ES2812256T3 - Agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina - Google Patents

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Abstract

Agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina, que consiste en 44 genes que comprende: 1) cinco genes de policétido sintasa, incluyendo los residuos de orf10 16215-10543 de SEQ ID NO 1, residuos de orf11 21076-16328 de SEQ ID NO 1, residuos de orf12 32511-21124 de SEQ ID NO 1, residuos de orf13 38599-32585 de SEQ ID NO 1, residuos de orf14 52259-38643 de SEQ ID NO 1; 2) nueve genes relacionados con la unidad de extensión de la síntesis de policetona y modificación, incluyendo los residuos de orf1 1-645 de SEQ ID NO 1, residuos de orf4 3614-4840 de SEQ ID NO 1, residuos de orf5 4846-5511 de SEQ ID NO 1, residuos de orf6 7150-5801 de SEQ ID NO 1, residuos de orf15 53099-54310 de SEQ ID NO 1, residuos de orf36 83164-82052 de SEQ ID NO 1, residuos de orf37 84400-83279 de SEQ ID NO 1, residuos de orf38 84713-84393 de SEQ ID NO 1, residuos de orf39 85576-84710 de SEQ ID NO 1; 3) dieciséis genes relacionados con la síntesis de glicosilo, incluyendo los residuos de orf9 10543-9830 de SEQ ID NO 1, residuos de orf16 54495-54845 de SEQ ID NO 1, residuos de orf17 54842-56041 de SEQ ID NO 1, residuos de orf18 56038-56946 de SEQ ID NO 1, residuos de orf19 56930-57967 de SEQ ID NO 1, residuos de orf 57937-60174 de SEQ ID NO 1, residuos de orf21 60836-61984 de SEQ ID NO 1, residuos de orf22 62796-62077 de SEQ ID NO 1, residuos de orf24 67379-66318 de SEQ ID NO 1, residuos de orf26 20 69349-70650 de SEQ ID NO 1, residuos de orf28 72422-73462 de SEQ ID NO 1, residuos de orf29 74601-73561 de SEQ ID NO 1, residuos de orf33 78783-79775 de SEQ ID NO 1, residuos de orf34 79772-80779 de SEQ ID NO 1, residuos de orf35 82055-80823 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf41 87094-87702 de SEQ ID NO 1; 4) seis genes relacionados con la transferencia de glicosilo, incluyendo los residuos de orf7 8444-7179 de SEQ ID NO 1, residuos de orf8 9729-8482 de SEQ ID NO 1, residuos de orf30 74913-76160 de SEQ ID NO 1, residuos de orf31 76218-77486 de SEQ ID NO 1, residuos de orf32 77606-78781 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf40 85825-87042 de SEQ ID NO 1; 5) dos genes relacionados con la resistencia, incluyendo los residuos de orf3 3133-2285 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf25 69004-67352 de SEQ ID NO 1; 6) cuatro genes relacionados con la regulación de la biosíntesis, incluyendo los residuos de orf2 1810-1208 de SEQ ID NO 1, residuos de orf23 63633-65645 de SEQ ID NO 1, residuos de orf27 72156-70708 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf42 89315-88143 de SEQ ID NO 1; y 7) dos genes, incluyendo un gen de marcador de ingeniería genética exógeno de residuos de orf43 866-60 de SEQ ID NO 2 y un gen de micarosa 4"-O-hidroxi-isovaleriltransferasa de residuos de orf44 2337-1174 de SEQ ID NO 2 unido a orf43; orf43 y orf44 no están unidos a SEQ ID NO 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina
Campo técnico:
La presente divulgación pertenece a los campos de recursos de genes microbianos e ingeniería genética, específicamente se refiere a la investigación de función, análisis y clones de agrupaciones de genes de biosíntesis de antibióticos en la ingeniería genética y a una aplicación de las agrupaciones de genes de biosíntesis de antibióticos.
Antecedentes:
La carrimicina ha usado nombres, es decir, shengjimycin y biotec-espiramicina, es un antibiótico de macrólido de 16 miembros desarrollado usando una tecnología de biología de síntesis [descrita en las patentes con el número ZL971044406 y ZL021487715]. La carrimicina es una espiramicina con 4”-hidroxilo multiacetilado, que toma la 4”-isovaleril-espiramicina III, II y I como componentes principales, en la que el componente III representa aproximadamente el 30% o más, el componente II representa aproximadamente el 25% y el contenido en componente I no supera el 10%.
Figure imgf000002_0001
Isovaleril-espiramicina III: R=COCH2CH3 R' =COCH2CH(CH3)2
Isovaleril-espiramicina II: R=COCH3 R' =COCH2CH(CH3)2
Isovaleril-espiramicina I: R=H R' =COCH2CH(CH3)2
La carrimicina tiene una actividad relativamente alta frente a bacterias Gram-positivas y tiene actividad antibacteriana frente a bacterias resistentes a antibióticos de beta-lactama, eritromicina, Bacillus influenzae, gonococos, legionela, Bacteroides fragilis y Clostridium perfringens. Particularmente, la carrimicina tiene una actividad relativamente alta frente a Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae [Yu, Lanxiang, et al., Sichuan Journal of Physiological Sciences; 1998, 20 (3), número de patente: 2003101224209] y tiene mejores efectos tras el antibiótico y efectos antibióticos sub-MIC. La carrimicina está libre de resistencia a fármacos cruzada completa con fármacos similares. Según se muestra mediante investigaciones farmacocinéticas, la carrimicina tiene una lipoficidad superior y tiene una alta actividad antibacteriana intracelular, alta velocidad de absorción con administración oral, alta biodisponibilidad absoluta, alta capacidad de penetración tisular, amplia distribución tisular, larga semivida de eliminación y largo tiempo de retención in vivo, y la concentración tisular de la carrimicina es superior a la concentración en plasma sanguíneo [Sun, Liwen, et al., Chinese Pharmacological Bulletin 2000, 16 (6): 694-8; Zhong, Dafang, et al., J chromatography B. 2003, 791: 45; Shi, Xiangguo, et al., Asian Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics.
2003, 3 (2): 134; Shi, Xiangguo, et al., Chinese Chemical letter 2004, 15: 431; Shi, Xiangguo, et al., ActaPharmacologicaSinica, 2004, 25: 1396]. Según se muestra mediante resultados de investigación en tres fases clínicas completadas, toxicológicas y farmacológicas, la carrimicina se usa para tratar infecciones de las vías respiratorias, es definitiva en cuanto al efecto de tratamiento y tiene una baja tasa de reacciones adversas, particularmente tiene pocas lesiones en los hígados y tiene una buena seguridad [Lin, Futian, et al., Fighth nationwide antibiotic academic conference paper compilation 1997, pág. 167; Zhao, Chunyan, et al., Chinese Journal of Antibiotics, 1998, 23 (4): 306; Sun, Tao, et al., Chinese Journal of Antibiotics, 2001, 26 (1): 49-51]. La carrimicina es un producto fermentado dirigido de bacteria de ingeniería genética obtenida usando tecnología de recombinación génica. El procedimiento de preparación es sencillo y conveniente, y puede evitar eficazmente la contaminación química y ahorrar fuente de energía. Las preparaciones orales de carrimicina resultan convenientes de tomar y solo se requiere que se tomen una vez al día, lo cual ayuda a mejorar el cumplimiento de los pacientes con los medicamentos, y también resulta conveniente para entrar en las series de fármacos de seguros médicos básicos.
La carrimicina es un producto fermentado de bacterias de ingeniería genética (Streptomyces spiramyceticus WSJ-1), que se obtiene sometiendo genes de 4”-isovaleril-transferasa de bacterias productoras de carbomicina a expresión de clones en bacteria productoras de espiramicina (Streptomyces spiramyceticus F21). Las bacterias productoras de espiramicina (Streptomyces spiramyceticus F21) se aislaron a partir de la tierra en Yongchang County, Gansu Province, China en 1982 por el presente laboratorio. Las características morfológicas, características bioquímicas fisiológicas, composición química de la pared celular, secuencia génica de ARNr 16S y 5 niveles de proteína de genes de mantenimiento de las bacterias en un análisis de árbol filogenético no tienen nada en común con bacterias productoras de espiramicina notificadas en el extranjero, Streptomyces ambofaciens ATCC23877 y estreptomicetos notificados. Por tanto, es extremadamente posible que las bacterias productoras de espiramicina (Streptomyces spiramyceticus F21) sean una nueva especie de estreptomiceto [Dai, Jianlu, et al., Journal of Microbiology, 2012, 39 (4): 503-514].
Se ha completado la secuenciación de agrupaciones de genes relacionados con la biosíntesis de espiramicina en las bacterias productoras de espiramicina, Streptomyces ambofaciens ATCC23877 [Karray F., Microbiology, 2007, 153: 4111-4122], así como el documento EP0791656, y también se han notificado secuencias de agrupaciones de genes de biosíntesis de otros antibióticos de macrólidos tales como avermectina, canavaliamicina, eritromicina, calcomicina, tilosina y medemicina [Ikeda H. et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(5): 526-531, Haydock et al., Microbiology, 2005, 151, 3161-3169; Oliynyk M. et al., Nat. Biotechnol. 2007, 25(4): 447-453; Wards L. et al., Antimicrob. Agents & Chemotherapy, 2004, 48(12): 4703-4712; Cundiffe E. et al., Antonie Van Leeuwenhoek, 2001,79(3-4): 229-234; Midoh Naoki et al., patente estadounidense 7070980]. Las agrupaciones de genes de biosíntesis de antibióticos de macrólidos tienen la longitud completa de aproximadamente 50-80 kb y tienen las características comunes de estar compuestas por policétido sintasa (PKS) para codificar para una estructura modular de biosíntesis de un anillo de macrólido de 16 miembros, enzimas relacionadas con la unidad de extensión de la síntesis de policetona, enzimas responsables de la modificación de diferentes grupos radicales de un anillo de lactona, genes de síntesis de glicosilo y enzimas relacionadas con la transferencia y genes relacionados con la función de resistencia y regulación y control, etc. Los macrólidos se forman llevando a cabo una reacción de condensación continua para catalizar algunas moléculas de ácido carboxílico simples mediante PKS compuestas por estructuras modulares de una manera similar a la biosíntesis de ácidos grasos. Cada módulo solo es responsable de la reacción de condensación en una etapa en un procedimiento de formación de cadena de policetona, y el módulo contiene al menos un dominio estructural de beta-cetoacilsintetasa (KS), un dominio estructural de aciltransferasa (AT) y un dominio estructural de proteína portadora de acilo (ACP). Además, el módulo posiblemente contiene además un dominio estructural de betacetoacilreductasa (KR), un dominio estructural de deshidrogenasa (DH) y un dominio estructural de éster acilreductasa (ER), y los dominios estructurales determinan una etapa de reducción de unidades de extensión añadidas. Mientras tanto, también se requiere la acción de un dominio estructural de tioesterasa (TE) para catalizar la ciclización y liberación de cadenas de policetona. Finalmente, también se requiere llevar a cabo etapas de modificación tales como hidroxilación, metilación, metoxilación y acilación para formar diversas estructuras de antibióticos de macrólidos. Generalmente, todos los macrólidos están conectados con grupos glicosilo (o glicosilamino) en diferentes cantidades, por ejemplo, la carrimicina contiene tres grupos glicosilo, es decir, forosamina, micaminosa y micarosa. Los grupos glicosilo se realizan mediante enzimas relacionadas con síntesis y transferencia de glicosilo. Los genes resistentes dotan a las bacterias productoras de capacidad para resistir al antibiótico producido por ellas mismas y generalmente están relacionados con la proteína de transporte de ABC. Los genes relacionados con la función de regulación y control participan en la regulación y el control de antibióticos de biosíntesis propia.
Mediante información de secuencia y análisis estructural de agrupación de genes, pueden realizarse adicionalmente manipulaciones genéticas en bacterias productoras para obtener antibióticos novedosos y más eficaces. Por ejemplo, se crean nuevos antibióticos de macrólidos cambiando las estructuras modulares de síntesis de PKS de antibióticos de macrólidos mediante manipulación genética, cambiando la modificación posterior del anillo de lactona y sustituyendo o modificando grupos glicosilo. Y el rendimiento de los antibióticos puede aumentarse llevando a cabo una operación genética sobre genes resistentes o genes reguladores. [Wilkinson B. et al., Chem Biol. 2000, 7 (2): 111­ 117; Kalz L. et al., Med Res Rev. 1999, 19 (6): 543-58; Goodman CD et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013, 57(2): 907-913; Wang W et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(15): 5688-93; Stratigopoulos G et al., Mol Microbiol. 2004, 54(5): 1326-34; Novakova R et al., Folia Microbiol. 2011, 56(3): 276-82].
Sumario:
La presente divulgación proporciona una agrupación de genes de unión de biosíntesis de carrimicina. La agrupación de genes tiene 44 marcos de lectura abierta (orf) de genes en total, la longitud completa de las secuencias de nucleótidos es de 89315 pb (sec. 1). La agrupación de genes contiene 5 orf que codifican para policétido sintasa (orf 10-14), que comprende 8 módulos y 37 dominios estructurales, 9 orf relacionados con la unidad de extensión de la síntesis de policetona y modificación (1,4-6, 15 y 36-39), 16 orf relacionados con la síntesis de glicosilo (9, 16-22, 24, 26, 28, 29, 33-35 y 41) y 6 orf relacionados con la transferencia de glicosilo (7, 8, 30-32 y 40). Además, la agrupación de genes comprende además 2 orf relacionados con la resistencia (3 y 25) y 4 orf posiblemente relacionados con la regulación y el control (2, 23, 27 y 42). Las secuencias de nucleótidos se seleccionan por separado de un grupo que consiste en orf1 (1-645), orf2 (1810-1208), orf3 (3133-2285), orf4 (3614-4840), orf5 (4846-5511), orf6 (7150-5801), orf7 (8444-7179), orf8 (9729-8482), orf9 (10543-9830), orf10 (16215-10543), orf11 (21076-16328), orf12 (32511­ 21124), orf13 (38599-32585), orf14 (52259-38643), orf15 (53099-54310), orf16 (54495-54845), orf17 (54842-56041), orf18 (56038-56946), orf19 (56930-57967), orf20 (57937-60174), orf21 (60836-61984), orf22 (62796-62077), orf23 (63633-65645), orf24 (67379-66318), orf25 (69004-67352), orf26 (69349-70650), orf27 (72156-70708), orf28 (72422­ 73462), orf29 (74601-73561), orf30 (74913-76160), orf31 (76218-77486), orf32 (77606-78781), orf33 (78783-79775), orf34 (79772-80779), orf35 (82055-80823), orf36 (83164-82052), orf37 (84400-83279), orf38 (84713-84393), orf39 (85576-84710), orf40 (85825-87042), orf41 (87094-87702) y orf42 (89315-88143) en la sec. 1. Además, la agrupación de genes comprende además orf43 (866-60) y orf44 (2337-1174) en una sec. 2 de gen exógeno no unida a la sec. 1 con la longitud completa de 2337 pb.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de 4'-fosfopanteteinil-transferasa (PPT), la secuencia de aminoácidos consiste en 214 aminoácidos en la sec. 3 y se denomina IA-W1, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 1-645 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de un factor de regulación y control de la transcripción de la familia TetR, la secuencia de aminoácidos consiste en 200 aminoácidos en la sec. 4 y se denomina IA-W2, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 1810-1208 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de metiltransferasa de ARNr 23S, la secuencia de aminoácidos consiste en 282 aminoácidos en la sec. 5 y se denomina IA-W3, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 3133-2285 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de 3-O-aciltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 408 aminoácidos en la sec. 6 y se denomina IA-W4, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 3614-4840 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de O-metiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 221 aminoácidos en la sec. 7 y se denomina IA-W5, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 4846-5511 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de crotonilo coenzima A reductasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 449 aminoácidos en la sec. 8 y se denomina IA-W6, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 7150-5801 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de glicosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 421 aminoácidos en la sec. 9 y se denomina IA-W7, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 8444-7179 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de proteína accesoria de glicosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 415 aminoácidos en la sec. 10 y se denomina IA-W8, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 9729-8482 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-aminohexosa N-dimetiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 237 aminoácidos en la sec. 11 y se denomina IA-W9, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 10543-9830 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio estructural de policetidosintasa de cetosintasa (KS)s-aciltransferasa (AT)s-cetorreductasa (KR)s-proteína portadora de acilo (ACP)8-tioesterasa de liberación de cadena (TE), la secuencia de aminoácidos consiste en 1890 aminoácidos en la sec. 12 y se denomina IA-W10, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 16215-10543 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio estructural de policétido sintasa de KS7-AT7-KR7-ACP7 , la secuencia de aminoácidos consiste en 1582 aminoácidos en la sec. 13 y se denomina IA-W11, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 21076-16328 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio estructural de policétido sintasa de KS5-AT5-KR5-ACP5-KS6-AT6-DH6 (deshidrogenasa)-ER6 (enoilreductasa)-KR6-ACP6, la secuencia de aminoácidos consiste en 3795 aminoácidos en la sec. 14 y se denomina IA-W12, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 32511-21124 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio estructural de policétido sintasa de KS4-AT4-DH4-KR4-ACP4 , la secuencia de aminoácidos consiste en 2004 aminoácidos en la sec. 15 y se denomina IA-W13, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 38599-32585 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio estructural de policétido sintasa de KS1-AT1-ACP1-KS2-AT2-KR2-ACP2-KS3-AT3-DH3-KR3-ACP3 , la secuencia de aminoácidos consiste en 4538 aminoácidos en la sec. 16 y se denomina IA-W14, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 52259-38643 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de oxidasa del citocromo P-450, la secuencia de aminoácidos consiste en 403 aminoácidos en la sec. 17 y se denomina IA-W15, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 53099-54310 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa isomerasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 116 aminoácidos en la sec. 18 y se denomina IA-W16, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 54495-54845 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa aminotransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 399 aminoácidos en la sec. 19 y se denomina IA-W17, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 54842-56041 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-glucosa sintasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 302 aminoácidos en la sec. 20 y se denomina IA-W18, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 56038-56946 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-glucosa-4,6-deshidrogenasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 345 aminoácidos en la sec. 21 y se denomina IA-W19, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 56930-57967 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa-2,3-deshidrogenasa/tioesterasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 745 aminoácidos en la sec. 22 y se denomina IA-W20, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 57937-60174 bases en la sec. 1. La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa aminotransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 382 aminoácidos en la sec. 23 y se denomina IA-W21, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 60836-61984 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-aminohexosa N-dimetiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 239 aminoácidos en la sec. 24 y se denomina IA-W22, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 62796-62077 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de un factor de regulación y control de la transcripción, la secuencia de aminoácidos consiste en 670 aminoácidos en la sec. 25 y se denomina IA-W23, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 63633-65645 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-aminohexosa isomerasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 354 aminoácidos en la sec. 26 y se denomina IA-W24, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 67379-66318 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de proteína de transporte de ABC, la secuencia de aminoácidos consiste en 550 aminoácidos en la sec. 27 y se denomina IA-W25, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 69004-67352 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa deshidrogenasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 433 aminoácidos en la sec. 28 y se denomina IA-W26, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 69349-70650 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de enzima similar a GTP, la secuencia de aminoácidos consiste en 482 aminoácidos en la sec. 29 y se denomina IA-W27, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 72156-70708 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa isomerasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 346 aminoácidos en la sec. 30 y se denomina IA-W28, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 72422-73462 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa cetorreductasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 346 aminoácidos en la sec. 31 y se denomina IA-W29, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 74601-73561 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de proteína accesoria de glicosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 415 aminoácidos en la sec. 32 y se denomina IA-W30, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 74913-76160 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de glicosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 422 aminoácidos en la sec. 33 y se denomina IA-W31, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 76218-77486 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de glicosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 391 aminoácidos en la sec. 34 y se denomina IA-W32, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 77606-78781 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa cetorreductasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 330 aminoácidos en la sec. 35 y se denomina IA-W33, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 78783-79775 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa reductasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 335 aminoácidos en la sec. 36 y se denomina IA-W34, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 79772-80779 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa metiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 410 aminoácidos en la sec. 37 y se denomina IA-W35, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 82055-80823 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de metoximalonilsintetasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 370 aminoácidos en la sec. 38 y se denomina IA-W36, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 83164-82052 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de deshidrogenasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 373 aminoácidos en la sec. 39 y se denomina IA-W37, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 84400-83279 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de proteína portadora de acilo, la secuencia de aminoácidos consiste en 106 aminoácidos en la sec. 40 y se denomina IA-W38, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 84713-84393 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de metoximalonilo deshidrogenasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 288 aminoácidos en la sec. 41 y se denomina IA-W39, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 85576-84710 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de glicosiltransferasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 405 aminoácidos en la sec. 42 y se denomina IA-W40, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 85825-87042 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de NDP-hexosa isomerasa, la secuencia de aminoácidos consiste en 202 aminoácidos en la sec. 43 y se denomina IA-W41, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 87094-87702 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de una proteína de factor de regulación y control de la transcripción, la secuencia de aminoácidos consiste en 390 aminoácidos en la sec. 44 y se denomina IA-W42, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 89315-88143 bases en la sec. 1.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de una metilasa de ARNr 23S exógena (tiostreptona y marcador de resistencia de tsr relacionado), la secuencia de aminoácidos consiste en 269 aminoácidos en la sec. 45 y se denomina IA-W43, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 866-57 bases en la sec. 2.
La presente divulgación proporciona además una secuencia de aminoácidos de 4”-micarosa-glucosidoisovaleriltransferasa exógena, la secuencia de aminoácidos consiste en 388 aminoácidos en la sec. 46 y se denomina IA-W44, y la secuencia de nucleótidos de un gen codificante se selecciona de 2337-1171 bases en la sec. 2.
Basándose en la obtención de información de la agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina, y el análisis de las posibles funciones de proteínas codificadas de cada gen mediante bloqueo génico y comparación homóloga, se describen adicionalmente los 44 genes de la agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina de la presente divulgación, y la agrupación de genes tiene una estructura mostrada en la figura 1, específicamente:
(1) cinco genes de policétido sintasa, incluyendo orf10-14;
(2) nueve genes relacionados con la unidad de extensión de la síntesis de policetona y genes relacionados con la modificación, incluyendo orf1, orf4-6, 15 y 36-39;
(3) dieciséis genes relacionados con la síntesis de glicosilo, incluyendo orf9, 16-22, 24, 26, 28, 29, 33-35 y 41; (4) seis genes relacionados con la transferencia de glicosilo, incluyendo orf7, 8, 30-32 y 40;
(5) dos genes relacionados con la resistencia, incluyendo orf3 y 25;
(6) 4 genes relacionados con la regulación y control de la biosíntesis en total, incluyendo orf2, 23, 27 y 42; y
(7) dos genes, incluyendo un gen de marcador de ingeniería genética exógeno orf43 (tiostreptona y un gen resistente de tsr) y un gen de micarosa 4”-O-isovaleril-transferasa orf44 unido al orf43.
Cinco genes de policétido sintasa (orf10-14) en la sec. 1, secuencias complementarias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de las mismas son esenciales para la síntesis de un anillo de lactona de carrimicina. Los 5 genes de policétido sintasa comprenden 8 módulos y 37 dominios estructurales mostrados en la figura 2. Orf14 comprende 3 módulos: un dominio estructural de carga 1, un módulo 2 y un módulo 3; en un dominio de módulo de carga, KS1, AT1 y ACP1 son responsables de la síntesis inicial del anillo de lactona, y se cataliza ácido acético como unidad de inicio. El módulo 2 comprende los dominios estructurales KS2 , AT2 , KR2 y ACP2 ; y el módulo 3 comprende los dominios estructurales KS3 , AT3 , DH3 , KR3 y ACP3 y es responsable de la introducción de 2 unidades de extensión de ácido acético adicionales para formar finalmente un entramado de cadena de carbono C11-15 de carrimicina. El Orf13 comprende un módulo 4 que comprende KS4, AT4 , DH4 , KR4 y ACP4 y es responsable de la extensión de una tercera unidad de ácido acético para formar finalmente un entramado de cadena de carbono C9-10 de carrimicina. El Orf12 comprende un módulo 5 y un módulo 6, y el módulo 5 comprende un dominio estructural KS5-AT5-KR5-ACP5 y es responsable de la introducción de una unidad de extensión de ácido propiónico; y el módulo 6 comprende un dominio estructural KS6-AT6-DH6-KR6-ER6-KR6-ACP6 y es responsable de la introducción de una unidad de extensión de ácido butírico para formar finalmente un entramado de cadena de carbono C5-C8 de carrimicina. El Orf11 comprende un módulo 7 que contiene un dominio estructural KS7-AT7-KR7-ACP7 y es responsable de la introducción de una unidad de extensión de ácido glicólico para formar finalmente un entramado de cadena de carbono C3-C4 de carrimicina. El Orf10 comprende un módulo 8 que contiene un dominio estructural KS8-AT8-KR8-ACP8-TE y es responsable de la introducción de una unidad de extensión de ácido acético, y la ciclización y liberación de una cadena de carbono se completan con la participación de tioesterasa (TE). En la figura 2 se muestra un diagrama esquemático estructural de genes de policétido sintasa de carrimicina. En la tabla 1 se muestran todos los dominios estructurales y posiciones de aminoácidos de los mismos de los genes de policétido sintasa.
Secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias y secuencias de aminoácidos correspondientes de las mismas de los genes relacionados con la unidad de extensión de la síntesis de policetona y modificación orf1, orf4-6, 15 y 36-39 son: IA-W1, que codifica para una proteína portadora de acilo (ACP) sintetizada por policétido modificado con PPT para permitir que la proteína se convierta en una proteína activa; IA-W4, que codifica para 3-O-aciltransferasa y es responsable de la acilación de hidroxilo en posición 3 de carrimicina; IA-W5 y IA-W6, que codifican por separado para O-metilasa y crotonoilo coenzima A reductasa y son responsables del suministro de unidades de extensión de policétido; IA-W15, que codifica para mono-oxidasa del citocromo P450 y es responsable de la oxidación de una cadena de carbono de policétido; y IA-W36-39, que codifican por separado para metoximalonilsintetasa, deshidrogenasa, proteína portadora de acilo y metoximalonilo deshidrogenasa. Y todos los genes participan en la síntesis y modificación de las unidades de extensión de policétido.
Tabla 1: Todos los dominios estructurales y las posiciones de aminoácidos de los mismos de genes de policétido sintasa:
Tabla 1.1 Todos los dominios estructurales y las posiciones de aminoácidos de los mismos del gen de policétido sintasa IA-W14
Módulo Dominio estructural Posición de aminoácido Módulo de carga - módulo 1 KS1 1-400
AT1 511-814
ACP1 918-989
Módulo 2 KS2 1018-1444
AT2 1551-1854
k r 2 2160-2338
a c p 2 2473-2546
Módulo 3 k s 3 2570-2995
ATs 3109-3412
d h 3 3483-3653
k r 3 4068-4248
ACPa 4369-4441
Tabla 1.2 Todos los dominios estructurales y las posiciones de aminoácidos de los mismos del gen de policétido sintasa IA-W13
Módulo Dominio estructural Posición de aminoácido Módulo 4 k s 4 36-461
a t 4 575-878
d h 4 945-1158
k r 4 1532-1711
a c p 4 1831-1904
Tabla 1.3 Todos los dominios estructurales y las posiciones de aminoácidos de los mismos del gen de policétido sintasa IA-W12
Módulo Dominio estructural Posición de aminoácido Módulo 5 KS5 37-463
ATg 662-957
KRs 1245-1413
ACPs 1519-1592
Módulo 6 KSe 1613-2039
ATs 2157-2458
DHe 2524-2686
ER6 3025-3329
KRe 3338-3518
ACPe 3632-3702
Tabla 1.4 Todos los dominios estructurales y las posiciones de aminoácidos de los mismos del gen de policétido sintasa IA-W11
Módulo Dominio estructural Posición de aminoácido Módulo 7 k s 7 35-460
a t 7 566-864
k r 7 1149-1328
a c p 7 1433-1505
Tabla 1.5 Todos los dominios estructurales y las posiciones de aminoácidos de los mismos del gen de policétido sintasa IA-W10
Módulo Dominio estructural Posición de aminoácido Módulo 8 KSe 36-461
ATs 579-878
DHs 831-993
KRe 1232-1411
ACPs 1513-1584
TEs 1659-1872
La cantidad de genes relacionados con la síntesis de glicosilo de carrimicina es de 12 en total, incluyendo orf9, 16-22, 24, 26, 28, 29, 33-35 y 41, en los que, orf18, 19 y 28 codifican para enzimas de síntesis, deshidratación e isomerización de unidades de glicosilo básicas de carrimicina; orf9, 20, 21, 24, 26 y 29 codifican para enzimas de N-dimetilación, 2,3-deshidratación, aminación, isomerización, deshidratación y cetorreducción de NDP-hexosamina en la síntesis de forosamina; orf16, 17 y 22 codifican para enzimas de isomerización, aminación y N-dimetilación de NDP-hexosamina de micaminosa; y orf33, 34, 35 y 41 codifican para enzimas de cetorreducción, metilación e isomerización de NDP-hexosamina de micarosa.
La cantidad de genes relacionados con la transferencia de glicosilo de carrimicina es de 6 en total, incluyendo orf7, 8, 30-32 y 40, en los que orf7 codifica para glicosilasa de micaminosa; orf8 codifica para una proteína accesoria de glicosilación de micaminosa; orf31 y 32 codifican para glicosilasa de forosamina; orf30 codifica para una proteína accesoria de glicosilación de forosamina; y orf40 codifica para una enzima de glicosilación de micarosa.
La cantidad genes relacionados con la resistencia de carrimicina es de 2 en total, incluyendo orf3 y 25, en los que orf3 codifica para una metilasa de ARNr 23S; y orf25 codifica para una proteína de transporte de ABC, el orf3 y el orf25 dotan a las bacterias productoras de carrimicina de resistencia al antibiótico producido por ellas mismas mediante un mecanismo de metilación y bombeo para ARN de ribosoma.
La cantidad de genes de carrimicina relacionados con la regulación y control de la biosíntesis es de 4 en total, incluyendo orf2, 23, 27 y 42, en los que orf2 codifica para un factor de inhibición de la regulación y el control de la transcripción de la familia TetR y posiblemente participa en la regulación y el control negativo de la biosíntesis de carrimicina; orf23 y orf42 codifican por separado para dos factores de transcripción de regulación y control positivos, y este último factor de transcripción de regulación y control positivo sirve como factor de regulación y control positivo especial de la ruta y se usa para regular y controlar directamente la biosíntesis de carrimicina; y orf27 codifica para una enzima de GTP y posiblemente regula y controla la biosíntesis de carrimicina mediante funciones de regulación y control de células.
Los orf43 y orf44 exógenos están relacionados con la biosíntesis de carrimicina, en los que el orf43 codifica para un gen de metilasa de ARNr 23S relacionado con resistencia a tiostreptona, el gen está relacionado con un gen de micarosa 4”-O-hidroxi-isovaleriltransferasa orf44, y la expresión de resistencia del orf43 puede proporcionar un marcador de identificación para modificar por ingeniería genética bacterias de carrimicina.
Pueden obtenerse secuencias complementarias de sec. 1 y sec. 2 de la presente divulgación en cualquier momento según el principio de apareamiento de bases complementario. Pueden obtenerse secuencias de nucleótidos o parte de las secuencias de nucleótidos de sec. 1 y sec. 2 mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o digestión enzimática de ADN correspondiente usando una endonucleasa de restricción apropiada o usando otras tecnologías apropiadas. Pueden obtenerse genes similares a genes de biosíntesis de carrimicina a partir de otros organismos mediante las secuencias de nucleótidos o parte de las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación usando un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un método para llevar a cabo una hibridación de tipo Southern usando ADN que contiene las secuencias de la presente divulgación como sonda.
La presente divulgación proporciona además una manera de obtener al menos parte de la secuencia de ADN en la sec. 1 y sec. 2 para construir un vector recombinado que no forma parte de la invención.
La presente divulgación proporciona además una manera de bloquear los genes de biosíntesis de carrimicina, en la que al menos uno de los genes comprende secuencias de nucleótidos en la sec. 1, que no forma parte de la invención. Se da a conocer, pero no forma parte de la invención, que pueden obtenerse nuevos derivados de carrimicina mediante bloqueo de una o más etapas de biosíntesis de carrimicina usando los genes de clones o fragmentos de ADN de secuencias de nucleótidos o al menos parte de las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación. Las secuencias de nucleótidos comprenden los fragmentos de ADN o genes y pueden usarse para aumentar el rendimiento de carrimicina o derivados de la misma.
Se dan a conocer ADN de clon de secuencias de nucleótidos o al menos parte de las secuencias de nucleótidos pero no forman parte de la invención de la presente divulgación que pueden usarse para localizar más plásmidos de biblioteca a partir de una biblioteca genómica. Estos plásmidos de biblioteca comprenden al menos parte de las secuencias de la presente divulgación y también contienen ADN de regiones, adyacentes a los plásmidos de biblioteca, en un genoma de bacterias productoras de carrimicina.
Las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación pueden modificarse o mutarse. Las maneras de modificación o mutación comprenden inserción o sustitución, una reacción en cadena de la polimerasa, una reacción en cadena de la polimerasa mediada por errores, mutación específica del sitio, reconexión de secuencias diferentes y mutación provocada por radiación ultravioleta o reactivos químicos.
Se da a conocer, pero no forma parte de la invención, que pueden hacerse evolucionar directamente secuencias de ácido nucleico (intercambio de a Dn ) a través de diferentes partes de las secuencias o secuencias homólogas de otras fuentes.
Pueden usarse fragmentos o dominios estructurales o módulos o genes de secuencias de nucleótidos o al menos parte de las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación para construir una biblioteca de policétido sintasa o una biblioteca de derivados de policétido sintasa o una biblioteca de paquetes. Se producen nuevos compuestos de policetona mediante deleción o desactivación de uno o más dominios estructurales, módulos o genes de policétido sintasa de sistemas de policétido sintasa iguales o diferentes o aumentando uno o más dominios estructurales, módulos o genes de policétido sintasa.
Las secuencias de nucleótidos de genes modificadores de la biosíntesis y genes de síntesis de glicosilo y glicosiltransferasa de la presente divulgación proporcionan una manera de obtener derivados de carrimicina mediante deleción, sustitución o reformado de estos genes de síntesis y transferencia y modificación de glicosilo, todo lo cual no forma parte de la invención.
Pueden usarse fragmentos o dominios estructurales o módulos o genes de secuencias de nucleótidos o al menos parte de las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación para aumentar el rendimiento de carrimicina o derivados de la misma mediante una duplicación de la cantidad, todo lo cual no forma parte de la invención.
Pueden expresarse genes de clones de secuencias de nucleótidos o al menos parte de las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación en huéspedes exógenos mediante sistemas de expresión apropiados para obtener carrimicina modificada o carrimicina con bioactividad superior o rendimiento superior. Estos huéspedes exógenos comprenden Streptomyces, Escherichia coli, Bacillus, levadura, plantas, animales, etc., todo lo cual no forma parte de la invención.
Pueden expresarse genes o agrupaciones de genes de secuencias de nucleótidos o al menos parte de las secuencias de nucleótidos proporcionadas por la presente divulgación en huéspedes heterólogos, y las funciones de los genes o agrupaciones de genes en cadenas de metabolismo de los huéspedes se entienden mediante una tecnología de chip de ADN.
Los polipéptidos de secuencias de aminoácidos o al menos parte de las secuencias de aminoácidos proporcionadas por la presente divulgación todavía pueden tener bioactividad, incluso nueva actividad biológica, después de retirar o sustituir uno o algunos aminoácidos, o se aumenta el rendimiento, o se optimizan características dinámicas u otras propiedades buscadas de proteínas, todo lo cual no forma parte de la invención. Pueden obtenerse nuevas proteínas o enzimas, pero que no forman parte de la invención, mediante conexión de las secuencias de aminoácidos de la presente divulgación mediante deleción de tecnología apropiada, y después se producen productos nuevos o asociados.
Las secuencias de aminoácidos proporcionadas por la presente divulgación pueden usarse para separar proteínas requeridas y pueden aplicarse a la preparación de anticuerpos, todo lo cual no forma parte de la invención.
Las secuencias de aminoácidos proporcionadas por la presente divulgación, pero que no forman parte de la invención, proporcionan la posibilidad de predecir una estructura tridimensional de policétido sintasa.
Los genes proporcionados por la presente divulgación y proteínas y anticuerpos de los mismos dados a conocer, pero que no forman parte de la invención, también pueden usarse para examinar y desarrollar compuestos o proteínas para medicamentos, industria y agricultura.
Breve descripción de los dibujos:
Figura 1: una estructura de una agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina.
Figura 2: una estructura de un gen de policétido sintasa de carrimicina.
Figura 3: un diagrama esquemático de la construcción de plásmidos recombinantes de bloqueo de gen de 3-O-aciltransferasa IA-W4 e intercambio doble mediante
Figura 4: un diagrama esquemático de construcción de plásmidos recombinantes de bloqueo de gen de regulación y control de la transcripción IA-W42 y así sucesivamente.
Figura 5A: verificación del bloque de un gen de 3-O-aciltransferasa IA-W4 mediante PCR, en la que: 1: cepa original; 2, 3, 4: mutante con bloqueo de gen; y 5: marcador III de ADN.
Figura 5B: verificación del bloqueo de otros genes mediante PCR, en la que: III: marcador III de ADN; C: cepa original; y M: mutante con bloqueo de gen.
Figura 6: análisis de HPLC de productos fermentados de unos mutantes con bloqueo de gen de 3-O-aciltransferasa IA-W4, en la que: a: un control de carrimicina; y b: extracto fermentado de mutante con bloqueo de gen, I, II y III son picos de absorción de tres componentes principales, es decir, isovaleril-espiramicina I, isovaleril-espiramicina II e isovaleril-espiramicina III de carrimicina, respectivamente.
Según la presente divulgación, pero no forma parte de la invención, se obtienen cepas mutantes mediante experimentos de bloqueo de gen; y se demuestra mediante los experimentos que el cambio de componentes de carrimicina de las cepas mutantes está provocado por bloqueo de gen, o ya no se produce la carrimicina. Y por tanto, se fomenta que la información de agrupación de genes obtenida se refiere a la biosíntesis de carrimicina.
Según la presente divulgación, pero no forma parte de la invención, un gen de marcador de resistencia a tiostreptona exógeno (orf43) y un gen de micarosa 4”-O-hidroxi-isovaleriltransferasa (orf44) unido al orf43 se integran en cromosomas de las bacterias productoras de carrimicina mediante recombinación homóloga génica. El presente laboratorio ha demostrado mediante investigaciones que el orf43 y el orf44 son esenciales para la biosíntesis de carrimicina (Chinese Journal of Biotechnology, volumen 15, número 2, 1999, 171-176).
Descripción detallada:
Las realizaciones proporcionadas a continuación solo se usan para ayudar a los expertos en la técnica a entender mejor la presente divulgación, en lugar de limitar la presente divulgación de ninguna manera.
<Realización 1> Extracción de ADN total de bacterias productoras de carrimicina (S. spiramyceticus)
Fórmula de medio de cultivo R2YE (g/100 ml):
Sacarosa 10,3 Glucosa 1,0
Extracto de levadura 0,4 Triptona 0,2
Peptona 0,4 Hidrolizado de caseína 0,1
K2SO4 0,025 CaCI2 0,216 KH2PO4 0,005 MgCI2, 6H20 1,012 NaOH (1 M) 0,5 ml Tris-HCI (0,25 mol/l, pH 7,2) 10 ml
Se añaden 0,2 ml de disolución de oligoelementos y se añade agua destilada hasta que el volumen es de 100 ml y el pH es de 6,5.
Disolución de oligoelementos (g/100 ml):
ZnCI2 0,004 FeCI3, 6 H2O 0,02
CUCI2 , 2 H2O 0,001 MnCI2 ,4H 20 0,001 Na2B407, IOH2O 0,001 (NH4)sM0702, 4H20 0,001
Se realiza una esterilización de 15 libras durante 20 min a una temperatura de 121°C.
Se inoculó S. spiramyceticus en 25 ml de medio de cultivo R2YE, se realizó un cultivo en mesa vibradora durante 48 h a una temperatura de 28°C. Después se realizó un cultivo secundario en 100 ml de medio de cultivo R2YE, se realizó un cultivo en mesa vibradora durante 24 h a una temperatura de 28°C. Después se recogieron los talos (aproximadamente 10 g) después de centrifugar durante 10-15 min a una velocidad de 5.000 rpm. Se realizó la operación principalmente según las especificaciones del producto de la empresa de ciencias biológicas UPTECH™ Se añadieron 50 ml de una disolución de EDTA 25 mM en los talos para su lavado con vibración y después se centrifugó la disolución, y se descartó el sobrenadante. Se suspendieron los micelios con 25 ml de disolución de lisozima (10 mg/ml, preparada a partir de T ris-HCl 10 mM con pH de 8,0, EDTA 2 mM y T ritonX-100 al 1,2% añadiendo 0,5 ml de ARNasa 100 mg/ml) y se cultivaron durante aproximadamente 1-2 h a una temperatura de 37°C hasta que las células eran translúcidas. Después se añadieron 2,5 ml de disolución de proteasa K y se realizó el cultivo durante 30 min a una temperatura de 55°C. Después se añadieron 20 ml de disolución de SDS al 10% y se realizó el cultivo durante 10 min a una temperatura de 70°C. Se añadió un volumen igual de etanol anhidro y se realizó una vibración completa. Después se transfirió la disolución a una columna de purificación de ADN, centrifugando durante 1 min a una velocidad de 12.000 rpm. Después se añadieron 50 ml de disolución que contenía proteasa para lavar la columna y se realizó la centrifugación durante 1 min a una velocidad de 12.000 rpm a temperatura ambiente. Después, se lavó la columna dos veces con 50 ml de disolución de aclarado y se realizó la centrifugación durante 1 min a una velocidad de 12.000 rpm a la vez. Después se añadieron 5-10 ml de eluyente de TE y se colocó durante 2-5 min a temperatura ambiente y se realizó la centrifugación durante 1 min a una velocidad de 12.000 rpm. Se recogió la disolución y se guardó el ADN total a una temperatura de -20°C.
<Realización 2> Verificación de funciones de información de genes en la sec. 1 mediante bloqueo de genes
Se lleva a cabo el bloqueo de genes tales como IA-W1, IA-W42 en dos extremos de agrupaciones de genes, e IA-W4, 17, 21, 23 y 27 seleccionados para obtener cepas mutantes. Se demuestra mediante experimentos que la capacidad de estas cepas bloqueadas para producir carrimicina ha cambiado la carrimicina o desaparece. Por tanto, la información de agrupación de genes obtenida es esencial para la producción de carrimicina. Se diseñan cebadores según los genes codificantes anteriormente mencionados y secuencias en el sentido de 5' y de 3' de las mismas y se insertan en sitios de digestión enzimática apropiados y las secuencias de cebadores se muestran en la tabla 2.
Tabla 2 Secuencias de cebadores diseñadas para el experimento de bloqueo de genes
Figure imgf000012_0001
Se obtienen por separado fragmentos de genes homólogos correspondientes mediante amplificación por PCR y se obtuvo plásmido recombinante que contenía genes homólogos adoptando sitios de digestión enzimática correspondientes, insertando genes resistentes marcados examinados (apramicina-Am) y conectando los genes a un vector sensible a la temperatura pKC1139 [Bierman M. et al., Gene, 1992; 116(1): 43-9] o vector de Escherichia coli/Streptomyces pGH112 [Youbao Biology Company]. Se transformó el plásmido recombinante con protoplastos y se transfirió al interior de las bacterias productoras de carrimicina. Después del cultivo, se aislaron colonias individuales para obtener la cepa con bloqueo de gen de intercambio doble de fragmento homólogo. En la figura 3 se muestra un diagrama esquemático de la construcción de plásmidos recombinantes de bloqueo de un gen de 3-O-aciltransferasa IA-W4 e intercambio doble. En la figura 4 se muestra un diagrama esquemático de la construcción de plásmidos recombinantes de bloqueo de genes tales como un gen de regulación y control de la transcripción IA-W42.
Se sometieron ADN total de cepas bloqueadas y ADN total de cepas originales a verificación mediante PCR adoptando por separado cebadores correspondientes, tal como se muestra en la figura 5A y la figura 5B. Mediante un resultado de la figura 5A, se muestra que se delecionaron 613 pb en el gen codificante orf4 de una cepa mutante con bloqueo de gen IA-W4. En la figura 5B se ilustra un resultado de verificación mediante PCR, en comparación con las cepas originales, la longitud de los productos de PCR aumenta a medida que los genes resistentes marcados examinados se insertaron en la cepa mutante con genes codificantes relacionados bloqueados.
Mediante experimentos de fermentación y detección por HPLC de productos, se demostró que las cepas mutantes con bloqueo de IA-W4 ya no producen 4”-isovaleril-espiramicina III y II y están dominadas con 4”-isovalerilespiramicina I como componente principal (figura 6). Se demuestra que un gen de 3-O-aciltransferasa IA-W4 en la información génica en la sec. 1 proporcionada por la presente divulgación participa en la biosíntesis de carrimicina. Debido al bloqueo del gen, las cepas mutantes pierden la función de acilar hidroxilo en posición 3 de un anillo de lactona de carrimicina.
Mediante experimentos de fermentación en otras cepas con bloqueo de gen y actividad antibacteriana y detección por HPLC de productos, se demuestra que las cepas bloqueadas ya no producen carrimicina activada. Se demuestra que la agrupación de genes en la sec. 1 proporcionada por la presente divulgación participa en la biosíntesis de carrimicina.
<Realización 3> Examen de cepas con bloqueo y transferencia de genes de bacterias productoras de carrimicina
3.1 Preparación de protoplasto:
Se inocularon esporas inclinadas recientes de bacterias productoras de carrimicina en medio de cultivo líquido R2YE y se agitaron durante 48 h a una temperatura de 28°C a una velocidad de 220 rpm. Se inoculó el fluido de cultivo a una tasa de inoculación del 10% en medio de cultivo líquido R2YE reciente que contenía glicina al 0,5% y se agitó durante 20 h a una temperatura de 28°C. Se tomaron 10 ml de disolución de bacterias en un tubo de centrífuga y se centrifugaron a una velocidad de 3.000 rpm para recoger micelio. Se lavó el micelio con tampón P.
Tris-HCI (pH 8,0) 1 mol/l 3,1 ml CaCI2-2H20 3,68 MgCÍ2-6H20 2,04 Sacarosa 103
Glucosa 1,0 Disolución de oligoelementos 2,0 ml pH 7,6
Se realizó una esterilización de 15 libras durante 30 min a una temperatura de 121°C.
Después de lavar dos veces, se suspendió el micelio con un volumen apropiado de tampón P, se añadió una disolución de tampón P con lisozima (la concentración final es de 2 mg/ml), se mezcló de manera uniforme y se incubó durante 30-45 min en un baño de agua a una temperatura de 37°C y se agitó una vez cada 10-15 min. Se observaron condiciones de formación de protoplasto con un microscopio de diferencia de fase de 10 X 40. Se detuvo la enzimólisis cuando el examen microscópico muestra que la mayor parte de los micelios han formado protoplasto. Después de filtrar a través de un algodón absorbente, se sometió el líquido de filtro a lavado centrífugo dos veces con tampón P. Finalmente, se suspendió el protoplasto con 1 ml de tampón P y se cargó la suspensión por separado en tubos de EP a 100 pl/tubo y se conservó a una temperatura de -70°C para su uso posterior.
3.2 Transformación de protoplasto mediante ADN de plásmido:
Se tomaron 100 pl de protoplasto y se añadieron a 10 pl de disolución de ADN de plásmido, se dio la vuelta a una pared de tubo para realizar una mezcla uniforme. Se añadieron rápidamente 400 pl de tampón P que contenía PEG-1000 al 25% (un producto de la empresa Britain Koch-light), se realizaron soplado-succión y mezclado uniforme y se colocó durante 5 min a temperatura ambiente. Se recubrió una placa plana de R2YE deshidratada con 200 pl de mezcla, se cultivó durante 20 h a una temperatura de 28°C, se cubrió con agua estéril con tsr 50 pg/ml, se cultivó durante 5-7 días a una temperatura de 28°C y se recogieron los transformantes.
3.3 Examen de cepas mutantes con bloqueo de gen
Se recogen los transformantes en un medio de cultivo que contiene 50 pg/ml de Tsr
Polvo de torta de semilla de soja 20 Glucosa 10 Almidón 30 CaC03 5,0 NaCI 4,0 agar 18
Se usa agua desionizada para la preparación y se realiza una esterilización de 15 libras durante 30 min a una temperatura de 121°C a un valor de pH natural.
Se realizó el cultivo durante 5-7 días a una temperatura de 28°C, se llevó a cabo el paso de 4-5 generaciones en un medio de cultivo no dosificado. Se separaron las monoesporas. Se examinaron las monoesporas de manera separada y correspondiente en un medio de cultivo que contenía Am (Am 50 pg/ml) para separar mediante examen cepas con bloqueo de gen que crecen en Am y no crecen en Tsr. Se escogieron cepas bloqueadas con expresión de marcador de resistencia estable, se extrajo el ADN de las cepas bloqueadas a partir de los genomas, se realizó la amplificación mediante PCR adoptando cebadores correspondientes en la realización 2 y se evaluó el bloqueo de gen correcto según tamaños de producto y secuenciación de ADN.
<Realización 4> Fermentación de bacterias productoras de carrimicina y cepas con bloqueo de gen y detección e identificación de actividad de producto

Claims (7)

REIVINDICACIONESAgrupación de genes de biosíntesis de carrimicina, que consiste en 44 genes que comprende:
1) cinco genes de policétido sintasa, incluyendo los residuos de orf1016215-10543 de SEQ ID NO 1, residuos de orf1121076-16328 de SEQ ID NO 1, residuos de orf1232511-21124 de SEQ ID NO 1, residuos de orf13 38599-32585 de SEQ ID NO 1, residuos de orf1452259-38643 de SEQ ID NO 1;
2) nueve genes relacionados con la unidad de extensión de la síntesis de policetona y modificación, incluyendo los residuos de orf1 1-645 de SEQ ID NO 1, residuos de orf43614-4840 de SEQ ID NO 1, residuos de orf54846-5511 de SEQ ID NO 1, residuos de orf67150-5801 de SEQ ID NO 1, residuos de orf1553099­ 54310 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3683164-82052 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3784400-83279 de SEQ ID NO 1, residuos de orf38 84713-84393 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3985576-84710 de SEQ ID NO 1;
3) dieciséis genes relacionados con la síntesis de glicosilo, incluyendo los residuos de orf9 10543-9830 de SEQ ID NO 1, residuos de orf16 54495-54845 de SEQ ID NO 1, residuos de orf1754842-56041 de SEQ ID NO 1, residuos de orf18 56038-56946 de SEQ ID NO 1, residuos de orf19 56930-57967 de SEQ ID NO 1, residuos de orf2057937-60174 de SEQ ID NO 1, residuos de orf21 60836-61984 de SEQ ID NO 1, residuos de orf2262796-62077 de SEQ ID NO 1, residuos de orf2467379-66318 de SEQ ID NO 1, residuos de orf26 69349-70650 de SEQ ID NO 1, residuos de orf28 72422-73462 de SEQ ID NO 1, residuos de orf29 74601­ 73561 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3378783-79775 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3479772-80779 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3582055-80823 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf41 87094-87702 de SEQ ID NO 1;
4) seis genes relacionados con la transferencia de glicosilo, incluyendo los residuos de orf7 8444-7179 de SEQ ID NO 1, residuos de orf89729-8482 de SEQ ID NO 1, residuos de orf3074913-76160 de SEQ ID NO 1, residuos de orf31 76218-77486 de SEQ ID NO 1, residuos de orf32 77606-78781 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf4085825-87042 de SEQ ID NO 1;
5) dos genes relacionados con la resistencia, incluyendo los residuos de orf3 3133-2285 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf2569004-67352 de SEQ ID NO 1;
6) cuatro genes relacionados con la regulación de la biosíntesis, incluyendo los residuos de orf2 1810-1208 de SEQ ID NO 1, residuos de orf2363633-65645 de SEQ ID NO 1, residuos de orf2772156-70708 de SEQ ID NO 1 y residuos de orf4289315-88143 de SEQ ID NO 1; y
7) dos genes, incluyendo un gen de marcador de ingeniería genética exógeno de residuos de orf43 866-60 de SEQ ID NO 2 y un gen de micarosa 4”-O-hidroxi-isovaleriltransferasa de residuos de orf442337-1174 de SEQ ID NO 2 unido a orf43;
orf43 y orf44 no están unidos a SEQ ID NO 1.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque los cinco genes de policétido sintasa codifican para una enzima de biosíntesis de policétido, la enzima de biosíntesis de policétido cataliza la síntesis de un anillo de lactona de 16 miembros de carrimicina, y
secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de los 5 genes de policétido sintasa de residuos de orf10 16215-10543 de SEQ ID NO 1, residuos de orf11 21076-16328 de SEQ ID NO 1, residuos de orf12 32511-21124 de SEQ ID NO 1, residuos de orf13 38599­ 32585 de SEQ ID NO 1, residuos de orf14 52259-38643 de SEQ ID NO 1 comprenden IA-W10 definido en SEQ ID NO 12, IA-W11 definido en SEQ ID NO 13, IA-W12 definido en SEQ ID NO 14, IA-W13 definido en SEQ ID NO 15 y IA-W14 definido en SEQ ID NO 16.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de los genes relacionados con la unidad de extensión de la síntesis de policetona y modificación incluyendo orf1, orf4-6, 15 y 36-39 comprenden IA-W1 definido en SEQ ID NO 3, iA-W4 definido en SEQ ID NO 6, IA-W5 definido en SEQ ID NO 7, IA-W6 definido en SEQ ID NO 8, IA-W15 definido en SEQ ID NO 17, IA-W36 definido en SEQ ID NO 38, IA-W37 definido en SEQ ID NO 39, IA-W38 definido en SEQ ID NO 40 y IA-W39 definido en SEQ ID NO 41.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de los genes relacionados con la síntesis de glicosilo incluyendo orf9, 16-22, 24, 26, 28, 29, 33-35 y 41 comprenden IA-W9 definido en SEQ ID NO 11, IA-W16 definido en SEQ ID NO 18, IA-W17 definido en SEQ ID NO 19, IA W18 definido en SEQ ID NO 20, IA-W19 definido en SEQ ID NO 21, IA-W20 definido en SEQ ID NO 22, IA-W21 definido en SEQ ID NO 23, IA-W22 definido en SEQ ID NO 24, IA-W24 definido en SEQ ID NO 26, IA-W26 definido en SEQ ID NO 28, IA-W28 definido en SEQ ID NO 30, IA-W29 definido en SEQ ID NO 31, IA-W33 definido en SEQ ID NO 35, IA-W34 definido en SEQ ID NO 36, IA-W35 definido en SEQ ID NO 37 y IA-W41 definido en SEQ ID NO 43.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de los genes relacionados con la transferencia de glicosilo incluyendo orf7, 8, 30-32 y 40 comprenden IA-W7 definido en SEQ ID NO 9, IA-W8 definido en SEQ ID NO 10, IA-W30 definido en SEQ ID NO 32, IA-W31 definido en SEQ ID NO 33, IA-W32 definido en SEQ ID NO 34 y IA-W40 definido en SEQ ID NO 42.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de los genes relacionados con la resistencia incluyendo orf3 y 25 comprenden IA-W3 definido en SEQ ID NO 5 y IA-W25 definido en SEQ ID NO 27.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias de los genes relacionados con la regulación de la biosíntesis incluyendo orf2, 23, 27 y 42 comprenden IA-W2 definido en SEQ ID NO 4, IA-W23 definido en SEQ ID NO 25, IA-W27 definido en SEQ ID NO 29 y IA-W42 definido en SEQ ID NO 44.
Agrupación de genes de biosíntesis según la reivindicación 1, caracterizada porque secuencias de aminoácidos correspondientes a secuencias de nucleótidos o secuencias complementarias del gen de marcador de ingeniería genética exógeno orf43 y el orf44 unido al orf43 comprenden IA-W43 definido en SEQ ID NO 45 y IA-W44 definido en SEQ ID NO 46.
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