ES2754498T3 - Escisión e inserción de genes grandes - Google Patents

Abstract

Procedimiento para alterar un ácido nucleico diana en una célula que comprende introducir en la célula uno o varios primeros ácidos nucleicos externos que codifican dos o más secuencias de ARN guía complementarias al ADN, en los que el ADN incluye el ácido nucleico diana, introducir en la célula un segundo ácido nucleico externo que codifica una proteína Cas9 que se une al ADN y está guiado por las dos o más secuencias de ARN guía, introducir en la célula una secuencia de ácido nucleico exógeno que se incluirá en la secuencia de ácido nucleico diana, en el que se expresan las dos o más secuencias de ARN guía y la proteína Cas9, en el que las dos o más secuencias de ARN guía y la proteína Cas9 se localizan conjuntamente en el ADN y en el que la proteína Cas9 crea dos o más rupturas bicatenarias para eliminar una primera secuencia de ácido nucleico de interés y en el que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserta entre los dos puntos de ruptura del ácido nucleico diana, en el que la primera secuencia de ácido nucleico de interés y la secuencia de ácido nucleico exógeno tienen una longitud de más de 1000 pares de bases, y en el que la secuencia de ácido nucleico exógena que se incluirá en la secuencia de ácido nucleico diana está flanqueada por secuencias complementarias al área alrededor de la primera secuencia de ácido nucleico de interés.

Description

DESCRIPCIÓN

Escisión e inserción de genes grandes

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los sistemas CRISPR (“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”, Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas)-Cas bacterianos y de arqueas se basan en ARN guía cortos en complejo con proteínas Cas para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes dentro del ácido nucleico externo invasor. Ver Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. y Siksnys, V. Cas9-ARNcr ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Jinek, M. et al. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011); y Bhaya, D., Davison, M. y Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011). Una reciente reconstitución in vitro del sistema CRISPR de S. pyogenes tipo II demostró que ARNcr (“ARN Cr Is Pr”) fusionado con un ARNtracr transcodificado normalmente. (“ARN CRIs Pr transactivador”) es suficiente para dirigir la proteína Cas9 a la secuencia específica de secuencias de ADN diana que coinciden con el ARNcr. Expresar un ARNg homólogo a un sitio diana da como resultado el reclutamiento de Cas9 y la degradación del ADN diana. Ver H. Deveau et al., Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (febrero de 2008).

CARACTERÍSTICAS

Aspectos de la presente invención se refieren a mejorar la eficacia de las inserciones de genes grandes en un ácido nucleico diana. Aspectos de la presente invención se refieren a la escisión de una secuencia de ácido nucleico grande, tal como un gen grande, a partir de un ácido nucleico diana dentro de una célula. Aspectos de la presente invención se refieren a la inserción de una secuencia de ácido nucleico grande, tal como un gen grande, en un ácido nucleico diana dentro de una célula. Aspectos de la presente invención se refieren a la escisión de una secuencia de ácido nucleico grande, tal como un gen grande, a partir de un ácido nucleico diana dentro de una célula y la inserción de una secuencia de ácido nucleico grande, tal como un gen grande, en el ácido nucleico diana dentro de la célula.

Aspectos de la presente invención se refieren al diseño de vectores de direccionamiento para grandes sustituciones de ácido nucleico dentro de un ácido nucleico diana.

Según un primer aspecto específico de la presente invención, se da a conocer un procedimiento para alterar un ácido nucleico diana en una célula, que comprende introducir en la célula uno o varios primeros ácidos nucleicos externos que codifican dos o más secuencias de ARN guía complementarias al ADN, en el que el ADN incluye el ácido nucleico diana, introducir en la célula un segundo ácido nucleico externo que codifica una proteína Cas9 que se une al ADN y está guiado por las dos o más secuencias de ARN guía, introducir en la célula una secuencia de ácido nucleico exógeno a incluir en la secuencia del ácido nucleico diana, en el que las dos o más secuencias de ARN guía y la proteína Cas9 se expresan, en el que las dos o más secuencias de ARN guía y la proteína Cas9 se localizan conjuntamente en el ADN y en el que la proteína Cas9 crea dos o más rupturas bicatenarias para eliminar una primera secuencia de ácido nucleico de interés y en la que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserta entre los dos puntos de ruptura del ácido nucleico diana, en el que la primera secuencia de ácido nucleico de interés y la secuencia de ácido nucleico exógena tienen una longitud de más de 1000 pares de bases, y en el que la secuencia de ácido nucleico exógena a incluir en la secuencia de ácido nucleico diana está flanqueada por secuencias complementarias al área alrededor la primera secuencia de ácido nucleico de interés.

Según ciertos aspectos, se utiliza Cas9 para crear dos o más rupturas bicatenarias en la secuencia de ácido nucleico diana. Se pueden hacer dos o más o una pluralidad de rupturas bicatenarias en la secuencia de ácido nucleico diana. Según un aspecto, se elimina una primera secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico diana y se inserta una secuencia de ácido nucleico exógeno en la secuencia de ácido nucleico diana entre los sitios de corte o los extremos cortados de la secuencia de ácido nucleico diana. Según ciertos aspectos, una ruptura bicatenaria en cada brazo de homología aumenta o mejora la eficiencia de la inserción o la sustitución de la secuencia de ácido nucleico, tal como mediante recombinación homóloga. Según ciertos aspectos, múltiples rupturas bicatenarias o sitios de corte mejoran la eficiencia de incorporación de una secuencia de ácido nucleico a partir de un vector de direccionamiento.

Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a procedimientos de sustitución y eliminación knock-in homocigótica de genes endógenos de multikilobases en células, tales como células de mamífero, entre las que se incluyen células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC, de induced pluripotent stem cell). Según ciertos aspectos, los procedimientos se practican sin un marcador de selección.

Las secuencias de ácido nucleico grandes, dentro del alcance de la presente invención, (que puede ser la primera secuencia de ácido nucleico de interés que se elimina o la secuencia de ácido nucleico exógeno que se inserta) son secuencias de ácido nucleico que tienen entre más de 1000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre más de 1000 pares de bases y, aproximadamente, 10.000 pares de bases de longitud, entre, aproximadamente, 2000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 3000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 4000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 bases pares, entre, aproximadamente, 5000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 6000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 7000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 8000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 9000 bases pares y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 10.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 20.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 30.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 40.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 50.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 60.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 70.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 bases pares, entre, aproximadamente, 80.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 90.000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases, entre, aproximadamente, 2000 pares de bases y, aproximadamente, 10.000 pares de bases o entre más de 1000 pares de bases y, aproximadamente, 5.000 pares de bases. Las secuencias de ácido nucleico grandes pueden denominarse en la presente memoria descriptiva secuencias de ácido nucleico de “kilobases” o “multikilobases”, es decir, más de 1000 pares de bases. Según ciertos aspectos, la secuencia de ácido nucleico a insertar es heteróloga al genoma de la célula en la que se inserta. Según ciertos aspectos, el ácido nucleico exógeno que se inserta en la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico externa que puede ser diferente de la primera secuencia de ácido nucleico de interés que está sustituyendo o puede ser diferente de cualquier secuencia de ácido nucleico en el ácido nucleico o genoma diana de la célula. Según un aspecto, la eliminación de la primera secuencia de ácido nucleico de interés y la inserción del ácido nucleico exógeno se produce de manera simultánea o sustancialmente simultánea. Esto debe distinguirse de los procedimientos en los que se produce una eliminación, seguida de una inserción por separado.

Según un aspecto, la célula es una célula eucariota. Según un aspecto, la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal. Según un aspecto, la célula es una célula de mamífero.

Según un aspecto, los dos o más ARN guía tienen entre, aproximadamente, 10 y, aproximadamente, 500 nucleótidos. Según un aspecto, los dos o más ARN guía tienen entre, aproximadamente, 20 y, aproximadamente, 100 nucleótidos.

Según un aspecto, los dos o más ARN guía son ARNcr. Según un aspecto, los dos o más ARN guía son ARNtracr. Según un aspecto, los dos o más ARN guía son fusiones de ARNtrac-ARNcr.

Según un aspecto, el ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.

Otras características y ventajas de ciertas realizaciones de la presente invención se harán más evidentes en la siguiente descripción de las realizaciones y dibujos de las mismas, y a partir de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

El archivo de la patente o la solicitud contiene, como mínimo, un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con el o los dibujos en color, previa solicitud y pago de la tarifa necesaria. Las características y ventajas anteriores y otras de la presente invención se entenderán de manera más completa a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones ilustrativas tomadas conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:

Figuras 1(a)-(d) Sustitución homocigótica de gen diana utilizando uno o dos ARNgc CRISPR. Figura 1(a) Dos ARNgc Crispr se dirigen a hThy1 dentro del intrón 1 (L1) o después de los sitios de poliadenilación (R1). El plásmido del vector direccionado a mThy1 contiene los exones 2 y 3 de mThy1 (naranja), flanqueados por brazos de homología hThy1 fuera de los sitios ARNgc - el promotor hThy1 y el exón 1 (que codifica la secuencia líder) se retienen, pero los sitios ARNgc están alterados. Los triángulos pequeños indican los sitios de cebador para las cuatro reacciones de genotipado de PCR. Figura 1(b) se nucleofectaron iPSC PGP1 con plásmidos que codifican el vector direccionado a mThy1, la nucleasa Cas9 y L1, R1, ambos, o sin ARNgc. Cinco días después, las células se analizaron por citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células que han ganado la expresión de mThy1 y/o han perdido la expresión de hThy1. Figura 1(c) Las iPSC individuales se clasificaron mediante FACS ("Fluorescence-Activated Cell Sorter", Fluorescencia de Clasificación de Células Activadas) a partir de cada cuadrante, se cultivaron en pocillos individuales y se genotiparon utilizando las cuatro reacciones de PCR. Los alelos se identificaron en función del tamaño y la secuenciación de Sanger de los productos de PCR: humanos nativos (+); de ratón recombinante (m); escindidos entre los dos sitios ARNgc (A); e invertidos entre los dos sitios ARNgc (i). Se muestran geles representativos de /+ de tipo salvaje, m/+ heterocigótico, m/m homocigótico, m/A heterocigótico, A/A homocigótico e i/A colonias heterocigóticas. Figura 1(d) Frecuencia de genotipos entre colonias iPS clasificadas por FACS. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Figuras 2(a)-(e). Frecuencia de deleciones homocigóticas y heterocigóticas generadas por CRISPR. Figura 2(a) Se generaron ARNgc crispr dirigidos al gen Thy1 humano: dos dentro del intrón 1 (Izquierda: L1 y L2), y diez a varias distancias después de hThy1 (Derecha: R1 a R10). b+c) Los pares de un ARNgc izquierdo y uno derecho se nucleofectaron en iPSC PGP1, en la figura 2(b), o en un clon iPSC PGP1 Thy1m/+, en la figura 2(c). Como control negativo, solo se nucleofectó un ARNgc izquierdo (columna derecha). Cinco días después, se analizaron las células mediante citometría de flujo para la deleción homocigótica de ambos alelos Thy1 humanos de la figura 2(b) o la deleción heterocigótica del alelo Thy1 humano restante y la retención del alelo Thy1 de ratón de la figura 2(c). Se indica la distancia entre los sitios ARNgc (Thy1 A) y la frecuencia de las células hThy1-. Figuras 2(d)-(e). Se representa gráficamente el porcentaje de células hThy1- de cada par de ARNgc menos el del control solo de ARNgc izquierdo frente al tamaño de la eliminación de Thy1. Los pares de ARNgc que incluían L1 o L2 se muestran en negro o rojo, respectivamente. Las barras de error muestran el promedio ± eem de dos experimentos independientes.

Figura 3(a)-(c). Secuencias de escisiones y uniones de inversión. La reacción de PCR de genotipado n.° 1 se realizó en ADN genómico purificado de clones hThy1-mThy1-iPSC clasificados por FACS (tal como se describe en la figura 1) y se analizó mediante secuenciación de Sanger utilizando los mismos cebadores de PCR. Los picos dobles en las trazas de secuenciación de Sanger resultantes se deconvolucionaron para revelar la secuencia bialélica de cada clon. Figura 3(a) Secuencia nativa del locus Thy1 humano (SEQ ID n.°: 108). Los sitios direccionados a ARNgc Crispr L1 (púrpura) y R1 (rojo) se encuentran separados 2,7 kb en el locus Thy1 humano. Los sitios de escisión de nucleasa predichos se indican 6 pb aguas arriba del PAM (“Protospacer adjacent motif”, Motivo Adyacente de Protoespaciador) (subrayado). Figuras 3(b)-(c) Secuencias bialélicas de colonias hThy1- mThy1- de la figura 3(b) cuatro A/A doblemente extirpadas (SEQ ID n.°: 109-112) y la figura 3(c) cinco i/A invertido-y-escindido (SEQ ID n.°: 113-120) descritas en la figura 1d. Las secuencias que se encontraron en dos clones separados se indican como x2. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 4(a)-(b). Sustitución dirigida del gen CD147 de ratón en el locus genómico humano CD147. Figura 4(a) Se diseñaron dos ARNgc Crispr separados por 9,8 kb dirigidos al gen CD147 humano dentro del intrón 1 (L147, izquierda) y después del sitio de poliadenilación (R147, derecha). El plásmido del vector direccionado a CD147 de ratón comprende una secuencia de 5,8 kb que abarca los exones 2 a 7 de CD147 de ratón (marrón), flanqueada por brazos de homología que coinciden con la secuencia de CD147 humana fuera de los sitios ARNgc. En la construcción de direccionamiento, se retienen el promotor CD147 humano y el exón 1 (que codifica la secuencia líder), pero los sitios de ARNgc se interrumpen. Figura 4(b) se nucleofectaron iPSC PGP1 con plásmidos que codifican el vector direccionado a CD147 de ratón, la nucleasa Cas9 y ambos, o ningún ARNgc. Nueve días después, las células se analizaron por citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células que han ganado la expresión de CD 147 de ratón y/o han perdido la expresión de CD147 humano. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes.

Figuras 5(a)-(b). Sustitución genética dirigida en orientación génica con Crispr o TALEN (“Transcription activator-like effector nucleases”, Nucleasas Efectora Activadora de la Transcripción). Figura 5(a) Se diseñaron dos ARNgc Crispr separados por 2,2 kb dirigidos al gen Thy1 humano dentro del exón 2 (L3, izquierda) y después de los sitios de poliadenilación (R1, derecha). También se diseñaron dos pares TALEN dirigidos a los mismos sitios L3 y R1. Para el vector de direccionamiento “knock-in”, una secuencia de 1,9 kb que abarca el gen mCherry fluorescente bajo el promotor constitutivo pGK (rojo) estaba flanqueada por brazos de homología que coincidían con la secuencia Thy1 humana fuera de los sitios ARNgc. El inserto pGK-mCherry se clonó en orientación directa o inversa con respecto al gen Thy1. Los sitios ARNgc y TALEN están alterados en ambas construcciones direccionadas a mCherry. Figura 5(b) se nucleofectó iPSC PGP1 con el vector direccionado a mCherry sentido o antisentido junto con plásmidos que codifican: la nucleasa Cas9 con uno o ambos ARNgc; uno o ambos pares TALEN; o un plásmido vector vacío. Diez días después, las células se analizaron por citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células que han obtenido expresión de mCherry y/o pérdida de expresión de Thy1 humano. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Figura 6 (a)-(b). Sustitución de genes dirigida utilizando vectores de direccionamiento circulares o lineales. Figura 6(a) El vector direccionado a Thy1 de ratón plasmídico circular de la figura 1 se amplificó utilizando cebadores de PCR en los extremos de los brazos de homología (triángulos pequeños) para producir una forma lineal del vector direccionado a Thy1 de ratón. Figura 6(b) Se nucleofectó iPSC PGP1 con el plásmido circular o el vector direccionado a Thy1 de ratón producto de la PCR lineal junto con plásmidos que codifican la nucleasa Cas9, y L1, R1, ambos, o ningún ARNgc. Seis días después, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Se indica la frecuencia de las células que han ganado la expresión de Thy1 de ratón y/o han perdido la expresión de Thy1 humano. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 7(a)-(b). Efecto de la longitud del brazo de homología en la eficiencia de recombinación. Se construyeron versiones del plásmido del vector direccionado a Thy1 de ratón (figura 1a) con brazos de homología de varias longitudes, pero que contenían todavía la secuencia de 2,5 kb que abarca los exones 2 y 3 de Thy1 de ratón. Cada vector direccionado a Thy1 de ratón se nucleofectó en la PGP1 de la figura 7(a) o la iPSC PGP4 de la figura 7(b) junto con plásmidos que codifican la nucleasa Cas9 y L1, R1, ambos, o ningún ARNgc. Diez días después, se analizó la expresión de los genes Thy1 humanos y de ratón en las células mediante citometría de flujo. Se indica la frecuencia de las células en cada cuadrante de fluorescencia. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 8(a)-(c). Sustitución genética dirigida con homología a cada lado de cada sitio de corte. Figura 8(a) El vector direccionado a mThy1 de la figura 1 (Exterior) se modificó de manera que los brazos de homología Thy1 humanos se extendieran dentro de los sitios ARNgc L1 y R1. A la vez que los exones 2 y 3 Thy1 de ratón (naranja) se retienen completamente en este vector de direccionamiento, se sustituyeron 350 pb de intrón 1 de Thy1 de ratón y 150 pb de secuencia Thy1 de ratón después del sitio de poliadenilación con la secuencia humana correspondiente. El vector de direccionamiento resultante contiene sitios de ARNgc L1 y R1 intactos (Intactos). A continuación, se eliminó un único par de bases de cada sitio de ARNgc en el vector de direccionamiento para desarrollar una versión alternativa con brazos de homología similares, pero sitios de ARNgc alterados (Alterados). Figuras 8(b)-(c) se nucleofectaron iPSC PGP1 o PGP4 con uno de los vectores direccionados a Thy1 de ratón (Externo, Intacto o Alterado) junto con plásmidos que codifican la nucleasa Cas9, y L1, R1, ambos, o ningún ARNgc. Figura 8(b) Dos días después de la nucleofección, se tiñó una muestra de células de cada condición con el colorante de viabilidad ToPro3, y se analizó por citometría de flujo utilizando una velocidad de flujo y tiempo de recolección constante. Los recuentos de células viables se normalizaron al del vector direccionado a Thy1 de ratón externo sin ARNgc (100). Figura 8(c) Cinco días después de la nucleofección, las células se analizaron por citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células que han ganado la expresión de Thy1 de ratón y/o han perdido la expresión de Thy1 humano. Los resultados son representativos de experimentos independientes de tres (PGP1) y dos (PGP4).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las realizaciones de la presente invención se basan en la utilización de proteínas de unión a ADN que tienen actividad de nucleasa para eliminar una primera secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de este modo la inserción de una secuencia de ácido nucleico exógeno en la misma. Dichas proteínas de unión al ADN son inmediatamente conocidas por los expertos en la técnica para unirse al ADN para diversos fines. Dichas proteínas de unión al ADN pueden ser de origen natural. Las proteínas de unión al ADN incluidas dentro del alcance de la presente invención incluyen aquellas que pueden ser guiadas por ARN, denominadas en la presente memoria descriptiva como ARN guía. Según este aspecto, el ARN guía y la proteína de unión al ADN guiada por ARN forman un complejo de localización conjunta en el ADN. Dichas proteínas de unión al ADN que tienen actividad de nucleasa son conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen proteínas de unión al ADN que se dan naturalmente que tienen actividad de nucleasa, tales como proteínas Cas9 presentes, por ejemplo, en sistemas CRISPR Tipo II. Dichas proteínas Cas9 y sistemas CRISPR Tipo II están bien documentados en la técnica. Ver Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, vol. 9 de junio de 2011, págs. 467-477, incluida toda la información complementaria.

Las proteínas de unión a ADN de ejemplo que tienen actividad de nucleasa funcionan para seccionar o cortar ADN bicatenario. Dicha actividad de nucleasa puede ser resultado de que la proteína de unión al ADN tenga una o más secuencias de polipéptidos que exhiben actividad de nucleasa. Tales proteínas de unión a ADN de ejemplo pueden tener dos dominios de nucleasa separados con cada dominio responsable de cortar o mellar una cadena particular del ADN bicatenario. Las secuencias de polipéptidos de ejemplo que tienen actividad de nucleasa conocida por los expertos en la técnica incluyen el dominio relacionado con la nucleasa McrA-HNH y el dominio nucleasa de tipo RuvC. En consecuencia, las proteínas de unión a ADN de ejemplo son aquellas que en la naturaleza contienen uno o varios del dominio relacionado con nucleasa McrA-NHH y el dominio de nucleasa de tipo RuvC.

Según un aspecto, una proteína de unión a ADN que tiene dos o más dominios de nucleasa puede modificarse o alterarse para inactivar todos los dominios de nucleasa excepto uno. Una proteína de unión de ADN modificada o alterada de este tipo se denomina una proteína nickasa de unión a ADN, en la medida en que la proteína de unión a ADN corta o mella solamente una cadena del ADN de doble cadena. Cuando está guiada por ARN a ADN, la proteína nickasa de unión de ADN se denomina proteína nickasa de unión a ADN guiada por ARN.

Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína de unión a ADN guiada por ARN de un sistema CRISPR Tipo II. Una proteína de unión a ADN de ejemplo es una proteína Cas9.

En S. pyogenes, Cas9 genera una ruptura bicatenaria de doble cadena de extremo romos 3 pb aguas arriba del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) a través de un proceso mediado por dos dominios catalíticos en la proteína: un dominio HNH que escinde la cadena complementaria del ADN y un dominio de tipo RuvC que escinde la cadena no complementaria. Ver Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012). Se sabe que las proteínas Cas9 existen en muchos sistemas CRISPR Tipo II, incluidos los siguientes, tal como se identifica en la información complementaria de Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, vol. 9 de junio de 2011, págs. 467-477: Methanococcus maripaludis C7; Corynebacterium diphtheriae; Corynebacterium efficiens YS-314; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kitasato; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Bielefeld; Corynebacterium glutamicum R; Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385; Mycobacterium abscessus ATCC 19977; Nocardia farcinica IFM10152; Rhodococcus erythropolis PR4; Rhodococcus jostii RHA1; Rhodococcus opacus B4 uid36573; Acidothermus cellulolyticus 11B; Arthrobacter chlorophenolicus A6; Kribbella flavida D^s M 17836 uid43465; Thermomonospora curvata DSM 43183; Bifidobacterium dentium Bd1; Bifidobacterium longum DJO10A; Slackia heliotrinireducens DSM 20476; Persephonella marina EX H1; Bacteroides fragilis NCTC 9434; Capnocytophaga ochracea DSM 7271; Flavobacterium psychrophilum JIP02 86; Akkermansia muciniphila ATCC BAA 835; Roseiflexus castenholzii DSM 13941; Roseiflexus RS1; Synechocystis PCC6803; Elusimicrobium minutum Pei191; filotipo Rs D17 de la bacteria del grupo 1 de termitas no cultivadas; Fibrobacter succinogenes S85; Bacillus cereus ATCC 10987; Listeria innocua, Lactobacillus casei; Lactobacillus rhamnosus GG; Lactobacillus salivarius UCC118; Streptococcus agalactiae A909; Streptococcus agalactiae NEM316; Streptococcus agalactiae 2603; Streptococcus dysgalactiae equisimilis GGS 124; Streptococcus equi zooepidemicus MGCS10565; Streptococcus gallolyticus UCN34 uid46061; Streptococcus gordonii Challis subst CH1; Streptococcus mutans NN2025 uid46353; Streptococcus mutans; Streptococcus pyogenes M1 GAS; Streptococcus pyogenes MGAS5005; Streptococcus pyogenes MGAS2096; Streptococcus pyogenes MGAS9429; Streptococcus pyogenes MGAS10270; Streptococcus pyogenes MGAS6180; Streptococcus pyogenes MGAS315; Streptococcus pyogenes SSI-1; Streptococcus pyogenes MGAS10750; Streptococcus pyogenes NZ131; Streptococcus thermophiles CNRZ1066; Streptococcus thermophiles LMD-9; Streptococcus thermophiles LMG 18311; Clostridium botulinum A3 Loch Maree; Clostridium botulinum B Eklund 17B; Clostridium botulinum Ba4 657; Clostridium botulinum F Langeland; Clostridium cellulolyticum H10; Finegoldia magna ATCC 29328; Eubacterium rectale ATCC 33656; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma mobile 163K; Mycoplasma penetrans; Mycoplasma synoviae 53; Streptobacillus moniliformis DSM 12112; Bradyrhizobium BTAi1; Nitrobacter hamburgensis X14; Rhodopseudomonas palustris BisB18; Rhodopseudomonas palustris BisB5; Parvibaculum lavamentivorans DS-1; Dinoroseobacter shibae DFL 12; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 FAPERJ; Gluconacetobacter diazotrophicus Pal 5 JGI; Azospirillum B510 uid46085; Rhodospirillum rubrum ATCC 11170; Diaphorobacter TPSY uid29975; Verminephrobacter eiseniae EF01-2; Neisseria meningitidis 053442; Neisseria meningitidis alfa14; Neisseria meningitidis Z2491; Desulfovibrio salexigens DSM 2638; Campylobacter jejuni doylei 269 97; Campylobacter jejuni 81116; Campylobacter jejuni; Campylobacter lari RM2100; Helicobacter hepaticus; Wolinella succinogenes; Tolumonas auensis DSM 9187; Pseudoalteromonas atlantica T6c; Shewanella pealeana ATCC 700345; Legionella pneumophila Paris; Actinobacillus succinogenes 130Z; Pasteurella multocida; Francisella tularensis novicida U112; Francisella tularensis holarctica; Francisella tularensis FSC 198; Francisella tularensis; Francisella tularensis WY96-3418 y Treponema denticola ATCC 35405. En consecuencia, los aspectos de la presente invención están dirigidos a una proteína Cas9 presente en un sistema CRISPR Tipo II.

En la bibliografía, la proteína Cas9 se puede denominar por un técnico en la materia como Csn1. La secuencia de la proteína Cas9 de S. pyogenes que es el sujeto de los experimentos descritos en la presente memoria descriptiva se muestra a continuación. Ver Deltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011).

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAE ATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFG NIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSD VDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGN LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYA GYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQ1HLGELH AILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE

VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFL SGEQKKAJVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFBCKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKJ IKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREM1EERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWG RLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQL1HDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSL HEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRER MKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDH IVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNL TKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS KLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVR K MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDF ATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVA YSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPK YSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVE QHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENI1HLFTLTNLGA PAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATL1HQSITGLYETRIDLSQLGGD- SEQ ID n.°: 1

Según un aspecto, entre las nucleasas de proteínas de unión a ADN se incluyen homólogos y ortólogos de las mismas y secuencias de proteínas que tienen, como mínimo, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 99 % de homología con las mismas y que son proteínas de unión al ADN con actividad de nucleasa.

Otros aspectos de la presente invención están dirigidos a la utilización de proteínas o sistemas de unión a ADN en general para la modificación o edición genética de un ácido nucleico diana, tal como un gen diana, tal como mediante la inserción de un gen más grande en el ácido nucleico diana. Un técnico en la materia identificará fácilmente sistemas de unión de ADN de ejemplo basados en la presente invención. Entre dichos sistemas de unión a ADN se incluyen nucleasas ZFN (“Zinc Finger Nucleases”, Nucleasas de Dedos de Zinc), TALE, TALENS o CRISPR/Cas9.

Según ciertos aspectos, en la presente memoria descriptiva se describen procedimientos para editar ácidos nucleicos en una célula que incluyen la introducción de uno o varios, dos o más o una pluralidad de ácidos nucleicos externos en la célula. Los ácidos nucleicos externos introducidos en la célula codifican uno o varios ARN guía, una proteína o proteínas Cas9 y la secuencia de ácido nucleico grande que se insertará. Juntos, un ARN guía y una proteína Cas9 se denominan complejo de localización conjunta, dado que un técnico en la materia entiende ese término en la medida en que el ARN guía y la proteína Cas9 se unen al ADN y la proteína Cas9 corta el ADN para eliminar una primera secuencia de ácido nucleico de interés. La secuencia grande de ácido nucleico se inserta en el ADN. Según ciertos aspectos adicionales, los ácidos nucleicos externos introducidos en la célula codifican uno o varios ARN guía y una proteína Cas9.

Entre las células, según la presente invención, se incluye cualquier célula en la que los ácidos nucleicos externos puedan introducirse y expresarse tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Debe entenderse que los conceptos básicos de la presente invención descritos en la presente memoria descriptiva no están limitados por el tipo de célula. Entre las células, según la presente invención, se incluyen células eucariotas, células procariotas, células animales, células vegetales, células fúngicas, células de arqueas, células eubacterianas y similares. Entre las células se incluyen células eucariotas, tales como células de levadura, células vegetales y células animales. Entre las células particulares se incluyen células de mamífero. Entre las células particulares se incluyen células madre, tales como células madre pluripotentes, tales como células madre pluripotentes inducidas por humanos. Entre los ácidos nucleicos diana se incluye cualquier secuencia de ácido nucleico en la que una nucleasa de proteína de unión a ADN pueda ser útil para mellar o cortar, tal como una proteína de unión a ADN guiada por ARN que forma un complejo de localización conjunta, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Entre los ácidos nucleicos diana se incluyen genes. Para los fines de la presente , el ADN, tal como el ADN bicatenario, puede incluir el ácido nucleico diana y un complejo de localización conjunta puede unirse al ADN o localizarse conjuntamente de otro modo con ADN en el ácido nucleico diana o adyacente o cerca mismo y de una manera en la que el complejo de localización conjunta puede tener un efecto deseado sobre el ácido nucleico diana. Entre dichos ácidos nucleicos diana se pueden incluir ácidos nucleicos endógenos (o naturales) y ácidos nucleicos exógenos (o externos). Una de las habilidades basadas en la presente invención será la capacidad de identificar o diseñar fácilmente ARN guía y proteínas Cas9 que se localizan conjuntamente en un ADN que incluye un ácido nucleico diana. El ADN incluye ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.

Los ácidos nucleicos externos (es decir, aquellos que no forman parte de la composición de ácido nucleico natural de una célula) pueden introducirse en una célula utilizando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica para dicha introducción. Entre dichos procedimientos se incluyen transfección, transducción, transducción viral, microinyección, lipofección, nucleofección, bombardeo de nanopartículas, transformación, conjugación y similares. Un técnico en la materia comprenderá y adaptará fácilmente dichos procedimientos utilizando fuentes de bibliografía fácilmente identificables.

Los siguientes ejemplos se exponen como representativos de la presente invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la presente invención, ya que estas y otras realizaciones equivalentes serán evidentes a la vista de la presente invención, las figuras y las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLO I

Secuencias diana de ARNgc

Se utilizó un algoritmo computacional para identificar secuencias de ARNgc (ARN de guía única) Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) en diversas posiciones alrededor de los genes humanos Thy1 y CD 147 en función de su singularidad en el genoma humano:

Thy1 humano:

L1 CACAG TCTCA GAAAA GCGC AGG (SEQ ID n.2: 2)

L2 AAATA TCAGC GCGGT GGAT TGG (SEQ ID n.2: 3)

L3 GGTCA GGCTG AACTC GTAC TGG (SEQ ID n.2: 4)

R1 TTAGT AGCAA CGCTA CCCC AGG (SEQ ID n.2: 5)

R2 GTGTG CAGTC ATTAG CCCC TGG (SEQ ID n.2: 6)

R3 GGGCA AATGT GTCTC GTTA GGG (SEQ ID n.2: 7)

R4 TTCTC CTTTC CGAAG TCCG JGG (SEQ ID n.2: 8)

R5 GCCGC TGTCG CCTGG CAAA AGG (SEQ ID n.2: 9)

R6 GATGG TAGAC ATCGA CCAT GGG (SEQ ID n.2: 10)

R7 TTCAA TTTCG GGCCC GATC TGG (SEQ ID n.2: 11)

R8 TGAGT CGCGT CACGG CTAT JGG (SEQ ID n.2: 12)

R9 CATTT GCGGT GGTAA TCGC AGG (SEQ ID n.2: 13)

R10 GATCG GGTCG CGTC GGG (SEQ ID n.2: 14)

CD147 humano:

L147 TTTCC TGCGC TGAAT CGGG TGG (SEQ ID n.2: 15)

R147 GGCTC CTGTC TGTGC CTGA CGG (SEQ ID n.2: 16)

EJEMPLO II

Construcción de plásmidos Cas9 y ARNgc

Se sintetizaron el promotor U6 y la secuencia de la cadena principal ARNgc tal como se ha descrito en Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) (IDT) y se clonaron utilizando ensamblaje isotérmico en una cadena principal de plásmido mínimo que contiene el gen de resistencia a ampicilina y pBR322 ori PCR amplificado a partir de pUC19 utilizando cebadores 5’ CTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA ttagacgtcaggtggcacttttc 3’ (SEQ ID n.°: 17) 5’ CCTTTAAAGCCTGCTTTTTTGTACA GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 3’ (SEQ ID n.2: 18). Se clonaron varias secuencias de ARNgc en este vector utilizando ensamblaje isotérmico. Los segmentos superpuestos para el ensamblaje isotérmico están subrayados. Todos los cebadores eran de IDT; todas las reacciones de PCR se realizaron con el kit de PCR KAPA HiFi HotStart. Los plásmidos se mantuvieron en bacterias TOP10 o Stb13 (Invitrogen).

Se amplificó mediante PCR un gen de nucleasa Cas9 optimizado por codón humano, Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) utilizando los cebadores 5’ GCCACCATGGACAAGAAGTACTCC 3’ (SEQ ID n.2: 19) y 5’ TCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGG 3’ (SEQ ID n.°: 20) y se clonó utilizando el ensamblaje isotérmico entre un promotor EF1a y una secuencia de poliadenilación de bGH en una cadena principal de plásmido pCDNA3. El promotor EF1a se amplificó mediante PCR a partir de pEGIP (Addgene n.° 26777) utilizando los cebadores 5’ CCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGA tgaaaggagtgGGAATTggc 3’ (SEQ ID n.2: 21) y 5’ GGAGTACTTCTTGTCCATGGTGGC GGCC AACTAGCCAGCTTGGGTCTCCC 3’ (SEQ ID n.2: 22). La secuencia de poliadenilación de bGH se amplificó mediante PCR a partir de pST1374 (Addgene n.° 13426) utilizando cebadores 5’ GCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGA CATCACCATTGAGTTTAAACCCGC 3’ (SEQ ID n.2: 23) y 5’ CCAAGCTCTAGCTAGAGGTCGACG GACT C GAGCCCCAGCTGGTTC 3’ (SEQ ID n.2: 24). La cadena principal del plásmido se amplificó mediante PCR a partir de pCDNA3 (Invitrogen) utilizando los cebadores 5’ ATACCGTCGACCTCTAGCTAG 3’ (SEQ ID n.2: 25) y 5’ TCCGTCGACGTCAGGTGG 3’ (SEQ ID n.2: 26).

EJEMPLO III

Construcción del plásmido de direccionamiento

El vector dirigido a Thy1 de ratón con homología alrededor de los sitios ARNgc (Exterior) se clonó utilizando ensamblaje isotérmico. Los exones 2 y 3 de Thy1 de ratón se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico C57BL/6J (Jackson Laboratories) utilizando los cebadores 5’ TGGTGGTGGTTGTGGTACACACC 3’ (SEQ ID n.°: 27) y 5’ AATAGGGAGGGCCGGGGTACC 3’ (SEQ ID n.°: 28). El brazo de homología de Thy1 humano corriente arriba se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de iPCS PGP1 utilizando los cebadores 5’ AC CCTTCCCCTCCTAGATCCCAAGCC 3’ (SEQ ID n.2: 29) y 5’ GATTAAAGGTGTGTACCACAACCACCACCA CTTTTCTGAGACTGTGAGGGAG 3’ (SeQ ID n.°: 30). El brazo de homología Thy1 humano corriente abajo se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico iPSC PGP1 humano utilizando cebadores 5’ AGACTCTGGGGTACCCCGGCCCTCCCTATT CCCAGGGGCTAATGACTGC 3’ (SEQ ID n.2: 31) y 5’ GCACCTCCAGCCATCACAGC 3’ (SEQ ID n.°: 32). La cadena principal del plásmido se amplificó mediante PCR a partir de pUC19 utilizando los cebadores 5’ CCÁGGAAGGGGCTGTGATGGCTGGAGGTGC ttagacgtcaggtggcacttttc 3’ (SEQ ID n.°: 33) y 5’ GGGCTTGGGATCTAGGAGGGGAAGG GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 3’ (SEQ ID n.2: 34).

Se amplificó mediante PCR una versión lineal del vector direccionado a Thy1 de ratón a partir del vector de direccionamiento Externo original utilizando los cebadores 5’ AC CCTTCCCCTCCTAGATCCCAAGCC 3’ (SEQ ID n.°: 35) y 5’ GCACCTCCAGCCATCACAGC 3’ (SEQ ID n.°: 36). Los productos de PCR se limpiaron con el kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen).

Las versiones del vector direccionado a Thy1 de ratón con brazos de homología más cortos se clonaron a partir del plásmido del vector direccionado a Thy1 Externo original utilizando el ensamblaje isotérmico utilizando combinaciones de los siguientes tres cebadores de PCR directos y tres inversos. Cebadores directos que determinan la longitud del brazo de homología aguas arriba:

1550 pb, L: 5’ ACCCTTCCCCTCCTAGATCCCAAGCC 3’ (SEQ ID n.2: 37);

821 pb, M: 5’ AAGATTCAGAGAGATTCATTCATTCATTCACAA 3’ (SEQ ID n.2: 38);

100 pb, S: 5’ CCTGCTAACAGGTACCCGGCATG 3’ (SEQ ID n.2: 39).

Los cebadores inversos que determinan la longitud del brazo de homología aguas abajo:

2466 pb, L: 5’ GCACCTCCAGCCATCACAGC 3’ (SEQ ID n.2: 40);

797 pb, M: 5’ CAGCATCTTGCTAAGGGGTTGTCAG 3’ (SEQ ID n.2: 41);

94 pb, S: 5' GTCAGCAGACATGGGATGTTCGTTT 3' (SEQ ID n.2: 42).

La cadena principal del plásmido se amplificó mediante PCR a partir de pUC19 utilizando los siguientes tres cebadores directos e inversos con salientes complementarios a los brazos de homología de Thy1 aguas arriba y aguas abajo.

Salientes aguas arriba:

1550 pb: 5' GGGCTTGGGATCTAGGAGGGGAAGG GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 3' (SEQ ID n.2: 43);

821 pb: 5' TGAATGAATGAATGAATCTCTCTGAATCTT GTTTGCGTATTGGGCGCTCTT C 3' (SEQ ID n.2: 44); 100 pb: 5' TCCTGCCCCATGCCGGGTACCTGTTAGCAG GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 3' (SEQ ID n.2: 45). Salientes aguas abajo:

2466 pb: 5' CCAGGAAGGGGCTGTGATGGCTGGAGGTGC ttagacgtcaggtggcacttttc 3' (SEQ ID n.°: 46);

797 pb: 5' GGAGGCTGACAACCCCTTAGCAAGATGCTG ttagacgtcaggtggcacttttc 3' (SEQ ID n.°: 47);

94 pb: 5' CAAATAAACGAACATCCCATGTCTGCTGAC ttagacgtcaggtggcacttttc 3' (SEQ ID n.°: 48).

Se clonó una versión del vector direccionado a Thy1 de ratón con brazos de homología más largos (XX) utilizando ensamblaje isotérmico. El plásmido original del vector direccionado a Thy1 Externo se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 5' CCTTCCCCTCCTAGATCCCAAGCC 3' (SEQ ID n.°: 49) y 5' GCACCTCCAGCCATCACAGC 3' (SEQ ID n.°: 50). Se amplificaron 3 kb adicionales del brazo de homología de Thy1 aguas arriba a partir de ADN genómico de PGP1 utilizando los cebadores 5' TCTTGTTTGAGATGTTGTGCGGG 3' (SEQ ID n.2: 51) y 5' CTGGTTTCAGCACTCCGATCCTATC 3' (SEQ ID n.2: 52). Un extra de 2,4 kb del brazo de homología de Thy1 aguas abajo se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico PGP1 utilizando los cebadores 5' TGTGGCTCTGCACCAGGAAG 3' (SEQ ID n.°: 53) y 5' CCTCTCCCTTTTCCCTGGTTTTG 3' (SEQ ID n.°: 54). La cadena principal del plásmido con salientes complementarios se amplificó mediante PCR a partir de pUC19 utilizando los cebadores 5' TÁCTCTGCAAAACCAGGGAAAAGGGAGAGG ttagacgtcaggtggcacttttc 3' (SEQ ID n.°: 55) y 5' CTGTGGATAGGATCGGAGTGCTGAAACCAG GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC3' (SEQ ID n.2:56).

El vector direccionado a Thy1 de ratón con homología alrededor de cada sitio de ARNgc (Intacto) se clonó utilizando ensamblaje isotérmico. Un fragmento más corto de los exones 2 y 3 de Thy1 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido de vector direccionado a Thy1 Externo original utilizando los cebadores 5' ATCTCTCCACTTCAGGTGGGTGGGAGGCCCCTGT GGTCTGTGTCTCCCCAAATT 3' (SEQ ID n.2: 57) y 5' CAGGTGGACAGGAGGACAGATTCCAGAGGC TTGGTTTTATTGTGCAGTTTTCTTTC 3' (SEQ ID n.2: 58). Un fragmento extendido del brazo de homología aguas arriba dentro de los sitios de ARNgc se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico PGP1 utilizando los cebadores 5' GGCTTCCTTCCCTCCAGAG 3' (SEQ ID n.°: 59) y 5' ACAGGGGCCTCCCACCC 3' (SEQ ID n.°: 60). Un fragmento extendido del brazo de homología aguas abajo dentro de los sitios de ARNgc se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico PGP1 utilizando los cebadores 5' CAAGCCTCTGGAATCTGTCCTC 3' (SEQ ID n.2: 61) y 5' GCCCAGTGTGCAGTCATTAGC 3' (SEQ ID n.2: 62). La cadena principal del plásmido con los fragmentos restantes del brazo de homología aguas arriba y aguas abajo se amplificó mediante PCR a partir del vector direccionado a Thy1 Externo original utilizando los cebadores 5' CTTTTCTGAGACTGTGAGGGAG 3' (SEQ ID n.2: 63) y 5' TACCCCAGGGGCTAATGACTGCAC 3' (SEQ ID n.2: 64).

El vector direccionado a Thy1 de ratón con homología alrededor de cada sitio de ARNgc alterado (Alterado) se clonó utilizando ensamblaje isotérmico. Para eliminar un nucleótido de cada uno de los sitios de ARNgc, dos secciones se amplificaron mediante PCR a partir del plásmido del vector direccionado a Thy1 Intacto con cebadores 5' ACAGTCTCAGAAAACGCAGGTGACAAAG 3' (SEQ ID n.2: 65) y 5' CATTAGCCCCTGGGTAGCGTTGCTACTAAG 3' (SEQ ID n.2: 66) y posteriormente 5' TTGTCACCTGCGTTTTCTGAGACTGTGAG 3' (SEQ ID n.2: 67) y 5' CTTAGTAGCAACGCTACCCAGGGGCTAATG 3' (SEQ ID n.2: 68).

El vector direccionado a mCherry Thy1 se clonó utilizando ensamblaje isotérmico. El transgén mCherry se amplificó mediante PCR a partir de una construcción plasmídica que contenía mCherry bajo el control de un promotor pGK con una secuencia de poliadenilación de bGH utilizando cebadores 5' GAGAATACCAGCAGTTCACCCATCCAGTAC GAAATTCTACCGGGTAGGGGAG 3' (SEQ ID n.2: 69) y 5' CCCAGTGTGCAGTCATTAGCCCCTGGGGTA CGACGGCCAGTGAATTGTAATACG 3' (SEQ ID n.2: 70). El brazo de homología aguas arriba se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico PGP1 utilizando cebadores 5' AC CCTTCCCCTCCTAGATCCCAAGCC 3' (SEQ ID n.2: 71) y 5' GTACTGGATGGGTGAACTGCTGGTATTC 3' (SEQ ID n.°: 72). El brazo de homología aguas abajo se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de PGP1 utilizando los cebadores 5' TACCCCAGGGGCTAATGACTGCAC 3' (SEQ ID n.2: 73) y 5' GCACCTCCAGCCATCACAGC 3' (SEQ ID n.°: 74). La cadena principal del plásmido se amplificó mediante Pc R a partir de pUC19 utilizando los cebadores 5' CCÁGGAAGGGGCTGTGATGGCTGGAGGTGC ttagacgtcaggtggcacttttc 3' (SEQ ID n.°: 75) y 5' GGGCTTGGGATCTAGGAGGGGAAGG GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 3' (SEQ ID n.2: 76).

El vector direccionado a CD147 de ratón se clonó utilizando ensamblaje isotérmico. Los exones 2-7 de CD147 de ratón se amplificaron mediante PCR a partir de ADN genómico C57BL/6J (Jackson Laboratories) utilizando los cebadores 5' GAAGTCGAGGTTCCAAGGTCACAGTGAG GGGGCCCTGGCCACCC CTTGCAGGTTCTCCATAGTCCACAG 3' (SEQ ID n.2: 77) y 5' CAACAACCCCTCCTGTATATGACCT 3' (SEQ ID n.2: 78). El brazo de homología aguas arriba se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico PGP1 utilizando los cebadores 5' ACACACTTTCAACCTCCAAGAGACG 3' (SEQ ID n.2: 79) y 5' CTCACTGTGACCTTGGAACCTCG 3' (SEQ ID n.°: 80). El brazo de homología aguas abajo se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico PGP1 utilizando cebadores 5' TGTTGAGGTCATATACAGGAGGGGTTGTTG CCTGACGGGGTTGGGTTTTCC 3' (SEQ ID n.2: 81) y 5' AA GGGAGCCCTGAGGCCTTTTCC 3' (SEQ ID n.2: 82).

La cadena principal del plásmido con salientes complementarios se amplificó mediante PCR a partir de pUC19 utilizando los cebadores 5' TCAGGAAAAGGCCTCAGGGCTCCC ttagacgtcaggtggcacttttc 3' (S^eQ ID n.°: 83) y 5' CGTCTCTTGGAGGTTGAAAGTGTGT GTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC 3' (SEQ ID n.2: 84).

EJEMPLO IV

Ensamblaje TALEN

Se ensamblaron pares TALE (16,5 mer) dirigidos al gen Thy1 humano utilizando el Ensamblaje Iterativo Taponado. Par TALE dirigido sobre el sitio ARNgc L3: Izquierda: 5' T ACCAGCAGTTCACCCAT 3' (SEQ ID n.°: 85); Derecha: 5' T CTTTGTCTCACGGGTCA 3' (SEQ ID n.°: 86). Par TALEN dirigido sobre el sitio ARNgc R1: Izquierda: 5' T CTCCCCAACCACTTAGT 3' (SEQ ID n.2: 87); Derecha: 5' T GTGCAGTCATTAGCCCC 3' (SEQ ID n.2: 88). TALE se clonaron en dominios de nucleasa de heterodímero FokI utilizando ensamblaje isotérmico. Los TALE ensamblados se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores 5' GGCCGCCACCATGGATTATAAGGAC 3' (SEQ ID n.°: 89) y 5' GGAACCTGCCACTCGATGTG 3' (SEQ ID n.°: 90). Los dominios de nucleasa de heterodímero FokI KKR y ELD con las mutaciones de Sharkey se derivaron de pMG10 (Addgene n.° 31238) utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning (Stratagene). El dominio KKR-Sharkey FokI se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 5' GACATCACATCGAGTGGCAGGTTCC CAGCTGGTGAAGTCCGAGC 3' (SEQ ID n.2: 91) y 5' CAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC TGATCAGCG GGGTTA GAAATTGATTTCACCATTGTTGAAC 3' (SEQ ID n.°: 92). El dominio ELD-Sharkey FokI se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 5' GACATCACATCGAGTGGCAGGTTCC CAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGG 3' (SEQ ID n.2: 93) y 5' CAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC TGATCAGCG CCCTTAAAAGTTTATCTCGCCG 3' (SEQ ID n.2: 94). Cada dominio heterodimérico TALE y FokI se clonó en una cadena principal de plásmido que contenía un promotor EF1a y una secuencia de poliadenilación de bGH; esto se amplificó a partir del vector de expresión Cas9 descrito anteriormente utilizando los cebadores 5' GCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTG 3' (SEQ ID n.°: 95) y 5' CTTATAA TCCATGGTGGCGGCC 3' (SEQ ID n.2: 96).

EJEMPLO V

Cultivo y transfección de iPSC

Se obtuvieron iPSC humanas verificadas de los donantes de PGP1 y PGP4 del Proyecto Genoma Personal a través de Coriell. Las líneas celulares se mantuvieron en placas recubiertas con Matrigel (BD) y se cultivaron en mTesr1 (Stem Cell Technologies) según las instrucciones del fabricante. Se añadieron 10 pM del inhibidor Rock Y-27632 (Millipore) al cultivo antes, durante y después del pasaje con Accutase (Millipore). La pluripotencia de los cultivos de iPSC se verificó mediante tinción con TRA-1/60 FACS (BD).

Todos los plásmidos se purificaron utilizando el kit Qiagen Endo-free Plasmid Maxiprep. Los plásmidos se nucleofectaron en células iPSC utilizando la unidad Lonza 4D-Nucleofector X (Buffer P3, Program CB-150) según las instrucciones del fabricante. Por cada reacción de nucleofección de 20 pl, se transfectaron 0,2-0,5 x 106 iPSC con hasta 4 pg de ADN plasmídico. Después de la nucleofección, las iPSC se sembraron en placas recubiertas con Matrigel de 24 y 96 pocillos que contenían medios mTesr1 más 10 pM de Y-27632.

Para las nucleofecciones basadas en CRISPR con un vector de direccionamiento (ver las figuras 1(a)-(d) y las figuras 3(a)-(c) a las figuras 8(a)-(c)), se utilizaron 2 pg de plásmido vector de direccionamiento, 0,5 pg de plásmido Cas9, y 1,5 g de plásmido total de ARNgc. Cuando se utilizaron dos ARNgc, se combinaron 0,75 pg de cada plásmido. Cuando no se utilizaron ARNgc, se utilizó 1,5 pg de pUC19 en su lugar.

Para las nucleofecciones basadas en CRISPR sin un vector de direccionamiento (ver las figuras 2(a)-(e), se utilizaron 2 ^g de plásmido total: 0,5 ^g de plásmido Cas9 con 0,75 ^g de cada plásmido de ARNgc o 0,75 ^g de pUC19.

Para las nucleofecciones basadas en TALEN con un vector de direccionamiento (ver las figuras 5(a)-(b)), se utilizaron 2 ^g de plásmido del vector de direccionamiento más 2 ^g de plásmido TALEN total. Para una ruptura de ADNbc utilizando un par de TALEN, se utilizó 1 ^g de cada plásmido heterodimérico que expresaba TALEN. Para dos rupturas de ADNbc utilizando dos pares de TALEN, se utilizaron 0,5 ^g de cada plásmido heterodimérico que expresaba TALEN.

EJEMPLO VI

Tinción de FACS

Se disociaron iPSC utilizando TrypLE Express (Invitrogen) y se lavaron en tampón de FACS: PBS (Invitrogen) albúmina de suero bovino al 0,2 % (Sigma). Las células se tiñeron en tampón de FACS más suero de ternera fetal al 10 % durante 30 minutos a 4 °C. Se adquirieron los siguientes anticuerpos de eBioscience: Anti-APC Thy1 humano (eBio5E10), anti-PE Thy1.2 de ratón (30-H12), anti-APC CD147 humano (8D12), anti-PE CD147 de ratón (RL73), APC IgG1K control de isotipo ratón (P3.6.2.8.1), PE IgG2b control de isotipo ratón (eBMG2b). Las células se lavaron dos veces en tampón de FACS y posteriormente se resuspendieron en tampón de FACS con el colorante de viabilidad SYTOX Blue (Invitrogen). Las muestras se recogieron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa con un High Throughput Sampler (HTS) y se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star).

Para los recuentos constantes de células viables que se muestran en las figuras 8(a)-(c), cada muestra se cultivó en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Cada pocillo se disoció con 50 ^l de TrypLE. Posteriormente, se añadieron 150 |^ l de tampón de FACS que contenía el colorante de viabilidad ToPro3 (Invitrogen). E1HTS se utilizó para analizar 100 ^l de cada pocillo a una velocidad constante de 1 ^l/s con mezcla.

EJEMPLO VII

Clasificación de FACS de iPSC de célula única

Para la clasificación de FACS, se clasificaron iPSC a una célula/pocillo en placas de 96 pocillos que contenían células alimentadoras. Las placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos se recubrieron con gelatina (Millipore) y se cultivaron con fibroblastos embrionarios de ratón CF-1 irradiados (106 MEF por placa; Global Stem) la noche anterior. Antes de la clasificación, los medios en las placas se cambiaron a medios de mantenimiento de células hES con 100 ng/ml de bFGF (Millipore), inhibidores de SMC4 (BioVision) y 5 ^g/ml de fibronectina (Sigma). Durante, como mínimo, 2 horas antes de la clasificación de FACS, los iPSC se pretrataron con mTesr1 que contenía inhibidores de SMC4. Las células se disociaron con Accutase y se tiñeron tal como se ha descrito anteriormente. Las iPSC se clasificaron utilizando un BD FACS Aria en las placas de 96 pocillos recubiertas con MEF. Las colonias de iPSC establecidas se pasaron mecánicamente a nuevos pozos recubiertos con MEF.

EJEMPLO VIII

Genotipado mediante PCR

El ADN genómico de los clones de iPSC clasificados se purificó a partir de las placas de 96 pocillos. Cada clon se genotipó utilizando cuatro juegos de cebadores de PCR (ver las figuras 1 (a)-(d)) utilizando la polimerasa KAPA HiFi HotStart y se ejecutó en un gel de agarosa al 0,8 %.

Reacción 1: 5' AGGGACTTAGATGACTGCCATAGCC 3' (SEQ ID n.2: 97) y 5' ATGTTGGCAGTAAGCATGTTGTTCC 3' (SEQ ID n.°: 98). Thy1 (+) de tipo salvaje o alelo invertido (i): 3129 pb; alelo dirigido a Thy1 de ratón (m): 2904 pb; alelo escindido (A): 387 pb.

Reacción 2: 5' AGGGACTTAGATGACTGCCATAGCC 3' (SEQ ID n.2: 99), 5' CTCACCTCTGAGCACTGTGACGTTC 3' (SEQ ID n.2: 100) y 5' ACTGAAGTTCTGGGTCCCAACAATG 3' (SEQ ID n.°: 101). Alelo de tipo salvaje (+): 993 pb; alelo dirigido a ratón (m): 490 pb; alelo escindido (A) o invertido (i): sin producto de PCR.

Reacción 3: 5' ATGAATACAGACTGCACCTCCCCAG 3' (SEQ ID n.2: 102), 5' CTCACCTCTGAGCACTGTGACGTTC 3' (SEQ ID n.2: 103) y 5' CCATCAATCTACTGAAGTTCTGGGTCCCAACAATG 3' (SEQ ID n.2: 104). Alelo de tipo salvaje (+): 2393 pb; alelo dirigido a ratón (m): 1891 pb; alelo escindido (A) o invertido (i): sin producto de PCR.

Reacción 4: 5' TGAAGTGAAACCCTAAAGGGGGAAG 3' (SEQ ID n.2: 105), 5' AAACCACACACTTCAACCTGGATGG 3' (SEQ ID n.2: 106) y 5' GTTTGGCCCAAGTTTCTAAGGGAGG 3' (SEQ ID n.°: 107). Alelo de tipo salvaje (+): 3064 pb; alelo dirigido a ratón (m): 2707; alelo escindido (A) o invertido (i): sin producto de PCR.

El ADN genómico de los clones de iPSC clasificados se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores en la Reacción 1 de genotipado, que se extiende fuera de los sitios de nucleasa de ARNgc. Se separaron productos de PCR de diferentes tamaños utilizando extracción en gel de agarosa (Qiagen). Los productos de PCR se secuenciaron por Sanger (Genewiz) utilizando los mismos dos cebadores. Los picos simples y dobles se analizaron a partir del archivo de trazas de Sanger y se deconvolucionaron para determinar las secuencias bialélicas de cada clon.

EJEMPLO IX

Los aspectos de la presente invención están dirigidos a mejorar la baja frecuencia de recombinación homóloga (HR (“Homologous Recombination”, Recombinación Homóloga)) (10-3-10-7) que puede limitar las sustituciones de genes específicos incluso cuando se utilizan marcadores de direccionamiento de antibióticos. Ver Deng, C. y Capecchi, M. R. Mol. Cell. Biol. 12, 3365-3371 (1992). Los aspectos de la presente invención contemplan la utilización de sistemas de nucleasas diseñados a medida, tales como las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. y Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010), nucleasas efectoras activadoras de la transcripción (TALEN) Joung, J. K. y Sander, J. D. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 49-55 (2012), o nucleasas CRISPR/Cas9 Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) para la modificación eficiente del genoma, tal como la escisión y la sustitución de secuencias largas de ácido nucleico, tales como secuencias genéticas largas. Los aspectos de la presente invención prevén la utilización de tipos de células que pueden ser resistentes a la edición de genes utilizando procedimientos convencionales.

Los aspectos de la presente invención prevén la utilización de una o más rupturas de ADNbc en sitios diana específicos, en los que la vía de reparación NHEJ Chapman, J. R, Taylor, M. R. G. y Boulton, S. J. Molecular Cell 47, 497-510 (2012) puede, a continuación, mutar e interrumpir los genes Urnov, F. D, Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. y Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010), Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013). Los aspectos de la presente invención prevén dos rupturas de ADNbc que pueden escindir la porción intermedia del genoma Lee, H. J., Kim, E. y Kim, J.-S. Genome Research 20, 81-89 (2010) o generar translocaciones Piganeau, M. et al. Genome Research 23, 1182-1193 (2013). Los aspectos de la presente invención prevén la utilización de HR que utiliza un ssODN Chen, F. et al. Nature Methods 8, 753-755 (2011), Yang, L. et al. Nucleic Acid Research (2013). doi: 10.1093/nar/gkt555 o vector de direccionamiento de plásmidos Yang, L. et al. Nucleic Acid Research (2013). doi: 10.1093/nar/gkt555, Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) para introducir mutaciones o transgenes Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 3055-3060 (2007), Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851-857 (2009). Los aspectos de la presente invención prevén procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva para mejorar la eficacia de la inserción de genes de inserciones más grandes que pueden ser ineficaces. Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 3055-3060 (2007), Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S. y Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11,636-646 (2010).

Los aspectos de la presente invención prevén generar sustituciones de genes dirigidos de múltiples kilobases utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva y la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ (“Microhomology-Mediated End Joining”, Unión de extremos Mediada por Microhomología)) entre los salientes cortos monocatenarios que pueden ser el resultado de la escisión de ZFN Orlando, S. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e152 (2010), Cristea, S. et al. Biotechnol. Bioeng. 110, 871-880 (2013), Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N. y Yang, Y. Genome Research 23, 539-546 (2013). Los aspectos de la presente invención prevén mejorar la eficiencia de los cruces de HR entre los brazos de homología flanqueantes generando una ruptura de ADNbc en cada brazo de homología. Se prevé además la utilización de múltiples sitios de corte en cada brazo de homología para mejorar la eficiencia de la inserción del ácido nucleico de gran tamaño.

EJEMPLO X

Optimización del diseño del vector diana

Los aspectos de la presente invención se refieren a la optimización del diseño del vector de direccionamiento para la sustitución de ácido nucleico de gran tamaño. Según un aspecto de ejemplo, el gen Thy1 humano de 2,7 kb (hThy1) se reemplazó con su homólogo de ratón (mThy1) en iPSC humano derivado de donantes del Proyecto Genoma Personal (PGP). El Thy1 humano (CD90) es ventajoso para demostrar un ejemplo de sustitución de genes grandes utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva, porque se expresa en la superficie de las iPSC humanas, no es esencial para la supervivencia celular in vitro, y están disponibles anticuerpos de tinción específicos de especie. Debe entenderse que este ejemplo es solo a modo de ejemplo y no pretende limitar el alcance de la presente invención a la escisión de Thy1 humano y la sustitución con Thy1 de ratón.

Se diseñaron dos ARN de guía única (ARNgc) direccionados a Thy1 humano dentro del intrón 1 o después de la secuencia de poliadenilación. El plásmido del vector direccionado a mThy1 contenía los exones 2 y 3 de Thy1 de ratón flanqueado por brazos de homología Thy1 humanos fuera de los sitios de corte (figura 1a). Cuando se realizaron ambas rupturas de ADNbc, el 6,7 % de iPSC se convirtió en mThy1+ hThy1- sin selección (figura 1b). El genotipado mediante PCR de clones de mThy1+ hThy1- de células individuales clasificadas por FACS reveló una mezcla de sustitución homocigótica dirigida (m/m; 4,7 %) y sustitución de un alelo humano con escisión del otro (m/A; 2 %) (figuras 1 (c)-(d)). Además, el 1,6 % de las células eran mThy1+ hThy1+ doblemente positivas (m/+; sustitución heterocigótica dirigida).

Finalmente, el 16,2 % de las células eran mThy1- hThy1- doblemente negativas: la secuenciación de PCR y Sanger reveló una mezcla de escisión homocigótica (A/A) e inversión y escisión heterocigótica (i/A) entre los sitios ARNgc (figura 1 (a)-(d)). Si bien se observaron unos pocos indeles y bases insertadas en los sitios de escisión e inversión, el indel más grande fue de solo 15 pb, y la mayoría de los alelos se volvieron a unir exactamente entre los sitios de corte (figuras 3 (a)-(c)). Comunicaciones anteriores que generaban dos rupturas de ADNbc con ZFN o TALEN observaron indeles en la mayoría de los alelos de escisión e inversión, hasta de 200 pb Lee, H. J., Kim, E. y Kim, J. S. Genome Research 20, 81-89 (2010), Lee, HJ, Kweon, J., Kim, E., Kim, S. y Kim, J. S. Genome Research 22, 539-548 (2012), Piganeau, M. et al. Genome Research 23, 1182-1193 (2013). En contraste con los salientes 5’ producidos por ZFN y TALEN, las nucleasas Cas9 producen rupturas de ADNbc de extremos romos Jinek, M. et al. Science 337, 816-821 (2012), lo que puede contribuir al aumento de la fidelidad de reunión, que también se observó para las escisiones mediadas por Cas9 más cortas de 19 pb Mali, P. et al. Science 339, 823-826 (2013) y 118 pb Cong, L. et al. Science 339, 819-823 (2013).

Cuando solo se utilizó un solo ARNgc, la sustitución homocigótica mThy1 tuvo lugar en más del 2 % de las células (mThy1+ hThy1-; m/m) y la sustitución heterocigótica tuvo lugar en el 4-6 % de las células (mThy1+ hThy1+; m/+). Se observaron muy pocas células mThy1- hThy1- doblemente negativas y no se observaron alelos hThy1 escindidos (A) (figuras 1 (a)-(d)). Se produjo un patrón similar de resultados al reemplazar el gen CD147 humano de 9,8 kb con su homólogo de ratón o reemplazar hThy1 con un indicador fluorescente (figuras 4 (a)-(b) y figuras 5 (a)-(b)).

EJEMPLO XI

Determinación del efecto de la longitud de homología

sobre sustituciones de genes dirigidos en iPSC humanas

Los vectores direccionados a genes convencionales se transfectan normalmente como plásmidos linealizados. Con ZFN, las construcciones de direccionamiento de plásmidos circulares produjeron tasas más altas de inserción génica mediada por HR que los plásmidos linealizados, aunque las construcciones lineales fueron más efectivas en la inserción génica mediada por MMEJ Orlando, S. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e152 (2010), Cristea, S. et al. Biotechnol. Bioeng. 110, 871-880 (2013). Un vector direccionado a mThy1 linealizado produjo mucho menos direccionamiento genético en comparación con el plásmido circular (figura (a)-(b)), lo que puede deberse a la eficiencia de nucleofección reducida de los plásmidos linealizados o al aumento de la degradación. Cristea, S. et al. Biotechnol. Bioeng. 110, 871-880 (2013).

Para el direccionamiento genético convencional mediado por HR, la frecuencia de direccionamiento aumentó con la longitud del brazo de homología hasta, aproximadamente, 14 kb Deng, C. y Capecchi, M. R. Mol. Cell. Biol. 12, 3365-3371 (1992), aunque la longitud del brazo de homología adicional (hasta, aproximadamente, 70kb) utilizando cromosomas artificiales bacterianos puede mejorar los vectores de direccionamiento débiles o no isogénicos Valenzuela, D. M. et al. Nat Biotechnol 21, 652-659 (2003). Sin embargo, la introducción de una ruptura de ADNbc reduce la longitud necesaria del brazo de homología a, aproximadamente, 0,2-0,8 kb para las inserciones de transgenes en un solo sitio de corte Elliott, B., Richardson, C., Winderbaum, J., Nickoloff, J. A y Jasin, M. Mol. Cell. Biol. 18, 93-101 (1998), Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 3055-3060 (2007), Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851-857 (2009), Orlando, S. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e152 (2010), Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K. y Carroll, D. G3 Genes|Genomes|Genetics 3, 657-664 (2013). Para examinar el efecto de la longitud de homología en las sustituciones de genes de direcionamiento en iPSC humanas, se construyeron versiones del vector direccionado a mThy1 con brazos de homología de varias de longitudes (figura 7(a)). Además de los brazos de homología de, aproximadamente, 2 kb del vector de direccionamiento original (largo, L), se eligieron longitudes más cortas de, aproximadamente, 800 pb (medio, M) o, aproximadamente, 100 pb (corto, S), ya que estas longitudes se utilizan a menudo para la inserción de genes mediada por HR Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 3055-3060 (2007), Hockemeyer, D. et al. Nat Biotechnol 27, 851-857 (2009) o corrección de ssODN Chen, F. et al. Nature Methods 8, 753-755 (2011), Yang, L. et al. Nucleic Acids Research (2013). doi: 10.1093/nar/gkt555. También se probaron brazos de homología más largos de, aproximadamente, 5 kb (extralargo, X). Con dos rupturas de ADNbc, las frecuencias de direccionamiento fueron más elevadas con brazos de homología de, aproximadamente, 2 kb (LL y ML), y generalmente disminuyeron con menos homología, aunque se consiguieron frecuencias de más del 1 % hasta, aproximadamente, 1,5 kb de homología total (MM, LS y SL). Los brazos de homología extralargos no mejoraron la eficacia del direccionamiento genético (XX frente a LL).

Cuando solo se utilizó una ruptura de ADNbc, la longitud de homología fue más importante en el brazo opuesto al sitio de corte. Los vectores ^lM y LS mostraron un mayor direccionamiento genético con el ARNgc Derecho que con el Izquierdo; los vectores ML y Sl mostraron un mayor direccionamiento genético con el ARNgc Izquierdo que con el Derecho (figura 7(a)). Se observó el mismo patrón de resultados en iPSC PGP4, a pesar de que las eficiencias de direccionamiento fueron más bajas (figura 7(b)). Estos resultados son consistentes con un modelo de hibridación de cadena dependiente de síntesis Moehle, E. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 3055-3060 (2007), Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S y Gregory, P. D. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010), Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. y Boulton, S. J. Molecular Cell 47, 497-510 (2012): el cromosoma reseccionado fuera del ADNbc rompe las hibridaciones a la secuencia correspondiente en el plásmido del vector de direccionamiento. Se incorpora la secuencia Thy1 de ratón heteróloga en el vector de direccionamiento, formando un bucle D, hasta que se alcanza la secuencia humana en el brazo de homología opuesto. La longitud suficiente de este brazo de homología permite su búsqueda de homología posterior y la hibridación a la parte correspondiente del cromosoma para la resolución del bucle D.

Según este modelo, las secuencias de brazo de homología deberían extenderse fuera de los sitios de ruptura del ADNbc, con la secuencia de sustitución heteróloga presente en el interior. Los brazos de homología que abarcan ambos lados de cada sitio de corte no mejoraron la eficiencia del direccionamiento en iPSC PGP1 o PGP4 (figuras 8(a)-(c)). Dado que el vector de direccionamiento incluía ahora sitios diana intactos de ARNgc, se observó el doble de la muerte de iPSC (figura 8(b)), posiblemente debido a un abrumador número de rupturas de ADNbc en la célula. Cuando estos sitios de ARNgc fueron alterados por una sola deleción de pb, no se observó un aumento de la muerte celular, pero la eficacia del direccionamiento aún se redujo en comparación con el vector de direccionamiento mThy1 original. Sin desear quedar limitados por la teoría científica, los resultados no sugieren un mecanismo de HR predominante de las uniones dobles de Holliday, en la que ambos extremos de cada ADNbc se rompen en las secuencias homólogas correspondientes en el vector de direccionamiento, formando entrecruzamientos separados Chapman, J. R., Taylor, M. R. G. y Boulton, S. J Molecular Cell 47, 497-510 (2012).

EJEMPLO XII

Determinación de la relación entre la frecuencia y el tamaño de las deleciones mediadas por Cas9 en iPSC humanas

Se han conseguido deleciones de múltiples kilobases utilizando ZFN en líneas celulares tumorales, aunque la frecuencia de deleción generalmente disminuye con tamaños mayores de deleción Lee, H. J, Kim, E. y Kim, J. S. Genome Research 20, 81-89 (2010), Chen, F. et al. Nature Methods 8, 753-755 (2011). Para delinear la relación entre la frecuencia y el tamaño de las deleciones mediadas por Cas9 en iPSC humanas, se diseñaron dos ARNgc Izquierdos y diez Derechos direccionados a hThy1 a diversas distancias (figura 2a). Dado que no se utilizó un vector de direccionamiento, las células con ambos alelos hThy1 alterados se convirtieron en hThy1-(figura 2b). Las células nucleofectadas solo con el ARNgc Izquierdo se utilizaron para determinar el nivel de fondo de las células hThy1-(figura 2b, columna derecha). Mientras que la frecuencia de deleción homocigótica por encima del nivel de fondo tendía a ser mayor para distancias más cortas, hasta un 24 % para una deleción de 2,7 kb y un 8 % para una deleción de 86 kb, otros sitios ARNgc produjeron frecuencias de eliminación mucho más bajas, que no siempre correspondían a la medida (figura 2d).

La frecuencia de las deleciones monoalélicas se determinó utilizando una línea clonal mThy1+ hThy1+ de iPSC generada tal como se describe en las figuras 1(a)-(d). Dado que el alelo mThy1 no contiene los dos sitios ARNgc Izquierdos, solo el alelo hThy1 individual restante estaba sujeto a deleción. Si bien la frecuencia de las deleciones heterocigóticas fue ocasionalmente mayor que la de las deleciones homocigóticas del mismo par de ARNgc, generalmente estaban dentro de unos pocos puntos porcentuales (figuras 2(c)-(e)). Sin desear quedar limitados a la teoría científica, la actividad de nucleasa variable entre los sitios de ARNgc debido a diferencias en la temperatura de fusión, la expresión génica o el entorno de cromatina en el sitio diana Yang, L. et al. Nucleic Acid Research (2013). doi: 10.1093/nar/gkt555, probablemente no sea la causa de las variaciones observadas en la frecuencia de deleción génica, ya que ni el ARNgc L1 ni el L2 produjeron consistentemente más deleciones cuando se combinaron con el mismo ARNgc Derecho. Las variables específicas del par, tales como las microhomologías entre los dos sitios de corte de ADNbc, pueden influir en la frecuencia de eliminación.

EJEMPLO XIII

Sustitución de genes utilizando diferentes nucleasas y el diseño óptimo para vectores de sustitución de genes

Según ciertos aspectos, el diseño para vectores de sustitución de genes descrito en la presente memoria descriptiva puede utilizarse con diferentes nucleasas, dado que no es particular del sistema que genera la ruptura del ADN. Se han conseguido sustituciones eficaces de genes de múltiples kilobases utilizando nucleasas ZFN, TALEN y CRISPR (figuras 5(a)-(b) y datos no mostrados). Aunque las sustituciones de genes específicos con un sitio de corte fueron menos eficaces, la utilización de un solo sitio de corte reduce los genotipos potenciales y las mutaciones formadas fuera de la diana. Las técnicas actuales requieren que la ruptura del ADNbc se realice dentro de los 100 pb del sitio de mutación o inserción, lo que limita los sitios de ARNgc potencialmente disponibles Elliott, B., Richardson, C., Winderbaum, J., Nickoloff, J. A. y Jasin, M. Mol. Cell. Biol. 18, 93-101 (1998), Yang, L. et al. Nucleic Acid Research (2013). doi: 10.1093/nar/gkt555. Según ciertos aspectos, se pueden hacer sustituciones genéticas grandes utilizando una gama más amplia de sitios de nucleasas, ubicados alrededor del gen o dentro de los intrones. Otros sitios únicos de ARNgc son útiles dentro de los presentes procedimientos, evitando secuencias de codificación conservadas dentro de una familia de genes. Esto facilita la prueba de múltiples ARNgc para una región particular (figuras 2(a)-(e)). Según los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva, los brazos de homología flanqueantes de hasta 2 kb mejoran la eficacia del direccionamiento genético (figuras 7(a)-(b)).

Según ciertos aspectos, se dan a conocer procedimientos para realizar sustituciones de genes específicos (en oposición a las interrupciones o inserciones de genes) utilizando proteínas de unión al ADN que tienen actividad de nucleasa, tales como las nucleasas ZFN, TALEN y CRISPR/Cas para la edición del genoma. Según ciertos aspectos, se dan a conocer procedimientos para aislar clones dirigidos mediante cribado sin selección debido a las altas eficiencias de direccionamiento de la sustitución genética descrita en la presente memoria descriptiva. Según ciertos aspectos, los genes también podrían sustituirse con proteínas fluorescentes para que FACS pudiera seleccionar y clonar con éxito las células seleccionadas. Las sustituciones de genes con secuencias heterólogas serán particularmente beneficiosas para generar animales “knock-in” o modelos de enfermedades en líneas celulares humanas. Entre las aplicaciones particulares se incluyen: colocar construcciones comunicadoras en promotores endógenos; sustituir un gen endógeno con un transgén recodificado; o genómica comparativa entre diferentes especies.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para alterar un ácido nucleico diana en una célula que comprende

introducir en la célula uno o varios primeros ácidos nucleicos externos que codifican dos o más secuencias de ARN guía complementarias al ADN, en los que el ADN incluye el ácido nucleico diana,

introducir en la célula un segundo ácido nucleico externo que codifica una proteína Cas9 que se une al ADN y está guiado por las dos o más secuencias de ARN guía,

introducir en la célula una secuencia de ácido nucleico exógeno que se incluirá en la secuencia de ácido nucleico diana, en el que se expresan las dos o más secuencias de ARN guía y la proteína Cas9,

en el que las dos o más secuencias de ARN guía y la proteína Cas9 se localizan conjuntamente en el ADN y en el que la proteína Cas9 crea dos o más rupturas bicatenarias para eliminar una primera secuencia de ácido nucleico de interés y en el que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserta entre los dos puntos de ruptura del ácido nucleico diana,

en el que la primera secuencia de ácido nucleico de interés y la secuencia de ácido nucleico exógeno tienen una longitud de más de 1000 pares de bases, y

en el que la secuencia de ácido nucleico exógena que se incluirá en la secuencia de ácido nucleico diana está flanqueada por secuencias complementarias al área alrededor de la primera secuencia de ácido nucleico de interés.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico exógeno tiene una longitud de entre más de 1000 pares de bases y, aproximadamente, 100.000 pares de bases.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la primera secuencia de ácido nucleico de interés tiene una longitud de entre más de 1000 pares de bases y, aproximadamente, 10.000 pares de bases.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula eucariota.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que los dos o más ARN guía están entre, aproximadamente, 10 y, aproximadamente, 500 nucleótidos.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que los dos o más ARN guía están entre, aproximadamente, 20 y, aproximadamente, 100 nucleótidos.

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las dos o más secuencias de ARN guía son ARNcr.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que las dos o más secuencias de ARN guía son fusiones de ARNtrac-ARNcr.

10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el ADN es ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN viral o ADN exógeno.

11. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserta en la secuencia de ácido nucleico diana mediante recombinación homóloga.

12. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserta en la secuencia de ácido nucleico diana por unión de extremo no homólogo.

13. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula humana.

14. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula madre pluripotente inducida por humanos.