ES2784378T3

ES2784378T3 - Células precursoras mesenquimales perivasculares

Info

Publication number: ES2784378T3
Application number: ES11159624T
Authority: ES
Inventors: Stan Gronthos; Andrew Zannettino; Songtao Shi
Original assignee: Mesoblast Inc
Current assignee: Mesoblast Inc
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2004-03-29
Publication date: 2020-09-24
Anticipated expiration: 2024-03-29
Also published as: FR20C1036I1; AU2009227897A1; AU2003901668A0; EP1613335A4; ES2465226T3; JP2017148076A; EP2380971B1; CN1822846B; CA2816489A1; PT1613335E; JP6188435B2; AU2009227881B2; CA2872395A1; AU2006203628A1; AU2009227897B2; EP2380971A2; NL301059I2; JP2017014285A; JP2015156874A; CA2816489C

Abstract

Una población celular enriquecidas en células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5, en la que la población comprende al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica y en la que la población celular se ha enriquecido desde el tejido adiposo para su uso como medicamento.

Description

DESCRIPCIÓN

Células precursoras mesenquimales perivasculares

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a poblaciones de células enriquecidas en células precursoras mesenquimales, y usos médicos de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han hecho numerosos intentos de aislar y enriquecer células precursoras mesenquimales debido al potencial que tienen estas células en el uso medicinal. Pittinger y col., (1999) muestran la expansión de células clonogénicas de la médula ósea y describen una preparación de células madre mesenquimales agrandadas. En la publicación WO01/04268 de Simmons y col., se describe un ejemplo más reciente de dicho procedimiento que proporciona un rendimiento relativamente alto de la médula ósea.

El documento de Doherty y col., Journal of Bone and Mineral Research, vol.13, No. 5, 1 de mayo de 1998, describe el aislamiento de pericitos vasculares de la retina bovina que muestran potencial osteogénico y que expresan 3G5 y STRO-1.

Hasta la fecha, sin embargo, no ha habido ejemplos de procedimientos que permitan el aislamiento de células precursoras mesenquimales de una amplia gama de tejidos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención surge del hallazgo de que una población de células precursoras mesenquimales (CPM) multipotenciales está presente en un nicho perivascular. Esto ha llevado a la demostración de que existe una gama mucho más amplia de fuentes de tipo de tejido para la obtención de CPM, que el tejido único, la médula ósea, mencionado en el documento WO01/04268. La presente invención surge del hallazgo adicional de que una población enriquecida de CPM puede diferenciarse en dos poblaciones discriminadas por el marcador 3G5. Las CPM que son positivas para 3G5 se consideran de interés, en particular, para aplicaciones de neovascularización, aunque se puede demostrar que también se diferencian en otros tipos de tejidos. Un hallazgo adicional de la presente invención es que los niveles de CPM presentes en las poblaciones enriquecidas preferidas de esta invención pueden dar lugar a un número suficiente de células comprometidas para proporcionar un número de tipos de tejidos diferenciados.

En un primer aspecto, la invención es una población de células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5 y que comprenden al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica, en la que la población se enriquece en un procedimiento que comprende: la etapa de preparar una suspensión monocelular desde un tejido fuente vascularizado y la etapa de enriquecimiento en función de la presencia del marcador 3G5; otra etapa de preparar una suspensión monocelular desde tejido adiposo y la separación del tejido en células separadas, y la etapa de enriquecimiento en función de la presencia o el nivel del marcador 3G5 y la ausencia de uno o más marcadores de superficie indicativos de compromiso; para su uso en una aplicación de neovascularización o para la generación de tejido en un mamífero en el que se introduce el medicamento.

En esta invención también se describe un procedimiento de enriquecimiento para células precursoras mesenquimales (CPM), el procedimiento incluye la etapa de preparar una suspensión monocelular a partir de un tejido fuente vascularizado y la etapa de enriquecimiento en función de la presencia de marcadores expresados en el tejido vascularizado por células perivasculares.

En un segundo aspecto, la invención es una población de células enriquecidas en células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5, en la que la población comprende al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica y en la que la población celular se ha enriquecido desde el tejido adiposo para su uso como medicamento. En una realización, las células se enriquecen a partir de un tejido adiposo vascularizado.

En una realización, las células son para generar tejido adiposo.

En una realización, la población celular es humana.

En un tercer aspecto, la invención es una población de células enriquecidas en células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5, en la que la población comprende al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica y en la que la población celular se ha enriquecido desde el tejido adiposo para su uso en la generación de tejido o aplicaciones de neovascularización.

En una realización, las células a regenerar se seleccionan de entre condrocitos, células de tendones, células de ligamentos, células de cartílago, células de adipocitos, células de fibroblastos, células del estroma de la médula, células del estroma de soporte hematopoyético, células del músculo cardíaco, células del músculo liso, células del músculo esquelético, células pericíticas, células vasculares, células epiteliales, células gliales, células neuronales, células de astrocitos o células de oligodendrocitos.

En una realización, las células se enriquecen a partir de un tejido adiposo vascularizado.

En una realización, las células son para generar tejido adiposo.

En una realización, las células son para regenerar un tejido distinto del tejido adiposo.

En una realización, la población celular es humana.

En esta invención, también se describen unas células precursoras mesenquimales (CPM) aisladas, las cuales tienen un fenotipo de 3G5, MUC18, VCAM-1, STRO-1bri y actina del músculo liso a.

En esta invención, también se describe una célula de mamífero aislada que es multipotente y es positiva para el marcador de superficie 3G5.

En esta invención, también se describe una célula precursora mesenquimal (CPM), capaz de formar una colonia clonogénica y diferenciarse a tres o más tipos de tejido mesenquimal, aislada de un tejido del grupo que comprende, entre otros, tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, hígado, riñón, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, bazo, ganglios linfáticos, timo, páncreas, hueso, ligamento, médula ósea, tendón y músculo esquelético, y que es positivo para el marcador de superficie STRO-1.

En esta invención, también se describe una población no expandida de células enriquecidas en células precursoras mesenquimales (CPM), capaces de formar una colonia clonogénica y diferenciarse a tres o más tipos de tejido mesenquimal, con dichas CPM coexpresando los marcadores de superficie MUC18/CD146 y la actina del músculo liso alfa.

En esta invención, también se describe una célula de progenie diferenciada que surge de una célula como se describe en esta invención, preferentemente en la que la célula de la progenie es al menos una célula de osteoblastos, odontoblastos, productores de dentina, condrocitos, tendones, ligamentos, cartílagos, adipocitos, fibroblastos, estroma de médula, estroma de soporte hematopoyético, músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético, pericito, o una célula vascular, epitelial, glial, neuronal, de astrocito u oligodendrocito.

En un cuarto aspecto, la invención es una población celular obtenida mediante cultivo que expande la población enriquecida de células que expresan 3G5 y que comprende al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica como se define en el segundo o tercer aspecto y sus realizaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Propiedades de las células STRO-1 aisladas por MACS coetiquetadas con antiCD146 (CC9). (A) La región de clasificación, R1, representa la población de STRO-1BRT/CD146+ de doble positivo. (B) La incidencia de colonias de células clonogénicas (> 50 células) en función de la expresión de STRO-1BRT/CD146+ se determinó limitando el análisis de dilución de 24 repeticiones por concentración celular, usando el análisis de distribución de Poisson desde 5 experimentos independientes. Características de dispersión de luz frontal (tamaño) y perpendicular (granularidad) de las c Mn MO (C), células STRO-1 int/CD146-(D) y células STRO-1BRT/CD146+ (E). (F) Análisis de RT-PCR de células STRO-1BRT/CD146+ de la médula clasificadas para las transcripciones de CBFA1 (carril 2), osteocalcina (carril 4) y GAPDH (carril 6). También se muestran las células de control (cultivos de células madre estromales de la médula ósea (CMEMO) efectuados en presencia de dexametasona) que expresan CBFA1 (carril 1), osteocalcina (carril 3) y GAPDH (carril 5). Las mezclas de reacción se sometieron a una electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. (G) La expresión in situ de CD146 en las paredes de los vasos sanguíneos (bv) (flecha) en secciones de médula ósea humana (bm) cerca de la superficie del hueso (b) 20X. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina. (H) Tinción de inmunofluorescencia dual que demuestra la reactividad del anticuerpo STRO-1 etiquetado con rojo Texas y el anticuerpo CC9 etiquetado con isotiocianato de fluoresceína, que reacciona a las paredes de los vasos sanguíneos en secciones congeladas de la médula ósea humana.

Figura 2. Análisis inmunofenotípico de CMPD in vivo. El gráfico de barras muestra el número de colonias clonogénicas recuperadas de suspensiones monocelulares de pulpa dental después de la selección de la perla inmunomagnético en función de la reactividad a los anticuerpos que reconocen STRO-1, CD146 y 3G5 y los anticuerpos de control negativo del isotipo. Los datos se expresan como el número de unidades formadoras de colonias obtenidas en las fracciones de células positivas para perlas como un porcentaje del número total de colonias en células de pulpa no fraccionadas promediadas a partir de tres experimentos separados. La significación estadística (*) se determinó usando la prueba t de Student (p 0.01) comparando el porcentaje total de colonias para cada anticuerpo con el control correspondiente del isotipo correspondiente.

Figura 3. Reactividad de los marcadores perivasculares en pulpa dental. (A) Inmunolocalización del antígeno STRO-1 en los vasos sanguíneos (flechas pequeñas) en la pulpa dental humana (p) y alrededor del perineuro (flecha grande) que rodea un haz nervioso (nb) 20X. (B) Tinción de inmunofluorescencia doble que demuestra la reactividad del anticuerpo STRO-1 etiquetado con rojo Texas al perineuro de la pulpa dental (flecha) en combinación con un anticuerpo antineurofilamento etiquetado con isotiosianato de fluoresceína que tiñe el haz nervioso interno (nb), 40X. (C) Inmunolocalización del antígeno CD146 a las paredes de los vasos sanguíneos en el tejido de la pulpa dental humana 20X. (D) Tinción de inmunofluorescencia doble que demuestra la reactividad del anticuerpo STRO-1 etiquetado con rojo Texas a un vaso sanguíneo y el anticuerpo CC9 etiquetado con isotiosianato de fluoresceína. (E) Tinción inmunohistoquímica de tejido pulpar con un anticuerpo policlonal antiDSP de conejo (flecha) contra la capa externa de odontoblastos (od). 20X. (F) reactividad de 3G5 a un solo pericito (flecha) en una pared de vasos sanguíneos (bv) 40X. Las secciones de tejidos se contratiñeron con hematoxilina.

Figura 4. Reactividad de 3G5 a CMEMO. (A) El histograma representativo representa un perfil de análisis FACS de doble color típico de células mononucleares de médula ósea (CMNMO) enteras que expresan CD146 (PE) y 3G5 (FITC). (B) Se efectuaron ensayos de eficiencia de colonias para todos los diferentes patrones de expresión observados (regiones "R" 1-6). Los datos se expresan como la incidencia media de las unidades formadoras de colonias para cada fracción celular promediada a partir de tres experimentos separados.

Figura 5. Potencial de desarrollo de CMEMO y CMPD purificadas in vivo. Preparaciones de células STRO-1BRT/CD146 de la médula ósea aisladas por MACS/FACS (flecha) teñidas con un anticuerpo específico para la actina del músculo liso a (A) y el factor von Willebrand (B). Las células pulpares CD146+ (flecha grande) aisladas mediante selección de perlas inmunomagnéticas (perlas magnéticas representadas con flechas pequeñas), teñidas con un anticuerpo específico para la actina del músculo liso a (C) y el factor von Willebrand. (D). (E) Formación de hueso ectópico (b) y médula hematopoyética/adipogénica (bm) por células expandidas ex vivo derivadas de CMEMO STRO-1BRT/CD146+ trasplantadas con HA/TCP en ratones inmunocomprometidos durante tres meses (E). (F) Formación ectópica de dentina (d) y tejido pulpar fibroso (p) por células expandidas ex vivo derivadas de CMPD CD146+ trasplantadas con HA/TCP en ratones inmunocomprometidos durante tres meses. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Figura 6. Expresión de CD34, CD45 y glicoforina-A en células mononucleares de médula ósea positivas para STRO-1. Histogramas representativos que representan los perfiles típicos de análisis de citometría de flujo de doble color de células mononucleares de médula ósea positivas para STRO-1 aisladas inicialmente por clasificación magnética activada y teñidas conjuntamente con anticuerpos dirigidos contra CD34 (A), CD45 (B) o glicoforina A (C) . El anticuerpo STRO-1 se identificó usando un isotiocianato de fluoresceína de IgM antimurina de cabra, mientras que el CD34, el CD45 y la glicoforina A se identificaron usando una ficoeritrina de IgG antimurina de cabra. La fracción de STRO-1 de alta expresión que contenía la población de CPM clonogénica se aisló mediante clasificación celular activada por fluorescencia en función de las regiones R1 y R2.

Figura 7. Las CPM de médula ósea son STRO-1 bright y negativas para CD34, CD45 y glicoforina A. El gráfico muestra los resultados de los ensayos de formación de colonias adherentes in vitro efectuados para cada una de las diferentes poblaciones de STRO-1 bright clasificadas, seleccionadas por su coexpresión o falta de los antígenos CD34, CD45 o glicoforina A, en función de las regiones R1 y R2, como se indica en la Figura 6. Estos datos se expresan como la incidencia media de las unidades formadoras de colonias para cada fracción celular promediada a partir de dos experimentos separados.

Figura 8. Reactividad de los marcadores perivasculares en diferentes tejidos humanos. Tinción de inmunofluorescencia de doble color que demuestra reactividad de (A) STRO-1 y CD146, (B) STRO-1 y actina del músculo liso alfa, y (C) 3G5 y CD146, en los vasos sanguíneos y el tejido conectivo presente en el bazo, el páncreas (Panel 1), cerebro, riñón (Panel 2), hígado, corazón (Panel 3) y piel (Panel 4) 20X. Los anticuerpos STRO-1 y 3G5 se identificaron usando un rojo Texas de IgM antimurina de cabra, mientras que el CD146 y la actina del músculo liso alfa se identificaron usando un isotiocianato de fluoresceína de IgG o antimurino de cabra. La ubicación conjunta se indica mediante la superposición de áreas de fluorescencia amarilla y naranja (flechas blancas).

Figura 9. Aislamiento de CPM derivadas de tejido adiposo por FACS. Histogramas de citometría de flujo representativos que representan la expresión de STRO-1, CD146 y 3G5 en preparaciones frescas de suspensiones monocelulares derivadas de tejidos adiposos periféricos generados después de la digestión con colagenasa/dispasa como se describió anteriormente (Shi y Gronthos 2003). Los anticuerpos se identificaron usando ya sea IgM antimurina de cabra o ficoeritrina de IgG. A continuación, las poblaciones celulares se seleccionaron mediante FACS, en función de su positividad (región R3) o negatividad (región R2) para cada marcador y, a continuación, se colocaron en un medio de crecimiento regular para evaluar la incidencia de las células adherentes formadoras de colonias en cada fracción celular.

Figura 10. Las CPM clonogénicas derivadas del tejido adiposo son positivas para STRO-1/3G5/CD146. El gráfico de barras representa el número de colonias clonogénicas recuperadas de suspensiones monocelulares de tejido adiposo periférico humano digerido enzimáticamente, después de la clasificación de células activadas por fluorescencia, en función de su reactividad a anticuerpos que reconocen ^sT^rO-1, CD146 y 3G5 (Figura 9) y, a continuación, cultivadas en un medio de crecimiento estándar, como se describió anteriormente para la médula ósea y el tejido de la pulpa dental (Shi y Gronthos 2003). Los datos se expresan como el número de unidades formadoras de colonias obtenidas por 105 células colocadas en placas en las fracciones celulares positivas y negativas, promediadas a partir de dos experimentos separados.

Figura 11. Análisis inmunofenotípico de CPM derivadas de tejido adiposo. Histogramas citométricos de flujo representativos que representan la coexpresión de STRO-1 y CD146 (A) y 3G5 y CD146 en preparaciones frescas de suspensiones monocelulares derivadas de tejido adiposo periférico, generadas después de la digestión con colagenasa/dispasa. Los anticuerpos STRO-1 y 3G5 se identificaron usando una ficoeritrina de IgM antimurina de cabra, mientras que el CD146 se identificó usando un isotiocianato de fluoresceína de IgG antimurina de cabra. Aproximadamente el 60 y el 50% de las células positivas para CD146 coexpresan STRO-1 y 3G5, respectivamente. Estos datos sugieren que el 10% o más de las células positivas para CD164 coexpresan STRO-1 y 3G5.

Figura 12. Potencial de desarrollo de CPM derivadas de adipocitos purificados in vitro. Las preparaciones de cultivos primarios de CPM derivadas de células de tejido adiposo STRO-1+/CD146 se cultivaron nuevamente en condiciones de cultivo estándar (A), en un medio inductivo osteogénico (B), un medio inductivo adipogénico (C) o en condiciones condrogénicas (D), como describieron anteriormente Gronthos y col. 2003. Después de dos semanas de inducción de diferenciación múltiple, las CPM derivadas de adipocitos demostraron la capacidad de formar hueso (B; depósitos minerales positivos de alizarina), grasa (C; lípido positivo de rojo aceite O) y cartílago (D: matriz de colágeno tipo II). Figura 13. Aislamiento de CPM derivadas de tejido cutáneo por FACS. Histogramas de citometría de flujo representativos que representan la expresión de STRO-1, CD146 y 3G5 en preparaciones frescas de suspensiones monocelulares derivadas de tejido cutáneo de espesor total, generadas después de la digestión con colagenasa/dispasa. Los anticuerpos se identificaron usando ya sea IgM antimurina de cabra o ficoeritrina de IgG. A continuación, las poblaciones celulares se seleccionaron mediante FACS, en función de su positividad (región R3) o negatividad (región r2) para cada marcador y, a continuación, se colocaron en un medio de crecimiento regular para evaluar la incidencia de las células adherentes formadoras de colonias en cada fracción celular.

Figura 14. Las CPM clonogénicas derivadas de tejido cutáneo son positivas para STRO-1/3G5/CD146. El gráfico de barras representa el número de colonias adherentes recuperadas de suspensiones monocelulares de tejido cutáneo humano digerido enzimáticamente, después de la clasificación de células activadas por fluorescencia, en función de su reactividad a anticuerpos que reconocen STRO-1, CD146 y 3G5 (Figura 6) y, a continuación, cultivadas en un medio de crecimiento estándar, como se describió anteriormente para la médula ósea y el tejido de la pulpa dental (Shi y Gronthos 2003). Los datos se expresan como el número de unidades formadoras de colonias obtenidas por 105 células colocadas en placas en las fracciones celulares positivas y negativas, promediadas a partir de dos experimentos separados.

Figura 15. A. Patrón de expresión inmunofenotípica de CPM de médula ósea expandidas ex vivo. Las suspensiones monocelulares de CPM de médula ósea expandidas ex vivo se prepararon mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y, a continuación, se incubaron con anticuerpos que identifican marcadores asociados al linaje celular. Para aquellos anticuerpos que identifican antígenos intracelulares, las preparaciones celulares se fijaron con etanol frío al 70% para permeanbilizar la membrana celular antes de la tinción para marcadores intracelulares. Los anticuerpos de control de isotipo coincidentes se trataron en idénticas condiciones. El análisis de citometría de flujo se efectuó usando un instrumento COULTER EPICS. Los gráficos de puntos representan 5.000 eventos en modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de células de linaje (línea en negrita) con referencia a los anticuerpos de control negativo coincidentes con el isotipo (línea delgada). B. Perfil de expresión génica de CPM cultivadas. Se prepararon suspensiones monocelulares de CPM de médula ósea expandidas ex vivo mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y se preparó un ARN celular total. Usando el procedimiento de extracción de ARNzolB, se aisló el ARN total y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc, preparado usando un procedimiento estándar. La expresión de varias transcripciones se evaluó mediante amplificación por PCR, usando un protocolo estándar, como se describió anteriormente (Gronthos y col. 2003). Los conjuntos de cebadores usados en este estudio se muestran en la Tabla 2. Después de la amplificación, se analizó cada mezcla de reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQant.

Figura 16. Las CPM STRO-1bri expandidas ex vivo pueden convertirse en arteriolas in vitro. Las suspensiones monocelulares de CPM STRO-1bri de médula ósea expandidas ex vivo se prepararon mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y, a continuación, se colocaron en placas de 48 pocilios que contenían 200 |jl de matrigel. Las CPM STRO-1bri se colocaron en una placa a 20.000 células por pocillo, en un medio sin suero (Gronthos y col. 2003) suplementado con los factores de crecimiento PDGF, EGF, VEGf a 10 ng/ml. Después de 24 horas de cultivo a 37°C en un 5% de CO2, los pocillos se lavaron y, a continuación, se fijaron con paraformaldehído al 4%. Posteriormente, se efectuaron estudios inmunohistoquímicos que demostraron que las estructuras en forma de cordón expresaban la actina del músculo liso alfa identificada con un anticuerpo de peroxidasa de rábano picante de IgG antimurina de cabra.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRADAS Y EJEMPLIFICADAS DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se refiere a células precursoras mesenquimales, en particular, a aquellas que pueden estar presentes en el compartimento perivascular del tejido vascularizado. Dichas células mesenquimales pueden identificarse por la presencia del marcador de superficie 3G5 y, quizás, adicionalmente o por separado mediante otros marcadores de desarrollo temprano como CD146 (MuC18), VcAm -1 y STRO-1.

Las células precursoras son células tempranas que se encuentran sustancialmente en una etapa de desarrollo previa a la expansión. Estas son células que aún tienen que diferenciarse a células completamente comprometidas, sin embargo, no necesitan ser células madre en un sentido estricto, ya que son necesariamente capaces de diferenciarse en todos los tipos de células. Las células precursoras parcialmente diferenciadas tienen el beneficio de tener un mayor potencial proliferativo que las células madre.

Las células precursoras actuales están algo diferenciadas en que están comprometidas con el tejido mesenquimal, en oposición, por ejemplo, a los tejidos hemopoyéticos. A partir de los datos producidos, resulta evidente que las CPM que se han aislado carecen de marcadores asociados con células hemopoyéticas como CD34, y además su potencial de diferenciación no se extiende a las líneas hemopoyéticas. Además, no necesariamente tienen el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células mesenquimales, sino que pueden diferenciarse en uno, dos, tres o más tipos de células. Se anticipa que estas células precursoras recolectadas de los tejidos en cuestión pueden ser útiles para regenerar tejidos para los tipos de células de los que se han obtenido. Por consiguiente, las células precursoras aisladas del corazón pueden reintroducirse para regenerar el tejido cardíaco, sin embargo, su potencial no necesita ser tan limitado, las células precursoras aisladas de un tipo de tejido podrían ser útiles para regenerar tejido en otro tipo de tejido. Se sabe que el microambiente en el que se encuentra una célula sin diferenciar ejerce una influencia en la ruta de diferenciación y, por lo tanto, la reintroducción no necesariamente debe ser específica para el tejido.

Los datos presentados muestran que las CPM se han cosechado y, a continuación, se han reintroducido para producir huesos y médula ósea, así como también dentina y pulpa, respectivamente, además de que se han producido ateriolas, estructuras similares al cordón, después de la expansión ex vivo de las CPM aisladas.

Se anticipa que podría producirse una amplia gama de células en función de la expresión génica de marcadores característicos de ciertos tipos de células. Por consiguiente, se anticipa que, en condiciones de cultivo adecuadas, el intervalo de tipos de células que se pueden generar a partir de las CPM perivasculares de la presente descripción incluye, entre otros, los siguientes: células de osteoblastos, odontoblastos, productores de dentina, condrocitos, tendones, ligamentos, cartílagos, adipocito, fibroblastos, estroma de médula, estroma de soporte osteoclástico y hematopoyético, músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético, pericito, células vasculares, epiteliales, gliales, neuronales, de astrocitos u oligodendrocitos.

Uno de los beneficios del hallazgo de que las CPM pueden aislarse de las células perivasculares es que esto expande enormemente el intervalo de tejidos de origen de los cuales las CPM pueden aislarse o enriquecerse y ya no existe una restricción efectiva de la médula ósea como la fuente de CPM. Los tejidos a partir de los cuales se han aislado estas CPM en los ejemplos de esta descripción son médula ósea humana, células de pulpa dental, tejido adiposo y cutáneo. Además, la tinción in situ y los estudios histológicos han identificado que las CPM están presentes en el compartimento perivascular del bazo, páncreas, cerebro, riñón, hígado y corazón. Dada esta amplia y diversa gama de tipos de tejidos donde están presentes las CPM perivasculares, se propone que las CPM también estarán presentes en una gama aún más amplia de tejidos que pueden incluir tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, hígado, riñón, corazón , retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, bazo, ganglios linfáticos, timo, páncreas, hueso, ligamento, médula ósea, tendón y músculo esquelético.

Estas células precursoras de la presente descripción se distinguen de otras CPM conocidas en el sentido de que son positivas para 3G5 o tal vez que transportan otros marcadores perivasculares. Se pueden aislar enriqueciendo para un marcador de superficie de desarrollo temprano presente en células perivasculares, en particular la presencia de uno o más de CD146 (MUC18), VCAM-1 y, alternativamente o adicionalmente, un alto nivel de expresión del marcador reconocido por el anticuerpo monoclonal STRO -1. De manera alternativa o adicionalmente, el enriquecimiento puede llevarse a cabo usando 3G5.

Los marcadores asociados con las células perivasculares también pueden estar presentes en las CPM, por ejemplo, la actina del músculo liso alfa (aSMA).

Otros marcadores de desarrollo tempranos asociados a las CPM también pueden estar presentes. Estos pueden incluir, pero no están necesariamente limitados a, el grupo que consiste en THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD61, integrina beta 5, 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, STRO-1bri, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R y Leptina-R (STRO-2). La expresión positiva de uno o más de estos marcadores puede usarse en procedimientos de enriquecimiento para CPM a partir del tejido fuente.

Las CPM de la presente descripción también pueden caracterizarse por la ausencia de marcadores presentes en el tejido diferenciado, y el enriquecimiento puede basarse en la ausencia de dichos marcadores.

De manera similar, se prefiere que las poblaciones de células enriquecidas no sean de origen hemopoyético y, por consiguiente, se prefiere que estas células no estén presentes. Los marcadores característicamente identificados como no presentes incluyen, entre otros, CD34, CD45 y glicoforina A. Otros marcadores adicionales para este propósito podrían incluir CD20 y CD19 (marcadores de linfocitos B), CD117 (oncoproteína del kit c) presente en células madre hemopoyéticas y angioblastos, CD14 (macrófagos), CD3 y CD4 (células T).

Puede ser deseable usar las CPM perivasculares relativamente inactivas, directamente enriquecidas o aisladas. De manera alternativa, se halló que la expansión de la población enriquecida puede llevarse a cabo y tener el efecto beneficioso de dar como resultado un número mucho mayor de células. Sin embargo, el efecto de la expansión del conjunto de células directamente enriquecido es que se producirá alguna diferenciación de las CPM iniciales. La expansión durante un período de 5 semanas podría resultar en un aumento de 103 veces. Se pueden elegir otros períodos para expandir la población a una cantidad entre 102 y 105 veces. Este potencial podría ser dirigido al cultivarlos en medios que contienen citocinas y otros factores que dirigen la diferenciación a un tipo de tejido particular, por ejemplo, PDGF y VEGF formando cordones de músculo liso alfa. Estos podrían introducirse en un tejido con, por ejemplo, un insulto para ayudar con la reparación. De manera alternativa, después de la expansión, puede desearse volver a seleccionar las células sobre la base de un marcador de desarrollo temprano, que podría ser STRO-1bri, a fin de aumentar la proporción de CPM en la población.

Se halló que no se necesita una población esencialmente pura de CPM para proporcionar la formación de células diferenciadas a fin de formar las estructuras de tejido deseadas. La población enriquecida puede tener niveles de CPM superiores a aproximadamente el 0,001, el 0,01, el 0,02, el 0,05, el 0,1, el 0,2, el 0,5 o el 1% o más, como proporción del número total de células en la población enriquecida. Este orden de enriquecimiento puede lograrse mediante el uso de un único marcador para la selección de la población enriquecida de CPM. Esto es particularmente cierto cuando el tejido fuente tiene un nivel inherentemente alto de CPM perivasculares. Se halló que hay considerablemente más CPM positivas para 3G5 en ciertos tejidos, por ejemplo, en la pulpa dental, que en la médula ósea. Por consiguiente, en la médula ósea, las CPM positivas para 3G5 constituyen aproximadamente el 15% de las CPM en función de células STR1bri formadoras de colonias, mientras que, en la pulpa dental, se halló que constituyen el 65% y más del 90% en los tejidos grasos y cutáneos. La expansión de la población y, a continuación, el reenriquecimiento usando un solo marcador podría dar como resultado niveles más altos de CPM, quizás niveles mayores que aproximadamente el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 5 o el 10%. Si bien se considera deseable que una proporción sustancial y, preferentemente, la mayoría de las células precursoras sean CPM perivasculares, no se considera esencial para ciertas formas de descripción que las CPM perivasculares sean la única forma de células precursoras. También pueden estar presentes otras formas de precursores sin interferir indebidamente con la capacidad de las CPM perivasculares de experimentar la diferenciación deseada. Dichas otras formas pueden incluir precursores hemopoyéticos o CPM no perivasculares, quizás negativos para 3G5. Ciertas formas de la presente descripción proporcionan CPM perivasculares sustancialmente libres de células endoteliales. En ese contexto, se podría considerar que sustancialmente libre es inferior a aproximadamente el 5, el 2, el 1 o el 0,1% de células endoteliales. De manera alternativa, el contexto podría ser una evaluación de que la población enriquecida es negativa para el factor von Willebrand.

Se entenderá que el reconocimiento de las células que transportan los marcadores de la superficie celular que forman la base de la separación se puede efectuar mediante un número de procedimientos diferentes, sin embargo, todos estos procedimientos dependen de la unión de un agente de unión al marcador en cuestión, lo cual es seguido por una separación de aquellos que exhiben unión, ya sea unión de alto nivel o unión de bajo nivel, o ninguna unión. Los agentes de unión más convenientes son anticuerpos o moléculas en función de anticuerpo, siendo preferentemente anticuerpos monoclonales o en función de anticuerpos monoclonales debido a la especificidad de estos últimos agentes. Se pueden usar anticuerpos para ambas etapas, sin embargo, también se podrían usar otros agentes, por consiguiente, también se pueden emplear ligandos para estos marcadores para enriquecer las células que los poseen o que carecen de estos. Los anticuerpos pueden enlazarse con un soporte sólido para permitir una separación bruta. Las técnicas de separación deberían maximizan la retención de viabilidad de la fracción para recoger. Pueden emplearse varias técnicas de diferente eficacia para obtener separaciones relativamente brutas. La técnica particular empleada dependerá de la eficiencia de separación, la citotoxicidad asociada, la facilidad y velocidad de rendimiento y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidades técnicas. Los procedimientos para la separación pueden incluir, pero sin limitación, separación magnética usando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo, cromatografía de afinidad e "inmunopurificación" con anticuerpo enlazado con una matriz sólida. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen, entre otros, la FACS. Es en el contexto de estos procedimientos que una célula puede ser negativa o positiva. Las células positivas pueden ser un expresador bajo (lo) o alto (bright) dependiendo del grado en que el marcador esté presente en la superficie celular, los términos se relacionan con la intensidad de fluorescencia u otro color usado en el procedimiento de clasificación del color de las células. La distinción de lo y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población celular particular que se está clasificando.

El procedimiento de enriquecimiento para CPM perivasculares podría incluir la etapa de hacer un primer grupo de células parcialmente enriquecido mediante el enriquecimiento para la expresión de un primer marcador de entre los marcadores y, a continuación, la etapa de enriquecer, para la expresión del segundo de los marcadores del conjunto celular parcialmente enriquecido.

También se describe un procedimiento que comprende una primera etapa que es una etapa de clasificación en fase sólida, en función del reconocimiento de uno o más de los marcadores. La etapa de clasificación en fase sólida usa una MACS que reconoce la expresión de alto nivel de STRO-1. Esto proporciona un grupo enriquecido con un mayor número de células que si se usara una clasificación de alta precisión como primera etapa. Si, por ejemplo, se usara FACS primero, muchas de las células precursoras serían rechazadas debido a su asociación a otras células. A continuación, se puede proceder a una segunda etapa de clasificación usando un procedimiento de separación preciso. Esta segunda etapa de clasificación puede involucrar el uso de dos o más marcadores. Por consiguiente, se recurre a FACS de dos colores para reconocer la expresión de alto nivel del antígeno reconocido por las STRO-1, así como también la expresión de CD 146. Las ventanas usadas para la clasificación en la segunda etapa se pueden ajustar de manera más ventajosa porque la población inicial ya está parcialmente enriquecida.

El procedimiento de enriquecimiento para las CPM perivasculares también podría incluir la recolección de una fuente de células madre antes de la primera etapa de enriquecimiento usando técnicas conocidas. Por consiguiente, el tejido será eliminado quirúrgicamente. Entonces, se separarán las células que comprenden el tejido fuente en lo que se denomina suspensión celular simple. Esta separación puede conseguirse por medios físicos y/o enzimáticos.

La fuente preferida de tales CPM perivasculares es la humana, sin embargo, se espera que la descripción también sea aplicable a los animales, y estos podrían incluir animales agrícolas, como vacas, ovejas, cerdos, animales domésticos como perros, animales de laboratorio como ratones, ratas, hámsters y conejos o animales que podrían usarse para deportes, como los caballos.

En una forma adicional, se podría decir que la descripción reside en un procedimiento de generación de tejido en un mamífero que comprende la etapa de enriquecer una población de células precursoras, como se describe en esta invención, e introducir la población enriquecida en el mamífero y permitir que la población enriquecida genere el tejido en el mamífero.

Otro uso potencial para las células enriquecidas de la presente descripción es como un medio de terapia génica, mediante la introducción de ácidos nucleicos exógenos para la expresión de sustancias terapéuticas en los tipos de tejido en cuestión.

En el contexto de la presente divulgación, el término célula aislada puede significar que las CPM perivasculares comprenden al menos el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80 o el 95% del total de células de la población en la que están presentes.

EJEMPLO 1 Aislamiento y expansión de células precursoras

Los nichos de células madre identificados en un número de tejidos adultos diferentes, que incluyen piel, folículos pilosos, médula ósea, intestino, cerebro, páncreas y, más recientemente, pulpa dental, a menudo son sitios altamente vascularizados.(1) El mantenimiento y la regulación de las poblaciones de células madre normalmente inactivas está estrictamente controlado por el microambiente local, según los requisitos del tejido del huésped.(2'3) Tanto los tejidos conectivos de soporte de la médula ósea como la pulpa dental contienen poblaciones de células madre estromales con alto potencial proliferativo capaces de regenerar sus respectivos microambientes con notable fidelidad, incluyendo las estructuras mineralizadas circundantes de hueso y dentina.(4'5) En el organismo postnatal, el estroma de la médula ósea existe como un tejido muy vascularizado y poco tejido que soporta y regula la hematopoyesis.16-8) En un momento en que muchos tejidos han perdido o disminuido su capacidad de regeneración, la médula ósea adulta conserva la capacidad de renovación continua del tejido parenquimal hematopoyético y es responsable de la remodelación de las superficies óseas adyacentes.(9'10°) En contraste, la cámara pulpar interna de los dientes está compuesta por un tejido fibroso compacto no hematopoyético, infiltrado por una red microvascular, que es enterrado por la dentina mineralizada^11-1^ Después de la maduración del diente, la pulpa dental se vuelve relativamente estática, actuando solo en una capacidad reparadora en respuesta a una matriz de dentina comprometida causada por insultos como caries o trauma mecánico.

Los precursores de osteoblastos funcionales (CMEMO: células madre del estroma de la médula ósea) y odontoblastos (CMPD: células madre de la pulpa dental), ambas formas de CPM identificadas por su tejido de origen, se identificaron inicialmente por su capacidad para formar grupos de células clonogénicas in vitro, una característica común entre diferentes poblaciones de células madre.(4'14-18) La progenie de las CMEMO y las CMPD expandidas ex vivo comparten un perfil de expresión génica similar para una variedad de reguladores transcripcionales, proteínas de matriz extracelular, factores de crecimiento/receptores, moléculas de adhesión celular y algunos, pero no todos, marcadores de linaje característicos de fibroblastos, células endoteliales, células de músculo liso y osteoblastos.(4'19) Sin embargo, estudios previos han documentado que las colonias de CMEMO individuales demuestran marcadas diferencias en sus tasas de proliferación in vitro y potenciales de desarrollo in vivo.(5'14'20°) De manera similar a estos hallazgos, recientemente hemos observado niveles comparables de heterogeneidad en el crecimiento y la capacidad de desarrollo de diferentes colonias de CMPD.(21) Juntos, estos estudios infieren una disposición jerárquica de células precursoras del estroma que residen en la médula ósea y la pulpa dental, encabezadas por una población menor de células madre pluripotenciales altamente proliferativas que dan lugar a poblaciones de células progenitoras bi y unipotenciales comprometidas.(22)

A pesar de nuestro amplio conocimiento sobre las propiedades de las CMEMO y las CMPD cultivadas, todavía no sabemos si sus características in vitro son un retrato preciso de sus verdaderos patrones de expresión génica y potenciales de desarrollo in situ. Además, no se sabe formalmente si todas las células formadoras de colonias dentro de cada tejido derivan de un grupo de células madre pluripotentes o si surgen de progenitoras comprometidas que pertenecen a distintos linajes. También hay una falta de información sobre la ubicación anatómica precisa de las CMEMo y las CMPD en sus respectivos tejidos. Esto se atribuye principalmente a la rareza de las células madre y la ausencia de marcadores específicos que identifiquen diferentes etapas de desarrollo durante la osteogénesis y la odontogénesis, particularmente para las subpoblaciones primitivas. Anteriormente se ha planteado la hipótesis de que un posible nicho para los precursores de osteoblastos y odontoblastos pueden ser las redes de microvasculatura de la médula ósea y la pulpa dental, respectivamente.(23'24)

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Muestras de tejido

Las células mononucleares de médula ósea derivadas de la médula ósea (CMNMO), de voluntarios adultos humanos normales, se obtuvieron según las pautas establecidas por el Comité de Ética Humana de1Hospital Royal Adelaide. Los terceros molares afectados de humanos normales se obtuvieron de adultos jóvenes de la Investigación de la Clínica Dental de la Universidad de Adelaide, según las pautas aprobadas que establece el Comité de Ética Humana de la Universidad de Adelaide, respectivamente. La piel de espesor completo y el tejido adiposo periférico descartados se obtuvieron de procedimientos de cirugía plástica de rutina del Laboratorio de Ingeniería de Células de la Piel, bajo las pautas establecidas por el Comité de Ética Humana del Hospital Royal Adelaide. El tejido pulpar se separó de la corona y la raíz, como se describió anteriormente.(4) Se prepararon suspensiones monocelulares de pulpa dental, tejido cutáneo y adiposo mediante una digestión enzimática en una solución de colagenasa de 3 mg/ml tipo I (Worthington Biochem, Freehold, NJ) y 4 mg/ml de dispasa (Boehringer Mannheim, GMBH, Alemania) para un período de una a tres horas a 37°C. Se obtuvieron suspensiones monocelulares pasando las células a través de un filtro de 70 pm (Falcon, BD Labware, Franklin Lakes, NJ). Las preparaciones celulares (0,01 a 1 x 105/pocillo) de la médula ósea, la pulpa dental, la piel y el tejido adiposo se usaron para la inmunoselección, la extracción de ARN o el cultivo directo en placas de 6 pocillos (Costar, Cambridge, MA), como se describe a continuación.

Otras muestras de tejido humano (cerebro, hígado, corazón, riñón, pulmón, bazo, timo, ganglios linfáticos, páncreas, piel) se obtuvieron de autopsias efectuadas en el Hospital Royal Adelaide durante exámenes patológicos de rutina, según las pautas aprobadas que establece el Comité de Ética Humana del Hospital Royal Adelaide. Pequeños especímenes de aproximadamente 0,5 cm2 de cada tipo de tejido se colocaron en criomoldes Tissue-Tek II de 25 mm x 20 mm x 5 mm (Miles Laboratories; Naperville, IL) y se embebieron con un medio compuesto O.C.T. (Miles Laboratories) por inmersión en un vaso de precipitados pírex de isopentano, de 150 a 200 ml (BDH Chemicals, Poole, Inglaterra) preenfriado mediante la suspensión de un vaso de precipitados de vidrio en un baño de nitrógeno líquido. El isopentano se ha enfriado cuando el fondo del vidrio es blanco. Las secciones congeladas se almacenaron inmediatamente a -80°C. Se obtuvieron secciones congeladas de tejido nervioso y muscular del Departamento de Histopatología del IMVS, de Australia del Sur, y secciones del prepucio del Departamento de Inmunología del IMVS, de Australia del Sur. El Dr. TJ Khong del Departamento de Histopatología del Hospital de Mujeres y Niños de Adelaide, de Australia del Sur, proporcionó amablemente secciones de extremidades fetales humanas embebidas en parafina, fijadas en formalina (52 días).

Ensayo y cultivo de eficiencia de colonias

Las suspensiones monocelulares se colocaron en placas a bajas densidades de recubrimiento (entre 1.000 y 10.000 células por pocillo, por triplicado en placas de seis pocillos) para evaluar la eficiencia de formación de colonias de diferentes fracciones celulares inmunoseleccionadas. Las células se cultivaron en una Modificación alfa del medio de Eagle suplementado con suero de ternera fetal al 20%, L-Glutamina 2 mM, L-ascorbato-2-fosfato 100 jM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 jg/ml a 37°C en 5% de CO2. Los cultivos del día 14 se fijaron con formalina al 4% y, a continuación, se tiñeron con azul de toluidina al 0,1%. Los agregados de igual o mayor que cincuenta células se puntuaron como colonias clonogénicas equivalentes a unidades formadoras de colonias fibroblásticas (UFC-F).

Clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)

Este procedimiento es una modificación de lo descrito en otra parte. (25) De manera breve, aproximadamente 1 x 108 CMNMO se incubaron con un sobrenadante STRO-1bri (CMNMO antihumanas murinas, IgM) (29) (1/2) durante 1 hora en hielo. A continuación, las células se lavaron con PBS/FBS al 5% y se resuspendieron en una dilución 1/50 de IgM anti ratón de cabra biotinilada (específica de la cadena j; Caltag Laboratories, Burlingame, CA) durante 45 minutos en hielo. Después del lavado, las células se incubaron con microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, FRG) durante 15 minutos en hielo y, a continuación, se separaron en una columna magnética Mini MACS (Miltenyi Biotec) según las recomendaciones del fabricante.

Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)

Las células STRO-1bri aisladas por MACS se incubaron con un conjugado de estreptavidina-FITC (1/50; Laboratorios CALTAG) durante 20 minutos en hielo y, a continuación, se lavaron con PBS/FBS al 5%. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de un solo color se efectuó usando un citómetro de flujo FACStarPLUS (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). El análisis de FACS de dos colores se logró incubando CMNMO STRO-1bri aisladas por MACS con niveles saturantes (1:1) de sobrenadante de anticuerpo CC9 (CD146/MUC-18/Mel-CAM, IgG antihumano de ratón, IgG2a, Dr. Stan Gronthos) durante una hora en hielo. Después de lavar con PBS/FBS al 5%, las células se incubaron con un anticuerpo de conjugado de ficoeritrina (PE) de IgG2a(específica de la cadena y) anti-ratón de cabra como segunda etiqueta (1/50, Laboratorios CALTAG) durante 20 minutos en hielo. Las células se clasificaron usando la unidad de deposición celular automatizada (ACDU) de un citómetro de flujo FACStarPLUS citómetro de flujo. Ensayo de dilución limitante: se sembraron 1, 2, 34, 5 y 10 células por pocillo, 24 réplicas, cultivadas en medio privado de suero durante 10 días, como se describió anteriormente126*. De manera similar, las CMEMO no fraccionadas recién preparadas se incubaron con CC9 (IgG2a) y los anticuerpos 3G5 (IgM) o los anticuerpos de control negativo del isotipo, durante una hora en hielo. Después de lavar con PBS/FBS al 5%, las células se incubaron con anticuerpos conjugados de ficoeritrina (PE) de IgG2a (específica de la cadena ^y) anti-ratón de cabra e IgM como segunda etiqueta (1/50, Laboratorios CALTAG) durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron en PBS/% 5 FBS antes de analizarlas usando un citómetro de flujo FACStar PLUS. La reactividad positiva para cada anticuerpo se definió como el nivel de fluorescencia superior al 99% de los anticuerpos de control del isotipo compatible.

Análisis de citometría de flujo

Se prepararon suspensiones monocelulares de CPM de médula ósea expandidas ex vivo mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y, a continuación, se incubaron con sobrenadante STRO-1 puro o anticuerpos que identificaban diferentes marcadores asociados al linaje celular (10 jg/ml) durante una hora en hielo. A continuación, las células se lavaron en PBS/FBS al 5% y, a continuación, se incubaron ya sea con una ficoeritrina de IgM antimurina de cabra (1/50, SouthernBiotechnologies), ficoeritrina IgG anticonejo o antimurina de cabra (Laboratorios Caltag). Para aquellos anticuerpos que identifican antígenos intracelulares, las preparaciones celulares se sometieron a la permeabilización de la membrana celular antes de la tinción para marcadores intracelulares. Los anticuerpos de control de isotipo coincidentes se trataron en idénticas condiciones. El análisis de citometría de flujo se efectuó usando un instrumento COULTER EPICS. Los gráficos de puntos representan 5.000 eventos en modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de células de linaje con referencia a los anticuerpos de control negativo coincidentes con el isotipo.

Inmunohistoquímica

Se desparafinaron secciones de tejido humano (jm) en xileno y se rehidrataron a través de etanol graduado en PBS. Las secciones de tejido congelado (jm) y las preparaciones de citospina se fijaron con acetona fría a -20°C durante 15 minutos y, a continuación, se lavaron en PBS. Las muestras se trataron posteriormente con PBS que contenía 1,5% de peróxido de hidrógeno durante 30 minutos, se lavaron y, a continuación, se bloquearon con suero de cabra no inmune al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Anticuerpos usados: Los controles de ratón (IgG1 y IgG2a) (Caltag, Burlingame, CA); el control de conejo (Ig), 1A4 (anti actina del músculo liso alfa, IgG1), 2F11 (antineurofilamento, IgG1), F8/86 (antifactor von Willebrand murino, IgG1) (Dako, Carpinteria, CA); STRO-1; CC9 (antiCD146); LF-151 (antidentinsialoproteína humana de conejo; Dr. L. Fisher, NIDCR/NIH, MD). Diluciones de trabajo: suero de conejo (1/500), sobrenadantes monoclonales (1/2) y anticuerpos purificados (10 |jg/ml). La tinción única se efectuó incubando las muestras con el anticuerpo secundario adecuado, IgM anti-ratón de cabra biotinilado, IgGi, IgG2a o anticonejo de cabra biotinilado durante una hora a temperatura ambiente (Laboratorios Caltag). El complejo de avidina-peroxidasa y el sustrato se añadieron, a continuación, según las instrucciones del fabricante (Vectastain ABC Kit standard, Vector Laboratories). Las muestras se contratiñeron con hematoxilina y se montaron en medios acuosos. El etiquetado por fluorescencia doble se logró mediante la adición de los anticuerpos secundarios, el rojo Texas de IgM anti-ratón de cabra y FITC de IgG (Laboratorios CALTAG), durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, las muestras se montaron en un montante fluorescente VECTASHIELD.

Selección de perlas inmunomagnéticas

Las suspensiones monocelulares de tejido de pulpa dental se incubaron con anticuerpos reactivos a STRO-1 (1/2), CD146 (1/2) o 3G5 (1/2) durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron dos veces con PBS/BSA al 1% y, a continuación, se incubaron ya sea con Dynabeads magnéticas, conjugadas de IgG anti-ratón de oveja o conjugadas de IgM anti-ratón de rata (4 perlas por célula: Dynal, Oslo, Noruega) durante 40 minutos en un mezclador rotativo a 4°C. Las células que se unen a las perlas se eliminaron usando el concentrador de partículas magnéticas CPM-1 (Dynal) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

Ensayo matrigel-arteriola

Las suspensiones monocelulares de CPM STRO-1bright de médula ósea expandidas ex vivo se prepararon mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y, a continuación, se colocaron en placas de 48 pocillos que contenían 200 j l de matrigel. Las CPM STRO-1bright se colocaron en una placa a 20.000 células por pocillo, en un medio sin suero (Gronthos y col. 2003) suplementado con los factores de crecimiento PDGF, EGF, VEGF a 10 ng/ml. Después de 24 horas de cultivo a 37°C en un 5% de CO2, los pocillos se lavaron y, a continuación, se fijaron con paraformaldehído al 4%. Posteriormente, se efectuaron estudios inmunohistoquímicos para la actina del músculo liso alfa, identificada con un anticuerpo de peroxidasa de rábano picante de IgG antimurino de cabra/kit de Vectastaining, como se describió anteriormente.

Diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica de CPM in vitro

Se cultivaron suspensiones monocelulares de CPM derivadas de tejido adiposo, expandidas ex vivo en un aMEM suplementado con FCS al 10%, L-ascorbato-2-fosfato 100 jM, dexametasona 10'7 M y 3 mM fosfato inorgánico previamente mostrado, para inducir CPM de médula ósea destinadas a formar una matriz ósea mineralizada in vitro (Gronthos y col., 2003). Los depósitos minerales se identificaron por tinción von Kossa positiva. Se indujo adipogénesis en presencia de metilisobutilmetilxantina 0,5 mM, hidrocortisona 0,5 jM e indometacina 60 jM como se describió anteriormente (Gronthos y col. 2003). Se usó tinción rojo aceite O para identificar las células grasas cargadas de lípidos. La diferenciación condrogénica se evaluó en cultivos agregados tratados con 10 ng/ml de TGF-p3, como se describió (Pittenger y col., 1999)

Estudios de trasplante in vivo

Aproximadamente 5,0x106 de células expandidas ex vivo derivadas ya sea de CMEMO STRO-1b7CD146+ o CMPD CD146+ se mezclaron con 40 mg de polvo cerámico de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (HA/TCP) (Zimmer Inc, Varsovia, IN) y, a continuación, se trasplantaron por vía subcutánea en la superficie dorsal de ratones beige inmunocomprometidos de 10 semanas de edad (NIH-bg-nu-xid, Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, IN), como se describió anteriormente.(4) Estos procedimientos se efectuaron según las especificaciones de un protocolo de animales aprobado (NIDCR #00-113).

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa.

El ARN total se preparó a partir de CMNMO STRO-1BRT/CD146+ clasificadas y células de control (cultivos primarios de CMEMO efectuados en presencia de 10'7 M dexametasona durante tres semanas) usando RNA STAT-60 (TEL-TEST Inc. Friendswood TX). La síntesis de ADNc de primera cadena se efectuó con un kit de síntesis de ADNc de primera cadena (GIBCO BRL, Life Technologies) usando un cebador oligo-dT. Se añadió ADNc de la primera cadena (2 jl) a 46 j l de una mezcla de reacción maestra de PCR 1X (Roche Diagnostics, Gmbh Mannheim Alemania) y 10 pMol de cada conjunto de cebadores específicos humanos: CBFA1 (632 pb y tres variantes de empalme alternativas más pequeñas) (27) sentido 5'-CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3' [SEQ ID NO. 1], antisentido, 5'-CATAGCCATCGTAGCCTTGTCCT-3' [SEQ ID NO. 2]; osteocalcina (310 bp)<4> sentido, 5'-CATGAGAGCCCTCACA-3' [SEQ ID NO. 3], antisentido, 5'-AGAGCGACACCCTAGAC-3' [SEQ ID NO. 4]; GAPDH (800 bp) <4> sentido, 5'-AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3' [SEQ ID NO. 5]; antisentido 5'-TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3' [SEQ ID NO. 6]. Las reacciones se incubaron en un termociclador PCR Express Hybaid (Hybaid, Franklin, MA) a 95°C durante 2 minutos durante 1 ciclo, a continuación, 94°C/(30 segundos), 60°C/(30 segundos) y 72°C/(45 segundos) durante 35 ciclos, con una extensión final de 7 minutos a 72°C. Después de la amplificación, cada reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.

RESULTADOS

Las CMEMO y las CMPD expresan los antígenos vasculares asociados STRO-1 y CD146 in vivo.

Hemos demostrado anteriormente la eficacia de la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) para aislar y enriquecer todas las colonias clonogénicas detectables a partir de aspirados de médula humana, en función de su alta expresión del antígeno STRO-1.(25'26) Para caracterizar aún más las CMEMO, incubamos las células STRO-1bri aisladas por MACS con otro anticuerpo monoclonal, CC9,(28) que reconoce el antígeno de superficie celular CD146, también conocido como MUC-18, Mel-CAM y Sendo-1, que está presente en las células endoteliales y del músculo liso. Estos estudios determinaron que el CC9 unía selectivamente la fracción de expresión de STRO-1 bright (STRO-1BRT) de la población STRO-1 total mediante análisis FACS de doble color (Figura 1A). Los ensayos de eficiencia de clonación, usando estadísticas de distribución de Poisson, arrojaron un marcado aumento en la incidencia de CMEMO (1 colonia por 5 células STRO-1^brt/CD146+ en placa), y lograron un enriquecimiento de 2 x 103 veces de la población de colonias clonogénicas, en comparación con la médula no fraccionada (Figura 1B). No se pudo detectar la formación de colonias en la fracción celular de STRO-1brt/CD146‘ (datos no mostrados).

Las propiedades de dispersión de luz de las células STRO-1BRT/CD146+ de la médula eran típicamente más grandes y más granulares que las células eritroides nucleadas y los linfocitos B que comprenden la mayor parte de la población STRO-1+(29) (Figura 1C-E). Se halló que las preparaciones de citospina de las células STRO-1BRT/CD146+ clasificadas eran negativas para los marcadores asociados a eritroides (glucoforina-A) y leucocitos (CD45) (datos no mostrados). La confirmación de que las CMEMO representaban una población precursora osteogénica temprana se obtuvo mediante análisis de RT-pCr de células STRO-1brt/CD146+ aisladas con MACS/FACS y altamente purificadas, los cuales no detectaron los marcadores osteogénicos tempranos y tardíos, CBFA1 y osteocalcina, respectivamente (Figura 1F). Sin embargo, se halló que la progenie de CMEMO STRO-1 BRT/CD146+ clasificadas expresan CBFA1 y osteocalcina, después de la expansión ex vivo. Los estudios de inmunolocalización demostraron que el antígeno CD146 se expresaba predominantemente en las paredes de los vasos sanguíneos en secciones de la médula ósea humana (Figura 1G). La ubicación tanto de STRO-1 como de CD146 se limitó a grandes vasos sanguíneos en secciones congeladas de trefina de la médula ósea humana (Figura 1H).

Los protocolos de inmunoselección se usaron posteriormente para determinar si las CMPD humanas también expresaban STRO-1 y CD146 in situ. El uso de análisis MACS o FACS para aislar las CMPD fue restrictivo debido a la rareza de estas células (1 célula formadora de colonias por 2 x 103 células en placas) compuesta por el número limitado de células pulpares (aproximadamente 105 células por muestra de pulpa) obtenidas después del procesamiento. Para evitar esto, agrupamos varios tejidos pulpares obtenidos de 3 a 4 terceros molares diferentes por experimento y empleamos la selección de microperlas inmunomagnéticas en suspensiones monocelulares de tejido pulpar, en función de su expresión de los antígenos STRO-1 o CD146. La fracción de STRO-1+ representaba aproximadamente el 6% de la población total de células pulpares. Los estudios comparativos demostraron que las tasas de crecimiento de las colonias individuales no se alteraron en presencia de las perlas magnéticas (datos no mostrados). Los ensayos de eficiencia de colonias indicaron que la mayoría de las células formadoras de colonias derivadas de la pulpa dental (82%) estaban representadas en la menor fracción celular STRO-1+ análoga a las CMEMO (Figura 2). La incidencia media de las CMPD en la fracción positiva de STRO-1 (329 células formadoras de colonias por 105 células en placas ± 56 SE, n = 3) fue seis veces mayor que para las células pulpares no fraccionadas (55 células formadoras de colonias por 105 células en placas ± 14 SE, n = 3). Usando una estrategia similar, se seleccionaron diferentes fracciones de células de pulpa dental humana en función de su reactividad con el anticuerpo CC9. Los ensayos de eficiencia de colonias mostraron que una alta proporción (96%) de colonias clonogénicas derivadas de la pulpa dental también estaban presentes en la población CD146+, usando la selección de perla inmunomagnética Dynal (Figura 2). La incidencia media de las colonias clonogénicas en la fracción CD146+ (296 células formadoras de colonias por 105 células en placas ± 37 SE, n = 3) fue siete veces mayor que para las células pulpares no fraccionadas (42 células formadoras de colonias por 105 células en placas ± 9 SE, n = 3).

Los estudios de inmunolocalización mostraron que la expresión de STRO-1 estaba restringida a las paredes de los vasos sanguíneos y al perineuro que rodeaba los haces nerviosos, pero no estaba presente en la capa de odontoblastos o tejido fibroso maduro, en secciones congeladas de tejido de pulpa dental humana (Figura 3A-B). Además, se detectó la ubicación conjunta de CD146 con STRO-1 en las paredes celulares de los vasos sanguíneos externos, sin reactividad al tejido fibroso circundante, la capa de odontoblastos y el perineuro del nervio (Figura 3C-D). Es importante destacar que la expresión del marcador de diferenciación específica de odontoblastos humanos, la dentinsialoproteína (DSP), se restringió a la capa pulpar externa que contiene odontoblastos maduros (Figura 3E) y estuvo ausente en el tejido fibroso, haces nerviosos y vasos sanguíneos.

Expresión diferencial del marcador perivascular 3G5 por las CMEMO y las CMPD.

En el presente estudio, el análisis de citometría de flujo reveló que el antígeno de la superficie celular, 3G5, estaba altamente expresado por una gran proporción (54%) de células de médula hematopoyética (Figura 4A).

Esta observación eliminó el 3G5 como un marcador candidato para aislar poblaciones purificadas de CMEMO directamente de aspirados de médula humana. Además, el análisis de FACS doble en función de la expresión de 3G5 y STRO-1 no fue posible, ya que ambos anticuerpos compartían el mismo isotipo. Sin embargo, los ensayos de eficiencia de colonias in vitro para diferentes subfracciones clasificadas por FACS 3G5/CD146 demostraron que solo una proporción menor (14%) de colonias clonogénicas de médula ósea expresaron el antígeno 3G5 a niveles bajos (Figura 4b ). Por el contrario, una mayor proporción (63%) de CMPD clonogénicas (192 células formadoras de colonias por 105 células en placas ± 18,4 SE n = 3) estaban presentes en la fracción celular 3G5+ después de la selección de la perla inmunomagnética (Figura 2). El 3G5 demostró una reactividad específica a pericitos en secciones congeladas de tejido de pulpa dental humana (Figura 3F).

A continuación, analizamos la expresión de marcadores más específicos de células endoteliales (factor von Willebrand) y pericitos/células del músculo liso (actina del músculo liso a) en preparaciones de citospina usando CMEMO STRO-1BRT/CD146+ recién aisladas y CMPD que expresan CD146+. Se halló que una gran proporción de CMEMO purificadas (67%) eran positivas para la actina del músculo liso a (Figura 5A), pero carecían de la expresión del Factor von Willebrand (Figura 5B). Del mismo modo, también se halló que la mayoría de las CMPD aisladas (85%) expresaban actina del músculo liso a, pero no el factor von Willebrand (Figura 5^c, 5D). Las poblaciones purificadas de CMEMO STRO-1BRT/CD146+ y CMPD CD146+ se expandieron posteriormente in vitro, a continuación, se trasplantaron a ratones inmunocomprometidos para evaluar sus potenciales de desarrollo in vivo. La progenie de las CMEMO y las CMPD cultivadas mostró capacidades distintas, capaces de regenerar la médula ósea y microambientes dentales/pulpares, respectivamente (Figura 5E, F), y parecía idéntica al potencial de desarrollo de las CMEMO y las CMPD derivadas de múltiples colonias no seleccionadas (4).

ANÁLISIS DE RESULTADOS

El presente estudio proporciona evidencia directa de que dos poblaciones de células madre mesenquimales, distintas en su ontogenia y potencial de desarrollo, están asociadas a la microvasculatura de sus respectivos tejidos.

Empleamos diferentes protocolos de inmunoselección para demostrar que las CMEMO y las CMPD podían recuperarse eficientemente de los aspirados de médula ósea y del tejido pulpar digerido con enzimas, de manera respectiva, principalmente en función de su alta expresión del antígeno STRO-1. Este antígeno de la superficie celular está presente en los precursores de varios tipos de células estromales, incluyendo los fibroblastos de la médula, los osteoblastos, los condrocitos, los adipocitos y las células del músculo liso aisladas de la médula ósea adulta y fetal humana.(29'32_34) Estudios anteriores han implicado al STRO-1 como un marcador de poblaciones preosteogénicas, donde su expresión se pierde progresivamente después de la proliferación y diferenciación celular en osteoblastos maduros in vitro.(27'35'36) También se halló que el antígeno STRO-1 estaba presente en las paredes celulares externas de la médula ósea humana y los vasos sanguíneos de la pulpa dental, según estudios previos que ubicaron el STRO-1 en grandes vasos sanguíneos, pero no capilares, en diferentes tejidos adultos como cerebro, intestino, corazón, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, timo.(6) Por lo tanto, el STRO-1 parece ser un marcador temprano de diferentes poblaciones de células madre mesenquimales e infiere un posible nicho perivascular para estas poblaciones de células madre in situ.

Para determinar si las CMEMO y CMPD se asociaron directamente a los vasos sanguíneos, usamos otro anticuerpo (CC9), (28) que reconoce al miembro de la súper familia de inmunoglobulina, CD146 (MUC-18/Mel-CAM), conocido por estar presente en el músculo liso, el endotelio, los miofibroblastos y las células de Schwann in situ, además de ser un marcador para algunas neoplasias humanas.(37) En particular, el CD146 no es expresado por las células madre hematopoyéticas de la médula ósea, ni por sus progenitoras. Si bien no se conoce la función precisa de CD146, se ha vinculado con varios procedimientos celulares, incluida la adhesión celular, la reorganización del citoesqueleto, la forma celular, la migración y la proliferación a través de la señalización transmembrana.

Para diseccionar la población de CMEMO, las células de la médula que expresaban STRO-1BRT se distinguieron adicionalmente de las células hematopoyéticas STRO-1+ (predominantemente eritrocitos nucleados de glucoforina A+) en función de su expresión de CD146, usando un análisis de FACS doble. Las CMEMO STRO-1BRT/CD146+ humanas purificadas mostraron propiedades de dispersión de luz características de las células granulares grandes. Nuestro estudio respalda los hallazgos de Van Vlasselaer y colegas (1994)(38) quienes aislaron CMEMO parcialmente purificadas de la médula ósea murina después del tratamiento con 5-fluoracilo (5-FU), e identificaron a esta población con altas características de dispersión de luz perpendicular y frontal. Lo que resulta interesante, es que las CMEMO murinas resistentes a 5-FU recién aisladas también resultaron positivas para dos marcadores perivasculares Sab-1 y Sab-2.(38) Por el contrario, estudios más recientes han demostrado que cuando se cultivan CMEMO in vitro, las poblaciones más primitivas muestran bajas propiedades de dispersión de luz perpendicular y directa (39) y, por lo tanto, pueden no reflejar la verdadera morfología de las CMEMO in situ. En el presente estudio, las CMEMO STRO-1BRT/CD146+ humanas clasificadas carecían de la expresión de CBFA1 y osteocalcina que identifican poblaciones osteogénicas tempranas y tardías comprometidas, respectivamente, (40°'41) indicando que las CMEMO exhiben un fenotipo preosteogénico en aspirados de médula ósea humana. Hallamos que una alta proporción de CMEMO de STRO-1BRT/CD146+ recién aisladas expresaron la actina de músculo liso a, pero no el factor von Willebrand, marcador endotelial específico, lo que proporciona evidencia directa de que esta población precursora primitiva muestra un fenotipo perivascular característico.

El presente estudio también demostró la eficacia del uso de la selección de microperlas magnéticas para aislar y enriquecer las CMPD directamente del tejido de la pulpa dental humana en función de su expresión de STRO-1 o CD146. La inmunolocalización de CD146 parecía ser específica de la microvasculatura dentro de la pulpa dental. La localización conjunta de STRO-1 y CD146 en las paredes externas de los vasos sanguíneos grandes, en el tejido de la pulpa dental, implicaba que la mayoría de las CMPD surgen de la microvasculatura. Sin embargo, dado que el anticuerpo STRO-1 también reaccionó con el perineuro en la pulpa dental y los haces de nervios periféricos (observaciones no publicadas), se requiere más investigación para determinar el papel de este antígeno en el desarrollo de las células neurales.

De manera análoga a las CMEMO, se halló que las CMPD CD146+ recién aisladas expresaban actina de músculo liso a, pero no el factor von Willebrand. También se demostró que las CMPD son una población preodontogénica inmadura tanto por su ubicación distal de la superficie de formación de dentina como por su falta de expresión de la sialoproteína de dentina (DSP) específica de odontoblastos, que está restringida a la capa pulpar externa que contiene odontoblastos diferenciados. Anteriormente hemos descrito que las CMPD humanas expandidas ex vivo no expresan la molécula precursora, la dentinsialofosfoproteína (DSPP), in vitro cuando se cultivan en condiciones no inductivas.(4) Estudios similares han demostrado que el ARNm de DSPP se expresó altamente en tejido de pulpa/odontoblastos recién aislado, pero no se detectó en células de papila dental cultivadas, derivadas de incisivos de ratas.(43' 44) La DSPP solo se expresa cuando se inducen las CMPD, ya sea in vitro, (45) o por trasplante in vivo para formar una matriz de dentina ordenada.(4) Los estudios in vitro de las CMEMO y las CMPD expandidas ex vivo respaldaron la idea de que su progenie era morfológicamente similar a las células perivasculares cultivadas que tenían una morfología bipolar fibroblástica, estelar o plana, en lugar de una apariencia poligonal de tipo endotelial. Además, hemos demostrado anteriormente que la progenie de las colonias derivadas de CMEMO y CMPD exhiben una tinción heterogénea, tanto para CD 146 como para la actina muscular lisa a, pero carecen de la expresión de los marcadores endoteliales, el CD34 y el factor von Willebrand, in vitro.(4) Las observaciones que dos poblaciones diferentes de células madre mesenquimales, como las CMEMO y las CMPD, se alojan en nichos perivasculares pueden tener implicaciones adicionales para identificar poblaciones de células madre en otros tejidos adultos. Hallazgos recientes han identificado células madre mesenquimales multipotentes de "reserva" humanas en tejidos conectivos del músculo esquelético y dermis derivadas de muestras humanas fetales y adultas.(56) Sin embargo, la ubicación exacta, el potencial de desarrollo y la ontogenia de estas células madre aún se desconocen en gran medida. En el presente estudio, la identificación de nichos de células madre mesenquimales en la médula ósea y la pulpa de dentina puede ayudar a dilucidar las condiciones fundamentales necesarias para mantener y expandir selectivamente las poblaciones primitivas multipotenciales in vitro, a fin de dirigir sus potenciales de desarrollo in vivo.

EJEMPLO 2

Las CPM de médula ósea humana adulta son distintas de las células precursoras del estroma, las células madre hematopoyéticas y los angioblastos por su alta expresión del antígeno STRO-1 y la falta de expresión de CD34.

La médula ósea postnatal parece ser un centro de tipos de células madre precursoras y células madre residenciales responsables de la formación de células sanguíneas (células madre hematopoyéticas), desarrollo endotelial (angioblastos) y diferenciación del tejido conectivo/estroma (células precursoras estromales/células madre estromales de la médula ósea/células madre mesenquimales). El trabajo reciente de nuestro grupo (Gronthos y col. 2003; Shi y Gronthos 2003), por primera vez, ha purificado y caracterizado células precursoras mesenquimales (CPM) multipotenciales de la médula ósea en función de su alta expresión del antígeno STRO-1 y por su coexpresión de los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, VCAM-1 (CD106) y MUC-18 (CD146). Los primeros estudios efectuados por Simmons y Torok-Storb (1991a y b), han demostrado que las células precursoras estromales STRO-1+, con la capacidad de formar colonias adherentes in vitro, también expresaron el marcador de células madre hematopoyéticas, CD34, aunque a niveles bajos. Estos estudios usaron la lisis celular mediada por el anticuerpo CD34 para eliminar una alta proporción de células adherentes formadoras de colonias en aspirados de médula (Simmons y Torok-Storb 1991b). Es importante tener en cuenta que, si bien el anticuerpo STRO-1 se generó después de la inmunización de ratones con células CD34+ humanas de la médula ósea, esto puede haber surgido debido al hecho de que el antígeno STRO-1 también se expresa en niveles de moderados a bajos en glóbulos rojos nucleados CD34+/glicoforina A+ y linfocitos B CD34+/CD20+. Ahora ofrecemos evidencia directa, usando tecnología sofisticada de clasificación de células activadas por fluorescencia, de que las CPM multipotenciales de la médula ósea humana adulta expresa altos niveles de STRO-1, pero carece de expresión en la célula precursora del estroma, la célula madre hematopoyética y el marcador de angioblastos (CD34), el antígeno leucocitario (CD45), y el marcador de glóbulos rojos nucleados (Glicoforina A) (Figura 6A-C). Estos datos demuestran que las CPM derivadas de médula ósea humana adulta son una nueva población de células madre, distintas de las células precursoras del estroma más maduras, las células madre hematopoyéticas y los angioblastos (Figura 7).

A menos que se indique lo contrario, los materiales y procedimientos de este ejemplo son los mismos que los del Ejemplo 1.

EJEMPLO 3. Identificación de CPM multipotenciales en diferentes tejidos humanos.

Si bien se desconoce en gran medida la existencia y la ubicación precisa de las CPM en diferentes tejidos, recientemente hemos demostrado que parece que las CPM residen en un nicho perivascular en la médula ósea humana y los tejidos de la pulpa dental (Shi y Gronthos 2003). Estas observaciones se basaron en una combinación de procedimientos de inmunohistoquímica e inmunoselección para identificar y aislar diferentes poblaciones de CPM en función de su expresión del marcador de células madre mesenquimales, STRO-1, los marcadores de músculo liso y pericito, CD146, actina de músculo liso alfa y marcador específico de pericito, 3G5. Ahora hemos extendido estos estudios que demuestran la ubicación conjunta de STRO-1/CD146, STRO-1/actina del músculo liso alfa y antígenos 3G5/CD146 en una variedad más amplia de tejidos que incluyen corazón, hígado, riñón, piel, bazo, páncreas, ganglio linfático (Figura 8).

Para confirmar nuestros hallazgos anteriores de que las CPM se pueden derivar de un tejido que no sea la médula ósea, como la pulpa dental, usamos la clasificación de células activadas por fluorescencia para aislar diferentes poblaciones de CPM de tejidos adiposos periféricos de humanos adultos. Se obtuvieron suspensiones monocelulares después de la digestión del tejido adiposo con colagenasa y dispasa, como se describió anteriormente (Shi y Gronthos 2003). Las células derivadas de tejido adiposo se incubaron con anticuerpos reactivos contra STRO-1, CD146 y 3G5. A continuación, las poblaciones celulares se seleccionaron mediante FACS, en función de su positividad (región R3) o negatividad (región R2) para cada marcador y, a continuación, se colocaron en un medio de crecimiento regular (Shi y Gronthos 2003) para evaluar la incidencia de las células adherentes formadoras de colonias en cada fracción celular (Figura 9). Después de 12 días de cultivo, se puntuaron las colonias (agregados de 50 células o más) y se mostraron como el número de colonias por 105 células colocadas en placas para cada fracción celular. Nuestros datos demostraron que las CPM se pueden derivar de tejidos adiposos en función de su expresión de antígenos STRO-1/3G5/CD146 (Figura 10). El análisis citométrico de flujo de doble color confirmó que solo una pequeña proporción de células derivadas del tejido adiposo coexpresaron STRO-1/CD146 y 3G5/CD146 (Figura 11). Estos hallazgos son consistentes con nuestras observaciones previas de que las CPM se pueden aislar tanto de la médula ósea como del tejido de la pulpa dental, en función del mismo conjunto de marcadores perivasculares (Shi y Gronthos 2003). Además, proporcionamos evidencia que demuestra que las CPM derivadas del tejido adiposo aisladas mediante la selección de CD 146 tienen la capacidad de diferenciarse en diferentes tejidos como hueso, grasa y cartílago (Figura 12), como se describió anteriormente (Gronthos y col. 2003).

Los hallazgos recientes que examinan la existencia de las CPM en tejidos no relacionados, como la piel, también se han examinado para fortalecer aún más nuestra hipótesis. Se obtuvieron suspensiones monocelulares después de la digestión de la piel humana de grosor completo con colagenasa y dispasa, como se describió anteriormente para el tejido adiposo humano. A continuación,, las células derivadas de la piel se incubaron con anticuerpos reactivos contra STRO-1, CD146 y 3G5, identificados usando una IgM antimurina de cabra o fitoeritrina de IgG. A continuación, las poblaciones celulares se seleccionaron mediante FACS, en función de su positividad (región R3) o negatividad (región R2) para cada marcador y, a continuación, se colocaron en un medio de crecimiento regular (Shi y Gronthos 2003) para evaluar la incidencia de las células adherentes formadoras de colonias en cada fracción celular (Figura 13). Después de 12 días de cultivo, se puntuaron las colonias (agregados de 50 células o más) y se mostraron como el número de colonias por 105 células colocadas en placas para cada fracción celular. Los datos demostraron que las CPM también se pueden derivar de la piel en función de su expresión de antígenos STRO-1/3G5/CD146 (Figura 10). En conjunto, estos datos sugieren que las CPM multipotenciales pueden identificarse y aislarse en prácticamente todos los tejidos vascularizados derivados del tejido humano postnatal en función de un fenotipo común.

A menos que se indique lo contrario, los materiales y procedimientos de este ejemplo son los mismos que los del Ejemplo i.

Figura 8. Reactividad de los marcadores perivasculares en diferentes tejidos humanos. Tinción de inmunofluorescencia de doble color que demuestra reactividad de (A) STRO-1 y CD146, (B) STRO-1 y actina del músculo liso alfa, y (C) 3G5 y CD146, en los vasos sanguíneos y el tejido conectivo presente en el bazo, el páncreas (Panel I), cerebro, riñón (Panel II), hígado, corazón (Panel III) y piel (Panel IV) 20X. Los anticuerpos STRO-1 y 3G5 se identificaron usando un rojo Texas de IgM antimurina de cabra, mientras que el CD146 y la actina del músculo liso alfa se identificaron usando un isotiocianato de fluoresceína de IgG o antimurino de cabra. La ubicación conjunta se indica mediante la superposición de áreas de fluorescencia amarilla y naranja (flechas blancas).

Figura 9. Aislamiento de CPM derivadas de tejido adiposo por FACS. Histogramas de citometría de flujo representativos que representan la expresión de STRO-1, CD146 y 3G5 en preparaciones frescas de suspensiones monocelulares derivadas de tejidos adiposos periféricos generadas después de la digestión con colagenasa/dispasa como se describió anteriormente (Shi y Gronthos 2003). Los anticuerpos se identificaron usando ya sea IgM antimurina de cabra o ficoeritrina de IgG. A continuación, las poblaciones celulares se seleccionaron mediante FACS, en función de su positividad (región R3) o negatividad (región R2) para cada marcador y, a continuación, se colocaron en un medio de crecimiento regular para evaluar la incidencia de las células adherentes formadoras de colonias en cada fracción celular.

Figura 10. Las CPM clonogénicas derivadas del tejido adiposo son positivas para STRO-1/3G5/CD146. El gráfico de barras representa el número de colonias clonogénicas recuperadas de suspensiones monocelulares de tejido adiposo periférico humano digerido enzimáticamente, después de la clasificación de células activadas por fluorescencia, en función de su reactividad a anticuerpos que reconocen STRO-1, CD146 y 3G5 (Figura 9) y, a continuación, cultivadas en un medio de crecimiento estándar, como se describió anteriormente para la médula ósea y el tejido de la pulpa dental (Shi y Gronthos 2003). Los datos se expresan como el número de unidades formadoras de colonias obtenidas por 105 células colocadas en placas en las fracciones celulares positivas y negativas, promediadas a partir de dos experimentos separados.

Figura 14. Las CPM clonogénicas derivadas de tejido cutáneo son positivas para STRO-1bri/3G5/CD146. El gráfico de barras representa el número de colonias adherentes recuperadas de suspensiones monocelulares de tejido cutáneo humano digerido enzimáticamente, después de la clasificación de células activadas por fluorescencia, en función de su reactividad a anticuerpos que reconocen STRO-1, CD146 y 3G5 y, a continuación, cultivadas en un medio de crecimiento estándar, como se describió anteriormente para la médula ósea y el tejido de la pulpa dental (Shi y Gronthos 2003). Los datos se expresan como el número de unidades formadoras de colonias obtenidas por 105 células colocadas en placas en las fracciones celulares positivas y negativas, promediadas a partir de dos experimentos separados.

EJEMPLO 4. Análisis inmunofenotípico de células precursoras mesenquimales de médula ósea humana expandidas ex vivo

Hemos informado anteriormente que las células precursoras mesenquimales (CPM) multipotenciales pueden purificarse de células mononucleares de médula ósea humana adultas en función del fenotipo STRO-1bright/VCAM-1 (CD106)+ o STRO-1bright/MUC-18 (CD146)+ (Gronthos y col. 2003; Shi y Gronthos 2003). La población de CPM se puede propagar fácilmente in vitro en condiciones de cultivo definidas (Gronthos y col. 2003). Ahora se presentan datos que caracterizan a la progenie de las CPM expandidas ex vivo en función de los marcadores asociados con diferentes linajes celulares, tanto a nivel de ARNm como de proteína, usando la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) y el análisis de citometría de flujo, respectivamente.

En la primera serie de experimentos, se empleó un análisis semicuantitativo de RT-PCR para examinar el perfil de expresión génica de varios genes asociados al linaje presentes en las poblaciones de CPM cultivadas (Figura 15). La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQuant (Figura 15 B). Además, se usó el análisis de citometría de flujo de un solo color para examinar el perfil de expresión de proteínas de las CPM expandidos ex vivo en función de su expresión de marcadores asociados al linaje celular (Figura 15 A). En la Tabla 1, se presenta un resumen del fenotipo general en función de la expresión génica y de proteínas de las CPM cultivadas. La comparación directa del perfil de expresión génica de CPM descrito en la presente patente demostró claras diferencias entre esta población celular y las células madre mesenquimales (CMM) descritas anteriormente por Pittenger y col. 1999 (Tabla 1).

Figura 15A. Patrón de expresión inmunofenotípica de CPM de médula ósea expandidas ex vivo. Las suspensiones monocelulares de CPM de médula ósea expandidas ex vivo se prepararon mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y, a continuación, se incubaron con anticuerpos que identifican marcadores asociados al linaje celular. Para aquellos anticuerpos que identifican antígenos intracelulares, las preparaciones celulares se fijaron con etanol frío al 70% para permeanbilizar la membrana celular antes de la tinción para marcadores intracelulares. Los anticuerpos de control de isotipo coincidentes se trataron en idénticas condiciones. El análisis de citometría de flujo se efectuó usando un instrumento COULTER EPICS. Los gráficos de puntos representan 5.000 eventos en modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de células de linaje (línea en negrita) con referencia a los anticuerpos de control negativo coincidentes con el isotipo (línea delgada).

Figura 15B. Perfil de expresión génica de CPM cultivadas. Se prepararon suspensiones monocelulares de CPM de médula ósea expandidas ex vivo mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y se preparó un ARN celular total. Usando el procedimiento de extracción de ARNzolB, se aisló el ARN total y se usó como plantilla para la síntesis de ADNc, preparado usando un procedimiento estándar. La expresión de varias transcripciones se evaluó mediante amplificación por PCR, usando un protocolo estándar, como se describió anteriormente (Gronthos y col. 2003). Los conjuntos de cebadores usados en este estudio se muestran en la Tabla 2. Después de la amplificación, se analizó cada mezcla de reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. La expresión génica relativa para cada marcador celular se evaluó con referencia a la expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, usando el software ImageQant.

Figura 16. Las CPM STRO-1 bri expandidas ex vivo pueden convertirse en arteriolas in vitro. Las suspensiones monocelulares de CPM STRO-1bri y CPM STRO-1duN de la médula ósea expandidas ex vivo se prepararon mediante un tratamiento con tripsina/EDTA y, a continuación, se colocaron en placas de 48 pocillos que contenían 200 pl de matrigel. Las CPM STRO-1duN (A) y STRO-1bri (B) se sembraron en placa a 20.000 células por pocillo en un medio sin suero (Gronthos y col.2003) suplementado con los factores de crecimiento PDGF, EGF, VEGF a 10 ng/ml. Después de 24 horas de cultivo a 37°C en un 5% de CO2, los pocillos se lavaron y, a continuación, se fijaron con paraformaldehído al 4%. Posteriormente, se efectuaron estudios inmunohistoquímicos que demostraron que las estructuras en forma de cordón expresaban la actina del músculo liso alfa, identificada con un anticuerpo de peroxidasa de rábano picante de IgG antimurina de cabra.

Tabla 1. Comparación entre las células precursoras mesenquimales (CPM) humanas cultivadas y las células madre mesenquimales (CMM) humanas cultivadas después de la expansión ex vivo. Se halló que los antígenos están presentes en la superficie celular, intracelular o en la matriz extracelular. Las CPM expresan marcadores de tejidos con diferente ori en de desarrollo, es decir, ECT-ectodermo, MES-mesodermo END-endodermo.

T l 2. r RT-P R n i i n r l m lifi i n ífi ARNm h m n

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población celular enriquecidas en células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5, en la que la población comprende al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica y en la que la población celular se ha enriquecido desde el tejido adiposo para su uso como medicamento.

2. La población celular para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, en la que las células se enriquecen a partir de un tejido adiposo vascularizado.

3. La población celular para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que las células son para generar tejido adiposo.

4. La población celular para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la población celular es humana.

5. Una población celular enriquecidas en células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5, en la que la población comprende al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica y en la que la población celular se ha enriquecido desde el tejido adiposo para su uso en la generación de tejido o aplicaciones de neovascularización.

6. La población celular para su uso según la reivindicación 5, en la que las células a regenerar se seleccionan de condrocitos, células de tendones, células de ligamentos, células de cartílago, células de adipocitos, células de fibroblastos, células del estroma de la médula, células del estroma de soporte hematopoyético, células del músculo cardíaco, células del músculo liso, células del músculo esquelético, células pericíticas, células vasculares, células epiteliales, células gliales, células neuronales, células de astrocitos o células de oligodendrocitos.

7. La población celular para uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en la que las células se enriquecen a partir de un tejido adiposo vascularizado.

8. La población celular para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que las células son para la generación de tejido adiposo.

9. La población celular para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que las células son para la regeneración de un tejido distinto del tejido adiposo.

10. La población celular para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que la población celular es humana.

11. Una población de células precursoras mesenquimales (CPM) que expresan 3G5 y que comprenden al menos un 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica, en la que la población se enriquece en un procedimiento que comprende:

• la etapa de preparar una suspensión monocelular a partir de tejido adiposo y la etapa de enriquecimiento en función de la presencia del marcador 3G5; o

• la etapa de preparar una suspensión monocelular a partir de tejido adiposo y separar el tejido en células separadas, y la etapa de enriquecimiento en función de una presencia o nivel del marcador 3G5 y la ausencia de uno o más marcadores de superficie indicativos de compromiso;

para su uso en una aplicación de neovascularización o para la generación de tejido en un mamífero en el que se introduce el medicamento.

12. Una población celular obtenida por cultivo que expande la población enriquecida de células que expresan 3G5 y que comprende al menos el 1% de CPM capaces de formar una colonia clonogénica, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 4 a 7 o 10.