KR20180056777A - B형 간염 바이러스를 강력하게 중화하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

B형 간염 바이러스를 강력하게 중화하는 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은, B형 간염 표면 항원 (HBsAg)의 항원성 루프 영역에 결합하고 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 델타 간염 바이러스 (HDV) 감염 모두를 강력하게 중화시키는 항체, 및 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체 및 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프는 물론, 그러한 항체 및 항체 단편을 암호화하는 핵산 및 생산하는 세포에 관한 것이다. 더불어, 본 발명은 B형 간염 및 D형 간염의 진단, 방지 및 치료에서의 본 발명의 항체 및 항체 단편의 용도에 관한 것이다.

Description

B형 간염 바이러스를 강력하게 중화하는 항체 및 그의 용도
본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 델타 간염 바이러스(HDV)에 대한 항체 및 그의 용도 분야에 관한 것이다. 본 발명에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 강력한 항 B형 간염 항체는 HBV의 외피 단백질 (HBsAg)의 S 도메인의 항원성 루프 영역에 자리한 에피토프에 결합한다. 본 발명은 또한 이러한 항체 및 항체 단편을 암호화하는 핵산 및 이를 생산하는 불멸화된 B 세포 및 배양된 형질 세포에 관한 것이다. 더불어, 본 발명은 선별 방법은 물론 질병, 구체적으로 B형 간염 및 D형 간염의 진단, 방지 및 치료에서의 항체 및 항체 단편의 용도에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (HBV)는 (i) 세 개의 관련된 표면 단백질 (B형 간염 표면 항원,HBsAg) 및 지질을 함유하는 외피(envelope) 및 (ii) 바이러스 DNA 및 DNA 폴리머라아제를 둘러싸는 정20면체 뉴클레오캡시드로 구성된다. HBV 캡시드는 RNA의 전게놈(pregenome) 복제 복합체의 포장 중에 감염된 세포의 세포질에서 형성되고, 입자의 루멘에서 전게놈의 역전사에 의해 바이러스 DNA 게놈을 합성하는 동안 발아(bud)하는 능력을 얻는다. 세 개의 HBV 외피 단백질-HBsAg, M-HBsAg, 및 L-HBsAg는 소포체에서 복잡한 막통과 주름을 만들고, 이황화 결합된 동종- 및 이종이량체를 형성한다. 세포내 막에서 발아하는 동안, 세포질 preS 영역 내 짧은 선형 도메인은 캡시드 표면과 상호작용한다. 비리온(비리온)은 순차로 혈액 내로 분비된다. 더불어, 표면 단백질은 캡시드의 부재하에서도 발아하고 또한 비리온에 3-4 로그 초과하여 분비되는 서브바이러스 입자 (subviral particle, SVP)를 형성할 수 있다. HBsAg 의 높은 수준은 HBsAg-특이적T-세포 반응을 탈진시킬 수 있고, 만성 B형 간염 (CHB) 환자에서 바이러스 면역관용의 중요 인자로 제안된다 (Chisari FV, Isogawa M, Wieland SF, Pathologie Biologie, 2010;58:258-66).
B형 간염 바이러스는 잠재적으로 생명-위협하는 급성 및 만성 간 감염을 일으킨다. 급성 B형 간염은, 증상과 함께 또는 증상 없이, 전격 간염(fulminant hepatitis) 발생의 위험과 함께, 바이러스혈증으로 특징 지어진다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [정식발행 전 온라인발행]). B 형 간염에 대해 효과적인 백신이 1982 년부터 사용할 수 있음에도 불구하고, WHO는 240만 명의 사람이 만성 B 형 간염에 감염되고 780000명 초과하는 사람이 B 형 간염의 합병증으로 매년 죽는 것으로 보고한다. 대략 만성 B형 간염 (CHB) 환자의 삼 분의 일이 경화, 간부전 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)이 발생하고 매년 600,000 의 사망을 차지한다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [정식발행 전 온라인발행]).
현재 가능한 만성 B형 간염에 대한 치료는 (페길화된(pegylated)) 인터페론-알파 (IFN-α 또는 pegIFN-α) 및 B형 간염 바이러스 (HBV) DNA 중합효소를 억제하는 뉴클레오시(티)드 유사체 직접 작용 항바이러스제(Direct Acting Antivirals, DAAs) ("중합효소 억제제")를 포함한다. 중합효소 억제제는 라미부딘, 아데포비르, 엔트카비르, 텔비부딘 및 테노포비르를 포함한다. 중합효소 억제제 (라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘, 테노포비르)은 HBV DNA 중합효소의 역전사효소 기능을 저지하고 그러므로 프리게놈 RNA로부터의 바이러스 DNA의 합성을 방해한다. 이 치료는 바이러스 확산, cccDNA의 형성을 예방하지 못하고 HBsAg 방출에 영향을 미치지 않는다. 게다가, 중합효소 억제제는 질병 진행을 제한하지만 바이러스는 좀처럼 제거하지 못한다. 따라서, 바이러스 재발이 치료 중단 후 흔하게 관찰되고 그러므로, 중합효소 억제제는 평생 동안 사용되어야 한다. 더불어, 장기간의 치료 후 약물-내성 돌연변이체가 출현한다. PEG-IFN-α는 간접적으로 면역 조정 효과를 통하고 직접적으로 HBV 전사체의 항정-상태(steady-state) 수준을 감소(cccDNA-결합 히스톤의 증가된 아세틸화)에 의해 HBV를 억제한다. 하지만, PEG-IFN-α는 제한된 효능을 가지고 심각한 부작용을 야기한다.
pegIFN-α는 치료받은 환자의 대략 삼분의 일에서 효과적인 반면, 중합효소 억제제는 상기 치료된 환자들의 압도적 다수에서 바이러스 로드를 유의적으로 감소시킨다 (Timothy M. Block, Robert Gish,Haitao Guo, Anand Mehta, Andrea Cuconati, W. Thomas London, Ju-Tao Guo Chronic hepatitis B: What should be the goal for new therapies? Antiviral Research 98 (2013) 27-34). 인터페론 α 는 많은 유해 작용과 연관되고 진행성 경화 또는 의료적/정신적 금기를 갖는 환자에서는 사용될 수 없다 (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [정식발행 전 온라인발행]). 비록 예를 들어 엔테카르비르 및 테노포비르와 같은 중합효소 억제제는 유해 영향을 감소시키는 것으로 나타나지만, 이들 약물에 대한 HBeAG 혈청전환 속도 및 HBsAg 손실은 낮다. 그러므로, 대개의 환자들은 종종 비용 및 유해 작용, 약물 내성 및 비-준수의 위험과 연관되는 평생 치료를 요구한다. 따라서, 만성 B형 간염에 대한 현재 가능한 치료는 여전히 다양한 제한에 의한 장애가 있고 치유력이 있는 것으로 여겨지지 못한다. 그러므로 - 비록 HBV 에 대한 치료는 개선되었으나 - HBV 환자들은 종종 평생 요법이 요구되고 치유는 여전히 도전 목표이다. (Liang TJ, Block TM, McMahon BJ, Ghany MG, Urban S, Guo JT, Locarnini S, Zoulim F, Chang KM, Lok AS. Present and future therapies of hepatitis B: From discovery to cure. Hepatology. 2015 Aug 3. doi: 10.1002/hep.28025. [정식발행 전 온라인발행]). 만성 B형 간염 (CHB)을 치유하는 최근접 결과 및 치료의 이상적인 종점은 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)의 상실에 도달하는 것이나, 이는, 하지만, 현재 가능한 만성 B형 간염의 치료에 효과적으로 도달하지 못하였다 (참조를 위해 Gish R.G. et al., 2015, Antiviral Research 121:47-58).
급성 간염 또는 간세포 암종을 갖는 심각한 비대상성 (Severely decompensated)HBV 환자는 동소성 간 이식(orthotopic liver transplantation, OLT)으로 표시된다. OLT 이후, B형 간염 재발율은 예방없이 80% 초과하고, 반면에 이식 수령자의 90% 초과자가 B형 간염 면역글로불린 (HBIG) 및 뉴클레오시(티)드 유사체의 조합된 치료로 임상적으로 조절된다. B형 간염 면역글로불린 (HBIG)은 백신접종된 제공자로부터 정제된 다클론 면역글로불린이다. 하지만, 장기간 HBIG 투여는 제한된 사용 가능성 및 극도로 높은 비용을 포함하는 수 개의 미해결 이슈와 연관된다 (Takaki A, Yasunaka T, Yagi T. Molecular mechanism to control post-transplantation hepatitis B recurrence. Int J Mol Sci. 2015 Jul 30;16(8):17494-513). 게다가, 극도로 고용량이 투여되어야만 하고, 다시 말해 10 그람 (결합 어세이에 기초하여 10,000 IU 함유)이 이식 동안 정맥내 주입에 의해 투여된다. 순차로 2 그람이 정맥내로 매일 8일 동안 투여되고 항-HBs 혈청 수준을 100 IU/ml 초과로 유지하기 위하여 부가 주입이 매 1-3개월마다 주어진다. 다시금, 평생 치료가 요구된다.
보다 더 심각한 합병증이 델타 간염 바이러스 (HDV) 로의 동시감염 또는 중복감염이 발생하는 동안 관찰된다. WHO에 따르면, D형 간염은 세계적으로 약 15 백만 사람을 감염시킨다. HDV는 오직 HBV의 존재하에서만 번식할 수 있기 때문에 서브바이러스 부수체로 여겨진다. HDV는 최소 동물 바이러스의 하나로, 그로써 그의 게놈은 오직 1.6kb 이고 S 및 LHDAg를 암호화한다. HDV의 게놈 복제를 위해 필요한, RNA 중합 효소를 포함하는, 모든 다른 단백질은 숙주 세포에 의해 제공되고, HDV 외피는 HBV에 의해 제공된다. 다시 말해서, HDV는 B형 간염 외피 단백질 (HBsAg)을 그 자신의 비리온 껍질로 이용하기 때문에 그의 복제를 위해 HBV와의 동시감염을 요구하는 불완전 바이러스이다. 허용 세포로 도입되는 경우, HDV RNA 게놈은 복제하고 리보핵산단백질 (RNP) 복합체로 조립하는 HDV-암호화된 단백질의 다중 카피와 연관된다. RNP는 HBV 외피 단백질에 의해 세포로부터 유출되고, 이는 분비되기 전에 전-골지(pre-Golgi) 구획의 루멘으로 발아하는 지질단백질 소포(vesicle)를 조립할 수 있다. 게다가, HBV 외피 단백질은 또한 비감염된 세포에HDV를 타겟팅하는 기전을 제공하고, 그렇게 함으로써 HDV의 확산을 보장한다.
HDV에 의해 발생한 합병증은 급성 감염에서의 간 부전 및 간경화의 급속한 진행, 만성 감염에서 간 종양 발현의 증가된 위험을 경험할 큰 가능성을 포함한다. B형 간염 바이러스와의 조합에서, D형 간염은 20%의 모든 간염 감염에서 가장 높은 치사율을 가진다(Fattovich G, Giustina G, Christensen E, Pantalena M, Zagni I, Realdi G, Schalm SW. Influence of hepatitis delta virus infection on morbidity and mortality in compensated cirrhosis type B. Gut. 2000 Mar;46(3):420-6). 만성 HDV 감염에 오직 승인된 요법은 인터페론-알파이다. 하지만, 인터페론-알파로의 HDV 치료는 비교적 비효율적이고 내성이 좋지 않다. 인터페론-알파로의 치료는 사분의 일의 환자에서 치료 후 6개월에 지속된 바이러스 반응을 초래한다. 또한, 뉴클레오시(티)드 유사체(NA)는 델타 간염에서 널리 시험되었으나, 그들은 효과없는 것으로 나타났다. NA와 인터페론의 조합 치료도 또한 실망스러운 것으로 증명되어서 신규한 치료 선택에 대한 요구가 있다 (Zaigham Abbas, Minaam Abbas Management of hepatitis delta: Need for novel therapeutic Options. World J Gastroenterol 2015 August 28; 21(32): 9461-9465).
상기의 관점에서, 본 발명의 목적은, B형 간염 바이러스 (HBV) 및 델타 간염 바이러스 (HDV) 양자 모두를 중화할 수 있는, 항체-기반 산물을 제공하는 것이다. 이는 개선된 B형 간염의 예방 및 치료를 가능케 한다. 게다가, D형 간염에 현재 사용 가능한 치료가 없고, 따라서, 또한 본 발명의 목적은 D형 간염의 예방 및 치료를 위한 항체-기반 산물을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 뿐만 아니라 만성 B형 간염의 더 좋은 치료를 가능케 하는, 항체-기반 산물을 제공하는 것이다. 이것을 위하여, 하나의 단일 항체-기반 산물이 (i) 강력하게 HBV를 중화, (ii) HBsAg 및 HBV의 제거를 촉진 및 (iii) 혈청전환, 즉 바이러스에 대한 면역 반응 유도에 의해 상이한 방식으로 작용한다면 유리하다. 게다가, 항체는 유리하게 또한 개선된 항원의 제시를 촉진하고, 그것에 의해서 항-HBV T-세포 반응의 복원을 촉진할 것이다. 더불어, 본 발명의 목적은 상이한 - 바람직하게는 알려진 모든 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 유전형 및 상이한 - 바람직하게는 알려진 모든 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 감염성 돌연변이체에 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다. 요약 하면, 본 발명의 목적은 상기에서 논의된 선행 기술의 결함을 극복할 수 있는, 개선된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 물론, 관련된 핵산 분자, 벡터 및 세포 및 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 기본 목적은 하기에 제시된 대상 및 첨부된 청구항에 의해 해결된다.
다음과 같이, 본 발명의 구성요소는 기술될 것이다. 이들 구성요소는 구체적인 구현예들과 함께 열거되지만, 하지만, 그들은 추가적인 구현예를 생산하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서는 명시적으로 기술된 구현예와 임의의 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성요소를 조합하는 구현예를 지지하고 아우르는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 본 명세서에 기술된 모든 구성요소의 임의의 치환 및 조합은 그 맥락이 달리 표시하지 않는 한 본 출원의 명세서에 의해 개시되는 것으로 여겨져야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 바처럼 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
후술되는 본 상세한 설명 및 청구항을 통해, 그 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다", 및 예를 들어 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변동들은, 언급된 일원(member), 완전체(integer) 또는 단계를 포함하고 다른 비언급된 일원, 완전체 또는 단계를 제외하지 않음을 암시하는 것이 이해될 것이다. 용어 "이루어진"은 용어 "이루어지다"의 구체적 구현예이고, 여기서 임의의 다른 비언급된 일원, 완전체 또는 단계는 제외된다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "포함하다"는 용어 "이루어지다"를 아우른다. 용어 "포함하는"은 따라서 "포함하는"은 물론 "이루어지는"을 아우르고, 일례로, X를 "포함하는" 조성물은 X만 독점적으로 포함하거나 또는, 일례로, X+Y처럼, 추가적인 무엇을 포함할 수 있다.
용어 "그" 및 "이" 및 "상기" 및 본 발명의 기술하는 맥락에서 사용된 유사한 참조어들은 (특별히 청구항의 맥락에서), 맥락에 의해 달리 표시내거나 또는 명백하게 상반되지 않는 한, 단수 및 복수 양자 모두를 다루는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값 범위의 열거는 단지 상기 범위에 들어가는 각각 분리된 값을 개별적으로 지칭하는 간략 기재법을 제공하는 것을 의도하는 것에 불과하다. 본 명세서에서 달리 표시되지 않는 한, 각각 개별적 값은 그것이 개별적으로 본 명세서에 열거된 것처럼 본 명세서로 통합된다. 명세서 내 어떠한 용어도 비-청구된 구성요소가 본 발명의 실천에 필수적인 것으로 해석되어서는 안된다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않고, 일례로, Y가 "실질적으로 배제된" 조성물은 Y가 완전히 배제될 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로" 는 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 값 x과 관련된 용어 "약"은 x ± 10%를 의미한다.
용어 "질병(disease)"는 본 명세서에 사용된 바처럼 일반적으로 용어 "질환(disorder)" 및 "상태(상태)" (의료적 상태로서)와 같은 뜻이고, 모두 인간 또는 동물 신체 또는 그의 일부의 하나의 정상 기능을 손상시키는 비정상 상태를 반영한다는 점에서, 상호교환적으로 사용되는 것으로 의도되고, 인간 또는 동물의 삶의 기간 또는 질을 감소시키는 구별되는 징후 및 증상, 및 원인에 의해 전형적으로 드러난다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 대상 또는 환자의 "치료"의 기준은 예방, 방지, 약화, 개선 및 요법을 포함한다. 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간을 포함하는 모든 포유류를 의미하는 것으로 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 대상의 예는 인간, 소, 개, 고양이, 말, 산양, 양, 돼지, 및 토끼를 포함한다. 일 구현예에서, 환자는 인간이다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질" 및 이들 용어의 변동은 구체적으로 펩티드, 올리고펩타이드, 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 단백질, 개별적으로, 정상 펩티드 결합에 의해, 또는 변형된 펩티드 결합에 의해, 예를 들어 예를 들면 이소스테릭 펩티드의 경우와 같이, 서로 합쳐진 최소한 두 개 아미노산을 포함하는 분자를 지칭한다. 예를 들면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 바람직하게는, 정상 펩티드 결합 ("정통적" 폴리펩티드)에 의해 서로 간에 연결된, 유전 부호(genetic code)에 의해 정의되는 20 개의 아미노산으로부터 선택되는 아미노산으로 구성된다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 또한 비-펩티드 구조 요소를 함유하는 펩티드 유사체로 정의되는 "펩티드미메틱"(peptidomimetic)을 포함하고, 이 펩티드는 자연의 부모 펩티드의 생물 작용을 흉내내거나 억제할 수 있다. 펩티드미메틱은 예를 들어 효소적으로 잘라지는 펩티드 결합과 같은 전통적 펩티드 특징은 결여한다. 구체적으로, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 이들 아미노산에 더불어 아미노산 유전 부호에 의해 정의되는 20 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있고, 또는 유전 부호에 의해 정의되는 20 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 맥락에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은, 예를 들어 번역후 성숙 공정과 같은 자연 공정에 의해 또는 화학적 공정에 의해 변형된 아미노산으로 동등하게 구성될 수 있고, 이는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 변형은 문헌들에 상세히 기술되어 있다. 이들 변형은 폴리펩티드 내: 펩티드 스켈레톤 내, 아미노산 사슬 내 또는 심지어 카르복시- 또는 아미노-말단 끝 임의의 곳에 나타날 수 있다. 구체적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination) 후에 분지화되거나 또는 분지형성과 함께 또는 분지형성 없이 고리화될 수 있다. 이 유형의 변형은 당해 분야의 기술자들에게 잘 알려진 자연 또는 합성 번역후 공정의 결과일 수 있다. 본 발명의 맥락에서 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"는 구체적으로 변형된 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질를 또한 포함한다. 예를 들면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 변형은 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), ADP-리보실화(ribosylation), 아미드화(amidation), 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 고정(covalent fixation), 지질 또는 지질유도체의 공유적 고정, 포스파티딜이노시톨의 공유적 고정, 공유적 또는 비공유적 교차결합, 고리화, 이황 결합 형성, 탈메틸화(demethylation), 페길화를 포함하는 글리코실화, 하이드록실화, 아이오다이제이션(iodization), 메틸화(methylation), 미리스토일화(myristoylation), 산화(oxidation), 단백질 분해 공정, 인산화, 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 세넬로일화(seneloylation), 황산화(sulfatation), 예를 들어 아르기닌화(arginylation) 또는 유비퀴틴화(ubiquitination) 같은 아미노산 추가를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 문헌들에 상세히 기술되어 있다 (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). 그에 따라, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", "단백질"은 바람직하게는 예를 들면 지질펩티드, 지질단백질, 글리코펩티드, 글리코단백질 및 등등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바처럼 "(폴리)펩티드"는 상기 설명된 아미노산 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 단쇄를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바처럼, "단백질"은 하나 이상의, 일례로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 (폴리)펩티드, 즉 상기 설명된 아미노산 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 하나 이상의 사슬을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 단백질은 1, 2, 3, 또는 4개 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "재조합"은, 본 명세서에 사용된 바처럼 (일례로 재조합 항체, 재조합 단백질, 재조합 핵산 등등.), 재조합 방식에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되고, 또한 자연적으로 발생하지 않는 임의의 분자 (항체, 단백질, 핵산 등등.) 를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "핵산", "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드" 상호교환적으로 사용되고 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것을 의도한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 그러나 바람직하게는 이중-가닥 DNA 이다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "세포", "세포주", 및 "세포 배양"은 상호교환적으로 사용되고 모든 이러한 지정은 후손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환주" 및 "형질전환 세포"는 일차 대상 세포 및 그로부터 유래된 배양물을 이동 횟수에 상관없이 포함한다. 또한 모든 후손은, 고의의 또는 우연의 돌연변이로 인해, DNA 내용이 정밀하게 일치하지 않을 수 있다는 것이 이해된다. 처음부터 형질전환 세포에서 검사되어 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변종 후손들이 포함된다. 뚜렷한 지정이 의도되는 곳에서는, 맥락으로부터 명백할 것이다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "항원 결합 단편", "단편", 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하도록 상호교환적으로 사용된다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되지 않지만, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함한다. 더욱이, 용어 "항체"는 본 명세서에 사용된 바처럼 항체 및 그의 항원 결합 단편 양자 모두를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바처럼, "중화 항체"는 숙주 내 감염을 개시 및/또는 영속시키는 병원체의 능력을 중화, 즉, 예방, 억제, 감소, 저해 또는 방해할 수 있는 것이다. 용어 "중화 항체" 및 "중화하는 항체" 또는 "중화하는 항체들"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 항체는 단독, 또는 조합으로, 본 명세서에 기술된 것처럼 적당한 제형에 따른 방지제 또는 치료제로서, 활발한 백신접종과 연관되어, 진단 도구로서, 또는 생산 도구로서 사용될 수 있다.
용량은 종종 체중과 관련되어 표현된다. 따라서, [g, mg, 또는 다른 단위]/kg (또는 g, mg 등등.) 으로 표현된 용량은, 비록 용어 "체중"이 명시적으로 언급되어 있지 않은 경우라도, 통상적으로 "체중 kg (또는 g, mg 등등.) 당" [g, mg, 또는 다른 단위] 을 지칭한다.
용어 "결합하는" 및 "특이적으로 결합하는" 및 유사 참조어들은 비-특이적 부착을 아우르지는 않는다.
용어 "백신"은 본 명세서에 사용된 바처럼 전형적으로 최소한 하나 항원, 바람직하게는 면역원(immunogen)을 제공하는 방지적 또는 치료적 물질인 것으로 이해된다. 항원 또는 면역원은 백신접종에 적합한 임의의 물질로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 항원 또는 면역원은 병원체로부터, 예를 들어 박테리아 또는 바이러스 조각 등등 으로부터, 또는 종양 또는 암성 조직으로부터 유래될 수 있다. 항원 또는 면역원은 적응 면역 반응을 제공하는 신체의 적응 면역 시스템을 자극한다. 구체적으로, "항원" 또는 "면역원"은 면역 시스템에 의해, 바람직하게는 적응 면역 시스템에 의해, 인식될 수 있는 물질을 전형적으로 지칭하고, 이는 일례로 적응 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원-특이적 T 세포의 형성에 의해, 항원-특이적 면역 반응을 촉발할 수 있다. 전형적으로, 항원은 MHC에 의해 T-세포에 제시될 수 있는 펩티드 또는 단백질이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "서열 변종"은 기준 서열과 비교하여 하나 이상의 변경을 가지는 임의의 서열을 지칭하고, 그로써 기준 서열은 "서열 및 SEQ ID 번호 표" (서열 리스팅)에 리스트된 임의의 서열, 즉 서열목록 번호: 1 내지 서열목록 번호: 88이다. 따라서, 용어 "서열 변종"은 뉴클레오티드 서열 변종 및 아미노산 서열 변종을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 맥락에서 서열 변종에 대해, 기준 서열은 또한 뉴클레오티드 서열이고, 반면에 아미노산 서열의 맥락에서 서열 변종에 대해, 기준 서열은 또한 아미노산 서열이다. "서열 변종"은 본 명세서에 사용된 바처럼 기준 서열에 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 일치한다. 서열 일치성은 통상적으로 기준 서열 (즉 본 출원에 언급된 서열)의 전체 길이에 관해 계산된다. 일치 백분율은, 본 명세서에 참조된 것처럼, 예를 들면, NCBI에 의해 특정되는 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST를 사용해, 결정될 수 있다 (미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information); http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 and gap extension penalty=1].
핵산 (뉴클레오티드) 서열의 맥락에서 "서열 변종"은 기준 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드가 삭제, 또는 치환되거나, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드가 기준 뉴클레오티드 서열의 서열 내로 삽입된 변경된 서열을 가진다. 뉴클레오티드는 본 명세서에서 표준 한-글자 지정 (A, C, G, 또는 T)에 의해 지칭된다. 유전 부호의 변성(degeneracy)으로 인하여, 뉴클레오티드 서열의 "서열 변종"은 각각의 기준 아미노산 서열 내 변화, 즉 아미노산 "서열 변종"을 초래하거나 초래하지 않을 수 있다. 아미노산 서열 변종을 초래하지 않는, 뉴클레오티드 서열 변종이 바람직하다(침묵 돌연변이). 하지만, "비-침묵" 돌연변이를 이끄는 뉴클레오티드 서열 변종도 또한 범주 내이고, 구체적으로 기준 아미노산 서열에 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 초래하는, 이러한 뉴클레오티드 서열 변종이다.
아미노산 서열의 맥락에서 "서열 변종"은 기준 아미노산 서열과 비교하여 서열 내 하나 이상의 아미노산이 삭제, 치환, 또는 삽입된 변경된 서열을 가진다. 변경의 결과로, 이러한 서열 변종은 기준 아미노산 서열에 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 가진다. 예를 들면, 기준 서열의 100 아미노산 당 변경 즉 삭제, 삽입 또는 치환의 임의의 조합이 10개 이하인 변종 서열은 기준 서열에 "최소한 90% 일치" 한다.
비-보존적 아미노산 치환을 가지는 것이 가능하지만, 치환은 치환된 아미노산이 기준 서열 내 대응 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 성질을 가지는 보존적 아미노산 치환인 것이 바람직하다. 예를 들자면, 보존적 아미노산 치환은 하나의 지방족 또는 소수성 아미노산, 일례로 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신의 또다른 것과의 치환; 하나의 하이드록실-함유 아미노산, 일례로 세린 및 트레오닌, 의 또다른 것과의 치환; 하나의 산성 잔기, 일례로 글루탐산의 또다른 것과의 치환; 하나의 아미드-함유 잔기, 일례로 아스파라긴 및 글루타민의 또다른 것과의 교체; 하나의 방향성 잔기, 일례로 페닐알라닌 및 타이로신의 또다른 것과의 교체; 하나의 염기성 잔기, 일례로 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 또다른 것과의 교체; 및 하나의 작은 아미노산, 일례로, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 및 글라이신의 또다른 것과의 교체를 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 수 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합은 물론, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 정보제공 분자 또는 효소의 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
중요하게, 서열 변종 내 변경은 각각의 기준 서열의 기능성, 현재 사례에서, 예를 들면, 동일한 에피토프에 결합 및/또는 HBV 및 HDV의 감염을 충분히 중화시키는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 서열의 기능성을 폐지하지 않는다. 어느 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기, 각각이 이러한 기능성을 폐지하지 않고 치환, 삽입 또는 삭제될 수 있는지를 결정하는 안내는 당해 분야에서 잘 알려진 컴퓨터 프로그램의 사용에 의해 발견될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 지정된 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 "유래된" 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 기원을 지칭한다. 바람직하게는, 특정 서열로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 그것이 유래된 서열 또는 그의 부분에 본질적으로 일치하는 아미노산 서열을 가지고, 그로써 "본질적으로 일치"는 상기에서 정의되 서열 변종을 포함한다. 바람직하게는, 특정 펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 특정 펩티드 또는 단백질 내 대응 도메인로부터 유래된다. 그것에 의해서, "대응"은 구체적으로 동일한 기능성을 지칭한다. 예를 들면, "세포외 도메인"은 (또다른 단백질의) 또다른 "세포외 도메인"에 대응하고, 또는 "막관통 도메인"은 (또다른 단백질의) 또다른 "막관통 도메인"에 대응한다. 펩티드, 단백질 및 핵산의 "대응" 일부는 따라서 당해 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 인식 가능하다. 마찬가지로, 다른 서열에서 "유래된" 서열은 통상적으로 당해 분야의 통상의 기술자에게 서열 내 그의 기원을 가지는 것으로 쉽게 인식가능하다.
바람직하게는, 또다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 개시(staring) 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (이로부터 그것이 유래된)에 일치할 수 있다. 하지만, 또다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 또한 개시 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (이로부터 그것이 유래된)에 관한 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있고, 구체적으로 또다른 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유래된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 상기 기술된 개시 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (이로부터 그것이 유래된)처럼 기능적 서열 변종일 수 있다. 예를 들면, 펩티드/단백질에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기와 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입 또는 삭제가 일어날 수 있다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "돌연변이"는 기준 서열, 일례로 대응 유전자 서열에 비교하여 핵산 서열 내 및/또는 아미노산 서열 내 변화와 관련된다. 돌연변이는, 일례로 유전자 서열에 비교하여, 예를 들면, (자연적으로 발생하는) 신체 돌연변이, 자연발생 돌연변이, 유도된 돌연변이, 일례로 효소, 화학물질 또는 방사선에 의해 유도된, 또는 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) (핵산 서열 내 및/또는 아미노산 서열 내 특이적 및 의도적 변화를 만드는 분자 생물학적 방법)에 의해 획득된 돌연변이일 수 있다. 따라서, 용어 "돌연변이" 또는 "돌연변이화"는, 일례로 핵산 서열 내 또는 아미노산 서열 내, 물리적으로 돌연변이를 만드는 것을 또한 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 치환, 삭제 및 삽입은 물론 수 개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 아미노산의 역전(inversion)을 포함한다. 아미노산 서열 내 돌연변이를 도달하기 위하여, 바람직하게는 돌연변이는 (재조합) 돌연변이된 폴리펩티드를 발현하기 위하여 상기 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내로 도입될 수 있다. 돌연변이는 일례로, 변경함에 의해, 일례로, 부위-특이적 돌연변이에 의해, 하나의 아미노산을 암호화하는 핵산 분자의 코돈에서 상이한 아미노산을 암호화하는 코돈을 초래, 또는 서열 변종을 합성함에 의해, 일례로, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 알아서 핵산 분자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이할 필요 없이 폴리펩티드의 변종을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 합성을 디자인함에 의해 도달할 수 있다.
본 발명은, 다른 결과들 사이에서, B형 간염 및 델타 바이러스의 중화에 대단히 강력한 항체는 물론, 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프의 발견 및 분리에 기초한다. 이러한 항체는, B형 간염 바이러스를 중화하기 위하여 오직 적은 양의 항체가 요구되기 때문에 선호된다. 게다가, D형 간염에 사용가능한 치료법이 현재 없다. 본 발명에 따른 항체는 HBV 및 HDV의 예방은 물론 치료 또는 약화에 대단히 효과적이다. 게다가, 본 발명에 따른 항체는 상이한 - 바람직하게는 알려진 모든 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 유전형 및 상이한 - 바람직하게는 알려진 모든 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 감염형 돌연변이체에 결합한다.
항체 및 그의 항원-결합 단편
첫 번째 측면에서 본 발명은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합하고 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스에의 감염을 중화하는 분리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "항체"는, 이에 제한됨 없이, 전체 항체, 항체 단편, 구체적으로 항원 결합 단편, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 재조합 항체 및 유전적으로 재조합된 항체 (변종 또는 돌연변이체 항체)를 본 발명에 따른 특징적 성질이 보유되는 한 포함하는 다양한 형태의 항체를 아우른다. 인간 항체 및 단일클론 항체가 바람직하고 특별히 바람직한 것은 인간 단일클론 항체, 구체적으로 재조합 인간 단일클론 항체과 같은 것이다.
인간 항체는 당해 분야에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한, 면역화 되면서, 인간 항체의 전체 레파토리 또는 선택이 가능한 트랜스제닉 동물 (일례로, 마우스) 내에서 생산될 수 있다. 이러한 생식-계통 돌연변이체 마우스 내 인간 생식 계통 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 유발되면서 인간 항체의 생산을 초래할 것이다 (참조, 일례로, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340). 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 내에서 생산될 수 있다 (Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Cole et al. 및 Boerner et al.의 테크닉은 인간 단일클론 항체의 제조에 사용가능하다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 바람직하게는, 인간 단일클론 항체는 Traggiai E, Becker S, Subbarao K, Kolesnikova L, Uematsu Y, Gismondo MR, Murphy BR, Rappuoli R, Lanzavecchia A. (2004): An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10(8):871-5에 기술된 개선된 EBV-B 세포 불멸화(immortalization)를 사용하여 제조된다. 용어 "인간 항체"는 본 명세서에 사용된 바처럼 또한, 일례로 가변 영역 내에서, 본 발명에 따른 성질을 본 명세서에 기술된 것처럼 발생시키도록 변형된, 그러한 항체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "가변 영역" (경쇄 (VL)의 가변 영역, 중쇄 (VH)의 가변 영역)은 항체를 항원에 결합하는 데 직접적으로 관여되는 경쇄 및 중쇄의 쌍의 각각을 뜻한다.
본 발명의 항체는 임의의 동형(isotype) (일례로, IgA, IgG, IgM, 즉 α, γ 또는 μ 중쇄)이 될 수 있으나, 그러나 바람직하게는 IgG일 것이다. IgG 동형 내에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스일 수 있고, 그로써 IgG1이 바람직하다. 본 발명의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다. IgG-유형의 HBsAg-특이적 항체는 또한 유리하게 감염된 세포로부터 HBV 및 HbsAg의 방출을 - FcRN-IgG 수용체를 통해 간세포 안으로 IgG의 항원-비의존적 흡수에 기초하여 - 막을 수 있다. 그러므로, IgG-유형의 HBsAg-특이적 항체는 세포 내적으로 결합하고 그것에 의해서 HBV 비리온 및 HbsAg의 방출을 막을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 정제된 항체, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv이다.
본 발명의 항체는 따라서 바람직하게는 인간 항체, 단일클론 항체, 인간 단일클론 항체, 재조합 항체 또는 정제된 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 단편, 특히 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 단편을 제공한다. 그러한 단편은, 이에 제한되지 않지만, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함한다. 비록 본 명세서는, 청구항을 포함하여, 몇몇 장소에서, 명시적으로 항원 결합 단편(들), 항체 단편(들), 항체의 변종(들) 및/또는 유도체(들)을 지칭하지만, 용어 "항체" 또는 "본 발명의 항체"는 항체의 모든 카테고리, 다시 말해, 항원 결합 단편(들), 항체 단편(들), 항체의 변종(들) 및 유도체(들)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 항체의 단편은 효소, 예를 들어 펩신 또는 파파인과의 소화를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황 결합의 분해에 의해 항체로부터 획득될 수 있다. 대안적으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄의 서열의 일부의 클로닝 및 발현에 의해 획득될 수 있다. 항체 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)을 아우른다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 항체로부터의 CDR을 포함하는 scFv를 포함한다. 또한 중쇄 또는 경쇄 단량체 및 이량체, 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체는 물론, 단쇄 항체, 일례로, 그 내에서 펩티드 링커에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 합쳐지는 단쇄 Fv도 포함된다.
본 발명의 항체 단편은 일가(monovalent) 또는 다가(multivalent) 상호작용을 전해줄 수 있고 상기 기술된 것처럼 다양한 구조에 함유될 수 있다. 사례를 들면, scFv 분자는 삼가의 "트리아바디" 또는 사가의 "테트라바디"를 생성하기 위해 합성될 수 있다. scFv 분자는 이가의 미니바디를 가져오는 Fc 영역의 도메인을 포함할 수 있다. 더불어, 본 발명의 서열은 본 발명의 서열이 본 발명의 에피토프를 타겟하고 분자의 다른 영역은 다른 타겟에 결합하는 다가특이성 분자의 성분이 될 수 있다. 예시적 분자는, 이에 제한되지 않지만, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab3, 이중특이적 scFv, 및 디아바디를 포함한다 (Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
본 발명에 따른 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 항체는 실질적으로 다른 폴리펩티드를 포함하지 않는 조성물 내에 존재할 것이고, 일례로, 여기서 조성물의 90% (중량으로) 미만, 통상적으로 60% 미만 및 더 통상적으로 50% 미만이 다른 폴리펩티드로 구성된다.
본 발명에 따른 항체는 인간 내 및/또는 비-인간 (또는 이종) 숙주 내에서, 일례로, 마우스 내에서 면역원성일 수 있다. 예를 들면, 항체는 비-인간 숙주 내에서는 면역원성이지만, 인간 숙주 내에서는 아닌 이디오토프(idiotope)를 가질 수 있다. 인간 용도를 위한 본 발명의 항체는 예를 들어 마우스, 산양, 토끼, 래트(rat), 비-영장류 포유류, 등등과 같은 숙주로부터 쉽게 분리될 수 없고 인간화에 의해 또는 제노-마우스로부터 일반적으로 획득될 수 없는 것들을 포함한다.
본 발명에 따른, 항체, 및 그의 항원 결합 단편은 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합한다. B형 간염 바이러스의 외피는 세 개의 "HBV 외피 단백질" (또한 "HBsAg"으로 알려진, "B형 간염 표면 항원"): S 단백질 ("small"의 뜻으로, 또한 S-HBsAg로도 지칭됨), M 단백질 ("middle"의 뜻으로, 또한 M-HBsAg로도 지칭됨) 및 L 단백질 ("large"의 뜻으로, 또한 L-HBsAg로도 지칭됨)을 함유한다. S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 동일한 C-말단 끝 (또한 "S 도메인"으로도 지칭됨, 226 아미노산)을 공유하고, 이는 S 단백질 (S-HBsAg)에 대응하고 바이러스 조립 및 감염력에 중대하다. S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 세포질세망(endoplasmic reticulum, ER) 내에서 합성, 조립되고, 골지 기관(Golgi apparatus)을 통해 입자처럼 분비된다. S 도메인은 네 개의 예상되는 막관통 (TM) 도메인을 포함하고, 그로써 S 도메인의 N-말단은 물론 C-말단 양쪽은 루멘에 노출된다. 막관통 도메인 TM1 및 TM2은 ER 맴브레인으로의 동시번역 단백질 통합(cotranslational protein integration)을 위해 양쪽 모두 필요하고 막관통 도메인 TM3 및 TM4은 C-말단 내 S 도메인의 세 번째에 자리한다. HBsAg의 "항원성 루프 영역"은 HBsAg의 S 도메인의 예상되는 TM3 및 TM4 막관통 도메인 사이에 자리하고, 그로써 항원성 루프 영역은 전체 226개 아미노산을 포함하는 S 도메인의 아미노산 101 - 172을 함유한다 (Salisse J. and Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328). 감염력의 결정은 HBV 외피 단백질의 항원성 루프 영역에 의한다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 구체적으로, HBsAg의 119 내지 125 번째의 잔기는, HBV 및 HDV의 감염력에 요구되는 가장 중요한 서열인 것으로 판명된 CXXC 모티프를 함유하였다 (Jaoude GA, Sureau C, Journal of Virology, 2005;79:10460-6).
본 명세서에서 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열 내 위치를 지칭하는 경우, 이는 서열목록 번호: 3 (하기)에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 자연적 또는 인공적 서열 변종을 지칭한다.
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI
(서열목록 번호: 3; 아미노산 101 - 172는 밑줄로 보였다)
예를 들면, 표현 "S 도메인의 아미노산 101 - 172"은 서열목록 번호: 3에 따른 폴리펩티드의 위치 101 - 172로부터의 아미노산 잔기를 지칭한다. 하지만, 당해 분야의 기술자는 돌연변이 또는 변동이 (이에 제한되지 않지만, 치환, 삭제 및/또는 추가를 포함함, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 것처럼 상이한 유전형의 HBsAg 또는 상이한 HBsAg 돌연변이체) HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열 내에서 자연적으로 발생하거나 또는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 서열 내로 그의 생물학적 성질에 영향없이 인공적으로 도입될 수 있다는 것을 이해한다. 그러므로, 본 발명에서, 용어 "HBsAg의 S 도메인"은, 예를 들면, 서열목록 번호: 3에 따른 폴리펩티드 및 그의 자연적 또는 인공적 돌연변이체를 포함하는, 이러한 폴리펩티드를 모두 포함하는 터이다. 더불어, HBsAg의 S 도메인의 서열 단편이 본 명세서에 기술되는 경우 (일례로 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 101 - 172 또는 아미노산 120 - 130), 그들은 서열목록 번호: 3의 대응 서열 단편뿐 아니라, 그의 자연적 또는 인공적 돌연변이체의 대응 서열 단편도 포함한다. 예를 들면, 표현 "HBsAg의 S 도메인의 위치101 - 172로부터의 아미노산 잔기"는 서열목록 번호: 3의 위치 101 - 172로부터의 아미노산 잔기 및 그의 돌연변이체 (자연적 또는 인공적 돌연변이체)의 대응 단편을 포함한다. 본 발명에 따른, 표현 "대응 서열 단편" 또는 "대응 단편"은 서열이 최적화 정렬, 다시 말해, 서열이 가장 높은 백분율의 일치성을 얻도록 정렬된 때 서열의 동일한 위치에 자리한 단편을 지칭한다.
M 단백질 (M-HBsAg)은 "pre-S2"으로 불리는 55개 아미노산의 N-말단 도메인에 의해 연장된 S 단백질에 대응한다. L 단백질 (L-HBsAg)은 "pre-S1" (유전형 D)으로 불리는 108개 아미노산의 N-말단 도메인에 의해 연장된 M 단백질에 대응한다. L 단백질의 pre-S1 및 pre-S2 도메인은, 바이러스 조립에 절대적인 역할을 하는, 바이러스 입자의 내부 면 (ER의 세포질 측), 또는, 타겟 세포와의 상호작용이 가능하고 바이러스 감염력에 필요한, 외부 면 (ER의 내강 측) 에 존재할 수 있다. 게다가, HBV 표면 단백질 (HBsAgs)은 비리온 외피 내로 통합될 뿐 아니라 또한 ER-골지 중간 구획 막으로부터 자발적으로 싹터서 분비에 의해 세포로부터 방출되는 빈 "서브바이러스 입자" (SVPs)를 형성한다.
모든 세 개의 HBV 외피 단백질 S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 S 도메인을 포함하기 때문에, 모든 세 개의 HBV 외피 단백질 S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg는 또한 "항원성 루프 영역"을 포함한다. 그에 따라, 본 발명에 따른, HBV를 중화시키고 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합하는, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 모든 세 개의 HBV 외피 단백질 S-HBsAg, M-HBsAg 및 L-HBsAg에 결합한다.
게다가, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스와의 감염을 중화시킨다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스의 바이러스 감염력을 감소시킨다.
실험실에서 바이러스 감염력 (또는 "중화")을 연구하고 정량화하기 위해 당해 분야의 기술자는 다양한 표준 "중화 어세이"를 안다. 중화 어세이를 위하여 동물 바이러스는 세포 및/또는 세포주에서 전형적으로 번식된다. 본 발명의 맥락에서 중화 어세이가 바람직하고, 여기서 배양된 세포는 검사되는 항체의 존재 (또는 부존재) 하에 고정된 양의 HBV 또는 HDV와 인큐베이트된다. 판독정보로 세포 배양 상청액 내로 분비된 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 또는 B형 간염 e 항원 (HBeAg)의 수준이 사용되거나 및/또는 HBcAg 염색이 평가될 수 있다. HDV를 위해, 예를 들면 델타 항원 면역형광 염색이 평가될 수 있다.
HBV 중화 어세이의 바람직한 구현예에서, 배양된 세포, 예를 들면 HepaRG 세포, 구체적으로 분화 HepaRG 세포는, 검사되는 항체의 존재 (또는 부존재) 하에, 예를 들면 16 시간 동안 37°C에서, 고정된 양의 HBV와 인큐베이트된다. 이 인큐베이션은 바람직하게는 (일례로 4% PEG 8000이 보충된) 배지에서 수행된다. 인큐베이션 후에, 세포는 세척되고 부가 배양될 수 있다. 바이러스 감염력을 측정하기 위해, 배양 상청액 내로 분비된 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 B형 간염 e 항원 (HBeAg)의 수준이, 일례로 감염 후 7일 부터 11일 까지, 효소 면역 측정법 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로, HBcAg 염색은 면역형광 어세이에서 평가될 수 있다. HDV 중화 어세이의 바람직한 구현예에서 본질적으로 HBV 를 위한 동일한 어세이가, HDV 담체로부터의 혈청이 (HBV 대신) 분화 HepaRg 세포에서 HDV 감염 접종원으로 사용될 수 있다는 상이점과 함께, 사용될 수 있다. 검출을 위해, 델타 항원 면역형광 염색이 판독기로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 높은 중화 효능을 가진다. B형 간염 바이러스 (HBV) 및 델타 간염 바이러스 (HDV)의 50% 중화를 위해 요구되는 본 발명의 항체의 농도는, 예를 들면, 약 10 μg/ml 이하이다. 바람직하게는, HBV 및 HDV의 50% 중화를 위해 요구되는 본 발명의 항체의 농도는 약 5 μg/ml, 더 바람직하게는 HBV 및 HDV의 50% 중화를 위해 요구되는 본 발명의 항체의 농도는 약 1 μg/ml, 보다 더 바람직하게는, HBV 및 HDV의 50% 중화를 위해 요구되는 본 발명의 항체의 농도는 약 750 ng/ml이다. 가장 바람직하게는, HBV 및 HDV의 50% 중화를 위해 요구되는 본 발명의 항체의 농도는 500 ng/ml 이하, 일례로 450, 400, 350, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50　ng/ml 이하이다. 이는 항체의 오직 낮은 농도가 HBV 및 HDV의 50% 중화를 위해 요구된다는 것을 의미한다. 특이성 및 효능은 당해 분야에 알려진 표준 어세이를 사용하여 측정될 수 있다.
HBV 및 HDV 모두를 강력하게 중화하는, 본 발명에 따른, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, B형 간염 및 D형 간염의 예방 및 치료에 유용하다. 본 맥락에서 HDV 감염은 전형적으로 HBV 감염과 동시에 또는 순차로 발생하고 (HDV는 그 자신의 복제를 위해 HBV의 보조를 요구하므로 HBV 부존재하에서의 HDV 접종은 D형 간염을 초래하지 않는다) 및 D형 간염은 전형적으로 만성 HBV 보균자에서 관찰된다는 것은 흥미롭다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBsAg 및 HBV의 제거를 촉진한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBV 및 B형 간염 바이러스의 서브바이러스 입자 (SVP's) 모두의 제거를 촉진한다. HbsAg의 또는 서브바이러스 입자의 제거는, 일례로 B형 간염 환자로부터, 예를 들면 혈액 샘플 내 HbsAg의 수준을 측정함에 의해 평가될 수 있다. 유사하게, HBV의 제거는, 일례로B형 간염 환자로부터, 예를 들면 혈액 샘플 내 HBV의 수준을 측정함에 의해 평가될 수 있다.
HBV에 감염된 환자의 혈청 내에는, 감염성 입자 (HBV)에 더불어, 비교적 더작은 구 및 다양한 길이의 필라멘트 형태의 HBV 외피 단백질 (HBsAg) 단독으로 구성된 빈 서브바이러스 입자 (SVP)의 과잉 (전형적으로 1,000- 내지 100,000-배)이 전형적으로 있다. 서브바이러스 입자는 HBV의 세포내 바이러스 복제 및 유전자 발현을 강하게 증진하는 것을 보였다 (Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). 감염력은 바이러스의 수뿐 아니라 SVP의 수에도 의존하기 때문에, 이는 HBV를 함유하는 혈청의 감염력의 맥락에서 또한 중요하다 (Bruns M. et al. 1998 J Virol 72(2): 1462-1468). 게다가, 서브바이러스 입자의 과잉은 중화 항체를 흡수함에 의해 미끼 역할을 하고 그러므로 감염의 제거를 지연시킬 수 있다. 전형적으로, B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 손실의 도달은 따라서 치료의 이상적 종점 및 만성 B형 간염 (CHB) 치유의 가장 가까운 결과인 것으로 여겨진다.
그에 따라, 바람직하게는 HbsAg의 제거, 구체적으로 B형 간염 바이러스의 서브바이러스 입자, 및 HBV의 제거를 촉진하는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 구체적으로 만성 B형 간염의 맥락에서, B형 간염의 개선된 치료를 가능케 한다. 그것에 의해서, 미끼로 작용하는 SVP에 의해 더 적은 항체가 흡수되므로 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 그의 중화 성질을 보다 더 강력하게 행사할 수 있다. 더불어, 바람직하게는 B형 간염 바이러스의 서브바이러스 입자의 제거를 촉진하는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBV를 함유하는 혈청의 감염력을 감소시킨다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, Fc 모이어티를 포함한다. 더 바람직하게는, Fc 모이어티는 인간 기원으로부터, 일례로 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4로부터 유래하고, 그로써 인간 IgG1가 특히 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "Fc 모이어티"는 파파인 분할 부위 (일례로, 자연적 IgG 내 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기를 114가 되도록 함)의 바로 위쪽 힌지 영역 내에서 시작하여 면역글로불린 중쇄의 C-말단에서 끝나는 면역글로불린 중쇄의 부분으로부터 유래된 서열을 지칭한다. 그에 따라, Fc 모이어티는 완전 Fc 모이어티 또는 그의 부분 (일례로, 도메인) 일 수 있다. 완전 Fc 모이어티는 최소한 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인 (일례로, EU 아미노산 위치 216-446)을 포함한다. 추가적 라이신 잔기 (K)는 때때로 Fc 모이어티의 최외 C-말단에 존재하나, 그러나 종종 성숙 항체로부터 분할된다. Fc 모이어티 내의 각각의 아미노산 위치는 당해 분야에서 인정되는 EU 넘버링 시스템 Kabat에 따라 넘버링되었고, 일례로, Kabat et al.에 의한, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 and 1987에서 참조해라.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 Fc 모이어티는 최소한 한 개의: 힌지 (일례로, 상부, 중부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변종, 부분, 또는 단편을 포함한다. 바람직한 구현예에서, Fc 모이어티는 최소한 힌지 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 포함한다. 더 바람직하게는, Fc 모이어티는 전체 Fc 모이어티이다. Fc 모이어티는 또한 자연적으로-발생한 Fc 모이어티에 관한 하나 이상의 아미노산 삽입, 삭제, 또는 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 최소한 한 개의 힌지 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인 (또는 그의 부분)이 삭제될 수 있다. 예를 들면, Fc 모이어티는: (i) CH2 도메인 (또는 그의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 그의 부분), (ii) CH3 도메인 (또는 그의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 그의 부분), (iii) CH3 도메인 (또는 그의 부분)에 융합된 CH2 도메인 (또는 그의 부분), (iv) 힌지 도메인 (또는 그의 부분), (v) CH2 도메인 (또는 그의 부분), 또는 (vi) CH3 도메인 또는 그의 부분을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
Fc 모이어티는 변형될 수 있어 자연적으로 발생한 면역글로불린 분자의 전체 Fc 모이어티로부터의 아미노산 서열은 다양한 반면, 자연적으로-발생한 Fc 모이어티에 의해 부여된 최소한 한 개의 선호되는 기능을 보유하는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에 이해될 것이다. 이러한 기능은 Fc 수용체 (FcR) 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능, 단백질 A 결합, 단백질 G 결합, 및 보체 결합을 포함한다. 이러한 기능에 중책인 및/또는 필수적인, 자연적으로 발생한 Fc 모이어티의 부분은 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.
예를 들면, 보체 캐스테이드를 활성화하기 위해 C1q는, 항원성 타겟에 부착된, 최소한 두 개 분자의 IgG1 또는 한 개 분자의 IgM에 결합한다 (Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). Burton, D. R.,은 아미노산 잔기 318 에서 337을 포함하는 중쇄 영역이 보체 고정에 관여되는 것을 기술하였다 (Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206). Duncan, A. R., 및 Winter, G.는 부위 특이적 돌연변이를 사용하여, Glu318, Lys320 및 Lys322이 C1q에 결합 부위를 형성하는 것을 보고하였다 (Nature 332 (1988) 738-740). C1q의 결합에서 Glu318, Lys320 및 Lys 322 잔기의 역할은 이들 잔기를 함유하는 짧은 합성 펩티드의 보체 매개된 용해를 억제하는 능력에 의해 추인되었다.
예를 들면, FcR 결합은 (항체의) Fc 모이어와 Fc 수용체 (FcRs)의 상호작용에 의해 매개될 수 있고, 이는 조혈 세포에서 특화된 세포 표면 수용체이다. Fc 수용체는 면역글로불린 상과(superfamily)에 속하고, 면역 복합체의 포식작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 항체로 코팅된 적혈구 및 다양한 다른 세포 타겟(일례로 종양 세포)의, 항체 의존적 세포 매개 세포독성을 통한, 용해 양자 모두를 매개함을 보여주었다 (ADCC; Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcRs는 면역글로불린 클래스에 대한 그들의 특이성으로 정의되고; IgG 항체를 위한 Fc 수용체는 FcγR로, IgE를 위한 것은 FcεR로, IgA를 위한 것은 FcαR 등으로 지칭되고 신생아 Fc 수용체는 FcRn로 지칭된다. Fc 수용체 결합은 예를 들면 Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; deHaas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248에 기술되어 있다.
자연적 IgG 항체 (FcγR)의 Fc 도메인에 의한 수용체의 교차-결합은 포식작용, 항체-의존적 세포성 세포독성, 및 염증 매개체의 방출은 물론, 면역 복합체 제거 및 항체 생산의 조절을 포함하는 광범위한 작동자 기능을 촉발한다. 그러므로, 수용체 (FcγR)의 교차-결합을 제공하는 Fc 모이어티가 바람직하다. 인간에서, 세 개 클래스의 FcγR이 특징 지어졌고, 이들은: (i) FcγRI (CD64), 이는 단량체 IgG에 높은 친화성으로 결합하고 그리고 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구에서 발현된다; (ii) FcγRII (CD32), 이는 복합 IgG에 중간 내지 낮은 친화성으로 결합하고, 널리, 구체적으로 백혈구에서 발현되고, 항체-매개 면역에서 핵심 플레이어가 되는 것으로 알려져 있고, 이는 FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC로 나누어질 수 있고, 이는 면역 시스템 내에서 상이한 기능을 수행하고, 그러나 유사 낮은 친화성으로 IgG-Fc에 결합하고, 이들 수용체의 엑토도메인(ectodomain)은 대단히 동종이다; 및 (iii) FcγRIII (CD16), 이는 IgG에 중간 내지 낮은 친화성으로 결합하고 두 개 형태로 실재한다: NK 세포, 대식세포, 호산구 및 몇몇 단핵구 및 T 세포 및 매개 ADCC에서 발견되는 FcγRIIIA 및 FcγRIIIB, 이는 호중구에서 높게 발현된다. FcγRIIA는 사멸에 관여하는 많은 세포(일례로 대식세포, 단핵구, 호중구)에서 발견되고 사멸 공정을 활성화할 수 있는 것처럼 여겨진다. FcγRIIB는 억제 공정에서 중요한 역할을 하는 것처럼 여겨지고 B-세포, 대식세포에서 및 비만 세포 및 호산구에서 발견된다. 중요하게, 모든 FcγRIIB의 75%가 간에서 발견된다 (Ganesan, L. P. et al., 2012: FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988). FcγRIIB는, 간에서 LSE로 불리는, 간 시누소이드 내피(Liver Sinusoidal Endothelium), 및 쿠퍼(Kupffer) 세포에서 풍부하게 발현되고 LSEC는 작은 면역 복합체 제거의 주요 부위이다 (Ganesan, L. P. et al., 2012: FcγRIIb on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes. Journal of Immunology 189: 4981-4988).
그에 따라, 본 발명에서 FcγRIIb에 결합할 수 있는 그러한 항체, 및 그의 항원 결합 단편, 예를 들면 FcγRIIb, 구체적으로 Fc 영역에 결합하기 위한 Fc 모이어티를 포함하는 항체, 예를 들어, 예를 들면 IgG-유형 항체가 바람직하다. 게다가, Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933에 의해 기술된 것처럼 돌연변이 S267E 및 L328F를 도입함에 의해 FcγRIIB 결합을 증진하도록 Fc 모이어티를 재조합하는 것이 가능하다.
그것에 의해서, 면역 복합체의 제거는 증진될 수 있다 (Chu, S., et al., 2014: Accelerated Clearance of IgE In Chimpanzees Is Mediated By Xmab7195, An Fc-Engineered Antibody With Enhanced Affinity For Inhibitory Receptor FcγRIIb. Am J Respir Crit, American Thoracic Society International Conference Abstracts). 그에 따라, 본 발명의 맥락에서, 돌연변이 S267E 및 L328F와 재조합된 Fc 모이어티를 포함하는, 구체적으로 Chu, S. Y. et al., 2008: Inhibition of B cell receptor-mediated activation of primary human B cells by coengagement of CD19 and FcgammaRIIb with Fc-engineered antibodies. Molecular Immunology 45, 3926-3933에 의해 기술된, 그러한 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 바람직하다.
B-세포에서 부가 면역글로불린 생산 및 동형 스위칭, 예를 들어 말하자면 IgE 클래스를 저지하는 기능을 하는 것으로 여겨진다. 대식세포에서, FcγRIIB은 FcγRIIA를 통해 매개되면서 포식작용을 억제하는 행동을 한다. 호산구 및 비만 세포에서 b 형은 그의 분리된 수용체에의 IgE 결합을 통해 이들 세포의 활성화를 저지하는 데 도움될 수 있다.
FcγRI 결합과 관련하여, 자연 IgG 내에서 최소한 한 개의 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329의 변형은 FcγRI에의 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4로 치환된, 위치 233-236의 IgG2 잔기는, FcγRI에의 결합을 103-배까지 감소시키고 항체-민감화 적혈구에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다 (Armour, K. L., et al. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624). FcγRII 결합과 관련하여, FcγRIIA에 대한 감소된 결합은 일례로 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 중 최소한 한 개의 IgG 돌연변이에서 발견된다. FcγRIII 결합과 관련하여, FcγRIIIA에 대한 감소된 결합은 일례로 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376 중 최소한 한 개의 돌연변이에서 발견된다. Fc 수용체에 대한 인간 IgG1에서의 결합 부위의 맵핑, 상기 언급된 돌연변이 부위 및 FcγRI 및 FcγRIIA에의 결합을 측정하는 방법은 Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604에 기술되어 있다.
중대한 FcγRII에의 결합과 관련하여, 자연적 IgG Fc의 두 개 영역이 FcγRIIs 및 IgGs의 상호작용에 결정적인 것으로 나타나고, 다시 말해 (i) IgG Fc의 하부 힌지 부위, 구체적으로 아미노산 잔기 L, L, G, G (234 - 237, EU 넘버링), 및 (ii) IgG Fc의 CH2 도메인의 인접한 영역, 구체적으로 하부 힌지 영역에 인접한 상부 CH2 도메인 내의 루프 및 가닥, 일례로 P331의 영역 내이다 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318). 게다가, FcγRI는 IgG Fc의 동일한 부위에 결합하는 것으로 나타나고, 반면에 FcRn 및 단백질 A는 IgG Fc의 상이한 부위에 결합하고, 이는 CH2-CH3 접촉면에 있는 것으로 나타난다 (Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 - 5318).
예를 들면, Fc 모이어티는 FcRn 결합 또는 연장된 반감기를 위해 요구되는 것으로 당해 분야에서 알려진 Fc 모이어티의 최소한 부분을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 항체의 Fc 모이어티는 단백질 A 결합을 위해 요구되는 것으로 당해 분야에서 알려진 것의 최소한 부분을 포함하고 및/또는 본 발명의 항체의 Fc 모이어티는 단백질 G 결합을 위해 요구되는 것으로 당해 분야에서 알려진 Fc 분자의 최소한 부분을 포함한다. 바람직하게는, 보유된 기능은 HBsAg 및 HBV의 제거이고, 이는 FcγR 결합에 의해 매개되는 것으로 추정된다. 그에 따라, 바람직한 Fc 모이어티는 FcγR 결합을 위해 요구되는 것으로 당해 분야에서 알려진 최소한 부분을 포함한다. 상기 개요된 것처럼, 바람직한 Fc 모이어티는 따라서 최소한 (i) 자연적 IgG Fc의 하부 힌지 부위, 구체적으로 아미노산 잔기 L, L, G, G (234 - 237, EU 넘버링), 및 (ii) 자연적 IgG Fc의 CH2 도메인의 인접한 영역, 구체적으로 하부 힌지 영역에 인접한 상부 CH2 도메인 내의 루프 및 가닥, 일례로 P331의 영역 내, 예를 들면 P331 주변의 자연적 IgG Fc의 상부 CH2 도메인 내 최소한 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 연속적 아미노산의 영역, 일례로 자연적 IgG Fc의 아미노산 320 내지 340 (EU 넘버링)을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바처럼, 용어 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 두 개 이상의 Fc 모이어티에 의해 형성된 면역글로불린의 부분을 지칭한다. 예를 들면, Fc 영역은 단량체 또는 "단일-사슬" Fc 영역 (즉, scFc 영역)일 수 있다. 단쇄 Fc 영역은 단일 폴리펩티드 사슬 내에서 연결된 Fc 모이어티를 포함한다 (일례로, 단일 근접한 핵산 서열에 암호화). 예시적 scFc 영역은 WO 2008/143954 A2에 개시되어 있다. 바람직하게는, Fc 영역은 이량체 Fc 영역이다. "이량체 Fc 영역" 또는 "dcFc" 는 두 개의 분리된 면역글로불린 중쇄의 Fc 모이어티에 의해 형성된 이량체를 지칭한다. 이량체 Fc 영역은 두 개의 일치하는 Fc 모이어티의 동종이량체 (일례로, 자연적으로 발생한 면역글로불린의 Fc 영역) 또는 두 개의 비-일치하는 Fc 모이어티의 이종이량체일 수 있다.
Fc 영역의 Fc 모이어티는 동일한 또는 상이한 클래스 및/또는 서브클래스일 수 있다. 예를 들면, Fc 모이어티는 면역글로불린 (일례로, 인간 면역글로불린) IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, Fc 영역의 Fc 모이어티는 동일한 클래스 및 서브클래스이다. 하지만, Fc 영역 (또는 하나 이상의 Fc 영역의 Fc 모이어티)는 또한 키메릭일 수 있고, 그로써 키메라 Fc 영역은 상이한 면역글로불린 클래스 및/또는 서브클래스로부터 유래된 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이량체 또는 단일-사슬 Fc 영역의 최소한 두 개의 Fc 모이어티는 상이한 면역글로불린 클래스 및/또는 서브클래스로부터 올 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 키메라 Fc 영역은 하나 이상의 키메라 Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 키메라 Fc 영역 또는 모이어티는 첫 번째 서브클래스 (일례로, IgG1, IgG2, 또는 IgG3 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 하나 이상의 부분을 포함할 수 있는 반면 Fc 영역 또는 모이어티의 나머지는 상이한 서브클래스이다. 예를 들면, Fc 폴리펩티드의 Fc 영역 또는 모이어티는 첫 번째 서브클래스 (일례로, IgG1, IgG2 또는 IgG4 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 두 번째 서브클래스 (일례로, IgG3 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역 또는 모이어티는 첫 번째 서브클래스 (일례로, IgG4 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 힌지 및/또는 CH2 도메인 및 두 번째 서브클래스 (일례로, IgG1, IgG2, 또는 IgG3 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키메라 Fc 영역은 첫 번째 서브클래스 (일례로, IgG4 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된 Fc 모이어티 (일례로, 전체 Fc 모이어티) 및 두 번째 서브클래스 (일례로, IgG1, IgG2 또는 IgG3 서브클래스)의 면역글로불린으로부터 유래된Fc 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 면역글로불린으로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 면역글로불린으로부터의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 분자로부터의 CH1 도메인 및 CH2 도메인 및 IgG1 분자로부터의 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역 또는 모이어티는 항체의 특정 서브클래스로부터의 CH2 도메인의 부분, 일례로, CH2 도메인의 EU 위치 292-340를 포함할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역 또는 모이어티는 IgG4 모이어티로부터 유래된 CH2의 위치 292-340의 아미노산 및 IgG1 모이어티로부터 유래된 CH2의 나머지를 포함할 수 있다 (대안적으로, CH2의 292-340은 IgG1 모이어티로부터 유래되고 CH2의 나머지는 IgG4 모이어티로부터 유래될 수 있다).
게다가, Fc 영역 또는 모이어티는 (추가적으로 또는 대안적으로) 예를 들면 키메라 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키메라 힌지는, 일례로 부분적으로, IgG1, IgG2, 또는 IgG4 분자 (일례로, 상부 및 하부 중부 힌지 서열)로부터 및, 부분적으로, IgG3 분자 (일례로, 중부 힌지 서열)로부터 유래될 수 있다. 또다른 실시예에서, Fc 영역 또는 모이어티는, 부분적으로, IgG1 분자로부터 및, 부분적으로, IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다. 또다른 실시예에서, 키메라 힌지는 IgG4 분자로부터의 상부 및 하부 힌지 도메인 및 IgG1 분자로부터의 중부 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 키메라 힌지는, 예를 들면, IgG4 힌지 영역의 중부 힌지 도메인 내 EU 위치 228에 프롤린 치환 (Ser228Pro)을 도입함에 의해 만들어질 수 있다. 또다른 구현예에서, 키메라 힌지는 IgG2 항체로부터의 EU 위치 233-236의 아미노산 및/또는 Ser228Pro 돌연변이를 포함할 수 있고, 여기서 힌지의 남는 아미노산은 IgG4 항체로부터 올 수 있다 (일례로, 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVAGP의 키메라 힌지). 본 발명에 따른 항체의 Fc 모이어티에 사용될 수 있는, 부가 키메라 힌지는 US 2005/0163783 A1에 기술되어 있다.
본 발명에서 Fc 모이어티, 또는 Fc 영역은, 인간 면역글로불린 서열로부터의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이 바람직하다 (일례로, 인간 IgG 분자로부터의 Fc 영역 또는 Fc 모이어티로부터). 하지만, 폴리펩티드는 또다른 포유류 종으로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 영장류 Fc 모이어티 또는 영장류 결합 부위는 대상 폴리펩티드 내 포함될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 쥐과 아미노산은 Fc 모이어티 내 또는 Fc 영역 내에 존재할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는, 구체적으로 상기 기술된 Fc 모이어티에 더불어, 불변 영역으로부터 유래된 다른 부분, 구체적으로 IgG의 불변 영역으로부터, 바람직하게는 IgG1의 불변 영역으로부터, 더 바람직하게는 인간 IgG1의 불변 영역으로부터의 것을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는, 구체적으로 상기 기술된 Fc 모이어티에 더불어, 불변 영역의 모든 다른 부분, 구체적으로 IgG의 불변 영역의 모든 다른 부분, 바람직하게는 IgG1의 불변 영역의 모든 다른 부분, 더 바람직하게는 인간 IgG1의 불변 영역의 모든 다른 부분을 포함한다.
상기 개요된 것처럼, 특히 바람직한 본 발명에 따른 항체는 인간 IgG1으로부터 (전체) Fc 영역을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는, 구체적으로 인간 IgG1으로부터 유래된 (전체) Fc 영역에 더불어 또한 IgG의 불변 영역의 모든 다른 부분, 바람직하게는 IgG1의 불변 영역의 모든 다른 부분, 더 바람직하게는 인간 IgG1의 불변 영역의 모든 다른 부분을 포함한다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 HBsAg 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J에 결합하는 것이 또한 바람직하다. HbsAg의 상이한 유전형의 실시예는 다음을 포함한다: GenBank 등록 번호 J02203 (HBV-D, ayw3), GenBank 등록 번호 FJ899792.1 (HBV-D, adw2), GenBank 등록 번호 AM282986 (HBV-A), GenBank 등록 번호 D23678 (HBV-B1 Japan), GenBank 등록 번호 AB117758 (HBV-C1 Cambodia), GenBank 등록 번호 AB205192 (HBV-E Ghana), GenBank 등록 번호 X69798 (HBV-F4 Brazil), GenBank 등록 번호 AF160501 (HBV-G USA), GenBank 등록 번호 AY090454 (HBV-H Nicaragua), GenBank 등록 번호 AF241409 (HBV-I Vietnam) 및 GenBank 등록 번호 AB486012 (HBV-J Borneo). 상이한 유전형의 HBsAg의 S 도메인의 항원성 루프 영역의 아미노산 서열은 표 1 에 보여진다 (서열목록 번호: 5 - 15).
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 6개, 보다 더 바람직하게는 최소한 8개, 및 특히 바람직하게는 모든 10개의 HBsAg 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J에 결합한다. HBV는 게놈 서열에 따라 많은 유전형으로 분화된다. 지금까지, HBV 게놈의 여덟 개의 잘 알려진 유전형 (A-H)이 정의되었다. 게다가, 두 개의 새로운 유전형, I 및 J도 또한 확인되었다 (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434). 유전형은 병의 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있고 항바이러스 치료에 대응하여 유전형 사이의 상이점이 결정되어진다. 예를 들면, 유전형 A는 만성의 경향이 있고, 반면에 바이러스 돌연변이는 자주 유전형 C에서 만난다. 만성 및 돌연변이 빈도 모두는 유전형 D에서는 흔하다. 게다가, HBV의 유전형은 전 세계에 상이하게 분포되어 있다 (Sunbul M., 2014, World J Gastroenterol 20(18): 5427-5434). 바람직하게는 최소한 6개의, 바람직하게는 최소한 8개의, 더 바람직하게는 모든 10 개의 HBsAg 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J에 결합하는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 제공함에 의해, 상이한 유전형에 매우 넓게 결합하는 항체가 제공된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 항원성 루프 영역 내에 돌연변이를 갖는 HBsAg 돌연변이체에 결합한다: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A. 이들 돌연변이체는 HbsAg 유전형 D의 S 도메인에 기초하여 자연적으로 발생한 돌연변이체이고, Genbank 등록 번호 FJ899792 (서열목록 번호: 4), 그로써 돌연변이된 아미노산 잔기(들)은 이름으로 표시된다.
서열목록 번호: 4:
MENVTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPTCPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSTLSPFLPLLPIFFCLWVYI
(항원성 루프 영역, 즉 아미노산 101 - 172는 밑줄로 보여진다).
상이한 돌연변이체의 HBsAg의 S 도메인의 항원성 루프 영역의 아미노산 서열은 표 1 에 보여진다(서열목록 번호: 16 - 33).
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 12, 보다 더 바람직하게는 최소한 15, 및 특히 바람직하게는 모든 18개의 항원성 루프 영역 내에 돌연변이를 갖는 감염성 HBsAg 돌연변이체에 결합한다: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 한 개의, 바람직하게는 최소한 두 개의, 더 바람직하게는 최소한 세 개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 115 - 133으로부터, 바람직하게는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133 으로부터, 더 바람직하게는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130으로부터 선택된다. 흥미롭게, 아미노산의 위치는 (일례로 115 - 133, 120 - 133, 120 - 130) 상기 기술된 것처럼 HBsAg의 S 도메인을 지칭하고, 이는 모든 세개의 HBV 외피 단백질 S-HBsAg, M-HbsAg, 및 L-HbsAg에 존재하고, 여기서 S-HbsAg는 전형적으로 HBsAg의 S 도메인에 대응한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBsAg의 항원성 루프 영역 내 에피토프에 결합하고, 그로써 에피토프는 전형적으로 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115 - 133으로부터 선택된, 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 133으로부터 선택된, 더 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 130으로부터 선택된 위치에 자리한 하나 이상의 아미노산에 의해 형성된다.
용어 "의해 형성되다"는 본 명세서에 사용된 바처럼 에피토프의 맥락에서, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프는 선형 (연속적) 또는 입체형태적 (비연속적)일 수 있다는 것을 의미한다. 선형 또는 순차적 에피토는 항체에 의해 이의 아미노산의 선형 서열, 또는 일차 구조에 의해 인식되는 에피토프이다. 대조적으로, 입체형태적 에피토프는 특이적 삼-차원 형상 및 단백질 구조를 가진다. 그에 따라, 만약 에피토프가 선형 에피토프이고 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115 - 133으로부터 선택된, 바람직하게는 아미노산 위치 120 -133으로부터 선택된 위치에 자리한 한 개 초과의 아미노산을 포함하는 경우에는, 에피토프에 의해 포함되는 아미노산은 전형적으로 일차 구조 (즉 아미노산 서열 내 연속적 아미노산)의 인접한 위치에 자리한다. 입체형태적 에피토프 (3D 구조)의 사례에서는, 대조적으로, 아미노산 서열은 전형적으로 에피토프처럼 3D 구조를 형성하고, 따라서, 에피토프를 형성하는 아미노산 (또는 에피토프에 "의해 포함되는" 아미노산)은 일차 구조의 인접한 위치에 자리하거나 또는 하지 않을 수 있다 (즉 아미노산 서열 내 연속적 아미노산이거나 또는 아닐 수 있음).
바람직하게는, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프는 오직 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115 - 133으로부터 선택된, 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 133으로부터 선택된, 더 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 130으로부터 선택된 아미노산(들)에 의해 형성된다. 다시 말해서, (부가) 아미노산이 - 위치 115 - 133, 바람직하게는 위치 120 - 133, 더 바람직하게는 위치 120 - 130의 외부에 자리한 - 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프를 형성하기 위해 요구되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 HBsAg의 항원성 루프 영역 내 에피토프는, HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115 - 133으로부터 선택된, 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 133으로부터 선택된, 더 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 130으로부터 선택된 위치에 자리한 두 개 이상의 아미노산에 의해 형성된다. 더 바람직하게는, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 HBsAg의 항원성 루프 영역 내 에피토프는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115 - 133으로부터 선택된, 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 133으로부터 선택된, 더 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 130으로부터 선택된 위치에 자리한 세 개 이상의 아미노산에 의해 형성된다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 HBsAg의 항원성 루프 영역 내 에피토프는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 위치 115 - 133으로부터 선택된, 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 133으로부터 선택된, 더 바람직하게는 아미노산 위치 120 - 130으로부터 선택된 위치에 자리한 네 개 이상의 아미노산에 의해 형성된다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBsAg의 S 도메인의 아미노산 115 - 아미노산 133으로부터 선택된, 바람직하게는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 아미노산 133으로부터 선택된, 더 바람직하게는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130으로부터 선택된, 최소한 한 개의, 바람직하게는 최소한 두 개의, 더 바람직하게는 최소한 세 개의, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산에 결합하는 것이 바람직하다.
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 아미노산 133으로부터, 바람직하게는 아미노산 120 - 130으로부터 선택되고 그리고 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 인접한 위치에 자리한다 (즉 아미노산 서열/일차 구조 내 연속적 아미노산임).
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이 결합하는 에피토프는, 바람직하게는 입체형태적 에피토프이다. 그에 따라, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 것이 바람직하고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133으로부터, 바람직하게는 아미노산 120 - 130으로부터 선택되고, 그리고 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의 아미노산은 (일차 구조의) 인접한 위치에 자리하지 않는다.
다시 말해서, (i) 항체가 결합하는 아미노산 (즉 에피토프를 형성하는 아미노산)의 어느 것도 일차 구조의 인접한 위치에 자리하지 않거나 또는 (ii) 일부, 예를 들면 항체가 결합하는 아미노산 (즉 에피토프를 형성하는 아미노산)의 두 개 또는 세 개는, (일차 구조의) 인접한 위치에 자리하는 반면에 항체가 결합하는 다른 아미노산 (즉 에피토프를 형성하는 아미노산)은 (일차 구조의) 인접한 위치에 자리하지 않는다.
일차 구조의 인접한 위치에 자리하지 않는, 항체가 결합하는 아미노산 (즉 에피토프를 형성하는 아미노산)은, 항체가 결합하지 않는 하나 이상의 아미노산에 의해, 전형적으로 간격 지어진다. 바람직하게는, 최소한 한 개의, 더 바람직하게는 최소한 두 개의, 보다 더 바람직하게는 최소한 세 개의, 가장 바람직하게는 최소한 네 개의, 특히 바람직하게는 최소한 다섯 개의 아미노산은 에피토프에 의해 포함되고 인접한 위치에 자리하지 않는 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 아미노산 사이에 자리할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBsAg의 S 도메인의 최소한 아미노산 P120, C121, R122 및 C124 를 포함하는 에피토프에 결합한다. 더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 88에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:
PCRXC
여기서 X는 임의의 아미노산 또는 비아미노산이고; 바람직하게는 X는 임의의 아미노산이고; 더 바람직하게는 X는 T, Y, R, S, 또는 F이고; 보다 더 바람직하게는 X는 T, Y 또는 R이고; 가장 바람직하게는 X는 T 또는 R이다.
보다 더 바람직하게는 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 80에 따른 아미노산 서열:
TGPCRTC
또는 서열목록 번호: 80과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 90%, 더 바람직하게는 최소한 95% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
가장 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 85에 따른 아미노산 서열:
STTSTGPCRTC
또는 서열목록 번호: 85와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 90%, 더 바람직하게는 최소한 95% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
항체 또는 항원 결합 단편은 HBsAg의 S 도메인의 최소한 아미노산 145 - 151를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다:
GNCTCIP
(서열목록 번호: 81).
더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 80에 따른 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 81에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 85에 따른 아미노산 서열 및/또는 서열목록 번호: 87에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합한다.
상기 기술된 것처럼, 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 선형 (연속적) 또는 입체형태적 (비연속적)일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 입체형태적 에피토프에 결합하고, 더 바람직하게는 입체형태적 에피토프는 오직 비-환원 상태에서만 존재한다.
하지만, 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항체 단편은, 선형 에피토프에 결합하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 선형 에피토프는 비-환원 상태 및 환원 상태 모두에서 존재한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 다음 서열목록 번호: 1에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원성 루프 내 에피토프에 결합한다:
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 임의의 아미노산일 수 있다 (서열목록 번호: 1).
바람직하게는, X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 아미노산이고, 이는 보존적으로 서열목록 번호: 3의 아미노산 120 - 130에 비교하여 보존적으로 치환된다. 또한 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 아미노산이고, 이는 임의의 서열목록 번호 5 - 33의 아미노산 20 - 30에 비교하여 보존적으로 치환된다 (cf. 표 1; 항원성 루프 영역 서열을 지칭함, 즉 HbsAG의 상이한 변종의 S 도메인의 aa 101 - 172).
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X1은 작은 아미노산이다. "작은" 아미노산은, 본 명세서에 사용된 바처럼, 알라닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 더 바람직하게는, X1은 프롤린, 세린 또는 트레오닌이다.
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X2는 작은 아미노산이다. 더 바람직하게는, X2는 시스테인 또는 트레오닌이다.
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X3은 하전된 아미노산 또는 지방족 아미노산이다. "하전된" 아미노산은, 본 명세서에 사용된 바처럼, 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 트립토판및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. "지방족" 아미노산은, 본 명세서에 사용된 바처럼, 알라닌, 글라이신, 이소류신, 류신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 더 바람직하게는, X3은 아르기닌, 라이신, 아스파르트산 또는 이소류신이다.
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X4는 작은 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. "소수성" 아미노산은, 본 명세서에 사용된 바처럼, 알라닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 타이로신, 메티오닌, 프롤린 및 글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 더 바람직하게는, X4는 메티오닌 또는 트레오닌이다.
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X5는 작은 아미노산 및/또는 소수성 아미노산이다. 더 바람직하게는, X5는 트레오닌, 알라닌 또는 이소류신이다.
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X6은 작은 아미노산 및/또는 소수성 아미노산. 더 바람직하게는, X6은 트레오닌, 프롤린 또는 류신이다.
바람직하게는, 서열목록 번호: 1에서 X7은 극성 아미노산 또는 지방족 아미노산이다. "극성" 아미노산은, 본 명세서에 사용된 바처럼, 아스파르트산, 아스파라긴, 아르기닌, 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 글루타민, 트립토판, 타이로신, 세린, 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산을 지칭한다. 더 바람직하게는, X7은 글루타민, 히스티딘 또는 류신이다.
그에 따라, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 다음 서열목록 번호: 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원성 루프 내 에피토프에 결합하는 것이 더 바람직하다:
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
여기서 X1은 P, T 또는 S,
X2는 C 또는 S,
X3은 R, K, D 또는 I,
X4는 M 또는 T,
X5는 T, A 또는 I,
X6은 T, P 또는 L, 및
X7은 Q, H 또는 L임.
(서열목록 번호: 2).
서열목록 번호: 1 또는 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 바람직한 에피토프에 관해, 용어 "의해 형성되다"는 본 명세서에 사용된 바처럼 구체적으로 항체가 서열목록 번호: 1 또는 2의 각각 및 모든 아미노산에 필연적으로 결합되는 것을 암시하는 것을 의도하지 않음은 잘 알려져 있다. 구체적으로 바람직한 입체형태적 에피토프의 사례에서, 항체는 오직 서열목록 번호: 1 또는 2의 몇몇 아미노산에 결합할 수 있고, 그로써 다른 아미노산 잔기는, 그것에 의해서 에피토프의 3D 구조를 제공하는, 단지 "스페이서"로서 작용한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 하기 표 1의 서열목록 번호 5 - 33으로부터 선택된 아미노산 서열의 하나 이상의, 바람직하게는 두 개 이상의, 더 바람직하게는 세 개 이상의, 및 보다 더 바람직하게는 네 개 이상의 아미노산에 의해 형성된 HBsAg의 항원성 루프 내 에피토프에 결합한다.
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 하기 표 1의 임의의 서열목록 번호 5 - 33 또는 그의 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 갖는 HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 하기 표 1의 임의의 서열목록 번호 5 - 33에 따른 아미노산 서열을 갖는 모든 HbsAg의 항원성 루프 변종에 결합한다. 다시 말해서, 만약 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이, 임의의 서열목록 번호 5 - 33에 따른 아미노산 서열을 갖는 모든 상이한 HbsAg의 항원성 루프 영역에 결합할 수 있다면 특히 바람직하다.
표 1: 본 명세서에 사용된 상이한 유전형 및 돌연변이체의 HBsAg의 S 도메인의 항원성 루프 영역의 예시적 아미노산 서열 (HBsAg의 S 도메인의 잔기 101-172 - 본 명세서에 사용된 상이한 유전자형 및 돌이변이체의 관련된 돌연변이를 포함하기 위하여 HBsAg의 S 도메인의 잔기 100-172로 지칭되는 서열목록 번호: 16은 제외).
Name 서열목록 번호 아미노산 서열
J02203 (D, ayw3) 5 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
FJ899792 (D, adw2) 6 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
AM282986 (A) 7 QGMLPVCPLIPGTTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW
D23678 (B1) 8 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW
AB117758 (C1) 9 QGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSW
AB205192 (E) 10 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
X69798 (F4) 11 QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFPSCCCSKPSDGNCTCIPIPSSWALGKYLWEWASARFSW
AF160501 (G) 12 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSW
AY090454 (H) 13 QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKYLWEWASARFSW
AF241409 (I) 14 QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASARFSW
AB486012 (J) 15 QGMLPVCPLLPGSTTTSTGPCRTCTITAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFAKFLWEWASVRFSW
HBsAg Y100C/P120T 16 CQGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg P120T 17 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg P120T/S143L 18 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGTCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPLDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg C121S 19 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPSRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg R122D 20 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCDTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg R122I 21 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCITCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg T123N 22 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRNCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg Q129H 23 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAHGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg Q129L 24 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPALGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg M133H 25 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSHYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg M133L 26 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSLYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg M133T 27 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSTYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg K141E 28 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTEPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg P142S 29 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKSSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg S143K 30 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPKDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg D144A 31 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSAGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg G145R 32 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDRNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
HBsAg N146A 33 QGMLPVCPLIPGSSTTGTGPCRTCTTPAQGTSMYPSCCCTKPSDGACTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW
일반적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 바람직하게는 중쇄에 (최소한) 세 개의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 경쇄에 (최소한) 세 개의 CDR을 포함한다. 일반적으로, 상보성 결정 영역 (CDR)은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인에 존재하는 고가변 영역이다. 전형적으로, 항체의 중쇄의 CDR 및 연결된 경쇄는 함께 항원 수용체를 형성한다. 통상적으로, 세 개의 CDR (CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 가변 도메인에 비-연속적으로 정렬된다. 항원 수용체는 전형적으로 (두 개의 상이한 폴리펩티드 사슬, 즉 중쇄 및 경쇄의) 두 개의 가변 도메인으로 구성되므로, 각 항원 수용체에 대해 여섯 개의 CDR이 있다 (중쇄: CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3; 경쇄: CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3). 단일 항체 분자는 통상적으로 두 개의 항원 수용체를 가지고 그러므로 열두 개의 CDR을 함유한다. 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR은 골격 영역(framework region)에 의해 분리될 수 있고, 그로써 골격 영역 (FR)은가변 도메인 내에서 CDR 보다 덜 "가변"적인 영역이다. 예를 들면, 사슬 (또는 각 사슬, 각각) 은, 세 개의 CDR에 의해 분리된, 네 개의 골격 영역으로 구성될 수 있다.
중쇄에 세 개의 상이한 CDR 및 경쇄에 세 개의 상이한 CDR를 포함하는, 본 발명의 예시적 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열이 결정되었다. CDR 아미노산의 위치는IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된다 (IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) 핵산 Res. 37, D1006-D1012).
표 2는 본 발명에 따른 예시적 항체 ("HBC34")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 보여준다:
HBC34 서열목록 번호 아미노산 서열
CDRH1 34 GRIFRSFY
CDRH2 35 NQDGSEK
CDRH2 long 66 INQDGSEK
CDRH3 36 AAWSGNSGGMDV
CDRL1 37 KLGNKN
CDRL2 38 EVK
CDRL2 long 39 VIYEVKYRP
CDRL3 40 QTWDSTTVV
VH 41 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVSS
VL 42 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL
따라서 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 표 2에 보여진 최소한 한 개의 CDR 서열, VH 서열 및/또는 VL 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
표 3은 본 발명에 따른 부가 예시적 항체 ("HBC34v7")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 보여준다:
HBC34v7 서열목록 번호 아미노산 서열
CDRH1 34 GRIFRSFY
CDRH2 35 NQDGSEK
CDRH2 long 66 INQDGSEK
CDRH3 36 AAWSGNSGGMDV
CDRL1 37 KLGNKN
CDRL2 38 EVK
CDRL2 long 39 VIYEVKYRP
CDRL3 58 QTFDSTTVV
VH 41 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVSS
VL 59 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVL
따라서 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 표 3에 보여진 최소한 한 개의 CDR 서열, VH 서열 및/또는 VL 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
표 4는 본 발명에 따른 부가 예시적 항체("HBC34v23")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 보여준다:
HBC34v23 서열목록 번호 아미노산 서열
CDRH1 34 GRIFRSFY
CDRH2 35 NQDGSEK
CDRH2 long 66 INQDGSEK
CDRH3 36 AAWSGNSGGMDV
CDRL1 37 KLGNKN
CDRL2 38 EVK
CDRL2 long 39 VIYEVKYRP
CDRL3 58 QTFDSTTVV
VH 41 ELQLVESGGGWVQPGGSQRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEWVATINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVSVSS
VL 65 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNACWYQQKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL
따라서 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 표 4에 보여진 최소한 한 개의 CDR 서열, VH 서열 및/또는 VL 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
표 5은 본 발명에 따른 부가 예시적 항체("HBC34v31")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 보여준다:
HBC34v31 서열목록 번호 아미노산 서열
CDRH1 34 GRIFRSFY
CDRH2 35 NQDGSEK
CDRH2 long 66 INQDGSEK
CDRH3 36 AAWSGNSGGMDV
CDRL1 37 KLGNKN
CDRL2 38 EVK
CDRL2 long 39 VIYEVKYRP
CDRL3 40 QTWDSTTVV
VH 67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEWVANINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVTVSS
VL 42 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYFCQTWDSTTVVFGGGTRLTVL
따라서 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 표 5에 보여진 최소한 한 개의 CDR 서열, VH 서열 및/또는 VL 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
표 6은 본 발명에 따른 부가 예시적 항체("HBC34v32")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 보여준다:
HBC34v32 서열목록 번호 아미노산 서열
CDRH1 34 GRIFRSFY
CDRH2 35 NQDGSEK
CDRH2 long 66 INQDGSEK
CDRH3 36 AAWSGNSGGMDV
CDRL1 37 KLGNKN
CDRL2 38 EVK
CDRL2 long 39 VIYEVKYRP
CDRL3 58 QTFDSTTVV
VH 67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEWVANINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVTVSS
VL 59 SYELTQPPSVSVSPGQTVSIPCSGDKLGNKNVCWFQHKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYFCQTFDSTTVVFGGGTRLTVL
따라서 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 표 6에 보여진 최소한 한 개의 CDR 서열, VH 서열 및/또는 VL 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
표 7은 본 발명에 따른 부가 예시적 항체("HBC34v33")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열을 보여준다:
HBC34v33 서열목록 번호 아미노산 서열
CDRH1 34 GRIFRSFY
CDRH2 35 NQDGSEK
CDRH2 long 66 INQDGSEK
CDRH3 36 AAWSGNSGGMDV
CDRL1 37 KLGNKN
CDRL2 38 EVK
CDRL2 long 39 VIYEVKYRP
CDRL3 58 QTFDSTTVV
VH 67 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFRSFYMSWVRQAPGKGLEWVANINQDGSEKLYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNNLRVEDTAVYYCAAWSGNSGGMDVWGQGTTVTVSS
VL 65 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKNACWYQQKPGQSPVLVIYEVKYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQTFDSTTVVFGGGTKLTVL
따라서 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 표 7에 보여진 최소한 한 개의 CDR 서열, VH 서열 및/또는 VL 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
표 8 은 야생형 (WT) 항체 "HBC34"의 예시적 항체 변종 "HBC34v7", "HBC34v23", "HBC34v31", "HBC34v32" 및 "HBC34v33" 의VH 및 VL 변형에 대한 및 대응 CDR 및 VH/VL 아미노산 서열의 각각의 서열목록 번호에 대한 개요를 제공한다:
변종 명칭 VH 변형 VL 변형 CDR VL VH
H1 H2 H3 L1 L2 L3
HBC34 WT WT 34 35/66 36 37 38/39 40 41 42
HBC34-V7 WT W107F 34 35/66 36 37 38/39 58 41 59
HBC34-V23 WT W07F/FR1234GL/CDR2Y66 34 35/66 36 37 38/39 58 41 65
HBC34-V31 FR124GL WT 34 35/66 36 37 38/39 40 67 42
HBC34-V32 FR124GL W107F 34 35/66 36 37 38/39 58 67 59
HBC34-V33 FR124GL W07F/FR1234GL/CDR2Y66 34 35/66 36 37 38/39 58 67 65
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 CDR, 바람직하게는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은, 본 명세서에 기술된 것처럼 서열목록 번호: 36 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 그에 따라, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36에 따른 아미노산 서열을 포함한다.또한 항체 또는 항원 결합 단편은 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하는 것이 바람직하고, 여기서 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 서열목록 번호: 58, 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 그에 따라, 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 서열목록 번호: 58과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3 은 서열목록 번호: 40 또는 서열목록 번호: 58에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 그에 따라, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 중쇄 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 66과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 중쇄 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 CDRL1은 서열목록 번호: 37 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 최소한 한 개의 CDRL3 아미노는 서열목록 번호: 40 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 경쇄 CDRL1은 서열목록 번호: 37 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 경쇄 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3 아미노는 서열목록 번호: 58 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 그에 따라, 최소한 한 개의 경쇄 CDRL1은 서열목록 번호: 37과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 경쇄 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 58과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 최소한 한 개의 경쇄 CDRL1은 서열목록 번호: 37에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 경쇄 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 58에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
그에 따라, 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34 - 38 및 40 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34 - 37 및 39 - 40 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39 - 40 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34 - 38 및 58 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
그에 따라, 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 각 서열목록 번호: 34 - 38 및 40, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (ii) 각 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 40, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (iii) 각 서열목록 번호: 34 - 38 및 58, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (iv) 각 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (v) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (vi) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 40 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (vii) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (viii) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열목록 번호: 34 - 38 및 40, 각각에 따른; 또는 (ii) 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 40, 각각에 따른; 또는 (iii) 서열목록 번호: 34 - 38 및 58, 각각; 또는 (iv) 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58, 각각에 따른; 또는 (v) 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66, 각각에 따른; 또는 (vi) 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 40 및 66, 각각에 따른; 또는 (vii) 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66, 각각에 따른; 또는 (viii) 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66, 각각에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
게다가, 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 41 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및/또는 서열목록 번호: 42 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 그에 따라, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직한다. 더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 열목록 번호: 41에 따른중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함한다.
게다가, 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 41 또는 67 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및/또는 서열목록 번호: 42 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 그에 따라, 항체 또는 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 41 또는 67과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 59 또는 65 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함한다. 그에 따라, 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열목록 번호: 41 또는 67과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열; 및 (ii) 서열목록 번호: 59 또는 65와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 59 또는 65에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 34 - 38 및 40 의 아미노산 서열 또는 서열목록 번호: 34 - 37 및 39 - 40의 아미노산 서열, 각각과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 및 경쇄 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 34 - 38 및 58의 아미노산 서열, 각각, 또는 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58의 아미노산 서열, 각각과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 및 경쇄 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66 의 아미노산 서열, 각각, 또는 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39 - 40 및 66 의 아미노산 서열, 각각과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 및 경쇄 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66 의 아미노산 서열, 각각, 또는 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66 의 아미노산 서열, 각각과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는, 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 및 경쇄 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 41 - 42 의 아미노산 서열과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 최소한 한 개의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 최소한 한 개의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 41 및 59 의 아미노산 서열과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 최소한 한 개의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 최소한 한 개의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 서열목록 번호: 41 및 65 의 아미노산 서열과 최소한 80%, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 최소한 한 개의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 최소한 한 개의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34이고, 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34이다.
본 발명자들은 본 명세서에서HBC34로 치징되는 본 발명에 따른 단일클론 항체 (mAb)를 분리하였다 (cf. 실시예 1). 항체 HBC34, 구체적으로 HBC34의 VH 및 VL 유전자에 기초하여, 용어 "gHBC34"는, 본 명세서에 사용된 바처럼, 각각의 "제네릭" 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 다시 말해, "gHBC34"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열목록 번호: 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 갖는, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 구체적으로, "gHBC34"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열목록 번호: 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "gHBC34"의 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열목록 번호: 41에 따른 아미노산 서열을 가지고 "gHBC34"의 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열목록 번호: 42에 따른 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34v7이고, 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34v7이다.
본 발명자들은 본 명세서에서HBC34v7 로 지칭되는 본 발명에 따른 부가 단일클론 항체 (mAb)를 확인하였다 (cf. 실시예 11). 항체 HBC34v7, 구체적으로 HBC34v7의 VH 및 VL 유전자에 기초하여, 용어 "gHBC34v7"는, 본 명세서에 사용된 바처럼, 각각의 "제네릭" 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 다시 말해, "gHBC34v7"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 CDRL3 서열목록 번호: 58에 따른 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "gHBC34v7"의 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열목록 번호: 41에 따른 아미노산 서열을 가지고 "gHBC34v7"의 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열목록 번호: 59에 따른 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34v23이고, 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34v23이다.
본 발명자들은 본 명세서에서HBC34v23 로 지칭되는 본 발명에 따른 부가 단일클론 항체 (mAb)를 확인하였다 (cf. 실시예 12). 항체 HBC34v23, 구체적으로 HBC34v23의 VH 및 VL 유전자에 기초하여, 용어 "gHBC34v23"는, 본 명세서에 사용된 바처럼, 각각의 "제네릭" 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 다시 말해, "gHBC34v23"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 CDRL3 서열목록 번호: 58에 따른 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "gHBC34v23"의 중쇄 가변 영역 (VH) 은 서열목록 번호: 41에 따른 아미노산 서열을 가지고 "gHBC34v23"의 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열목록 번호: 59에 따른 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, gHBC34v31이고, 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBC34v31이다.
본 발명자들은 본 명세서에서 HBC34v31로 지칭되는 본 발명에 따른 부가 단일클론 항체 (mAb)확인하였다 (cf. 실시예 12). 항체 HBC34v31, 구체적으로 HBC34v31의 VH 및 VL 유전자에 기초하여, 용어 "gHBC34v31"는, 본 명세서에 사용된 바처럼, 각각의 "제네릭" 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 다시 말해, "gHBC34v31"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열목록 번호: 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "gHBC34v31"의 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열목록 번호: 67에 따른 아미노산 서열을 가지고 "gHBC34v31"의 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열목록 번호: 42에 따른 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, gHBC34v32이고, 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, HBC34v32이다.
본 발명자들은 본 명세서에서HBC34v32로 지칭되는 본 발명에 따른 부가 단일클론 항체 (mAb)를 확인하였다 (cf. 실시예 12). 항체 HBC34v32, 구체적으로 HBC34v32의 VH 및 VL 유전자에 기초하여, 용어 "gHBC34v32"는, 본 명세서에 사용된 바처럼, 각각의 "제네릭" 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 다시 말해, "gHBC34v32"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열목록 번호: 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "gHBC34v32"의 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열목록 번호: 67에 따른 아미노산 서열을 가지고 "gHBC34v32"의 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열목록 번호: 59에 따른 아미노산 서열을 가진다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34v33이고, 구체적으로, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34v33이다.
본 발명자들은 본 명세서에서HBC34v33로 지칭되는 본 발명에 따른 부가 단일클론 항체 (mAb)를 확인하였다 (cf. 실시예 12). 항체 HBC34v33, 구체적으로 HBC34v33의 VH 및 VL 유전자에 기초하여, 용어 "gHBC34v33"는, 본 명세서에 사용된 바처럼, 각각의 "제네릭" 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. 다시 말해, "gHBC34v33"는, 서열목록 번호: 34에 따른 CDRH1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 CDRH2 아미노산 서열, 서열목록 번호: 36에 따른 CDRH3 아미노산 서열, 서열목록 번호: 37에 따른 CDRL1 아미노산 서열, 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 CDRL2 아미노산 서열, 및 서열목록 번호: 40에 따른 CDRL3 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 지칭한다. "gHBC34v33"의 중쇄 가변 영역 (VH) 은 서열목록 번호: 67에 따른 아미노산 서열을 가지고 "gHBC34v33"의 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열목록 번호: 65에 따른 아미노산 서열을 가진다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 인간 항체, 단일클론 항체, 인간 단일클론 항체, 정제된 항체, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv이다.
본 발명의 항체는 따라서 인간 항체, 단일클론 항체, 인간 단일클론 항체, 재조합 항체 또는 정제된 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 단편, 특히 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 단편을 제공한다. 이러한 단편은, 이에 제한되지 않지만, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv을 포함한다.
본 발명의 항체의 단편은 효소, 예를 들어 펩신 또는 파파인과의 소화를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황 결합의 분해에 의해 항체로부터 획득될 수 있다. 대안적으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄의 서열의 일부의 클로닝 및 발현에 의해 획득될 수 있다. 항체 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)을 아우른다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 항체로부터의 CDR을 포함하는 scFv를 포함한다. 또한 중쇄 또는 경쇄 단량체 및 이량체, 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체는 물론, 단쇄 항체, 일례로, 그 내에서 펩티드 링커에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 합쳐지는 단쇄 Fv도 포함된다.
본 발명의 항체 단편은 일가(monovalent) 또는 다가(multivalent) 상호작용을 전해줄 수 있고 상기 기술된 다양한 구조에 함유될 수 있다. 사례를 들면, scFv 분자는 삼가의 "트리아바디" 또는 사가의 "테트라바디"를 생성하기 위해 합성될 수 있다. scFv 분자는 이가의 미니바디를 가져오는 Fc 영역의 도메인을 포함할 수 있다. 더불어, 본 발명의 서열은 본 발명의 서열이 본 발명의 에피토프를 타겟하고 분자의 다른 영역은 다른 타겟에 결합하는 다가특이성 분자의 성분이 될 수 있다. 예시적 분자는, 이에 제한되지 않지만, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab3, 이중특이적 scFv, 및 디아바디를 포함한다 (Holliger andHudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의, 본 명세서에 기술된 것처럼 약제로의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 본 명세서에 기술된 것처럼 B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화에서의 용도이다. 이 측면에서 상세한 설명이 "의료적 치료 및 용도" 및 본 발명의 약학 조성물의 맥락에서 하기에서 제공된다.
핵산 분자
또다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기 기술된 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자 및/또는 폴리뉴클레오티드의 예는, 일례로, 재조합 폴리뉴클레오티드, 벡터, 올리고뉴클레오티드, RNA 분자 예를 들어 rRNA, mRNA, miRNA, siRNA, 또는 tRNA, 또는 예를 들어 cDNA 같은 DNA 분자를 포함한다. 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄 및 CDR의 일부 또는 전부를 암호화하는 핵산 서열이 바람직하다. 표 2 - 8는 본 발명에 따른 예시적 항체의 CDR 및 VH 및 VL의 아미노산 서열을 위한 SEQ ID 번호를 제공하고, 이는 바람직하게는 본 명세서에 기술된 것처럼 폴리뉴클레오티드/핵산 서열에 의해 암호화된다. 바람직하게는 따라서 경쇄 또는 중쇄의 일부 또는 전부, 구체적으로 본 발명의 예시적 항체의 VH 및 VL 서열 및 CDR을 암호화하는 핵산 서열이 본 명세서에 제공된다. 표 9는 하기에 본 발명에 따른 예시적 항체의 CDR 및 VH 및 VL을 암호화하는 핵산 서열을 위한 SEQ ID 번호를 제공한다. 유전 부호의 중복성으로 인해, 본 발명은 또한 이들 핵산 서열의 서열 변종 및, 구체적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그러한 서열 변종을 포함한다.
핵산 분자는 핵산 성분을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어지는 분자이다. 용어 핵산 분자는 바람직하게는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 구체적으로, 이는 용어 "폴리뉴클레오티드"와 동의어로 사용된다. 바람직하게는, 핵산 분자는 설탕/포스페이트-중추(backbone)의 포스포디에스테르-결합에 의해 서로 공유적으로 연결된 뉴클레오티드 단량체를 포함하거나 이로 이루어지는 중합체이다. 용어 "핵산 분자"는 또한 변형된 핵산 분자, 예를 들어 염기-변형된, 설탕-변형된 또는 중추-변형된 등등, DNA 또는 RNA 분자를 아우른다.
표 9는 본 발명에 따른 예시적 항체 ("HBC34", "HBC34v7", "HBC34v23", "HBC34v31", "HBC34v32" 및 "HBC34v33")의 CDR 및 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 핵산 서열:
명칭 서열목록 번호 핵산 서열
HBC34
CDRH1 43 GGACGCATCTTTAGAAGTTTTTAC
CDRH2 44 ATAAACCAAGATGGAAGTGAGAAA
CDRH3 45 GCGGCTTGGAGCGGCAATAGTGGGGGTATGGACGTC
CDRL1 46 AAATTGGGGAATAAAAAT
CDRL2 47 GAGGTTAAA
CDRL2 long 48 gtcatctatGAGGTTAAAtaccgcccc
CDRL3 49 CAGACGTGGGACAGCACCACTGTGGTG
VH 50 GAACTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTGGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCAGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCATCTTTAGAAGTTTTTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACTATAAACCAAGATGGAAGTGAGAAATTATATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTATTTCTGCAAATGAACAACCTGAGAGTCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGCGCGGCTTGGAGCGGCAATAGTGGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCTCCGTCTCCTCA
VL 51 TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGTCAGCATCCCCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGAATAAAAATGTTTGCTGGTTTCAGCATAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGTTGGTCATCTATGAGGTTAAATACCGCCCCTCGGGGATTCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGCCTATTTCTGTCAGACGTGGGACAGCACCACTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAGGCTGACCGTCCTA
VH 최적화 코돈 70 GAACTGCAGCTGGTCGAATCAGGAGGAGGGTGGGTCCAGCCCGGAGGGAGCCAGAGACTGTCTTGTGCCGCATCAGGGAGGATCTTCAGGAGCTTCTACATGTCCTGGGTGCGCCAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCCACCATCAACCAGGACGGATCTGAAAAGCTGTATGTGGATAGTGTCAAAGGCCGGTTCACAATTAGCAGAGACAACGCTAAAAATTCTCTGTTTCTGCAGATGAACAATCTGCGAGTGGAGGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCGCTTGGTCTGGCAACAGCGGCGGGATGGATGTCTGGGGGCAGGGCACAACAGTGAGCGTCTCTTCC
VL 최적화 코돈 71 TCATACGAACTGACTCAGCCTCCCTCCGTCTCCGTCTCACCTGGACAGACCGTCTCAATCCCCTGCTCCGGCGAT
AAACTGGGCAACAAGAACGTGTGCTGGTTCCAGCACAAACCCGGACAGAGTCCTGTGCTGGTCATCTACGAGGTCAAGTATCGGCCAAGCGGCATTCCCGAAAGATTCAGCGGCTCCAACTCTGGGAATACCGCAACACTGACTATCTCTGGAACCCAGGCAATGGACGAGGCAGCTTACTTTTGCCAGACTTGGGATTCAACTACTGTCGTGTTCGGCGGCGGAACTAGACTGACTGTCCTG
CRDH1 최적화 코돈 72 GGGAGGATCTTCAGGAGCTTCTAC
CDRH2 최적화 코돈 73 ATCAACCAGGACGGATCTGAAAAG
CDRH3 최적화 코돈 74 GCCGCTTGGTCTGGCAACAGCGGCGGGATGGATGTC
CDRL1 최적화 코돈 75 AAACTGGGCAACAAGAAC
CDRL2 최적화 코돈 76 GAGGTCAAG
CDRL2 long 최적화 코돈 77 GTCATCTACGAGGTCAAGTATCGGCCA
CDRL3 최적화 코돈 78 CAGACTTGGGATTCAACTACTGTCGTG
HBC34v7, HBC34v23, HBC34 v31, HBC34 v32 및 HBC34 v33
CDRL1 v7 및 CDRL1 v23 60 AAGCTGGGGAACAAAAAT
CDRL2 v7 및 CDRL2 v23 61 GAGGTGAAA
CDRL2 long v7 및 CDRL2 v23 long 62 GTCATCTACGAGGTGAAATATCGGCCT
CDRL3 v7 및 CDRL3 v23 63 CAGACATTCGATTCCACCACAGTGGTC
VL v7 64 TCTTACGAGCTGACACAGCCACCTAGCGTGTCCGTCTCTCCAGGACAGACCGTGTCCATCCCTTGCTCTGGCGACAAGCTGGGGAACAAAAATGTCTGTTGGTTCCAGCACAAGCCAGGGCAGAGTCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAATATCGGCCTTCAGGAATTCCAGAACGGTTCAGCGGATCAAACAGCGGCAATACTGCAACCCTGACAATTAGCGGGACCCAGGCCATGGACGAAGCCGCTTATTTCTGCCAGACATTCGATTCCACCACAGTGGTCTTTGGCGGGGGAACTAGGCTGACCGTGCTG
HBC34 v31, HBC34 v32 및 HBC34 v33 VH 68 GAGGTGCAGCTGGTGGAATCCGGCGGGGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCACTGAGACTGAGCTGTGCAGCTTCTGGAAGAATCTTCAGATCTTTTTACATGAGTTGGGTGAGACAGGCTCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAAACATCAATCAGGACGGATCAGAAAAGCTGTATGTGGATAGCGTCAAAGGCAGGTTCACTATTTCCCGCGACAACGCCAAAAATTCTCTGTTTCTGCAGATGAACAATCTGCGGGTGGAGGATACCGCTGTCTACTATTGTGCAGCCTGGTCTGGCAACAGTGGAGGCATGGACGTGTGGGGACAGGGAACCACAGTGACAGTCAGCTCC
VL v23 69 TCTTACGAGCTGACACAGCCCCCTAGCGTGTCCGTCTCTCCAGGCCAGACAGCATCCATCACTTGCTCTGGCGACAAGCTGGGGAACAAAAATGCCTGTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGCAGAGTCCCGTGCTGGTCATCTACGAGGTGAAATATCGGCCTTCAGGAATTCCAGAAAGATTCAGTGGATCAAACAGCGGCAATACTGCTACCCTGACAATTAGCGGGACCCAGGCCATGGACGAAGCTGATTACTATTGCCAGACATTCGATTCCACCACAGTGGTCTTTGGCGGGGGAACTAAGCTGACCGTGCTG
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자의 서열은 임의의 한 개의 서열목록 번호: 43 - 51 중 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또한 본 발명에 따른 핵산 분자의 서열은 임의의 한 개의 서열목록 번호: 43 - 51, 60 - 64 및 68 - 78에 따른 핵산 서열을 포함하거나 또는 그로 구성되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 핵산 서열은, 본 발명에 따른 (예시적) 항체에서 사용된 CDR, VH 서열 및/또는 VL 서열을 암호화하는 핵산, 예를 들면 표 9에 보여진 서열과 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 88%, 최소한　90%, 최소한 92%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98% 또는 최소한 99% 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 폴리뉴클레오티드 서열이 임의의 한 개의 서열목록 번호: 43 - 51 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 분자가 바람직하다. 폴리뉴클레오티드 서열이 임의의 서열목록 번호: 43 - 51, 60 - 64 및 68 - 78과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 분자가 또한 바람직하다. 더 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 한 개의 서열목록 번호: 43 - 51, 60 - 64 및 68 - 78에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
더 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 서열목록 번호: 70 - 78과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 서열목록 번호: 70 - 78은 코돈-최적화 핵산 서열이다 (cf. 표 9). 특히 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 한 개의 서열목록 번호: 70 - 78에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이루어진다.
일반적으로, 핵산 분자는 특정한 핵산 서열을 삽입, 삭제 또는 변경하여 조작될 수 있다. 이러한 조작으로부터의 변화는, 이에 제한되지 않지만, 제한 부위를 도입, 코돈 사용을 수정, 전사 및/또는 번역 조절 서열을 추가 또는 최적화하는, 등등의 변화를 포함한다. 또한 핵산을 변화하여 암호화된 아미노산을 변경하는 것도 가능한다. 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내로 하나 이상의 (일례로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 등등.) 아미노산 치환, 삭제 및/또는 삽입을 도입하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 점 돌연변이는 작동자 기능, 항원-결합 친화성, 번역후 변형, 면역원성, 등등을 변형할 수 있고, 공유기(일례로, 표지)의 부착을 위해 아미노산을 도입할 수 있고 또는 태그를 (일례로, 정제 목적을 위해) 도입할 수 있다. 돌연변이는 특이적 부위에 도입될 수 있거나 또는, 선택에 뒤이어 (일례로, 분자 진화) 무작위로 도입될 수 있다. 사례를 들면, 본 발명의 (예시적) 항체의 임의의 CDR 영역, VH 서열 및/또는 VL 서열을 암호화하는 하나 이상의 핵산은 암호화된 아미노산 내에 상이한 성질을 도입하도록 무작위로 또는 지향적으로 돌연변이될 수 있다. 이러한 변화는 초기 변화는 보유되고 다른 뉴클레오티드 위치에서의 새로운 변화는 도입되는 반복적 공정의 결과일 수 있다. 더욱이, 비의존적 단계에 도달된 변화는 조합될 수 있다. 암호화된 아미노산에 도입된 상이한 성질은, 이에 제한되지 않지만, 증진된 친화성을 포함할 수 있다.
벡터
부가로 본 발명의 범주 내에 벡터, 예를 들면, 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 포함된다. 바람직하게는, 벡터는 상기 기술된 핵산 분자를 포함한다.
용어 "벡터"는 핵산 분자, 바람직하게는 재조합 핵산 분자, 즉 자연적으로 발생하지 않는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 본 발명의 맥락에서 핵산 서열을 통합하거나 정박하기에 적합하다. 이러한 벡터는 저장 벡터, 발현 벡터, 클로닝 벡터, 이동 벡터 등등일 수 있다. 저장 벡터는 핵산 분자의 편리한 저장을 허용하는 벡터이다. 따라서, 벡터는 서열 대응, 일례로, 본 발명에 따른 원하는 항체 또는 그의 항체 단편을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 발현 산물, 예를 들어 RNA, 일례로 mRNA, 또는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 벡터의 서열 신장의 전사에 필요한 서열, 예를 들어 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 부위를 함유하는 벡터이고, 이는 벡터 내로 핵산 서열을 통합하는데 사용될 수 있다. 클로닝 벡터는, 일례로, 플라스미드 벡터 또는 박테리오파지 벡터일 수 있다. 이동 벡터는 세포 또는 유기체 내로 이동하는데 적합한 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 본 발명의 맥락에서, 일례로, RNA 벡터 또는 DNA 벡터일 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 DNA 분자이다. 예를 들면, 벡터는 본 명세서의 의미에서 클로닝 부위, 선택 마커, 예를 들어 항생제 내성 인자, 및 벡터의 증식에 적합한 서열, 예를 들어 복제 원점을 포함한다. 바람직하게는, 현재 명세서의 맥락에서 벡터는 플라스미드 벡터이다.
세포
부가적 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하는; 및/또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
이러한 세포의 예는 이에 제한되지 않지만, 진핵 세포, 일례로, 효모 세포, 동물 세포 또는 식물 세포를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 포유류 세포, 더 바람직하게는 포유류 세포주이다. 바람직한 예는 인간 세포, CHO 세포, HEK293T 세포, PER.C6 세포, NS0 세포, 인간 간 세포, 일례로 Hepa RG 세포, 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
구체적으로, 세포는 본 발명에 따른 벡터로, 바람직하게는 발현 벡터와 함께, 형질주입될 수 있다. 용어 "형질주입"은 핵산 분자, 예를 들어 DNA 또는 RNA (일례로 mRNA) 분자의, 세포 내로, 바람직하게는 진핵 세포 내로의 도입을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "형질주입"은 세포 내로, 바람직하게는 진핵 세포 내로, 예를 들어 포유류 세포 내로 핵산 분자를 도입하기 위해 당해 기술자들에게 알려진 임의의 방법을 아우른다. 이러한 방법은, 예를 들면, 전기천공, 일례로 양이온성 지질 및/또는 리포솜에 기초한 리포펙션, 인산칼슘 침전, 형질주입에 기초한 나노입자, 형질주입에 기초한 바이러스, 또는 양이온성 중합체, 예를 들어 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine) 등등에 기초한 형질주입을 아우른다. 바람직하게는, 도입은 비-바이러스성이다.
게다가, 본 발명의 세포는, 일례로 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하기 위해, 본 발명에 따른 벡터로 안정적으로 또는 일시적으로 형질주입될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 본 발명에 따른 벡터로 안정적으로 형질주입된다. 대안적으로, 또한 세포는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 본 발명에 따른 벡터로 일시적으로 형질주입되는 것이 바람직하다.
항체의 선택적 추가적 특성
본 발명의 항체는, 예를 들면, 치료 부위에 전달을 위한 약물에 커플링되거나 또는 관심 세포를 포함하는 부위의 이미징을 촉진하는 검출가능한 표지에 커플링될 수 있다. 항체를 약물 및 검출가능한 표지에 커플링하는 방법은, 검출가능한 표지를 사용한 이미징을 위한 방법처럼, 당해 분야에 잘 알려져 있다. 표지된 항체는, 광범위한 표지를 써서, 광범위한 어세이에서 쓰여질 수 있다. 본 발명의 항체와HBsAg에서의, 구체적으로 HBsAg의 항원성 루프 영역에서의, 관심 에피토프 사이의 항체-항원 복합체의 형성의 검출은 검출 가능한 물질의 부착에 의해 촉진될 수 있다. 적합한 검출 수단은 표지의 사용, 예를 들어 방사선핵종, 효소, 조효소, 형광물질, 화학발광제, 색소원(chromogen), 효소 기질 또는 보조-인자, 효소 억제제, 배합군 복합체(prosthetic group complexes), 자유 라디칼, 입자, 염료, 및 등등을 포함한다. 적합한 효소의 예는 호스래디쉬 퍼록시다아제, 알카린 포스파타아제, b-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하고; 적합한 배합군 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플로오레세인 이소시오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 파이코에리스린(phycoerythrin)을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀(luminol)이다; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라아제(luciferase), 루시페린(luciferin), 및 애큐오린(aequorin)을 포함하고; 및 적합한 방사성 물질의 예는125I, 131I, 35S, 또는　3H를 포함한다. 이러한 표지된 시약은 다양한 잘 알려진 어세이, 예를 들어 방사선면역측정법, 효소 면역측정법, 일례로, ELISA, 형광 면역측정, 및 등등에서 사용될 수 있다. 표지된 본 발명에 따른 항체는 따라서, 예를 들면 US 3,766,162; US 3,791,932; US 3,817,837; 및 US 4,233,402에 기술된 이러한 어세이에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 치료 모이어티, 예를 들어 세포독소, 치료제, 또는 방사성 금속 이온 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다. 방사성 동위원소의 예는, 이에 제한되지 않지만, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111, 및 등등을 포함한다. 이러한 항체 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있고; 약물 모이어티는 전통적인 화학적 치료제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들면, 독소, 예를 들어 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin), 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin)를 포함할 수 있다.
이러한 치료 모이어티를 항체에 접합하기 위한 테크닉은 잘 알려져 있다. 예를 들면, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; and Thorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158를 참조해라.
대안적으로, 항체, 또는 그의 항체 단편은, US 4,676,980에 기술된 것처럼 항체 이형접합체를 형성하기 위해, 두 번째 항체, 또는 그의 항체 단편에 접합될 수 있다. 더불어, 링커는, 일례로, US 4,831,175에 기술된 것처럼, 표지와 본 발명의 항체 사이에 사용될 수 있다. 항체 또는, 그의 항원-결합 단편은 방사성 요오드, 인디움(indium), 이트륨(yttrium), 또는 당해 분야에 알려진 다른 방사성 입자와, 일례로, US 5,595,721에 기술된 것처럼, 직접적으로 표지될 수 있다. 치료는, 일례로,　WO 00/52031; WO 00/52473에 기술된 것처럼, 동시에 또는 순차로 투여되는 접합된 및 비-접합된 항체의 치료의 조합으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 고형 지지체에 부착될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 항체, 또는 그의 기능적 항체 단편은, 예를 들면, 그들의 순환 반감기를 증가시키기 위해, 공유적 접합에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 중합체, 및 펩티드에 그들을 부착하는 방법의 예는, US 4,766,106; US　4,179,337; US 4,495,285 및 US 4,609,546에서 보여준다. 몇몇 구현예에서 중합체는 폴리옥시에틸레이티드 폴리올 및 폴리옥시에틸렌 글리콜(PEG)로부터 선택될 수 있다. PEG는 실온에서 수용성이고 다음 일반식을 가진다: R(O-CH2-CH2)nO-R, 여기서 R 은 수소, 또는 예를 들어 알킬 또는 알칸올 기 같은 보호기일 수 있다. 바람직하게는, 보호기는1 내지 8 개의 탄소를 가질 수 있다. 예를 들면, 보호기는 메틸이다. 심볼 n은 양의 정수이다. 일 구현예에서 n은 1 내지 1,000이다. 또다른 구현예에서 n은 2 내지 500이다. 바람직하게는, PEG는 1,000 내지 40,000의 평균 분자량을 가지고, 더 바람직하게는 PEG는 2,000 내지 20,000의 분자량을 가지고, 보다 더 바람직하게는 PEG는 3,000 내지 12,000의 분자량을 가진다. 뿐만 아니라, PEG는 최소한 한 개의 하이드록시 기를 가질 수 있고, 예를 들면 PEG는 말단 하이드록시 기를 가질 수 있다. 예를 들면, 이것은 억제제 위에서 자유 아미노 기와 반응하도록 활성화된 말단하이드록시 기이다. 하지만, 반응기의 유형 및 양은 본 발명의 공유적으로 접합된 PEG/항체를 도달하기 위해 달라질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
수용성 폴리옥시에틸레이티드 폴리올은 또한 본 발명에서 유용하다. 그들은 폴리옥시에틸레이티드 솔비톨, 폴리옥시에틸레이티드 글루코즈, 폴리옥시에틸레이티드 글리세롤 (POG), 및 등등을 포한한다. 일 구현예에서, POG 가 사용된다. 임의의 이론에 의해 구속됨 없이, 폴리옥시에틸레이티드 글리세롤의 글리세롤 중추는, 예를 들면, 동물 및 인간 내에서 모노-, 디-, 트리글리세라이드로 자연적으로 발생하는 동일한 중추이기 때문에, 이 분지(branching)는 필연적으로 체내에서 외부 물질로 보여지지 않을 것이다. POG는 PEG와 동일한 범위의 분자량을 가질 수 있다. 순환 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 또다른 약물 전달 시스템은 리포솜이다. 리포솜 전달 시스템을 준비하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다. 다른 약물 전달 시스템은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면, Poznansky et al. (1980) 및 Poznansky　(1984)에 참조된 것에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 항체는 실질적으로 다른 폴리펩티드를 포함하지 않는 조성물 내에 존재할 것이고, 일례로, 여기서 조성물의 90% (중량으로) 미만, 통상적으로 60% 미만 및 더 통상적으로 50% 미만이 다른 폴리펩티드로 구성된다.
본 발명의 항체는 비-인간 (또는 이종) 숙주 내에서, 일례로, 마우스 내에서 면역원성일 수 있다. 구체적으로, 항체는 항체는 비-인간 숙주 내에서는 면역원성이지만, 인간 숙주 내에서는 아닌 이디오토프를 가질 수 있다. 구체적으로, 인간 용도를 위한 본 발명의 항체는 예를 들어 마우스, 산양, 토끼, 래트(rat), 비-영장류 포유류, 등등과 같은 숙주로부터 쉽게 분리될 수 없고 인간화에 의해 또는 제노-마우스로부터 일반적으로 획득될 수 없는 것들을 포함한다.
항체의 생산
본 발명에 따른 항체는 당해 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 하이브리도마 테크놀로지를 사용하여 단일클론 항체를 만들기 위한 일반적인 방법론은 잘 알려져 있다 (Kohler, G. and Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983). 일 구현예에서, WO 2004/076677에 기술된 대안적인 EBV 불멸화 방법이 사용된다.
바람직한 방법은 WO 2004/076677에 기술되어 있다. 이 방법에서 본 발명의 항체를 생산하는 B 세포는 EBV 및 다클론 B 세포 활성제와 형질전환된다. 세포 성장 및 분화의 추가적 자극제는 형질전환 단계 동안 효율성을 부가 증진시키기 위해 선택적으로 추가될 수 있다. 이들 자극제는 예를 들어 IL-2 및 IL-15 같은 사이토킨일 수 있다. 일 측면에서, IL-2는 불멸화 단계 동안 불멸화의 효율성을 부가 개선하기 위해 추가되지만, 그러나 이의 사용은 필수적이 아니다. 이들 방법을 사용해 생산된 불멸화된 B 세포는 그러고는 당해 분야에 알려진 방법 및 그로부터 분리된 항체를 사용해 배양될 수 있다.
또다른 바람직한 방법은 WO 2010/046775에 기술되어 있다. 이 방법에서 형질 세포는 제한된 수로, 또는 마이크로웰 배양 접시에서 단일 형질 세포로 배양된다. 항체는 형질 세포 배양으로부터 분리될 수 있다. 더욱이, 형질 세포 배양으로부터, RNA는 추출될 수 있고 PCR은 당해 분야에 알려진 방법을 사용해 수행될 수 있다. 항체의 VH 및 VL 영역은 RT-PCR (역전사효소 PCR)에 의해 증폭되고, 서열화되고 발현 벡터로 클로닝될 수 있고 이는 그러고는 HEK293T 세포 또는 다른 숙주 세포 내로 형질주입된다. 발현 벡터 내 핵산의 클로닝, 숙주 세포의 형질주입, 형질주입된 숙주 세포의 배양 및 생산된 항체의 분리는 당해 분야의 기술자에게 알려진 임의의 방법을 사용하여 될 수 있다.
항체는, 원한다면, 여과, 원심분리 및 예를 들어 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피 같은 다양한 크로마토그래피 방법을 사용해, 부가 정제될 수 있다. 항체, 일례로, 단일클론 항체의 정제를 위한 테크닉은, 약학적-등급 항체를 생산하기 위한 테크닉을 포함하여, 당해 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체의 단편은 효소, 예를 들어 펩신 또는 파파인과의 소화를 포함하는 방법에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 이황 결합의 분해에 의해 항체로부터 획득될 수 있다. 대안적으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄의 서열의 일부의 클로닝 및 발현에 의해 획득될 수 있다. 항체 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)을 아우른다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명의 항체로부터의 CDR을 포함하는 scFv를 포함한다. 또한 중쇄 또는 경쇄 단량체 및 이량체, 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체는 물론, 단쇄 항체, 일례로, 그 내에서 펩티드 링커에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 합쳐지는 단쇄 Fv도 포함된다.
본 발명의 항체 단편은 일가(monovalent) 또는 다가(multivalent) 상호작용을 전해줄 수 있고 상기 기술된 것처럼 다양한 구조에 함유될 수 있다. 사례를 들면, scFv 분자는 삼가의 "트리아바디" 또는 사가의 "테트라바디"를 생성하기 위해 합성될 수 있다. scFv 분자는 이가의 미니바디를 가져오는 Fc 영역의 도메인을 포함할 수 있다. 더불어, 본 발명의 서열은 본 발명의 서열이 본 발명의 에피토프를 타겟하고 분자의 다른 영역은 다른 타겟에 결합하는 다가특이성 분자의 성분이 될 수 있다. 예시적 분자는, 이에 제한되지 않지만, 이중특이적 Fab2, 삼중특이적 Fab3, 이중특이적 scFv, 및 디아바디를 포함한다 (Holliger andHudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).
분자 생물학의 표준 테크닉이 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 DNA 서열을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용해 완전하게 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위-특이적 돌연변이 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 적당하게 사용될 수 있다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들면 E. coli, 및 다른 미생물 시스템이, 예를 들어 Fab 및 F(ab')2 단편, 및 특별히 Fv 단편 및 단쇄 항체 단편, 예를 들면, 단쇄 Fvs 같은 항체 단편의 발현을 위해, 부분적으로, 사용될 수 있다. 진핵, 일례로, 포유류, 숙주 세포 발현 시스템이 전체 항체 분자를 포함하는, 더 큰 항체 분자의 생산을 위해 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는, 이에 제한되지 않지만, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 DNA로부터의 단백질의 발현을 위해 적합한 상태 하에서 본 발명의 핵산을 암호화하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는, 및 항체 분자를 분리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자의 생산을 위한 공정을 제공한다.
항체 분자는 오직 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이 경우 오직 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열은 숙주 세포 형질주입에 사용되는 것이 필요하다. 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 산물의 생산을 위해, 세포주는 두 개의 벡터, 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는두 번째 벡터로 형집주입될 수 있다. 대안적으로, 단일 벡터, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터가 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체는 (i) 숙주 세포 내에서 본 발명에 따른 핵산 서열을 발현하는 단계, 일례로 본 발명에 따른 벡터의 사용에 의해, 및 (ii) 발현된 항체 산물을 분리하는 단계에 의해 생산될 수 있다. 추가적으로, 방법은 (iii) 분리된 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 형질전환 B 세포 및 배양된 형질 세포는 원하는 특이성 및 기능의 항체를 생산하는 것들로 스크리닝될 수 있다.
스크리닝 단계는 임의의 면역어세이, 일례로, ELISA, 염색 조직 또는 세포 (형질주입된 세포를 포함)의 염색에 의해, 중화 어세이에 의해 또는 원하는 특이성 또는 기능을 확인하기 위해 당해 분야에 알려진 많은 다른 방법 중 한 개에 의해 실행될 수 있다. 어세이는 하나 이상의 항원의 간단한 인지에 기초하여 선택하거나, 또는 원하는 기능에 추가로 기초하여 선택, 일례로, 단지 항원-결합 항체 보다 중화 항체를 선택, 타겟된 세포의 특징, 예를 들어 그들의 신호전달경로, 그들의 모양, 그들의 성장 속도, 다른 세포에 영향 미치는 그들의 능력, 다른 세포에 의한 또는 다른 시약에 의한 또는 상태의 변화에 의한 영향에 대한 그들의 반응, 그들의 분화 상태 등등을 변화시킬 수 있는 항체를 선택할 수 있다.
개별적 형질전환 B 세포 클론은 그러고는 양성 형질전환 B 세포 배양으로부터 생산될 수 있다. 양성 세포의 혼합물로부터 개별적 클론을 분리하기 위한 클로닝 단계는 한계 희석, 미세조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침전 또는 당해 분야에 알려진 또다른 방법을 사용해 실행될 수 있다.
배양된 형질 세포로부터의 핵산은 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 분리, 클론되고 및 HEK293T 세포 또는 다른 알려진 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
본 발명의 불멸화된 B 세포 클론 또는 형질주입된 숙주 세포는 다양한 방식으로, 일례로, 단일클론 항체의 급원으로, 관심의 단일클론 항체를 암호화하는 핵산 (DNA 또는 mRNA)의 급원으로, 연구를 위해, 등등에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 생산하는 불멸화된 B 기억 세포 또는 형질주입된 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 불멸화된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포는 또한 순차적 재조합 발현을 위한 항체 유전자의 클로닝을 위한 핵산의 급원으로 사용될 수 있다. 재조합 급원으로부터의 발현은, 안정성, 재현성, 배양 용이성, 등등의 원인으로, B 세포 또는 하이브리도마로부터의 발현 보다 약학적 목적에서 더 흔하다.
따라서 본 발명은 또한 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 (i) 관심 항체를 암호화하는 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 하나 이상의 핵산 (일례로, 중쇄 및/또는 경쇄 mRNA)을 획득하는 단계; (ii) 발현 벡터 내로 핵산을 삽입하는 단계 및 (iii) 숙주 세포 내에서 관심 항체의 발현을 허용하기 위해 숙주 세포 내로 벡터를 형질주입하는 단계를 포함한다.
유사하게, 본 발명은 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 (i) 관심 항체를 암호화하는B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 핵산(들)을 시퀀싱하는 단계; 및 (ii) 숙주 세포 내에서 관심 항체의 발현을 허용하기 위해 단계 (i)로부터 얻은 서열 정보를 사용해 숙주 세포 내로 삽입하기 위한 핵산(들)을 준비하는 단계를 포함한다. 핵산은, 그럴 필요는 없지만, 단계 (i) 및 (ii) 사이에, 제한 부위를 도입, 코돈 사용을 변화, 및/또는 전사 및/또는 번역 조절 서열을 최적화하여 조작될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 또한 관심 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산으로 숙주 세포를 형질주입하는 단계를 포함하는 형질주입된 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 핵산은 본 발명의 불멸화된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 유래된 핵산이다. 따라서 먼저 핵산(들)을 제조하고 그러고는 이를 사용해 숙주 세포를 형질주입하는 절차가 상이한 시간에 상이한 사람에 의해 상이한 장소에서 (일례로, 상이한 국가에서) 수행될 수 있다.
본 발명의 이들 재조합 세포는 그러고는 발현 및 배양 목적을 위해 사용될 수 있다. 그들은 대규모 약학적 생산을 위한 항체의 발현에 유용하다. 그들은 또한 약학 조성물의 활성 성분으로 사용될 수 있다. 임의의 적합한 배양 테크닉이 사용될 수 있고, 이에 제한되지 않지만 정치 배양(static culture), 회전병 배양(roller bottle culture), 복수 유체(ascites fluid), 유공 섬유 유형 반응기 카트리지(hollow-fiber type bioreactor cartridge), 모듈라 미니 반응기(modular minifermenter), 교류 탱크(stirred tank), 마이크로캐리어 배양기(microcarrier culture), 세라믹 중심 관류(ceramic core perfusion), 등등을 포함한다.
B 세포 또는 형질 세포로부터 면역글로불린 유전자를 획득하고 시퀀싱하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다 (일례로, Kuby Immunology의 Chapter 4, 4th edition, 2000를 참조하라).
형질주입된 숙주 세포는, 효모 및 동물 세포, 특히 포유류 세포 (일례로, CHO 세포, NS0 세포, 인간 세포 예를 들어 PER.C6 또는 HKB-11 세포, 골수종 세포, 또는 인간 간 세포, 예를 들어Hepa RG)는 물론, 식물 세포를 포함하는 진핵 세포일 수 있고, 그로써 포유류 세포가 바람직하다. 바람직한 발현 숙주는 본 발명의 항체를, 특히 그들 스스로는 인간에서 면역원성이 아닌 탄수화물 구조로, 글리코실화할 수 있다. 일 구현예에서 형질주입된 숙주 세포는 무-혈청 배지에서 성장할 수 있다. 부가 구현예에서 형질주입된 숙주 세포는 동물-유래 산물의 존재없이 배양물에서 성장할 수 있다. 형질주입된 숙주 세포는 또한 세포주를 제공하기 위해 배양될 수 있다.
본 발명은 또한 관심 항체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 (일례로, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 (i) 본 발명에 따른 불멸화된 B 세포 클론를 제조하거나 또는 형질 세포를 배양하는 단계; (ii) 관심 항체를 암호화하는 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포 핵산으로부터 획득하는 단계를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 관심 항체를 암호화하는 핵산 서열을 획득하는 방법을 제공하고, 이는 (i) 본 발명에 따른 불멸화된 B 세포 클론을 제조하거나 또는 형질 세포를 배양하는 단계; (ii) 관심 항체를 암호화하는 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 핵산을 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
본 발명은 부가로 본 발명의 형질전환 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 획득된 핵산을 획득하는 단계를 포함하는 관심 항체를 암호화하는 핵산 분자(들)을 제조하는 방법을 제공한다. 따라서 먼저 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포를 획득하고, 그 후 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 핵산(들)을 획득하는 절차가 상이한 시간에 상이한 사람에 의해 상이한 장소에서 (일례로, 상이한 국가에서) 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 (일례로, 약학적 용도를 위한) 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 이는 (i) 관심 항체를 발현하는 선택된 B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포로부터 하나 이상의 핵산 (일례로, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 획득 및/또는 시퀀싱하는 단계; (ii) 발현 벡터를 제조하기 위해 핵산(들)을 삽입하거나 핵산(들) 서열(들)을 사용하는 단계; (iii) 관심 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 형질주입하는 단계; (iv) 관심 항체가 발현되는 상태 하에서 형질주입된 숙주 세포를 배양 또는 이차-배양하는 단계; 및, 선택적으로, (v) 관심 항체를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 형질주입된 숙주 세포 집단, 일례로 안정적으로 형질주입된 숙주 세포 집단을, 관심 항체가 발현되는 상태 하에서 배양 또는 이차-배양하고, 선택적으로, 관심 항체를 정제하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 형질주입된 숙주 세포 집단은 (i) 상기 기술된 것처럼 제조된B 세포 클론 또는 배양된 형질 세포에 의해 생산된 선택된 관심 항체를 암호화하는 핵산(들)을 제공하는 단계, (ii) 발현 벡터 내로 핵산(들)을 삽입하는 단계, (iii) 관심 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 벡터를 형질주입하는 단계, 및 (iv) 관심 항체를 생산하기 위해 삽입된 핵산을 포함하는 형질주입된 숙주 세포를 배양 또는 이차-배양하는 단계에 의해 제조되었다. 따라서 재조합 숙주 세포를 제조하고 그 후 항체를 발현하기 위해 이를 배양하는 절차가 매우 상이한 시간에 상이한 사람에 의해 상이한 장소에서(일례로, 상이한 국가에서) 수행될 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 하나 이상의 다음을 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
(i) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항체 단편;
(ii) 본 발명에 따른 항체, 또는 항체 단편을 암호화하는 핵산;
(iii) 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터; 또는
(iv) 본 발명에 따른 항체를 발현하거나 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세포.
다시 말해서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 본 발명에 따른 세포을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물은 바람직하게는 또한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 함유할 수 있다. 비록 담체 또는 또는 부형제는 투여를 촉진할 수 있지만, 그 스스로 조성물을 수여받는 개체에 유해한 항체의 생산을 유도해서는 안된다. 유독해서도 안된다. 적합한 담체는 크고, 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 폴리사카라이드, 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 약학 조성물 내 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분 또는 비활성 성분일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학 조성물 내 약학적으로 허용가능한 담체는 B형 또는 D형 간염에 대해 활성 성분이 아니다.
약학적으로 허용가능한 염, 예를 들면 무기산 염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
약학 조성물 내 약학적으로 허용가능한 담체는 추가적으로 액체, 예를 들어, 물, 염, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예를 들어 가습제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물 내에 존재할 수 있다. 이러한 담체는, 대상에 의한 소화를 위해, 약학 조성물을 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액제, 젤, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 조제될 수 있게 한다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 액상 용액 또는 현탁액의 주사제로 제조될 수 있다. 주사 전 액상 입자에 용액, 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 준비될 수 있다 (일례로, 보존제를 함유하는 멸균수로 재구성하기 위한 동결건조된 조성물, 시나지스(Synagis)® 및 허셉틴(Herceptin)® 유사). 조성물은 국소 투여용, 일례로, 연고, 크림 또는 분말로 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여용, 일례로, 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 시럽 (선택적으로 향이 첨가된)으로 제조될 수 있다. 조성물은 폐 투여를 위해, 일례로, 분말 또는 스프레이를 사용해 흡입기로 제조될 수 있다. 조성물은 좌제 또는 질좌제로 제조될 수 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 안구 투여, 일례로, 드롭으로 제조될 수 있다. 조성물은 대상에게 투여하기 직전에 조합된 조성물이 재구성되도록 고안된 키트 형태일 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 항체는 멸균수 또는 멸균 완충액과 함께 키트에 제공될 수 있다.
조성물 내 활성 성분은 항체 분자, 항체 단편 또는 그의 변종 및 유도체이고, 구체적으로 조성물 내 활성 성분은 본 발명에 따른 항체 분자, 항체 단편 또는 그의 변종 및 유도체인 것이 바람직하다. 이를 테면, 이는 위장관에서 분해되기 쉬울 수 있다. 따라서, 만약 조성물이 위장관을 이용한 경로로 투여된다면, 조성물은 위장관에서 항체의 분해로부터 항체를 보호하지만 위장관으로부터 일단 흡수되면 항체를 방출하는 물질을 함유할 것이다..
약학적으로 허용가능한 담체의 완전한 논의는 Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472에서 가능하다.
본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 pH 5.5 내지 8.5를 가지고, 몇몇 구현예에서 이는 6 내지 8일 수 있고, 그리고 다른 구현예에서 약 7이다. pH는 완충액의 사용에 의해 유지될 수 있다. 조성물은 멸균 및/또는 발연원이 없을 것이다. 본 조성물은 인간에 대해 등장성이다. 일 구현예에서 본 발명의 약학 조성물은 밀봉된 용기에 공급된다.
본 발명의 범주 내에 조성물은 수 개의 투여의 형태로 존재한다; 형태는, 이에 제한되지 않지만, 비경구 투여에 적합한 이들 형태, 일례로, 주사 또는 주입, 예를 들면 일시 주사 또는 연속적 주입을 포함한다. 산물이 주사 또는 주입을 위한 경우, 오일 또는 수용성 비이클 내에 현택액, 용액, 에멸젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 특정한 제형제, 예를 들어, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체와의 재구성을 위한 건조 형태일 수 있다. 입자는 전형적으로, 성분, 예를 들어 약학적 활성 성분, 구체적으로 본 발명에 따른 항체를 저장, 운송, 및/또는 투여하기에 적합한 물질인 것으로 이해된다. 예를 들면, 본 입자는 약학적 활성 성분, 구체적으로 본 발명에 따른 항체를 저장, 운송, 및/또는 투여하기에 적합한 생리학적으로 허용가능한 액체일 수 있다. 일단 조제되면, 본 발명의 조성물은 대상에게 직접적으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서 조성물은 포유류, 일례로, 인간 대상에 투여를 위해 맞추어진다.
이 발명의 약학 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 복강내, 수막강내, 심실내, 경피, 피부통과, 국소, 피하, 비강내, 장관, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 괴사분사(Hypospray)가 또한 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약학 조성물은 경구 투여를 위해, 일례로 정제, 캡슐 및 등등, 국소 투여용, 또는 주사용, 일례로 액상 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있고, 그로써 약학 조성물은 주사용이 특히 바람직한다. 주사 전 액상 입자에 용액, 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 바람직하고, 일례로 약학 조성물은 동결건조된 형태이다.
주사, 일례로 정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 병의 부위에의 주사를 위해, 활성 성분은 바람직하게는 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비경구적으로 사용가능한 수성 용액의 형태일 것이다. 당해 분야의 관련 기술자들, 예를 들면, 등장성 입자, 예를 들어 염화 나트륨 주사, 링거(Ringer's) 주사, 락토오즈를 가한 링거(Lactated Ringer's) 주사를 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가, 필요하면, 포함될 수 있다. 개체에 주어지는 것이 폴리펩티드, 펩티드, 또는 핵산 분자, 본 발명에 따른 다른 약학적으로 유용한 성분인지 무관하게, 투여는 바람직하게는 "방지적 유효량" 또는 "치료적 유효량" (사례에 따라)이고, 이는 개체에 이득을 보여주기에 충분하게 된다. 실제 투여되는 양, 및 투여의 속도 및 시간-경로는 치료되어야 하는 것의 성질 및 심각성에 따라 달라진다. 주사를 위해, 본 발명에 따른 약학 조성물은 예를 들면 사전-충전된 시린지로 제공될 수 있다.
상기 기술된 발명의 약학 조성물은 상기 정의된 것처럼, 이에 제한되지 않지만, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 수성 용액을 포함하는, 임의의 경구적으로 허용가능한 복용량 형태로 경구적으로 투여될 수 있다. 경구 용도를 위한 정제의 사례에서, 흔히 사용되는 담체는 락토오즈 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)도 또한 전형적으로 추가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토오즈 및 건조된 옥수수전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 요구되는 경우에는, 활성 성분, 즉 상기 정의된 것처럼 발명의 운반체 카르고 접합체 분자는 유화제 및 현탁화제와 조합된다. 원한다면, 특정의 감미제, 향미제 또는 색소가 또한 추가될 수 있다.
발명의 약학 조성물은 또한, 특별히 치료의 타겟이 국소 적용에 의해 손쉽게 접근 가능한 지역 또는 기관을 포함하는 경우, 일례로 피부 또는 임의의 다른 접근 가능한 상피 조직의 질병을 포함하여 국소적으로 투여될 수 있다. 적합한 국소 제형은 각각의 이들 지역 또는 기관을 위해 손쉽게 제조될 수 있다. 국소 적용을 위해, 발명의 약학 조성물은, 발명의 약학 조성물, 특히 이의 성분을 상기 정의된 것처럼 함유하고, 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된, 적합한 연고로 제형될 수 있다. 국소 투여를 위한 담체는, 이에 제한되지 않지만, 미네랄 오일, 유동 와셀린(liquid petrolatum), 백색 와셀린(white petrolatum), 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸린, 폴리옥시프로필렌 성분, 유화 왁스 및 물을 포함한다. 대안적으로, 발명의 약학 조성물은 적합한 로션 또는 크림으로 제형될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 적합한 담체는, 이에 제한되지 않지만, 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스(cetyl esters wax), 세테아릴 알코올(cetearyl alcohol), 2-옥틸도데칸올(2-octyldodecanol), 벤질 알코올 및 물을 포함한다.
복용량 처치는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정일 수 있고, 그로써 본 발명의 맥락에서 다중 용량 일정이 바람직하다. 알려진 항체-기반 의약, 구체적으로 항-HBV 기반 의약, 일례로 헤파텍트(Hepatect)® CP는 투여의 빈도와 관련된 지침, 구체적으로 상이한 적응증에 대하여, 일례로, 의약이 매일, 매주, 매월 전달되어야 하는지 등등을 제공한다. 빈도 및 복용량은 또한 증상의 심각성에 따라 달라진다.
예를 들면, 본 발명에 따른 약학 조성물은 매일, 일례로 하루에 한 번 또는 수 번, 일례로 하루에 한 번, 두 번, 세 번 또는 네 번, 바람직하게는 하루에 한 번 또는 두 번, 더 바람직하게 하루에 한 번, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일 또는 그 이상 동안, 일례로 하루에 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월 동안 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 매주, 일례로 주마다 한 번 또는 두 번, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 주 또는 그 이상 동안, 일례로 주마다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 또는 주마다 2, 3, 4, 또는 5 년 동안 투여될 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 매월, 일례로 월마다 한 번 또는, 더 바람직하게는, 매 격월마다 1, 2, 3, 4, 또는 5 년 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 투여의 바람직한 종점은 혈청전환이 도달한 때이고, 바람직하게는 요법의 종점은 항-HBV 항체로의 혈청전환을 동반한 혈청으로부터 HBsAg의 지속적 소실이다. 또한 투여는 일생 동안 지속되는 것이 바람직하다. 더불어, 또한 한 개의 오직 단일 투여는, 구체적으로 특정한 적응증에 대하여, 일례로 비-면역화된 대상에서 우연한 노출의 사례에서 B형 간염의 예방을 위해 또한 착상될 수 있다.
구체적으로, 단일 용량, 일례로 매일, 매주 또는 매월 용량을 위한, 바람직하게는 매주 용량을 위한, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 양은, 본 발명에 따른 약학 조성물로, 1 g을 초과하지 않고, 바람직하게는 500 mg을 초과하지 않고, 더 바람직하게는 250 mg을 초과하지 않고, 보다 더 바람직하게는 100 mg을 초과하지 않고, 및 특히 바람직하게는 50 mg을 초과하지 않는 것이 바람직하다.
약학 조성물은 전형적으로 "유효"량의 하나 이상의 본 발명의 항체, 즉 원하는 질병 또는 상태를 치료, 개선, 약화 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료 효과를 드러내기에 충분한 양을 포함한다. 치료 효과는 또한 병원성능 또는 신체 증상의 감소 또는 약화를 포함한다. 임의의 특정 대상을 위한 정밀한 유효량은 그들의 크기, 중량, 및 건강, 상태의 성질 및 정도, 및 투여를 위해 선택된 치료제 또는 치료제들의 조합에 따라 달라질 것이다. 주어진 상태에 대한 유효량은 일상적인 실험에 의해 결정되며, 임상의의 판단 범위내에 있다. 본 발명을 목적을 위하여, 유효 용량은 일반적으로 이것이 투여되는 개체의 체중 (일례로, kg)에 관련하여 본 발명의 항체로 (일례로 약학 조성물 내 항체의 양으로) 약 0.005 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 0.0075 내지 약 50 mg/kg, 더 바람직하게는 0.01 내지 약 10 mg/kg, 및 보다 더 바람직하게는 0.02 내지 약 5 mg/kg이 될 것이다.
예를 들면, 간 이식의 맥락에서, 일례로 B형 간염은 간 부전을 초래하므로, 본 발명에 따른 약학 조성물 내 항체, 또는 그의 항원 결합 단편의 양은, 이식 당일에는 단일 용량으로, 바람직하게는 50 mg을 초과하지 않고, 더 바람직하게는 10 mg 이하, 그러고는 수술 전후로는 항-HBs 혈청 수준 약 100 IU/L을 유지하기 위해, 칠 일 동안 매일 10 - 50 mg 이하, 바람직하게는 2 - 10 mg 이하, 및 매 1-3 개월 동안 투여된 단일 용량당 10 - 50 mg 이하, 바람직하게는 2 - 10 mg 이하일 것이다.
만성 B형 간염의 치료를 위해, 예를 들면, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 약학 조성물은 바람직하게는 피하로, 본 발명에 따른 항체의 단일 용량으로 500 mg 까지, 바람직하게는 250 mg 까지, 더 바람직하게는 100 mg 까지 투여된다. 이러한 단일 용량은 상기 기술된 것처럼 매일, 매주 또는 매월 투여될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 약학 조성물은 또한 추가적 활성 성분을 포함할 수 있고, 이는 부가항체 또는 항체가 아닌 성분일 수 있다. 추가적 활성 성분은 바람직하게는 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제로부터 선택된다. 바람직한 중합효소 억제제는 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘 및 테노포비르를 포함한다. 중합효소 억제제는 역전사 및 DNA-플러스 가닥의 합성을 저지한다. 중합효소 억제제는 바이러스 확산, cccDNA의 형성을 예방하지 못하고 방출에 영향을 미치지 않는다. 인터페론은 IFN알파 및 IFN베타를 포함하고, 그로써 IFN베타가 바람직하다. 바람직한 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1 및/또는 CTLA4의 차단으로 기울어지고, 따라서, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-CTLA4 항체를 포함한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 추가적 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 동일한 약학 조성물 내에서 추가적 활성 성분으로 존재할 수 있거나 또는, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 첫 번째 약학 조성물에 포함되고 추가적 활성 성분은 첫 번째 약학 조성물과는 상이한 두 번째 약학 조성물에 의해 포함된다. 그에 따라, 만약 한 개 초과의 추가적 활성 성분이 착상되면, 각각의 추가적 활성 성분 및 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 상이한 약학 조성물에 의해 포함된다. 이러한 상이한 약학 조성물은 조합된/동시적으로 또는 분리된 시간에 또는 분리된 위치에서 (일례로 신체의 분리된 부분) 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 및 추가적 활성 성분은 추가적 치료 효과 또는, 바람직하게는, 상승적 치료 효과를 제공한다. 용어 "상승적"은 각각의 활성제의 개별적 효과의 합보다 더 큰 두 개 이상의 활성제의 조합된 효과를 기술하기 위해 사용된다. 따라서, 두 개 이상의 약제의 조합된 효과가 활성 또는 공정의 "상승적 억제"를 초래하는 경우에는, 활성 또는 공정의 억제가 각각의 활성제의 억제 효과의 합보다 더 큰 것을 의도한다. 용어 "상승적 치료 효과"는 두 개 이상의 요법의 조합에서 관찰된 치료 효과가 각각의 개별적 요법에서 관찰되는 개별적 치료 효과의 합보다 더 큰 것을 지칭한다.
gHCB34에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항체를 포함할 수 있고, 여기서 항체는 조성물 내 총 단백질의 최소한 50% 중량으로 (일례로, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)으로 만들어질 수 있다. 이러한 조성물 내에서, 항체는 바람직하게는 정제된 형태이다.
본 발명은 또한 (i) 본 발명의 항체를 제조하는; 및 (ii) 정제된 항체를 하나 이상의 약학적으로-허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 구현예에서, 약학 조성물을 제조하는 방법은 항체를 하나 이상의 약학적으로-허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는 본 발명의 형질전환 B 세포 또는 배양된 형질 세포로부터 획득된 단일클론 항체이다.
치료적 목적을 위해 항체 또는 B 세포를 전달하는 것의 대안으로, B 세포 또는 배양된 형질 세포로부터 유래된 관심의 단일클론 항체 (또는 그의 비활성 단편)을 암호화하는 핵산 (전형적으로 DNA)를 대상에게 전달에게 전달하는 것이 가능하고, 그로 인해 핵산은 원하는 치료 효과를 제공하도록 대상 내 정위치에서 발현될 수 있다. 적합한 유전자 요법 및 핵산 전달 벡터은 당해 분야에 알려져 있다.
약학 조성물은, 특히 만약 다중 용량 형태로 포장되는 경우에는, 항균제를 포함할 수 있다. 그들은 세제, 일례로, 트윈 (폴리소르베이트), 예를 들어 트윈 80을 포함할 수 있다. 세제는 일반적으로 낮은 수준, 일례로, 0.01% 미만으로 존재한다. 조성물은 또한 독성을 주는 소듐 염 (일례로, 염화 나트륨)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 10±2 mg/ml 농도의 염화 나트륨이 전형적이다.
더욱이, 약학 조성물은, 특히 만약 그들이 동결건조되거나 또는 만약 동결건조된 물질로부터 재구성된 물질을 포함하는 경우에는, 당 알코올 (일례로, 만니톨) 또는 다이사카라이드 (일례로, 수크로오즈 또는 트레할로스) 일례로, 대략15-30 mg/ml (일례로, 25 mg/ml)를 포함할 수 있다. 동결건조를 위한 조성물의 pH는 동결건조 전에 5 내지 8, 또는 5.5 내지 7, 또는 대략 6.1 로 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 면역 조절제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 면역 조절제는 항원보강제(adjuvant)를 포함한다.
의료적 치료 및 용도
부가적 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 (i) B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화; 또는 (ii) B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단 용도를 제공한다.
본 발명의 범주 내에 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물의 투여의 수 개의 형태 및 경로가 약학 조성물에 대해 상기 기술된 것처럼 있다. 이는 또한 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 및 세포의 용도의 맥락에서, 구체적으로 바람직한 형태 및 투여의 경로와 관련하여, 적용된다.
진단의 방법은 항체 또는 항체 단편를 샘플과 코팅하는 것을 포함한다. 이러한 샘플은, 예를 들면 분리된 조직 샘플, 예를 들면, 비강 통로, 부비강, 타액선, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상샘, 뇌, 피부 또는 혈액, 바람직하게는 혈청으로부터 얻은, 대상으로부터 분리될 수 있다. 본 진단 방법은 또한, 구체적으로 항체 또는 항체 단편의 샘플과의 접촉에 후행하는, 항원/항체 복합체의 검출을 포함한다. 이러한 검출 단계는 전형적으로 실험대에서, 즉 인간 또는 동물 신체에의 어떠한 접촉 없이 수행된다. 검출 방법의 예는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있고, 일례로, ELISA (효소 면역 측정법)를 포함한다.
본 발명은 또한 (i) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 그의 변종 및 유도체, (ii) 본 발명에 따른 불멸화된 B 세포 클론, (iii) 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터 또는 (iv) 본 발명의 약학 조성물의 (a) B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방, 치료 또는 약화를 위한 약제의 제조 또는 (b) B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단을 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 약제, 구체적으로B형 간염 및/또는 D형 간염의 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다. 이는 또한 본 발명의 항체의 대상의 치료를 위한 약제의 제조 및/또는 대상 내 진단에서의 용도를 제공한다. 이는 또한 본 발명의 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예에서 대상은 인간일 수 있다. 치료적 처치의 효능을 확인하는 하나의 방법은 본 발명의 조성물의 투여 이후 질병 증상을 모니터링하는 것을 관여한다. 치료는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 불멸화된 B 세포 클론, 또는 약학 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 이러한 대상은, 이에 제한되지 않지만, B형 간염 및/또는 D형 간염에 걸리기 쉬운 위험에 있는 자를 포함한다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은, 또한B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단을 위한 키트에 사용될 수 있다. 더욱이, 본 명세서에 기술된 것처럼 본 발명의 항체를 결합할 수 있는, HBsAg의 항원성 루프 영역 내 에피토프는 보호적 항-HBV 항체의 존재를 검출하거나 또는 역가를 결정함에 의해 적용 절차의 효능을 모니터링하기 위한 키트에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 만성 B형 간염의 치료 또는 약화에 사용된다.
흥미롭게도, 본 발명에 따른 항체는 (i) 강력하게HBV 감염을 중화하고, (ii) L-HBsAg (거대HBV 외피 단백질, 이는 감염성HBV 입자에 존재)에 결합하고, 그것에 의해서HBV의 확산을 예방하고, (iii) S-HBsAg에 결합하고, 그것에 의해서 서브바이러스 입자 (SVP)의 제거를 촉진하고 및 (iv) 혈청전환, 즉 바이러스에 대한 활성 면역 반응을 유도할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 간 이식 이후 B형 간염 (재-)감염의 예방, 구체적으로 B형 간염 유도 간 부전을 위해 사용된다.
이것을 위하여, 바람직하게는 높은 용량이 간 이식 수여받는 환자에게 이식 당일 투여될 수 있고 그리고 매일 용량이 수술 전후로 약 일주일 동안 주어진다. 그후에, 바람직하게는 부가 용량이 매 1-3 개월마다 항-HBV 항체 혈청 수준 100 IU/ml 초과를 유지하기 위해 주어질 수 있다.
또다른 바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 비-면역된 대상에서 B형 간염의 예방/방지에 사용된다. 이는 예를 들면HBV에 (가상의) 우연의 노출 (사후-노출 방지) 사례이다. 용어 "비-면역된 대상"은 예방접종을 전혀 받지 않고, 따라서 면역되지 않은 대상, 및 백신접종 이후 면역 반응을 보이지 않는 (측정가능한 항-B형 간염 항체 없음) 대상을 포함한다. 구체적으로 나중 그룹에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 B형 간염의 (연속적) 예방에 사용될 수 있고, 즉 "사후-노출 방지"와 대조적으로 (연속적) 예방은 바람직하게는 백신접종 이후 면역 반응을 보이지 않는 (측정가능한 항-B형 간염 항체 없음) 이러한 대상, 및 연속적 예방이 필요한 자를 위한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 혈액투석 환자에서 B형 간염의 방지에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 신생아에서B형 간염의 예방에 사용된다. 그것에 의해서, 구체적으로 B형 간염 바이러스 담체-모체의 신생아/비-면역된 모체가 바람직하다. 게다가, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 출생시 또는 출생 후 가능한 빨리 투여되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 투여는 예방접종에 뒤따라 혈청전환까지 반복될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 D형 간염의 치료 또는 약화, 바람직하게는 B형 간염 및 D형 간염에 사용되고, 구체적으로 이는 B형 간염 및 D형 간염 동반이환(comorbidity)이다. 흥미롭게도, 본 발명에 따른 항체는 B형 간염 바이러스뿐만 아니라, 또한 델타 간염 바이러스로 강력하게 중화한다. 그러므로, 본 발명에 따른 항체는 D형 간염의 첫 번째 치료를 제공할 수 있다.
병용 요법
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성의 방법 내 투여 및 본 발명에 따른 용도는 단독 또는, 치료 또는 억압되어야 하는 질병 또는 질환을 치료 및/또는 안정화에 유용한 보조제(또한 본 명세서에서 "추가적 활성 성분" 으로 지칭)와의 조합으로 실행될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여를 아우르고, 여기서 이것은 B형 간염을 치료 및/또는 예방하기에 유용한 다른 치료 요법 또는 보조제와, 이전에, 동시적으로 또는 순차적으로, 대상에게 투여된다. 상기 보조제와 동시적으로 투여되는 상기 항체, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물은, 동일한 또는 상이한 조성물(들) 내에 동일한 또는 상이한 투여의 경로(들)에 의해 투여될 수 있다.
상기 치료 요법 또는 보조제는 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면에서 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기에서 기술된 (의료적) 용도를 위해 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제와 조합으로 투여된다.
바람직한 중합효소 억제제는 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘 및 테노포비르를 포함한다. 라미부딘은 가장 바람직한 중합효소 억제제이다. 중합효소 억제제는 역전사 및DNA-플러스 가닥의 합성을 저지한다. 중합효소 억제제는 바이러스 확산, cccDNA의 형성을 예방하지 않고 HBsAg 방출에 영향을 미치지 않는다.
인터페론은 IFN알파 및 IFN베타를 포함하고, 그로써 IFN베타가 바람직하다.
바람직한 체크포인트 억제제는 PD-1/PD-L1 및/또는 CTLA4의 차단으로 기울어지고, 따라서, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-CTLA4 항체를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 추가적 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물좌 조합하여 투여되는 부가적 바람직한 보조제 (추가적 활성 성분)은 LTbR 작용제를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 중합효소 억제제와 조합하여 투여된다. 이는 구체적으로 B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화에서의 이러한 조합의 용도를 위해 적용된다. 이 맥락에서, 바람직한 중합효소 억제제는 라미부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 텔비부딘 및 테노포비르을 포함한다. 가장 바람직한 중합효소 억제제는 라미부딘이다.
바람직하게는, 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물은 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제와 동일한 또는 상이한 투여의 경로를 통해 투여된다.
부가적 측면에서 본 발명은 따라서 또한 다음의 조합을 제공한다.
(i) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물; 및
(ii) 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제.
이러한 조합은 바람직하게는 B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화, 구체적으로 만성 B형 간염 및/또는 만성 D형 간염의 치료 또는 약화에 사용된다. 더 바람직하게는, 조합은 HBV 단독-감염된 환자 또는 HBV/HDV 공동-감염된 환자에서 사용된다.
이러한 조합은 바람직하게는 HBsAg 제거를 가속한다.
그런 관점에서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 키트를 제공한다,
(i) 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물; 및
(ii) 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제.
더불어, 키트는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여를 위한 수단, 예를 들어 시린지 또는 혈관 및/또는 리플렛, 예를 들면 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 대한 지시사항과 함께, 및/또는 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 동일한 약학 조성물 내에서 추가적 활성 성분 (보조제)로 존재할 수 있거나 또는, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 첫 번째 약학 조성물에 포함되고 추가적 활성 성분 (보조제)는 첫 번째 약학 조성물과는 상이한 두 번째 약학 조성물에 의해 포함된다. 그에 따라, 만약 한 개 초과의 추가적 활성 성분 (보조제)가 착상되면, 각각의 추가적 활성 성분 (보조제) 및 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 바람직하게는 상이한 약학 조성물에 의해 포함된다. 이러한 상이한 약학 조성물은 조합된/동시적으로 또는 분리된 시간에 또는 분리된 위치에서 (일례로 신체의 분리된 부분) 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편 및 추가적 활성 성분(보조제)은 추가적 치료 효과 또는, 바람직하게는, 상승적 치료 효과를 제공한다. 상기 기술된 것처럼, 용어 "상승적"은 각각의 활성제의 개별적 효과의 합보다 더 큰 두 개 이상의 활성제의 조합된 효과를 기술하기 위해 사용된다. 따라서, 두 개 이상의 약제의 조합된 효과가 활성 또는 공정의 "상승적 억제"를 초래하는 경우에는, 활성 또는 공정의 억제가 각각의 활성제의 억제 효과의 합보다 더 큰 것을 의도한다. 용어 "상승적 치료 효과"는 두 개 이상의 요법의 조합에서 관찰된 치료 효과가 각각의 개별적 요법에서 관찰되는 개별적 치료 효과의 합보다 더 큰 것을 지칭한다.
용도 및 방법
또다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 항-간염-B 또는 항-간염-D 백신의 질을 모니터링하기 위한 용도를 상기 백신의 항원이 올바른 입체형태의 특이적 에피토프를 함유하는지 확인함에 의해 제공한다.
게다가, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단 용도를 제공한다.
더불어 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 분리된 혈액 샘플이 B형 간염 바이러스 및/또는 델타 간염 바이러스에 감염되었는지 결정하는 용도가 제공된다.
상기 기술된 것처럼, 진단의 방법은 항체 또는 항체 단편를 샘플과 코팅하는 것을 포함한다. 이러한 샘플은, 예를 들면 분리된 조직 샘플, 예를 들면, 비강 통로, 부비강, 타액선, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상샘, 뇌, 피부 또는 혈액, 바람직하게는 혈청으로부터 얻은, 대상으로부터 분리될 수 있다. 본 진단 방법은 또한, 구체적으로 항체 또는 항체 단편의 샘플과의 접촉에 후행하는, 항원/항체 복합체의 검출을 포함한다. 이러한 검출 단계는 전형적으로 실험대에서, 즉 인간 또는 동물 신체에의 어떠한 접촉 없이 수행된다. 검출 방법의 예는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있고, 일례로, ELISA (효소 면역 측정법)를 포함한다.
본 발명은 또한 대상 내 B형 간염 및/또는 D형 간염 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 방법은 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 간 이식을 받았던 대상에서 투여하는 것을 포함하는 간 이식을 받았던 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
상기의 방법에서 만성 B형 간염을 앓는 대상이 바람직하다.
게다가, 앞서 기술된 상세 사항들은, 구체적으로 약학 조성물 및 의료적 용도의 맥락에서, 또한 본 명세서에 기술된 방법에 적용된다. 예를 들면, 상기 기술된 방법에서 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 벡터, 본 발명에 따른 세포 또는 본 발명에 따른 약학 조성물이 바람직하게는 본 명세서에 기술된 것처럼 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제와 조합하여 투여된다.
본 발명은, 다른 결과들 사이에서, B형 간염 및 델타 바이러스의 중화에 대단히 강력한 항체는 물론, 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프의 발견 및 분리에 기초한다. 이러한 항체는, B형 간염 바이러스를 중화하기 위하여 오직 적은 양의 항체가 요구되기 때문에 선호된다. 게다가, D형 간염에 사용가능한 치료법이 현재 없다. 본 발명에 따른 항체는 HBV 및 HDV의 예방은 물론 치료 또는 약화에 대단히 효과적이다. 게다가, 본 발명에 따른 항체는 상이한 - 바람직하게는 알려진 모든 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 유전형 및 상이한 - 바람직하게는 알려진 모든 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 감염형 돌연변이체에 결합한다.
다음과 같이 첨부된 도면에 대한 간략한 설명이 주어질 것이다. 숫자들은 본 발명을 조금 더 상세히 구현하는 것으로 의도된다. 하지만, 그들은 어느 방식으로도 본 발명의 주제를 제한하는 것을 의도하지 않는다. .
도 1은 실시예 1 의 ELISA에 의해 측정된 HBC34 단일클론 항체의 세 개의 상이한 HBsAg 혈청형 (adw, ady, 및 ayw) 에 대한 결합을 보여준다.
도 2는 실시예 2의 다양한 항-HB 항체, 다시 말해 HBV 면역글로불린 (HBIG), HBC34, 및 부가 단일클론 항체의 PreS1 (18/7) 또는 HbsAg에 대한 생체내에서HepaRG 세포의 HBV 감염을 중화하는 능력을 보여준다. 각각의 항체는 세 개의 상이한 농도, 다시 말해 5 μg/ml, 0.5 μg/ml 및 0.05 μg/ml에서 검사되었고, 단HBIG는, 5000 μg/ml, 500 μg/ml 및 50 μg/ml에서 검사되었다.
도 3은 실시예 2의 세 개의 상이한 농도 (5 μg/ml, 0.5 μg/ml 또는 0.05 μg/ml) 의 HBC34 단일클론 항체의 존재 하에서 감염된 HepaRG 세포내 HbcAg 염색 및, 참조대로, 핵 염색을 보여준다.
도 4는 실시예 2의 HBC34의 상이한 농도의 감염성HDV에 대한 중화 활성을 보여준다. 0.12 μg/ml HBC34의 농도에서 HDV-양성 세포가 검출가능하지 않았고, 이는 HDV의 잠재적 중화를 표시한다. HBIG는, 대조적으로, HDV를 중화하지 않았다 (1:1000 희석, 즉 50 μg/ml에서 검사시).
도 5는 실시예 3 의 10 개의 HBV 유전형 A, B. C. D, E, F, G, H, I 및 J 의 HBsAg의 항원성 루프의 아미노산 서열을 보여준다. 이들 서열은 HBC34 항체에 의해 인식되는 에피토프를 포함한다 (회색으로 하이라이트 됨). 맨 위의 서열 (HBV-D J02203) 이 실시예 5, 도 7에서 펩티드 라이브러리를 고안하는데 사용되었다.
도 6은 실시예 3의, 세포형광 분광계 분석에 의해 분석된, 인간 단일클론 항체 HBC34 및 대조군 항체 (모두 5 μg/ml)의, 도면에 표시된 것처럼, 상이한 HBsAg 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J을 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질주입된 투과된 Hep2 세포에의 결합을 보여준다
도 7은 실시예 4의 검사된 19 개의 HBsAg 돌연변이체의 항원성 루프의 아미노산 서열을 보여준다. 원은 HBC34 항체에 의해 약하게 (점선 원) 결합되거나 또는 결합되지 않은 HBsAg 돌연변이체의 잔기이다.
도 8은 실시예 4의, 도면에 표시된 것처럼, 인간 단일클론 항체 HBC34 및 두 개의 다른HBsAg-특이적 항체 (Ab5 및 Ab6)의, 모두 5 μg/ml 에서 검사된, 상이한 HBsAg 유전형을 발현하는 플라스미드로 형질주입된 투과된 Hep2 세포에의 결합을 보여준다("WT":HBsAg 유전형 D, Genbank 등록 번호 FJ899792).
도 9는 실시예5 의 HBC34에 의해 결합되는 네 개의 펩티드는 물론, 펩스칸 테크놀로지를 사용해 측정된 HBC34의 650 선형 및 루프형 펩티드 라이브러리에의 결합을 보여준다. 1로 표시된 잔기는 스캐폴드 입체형태적 에피토프를 재건하기 위한 화학적 연결을 허용하도록 도입된 시스테인이다. 만약 다른 시스테인이 신규 도입된 시스테인 옆에 존재한다면, 그들은 알라닌에 의해 교체된다 (알라닌 잔기는 밑줄).
도 10은 실시예 5의 HBV 바이러스 입자에서 환원 상태하에서 Ab4 및 HBC34에 의한 웨스턴 블롯 염색을 보여준다. Ab4는 대조되는 항체이고, 이는 또한 항원성 루프에 대한 반응성이다.
도 11은 실시예 6의 5 x 107 카피의 HBV 게놈 등가물 (유전형 D)이 접종된 인간화 uPA/SCID 마우스 에서의 HBV 바이러스혈증의 수준을 보여주고, 여기서 감염후 삼 주후부터 HBC34 (1 mg/kg 투여 i.p. 매주 두 번), 대조군 항체 (대조군 AB) 또는 엔테카비르 (ETV; 경구적으로 투여 1 μg/ml)를 6주 동안 수여받았다. HBV 감염의 확산기에 (p.i. (감염후) 3주 에서 6주), 바이러스혈증은 대조군 항체를 수여받은 그룹에서 >2 로그 증가하였고, 반면 HBV 역가는 HBC34 또는 엔테카비르로 처리받은 마우스에서는 감소되었다.
도 12는 실시예 6 의 HbsAg의 존재를 위한 간세포 염색 (간내 분석)을 마우스에서 실시예 6의 실험 끝에서 (9주) 보여준다. 대조군 항체를 수여받은 마우스에서는 거의 모든 간세포가 HBsAg 양성 염색되었고, 반면 확산은 엔테카비르로 처리 및 HBC34 처리 모두에 의해 효과적으로 차단되었다 (ca. 1-5% HBsAg-양성 세포).
도 13은 실시예 6의 cccDNA 측정을 보여주고, 이는 유의적으로 HBV 감염후 3주후 희생된 마우스 ("3주 hbv"; 즉 무처리)와 감염후 3주 부터 9주까지 HBC34 또는 엔테카비르로 처리된 마우스 사이에 유의적으로 차이나지 않았다. 대조적으로, cccDNA/세포의 산출된 양은 감염후 9주에 희생시 대조군 항체를 수여받은 그룹에서 2 로그까지 증가하였다.
도 14는 실시예 6 의 기준 (BL), 처리 3주 (감염후 6주) 및 처리 6주 (감염후 9주)의 순환 HbsAg 수준을 보인다. 순환 HbsAg 수준은 HBC34를 수여받은 마우스에서, 엔테카비르로 처리된 마우스는 제외하고, >1 로그 (및 검출 한계 아래) 감소하였고, 반면HBsAg 수준은 대조군 그룹에서 >2 로그 (5000-10000 IU/ml 수준에 도달) 증가하였다.
도 15는 실시예 7의 HBV 역가 (왼쪽 패널) 및 순환 HbsAg 수준(오른쪽 패널)을 만성 B형 간염 셋팅에서 기준 (BL), 처리 3주 (감염후 15주, "3주") 및 처리 6주 (감염후 18주, "6주")에서 보여준다. HBV 역가 및 순환 HbsAg 수준은 HBC34를 수여받은 마우스에서 처리 3주 및 6주에서 감소하였다. 개별적 곡선은 개별적 동물을 대표한다. 대조군 항체: 점선, HBC34: 실선.
도 16은 실시예 8의 일차 인간 간세포와 재증식되고 그리고 HDV-RNA 및 HBV-DNA를 함유하는 환자-유래 혈청과 공동-감염된 uPA/SCID 마우스에서HBV 역가 (왼쪽 패널) 및 HDV 역가 (오른쪽 패널)를 보여준다. 감염후 오 주후HBC34 또는 대조군 항체 ("대조군") 처리가 시작되었다. HBV 역가 (왼쪽 패널) 및 HDV 역가 (오른쪽 패널)는 기준 (3주, 5주BL), 처리 3주 (감염후 8주 - "8주") 및 처리 6주 (감염후 11주- "11주")에 보였다. 개별적 곡선은 개별적 동물을 대표한다. 대조군 항체: 점선, HBC34: 실선.
도 17 (파트 1)은 실시예 9의 HBV-s-항원의 항원성 루프의 도식을 보여주고, HBC34의 에피토프는 회색으로 하이라이트 되었다. HBC34의 에피토프를 맵하기 위해 1520 개 상이한 펩티드의 라이브러리가 펩스칸 테크놀로지를 사용해 결정되어 검사되었다. 도 17 (파트 2-5)는 실시예 9 의 HBC34의 16 상이한 셋트의 펩티드에 대한 결합의 규모 (ELISA 강도) 를 보여준다. HBC34는, 두 개의 비연속적 에피토프 부분 (파트 2)을 대표하는 조합성 CLIPS 컨스트럭트로 구성되는 셋트 13-16 의 펩티드에의 결합에 의해 구현되는 것처럼, 입체형태적 에피토프, 및 루프형 펩티드 (파트 3)로 구성되는 셋트 9-12 의 펩티드에 결합한다. 선형 펩티드 1-4 (파트 4) 및 5-8 (파트 5)의 셋트에서는 HBC34 결합이 관찰되지 않았고 이는 HBC34는 비연속적 입체형태적 에피토프에 결합하는 생각을 더욱 지지한다.
도 18 은 실시예 9의 HBC34의 812 개의 비연속적 또는 루프형 T3 CLIPS 펩티드로 구성되는 펩티드 라이브러리에 대한 결합을 보여준다. 도 17에 기술된 에피토프 맵핑을 정밀하게 다듬기 위해, 3 셋트의 펩티드 (RN1, RN2 및 RN3로 더브됨)가 종전 셋트 (도 17)에 기초하여 전체 치환 분석에 의해 발생되었다. 도 18은 결합 ofHBC34의 셋트 1-3에의 결합을 보여주고, 여기서 박스된 잔기는 시리즈 AEFGHKLPQRSVY_로부터 선택된 13개의 아미노산 중 한 개와 치환되었고, 여기서 "_"는 잔기 삭제를 나타낸다. 교환된 위치의 원래 잔기는 각 패널의 왼쪽에, (i) 수평적으로 박스된 서열 (원래 아미노산이 교환된 시리즈의 부분임) 또는 (ii) 서열 아래 (원래 아미노산이 교환된 시리즈의 부분이 아님)로 표시되었다.
도 19 는 실시예 10의 2 x 109 카피의 HBV 게놈 등가물(유전형 D)을 접종받은 인간화 uPA/SCID 마우스에서, HBC34 (1 mg/kg i.p 두 번째 주) 및 라미부딘 (음용수에 0.4 mg/ml 로 보충)의 병용요법의 HBV 바이러스혈증 (패널 A) 및 순환HBV-s-항원 (패널 B) 수준의 감소 효과를 보여주고, 여기서 마우스는 감염후 8주 후부터 4주 동안 대조군 항체 (대조군), HBC34 단독 (HBC34), 라미부딘 단독 또는 조합 처리 (HBC34 및 라미부딘)를 수여받았다. 병용 요법은 각 약물 단독에 비교하여 바이러스혈증의 더 높은 감소를 초래하였다.
도 20은 실시예 11 및 12의 항체 변종 1-32를 획득하기 위해 발생된 두 개의 셋트의 VH (패널 A) 및 VL (패널 B) 서열의 얼라인먼트를 보여준다. CDR (IMGT에 따라 정의된)은 회색으로 하이라이트되었다.
도 21은 실시예 11의 18 개의 조작된 HBC34 변종 (컬럼 2 및 3에 표시된 돌연변이된 VH 및 VL 서열을 조합함에 의해 획득됨)의 HBsAg (adw 아형)에의 결합을 ELISA에 의해 측정하여 보여준다. 컬럼 4에는, 결합의 상실은 "-"로 표시되었고, 강하게 감소된 결합은 "+/-"로 표시되었고, 감소된 결합은 "+/~"로 표시되었고, 원래 항체와 유사 또는 동일한 결합은 "+"로 표시되었다.
도 22 는 실시예 11의 HBC34의 상이한 조작된 변종의 HBsAg (adw)에의 결합을 직접 항원-기반 ELISA 어세이에 의해 결정하여 보여준다. 이들 8개의 변종은 , 도 21에 기술된 18개의 HBC34 돌연변이체로부터 선택되었고; HBsAg를 위한 친화성을 더 잘 특징화하기 위하여 8 개 항체가 적정되었고 부모 항체 서열과 비교되었다.
도 23 은 실시예 11의 도 22에 기술된 8개 항체의 특성의 요약을 보여준다. 도 22의 곡선을 Graphpad 프리즘을 사용해 맞춰서 EC50이 결정되었다. 생산성은 각각의 8개 변종은 물론 부모 항체 각각과 293 Expi 세포와의 형질주입의 상청액 300 ml 내에 분비된 IgG를 (ELISA) 정량함에 의해 결정되었다.
도 24는 실시예 11 및 12의 15 개 변종의 특징을 요약하는 표를 보여주고, 이 중 12개의 HBC34의 추가적 조작된 변종은, 종전의 셋트의 결과에 기초하여 골격에 추가적 돌연변이를 도입함에 의해 고안되었다 (패널 A). 결합 곡선은 항원-기반 ELISA 어세이에서 항체를 적정함에 의해 획득하였고 EC50은 프리즘으로 곡선을 맞춤에 의해 계산되었다. 생산성은 각각의 15개 변종은 물론 부모 항체 각각과 293 Expi 세포의 형질주입의 상청액 300 ml 내에 분비된 IgG를 (ELISA) 정량함에 기초하여 계산되었다. 배수-변화는 플롯하여 패널 B에 보였다.
도 25 는 실시예 11 및 12의 HBC34 및 변종 6,7,19.23 및 24의, 세포 형광 분광계 분석으로 결정된, 결합을 보여준다. 모든 항체는 5 μg/ml에서 시작하여 적정되었고 상이한 HBsAg 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I 및 J를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질주입된 투과된 Hep2 세포에 결합되었다.
다음과 같이, 다양한 구현예 및 본 발명의 측면을 설명하는 특정의 실시예가 제시된다. 하지만, 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 구현예에 의해의 범주에 의해 제한되지 않아야 한다. 후술 제조 및 실시예는 당해 분야의 기술자가 본 발명을 더 분명히 이해하고 실시할 수 있도록 주어진다. 본 발명은, 하지만, 예시된 구현예에 의해 범주가 제한되지 않고, 이는 단지 본 발명의 단일 측면의 설명을 의도하고, 기능적으로 등가인 방법도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 확실히, 본 명세서에 기술된 것에 더불어, 하기 숫자 및 실시예와 동반하여, 뒤따르는 설명으로부터 본 발명의 다양한 변형이 당해 분야의 기술자에게 분명해질 것이다. 이러한 변형 모두는 첨부된 청구항의 범주 내에 속한다.
실시예 1: 인간 단일클론 항체 HBC34의 확인 및 특징화
인간 단일클론 항체는 Traggiai E. et al., 2004, Nat Med 10(8): 871-5에 기술된 것과 유사한 방식으로 인간 환자로부터 분리되었다. 항체는 이의 가변 영역 (표 2 및 3) 및 그 안의 상보성 결정 영역 (CRD)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 결정함에 의해 특징 지어지고 그리고 "HBC34"로 명명되었다. 그에 따라, HBC34는 상기 표 2 및 3에서 보여진 CDR, VH 및 VL 서열을 갖는 IgG1-유형 완전 인간 단일클론 항체이다.
다음으로, 세 개의 HBsAg 혈청형 adw, ady, 및 ayw 중 어느 것에 인간 단일클론 항체 HBC34가 결합하는지 결정되었다. 흥미롭게도, ELISA에 의해 측정시, HBC34는 높은 친화성으로 세 개의 HBsAg 혈청형 (adw, ady 및 ayw)에 유사하고 낮은 EC50 값으로 결합한다(도 1).
HBV 항체의 보호 역가는 상이한 어세이에 대한 표준화를 허용하는 국제 단위(International Units, IU)로 표현된다. 1977년에, 항-HBs 면역글로불린 (W1042)을 위한 국제 표준 제제(International Reference Preparation)가 수립되었다. 본 표준의 제조에 사용된 펼장은 B형 간염 바이러스에 자연적으로 감염되었던 개체로부터 유래되었다 (Barker, L. F., D. Lorenz, S. C. Rastogi, J. S. Finlayson, and E. B. Seligmann. 1977. Study of a proposed international reference preparation for antihepatitis B immunoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization technical report series. WHO Expert Committee on Biological Standardisation 29th Report BS 77.1 164. Geneva, Switzerland, WorldHealth Organization, 1977; WorldHealth Organization: Anti-hepatitis B immunoglobulin. WHO Tech Rep Ser 1978; 626:18). HBC34의 활성은, 면역분석 (애보트 아키텍트 (Abbott Architect) 진단적 면역분석)으로 진단적으로 측정시, 5000 IU/mg이다. 비교하면 HBIG 의 활성은 ~ 1 IU/mg이다.
실시예 2: 항체 HBC34는 강력하게 감염성HBV 및 HDV를 중화한다
실시예 2의 첫 번째 목적은 HBC34가 중화 감염성 HBV를 중화하는지 여부를 결정하고 HBC34의 중화 활성을 다른 항-HB 항체의 그것과 비교하는 것이다. 이것을 위하여, 분화 HepaRG 세포는 고정된 양의 HBV와 함께 항체 (HBC34, 18/7, Ab2, Ab3 및 HBIG)의 존재 또는 부존재하에 4% PEG 8000 (시그마-알드리치) 보충된 배지에서 16 시간 동안 37°C에서 인큐베이트되었다. 인큐베이션의 끝에, 세포는 세척되었고 그리고 부가 배양되었다. 배지는 매 3일마다 변화되었다. 감염은 배양 상청액 내로 분비된 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 및 B형 간염 e 항원 (HBeAg)의 수준을 감염후 7 에서 11 일까지 효소 면역 측정법 (ELISA)으로 측정하고 및 면역형광분석으로 HBcAg 염색을 검출함에 의해 검출되었다.
도 2 및 3에 보인 것처럼, HBC34는 5 및 0.5 μg/ml에서 검사시 완전하게 HBV 감염을 중화하였지만, 반면에 비교되는 인간 단일클론 항-HB 항체 Ab2 및 Ab3은, 이들 또한 HbsAg에 결합하지만, 완전 중화의 결과를 초래하지 않았다. 이는 HbsAg에 결합하는 모든 항체가 HBV 감염을 중화할 수 있는 것은 아니라는 것을 표시한다 (일례로 Ab2 및 Ab3). 흥미롭게, HBIG는 오직 5000 및 500 μg/ml에서 검사시, 즉 HBC34에 비교하여 1000 배 더 낮은 효능으로 HBV 감염을 중화하였다. 18/7 은 HbsAg의 pre-S1 영역에 대조되는 쥐과 단일클론 항체이다.
실시예 2의 두 번째 목적은 분화 HepaRg 세포에서 HBC34의 중화 활성을 HDV에 대조하여 결정하는 것이었다. HDV 담체로부터의 혈청이 HDV 감염 접종물로 사용되었다. 델타 항원 면역형광 염색이 판독기로 사용되었다. 도 4에 보인 것처럼, HBC34는 0.12 μg/ml에서 검사시 HDV 감염을 완전하게 차단하였다. 비교하면, HBIG 도 또한 검사되었고 (1/1000, 즉 50 μg/ml에서 검사시) 이는 유효하였다.
실시예 3: 항체 HBC34는 모든 10개의 HBV 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J를 인식한다
HBC34가 10 개의 HBV 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J를 인식하는 그의 능력이 (도 5에 보인 것처럼) 유속 세포 분석법에 의해 검사되었다. 구체적으로, 인간 상피 세포 (Hep2 세포)가 각각의 HbsAg의 10개 HBV 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J (도 5에 보인 것처럼)를 발현하는 플라스미드로 형질주입되었다. 인간 단일클론 항체 HBC34 (5 μg/ml) 및 대조군 항체 (5 μg/ml)가 일시적으로 형질주입된 투과처리된 세포의 염색을 위해 사용되었다. 형질주입 이틀 후, Hep2 세포가 수집, 고정되었고 그리고 HBC34 또는 대조군 Ab와의 면역염색을 위한 사포닌과 함께 투과처리되었다. 항체의 형질주입된 세포에의 결합이 Becton Dickinson FACSCanto2 (BD Biosciences)와 FlowJo 소프트웨터 (TreeStar)를 사용하여 분석되었다. 도 6 에 보인 것처럼 HBC34는 모든 10개의 HBV HBsAg 유전형을 유사한 염색 패턴과 함께 인식하였다.
실시예 4: 항체 HBC34는 모든 기능적HBsAg 돌연변이체를 인식한다
HBC34가 19개의 상이한 HBsAg 유전형 D 돌연변이체 (HBsAg 유전형 D에 기초, Genbank 등록 번호 FJ899792, 도 7에 보인 것처럼) HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg T123N/C124R, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A (이들 돌연변이체의 항원성 루프 영역의 아미노산 서열을 위해서는 서열목록 번호 16 - 33 참조)에 결합하는 그의 능력이 유속 세포 분석법에 의해 검사되었다. 구체적으로, 인간 상피 세포 (Hep2 세포)가 상이한 HBsAg 돌연변이체를 발현하고 실시예 3에서 분석된 플라스미드로 형질주입되었다. 5 μg/ml의 인간 단일클론 항체 HBC34 및 두 개의 다른 HBsAg-특이적 항체 (Ab5 및 Ab6)가 HBC34가 형질주입된 Hep2 세포에 결합하는 것을 검사하기 위해 사용되었다.
도 8에 보인 것처럼, HBC34는 19개의 HBsAg 돌연변이체 중 18개에 결합하는 것으로 발견되었다. HBC34 결합은, Ab5 및 Ab6 결합을 제외하고, 오직 돌연변이체 HBsAg T123N/C124R 에서, 즉 잔기 123 및 124 가 모두 돌연변이된 경우에, 완전하게 파괴되었다. 흥미롭게, 이들 두 개의 잔기의 알라닌으로의 돌연변이 (즉 T123 및 C124)는 HBV 감염력의 상실과 연관되는 것으로 보였고, 이는 필시 항원성 루프 내 입체형태적 변화를 초래할 수 있는 C124에 의해 형성되는 다이설파이드 브릿지(disulphide bridge)의 상실 때문이다 (Salisse J. and Sureau C., 2009, Journal of Virology 83: 9321-9328). 따라서, 인간 단일클론 항체 HBC34는 18개의 HBsAg 돌연변이체에 결합한다.
실시예 5: 항체 HBC34는 항원성 루프 내 보존적 입체형태적 에피토프에 결합한다
HBC34에 의해 인식되는 에피토프가, HbsAg의 항원성 루프 영역의 전체를 다루도록 고안된, 라이브러리 650 선형 및 루프형 펩티드 ("CLIPS Discontinuous Epitope Mapping" 테크놀로지, 펩스칸(Pepscan), 렐리스타드(Lelystad), 네덜란드)를 사용하여 확인되었다. The 선형 및 CLIPS 펩티드는 표준 Fmoc-화학에 기초하여 합성된다. 루프형 펩티드는 입체형태적 에피토프를 재건하기 위하여, Chemically Linked Peptides on Scaffolds, CLIPS, Timmerman et al., 2007, Journal of Molecular Recognition 20: 283-99에 기술된 테크놀로지를 사용해 화학적 스캐폴드 위에서 합성된다. 예를 들면 단일 루프형 펩티드는 두 개의 시스테인을 함유하여 합성되고 루프의 크기는 시스테인 잔기를 다양한 간격으로 도입함에 의해 다양하다. 만약 다른 시스테인이 신규 도입된 시스테인 옆에 존재한다면, 그들은 알라닌에 의해 교체된다. 펩티드 내 다중 시스테인의 곁-사슬은 크레딧-카드 포맷(credit-card format) 폴리프로필렌 펩스칸 카드 (455 펩티드 포맷/카드)에서 0.5 mM 용액의 CLIPS 템플레이트, 예를 들어 암모늄 비스카보네이트 내 1,3-비스 (브로모메틸)벤젠과 반응함에 의해 CLIPS 템플레이트와 커플링된다. 항체의 각각 펩티드에의 결합이 펩스칸-기반 ELISA에서 검사된다. 공유적으로 연결된 펩티드를 함유하는 455-웰 크레딧 카드 포맷 폴리프로필렌 카드가 검사 항체 (1 μg/ml)와 블로킹 용액에서 배양된다. 세척 후 퍼록시다아제 기질 2,2'-아지노-다이-3-에틸벤즈티아졸 설포네이트(2,2'-azino-di-3-ehylbenzthiazoline sulfonate, ABTS) 및 2 μl의 3% H2O2 가 추가된다. 한 시간 이후, 발색 현상이 전하 결합 소자 (CCD)-카메라 및 이미지 프로세싱 시스템으로 측정된다. 원 데이터는 광학 값이고 0 내지 3000 의 범위이다 (1 에서 3의 표준 96-웰 플레이트 ELISA 리더와 유사한 로그 스케일).
도 9 에 보인 것처럼, HBC34는 서열목록 번호 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 이중 루프형 펩티드를 인식하는 것으로 발견되었다:
XGSSTTSTGPCRTCMTXPSDGNATAIPIPSSWX
여기서 X 로 코드된 잔기는 시스테인과 치환되었고 밑줄된 잔기는 C 에서 A로 치환되었다 (서열목록 번호 52).
세 개의 추가적 펩티드는 더 낮은 시그널과 인식되었다:
(a) 서열목록 번호 53에 따른 아미노산 서열을 갖는 선형 15-mer 펩티드:
TSTGPCRTCMTTAQG
(서열목록 번호 53),
(b) 서열목록 번호 54 에 따른 아미노산 서열을 갖는 또다른 선형 펩티드:
GMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTT
(서열목록 번호 54),
및 (c) 서열목록 번호 55 에 따른 아미노산 서열을 갖는 이중 루프형 펩티드:
XSMYPSASATKPSDGNXTGPCRTCMTTAQGTSX
여기서 X 로 코드된 잔기는 시스테인과 치환되었고 밑줄된 잔기는 C 에서 A로 치환되었다 (서열목록 번호 55).
이 분석은 HBC34의 중심 에피토프는 서열목록 번호: 56 에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 입체적 에피토프에 의해 형성된다는 것을 표시하였다:
PCRTCMTTAQG
(서열목록 번호 56;HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130 (HBV-D J02203).
게다가, 도 10 에 보인 것처럼 인간 단일클론 항체 HBC34는 웨스턴 블롯에서HBV 바이러스 입자에서 환원 상태하에서 전혀 반응하지 않는다.
이들 결과는, HBC34가 결합하는, HBsAg의 에피토프는 입체형태적 에피토프라는 것을 추인한다.
이들 결과는 실시예 4 에서 관찰된 HBC34 결합이 T123N/C124R 돌연변이의 존재하에서 상실되었다는 것과 일관된다.
입체형태적 에피토프를 포함하고, HBC34가 결합하는, HbsAg의 영역은 상이한 HBV 유전형 내에서 다형(polymorphic)이다. 다음과 같은 HbsAg의 에피토프 영역의 제네릭 서열 내에서 상이한 유전형으로 돌연변이된 잔기가 X로 표시되었다:
PCX1TCX2X3X4AQG,
여기서 X1은 바람직하게는 R 또는 K,
X2는 바람직하게는 M 또는 T,
X3은 바람직하게는 T 또는 I, 및
X4는 바람직하게는 T, P 또는 L임
(서열목록 번호: 57).
게다가, 인간 단일클론 항체 HBC34에 결합하는 18개의 HBsAg 돌연변이체에 대한 상기의 서열의 추가적 비교는, HBC34는 서열목록 번호: 2 에 따른 아미노산 서열에 의해 형성되는 에피토프에 결합한다는 것을 표시한다:
X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
여기서 X1은 P, T 또는 S,
X2는 C 또는 S,
X3은 R, K, D 또는 I,
X4는 M 또는 T,
X5는 T, A 또는 I,
X6은 T, P 또는 L, 및
X7은 Q, H 또는 L임.
실시예 6:HBV 감염후 3주 후 시작하는 HBC34의 투여는 인간화 uPA 마우스에서 바이러스 확산을 예방한다
실시예 6의 목적은 인간 단일클론 항체 HBC34가 HBV의 확산을 예방할 수 있는지를 조사하는 것이다. 다시 말해서, 진입 억제제 HBC34 항체의 인간 간세포의 감염을 억제하는 능력을 생체내에서 초기 감염 설립 후 마우스를 처리함에 의해 조사하는 것이 목적이다. 이것을 위하여, 일차 인간 간세포와 재증식된 미경험(na
Figure pct00001
ve) uPA/SCID 마우스가 사용되었다 (Petersen et al. Nature Biotechnology, 2008, 26:335-341 참조). 이들 마우스는 저온보존된 인간 간세포와 비장내 주사에 의해 접목되었다. 여덞 주후 숙주 간 내에 인간 간세포의 성공적인 재증식이, 이식된 인간 간세포에서 독점적으로 발현되는 인간 혈청 알부민을 측정하여 결정되었다. 적절한 인간 알부민 수준의 마우스는 바이러스 진입을 허용하기 위해 5 x 107 카피의 HBV 게놈 등가물 (유전형 D, HBeAg 양성)로 i.p. 접종되었다. 감염후 삼 주후, 처리 프로토콜이 시작되었고 그로써 마우스는 HBC34 처리 (매주 두번 1 mg/kg로 i.p. 투여), 대조군 항체 또는 엔테카비르 (ETV; 물 내 1 μg/ml로 경구적으로 투여, 바라클루드(Baraclude) 용액, Bristol-Myers Squibb)를 6주 동안 수여받았다. 희생에서 제거된 간 검체는 면역형광 분석을 위해 액체 질소 내에서 스냅-동결되었다.
HBV DNA는 QiAmp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen, 힐덴, 독일)를 사용해 혈청 샘플로부터 추출되었다. HBV-특이적 프라이머 및 하이브리다이제이션 프로브가 이전에 기술된 것처럼 HBV DNA 바이러스혈증 및 cccDNA 로드를 정량적으로 결정하기 위해 사용되었다 (Volz T et al., Gastroenterology 2007;133: 843-852). DNA 및 RNA는 Master Pure DNA 정제 키트 (Epicentre, Biozym, 독일) 및 RNeasy RNA 정제 키트 (Qiagen, Hilden, 독일)를 사용해 간 검체로부터 추출되었다. 간내 HBV DNA 값은 베타-글로빈 유전자 키트 (Roche DNA 대조군 키트; Roche Diagnostics)를 사용해 세포 DNA 함량으로 표준화되었다. rcDNA의 수준은 총HBV DNA으로부터 cccDNA 양을 빼서 산출되었다. 바이러스 RNA 및 게노믹 RNA는 올리고-dT 프라이머 및 Transcriptor 키트 (Roche Applied Science)를 사용해 역전사되었고 총 바이러스 RNA에 특이적인 프라이머를 사용해 정량화되었다. HBV RNA 수준은 인간 특이적 GAPDH RNA에 대해 표준화되었다. 혈액 샘플로부터의 HBsAg 정량화는 Abbott Architect 플랫폼 (정량 HBsAg 키트, Abbott, Ireland, Diagnostic Division)를 사용해, 제조자에 의해 권유된 대로 수행되었다. 키메라 마우스 간의 동결절편(Cryostat section)은, 인간 간세포를 염색하기 위해, 인간특이적 사이토케라틴-18 단일클론 (Dako, Glostrup, 덴마크)를 사용해 면역염색되었다. HBV 중심 항원 (HBcAg)의 검출을 위해, the 다클론 래빗 항-HBcAg 가 사용되었다. 특이적 시그널은 Alexa-표지된 이차 항체 (Invitrogen, Darmstadt, 독일) 또는 TSA-Fluorescein (HBcAg) 시스템 (Perkin Elmer, Ju¨gesheim, 독일)을 써서 시각화되었고, 반면 핵 염색은 Hoechst 33342 (Invitrogen)로 획득되었다. 염색된 절편은 형광 현미경에 의해 분석되었다.
HBV DNA의 중앙 기준값 (median baseline level)은 처리 시작시에 2 x 106 DNA 카피/ml 였다. HBV 감염의 확산기에 (p.i. (감염후) 3주 에서 6주), 바이러스혈증은 대조군 항체를 수여받은 그룹에서 >2 로그 증가하였고, 반면 HBV 역가는 HBC34 또는 엔테카비르로 처리받은 마우스에서는 감소되었다 (도 11).
마우스는 또한 실험의 끝에서 (즉 9주) 간세포 염색에 의해 HbcAg의 존재가 간 내적으로 분석되었다. 대조군 항체를 수여받은 마우스에서는 거의 모든 간세포가 HBcAg 양성 염색되었고, 반면 확산은 엔테카비르로 처리 및 HBC34 처리 모두에 의해 효과적으로 차단되었다 (ca. 1-5% HBcAg-양성 세포). 이들 결과는 HBC34는 HBV 감염의 증가기(ramp-up phase) 동안 바이러스 확산을 효과적으로 차단할 수 있다는 것은 표시한다 (도 12).
조직학적 및 혈청학적 데이터와 일맥상통하게, cccDNA 측정은 간내 cccDNA 로드가 HBV 감염후 3주후 희생된 마우스와 감염후 3주 부터 9주까지 처리된 마우스 사이에 유의적으로 차이나지 않았다는 것으로 보였다. 대조적으로, cccDNA/세포의 산출된 양은 감염후 9주에 희생시 대조군 그룹에서 2 로그까지 증가하였고, 이는 신규 형성된 rcDNA는 처리된 마우스에서 cccDNA로 효과적으로 전환될 수 없다는 것을 제안한다 (도 13). 동일한 경향이 또한 다른 간 내 바이러스 파라미터, 예를 들어 완화된 순환DNA (rcDNA) 및 HBV RNA 전사체의 수준을 측정함에 의해 발견되었다.
게다가, 혈액 순환 HbsAg의 수준은 기준 (BL), 처리 3주 (감염후 6주) 및 처리 6주 (감염후 9주)에 측정되었다. 순환 HbsAg의 수준은 HBC34를 수여받은 마우스에서, 엔테카비르로 처리된 마우스는 제외하고, >1 로그 (및 검출 한계 아래) 감소하였고, 반면 HBsAg 수준은 대조군 그룹에서 >2 로그 (5000-10000 IU/ml의 수준에 도달) 증가하였다는 것이 흥미롭다 (도 14). HbsAg의 측정은 스파이크-인 실험에서 결정시HBC34 항체의 존재에 의해 영향받지 않았고 여기서 HBC34 항체의 HBsAg 양성 마우스 혈청에의 추가는 Abbott Architect 진단적 면역분석을 사용해 예상된 측정을 변경하지 않았다.
이들 결과는 HBC34는 HBV 바이러스 확산을 막고 HbsAg의 제거를 촉진할 수 있다는 것을 표시한다.
실시예 7: 만성적으로 HBV 감염된 인간화 uPA 마우스 내 HBC34의 투여는 promotedHBV 및 HBsAg 제거를 촉진한다
B형 간염 만성 셋팅을 모방하기 위해, 미경험 인간화 uPA/SCID 마우스는 HBV로 감염되었고 감염후 12주 후, 2 x 109 카피/ml의 HBV DNA 중앙값 수준 및 10000 IU/ml의 HbsAg 수준에 도달하였다. 이들 수준은 만성 HBV 감염의 인간 환자에서 흔히 관찰되는 수준만큼 높다.
그후에, 마우스는 감염후 12주 후부터 HBC34 또는 대조군 항체로 6주 동안 처리되었다 (1 mg/kg i.p. 매주 두 번). 도 15에 보인 것처럼 HBV 역가 및 혈액 순환 HbsAg의 수준은 HBC34를 수여받은 마우스에서 3주 (감염후 15주) 에서 6 주 (감염후 18주) 동안 감소하였다. 따라서, HBC34는 6주 처리 후에 HBV 바이러스혈증 및 HBsAg 수준 모두의 명백한 감소를 촉진하였다. HBeAg 및 인간 알부민 수준은 HBC34-처리된 마우스에서 변경되지 않았고, 이는 간 독성의 부존재를 표시한다.
실시예 8:HBC34의 투여는 생체내 HDV 감염을 차단한다
미경험 인간화 uPA/SCID 마우스는 HDV-RNA 및 HBV-DNA를 함유하는 환자-유래 혈청과 공동-감염되었다. 감염 이후 다섯 주에 (HBV 역가는 107 내지 109 수준에 도달하였고 HDV RNA는 103 내지 106 카피/ml 수준에 도달한 때) 마우스는 HBC34 또는 대조군 항체로 6주 동안 처리되었다 (1 mg/kg i.p. 매주 두 번).
HBV DNA 바이러스혈증은 실시예 6 및 7에서 기술된 것처럼 측정되었다. HDV 바이러스혈증은 바이러스 RNA의 역전사 (QiAmp MinElute Virus Spin Kit를 사용해 혈청 샘플로부터 추출, Qiagen, 벤로, 네덜란드) 및 ABI Fast 1-Step Virus Master (Applied Biosystems, 카를스바드, 미국)를 사용한 정량적 RT-PCR, HDV 특이적 프라이머 및 ABI Viia7의 프로브 (Applied Biosystems, 카를스바드, 미국)를 통해 결정되었다.
도 16 에 보인 것처럼, HBC34는 처리후 3주 및 6주 (8주 및 11주, 각각) 모두에서 HDV 바이러스 확산을 효과적으로 차단하였다. 유사하게 HBV 만성적으로 감염된 마우스에서 관찰된 것은, HBC34가 2 로그의 HBV 바이러스 DNA 역가 감소를 촉진하였다 (도 13).
실시예 9:HBC34 비연속적 에피토프의 정밀한 에피토프 맵핑
실시예 5에 기술된 HBC34 항체에 의해 인식되는 에피토프를 더욱 다듬기 위해, 16 개의 상이한 셋트로 구성되는 1520개 펩티드의 새로운 라이브러리가 발생되었다:
- 셋트 1 (LIN15 더브됨): 타겟 서열로부터 유래된 선형 15-mer 펩티드 (서열목록 번호: 5: QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW; J02203 (D, ayw3)) 한 개의 잔기의 오프셋도 함께함. 자연적 Cys 잔기는 아세트아미도메틸(acetamidomethyl) 기 (또는 "Acm"로도 지칭됨; 각각의 아미노산 서열에서 "2" 로 표시됨)에 의해 보호된다.
- 셋트 2 (LIN22 더브됨): 타겟 서열로부터 유래된 선형 22-mer 펩티드 (서열목록 번호: 5: QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW; J02203 (D, ayw3)) 한 개의 잔기의 오프셋도 함께함. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 3 (LIN30 더브됨): 타겟 서열로부터 유래된 선형 30-mer 펩티드 (서열목록 번호: 5: QGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFGKFLWEWASARFSW; J02203 (D, ayw3)) 한 개의 잔기의 오프셋도 함께함. 자연적 Cys 잔기 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 4 (LIN15.AA 더브됨): 셋트 1의 펩티드, 다만 위치 9 및 10의 잔기가 Ala에 의해 교체됨. 자연적 Ala가 어느 한 위치에 발생하면, 이는 Gly에 의해 교체된다.
- 셋트 5 (LIN22.AA 더브됨): 셋트 2의 펩티드, 다만 위치 12 및 13의 잔기가 Ala에 의해 교체됨. 자연적 Ala가 어느 한 위치에 발생하면, 이는 Gly에 의해 교체된다.
- 셋트 6 (LIN30.AA 더브됨): 셋트 3의 펩티드, 다만 위치 16 및 17 의 잔기가 Ala에 의해 교체됨. 자연적 Ala가 어느 한 위치에 발생하면, 이는 Gly에 의해 교체된다.
- 셋트 7 (CYS.A 더브됨): 길이 27의 조합성 펩티드. 위치 1 - 11 및 17 - 27은 선형 서열이고, 페어링(paring) Cys 잔기를 함유한다. 이들 11-mer 서열은 "GGSGG" (서열목록 번호: 79) 링커를 통해 합쳐진다. 다이설파이드 브릿지 형성에 참여하지 않는, Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 8 (CYS.B로 더브됨): 선형 22-mer 서열, 다이설파이드 브릿지를 형성하는 두 개의 Cys을 함유함. 다이설파이드 브릿지 형성에 참여하지 않는, Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 9 (루프12 더브됨): 길이 12의 구속성 펩티드. 위치 2 - 11은 HBV-S-Ag의 항원성 루프의 타겟 서열로부터 유래된10-mer 서열이다. 위치 1 및 12는 Cys 잔기이고, 이는 mP2 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 10 (루프15로 더브됨): 길이 15 의 구속성 펩티드. 위치 2 - 14는 HBV-S-Ag의 항원성 루프의 타겟 서열로부터 유래된 13-mer 서열이다. 위치 1 및15는 Cys 잔기이고, 이는 mP2 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 11 (루프21 더브됨): 길이 21 의 구속성 펩티드. 위치 2 - 20은 HBV-S-Ag의 항원성 루프의 타겟 서열로부터 유래된 19-mer 서열이다. 위치 1 및 21는 Cys 잔기이고, 이는 mP2 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 12 (루프31 더브됨): 길이 31 의 구속성 펩티드. 위치 2 - 30은 HBV-S-Ag의 항원성 루프의 타겟 서열로부터 유래된 29-mer 서열이다. 위치 1 및 31은 Cys 잔기이고, 이는 mP2 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 13 (MAT.A 더브됨): 길이 25 의 조합성 펩티드. 위치 2- 12 및 14 - 24는 HBV-S-Ag의 항원성 루프의 타겟 서열로부터 유래된 11-mer 펩티드이다. 위치 1, 13 및 25 은 Cys 잔기이고, 이는 T3 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 14 (MAT.B 더브됨): 길이 28 의 조합성 펩티드. 위치 2- 12 및 14 - 27은 11-mer 및 14-mer 펩티드 각각이다. 위치 1, 13 및 28는 Cys 잔기이고, 이는 T3 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 15 (MAT.C 더브됨): 길이 28 의 조합성 펩티드. 위치 2- 15 및 17 - 27는 14-mer 및 11-mer 펩티드 각각이다. 위치 1, 16 및 28은 Cys 잔기이고, 이는 T3 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 16 (MAT.D 더브됨): 길이 31 의 조합성 펩티드. 위치 2- 15 및 17 - 30은 HBV-S-Ag의 항원성 루프의 타겟 서열으로부터 유래된 14-mer 펩티드이다. 위치 1, 16 및31은 Cys 잔기이고, 이는 T3 CLIPS에 의해 합쳐진다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
높은 가혹 상태하에서 검사되는 경우, 항체 HBC34는 어레이에 존재하는 어느 펩티드도 결합하지 않았다. 낮은 가혹 상태 (0.1% 펩스칸 완충액 내 5 μg/ml 및 말 혈청 및 난백알부민의 조합을 함유하는 전처리) 에서 검사되는 경우, 항체는 bound 구속성 및 조합성 펩티드를 결합하고 - 펩티드 셋트 14 내지 셋트 16에의 결합은 셋트 13 및 셋트 15에의 결합과 비교하여 다소 더 낮았다. 선형 에피토프 미믹에서는 결합이 기록되지 않았다. 데이터는 도 17에 보인다. 이들 데이타는 항체 HBC34가 펩티드 스트레치 18TGPCRTC24 (서열목록 번호: 80) 및 45GNCTCIP51 (서열목록 번호: 81)로 구성되는 입체형태적 비연속적 에피토프를 인식하는 것을 보여주고, 여기서 펩티드 스트레치 18TGPCRTC24 (서열목록 번호: 80) 은 에피토프의 다수 부분이다 (도 17).
상기 기술된 결과에 기초하여 전체 치환 분석 수단에 의해 항체 HBC34의 에피토프 맵을 다듬어서, 세 개의 상이한 셋트로 구성되는 812 개의 비연속적 또는 루프형 T3 CLIPS 펩티드가 합성되었다:
- 셋트 1 (RN1 더브됨; 비연속적 T3 CLIPS): 비연속적 미믹 C2IPIPSSWAFGCSTTSTGP2RT2C (서열목록 번호: 82)으로부터 유래된 에피토프 돌연변이체 시리즈. 이 서열의 각각 위치에 대해, 치환 분석이 수행되었다. 다시 말해서, 펩티드 서열의 각각 위치에 대해, 이러한 위치의 원래 아미노산이 알라닌 (A), 글루탐산 (E), 페닐알라닌 (F), 글라이신 (G), 히스티딘 (H), 라이신 (K), 류신 (L), 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (들), 발린 (V), 타이로신 (Y), 및 " "; 여기서 "_"는 잔기 삭제를 나타내는 것으로 이루어진 그룹에서 선택된 13개의 아미노산의 한 개에 의해 교체되어 변종이 만들어졌다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 2 (RN2 더브됨; 비연속적 T3 CLIPS): 비연속적 미믹 CGN2T2IPIPSSWAFCSTTSTGP2RT2C (서열목록 번호: 83)으로부터 유래된 에피토프 돌연변이체 시리즈. 이 서열의 각각 위치에 대해, 치환 분석이 셋트 1에서와 동일한 방식으로 수행되었다 (즉, GN2T 잔기는 돌연변이되지 않았다). 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
- 셋트 3 (RN3 더브됨; 루프 T3 CLIPS): 루프형 미믹 CGGGCSTTSTGP2RT2C (서열목록 번호: 84) 으로부터 유래된 에피토프 돌연변이체 시리즈. 이 서열의 위치 6 - 16 에 대해, 치환 분석이 셋트 1에서와 동일한 방식으로 수행되었다. 자연적 Cys 잔기는 Acm에 의해 보호된다 ("2"로 표시됨).
HBC34 항체는 펩스칸-기반 ELISA로 20 μg/ml에서 0.1% SQ (0.1%의 말 혈청 및 난백알부민의 조합을 함유하는 펩스칸 완충액)로 전처리된 펩티드 어레이에서 검사되었다. 펩티드 어레이는 HBC34 항체 용액과 (밤새 4°C에서) 배양되었다. 세척 이후, 펩티드 어레이는 적절한 항체 퍼록시다아제 접합체 (SBA)의 1/1000 희석과 함께 한 시간 동안 25°C에서 배양되었다. 세척 이후, 퍼록시다아제 기질은 2,2'-아지노-다이-3-에틸벤즈티아졸 설포네이트 (ABTS) 및 20 μl/ml 의 3 퍼센트H2O2 가 추가되었다. 한 시간 이후, 발색 현상이 측정되었다. 발색 현상은 전하 결합 소자 (CCD)-카메라 및 이미지 프로세싱 시스템으로 정량화되었다.
예상된 것처럼, 낮은 가혹 상태에서 검사되는 경우, 항체 HBC34는 모든 셋트로부터의 펩티드를 결합하였다. 실험의 결과는, 잔기 120PCR122 및 C124 가 결합을 위해 결정적이고, 반면 잔기 I150, I152, W156 및 F158의 오직 특정한 교체가 결합을 현저히 감소시켰다고 보인다 (도 18). 게다가, 모든 세개의 어레이에 기록된 데이터는 영역 114STTSTGPCRTC124 (서열목록 번호: 85) 내의 임의의 잔기의 E와의 교체는 결합을 감소시킬 것이고, 반면 R 또는 Y와의 정반대 교체는 결합을 증가시킨다는 것을 일관적으로 보여주었다. 하지만, 영역 145GNCTCIPIPSSWAFC159 (서열목록 번호: 86)에 대해서는 동일함이 관찰되지 않았다.
이들 결과를 종합하면 항체 HBC34는 비연속적 에피토프를 인식하고 잔기 120PCR122 및 C124 가 결합을 위해 중대하다는 것을 제안한다. 잔기 145GNCTCIPIPSSWAF158 (서열목록 번호: 87)의 존재는 에피토프 - 파라토프 상호작용을 설립하고 안정화하기 위한 구조적 맥락을 제공하는 것으로 보였다. 이 결론은 비연속적 에피토프 미믹 (145GNCTCIPIPSSWAF158 (서열목록 번호: 87) 및 114STTSTGPCRTC124 (서열목록 번호: 85)가 한 개의 미믹 내에 존재하는 경우)이, 서열 114STTSTGPCRTC124 (서열목록 번호: 85) 단독 (셋트 3, RN3) 보다 교체에 더 내성적이라는 관찰로부터 떠올랐다. 추가적으로, 비틀림각을 고정하고 그것에 의해서 입체적 강성을 제공하는 P151는 특별히 정반대 성질로 알려진 G에 의해 교체되는 경우 결합에 영향을 주는 것을 보였다. G145P 교체는 유사하게HBC34의 결합에 영향을 준다. R/Y 교체는 모티프 114STTSTGPCRTC124 (서열목록 번호: 85) 내 임의의 위치에의 결합을 개선하지만, 그러나 모티프 145GNCTCIPIPSSWAF158 (서열목록 번호: 87) 내에서는 그러하지 않고, 반면 E 교체는 결합을 감소시키는 것이 반복적으로 관찰되었다. 이 관찰은 잔기 114STTSTGPCRTC124 (서열목록 번호: 85)는 항체 HBC34 내 음으로 하전된 파라토프 (또는 음전하의 클러스터에 근접)에 결합하고 결합의 개선은 물론 정전기력으로부터 감소된 결과 및 에피토프 보다는 파라토프 특성을 특징 지우는 것을 제안한다.
실시예 10:HBC34 및 라미부딘의 조합으로 처리된 만성적으로 HBV 감염된 인간화 uPA 마우스에서 증가된 HbsAg 감소
부가 연구에서, 항체 HBC34를 포함하는 병용 요법의 효능이 조사되었다. HBC34와의 조합을 위해, 중합효소 억제제, 다시 말해 라미부딘이 선택되었다.
만성 B형 간염 셋팅을 미믹하기 위해, 미경험 인간화 uPA/SCID 마우스는 HBV 로 감염되었고 감염후 8주 후, 2 x 109 카피/ml의 HBV DNA 중앙값 수준 및 9000 IU/ml 의 HBsAg 수준에 도달하였다. 이들 수준은 만성 HBV 감염의 인간 환자에서 흔히 관찰되는 수준만큼 높다.
그후에, 마우스는 감염후 8주 후부터 항체 HBC34 단독, 중합효소 억제제 라미부딘 단독, HBC34 및 라미부딘의 조합, 또는 대조군 항체로 4주 동안 처리되었다 (HBC34는 1 mg/kg i.p. 매주 두 번; 라미부딘은 음용수에 0.4 mg/ml로 보충).
HBV 바이러스혈증 및 혈청 내 HBsAG 수준은, 처리 0주 (처리전), 처리 2주, 처리 4주, 및 처리 6주, 또는 처리 0주 (처리전), 처리 3주 및 처리 6주에 판정되었다. 결과는 도 19A (HBV 바이러스혈증) 및 B (HBsAG)에 보였다.
도 19에 보인 것처럼, HBC34, 라미부딘 또는 양자 약물의 조합의 처리는, 각각 바이러스혈증 (A)의 평균 0.7 로그, 1.3 로그 및 2.4 로그 감소를 초래하였다. 현저히, HBsAg (B)는 단독 HBC34을 수여받은 마우스에서 1.3 로그 (평균 BL=15,600IU/ml), 조합 그룹에서는 2.6 로그 (평균 BL=2,600IU/ml) 떨어트렸고, 반면에 라미부딘 단독 처리된 마우스에서는 비유의적인 HBsAg 감소 (0.2 로그; 평균 BL=9,000IU/ml)가 검출되었다.
요약 하면, HBC34 및 라미부딘의 조합은 분명하게 가장 강한 효과에 도달하였다. 흥미롭게도, 비록 라미부딘 단독은 유효하지 않았을지라도, HBC34 및 라미부딘의 조합에서 이러한 강한 효과가 관찰되었다. 그런 관점에서, 관찰된 HBC34 및 라미부딘의 조합의 강한 효과는 분명하게 비예측된 상승적 효과이다.
요약 하면, 병용 요법에서 도달된 놀랍도록 강한 HBsAg 감소는 HBC34 항체가, 일례로 만성 셋팅에서, HBV 단독-감염된 및 HBV/HDV 공동-감염된 환자 모두에서HBsAg 제거를 가속화하기 위해 중합효소 억제제와의 조합으로 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 11:HBC34 항체의 서열 엔지니어링: VH 및 VL의 CDR3
HBC34 돌연변이체의 첫 번째 시리즈가, (i) VH CDR3의 잔기 W107를 A 또는 F, (ii) VH CDR3의 잔기 M115를 I 또는 L, 및/또는 (iii) VL CDR3의 잔기 W107을 A 또는 F로 돌연변이함에 의해, VH 및 VL의 CDR3 내 돌연변이와 함께 발생하였다. 총 18개의 HBC34 변종이 비-돌연변이된 HBC34의 VH 또는 VL (후술에서는 WT, 야생형 또는 부모 항체로 지칭)를 VH 및 VL 돌연변이체의 상이한 조합과 결합에 의해, 도 20 및 도 21에 도시된 것처럼, 생산되었다.
생산된 HBC34 항체 변종은 ELISA에 의해 HBsAg adw 항원에의 결합이, 실시예 1에서와 유사하게 검사되었다. 결과는 도 21에 보였다.
흥미롭게, VH CDR3의 W107의 A로의 돌연변이는 (HBC34-V5, HBC34-V8, HBC34-V9, HBC34-V10, HBC34-V12 및 HBC34-V17 변종, 도 21) HBsAg에의 HBC34 결합을 완전하게 파괴하였다. 이는 항원 인식을 위한 HBC34 파라토프에서 핵심 잔기인 것을 표시한다. VH CDR3의 W107의 (W와 유사한 방향성 특징의 아미노산) F 로의 돌연변이는 HBC34 결합에 부분적으로 영향주었고 (HBC34-V1), 이는 W은 HbsAg에 대한 HBC34 결합 친화성을 저하함 없이 돌연변이될 수 없음을 표시한다.
VH CDR3의 M115의 L로의 돌연변이는 HBC34 결합에 영향주지 않았고 (HBC34-V13), 반면 I로의 돌연변이는 HBC34 결합을 부분적으로 감소시켰고 (HBC34-V11), 이는 M115는 HBC34 결합을 저하함 없이 L에 의해 치환될 수 있지만, I에 의해서는 안 된다는 것을 표시한다. 단일 돌연변이 W107A에서 획득한 결과와 일관되게, 이중 돌연변이 W107A 및 M115A (HBC34-V10)는 HBC34 결합을 완전하게 파괴하였다.
VL CDR3의 W107의 F로의 돌연변이는 HBC34 결합에 영향주지 않았고 (HBC34-V7), 반면 A 로의 돌연변이는 HBC34 결합을 부분적으로 감소시켰고 (HBC34-V15), 이는 VL CDR3의 W107은 HBC34 결합을 저하함 없이 F에 의해 치환될 수 있지만, A에 의해서는 안 된다는 것을 표시한다. 예상된 것처럼 VH의 CDR3 내 W107F 및 VL의CDR3 내 W107A 돌연변이의 조합은 결합을 완전하게 파괴하였다 (HBC34-v2). 돌연변이의 조합 VH CDR3 내 M115L 및 VL CDR3 내 W107F (HBC34-V6), 돌연변이 VH CDR3 내 M115I 와 VL CDR3 내 W107F (HBC34-v4) 및 돌연변이 VH CDR3 내 W107F 및 VL CDR3 내 W107F는 HBsAg에의 HBC34 결합에 부분적으로 영향주었고, 이는 이들 두 개의 돌연변이의 조합은, 개별적 돌연변이는 제외하고, 부모 HBC34 항체의 결합 친화성 보유와 양립될 수 없음을 표시한다.
다음 단계에서, (i) 초기 결과를 확정하고; (ii) ELISA에 의해 결합 친화성을 측정하고 (즉 결합의 EC50 결정); 및 (iii) 일시적으로 형질주입된 293-Expi 세포로부터의 이들 HBC34 변종의 생산성을 판정하기 위해, 상기 기술된 18개의 HBC34 변종 중 6개 (HBC34-V1, V3, V4, V6, V7, V11 및 V13)가 부가 특징화를 위해 선택되었다 (도 22 및 도 23).
첫 번째 실험에서 관찰된 것처럼, (이중 돌연변이 VH CDR3의 W107F 및 VL CDR3의 W107F를 운반하는) HBC34-V3 변종은 부모 HBC34 항체에 비교하여 9배 더 높은 EC50으로 HBsAg (adw 혈청형)에 결합된다. 더불어, HBC34-V3은 HBC34에 비교하여 거의 5배 더 낮은 농도에서 생산된다. 단일 돌연변이 M115I 및 M115L를 운반하는 HBC34-V11 및 HBC34-V13 변종은, 각각, HBC34와 일치하거나 또는 살짝 우월한 EC50으로 HbsAg에 결합된다. 하지만, 두 변종 모두는 HBC34 보다 덜 효과적으로 생산되었다 (HBC34에 비교시 0.6x 및 0.3x 더 낮은 생산성). 이들 결과는 HBC34-V11, 보다 더 HBC34-V13 변종은 포유류 세포 내에서 높은 친화성으로 HbsAg에 결합하지만 그러나 덜 효과적으로 생산된다는 것을 표시한다. 유사하게, 단일 돌연변이 VH CDR3 내 W107F 를 운반하는 HBC34-V1 변종은 HBC34와 동등하게 HbsAg에 결합하지만 (1.6-배 더 높은 EC50), 그러나 HBC34에 비교하여 4-배 덜 효과적으로 생산된다 (즉 0.25x). VL CDR3의 W107와 VH CDR3의 W107, M115I 또는 M115L (HBC34-V3, HBC34-V4 및 HBC34-V6)의 조합은 결합 친화성 (1.6-9.0 배 더 높은 EC50) 및 생산성 (배양 상청액 내에서 0.20-0.35x 더 낮은 항체 농도) 모두를 감소시켰다. 놀랍게도, 단일 돌연변이 VL CDR3의 W107F (HBC34-V7)는 HBC34와 유사하게 HBsAg에 결합하였고 HBC34보다 보다 더 효과적으로 생산되었고 (1.7x 까지), 533 μg/ml의 배양 상청액에서 현저하게 높은 농도를 도달하였다 (도 23).
실시예 12: HBC34 항체의 서열 엔지니어링: 골격 영역
열두 개의 추가적 HBC34 변종이 생산되었고 (HBC34-V19 에서 HBC34-V30; 도 24A) 여기서 수 개 돌연변이가 HBC34 비돌연변이된 흔한 선조 (HBC34-UCA) 에서 발견되는 잔기에 대응하는 VH 및 VL 모두의 골격 영역 (FR)에 도입되었고 (도 20) 그리고 VH CDR3 돌연변이 M115L 및 VL CDR3 돌연변이 W107F와 조합되었다.
결과는 도 24에 보였다. VL CDR3 내 W107 돌연변이, WT과 조합된, M115L의 존재하에, VL의 FR 내 9 개 돌연변이의 도입은 (HBC34-27, HBC34-V28, HBC34-V29 및 HBC34-V30) HBsAg에의 HBC34 결합을 유의적으로 감소시켰고, 따라서 VL 내 돌연변이된 잔기를 위한 중요한 역할을 표시한다 (도 24A-B). HBC34 변종, 여기서 상기 기술된 동일한 VL 변종은 (즉 W107F/FR1234-GL) M115L 돌연변이 및 FR 내 추가적 9개 돌연변이를 운반하는 VH와 조합되었고, HbsAg에 결합하지 않았고, 이는 VH 및 VL 모두 내의 돌연변이가 HBsAg에의 결합에 본질적으로 기여하는 것을 표시한다.
중요하게, HBC34-V23 및 HBC34-V24 내에서 VL의 FR 내 도입된 9개 돌연변이 중 오직 한 개의 제거 (즉 K66Y)는 Y66K 돌연변이를 운반하는 대응 변종 (HBC34-V27 및 HBC34-V28)에 비교하여 HBsAg에의 결합을 유의적으로 증가시켰다 (100x 배 더 낮은 EC50). 유사하게, HBC34-V25 및 HBC34-V26 내에서 K66Y 돌연변이의 제거는 Y66K 돌연변이 (HBC34-V27 및 HBC34-V28)를 운반하는 대응 비-결합 변종에 비교하여 HBsAg 결합을 회복시켰다.
이처럼, HBC34-V23 변종은 높은 친화성 결합을 보유하였고 (HBC34에 비교하여 1.5x 더 높은 EC50) 그리고 부모 HBC34 항체와 유사하게 생산되었다. 흥미롭게, HBC34-V24 변종은 HBC34-V23 변종과 오직 한 개의 아미노산이 상이하고 (즉 VH 내 M115L), HBC34-V23의 것과 유사한 EC50으로 결합되지만 그러나 효과적으로 생산되지는 않았다 (HBC34에 비교하여 오직 0.14x 생산성). 이들 결과는, 비록 HBC34 변종의 HBsAg에의 결합에 유의적으로 영향을 주지는 않지만, 위치 115 에서의 L의 존재는 그 돌연변이를 운반하는 HBC34 변종의 생산성에 부정적 영향을 가진다는 것을 표시한다. 확실히, 평균적으로 M115L 돌연변이 (HBC34-V6, HBC34-V13, HBC34-V19, HBC34-V20, HBC34-V21, HBC34-V22, HBC34-V24, HBC34-V25, HBC34-V26, HBC34-V28, HBC34-V29 및 HBC34-V30)를 운반하는 모든 HBC34 변종은 부모 HBC34 항체에 비교하여 0.3x의 평균 생산성을 가진다.
현저하게, VH CDR3 내 M115L 돌연변이의 존재하에 VH의 FR 내 5 또는 9개 돌연변이의 도입 (HBC34-V19 및 HBC34-V20 변종, 각각)은 HBsAg에의 결합을 눈에 띄게 감소시키지 않았고, 이는 돌연변이된 잔기는 HBC34 항체에 의한 높은 친화성 항원 인식에서 중요한 역할을 가지지 않는다는 것을 제안한다. HBC34V19의 중추에W107F 돌연변이의 도입 및 HBC34-V21 및 HBC34-V22 내 HBC34-V20 변종은 HBsAg에의 결합을 20-30x로 감소시켰다. 흥미롭게도, 동일한 돌연변이 (즉 VL CDR3 내W107)는 VH의 FR 내 동일한 5 또는 9 개 돌연변이를 운반하지 않는 다른 변종의 결합에 영향을 주지 않았고, 결과는 VH FR 내 잔기는 VH의 잔기 107과 함께 HbsAg에의 결합에서 협력적인 역할을 (일례로 가변 영역 스캐폴드의 특정한 입체형태를 안정화함에 의해) 가진다는 것을 표시할 수 있다.
마지막으로 및 도 23에 보인 실시예 11의 결과와 일관되게, 단일 돌연변이 VL CDR3 내 W107를 운반하는 HMB34-V7 항체는 HBC34에 비교하여 비교할말한 HBsAg에의 결합을 보였고 (즉 1.4x) 그리고 HBC34 보다 더 효과적으로 생산되었다 (1.2x) (수행된 두 개의 실험에서 평균적으로 HBC34-V7은 HBC34 항체 보다 1.5x, 즉 50%, 더 효과적으로 생산되었다. 이 결과는 VL CDR3 내 W107F 돌연변이는, 비록 HBsAg에의 결합 친화성에 눈에 띄게 영향을 주지 않지만, HBC34 항체 생산성에 긍정적 영향을 가진다는 것을 제안한다.
마지막으로, HBC34 및 변종 HBC34-V6, HBC34-V7, HBC34-V19, HBC34-V23 및 HBC34-V24 가 10 개의 HBV 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J를 인식하는 그들의 능력이 (도 25에 보인 것처럼) 유속 세포 분석법에 의해 검사되었다. 구체적으로, 인간 상피 세포 (Hep2 세포)가 각각의 HbsAg의 10개 HBV 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J 를 발현하는 플라스미드로 형질주입되었다. 모든 항체가 다중 농도에서 (5000 ng/ml 부터 7 ng/ml까지 8개의 연속 희석) 일시적으로 형질주입된 투과처리된 세포의 염색을 위해 사용되었다. 형질주입 이틀 후, Hep2 세포가 수집, 고정되었고 그리고 HBC34 및 모든 다섯 개의 선택된 변종과의 면역염색을 위한 사포닌과 함께 투과 처리되었다. 항체의 형질주입된 세포에의 결합이 Becton Dickinson FACSCanto2 (BD Biosciences)와 FlowJo 소프트웨터 (TreeStar)를 사용하여 분석되었다. 도 25에 보인 것처럼 HBC34 및 모든 다섯 개의 선택된 변종은 모든 10개의 HBV HBsAg 유전형을 유사한 수준에서 인식하였다.
서열 표 및 서열 ID 번호 (서열 목록):
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
<110> Humabs BioMed SA <120> ANTIBODIES THAT POTENTLY NEUTRALIZE HEPATITIS B VIRUS AND USES THEREOF <130> HB01P024WO1 <150> PCT/EP2015/001970 <151> 2015-10-07 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is Pro, Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Arg, Lys, Asp or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is Met or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Thr, Ala or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is Thr, Pro or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is Gln, His or Leu <400> 2 Xaa Xaa Xaa Thr Cys Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S domain of HBsAg (GenBank acc. no. 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region HBsAg M133H <400> 25 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser 20 25 30 His Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr 35 40 45 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu 50 55 60 Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp 65 70 <210> 26 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigenic loop region HBsAg M133L <400> 26 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser 20 25 30 Leu Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr 35 40 45 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu 50 55 60 Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp 65 70 <210> 27 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigenic loop region HBsAg M133T <400> 27 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser 20 25 30 Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr 35 40 45 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu 50 55 60 Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp 65 70 <210> 28 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigenic loop region HBsAg K141E <400> 28 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser 20 25 30 Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Glu Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr 35 40 45 Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu 50 55 60 Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp 65 70 <210> 29 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigenic loop region HBsAg P142S <400> 29 Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser 20 25 30 Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Ser Ser Asp Gly Asn Cys Thr 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tgagctgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccact ataaaccaag atggaagtga gaaattatat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactattt 240 ctgcaaatga acaacctgag agtcgaggac acggccgttt attactgcgc ggcttggagc 300 ggcaatagtg ggggtatgga cgtctggggc caggggacca cggtctccgt ctcctca 357 <210> 51 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody HBC34 VL nuc <400> 51 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc caggacagac agtcagcatc 60 ccctgctctg gagataaatt ggggaataaa aatgtttgct ggtttcagca taagccaggc 120 cagtcccctg tgttggtcat ctatgaggtt aaataccgcc cctcggggat tcctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg cctatttctg tcagacgtgg gacagcacca ctgtggtgtt cggcggaggg 300 accaggctga ccgtccta 318 <210> 52 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is substituted with Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) <223> Xaa is substituted with Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa is substituted with Cys <400> 52 Xaa Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr 1 5 10 15 Xaa Pro Ser Asp Gly Asn Ala Thr Ala Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp 20 25 30 Xaa <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 53 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly 1 5 10 15 <210> 54 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 54 Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser 1 5 10 15 Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr 20 25 <210> 55 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is substituted with Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) <223> Xaa is substituted with Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa is substituted with Cys <400> 55 Xaa Ser Met Tyr Pro Ser Ala Ser Ala Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn 1 5 10 15 Xaa Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr 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tcttacgagc tgacacagcc acctagcgtg tccgtctctc caggacagac cgtgtccatc 60 ccttgctctg gcgacaagct ggggaacaaa aatgtctgtt ggttccagca caagccaggg 120 cagagtcccg tgctggtcat ctacgaggtg aaatatcggc cttcaggaat tccagaacgg 180 ttcagcggat caaacagcgg caatactgca accctgacaa ttagcgggac ccaggccatg 240 gacgaagccg cttatttctg ccagacattc gattccacca cagtggtctt tggcggggga 300 actaggctga ccgtgctg 318 <210> 65 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL v23 aa <400> 65 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Asn Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Val Lys Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Phe Asp Ser Thr Thr Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34wt CDRH2 aa <400> 66 Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 67 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 v31, HBC34 v32 and HBC34 v33 VH <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Phe Arg Ser Phe 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Lys Leu Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Trp Ser Gly Asn Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 v31, HBC34 v32 and HBC34 v33 VH (nuc) <400> 68 gaggtgcagc tggtggaatc cggcggggga ctggtgcagc ctggcggctc actgagactg 60 agctgtgcag cttctggaag aatcttcaga tctttttaca tgagttgggt gagacaggct 120 cctgggaagg gactggagtg ggtcgcaaac atcaatcagg acggatcaga aaagctgtat 180 gtggatagcg tcaaaggcag gttcactatt tcccgcgaca acgccaaaaa ttctctgttt 240 ctgcagatga acaatctgcg ggtggaggat accgctgtct actattgtgc agcctggtct 300 ggcaacagtg gaggcatgga cgtgtgggga cagggaacca cagtgacagt cagctcc 357 <210> 69 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL v23 nuc <400> 69 tcttacgagc tgacacagcc ccctagcgtg tccgtctctc caggccagac agcatccatc 60 acttgctctg gcgacaagct ggggaacaaa aatgcctgtt ggtatcagca gaagccaggg 120 cagagtcccg tgctggtcat ctacgaggtg aaatatcggc cttcaggaat tccagaaaga 180 ttcagtggat caaacagcgg caatactgct accctgacaa ttagcgggac ccaggccatg 240 gacgaagctg attactattg ccagacattc gattccacca cagtggtctt tggcggggga 300 actaagctga ccgtgctg 318 <210> 70 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt VH codon optimized <400> 70 gaactgcagc tggtcgaatc aggaggaggg tgggtccagc ccggagggag ccagagactg 60 tcttgtgccg catcagggag gatcttcagg agcttctaca tgtcctgggt gcgccaggca 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtcgccacc atcaaccagg acggatctga aaagctgtat 180 gtggatagtg tcaaaggccg gttcacaatt agcagagaca acgctaaaaa ttctctgttt 240 ctgcagatga acaatctgcg agtggaggat accgccgtct actattgcgc cgcttggtct 300 ggcaacagcg gcgggatgga tgtctggggg cagggcacaa cagtgagcgt ctcttcc 357 <210> 71 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt VL codon optimized <400> 71 tcatacgaac tgactcagcc tccctccgtc tccgtctcac ctggacagac cgtctcaatc 60 ccctgctccg gcgataaact gggcaacaag aacgtgtgct ggttccagca caaacccgga 120 cagagtcctg tgctggtcat ctacgaggtc aagtatcggc caagcggcat tcccgaaaga 180 ttcagcggct ccaactctgg gaataccgca acactgacta tctctggaac ccaggcaatg 240 gacgaggcag cttacttttg ccagacttgg gattcaacta ctgtcgtgtt cggcggcgga 300 actagactga ctgtcctg 318 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt CDRH1 codon optimized <400> 72 gggaggatct tcaggagctt ctac 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt CDRH2 codon optimized <400> 73 atcaaccagg acggatctga aaag 24 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt CDRH3 codon optimized <400> 74 gccgcttggt ctggcaacag cggcgggatg gatgtc 36 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt CDRL1 codon optimized <400> 75 aaactgggca acaagaac 18 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt CDRL2 long codon optimized <400> 77 gtcatctacg aggtcaagta tcggcca 27 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBC34 wt CDRL3 codon optimized <400> 78 cagacttggg attcaactac tgtcgtg 27 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 79 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 80 Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 81 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro 1 5 <210> 82 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> discontinuous epitope mimic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <400> 82 Cys Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Cys Ser Thr Thr 1 5 10 15 Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Cys 20 25 <210> 83 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> discontinuous epitope mimic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <400> 83 Cys Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Cys 20 25 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> looped epitope mimic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> cysteine coupled to acetamidomethyl <400> 84 Cys Gly Gly Gly Cys Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 10 15 Cys <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 85 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 86 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Cys 1 5 10 15 <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <400> 87 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe 1 5 10 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 88 Pro Cys Arg Xaa Cys 1 5

Claims (87)

  1. HBsAg의 항원성 루프 영역에 결합하고 B형 간염 바이러스 및 델타 간염 바이러스와의 감염을 중화하는, 분리된 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 HBsAg 및 HBV의 제거를 촉진하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 Fc 모이어티를 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 HBsAg 유전형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, 및 J 중 최소한 6 개, 바람직하게는 최소한 8 개, 더 바람직하게는 모든 10 개에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항원성 루프 영역에 돌연변이를 갖는 HBsAg 돌연변이체: HBsAg Y100C/P120T, HBsAg P120T, HBsAg P120T/S143L, HBsAg C121S, HBsAg R122D, HBsAg R122I, HBsAg T123N, HBsAg Q129H, HBsAg Q129L, HBsAg M133H, HBsAg M133L, HBsAg M133T, HBsAg K141E, HBsAg P142S, HBsAg S143K, HBsAg D144A, HBsAg G145R 및 HBsAg N146A 중 최소한 12개, 바람직하게는 최소한 15개, 더 바람직하게는 모든 18개에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 최소한 한 개의, 바람직하게는 최소한 두 개의, 더 바람직하게는 최소한 세 개의, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하고, 여기서 최소한 한 개의, 바람직하게는 최소한 두 개의, 더 바람직하게는 최소한 세 개의, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 115 - 133으로부터, 바람직하게는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133으로부터, 더 바람직하게는 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 130 으로부터 선택되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133으로부터, 바람직하게는 아미노산 120 - 130으로부터 선택되고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 인접한 위치에 자리하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 에피토프는 입체형태적 에피토프인 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제6항 내지 제8항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 HBsAg의 항원성 루프 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 HBsAg의 S 도메인의 아미노산 120 - 133으로부터, 바람직하게는 아미노산 120 - 130으로부터 선택되고, 여기서 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 더 바람직하게는 최소한 네 개의 아미노산은 인접한 위치에 자리하지 않는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 최소한 한 개의, 바람직하게는 최소한 두 개의, 더 바람직하게는 최소한 세 개의, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개의, 가장 바람직하게는 최소한 다섯 개의 아미노산은, 에피토프에 의해 포함되고 인접한 위치에 자리하지 않는, 최소한 두 개의, 바람직하게는 최소한 세 개의, 아미노산 사이에 자리하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. 제6항 내지 제10항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 HBsAg의 S 도메인의 최소한 아미노산 P120, C121, R122 및 C124 를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제6항 내지 제11항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 88에 따른 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편:
    PCRXC
    여기서 X는 임의의 아미노산 또는 비아미노산이고; 바람직하게는 X는 임의의 아미노산이고; 더 바람직하게는 X는 T, Y, R, S, 또는 F이고; 보다 더 바람직하게는 X는 T, Y 또는 R이고; 가장 바람직하게는 X는 T 또는 R이다.
  13. 제6항 내지 제12항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 80에 따른 아미노산 서열:
    TGPCRTC
    또는 상기 서열목록 번호: 80과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 90%, 더 바람직하게는 최소한 95% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제6항 내지 제13항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 85에 따른 아미노산 서열:
    STTSTGPCRTC
    또는 상기 서열목록 번호: 85와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 90%, 더 바람직하게는 최소한 95% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제6항 내지 제14항 중 임의의 항에 있어서, 상기 에피토프는 HBsAg의 S 도메인의 최소한 아미노산 145 - 151를 포함하는 아미노산 서열 (서열목록 번호: 81)을 부가로 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제6항 내지 제15항 중 임의의 항에 있어서, 상기 에피토프는 서열목록 번호: 80에 따른 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 81에 따른 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. 제6항 내지 제16항 중 임의의 항에 있어서, 상기 에피토프는 서열목록 번호: 85에 따른 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 87에 따른 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  18. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 1에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원성 루프 내 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편:
    X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
    여기서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 임의의 아미노산일 수 있다.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음 서열목록 번호: 2에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 HBsAg의 항원성 루프 내 에피토프에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편:
    X1 X2 X3 TC X4 X5 X6A X7G
    여기서 X1은 P, T 또는 S,
    X2는 C 또는 S,
    X3은 R, K, D 또는 I,
    X4는 M 또는 T,
    X5는 T, A 또는 I,
    X6은 T, P 또는 L, 및
    X7은 Q, H 또는 L임.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호 5 - 33 또는 그의 서열 변종으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HBsAg의 S 도메인의 항원성 루프 영역에 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  21. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 단일클론 항체 또는 그의 단일클론 항원 결합 단편 및/또는 인간 항체 또는 그의 인간 항원 결합 단편인 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  22. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG 유형, 바람직하게는 IgG1 유형인 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  23. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  24. 제23항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  26. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 최소한 한 개의 CDRH1, 최소한 한 개의 CDRH2 및 최소한 한 개의 CDRH3를 포함하는 중쇄 및 최소한 한 개의 CDRL1, 최소한 한 개의 CDRL2 및 최소한 한 개의 CDRL3를 포함하는 경쇄를 포함하고, 여기서 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3는 서열목록 번호: 40 또는 서열목록 번호: 58, 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  27. 제26항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 서열목록 번호: 58과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 서열목록 번호: 58에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  29. 제23항 또는 제28항 중 임의의 항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  30. 제29항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 중쇄 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 66과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 중쇄 CDRH1은 서열목록 번호: 34에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 중쇄 CDRH2는 서열목록 번호: 35 또는 66에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 중쇄 CDRH3은 서열목록 번호: 36에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  32. 제23항 내지 제31항 중 임의의 항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 CDRL1은 서열목록 번호: 37 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 최소한 한 개의 CDRL3 아미노는 서열목록 번호: 40 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  33. 제23항 내지 제31항 중 임의의 항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 경쇄 CDRL1은 서열목록 번호: 37 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 최소한 한 개의 경쇄 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3 아미노는 서열목록 번호: 58 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 경쇄 CDRL1은 서열목록 번호: 37과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 경쇄 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 58과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  35. 제32항 내지 제34항 중 임의의 항에 있어서, 상기 최소한 한 개의 경쇄 CDRL1은 서열목록 번호: 37에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 최소한 한 개의 경쇄 CDRL2는 서열목록 번호: 38 또는 39에 따른 아미노산 서열을 포함하고; 및/또는 최소한 한 개의 경쇄 CDRL3은 서열목록 번호: 40 또는 58에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  36. 청구항 제1항 내지 제32항, 제34항 및 제35항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34 - 38 및 40 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34 - 37 및 39 - 40 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  37. 청구항 제1항 내지 제32항, 제34항 및 제35항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39 - 40 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  38. 청구항 제1항 내지 제31항 및 제33항 내지 제35항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34 - 38 및 58 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  39. 청구항 제1항 내지 제31항 및 제33항 내지 제35항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, 각각, 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 또는 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  40. 제36항 내지 제39항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은, (i) 각 서열목록 번호: 34 - 38 및 40, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (ii) 각 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 40, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (iii) 각 서열목록 번호: 34 - 38 및 58, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (iv) 각 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (v) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (vi) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 40 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (vii) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는; 또는 (viii) 각 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66, 각각과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  41. 제36항 내지 제40항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열목록 번호: 34 - 38 및 40, 각각에 따른; 또는 (ii) 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 40, 각각에 따른; 또는 (iii) 서열목록 번호: 34 - 38 및 58, 각각에 따른; 또는 (iv) 서열목록 번호: 34 - 37, 39 및 58, 각각에 따른; 또는 (v) 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 40 및 66, 각각에 따른; 또는 (vi) 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 40 및 66, 각각에 따른; 또는 (vii) 서열목록 번호: 34, 36 - 38, 58 및 66, 각각에 따른; 또는 (viii) 서열목록 번호: 34, 36 - 37, 39, 58 및 66, 각각에 따른, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  42. 제1항 내지 제32항, 제34항 내지 제37항 및 제40항 및 제41항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  43. 제1항 내지 제32항, 제34항 내지 제37항 및 제40항 및 제41항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열목록 번호: 41 또는 67과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열; 및 (ii) 서열목록 번호: 42와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  45. 제42항 내지 제44항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 42에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  46. 제1항 내지 제31항, 제33항 내지 제35항 및 제38항 내지 제41항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 59 또는 65 또는 그의 기능적 서열 변종에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  47. 제46항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열목록 번호: 41 또는 67과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열; 및 (ii) 서열목록 번호: 59 또는 65와 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 번호: 41 또는 67에 따른 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열 및 서열목록 번호: 59 또는 65에 따른 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열을 포함하는 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  49. 제1항 내지 제32항, 제34항 내지 제36항 및 제40항 내지 제45항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34이고, 바람직하게는 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34인 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  50. 제1항 내지 제31항, 제33항 내지 제35항, 제38항 내지 제41항 및 제46항 내지 제48항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34v7 또는 gHBC34v23이고, 바람직하게는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34v7 또는 HBC34v23인 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  51. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 gHBC34v31, gHBC34v32 또는 gHBC34v33이고, 바람직하게는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 HBC34v31, HBC34v32 또는 HBC34v33인 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  52. 전술한 청구항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편은 정제된 항체, 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv인 것으로 특징되는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  53. 약제로의 용도를 위한 전술한 청구항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  54. B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화의 용도를 위한 전술한 청구항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편.
  55. 전술한 청구항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자.
  56. 제51항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열목록 번호: 43 - 51 또는 그의 기능적 서열 변종 중 임의의 한 개에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 핵산 분자.
  57. 제55항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 서열목록 번호: 43 - 51, 60 - 64 및 68 - 78과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 분자.
  58. 제55항 또는 제57항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열목록 번호: 43 - 51, 60 - 64 및 68 - 78 중 임의의 한 개에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 분자.
  59. 제55항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 임의의 서열목록 번호: 70 - 78과 최소한 80%, 바람직하게는 최소한 85%, 더 바람직하게는 최소한 90%, 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 및 특히 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 일치성을 공유하는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산 분자.
  60. 제55항 및 제57항 내지 제59항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열목록 번호: 70 - 78 중 임의의 한 개에 따른 핵산 서열을 포함하거나 이루어지는 핵산 분자.
  61. 제55항 내지 제66항 중 임의의 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  62. 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하거나; 또는 제61항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  63. 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터 및/또는 제62항에 따른 세포를 포함하는 약학 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  65. (i) B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화; 또는 (ii) B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단에서의 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  66. 만성 B형 간염의 치료 또는 약화에서 제65항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  67. 간 이식 이후 B형 간염 (재-)감염, 구체적으로 B형 간염 유도 간 부전 예방에서 제65항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  68. 비-면역된 대상에서의 B형 간염의 예방/방지에서 제65항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  69. 혈액 투석 환자에서의 B형 간염의 방지에서 제65항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  70. 신생아에서의 B형 감염의 예방에서 제65항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  71. D형 간염, 바람직하게는 B형 간염 및 D형 간염의 치료 또는 약화에서 제65항에 따른 용도를 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  72. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물은 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제와 조합하여 투여되는, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물은 중합효소 억제제와 조합하여 투여되는, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 중합효소 억제제는 라미부딘인, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  75. 제72항 내지 제74항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물은 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제와 동일한 또는 상이한 투여의 경로를 통해 투여되는, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물.
  76. (i) 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물; 및
    (ii) 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제의 조합물.
  77. B형 간염 및/또는 D형 간염의 방지, 치료 또는 약화 용도를 위한, 구체적으로 만성 B형 간염 및/또는 만성 D형 간염의 치료 또는 약화 용도를 위한 제76항의 조합물.
  78. 제77항에 있어서, 상기 조합물은 HBV 단독-감염된 환자 또는 HBV/HDV 공동-감염된 환자에서 사용되는 조합물.
  79. 제76항 또는 제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 조합물은 HBsAg 제거를 가속화하는 조합물.
  80. (i) 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물; 및
    (ii) 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제를 포함하는 키트.
  81. 백신의 항원이 올바른 입체형태의 특이적 에피토프를 함유하는지 확인함에 의한, 항-간염-B 또는 항-간염-D 백신의 질을 모니터링하기 위한, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물의 용도.
  82. 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물의 B형 간염 및/또는 D형 간염의 진단 용도.
  83. 분리된 혈액 샘플이 B형 간염 바이러스 및/또는 델타 간염 바이러스에 감염되었는지 결정하는, 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물의 용도.
  84. 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 및/또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상 내 B형 간염 및/또는 D형 간염 예방 및/또는 치료하는 방법.
  85. 치료적 유효량의 제1항 내지 제54항 중 임의의 항에 따른 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 제55항 내지 제60항에 따른 핵산, 제61항에 따른 벡터, 제62항에 따른 세포 및/또는 제63항 또는 제64항에 따른 약학 조성물을 간 이식을 받았던 대상에서 투여하는 단계를 포함하는 간 이식을 받았던 대상을 치료하는 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 대상은 만성 B형 간염을 가지고 있는 방법.
  87. 제84항 내지 제86항 중 임의의 항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산, 벡터, 세포 또는 약학 조성물은 중합효소 억제제, 인터페론 및/또는 체크포인트 억제제와 조합하여 투여되는 방법.




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