ES2808659T3 - Bacterias mutantes para la producción de módulos generalizados para antígenos de membrana - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para preparar vesículas a partir de una bacteria gramnegativa en el que al menos una proteína que contiene un dominio catalítico LytM se inactiva comprendiendo una etapa de obtención de vesículas a partir de un cultivo de la bacteria, en el que: (a) la al menos una proteína que contiene un dominio catalítico de LytM se inactiva mediante una mutación de inactivación génica en la región codificante del gen o su promotor que: (i) reduce el nivel de ARNm que codifica la proteína al 0 % de aquel producido por la bacteria de tipo silvestre; o (ii) inhibe la traducción del ARNm que codifica la proteína al 0 % de aquel producido por la bacteria de tipo silvestre.

Description

DESCRIPCIÓN

Bacterias mutantes para la producción de módulos generalizados para antígenos de membrana

La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud PCT PCT/EP2013/058459 (presentada el 24 de abril de 2013).

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de las vesículas de bacterias gramnegativas, particularmente para su uso en composiciones inmunogénicas, por ejemplo, vacunas.

Antecedentes de la técnica

Las bacterias gramnegativas pueden liberar espontáneamente vesículas de sus membranas externas durante el crecimiento debido a la presión de turgencia de la envoltura celular. La formación de tales vesículas puede facilitarse mediante la interrupción de determinados componentes bacterianos, por ejemplo, las referencias 1 y 2 interrumpieron el sistema Tol-Pal de E. coli para proporcionar cepas que liberan vesículas en el medio de cultivo durante el crecimiento. Las vesículas también pueden producirse por la interrupción de bacterias enteras. Los procedimientos conocidos de producción de vesículas incluyen procedimientos que usan tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato) [3 y 4], procedimientos sin detergente [5] o sometimiento a ultrasonidos [6], etc. Estas vesículas (que generalmente se llaman ampollas y vesículas de la membrana externa (VME, del inglés outer membrane vesicles)) son ricas en células inmunogénicas asociadas a la superficie celular, antígenos periplásmicos y secretados y se han usado como vacunas, por ejemplo contra el serogrupo B de Neisseria meningitidis [7]. Son particularmente adecuados para este uso porque las vesículas contienen compuestos que actúan como adyuvantes, provocando fuertes respuestas inmunitarias contra los antígenos. De esta manera, las vesículas son un imitador más cercano de la bacteria nativa para el sistema inmunitario que las proteínas antigénicas purificadas u otros componentes bacterianos. Sin embargo, como las vesículas derivan de bacterias, por lo general, requieren tratamiento para eliminar los componentes bacterianos reactogénicos como la endotoxina. Esto puede lograrse mediante tratamiento con detergente. etc. [8].

Bemadac y col. 1998 y el documento WO 2013/006055 desvelan que la deleción de tolA da como resultado una producción aumentada de vesículas de membrana externa.

Es un objeto de la invención proporcionar componentes adicionales y mejorados para preparar estas vesículas, y en particular vesículas que pueden usarse como vacunas. Un objeto específico de la invención es proporcionar una bacteria gramnegativa que esté adaptada para la producción de las vesículas. Por ejemplo, la bacteria puede adaptarse para proporcionar un alto rendimiento de vesículas, vesículas con contenido y/o composición proteica alterada y vesículas con eficacia protectora cruzada mejorada.

En particular en relación con Haemophilus influenza, sigue siendo necesario proporcionar una vacuna que proteja contra un amplio espectro de cepas de Haemophilus influenzae. H. influenzae es un microorganismo versátil con una capacidad mejorada para adaptarse a nuevos nichos y provocar un amplio espectro de enfermedades. Los factores de aptitud, virulencia y colonización pueden cambiar para permitir que el microorganismo se adapte a diferentes tejidos y hospedadores. Por lo tanto, los antígenos potenciales están sujetos a una alta presión selectiva y, como resultado, puede tener variabilidad de secuencia entre diferentes cepas.

Divulgación

Las bacterias gramnegativas están separadas del medio externo por dos capas sucesivas de estructuras de membrana. Estas estructuras, denominadas la membrana citoplasmática y la membrana externa (ME), difieren tanto estructural como funcionalmente. La membrana externa juega un papel importante en la interacción de las bacterias patógenas con sus respectivos hospedadores. En consecuencia, las moléculas bacterianas expuestas en la superficie representan dianas importantes para la respuesta inmunitaria del hospedador, haciendo que los componentes de la membrana externa sean candidatos atractivos para proporcionar vacuna, reactivos diagnósticos y terapéuticos.

La presente divulgación describe que la mutación o deleción de uno o más genes que codifican polipéptidos que tienen en común el dominio catalítico LytM da como resultado un cambio drástico en la división celular bacteriana y el fenotipo bacteriano. Los inventores también han demostrado que dicha mutación o deleción da como resultado la liberación de vesículas conocidas como VME o vesículas de membrana externa, mientras que las mismas cepas NTHi de tipo silvestre normalmente no liberan VME.

Los presentes inventores han generado bacterias gramnegativas en las que se altera la expresión normal de proteínas que contienen un dominio catalítico LytM (es decir, la proteína está inactivada) y han observado que estas bacterias tienen propiedades que pueden ser ventajosas en la preparación de vesículas. Estas propiedades incluyen una mayor tendencia a formar vesículas y cambios en la naturaleza y/o cantidad de proteínas presentes en las vesículas resultantes. Se sabía en E. coli que dos componentes de la maquinaria de división con dominios LytM (EnvC y NlpD) son reguladores directos de las hidrolasas de la pared celular (amidasas) responsables de la separación celular (AmiA, AmiB y AmiC) [9]. También se sabe que las metaloproteasas LytM en E. coli son absolutamente necesarias para la separación de células hijas.

En una realización particularmente preferida, se describe que al eliminar NT013 y/o NT022 no solo se ve afectada la división celular bacteriana, sino también hay una sorprendente producción y liberación de vesículas de membrana externa (VME) en cepas NTHI, que normalmente no liberan VME.

En particular, se ha mostrado en Haemophilus influenzae no tipificable (NTHiJ que la deleción de NT013 provoca un aumento en la liberación de vesículas y cambios en el contenido de proteínas y/o composición de las vesículas resultantes, por ejemplo, en comparación con NHTi sin la deleción, como se muestra con más detalle a continuación. La deleción de NT017 en NTHi provoca cambios en el contenido de proteína y/o composición de las vesículas resultantes, por ejemplo, en comparación con NHTi sin la deleción, como se muestra con más detalle a continuación. La deleción de NT022 en NTHi provoca un aumento en la liberación de vesículas y cambios en el contenido de proteínas y/o composición de las vesículas resultantes, por ejemplo, en comparación con NHTi sin la deleción, como se muestra con más detalle a continuación.

La tasa de crecimiento de la bacteria mutada puede ser comparable a la tasa de crecimiento del tipo silvestre, a diferencia de la tasa de crecimiento del mutante TolR conocido.

La presente invención por lo tanto proporciona un procedimiento para preparar vesículas a partir de una bacteria gramnegativa en la que al menos una proteína que contiene un dominio catalítico LytM se inactiva comprendiendo una etapa de obtención de vesículas a partir de un cultivo de la bacteria, en la que:

(a) la al menos una proteína que contiene un dominio catalítico de LytM se inactiva por una mutación de inactivación génica en la región codificante del gen o su promotor que:

(i) reduce el nivel de ARNm que codifica la proteína al 0 % de aquel producido por la bacteria de tipo silvestre; o

(ii) inhibe la traducción del ARNm que codifica la proteína al 0 % de aquel producido por la bacteria de tipo silvestre.

Alternativa o adicionalmente, la al menos una proteína que contiene un dominio catalítico LytM se selecciona de una cualquiera de NT013, NT022 y NT017 de NTHi, en la que:

NT013 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o comparte una identidad de secuencia del 95 % con la SEQ ID NO: 1,

NT022 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o comparte una identidad de secuencia del 95 % con la SEQ ID NO: 5 y

NT017 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 o comparte una identidad de secuencia del 95 % con la SEQ ID NO: 3.

Alternativa o adicionalmente, la bacteria Gram-negativa se selecciona de H. influenzae no tipificable, N. meningitidis y B. pertussis.

Alternativa o adicionalmente, las vesículas no comprenden ninguna bacteria viva y/o entera.

Alternativa o adicionalmente, el procedimiento comprende la etapa adicional de mezclar vesículas con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La divulgación por lo tanto proporciona bacterias gramnegativas en las que al menos una proteína que contiene el dominio catalítico LytM está inactivada, y procedimientos para preparar vesículas a partir de la bacteria. La divulgación también proporciona las vesículas obtenidas u obtenibles de esta bacteria y composiciones inmunogénicas que comprenden estas vesículas. Las composiciones inmunogénicas pueden usarse en particular como vacunas.

Por lo tanto la divulgación proporciona una bacteria gramnegativa en la que al menos un dominio catalítico de LytM que contiene proteína está inactivado. En una realización esto da como resultado una bacteria que, durante el crecimiento en medio de cultivo, libera mayores cantidades de vesículas en el medio y/o vesículas que tienen una composición de proteína diferente a la misma bacteria en la que la proteína que contiene un dominio catalítico LytM está activo. Opcionalmente la al menos una proteína que contiene un dominio catalítico de LytM no se expresa. La divulgación también proporciona una bacteria gramnegativa en la que una o más proteínas que contienen el dominio catalítico de LytM tienen una modificación tal que, durante el crecimiento en medio de cultivo, la bacteria libera mayores cantidades de vesículas en el medio que la misma bacteria que carece de la modificación y/o vesículas que tienen un contenido y/o composición de proteína diferente a la misma bacteria que carece de la modificación.

En particular, la presente divulgación, también proporciona una bacteria NTHi en la que uno o más de los antígenos de la divulgación (por ejemplo, NT013, NT017 y NT022) se ha/se han inactivado génicamente [10]. Las técnicas para producir bacterias de inactivación génica son bien conocidas y se ha informado la inactivación de genes de cepas NTHi, es decir, en la Ref. 11.

La divulgación también proporciona una bacteria NTHI en la que uno o más de los antígenos de la divulgación (por ejemplo, NT013, NT017 y NT022) tiene una mutación que inhibe su actividad. El gen que codifica el antígeno tendrá una mutación que cambia la secuencia de aminoácidos codificada o anula su expresión. La mutación puede implicar deleción, sustitución y/o inserción, cualquiera de las cuales puede implicar uno o más aminoácidos.

Una realización proporciona deleciones de uno o más genes que codifican antígenos de la divulgación (por ejemplo, NT013, NT017 y NT022).

En una realización, la presente divulgación proporciona genes NTHI que codifican polipéptidos que tienen el dominio catalítico LytM. Generalmente las metaloproteasas se identifican en que contienen dominios de aminoácidos HxH y HxxxD en sus dominios catalíticos. Preferentemente, estos uno o más genes codifican uno cualquiera de NT013, NT022 o NT017.

Las realizaciones preferidas proporcionan cepas de NTHI en las que las deleciones de uno o más genes codifican una cualquiera de NT013 o NT022 o NT017. Por ejemplo, los genes eliminados pueden sustituirse con un casete de resistencia a antibióticos, tal como el casete de resistencia a la eritromicina. Se ha descubierto que todos los polipéptidos mencionados anteriormente tienen en común un dominio catalítico de LytM y son todos metaloproteasas.

También se ha descubierto que el dominio LytM en NT013 y NT022 está conservado. El sitio catalítico activo NT013 está representado por los siguientes motivos de aminoácidos -HKGD- y -HLH- en la porción C-terminal del sitio activo catalítico NT022 está representado por los siguientes motivos de aminoácidos -NKGID- y -KLH- en el C-terminal.

La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una bacteria gramnegativa, que comprende una etapa de modificación del gen o genes que codifican una o más proteínas que contienen el dominio catalítico de LytM de tal manera que la modificación provoque que la bacteria, cuando se cultiva en medio de cultivo, libere mayores cantidades de vesículas en el medio que la bacteria inicial y/o vesículas que tienen un contenido y/o composición de proteína diferente a la bacteria inicial. La etapa de mutación puede inactivar (por ejemplo, mutar o eliminar) el gen.

Las bacterias mutantes de la descripción son particularmente útiles para preparar vesículas de membrana externa bacterianas que incluyen antígenos NTHi (por ejemplo, antígenos de la divulgación (por ejemplo, NT013, NT017 y NT022)) y que pueden usarse como inmunógenos.

También se proporciona un procedimiento para producir una bacteria NTHi que sobreproduce VME de la divulgación, cuyo procedimiento comprende modificar genéticamente una cepa bacteriana gramnegativa mediante uno o más de los siguientes procedimientos: (a) diseñar por ingeniería genética la cepa para regular negativamente la expresión de uno o más genes Tol; y (b) mutar uno o más gen o genes que codifican una proteína que comprende un sitio asociado a peptidoglucano para atenuar la actividad de unión a peptidoglucano de la proteína o proteínas; (c) por mutación o deleción de uno o más genes que codifican polipéptidos que tienen en común el dominio catalítico LytM. En una realización particularmente preferida, el NTHi podría no expresar genes NT013, NT022 y/o cualquiera de los genes Tol activos [11], [10]. En una realización, la modificación es mutación o deleción de uno o más genes que codifican polipéptidos que tienen en común el dominio catalítico LytM.

La divulgación también proporciona una vesícula aislada u obtenible de una bacteria de la divulgación, por ejemplo, usando cualquiera de los procedimientos mencionados en el presente documento. Estas vesículas son útiles como componentes de vacunas.

La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una bacteria gramnegativa, por ejemplo, una vesícula de NTHi, que comprende una etapa de tratar una bacteria gramnegativa, por ejemplo, NTHi de la divulgación de tal manera que su membrana externa forme vesículas.

La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una bacteria gramnegativa, por ejemplo, una vesícula de NTHi, que comprende una etapa de cultivar una bacteria gramnegativa, por ejemplo, NTHi de la divulgación en condiciones en las que su membrana externa arroja vesículas espontáneamente.

La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar vesículas, que comprende una etapa de separación de las vesículas de un medio de cultivo que comprende bacterias de la divulgación que se han cultivado en condiciones que permiten la liberación de vesículas en el medio por la bacteria. Las vesículas preparadas por este procedimiento pueden usarse como componentes de composiciones farmacéuticas que incluyen vacunas.

La divulgación también proporciona un medio de cultivo que comprende bacterias de la divulgación que se han cultivado en condiciones que permiten la liberación de vesículas en el medio por la bacteria. Las vesículas pueden purificarse a partir de este medio de cultivo.

La divulgación también proporciona una composición que comprende vesículas que, durante el cultivo de bacterias de la divulgación, se liberan en el medio de cultivo. Esta composición no comprende ninguna bacteria viva y/o entera. Esta composición y/o sus componentes pueden usarse para la preparación de vacunas.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden vesículas de la divulgación pueden usarse en medicina, por ejemplo, en procedimientos de tratamiento o prevención de infecciones y en procedimientos para generar una respuesta de anticuerpos.

La divulgación también proporciona una composición que comprende vesículas, en la que las vesículas están presentes en el filtrado obtenible después de la filtración a través de un filtro de 0,22 pm de un medio de cultivo en el que se ha cultivado una bacteria de la divulgación. Esta composición y/o sus componentes pueden usarse para la preparación de vacunas.

Proteínas que contienen el dominio LytM

De acuerdo con la divulgación, una o más proteínas que contienen el dominio LytM se modifican en una bacteria gramnegativa. Típicamente esto es inactivación (por ejemplo, por mutación o deleción). Esto puede hacer que la bacteria se libere durante el crecimiento en el medio de cultivo (i) mayores cantidades de vesículas y/o (ii) vesículas que tienen un contenido y/o composición de proteínas diferente, que la misma bacteria en la que el dominio catalítico LytM que contiene proteína está activo. Pueden hacerse diversas modificaciones.

Las metaloproteasas del tipo lisostafina (LytM) de las peptidasas están ampliamente distribuidas, produciéndose en bacteriófagos, en bacterias grampositivas y gramnegativas. Las metaloproteasas que contienen el dominio catalítico LytM pertenecen a la familia de la peptidasa M23 [12], este dominio se identificó por primera vez en una autolisina secretada de Staphylococcus aureus [13].

Los dominios LytM y, por lo tanto, la proteína que contiene el dominio LytM pueden identificarse en general basado en la identidad de secuencia con los dominios LytM de proteínas conocidas que contienen el dominio LytM tales como EnvC, NIpD y YebA de E. coli, NT013, NT017 o NT022 de Haemophilus influenza no encapsulado (no tipificable).

Un dominio LytM de esta manera tiene típicamente al menos el 30, el 40, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de cualquiera de los LytM dominios a los que se hace referencia en el presente documento. Una proteína que contiene un dominio LytM contiene un dominio LytM. Se proporcionan ejemplos de secuencias para dominios LytM y proteínas que contienen dominios LytM a continuación.

El antígeno NT013 se anota como proteína que contiene repetición de TPR y también como subunidad de hemo liasa de maduración de citocromo c CcmH2. Se ha lanzado como NTHI0532 en la cepa 86-028NP. NT013 se ha anotado como perteneciente a la familia de proteínas metaloproteasas y tiene un dominio catalítico LytM.

El antígeno NT013 tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal nativa 42 (aminoácidos 1 a 42 de la SEQ ID NO: 1). El antígeno NT013 sin la secuencia de aminoácidos N-terminal nativa 42 está representado por la SEQ ID NO: 85.

El antígeno NT017 se ha anotado como proteína de supervivencia proteína similar a SurA NTHI0915 en la cepa 86-026NP.

El antígeno NT017 tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal nativa 20 (aminoácidos 1 a 20 de la SEQ ID NO: 3). El antígeno NT017 sin la secuencia de aminoácidos N-terminal nativa 42 está representado por la SEQ ID NO: 86.

El antígeno NT022 se ha anotado como NTHI0830 de la cepa NP86-028 y se ha identificado que es una posible lipoproteína B antigénica de la membrana externa. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176. También se ha descubierto que contiene un dominio catalítico de LytM y que está expuesto y secretado en la superficie.

El antígeno NT022 tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal nativa 18 (aminoácidos 1 a 18 de la SEQ ID NO: 5). El antígeno NT022 sin la secuencia de aminoácidos N-terminal nativa 18 está representado por la SEQ ID NO: 87.

Los homólogos de las proteínas que contienen el dominio LytM se encuentran en diversas bacterias gramnegativas y los ejemplos se exponen en la tabla a continuación:

Los dominios LytM pueden contener el motivo HxxxD (SEQ ID NO: 13) y/o HxH, por ejemplo, HKGVD (SEC ID NO: 14), HRGVD (SEQ ID NO: 15), HTGID (SEQ ID NO: 16), HLH. Otros motivos específicos incluyen NKGVD (SEQ ID NO: 17), TKGID (SEQ ID NO: 18), NKGID (SEQ ID NO: 19), QLH, RLH, KLH, WKGVF (SEQ ID NO: 20), WRGLV (SEQ ID NO: 21), WKGMV (SEQ ID NO: 22), GLY, SLY, ALY.

Los antígenos NTHi, es decir, las proteínas, se definen anteriormente por referencia a convenciones de nomenclatura de las referencias, por ejemplo, la numeración "NTHI" (del genoma de la cepa 86-028NP). Tales convenciones se explican con más detalle en la referencia 14 (particularmente la Tabla 1). Por lo tanto puede encontrarse fácilmente una secuencia de aminoácidos y nucleótidos ejemplar para cualquiera de los antígenos, es decir, proteínas a las que se hace referencia en el presente documento, en bases de datos de secuencias públicas para las cepas indicadas (junto con información adicional, tal como anotaciones funcionales), pero la divulgación no se limita a secuencias de la cepa 86-028NP. Las secuencias del genoma de varias otras cepas de NTHI están disponibles (nuevamente, véase la Tabla 1 de la referencia 14). Las técnicas de búsqueda y alineación convencionales pueden usarse para identificar en cualquiera de estas (u otras) secuencias genómicas adicionales el homólogo de cualquier secuencia particular dada en el presente documento. Además, las secuencias disponibles pueden usarse para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias homólogas de otras especies y cepas. Por lo tanto la divulgación no se limita a estas especies y cepas específicas o las cepas en las que se encuentran las secuencias ejemplificadas, sino que abarca tales variantes y homólogos de otras gramnegativas, por ejemplo, cepas NTHI y el uso de especies y cepas en las que se encuentran tales variantes y homólogos, así como variantes no naturales. En general, las variantes adecuadas de una SEQ ID NO particular incluyen sus variantes alélicas, sus formas polimórficas, sus homólogos, sus ortólogos, sus parálogos, sus mutantes, etc. En realizaciones de la divulgación, una proteína que contiene un dominio LytM es un homólogo, ortólogo o parálogo de NT013, NT022 o NT017 de NTHi.

De esta manera, por ejemplo, los polipéptidos o proteínas usados con la divulgación, es decir, modificados en el transcurso de la divulgación pueden, en comparación con las SEQ ID NO en el presente documento, incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido por otro aminoácido que tenga una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica. Los polipéptidos, es decir, proteínas, también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) deleciones de aminoácidos individuales en relación con las secuencias SEQ ID NO. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con las secuencias SEQ ID NO.

De forma similar, un polipéptido usado con la divulgación, es decir, modificado en el transcurso de la fabricación de la divulgación, puede comprender una secuencia de aminoácidos que:

(a) es idéntica (es decir, un 100 % idéntica) a una secuencia desvelada en el listado de secuencias;

(b) comparte identidad de secuencia (por ejemplo, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 %, el 99,5 % o más) con una secuencia desvelada en el listado de secuencias;

(c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación con las secuencias de (a) o (b); y/o

(d) cuando se alinea con una secuencia particular del listado de secuencias usando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana en movimiento de x aminoácidos del extremo N al extremo C (de tal forma que para un alineamiento que se extiende hasta p aminoácidos, siendo p>x, hay p-x+1 ventanas de este tipo) tiene al menos x y aminoácidos idénticos alineados, en la que: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x y no es un número entero entonces se redondea al alza al número entero más próximo. El algoritmo de alineamiento por pares preferido es el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch [15], que usa parámetros por defecto (por ejemplo con una penalización por apertura de hueco = 10,0, y con una penalización por extensión de hueco = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [16].

Dentro del grupo (c), las deleciones o sustituciones pueden encontrarse en el extremo N y/o el extremo C o puede encontrarse entre los dos extremos. Por lo tanto un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden implicar la eliminación de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C. El truncamiento del extremo N puede retirar los péptidos líderes, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un hospedador heterólogo. El truncamiento del extremo C puede retirar las secuencias de anclaje, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un hospedador heterólogo.

En general, cuando un antígeno comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia del listado de secuencias tal como una secuencia NTHI (por ejemplo, cuando comprende una lista de secuencias con <100% de identidad de secuencia a la misma, o cuando comprende un fragmento de la misma) se prefiere en cada caso individual de que el antígeno pueda provocar un anticuerpo que reconoce la secuencia NTHI respectiva del listado de secuencias.

En algunas realizaciones, la proteína que contiene LytM se selecciona de NT013 y NT022 de NTHi o un homólogo, ortólogo o parálogo de los mismos.

En algunas realizaciones, la proteína que contiene LytM es NT017 de NTHi o un homólogo, ortólogo o parálogo de los mismos.

La bacteria

La bacteria gramnegativa de la divulgación es típicamente una cepa de Haemophilus influenzae no encapsulada (no tipificable) (NTHi). Sin embargo, puede ser una bacteria gramnegativa diferente, incluyendo Neisseria meningitidis (especialmente el serogrupo B) y B. pertussis. En algunas realizaciones, la bacteria gramnegativa de la divulgación no es una cepa de Haemophilus influenzae no encapsulada (no tipificable).

Las especies ejemplares para su uso en la divulgación incluyen especies en cualquiera de los géneros Escherichia, Shigella, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Chlamydia, Haemophilus, Legionella, Pseudomonas, Yersinia, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, Campylobacter, Klebsiella, etc. En particular, la bacteria puede ser una especie de Shigella (tales como S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii o S. sonnei). Alternativamente, puede ser una especie de Neisseria, por ejemplo, una especie no patógena tales como N. bacilliformis, N. cinerea, N. elongata, N. flavescens, N. lactamica, N. macacae, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca o N. subflava y en particular N. lactamica. Alternativamente, puede usarse una especie patógena de Neisseria, por ejemplo, N. gonorrhoeae o N. meningitidis. En otros ejemplos, la bacteria puede ser Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae (incluyendo las cepas no tipificables), Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, Salmonella enterica (incluyendo las serovariedades typhi y typhimurium, así como las serovariedades paratyphi y enteritidis), Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, Klebsiella pneumoniae, Proteus (por ejemplo Proteus mirabilis), Citrobacter, Serratia (por ejemplo Serratia marcescens), Erwinia, Pasteurella, Yersinia pesti, E. coli etc. También pueden usarse bacterias gramnegativas fotosintéticas. Normalmente, la bacteria es una cepa competente. Esta característica facilita la modificación genética de la bacteria.

Las bacterias gramnegativas pueden definirse en función de su forma, como cocos, bacilos o cocobacilos y la bacteria puede ser de esta manera un coco, bacilo o cocobacilo gramnegativo.

La bacteria gramnegativa es opcionalmente una proteobacteria, por ejemplo, perteneciente a una clase seleccionada de Alfaproteobacterias, Betaproteobacterias, Gammaproteobacterias, Deltaproteobacterias, Epsilonproteobacterias o Aciditio-bacilos. La bacteria gramnegativa opcionalmente no pertenece a una clase seleccionada de Alfaproteobacterias, Betaproteobacterias, Gammaproteobacterias, Deltaproteobacterias, Epsilonproteobacterias o Aciditiobacilos.

En algunas realizaciones la bacteria coloniza a los humanos. En algunas realizaciones la bacteria es patógena en humanos.

En algunas realizaciones, la bacteria produce vesículas cuando se cultiva en condiciones normales de cultivo. En otras realizaciones, la bacteria no produce vesículas cuando se cultiva en condiciones normales de cultivo.

En algunas realizaciones la bacteria no es del género Caulobacter, por ejemplo no es Caulobacter crescentus. En algunas realizaciones la bacteria no es del género Escherichia, por ejemplo no es E. coli. En algunas realizaciones la bacteria no es del género Helicobacter, por ejemplo no es H. pylori. En algunas realizaciones la bacteria no es del género Neisseria por ejemplo no es N.gonorrhoeae o no es N. meningitidis. En algunas realizaciones la bacteria no es del género Yersinia por ejemplo no es Yersinia pestis. En algunas realizaciones la bacteria no es del género Yersinia por ejemplo no es Yersinia pestis. En algunas realizaciones la bacteria no es H. somni.

En algunas realizaciones la bacteria está en la clase Betaproteobacterias y la proteína que contiene LytM se selecciona de NT013, NT017 y NT022, opcionalmente seleccionado de NT017 y NT022 de NTNi, o un homólogo, ortólogo o parálogo de los mismos.

En algunas realizaciones la bacteria es un cocobacilo gramnegativo y la proteína que contiene LytM se selecciona de NT013, NT017 y NT022, opcionalmente seleccionado de NT013 y nT017 de NTNi, o un homólogo, ortólogo o parálogo de los mismos.

En algunas realizaciones la bacteria es un coco gramnegativo y la proteína que contiene LytM se selecciona de NT013, NT017 y NT022, opcionalmente seleccionado de NT017 y NT022 de NTNi, o un homólogo, ortólogo o parálogo de los mismos.

Cuando la bacteria es Neisseria meningitidis la proteína que contiene LytM puede seleccionarse, por ejemplo, de NMB1483, NMB0315 y NMB1333.

Cuando la bacteria es B. pertussis la proteína que contiene LytM puede seleccionarse, por ejemplo, de BP1721, BP2956, BP0608, BP2919, BP3015 y BP1017.

Otras mutaciones

Además de tener una proteína que contiene un dominio catalítico de LytM interrumpido, una bacteria gramnegativa de la divulgación puede incluir ventajosamente uno o más cambios adicionales con respecto a una cepa de tipo silvestre. Estos cambios pueden usarse, por ejemplo, para retirar componentes de la bacteria que serían tóxicos o indeseables en una vacuna humana.

La bacteria también puede contener otras adaptaciones para la producción de vesículas. En particular, la bacteria típicamente comprende un genoma en el que una o más secuencias están presentes de manera que, en comparación con la misma bacteria sin dicha secuencia o secuencias, la bacteria produce mayores cantidades de vesículas. Las secuencias que aumentan la producción de vesículas pueden identificarse añadiendo o eliminando la secuencia a una cepa productora de vesículas y determinando el efecto sobre la producción de vesículas. Los ejemplos incluyen la inactivación o deleción de cualquiera de los genes Tol [10,11].

Por ejemplo, puede haber modificaciones adicionales, por ejemplo, inactivaciones génicas en uno o más de lpxL1, IgtB, porA, frpB, synX, IgtA, mltA y/o Ist.

En algunas realizaciones una bacteria puede incluir una o más de las mutaciones de inactivación y/o hiperexpresión desveladas en las referencias 17 y 18-20. Los genes adecuados para la modificación incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB [18]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA y/o TbpB; y (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB y/o SynC.

Una bacteria puede tener una o más, o todas, de las siguientes características: (i) LgtB y/o GalE regulados negativamente para truncar el LOS; (ii) TbpA regulado positivamente; (iii) NhhA regulado positivamente; (iv) Omp85 regulado positivamente; (v) LbpA regulado positivamente; (vi) NspA regulado positivamente; (vii) PorA inactivado; (viii) FrpB regulado negativamente o inactivado; (ix) Opa regulado negativamente o inactivado; (x) Opc regulado negativamente o inactivado; (xii) complejo del gen cps eliminado. Un LOS truncado puede ser uno que no incluya un epítopo de sialil-lacto-N-neotetraosa, por ejemplo, podría ser un LOS deficiente en galactosa. El LOS puede no tener cadena a.

Dichas mutaciones se han descrito particularmente en Neisseria meningitidis.

Antígenos adicionales

Opcionalmente, la bacteria comprende un genoma en el que una o más secuencias están presentes de manera que, en comparación con la misma bacteria sin dichas secuencias, la bacteria produce vesículas que comprenden uno o más antígenos adicionales. Estos antígenos adicionales normalmente no se encuentran en la bacteria en su correspondiente cepa de tipo silvestre. Por ejemplo, el antígeno o antígenos adicionales pueden ser uno o más antígenos proteicos de una bacteria seleccionada de Neisseria meningitidis (especialmente el serogrupo B), E. coli patógeno, Vibrio cholera, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae. Otras bacterias adecuadas incluyen Bacillus anthracis, Shigella, Chlamydia, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium ulcerans, Streptococcus, Pseudomonas, Shigella, Campylobacter, Salmonella (por ejemplo Salmonella typhimurium), Yersinia (por ejemplo Yersinia pestis), Rickettsia prowazekii, Neisseria, Clostridium botulinum y Helicobacter. De forma similar, el antígeno o antígenos adicionales pueden ser uno o más antígenos proteicos víricos, tales como un antígeno de un virus de la familia Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papovaviridae, Rhabdoviridae o Togaviridae, por ejemplo, un antígeno del VIH o la gripe. El antígeno o antígenos adicionales pueden ser uno o más antígenos proteicos de cualquier patógeno. El antígeno o antígenos adicionales también pueden ser uno o más antígenos de células cancerosas, por ejemplo, una o más oncoproteínas. Por lo tanto, las vesículas de la bacteria pueden usarse como un sistema de administración para presentar los antígenos adicionales al sistema inmunitario. La una o más secuencia o secuencias presentes en el genoma son, por lo tanto, capaces de dirigir la expresión del antígeno o antígenos adicionales en las vesículas. La secuencia o secuencias pueden estar integradas en el cromosoma bacteriano o pueden estar presentes en elemento o elementos genómicos no integrados, por ejemplo, plásmido o plásmidos. Por ejemplo, es eficiente incluir la secuencia o secuencias dentro de uno o más vectores de expresión de tal manera que sea posible controlar la expresión en la bacteria. Por ejemplo, cada secuencia puede estar en un casete de expresión adecuado. Normalmente, las secuencias incluirán genes que codifican los antígenos adicionales, junto con cualquier secuencia reguladora requerida para la expresión eficaz en las vesículas (es decir, promotores, secuencias señal, chaperones, maquinaria de vía de secreción etc.). La persona experta conoce los procedimientos para dicha expresión génica heteróloga en bacterias gramnegativas, particularmente E. coli, y también cómo dirigir esta expresión para que las proteínas heterólogas estén presentes en las vesículas (véanse, por ejemplo, las ref. 21, 22, 23 etc.). Por ejemplo, las proteínas pueden fusionarse con los péptidos líderes apropiados para la compartimentación periplásmica. Cuando una proteína se dirige al periplasma de esta manera, puede ser útil romper las vesículas, por ejemplo, usando sometimiento a ultrasonidos y/o detergente, antes de la administración como una vacuna. Esto ayuda a liberar la proteína de la vesícula, mientras se conserva la adyuvancia de los otros componentes de la vesícula. De forma similar, las proteínas pueden fusionarse con secuencias líderes seguidas de una "caja de lipidación" para la compartimentación en la membrana interna y/o externa como lipoproteínas. Cuando una proteína se dirige a una membrana de esta manera, normalmente estará orientado dentro o fuera de la vesícula. Esta orientación puede cambiarse por la acción de mecanismos endógenos "flip/flop", por ejemplo, en especies de Neisseria. Las proteínas también pueden fusionarse con regiones transmembrana y/o fusionarse con proteínas de membrana endógenas, por ejemplo, porinas, para la compartimentación de antígenos en la membrana externa. La eficiencia de expresión también puede optimizarse modificando el uso de codones en las secuencias para que coincida con las preferencias de la bacteria gramnegativa (ref. 24).

Preparación de mutantes

Las bacterias gramnegativas de la divulgación pueden prepararse convenientemente a partir de cepas de tipo silvestre u otras cepas iniciales usando técnicas convencionales de mutagénesis. La modificación (por ejemplo, la inactivación) de la proteína o gen que contiene el dominio LytM puede lograrse de varias maneras, por ejemplo, por deleción o mutación en su promotor, por deleción o mutación de su codón de inicio, mediante la introducción de un codón de parada prematuro, por deleción de la parte completa o parcial (por ejemplo, al menos el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 %) de la región codificante, por inactivación génica, etc. Se prefieren mutantes inactivados isogénicos. Una mutación de inactivación génica puede estar situada en la región codificante del gen o puede estar dentro de sus regiones de control transcripcional (por ejemplo, dentro de su promotor). Una mutación de inactivación génica reducirá el nivel de ARNm que codifica el antígeno al <1 % del producido por la bacteria de tipo silvestre, preferentemente <0,5 %, más preferentemente <0,1 % y lo más preferentemente al 0 %. En el ARNm de la bacteria gramnegativa resultante que codifica el gen deseado está ausente y/o su traducción está inhibida (por ejemplo, típicamente a menos del 1 % de los niveles de tipo silvestre, preferentemente <0,5 %, más preferentemente <0,1 % y lo más preferentemente al 0 %).

Una bacteria gramnegativa la de la divulgación puede contener un gen marcador en el o en lugar del gen inactivado, por ejemplo, un antibiótico, por ejemplo, marcador de resistencia a eritromicina. Esto puede lograrse usando recombinación homóloga. También pueden usarse deleciones sin marcar (es decir, deleción sin la introducción de un gen marcador).

En algunas realizaciones, al menos un dominio LytM que contiene proteína está inactivado, por ejemplo, de tal manera que no lleva a cabo su función normal, o lo hace a un nivel reducido. Esto puede surgir a través de la reducción en la cantidad de proteína que se expresa y/o por una reducción en la actividad de la proteína expresada. Por lo tanto, puede haber inactivación (por ejemplo, por mutación o una deleción) en el gen que codifica la proteína. En una realización, la proteína que contiene el dominio LytM se expresa a un nivel de menos del 90, el 80, el 70, el 60, el 50, el 40, el 30, el 20, el 10, el 5, el 2, el 1 % del nivel al que se expresa la proteína no modificada. La proteína que contiene el dominio LytM puede no expresarse. En una realización, la actividad de la proteína que contiene el dominio LytM expresado es menos del 90, el 80, el 70, el 60, el 50, el 40, el 30, el 20, el 10, el 5, el 2, el 1 % de la actividad de la proteína no modificada. La proteína que contiene el dominio LytM puede no ser funcional.

En algunas realizaciones, pueden hacerse mutaciones y/o deleciones en el dominio LytM. Pueden elegirse mutaciones y/o deleciones que hacen que el dominio LytM y/o la proteína que contiene el dominio LytM no sea funcional, o con una función reducida, como se define anteriormente.

Alternativamente, la deleción o mutación puede reducir la actividad o función de la proteína que contiene el dominio LytM. La deleción o mutación puede estar en el dominio LytM o en otra parte de la proteína. Por ejemplo la deleción o mutación puede dar como resultado una proteína expresada que carece de uno o más de un dominio (por ejemplo, que carece del dominio LytM). El procedimiento de preparación de una cepa gramnegativa, por ejemplo, adecuado para la preparación de vesículas puede estar seguido de una etapa de cultivo de las bacterias modificadas obtenidas para proporcionar un cultivo bacteriano.

Las condiciones de cultivo para el crecimiento de bacterias gramnegativas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden cultivarse usando una fuente de nitrógeno orgánico (tales como mezclas de aminoácidos, por ejemplo, que contienen Ala, Arg, Asn, Asp; casaminoácidos, pueden usarse), glicerol como una fuente de carbono, etc. La inclusión de ácido L-aspártico en el medio es particularmente útil y puede funcionar tanto como fuente de nitrógeno como de carbono.

Procedimientos para producir las vesículas

La divulgación también proporciona procedimientos para preparar vesículas de la divulgación y vesículas obtenidas u obtenibles por estos procedimientos. El procedimiento comprende una etapa para obtener vesículas de un cultivo de bacterias. Las vesículas pueden obtenerse por ruptura o formación de ampollas de la membrana externa de la bacteria para formar vesículas a partir de ellas. Por lo tanto, el término "vesículas" típicamente significa VME, ampollas, microvesículas (MV [25]) y 'VME nativas' ('VMEN' [26]). Por lo general, también puede significar VME extraídas con detergente (VMED) y VME derivadas de mutantes (m-VME). La expresión "módulo generalizado para antígenos de membrana" puede usarse para vesículas obtenidas de bacterias mutantes.

De esta manera las vesículas pueden obtenerse cultivando una bacteria apropiada, por ejemplo, la bacteria de la divulgación en condiciones que permitan la liberación de vesículas, y un procedimiento de preparación de vesículas a partir de la bacteria de la divulgación puede comprender o comprender adicionalmente cultivar una bacteria apropiada, por ejemplo, la bacteria de la divulgación en condiciones que permitan la liberación de vesículas.

Las ampollas (incluyendo las VM) son vesículas de membrana de origen natural que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y se liberan al medio de cultivo. Preferentemente, las vesículas de la divulgación son ampollas porque la separación de ampollas liberadas espontáneamente del medio de cultivo es más conveniente que los procedimientos que implican la interrupción deliberada de la membrana externa (por ejemplo, por tratamiento con detergente o sometimiento a ultrasonidos). Además, están sustancialmente libres de membrana interna y contaminación citoplasmática. Estas vesículas típicamente tienen un diámetro de 35-120 nm o 20-100 nm por microscopía electrónica, por ejemplo, un diámetro de 50 nm y pueden purificarse del medio de cultivo. La purificación idealmente implica separar las vesículas de las bacterias vivas y/o intactas, por ejemplo, mediante filtración basada en el tamaño usando un filtro, tal como un filtro de 0,22 pm, que permite que las vesículas pasen a través pero no permite el paso de bacterias intactas, o mediante el uso de centrifugación a baja velocidad para sedimentar las células mientras se dejan las vesículas en suspensión. Un procedimiento preferido que implica un procedimiento de filtración de dos etapas se describe en la ref. 27.

Por lo tanto, a diferencia del medio de cultivo, las composiciones que contienen vesículas de la divulgación generalmente estarán sustancialmente libres de bacterias enteras, ya sea vivas o muertas. El tamaño de las vesículas significa que pueden separarse fácilmente de bacterias enteras por filtración, por ejemplo, como se usa típicamente para la esterilización por filtración. Aunque las vesículas pasarán por un filtro convencional de 0,22 pm, estos pueden obstruirse rápidamente por otro material, por lo que puede ser útil realizar etapas secuenciales de esterilización por filtración a través de una serie de filtros de tamaño de poro decreciente antes de usar un filtro de 0,22 pm. Ejemplos de filtros anteriores serían aquellos con un tamaño de poro de 0,8 pm, 0,45 pm, etc.

En algunas realizaciones las VME pueden prepararse artificialmente a partir de bacterias y pueden prepararse usando tratamiento con detergente (por ejemplo, con desoxicolato o sarkosilo) o por medios no detergentes (por ejemplo, véase la referencia 28). Las técnicas para formar vesículas incluyen el tratamiento de bacterias con un detergente de sal de ácido biliar (por ejemplo, sales de ácido litocólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., prefiriéndose el desoxicolato sódico [29 y 30] para tratar Neisseria) a un pH suficientemente alto para no precipitar el detergente [31]. Otras técnicas pueden realizarse sustancialmente en ausencia de detergente [28] usando técnicas tales como sometimiento a ultrasonidos, homogeneización, microfluidización, cavitación, choque osmótico, trituración, prensa francesa, combinación, etc. Los procedimientos que no usan detergente o con bajo contenido pueden retener antígenos útiles como NspA [28]. Por lo tanto, un procedimiento puede usar un tampón de extracción de VME con aproximadamente un 0,5 % de desoxicolato o inferior, por ejemplo, aproximadamente el 0,2 %, aproximadamente el 0,1 %, <0,05 % o cero.

Un procedimiento útil para la preparación de vesículas se describe en la referencia 32 e implica la ultrafiltración en VME brutas, en lugar de una centrifugación a alta velocidad. El procedimiento puede implicar una etapa de ultracentrifugación después de que tenga lugar la ultrafiltración.

Por lo tanto, las vesículas pueden obtenerse tratando una bacteria gramnegativa apropiada, por ejemplo, una bacteria de la divulgación de manera que su membrana externa forme vesículas y un procedimiento de preparación de vesículas a partir de la bacteria de la divulgación puede comprender o comprender adicionalmente tratar una bacteria gramnegativa apropiada, por ejemplo, una bacteria de la divulgación de manera que su membrana externa forme vesículas.

Liberación de grandes cantidades de vesículas

Se ha demostrado que los mutantes NHTi en los que NT013 o NT022 están inactivados liberan mayores cantidades de vesículas que el NTHi de tipo silvestre.

La bacteria de la divulgación en una realización puede liberar mayores cantidades de vesículas en el medio de cultivo, en comparación con la misma bacteria en la que la proteína que contiene el dominio catalítico LytM está activa. Esto puede ser un aumento de al menos el 10, el 20, el 50, el 100, el 150, el 200, el 250, el 500, el 600, el 700, el 800, el 900, el 1000 % en comparación con la misma bacteria en la que está activa la proteína que contiene el dominio catalítico LytM.

Alternativamente, la divulgación proporciona un procedimiento para aumentar la producción de vesículas a partir de una bacteria gramnegativa, por ejemplo, en comparación con la misma bacteria en la que la proteína que contiene el dominio catalítico LytM está activa, que comprende modificar, por ejemplo, inactivar al menos una proteína que contiene un dominio catalítico LytM en la bacteria. Opcionalmente la bacteria se cultiva.

Producción de vesículas de membrana externa con una composición proteica diferente

Se ha demostrado que los mutantes NHTi en los que al menos una proteína que contiene el dominio catalítico LytM está inactivada generan vesículas que tienen diferentes composiciones de proteínas para NTHi de tipo silvestre. Específicamente, en comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre, las vesículas del mutante NT013 pueden tener un aumento en la cantidad de lipoproteína, un aumento en la cantidad de proteína periplásmica, una disminución en la cantidad de proteína de la membrana externa.

En comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre, las vesículas del mutante NT017 pueden tener un aumento en la cantidad de proteína citoplásmica y una disminución en la cantidad de proteína de la membrana externa. En comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre, las vesículas del mutante NT022 pueden tener un aumento en la cantidad de lipoproteína, un aumento en la cantidad de proteína periplásmica, una disminución en la cantidad de proteína de la membrana externa.

Las lipoproteínas NT069 (anotadas como NTHI1957) y NTHI0353 pueden encontrarse a niveles aumentados en vesículas mutantes NTHi NT013 y NT022, en comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre.

La serina proteasa periplásmica HhoA puede encontrarse a niveles aumentados en vesículas mutantes NTHi NT013 y/o a niveles disminuidos en vesículas mutantes NTHi NT017 y NT022, en comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre.

La proteína de la membrana externa NTHI1668 puede encontrarse en niveles aumentados en vesículas mutantes NTHi NT013, NT017 y NT022, en comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre. La proteína de membrana externa P2, que es una proteína abundante y variable, se encuentra en niveles disminuidos en vesículas mutantes NTHi NT013, NT017 y NT022 y el nivel de proteína P5 de la membrana externa también cambian en comparación con las vesículas de NHTi de tipo silvestre. La presencia de P2 y P5, se cree que contribuyen a la falta de reactividad cruzada en los sueros generados contra las VME de Haemophilus y, como tal, la reducción en P2 y/o P2+P5 total puede ser ventajosa, por ejemplo, en la producción de vesículas con reactividad cruzada mejorada. De esta manera las vesículas de la divulgación pueden contener diferencias (por ejemplo, aumentos o disminuciones, por ejemplo, de al menos el 10, el 20, el 50, el 100, el 150, el 200, el 250, el 500, el 600, el 700, el 800, el 900, el 1000 %) en la cantidad total de proteína, la cantidad de lipoproteína, la cantidad de proteína periplásmica, la cantidad de proteína de la membrana externa y/o la cantidad de proteína citoplasmática en comparación con la misma bacteria en la que la proteína que contiene el dominio catalítico LytM está activa.

Así, las vesículas de la divulgación pueden contener diferencias (por ejemplo, aumentos o disminuciones, por ejemplo, de al menos el 10, el 20, el 50, el 100, el 150, el 200, el 250, el 500, el 600, el 700, el 800, el 900, el 1000 % en la cantidad de uno o más proteínas, por ejemplo, proteínas de membrana externa seleccionadas de (i) P2 NHTi, (ii) P5 NHTi y (iii) P2 NHTi P5 NHTi total, en comparación con las vesículas de la misma bacteria en la que la proteína que contiene el dominio catalítico LytM está activa. Se hace referencia a P2 y P5 NTHi pero si las vesículas son de una bacteria gramnegativa diferente, el homólogo, ortólogo o parálogo de P2 o P5 en esa bacteria puede aumentar o disminuir.

La divulgación proporciona de esta manera un procedimiento para alterar la cantidad total de proteína, la cantidad de lipoproteína, la cantidad de proteína periplásmica, la cantidad de proteína de membrana externa y/o la cantidad de proteína citoplasmática en una vesícula de una bacteria gramnegativa, por ejemplo, en comparación con la misma bacteria en la que la proteína que contiene el dominio catalítico LytM está activa, que comprende modificar, por ejemplo, inactivar al menos una proteína que contiene un dominio catalítico LytM en la bacteria. Opcionalmente la bacteria se cultiva. Opcionalmente, la proteína de la membrana externa es P2 y/o P5. La alteración puede ser como se definió anteriormente.

Composiciones inmunogénicas y medicamentos

Las composiciones inmunogénicas de la divulgación pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la divulgación pueden ser profilácticas (es decir, para evitar la infección) o bien terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas.

Las composiciones pueden ser de esta manera farmacéuticamente aceptables. Normalmente incluirán componentes además de los antígenos, por ejemplo, incluirán típicamente uno o más vehículo o vehículos y/o excipiente o excipientes farmacéuticos. Un análisis exhaustivo de tales componentes está disponible en la referencia 33.

Por lo tanto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) vesículas de la divulgación y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición es adecuada para uso farmacéutico. La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una composición tal, que comprende la etapa de mezclar vesículas de la divulgación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica es preferentemente una composición inmunogénica.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser cualquier sustancia que no induzca por sí misma la producción de anticuerpos dañinos para el paciente que recibe la composición y que puede administrarse sin una toxicidad indebida. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Algunas sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares (por ejemplo, estabilizantes, conservantes), también pueden estar presentes en dichos vehículos. Una descripción exhaustiva de los vehículos adecuados está disponible en la ref. 33.

Las composiciones se administrarán generalmente a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, después se cargan y se distribuyen y se administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de uso. Por lo tanto, una composición de la divulgación puede secarse, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes tales como timerosal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacuna esté en forma sustancialmente libre (es decir, que tenga menos de 5 |jg/ml) de material mercurial, por ejemplo, libre de timerosal. Se prefieren especialmente las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren particularmente las vacunas sin conservantes.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura. Se proporcionan detalles adicionales de dichos agentes más adelante.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro sódico (NaCl), que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 1o+2mg/ml NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro potásico, dihidrogenofosfato potásico, deshidrato de fosfato disódico, cloruro de magnesio, cloruro cálcico, etc.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg y más preferentemente, se encontrará en el intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Los tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición estará generalmente entre 5,0 y 8,1 y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica, por ejemplo, contiene <1 UE (unidad de endotoxinas, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten.

La composición puede incluir material para una sola inmunización o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit "multidosis"). Se prefiere la inclusión de un conservante en disposiciones multidosis. Como alternativa (o además) de incluir un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la extracción de material.

Las vacunas para humanos se administran normalmente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque puede administrarse media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a niños.

Las composiciones inmunogénicas de la divulgación también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, analizado adicionalmente a continuación.

Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la divulgación incluyen, pero no se limitan a:

• sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio, incluyendo hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) y sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la ref. 34];

• emulsiones de aceite en agua, tales como emulsiones de escualeno-agua, incluyendo MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador) [Capítulo 10 de la ref. 34; véanse también las ref. 35-37 y el capítulo 12 de la ref. 38], adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA);

• formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 34], tales como QS21 [39] e ISCOM [capítulo 23 de la ref. 34];

• virosomas y partículas similares a virus (VLP) [40-46];

• derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos del lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados del lípido A [47, 48], oligonucleótidos inmunoestimulantes [49-54], tales como IC-31™ [55] (desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26-meros 5'-(IC)¹³-3 '(SEQ ID NO: 23) y péptido policatiónico polimérico que comprende la secuencia de aminoácidos de 11-meros KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 24) y toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas [56 - 65];

• inmunomoduladores humanos, incluyendo citocinas, tales como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [66, 67], interferones (por ejemplo, interferón-y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral;

• bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como quitosano y derivados de los mismos, microesferas de ácido hialurónico esterificado [68] o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa [69];

• micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 jm de diámetro, más preferentemente de 200 nm a ~30 |jm de diámetro y lo más preferentemente de ~500 nm a ~10jm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.);

• liposomas [Capítulos 13 y 14 de la ref. 34, ref. 70-72];

• éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [73];

• Formulaciones de PCPP [74 y 75];

• péptidos de muramilo, incluyendo N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-lalanil-d-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil-l-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforíloxi)-etilamina MTP-PE); y

• compuestos de imidazoquinolona, incluyendo Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M") [76 y 77].

Las composiciones inmunogénicas y las vacunas de la divulgación también pueden comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes pueden usarse en la divulgación: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [78]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [79]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [80]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [81]; (6) SAF, que contiene un 10 % de escualano, Tween 80™ al 0,4 %, polímero de bloque pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, ya esté microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado con formación de vórtice para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula. (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tales como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de la ref. 34.

Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio y los antígenos normalmente se adsorben a estas sales. El fosfato cálcico es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones adyuvantes preferidas incluyen combinaciones de los adyuvantes Th1 y Th2, tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Puede usarse una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL (esto se ha informado que es eficaz en la inmunización neumocócica [82]). Se prefiere el uso de un adyuvante MF59, en particular en caso de inmunización IM (intramuscular) o IP (intraperitoneal).

Las composiciones de la divulgación pueden provocar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral. Preferentemente, esta respuesta inmunitaria inducirá anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente tras la exposición a NTHI.

Dos tipos de linfocitos T, linfocitos CD4 y CD8, generalmente se consideran necesarios para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor de CD8 y se denominan comúnmente linfocitos T citotóxicos (CTL). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en moléculas del MHC de Clase I.

Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor de CD4 y se denominan comúnmente linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas MHC de clase II. Tras la interacción con una molécula del MHC de clase II, las células CD4 pueden secretar factores, tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T auxiliares o las células CD4+ pueden dividirse adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: el fenotipo TH1 y los fenotipos TH2, que difieren en su función efectora y citocinas.

Las células TH1 activadas potencian la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL específicos de antígeno) y por lo tanto, son particularmente valiosos en la respuesta a infecciones intracelulares. Las células TH1 pueden secretar uno o más de IL-2, IFN-y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, células NK (citolíticas naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (CTL). Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria mediante la estimulación del crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar IgG2a.

Las células TH2 activadas potencian la producción de anticuerpos y por lo tanto, son valiosas para responder a infecciones extracelulares. Las células ^t H2 pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para la protección futura.

Una respuesta inmunitaria potenciada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta inmunitaria TH2 mejoradas.

Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento en CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas a una respuesta inmunitaria TH1 (tales como IL-2, IFN-^y y TNF-p), un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad NK o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH1 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Puede desencadenarse una respuesta inmunitaria TH1 usando un adyuvante de TH1. Un adyuvante de TH1 provocará generalmente niveles aumentados de producción de IgG2a con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes TH1 adecuados para su uso en la divulgación pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similares a virus, derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como los oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes TH1 preferidos para su uso en la divulgación. Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas a una respuesta inmunitaria TH2 (tales como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH2 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

Puede desencadenarse una respuesta inmunitaria TH2 usando un adyuvante de TH2. Un adyuvante de TH2 provocará generalmente niveles aumentados de producción de IgG1 con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la divulgación incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas ribosilantes de ADP y derivados detoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la divulgación.

Preferentemente, la divulgación incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y un adyuvante TH2. Preferentemente, dicha composición desencadena una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada, es decir, un aumento en la producción tanto de IgG1 como de IgG2a con respecto a la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y uno TH2 provoca un aumento de las respuestas inmunitarias TH1 y/o un aumento de las respuestas inmunitarias TH2 con respecto a la inmunización con un solo adyuvante (es decir, con respecto a la inmunización con un adyuvante de TH1 solo o a la inmunización con un adyuvante TH2 solo).

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria posibilita una o ambas de una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada.

La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y una mucosa. Preferentemente, la respuesta inmunitaria posibilita una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una mucosa mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosa es una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Las infecciones bacterianas pueden afectar a diversas áreas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones de la divulgación pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también pueden prepararse (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por congelación). La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para administración oral, por ejemplo, como un comprimido o una cápsula, como una pulverización o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizado. La composición puede prepararse en forma de un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñada de tal manera que se reconstituye una composición combinada justo antes de su administración a un paciente. Dichos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Cuando va a prepararse una composición de manera extemporánea antes de su uso (por ejemplo, cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta en forma de kit, el kit puede comprender dos viales o puede comprender una jeringuilla ya cargada y un vial, usándose el contenido de la jeringa para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacuna comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno o antígenos, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y físico del individuo que se vaya a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo que se vaya a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas rutinarias. En los casos en los que se incluye más de un antígeno en una composición, pueden estar presentes dos antígenos a dosis iguales entre sí o a diferentes dosis.

Como se ha mencionado anteriormente, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura y este componente puede ser particularmente útil en las composiciones adyuvadas (en particular, aquellas que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio). Como se describe en la referencia 83, puede añadirse un agente protector contra la temperatura líquido a una composición de vacuna acuosa para reducir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación por debajo de 0 °C. Por lo tanto, la composición puede almacenarse a menos de 0 °C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir la desintegración térmica. El agente protector contra la temperatura también permite congelar la composición a la vez que impide la aglomeración de los adyuvantes de sales minerales tras la congelación y descongelación y también pueden proteger a la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, por encima de 40 °C. Pueden mezclarse una vacuna acuosa de partida y el agente protector contra la temperatura líquido de tal forma que el agente protector contra la temperatura líquido forma un 1-80% en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores contra la temperatura adecuados han de ser seguros para su administración a seres humanos, fácilmente miscibles/solubles en agua y no han de dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular medio en el intervalo de 200-20.000 Da. En una realización preferida, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").

Debido a la naturaleza particulada de las vesículas, un producto de vacuna final puede ser una suspensión con una apariencia turbia. Esta apariencia significa que la contaminación microbiana no es fácilmente visible, por lo que la vacuna puede contener un agente antimicrobiano. Esto es particularmente importante cuando la vacuna se envasa en envases multidosis. Los antimicrobianos preferidos para la inclusión son 2-fenoxietanol y timerosal. Se prefiere, sin embargo, no usar conservantes mercuriales (por ejemplo, timerosal) y se prefiere que la composición contenga menos de aproximadamente 25 ng/ml de mercurio. Más preferentemente, la composición no contiene mercurio. El trabajo previo con vacunas de vesículas (por ejemplo, para meningococo) ofrece orientación farmacéutica, posológica y de formulación para la administración de vesículas. La concentración de vesículas en las composiciones de la divulgación estará generalmente entre 10 y 500 pg/ml, preferentemente entre 25 y 200 pg/ml y más preferentemente de aproximadamente 50 pg/ml o aproximadamente 100pg/ml (expresado en términos de proteína total en las vesículas). Dosis más bajas pueden ser eficaces para la seroconversión. Por lo tanto, la concentración de vesículas en las composiciones de la divulgación puede estar en el intervalo de 1 ng/ml a 10 pg/ml, o 1 ng/ml a 1 pg/ml, o 0,5 pg/ml a 50 pg/ml. Un volumen de dosificación de 0,5 ml es típico para inyección.

La composición puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.

Inmunización

La divulgación también proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la divulgación. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica inmunidad mediada por anticuerpos y/o células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

La divulgación también proporciona composiciones de la divulgación para su uso en medicina o como un medicamento, por ejemplo, para aumentar la respuesta inmunitaria en un mamífero (por ejemplo, como composiciones inmunogénicas o como vacunas).

La respuesta inmunitaria puede ser contra bacterias gramnegativas.

La divulgación también proporciona composiciones de la divulgación en la fabricación de un medicamento para elevar una respuesta inmunitaria en un mamífero o para prevenir enfermedades en un mamífero y el uso de vesículas de la divulgación en la fabricación de un medicamento para elevar una respuesta inmunitaria en un mamífero o para prevenir enfermedades en un mamífero.

Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero puede protegerse contra la infección bacteriana, por ejemplo, por bacterias gramnegativas tales como H. influenzae.

La divulgación es eficaz contra H. influenzae de diversos serotipos diferentes, pero puede ser particularmente útil en la protección contra la enfermedad resultante de la infección por H. influenzae no tipificable (NTHI). De acuerdo con la divulgación, una infección puede estar asociada a una enfermedad o afección seleccionada de, por ejemplo, otitis media (incluyendo otitis media aguda), bronquitis, conjuntivitis, sinusitis, una infección del tracto urinario, neumonía, bacteriemia, artritis séptica, epiglotitis, neumonía, enfisema, pericarditis, celulitis, osteomielitis, infección del tracto respiratorio inferior o meningitis. La divulgación es particularmente útil para tratar o prevenir la inflamación del oído medio o para tratar o prevenir enfermedades de EPOC, al provocar una respuesta inmunitaria que evita que las bacterias se muevan desde la garganta hasta el oído medio a través de la trompa de Eustaquio, en la que se coloniza después el oído medio.

La divulgación también proporciona un kit que comprende un primer componente y un segundo componente en la que ni el primer componente ni el segundo componente es una composición de la divulgación como se ha descrito anteriormente, pero en la que el primer componente y el segundo componente pueden combinarse para proporcionar una composición de la divulgación como se ha descrito anteriormente. El kit puede incluir además un tercer componente que comprende uno o más de lo siguiente: instrucciones, jeringuilla u otro dispositivo de administración, adyuvante o solución de formulación farmacéuticamente aceptable.

La divulgación también proporciona un dispositivo de suministro precargado con una composición inmunogénica de la divulgación.

El mamífero es preferentemente un ser humano, por ejemplo, un paciente humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un bebé) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc. Un mamífero (por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un paciente) puede estar en riesgo de contraer la enfermedad o puede ser una mujer embarazada, por ejemplo, mujer ('inmunización materna').

Una forma de verificar la efectividad del tratamiento terapéutico implica la monitorización de la infección bacteriana, por ejemplo, por H. influenzae después de la administración de las composiciones de la divulgación. Una forma de comprobar la efectividad del tratamiento profiláctico implica monitorizar las respuestas inmunitarias, de forma sistémica (tal como monitorizando el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o de forma mucosa (tal como monitorizando el nivel de producción de IgA), contra los antígenos en las composiciones de la divulgación después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la divulgación puede determinarse administrándolas a sujetos de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales tales como un modelo de chinchilla [84]) y después determinando parámetros convencionales que incluyen títulos ELISA (GMT) de IgG. Estas respuestas inmunitarias generalmente se determinarán alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición y se comparan con los valores determinados antes de la administración de la composición. Cuando se administra más de una dosis de la composición, puede hacerse más de una determinación posterior a la administración. Normalmente, las respuestas séricas de anticuerpos específicos de antígeno se determinan después de la inmunización pero antes de la exposición, mientras que las respuestas mucosales específicas de antígeno se determinan después de la inmunización y después de la exposición.

La efectividad de las composiciones de vacuna también puede determinarse in vivo mediante estudios de inmunización en modelos animales de infección bacteriana, por ejemplo, por H. influenzae, por ejemplo,, en conejillos de indias, chinchillas o ratones, con las composiciones de vacuna. Uno de estos modelos se describe en la referencia 85.

Otro modelo animal útil que a usar para determinar la efectividad in vivo de las composiciones de vacuna de la divulgación se describe en la referencia 86.

Las composiciones de la divulgación se administrarán en general directamente a un paciente. Puede lograrse la administración directa mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intramuscular o al espacio intersticial de un tejido) o por vía mucosa, tales como por administración rectal, oral, (por ejemplo, comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosa.

La divulgación puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa, preferentemente, para desencadenar una inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada.

Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada se refleja por una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mejorada incluye un aumento en la producción de IgG1 y/o IgG2a y/o IgA.

La dosificación puede ser una pauta en una sola dosis o una pauta en múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta multidosis, las diversas dosis pueden administrarse por vías iguales o diferentes, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo mucoso, un cebado mucoso y un refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán típicamente al menos con 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las vacunas preparadas de acuerdo con la divulgación pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos. Por lo tanto, un paciente humano puede ser menor de 1 año, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad y preferentemente, >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, sin embargo, y puede usarse más generalmente en una población.

Las vacunas producidas mediante la divulgación pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna para el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubeola, una vacuna contra MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna contra MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna contra DTP, una vacuna conjugada contra H.influenzae de tipo b, una vacuna del virus de la polio inactivado, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como una vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna contra el virus sincicial respiratorio, etc.

Inmunización de la mucosa

La divulgación proporciona las composiciones de la divulgación para la inmunización de la mucosa. La divulgación también proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de dicha composición inmunogénica al mamífero. La composición se administra preferentemente a través de la mucosa (a una superficie de la mucosa), por ejemplo, puede administrarse por vía intranasal.

Puede estar presente una toxina bacteriana de ribosilación de ADP y/o un derivado detoxificado de la misma que puede ser, por ejemplo, derivado de enterotoxina lábil al calor ("LT") de E. coli. El derivado puede tener una mutación desintoxicante en su subunidad A, por ejemplo, puede ser LT-K63 o LT-R72. En particular puede ser LT-K63. En otras realizaciones, no es LT-K63.

Se prefiere la administración intranasal de composiciones de la divulgación y un adyuvante LT-K63. Esto puede disminuir la carga bacteriana de H. influenzae en la nasofaringe, los pulmones y la sangre, y aumentar la tasa de supervivencia de los mamíferos infectados.

Componentes antigénicos adicionales de las composiciones de la divulgación

La divulgación también proporciona composiciones que comprenden además al menos un antígeno de H. influenzae no tipificable o al menos otro antígeno de H. influenzae no tipificable.

La divulgación también proporciona composiciones que comprenden además al menos un antígeno que no es un antígeno de H. influenzae no tipificable.

En particular, la divulgación también proporciona una composición que comprende uno o más polipéptidos de la divulgación y uno o más de los siguientes antígenos adicionales:

- un antígeno de N. meningitidis serogrupo A, B, C, W135 y/o Y.

- un antígeno sacárido o polipéptido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 87, 88, 89].

- un antígeno del virus de la hepatitis A, tales como virus inactivados [por ejemplo, 90, 91].

- un antígeno del virus de la hepatitis B, tales como los antígenos de superficie y/o núcleo [por ejemplo 91, 92]. - un antígeno de difteria, tales como un toxoide diftérico [por ejemplo, capítulo 3 de la ref. 93] o el mutante CRM197 [por ejemplo, 94].

- un antígeno del tétanos, tales como un toxoide tetánico [por ejemplo, capítulo 4 de la ref. 93].

- un antígeno de Bordetella pertussis, tales como la holotoxina de pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, ref. 95 y 96].

- un antígeno pertussis celular completo

- un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 97].

- antígeno o antígenos de polio [por ejemplo, 98, 99] tal como IPV.

- antígenos de sarampión, paperas y/o rubeola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 93].

- antígeno o antígenos de la gripe [por ejemplo, capítulo 19 de la ref. 93], tales como las proteínas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.

- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 100].

- un antígeno proteico de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 101, 102].

- un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B).

- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo 102, 103, 104].

- un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 105].

- un antígeno del virus sincicial respiratorio, por ejemplo, una proteína F recombinante

- una composición de vacuna que comprende una vacuna conjugada (adsorbida) de difteria (D), tétanos (T), tos ferina (acelular, componente) (Pa), hepatitis B (ADNr) (VHB), poliomielitis (inactivado) (IPV) y Haemophilus influenzae tipo b (Hib), por ejemplo, Infanrix-hexa

La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Las combinaciones con una vacuna contra el VSR y/o con una vacuna que contiene DTPa son de particular interés.

Los antígenos de proteínas tóxicas pueden detoxificarse en caso necesario (por ejemplo, detoxificación de toxina pertussis por medios químicos y/o genéticos [96]).

En los casos en los que se incluye un antígeno de difteria en la composición, se prefiere incluir también un antígeno del tétanos y antígenos de pertussis. De forma similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos también se prefiere incluir antígenos diftéricos y de pertussis. De forma similar, cuando se incluye un antígeno de pertussis también se prefiere incluir antígenos diftéricos y del tétanos. Por lo tanto, se prefieren las combinaciones de DTP.

Los antígenos sacáridos se encuentran preferentemente en forma de conjugados. Las proteínas vehículo para los conjugados incluyen toxina diftérica, toxina tetánica, la proteína de la membrana externa de N. meningitidis [106], péptidos sintéticos [107,108], proteínas de choque térmico [109,110], proteínas de pertussis [111,112], proteína D de H. influenzae [113], citocinas [114], linfocinas [114], proteínas estreptocócicas, hormonas [114], factores de crecimiento [114], toxina A o B de C. difficile [115], proteínas de captación de hierro [116], etc. Una proteína vehículo preferida es el mutante CRM197 de la toxina diftérica [117].

Los antígenos en la composición estarán normalmente presentes a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para generar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.

Como una alternativa al uso de proteínas antigénicas en las composiciones inmunogénicas de la divulgación, puede usarse ácido nucleico (preferentemente, ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido) que codifica el antígeno. Los antígenos se adsorben preferentemente a una sal de aluminio.

General

La expresión "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo más, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente", en relación con un valor numérico x, es opcional y significa, por ejemplo, x±10 %. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "esencialmente" puede omitirse de la definición de la divulgación.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es igual al comparar las dos secuencias. Pueden determinarse este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 118. Se determina un alineamiento preferido mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de hueco afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman es bien conocido y se desvela en la referencia 119.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Expresión y localización subcelular de factores NTHi LytM. (A) Se realizaron análisis de transferencia Western en diferentes extractos de compartimentos celulares usando antisueros específicos generados contra NT013, NT017 y NT022. 1 - Proteína recombinante, 2 - extracto total TS, 3 extracto total KO, 4 - proteínas de membrana externa TS, 5 - proteínas de membrana externa KO, 6 - fracción periplásmica TS, 7 - fracción periplásmica KO, 8 - sobrenadante, TS 9 sobrenadante KO. Las flechas rojas indican las señales específicas. Como cabía esperar, no se observa reactividad específica con las cepas mutantes; sin embargo, los antisueros reaccionan de forma cruzada con otras bandas no específicas presentes también en las cepas de inactivación génica no se caracterizaron. (B) Análisis de microscopía de inmunofluorescencia en la cepa de tipo silvestre Hi176 y el mutante 176ANT022 confirmando la localización de la superficie de la proteína NT022. Las bacterias son rojas y los factores LytM en verde. (C) Modelo de localización de proteínas LytM en NTHi.

Figura 2: Caracterización fenotípica de NTHi de tipo silvestre Hi176 y de mutantes LytM. El fenotipo de agregación en cultivos líquidos de crecimiento estático durante 16 h a 37 °C (A) y UFC por mililitro (B) de recuentos de UFC se realizó a dos DO diferentes. La cepa 176ANT017 tiene una tasa de crecimiento y una UFC similar a la cepa original, mientras que los mutantes 176ANT013 y 176ANT022 mostraron una tasa de crecimiento reducida y una UFC menor. (C) Imagen confocal que muestra la agregación bacteriana de las cepas 176ANT013 y 176ANT022, las bacterias se tiñen en rojo y Dapi en azul.

Figura 3: Microscopía confocal y electrónica en mutantes LytM. (A) Imágenes confocales de Hi176 ts, 176ANT013 y 176ANT022, Las bacterias se tiñen de rojo (anti bacteria total) y azul (DAPI). (B) Microscopía electrónica de barrido de 176 ts, 176ANT013 y 176a Nt 022. El mutante 176ANT017 no muestra ninguna diferencia en comparación con la cepa de tipo silvestre (datos no mostrados).

Figura 4: Formación de tabique en mutantes LytM. Microscopía electrónica de transmisión en Hi176 ts y mutantes LytM. Las flechas rojas indican una formación de tabique deteriorada en mutantes 176ANT013 y 176ANT022.

Figura 5: Los mutantes 176ANT013 y 176ANT022 liberan más VME que la cepa de tipo silvestre. Microscopía electrónica de transmisión de Hi176TS, mutantes 176ANT013 y 176ANT022 y de sus respectivas preparaciones de VME. Las flechas rojas indican VME que se liberan de la superficie bacteriana.

Figura 6: Análisis de VME. Gel de SDS page teñido con Coomassie de VME preparadas a partir de las cepas de tipo silvestre, 176ANT013 y 176ANT022 (A). La identificación por espectrometría de masas se realizó en bandas seleccionadas (B). Ensayo de luciferasa usando células HEK293 que expresan de manera estable el casete indicador NF-KB-luciferasa y TLR2 (C) o TLR4/MD2/CD14 (D). La estimulación de los receptores TLR se evalúa midiendo la actividad luciferasa inducida por NF-^kB después de 6 horas de incubación con VME diluidas en serie. Los niveles de IL-6 y TNFa se midieron en hPBMC estimuladas (O.N.) con diferentes diluciones de VME purificadas de cepas ts y mutantes (E-F).

Figura 7: Análisis de proteínas encontradas en VME

Figura 8: Lipoproteínas en VME. VME de TS, AtolR, A17 tienen cantidades similares de lipoproteínas, mientras que los mutantes A13 y A22 están enriquecidos para las lipoproteínas, en particular lipoproteínas NTHI1957 y NTHI 0353.

Figura 9: Proteínas periplásmicas en VME. La proteína periplásmica principal es la serina proteasa periplásmica de HhoA. Esto es particularmente cierto a partir de la vesícula derivada de A13. En comparación con las VME generadas a partir del TS, las VME derivadas de AtoIR y A22 están enriquecidas en proteínas periplásmicas. En comparación con las VME generadas a partir del TS, Las VME derivadas de A17 contienen una baja cantidad de proteínas periplásmicas.

Figura 10: Proteínas de la membrana externa en VME. De cada tipo de VME, las proteínas de membrana externa más abundantes son nt099 (proteína de membrana externa P2) y nt092 (proteína de membrana externa P5). La caída principal en la cantidad de proteína de la membrana externa observada para VME derivadas de A13 y A22 se debe a la reducción de P2.

Figura 11: Cantidades relativas de proteínas en VME. Cantidades relativas de proteínas nt067, nt014, nt022 y nt016 encontradas en VME producidas por cepas mutantes, con respecto a la cepa de tipo silvestre.

Figura 12: Tinción DAPI de MC58 A1483 y bacterias de tipo silvestre.

Figura 13: Análisis MET (A) y MEB (B) de MC58 A1483 y bacterias de tipo silvestre.

Figura 14: Análisis de proteínas de vesículas producidas por MC58 A1483 y bacterias de tipo silvestre.

Figura 15: Tinción DAPI de BP1721 de inactivación génica y bacterias de tipo silvestre.

Figura 16: Alineación múltiple para los homólogos de NlpD.

Figura 17: Alineación múltiple para los homólogos de YebA.

Figura 18: Alineación múltiple para los homólogos de EnvC.

Figura 19: Análisis de proteínas de vesículas producidas por Bp W28 9G/129K ANlpD y bacterias de tipo silvestre.

Modos para llevar a cabo la divulgación

Se generaron mutantes de inactivación génica de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) para tres metaloproteasas LytM: NTHI0532 (NT013), NTHI0915 (NT017) y NTHI0830 (NT022). Estos mutantes mostraron defectos en la superficie celular que provocaron un aumento en la liberación de vesículas de membrana externa (VME). Adicionalmente, Se demostró que estas proteínas están implicadas en la división celular bacteriana y la patogénesis. En particular, NT013 y NT022 son fundamentales para la escisión de peptidoglucano y la división celular. NT017 tiene una fuerte influencia en la colonización de NTHi y la evasión de inmunidad del hospedador.

PROCEDIMIENTOS

Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano

Se usó la cepa NTHi 176 para este estudio. Fue parte de un estudio de cohorte de otitis media finlandesa, como aislado obtenido del oído medio. Se cultivó NTHi en agar chocolate polivitex (BioMerieux) incubado a 37 °C con un 5% de CO2. El caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI) (Difco Laboratories) suplementado con 10|jg/ml de hemina (Fluka Biochemika) y dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD, Sigma) se usó como medio de crecimiento fluido. Escherichia coli cepas DH5a, HK100 y BL2l (DE3) (Invitrogen) se usaron para la clonación y expresión de proteínas LytM. Se cultivaron a 37 °C en medio Luria Bertani (LB) y, cuando se requirió, se suplementó con ampicilina 100 jg/ml.

Cultivos celulares

Las células de cultivo de tejidos utilizadas en este estudio son células epiteliales de Chang (derivado de Wong-Kilbourne, clon 1-5c-4, conjuntiva humana, ATCC® CCL-20.2™) y HEK293 (riñón humano, ATCC® CRL1573™). Las células Chang se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM; Gibco) suplementado con Hepes 25 mM, L-glutamina 15 mM, antibióticos y suero de ternera fetal inactivado por calor al 10 % (vol/vol) (FCS, Invitrogen Corporation). Se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO².

Las células HEK293 que expresan de forma estable TLR2 o TLR4/MD2/CD14 y el casete indicador NF-KB-luciferasa, se cultivaron en DMEm que contenía 4,5 g/ml de glucosa, suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, 100 U/ml de pelicilina, 100 jg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, 5 jg/ml de puromicina, 250 jg/ml de higromicina (y más 10 jg/ml de blasticidina para células HEK293-TLR4).

Clonación de genes que codifican proteínas LytM

Los genes LytM se clonaron en el vector pET15b+ (Novagen) mediante el procedimiento de extensión de cebador incompleto de polimerasa (PIPE) (119). En resumen, las secuencias que codifican para cada proteína se amplificaron por PCR a partir del ADN genómico HI176, retirando el péptido señal. Las PCR generaron mezclas de productos de extensión incompletos; para el diseño de cebadores, se introdujeron secuencias cortas superpuestas en los extremos de estas mezclas de extensión incompletas, lo que permitió que las cadenas complementarias se hibridaran y produjeran combinaciones híbridas de vector-inserto. Las células HK100 de Escherichia coli [120] se transformaron después con híbridos de inserción de vector. Se seleccionaron colonias resistentes a ampicilina individuales y se verificó la presencia del plásmido recombinante por PCR. Los plásmidos de los clones positivos se aislaron y se subclonaron en células competentes E. coli BL21 (DE3).

Expresión y purificación de proteínas recombinantes

Para la purificación de proteínas, una sola colonia de cepa de E. coli BL21 (DE3) que expresa NTHI0532, NTHI0915 y NTHI0830 se inocularon en LB ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C, se diluyeron en medio LB nuevo y se cultivaron a 30 °C a una DO de 0,6-0,8. La sobreexpresión de la proteína se indujo por la adición de 1 mM de isopropil-1-tio-p-D-galactopiranósido (IPTG; Sigma) durante 4 horas. Las proteínas recombinantes 6 x Hisfusion se purificaron por cromatografía de afinidad en quelante conjugado Ni²⁺" de resina Sepharose 4B de flujo rápido (Pharmacia). La pureza se verificó mediante tinción por electroforesis SDS-PAGE con azul Coomassie. La concentración de proteína se determinó usando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Scientific).

Construcción de los mutantes de inactivación génica

Los mutantes eliminados de NTHI0532, NTHI0915 y NTHI0830 se construyeron mediante reemplazo alélico de cada gen completo con un casete de resistencia a eritromicina. Las regiones corriente arriba y corriente abajo de los tres genes se amplificaron por PCR usando los cebadores enumerados a continuación y se clonaron en el vector Stratagene pSC-A TOPO. El casete de resistencia a eritromicina se purificó del plásmido pIM13. Las construcciones que contienen regiones corriente arriba, se ensamblaron casetes de resistencia y regiones corriente abajo. Los plásmidos obtenidos se linealizaron y se usaron para transformar la cepa 176 NTHi usando el protocolo MIV [121]. Las cepas de inactivación génica obtenidas fueron confirmadas por PCR, Western Blot y secuenciación de locus.

Preparación de antisueros policlonales

Se inmunizaron grupos de cuatro ratones CD1 para producir antisueros policlonales; se usaron 10 pg de proteína purificada para cada ratón. La proteína recombinante se administró intraperitonealmente en presencia de aluminio. Se administraron una segunda (día 21) y una tercera (día 35) dosis de refuerzo. Se tomó una muestra de sangre el día 49.

Los tratamientos se realizaron de acuerdo con el comité ético interno de animales y las directrices institucionales. Fraccionamiento celular y análisis de transferencia Western

Las cepas de Haemophilus se cultivaron en BHI hasta la mitad de la fase logarítmica a 37 °C con 5 % de CO2. Los lisados de células enteras y fracciones periplásmicas se purificaron usando el kit PeriPreps Periplasting de Epicentre. Las proteínas de la membrana externa (PME) se recuperaron sobre la base de la insolubilidad de Sarkosyl siguiendo el procedimiento rápido descrito por Carlone y col. [122].

Para preparar sobrenadantes de cultivo, las bacterias se cosecharon a 13000 g durante 10 min a 4 °C. Se filtró 1 ml de sobrenadante de cultivo a través de un filtro de 0,22 mm y se precipitó con un volumen de TCA al 50 % durante 1 hora a 4 °C.

Después de la centrifugación a 13000 g durante 30 minutos, El sedimento conseguido se lavó una vez con etanol al 70 % y se resuspendió en tampón de carga de muestra IX.

Las proteínas de cada fracción celular se separaron por electroforesis SDS-PAGE usando NuPAGE Gel System, según las instrucciones del fabricante (Invitrogen) y se reveló por tinción con azul de Coomassie o se transfirió a membranas de nitrocelulosa para análisis de transferencia Western.

Las transferencias Western se realizaron de acuerdo con los procedimientos convencionales. Las diferentes proteínas LytM se identificaron con un antisuero policlonal de ratón producido contra NTHI0532 recombinante, NTHI0915 y NTHI0830 (diluido 1:1000) y un antisuero anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (DAKO), como anticuerpo secundario. Las bandas se visualizaron con sustrato quimioluminiscente Super Signal (Pierce) y con el kit de sustrato Opti 4CN (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Microscopía con focal

La presencia de proteínas LytM en la superficie NTHi se verificó mediante imágenes confocales. Se usaron mutantes de inactivación génica como controles negativos. Las bacterias se cultivaron hasta la fase exponencial y se fijaron en paraformaldehído al 4 % (Sigma). Después de múltiples lavados, las bacterias se extendieron sobre portaobjetos recubiertos con polilisina y se bloquearon con PBS 3 % de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma) durante 30 min a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron y se incubaron con antisueros específicos (1:1000) durante 15 min a temperatura ambiente. Los antisueros LytM se absorbieron previamente con bacterias KO intactas para minimizar la reactividad cruzada. Las bacterias se lavaron varias veces con PBS y se incubaron con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (1:400) (Molecular Probes). Las muestras marcadas se montaron con el reactivo antifade ProLong®Gold con DAPI (Molecular Probes) y se analizaron con el microscopio confocal ZeissLSM710.

Microscopía electrónica de barrido y de transmisión

La microscopía electrónica se realizó en cepas de 176ts y noqueadas para observar defectos en la morfología bacteriana. Las bacterias se cultivaron hasta la fase exponencial, se lavaron con PBS y se fijaron durante la noche en tampón de sacarosa cacodilatado que contenía 2,5 % de glutaraldehído y 2,5 % de paraformaldehído. Las muestras fueron luego fijadas en OsO4 al 1 % y rojo de rutenio al 0,15 % en tampón de cacodilato, bloqueado con acetato de uranilo al 1 % y deshidratado con dilución en serie de acetona.

Para MEB, las muestras fueron secadas por el procedimiento de punto crítico usando CO² en una Unión Balzers CPD 020, recubierto por pulverización catódica con oro en una unidad Balzers MED 010, y observado con un microscopio electrónico JEOL JSM 5200. Para MET, las muestras fueron fijadas y deshidratadas como se describió anteriormente y luego incrustadas en resina basada en Epon. Se cortaron secciones delgadas con un ultramicrotomo Reichert Ultracut mediante el uso de un cuchillo de diamante, recogido en redes de cobre de colodión, teñido con acetato de uranilo y citrato de plomo, y observado con un microscopio electrónico JEOL 1200 EX II.

Preparación de vesículas de membrana externa

Las vesículas de membrana externa nativas (VME) se aislaron de cepas TS y mutantes, haciendo crecer las bacterias hasta la fase exponencial en 200 ml de cultivos BHI. Las bacterias se centrifugaron y el sobrenadante se filtró y se dejó a 4 °C durante la noche añadiendo inhibidor de proteasas y EDTA. El sobrenadante se ultracentrifugó durante 3 horas a un máximo de 200000 X g y el sedimento final que contenía VME se resuspendió en PBS.

Espectrometría de masas

Las bandas teñidas con Coomassie de SDS-PAGE se cortaron y se tiñeron en NH⁴HCO³ 50 mM 50 % de acetonitrilo. Después de una etapa de secado, las bandas se digirieron en gel con 12,5 ng/ml de tripsina en NH⁴HCO³5 mM toda la noche a 37° C. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) de concentración final al 0,1 % y las muestras se sometieron a análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. Se detectó 1 pl de solución de digestión en una diana PAC (Prespotted AnchorChip 96, ajustado para Proteomics, Bruker Daltonics) y secados al aire a temperatura ambiente. Las manchas se lavaron con 0,6 pl de una solución de etanol al 70 % (vol/vol), 0,1 % (vol/vol) de TFA. Los espectros de masa peptídica se calibraron externamente usando los patrones previamente detectados en la diana. La determinación de masas moleculares de péptidos se realizó usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF UltraFlex (Bruker Daltonics, Bremen, GmbH). Los iones generados por desorción láser a 337 nm (láser N2) se registraron a un voltaje de aceleración de 25 kV en el modo reflector. En general, se acumularon aproximadamente 200 espectros individuales para mejorar la relación señal/ruido y se analizaron mediante FlexAnalysis (versión 2.4, Bruker Daltonics). Las huellas dactilares de péptidos se realizaron mediante búsquedas MASCOT contra la base de datos Haemophilus influenzae 86-028NP usando los siguientes parámetros: (i) 1 como número de escisiones perdidas permitidas, (ii) oxidación de metionina como modificación variable, (iii) 75 ppm como tolerancia peptídica. Solo se consideraron aciertos significativos, según lo definido por el sistema de puntuación y probabilidad MASCOT.

Ensayos de reactogenicidad

Para el ensayo de luciferasa, se sembraron células HEK293-TLR2 y HEK293-TLR4 en placas de fondo de micropocillos de 96 pocillos en 90 pl de medio completo en ausencia de antibióticos de selección. Después de la incubación durante la noche, las células se estimularon por duplicado con diferentes concentraciones de VME (10 pl/pocillo) a partir de 1 mg/ml diluido 1:2 en PBS, durante 6 h. Después, el medio se desechó y las células se lisaron con 20 pl de tampón de lisis pasivo (Promega) durante 20 min a temperatura ambiente. Los niveles de luciferasa se midieron mediante la adición de 100 pl/pocillo de sustrato de ensayo de luciferasa (Promega) usando un lector de microplacas LMax II384 (Molecular Devices). Las unidades de luz bruta (RLU) de cada muestra se dividieron por la RLU de la muestra de control (PBS) y se expresaron como Inducción de Plegamiento (FI).

Las PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se aislaron de capas leucocíticas de donantes sanos usando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll (Amersham Biosciences). Las células se sembraron en placas de fondo de micropocillos de 96 pocillos en 180 pl de RPMI (GIBCO) suplementado con 10 % de FBS inactivado por calor, 100 U/ml de pelicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM. Las células se estimularon con diferentes concentraciones de VME (20 pl/pocillo) a partir de 1 mg/ml diluido 1:2 en PBS, durante toda la noche. El ensayo de mesoescala 7 puntos proinflamatorios humanos (MSD Technology) se usa para la detección de citocinas inflamatorias siguiendo las instrucciones del fabricante.

RESULTADOS NT013, NT017 y NT022 de NTHi muestran una homología significativa con varias proteínas LytM previamente caracterizadas expresadas por otras bacterias gramnegativas. En particular, las proteínas de E. coli conocidas por estar involucradas en el proceso de división celular tales como YebA, EnvC y NlpD muestran una identidad de aminoácidos del 49% con NT013, el 40% con NT017 y el 43% con NT022, respectivamente. Los dominios catalíticos de LytM son las regiones más conservadas entre las proteínas NTHi y E. coli, de hecho, el porcentaje de homología crece hasta el 79 % para este dominio específico.

Las proteínas LytM se distribuyen de manera diferente en los compartimentos NTHi

Para verificar la expresión y la localización subcelular de las proteínas LytM NT013, NT017 y NT022, se generaron mutantes de deleción única de los genes que codifican las tres proteínas LytM en la cepa NTHÍ176. Se realizó inmunotransferencia con antisueros específicos generados contra cada una de las proteínas recombinantes LytM para determinar el nivel de expresión en fracciones periplásmica, membrana externa y sobrenadante.

Como se muestra en la Figura 1A, NT013 se detectó en los extractos de proteínas de la membrana externa, NT017 en la fracción periplásmica, mientras que NT022 se encontró en todas las fracciones. Como control, ninguno de los antisueros reconoció bandas específicas a 53 kDa, 46 kDa y 42,5 kDa correspondientes a NT013, NT017 y NT022 en preparaciones celulares de las respectivas cepas mutantes inactivadas (Figura 1A).

Sorprendentemente, la microscopía de inmunofluorescencia confocal de bacterias teñidas para NT013 no reveló ninguna señal específica de la proteína en la superficie bacteriana, indicando que NT013 podría estar asociado a la capa interna de la membrana externa ya que se encontró que estaba presente en la fracción de membrana externa mediante análisis de transferencia western. Como cabía esperar, NT017, que se encontró en la fracción periplasmática, fue negativo por análisis de microscopía confocal y se confirmó que NT022 estaba expuesto en la superficie bacteriana (Figura 1B). De interés, parece que el antígeno se transloca en la superficie bacteriana en focos específicos cerca del tabique de división (Figura 1B). Un modelo de localización de proteínas se ilustra en la Figura 1C.

176ANT013 y 176ANT022 exhiben morfología celular aberrante y graves defectos de separación celular

Para investigar si las proteínas NTHi LytM, NT013 y NT022, jugaron un papel en la separación celular, se cultivaron mutantes de inactivación génica isogénicos únicos (176ANT013 y 176ANT022) en medio sólido o líquido y se compararon con la cepa de tipo silvestre. Estos no mostraron diferencias en la morfología de las colonias según lo visualizado por microscopía óptica. Para evaluar el efecto de las mutaciones, las cepas de inactivación génica se cultivaron en BHI líquido a 37 °C. No hubo diferencias significativas en la tasa de crecimiento de TS y mutantes, pero se observó un fenotipo de agregación en cultivos líquidos para 176ANT013 y 176ANT022 (Figura 2A) y se confirmó mediante imágenes confocales (Figura 2C). El número de colonias bacterianas también se midió a dos DO diferentes mediante cultivo en placa de dilución en serie en placas de chocolate con agar. Las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de 176ANT013 y 176ANT022 fueron mucho más bajas que el tipo silvestre Hi176 y de 176ANT017, de hecho, las UFC derivadas de 176ANT013 y 176ANT022 son, respectivamente, solo de aproximadamente 10 % y 1 % con respecto a la cepa original (Figura 2B).

Para verificar si el fenotipo de agregación bacteriana se debió a una falla en la separación celular, los presentes inventores usaron microscopía electrónica confocal y de barrido que mostró claramente que los mutantes 176ANT013 y 176ANT022 difieren del tipo salvaje en dimensión y morfología (Figura 3A y 3B).

En particular, las células 176ANT013 aparecieron aproximadamente cuatro veces más largas que la cepa de tipo silvestre y se comban en la porción central. Por otra parte, el mutante 176ANT022 forma cadenas más largas (hasta 0,1 mm), mientras que no se observaron diferencias morfológicas evidentes para 176ANT017. Se observó el mismo fenotipo cuando se generaron mutantes LytM en una cepa diferente (Hi162), lo que indica las propiedades funcionales ubicuas de tales determinantes.

Este resultado indica que NT013 y NT022 están implicados en la separación bacteriana, aunque no son esenciales para el crecimiento celular NTHi.

Los mutantes 176ANT013 y 176ANT022 liberan vesículas de membrana externa

Se observó formación de tabique defectuoso en mutantes 176ANT013 y 176ANT022 en microscopía electrónica de transmisión (MET) de superficies celulares bacterianas (Figura 4). Además, se destacó una formación exclusiva de ampollas en la superficie de ambos mutantes (Figura 5).

Se cree que esta formación de ampollas en la membrana se debe a una sobreproducción de vesículas de membrana externa (VEM) que son secretadas naturalmente por bacterias gramnegativas. Las VEM nativos se purificaron de estos dos mutantes y de la cepa Hi176 para verificar la calidad y cuantificar la liberación de VEM. El aislamiento de VEM reveló que ambas cepas mutantes producen más vesículas con respecto a la cepa de tipo silvestre (Figura 5). El análisis m Et de las preparaciones de VEM confirmó la presencia de vesículas con un diámetro aparente de 20 a 100 nm (Figura 5). La sobreproducción de VEM en mutantes LytM se cuantificó y mostró un aumento cuádruple con respecto al TS (procedimiento de Lowry para la cuantificación de proteínas).

Composición proteica de vesículas de membrana externa

Para comparar la composición de proteínas de las VEM extraídas de cada cepa, las muestras se procesaron en un gel SDS-page y se realizó una tinción con azul Coomassie (Figura 6A). Los patrones de proteínas fueron similares entre las cepas mutantes y de tipo silvestre, aunque algunas bandas mostraron una intensidad diferente. Como cabía esperar, el análisis de espectrometría de masas asoció estas bandas a varios determinantes de superficie conocidos, incluyendo HMW1 y 2, HtrA, P2, P5 y OMP26 (Figura 6B). Se hicieron comparaciones con el mutante ToIR conocido y con el tipo silvestre.

Las VEM purificadas de las cepas mutantes se analizaron para determinar su contenido de proteína y se compararon con las VEM purificadas de la cepa de tipo silvestre basándose en espectroscopía de masas de bandas seleccionadas.

Las proteínas de Haemophilus se agruparon en cinco clases de acuerdo con su localización dentro de la célula y se midió la cantidad de proteína de cada clase presente en las VME. Se observaron diferencias entre el tipo silvestre y los mutantes y esto sugiere mecanismos distintos de formación de VEM (véase la Figura 7). Las VEM mutantes NT013 y NT022 mostraron cantidades aumentadas de lipoproteínas y cantidades reducidas de proteínas de la membrana externa. Las cantidades de proteínas individuales se cuantificaron dentro de cada clase. Los resultados para la lipoproteína, las clases de proteína periplásmica y de proteína de membrana externa se ilustran en la Figura 8, la Figura 9 y la Figura 10 respectivamente.

Una diferencia es una disminución en la cantidad de proteínas inmunodominantes de la membrana externa (proteína 2 y proteína 5) en las cepas mutantes (véase la Figura 10 y la Tabla a continuación). En particular, en el tipo silvestre, la cantidad de estos P2 y P5 es aproximadamente el 56% del total, en ANT013 disminuye al 31 % y en ANT022 al 23 %. P2 y P5 son proteínas muy abundantes y variables y su presencia es una de las razones clave de la falta de reactividad cruzada en los sueros generados contra las VEM de Haemophilus. Por lo tanto las VEM mutantes con concentración reducida de P2 y P5 pueden usarse para mejorar la reactividad cruzada.

A continuación se presenta un resumen de los datos proteómicos relacionados con los factores de virulencia en el mutante NT017:

Se realizaron estudios inmunológicos en VEM de tipos silvestres y mutantes para determinar si las diferencias observadas en los patrones de proteínas de VEM podrían influir en la activación de TLR por LPS o componentes de lipoproteínas. Las células HEK293-hTLR2 y HEK293-hTLR4/CD14-MD2 fueron estimuladas con diferentes diluciones de VEM de las cepas de tipo silvestre y de inactivación génica. No se detectaron diferencias significativas (Figura 6C/D).

Además la misma estimulación se extendió a las células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC) para medir la producción de citocinas proinflamatorias. No se observaron diferencias significativas (Figura 6 E/F).

Proteína LytM de inactivación génica en Neisseria meningitidis

Se identificaron tres proteínas LytM en Neisseria meningitidis MC58 y son: NMB1483, NMB0315 y NMB1333. NMB1483 contiene dos dominios LysM y un dominio de la familia de peptidasas M23 y es el homólogo de NIpD encontrado en Neisseria meningitidis el grupo B. NMB0315 también es una metalopeptidasa dependiente de zinc de tipo lisostafina que pertenece a la familia de peptidasa M23 y se caracteriza por un sitio activo conservado que contiene un motivo HXH. NMB1333 también presenta un dominio conservado típico de la familia de peptidasas ^m 23. Las secuencias de genes y proteínas para las proteínas LytM se identificaron en Neisseria meningitidis se establecen en SEQ ID NO: 37-42.

Se generó un mutante de inactivación génica en la cepa MC58 de Neisseria meningitidis para el gen NMB1483 (NlpD) y se denominó: MC58A148. Una descripción detallada de la generación de mutantes de inactivación génica se describe en otra parte [123].

Las regiones de flanqueo de la secuencia de codificación del gen se amplificaron usando los siguientes conjuntos de cebadores:

El plásmido usado para la generación del mutante de deleción en MC58 fue: pBS-UD1483_Ery. Por intercambio alélico cromosómico, el gen fue sustituido por un casete de resistencia a la eritromicina.

La cepa MC58A1483 se analizó mediante análisis de microscopía confocal y mostró la presencia de múltiples agregados de tamaño variable, con respecto a la cepa TS. Para el análisis de microscopía confocal, las bacterias se cultivaron en medio GC hasta la fase exponencial (DO6000,5) y fijado en paraformaldehído al 4 %, antes de la tinción DAPI (Véase la Figura 12).

Para caracterizar aún más la morfología de las células bacterianas se realizó un análisis MET (microscopía electrónica de transmisión) y MEB (microscopía electrónica de barrido). Para el análisis MET, también se cultivaron bacterias en medio GC hasta la fase exponencial (DO6000,5). El análisis MET confirmó la presencia de agregados bacterianos y la morfología celular aberrante se mostró en MC58A1483, en comparación con el diplococo observado en la cepa TS. Además, la presencia de vesículas era claramente visible en la cepa mutante (véase la Figura 13A). Para el análisis MEB, también se cultivaron bacterias en medio GC hasta la fase exponencial (DO6000,5). Además, el análisis MEB confirmó la presencia de agregados bacterianos tridimensionales y de morfología celular aberrante en el mutante MC58A1483 (véase la Figura 13B).

El mutante MC58A1483 también se probó por su capacidad para producir VEM. En un primer experimento, las cepas MC58 y MC58A1483 se cultivaron hasta la fase estacionaria (DO600 1,3-1,5) en 50 ml de MCDM I (medio químicamente definido de meningitis I), en matraces agitadores de 250 ml incubados durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2 y 185 rpm.

Para el aislamiento de VEM, los cultivos se centrifugaron a 3500 rpm durante 30 min a 4 °C y los sobrenadantes se filtraron usando botellas de filtro Stericup (tamaño de poro de 0,22 pm).

Después se centrifugaron las muestras a 35.000 rpm (96.000 x g, promedio) a 4 °C durante 2 h, después se lavó con PBS y se centrifugó nuevamente a 35.000 rpm (96.000 x g, promedio) a 4 °C durante 2 h. Después de la retirada del sobrenadante, el sedimento se resuspendió en 200 a 500 pl de PBS.

Para verificar la calidad de la preparación y comparar la cantidad de vesículas producidas por las cepas mutantes MC58 TS y MC58A1483, Se cargó el mismo volumen de OMV para el análisis s DS-PAGE y las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie. Los resultados mostraron un patrón de proteína diferente en el mutante MC58A1483, en comparación con la cepa TS. La cuantificación total de proteínas por el ensayo de Lowry mostró un aumento de dos veces en la producción de VEM a partir del mutante, en comparación con la cepa TS (Figura 14A)

En un segundo experimento, las cepas MC58 y MC58A1483 se cultivaron hasta la fase exponencial (DO6000,5) en 40 ml de medio G^c , en matraces agitadores de 250 ml incubados a 37 °C, 5% de CO2 y 185 rpm. Para el aislamiento de VEM, se siguió el mismo protocolo.

Los resultados del análisis SDS-PAGE mostraron proteínas VEM solo del mutante MC58A1483. No se detectaron proteínas cuando se cargó el mismo volumen de VEM de la cepa TS. También la cuantificación por el ensayo de Lowry confirmó la ausencia de VEM en la preparación de la cepa TS (Figura 14B).

Se realizan otras preparaciones de VEM y se realiza un análisis proteómico de espectrometría de masas de la muestra en las fases de crecimiento exponencial y estacionaria. Se evalúa y compara la presencia de los principales antígenos de la vacuna 4CMenB.

Proteína LvtM de inactivación génica en Bordetella pertussis

Se identificaron seis peptidasas putativas en Bordetella pertussis Tohama I: BP1721, BP2956, BP0608, BP2919, BP3015 y BP1017. Bp 1721 y BP2919 tienen un dominio Lys-M (implicado en la unión a peptidoglugano) y un dominio Lyt-M (metalopeptidasas de tipo lisostafina) como NlpD de E. coli y NT022 de NTHi, las otras cuatro proteínas tienen solo el dominio Lyt-M. La organización del locus no ayuda a discriminar los diferentes homólogos, con la excepción de BP1721 que puede identificarse claramente como el homólogo de NlpD en B. pertussis. Las alineaciones múltiples mostraron una alta conservación del sitio catalítico de peptidasa entre BP2956 y NT013 y entre BP0608 y NT017. Las secuencias de genes y proteínas se muestran en SEQ ID NO: 47-58. BP1721 es un homólogo de NlpD. BP2956 es un supuesto homólogo NT013/YebA. BP0608 es un supuesto homólogo NT017/EnvC.

Se generó un mutante de inactivación génica en la cepa W28 9K-129G de Bordetella pertussis para el gen BP1721 (homólogo de NlpD). Las regiones de flanqueo de la secuencia de codificación del gen se amplificaron usando los siguientes conjuntos de cebadores:

La eliminación del gen BP1721 se obtuvo de la siguiente manera:

Se clonó un casete de resistencia a la kanamicina entre las regiones flanqueantes BP1721 en el vector suicida pSORTPI. La construcción pSORTP1-BP1721KO se introdujo en B. pertussis por conjugación. La integración del plásmido en el cromosoma después del primer evento de cruce se seleccionó por resistencia a gentamicina (presente en la estructura principal del plásmido) y resistencia a la kanamicina (presente en el inserto del plásmido). La pérdida del plásmido después del segundo evento de cruce y el reemplazo del gen BP1721 con el casete de kanamicina se seleccionó por resistencia a estreptomicina (el plásmido confiere sensibilidad a estreptomicina) y resistencia a kanamicina. El reemplazo del gen BP1721 con el casete de kanamicina se confirmó mediante amplificación por PCR usando cebadores externos a las regiones flanqueantes de BP1721 y usando B. pertussis W299K/129G como control. Los tamaños esperados de los productos de amplificación fueron 2189 pb para la cepa TS y 2574 pb para la cepa KO. Los cebadores usados fueron: BP1721 EXT 5' DIR: AACCTGGGCTTGAACt Cc (SEQ ID NO:63); BP1721 EXT 3' INV: ACACCAGCCAGGTATTGA (SEQ ID NO:64).

Los agregados celulares, que podrían deberse a mecanismos alterados de división celular, ya eran visibles desde el cultivo cuando la bacteria se cultivó en medio líquido. Los defectos de división celular se confirmaron posteriormente mediante análisis de microscopía confocal. Para el análisis de microscopía, se fijaron 50 pl de un cultivo líquido con paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con DAPI para visualizar el ADN. La cepa KO exhibió claramente un fenotipo de encadenamiento celular grave, en comparación con la cepa TS. (Véase la Figura 15).

Las cepas Bp W28 9G/129K y Bp W28 9G/129K ANlpD se cultivaron hasta la fase exponencial (DO6004,3-4,8) en 40 ml de caldo Stainer-Scholte (suplementado con estreptomicina 400 pg/ml) en matraces agitadores de 250 ml e incubados a 35 °C y 180 rpm.

Para el aislamiento de VEM, los cultivos se centrifugaron a 5000 rpm durante 45 min a 4 °C y los sobrenadantes se filtraron usando botellas de filtro Stericup (tamaño de poro de 0,22 pm). Las muestras fueron centrifugadas a 96000 x g a 4 °C durante 2 h, después se lavó con PBS y se centrifugó nuevamente a 96.000 x g a 4 °C durante 2 h. Después de la retirada del sobrenadante, el sedimento se resuspendió en 200 pl de PBS.

Para verificar la calidad de la preparación y comparar la cantidad de vesículas producidas por las cepas Bp W28 9G/129K y Bp W289G/129K ANlpD, se cargó el mismo volumen de OMV (10 pl) para el análisis de SDS-PAGE y las proteínas se tiñeron con SimpleBlue™ SafeStain (Life Technologies). Los resultados mostraron un patrón de proteína diferente en el mutante, en comparación con la cepa TS (véase la Figura 19).

Se genera un mutante de inactivación génica en la cepa W28 9K-129G de Bordetella pertussis para el gen BP2956 (supuesto NT013/homólogo de YebA). Las regiones de flanqueo de la secuencia de codificación del gen (negrita) se amplificaron usando los siguientes conjuntos de cebadores:

La eliminación del gen BP2956 se obtiene de la siguiente manera. Se clona un casete de resistencia a cloranfenicol entre las regiones flanqueantes BP2956 en el vector suicida pSORTP1. La construcción ^pSORTP1-BP2956^ko se introduce en B. pertussis por conjugación. La integración del plásmido en el cromosoma después del primer evento de cruce se selecciona por resistencia a gentamicina (presente en la estructura principal del plásmido) y resistencia a cloranfenicol (presente en el inserto del plásmido). La pérdida del plásmido después del segundo evento de cruce y el reemplazo del gen BP2956 con el casete de kanamicina se selecciona por resistencia a estreptomicina (el plásmido confiere sensibilidad a estreptomicina) y resistencia a cloranfenicol.

Estas cepas mutantes de deleción se analizan por su morfología celular, producción de VME y caracterización proteómica. En particular, se evalúa la presencia de la mayoría de los antígenos inmunogénicos (PT, FHA y 69K) de B. pertussis. Finalmente, estos mutantes se analizan in vitro por su función en la fisiología y/o la patogénesis de B. pertussis y las VME producidas se prueban en estudios de inmunogenicidad y reactividad cruzada.

Mutantes de inactivación génica para los otros supuestos homólogos de la proteína LytM: las regiones de flanqueo de la secuencia de codificación del gen (negrita) se amplificaron usando los siguientes conjuntos de cebadores:

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Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para preparar vesículas a partir de una bacteria gramnegativa en el que al menos una proteína que contiene un dominio catalítico LytM se inactiva comprendiendo una etapa de obtención de vesículas a partir de un cultivo de la bacteria, en el que:

(a) la al menos una proteína que contiene un dominio catalítico de LytM se inactiva mediante una mutación de inactivación génica en la región codificante del gen o su promotor que:

(i) reduce el nivel de ARNm que codifica la proteína al 0 % de aquel producido por la bacteria de tipo silvestre; o

(ii) inhibe la traducción del ARNm que codifica la proteína al 0 % de aquel producido por la bacteria de tipo silvestre.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la al menos una proteína que contiene el dominio catalítico LytM se selecciona de una cualquiera de NT013, NT022 y NT017 de NTHi, en la que:

NT013 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o comparte una identidad de secuencia del 95 % con la SEQ ID NO: 1,

NT022 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 5 o comparte una identidad de secuencia del 95 % con la SEQ ID NO: 5 y

NT017 tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 o comparte una identidad de secuencia del 95 % con la SEQ ID NO: 3.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que la bacteria gramnegativa se selecciona de H. influenzae no tipificable, N. meningitidis y B. pertussis.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que las vesículas no comprenden ninguna bacteria viva y/o entera.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende la etapa adicional de mezclar vesículas con un vehículo farmacéuticamente aceptable.