ES2768803T3 - Composición para inducir la reprogramación celular - Google Patents

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Jung Eun Lee
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Abstract

Un compuesto representado por la siguiente fórmula A como un derivado de indazol:**Fórmula** **(Ver fórmula)** en donde R1 es nitro o Y-carbonilo, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C1-30 o heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo; R2 es hidroxilo, halógeno, fenilo o alquenilo C2-30; en donde el fenilo en R2 está no sustituido o sustituido con hidroxilo, halógeno, alcoxilo C1-5, alquilo C1-5, alquenilo C2- 5, o una combinación de los mismos; R3 es hidrógeno; y X es amido, sulfonamido, oxima o imidamido, siempre que cuando R1 es nitro y X es amido, R2 no es fenilo sustituido o no sustituido.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para inducir la reprogramación celular
[Campo técnico]
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Coreana N.° 10-2014-0081889, presentada en la Oficina de Propiedad Intelectual de Corea, el 1 de julio de 2014.
La presente invención se refiere a compuestos y composiciones para inducir la reprogramación celular, tal como se define en las reivindicaciones.
[Técnica anterior]
A medida que ha ido creciendo la sociedad envejecida, muchas personas han padecido enfermedades degenerativas, y su número ha seguido aumentando. El método más ideal para el tratamiento de una serie de enfermedades degenerativas incurables, incluyendo la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Lou Gehrig, es trasplantar o bien células madre pluripotentes, extraídas del paciente, o bien células funcionales que se diferencian de ellas, en una parte afectada. En los últimos años, para el tratamiento radical de enfermedades degenerativas incurables, se ha disputado intensamente una competición por el desarrollo de tecnologías entre los países del mundo para liderar el desarrollo de agentes terapéuticos celulares y nuevos fármacos basados en la tecnología de reprogramación celular.
La tecnología de la reprogramación es un método relativamente fácil que causa poco o ningún daño físico y molestias a los pacientes. Esta tecnología hace posible obtener células auto-somáticas y producir células madre pluripotentes inducidas que tienen características similares a las de las células madre embrionarias humanas de ellas. Por lo tanto, evolucionó espectacularmente una estrategia para generar células madre auto pluripotentes a partir de células somáticas del paciente. Por ejemplo, puede usarse virus recombinados con un gen específico para inducir células madre no diferenciadas, y varios investigadores presentaron un método en el que el virus se transfecta en células para insertar el gen en el genoma de las células y la proteína de interés se expresa en las células. Por otra parte, se descubrió que células reprogramadas producidas mediante este método tenían características celulares y potencial de diferenciación, que son casi similares a los de las células madre embrionarias, pero estas células tienen el problema de que contienen una gran cantidad de material genético en el genoma de las células, porque el gen se suministra a las células por el vector viral. Adicionalmente, experimentos in vivo indicaron que las células madre pluripotentes inducidas tenían efectos secundarios tales como la formación de cáncer. Esto sugiere que la aplicación clínica real de células madre pluripotentes inducidas todavía puede ser arriesgada.
Tal como se describió anteriormente, las células madre pluripotentes inducidas tienen el problema de que se utiliza un oncogén en un proceso de reprogramación. Debido a este problema, en los últimos años, se han realizado estudios activos sobre la reprogramación directa para permitir que las células somáticas se diferencien directamente en una estirpe celular requerido en los pacientes, a diferencia de los métodos de reprogramación convencionales.
Por otra parte, entre los compuestos convencionales, los compuestos (por ejemplo, Reversina, inhibidor de la quinasa Aurora) que pueden usarse para la reprogramación celular no son adecuados como composición de reprogramación celular debido a su citotoxicidad.
Los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para superar los problemas descritos anteriormente y, como resultado, han sintetizado compuestos que no son tóxicos para las células y que permiten la reprogramación directa de células diferenciadas en células que tienen otras características, y han descubierto que el uso de estos compuestos permite una reprogramación celular segura y eficaz.
A lo largo de la memoria descriptiva, se hace referencia a y se citan una serie de publicaciones y documentos de patente.
El documento KR 20130085752 se refiere a un método para inducir células musculares cardíacas a partir de células somáticas usando un inhibidor de la glucógeno sintetasa quinasa (GSK), un agonista de canales de calcio, un activador de la señalización de adenosín monofosfato cíclico (cAMP), un inhibidor del receptor del factor de crecimiento transformante beta tipo I, una quinasa regulada extracelular (EKR1), o una proteína activadora (Ras)-GTPasa de sarcoma de rata.
[Descripción]
[Problema técnico]
Los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar composiciones capaces de inducir la reprogramación celular al mismo tiempo que muestran perfiles biológicos mejorados en comparación con los compuestos derivados de indazol convencionales. Como resultado, los presentes inventores han diseñado y sintetizado compuestos derivados de indazol novedosos que tienen la capacidad de inducir la reprogramación celular, y han descubierto que estos compuestos tienen una excelente capacidad de reprogramación celular sin mostrar citotoxicidad, a diferencia de los derivados de indazol convencionales (por ejemplo, inhibidores de quinasa), completando así la presente invención.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar una composición para inducir la reprogramación celular, tal como se define en las reivindicaciones.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar derivados de indazol novedosos, tal como se define en las reivindicaciones.
Otros objetos y ventajas de la presente invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos adjuntos y las reivindicaciones adjuntas. La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos.
[Solución técnica]
Según un aspecto, la presente invención proporciona una composición para inducir la reprogramación celular, que comprende un compuesto representado por la siguiente fórmula A:
Fórmula A
Figure imgf000003_0001
en donde R1 es nitro o Y-carbonilo, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C1-30 o heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo;
R2 es hidroxilo, halógeno, fenilo o alquenilo C2-30;
en donde el fenilo en R2 está no sustituido o sustituido con hidroxilo, halógeno, alcoxilo C1-5, alquilo C1-5, alquenilo C2-5, o una combinación de los mismos;
R3 es hidrógeno; y
X es amido, sulfonamido, oxima o imidamido, siempre que cuando R1 es nitro y X es amido, R2 no es fenilo sustituido o no sustituido.
Según otro aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para producir células reprogramadas a partir de células diferenciadas, comprendiendo el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto un compuesto representado por la fórmula A con las células diferenciadas; (b) cultivar las células de la etapa (a).
Los presentes inventores han realizado grandes esfuerzos para desarrollar composiciones capaces de inducir la reprogramación celular mientras muestran perfiles biológicos mejorados en comparación con los compuestos derivados de indazol convencionales. Como resultado, los presentes inventores han diseñado y sintetizado compuestos derivados de indazol novedosos que tienen la capacidad de inducir la reprogramación celular, y han descubierto que estos compuestos tienen una excelente capacidad de reprogramación celular sin mostrar citotoxicidad, a diferencia de los derivados de indazol convencionales (por ejemplo, inhibidores de quinasa).
El compuesto representado por la fórmula A según la presente invención es un compuesto que puede reprogramar células diferenciadas en células que tienen nuevas características, y se sintetiza químicamente usando indazol como núcleo. No se ha conocido que se usen compuestos derivados de indazol convencionales para la reprogramación celular, y el compuesto de la presente invención tiene una excelente capacidad para reprogramar células al mismo tiempo que tiene poca o ninguna citotoxicidad, en comparación con compuestos derivados de indazol convencionales. Un método convencional de reprogramación directa es un método para introducir un gen utilizando virus, y tiene deficiencias en que el método es difícil de aplicar directamente al paciente, la eficacia del proceso de inducir la reprogramación celular es baja, y surgen problemas inmunológicos. La reprogramación celular directa que utiliza el compuesto de bajo peso molecular de la presente invención es muy excelente en términos de seguridad, rentabilidad y eficacia, ya que se induce reprogramación celular mediante el tratamiento con el compuesto de bajo peso molecular en lugar de introducir un gen mediante un vector viral.
La composición de la presente invención es muy eficaz para inducir células reprogramadas a partir de células diferenciadas. Según la presente invención, la composición de la presente invención puede inducir líneas celulares de diversas estirpes, tales como células de estirpes osteogénicas reprogramadas o células de estirpes adipogénicas, a partir de células diferenciadas de mamíferos. Según una realización de la presente invención, la composición de la presente invención induce la diferenciación de mioblastos a osteoblastos o adipocitos.
El término "células diferenciadas" no está específicamente limitado e incluye, por ejemplo, células somáticas o células madre somáticas. El término "células somáticas" se refiere a células adultas que tienen una capacidad limitada para diferenciarse y autorrenovarse. Las células somáticas pueden ser células que forman piel, cabello, tejido adiposo o hueso humanos.
Las células diferenciadas pueden ser células de una variedad de mamíferos, incluyendo seres humanos, monos, cerdos, caballos, ganado, ovejas, perros, gatos, ratones y conejos. Preferiblemente, las células diferenciadas pueden ser células humanas.
Tal como se usa en el presente documento, el término "reprogramación" se refiere a un proceso mediante el cual las células que existen en diferentes condiciones, tales como células que no tienen potencial de diferenciación o células que tienen un determinado potencial de diferenciación, pueden finalmente restaurarse o convertirse en un nuevo tipo de células nuevo tipo de estado que tenga potencial de diferenciación. Según la presente invención, pueden reprogramarse células diferenciadas en células que tienen características que son el 0-100% diferente de las de las células diferenciadas, como resultado del contacto con la composición de la presente invención.
Tal como se usa en el presente documento, el término "nitro" se refiere a un grupo funcional -NO2.
El término "nitroxilo" se refiere a un grupo funcional -O-N=O.
El término "carbonilo" se refiere a un grupo funcional -(C=O).
El término "hidroxilo" se refiere a un grupo funcional -OH-.
El término "halógeno" se refiere a elementos del grupo de los halógenos e incluye, por ejemplo, flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal o ramificada, no sustituido o sustituido, e incluye, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isobutilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, tridecilo, pentadecilo y heptadecilo. "Alquilo C1-30" se refiere a un grupo alquilo que tiene una unidad alquilo que contiene de 1-30 átomos de carbono, y cuando el alquilo C1-30 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el número de carbonos del alquilo C1-30.
El término "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado insaturado de cadena lineal o ramificada, no sustituido o sustituido, que tiene el número indicado de átomos de carbono, e incluye, por ejemplo, etenilo, vinilo, propenilo, alilo, isopropenilo, butenilo, isobutenilo, t- butenilo, n-pentenilo y n-hexenilo. "Alquenilo C2-20" se refiere a un grupo alquenilo que tiene una unidad alquenilo que contiene de 2-30 átomos de carbono, y cuando el alquenilo C2-20 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el átomo de carbono del alquenilo C2-20. Según la presente invención, el alquenilo C2-30 en la posición R2 en la fórmula A es preferiblemente alquenilo C2-15.
El término "alcoxilo" se refiere a un grupo alquilo o arilo combinado con un átomo de oxígeno e incluye, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, ariloxilo y similares. "Alcoxilo C1-30" significa un grupo alquilo que tiene una unidad alcoxilo que contiene de 1 a 30 átomos de carbono, y cuando el alcoxilo C1-30 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el número de carbonos del alcoxilo C1-30.
El término "alcoxialquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo alcoxilo. "Alcoxialquilo C2-5" significa un grupo alcoxialquilo que tiene una unidad alcoxialquilo que contiene de 2 a 5 átomos de carbono, y cuando el alcoxialquilo C2-5 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el átomo de carbono del alcoxialquilo C2-5.
El término "alcoxicarbonilo" se refiere a carbonilo sustituido con alcoxilo. "Alcoxicarbonilo C2-5" significa un grupo alcoxicarbonilo que tiene una unidad alcoxicarbonilo que contiene de 2 a 5 átomos de carbono, y cuando el alcoxicarbonilo C2-5 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el átomo de carbono del alcoxicarbonilo C2-5.
La expresión "heterocicloalquilo que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre como heteroátomo" se refiere a un grupo hidrocarbonado cíclico no aromático que contiene átomos de carbono e hidrógeno y al menos un heteroátomo (nitrógeno, oxígeno o azufre). El heteroátomo es preferiblemente nitrógeno u oxígeno, y lo más preferiblemente, nitrógeno. Según la presente invención, el número de heteroátomos es de 1 a 4, o de 1 a 3, o de 1 a 2. "Heterocicloalquilo C2-30" se refiere a un heterocicloalquilo en donde el número de carbonos que forman la estructura del anillo es de 2-30.
Por otra parte, el heterocicloalquilo es un anillo de carbono total o parcialmente sustituido o no sustituido. El heterocicloalquilo puede estar sustituido con hidroxilo, halógeno, alquilo C1-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, alcoxilo C1-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, alquenilo C1-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, alcoxialquilo C2-8, alcoxicarbonilo C2-5, heterocicloalquenilo C2-8 que contiene nitrógeno como heteroátomo,
Figure imgf000005_0001
o una combinación de los mismos.
La expresión "heterocicloalquenilo que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre como heteroátomo" se refiere a un grupo hidrocarbonado cíclico no aromático que contiene átomos de carbono e hidrógeno y al menos un heteroátomo (nitrógeno, oxígeno o azufre). El heteroátomo es preferiblemente nitrógeno u oxígeno, y lo más preferiblemente, nitrógeno. Según la presente invención, el número de heteroátomos es de 1 a 4, o de 1 a 3, o de 1 a 2. "Heterocicloalquenilo C2-30" se refiere a un heterocicloalquenilo en donde el número de carbonos que forman la estructura del anillo es de 2-30.
El término "heterocicloalquenilalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo heterocicloalquenilo. "Heterocicloalquenilalquilo C2-8 significa un heterocicloalquenilalquilo que tiene una unidad de heterocicloalquenilalquilo que contiene de 2 a 5 átomos de carbono, y cuando el heterocicloalquenilalquilo C2-8 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el número de carbonos del heterocicloalquenilalquilo C2-8.
El término "arilo" se refiere a un anillo de carbono monocíclico o policíclico total o parcialmente sustituido o no sustituido. "Arilo C6-30" se refiere a un grupo arilo que tiene de 6 a 30 átomos de carbono en el anillo, y cuando el arilo C6-30 está sustituido, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el número de carbonos del arilo C6-30. Preferiblemente, arilo es monoarilo o biarilo. El monoarilo preferiblemente tiene de 5 a 6 átomos de carbono, y el biarilo preferiblemente tiene de 9 a 10 átomos de carbono. Según la presente invención, el arilo es arilo sustituido o no sustituido. Cuando el monoarilo, por ejemplo, fenilo, está sustituido, puede estar sustituido con diversos sustituyentes en diversas posiciones. Por ejemplo, puede estar sustituido con halógeno, hidroxilo, nitro, alquilo C1-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, alquenilo Ci-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, alcoxilo C1-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, alquilo C1-C5 de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido, o una combinación de los mismos.
Según la presente invención, el arilo C1-30 en la posición R2 en la fórmula 2 es fenilo. Los restos arilo descritos incluyen, pero no se limitan a, fenilo, bencilo, naftilo, pirrolilo, pirrolidinilo, piridinilo, pirimidinilo, purinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, furilo, tiofenilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo y tienilo.
El término "amina" se refiere a un grupo funcional que contiene un átomo de nitrógeno básico con un par no enlazado. "Amina C1-10" se refiere a un grupo de amina que tiene -NH2 o una unidad de amina que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando la amina C1-10 está sustituida, el átomo de carbono del sustituyente no está incluido en el átomo de carbono de la amina C1-10.
El término "amida" se refiere a un grupo funcional que consiste en un grupo acilo combinado con un átomo de nitrógeno. "Amida C1-10" se refiere a un grupo de amida que tiene una unidad de amida que contiene de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando la amida C1-10 está sustituida, el número de carbonos del sustituyente no está incluido en el número de carbonos de la amida C1-10. Según la presente invención, la amida es R-CO-NH-R', sulfonamida o fosforamida.
El término "oxima" se refiere a un grupo funcional que comprende una imina de RR'C=N-OH.
El término "imidamida" se refiere a un grupo funcional que comprende N-CR=N'H2.
Según la presente invención, Y en la fórmula A es hidroxilo, alcoxilo C1-30, o heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo.
Según la presente invención, el heterocicloalquilo en Y de la fórmula A puede estar sustituido con hidroxilo, halógeno, alquilo C1-5 , alquenilo C2-5 , alcoxilo C1-5 , alcoxialquilo C2-8 , alcoxicarbonilo C2-8, heterocicloalquenilalquilo C2-8 que
contiene nitrógeno como heteroátomo,
Figure imgf000005_0002
o una combinación de los mismos.
Según una realización de la presente invención, el heterocicloalquenilalquilo en Y es (1H-imidazol-1-il)alquilo.
Según la presente invención, R2 puede estar sustituido con hidrógeno, halógeno, arilo C1-15, alcoxilo C1-15 o alquenilo C2-15 y el arilo en R2 puede estar sustituido con hidroxilo, halógeno, alcoxilo C1-5, alquilo C1-5, alquenilo C2-5, o una combinación de los mismos.
Por otra parte, cuando X en la fórmula A es imidamido
Figure imgf000006_0001
puede estar unido a C o N' del imidamido.
Los compuestos de la presente invención pueden tener uno o más centros quirales y/o centros isoméricos geométricos, y por lo tanto la presente invención incluye todos los estereoisómeros representados por la fórmula A, tales como isómeros ópticos, diastereómeros e isómeros geométricos.
Según la presente invención, la composición para inducir la reprogramación celular según la presente invención puede contener un compuesto representado por una fórmula seleccionada del grupo que consiste en las siguientes fórmulas 6-14, 19-43 y 45. También se describen compuestos representados por las fórmulas 1-4, 5, 15-18 y 42-44:
Fórmula 1
Fórmula 6 Fórmula 12 Fórmula 19 Fórmula 25
Figure imgf000010_0001
Fórmula 29 Fórmula 31 Fórmula 36 Fórmula 40 Según la presente invención, la composición para inducir la reprogramación celular puede comprender un compuesto representado por una fórmula seleccionada del grupo que consiste en la siguiente fórmula 25, fórmula 30, fórmula 31, fórmula 33, fórmula 34, fórmula 35 y fórmula 45:
Fórmula 25
Fórmula 35
Figure imgf000015_0001
Según otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto derivado de indazol representado por la siguiente fórmula A:
Fórmula A
Figure imgf000015_0002
en donde R1 es nitro o Y-carbonilo, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C1-30, o heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo;
R2 es hidroxilo, halógeno, fenilo o alquenilo C2-30;
en donde el fenilo en R2 está no sustituido o sustituido con hidroxilo, halógeno, alcoxilo C1-5, alquilo C1-5, alquenilo C2-5, o una combinación de los mismos;
R3 es hidrógeno; y
X es amido, sulfonamido, oxima o imidamido, siempre que cuando R1 es nitro y X es amido, R2 no es fenilo sustituido o no sustituido.
Según la presente invención, Y es hidroxilo, alcoxilo C1-30, o heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo.
Según la presente invención, el heterocicloalquilo en Y de la fórmula A puede estar sustituido con hidroxilo, halógeno, alquilo C1-5, alquenilo C2-5, alcoxilo C1-5, alcoxialquilo C2-8, alcoxicarbonilo C2-8, heterocicloalquenilalquilo C2-8 que
contiene nitrógeno como heteroátomo,
Figure imgf000015_0003
o una combinación de los mismos. Según una realización de la presente invención, el heterocicloalquenilalquilo en Y es (1H-imidazol-1-il)alquilo.
Según la presente invención, R2 en la fórmula A puede estar sustituido con hidrógeno, halógeno, arilo C1-15, alcoxilo C1-15, alquilo C1-15 o alquenilo C2-15, y el arilo en R2 puede estar sustituido con hidroxilo, halógeno, alcoxilo C1-5, alquilo C1-5, alquenilo C2-5, o una combinación de los mismos.
Según una realización de la presente invención, el heteroátomo en la fórmula A es nitrógeno.
El compuesto derivado de indazol de la presente invención puede representarse mediante una fórmula seleccionada del grupo que consiste en las siguientes fórmulas 6-14, 19-43 y 45. También se describen compuestos representados mediante las fórmulas 1-2, 4, 5, 15-18 y 42-44:
Fórmula 1 Fórmula 8 Fórmula 15 Fórmula 22
Figure imgf000019_0001
Fórmula 26
Figure imgf000019_0002
Fórmula 27
Figure imgf000020_0001
Fórmula 33 Fórmula 38 Fórmula 43
Figure imgf000023_0001
Según la presente invención, el compuesto derivado de indazol puede representarse mediante una fórmula seleccionada del grupo que consiste en la siguiente fórmula 25, fórmula 30, fórmula 31, fórmula 33, fórmula 34, fórmula 35 y fórmula 45:
Fórmula 25
Fórmula 33
Figure imgf000024_0001
Según todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para inducir la programación celular, que comprende poner en contacto una composición que comprende un compuesto representado por la siguiente fórmula A con células diferenciadas:
Fórmula A
Figure imgf000024_0002
en donde Ri es nitro o Y-carbonilo, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C i-30, heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo;
R2 es hidrógeno, hidroxilo, halógeno, fenilo, alcoxilo C1-30, alquilo C1-30 o alquenilo C2-30;
R3 es hidrógeno; y
X es amido, sulfonamido, oxima o imidamido.
Según todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto representado por la fórmula A.
El método para inducir la reprogramación celular según la presente invención se realiza utilizando la composición para inducir la reprogramación celular según la presente invención tal como se describió anteriormente, y las descripciones comunes entre las dos se omiten con el fin de evitar una redundancia indebida que conduzca a la complejidad de la memoria descriptiva.
[Efectos ventajosos]
Las características y ventajas de la presente invención se resumen tal como sigue:
(a) La presente invención se refiere a una composición para inducir la reprogramación celular, tal como se define en las reivindicaciones.
(b) Los compuestos derivados de indazol según la presente invención pueden realizar una reprogramación celular eficaz al mismo tiempo que muestran perfiles biológicos mejorados.
(c) Los compuestos derivados de indazol según la presente invención no muestran citotoxicidad, a diferencia de compuestos de bajo peso molecular convencionales (por ejemplo, Reversina o BI0) para inducir la reprogramación celular. Por lo tanto, cuando estos compuestos se aplican clínicamente, pueden hacer una gran contribución al marcador de agentes terapéuticos celulares o inductores de reprogramación celular. (d) Por otra parte, no se conoce que se usen compuestos derivados de indazol convencionales para la reprogramación celular, y no pueden usarse a altas concentraciones debido a su citotoxicidad no específica. (e) Los compuestos de la presente invención tienen una excelente capacidad de reprogramación celular al mismo tiempo que causan poca o ninguna citotoxicidad, y tienen un nuevo mecanismo de acción, en comparación con compuestos derivados de indazol convencionales.
[Breve descripción de los dibujos]
Las figuras 1 y 2 muestran los resultados de la reprogramación de mioblastos de ratón C2C12 a osteoblastos al poner en contacto los mioblastos con el compuesto de la presente invención. Las células se pusieron en contacto con LDD-1821, LDD-1664, LDD-1945, LDD-2199 o LDD-2200, que es el compuesto de la presente invención, y luego se observaron las células mediante tinción con rojo de alizarina (ATDC5: línea celular de osteocondroprogenitor).
La figura 3 muestra los resultados obtenidos al poner en contacto C2C12 con los compuestos de la presente invención y analizar las células mediante un ensayo con rojo de alizarina. El gráfico muestra la absorbancia medida después de que las células se trataran con cada uno de los compuestos.
La figura 4 muestra los resultados de un ensayo MTT para mioblastos de ratón C2C12.
[Modo para la invención]
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Será evidente para los expertos en la técnica que estos ejemplos son solo para fines ilustrativos.
Ejemplos sintéticos
Esquema sintético 1
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Reactivos y condiciones: a) hidrato de hidrazina, 1-butanol, 110°C, 3 h; b) cloruro de R2-benzoilo, piridina, ta, 5 h; c) piperidina, EDC HCl, DMAP, DCM, ta, 2 h; d) 4-aminopiperidin-1-carboxilato de t-butilo, EDC HCl, DMAP, DCM, ta, 2 h; e) TFA, MC, 0°C, 1 h.
Los procedimientos de reacción y los sustituyentes descritos en los siguientes ejemplos sintéticos se refieren a los mostrados en el esquema sintético 1 anterior.
Procedimientos sintéticos generales
Procedimiento general de la etapa (a)
Se disolvió un compuesto de partida (1,0 g, 6,02 mmol) en n-butanol (20 ml). Entonces, se añadió a la disolución hidrato de hidrazina (420 pL, 7,22 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 2 horas y se enfrió, y luego se añadió a la mezcla de reacción cloruro de metileno (MC), y se filtró el precipitado formado, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético de referencia 1: 5-nitro -1H-indazol-3-il amina (compuesto 1)
Se disolvió 2-fluoro-5-nitrobenzonitrilo (1,0 g, 6,02 mmol) en n-butanol (20 ml). Entonces, se añadió a la disolución hidrato de hidrazina (420 pL, 7,22 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 2 horas y se enfrió, y luego se añadió a la mezcla de reacción cloruro de metileno (MC), y se filtró el precipitado formado, obteniendo así el compuesto deseado (84% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,89 (d, 1H), 8,05 (dd, 1H), 7,34 (d, 2H), 5,98 (s, 2H). Masa = 178,15.
Ejemplo sintético de referencia 2: ácido 3-amino-1H-¡ndazol-5-carboxílico (compuesto 2)
Se disolvió ácido 3-ciano-4-fluorobenzoico (1,0 g, 6,02 mmol) en n-butanol (20 ml). Entonces, se añadió a la disolución hidrato de hidrazina (420 j L, 7,22 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 2 horas y se enfrió, y luego se añadió a la mezcla de reacción cloruro de metileno (MC), y se filtró el precipitado formado, y luego se lavó con MeOH, obteniendo así el compuesto deseado (55% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 811,35 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 7,80 (d, 2H), 7,22 (d, 1H), 5,59 (s, 2H). Masa =177,16.
Procedimiento general de la etapa (b-2)
Se disolvió en piridina (0,3 ml) el compuesto (50 mg, 0,28 mmol) de fórmula 2 en el esquema sintético 1. Luego, se añadió R2-cloruro de benzoilo (16,5 j L, 0,28 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía, obteniendo así el compuesto deseado (compuestos 3 a 6).
Ejemplo sintético de referencia 3 (LDD-1664): N-(5-nitro-1(2)H-indazol-3-il)-benzamida (Compuesto 3)
Se disolvió 5-nitro-1H-indazol-3-il amina (50 mg, 0,28 mmol) en piridina (0,3 ml). Luego, se añadió cloruro de benzoilo (16,5 j L, 0,28 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada lavada con salmuera, secada con Na2SO4 anhidro, y luego concentrada a vacío. El concentrado se purificó por cromatografía de columna, obteniendo así el compuesto deseado (42% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 88,95 (d, 1H), 8,22 (dd, 1H), 8,12 (m, 2H), 8,12 (m, 2H), 7,69 (m, 4H). Masa = 282,26.
Ejemplo sintético de referencia 4 (LDD-1663): 3-bromo-N-(5-n¡tro-1H-¡ndazol-3-¡l)benzam¡da (compuesto 4)
Se disolvió 5-nitro-1H-indazol-3-il amina (0,14 mmol) en piridina (0,4 ml). Luego, se añadió cloruro de 3-bromobenzoilo (19 j L, 0,14 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. Se añadieron diclorometano (DCM) y hexano al extracto para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado (37% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 811,32 (s, 1H), 8,93 (d, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,19 (dd, 1H). Masa = 361,16.
Ejemplo sintético de referencia 5 (LDD-2348): 4-metox¡-N-(5-n¡tro-1H-¡ndazol-3-¡l)benzam¡da (compuesto 5)
Se disolvió 5-nitro-1H-indazol-3-il amina (25 mg, 0,14 mmol) en piridina (0,3 ml). Luego, se añadió cloruro de 4-metoxibenzoilo (24 mg, 0,14 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El concentrado se purificó por cromatografía de columna, obteniendo así el compuesto deseado (40% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 8,93 (d, 1H), 8,20 (dd, 1H), 8,12 (d, 2H), 7,67 (d, 1H), 7,11 (d, 2H), 3,86 (s, 3H). Masa = 312,28.
Ejemplo sintético 6 (LDD-1665): ácido 3-benzam¡do-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 6)
Se disolvió ácido 3-amino-1H-indazol-5-carboxílico (25 mg, 0,14 mmol) en piridina (0,5 ml). A continuación, se añadió cloruro de benzoilo (16,5 j L, 0,14 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. Se añadió DCM para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado (31% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,98 (s, 1H), 8,11 (d, 2H), 7,94 (dd, 1H), 7,66 (t, 1H), 7,58 (t, 3H). Masa = 281,27.
Procedimiento general de la etapa (c-3)
Se disolvió en dimetilformamida (DMF, 1 ml) el compuesto (25 mg, 0,14 mmol) de fórmula 3 en el esquema sintético 1. A continuación, se añadieron dimetilaminopiridina (DMAP, 0,03 mmol), piperidina (0,17 mmol) y dicloruro de etileno (EDC, 0,28 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 7 (LDD-1820): N-(5-(p¡per¡d¡n-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-¡l)benzam¡da (compuesto 7)
Se disolvió ácido 3-benzamido-1H-indazol-5-carboxílico (25 mg, 0,14 mmol) en DMF (1 ml). Se añadieron DMAP (0,03 mmol), piperidina (0,17 mmol) y EDC (0,28 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, CDCla) 511,02 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,04 (d, 2H), 7,59 (m, 3H), 7,37 (d, 1H), 7,21 (d, 1H), 3,59 (m, 4H), 1,75 (m, 6H). Masa = 348,41.
Procedimiento general de la etapa (d-4)
Se disolvió en DMF (1 ml) el compuesto (25 mg, 0,14 mmol) de fórmula 3 en el esquema sintético 1. Se añadieron DMAP (0,03 mmol), 4-aminpiperidin-1-carboxilato de t-butilo (0,17 mmol) y EDC (0,28 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento). Ejemplo sintético 8 (LDD-1690): 4-(3-benzamido 1H-indazol-5-carbonil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (compuesto 8)
Se disolvió ácido 3-benzamido-1H-indazol-5-carboxílico (25 mg, 0,14 mmol) en DMF (1 ml). Se añadieron DMAP (0,03 mmol), 4-aminopiperidin-1-carboxilato de t-butilo (0,17 mmol) y EDC (0,28 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 510,82 (s, 1H), 8,23 (s, 2H), 8,07 (d, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,60 (m, 4H), 3,96 (m, 3H), 2,79 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,41 (m, 11H). Masa =449,51.
Procedimiento general de la etapa (e-5)
Se disolvió en DCM (0,7 ml) el compuesto (30 mg, 0,065 mmol) de fórmula 5 en el esquema sintético 1. Se añadió a la disolución TFA (0,2 ml) a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 9 (LDD-1691): N-(5-(piperazin-1-carbonil)-1H-indazol-3-il)benzamida (compuesto 9)
Se disolvió 4-(3-benzamido 1H-indazol-5-carbonil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (30 mg, 0,065 mmol) en DCM (0,7 ml). A continuación, se añadió a la disolución ácido trifluoroacético (TFA, 0,2 ml) a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y MeOH, obteniendo así el compuesto deseado (20% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10,86 (s, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,07 (d, 2H), 7,85 (d, 1H), 7,63 (m, 4H). Masa = 349,39.
Esquema sintético 2
Figure imgf000028_0001
Reactivos y condiciones: a) cloruro de R2-bencenosulfonilo, piridina, ta, 5h; b) 4-aminopiperidin-1-carboxilato de tbutilo, EDC HCl, DMAP, DCM, ta, 2h; c) TFA, MC, 0°C, 1h.
Los procedimientos de reacción y sustituyentes descritos en los ejemplos sintéticos a continuación se refieren a los mostrados en el esquema sintético 2 anterior.
Procedimientos sintéticos generales
Procedimiento general de la etapa (a)
Se disolvió en piridina (0,9 ml) el compuesto (50 mg, 0,28 mmol) de fórmula 2 en el esquema sintético 2. A continuación, se añadió cloruro de R2-bencenosulfonilo (36 j L, 0,28 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. Se añadió DCM para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 10 (LDD-1667): N-(5-nitro-1H-¡ndazol-3-¡l)bencenosulfonamida (compuesto 10)
Se disolvió 5-nitro-1H-indazol-3-il amina (50 mg, 0,28 mmol) en piridina (0,9 ml). A continuación, se añadió cloruro de bencenosulfonilo (36 j L, 0,28 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. Se añadió MC para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado (43% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 811,14 (s, 1H), 8,70 (d, 1H), 8,12 (dd, 1H), 7,78 (d, 2H), 7,55 (m, 4H). Masa =318,31. Ejemplo sintético 11 (LDD-1666): 3-bromo-N-(5-n¡tro-1H-¡ndazol-3-¡l)bencenosulfonam¡da (compuesto 11)
Se disolvió 5-nitro-1H-indazol-3-il amina (0,28 mmol) en piridina (0,9 ml). A continuación, se añadió 3-cloruro de bromobencenosulfonilo (40 j L, 0,28 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. Se añadieron DCM y hexano al extracto para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado (50% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,99 (s, 1H), 8,72 (d, 1H), 8,19 (m, 1H), 7,99 (t, 1H), 7,87 (d, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,54 (t, 1H). Masa = 397,20.
Ejemplo sintético 12 (LDD-1668): ácido 3-(fen¡lsulfonam¡do)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 12)
Se disolvió ácido 3-amino-1H-indazol-5-carboxílico (25 mg, 0,14 mmol) en piridina (0,7 ml). se añadió cloruro de bencenosulfonilo (20 j L, 0,14 mmol) a la disolución que se agitó luego durante 1 hora, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl. Se añadió metanol al extracto para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado (20% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,88 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,89 (dd, 3H), 7,63 (m, 4H). Masa = 317,32.
Procedimiento general de la etapa (b-2)
Se disolvió en DMF (0,8 ml) el compuesto (25 mg, 0,08 mmol) de fórmula 7 en el esquema sintético 2. Se añadieron DMAP (0,02 mmol), 4-aminopiperidin-1-carboxilato de t-butilo (0,09 mmol) y EDC (0,16 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 13 (LDD-1692): 4-(3-(fen¡lsulfonam¡do)-1H-¡ndazol-5-carbon¡l)p¡peraz¡n-1-carbox¡lato de terc-butilo (compuesto 13)
Se disolvió ácido 3-(fenilsulfonamido)-1H-indazol-5-carboxílico (25 mg, 0,08 mmol) en DMF (0,8 ml). Se añadieron DMAP (0,015 mmol), 4-aminopiperidin-1-carboxilato de t-butilo (0,09 mmol) y EDC (0,16 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (50% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,77 (s, 1H), 8,31 (d, 2H), 7,83 (m, 3H), 7,62 (m, 1H), 7,57 (t, 2H), 7,44 (d, 1H). Masa = 485,56.
Procedimiento general de la etapa (c-3)
Se disolvió en DCM (0,4 ml) el compuesto (20 mg, 0,038 mmol) de fórmula 8 en el esquema sintético 2. Se añadió a la disolución TFA (0,15 ml) a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y MeOH, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 14 (LDD-1693): N-(5-(P¡peraz¡n-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-¡l)bencenosulfonam¡da (compuesto 14) Se disolvió 4-(3-(fenilsulfonamido)-1H-indazol-5-carbonil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (20 mg, 0,038 mmol) en DCM (0,4 ml). A continuación, se añadió TFA (0,15 ml) a la disolución a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado (20% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 511,92 (s, 1H), 8,28 (d, 1H), 8,22 (s, 1H), 7,80 (m, 2H), 7,68 (d, 1H), 7,38 (d, 3H), 7,20 (d, 1H), 3,95 (m, 1H), 3,16 (d, 3H), 2,78 (t, 2H), 1,85 (m, 2H), 1,57 (m, 2H). Masa = 385,44.
Esquema sintético 3
Figure imgf000030_0001
Reactivos y condiciones: a) nitrito de sodio, HCl, agua, ta, 8h; b) clorhidrato de hidroxilamina, TEA, DMF, 80°C, 12h; c) NCS, d Mf , 40°C, 1h; d) R2-anilina, TEA, 1,4-dioxano, ta, 1h; e) TMS-diazometano, DMF, 0°C, 30 min; f) diversas aminas.
Los procedimientos de reacción y sustituyentes descritos en los ejemplos a continuación se refieren a los mostrados en el esquema sintético 3 anterior.
Procedimientos sintéticos generales
Procedimiento sintético de la etapa (a)
Se añadió un compuesto de partida (1,0 g, 6,2 mmol) a agua (40 ml), y a esta se le añadió una disolución de nitrito de sodio (4,3 g, 62 mmol) en agua. A continuación, se añadió lentamente gota a gota HCl 3N a la mezcla de reacción a lo largo de 20 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas, y luego se filtró el precipitado formado. El precipitado se secó completamente, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético de referencia 15: 5-nitro-1H-¡ndazol-3-carbaldehido (compuesto 15)
Se añadió 5-nitro-1H-indol (1,0 g, 6,2 mmol) a agua (40 ml), y a esta se le añadió una disolución de nitrito de sodio (4,3 g, 62 mmol) en agua. A continuación, se añadió lentamente gota a gota HCl 3N (21 ml) a la mezcla de reacción a lo largo de 20 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas, y luego se filtró el precipitado formado. El precipitado se secó completamente a vacío, obteniendo así el compuesto deseado (40% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 11,98 (s, 1H), 9,75 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,56 (m, 2H). Masa =191,15.
Ejemplo sintético de referencia 16: ácido 3-form¡l-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 16)
Se añadió ácido 1H-indol-5-carboxílico (1,0 g, 6,02 mmol) a agua (40 ml), y a esta se le añadió una disolución de nitrito de sodio (4,3 g, 62 mmol) en agua. A continuación, se añadió lentamente gota a gota HCl 3N (21 ml) a la mezcla de reacción a lo largo de 20 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas, y luego se filtró el precipitado formado. El precipitado se secó completamente a vacío, obteniendo así el compuesto deseado (84% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,20 (s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,02 (d, 1H), 7,75 (d, 2H). Masa =190,16.
Procedimiento general de la etapa (b-2)
Se disolvió en DMF (13 ml) el compuesto (500 mg, 2,63 mmol) del compuesto de fórmula 11 en el esquema sintético 3. A continuación, se añadió clorhidrato de hidroxilamina (550 mg, 7,89 mmol) y trietilamina (110 pL, 7,89 mmol) a la disolución que luego se agitó a 80°C durante 12 horas, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El compuesto deseado que va a usarse en una reacción subsiguiente se obtuvo sin purificación por separado.
Ejemplo sintético de referencia 17: oxima de 5-n¡tro-1H-¡dazol-3-carboxaldeh¡do (compuesto 17)
Se disolvió 5-nitro-1H-indazol-3-carbaldehido (500 mg, 2,63 mmol) en DMF (13 ml). Se añadieron clorhidrato de hidroxilamina (550 mg, 7,89 mmol) y trietilamina (110 pL, 7,89 mmol) a la disolución que luego se agitó a 80°C durante 12 horas, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El compuesto deseado que va a usarse en una reacción subsiguiente se obtuvo sin purificación por separado (93% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 11,98 (s, 1H), 11,12 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,56 (m, 2H), 7,95 (s, 1H). Masa = 206,16.
Ejemplo sintético de referencia 18: ácido 3-((h¡drox¡¡m¡no)met¡l)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 18)
Se disolvió ácido 3-formil-1H-indazol-5-carboxílico (500 mg, 2,63 mmol) en DMF (13 ml). Se añadieron clorhidrato de hidroxilamina (550 mg, 7,89 mmol) y trietilamina (110 pL, 7,89 mmol) a la disolución que luego se agitó a 80°C durante 12 horas, seguido de extracción con acetato de etilo y HCl 1N. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El compuesto deseado que va a usarse en una reacción subsiguiente se obtuvo sin purificación por separado (93% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 11,61 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,96 (d, 2H), 7,62 (d, 1H). Masa = 205,17.
Procedimiento general de la etapa (c-3)
Se disolvió en DMF (12 ml) el compuesto (500 mg, 2,44 mmol) de fórmula 12 en el esquema sintético 3. A continuación, se añadió gota a gota N-clorosuccinimida (320 mg, 2,44 mmol) a la disolución que luego se agitó a 40°C durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con NSO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El compuesto deseado se obtuvo sin purificación por separado.
Ejemplo sintético 19: Cloruro de N-h¡drox¡-5-n¡tro-1H-¡ndazol-3-carbam¡m¡do¡lo (compuesto 19)
Se disolvió oxima de 5-nitro-1H-indazol-3-carboxaldehido (500 mg, 2,44 mol) en DMF (12 ml). Se añadió N-clorosuccinimida (320 mg, 2,44 mmol) a la disolución que luego se agitó a 40°C durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El compuesto deseado se obtuvo sin purificación por separado (80% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 11,98 (s, 1H), 11,12 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,56 (m, 2H). Masa = 240,60.
Ejemplo sintético 20: ácido 3-(cloro(h¡drox¡¡m¡no)met¡l)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 20)
Se disolvió ácido 3-((hidroxiimino)metil)-1H-indazol-5-carboxílico (500 mg, 2,44 mmol) en DMF (12 ml). Se añadió N-clorosuccinimida (320 mg, 2,44 mmol) a la disolución que luego se agitó a 40°C durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. El compuesto deseado se obtuvo sin purificación por separado (86% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 810,98 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 7,99 (d, 1H), 7,68 (d, 1H). Masa = 239,62.
Procedimiento general de la etapa (d-4)
Se disolvió el compuesto (30 mg, 0,13 mmol) de fórmula 13 en el esquema sintético 3 en (1,5 ml). A continuación, se añadió R2-anilina (35 pL, 0,38 mmol) a la disolución que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 21 (LDD-2369): N'-h¡drox¡-5-n¡tro-N-fenil-1H-¡ndazol-3-carbox¡¡m¡dam¡da (compuesto 21)
Se disolvió cloruro de N-hidroxi-5-nitro-1H-indazol-3-carbamimidoilo (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). Se añadió anilina (35 pL, 0,38 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,97 (s, 1H), 8,90 (d, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,23 (dd, 1H), 7,75 (dd, 1H). Masa = 297,27. Ejemplo sintético 22 (LDD-2370): N-(4-fluorofen¡l)-N'-h¡drox¡-5-nitro-1H-¡ndazol-3-carbox¡¡m¡dam¡da (compuesto 22) Se disolvió cloruro de N-hidroxi-5-nitro-1H-indazol-3-carbamimidoilo (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). A continuación, se añadió 4-fluoroanilina (37 pL, 0,38 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,95 (s, 1H), 8,92 (d, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,23 (dd, 1H), 7,75 (dd, 1H), 6,94 (m, 2H), 6,75 (m, 2H). Masa = 315,26.
Ejemplo sintético 23 (LDD-2371): N'-h¡drox¡-N-(4-h¡drox¡fen¡l)-5-nitro-1H-¡ndazol-3-carbox¡¡m¡dam¡da (compuesto 23) Se disolvió cloruro de N-hidroxi-5-nitro-1H-indazol-3-carbamimidoilo (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). A continuación, se añadió 4-hidroxianilina (41 mg, 0,38 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,65 (s, 1H), 8,92 (s, 1H), 8,84 (d, 1H), 8,21 (dd, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,72 (d, 1H), 6,60 (m, 2H), 6,50 (m, 2H). Masa = 313,27.
Ejemplo sintético 24 (LDD-2372): N'-h¡drox¡-N-(4-metox¡fen¡l)-5-nitro-1H-¡ndazol-3-carbox¡¡m¡dam¡da (compuesto 24) Se disolvió cloruro de N-hidroxi-5-nitro-1H-indazol-3-carbobamimidoilo (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). A continuación, se añadió 4-metoxianilina (41 mg, 47 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (33% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,74 (s, 1H), 8,87 (d, H), 8,23 (s, 1H), 8,21 (dd, 1H), 7,72 (d, 1H), 6,68 (m, 4H). Masa = 327,30.
Ejemplo sintético 25 (LDD-1986): ácido 3-(N'-h¡drox¡-N-fen¡lcarbamim¡do¡l)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 25) Se disolvió ácido 3-(cloro(hidroxiimino)metil)-1H-indazol-5-carboxílico (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). A continuación, se añadió anilina (35 pL, 0,38 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (75% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,82 (s, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,95 (dd, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,07 (t, 2H), 6,78 (t, 1H), 6,69 (d, 2H). Masa = 296,29.
Ejemplo sintético 26 (LDD-2197): ácido 3-N-(4-fluorofen¡l)-N'-h¡drox¡carbamim¡do¡l-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 26)
Se disolvió ácido 3-(cloro(hidroxiimino)metil)-1H-indazol-5-carboxílico (30 mg, 0,13 mmol) en (1,5 ml). A continuación, se añadió 4-fluoroanilina (37 pL, 0,38 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (29% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 10,79 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,95 (dd, 1H), 7,60 (dd, 1H), 6,93 (m, 2H), 6,714 (m, 2H). Masa =314,28.
Ejemplo sintético 27 (LDD-2349): ácido 3-(N'-h¡drox¡-N-(4-h¡drox¡fen¡l)carbamim¡do¡l)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 27)
Se disolvió ácido 3-(cloro(hidroxiimino)metil)-1H-indazol-5-carboxílico (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). A continuación, se añadió 4-hidroxianilina (41 mg, 0,38 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (31% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 513,23 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,90 (s, 1H), 7,92 (m, 2H), 7,47 (d, 1H), 6,64 (d, 2H), 6,40 (d, 2H) . Masa = 312,28.
Ejemplo sintético 28 (LDD-2198): ácido 3-(N'-h¡drox¡-N-(4-metox¡fen¡l)carbamin¡do¡l)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 28)
Se disolvió ácido 3-(cloro(hidroxiimino)metil)-1H-indazol-5-carboxílico (30 mg, 0,13 mmol) en etanol (1,5 ml). A continuación, se añadió 4-metoxianilina (41 mg, 47 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a 80°C durante 2 horas. El residuo resultante se concentró para eliminar el etanol, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (31% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10,60 (s, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,89 (dd, 1H), 7,54 (dd, 1H), 6,61 (s, 4H), 3,58 (s, 3H). Masa = 326,31.
Procedimiento general de la etapa (e-5)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,02 mmol) obtenido en el ejemplo sintético 25 en DMF (0,3 ml). A continuación, se añadió lentamente gota a gota tetrametilsilano (TMS)-diazometano (100 pL) a la disolución a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 29 (LDD-2196): 3-(N'-h¡drox¡-N-fen¡lcarbamim¡do¡l)-1H-¡ndazol-5-carbox¡lato de metilo (compuesto 29)
Se disolvió en DMF (0,3 ml) el compuesto (10 mg, 0,02 mmol) obtenido en el ejemplo sintético 25. A continuación, se añadió lentamente gota a gota TMS-diazometano (100 pL) a la disolución a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (83% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,27 (s, 1H), 9,56 (dd, 1H), 9,20 (s, 1H), 8,65 (dd, 1H), 8,25 (dd, 1H), 7,54 (m, 2H), 7,19 (t, 1H), 7,06 (dd, 2H), 3,55 (s, 3H). Masa = 310,31.
Procedimiento general de la etapa (f-6 )
Se disolvió en DMF (0,3 ml) el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) de fórmula 14 en el esquema sintético 3. A continuación, se añadieron hidroxibenzotriazol (HOBt, 0,04 mmol), piperidina (0,09 mmol), TEA (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CL A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 30 (LDD-1821): N'-h¡drox¡-N-fen¡l-5-(p¡perid¡n-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-carboxam¡da (compuesto 30) Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) de fórmula 14 en el esquema sintético 3 en DMF (0,3 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,04 mmol), piperidina (0,09 mmol), TEA (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución de reacción que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CL A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (65% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 510,67 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,34(d, 1H), 7,02(t, 2H), 6,73 (t, 1H), 6,64 (d, 2H), 3,56(m, 4H), 1,58 (m, 6 H). Masa = 363,42.
Ejemplo sintético 31 (LDD-2199): N-(4-fluorofen¡l)-N'-h¡drox¡-5-(p¡perid¡n-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-carboxam¡da (compuesto 31)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 26 en DMF (0,3 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,04 mmol), piperidina (0,09 mmol), TEA (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CI. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (72% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 10,67 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,58 (dd, 1H), 7,38 (dd, 1H), 6,915 (m, 2H), 6,71 (m, 2H), 3,33 (m, 4H), 1,62 (m, 6 H). Masa = 381,41.
Ejemplo sintético 32 (LDD-2350): N'-h¡drox¡-N-(4-h¡drox¡fen¡l)-5-(p¡perid¡n-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-carboxam¡da (compuesto 32)
Se disolvió en DMF (0,3 ml) el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 27. A continuación, se añadieron HOBt (0,04 mmol), piperidina (0,09 mmol), TEA (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CL A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (65% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,25 (s, 1H), 10,34 (s, 1H), 8,84 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,51 (d, 1H), 7,31 (dd, 1H), 6,53 (m, 2H), 6,44 (m, 2H), 3,39 (m, 4H), 1,60 (m, 6 H). Masa = 379,42.
Ejemplo sintético 33 (LDD-2200): N'-h¡drox¡-N-(4-metox¡fen¡l)-5-(p¡perid¡n-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-carboxam¡da (compuesto 33)
Se disolvió en DMF (0,3 ml) el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 28. A continuación, se añadieron HOBt (0,04 mmol), piperidina (0,09 mmol), TEA (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CL A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (41% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,48 (s, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,56 (dd, 1H), 7,36 (dd, 1H), 3,55 (s, 3H), 3,46 (m, 4H), 1,62 (m, 6 H). Masa = 393,45.
Ejemplo sintético 34 (LDD-1987): N'-h¡drox¡-N-fen¡l-5-(4-prop¡lp¡perazin-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-carboxam¡da (compuesto 34)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,3 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,04 mmol), 1-propilpiperazina (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (41% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,69 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,39 (dd, 1H), 7,06 (t, 2H), 6,77 (t, 1H), 6,69 (d, 2H), 3,45 (m, 4H), 2,37 (m, 4H), 2,29 (t, 2H), 1,47 (q, 2H), 0,88 (m, 3H). Masa = 406,49.
Ejemplo sintético 35 (LDD-1988): N'-hidroxi-5-(4-(2-metoxietil)p¡perazin-1-carbonil)-N-fenil-1H-indazol-3-carboximidamida (compuesto 35)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,3 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,04 mmol), 1-(2-metoxietil)piperazina (0,09 mmol) y EDC (0,09 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y agua. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice, obteniendo así el compuesto deseado (36% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,70 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,39 (dd, 1H), 7,06 (t, 2H), 6,77 (t, 1H), 6,69 (d, 2H), 3,46 (m, 6 H), 3,24 (s, 1H), 2,52 (m, 2H), 2,40 (m, 4H). Masa = 422,49.
Ejemplo sintético 36 (LDD-2351): 5-(4-(2-(1H-imidazol-1-il)etil)piperazin-1-carbonil)-N'-hidroxi-N-fenil-1H-indazol-3-carboximidamida (compuesto 36)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,6 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,08 mmol), 1-(2-(1H-imidazol-1-il)etil)piperazina (0,19 mmol) y EDC (0,19 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con una mezcla de disolventes de MC:MeOH = 10:1 y una disolución acuosa saturada de NaHCO3. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado (16% de rendimiento).1
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,74 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,870 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,58 (dd, 1H), 7,38 (dd, 1H), 7,20 (m, 1H), 7,05 (t, 2H), 6,87 (m, 1H), 6,77 (t, 1H), 6 , 6 8 (d, 2H), 4,10 (t, 2H), 3,46 (m, 4H), 2,68 (t, 2H), 2,42 (m, 4H). Masa = 458,53.
Ejemplo sintético 37 (LDD-2352): 5-(4-(2-(1H-¡m¡dazol-1-¡l)et¡l)p¡peraz¡n-1-carbon¡l)-N-(4-fluorofenil)-N'-h¡drox¡-1H-indazol-3-carboxiimidamida (compuesto 37)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,6 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,08 mmol), 1-(2-(1H-im¡dazol-1-¡l)etil)p¡peraz¡na (0,19 mmol) y EDC (0,19 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con una mezcla de disolventes de MC:MeOH = 10:1 y una disolución acuosa saturada de NaHCO3. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado (29% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 8 10,74 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,58 (d, 1H), 7,39 (dd, 1H), 7,20 (t, 1H), 6,92 (m, 3H), 6,70 (m, 2H), 4,10 (t, 2H), 3,50 (m, 4H), 2,68 (t, 2H), 2,40 (m, 4H). Masa = 476,52.
Ejemplo sintético 38 (LDD-2354): 5-(4-(2-(1H-¡m¡dazol-1-¡l)et¡l)p¡peraz¡n-1-carbon¡l)-N'-h¡droxi-N-(4-h¡drox¡fen¡l)-1H-¡ndazol-3-carboximidamida (compuesto 38)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,6 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,08 mmol), 1-(2-(1H-im¡dazol-1-¡l)etil)p¡peraz¡na (0,19 mmol) y EDC (0,19 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con una mezcla de disolventes de MC:MeOH = 10:1 y una disolución acuosa saturada de NaHCO3. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado (14% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,29 (s, 1H), 10,41 (s, 1H), 8 , 8 8 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,36 (dd, 1H), 7,22 (m, 1H), 6,90 (m, 1H), 6,55 (m, 2H), 6,49 (m, 2H), 4,10 (t, 2H), 3,50 (m, 4H), 2,67 (t, 2H), 2.42 (m, 4H). Masa = 474,52.
Ejemplo sintético 39 (LDD-2353): 5-(4-(2-(1H-¡m¡dazol-1-¡l)et¡l)p¡peraz¡n-1-carbonil)-N'-h¡drox¡-N-(4-metox¡fen¡l)-1H-¡ndazol-3-carboximidamida (compuesto 39)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,6 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,08 mmol), 1-(2-(1H-im¡dazol-1-¡l)etil)p¡peraz¡na (0,19 mmol) y EDC (0,19 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con una mezcla de disolventes de MC:MeOH = 10:1 y una disolución acuosa saturada de NaHCO3. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado (31% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,29 (s, 1H), 10,41 (s, 1H), 8 , 8 8 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,36 (dd, 1H), 7,22 (m, 1H), 6,90 (m, 1H), 6,55 (m, 2H), 6,49 (m, 2H), 4,10 (t, 2H), 3,50 (m, 4H), 2,67 (t, 2H), 2.42 (m, 4H). Masa = 488,55.
Ejemplo sintético 40 (LDD-2319): (2-(2-(2-(4-(3-(N'-h¡drox¡-N-fen¡lcarbam¡m¡doil)-1H-¡ndazol-5-carbon¡l)p¡peraz¡n-1-¡l) etoxi)etox¡)et¡l)carbamato de terc-butilo (compuesto 40)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DMF (0,6 ml). A continuación, se añadieron HOBt (0,08 mmol), 1-(2-(1H-im¡dazol-1-¡l)etil)p¡peraz¡na (0,19 mmol) y EDC (0,19 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El residuo resultante se extrajo con una mezcla de disolventes de MC:MeOH = 10:1 y una disolución acuosa saturada de NaHCO3. A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así el compuesto deseado (90% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,68 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,33 (dd, 1H), 6,99 (t, 2H), 6,71 (m, 2H), 6,63 (d, 2H), 3,49 (m, 8 H), 3,29 (m, 4H), 3,01 (m, 2H), 2,49 (m, 2H), 2,37 (m, 4H), 1,32 (s, 9H). Masa = 595,7.
Ejemplo sintético 41 (LDEH2320): 5-(4-(2-(2-(2-am¡noetox¡)etox¡)et¡l)p¡perazin-1-carbon¡l)-N'-h¡drox¡-N-fen¡l-1H-¡ndazol-3-carboximidamida (compuesto 41)
Se disolvió el compuesto (10 mg, 0,02 mmol) obtenido en el ejemplo 25 en DCM (0,3 ml). A continuación, se añadió a la disolución TFA (0,15 ml) a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice usando cloroformo saturado con amoníaco y metanol, obteniendo así (85% de rendimiento).1
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 10,75 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,38 (dd, 1H), 7,03 (t, 2H), 6,75 (t, 1H), 6 , 6 8 (d, 2H), 3,54 (m, 12H), 2,86 (m, 2H), 2,49 (m, 2H), 2,42 (m, 4H). Masa = 495,58.
Esquema sintético 4
Figure imgf000036_0001
Reactivos y condiciones: a) cloruro de R2-N-hidroxibenzimidoilo, TEA, 1,4-dioxano, ta, 18h; b) TMS-diazometano, DMF, 0°C, 30 min; c) diversas aminas, EDC HCl, HOBt, DMF, ta, 1h.
Los procedimientos de reacción y sustituyentes descritos en los ejemplos sintéticos a continuación se refieren a los mostrados en el esquema sintético 4 anterior.
Procedimientos sintéticos generales
Procedimiento sintético general de la etapa (a)
Se disolvió en 1,4-dioxano (1 ml) el compuesto (20 mg, 0,11 mmol) de fórmula 2 en el esquema sintético 4 anterior. Luego, se añadieron a la disolución cloruro de R2-N-hidroxibenzimidoilo (0,17 mmol) y TEA (0,22 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, y luego el residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CL A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 42 (LDD-2194): ácido 3-(N'-h¡drox¡benzim¡dam¡do)-1H-¡ndazol-5-carboxíl¡co (compuesto 42) Se disolvió en 1,4-dioxano (1 ml) el compuesto (20 mg, 0,11 mmol) obtenido en el ejemplo sintético 2. Luego, se añadieron a la disolución cloruro de N-hidroxibenzimidoilo (0,17 mmol) y TEA (0,22 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, y luego el residuo resultante se extrajo con acetato de etilo y disolución acuosa saturada de NH4CL A continuación, se realizó purificación por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto deseado (23% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,31 (s, 1H), 8,62 (m, 1H), 7,63 (dd, 1H), 7,43 (m, 3H), 7,33 (m, 2H), 7,16 (dd, 1H), 6,81 (s, 2H). Masa = 296,29.
Ejemplo sintético 45 (LDD-1945): N'-h¡drox¡-N-(5-(p¡per¡din-1-carbon¡l)-1H-¡ndazol-3-¡l)benz¡m¡dam¡da (compuesto 45) Se disolvió en 1,4-dioxano (0,4 ml) el compuesto (10 mg, 0,04 mmol) obtenido en el ejemplo sintético 44. Luego, se añadieron a la disolución cloruro de N-hidroxibenzimidoilo (0,04 mmol) y TEA (0,08 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, y se filtró el precipitado formado, y se lavó con MC, obteniendo así el compuesto deseado (31% de rendimiento).1
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 512,28 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,43 (m, 3H), 7,32 (d, 2H), 7,18 (m, 2H), 6,48 (s, 2H), 3,57 (m, 4H), 1,54 (m, 6 H). Masa = 363,42.
Procedimiento general de la etapa (b-2)
Se disolvió en DMF (0,3 ml) el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) de fórmula 17 en el esquema sintético 4. Luego, se añadió lentamente gota a gota TMS-diazometano (100 pL) a la disolución a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto deseado.
Ejemplo sintético 43 (LDD-2195): 3-(N'-h¡drox¡benz¡m¡dam¡do)-1H-¡ndazol-5-carboxilato de metilo (compuesto 43)
Se disolvió en DMF (0,3 ml) el compuesto (10 mg, 0,03 mmol) obtenido en el ejemplo sintético 42. Luego, se añadió lentamente gota a gota TMS-diazometano (100 pL) a la disolución a 0°C, seguido de agitación a 0°C durante 30 minutos. La disolución de reacción se concentró a vacío, y luego se purificó por cromatografía en gel de sílice para proporcionar el compuesto deseado (85% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 812,31 (s, 1H), 8,66 (m, 1H), 7,640 (dd, 1H), 7,43 (m, 3H), 7,33 (m, 2H), 7,19 (dd, 1H), 6,87 (s, 2H), 3,84(s, 3H). Masa = 310,31.
Procedimiento general de la etapa (c-3)
Se disolvió en DMF (2 ml) el compuesto (100 mg, 0,56 mmol) de fórmula 2 en el esquema sintético 2. A continuación, se añadieron HOBt (0,85 mmol), diversas aminas (0,68 mmol), TEA (1,7 mmol) y EDC (1,13 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. El residuo resultante se extrajo con disolución acuosa saturada de NaHCO3 y acetato de etilo. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. Se añadieron DCM y hexano al concentrado para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado.
Ejemplo sintético de referencia 44: (3-am¡no-1H-indazol-5-¡l)(p¡per¡d¡n-1-¡l)metanona (compuesto 44)
Se disolvió en DMF (2 ml) el compuesto (100 mg, 0,56 mmol) de fórmula 2 en la fórmula 4. A continuación, se añadieron HOBt (0,85 mmol), diversas aminas (0,68 mmol), TEA (1,7 mmol) y EDC (1,13 mmol) a la disolución que luego se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. El residuo resultante se extrajo con disolución acuosa saturada de NaHCO3 y acetato de etilo. La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 anhidro, y luego se concentró a vacío. Se añadieron DCM y hexano al concentrado para formar un precipitado, seguido de filtración, obteniendo así el compuesto deseado (41% de rendimiento).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8 11,58 (s, 1H), 7,81 (m, 1H), 7,24 (s, 2H), 5,50 (s, 2H), 3,40 (m, 4H), 1,61 (m, 6H). Masa = 244,30.
Ejemplos experimentales
Ejemplo experimental 1: Selección celular por tinción con rojo de alizarina
Selección de compuestos de bajo peso molecular que inducen la reprogramación celular directa
Un método para identificar compuestos que inducen la reprogramación celular se basó en un estudio previo (PMID: 23044010 y 18974773) sobre la conversión de miocito a osteocito mediante inducción de formación ósea y una publicación previa de reversina (Chen S 2004).
Se sembraron mioblastos de esqueletos de ratón C2C12 en una placa de cultivo celular de 24 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo. 24 horas después de la siembra, se añadió el compuesto de interés a tres pocillos a una concentración de 1. Para un control positivo, se trataron las células con reversina 100 nM o BIO 2 pM. Se sabe que los dos compuestos inducen la conversión de mioblastos a miocitos (Chen S 2004 y Kim WH recapitulan artículos). Para un control negativo, las células no se trataron o se trataron con DMSO. Las células se trataron con cada compuesto durante un total de 72 horas, y se trataron adicionalmente con cada compuesto después de 48 horas. La citotoxicidad de cada compuesto pudo confirmarse a partir de la desaparición de una porción de las células y a partir de los restos celulares flotantes durante el cultivo, y se seleccionó de nuevo un compuesto que causaba citotoxicidad a una concentración de 250 nM. Después de 72 horas, se reemplazó el medio con un medio inductor de diferenciación osteogénica (tratado durante 14 días con un DMEM suplementado con FBS al 10%, ácido ascórbico-2-fosfato 50 g/ml, dexametasona 0,1 pM, p-glicerofosfato 10 mM, 50 unidades/ml de penicilina y 50'1 de estreptomicina). El medio inductor de diferenciación osteogénica se basó en uno descrito previamente en reprogramación celular directa (artículos sobre reversina, Chen S 2004 y Chen S 2007). La reprogramación celular directa de miocitos a osteocitos se analizó mediante tinción con rojo de alizarina que detecta depósitos de calcio (Gregory CA 2004: PMID: 15136169) en células de estirpe ósea.
Tinción con rojo de alizarina
Se lavaron las células una vez con PBS, y luego se fijaron con formalina tamponada con fosfato durante 20 minutos. Las células fijadas se lavaron con agua destilada, y se sumergieron en una disolución de rojo de alizarina S al 1% en agua durante 5 minutos. El tinte restante se lavó con agua destilada. Las células se secaron y luego se tomaron imágenes con un microscopio óptico (Olympus CKX41). Las células teñidas se veían rojas, y se seleccionó un compuesto correspondiente a tales células como un compuesto "activo" y se analizó adicionalmente.
Usando el método de ensayo descrito anteriormente, se evaluaron los potenciales de reprogramación celular de los compuestos de indazol sintetizados. Los compuestos, LDD-1664, LDD-1821, LDD-1945, LDD-2199 y LDD-2200, mostraron un fuerte potencial de reprogramación en la diferenciación en osteoblastos, como la reversina de control positivo, y LDD-1986, LDD-1987 y LDD-1988 también mostraron potencial de reprogramación. En la tinción con aceite rojo O que permite observar la diferenciación en adipocitos, los compuestos LDD-1821, LDD-1986, LDD-1987 y LDD-1988 mostraron fuerte potencial de reprogramación. En particular, LDD-1821 mostró un fuerte potencial de reprogramación en la diferenciación tanto en osteoblastos como en adipocitos (véanse las figuras 1, 2 y 3).
Tabla 1: Resultados de tinción celular
Figure imgf000038_0002
Ejemplo experimental 2: Ensayo de quinasa
Se analizaron las actividades inhibidoras de derivados de indazol contra GSK-3 p y Aurora A mediante el ensayo de HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo). El ensayo de HTRF es un método de ensayo que detecta la fosforilación de sustancias peptídicas en presencia de ATP. Las sustancias fosforiladas se detectaron mediante señales de TR-FRET (Resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo). La quinasa Aurora A y GSK-3 p recombinante se compraron de Millipore (Billerica, MA). El ensayo se realizó usando un kit HTRF KinEASE (Cisbio). Cada uno de GSK-3 p y Aurora A se trató con 1 pM de cada compuesto de indazol, y se analizó el grado de inhibición de la fosforilación. El ensayo se compuso de una mezcla de compuesto-enzima y sustancia peptídica disuelta en tampón de reacción de quinasa (HEp Es 250 mM (pH 7,0), ortovanadato 0,5 mM, BSA al 0,05%, NaN3 al 0,1%). Tras la adición de tampón de detección, se detectó la señal de TR-FRET mediante un lector EnVision Multilabel.
La tabla 2 a continuación muestra el grado de inhibición de las actividades enzimáticas de GSK-3p y Aurora A por tratamiento con 1 pM de cada uno de LDD-1664 (referencia), LDD-1667, LDD-1820 y LDD-1821. Tal como se muestra en la tabla 2, los cuatro derivados mostraron todos una actividad inhibidora de menos del 50% contra GSK-3 p y Aurora A a una concentración de 1 pM. Además, LDD-1821 que muestra un excelente potencial de reprogramación no mostró actividad inhibidora contra las dos enzimas a una concentración de 1 pM. Por lo tanto, parece que los compuestos derivados de la presente invención inducen la reprogramación celular a través de mecanismos completamente diferentes de los de BI0 y reversina, que son inhibidores de GSK-3P o Aurora A.
Tabla 2: Ensayo de quinasa
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Ejemplo experimental 3: Ensayo con MTT
Se sembraron mioblastos C2C12 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3 x 103 células por pocillo. Las células se cultivaron durante un día, y luego se trataron con cada compuesto. A continuación, se incubaron las células durante 2 días, y luego se trataron con un medio sin suero que contenía bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) durante 3 horas. Tras la retirada del medio, las células se incubaron en DMSO durante 10 minutos mientras se agitaban. Se midió la absorbancia a 570 nm mediante un microlector (VersaMax, Molecular Devices) (véase la figura 4).
Las citotoxicidades de los compuestos enumerados en la tabla 3 a continuación se evaluaron mediante el ensayo con MTT. Como resultado, todos los derivados de indazol evaluados mostraron una CI50 de 10 pM o más. A este respecto, los derivados de indazol de la presente invención tienen excelentes ventajas sobre la BI0 y reversina convencionales que muestran alta citotoxicidad.
Tabla 3: Resultados del ensayo con MTT
Figure imgf000039_0002

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto representado por la siguiente fórmula A como un derivado de indazol:
Fórmula A
Figure imgf000040_0001
en donde R1 es nitro o Y-carbonilo, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C1-30 o heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo;
R2 es hidroxilo, halógeno, fenilo o alquenilo C2-30;
en donde el fenilo en R2 está no sustituido o sustituido con hidroxilo, halógeno, alcoxilo C1-5, alquilo C1-5, alquenilo C2-5 , o una combinación de los mismos;
R3 es hidrógeno; y
X es amido, sulfonamido, oxima o imidamido,
siempre que cuando R1 es nitro y X es amido, R2 no es fenilo sustituido o no sustituido.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C1-15 o heterocicloalquilo C2-15 que contiene nitrógeno como heteroátomo.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el heterocicloalquilo en Y está sustituido con hidroxilo, halógeno, alquilo C1-5, alquenilo C2-5, alcoxilo C1-5, alcoxialquilo C2-8, alcoxicarbonilo C2-8, heterocicloalquenilalquilo C2-8 que contiene nitrógeno como heteroátomo,
Figure imgf000040_0002
o una combinación de los mismos.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en donde el heterocicloalquenilalquilo es (1H-imidazol-1-il)alquilo.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R2 es halógeno, fenilo o alquenilo C2-15.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto está representado por una fórmula seleccionada del grupo que consiste en las siguientes fórmulas 6-14, 19-43 y 45:
Fórmula 6
Figure imgf000040_0003
Fórmula 7
Figure imgf000040_0004
Fórmula 8
Figure imgf000040_0005
Fórmula 9
Figure imgf000041_0001
Fórmula 20
Figure imgf000041_0002
Fórmula 21
Figure imgf000042_0001
Fórmula 24
Figure imgf000042_0002
Fórmula 27 Fórmula 28
Figure imgf000043_0001
Fórmula 29
Figure imgf000043_0002
Fórmula 30
Figure imgf000043_0003
Fórmula 31
Figure imgf000043_0004
Fórmula 35
Figure imgf000044_0001
Fórmula 39
Figure imgf000044_0002
Fórmula 41
Figure imgf000045_0001
7. El compuesto de la reivindicación 6, en donde el compuesto está representado por una fórmula seleccionada del grupo que consiste en las siguientes fórmulas 25, 30, 31, 33, 34, 35 y 45:
Fórmula 25
Figure imgf000045_0002
Fórmula 30
Figure imgf000045_0003
Fórmula 31
Fórmula 33
Figure imgf000046_0001
8. Un método in vitro para producir células reprogramadas a partir de células diferenciadas, comprendiendo el método las etapas de:
(a) poner en contacto el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con células diferenciadas; y (b) cultivar las células de la etapa (a).
9. Un método in vitro para inducir la reprogramación celular, que comprende poner en contacto una composición que comprende un compuesto representado por la siguiente fórmula A con células diferenciadas:
Fórmula A
Figure imgf000046_0002
en donde R1 es nitro o Y-carbonilo, en donde Y es hidroxilo, alcoxilo C1-30, heterocicloalquilo C2-30 que contiene nitrógeno como heteroátomo;
R2 es hidrógeno, hidroxilo, halógeno, fenilo, alcoxilo C1-30, alquilo C1-30 o alquenilo C2-30;
R3 es hidrógeno; y
X es amido, sulfonamido, oxima o imidamido.
10. Una composición que comprende el compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
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