado de un proceso iterativo donde los cambios iniciales se mantienen y se introducen nuevos cambios en otras posiciones de nucleótidos. Además, los cambios logrados en pasos independientes se pueden combinar. Las diferentes propiedades introducidas en los aminoácidos codificados pueden incluir, pero no se limitan a, una afinidad mejorada.

Vector

Se incluyen además dentro del alcance de la invención vectores, por ejemplo vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, un vector comprende una molécula de ácido nucleico tal como se describe anteriormente.

El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferentemente a una molécula de ácido nucleico recombinante, es decir una molécula de ácido nucleico que no está presente en la naturaleza. Un vector en el contexto de la presente invención es adecuado para incorporar o alojar una secuencia de ácido nucleico deseada. Estos vectores pueden vectores de almacenamiento, vectores de expresión, vectores de clonación, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molécula de ácido nucleico. Así, el vector puede comprender una secuencia que corresponde, por ejemplo, a un anticuerpo deseado o a un fragmento de anticuerpo del mismo de acuerdo con la presente invención. Se puede emplear un vector de expresión para la producción de productos de expresión, tales como ARN, por ejemplo ARNm, o péptidos, polipéptidos o proteínas. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender las secuencias necesarias para la transcripción de un tramo de secuencia del vector, tal como una secuencia promotora. Un vector de clonación es típicamente un vector que contiene un sitio de clonación, que se puede utilizar para incorporar secuencias de ácido nucleico en el vector. Un vector de clonación puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico o un vector bacteriófago. Un vector de transferencia puede ser un vector adecuado para transferir moléculas de ácido nucleico en células u organismos, por ejemplo vectores virales. Un vector en el contexto de la presente invención puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. Preferentemente, un vector es una molécula de ADN. Por ejemplo, un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonación, un marcador de selección, tal como un factor de resistencia a antibióticos, y una secuencia adecuada para la multiplicación del vector, tal como un origen de replicación. Preferentemente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector plasmídico.

Células

En un aspecto adicional, la presente invención también proporciona células que expresan el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención; y/o que comprenden el vector de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos de estas células incluyen, pero no se limitan a, células eucariotas, por ejemplo células de levadura, células animales o células vegetales. Preferentemente, las células son células de mamífero, en especial una línea celular de mamífero. Ejemplos preferidos incluyen células humanas, células CHO, células HEK293T, células PER.C6, células NS0, células hepáticas humanas, por ejemplo células Hepa RG, células de mieloma o células de hibridoma.

En particular, la célula se puede transfectar con un vector de acuerdo con la presente invención, preferentemente con un vector de expresión. El término “transfección” se refiere a la introducción de moléculas de ácido nucleico, tal como moléculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en las células, preferentemente en células eucariotas. En el contexto de la presente invención, el término “transfección” abarca cualquier método conocido por el experto para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, preferentemente en células eucariotas, tales como células de mamífero. Estos métodos abarcan, por ejemplo, electroporación, lipofección, por ejemplo basada en los lípidos catiónicos y/o liposomas, precipitación de fosfato de calcio, transfección basada en nanopartículas, transfección basada en virus o transfección basada en polímeros catiónicos, tal como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc. Preferentemente, la introducción no es viral.

Además, las células de la presente invención se pueden transfectar estable o transitoriamente con el vector de acuerdo con la presente invención, por ejemplo para expresar el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, las células se transfectan establemente con el vector de acuerdo con la presente invención que codifica el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo según la presente invención. Alternativamente, también es preferente que las células se transfecten de forma transitoria con el vector de acuerdo con la presente invención que codifica el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo según la presente invención.

Características adicionales opcionales de los anticuerpos

Los anticuerpos de la invención se pueden acoplar, por ejemplo a un fármaco, para el suministro a un sitio de tratamiento o acoplar a una etiqueta detectable para facilitar la formación de imágenes de un sitio que comprende células de interés. Los métodos para acoplar anticuerpos a los fármacos y etiquetas detectables son bien conocidos en la técnica, ya que son métodos de formación de imágenes que utilizan etiquetas detectables. Los anticuerpos etiquetados se pueden emplear en una amplia variedad de ensayos, empleando una amplia variedad de etiquetas. La detección de la formación de un complejo anticuerpo-antígeno entre un anticuerpo de la invención y un epítopo de interés en HBsAg, en particular en la región bucle antigénica de HBsAg, se puede conseguir uniendo una sustancia detectable al anticuerpo. Medios de detección adecuados incluyen el uso de etiquetas tales como radionúclidos, enzimas, coenzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, complejos de grupo prostético, radicales libres, partículas, tintes y similares. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente es luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y ecuorina; y ejemplos de materiales radiactivos adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Estos reactivos etiquetados se pueden utilizar en una variedad de ensayos bien conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoensayos de enzimas, por ejemplo ELISA, inmunoensayos fluorescentes y similares. Los anticuerpos etiquetados de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar así en estos ensayos, por ejemplo como se describe en la US 3.766.162, US 3.791.932, US 3.817.837 y US 4.233.402.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención se puede conjugar a una parte terapéutica, tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo o radioisótopo. Ejemplos de radioisótopos incluyen, pero no se limitan a, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 y similares. Estos conjugados de anticuerpos se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada; la parte del fármaco no se considera como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la parte de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria.

Las técnicas para conjugar esta parte terapéutica con los anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Arnon y col. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld y col. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom y col. (1987) “Antibodies for Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson y col. (2a ed; Marcel Dekker, Inc.), pp.

623-653; Thorpe (1985) “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review,” en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera y col. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin y col. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; y Thorpe y col. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158.

Alternativamente, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo, se puede conjugar con un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo para formar un heteroconjugado de anticuerpo tal como se describe en la US 4.676.980. Además, se pueden utilizar enlazadores entre las etiquetas y los anticuerpos de la invención, por ejemplo como se describe en la US 4.831.175. Los anticuerpos o los fragmentos de enlace a antígeno de los mismos se pueden etiquetar directamente con yodo radiactivo, indio, itrio u otra partícula radiactiva conocida en la técnica, por ejemplo como se describe en la US 5.595.721. El tratamiento puede consistir en una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados simultánea o subsecuentemente, por ejemplo como se describe en la WO00/52031, WO00/52473.

Los anticuerpos de la invención también se pueden unir a un soporte sólido. Adicionalmente, los anticuerpos de la invención, o fragmentos de anticuerpo funcionales de los mismos, se pueden modificar químicamente por conjugación covalente a un polímero, por ejemplo para incrementar su vida media circulante. Ejemplos de polímeros y métodos para unirlos a los péptidos se describen en US 4.766.106, US 4.179.337, US 4.495.285 y US 4.609.546. En algunas realizaciones, los polímeros se pueden seleccionar de polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2-CH2)nO-R, donde R puede ser hidrógeno o un grupo protector, tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferentemente, el grupo protector puede tener entre 1 y 8 carbonos. Por ejemplo, el grupo protector es metilo. El símbolo n es un número entero positivo. En una realización, n está entre 1 y 1.000. En otra realización, n está entre 2 y 500. De manera preferente, el PEG tiene un peso molecular promedio entre 1.000 y 40.000, de manera más preferente el PEG tiene un peso molecular entre 2.000 y 20.000, de manera aún más preferente el PEG tiene un peso molecular entre 3.000 y 12.000. Además, el PEG puede tener al menos un grupo hidroxilo, por ejemplo el PEG puede tener un grupo hidroxilo terminal. Por ejemplo, es el grupo hidroxilo terminal el que se activa para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de grupos reactivos puede variar para lograr un PEG/anticuerpo covalentemente conjugado de la presente invención.

Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG) y similares. En una realización, se utiliza POG. Sin estar limitado por una teoría, debido a que la cadena principal glicerol del glicerol polioxietilado es la misma cadena principal presente naturalmente en, por ejemplo, animales y humanos en mono-, di-, triglicéridos, esta ramificación no se observaría necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El POG puede tener un peso molecular en el mismo intervalo que el PEG. Otro sistema de suministro de fármacos que se puede utilizar para incrementar la vida media en circulación es el liposoma. Los métodos para preparar sistemas de suministro de liposomas son conocidos por el experto en la técnica. Otros sistemas de suministro de fármacos son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, en Poznansky y col. (1980) y Poznansky (1984).

Los anticuerpos de la invención se pueden proporcionar en forma purificada. Típicamente, el anticuerpo estará presente en una composición que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo donde menos del 90% (en peso), usualmente menos del 60% y más usualmente menos del 50% de la composición está constituida por otros polipéptidos.

Los anticuerpos de la invención pueden ser inmunogénicos en los huéspedes no humanos (o heterólogos), por ejemplo en ratones. En particular, los anticuerpos pueden tener un idiotipo que es inmunogénico en los huéspedes no humanos, pero no en un huésped humano. En particular, los anticuerpos de la invención para uso humano incluyen aquellos que no se pueden aislar fácilmente de los huéspedes, como ratones, cabras, conejos, ratas, mamíferos no primates, etc. y que generalmente no se pueden obtener por humanización o a partir de xeno-ratones.

Producción de Anticuerpos

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden obtener por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la metodología general para obtener anticuerpos monoclonales utilizando tecnologías de hibridoma es bien conocida (Kohler, G. y Milstein, C,. 1975; Kozbar y col. 1983). En una realización, se utiliza el método de inmortalización EBV alternativo descrito en la WO2004/076677.

Se describe un método preferido en la WO 2004/076677. En este método, las células B que producen el anticuerpo de la invención se transforman con EBV y un activador de células B policlonal. Se pueden añadir opcionalmente estimulantes adicionales del crecimiento y diferenciación celular durante el paso de transformación para mejorar adicionalmente la eficiencia. Estos estimulantes pueden ser citoquinas, tales como IL2 e IL-15. En un aspecto, la IL-2 se agrega durante el paso de inmortalización para mejorar adicionalmente la eficiencia de la inmortalización, pero su uso no es esencial. Las células B inmortalizadas producidas utilizando estos métodos se pueden entonces cultivar utilizando métodos conocidos en la técnica y aislarse los anticuerpos de las mismas.

Otro método preferente se describe en la WO 2010/046775. En este método, se cultivan células plasmáticas en número limitado o como células plasmáticas individuales en placas de cultivo de micropocillos. Los anticuerpos se pueden aislar de los cultivos de células plasmáticas. Además, a partir de los cultivos de células plasmáticas, se puede extraer el ARN y se puede llevar a cabo la PCR utilizando métodos conocidos en la técnica. Las regiones VH y VL de los anticuerpos se pueden amplificar por RT-PCR (PCR de transcriptasa inversa), se pueden secuenciar y clonar en un vector de expresión que después se transfiere a células HEK293T o a otras células huésped. La clonación del ácido nucleico en los vectores de expresión, la transfección de células huésped, el cultivo de las células huésped transfectadas y el aislamiento del anticuerpo producido se pueden llevar a cabo utilizando cualquiera de los métodos conocidos por el experto en la técnica.

Los anticuerpos se pueden además purificar, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos, como HPLC o cromatografía de afinidad. Las técnicas de purificación de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, incluyendo las técnicas para producir anticuerpos de grado farmacéutico, son bien conocidas en la técnica.

Los fragmentos de los anticuerpos de la invención se pueden obtener a partir de los anticuerpos por métodos que incluyen la digestión con enzimas, tal como pepsina o papaína, y/o por escisión de enlaces disulfuro mediante reducción química. Alternativamente, los fragmentos de los anticuerpos se pueden obtener por clonación y expresión de parte de las secuencias de las cadenas pesadas o ligeras. “Fragmentos” de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')'2 y Fv. La invención también abarca fragmentos Fv de una cadena (scFv) derivados de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, la invención incluye un scFv que comprende las CDR de un anticuerpo de la invención. También se incluyen monómeros y dímeros de cadena pesada o ligera, anticuerpos de cadena pesada de un dominio, anticuerpos de cadena ligera de un dominio, así como anticuerpos monocatenarios, por ejemplo Fv de una cadena, en el cual los dominios variables de cadena pesada y ligera están unidos por un enlazador peptídico.

Los fragmentos de anticuerpos de la invención pueden impartir interacciones monovalentes o multivalentes y estar contenidos en diversas estructuras como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas de scFv se pueden sintetizar para crear un “triacuerpo” trivalente o un “tetracuerpo” tetravalente. Las moléculas de scFv pueden incluir un dominio de la región Fc, dan como resultado minicuerpos bivalentes. Además, las secuencias de la invención pueden ser un componente de moléculas multiespecíficas donde las secuencias de la invención fijan como diana los epítopos de la invención y otras regiones de la molécula que se enlazan a otras dianas. Moléculas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, Fab2 biespecífico, Fab3 triespecífico, scFv biespecífico, y diacuerpos (Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

Se pueden emplear técnicas estándar de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar por completo o parcialmente utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. La mutagénesis dirigida a sitio y las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden utilizar por ser apropiadas.

Cualquier sistema células huésped/vector adecuado se puede utilizar para la expresión de las secuencias de ADN que codifican las moléculas de anticuerpo de la presente invención o fragmentos de las mismas. Se pueden emplear sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, en parte, para la expresión de fragmentos de anticuerpos, tal como los fragmentos Fab y F(ab')2, y especialmente los fragmentos Fv y los fragmentos de anticuerpos de una cadena, por ejemplo Fvs de una cadena. Se pueden emplear sistemas de expresión de células huésped eucariotas, por ejemplo de mamíferos, para la producción de moléculas de anticuerpo más grandes, incluyendo moléculas de anticuerpos completas. Células huésped de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, mieloma o células de hibridoma.

La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica un ácido nucleico de la presente invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención y aislar la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso solo se necesita emplear un polipéptido de cadena pesada o cadena ligera que codifica la secuencia para transfectar las células huésped. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un único vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada. Alternativamente, los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden producir (i) expresando una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped, por ejemplo empleando un vector de acuerdo con la presente invención y (ii) aislando el producto de anticuerpo expresado. Adicionalmente, el método puede incluir (iii) purificar el anticuerpo aislado. Las células B transformadas y las células plasmáticas cultivadas se pueden cribar para aquellos anticuerpos productores de la especificidad deseada o función.

El paso de cribado se puede llevar a cabo por cualquier inmunoensayo, por ejemplo ELISA, por tinción de los tejidos o células (incluyendo células transfectadas), por ensayo de neutralización o por cualquiera de otros métodos conocidos en la técnica para identificar la especificidad o función deseada. El ensayo puede seleccionarse sobre la base del reconocimiento simple de uno o más antígenos o sobre la base adicional de una función deseada, por ejemplo para seleccionar anticuerpos neutralizantes en lugar de solo anticuerpos de enlace a antígeno, para seleccionar anticuerpos que pueden cambiar las características de las células diana, tal como sus cascadas de señalización, su forma, su velocidad de crecimiento, su capacidad de influir en otras células, su respuesta a la influencia por otras células o por otros reactivos o por un cambio en las condiciones, su estado de diferenciación, etc.

Entonces se pueden producir clones de células B transformadas individuales en el cultivo de células B transformadas positivas. El paso de clonación para separar clones individuales de la mezcla de células positivas se puede llevar a cabo utilizando dilución limitante, micromanipulación, deposición de células individuales por clasificación de células u otro método conocido en la técnica.

Se puede aislar, clonar y expresar el ácido nucleico a partir de las células plasmáticas cultivadas en células HEK293T u otras células huésped conocidas utilizando métodos conocidos en la técnica.

Los clones de células B inmortalizadas o las células huésped transfectadas de la invención se pueden utilizar en varias formas, por ejemplo como fuente de anticuerpos monoclonales, como fuente de ácido nucleico (ADN o ARNm) que codifica un anticuerpo monoclonal de interés, para la investigación, etc.

La invención también proporciona una composición que comprende células de memoria B inmortalizadas o células huésped transfectadas que producen los anticuerpos de acuerdo con la presente invención.

El clon de células B inmortalizadas o las células plasmáticas cultivadas de la invención también se pueden utilizar como fuente de ácido nucleico para la clonación de genes de anticuerpos con el fin de la expresión recombinante subsecuente. La expresión de fuentes recombinantes es más habitual en propósitos farmacéuticos que la expresión de células B o hibridomas, por ejemplo por razones de estabilidad, capacidad de reproducción, facilidad de cultivo, etc.

Así, también se describe aquí un método para preparar una célula recombinante, comprendiendo el método los pasos de: (i) obtener uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo ARNm de cadena pesada y/o ligera) del clon de células B o de células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés; (ii) insertar el ácido nucleico en un vector de expresión y (iii) transfectar el vector en una célula huésped para permitir la expresión del anticuerpo de interés en dicha célula huésped.

De forma similar, también se describe aquí un método para preparar una célula recombinante que comprende los pasos de: (i) secuenciar ácido(s) nucleico del clon de célula B o de células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés; y (ii) utilizar la información de secuencia del paso (i) para preparar ácido(s) nucleico para la inserción en una célula huésped con el fin de permitir la expresión del anticuerpo de interés en dicha célula huésped. El ácido nucleico puede ser, pero no necesariamente, manipulado entre los pasos (i) y (ii) para introducir sitios de restricción, para cambiar el uso de codón y/o para optimizar las secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción.

Adicionalmente, también se describe aquí un método para preparar una célula huésped transfectada que comprende el paso de transfectar una célula huésped con uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo de interés, donde los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos que se derivan de un clon de células B inmortalizadas o de una célula plasmática cultivada de la invención. Así, los procedimientos para primero preparar el ácido(s) nucleico y después utilizarlo para transfectar una célula huésped se pueden llevar a cabo en diferentes tiempos, por diferentes personas, en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).

Estas células recombinantes de la invención entonces se pueden utilizar para la expresión y con propósitos de cultivo. Son particularmente útiles para la expresión de anticuerpos en la producción farmacéutica a gran escala. También se pueden utilizar como ingrediente activo en una composición farmacéutica. Se puede aplicar cualquier técnica de cultivo adecuada, incluyendo, pero no limitado a, cultivo estático, cultivo en botella giratoria, fluido de ascitos, cartucho biorreactor de tipo fibra hueca, minifermentador modular, tanque agitado, cultivo microportador, perfusión en núcleos de cerámica, etc.

Los métodos para obtener y secuenciar genes de inmunoglobulina de células B o células plasmáticas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Capítulo 4 de Kuby Immunology, 4a edición, 2000).

La célula huésped transfectada puede ser una célula eucariota, incluyendo levaduras y células animales, en particular células de mamífero (por ejemplo células CHO, células NS0, células humanas como PER.C6 o células HKB-11, células de mieloma o una célula de hígado humano, tal como Hepa RG), así como células vegetales, siendo preferentes las células de mamífero. Los huéspedes de expresión preferentes pueden glicosilar el anticuerpo de la invención, en particular con estructuras carbohidrato que no son inmunogénicas en humanos. En una realización, la célula huésped transfectada puede ser capaz de desarrollarse en medios libres de suero. En una realización adicional, la célula huésped transfectada puede ser capaz de desarrollarse en cultivo sin presencia de productos derivados de animales. La célula huésped transfectada también se puede cultivar para proporcionar una línea celular.

También se describe aquí un método para preparar una o más moléculas de ácido nucleico (por ejemplo genes de cadena pesada y ligera) que codifican un anticuerpo de interés, que comprende los pasos de: (i) preparar un clon de células B inmortalizadas o cultivar células plasmáticas de acuerdo con la invención; (ii) obtener del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de interés. Además, la invención también se describe aquí un método para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de interés, que comprende los pasos de: (i) preparar un clon de células B inmortalizadas o cultivar células plasmáticas de acuerdo con la invención; (ii) secuenciar el ácido nucleico del clon de células B o las células plasmáticas cultivadas que codifican el anticuerpo de interés.

Además, también se describe aquí un método para preparar molécula(s) de ácido nucleico que codifica(n) un anticuerpo de interés, comprendiendo el paso de obtener el ácido nucleico que fue obtenido a partir de un clon de células B transformadas o células plasmáticas cultivadas de la invención. Así, los procedimientos para primero obtener el clon de células B o la célula plasmática cultivada y después obtener ácido(s) nucleico(s) a partir del clon de células B o de las células plasmáticas cultivadas se puede llevar a cabo en diferentes tiempos, por diferentes personas, en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).

También se describe aquí un método para preparar un anticuerpo (por ejemplo para uso farmacéutico) de acuerdo con la presente invención, que comprende los pasos de: (i) obtener y/o secuenciar uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo genes de cadena pesada y ligera) del clon de células B seleccionado o de células plasmáticas cultivadas que expresan el anticuerpo de interés; (ii) insertar el o los ácidos nucleicos en o utilizar la(s) secuencia(s) de ácido nucleico para preparar un vector de expresión; (iii) transfectar una célula huésped que puede expresar el anticuerpo de interés; (iv) cultivar o sub-cultivar las células huésped transfectadas bajo condiciones de sobre-expresión del anticuerpo de interés; y, opcionalmente, (v) purificar el anticuerpo de interés.

También se describe aquí un método para preparar un anticuerpo que comprende los pasos de cultivar o subcultivar una población de células huésped transfectadas, por ejemplo una población de células establemente transfectadas, bajo condiciones de sobre-expresión del anticuerpo de interés y, opcionalmente, purificar el anticuerpo de interés, donde la población de células huésped transfectadas se ha preparado (i) proporcionando uno o más ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo seleccionado de interés que es producido por un clon de células B o por células plasmáticas cultivadas preparadas como se describe anteriormente, (ii) insertar el o los ácidos nucleicos en un vector de expresión, (iii) transfectar el vector en una célula huésped que puede expresar el anticuerpo de interés y (iv) cultivar o sub-cultivar la célula huésped transfectada que comprende los ácidos nucleicos insertados para producir el anticuerpo de interés. Así, los procedimientos para primero preparar la célula huésped recombinante y después cultivarla para expresar el anticuerpo se pueden llevar a cabo en diferentes tiempos, por diferentes personas, en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).

Composiciones farmacéuticas

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de: i) el anticuerpo, o el fragmento de anticuerpo del mismo, de acuerdo con la presente invención; ii) el ácido nucleico que codifica el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención;

iii) el vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; o

iv) la célula que expresa el anticuerpo de acuerdo con la presente invención o que comprende el vector de acuerdo con la presente invención.

En otras palabras, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención y/o la célula de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, la composición farmacéutica puede también contener un vehículo, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. Aunque el vehículo o excipiente puede facilitar la administración, no debe inducir la producción de anticuerpos perjudiciales al individuo que recibe la composición. No debe ser tóxico. Vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes de metabolismo lento como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. En general, los vehículos farmacéuticamente aceptables en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención pueden ser componentes activos o componentes inactivos. Preferentemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable en una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención no es un componente activo con respecto a la hepatitis B o D.

Se pueden utilizar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos inorgánicos, como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en una composición farmacéutica pueden contener además líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente pueden estar presentes sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras del pH en estas composiciones. Estos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones para la ingesta por parte del sujeto.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo una composición liofilizada, tipo SynagisMR y HerceptinMR, para su reconstitución con agua estéril que contiene un conservante). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo como una pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo como un comprimido o cápsula, como un espray o como un jarabe (opcionalmente saborizado). La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, utilizando un polvo fino o un rocío. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo como gotas. La composición puede estar en forma de un kit diseñado de manera que una composición combinada se reconstituye justo antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, un anticuerpo liofilizado se puede proporcionar en forma de kit con agua estéril o un tampón estéril.

Es preferente que el ingrediente activo de la composición sea una molécula de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos; en particular, el ingrediente activo de la composición es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o variantes y derivados de los mismos, de acuerdo con la presente invención. Como tal, puede ser susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. Así, cuando la composición se administra por una vía que utiliza el tracto gastrointestinal, la composición puede contener agentes que protegen al anticuerpo de la degradación, pero que liberan el anticuerpo una vez que se ha absorbido en el tracto gastrointestinal.

Una discusión minuciosa de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472.

Las composiciones farmacéuticas de la invención en general tienen un pH entre 5,5 y 8,5; en algunas realizaciones éste puede estar entre 6 y 8 y en otras realizaciones aproximadamente en 7. El pH puede mantenerse empleando una solución tampón. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se suministran en recipientes herméticamente sellados.

Dentro del alcance de la invención se encuentran composiciones en varias formas de administración; las formas incluyen, pero no se limitan a, aquellas formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo por inyección o infusión, por ejemplo por inyección de bolo o infusión continua. Cuando el producto es para la inyección o infusión, puede tener forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes formuladores, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca para su reconstitución antes del uso con un líquido estéril apropiado. Un vehículo se entiende típicamente como un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, el vehículo puede ser un líquido fisiológicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmacéuticamente activo, en particular los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. En una realización, las composiciones se adaptan para la administración a mamíferos, por ejemplo sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por cualquier número de vías, incluyendo, pero sin limitarse a, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal, rectal. También pueden emplearse hiporocíos para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Preferentemente, la composición farmacéutica se puede preparar para la administración oral, por ejemplo como comprimidos, cápsulas y similares, para la administración tópica o como inyectable, por ejemplo como soluciones o suspensiones líquidas, siendo particularmente preferente que la composición farmacéutica sea inyectable. Las formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección también pueden ser preferentes, por ejemplo la composición farmacéutica en forma liofilizada.

Para la inyección, por ejemplo intravenosa, cutánea o subcutánea, o para la inyección en el sitio de afección, el ingrediente activo preferentemente está en forma de solución acuosa parenteralmente libre de pirógenos y con un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. El experto en la técnica es capaz de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer-Lactato.Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, soluciones tampón, antioxidantes y/u otros aditivos si es necesario. Si un polipéptido, péptido o molécula de ácido nucleico, otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente invención se administra a un individuo, preferentemente la administración es en una “cantidad profilácticamente efectiva” o en una cantidad “terapéuticamente efectiva” (según el caso) que sea suficiente para beneficiar al individuo. La cantidad actual administrada y la velocidad y el tiempo de administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se trata. Para la inyección, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede proporcionar por ejemplo en una jeringa pre-cargada.

La composición farmacéutica inventiva como se define anteriormente también se puede administrar vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En caso de comprimidos para uso oral, los vehículos comúnmente utilizados incluyen lactosa o almidón de maíz. Normalmente también se añaden agentes lubricantes, como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo, es decir el anticuerpo inventivo o un fragmento de unión a antígeno del mismo se define anteriormente se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden agregar ciertos agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.

La composición farmacéutica inventiva también se puede administrar vía tópica, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por la aplicación tópica, incluyendo por ejemplo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos. Para aplicaciones tópicas, la composición farmacéutica inventiva se puede formular en un ungüento adecuado que contiene la composición farmacéutica inventiva, en particular sus componentes como se definen anteriormente, suspendidos o disueltos en uno o más vehículos. Vehículos para la administración tópica incluyen, pero no se limitan a, aceites minerales, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsificante y agua. Alternativamente, la composición farmacéutica inventiva se puede formular en una loción o crema adecuada. En el contexto de la presente invención, vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceites minerales, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, ceras de cetil ésteres, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa multi-dosis, siendo preferente en el contexto de la presente invención un programa multi-dosis. Los agentes farmacéuticos basados en anticuerpos conocidos, en particular agentes farmacéuticos basados en anti-HBV, por ejemplo HepatectMR CP, proporcionan una guía con respecto a la frecuencia de administración, en particular con respecto a diferentes indicaciones, por ejemplo si un agente farmacéutico se debe suministrar diario, semanalmente, mensualmente, etc. La frecuencia y dosificación puede depender de la gravedad de los síntomas.

Por ejemplo, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar a diario, por ejemplo una o varias veces al día, por ejemplo una, dos, tres o cuatro veces al día, preferentemente una o dos veces al día, de manera más preferente una vez al día, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 o más días, por ejemplo diariamente durante 1,2, 3, 4, 5, 6 meses. Preferentemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar semanalmente, por ejemplo una o dos veces a la semana, durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 o más semanas, por ejemplo semanalmente durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o semanalmente durante 2, 3, 4, o 5 años. Además, preferentemente la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar mensualmente, por ejemplo una vez al mes o, de manera más preferente, cada dos meses, durante 1, 2, 3, 4 o 5 o más años. Un punto final preferente de la administración es cuando se logra la seroconversión, preferentemente el punto final de la terapia es la desaparición persistente de HBsAg del suero, acompañada por seroconversión a anticuerpos anti-HBV. También es preferente que la administración continúe durante toda la vida. Además, también se prevé una sola administración, en particular con respecto a ciertas indicaciones, por ejemplo para la prevención de la hepatitis B en caso de exposición accidental, en sujetos no inmunizados.

En particular, se prefiere que, para una sola dosis, por ejemplo una dosis diaria, semanal o mensual, preferentemente para una dosis semanal, la cantidad de anticuerpo o de fragmento de unión a antígeno del mismo en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención no exceda 1 g, de manera preferente no exceda 500 mg, de manera más preferente no exceda 250 mg, de manera aún más preferente no exceda 100 mg y con particular preferencia no exceda 50 mg.

Las composiciones farmacéuticas incluyen típicamente una cantidad “efectiva” de uno o más anticuerpos de la invención, es decir una cantidad que es suficiente para tratar, mejorar, atenuar o prevenir una enfermedad o afección deseada, o para facilitar un efecto terapéutico detectable. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción o atenuación de la potencia patogénica o de síntomas físicos. La cantidad efectiva precisa para cualquier sujeto particular dependerá de su tamaño, peso y salud, de la naturaleza y grado de la afección y de los agentes terapéuticos o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para la administración. La cantidad efectiva para una situación dada se determina mediante experimentos de rutina y está dentro del juicio médico. Para propósitos de la presente invención, en general una cantidad efectiva será de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 100 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 0,0075 a aproximadamente 50 mg/kg, de manera más preferente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg y de manera aún más preferente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 5 mg/kg del anticuerpo de la presente invención (por ejemplo cantidad del anticuerpo en la composición farmacéutica) en relación con el peso corporal (por ejemplo, en kg) del individuo al cual se administra.

Por ejemplo, en el contexto del trasplante de hígado, por ejemplo debido a insuficiente hepática inducida por hepatitis B, la cantidad de anticuerpo o de fragmento de unión a antígeno del mismo en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención preferentemente puede no exceder 50 mg, de manera más preferente no más de 10 mg, para una sola dosis el día del trasplante, peri-operativamente entonces no más de 10 - 50 mg, de manera preferente no más de 2 - 10 mg, al día durante siete días y no más de 10 - 50 mg, de manera preferente no más de 2 - 10 mg, por una dosis administrada cada 1 - 3 meses para mantener niveles en suero de anti-HB aproximadamente en 100 IU/L.

Para el tratamiento de la hepatitis B crónica, por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención preferentemente se administra subcutáneamente con una sola dosis de hasta 500 mg, preferentemente de hasta 250 mg, de manera más preferente de hasta 100 mg del anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Esta dosis individual se puede administrar a diario, semanalmente o mensualmente como se describe anteriormente.

Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también puede comprender un componente activo adicional, que puede ser un anticuerpo adicional o un componente no anticuerpo. Preferentemente, el componente activo adicional se selecciona de inhibidores de polimerasa, interferones y/o inhibidores de punto de regulación. Los inhibidores de polimerasa preferidos incluyen Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina y Tenofovir. Los inhibidores de polimerasa suprimen la transcripción y la síntesis inversa de la hebra ADN-plus. Los inhibidores de polimerasa no previenen la propagación viral, la formación de cccADN y no afectan a la liberación de HBsAg. Los interferones incluyen IFNalfa y IFNbeta, siendo IFNbeta preferente. Los inhibidores de punto de regulación preferidos se dirigen a un bloqueo de PD-1/PD-L1 y/o de CTLA4 y así incluyen anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y anticuerpos anti-CTLA4. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más componentes activos adicionales.

El anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la presente invención puede estar presente ya sea en la misma composición farmacéutica que el componente activo adicional o, de manera preferente, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la presente invención está comprendido en una primera composición farmacéutica y el componente activo adicional está comprendido en una segunda composición farmacéutica diferente de la primera composición farmacéutica. Por consiguiente, si se prevé más de un componente activo adicional, cada componente activo adicional y el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la presente invención preferentemente está en una composición farmacéutica diferente. Estas composiciones farmacéuticas diferentes se pueden administrar bien combinadas/simultáneamente o bien en tiempos separados o en ubicaciones separadas (por ejemplo partes individuales del cuerpo).

Preferentemente, el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno de acuerdo con la presente invención y el componente activo adicional proporcionan un efecto terapéutico aditivo o, preferentemente, un efecto terapéutico sinérgico. El término “sinergia” se utiliza para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Así, cuando el efecto combinado de dos o más agentes da como resultado la “inhibición sinérgica” de una actividad o proceso, se propone que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término “efecto terapéutico sinérgico” se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias donde el efecto terapéutico (tal como es medido por cualquiera de un número de parámetros) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con las terapias individuales respectivas.

Es preferente una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con gHCB34 o un fragmento de enlace a antígeno del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización, una composición de la invención puede incluir anticuerpos de la invención donde los anticuerpos pueden constituir al menos el 50% en peso (por ejemplo el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) de la proteína total en la composición. En esta composición, preferentemente los anticuerpos están en forma purificada.

También se describe aquí un método para preparar una composición farmacéutica que comprende los pasos de: (i) preparar un anticuerpo de la invención; y (ii) administrar el anticuerpo purificado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

En otra realización, un método para preparar una composición farmacéutica comprende el paso de: mezclar un anticuerpo con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal que se obtuvo de una célula B transformada o una célula plasmática cultivada de la invención.

Como una alternativa para suministrar anticuerpos o células B con propósitos terapéuticos, es posible suministrar ácidos nucleicos (típicamente ADN) que codifican el anticuerpo monoclonal (o fragmentos activos del mismo) de interés derivado de células B o de células plasmáticas cultivadas a un sujeto, de forma que el ácido nucleico se puede expresar en el sujeto in situ para proporcionar un efecto terapéutico deseado. La terapia génica adecuada y los vectores de suministro de ácidos nucleicos son conocidos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un agente antimicrobiano, en particular si se envasa en un formato multi-dosis. Puede comprender un tensioactivo, por ejemplo Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Generalmente los tensioactivos están presentes en niveles bajos, por ejemplo menos del 0,01%. Las composiciones también pueden incluir sales de sodio (por ejemplo cloruro de sodio) para dar tonicidad. Por ejemplo, una concentración de 10 ± 2mg/ml de NaCl es típica.

Además, las compasiones farmacéuticas pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sacarosa o trehalosa), por ejemplo aproximadamente 15-30 mg/ml (por ejemplo 25 mg/ml), en particular si se van a liofilizar o si incluyen material que ha sido reconstituido del material liofilizado. El pH de una composición para liofilización se puede ajustar entre 5 y 8 o entre 5,5 y 7 o a aproximadamente 6,1 antes de la liofilización.

Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunoreguladores. En una realización, uno o más de los agentes inmunoreguladores incluye un adyuvante.

Tratamientos Médicos y Usos

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención en (i) la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o la hepatitis D; o en (ii) la diagnosis de la hepatitis B y/o la hepatitis D.

Dentro del alcance de la invención están varias formas y vías de administración del anticuerpo, o del fragmento de enlace a antígeno del mismo, del ácido nucleico, del vector, de la célula o de la composición farmacéutica, como se describe anteriormente con respecto a la composición farmacéutica. Esto se aplica también al contexto del uso del anticuerpo, o del fragmento de enlace a antígeno del mismo, del ácido nucleico, del vector y de la célula como se describe aquí, en particular con respecto a las formas preferentes y las vías de administración.

Los métodos de diagnosis pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Estas muestras se pueden aislar de un sujeto, por ejemplo una muestra de tejido aislada tomada de, por ejemplo, los orificios nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, orejas, ojos, placenta, tracto digestivo, corazón, ovarios, pituitaria, células suprarrenales, tiroides, cerebro, piel o sangre, preferentemente de suero. Los métodos de diagnosis también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo, en particular después del contacto de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Este paso de detección se lleva a cabo típicamente en el laboratorio, es decir sin contacto con el cuerpo humano o animal. Ejemplos de métodos de detección son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente de unión a enzimas).

La invención también proporciona el uso de (i) un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o variantes y derivados del mismo de acuerdo con la invención, (ii) un clon de células B inmortalizadas de acuerdo con la invención, (iii) un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la presente invención o (iv) una composición farmacéutica de la invención (a) para su uso para la prevención, tratamiento o atenuación de la hepatitis B y/o la hepatitis D o para (b) la diagnosis in vitro de la hepatitis B y/o la hepatitis D.

La invención también proporciona el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para el uso como un medicamento, en particular para la prevención o tratamiento de hepatitis B y/o hepatitis D. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un humano. Una forma de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorear los síntomas de la enfermedad después de la administración de la composición de la invención. El tratamiento puede ser un programa de dosis única o un programa multi-dosis.

En una realización, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, clon de células B inmortalizadas o composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra a un sujeto que necesite este tratamiento. Este sujeto incluye, pero no se limita a, aquel particularmente en riesgo o susceptible a hepatitis B y/o hepatitis D.

Los anticuerpos, o fragmentos de enlace a antígeno de los mismos, de acuerdo con la presente invención también se puede utilizar en un kit para la diagnosis de la hepatitis B y/o D. Además, el epítopo en la región bucle antigénica de HBsAg, que es capaz de enlazar un anticuerpo de la invención como se describe aquí, se puede utilizar en un kit para monitorear la eficacia de los procedimientos de aplicación detectando la presencia o determinando el título de anticuerpos anti-HBV protectores.

Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en el tratamiento o atenuación de la hepatitis B crónica.

Es de señalar que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención (i) neutraliza potentemente la infección por HBV, (ii) se enlaza a L-HBsAg (la proteína de envoltura HBV grande, presente en las partículas de HBV infecciosas), previniendo así la propagación de HBV, (iii) se enlaza a S-HBsAg, promoviendo así la eliminación de partículas subvirales (SVP) y (iv) puede inducir la seroconversión, es decir una respuesta inmunitaria activa al virus.

Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en la prevención de la (re-)infección por hepatitis B después del trasplante hepático, en particular para la insuficiencia hepática inducida por hepatitis B.

Para este fin, preferentemente se puede administrar una dosis alta al paciente que recibe un trasplante de hígado el día del trasplante y dosis diarias peri-operativamente durante aproximadamente una semana. Después, preferentemente se pueden administrar dosis adicionales cada 1-3 meses para mantener los niveles en suero del anticuerpo anti-HBV por encima de 100 lU/ml.

En otra realización preferente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en la prevención/profilaxis de la hepatitis B en sujetos no inmunizados. Esto es, por ejemplo en caso de una exposición accidental (asumida) a h Bv (profilaxis pos-exposición). El término “sujetos no inmunizados” incluye sujetos que nunca recibieron una vacunación y, por ello, no están inmunizados, y sujetos que no mostraron una respuesta inmune (anticuerpos anti-hepatitis B no medibles) después de la vacunación. En particular en el último grupo, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en la prevención (continua) de la hepatitis B, es decir en contraste con la “profilaxis pos-exposición”, la prevención (continua) es preferentemente para estos sujetos que no mostraron una respuesta inmune (anticuerpos anti-hepatitis B no medibles) después de la vacunación y para quienes es necesaria la prevención continua.

Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en la profilaxis de la hepatitis B en pacientes hemodializados.

Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en la prevención de la hepatitis B en el recién nacido. Así, son preferentes en particular los recién nacidos de madres portadoras del virus de la hepatitis B/madres no inmunizadas. Además, es preferente que el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administre al nacimiento o tan pronto como sea posible después del nacimiento. De manera preferente, la administración se puede repetir hasta la seroconversión después de la vacunación.

Preferentemente, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se utiliza en el tratamiento o la atenuación de la hepatitis D, preferentemente de la hepatitis B y de la hepatitis D, que, en particular, es una comorbilidad de la hepatitis B y hepatitis D. Es de señalar que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención no solo neutraliza potencialmente el virus de la hepatitis B virus, sino también el virus de la hepatitis delta. Por tanto, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede proporcionar un primer tratamiento de la hepatitis D.

Terapia de combinación

La administración del anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención en los métodos y usos según la invención se puede llevar a cabo de forma individual o en combinación con un co-agente (también referido aquí como “componente activo adicional”) útil para tratar y/o estabilizar la enfermedad o trastorno que se trata o reprime.

La invención abarca la administración del anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, donde la administración al sujeto se realiza antes de, simultáneamente o secuencialmente a otros regímenes terapéuticos o co-agentes útiles para tratar y/o prevenir la hepatitis B. Dichos anticuerpo, ácido nucleico, vector, célula o composición farmacéutica, cuando se administra simultáneamente con co-agentes, se puede administrar en la misma o diferente(s) composición(es) y por la misma o diferente vía de administración.

Dichos otros regímenes terapéuticos o co-agentes se pueden seleccionar del grupo consistente de inhibidores de la polimerasa, interferones y/o inhibidores de punto de regulación.

Así, en otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administra en combinación con un inhibidor de la polimerasa, un interferón y/o un inhibidor de punto de regulación para los usos (médicos) arriba descritos.

Inhibidores de la polimerasa preferentes incluyen Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina y Tenofovir. La Lamivudina es el inhibidor de la polimerasa especialmente preferente. Los inhibidores de la polimerasa suprimen la transcripción inversa y la síntesis de la hebra de ADN plus. Los inhibidores de la polimerasa no previenen la propagación viral, la formación de cccADN y no afectan a la liberación de HBsAg.

Los interferones incluyen IFNalfa e IFNbeta, siendo preferente IFNbeta.

Inhibidores de punto de regulación preferentes se dirigen a un bloqueo de PD-1/PD-L1 y/o de CTLA4 y, así, incluyen anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y anticuerpos anti-CTLA4. De esta manera, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más de los componentes activos adicionales.

Otros co-agentes preferentes adicionales (compuestos activos adicionales) que se administra en combinación con el anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención incluyen agonistas LTpR.

Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se administra en combinación con un inhibidor de la polimerasa. Esto se aplica en particular para un uso de esta combinación en la profilaxis, tratamiento o atenuación de la hepatitis B y/o D. En este contexto, los inhibidores de la polimerasa preferentes incluyen Lamivudina, Adefovir, Entecavir, Telbivudina y Tenofovir. El inhibidor de polimerasa especialmente preferente es lamivudina.

Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica se administran por la misma o diferente vía de administración que el inhibidor de la polimerasa, el interferón y/o el inhibidor de punto de regulación.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona así también una combinación de

i) el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el vector de acuerdo con la presente invención, la célula de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención; y

ii) un inhibidor de la polimerasa, un interferón y/o un inhibidor de punto de regulación.

Preferentemente, esta combinación se utiliza en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o D, en particular en el tratamiento o atenuación de la hepatitis B crónica y/o la hepatitis D crónica. De manera más preferente, la combinación se utiliza en pacientes mono-infectados con HBV o en pacientes co-infectados con HBV/HDV.

Esta combinación preferentemente acelera la eliminación de HBsAg.

En vista de ello, la presente invención también proporciona un kit que comprende

Además, el kit puede comprender medios para la administración del anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, tal como una jeringa o un recipiente, y/o un folleto, por ejemplo con instrucciones sobre el uso del anticuerpo, o del fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención y/o del inhibidor de la polimerasa, del interferón y/o del inhibidor de punto de regulación.

El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno, de acuerdo con la presente invención puede estar presente ya sea en la misma composición farmacéutica que el componente activo adicional (co-agente) o, preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno, de acuerdo con la presente invención está comprendido en una primera composición farmacéutica y el componente activo adicional (co-agente) está comprendido en una segunda composición farmacéutica diferente de la primera composición farmacéutica. Por consiguiente, cuando se prevé más de un componente activo adicional (co-agente), cada componente activo adicional (co-agente) y el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno, de acuerdo con la presente invención preferentemente están comprendidos en diferentes composiciones farmacéuticas. Estas composiciones farmacéuticas diferentes se pueden administrar bien combinadas/simultáneamente o en momentos separados o en ubicaciones separadas (por ejemplo partes individuales del cuerpo).

Preferentemente, el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno, de acuerdo con la presente invención y el componente activo adicional (co-agente) proporcionan un efecto terapéutico aditivo o, preferentemente, un efecto terapéutico sinérgico. Como se describe anteriormente, el término “sinergia” se utiliza para describir un efecto combinado de dos o más agentes activos que es mayor que la suma de los efectos individuales de cada agente activo respectivo. Así, cuando el efecto combinado de dos o más agentes da como resultado la “inhibición sinérgica” de una actividad o proceso, se propone que la inhibición de la actividad o proceso sea mayor que la suma de los efectos inhibidores de cada agente activo respectivo. El término “efecto terapéutico sinérgico” se refiere a un efecto terapéutico observado con una combinación de dos o más terapias, donde el efecto terapéutico (como es medido por cualquiera de diversos parámetros) es mayor que la suma de los efectos terapéuticos individuales observados con las terapias individuales respectivas.

Usos y métodos

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para monitorear la calidad de las vacunas anti-hepatitis-B o anti-hepatitis-D verificando que el antígeno de la vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta.

Además, la presente invención también proporciona el uso del anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención en la diagnosis de la hepatitis B y/o de la hepatitis D.

Además, también se proporciona el uso del anticuerpo, o de un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la presente invención, del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, del vector de acuerdo con la presente invención, de la célula de acuerdo con la presente invención o de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención para determinar si una muestra de sangre aislada está infectada con el virus de la hepatitis B y/o con el virus de hepatitis delta.

Como se describe anteriormente, los métodos para la diagnosis pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Estas muestras se pueden aislar de un sujeto, por ejemplo una muestra de tejido aislado tomada de, por ejemplo, los orificios nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oídos, ojos, placenta, tracto digestivo, corazón, ovarios, pituitaria, glándulas suprarrenales, tiroides, cerebro, piel o sangre, preferentemente suero. Los métodos de diagnosis in vitro también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo, en particular después del contacto con un anticuerpo o con un fragmento de anticuerpo con una muestra. Este paso de detección se lleva a cabo típicamente en el laboratorio, es decir, sin ningún contacto con el cuerpo humano o animal. Ejemplos de métodos de detección son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente de unión a enzimas).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

A continuación se proporciona una breve descripción de las figuras adjuntas. Las figuras se proponen para ilustrar la presente invención con más detalle.

Figura 1: muestra, para el ejemplo 1, el enlace del anticuerpo monoclona1HBC34 a tres serotipos HBsAg diferentes (adw, ady y ayw) tal como es medido por ELISA.

Figura 2: muestra, para el ejemplo 2, la capacidad de varios anticuerpos anti-HB, en particular inmunoglobulinas HBV (HBIG), HBC34 y otros anticuerpos monoclonales contra PreS1 (18/7) o HBsAg para neutralizar la infección por HBV de la célula HepaRG in vitro. Cada anticuerpo se sometió a prueba a tres concentraciones diferentes, en particular 5 pg/ml, 0,5 pg/ml y 0,05 pg/ml, excepto para HBIG, que se sometió a prueba a 5.000 pg/ml, 500 pg/ml y 50 pg/ml.

Figura 3: muestra, para el ejemplo 2, la tinción de HBcAg en células HepaRG infectadas en presencia de tres concentraciones diferentes (5 pg/ml, 0,5 pg/ml o 0,05 pg/ml) del anticuerpo monoclona1HBC34 y, como referencia, la tinción nuclear.

Figura 4: muestra, para el ejemplo 2, la actividad de neutralización de concentraciones diferentes de HBC34 en HDV infeccioso. En una concentración de 0,12 pg/ml de HBC34 no fueron detectables células HDV positivas, indicando la neutralización potente de HDV. El HBIG, en contraste, no neutralizó el HDV (sometido a prueba a 1:1.000 en dilución, es decir 50 pg/ml).

Figura 5: muestra, para el ejemplo 3, las secuencias de aminoácidos del bucle antigénico de HBsAg de 10 genotipos HBV A, B. C. D, E, F, G, H, I y J. Estas secuencias comprenden el epítopo reconocido por el anticuerpo HBC34 (resaltado en gris). La secuencia en la parte superior (HBV-D J02203) se utilizó para diseñar la librería de péptidos del Ejemplo 5, Fig 7.

Figura 6: muestra, para el ejemplo 3, el enlace, como se determina por análisis citofluorométrico, del anticuerpo monoclonal humano HBC34 y un anticuerpo de control (ambos a 5 pg/ml) para células Hep2 permeabilizadas transfectadas de forma transitoria con plásmidos que expresan los diferentes genotipos HBsAg A, B, C, D, E, F, G, H, I y J como se indica en la Figura. Figura 7: muestra, para el ejemplo 4, las secuencias de aminoácidos del bucle antigénico de 19 mutantes HBsAg ensayados. Encerrados en círculos se muestran los residuos de los mutantes HBsAg que se enlazaron débilmente (círculo punteado) o no con el anticuerpo HBC34.

Figura 8: muestra, para el ejemplo 4, el enlace del anticuerpo monoclonal humano HBC34 y otros dos anticuerpos específicos de HBsAg (Ab5 y Ab6), todos ensayados a 5 pg/ml en células Hep2 transfectadas con plásmidos que expresan diferentes mutantes del genotipo D HBsAg como se indica en la Figura (“WT”: Genotipo D HBsAg, n° de acceso de Genbank FJ899792). Figura 9: muestra, para el ejemplo 5, el enlace de HBC34 a una librería de 650 péptidos lineales y en bucle como se determina utilizando la tecnología Pepscan, así como las secuencias de cuatro péptidos enlazados por HBC34. Los residuos indicados como 1 son cisteínas que se introdujeron para permitir la unión química a los andamios a fin de reconstruir los epítopos conformacionales. Si están presentes otras cisteínas además de las cisteínas recién introducidas, se reemplazan por alanina (residuos alanina subrayados).

Figura 10: muestra, para el ejemplo 5, una tinción de western blot para Ab4 y HBC34 en partículas virales HBV bajo condiciones reductoras. El Ab4 es un anticuerpo comparativo, que también es reactivo contra el bucle antigénico.

Figura 11: muestra, para el ejemplo 6, los niveles de viremia de HBV en ratones uPA/SCID humanizados inoculados con 5 x 107 copias de equivalentes de genoma HBV (genotipo D), que recibieron a partir de tres semanas tratamiento post-infección con HBC34 (a 1 mg/kg administrado i.p. dos veces a la semana), un anticuerpo de control (AB de control) o entecavir (ETV; administrado oralmente a 1 pg/ml) durante 6 semanas. En la fase de propagación de la infección por HBV (semanas 3 a 6 p.i. (post-infección)) se incrementó la viremia >2 log en el grupo que recibió el anticuerpo de control, mientras que los títulos de HBV disminuyeron en los ratones tratados con HBC34 o entecavir. Figura 12: muestra, para el ejemplo 6 , la tinción de hepatocitos para la presencia de HBsAg (análisis intrahepático) en los ratones del Ejemplo 6 al final del experimento (semana 9). Casi todos los hepatocitos se tiñeron con HBsAg positivo en ratones que recibieron el anticuerpo de control, mientras que la propagación se bloqueó de manera eficiente por ambos, el tratamiento con entecavir y el tratamiento con HBC34 (aproximadamente 1-5% de células HBsAg-positivas). Figura 13: muestra, para el ejemplo 6, las mediciones de cccADN, que no difirieron significativamente entre los ratones que se sacrificaron en 3 semanas post-infección por HBV (“3 semanas hbv”; es decir sin tratamiento) y los ratones que se trataron de la semana 3 a la semana 9 post-infección con HBC34 o entecavir. En contraste, la cantidad estimada de cccADN/célula se incrementó hasta 2 veces en el grupo que recibió el anticuerpo de control tras el sacrificio 9 semanas post-infección. Figura 14: muestra, para el ejemplo 6, los niveles de HBsAg circulantes en la línea base (BL), la semana 3 de tratamiento (semana 6 post-infección) y la semana 6 de tratamiento (semana 9 post-infección). Los niveles de HBsAg circulantes disminuyeron >1 log (y por debajo del límite de detección) en los ratones que recibieron HBC34, pero no en los ratones tratados con entecavir, mientras que los niveles de HBsAg se incrementaron >2 log (alcanzando niveles de 5.000-10.000 IU/ml) en el grupo de control.

Figura 15: muestra, para el ejemplo 7, el título de HBV (panel izquierdo) y los niveles de HBsAg circulantes (panel derecho) en una configuración de hepatitis B crónica en la línea base (BL), la semana 3 de tratamiento (semana 15 post-infección, “semana 3”) y la semana 6 de tratamiento (semana 18 post-infección, “semana 6”). El título HBV y los niveles de HBsAg circulantes disminuyeron en los ratones que recibieron HBC34 en la semana 3 y en la semana 6 de tratamiento. Las curvas individuales representan animales individuales. El anticuerpo de control: líneas punteadas, HBC34: líneas continuas.

Figura 16: muestra, para el ejemplo 8, el título de HBV (panel izquierdo) y el título de HDV (panel derecho) en ratones uPA/SCID repoblados con hepatocitos humanos primarios y co-infectados con un suero derivado de un paciente que contiene HDV-ARN y HBV-ADN. Se inició el tratamiento cinco semanas después de la infección con HBC34 o con un anticuerpo de control (“control”). El título de HBV (panel izquierdo) y el título de HDV (panel derecho) se muestran en la línea base (semana 3, semana 5BL), en la semana 3 de tratamiento (semana 8 post-infección - “semana 8”) y en la semana 6 del tratamiento (semana 11 post-infección - “semana 11”). Las curvas individuales representan animales individuales. Anticuerpo de control: línea punteada, HBC34: líneas continuas.

Figura 17: (parte 1) muestra, para el ejemplo 9, una representación esquemática del bucle antigénico de HBV-s-Antígeno, el epítopo de HBC34 se resalta en gris. Para mapear el epítopo de HBC34, se sometió a prueba una librería de 1.520 péptidos diferentes como se determina utilizando la tecnología Pepscan. La Figura 17 (parte 2-5) muestra, para el ejemplo 9, la magnitud del enlace (intensidades ELISA) de HBC34 a 16 conjuntos diferentes de péptidos. El HBC34 se enlaza a un epítopo conformacional, como se demuestra por el enlace a los péptidos de los conjuntos 13-16 compuestos de constructos CLIPS de combinación, que representan dos partes de un epítopo discontinuo (parte 2) y a péptidos de los conjuntos 9-12 compuestos de péptidos bucle (parte 3). No se observa enlace de HBC34 con los conjuntos de péptidos lineales 1-4 (parte 4) y 5-8 (parte 5), apoyando adicionalmente la idea de que HBC34 se enlaza a un epítopo conformacional discontinuo.

Figura 18: muestra, para el ejemplo 9, el enlace de HBC34 a una librería de péptidos compuesta por 812 péptidos CLIPS t 3 discontinuos o en bucle. A fin de afinar el mapeo del epítopo descrito en la Figura 17, se generaron 3 conjuntos de péptidos (llamados RN1, RN2 y RN3) basados en los conjuntos previos (Figura 17) por análisis de sustitución completa. La Figura 18 muestra el enlace de HBC34 para los conjuntos 1-3 donde los residuos en las posiciones encasilladas se sustituyeron por uno de 13 aminoácidos seleccionados de la serie AEFGHKLPQRSVY_, donde “_ ” representa la supresión de un residuo. El residuo original en la posición permutada se indica en la izquierda de cada panel, (i) en la secuencia horizontalmente encasillada (cuando el aminoácido original es parte de las series de permutación) o (ii) por debajo de la secuencia (cuando el aminoácido original no es parte de la serie de permutación).

Figura 19: muestra, para el ejemplo 10, el efecto de una terapia de combinación con HBC34 (1 mg/kg i.p dos veces a la semana) y Lamivudina (complementada a 0,4 mg/ml en agua de beber) en reducir los niveles de la viremia HBV (panel A) y el HBV-s-Antígeno circulante (panel B) en ratones uPA/SCID humanizados inoculados con 2 x 109 copias de equivalentes de genoma HBV (genotipo D), que recibieron durante 4 semanas tras 8 semanas de la post-infección tratamiento con un anticuerpo de control (control), con HBC34 solo (HBC34), con lamivudina sola (Lamivudina) o con un tratamiento combinado (HBC34 y lamivudina). La terapia de combinación provocó una mayor reducción de la viremia que con cualquiera de los fármacos solos.

Figura 20: muestra, para los ejemplos 11 y 12, las alineaciones de los dos conjuntos de secuencias VH (panel A) y VL (panel B) generadas para obtener las variantes de anticuerpos 1-32. La CDR (definidas de acuerdo con IMGT) se resaltan en gris.

Figura 21: muestra, para el ejemplo 11, el enlace de 18 variantes de HBC34 modificadas (obtenidas combinando las secuencias VH y VL mutadas como se indica en las columnas 2 y 3) a HBsAg (subtipo adw) como se determina por el ELISA. En la columna 4, se indica la pérdida de enlace con “-”, el enlace fuertemente reducido se indica con “+/-”, el enlace reducido se indica con “+/~”, el enlace similar o igual al anticuerpo original se indica con “+”.

Figura 22: muestra, para el ejemplo 11, el enlace de 8 variantes modificadas por ingeniería diferentes de HBC34 a HBsAg (adw) como se determina en el ensayo ELISA basado en antígeno directo. Estas 8 variantes se seleccionaron entre los 18 mutantes HBC34 descritos en la Figura 21; con el fin de caracterizar mejor la afinidad de HBsAg, los 8 anticuerpos se titularon y se compararon con la secuencia de anticuerpos precursora.

Figura 23: muestra, para el ejemplo 11, el resumen de las características de los 8 anticuerpos descritos en la Figura 22. Se determinó EC50 ajustando las curvas de la Figura 22 utilizando el prisma Graphpad. La productividad se determinó por cuantificación (ELISA) de la IgG secretada en el sobrenadante de una transfección de 300 ml de 293 células Expi con cada una de las 8 variantes, así como del anticuerpo precursor.

Figura 24: muestra, para los ejemplos 11 y 12, una tabla que resume las características de 15 variantes, entre las cuales 12 variantes son adicionales modificadas genéticamente de HBC34 basadas en los resultados del conjunto previo introduciendo mutaciones adicionales en las estructuras (panel A). Las curvas de enlace se obtuvieron titulando los anticuerpos en el ensayo ELISA basado en antígenos y la EC50 se calculó ajustando las curvas con prisma Graphpad. Estas productividades se calcularon en base a la cuantificación de la IgG secretada en el sobrenadante de una transfección de 30 ml de 293 células Expi con cada una de las 15 variantes y el anticuerpo precursor. Los cambios en número de veces se representan y muestran en el panel B. Figura 25: muestra, para los ejemplos 11 y 12, el enlace, como se determina por análisis citofluorométrico, de HBC34 y las variantes 6, 7, 19.23 y 24. Todos los anticuerpos se titularon comenzando con 5 |jg/ml y se enlazaron a células Hep2 permeabilizadas transfectadas de forma transitoria con plásmidos que expresan los diferentes genotipos HBsAg A, B, C, D, E, F, G, H, I y J.

Ejemplos

A continuación, se indican ejemplos particulares que ilustran varias realizaciones y aspectos de la invención.

Ejemplo 1: Identificación y caracterización del anticuerpo monoclonal humano HBC34

Un anticuerpo monoclonal humano se aisló de un paciente humano de forma similar a como se describe en Traggiai E. y col., 2004, Nat Med 10(8): 871-5. El anticuerpo se caracterizó determinando las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de sus regiones variables (Tablas 2 y 3) y sus regiones determinadoras de complementariedad (CRD) y llamadas “HBC34”. Así, HBC34 es un anticuerpo monoclonal completamente humano tipo IgG1 con la CDR, las secuencias VH y VL mostradas anteriormente en las Tablas 2 y 3.

A continuación, se determinó al cual de los tres serotipos HBsAg adw, ady y ayw se enlaza el anticuerpo monoclonal humano HBC34. Es de resaltar que HBC34 se enlaza con alta afinidad a tres serotipos HBsAg (adw, ady y ayw) con valores EC50 similares y bajos, como es medido por ELISA (Figura 1).

Los títulos protectores de anticuerpos HBV se expresan en Unidades Internacionales (IU), lo que permite la estandarización sobre diferentes ensayos. En 1977, se estableció una Preparación de Referencia Internacional para la inmunoglobulina anti-HBs (W1042). El plasma utilizado en la preparación de este estándar se derivó de individuos que habían sido infectados naturalmente con el virus de hepatitis B (Barker, L. F., D. Lorenz, S. C. Rastogi, J. S. Finlayson, y E. B. Seligmann. 1977. Study of a proposed international reference preparation for antihepatitis B immunoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization technical report series. WHO Expert Committee on Biological Standardisation 29th Report BS 77.1 164. Ginebra, Suiza, World Health Organization, 1977; World Health Organization: Anti-hepatitis B immunoglobulin. WHO Tech Rep Ser 1978; 626:18). La actividad de HBC34, tal como se mide diagnósticamente con un inmunoensayo (inmunoensayo de diagnóstico Abbott Architect) es 5.000 IU/mg. Como comparación, la actividad de HBIG es ~ 1 IU/mg.

Ejemplo 2: El anticuerpo HBC34 neutraliza potencialmente los HBV y HDV infecciosos

El primer objetivo del Ejemplo 2 era determinar si HBC34 neutralizaba e1HBV infeccioso y comparar la actividad de neutralización de HBC34 a aquella de otros anticuerpos anti-HB. Para ello, células HepaRG diferenciadas se incubaron con una cantidad fija de HBV en presencia o ausencia de anticuerpos (HBC34, 18/7, Ab2, Ab3 y HBIG) en medio complementado con un 4% de PEG 8000 (Sigma-Aldrich) durante 16 horas a 37 °C. Al final de la incubación, las células se lavaron y se cultivaron adicionalmente. El medio se cambió cada 3 días. Se detectó la infección midiendo con el ensayo monoabsorbente de unión a enzimas (ELISA) los niveles del antígeno superficial de hepatitis B (HBsAg) y el antígeno de la hepatitis B (HBeAg) secretado en el sobrenadante del cultivo del día 7 a 11 post-infección y detectando la tinción de HBcAg en un ensayo de inmunofluorescencia.

Como se muestra en las Figuras 2 y 3, HBC34 neutralizó completamente la infección por HBV cuando se ensayó a 5 y 0,5 jg/ml, mientras que los anticuerpos anti-HB monoclonales humanos comparativos Ab2 y Ab3, que también se enlazan a HBsAg, no dieron como resultado una neutralización completa. Esto indica que no todos los anticuerpos que se enlazan a HBsAg son capaces de neutralizar la infección por HBV (por ejemplo Ab2 y Ab3). Cabe destacar que el HBIG neutralizó la infección por HBV solo cuando se ensayó a 5.000 y 500 jg/ml, es decir con una potencia 1.000 veces más baja en comparación con HBC34. 18/7 es un anticuerpo monoclonal murino contra la región pre-S1 de HBsAg.

El segundo objetivo del Ejemplo 2 era determinar la actividad neutralizante de HBC34 contra HDV en células HepaRg diferenciadas. Se utilizaron sueros portadores HDV como inóculo de infección de HDV. La tinción de inmunofluorescencia del antígeno Delta se utilizó como lectura. Como se muestra en la Figura 4, HBC34 bloqueó completamente la infección por HDV cuando ensayó a 0,12 jg/ml. Como comparación, HBIG también se ensayó y resultó ineficaz (sometido a prueba a 1/1.000, es decir 50 jg/ml).

Ejemplo 3: El anticuerpo HBC34 reconoce todos los 10 genotipos de HBV A, B, C, D, E, F, G, H, I y J Se ensayó HBC34 para su capacidad de reconocer los 10 genotipos de HBV A, B, C, D, E, F, G, H, I y J (como se muestran en la Figura 5) por análisis de citometría de flujo. En particular, células epiteliales humanas (células Hep2) se transfectaron con plásmidos que expresan en cada caso HBsAg de los 10 genotipos de HBV A, B, C, D, E, F, G, H, I y J (como se muestra en la Figura 5). El anticuerpo monoclonal humano HBC34 (5 pg/ml) y un anticuerpo de control (5 pg/ml) se utilizaron para la tinción de células permeabilizadas transfectadas de forma transitoria. Dos días después de la transfección, las células Hep2 se recolectaron, se fijaron y se permeabilizaron con saponina para la inmunotinción con HBC34 o un Ab de control. El enlace de los anticuerpos a las células transfectadas se analizó utilizando un Becton Dickinson FACSCanto2 (BD Biosciences) con software FlowJo (TreeStar). Como se muestra en la Figura 6, el HBC34 reconoció los 10 genotipos HBV HBsAg con patrones similares de tinción.

Ejemplo 4: El anticuerpo HBC34 reconoce todos los mutantes HBsAg funcionales

Se ensayó HBC34 para su capacidad de enlazarse a los 19 mutantes del genotipo D HBsAg diferentes (basados en el Genotipo D HBsAg, número de acceso de Genbank FJ899792, como se muestra en la Figura 7) HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg T123N/C124R, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R y HBsAg N146A (ver las SEQ ID NO 16 - 33 para las secuencias de aminoácidos de las regiones bucle antigénicas de esos mutantes) por análisis de citometría de flujo. En particular, células epiteliales humanas (células Hep2) se transfectaron con plásmidos que expresan los diferentes mutantes HBsAg y se analizaron como en el Ejemplo 3. 5 pg/ml del anticuerpo monoclonal humano HBC34 y dos de otros anticuerpos específicos de HBsAg (Ab5 y Ab6) se utilizaron para probar el enlace de HBC34 a las células Hep2 transfectadas.

Como se muestra en la Figura 8, se encontró que el HBC34 se enlaza a 18 de los 19 mutantes HBsAg. El enlace a HBC34, pero no el enlace a Ab5 y Ab6 , se anuló completamente solo en e1HBsAg T123N/C124R mutante, es decir cuando ambos residuos 123 y 124 se mutaron. Cabe destacar que la mutación de estos dos residuos (es decir T123 y C124) en la alanina demostró estar asociada con una pérdida de infectividad de HBV, que es mucho más probable debido a la pérdida del puente disulfuro formado por C124, que podría dar por resultado un cambio conformacional en el bucle antigénico (Salisse J. and Sureau C., 2009, JouARNl of Virology 83: 9321-9328). Así, el anticuerpo monoclonal humano HBC34 se enlaza a 18 mutantes HBsAg.

Ejemplo 5: El anticuerpo HBC34 se enlaza a un epítopo conformacional conservado en el bucle antigénico

El epítopo reconocido por HBC34 se identificó utilizando una librería de 650 péptidos lineales y en bucle (“CLIPS Discontinuous Epitope Mapping” tecnología de Pepscan, Lelystad, Los Países Bajos) diseñada para abarcar la región bucle antigénica completa del HBsAg. Los péptidos CLIPS lineales se sintetizaron según la química Fmoc estándar. Los péptidos bucle se sintetizaron en los esqueletos químicos para reconstruir los epítopos conformacionales utilizando la tecnología de Chemically Linked Peptides on Scaffolds, CLIPS, como se describe en Timmerman y col., 2007, Journal of Molecular Recognition 20: 283-99. Por ejemplo, se sintetizaron péptidos bucle individuales que contenían dos cisteínas y se varió el tamaño de los bucles introduciendo residuos cisteína en espacios variables. Si estaban presentes otras cisteínas además de las cisteínas recién introducidas, éstas se reemplazan por alanina. Las cadenas laterales de las diversas cisteínas en los péptidos se acoplan a las plantillas CLIPS por reacción en tarjetas PEPSCAN de polipropileno, con formato de tarjeta de crédito (455 formatos peptídicos/tarjeta) con una solución 0,5 mM de una plantilla CLIPS, tal como 1,3-bis(bromomotil)benceno en bicarbonato de amonio. El enlace del anticuerpo a cada péptido se ensaya en un ELISA basado en PEPSCAN. Las tarjetas de polipropileno con formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos que contienen los péptidos unidos covalentemente se incuban con el anticuerpo de ensayo (a 1 pg/ml) en solución de bloqueo. Después de lavar el sustrato, se añadió peroxidasa 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolin sulfonato (ABTS) y 2 pl de H2O2 al 3%. Pasada una hora, se midió el desarrollo de color con una cámara acoplada carga (CCD) y un sistema de procesamiento de imagen. Los datos en bruto son valores ópticos y varían de 0 a 3.000 (una escala logarítmica similar de 1 a 3 de un lector ELISA de placa de 86 pocillos estándar).

Como se muestra en la Figura 9, se encontró que el HBC34 reconocía un péptido en bucle doble con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 52:

XGSSTTSTGPCRTCMTXPSDGNATAIPIPSSWX

donde los residuos codificados como X se sustituyeron por cisteínas y los residuos subrayados se sustituyeron de C a A (SEQ ID NO 52).

Se reconocieron tres péptidos adicionales con una señal más baja:

a) un péptido lineal de 15-mer con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 53:

TSTGPCRTCMTTAQG (SEQ ID NO 53),

b) otro péptido lineal con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 54:

MLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTT (SEQ ID NO 54) y

(c) un péptido en bucle doble con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 55:

XSMYPSASATKPSDGNXTGPCRTCMTTAQGTSX, donde los residuos codificados como X se sustituyeron con cisteínas y los residuos subrayados se sustituyeron de C a A (SEQ ID NO 55).

Este análisis indicaba que el epítopo del núcleo de HBC34 está formado por un epítopo conformacional formado por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 56:

PCRTCMTTAQG (SEQ ID NO 56; aminoácidos 120 - 130 del dominio S de HBsAg (HBV-D J02203).

Además, como se muestra en la Figura 10, el anticuerpo monoclonal humano HBC34 no reaccionaba en absoluto en un análisis western blot con partículas virales HBV bajo condiciones reductoras.

Estos resultados confirman que el epítopo de HBsAg, al cual el HBC34 se enlaza, es un epítopo conformacional.

Estos resultados son consistentes con aquellos observados en el Ejemplo 4, donde el enlace a HBC34 se pierde en presencia de las mutaciones T123N/C124R.

La región de HBsAg que comprende el epítopo conformacional al cual se enlaza HBC34 es polimórfica en los diferentes genotipos HBV. En la siguiente secuencia genérica de la región del epítopo de HBsAg los residuos mutados en los diferentes genotipos se indican con una X:

PCX1TCX2X3X4AQG,

donde X1 preferentemente es R o K,

X2 preferentemente es M o T,

X3 preferentemente es T o I, y

X4 preferentemente es T, P o L

(SEQ ID NO: 57).

Además, una comparación adicional de la secuencia anterior con los 18 mutantes HBsAg a los cuales se enlaza el anticuerpo monoclonal humano HBC34 indica que el HBC34 se enlaza a un epítopo formado por una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2:

X1X2X3TCX4X5X6AX7G

donde X1 es P, T o S,

X2 es C o S,

X3 es R, K, D o I,

X4 es M o T,

X5 es T, A o I,

X6 es T, P o L, y

X7 es Q, H o L.

Ejemplo 6: La administración de HBC34 comenzando 3 semanas post-infección por HBV previene la propagación viral en ratones uPA humanizados

El objetivo del Ejemplo 6 era investigar si el anticuerpo monoclonal humano HBC34 era capaz de prevenir la propagación de HBV. En otras palabras, el objetivo era investigar la capacidad de entrada del anticuerpo HBC34 inhibidor para inhibir la infección de hepatocitos humanos in vivo tratando los ratones después de la infección inicial. Para ello, se utilizaron ratones uPA/SCID sin tratamiento previo repoblados con hepatocitos humanos primarios (ver Petersen y col. Nature Biotechnology, 2008, 26:335-341). Estos ratones se injertaron con hepatocitos humanos crioconservados por inyección intraesplénica. Ocho semanas después se determinó el éxito de la repoblación de los hepatocitos humanos en el hígado huésped midiendo la seroalbúmina humana, que se expresaba exclusivamente en los hepatocitos humanos trasplantados. Los ratones con niveles de albúmina humana apropiadas se inocularon i.p. con 5 x 107 copias de equivalente del genoma HBV (genotipo D, HBeAg positivo) para permitir la entrada viral. Tres semanas después de la infección, se inició el protocolo de tratamiento con el cual los ratones recibieron o bien el tratamiento de HBC34 (a 1 mg/kg administrado i.p. dos veces a la semana), o un anticuerpo de control o entecavir (ETV; administrado oralmente a 1 pg/ml en agua, Baraclude Solution, Bristol-Myers Squibb) durante 6 semanas. Las muestras de hígado extraídas tras sacrificio se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para un análisis de inmunofluorescencia.

El ADN de HBV se extrajo de las muestras de suero utilizando el kit QiAmp MinElute Virus spin (Qiagen, Hilden, Alemania). Se emplearon cebadores específicos de HBV y sondas de hibridación para determinar la viremia del ADN de HBV y las cargas de cccADN cuantitativamente tal como se describe previamente (Volz T y col., Gastroenterology 2007;133: 843-852). El ADN y el ARN se extrajeron de muestras de hígado utilizando el kit de Purificación Master Pure ADN (Epicentre, Biozym, Alemania) y el kit de purificación RNeasy ARN (Qiagen, Hilden, Alemania). Los valores de ADN de HBV intrahepáticos se normalizaron para los contenidos de ADN celular utilizando el kit gen de beta-globina (Roche ADN control Kit; Roche Diagnostics). Los niveles de ADNrc se estimaron extrayendo cantidades de cccADN del ADN total de HBV. Los ARN virales y los ARN genómicos se transcribieron de manera inversa utilizando los cebadores oligo-dT y el Transcriptor Kit (Roche Applied Science) y se cuantificaron utilizando cebadores específicos para los ARN virales totales. Los niveles de ARN de HBV se normalizaron a ARN GAPDH específico humano. La cuantificación de HBsAg de las muestras de sangre se llevó a cabo utilizando la plataforma Abbott Architect (quant. HBsAg kit, Abbott, Irlanda, Diagnostic Division), tal como recomienda el fabricante. Las secciones Cryostat de hígados de ratón quiméricos se inmunotiñeron utilizando citoqueratina-18 monoclonal específica humana (Dako, Glostrup, Dinamarca) para teñir los hepatocitos humanos. Para la detección del antígeno del núcleo HBV (HBcAg), se utilizó el anti-HBcAg de conejo policlonal. Las señales específicas se visualizaron empleando anticuerpos secundarios etiquetados con Alexa (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) o el Sistema TSA-Fluoresceína (HBcAg) (Perkin Elmer, Jügesheim, Alemania), mientras que la tinción nuclear se obtuvo con Hoechst 33342 (Invitrogen). Las secciones teñidas se analizaron por microscopía de fluorescencia.

El nivel medio de la línea base del ADN de HBV al inicio del tratamiento era 2 x 106 copias de ADN/ml. En la fase de propagación de la infección por HBV (semana 3 a semana 6 p.i. (post-infección)), la viremia se incrementó >2log en el grupo que recibió el anticuerpo de control, mientras que los títulos de HBV disminuyeron en los ratones tratados con HBC34 o entecavir (Figura 11).

Los ratones también se analizaron intrahepáticamente al final del experimento (es decir semana 9) tiñiendo los hepatocitos para la presencia de HBcAg. Casi todos los hepatocitos se tiñeron con HBcAg positivo en ratones que recibieron el anticuerpo de control, mientras que la propagación fue bloqueada eficientemente por ambos: el tratamiento con entecavir y el tratamiento con HBC34 (aproximadamente 1-5% de células HBcAg-positivas). Estos resultados indican que el HBC34 puede bloquear eficientemente la propagación viral durante la fase de aumento de la infección de HBV (Figura 12).

En línea con los datos histológicos y serológicos, las medidas de cccADN mostraron que las cargas de cccADN intrahepáticas no diferían significativamente entre los ratones que se sacrificaron 3 semanas pos-infección por HBV y los ratones que se trataron de la semana 3 a la semana 9 post-infección. En comparación, la cantidad estimada de cccADN/célula se incrementó hasta 2 log en el grupo de control sacrificado 9 semanas post infección, sugiriendo que los ADNrc recién formados no se podrían convertir eficientemente en cccADN en los ratones tratados (Figura 13). La misma tendencia también se encontró midiendo otros parámetros virales intrahepáticos, como los niveles del ADN circular relajado (ADNrc) y los transcriptos de HBV.

Además, se midieron los niveles de HBsAg circulante en sangre en la línea base (BL) la semana 3 de tratamiento (semana 6 post-infección) y la semana 6 de tratamiento (semana 9 post-infección). Cabe destacar que los niveles de HBsAg circulante disminuyeron >1 log (y por debajo del límite de detección) en los ratones que recibieron HBC34, pero no en los ratones tratados con entecavir, mientras que los niveles de HBsAg se incrementaron >2 log (alcanzando niveles de 5.000-10.000 lU/ml) en el grupo de control (Figura 14). La medida de HBsAg no se vio influida por la presencia del anticuerpo HBC34, tal como se determina en un experimento de enriquecimiento donde la adición del anticuerpo HBC34 a los sueros de ratones de HBsAg positivo no alteraba la medida esperada utilizando el inmunoensayo de diagnóstico Abbott Architect.

Estos resultados indican que el HBC34 puede bloquear la propagación viral por HBV y promueve la eliminación del HBsAg.

Ejemplo 7: La administración de HBC34 en ratones uPA humanizados infectados por HBV crónicos promovió la eliminación de HBV y HBsAg

Para imitar la configuración de la hepatitis B crónica, ratones uPA/SCID humanizados sin tratamiento previo se infectaron con HBV y, después de 12 semanas post-infección, se alcanzó un nivel medio de ADN de HBV de 2 x 109 copias/ml y un nivel de HBsAg de 10.000 IU/ml. Estos niveles son tan altos como los niveles que se observan comúnmente en pacientes humanos con infección por HBV crónica.

Después, los ratones se trataron comenzando desde la semana 12 post-infección ya sea con HBC34 o con un anticuerpo de control durante 6 semanas (1 mg/kg i.p. dos veces a la semana). Como se muestra en la Figura 15, el título de HBV y los niveles del HBsAg circulante en sangre disminuyeron en los ratones que recibieron HBC34 durante 3 semanas (semana 15 post-infección) y 6 semanas (semana 18 post-infección). Así, e1HBC34 promovía una reducción clara tanto de la viremia por HBV como de los niveles de HBsAg después de 6 semanas de tratamiento. HBeAg y los niveles de albúmina humano no se alteraron en los ratones tratados con HBC34, lo cual indica la ausencia de toxicidad hepática.

Ejemplo 8: La administración de HBC34 bloquea la infección por HDV in vivo

Ratones uPA/SCID humanizados sin tratamiento previo se co-infectaron con un suero derivado de un paciente que contenía HDV-ARN y HBV-ADN. Cinco semanas después de la inyección (cuando los títulos de HBV alcanzan niveles entre 107 a 109, y el ARN HDV alcanzaba niveles entre 103 a 106 copias/ml), los ratones se trataron con HBC34 o un anticuerpo de control durante 6 semanas (1 mg/kg i.p. dos veces a la semana).

Se midió la viremia de HBV ADN como se describe en los Ejemplos 6 y 7. La viremia de HDV se determinó mediante transcripción inversa del ARN viral (extraído de muestras de suero utilizando el kit QiAmp MinElute Virus Spin, Qiagen, Venlo, Los Países Bajos) y RT-PCR cuantitativa utilizando ABI Fast 1-Step Virus Master (Applied Biosystems, Carlsbad, EUA), cebadores específicos de HDV y sondas en un ABI Viia7 (Applied Biosystems, Carlsbad, EUA).

Como se muestra en la Figura 16, el HBC34 bloqueó de manera eficiente la propagación viral por HDV tanto a las 3 semanas como a las 6 semanas después del tratamiento (semanas 8 y 11, respectivamente). De forma similar a lo que se observó en ratones crónicamente infectados por HBV, e1HBC34 promovía una reducción de los títulos de ADN virales de HBV de 2 log (Figura 13).

Ejemplo 9: Mapeo fino del epítopo discontinuo HBC34

Para refinar adicionalmente el epítopo reconocido por el anticuerpo HBC34 descrito en el Ejemplo 5, se generó una nueva librería de 1.520 péptidos en 16 conjuntos diferentes:

- Conjunto 1 (llamado LIN15): Péptidos lineales de 15-mer derivados de la secuencia diana (SEQ ID NO: 5:

QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWA SARFSW; J02203 (D, ayw3)) con una compensación de un residuo. Los residuos Cys nativos están protegidos por un grupo acetamidometilo (también referido como “Acm”; indicado como “2” en las secuencias de aminoácidos respectivas).

- Conjunto 2 (llamado LIN22): Péptidos lineales de 22-mer derivados de la secuencia diana (SEQ ID NO: 5:

QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWA SARFSW; J02203 (D, ayw3)) con una compensación de un residuo. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 3 (llamado LIN30): Péptidos lineales de 30-mer derivados de la secuencia diana (SEQ ID NO: 5:

- Conjunto 4 (llamado LIN15.AA): Péptidos de conjunto 1, pero con los residuos en las posiciones 9 y 10 reemplazados por Ala. Cuando aparece un Ala nativo en cualquier posición, se reemplaza por Gly. - Conjunto 5 (llamado LIN22.AA): Péptidos de conjunto 2, pero los con residuos en las posiciones 12 y 13 reemplazado por Ala. Cuando aparece un Ala nativo en cualquier posición, se reemplaza por Gly. - Conjunto 6 (llamado LIN30.AA): Péptidos de conjunto 3, pero con los residuos en las posiciones 16 y 17 reemplazados por Ala. Cuando aparece un Ala nativo en cualquier posición, se reemplaza por Gly. - Conjunto 7 (llamado CYS.A): Péptidos de combinación de longitud 27. En las posiciones 1 - 11 y 17 - 27 son secuencias lineales que contienen residuos Cys apareados. Estas secuencias de 11-mer se unieron mediante el enlazante “GGSGG” (SEQ ID NO: 79). Los residuos Cys que no participan en la formación del puente disulfuro están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 8 (llamado CYS.B): Secuencias de 22-mer lineales que contienen dos Cys que forman un puente disulfuro. Los residuos Cys que no participan en la formación del puente disulfuro están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 9 (llamado LOOP12): Péptidos restringidos de longitud 12. En las posiciones 2 - 11 están las secuencias de 10-mer derivadas de la secuencia diana del Bucle Antigénico de HBV-S-Ag. En las posiciones 1 y 12 están los residuos Cys que se unen por mP2 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 10 (llamado LOOP15): Péptidos restringidos 15 de longitud. En las posiciones 2 - 14 están las secuencias de 13-mer derivadas de la secuencia diana del bucle Antigénico de HBV-S-Ag. En las posiciones 1 y 15 están los residuos Cys que se unen por mP2 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 11 (llamado LOOP21): Péptidos restringidos 21 de longitud. En las posiciones 2 - 20 están las secuencias de 19-mer derivadas de la secuencia diana del bucle Antigénico de HBV-S-Ag. En las posiciones 1 y 21 están los residuos Cys que se unen por mP2 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 12 (llamado LOOP31): Péptidos restringidos 31 de longitud. En las posiciones 2 - 30 están las secuencias de 29-mer derivadas de la secuencia diana del bucle Antigénico de HBV-S-Ag. En las posiciones 1 y 31 están los residuos Cys que se unen por mP2 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 13 (llamado MAT.A): Péptidos de combinación de 25 de longitud. En las posiciones 2 - 12 y 14 - 24 están los péptidos de 11-mer derivados de la secuencia diana del bucle Antigénico de HBV-S-Ag. En las posiciones 1, 13 y 25 están los residuos Cys que se unen por T3 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 14 (llamado MAT.B): Péptidos de combinación de 28 de longitud. En las posiciones 2 - 12 y 14 - 27 están los péptidos de 14-mer respectivamente. En las posiciones 1, 13 y 28 están los residuos Cys que se unen por T3 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”). - Conjunto 15 (llamado MAT.C): Péptidos de combinación de 28 de longitud. En las posiciones 2 - 15 y 17 - 27 están los péptidos de 14-mer y 11-mer respectivamente. En las posiciones 1, 16 y 28 están los residuos Cys que se unen por T3 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 16 (llamado MAT.D): Péptidos de combinación de 31 de longitud. En las posiciones 2 - 15 y 17 - 30 están los péptidos de 14-mer derivados de la secuencia diana del bucle Antigénico de HBV-S-Ag. En las posiciones 1, 16 y 31 están los residuos Cys que se unen por T3 CLIPS. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

Cuando se sometió a prueba bajo condiciones de alta rigurosidad el anticuerpo HBC34 no se enlazó a ningún péptido presente en los ensayos. Cuando se ensayó bajo condiciones de baja rigurosidad (5 pg/ml en 0,1% de solución tampón Pepscan y pre-acondicionamiento que contiene una combinación de suero de caballo y ovalbúmina), el anticuerpo enlazó péptidos restringidos y de combinación - enlazándose a péptidos del conjunto 14 y conjunto 16 algo menor en comparación con el conjunto 13 y el conjunto 15. No se registró enlace en las imitaciones de epítopo lineales. Los datos se muestran en la Figura 17. Estos datos muestran que el anticuerpo HBC34 reconoce un epítopo discontinuo conformacional compuesto de los tramos peptídicos 18TGPCRTC24 (SEQ ID NO: 80) y 45GNCTCIP51 (SEQ ID NO: 81), donde el tramo de péptidos 18TGPCRTC24 (SEQ ID NO: 80) es la parte dominante del epítopo (Figura 17).

Para el mapeo fino del epítopo del anticuerpo HBC34 por análisis de sustitución completa basado en los resultados descritos anteriormente, se sintetizaron 812 péptidos T3 CLIPS discontinuos o en bucle en tres conjuntos diferentes:

- Conjunto 1 (llamado RN1; T3 CLIPS discontinuo): Serie mutante de epítopo derivada de la imitación discontinua C2IPIPSSWAFGCSTTSTGP2RT2C (SEQ ID NO: 82). Para cada porción de esta secuencia, se llevó a cabo un análisis de sustitución. En otras palabras, para cada posición de la secuencia del péptido, se hicieron variantes donde el aminoácido original en esta posición se reemplazó por uno de los 13 aminoácidos seleccionados del grupo consistente en alanina (A), ácido glutámico (E), fenilalanina (F), glicina (G), histidina (H), lisina (K), leucina (L), prolina (P), glutamina (Q), arginina (R), serina (S), valina (V), tirosina (Y), y “ “; donde “_ ” representa la supresión del residuo. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 2 (llamado RN2; T3 CLIPS discontinuo): Series mutantes de epítopo derivadas de la imitación discontinua CGN2T2IPIPSSWAFCSTTSTGP2RT2C(SEQ ID NO: 83). Para cada posición de esta secuencia, se llevó a cabo un análisis de sustitución de la misma manera que para el Conjunto 1 (es decir los residuos GN2T no se mutaron). Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

- Conjunto 3 (llamado RN3; Bucle T3 CLIPS): La serie de mutantes de epítopos se derivó de la imitación de bucle c Gg GCSTTSTGP2RT2C_(SEQ id NO: 84). Para las posiciones 6 - 16 de esta secuencia, se llevó a cabo un análisis de sustitución de la misma manera que en el conjunto 1. Los residuos Cys nativos están protegidos con Acm (llamado “2”).

El anticuerpo HBC34 se ensayó en ELISA basado en PEPSCAN a 20 pg/ml en el arreglo de péptido pre acondicionado con 0,1% de SQ (solución tampón Pepscan que contiene un 0,1% de una combinación de suero de caballo y ovalbúmina). Los arreglos peptídicos se incubaron con la solución de anticuerpo HBC34 (durante la noche a 4 °C). Después del lavado, los arreglos peptídicos se incubaron a una dilución 1/1.000 con un conjugado de peroxidasa de anticuerpo apropiado (SBA) durante una hora a 25 °C. Después del lavado, se añadió el sustrato de peroxidasa sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 20 pl/ml de H2O2 al 3 por ciento. Después de una hora, se midió el desarrollo de color. El desarrollo de color se cuantificó con una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) y un sistema de procesamiento de imagen.

Como era esperable, cuando se ensayó bajo condiciones de baja rigurosidad, el anticuerpo HBC34 se enlaza a péptidos de todos los conjuntos. Los resultados del experimento demuestran que los residuos 120PCR122 y C124 son críticos para el enlace, mientras que solo ciertos reemplazos de los residuos I150, I152, W156 y F158 disminuyen notablemente el enlace (Figura 18). Además, los datos registrados en los tres ensayos demuestran coherentemente que los reemplazos de cualquier residuo dentro de la región 114STTSTGPCRTC124 (SEQ ID NO: 85) con E disminuyen el enlace, mientras que los reemplazos inversos con R o Y incrementan el enlace. Sin embargo, no se observó lo mismo para la región 145GNCTCIPIPSSWAFC159 (SEQ ID NO: 86).

Tomados conjuntamente, esos resultados sugieren que el anticuerpo HBC34 reconoce un epítopo discontinuo con los residuos 120PCR122 y C124 cruciales para el enlace. La presencia de los residuos 145GNCTCIPIPSSWAF158 (SEQ ID NO: 87) demostró que proporcionan un contexto estructural para establecer y estabilizar las interacciones epítopo - paratopo. Esta conclusión surge de la observación de que las imitaciones de epítopos discontinuos (cuando 145GNCTCIPIPSSWAF158 (SEQ ID NO: 87) y 114STTSTGPCRTC124 (SEQ ID NO: 85) están presentes en una imitación) son más tolerantes a los reemplazos que la secuencia 114STTSTGPCRTC124 (SEQ ID NO: 85) sola (conjunto 3, RN3). Adicionalmente, de demostró que P151, que fija los ángulos de torsión que proporcionan así rigidez conformacional, influye en el enlace, especialmente cuando se reemplaza por G, conocido por propiedades inversas. El G145P de reemplazo influye similarmente en el enlace de HBC34. Se observó repetidamente que los reemplazos R/Y mejoran el enlace a cualquier posición dentro de un motivo 114STTSTGPCRTC124 (s Eq ID NO: 85), pero no dentro del motivo 145GNCTCIPIPSSWAF158 (SEQ ID NO: 87), mientras que los reemplazos de E disminuyen el enlace. Esta observación puede sugerir que los residuos 114STTSTGPCRTC124 (SEQ ID NO: 85) se enlazan a un parátopo negativamente cargado dentro del anticuerpo HBC34 (o cercano a un agrupamiento de cargas negativas) y mejora el enlace, así como el resultado disminuido de las fuerzas electrostáticas, y caracteriza mejor las características del parátopo que aquellas del epítopo.

Ejemplo 10: Reducción incrementada de HBsAg en ratones uPA humanizados infectados con HBV crónica tratados con una combinación de HBC34 y lamivudina

En un estudio adicional, se investigó la eficacia de una terapia de combinación que incluye el anticuerpo HBC34. Para la combinación con HBC34, se seleccionó un inhibidor de la polimerasa, en particular lamivudina.

Para imitar la configuración de la hepatitis B crónica, ratones sin tratamiento previo UPA/SCID humanizados se infectaron con VHB y, después de 8 semanas post-infección, se alcanzó un nivel medio de ADN HBV de 2 x 109 copias/ml y un nivel de HBsAg de 9.000 IU/ml. Estos niveles son tan altos como los niveles que se observan comúnmente en pacientes humanos con infección por HBV crónica.

Después, los ratones se trataron comenzando de la semana 8 post-infección bien con el anticuerpo HBC34 solo, bien con el inhibidor de polimerasa lamivudina sola, bien con una combinación de HBC34 y lamivudina o bien con un anticuerpo de control durante 4 semanas (HBC34 a 1 mg/kg i.p. dos veces a la semana; lamivudina complementada en agua de beber a 0,4 mg/ml).

La viremia del HBV y los niveles de HBsAG en suero se evaluaron la semana 0 del tratamiento (antes del tratamiento), la semana 2 del tratamiento, la semana 4 del tratamiento y la semana 6 del tratamiento, o la semana 0 del tratamiento (antes del tratamiento), la semana 3 del tratamiento y la semana 6 del tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 19 A (viremia de HBV) y B (HBsAG).

Como se muestra en la Figura 19, el tratamiento con HBC34, lamivudina o ambos fármacos en combinación provocaron una reducción media 0,7log, 1,3log y 2,4log de la viremia (A), respectivamente. Notablemente, HBsAg (B) descendió 1,3log (BLmedia =15,600 IU/ml) en los ratones que recibieron HBC34 solo y 2,6log (BLmedia=2,600IU/ml) en el grupo de combinación, mientras que no se detectó reducción de HBsAg significativa (0,2log; BLmedia=9,000UI/ml) en los ratones tratados con lamivudina sola.

En resumen, la combinación de HBC34 y lamivudina claramente logró el efecto más potente. Es de señalar que se observó este efecto potente de la combinación de HBC34 y lamivudina, aun cuando la lamivudina sola no fue efectiva. Así, el potente efecto observado de la combinación de HBC34 y lamivudina es claramente un efecto sinérgico inesperado.

En resumen, la sorprendentemente potente reducción de HBsAg lograda en la terapia de combinación promueve que el anticuerpo HBC34 se pueda utilizar, por ejemplo en configuraciones crónicas, en combinación con inhibidores de la polimerasa para acelerar la eliminación de HBsAg tanto en pacientes monoinfectados con HBV como coinfectados con HBV/HDV.

Ejemplo 11: Modificación por ingeniería genética del anticuerpo HBC34: CDR3 de VH y VL

Se generó una primera serie de mutantes HBC34 con mutaciones en las CDR3 de VH y VL mutando (i) el residuo W107 de VH CDR3 en A o F, (ii) el residuo M115 de VH CDR3 en I o L y/o (iii) el residuo W107 de VL CDR3 en A o F. Se obtuvieron un total de 18 variantes de HBC34 combinando VH o VL no mutadas de HBC34 (a partir de ahora referida como WT, tipo natural o anticuerpo precursor) con diferentes combinaciones de mutantes VH y VL como se ilustra en la Figuras 20 y en la Figura 21.

Las variantes del anticuerpo HBC34 producidas se ensayaron con ELISA enlazando el antígeno HBsAg adw, de forma similar al Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 21.

Cabe destacar que la mutación de W107 de VH CDR3 en A (en las variantes HBC34-V5, HBC34-V8, HBC34-V9, HBC34-V10, HBC34-V12 y HBC34-V17, Figura 21) anularon completamente el enlace HBC34 a HBsAg. Esto indica que W107 es un residuo clave en el parátopo HBC34 para el reconocimiento del antígeno. La mutación de W107 de VH CDR3 en F (un aminoácido con características aromáticas similares a W) afectó parcialmente al enlace a HBC34 (HBC34-V1), indicando que W no se puede mutar sin comprometer la afinidad de enlace a HBC34 a HBsAg.

La mutación de M115 de VH CDR3 en L no afectó al enlace a HBC34 (HBC34-V13), mientras que la mutación en I (HBC34-V11) redujo parcialmente el enlace a HBC34, indicando que M115 se puede sustituir por L, pero no por I, sin comprometer el enlace a HBC34. De forma consistente con los resultados obtenidos con la mutación individual W107A, la mutación doble W107A y M115A (HBC34-V10) anuló completamente el enlace a HBC34.

La mutación de W107 de VL CDR3 en F no afectó al enlace a HBC34 (HBC34-V7), mientras que la mutación en A (HBC34-V15) redujo parcialmente el enlace de HBC34, indicando que W107 de VL CDR3 se podría sustituir por F, pero no por A, sin comprometer el enlace a HBC34. Como se esperaba, la combinación de las mutaciones W107F en Cd R3 de VH y W107A en CDR3 de VL anuló completamente el enlace (HBC34-v2). La combinación de las mutaciones M115L en VH CDR3 y W107F en VL CDR3s (HBC34-V6), de las mutaciones M115I en VH CDR3 con W107F en VL CDR3 (HBC34-v4) y de las mutaciones W107F en VH CDR3 y W107F en VL CDR3 afectó parcialmente al enlace a HBC34 a HBsAg, indicando que la combinación de estas dos mutaciones, pero no las mutaciones individuales, no es compatible para retener la afinidad de enlace del anticuerpo HBC34 precursor.

En un siguiente paso, seis de las 18 variantes de HBC34 descritas anteriormente se seleccionaron para su caracterización adicional (HBC34-V1, V3, V4, V6, V7, V11 y V13) con el fin (i) de confirmar los resultados iniciales; (ii) de medir la afinidad de enlace por ELISA (es decir determinar la EC50 del enlace); y (iii) evaluar la productividad de estas variantes de HBC34 a partir de células 293-Expi transcientemente transfectadas (Figura 22 y Figura 23).

Como se observa en el primer experimento, la variante HBC34-V3 (que lleva la mutación doble W107F de VH CDR3 y W107F de VL CDR3) se enlaza a HBsAg (serotipo adw) con una EC50 9 veces más alta en comparación con el anticuerpo HBC34 precursor. Además, se produjo HBC34-V3 en una concentración casi 5 veces más baja en comparación con HBC34. Las variantes HBC34-V11 y HBC34-V13 que llevan la mutación individual M115I y M115L, respectivamente, se enlazaron a HBsAg con una EC50 idéntica o ligeramente superior a aquella de HBC34. Sin embargo, ambas variantes se produjeron menos eficientemente que HBC34 (productividad más baja de 0,6x y 0,3x en comparación con HBC34). Estos resultados indican que HBC34-V11, y aún más las variantes HBC34-V13 se enlazan con alta afinidad a HBsAg, pero se producen menos eficientemente en las células de mamífero. Similarmente, la variante HBC34-V1, que lleva la mutación individual W107F en VH CDR3, se enlaza a HBsAg de forma comparable a HBC34 (EC50 1,6 veces más alta), pero se produjo 4 veces menos eficientemente (es decir 0,25x) en comparación con HBC34. La combinación de W107 de VL CDR3 con W107, M115I o M115L de VH CDR3 (HBC34-V3, HBC34-V4 y HBC34-V6) redujo tanto la afinidad de enlace (EC50 1,6-9,0 veces más alta) como la productividad (0,20-0,35x más baja que la concentración de anticuerpos en los sobrenadantes de cultivo). Sorprendentemente, la mutación individual W107F de VL CDR3 (HBC34-V7) se enlazó a HBsAg de forma similar a HBC34 y se produjo aún más eficientemente (hasta 1,7x) que HBC34, alcanzando una concentración notablemente alta en el sobrenadante de cultivo, de 533 pg/ml (Figura 23).

Ejemplo 12: Modificación de la secuencia del anticuerpo HBC34: regiones estructura

Se produjeron 12 variantes de HBC34 adicionales (HBC34-V19 a HBC34-V30; Figura 24A) donde se introdujeron varias mutaciones en las regiones estructura (FR) tanto de VH como de VL, que correspondían a los residuos encontrados en el ancestro común no mutado HBC34 (HBC34-UCA) (Figura 20) y se combinaron con la mutación VH CDR3 M115L y con la mutación VL CDR3 W107F.

Los resultados se muestran en la Figura 24. La introducción de 9 mutaciones en las FR de VL (HBC34-27, HBC34-V28, HBC34-V29 y HBC34-V30) en presencia de la mutación W107 en VL CDR3, combinadas con WT, M115L redujeron significativamente el enlace de HBC34 a HBsAg, indicando así una función importante para los residuos mutados en VL (Figura 24A-B). Las variantes HBC34 donde la misma variante VL descrita anteriormente (es decir W107F/FR1234-GL) se combinó con la VH que lleva la mutación M115L y las 9 mutaciones adicionales en las FR no se enlazaron a HBsAg, indicando que las mutaciones tanto en VH como en VL contribuyen esencialmente al enlace a HBsAg.

De manera recalcable, la eliminación de solo una de las 9 mutaciones introducidas en las FR de VL (es decir K66Y) en HBC34-V23 y HBC34-V24 incrementaron significativamente el enlace (EC50 100x veces más baja) a HBsAg en comparación con las variantes correspondientes que llevan la mutación Y66K (HBC34-V27 y HBC34-V28). Similarmente, la eliminación de la mutación K66Y en HBC34-V25 y HBC34-V26 restauró el enlace a HBsAg en comparación con las variantes no enlazadas correspondientes que llevan la mutación Y66K (HBC34-V27 y HBC34-V28).

De éstas, la variante HBC34-V23 retuvo el enlace de alta afinidad (EC50 1,5x más alta en comparación con HBC34) y se produjo similarmente con el anticuerpo HBC34 parenteral. Cabe destacar que la variante HBC34-V24 que difiere solo en un aminoácido de la variante HBC34-V23 (es decir M115L en VH) enlazó a HBsAg con una EC50 similar a aquella de HBC34-V23, pero no se produjo eficientemente (solo 0,14x de productividad en comparación con HBC34). Estos resultados indican que, mientras que no afecte significativamente al enlace de las variantes de HBC34 a HBsAg, la presencia de L en la posición 115 tiene un impacto negativo en la productividad de las variantes de HBC34 que llevan esta mutación. De hecho, en promedio, todas las variantes de HBC34 que llevan la mutación M115L (HBC34-V6, HBC34-V13, HBC34-V19, HBC34-V20, HBC34-V21, HBC34-V22, HBC34-V24, HBC34-V25, HBC34-V26, HBC34-V28, HBC34-V29 y HBC34-V30) tienen una productividad media 0,3x en comparación con aquella del anticuerpo HBC34 precursor.

Es de señalar que la introducción de 5 o 9 mutaciones en las FR de VH en presencia de la mutación M115L en VH CDR3 (variantes HBC34-V19 y HBC34-V20, respectivamente) no disminuyó apreciablemente el enlace a HBsAg, sugiriendo que los residuos mutados no tienen una función importante en el reconocimiento de antígeno de alta afinidad por el anticuerpo HBC34. La introducción de la mutación W107F en el esqueleto de las variantes HBC34V19 y HBC34-V20 en HBC34-V21 y HBC34-V22 redujo el enlace a HBsAg de 20-30x. Interesantemente, la misma mutación (es decir W107 en las VL CDR3) no afectó al enlace de otras variantes que no llevan las mismas 5 o 9 mutaciones en las FR de VH, un resultado que podría indicar que los residuos en las FR VH tienen una función cooperativa (por ejemplo estabilizando una cierta conformación del andamio de la región variable) en el enlace a HBsAg con el residuo 107 de VH.

Finalmente y en consistencia con los resultados del Ejemplo 11 mostrados en la Figura 23, el anticuerpo HMB34-V7 que lleva la mutación individual W107 en VL CDR3 mostró un enlace comparable a HBsAg (es decir 1,4x) en comparación con HBC34 y se produjo más eficientemente (1,2x) que HBC34 (en promedio en los dos experimentos llevados a cabo HBC34-V7 se produjo 1,5x, es decir, 50% más eficientemente que el anticuerpo HBC34). Este resultado sugiere que la mutación W107F en VL CDR3, mientras que no afecta apreciablemente a la afinidad de enlace a HBsAg, tiene un impacto positivo en la productividad del anticuerpo HBC34.

Finalmente, el HBC34 y las variantes HBC34-V6, HBC34-V7, HBC34-V19, HBC34-V23 y HBC34-V24 ensayaron en cuanto a su capacidad para reconocer los 10 genotipos HBV A, B, C, D, E, F, G, H, I y J (como se muestra en la Figura 25) por análisis de citometría de flujo. En particular, células epiteliales humanas (células Hep2) se transfectaron con los plásmidos que expresan en cada caso el HBsAg de los 10 genotipos HBV A, B, C, D, E, F, G, H, I y J. Todos los anticuerpos se ensayaron en múltiples concentraciones (8 diluciones en serie de 5.000 ng/ml a 7 ng/ml) para la tinción de células permeabilizadas transcientemente transfectadas. Dos días después de la transfección, se recogieron las células Hep2, se fijaron y permeabilizaron con saponina para la inmunotinción con HBC34 y las cinco variantes seleccionadas. El enlace de los anticuerpos a las células transfectadas se analizó utilizando un Becton Dickinson FACSCanto2 (BD Biosciences) con el software FlowJo (TreeStar). Como se muestra en la Figura 25, HBC34 y todas las cinco variantes ensayadas reconocieron los 10 genotipos HBV HBsAg a un nivel similar.

T

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, que se enlaza a la región de bucle antigénico de HBsAg y neutraliza la infección con el virus de hepatitis B y el virus de hepatitis delta, donde el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y las secuencias de aminoácidos de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 (i) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-38 y 40, respectivamente; o (ii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-37, 39 y 40, respectivamente; o (iii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-38 y 58, respectivamente; o (iv) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34-37, 39 y 58, respectivamente; o (v) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-38, y 40, respectivamente; o (vi) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-37, 39 y 40, respectivamente; o (vii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-38 y 58, respectivamente; o (viii) de acuerdo con las SEQ ID NO: 34, 66, 36-37, 39 y 58, respectivamente.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno comprende una fracción Fc, preferentemente el antígeno o el fragmento de enlace a antígeno del mismo es del tipo IgG, con mayor preferencia del tipo IgG1.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, donde el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace a antígeno del mismo monoclonal y/o un anticuerpo humano o un fragmento de enlace a antígeno del mismo humano.

4. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo comprende (i) una secuencia aminoácidos de una región variable de cadena pesada (VH) que comparte al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:41 o 67; y (ii) una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera (VL) que comparte al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 42, 59 o 65.

5. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada (VH) de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 o 67 y una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con la SEQ ID NO: 42, 59 o 65.

6. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, es un anticuerpo purificado, un anticuerpo de una sola cadena, Fab, Fab', F(ab')2, Fv o scFv.

7. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso como medicamento, preferentemente para su uso en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o de la hepatitis D.

8. Molécula de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo o el fragmento de enlace a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, donde la secuencia de polinucleótidos comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que comparte al menos un 80%, preferentemente al menos un 85%, de manera más preferente al menos un 90%, con especial preferencia al menos un 95% y con particular preferencia al menos un 98% o un 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 43-51,60-64 y 68- 78.

10. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9.

11. Célula que expresa el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o que comprende el vector según la reivindicación 10.

12. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9, el vector según la reivindicación 10 y/o la célula según la reivindicación 11 y, opcionalmente, un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9, el vector según la reivindicación 10, la célula según la reivindicación 11 o la composición farmacéutica según la reivindicación 12 para su uso en (i) la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o de la hepatitis D; o en (ii) la diagnosis de la hepatitis B y/o de la hepatitis D in vitro.

14. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13 en el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B crónica.

15. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13 en la prevención de la (re-)infección por hepatitis B después de un trasplante de hígado, en particular para la insuficiencia hepática inducida por hepatitis B.

16. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13 en la prevención de la hepatitis B en sujetos no inmunizados o en recién nacidos.

17. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13 en la profilaxis de la hepatitis B en sujetos no inmunizados o en pacientes hemodializados.

18. El anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13 o 14, donde el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, el ácido nucleico, el vector, la célula o la composición farmacéutica se administra en combinación con un inhibidor de la polimerasa, un interferón y/o un inhibidor de punto de regulación, preferentemente con un inhibidor de la polimerasa, tal como lamivudina.

19. Combinación de

i) el anticuerpo, o el fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9, el vector según la reivindicación 10, la célula según la reivindicación 11 o la composición farmacéutica según la reivindicación 12; y

ii) un inhibidor de la polimerasa, un interferón y/o un inhibidor de punto de regulación, preferentemente para su uso en la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B y/o de la hepatitis D, en particular para su uso en el tratamiento o la atenuación de la hepatitis B crónica y/o de la hepatitis D crónica.

20. Kit que comprende

21. Uso del anticuerpo, o del fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, del ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9, del vector según la reivindicación 10, de la célula según la reivindicación 11 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 12 para monitorear la calidad de las vacunas anti-hepatitis-B o anti-hepatitis-D mediante la verificación in vitro de que el antígeno de dicha vacuna contiene el epítopo específico en la conformación correcta.

22. Uso del anticuerpo, o del fragmento de enlace a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, del ácido nucleico según las reivindicaciones 8 - 9, del vector según la reivindicación 10, de la célula según la reivindicación 11 o de la composición farmacéutica según la reivindicación 12 en la determinación de si una muestra de sangre aislada está infectada con el virus de la hepatitis B y/o con el virus de la hepatitis delta.