ES2791690T3

ES2791690T3 - Formulaciones liofilizadas

Info

Publication number: ES2791690T3
Application number: ES12744782T
Authority: ES
Inventors: James Kranz; Joseph Rinella
Original assignee: GlaxoSmithKline LLC
Current assignee: GlaxoSmithKline LLC
Priority date: 2011-02-09
Filing date: 2012-02-09
Publication date: 2020-11-05
Anticipated expiration: 2032-02-09
Also published as: JP2014506578A; SG192671A1; EA201391136A1; EP2672986B1; CN103492407A; KR20140044305A; US20140044717A1; MX2013009280A; JP6125436B2; AU2012214419A1; CA2827033A1; IL227896B; WO2012109429A3; US10286037B2; IL227896A0; ZA201306118B; WO2012109429A2; EP2672986A4; EP2672986A2; AU2012214419B2

Abstract

Un procedimiento de producción de una composición de polipéptido liofilizado que comprende: combinar un polipéptido con un aditivo volátil para formar una mezcla líquida y liofilizar la mezcla líquida para obtener una composición de polipéptido liofilizado, en la que la mezcla líquida comprende del 0,5 % al 5 % en volumen del aditivo volátil, y el aditivo volátil es t-butanol.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones liofilizadas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones útiles para reducir el tiempo de reconstitución de moléculas biológicas liofilizadas y procedimientos de uso.

Antecedentes de la invención

La liofilización es un procedimiento que elimina el solvente de una solución para formar un sólido o polvo que es estable y más fácil de almacenar a temperatura elevada que el líquido. La liofilización, también conocida como secado por congelación, implica la congelación seguida por la sublimación. La materia liofilizada resultante puede almacenarse sin refrigeración, reduciendo los costos de almacenamiento y transporte de la sustancia, así como el espacio de almacenamiento requerido para el producto. También puede reducir el peso del producto, lo que reduce los costos de envío y los costos relacionados. La liofilización es particularmente útil para conservar y almacenar diversas moléculas biológicas, porque aumenta su vida útil.

Las moléculas biológicas son más difíciles de estabilizar mediante formulación que las moléculas pequeñas debido al número de grupos químicos y a la dependencia de la estabilidad en el mantenimiento del plegamiento nativo. Por esta razón, muchas moléculas biológicas comerciales se liofilizan. En general, la liofilización mejora la estabilidad a través de (i) la eliminación de agua (ya que la mayoría de las degradaciones químicas biológicas son hidrolíticas) y (ii) la disminución de la movilidad general del sistema (ya que el movimiento dinámico de las cadenas laterales y las moléculas es necesario para que ocurran los eventos de degradación química y física).

Las moléculas biológicas liofilizadas se reconstituyen antes de su uso, a menudo en los mismos recipientes en los que se liofilizaron y almacenaron. El tiempo de reconstitución corto es preferible tanto para médicos como para pacientes. Si el tiempo de reconstitución de la molécula biológica liofilizada es demasiado largo, aumentará el tiempo de preparación, lo que dificultará la administración a muchos pacientes al mismo tiempo. Además, muchas moléculas biológicas están diseñadas para ser administradas por los propios pacientes. Un tiempo de reconstitución más corto asegura que los pacientes reconstituyan completamente la molécula biológica antes de la administración, mejorando así la seguridad y la eficacia.

Los esfuerzos anteriores para reducir el tiempo de reconstitución se han centrado principalmente en la formulación del tampón de reconstitución. En contraste, la presente invención se dirige a la adición de un aditivo volátil a la formulación del tampón usado para la liofilización de una molécula biológica. Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos y composiciones para reducir el tiempo de reconstitución de una molécula biológica liofilizada.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige a un procedimiento para producir una composición de polipéptido liofilizado que comprende: combinar un polipéptido con un aditivo volátil para formar una mezcla líquida y liofilizar la mezcla líquida para obtener una composición de polipéptido liofilizado, en la que la mezcla líquida comprende del 0,5 % al 5 % en volumen de un aditivo volátil, y el aditivo volátil es el t-butanol.

La presente invención también se dirige a un procedimiento para reducir el tiempo de reconstitución de una composición de polipéptido liofilizado que comprende: a) liofilizar una mezcla líquida que comprende el polipéptido, en la que la mezcla líquida comprende del 0,5 % al 5 % en volumen de un aditivo volátil, en el que el aditivo volátil es el t-butanol y b) reconstituir el polipéptido liofilizado con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable en la composición de polipéptido liofilizado para producir una composición de polipéptido líquido, en la que el tiempo para reconstituir el polipéptido liofilizado en presencia del aditivo volátil es menor que el tiempo para reconstituir el mismo polipéptido liofilizado en ausencia del aditivo volátil.

La presente invención también se dirige a un procedimiento para producir una composición de polipéptido líquido que comprende: obtener un polipéptido liofilizado producido por un procedimiento de la presente invención, y reconstituir el polipéptido liofilizado con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable para producir una composición de polipéptido líquido.

La presente invención también se dirige a una composición que comprende un polipéptido terapéutico, un tampón, un tensioactivo, al menos un excipiente y al menos un aditivo volátil, en la que el aditivo volátil es el t-butanol y el t-butanol está presente del 0,5 % al 5 % en volumen.

Se divulga una formulación adecuada para la liofilización de un polipéptido.

Se divulga una composición seca del polipéptido producida por un procedimiento de la presente invención.

Se divulga una composición de polipéptido líquido producida por un procedimiento de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Gráficos de los tiempos de reconstitución del liófilo mediante el uso del procedimiento de agitación.

Figura 2. Gráficos de los tiempos de reconstitución del liófilo mediante el uso del procedimiento sin perturbaciones.

Figura 3. Gráficos de los tiempos de reconstitución del liófilo en función del número de muestra. (A) Gráficos de cajas que resumen los tiempos de recon promedio en todas las pruebas en función del número de muestra. El límite de la caja más cercano a cero indica el percentil 25, la línea dentro de la caja marca la mediana, y el límite de la caja más alejado de cero indica el percentil 75. Los bigotes (barras de error) encima y debajo de la caja indican los percentiles 90 y 10. Los valores atípicos inferiores al percentil 10 o superiores al 90 se representan como símbolos. (B) Todos los tiempos de recon del liófilo se representan en función del número de muestra.

Figura 4. Gráficos de tiempos de reconstitución del liófilo en función del número de muestra, separados por el analista y el procedimiento de reconstitución.

Figura 5. Secuencia de aminoácidos de Albiglutide (SEQ ID NO:1).

Figura 6. Diagrama de barras que compara los puntos finales de reconstitución de las muestras liofilizadas con o sin la adición del tBuOH al 2 %. Las barras representan el promedio de todas las pruebas, y los bigotes indican una desviación estándar de todas las pruebas, en función del tipo de muestra.

Figura 7. Diagrama de barras que compara los puntos finales de reconstitución de las muestras liofilizadas con o sin la adición del tBuOH al 2 %. Las barras representan el promedio de todas las pruebas, y los bigotes indican una desviación estándar de todas las pruebas, en función del tipo de muestra.

Figura 8. Secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada (SEQ ID NO: 3) y ligera (SEQ ID NO: 4) del mAb anti-NOGO.

Figura 9. Secuencia de aminoácidos del dAb anti-TNFR1 (SEQ ID NO: 5).

Figura 10. Secuencia de aminoácidos de IL18 (SEQ ID NO: 6).

Figura 11. Secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada (SEQ ID NO: 7) y ligera (SEQ ID NO: 8) del anti-IL5.

Figura 12. Secuencia de aminoácidos de los dominios VH (SEQ ID NO: 9) y VL (SEQ ID NO: 10) del anti-CD20.

Descripción detallada de la invención

Se divulgan, entre otras, las formulaciones de liofilización. La invención también proporciona, entre otros, los métodos de producción y los métodos de uso de las formulaciones de liofilización. Los inventores han descubierto que cuando se agrega un aditivo volátil a una formulación de liofilización para un polipéptido, los tiempos de reconstitución para el polipéptido liofilizado se reducen. También se divulga una composición seca del polipéptido producida por un procedimiento de la presente invención.

La invención proporciona un número de procedimientos, reactivos y compuestos que pueden usarse para producir una composición del polipéptido que comprende: combinar un polipéptido con un aditivo volátil para formar una mezcla líquida y liofilizar la mezcla líquida para obtener una composición de polipéptido liofilizado.

En la presente memoria se proporcionan procedimientos para liofilizar polipéptidos de soluciones líquidas, y productos que comprenden polipéptidos liofilizados obtenidos de tales soluciones líquidas liofilizadas. En ciertas realizaciones, el aditivo volátil se disuelve en solución acuosa que contiene el polipéptido y se liofiliza para proporcionar composiciones sólidas que contienen el polipéptido liofilizado. En ciertas realizaciones, estas composiciones sólidas que contienen el polipéptido liofilizado son estables y son adecuadas para el almacenamiento, por ejemplo, adecuadas para el almacenamiento durante largos períodos de tiempo. Tal almacenamiento puede ser en condiciones ambientales, puede ser bajo temperatura controlada, puede ser bajo humedad controlada, u otra condición o conjunto de condiciones; y puede almacenarse en un recipiente sellado (por ejemplo, una botella o frasco con tapa extraíble, un tubo, una cápsula, un comprimido, un vial, una jeringa, una jeringa de doble cartucho u otro recipiente), y puede ser en un recipiente sellado bajo un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno, argón, helio u otro gas inerte) u otro recipiente con o sin otro elemento o compuesto en el recipiente.

Debe entenderse que la presente invención no se limita a procedimientos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, por supuesto, variar. Se debe entender también que la terminología usada en la presente memoria es para propósitos de describir las realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitativa. Como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un," "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contenido del texto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una combinación de dos o más polipéptidos, y similares.

"Aproximadamente de", como se usa en la presente memoria cuando se refiere a un valor medible, tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20 % o ± 10 %, que incluyen ± 5 %, ± 1 % y ± 0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos divulgados.

A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado como lo entiende comúnmente un experto en la técnica a la que se pertenece la invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente memoria pueden usarse en la práctica para la prueba de la presente invención, en la presente memoria se describen los materiales y métodos preferidos. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología.

Todos los residuos de "aminoácidos" identificados en la presente memoria están en la configuración natural L. Conforme a la nomenclatura de polipéptido estándar, las abreviaturas para los residuos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla.

Debe notarse que todas las secuencias de residuos de aminoácidos están representadas en la presente memoria por fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional de amino-terminal a carboxiterminal.

El aditivo volátil es un solvente orgánico. En una realización, el solvente orgánico comprende un oxihidrocarburo inferior, un halohidrocarburo inferior, un haloxihidrocarburo inferior, un sulfoxihidrocarburo inferior, un ciclohidrocarburo inferior o una combinación de los mismos. En una realización, el oxihidrocarburo inferior es metanol, etanol, npropanol, iso-propanol, n-butanol, iso-butanol, 2-butanol, t-butanol, pentanol, iso-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, tpentanol, metiletilcetona, alcohol bencílico, ácido acético, metiletilcetona o una combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, el aditivo volátil es acetonitrilo, acetato de amonio o carbonato de amonio. En una realización, la cantidad de acetato de amonio o de carbonato de amonio es de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM. En una realización, la cantidad de acetato de amonio o de carbonato de amonio es de aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 250 mM.

"Oxihidrocarburos inferiores" como se hace referencia en la presente memoria significa compuestos que poseen radicales hidrocarbilo y átomos de oxígeno que tienen de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 4 átomos de oxígeno. Los ejemplos de oxihidrocarburos inferiores incluyen, pero no se limitan a, alcanoles inferiores, cetonas inferiores, ácidos carboxílicos inferiores, ésteres carboxílicos inferiores, carbonatos inferiores y similares.

"Inferiores", como se refiere a compuestos químicos descritos en la presente memoria, se refiere a aquellos compuestos que tienen de 1 a 8 átomos de carbono.

"Alcanol inferior" se refiere a un grupo alquilo C-i-Cs saturado que puede ser de cadena ramificada o lineal con de 1 a 4 grupos hidroxilo. Los ejemplos de alcanoles inferiores que tienen 1 grupo hidroxilo incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, n-propanol, iso-propanol, n-butanol, iso-butanol, 2-butanol, t-butanol, pentanol, iso-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, t-pentanol y similares.

Lo ejemplos de "cetonas inferiores" incluyen, pero no se limitan a, acetona, metil etil cetona, metil propil cetona, metil isopropil cetona, metil butil cetona, metil isobutil cetona, metil 2-butil cetona, metil t-butil cetona, dietil cetona, etil propil cetona, etil isopropil cetona, etil butil cetona, etil isobutil cetona, etil t-butil cetona y similares.

Los ejemplos de "ácidos carboxílicos inferiores" incluyen, pero no se limitan a, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico y similares.

Los ejemplos de "ésteres carboxílicos inferiores" incluyen, pero no se limitan a, acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, acetato de isobutilo, acetato de 2-butilo, acetato det-butilo y similares.

Los ejemplos de "carbonatas inferiores" incluyen, pero no se limitan a, dimetil carbonato, metil etil carbonato, metil propil carbonato, metil isopropil carbonato, metil butil carbonato, metil iso-butil carbonato, metil 2-butil carbonato, metil t-butil carbonato, carbonato de dietilo, etil propil carbonato, etil isopropil carbonato, etil butil carbonato, etil isobutil carbonato, etil t-butil carbonato y similares.

"Halohidrocarburos inferiores" como se hace referencia en la presente memoria significa compuestos que poseen radicales hidrocarbilo y halo átomos que tienen de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 4 halo átomos. Preferentemente, los átomos de halo son cloro, flúor y bromo. Con mayor preferencia, los átomos de halo son átomos de cloro. Los ejemplos de halohidrocarburos inferiores incluyen, pero no se limitan a, cloruro de metilo, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono y similares.

"Haloxihidrocarburos inferiores" significa oxihidrocarburos como se define en la presente memoria que están sustituidos adicionalmente con de 1 a 4 átomos de halo. Un ejemplo de haloxihidrocarburo incluye, pero que no se limita a, hexafluoroacetona.

"Sulfoxihidrocarburos inferiores" significa oxihidrocarburos como se define en la presente memoria que también contienen un átomo de azufre. Los ejemplos de sulfoxihidrocarburos inferiores incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO) y dimetilsulfona.

"Ciclohidrocarburos inferiores" se refiere a radicales hidrocarbilo que se ciclan como, por ejemplo, anillos de hidrocarburos de 3 a 8 miembros. Un ejemplo de ciclohidrocarburo incluye, pero que no se limita a, ciclohexano.

“Polipéptido,” “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Un polipéptido puede ser de origen natural (derivado de tejido), de expresión recombinante o natural de preparaciones celulares procariotas o eucariotas, o producirse químicamente mediante métodos sintéticos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido es un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de manera similar a un aminoácido de origen natural. Los residuos no naturales están bien descritos en la literatura científica y de patentes; a continuación, se describen algunos ejemplos de composiciones no naturales útiles como miméticos de residuos de aminoácidos naturales y sus directrices. Los miméticos de aminoácidos aromáticos se pueden generar reemplazando, por ejemplo, D- o L-nafilalanina; D- o L-fenilglicina; D- o L-2 tieneilalanina; D- o L-1, -2,3- o 4-pireneilalanina; D- o L-3 tieneilalanina; D- o L-(2-piridinil)-alanina; D- o L-(3-piridinil)-alanina; D- o L-(2-pirazinil)-alanina; D- o L-(4-isopropil)-fenilglicina: D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina: D-p-fluoro-fenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanina; K- o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina: D- o L-2-indol(alquil)alaninas; y, D- o L-alquinilaminas, donde el alquilo puede ser sustituido o no sustituido por metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotilo, isopentilo, o un aminoácido no ácido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo y piridilo aromático.

"Péptido" como se usa en la presente memoria incluye péptidos que son variaciones conservadoras de esos péptidos específicamente ejemplificados en la presente memoria. "Variación conservadora" como se usa en la presente memoria denota el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservadoras incluyen, pero no se limitan a, la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina, norleucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. Los aminoácidos hidrofílicos neutros que pueden sustituirse entre sí incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. La "variación conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido, con la condición de que los anticuerpos generados para el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido. Tales sustituciones conservadoras están dentro de la definición de las clases de los péptidos de la invención. "Catiónico", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier péptido que posee una carga neta positiva a pH 7,4. La actividad biológica de los péptidos se puede determinar por procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica y descritos en la presente memoria.

"Recombinante" cuando se usa con referencia a una proteína indica que la proteína ha sido modificada por la introducción de un ácido nucleico o proteína heteróloga o la alteración de un ácido nucleico o proteína nativa.

Como se usa el "tiempo de reconstitución" y las variaciones gramaticales del mismo significa la cantidad de tiempo necesaria para que una molécula liofilizada se disuelva y/o se suspenda en forma líquida. Por ejemplo, el tiempo de reconstitución incluye, pero que no se limita al tiempo requerido para que un sedimento seco del polipéptido se suspenda en agua o un tampón después de la liofilización. En consecuencia, un tiempo de reconstitución de "reducción" o "disminución" y variaciones gramaticales del mismo, significa que se requiere menos tiempo para que el polipéptido se seque bajo una primera formulación y/o condición para suspender en un líquido en comparación con el mismo polipéptido secado bajo una segunda formulación y/o condición y suspendido en el mismo líquido.

La presente invención también se dirige a un procedimiento para disminuir el tiempo de reconstitución de una composición de polipéptido liofilizado que comprende: a) liofilizar una mezcla líquida que comprende el polipéptido, en la que la mezcla líquida comprende del 0,5 % al 5 % en volumen de un aditivo volátil, en la que el aditivo volátil es el t-butanol y b) reconstituir el polipéptido liofilizado con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable en la composición del polipéptido liofilizado para producir una composición de polipéptido líquido,

en el que el tiempo para reconstituir el polipéptido liofilizado en presencia del aditivo volátil es menor que el tiempo para reconstituir el mismo polipéptido liofilizado en ausencia del aditivo volátil.

La presente invención también se dirige a un procedimiento para producir una composición de polipéptido líquido que comprende: obtener un polipéptido liofilizado producido por un procedimiento de la presente invención, y reconstituir el polipéptido liofilizado con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable para producir una composición de polipéptido líquido. También se divulga una composición de polipéptido líquido producida por un procedimiento de la presente invención.

En ciertas realizaciones ejemplares, el polipéptido liofilizado se reconstituye fácilmente una vez que se pone en contacto con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el polipéptido liofilizado se mezcla, por ejemplo, se agita durante aproximadamente 5 segundos y después se deja reposar durante aproximadamente 5 a aproximadamente 30 minutos, con un agente dispersante para proporcionar una composición de polipéptido líquido. El agente dispersante es preferentemente agua estéril o "agua para inyección" (WFI). El polipéptido líquido puede diluirse adicionalmente con solución salina isotónica u otros excipientes para producir una concentración deseable antes de la administración. De acuerdo con la presente invención, los "excipientes" incluyen, pero que no se limitan a, estabilizadores, por ejemplo, albúmina sérica humana (hsa), albúmina sérica bovina (bsa), a-caseína, globulinas, a-lactoalbúmina, LDH, lisozima, mioglobina, ovoalbúmina, RNasa A; agentes tamponantes, por ejemplo, ácido cítrico, HEPES, histidina, acetato de potasio, citrato de potasio, fosfato de potasio (KH²PO⁴), acetato de sodio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio (NAH²PO⁴), Tris base y Tris-HCI; aminoácidos/metabolitos, por ejemplo, glicina, alanina (a-alanina, p-alanina), arginina, betaína, leucina, lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, prolina, 4-hidroxiprolina, sarcosina, ácido Y-aminobutírico (GABA), opinas (alanopina, octopina, estrombina) y N-óxido de trimetilamina (TMAO); tensioactivos, por ejemplo, polisorbato 20 y 80, y poloxámero 407: ácidos grasos, por ejemplo, fosfatidilcolina, etanolamina y acetiltriptofanato: polímeros, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y polivinilpirrolidona (PVP) 10, 24, 40; excipientes de bajo peso molecular, por ejemplo, arabinosa, celobiosa, etilenglicol, fructosa, fucosa, galactosa, glicerina/glicerol, glucosa, innositol, lactosa, manitol, maltosa, maltotriosa, manosa, melibiosa, 2-metil-2,4-pentanodiol, octulosa, propilenglicol, rafinosa, ribosa, sorbitol, sacarosa, trehalosa, xilitol y xilosa; y excipientes de alto peso molecular, por ejemplo, celulosa, p-ciclodextrina, dextrano (10 kd), dextrano (40 kd), dextrano (70 kd), ficoll, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilalmidón, maltodextrina, metocel, peg (6 kd), polidextrosa, polivinilpirrolidona (PVP) k15 (10 kd), PVP (40 kd), PVP k30 (40 kd), PVP k90 (1.000 kd), sephadex G 200 y almidón; antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico, cisteína HCI, tioglicerol, ácido tioglicólico, tiosorbitol y glutatión; agentes reductores, por ejemplo, cisteína HCI, ditiotreotol y otros tiol o tiofenos; agentes quelantes, por ejemplo, EDTA, EGTA, ácido glutámico y ácido aspártico; sales inorgánicas/metales, por ejemplo, Ca²⁺, Ni²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na²SO⁴, (NH⁴)²SO⁴, Na²HPO⁴/NaH²PO⁴, K²HPO⁴/KH²PO⁴, MgSO⁴y NaF; sales orgánicas, por ejemplo, acetato de Na, polietileno de Na, capilato de Na (octanoato de Na), propionato, lactato, succinato y citrato; solventes orgánicos, por ejemplo, acetonitrilo, dimetilsulfóxido (dmso) y etanol.

En realizaciones ejemplares de la presente invención, las composiciones líquidas del polipéptido que se producen exhiben características deseables, tales como características deseables de viscosidad y de tensión superficial.

El término "tensión superficial" se refiere a la fuerza de atracción ejercida por las moléculas debajo de la superficie sobre aquellas en la interfaz superficie/aire, como resultado de la alta concentración molecular de un líquido en comparación con la baja concentración molecular del gas. Los líquidos con valores bajos de tensión superficial, como los líquidos no polares, fluyen más fácilmente que el agua. Típicamente, los valores de las tensiones superficiales se expresan en newtons/metros o dinas/centímetros.

La "tensión superficial dinámica" a la que se refiere en la presente memoria es la interfaz superficie/aire y la tensión interfacial dinámica a la interfaz superficie/superficie. Existen varios procedimientos alternativos para medir la tensión superficial dinámica, por ejemplo, la tensionometría de superficie de burbuja cautiva o la tensionometría de superficie de burbuja pulsante.

El término "viscosidad" se refiere a la resistencia interna al flujo exhibida por un fluido a una temperatura especificada; la relación entre el esfuerzo cortante y la velocidad de corte. Un líquido tiene una viscosidad de un poise si una fuerza de 1 dina/centímetro cuadrado hace que dos superficies líquidas paralelas de un centímetro cuadrado de área y un centímetro cuadrado se separen a una velocidad de 1 cm/segundo. Un poise equivale a cien centipoises.

Cuando se hace referencia a la viscosidad aparente, se entiende que el valor de la viscosidad depende de las condiciones bajo las que se tomó la medición, como la temperatura, la velocidad de corte y el esfuerzo cortante empleado. La viscosidad aparente se define como la relación entre el esfuerzo cortante y la velocidad de corte aplicada. Existen varios métodos alternativos para medir la viscosidad aparente. Por ejemplo, la viscosidad se puede probar con un cono y placa adecuados, placa paralela u otro tipo de viscosímetro o reómetro.

También se divulga una formulación adecuada para la liofilización de un polipéptido. En ciertas realizaciones, la mezcla líquida comprende de aproximadamente 0,1 % en volumen a aproximadamente 10 % en volumen del aditivo volátil, de aproximadamente 0,25 % en volumen a aproximadamente 5 % en volumen de aditivo volátil, o de aproximadamente 2 % en volumen de aditivo volátil. En una realización, la formulación comprende aproximadamente fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2, aproximadamente trehalosa 117 mM, aproximadamente manitol 153 mM y aproximadamente polisorbato-80 al 0,01 % (p/v). En otra realización, la formulación comprende histidina 26 mM, trehalosa 150 mM, polisorbato 80 (PS80) al 0,02 %, pH 6,0. En ciertas realizaciones, el polipéptido comprende albiglutide (SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, el polipéptido comprende IL18 (SEQ ID NO: 6). En una realización, la formulación líquida comprende aproximadamente t-butanol al 2 %. En una realización, la formulación líquida comprende aproximadamente t-butanol al 2 %, aproximadamente fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2, aproximadamente trehalosa 117 mM, aproximadamente manitol 153 mM y aproximadamente polisorbato-80 al 0,01 % (p/v). En otra realización, la formulación comprende aproximadamente t-butanol al 2 %, aproximadamente histidina 26 mM, pH 6,0, aproximadamente trehalosa 150 mM y aproximadamente polisorbato 80 (PS80) al 0,02 %.

Como se usa en la presente memoria, una "proteína terapéutica" se refiere a cualquier proteína y/o polipéptido que puede administrarse a un mamífero para provocar una respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano que se busca, por ejemplo, por un investigador o clínico. Una proteína terapéutica puede provocar más de una respuesta biológica o médica. Además, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a cualquier cantidad que, comparado con un sujeto correspondiente que no ha recibido tal cantidad, da como resultado, pero que no se limita a, cura, prevención, o mejora de una enfermedad, trastorno, o efecto secundario, o una disminución en la velocidad de avance de una enfermedad o trastorno. El término también incluye dentro de su ámbito cantidades efectivas para mejorar la función fisiológica normal, así como cantidades efectivas para provocar una función fisiológica en un paciente que mejora o ayuda en el efecto terapéutico de un segundo agente farmacéutico.

En un aspecto, la presente invención se dirige a una composición que comprende: un polipéptido terapéutico, un tampón, un tensioactivo, al menos un excipiente y al menos un aditivo volátil, en la que el aditivo volátil es el t-butanol y el t-butanol está presente del 0,5 % al 5 % en volumen. En una realización, el polipéptido terapéutico comprende el GLP-1 o un fragmento y/o variante del mismo. En una realización, el polipéptido terapéutico comprende al menos dos polipéptidos GLP-1 (7-36(A8G)) genéticamente fusionados al N-terminal de la albúmina sérica humana. En una realización, el polipéptido terapéutico comprende la SEQ ID NO: 1. En una realización, la proteína terapéutica comprende un agonista del GLP-1. En una realización, la proteína terapéutica comprende la albúmina sérica humana.

Se divulga el uso de cualquiera de las composiciones de las reivindicaciones de la presente invención para hacer un medicamento que comprende la SEQ ID NO: 1.

En una realización, el tampón es fosfato de sodio. En una realización el tampón es histidina. En una realización, el tensioactivo es el polisorbato-80. En una realización, el al menos un excipiente se selecciona de: trehalosa, maltosa, sacarosa, manosa, lactosa, manitol, sorbitol, glicerol y dextrosa. En una realización, el excipiente comprende: trehalosa y manitol.

"Agonista del GLP-1", como se usa en la presente memoria, significa cualquier compuesto o composición capaz de simular la producción de insulina y/o que tiene al menos una actividad del GLP-1 que incluye, pero que no se limita a una hormona incretina y/o fragmento, variante y/o conjugado de los mismos y a una incretina mimética y/o fragmento, variante y/o conjugado de la misma.

"Hormona incretina", como se usa en la presente memoria, significa cualquier hormona que potencie la secreción de insulina o que, de otro modo, eleve el nivel o la insulina. Un ejemplo de una hormona incretina es el GLP-1. El GLP-1 es una incretina secretada por las células L intestinales en respuesta a la ingestión de alimentos. En un individuo sano, el GLP-1 juega un papel importante en la regulación de los niveles posprandiales de glucosa en sangre al estimular la secreción de insulina dependiente de glucosa por el páncreas, lo que resulta en una mayor absorción de glucosa en la periferia. El GLP-1 también suprime la secreción de glucagón, lo que reduce la producción de glucosa hepática. Además, el GLP-1 retrasa el tiempo de vaciado gástrico y ralentiza la motilidad del intestino delgado retrasando la absorción de alimentos. El GLP-1 promueve la competencia continua de las células beta por estimular la transcripción de genes involucrados en la secreción de insulina dependiente de glucosa y al promover la neogénesis de las células beta (Meier y otros Biodrugs 2003; 17 (2): 93-102).

"Actividad de GLP-1", como se usa en la presente memoria, significa una o más de las actividades del GLP-1 humano de origen natural, que incluyen, pero que no se limitan a, reducir la glucosa en sangre y/o plasma, estimular la secreción de insulina dependiente de glucosa o elevar el nivel de insulina, que suprime la secreción de glucagón, reduce la fructosamina, aumenta el aporte de glucosa y el metabolismo al cerebro, retrasa el vaciado gástrico y promueve la competencia de las células beta, y/o la neogénesis. Cualquiera de estas actividades y otras actividades asociadas con la actividad GLP-1 puede ser causada directa o indirectamente por una composición que tiene actividad GLP-1 o un agonista del GLP-1. A modo de ejemplo, una composición que tiene actividad GLP-1 puede estimular directa o indirectamente la producción de insulina dependiente de glucosa, mientras que la estimulación de la producción de insulina puede reducir indirectamente los niveles de glucosa en plasma en un mamífero.

Un "mimético de la incretina", como se usa en la presente memoria, es un compuesto capaz de potenciar la secreción de insulina o de otro modo elevar el nivel de insulina. Un mimético de la incretina puede ser capaz de estimular la secreción de insulina, aumentar la neogénesis de las células beta, inhibir la apoptosis de las células beta, inhibir la secreción de glucagón, retrasar el vaciado gástrico e inducir saciedad en un mamífero. Un mimético de la incretina puede incluir, pero no se limita a, cualquier polipéptido que tenga actividad GLP-1, que incluye pero que no se limita a, la exendina 3 y la exendina 4, incluidos cualquier fragmento y/o variantes y/o conjugados de los mismos.

Como se usa en la presente memoria "conjugar" o "conjugado" y las variaciones gramaticales de los mismos se refieren a dos moléculas que están unidas entre sí. Por ejemplo, un primer polipéptido puede estar unido covalentemente o no covalentemente a un segundo polipéptido. El primer polipéptido puede estar unido covalentemente por un enlazador químico o puede estar genéticamente fusionado con el segundo polipéptido, en el que el primer y segundo polipéptido comparten una cadena principal común de polipéptidos.

Como se usa en la presente memoria, "fragmento", cuando se usa en referencia a un polipéptido, es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es igual a parte, pero no a toda la secuencia de aminoácidos de todo el polipéptido de origen natural. Los fragmentos pueden ser "independientes" o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman parte o región como una única región continua en un único polipéptido más grande. A modo de ejemplo, un fragmento del GLP-1 de origen natural incluiría los aminoácidos 7 a 36 de los aminoácidos 1 a 36 de origen natural. Además, los fragmentos de un polipéptido también pueden ser variantes de la secuencia parcial de origen natural. Por ejemplo, un fragmento del GLP-1 que comprende los aminoácidos 7-30 del GLP-1 de origen natural también puede ser una variante que tenga sustituciones de aminoácidos dentro de su secuencia parcial.

"Variante" como se usa el término en la presente memoria, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero conserva propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discutió más abajo. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias de referencia del polipéptido y de la variante sean muy similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o un polipéptido puede ser de origen natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que se produce de forma natural. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no son de origen natural pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. Las variantes también pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos o fragmentos de los mismos que tienen modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácidos. Una modificación química incluye, pero que no se limita a, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces y eliminar restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de los aminoácidos incluyen, sin limitación, la acilación de grupos lisina-£-amino, la N-alquilación de arginina, histidina o lisina, la alquilación de grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico, y la desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de des-amino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, alquilamida inferior, dialquilamida y éster de alquilo inferior. Además, uno o más grupos laterales, o grupos terminales, pueden estar protegidos por grupos protectores conocidos por el químico de proteínas normalmente capacitado.

En una realización de la presente invención, el polipéptido es un polipéptido GLP-1. El "polipéptido GLP-1" incluye, pero que no se limita a, el GLP-1 o un fragmento, variante y/o conjugado del mismo. Los fragmentos y/o variantes y/o conjugados del GLP-1 de la presente invención típicamente tienen al menos una actividad del GLP-1. Un GLP-1 o un fragmento, variante y/o conjugado del mismo puede comprender la albúmina sérica humana. La albúmina sérica humana puede conjugarse con el GLP-1 o fragmento y/o variante del mismo. La albúmina sérica humana puede conjugarse con una hormona incretina (tal como el GLP-1) y/o un mimético de la incretina (tal como la exendina 3 y la exendina 4) y/o fragmentos y/o variantes de la misma a través de un enlazador químico antes de la inyección o puede ser vinculado químicamente a la albúmina sérica humana de origen natural in vivo (véase por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,593,295 y la patente de Estados Unidos núm. 6,329,336, incorporadas en la presente memoria como referencia en su totalidad). Alternativamente, la albúmina sérica humana puede fusionarse genéticamente a un GLP-1 y/o fragmento y/o variante del mismo u otro agonista del GLP-1 tal como la exendina-3 o la exendina-4 y/o fragmentos y/o variantes de las mismas. En las siguientes solicitudes PCT se proporcionan ejemplos del GLP-1 y fragmentos y/o variantes de los mismos genéticamente fusionados con albúmina sérica humana: WO 2003/060071, WO 2003/59934, WO 2005/003296, WO 2005/077042 (incorporado en la presente memoria como referencia en su totalidad).

Los polipéptidos que tienen actividad GLP-1 pueden comprender al menos un fragmento y/o variante del GLP-1 humano. Los dos fragmentos de origen natural del GLP-1 humano están representados en la SEQ ID NO: 2.

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-

29 30 31 32 33 34 35 36 37

Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa (SEQ ID NO.: 2)

en la que: Xaa en la posición 37 es Gly (de aquí en adelante designado como "GLP-1(7-37)"), o -NH2 (de aquí en adelante designado como "GLP-1(7-36)"). Los fragmentos del GLP-1 pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas del GLP-1 que comprenden, o que consisten alternativamente en, aminoácidos 7 a 36 del GLP-1 humano (GLP-1(7-36)). Las variantes del GLP-1 o sus fragmentos pueden incluir, pero no se limitan a, una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos en el GLP-1 de tipo salvaje o en los fragmentos de origen natural del GLP-1 que se muestran en la SEQ ID NO.: 2. Las variantes del GLP-1 o los fragmentos del GLP-1 pueden incluir, pero no se limitan a, sustituciones de un residuo de alanina análoga a la alanina 8 del GLP-1 de tipo salvaje, tal alanina que se muta a una glicina (de aquí en adelante denominada "A8G") (Véase por ejemplo, los mutantes divulgados en la patente de Estados Unidos núm. 5,545,618, incorporada en la presente memoria como referencia en su totalidad).

En algunos aspectos, al menos un fragmento y variante del GLP-1 comprende el GLP-1(7-36(A8G)) y está genéticamente fusionado a la albúmina sérica humana. En una realización adicional, los polipéptidos de la invención comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o más moléculas orientadas en tándem del GLP-1 y/o fragmentos y/o variantes de los mismos fusionados al N- o C-terminal de la albúmina sérica humana o a una variante de la misma. Otras realizaciones tienen tales polipéptidos A8G fusionados al N- o C-terminal de la albúmina o una variante de la misma. Un ejemplo de dos fragmentos y/o variantes del GLP-1(7-36)(A8G) orientados en tándem fusionados al N-terminal de la albúmina sérica humana comprende la SEQ ID NO:1, que se presenta en la Figura 3. En otro aspecto, al menos un fragmento y variante del GLP-1 comprende al menos dos GLP-1 (7-36(A8G)) en tándem y genéticamente fusionados con la albúmina sérica humana. En un aspecto, al menos dos GLP-1(7-36(A8G)) se fusionan genéticamente al N-terminal de la albúmina sérica humana. Al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1 puede comprender la SEQ ID No.: 1.

Las variantes de GLP-1(7-37) pueden denotarse, por ejemplo, como Glu22-GLP-1(7-37)OH que designa una variante del GLP-1 en la que la glicina que normalmente se encuentra en la posición 22 de GLP-1(7-37)OH ha sido reemplazada por el ácido glutámico; Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH designa un compuesto GLP-1 en el que la alanina que normalmente se encuentra en la posición 8 y la glicina que normalmente se encuentra en la posición 22 de GLP-1(7-37)OH han sido reemplazadas por valina y ácido glutámico, respectivamente. Los ejemplos de variantes del GLP-1 incluyen, pero no se limitan a,

Val8-GLP-1(7-37)OH Gly8-GLP-1(7-37)OH Glu22-GLP-1(7-37)OH

Asp22-GLP-1(7-37)OH Arg22-GLP-1(7-37)OH Lys22-GLP-1(7-37)OH

Cys22-GLP-1(7-37)OH Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH

Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH Val8-Cys22-GLP-1(7-37)OH

Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH

Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH Gly8-Cys22-GLP-1(7-37)OH Glu22-GLP-1(7-36)OH

Asp22-GLP-1(7-36)OH Arg22-GLP-1(7-36)OH Lys22-GLP-1(7-36)OH

Cys22-GLP-1(7-36)OH Val8-Glu22-GLP-1(7-36)OH Val8-Asp22-GLP-1(7-36)OH

Val8-Arg22-GLP-1(7-36)OH Val8-Lys22-GLP-1(7-36)OH Val8-Cys22-GLP-1(7-36)OH

Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)OH Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)OH Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)OH

Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)OH Gly8-Cys22-GLP-1(7-36)OH Lys23-GLP-1(7-37)OH

Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH His24-GLP-1(7-37)OH

Val8-His24-GLP-1(7-37)OH Gly8-His24-GLP-1(7-37)OH Lys24-GLP-1(7-37)OH

Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH Gly8-Lys13-GLP-1(7-37)OH Glu30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH Asp30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Asp30-GLP-1(7-37)OH Gln30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Gln30-GLP-1(7-37)OH Tyr30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH Ser30-GLP-1(7-37)OH

Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH Gly8-Ser30-GLP-1(7-37)OH His30-GLP-1(7-37)OH

Val8-His30-GLP-1(7-37)OH Gly8-His30-GLP-1(7-37)OH Glu34-GLP-1(7-37)OH

Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH Gly8-Glu34-GLP-1(7-37)OH Ala34-GLP-1(7-37)OH

Val8-Ala34-GLP-1(7-37)OH Gly8-Ala34-GLP-1(7-37)OH Gly34-GLP-1(7-37)OH

Val8-Gly34-GLP-1(7-37)OH Gly8-Gly34-GLP-1(7-37)OH Ala35-GLP-1(7-37)OH

Val8-Ala35-GLP-1(7-37)OH Gly8-Ala35-GLP-1(7-37)OH Lys35-GLP-1(7-37)OH

Val8-Lys35-GLP-1(7-37)OH Gly8-Lys35-GLP-1(7-37)OH His35-GLP-1(7-37)OH

Val8-His35-GLP-1(7-37)OH Gly8-His35-GLP-1(7-37)OH Pro35-GLP-1(7-37)OH

Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH Gly8-Pro35-GLP-1(7-37)OH Glu35-GLP-1(7-37)OH

Gly8-Glu35-GLP-1(7-37)OH Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH Val8-His37-GLP-1(7-37)OH

Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7- Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7- Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH 37)OH 37)OH

Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7- Val8-His37-GLP-1-(7-37)OH Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH

37)OH

Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7- Gly8-Glu22-Ala27-GLP-1(7- Val8-Lys22-Glu23-GLP-1(7-37)OH 37)OH 37)OH

Gly8-Lys22-Glu23-GLP-1(7- Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH

37)OH.

Las variantes del GLP-1 también pueden incluir, pero no se limitan a, el GLP-1 o fragmentos del GLP-1 que tienen modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácidos. Una modificación química incluye, pero que no se limita a, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces y eliminar restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de los aminoácidos incluyen, sin limitación, la acilación de grupos lisina-£-amino, la N-alquilación de arginina, histidina o lisina, la alquilación de grupos de ácido carboxílico glutámico o aspártico, y la desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de des-amino, N-alquilo inferior, N-di-alquilo inferior y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxilo terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de amida, alquilamida inferior, dialquilamida y éster de alquilo inferior. Además, uno o más grupos laterales, o grupos terminales, pueden estar protegidos por grupos protectores conocidos por el químico de proteínas normalmente capacitado.

Los fragmentos o variantes del GLP-1 también pueden incluir polipéptidos en los que se han agregado uno o más aminoácidos al N-terminal y/o al C-terminal del fragmento o variante de GLP-1(7-37)OH. Los aminoácidos en el GLP-1 en los que se han agregado aminoácidos al N-terminal o al C-terminal se denotan por el mismo número que el aminoácido correspondiente en GLP-1(7-37)OH. Por ejemplo, el aminoácido N-terminal de un compuesto GLP-1 obtenido mediante la adición de dos aminoácidos al N-terminal de GLP-1(7-37)OH está en la posición 5; y el aminoácido C-terminal de un compuesto GLP-1 obtenido mediante la adición de un aminoácido al C-terminal de GLP-1(7-37)OH está en la posición 38. Por lo tanto, la posición 12 está ocupada por la fenilalanina y la posición 22 está ocupada por la glicina en ambos compuestos GLP-1, como en GLP-1(7-37)OH. Los aminoácidos 1-6 de un GLP-1 con aminoácidos añadidos al N-terminal pueden ser iguales o una sustitución conservadora del aminoácido en la posición correspondiente de GLP-1(1-37)OH. Los aminoácidos 38-45 de un GLP-1 con aminoácidos añadidos al C-terminal pueden ser iguales o una sustitución conservadora del aminoácido en la posición correspondiente del glucagón o de la exendina-4.

La albiglutide es un análogo novedoso del GLP-1 sintetizada a través de la fusión genética de una forma del péptido resistente a la DPP-IV como dímero de la albúmina humana, que proporciona una actividad de GLP-1 de larga duración con una vida media de aproximadamente 5 a 7 días. La secuencia primaria de aminoácidos de la albiglutide es la SEQ ID NO.:1.

La composición que comprende al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1 se administra a un humano de una vez al día a una vez al mes y se puede administrar una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada siete días, una vez cada catorce días , una vez cada cuatro semanas y/o una vez al mes. En otro aspecto, una primera dosis y una segunda dosis de una composición que comprende al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1 se administra a un humano. La primera y la segunda dosis pueden ser iguales o diferentes. Cada dosis de al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1 puede comprender de aproximadamente 0,25 |jg a aproximadamente 1.000 mg de al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1. Las dosis pueden incluir, pero no se limitan a, 0,25 jg , 0,25 mg, 1 mg, 3 mg, 6 mg, 16 mg, 24 mg, 48 mg, 60 mg, 80 mg, 104 mg, 20 mg, 400 mg. 800 mg hasta aproximadamente 1.000 mg del al menos un polipéptido que tiene actividad GLP-1.

En una realización, las composiciones de la presente invención comprenden aproximadamente 15 mg, 30 mg, 50 mg o 100 mg de SEQ ID NO:1.

En otra realización el polipéptido es un polipéptido de unión al antígeno. En una realización, el polipéptido de unión al antígeno se selecciona del grupo que consiste en un receptor soluble, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio variable único de inmunoglobulina, un Fab, un F(ab')2, una Fv, una Fv unida a disulfuro, un scFv, un anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, una scFv ligada a disulfuro, o un diacuerpo.

El término "polipéptido de unión al antígeno" como se usa en la presente memoria se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otras construcciones de proteínas que son capaces de unirse a un antígeno.

En una realización, el polipéptido de unión al antígeno es un mAb anti-NOGO. En una realización, el polipéptido de unión al antígeno comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 3 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 4.

En una realización, el polipéptido de unión al antígeno es un mAb anti-IL5. En una realización, el polipéptido de unión al antígeno comprende la cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 8.

En una realización, el polipéptido de unión al antígeno es un mAb anti-CD20. En una realización, el polipéptido de unión al antígeno comprende la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 10. En una realización, el polipéptido de unión al antígeno es un dominio variable único de inmunoglobulina. En una realización, el dominio variable único de inmunoglobulina es un dAb anti-TNFR1. En una realización, el dominio variable único de inmunoglobulina comprende la SEQ ID NO: 5.

Los términos Fv, Fc, Fd, Fab o F(ab)2 se usan con sus significados estándar (véase, por ejemplo, Harlow y otros, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado que contiene una región variable natural (cadenas ligeras y cadenas pesadas) derivada de un anticuerpo donante en asociación con regiones constantes de la cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor.

Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo modificado genéticamente que tiene sus CDR derivadas de una inmunoglobulina de un donante no humano, las partes restantes derivadas de inmunoglobulina de la molécula se derivan de una (o más) inmunoglobulina(s) humana(s). Además, los residuos de soporte del marco pueden alterarse para preservar la afinidad de unión (véase, por ejemplo, Queen y otros, Proc. Natl. Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson y otros, Bio/Technology, 9:421 (1991)). Un anticuerpo humano aceptor adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAt .RTM., la base de datos Los Alamos y la base de datos Swiss Protein, por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco del anticuerpo donante (en base a aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena pesada para la inserción de las CDR del donante. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones marco constantes o variables de la cadena ligera se puede seleccionar de manera similar. Cabe notar que no se requiere que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo aceptor se originen a partir del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe varias formas de producir tales anticuerpos humanizados--véase, por ejemplo, los documentos EP-A-0239400 y EP-A-054951.

El término "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) que contribuye con las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDR u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a una primera pareja de inmunoglobulina, para proporcionar región codificante de inmunoglobulina alterada y el anticuerpo resultante expresado alterado con la especificidad antigénica y la actividad neutralizante característica del anticuerpo donante.

El término "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) heterólogo al anticuerpo donante, que contribuye con todas (o cualquier parte, pero en algunas realizaciones todas) de las secuencias de aminoácidos que codifican las regiones marco de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera a la primera pareja de inmunoglobulina. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.

Las "CDR" se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ta Ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Institutos Nacionales de Salud (1987). Hay tres CDR de cadena pesada ytres de cadena ligera (o regiones CDR) en la porción variable de una inmunoglobulina. Por lo tanto, "CDR", como se usa en la presente memoria, se refiere a las tres CDR de cadena pesada, o las tres CDR de cadena ligera (o ambas CDR de cadena pesada y ligera, si es apropiado). La estructura y el plegamiento de proteínas del anticuerpo puede significar que otros residuos se consideran parte de la región de unión al antígeno y una persona experta lo entendería. Véase, por ejemplo, Chothia y otros, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.

Como se usa en la presente memoria, el término "dominio" se refiere a una estructura de proteína plegada que tiene una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son los responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas y, en muchos casos, pueden agregarse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de la función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable único del anticuerpo" es un dominio del polipéptido plegado que comprende secuencias características de dominios variables del anticuerpo. Entonces, incluye dominios variables de anticuerpos completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los que uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables de los anticuerpos, o dominios variables de los anticuerpos que se han truncado o comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que retienen al menos la actividad de unión y la especificidad del dominio de longitud completa.

La expresión "dominio variable único de la inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable del anticuerpo (Vh, Vhh, V) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio V diferente. Un dominio variable único de la inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o heteromultímero) con otras regiones variables diferentes o dominios variables donde las otras regiones o dominios no son necesarios para la unión al antígeno por el dominio variable de inmunoglobulina único (es decir, donde el dominio variable único de inmunoglobulina se une al antígeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un "dominio de anticuerpo" o "dAb" es lo mismo que un "dominio variable único de la inmunoglobulina" que es capaz de unirse a un antígeno como se usa el término en la presente memoria. Un dominio variable único de la inmunoglobulina puede ser un dominio variable del anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables únicos del anticuerpo de otras especies tales como roedores (por ejemplo, como se divulga en el documento WO 00/29004), tiburón nodriza y dAb de Camélido Vhh (nanocuerpos). Vhh de camélidos son polipéptidos de inmunoglobulina de dominio variable único que se derivan de especies como camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. Tales dominios Vhh pueden humanizarse de acuerdo con las técnicas estándar disponibles en la técnica, y tales dominios todavía se consideran "dominios anticuerpos" de acuerdo con la invención. Como se usa en la presente memoria "Vh" incluye dominios Vhh de camélido. Los NARV son otro tipo de dominio variable único de inmunoglobulina que se identificaron en peces cartilaginosos, incluido el tiburón nodriza. Estos dominios también se conocen como la región variable del Nuevo Receptor de Antígeno (abreviada comúnmente como V (NAR) o NARV). Para más detalles, véase Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) y US20050043519A.

El término "Dominio de unión al epítopo" se refiere a un dominio que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de una región o dominio V diferente, este puede ser un dominio de anticuerpo (dAb), por ejemplo, un dominio variable único de la inmunoglobulina humana, de camélido o de tiburón.

Como se usa en la presente memoria, el término "sitio de unión al antígeno" se refiere a un sitio en una proteína que es capaz de unirse específicamente al antígeno, este puede ser un dominio único, por ejemplo un dominio de unión al epítopo, o puede estar emparejado con los dominios Vh/Vl como se pueden encontrar en un anticuerpo estándar. En algunos aspectos de la invención, los dominios Fv de la cadena ligera (ScFv) pueden proporcionar sitios de unión al antígeno.

Los términos "mAbdAb" y dAbmAb "se usan en la presente memoria para referirse a las proteínas de unión al antígeno de la presente invención. Los dos términos pueden usarse indistintamente, y están destinados a tener el mismo significado como se usa en la presente memoria.

Ejemplos

La presente invención puede entenderse además como referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 ^:liofilización de la albiglutide en la presencia de t-butanol, etanol, acetonitrilo, Acetato de NH⁴ 0 NH⁴HCO³

Las muestras de albiglutide se prepararon para liofilización de acuerdo con la matriz de preparación analítica descrita en la Tabla I. Los liófilos se prepararon por la liofilización de 0,750 ml de la solución que contenía 50 mg de albiglutide en fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2, con trehalosa 117 mM, manitol 153 mM, polisorbato-80 al 0,01 % (p/v) en viales (2 ml 13 mm) que contenían la concentración apropiada de t-butanol, etanol y acetonitrilo (1, 5 y 10 % p/v); y la concentración adecuada de Acetato de NH⁴y de NH⁴HCO³(100 mM y 250 mM).

Tabla 1. Condiciones de la albiglutide en función del número de muestras.

Agitar/Descansar No interrumpido

# de Condiciones

Recon (min) Veces de cambio Recon (min) Veces de cambio 1: Form. Tampón 7,18 (+/-0,75) N.A. 18,09 (+/-4,55)

2: tButanol al 1 % 3,23 (+/-0,43) 0.45 6,01 (+/-1,56) 0.33

3: tButanol al 5 % 5,38 (+/-0,44) 0.75 9,18 (+/-4,57) 0.51

4: tButanol al 10 % 4,06 (+/-0,56) 0.57 4,80 (+/-0,10) 0.27

5: Etanol al 1 % 6,17 (+/-0,67) 0.86 14,89 (+/-2,83) 0.82

6: Etanol al 5 % 6,85 (+/-0,61) 0.95 13,47 (+/-0,56) 0.74

7: Etanol al 10% 5,78 (+/-0,55) 0.81 11,01 (+/-0,83) 0.61

8: Acetonitrilo al 1 % 5,90 (+/-0,55) 0.82 13,22 (+/-0,60) 0.73

9: Acetonitrilo al 5 % 6,05 (+/-0,53) 0.84 12,60 (+/-1,64) 0.70

10: Acetonitrilo al 10 % 5,82 (+/-0,51) 0.81 10,27 (+/-0,11) 0.57

11: Acetato de NH4 100 mM 10,73 (+/-0,59) 0.59

12: Acetato de NH4250 mM 6,65 (+/-0,90) 0.93 10,98 (+/-3,22) 0.61

13: NH4HCO3 100 mM 6,55 (+/-0,56) 0.91 10,63 (+/-2,26) 0.59

14: NH4HCO3250 mM 6,72 (+/-0,20) 0.94 9,95 (+/-1,85) 0.55

(n = 5 ) (n = 3)

Las muestras se liofilizaron mediante el uso de un liofilizador LyoStar en las siguientes condiciones de ciclado:

Ciclo de 74 hr

Estadio Tiempo (min) Temp Presión

Carga 0 Atmosférica

60 Atmosférica

Rampa para

Atmosférica

Congelar

Congelar 300

Atmosférica

Rampa para 360

Atmosférica

Recocido

Recocido 660

Atmosférica

Rampa para 1er

Atmosférica

Secado

Volver a congelar 900

Atmosférica

Extraído al Vacío 930

100 um Hg

1er Secado 1050

100 um Hg

Rampa para 1er 1170

100 um Hg

Secado

1er Secado 3570

100 um Hg

Rampa para 2do 3930

100 um Hg

Secado

2do Secado 4350

100 um Hg

Rampa de 2 horas a 4470

100 um Hg

RT

Mantener a RT 4650 100 um Hg

Ciclo de 74 hr

Estadio Tiempo (min) Temp Presión

74.5

Ejemplo 2-Reconstitución de la albiglutide liofilizada

Los liófilos se reconstituyeron con 0,675 ml de agua para inyección (WFI) mediante una jeringa de 1 ml y una aguja de 25G(5/8") a través del tapón del vial liofilizado (jeringas de tuberculina, Becton-Dickinson #309626). El volumen de 0,675 ml se corrige para el volumen de los componentes secos dando como resultado un volumen final de 0,75 ml. La reconstitución se realizó mediante el uso de un "procedimiento de agitación" o un "procedimiento sin interrupciones". Para el procedimiento de agitación, la muestra se agitó durante 10 segundos, seguido de 15 segundos de descanso. Para el procedimiento sin perturbaciones, la muestra se balanceó hacia adelante y hacia atrás durante 5 segundos y después se dejó sin perturbaciones. Se consideró que las muestras se habían reconstituido cuando no se veían partículas en los viales. Los resultados para ambos procedimientos de reconstitución se muestran en la Tabla 1 y también en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo 3-Liofilización de la albiglutide en presencia de t-butanol

Las muestras de albiglutide se prepararon para la liofilización de acuerdo con la matriz de preparación analítica descrita en la Tabla I. Los liófilos se prepararon por la liofilización de 0,750 ml de la solución que contenía 50 mg de albiglutide en fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2, con trehalosa 117 mM, manitol 153 mM, polisorbato-80 al 0,01 % (p/v) en viales (2 ml 13 mm) que contenían la concentración apropiada de t-butanol (entre 34 y 202 mM, o 0,25 a 2 % p/v).

Tabla 2. Condiciones de la albiglutide en función del número de muestras.

Ciclo de 74 hr

Estadio Tiempo (min) Temp Presión

Carga 0 5 °C Atmosférica

60 5 °C Atmosférica

Rampa para Congelar 180 Atmosférica

Congelar 300 Atmosférica

Rampa para Recocido 360 -15 °C Atmosférica

Recocido 660 -15 °C Atmosférica

Rampa para 1er Secado 780 Atmosférica

Volver a congelar 900

Atmosférica

Extraído al Vacío 930

100 um Hg

1er Secado 1050

100 um Hg

Rampa para 1er Secado 1170

100 um Hg

1er Secado 3570

100 um Hg

Rampa para 2do Secado 3930

100 um Hg

2do Secado 4350

100 um Hg

Rampa de 2 horas a RT 4470

100 um Hg

Mantener a RT 4650 100 um Hg

74.5

Ejemplo 4-Reconstitución de la albiglutide liofilizada

Los liófilos se reconstituyeron con 0,675 ml de agua para inyección (WFI) mediante una jeringa de 1 ml y una aguja de 25G(5/8") a través del tapón del vial liofilizado (jeringas de tuberculina, Becton-Dickinson #309626). El volumen de 0,675 ml se corrige para el volumen de los componentes secos dando como resultado un volumen final de 0,75 ml. La reconstitución se realizó mediante el uso de un "procedimiento sin perturbaciones" (la adición del agua fue seguida de una mezcla de luz inmediata seguida de dejar que el vial permaneciera sin perturbaciones). La adición del agua se realizó con cuatro variaciones en base al analista (tres personas diferentes que realizan la etapa de reconstitución) y el procedimiento de pipeteo:

Analista 1: reconstitución mediante jeringa a través del tapón.

Analista 2: reconstitución mediante jeringa a través del tapón.

Analista 3: reconstitución mediante jeringa a través del tapón.

Analista 1: reconstitución mediante el procedimiento tradicional de pipeteo Rainin P1000.

Los tiempos de reconstitución individuales se resumen en la Tabla 4 y gráficamente en la Figura 3. Hay un claro efecto de t-butanol añadido antes de la liofilización en los valores de punto final del tiempo de reconstitución resultante. Las muestras control se liofilizaron solo en la presencia de tampón de formulación (sin el aditivo volátil) y dieron un promedio de t = 17,87 (± 2,94) min (n = 26); los valores máximo y mínimo fueron t = 12,25 min y t = 26,53 min, respectivamente. Las muestras de t-Butanol al 0,25 % fueron virtualmente idénticas a las muestras control, con un tiempo promedio de punto final de reconstitución de t = 19,35 (± 4,08) min (n = 20); los valores máximo y mínimo fueron t = 12,42 min y t = 28,90 min, respectivamente.

A concentraciones de t-butanol al 0,5 % o más, existe una clara aceleración de las tasas de reconstitución con valores de punto final que disminuyen con el aumento de las concentraciones de t-butanol. A t-butanol al 0,5 %, el punto final promedio del tiempo de reconstitución sobre todos los resultados fue aproximadamente el 65 % del grupo control, con t = 11,84 (± 2,94) min (n = 19); los valores máximo y mínimo fueron t = 0,58 min y t = 17,93, respectivamente. Tenga en cuenta que una muestra en el grupo de 0,5 % dio > 37 min. En este caso, el liófilo se pegó al costado del vial por encima del menisco del solvente y no pudo entrar en solución, por lo que el dato puntual se excluyó del promedio.

Comparando los grupos de t-butanol al 1 %, t-butanol al 1,5 % y t-butanol al 2 %, hay una aceleración marcada en los tiempos de reconstitución con puntos finales de t = 7,71 (± 2,44) min (n = 30) a tButanol al 1 %, t = 7,16 (± 2,65) min (n = 20) a tButanol al 1,5 %, y t = 4,74 (± 1,75) min (n = 20) a 2 % de tButanol. Los valores de punto final de reconstitución máximo y mínimo fueron t = 1,37 min y t = 11,67 min a tButanol al 1 %, t = 3,90 min y t = 15,50 min a tButanol al 1,5 %, y t = 2,75 min y t = 9,25 min a tButanol al 2 %. Estos intervalos de valores sugerirían que los tiempos de reconstitución para la albiglutide liofilizada en presencia de tButanol al 2 % en el tampón de formulación podrían ser 3 veces más rápidos, en el orden de 10 minutos, que los recomendados actualmente para la albiglutide en el tampón de formulación, 30 min. En sumario, las muestras de tButanol al 2 % son aproximadamente 1,5 veces más rápidas que las muestras de tButanol al 1 %, y es ~3,75 veces más rápido que el grupo de muestra control.

Tabla 4. Puntos finales del tiempo de reconstitución promedio para los liófilos de la albiglutide, agrupados de acuerdo con el tipo de muestra.

Agrupación Ctrol tBu al 2 % tBu al 1,5% tBu al 1 % tBu al 0,5 % tBu al 0,25 %

Todas las pruebas - Promedio

4,74 7,16 7,71 11,84 19,35

(desv est) 2,94 1,75 2,65 2,44 5,18 4,08

(n) 26 20 20 30 19 20

Analista 1 (jeringa)-Promedio

4,61 6,51 6,97 13,53 17,37

(desv est) 1,42 1,57 1,27 1,45 0,71 4,34

(n) 6 3 3 6 3 3

Analista 2 (jeringa)-Promedio 17,95 4,90 8,63 7,16 9,23 21,24

(desv est) 3,27 2,62 3,81 3,99 7,76 4,49

(n) 7 6 6 9 5 6

Agrupación Ctrol tBu al 2 % tBu al 1,5% tBu al 1 % tBu al 0,5 % tBu al 0,25 %

Analista 3 (jeringa)-Promedio 18,01 4,60 6,39 8,00 11,48 18,80

(desv est) 4,55 0,87 1,64 1,26 5,05 3,99

(n) 7 6 6 9 6 6

Analista 1 (pipeta) - Promedio

4,78 6,71 8,84 13,86 18,94

(desv est) 1,54 1,93 2,54 1,24 3,56 3,93

(n) 6 5 5 6 5 5

Los resultados de los tiempos de recon del liófilo también se separaron en función del analista, y se comparó el procedimiento que implica la inyección de WFI a través del tapón (jeringa) frente al procedimiento tradicional de destapar el vial y dispensar mediante la pipeta Rainin, resumido en la Tabla 4 y gráficamente en la Figura 4. La distribución de los puntos finales del tiempo de reconstitución dentro de cada grupo de muestra representa la fuente dominante de variabilidad, con un analista individual y/o procedimientos de reconstitución que tienen una influencia mínima sobre los valores promedio o las desviaciones estándar para cada tipo de muestra. Las excepciones son para tButanol al 0,5 % (muestra 5) y para tButanol al 0,25 % (muestra 6) que mostraron una variabilidad más amplia de tiempos de reconstitución promedio y desviaciones estándar en comparación con las otras muestras.

Ejemplo 5-Reconstitución de los mAb, dAb e IL18 liofilizados.

El mAb Anti-NOGO (SEQ ID NO: 3 y 4), el dAb anti-TNFR1 (SEQ ID NO: 5), la IL18 (SEQ ID NO: 6), la anti-IL5 (SEQ ID NO: 7 y 8) y el anti-CD20 (dominios variables SEQ ID NO: 9 y 10) se concentraron a las concentraciones que se muestran a continuación en una formulación que comprende histidina 26 mM, trehalosa 150 mM, polisorbato 80 (PS80) al 0,02 %, pH 6,0, en un volumen de aproximadamente 0,75 ml y después liofilizado en un vial de 2 ml.

79,3 mg de mAb anti-IL5

77,9 mg de mAb anti-NOGO

78,2 mg de mAb anti-CD20

29,1 mg de dAb anti-TNFR1

19,0 mg de IL-18

Los liófilos se reconstituyeron con 0,675 ml de agua para inyección (WFI) mediante una jeringa de 1 ml y una aguja de 25G (5/8") a través del tapón del vial liofilizado (jeringas de tuberculina, Becton-Dickinson #309626). El volumen de 0,675 ml se corrige para el volumen de los componentes secos dando como resultado un volumen final de 0,75 ml. La reconstitución se realizó mediante el uso de un "procedimiento sin perturbaciones" (la adición del agua fue seguida de una mezcla de luz inmediata seguida de dejar que el vial permaneciera sin perturbaciones). La adición del agua fue realizada por tres analistas diferentes (tres personas diferentes que realizan el paso de reconstitución) mediante una jeringa a través del tapón. Los tiempos de reconstitución individuales se resumen en la Tabla 5, y gráficamente en las Figuras 6 y 7.

En las 5 proteínas analizadas, aquellas con t-butanol al 2 % añadido durante la liofilización tuvieron tiempos de reconstitución más rápidos que los grupos control. Esto es evidente no solo para los mAb probados, sino también para las pequeñas moléculas probadas; el dAb anti-TNFR1 y la IL-18, que también parecen tener tiempos de reconstitución más rápidos en presencia de t-butanol.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de producción de una composición de polipéptido liofilizado que comprende: combinar un polipéptido con un aditivo volátil para formar una mezcla líquida y liofilizar la mezcla líquida para obtener una composición de polipéptido liofilizado, en la que la mezcla líquida comprende del 0,5 % al 5 % en volumen del aditivo volátil, y el aditivo volátil es t-butanol.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla líquida comprende el 2 % en volumen de t-butanol.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un polipéptido de unión al antígeno.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende la SEQ ID NO:1.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el polipéptido de unión al antígeno se selecciona del grupo que consiste en receptor soluble, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, dominio variable único de inmunoglobulina, Fab, F(ab')², Fv, Fv ligado a disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv ligado a disulfuro y diacuerpo.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende al menos dos polipéptidos GLP-1 genéticamente fusionados al N-terminal de la albúmina sérica humana.

7. Un procedimiento de producción de una composición de polipéptido líquido que comprende: obtener un polipéptido liofilizado producido por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y reconstituir el polipéptido liofilizado con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable para producir una composición de polipéptido líquido.

8. Un procedimiento de reducción del tiempo de reconstitución de una composición de polipéptido liofilizado que comprende:

a) liofilizar una mezcla líquida que comprende el polipéptido, en el que la mezcla líquida comprende del 0,5 % al 5 % en volumen del aditivo volátil, en el que el aditivo volátil es t-butanol; y

b) reconstituir el polipéptido liofilizado con una cantidad suficiente de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable en la composición de polipéptido liofilizado para producir una composición de polipéptido líquido, en el que el tiempo para reconstituir el polipéptido liofilizado en presencia del aditivo volátil es menor que el tiempo para reconstituir el mismo polipéptido liofilizado en ausencia del aditivo volátil.

9. Una composición que comprende: un polipéptido terapéutico, un tampón, un tensioactivo, al menos un excipiente y al menos un aditivo volátil, en la que el aditivo volátil es t-butanol y el t-butanol está presente en un 0,5 % a 5 % en volumen.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que el polipéptido terapéutico comprende GLP-1 o un fragmento y/o variante del mismo.

11. La composición de la reivindicación 9, en la que el polipéptido terapéutico comprende un polipéptido de unión al antígeno.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que el tampón es fosfato de sodio.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que el tensioactivo es el polisorbato-80.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en la que el al menos un excipiente se selecciona de: trehalosa, maltosa, sacarosa, manosa, lactosa, manitol, sorbitol, glicerol y dextrosa.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende: un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 1, fosfato de sodio, trehalosa, manitol, polisorbato-80 y t-butanol, en la que el t-butanol está presente en un 0,5 % a 5 % en volumen.