ES2744588T3 - Nuevos polipéptidos - Google Patents

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Fredrik Frejd
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Abstract

Dímero de unión a FcRn, que comprende una primera unidad monomérica, una segunda unidad monomérica y un enlazador de aminoácidos, en donde dichas primera y segunda unidades monoméricas comprende cada una un motivo de unión BM a FcRn, motivo que consiste en la secuencia de aminoácidos EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29 en donde, independientemente entre sí, X2 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X3 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X4 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X6 se selecciona de A, E, F, G, H, I, K, Q, R, S y V; X7 se selecciona de A, F, H, K, N, Q, R, S y V; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de F, W e Y; X18 se selecciona de A, D, E y N; X21 se selecciona de A, S, V y W; X25 se selecciona de D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X26 se selecciona de K y S; X28 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; y X29 se selecciona de D y R, y en donde dicho dímero de unión a FcRn se une a FcRn con una mayor capacidad de unión en comparación con dicho primer monómero o dicho segundo monómero solos.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos polipéptidos
Campo técnico de la invención
La presente descripción se refiere a dímeros de polipéptidos diseñados por ingeniería que tienen una afinidad de unión por el receptor Fc neonatal (en lo sucesivo denominado FcRn). La presente descripción también se refiere al uso de estos dímeros como agentes para modificar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de una biomolécula, por ejemplo un producto farmacéutico, y como agentes terapéuticos.
Antecedentes
El receptor Fc neonatal (FcRn) es una proteína heterodimérica que consiste en una cadena pesada similar a la MHC clase I de transmembrana (FcRn cadena a) y la cadena ligera de p2-microglobulina, esta última que también forma una parte de las moléculas de MHC clase I (Simister y Mostov (1989) Nature 337:184-7; Burmeister et al. (1994) Nature 372:379-83).
FcRn se ubica predominantemente en los endosomas y es capaz de unirse a la albúmina sérica y a la inmunoglobulina G (IgG) a un pH <6.5 y las libera a pH >7.0 (revisado en Roopenian (2007) Nat Rev Immunol 7:715-25).
FcRn lleva a cabo diversas tareas distintas en mamíferos (Roopenian, supra). FcRn está implicado en el reciclaje de la IgG y la albúmina sérica, por medio de endocitosis, evitando con esto su degradación en el lisosoma, proporcionándoles mayor semivida y mayor disponibilidad en la sangre que otras proteínas séricas. Cuando la IgG, la albúmina sérica y otras proteínas séricas experimentan pasivamente pinocitosis por las células en contacto con la sangre, el pH disminuye gradualmente en los endosomas formados, lo cual permite la unión de la IgG y la albúmina sérica al FcRn. Entonces, el receptor junto con su ligando unido, es transportado vía los endosomas de reciclaje de regreso a la membrana plasmática. Después de regresar a la membrana plasmática, el pH aumenta por encima de 7, en cuyo punto el ligando de unión se libera.
FcRn también está reconocido por su capacidad de transportar la IgG sobre barreras, tales como la placenta, el epitelio de las vías respiratorias superiores, la barrera hematoencefálica y el intestino delgado proximal.
En mamíferos, las propiedades del FcRn se utilizan para la transcitosis de la IgG desde la madre al feto vía la placenta, y para la transcitosis de la IgG desde la leche de la madre al torrente sanguíneo de un lactante en el intestino delgado proximal.
El patrón de expresión del FcRn difiere entre especies. Sin embargo, el FcRn es expresado ampliamente por células en la barrera hematoencefálica, el epitelio de las vías respiratorias superiores, los riñones y los endotelios vasculares, y mediante las células presentadoras de antígenos, así como mediante otras células de origen hematopoyético en la mayoría de especies (Roopenian (2007), supra).
Los anticuerpos y péptidos con afinidad hacia el FcRn (Liu et al. (2007) J Immunol 179:2999-3011, Mezo et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:2337-42) y la p2-microglobulina (Getman y Balthasar (2005) J Pharm Sci 94:718-29) se han desarrollado con vistas a inhibir la unión entre la IgG endógena y el FcRn. Se ha realizado otro enfoque para mutar la región Fc de la IgG para obtener una mayor afinidad por el FcRn (Petkova et al. (2006) Int Immunol 18:1759-69, Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23:1283-8).
La fusión al dominio Fc o a la albúmina es una estrategia utilizada ampliamente para aumentar la semivida in vivo de las proteínas. Sin embargo, el gran tamaño de estas proteínas de fusión afecta adversamente a la penetración en tejidos y reduce la especificidad para el participante de la fusión (Valles et al. (2011) J Interferon Cytokine Res 32:178-184). Por otro lado, se han realizado mutaciones en el fragmento Fc de anticuerpos administrados a primates no humanos para prolongar la semivida (Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279:6213-6). Sin embargo, este enfoque se limita únicamente en uso a anticuerpos terapéuticos, y no se puede extrapolar a otras proteínas terapéuticas, a menos que las proteínas en cuestión se fusionen a los fragmentos Fc, lo cual también da como resultado moléculas de mayor tamaño. Se han diseñado una serie de métodos químicos y recombinantes para mejorar la semivida de las proteínas, tales como la PEGilación y las fusiones genéticas de la proteína al dominio Fc de la IgG o la albúmina (Revisado en Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol 21:1186-1190). Se ha informado que la PEGilación de proteínas disminuye su potencia y contribuye a su inmunorreactividad.
Las proteínas de fusión Fc también se han utilizado para la administración oral y pulmonar mediada por el FcRn (Low et al., (2005) Human reproduction Jul; 20(7):1805-13), sin embargo, sigue habiendo problemas con relación a la penetración en tejidos y la especificidad reducida, debido al tamaño de las moléculas de fusión.
Por lo tanto, existe una gran necesidad en el sector por una provisión continua de moléculas con alta afinidad por el FcRn. En particular, son necesarias pequeñas moléculas de unión, las cuales, cuando estén presentes como un partícipe en la fusión, no afecten adversamente a las propiedades de las moléculas a las que se fusionan y no contribuyan a una inmunorreactividad.
Sumario de la invención
La presente descripción se basa en el descubrimiento inesperado de que los polipéptidos de unión al FcRn en forma dimérica exhiben propiedades de unión significativamente mejoradas al FcRn en comparación con los polipéptidos de unión al FcRn correspondientes en forma monomérica. Los inventores de la presente han encontrado que la mejora en las propiedades de unión de dichos polipéptidos de unión al FcRn en forma dimérica es mayor de la que se anticipó por la simple fusión de dos polipéptidos de unión al FcRn.
De esta forma, un objeto de la presente descripción es proporcionar nuevos agentes de unión al FcRn.
También un objeto de la presente descripción es proporcionar estos agentes para utilizarse en modificar las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de una biomolécula, por ejemplo un producto farmacéutico. También un objeto de la presente descripción es proporcionar estos agentes para su uso como agentes terapéuticos por sí mismos, solos o como un tratamiento de combinación.
Un objeto de la presente descripción es proporcionar una molécula que permita una fijación como objetivo eficiente del FcRn, al tiempo que satisfaga las desventajas mencionadas anteriormente y otras de las terapias actuales. Estos y otros objetos que son evidentes para el experto a partir de la presente descripción se cumplen mediante los diferentes aspectos de la invención según se reivindica en las reivindicaciones anexas y como se describe en general en la presente.
De esta forma, en el primer aspecto de la descripción, se proporciona un polipéptido de unión al receptor Fc neonatal (FcRn) en forma dimérica, es decir, un “dímero de unión al FcRn”, que comprende una primera unidad monomérica, una segunda unidad monomérica y un enlazador de aminoácidos, en donde cada una de dicha primera y segunda unidades monoméricas comprenden un motivo de unión (BM) al FcRn, motivo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
EX2 X3 X4 AXa X7 EIR WLPNLX16 X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
en donde, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W y Y;
X3 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X4 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
Xa se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X7 se selecciona de A, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X16 se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de F, W e Y;
X18 se selecciona de A, D, E y N;
X21 se selecciona de A, S, V y W;
X25 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X26 se selecciona de K y S;
X28 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; y
X29 se selecciona de D y R,
y en donde el dímero de unión al FcRn se une al FcRn con una mayor capacidad de unión en comparación con dicha primera unidad monomérica o dicha segunda unidad monomérica solas.
La definición anterior de una clase de motivos de unión al FcRn con secuencias relacionadas se basa en un análisis estadístico de una serie de variantes aleatorias de monómeros polipeptídicos de un armazón original, que se seleccionaron por su interacción con el FcRn en diversos experimentos de selección diferentes. El motivo de unión al FcRn identificado, o “BM”, corresponde a la región de unión diana del armazón original, región que constituye dos hélices alfa dentro de un dominio proteínico con paquete tri-helicoidal. En el armazón original, los residuos de aminoácidos variados de las dos hélices de BM constituyen una superficie de unión para la interacción con la porción Fc constante de los anticuerpos. En la presente descripción, la variación aleatoria de los residuos superficiales de unión y la posterior selección de variantes han reemplazado la capacidad de interacción con Fc con una capacidad para interacción con el FcRn.
En una realización, el motivo de unión al FcRn de al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas consiste en la secuencia de aminoácidos
EX2 X3 X4 AXa X7 EIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
en donde, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X3 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X4 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
Xa se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X7 se selecciona de A, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X17 se selecciona de F, W e Y;
X18 se selecciona de A, D, E y N;
X21 se selecciona de A, S, V y W;
X25 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; y
X28 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una realización del primer aspecto de la descripción, dicho motivo de unión de al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas consiste en la secuencia de aminoácidos
EX2 X3 X4 AXa X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
en donde, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X3 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X4 se selecciona de A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
Xa se selecciona de A, E, F, G, H, I, K, Q, R, S y V;
X7 se selecciona de A, F, H, K, N, Q, R, S y V;
Xi a se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de F, W e Y;
X18 se selecciona de A, D, E y N;
X21 se selecciona de A, S, V y W;
X25 se selecciona de D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X2a se selecciona de K y S;
X28 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; y
X29 se selecciona de D y R.
En otra realización del primer aspecto, dicho motivo de unión de al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas consiste en la secuencia de aminoácidos, en donde, independientemente entre sí,
X2 se selecciona
Figure imgf000004_0001
Q, R, S, T, V, W e Y;
X3 se selecciona Q, R, S, T, V, W e Y;
X4 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X6 se selecciona de A, E, F, G, H, I, K, Q, R y S;
X7 se selecciona de A, F, H, K, N, Q, R, S y V;
X16 se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de F e Y;
X18 es D;
X21 es V;
X25 se selecciona de D, E, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X26 se selecciona de K y S;
X28 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V y W y
X29 se selecciona de D y R.
En otra realización del primer aspecto, dicho BM en al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de
i) EX2 X3 X4 AXa HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
en donde, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X3 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V e Y;
X4 se selecciona de A, D, E, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V e Y;
X6 se selecciona de A, G, K, R, S y V;
X17 se selecciona de F, W e Y;
X18 se selecciona de A, D, E y N;
X21 se selecciona de A, S, V y W;
X25 se selecciona de D, G, H, K, L, N, R, V y W;
X28 se selecciona de A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T, W e Y;
y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 96% de identidad con la secuencia.
Todavía en otra realización de dicho aspecto, el BM en la secuencia i) consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
EX2 X3 X4 AX6 HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
en donde, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de A, D, E, F, N, Q, R, S y W;
X3 se selecciona de D, E, G, H, K, M, N, Q, S y T;
X4 se selecciona de A, D, E, G, N, Q, R, S, T, V e Y;
X6 se selecciona de A, G, S y V;
X17 se selecciona de F, W e Y;
X18 se selecciona de A, D, E y N;
X21 se selecciona de A, S, V y W;
X25 se selecciona de D, G, H, K, L, N, R y V; y
X28 se selecciona de A, E, H, L, N, Q, R, S, T, W e Y.
Como se dará cuenta el experto, la función de cualquier polipéptido, incluyendo la capacidad de unión al FcRn del dímero de la presente descripción, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Por tanto, es posible realizar cambios menores a la secuencia de aminoácidos en un polipéptido sin afectar la función de la misma. De esta forma, la descripción abarca variantes del dímero de unión al FcRn, por ejemplo, las variantes en donde al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas se modifica pero se conservan las características de unión al FcRn.
Por lo tanto, como se describió anteriormente, también se abarca por la presente descripción un dímero de unión al FcRn, en donde al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas comprenden un motivo de unión (BM) al FcRn que comprende una secuencia de aminoácidos con el 96% o más de identidad a un polipéptido como se definió en i).
En algunas realizaciones, estos cambios se pueden realizar en todas las posiciones de las secuencias del BM como se describe en la presente. En otras realizaciones, estos cambios se pueden realizar sólo en las posiciones no variables, también designadas residuos de aminoácidos del armazón. En estos casos, no se permiten cambios en las posiciones variables, es decir, las posiciones designadas con una “X” en la secuencia i). Por ejemplo, es posible que un residuo de aminoácidos que pertenezca a un cierto agrupamiento funcional de residuos de aminoácidos (por ejemplo, hidrofóbico, hidrofílico, polar, etc.) se pudiera intercambiar por otro residuo de aminoácido proveniente del mismo grupo funcional.
La expresión “% de identidad”, en el sentido en el que se utiliza a todo lo largo de la memoria descriptiva, por ejemplo, se puede calcular como sigue. La secuencia de consulta se alinea a la secuencia diana utilizando el algoritmo CLUSTAL W (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Research 22: 4673-4680). Se realiza una comparación sobre la ventana correspondiente a lo más corto de las secuencias alineadas. La más corta de las secuencias alineadas en algunos casos puede ser la secuencia diana. En otros casos, la secuencia de consulta puede constituir la más corta de las secuencias alineadas. Los residuos de aminoácidos en cada posición se comparan, y el porcentaje de posiciones en las secuencias de consulta que tienen correspondencias idénticas en la secuencia diana se reseña como el % de identidad.
En el sentido en el que se utiliza en la presente “Xn” y “Xm” se utilizan para indicar los aminoácidos en las posiciones n y m en la secuencia del BM como se definió anteriormente, en donde n y m son números enteros que indican la posición de un aminoácido dentro de dicha secuencia según se cuenta desde extremo N-terminal de dicha secuencia. Por ejemplo, X3 y X7 indican el aminoácido en la posición tres y siete, respectivamente, desde el extremo N-terminal de dicho B m .
En realizaciones de acuerdo con el primer aspecto, se proporciona un dímero de unión al FcRn, en el cual al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas comprenden un motivo de unión al FcRn, en donde Xn se selecciona independientemente de un grupo de posibles residuos de acuerdo con la Tabla 1. El experto apreciará que Xn se puede seleccionar de uno cualquiera de los grupos listados de los posibles residuos y esta selección es independiente de la selección de los aminoácidos en Xm, en donde n^m. De esta forma, cualquiera de los residuos posibles listados en la posición Xn en la Tabla 1 se puede combinar independientemente con cualquiera de los residuos posibles descritos aquí en cualquier otra posición variable en la Tabla 1.
El experto apreciará que la Tabla 1 se debe leer como sigue: En una realización de acuerdo con el primer aspecto, se proporciona un dímero de unión al FcRn, en donde dicha primera unidad monomérica y dicha segunda unidad monomérica comprende cada una un motivo de unión (BM) al FcRn y en donde el residuo de aminoácido “Xn” en el BM de al menos una de dicha primera unidad monomérica y dicha segunda unidad monomérica se selecciona de “Posibles residuos”. El experto apreciará que el residuo de aminoácidos “Xn” en el BM de la primera unidad monomérica se selecciona independientemente del residuo de aminoácido “Xn” en el BM de la segunda unidad monomérica. De esta forma, la Tabla 1 describe diversas variantes específicas e individualizadas de la primera unidad monomérica y la segunda unidad monomérica de la presente descripción. Por ejemplo, en una realización, se proporciona un dímero de unión al FcRn, que comprende al menos una primera o segunda unidad monomérica, en donde X2 en el BM se selecciona de A, I, L, N, Q, S, T, V y W, y en otra realización, se proporciona un dímero de unión al FcRn, que comprende al menos una primera o segunda unidad monomérica, en donde X2 en BM se selecciona de A, I, L y Q. Para evitar dudas, dichas primera y segunda unidades monoméricas se pueden combinar libremente en otras realizaciones. Por ejemplo, en una modalidad, X3 se selecciona de A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, R, S y T, mientras que X7 se selecciona de A y H, y X25 se selecciona de H, L, R, V y W.
T a b l a 1 : P o s i b l e s r e s i d u o s e n l a s p o s i c i o n e s v a r i a b l e s d e l m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n d e l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n .
Figure imgf000007_0001
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En una realización, se proporciona un dímero de unión al FcRn, en donde X6X7 se selecciona de AH y GH en al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas. En una realización, X6X7 es AH. En una realización, X6X7 es GH. En una realización, X17X18 se selecciona de FD e YD en al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas. En una realización, X17X18 es FD.
En una realización más específica que define una subclase de los dímeros de unión al FcRn, la secuencia del BM de al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas cumple al menos tres de las seis condiciones I­ VI:
I. x6 se selecciona de A, G, K y S, tal como en particular A;
II. X7es H;
III. X17 se selecciona de F e Y, tal como en particular F;
IV. X16 es D;
V. X21 se selecciona de V y W, tal como, en particular, V;
VI. X25 se selecciona de H y R, tal como, en particular, H.
En algunos ejemplos de un dímero de unión al FcRn de acuerdo con el primer aspecto, dicha secuencia cumple con al menos cuatro de las seis condiciones I-VI. Más específicamente, la secuencia puede cumplir con al menos cinco de las seis condiciones I-VI, tal como la totalidad de las seis condiciones I-VI.
En una realización, las secuencias del BM de dichas primera y segunda unidades monoméricas son idénticas. En otra realización, las secuencias del BM de la primera y segunda unidades monoméricas son diferentes.
Como se describe en detalle en la sección experimental más adelante, la selección de las unidades monoméricas del polipeptido de unión al FcRn ha conducido a la identificación de una serie de secuencias con motivo de unión (BM) al FcRn individuales. Estas secuencias constituyen variantes individuales útiles como la primera y segunda unidades monoméricas como se describe en la presente. Las secuencias de los motivos de unión (BMs) al FcRn individuales se presentan en la Figura 1 y corresponden a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-353. Por lo tanto, en una realización del dímero de unión al FcRn de acuerdo con el primer aspecto, al menos una de dichas primera y segunda unidades monoméricas comprende un BM correspondiente a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-353, tal como se selecciona a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17-352. En una realización, dicha secuencia del BM corresponde a la secuencia desde la posición 8 hasta la posición 36 en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-15, las SEQ ID NO: 17-140 y la SEQ ID NO: 353, tal como el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17-140. En e n e l d o m i n i o o r i g i n a l . P o r e j e m p l o , s i n d e s e a r e s t a r v i n c u l a d o s p o r l a t e o r í a , s e c r e e q u e e l B M c o n s t i t u y e d o s d e l a s t r e s h é l i c e s d e u n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l , y p o r lo t a n t o p u e d e r e e m p l a z a r u n m o t i v o b i - h e l i c o i d a l d e n t r o d e c u a l q u i e r p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l . C o m o c o m p r e n d e r á e l e x p e r t o , e l r e e m p l a z o d e d o s h é l i c e s d e l d o m i n i o c o n p a q u e t e t r i -h e l i c o i d a l p o r l a s d o s h é l i c e s d e l B M s e t i e n e q u e r e a l i z a r p a r a n o a f e c t a r l a e s t r u c t u r a b á s i c a d e l p o l i p é p t i d o . E s d e c i r , e l p l e g a d o g e n e r a l d e l a c a d e n a p r i n c i p a l C a d e l p o l i p é p t i d o d e a c u e r d o c o n e s t a r e a l i z a c i ó n d e l a i n v e n c i ó n e s p r á c t i c a m e n t e e l m i s m o q u e e l d e l d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l d e l c u a l f o r m a p a r t e , p o r e j e m p l o , q u e t i e n e l o s m i s m o s e l e m e n t o s d e l a e s t r u c t u r a s e c u n d a r i a e n e l m i s m o o r d e n , e t c . D e e s t a f o r m a , u n B M d e a c u e r d o c o n l a d e s c r i p c i ó n “f o r m a p a r t e ” d e u n d o m i n i o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l s i e l p o l i p é p t i d o d e a c u e r d o c o n e s t a r e a l i z a c i ó n d e l a s p e c t o t i e n e e l m i s m o p l e g a d o q u e e l d o m i n i o o r i g i n a l , lo q u e i m p l i c a q u e s e c o m p a r t e n l a s p r o p i e d a d e s e s t r u c t u r a l e s b á s i c a s , a a q u e l l a s p r o p i e d a d e s , p o r e j e m p l o , q u e d a n p o r r e s u l t a d o e s p e c t r o s C D s i m i l a r e s . E l e x p e r t o s e r á c o n s c i e n t e d e o t r o s p a r á m e t r o s q u e s e a n r e l e v a n t e s .
E n r e a l i z a c i o n e s p a r t i c u l a r e s , e l m o t i v o d e u n i ó n ( B M ) a l F c R n e n a l m e n o s u n o d e d i c h o s p r i m e r o y s e g u n d o m o n ó m e r o s f o r m a a s í p a r t e d e u n d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l . P o r e j e m p l o , e l B m p u e d e c o n s t i t u i r e s e n c i a l m e n t e d o s h é l i c e s a l f a c o n u n b u c l e d e i n t e r c o n e x i ó n d e n t r o d e l d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i -h e l i c o i d a l . E n r e a l i z a c i o n e s p a r t i c u l a r e s , d i c h o d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l s e s e l e c c i o n a d e l o s d o m i n i o s d e p r o t e í n a s c o n r e c e p t o r e s b a c t e r i a n o s . E j e m p l o s n o l i m i t a n t e s d e e s t o s d o m i n i o s s o n l o s c i n c o d i f e r e n t e s d o m i n i o s t r i - h e l i c o i d a l e s d e l a P r o t e í n a A p r o v e n i e n t e d e S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s , t a l c o m o e l d o m i n i o B , y d e r i v a d o s d e l o s m i s m o s . E n a l g u n a s r e a l i z a c i o n e s , e l d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l e s u n a v a r i a n t e d e l a p r o t e í n a Z , q u e s e d e r i v a d e l d o m i n i o B d e l a P r o t e í n a A e s t a f i l o c o c a l .
E n r e a l i z a c i o n e s e n d o n d e e l m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n t a l c o m o s e d e s c r i b e e n l a p r e s e n t e f o r m a p a r t e d e u n d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l , a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n p u e d e c o m p r e n d e r u n m ó d u l o d e u n i ó n ( B M o d ) , m ó d u l o q u e c o n s i s t e e n u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :
iii) K -[ B M ] - D P S Q S X a X b L L X c E A K K L X d X e X f Q ; e n d o n d e
[ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n e e n l a p r e s e n t e , c o n l a c o n d i c i ó n d e q u e X 29 s e a D;
X a s e s e l e c c i o n a d e A y S ;
X b s e s e l e c c i o n a d e N y E ;
X c s e s e l e c c i o n a d e A , S y C ;
X d s e s e l e c c i o n a d e E , N y S ;
X e s e s e l e c c i o n a d e D , E y S ;
X f s e s e l e c c i o n a d e A y S ; y
iv ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s e l 93 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a p o r iii).
E n r e a l i z a c i o n e s e n d o n d e e l m o t i v o d e u n i ó n d e l F c R n c o m o s e d e s c r i b e e n l a p r e s e n t e f o r m a p a r t e d e u n d o m i n i o p r o t e í n i c o c o n p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l , a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n p u e d e c o m p r e n d e r u n m ó d u l o d e u n i ó n ( B M o d ) , e l m ó d u l o c o n s i s t e e n u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :
v ) K -[ B M ] - Q P E Q S X a X b L L X c E A K K L X d X e X f Q ; e n d o n d e
[ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n e e n l a p r e s e n t e , c o n l a c o n d i c i ó n d e q u e X 29 s e a R ;
X a s e s e l e c c i o n a d e A y S ;
X b s e s e l e c c i o n a d e N y E ;
X c s e s e l e c c i o n a d e A , S y C ;
X d s e s e l e c c i o n a d e E , N y S ;
X e s e s e l e c c i o n a d e D , E y S ;
X f s e s e l e c c i o n a d e A y S ;
y v i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s e l 93 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a p o r v ) . C o m o s e a n a l i z ó a n t e r i o r m e n t e , l o s p o l i p é p t i d o s q u e c o m p r e n d e n c a m b i o s m e n o r e s e n c o m p a r a c i ó n c o n l a s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s a n t e r i o r e s q u e n o a f e c t a n e n g r a n m e d i d a l a e s t r u c t u r a t e r c i a r i a y l a f u n c i ó n d e l a s m i s m a s t a m b i é n q u e d a n d e n t r o d e l a l c a n c e d e l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n . D e e s t a f o r m a , e n a l g u n a s r e a l i z a c i o n e s , l a s e c u e n c i a iv) o l a s e c u e n c i a v i ) t i e n e a l m e n o s e l 95 % , p o r e j e m p l o a l m e n o s e l 97 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a p o r iii) y v ) , r e s p e c t i v a m e n t e .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X a e s A . E n u n a r e a l i z a c i ó n a l t e r n a t i v a , X a e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s S . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X a e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s A . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X a e n la s e c u e n c i a iii) o v ) e s S .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X b e s N . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X b e n la s e c u e n c i a iii) o v ) e s E .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X c e s A . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X c e n la s e c u e n c i a iii) o v ) e s S . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X c e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s C .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X d e s E . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X d e n la s e c u e n c i a iii) o v ) e s N . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s S .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X e e s D . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X e e n la s e c u e n c i a iii) o v ) e s E . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X e e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s S .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X d X e s e s e l e c c i o n a d e E E , E S , S D , s E y S S . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X d X e e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s E S . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X d X e e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s S E . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X d X e e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) e s S D .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X f e s A . E n u n a r e a l i z a c i ó n , X f e n la s e c u e n c i a iii) o v ) e s S .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , e n d o n d e X a e s A ; X b e s N; X c e s A y X f e s A . E n u n a r e a l i z a c i ó n , e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , X a e s S ; X b e s E ; X c e s A y X f e s A .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , X a e s A ; X b e s N ; X c e s C y X f e s A .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , X a e s S ; X b e s E ; X c e s S y Xf e s S .
E n u n a r e a l i z a c i ó n m o d a l i d a d , e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , X a e s S ; X b e s E ; X c e s C y X f e s S .
Figure imgf000011_0001
E n u n a r e a l i z a c i ó n , e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , X a e s A ; X b e s N ; X c e s C ; X d X e e s E S y X f e s A .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , e n l a s e c u e n c i a iii) o v ) , X a e s S ; X b e s E ; X c e s S ; X d X e e s E S y X f e s S .
u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n :
x i ) F N K -[ B M ] - D P S Q S A N L L X c E A K K L N D A Q A P ; e n d o n d e [ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n i ó a n t e r i o r m e n t e y X c s e s e l e c c i o n a d e A y C ; y x i i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s e l 94 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a p o r x i ) .
C o m o s e a n a l i z ó a n t e r i o r m e n t e , l o s p o l i p é p t i d o s q u e c o m p r e n d e n c a m b i o s m e n o r e s e n c o m p a r a c i ó n c o n l a s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s a n t e r i o r e s q u e n o a f e c t a n e n g r a n m e d i d a a l a e s t r u c t u r a t e r c i a r i a y a l a f u n c i ó n d e l a s m i s m a s t a m b i é n q u e d a n d e n t r o d e l a l c a n c e d e l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n . D e e s t a f o r m a , e n a l g u n a s r e a l i z a c i o n e s , e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n i ó a n t e r i o r m e n t e p u e d e c o m p r e n d e r u n a s e c u e n c i a vii i), x ) o x i i ) q u e t i e n e a l m e n o s e l 96 % , t a l c o m o a l m e n o s e l 98 % d e i d e n t i d a d c o n u n a s e c u e n c i a d e f i n i d a p o r v i i ) , ix ) o x i ) , r e s p e c t i v a m e n t e . E n a l g u n a s r e a l i z a c i o n e s d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s p u e d e c o m p r e n d e r u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :
A D N N F N K -[ B M ] - D P S Q S A N L L S E A K K L N E S Q A P K ;
A D N K F N K -[ B M ] - D P S Q S A N L L A E A K K L N D A Q A P K ;
A D N K F N K -[ B M ] - D P S V S K E I L A E A K K L N D A Q A P K ;
A D A Q Q N N F N K -[ B M ] - D P S Q S T N V L G E A K K L N E S Q A P K ;
A Q H D E -[ B M ] - D P S Q S A N V L G E A Q K L N D S Q A P K ;
V D N K F N K -[ B M ] - D P S Q S A N L L A E A K K L N D A Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S E S S E L L S E A K K L N K S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L N D A Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L N D S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P ;
A E A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
A E A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L N D A Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P ;
A E A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
A E A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L S E A Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - Q P E Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L E S A Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - Q P E Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L S D A Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - Q P E Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
V D A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L N D A Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
V D A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L S E A Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - Q P E Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L E S A Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - Q P E Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L S D A Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - Q P E Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L N K A Q A P K ;
A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L A E A K K L N K A Q A P K ; y
A D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
e n d o n d e [ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n i ó a n t e r i o r m e n t e .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n p u e d e c o m p r e n d e r u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :
x ii i) A E A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ; e n d o n d e [ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n i ó a n t e r i o r m e n t e ; y x i v ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s e l 94 % d e i d e n t i d a d c o n l a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n x ii i).
E n u n a r e a l i z a c i ó n , l a s e c u e n c i a x ii i) s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n l a s S E Q ID N O : 354 - 357 , t a l c o m o e n p a r t i c u l a r s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n l a s S E Q ID N O : 354 y 357.
E n u n a r e a l i z a c i ó n , t a n t o d i c h a p r i m e r a c o m o d i c h a s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n u n a s e c u e n c i a xi i i) s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n l a s S E Q ID N O : 354 - 357 , t a l c o m o e n p a r t i c u l a r l a s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n l a s S E Q ID N O : 354 y 357. E n u n a r e a l i z a c i ó n , l a s e c u e n c i a x ii i) e s l a S E Q ID N O : 354 t a n t o e n d i c h a p r i m e r a c o m o d i c h a s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s . E n u n a r e a l i z a c i ó n , l a s e c u e n c i a x ii i) e s l a S E Q ID N O : 35 7 t a n t o e n d i c h a p r i m e r a c o m o d i c h a s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n p u e d e c o m p r e n d e r u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :
x v ) A E A K F A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
e n d o n d e [ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n i ó a n t e r i o r m e n t e ; y
x v i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s e l 94 % d e i d e n t i d a d c o n l a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n x v ) .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , l a s e c u e n c i a x v ) s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n l a s S E Q ID N O : 365 - 367. E n u n a r e a l i z a c i ó n , l a s e c u e n c i a x v ) e s l a S E Q ID N O : 365 , l a S E Q iD n O : 366 o l a S E Q ID N O : 367.
E n u n a r e a l i z a c i ó n , a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n p u e d e c o m p r e n d e r u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d a d e :
x v i i ) V D A K Y A K -[ B M ] - D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
e n d o n d e [ B M ] e s u n m o t i v o d e u n i ó n a l F c R n c o m o s e d e f i n i ó a n t e r i o r m e n t e ; y
x v i i i ) u n a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s q u e t i e n e a l m e n o s e l 94 % d e i d e n t i d a d c o n l a s e c u e n c i a d e f i n i d a e n x v i i ) .
S E Q ID N O : 75 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 20 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 23 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 23 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 65 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 75 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 65 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 75 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 65 ; S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75 ; S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 354 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 354 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 367 ; o S E Q ID N O : 367 y S E Q ID N O : 367 , r e s p e c t i v a m e n t e . E n u n a r e a l i z a c i ó n , l a p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 1; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 20 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 23 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 20 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 23 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 23 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 354 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 354 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 367 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 366 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 367 ; o S E Q ID N O : 367 y S E Q ID N O : 367 , r e s p e c t i v a m e n t e . E n o t r a r e a l i z a c i ó n , l a p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s S E Q ID N O : 1 y S E Q ID N O : 1; S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 20 ; S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 23 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 354 y S E Q ID N O : 354 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 366 ; o S E Q ID N O : 367 y S E Q ID N O : 367 , r e s p e c t i v a m e n t e . T o d a v í a e n o t r a r e a l i z a c i ó n , l a p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 20 ; S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 41 ; S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 44 ; S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 357 ; S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 366 ; o S E Q ID N O : 367 y S E Q ID N O : 367 , r e s p e c t i v a m e n t e .
T o d a v í a e n o t r a r e a l i z a c i ó n , l a p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e n l a s S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 366 ; o S E Q ID N O : 367 y S E Q ID N O : 367 , r e s p e c t i v a m e n t e .
E n b e n e f i c i o d e l a c l a r i d a d , l a d e s i g n a c i ó n d e l a p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s e n e l s e n t i d o e n e l q u e s e u t i l i z a a t o d o lo l a r g o d e l a p r e s e n t e d e s c r i p c i ó n s e r e a l i z a p o r r a z o n e s d e c l a r i d a d p a r a d i s t i n g u i r l a s , y n o s e p r e t e n d e h a c e r r e f e r e n c i a a l o r d e n r e a l d e l a s u n i d a d e s m o n o m é r i c a s e n l a c a d e n a p o l i p e p t í d i c a d e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n . D e e s t a f o r m a , p o r e j e m p l o , d i c h a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a p u e d e a p a r e c e r e n e l e x t r e m o N o e n e l e x t r e m o C d e u n a c a d e n a p o l i p e p t í d i c a , c o n r e s p e c t o a d i c h a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a .
C o m o c o m p r e n d e r á e l e x p e r t o , l a c o n s t r u c c i ó n d e u n a p r o t e í n a d e f u s i ó n i m p l i c a c o n f r e c u e n c i a u t i l i z a r e n l a z a d o r e s e n t r e l o s r e s t o s f u n c i o n a l e s q u e s e f u s i o n a r á n . E l e x p e r t o e s c o n s c i e n t e d e l o s d i f e r e n t e s t i p o s d e e n l a z a d o r e s c o n d i f e r e n t e s p r o p i e d a d e s , t a l e s c o m o l o s e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s f l e x i b l e s , e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s r í g i d o s y e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s e s c i n d i b l e s . L o s e n l a z a d o r e s s e h a n u t i l i z a d o p o r e j e m p l o , p a r a a u m e n t a r l a e s t a b i l i d a d o m e j o r a r e l p l e g a d o d e l a s p r o t e í n a s d e f u s i ó n , p a r a a u m e n t a r l a e x p r e s i ó n , m e j o r a r l a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a , p e r m i t i r l a f i j a c i ó n d e l o b j e t i v o y a l t e r a r l a f a r m a c o c i n é t i c a d e l a s p r o t e í n a s d e f u s i ó n .
D e e s t a f o r m a , e n u n a r e a l i z a c i ó n d e l p r i m e r a s p e c t o , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n t a l c o m o s e d e f i n e e n l a p r e s e n t e , e n d o n d e e l e n l a z a d o r s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s f l e x i b l e s , e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s r í g i d o s y e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s e s c i n d i b l e s . E n u n a r e a l i z a c i ó n d e u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n t a l c o m o s e d e f i n e e n l a p r e s e n t e , e l e n l a z a d o r e s t á d i s p u e s t o e n t r e l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a y l a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a . E l e x p e r t o a p r e c i a r á q u e l a p r e s e n c i a d e u n e n l a z a d o r d i s p u e s t o e n t r e l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a y l a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a n o e x c l u y e l a p r e s e n c i a d e e n l a z a d o r e s a d i c i o n a l e s .
E n l a z a d o r e s f l e x i b l e s s e u t i l i z a n c o n f r e c u e n c i a e n l a t é c n i c a c u a n d o l o s d o m i n i o s u n i d o s r e q u i e r e n u n c i e r t o g r a d o E n e l s e n t i d o e n e l q u e s e u t i l i z a e n l a p r e s e n t e , l a e x p r e s i ó n “m a y o r c a p a c i d a d d e u n i ó n ” e n e l c o n t e x t o d e a f i n i d a d d e u n i ó n p o r e l F c R n o l a u n i ó n d e F c R n s e d e b e i n t e r p r e t a r e n e l c o n t e x t o d e c u a l q u i e r a d e u n o o m á s d e l o s a n á l i s i s m e n c i o n a d o s a n t e r i o r m e n t e p a r a u n a e v a l u a c i ó n d e a f i n i d a d d i r e c t a o i n d i r e c t a .
E n e l s e n t i d o e n e l q u e s e d e f i n e e n l a p r e s e n t e , e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n s e u n e a l F c R n c o n u n a m a y o r c a p a c i d a d d e u n i ó n e n c o m p a r a c i ó n c o n d i c h a p r i m e r a o s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a s o l a . E n u n a r e a l i z a c i ó n , e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n s e p u e d e u n i r a l F c R n c o n a l m e n o s 2 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 3 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 4 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 6 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 7 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 8 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 9 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 25 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 50 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 100 v e c e s , m a y o r c a p a c i d a d q u e l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a o s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a c o r r e s p o n d i e n t e s o l a . E s t a r e l a c i ó n p u e d e s e r v e r d a d e r a s t a n t o a u n p H 6 , 0 c o m o a u n p H 7 , 4 , o a u n p H 6 , 0 ú n i c a m e n t e , o a u n p H 7 , 4 ú n i c a m e n t e .
Figure imgf000020_0001
E n a l g u n a s r e a l i z a c i o n e s , e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n s e p u e d e u n i r a l F c R n d e t a l f o r m a q u e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l F c R n y e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n s e a a l m e n o s 2 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 3 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 4 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 25 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 50 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 100 v e c e s m e n o r , t a l c o m o a l m e n o s 1000 v e c e s m e n o r e n c o m p a r a c i ó n c o n e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l F c R n y l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a o l a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a c o r r e s p o n d i e n t e s o l a .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , q u e t i e n e l a c a p a c i d a d d e u n i r s e a l F c R n a u n p H 6 , 0 d e t a l f o r m a q u e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n s e a a lo s u m o d e 1 x 10 -7 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -8 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -9 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -10 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -11 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -12 M . U n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n d e a c u e r d o c o n e s t a r e a l i z a c i ó n p o d r í a u n i r s e , o p e r m a n e c e r u n i d o , a l F c R n e n c o n d i c i o n e s d e p H á c i d o , t a l c o m o p H 6 , 0 , p o r e j e m p l o e n u n e n d o s o m a . S i e s t e p o l i p é p t i d o i n g r e s a r a e n u n e n t o r n o i n t r a c e l u l a r c a d a v e z m á s á c i d o , s e p o d r í a r e c i c l a r a l a m e m b r a n a p l a s m á t i c a a t r a v é s d e s u i n t e r a c c i ó n c o n e l F c R n , y d e e s t a f o r m a e v i t a r l a d e g r a d a c i ó n .
E n u n a r e a l i z a c i ó n , e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n y e l F c R n a p H 7 , 4 e s m a y o r q u e e l v a l o r K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 6 , 0. D e e s t a f o r m a , e l p o l i p é p t i d o d e u n i ó n a l F c R n p o d r í a u n i r s e a l F c R n c o n m a y o r a f i n i d a d a p H 6 , 0 q u e a p H 7 , 4. E n u n a r e a l i z a c i ó n , e l v a l o r K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 7 , 4 e s a l m e n o s 2 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 25 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 50 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 100 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 1000 v e c e s m a y o r q u e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n a p H 6 , 0.
Figure imgf000020_0002
E n u n a r e a l i z a c i ó n , e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n y e l F c R n a p H 7 , 4 e s a l m e n o s 1 x 1 0 -10 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 -9 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 -8 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 -7 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 -6 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 -5 M . E n a l g u n a s r e a l i z a c i o n e s , e l ú n i c o c r i t e r i o p a r a l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n y e l F c R n a p H 7 , 4 e s q u e c u a l q u i e r d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n q u e s e h a y a u n i d o a l F c R n d u r a n t e c o n d i c i o n e s m á s á c i d a s s e l i b e r e m á s r á p i d a m e n t e d e l F c R n c u a n d o a u m e n t a e l v a l o r d e p H .
E n u n a r e a l i z a c i ó n a l t e r n a t i v a , s e p r o p o r c i o n a u n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n , p a r a e l c u a l e l K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 7 , 4 e s i g u a l o m e n o r q u e e l K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 6 , 0. U n d í m e r o d e u n i ó n a l F c R n d e a c u e r d o c o n e s t a r e a l i z a c i ó n p o d r í a u n i r s e o p e r m a n e c e r u n i d o a l F c R n e n c o n d i c i o n e s d e p H á c i d o ( e s d e c i r , p o d r í a t e n e r u n a c o n s t a n t e d e d i s o c i a c i ó n a p H 6 , 0 , q u e s e a s u f i c i e n t e m e n t e l e n t a p a r a e v i t a r l a l i b e r a c i ó n ) , p o r e j e m p l o e n e l e n d o s o m a , a s í c o m o e n c o n d ic io n e s d e pH n e u tro o lig e ra m e n te b á s ic o , p o r e je m p lo e n la m e m b ra n a p la s m á tic a . En u n a m o d a lid a d m á s e s p e c íf ic a , e l v a lo r K d d e d ic h a in te ra c c ió n a pH 7 ,4 e s a l m e n o s 2 v e c e s m e n o r, ta l c o m o al m e n o s 5 v e c e s m e n o r, ta l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s m e n o r, ta l c o m o a l m e n o s 50 v e c e s m e n o r, ta l c o m o a l m e n o s 100 v e c e s m e n o r q u e e l v a lo r K d d e la in te ra c c ió n a pH 6 ,0.
E n o tra re a liz a c ió n , s e p ro p o rc io n a un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n , q u e e s c a p a z d e u n irs e a l F c R n a pH 7 ,4 d e ta l fo rm a q u e e l v a lo r K d d e la in te ra c c ió n s e a a lo s u m o d e 1 x 10 -7 M, ta l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -8 M, ta l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -9 M, ta l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -10 M , ta l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -11 M , ta l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 -12 M . U n d ím e ro d e u n ió n a l F c R n d e a c u e rd o co n e s ta re a liz a c ió n p o d ría u n irs e o p e rm a n e c e r u n id o d u ra n te un t ie m p o p ro lo n g a d o a l F c R n en c o n d ic io n e s d e pH n e u tro o l ig e ra m e n te b á s ic o , ta l c o m o pH 7 ,4 , p o r e je m p lo e n la m e m b ra n a p la s m á tic a . La e x p re s ió n “ p e rm a n e c e r u n id o ” se d e b e e n te n d e r c o n e l s ig n if ic a d o d e u n a in te ra c c ió n q u e te n g a u n a c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n le n ta a c o n d ic io n e s d e te rm in a d a s .
E n g e n e ra l, e l e x p e r to s a b e q u e e l v a lo r K d d e u n a in te ra c c ió n s e d e f in e c o m o la re la c ió n e n tre la c o n s ta n te de d is o c ia c ió n (k Off) y la c o n s ta n te d e a f in id a d (k on ). D e e s ta fo rm a , un a lto v a lo r K d p u e d e s e r d e b id o y a s e a a u n a a lta koff, a u n a b a ja k on o a a m b a s , e in v e rs a m e n te , un b a jo v a lo r K d p u e d e s e r d e b id o a y a s e a u n a b a ja koff, u n a a lta kon o a a m b a s .
E l e x p e r to e n te n d e rá q u e s e p u e d e n re a liz a r d iv e rs a s m o d if ic a c io n e s y /o a d ic io n e s a un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r a s p e c to d e s c r ito e n la p re s e n te p a ra a d a p ta r e l p o lip é p tid o a u n a a p lic a c ió n e s p e c íf ic a s in a p a r ta rs e d e l a lc a n c e d e la p re s e n te d e s c r ip c ió n .
P o r e je m p lo , en u n a re a liz a c ió n , se p ro p o rc io n a un d ím e ro d e u n ió n a F c R n c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n a l m e n o s un a m in o á c id o a d ic io n a l e n e l e x tre m o C - te rm in a l y /o e l e x tre m o N - te rm in a l. S e d e b e e n te n d e r a e s te p o lip é p tid o c o m o un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n o o m á s re s id u o s d e a m in o á c id o s a d ic io n a le s e n la p r im e ra y /o la ú lt im a p o s ic ió n e n la c a d e n a p o lip e p tíd ic a d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s . D e e s ta fo rm a , a l m e n o s u n a d e d ic h a s u n id a d e s m o n o m é r ic a s d e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n c o m o se d e f in e en la p re s e n te p u e d e c o m p re n d e r c u a lq u ie r n ú m e ro a d e c u a d o d e re s id u o s d e a m in o á c id o s a d ic io n a le s , p o r e je m p lo a l m e n o s un re s id u o d e a m in o á c id o a d ic io n a l. C a d a re s id u o d e a m in o á c id o a d ic io n a l se p u e d e a g re g a r , in d iv id u a l o c o le c t iv a m e n te , co n e l fin , p o r e je m p lo , d e m e jo ra r o s im p lif ic a r la p ro d u c c ió n , p u r if ic a c ió n , e s ta b il iz a c ió n in v iv o o in v itro , e l a c o p la m ie n to o la d e te c c ió n d e l p o lip é p tid o . E s to s re s id u o s d e a m in o á c id o s a d ic io n a le s p u e d e n c o m p re n d e r u n o o m á s re s id u o s d e a m in o á c id o s a g re g a d o s c o n e l f in d e un a c o p la m ie n to q u ím ic o . U n e je m p lo d e e s to e s la a d ic ió n d e un re s id u o d e c is te ín a . E s to s re s id u o s d e a m in o á c id o s a d ic io n a le s ta m b ié n p u e d e n p ro p o rc io n a r u n a “ e t iq u e ta ” p a ra la p u r if ic a c ió n o d e te c c ió n d e l p o lip é p tid o , ta l c o m o u n a e t iq u e ta H is 6 o u n a e t iq u e ta “ m y c ” ( c -m y c ) o u n a e t iq u e ta “ F L A G ” p a ra in te ra c c ió n c o n a n t ic u e rp o s e s p e c íf ic o s p a ra la e t iq u e ta o c ro m a to g ra fía d e a f in id a d m e tá lic a in m o v i liz a d a ( IM A C ) e n e l c a s o d e la e t iq u e ta d e h e x a h is tid in a .
L o s a m in o á c id o s a d ic io n a le s c o m o se a n a liz ó a n te r io rm e n te p u e d e n e s ta r a c o p la d o s a l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o a c u a lq u ie ra d e u n a o a m b a s d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s p o r m e d io d e c o n ju g a c ió n q u ím ic a (u t i l iz a n d o lo s m é to d o s c o n o c id o s d e la q u ím ic a o rg á n ic a ) o p o r c u a le s q u ie ra o tro s m e d io s , ta le s c o m o la e x p re s ió n d e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n c o m o u n a p ro te ín a d e fu s ió n o u n id o en c u a lq u ie r o tra fo rm a , y a s e a d ire c ta m e n te o a t ra v é s d e un e n la z a d o r , p o r e je m p lo , un e n la z a d o r d e a m in o á c id o s c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te .
L o s a m in o á c id o s a d ic io n a le s c o m o s e a n a liz ó a n te r io rm e n te , p u e d e n c o m p re n d e r , p o r e je m p lo , u n o o m á s d o m in io s p o lip e p tíd ic o s . U n d o m in io p o lip e p tíd ic o a d ic io n a l p u e d e p ro p o rc io n a r e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n c o n o tra fu n c ió n , ta l c o m o , p o r e je m p lo , o tra fu n c ió n d e u n ió n , o u n a fu n c ió n e n z im á t ic a , o u n a fu n c ió n tó x ic a o u n a fu n c ió n de s e ñ a liz a c ió n f lu o re s c e n te , o c o m b in a c io n e s d e la s m is m a s .
D e e s ta fo rm a , e n un s e g u n d o a s p e c to d e la p re s e n te d e s c r ip c ió n , s e p ro p o rc io n a u n a p ro te ín a d e fu s ió n o un c o n ju g a d o , q u e c o m p re n d e un p r im e r re s to q u e c o n s is te en un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n d e a c u e rd o c o n e l p r im e r a s p e c to , y un s e g u n d o re s to q u e c o n s is te e n un p o lip é p tid o q u e te n g a u n a a c t iv id a d b io ló g ic a d e s e a d a . E n o tra re a liz a c ió n , la p ro te ín a d e fu s ió n o e l c o n ju g a d o p u e d e n c o m p re n d e r a d ic io n a lm e n te re s to s a d ic io n a le s , q u e c o m p re n d a n a c t iv id a d e s b io ló g ic a s d e s e a d a s q u e p u e d e n s e r y a s e a la s m is m a s o d ife re n te s d e la a c t iv id a d b io ló g ic a d e l s e g u n d o re s to .
E n u n a re a liz a c ió n d e d ic h a p ro te ín a d e fu s ió n o d ic h o c o n ju g a d o , e l ta m a ñ o to ta l d e la m o lé c u la e s tá p o r d e b a jo de l u m b ra l p a ra un a c la ra m ie n to re n a l e f ic ie n te t ra s la a d m in is tra c ió n a un s u je to m a m ífe ro .
E n o tra re a liz a c ió n d e d ic h a p ro te ín a d e fu s ió n o d ic h o c o n ju g a d o , e l ta m a ñ o to ta l d e la m o lé c u la e s tá p o r e n c im a d e l u m b ra l p a ra un a c la ra m ie n to re n a l e f ic ie n te t ra s la a d m in is tra c ió n a un s u je to m a m ífe ro .
E n u n a re a liz a c ió n d e d io c h a p ro te ín a d e fu s ió n o d ic h o c o n ju g a d o , la s e m iv id a in v iv o d e la p ro te ín a d e fu s ió n o d e l c o n ju g a d o e s m á s la rg a q u e la s e m iv id a in v iv o d e l p o lip é p tid o q u e te n g a la a c t iv id a d b io ló g ic a d e s e a d a p e r se .
E je m p lo s no lim ita n te s d e u n a a c t iv id a d b io ló g ic a d e s e a d a c o m p re n d e n u n a a c t iv id a d te ra p é u t ic a , u n a a c t iv id a d d e u n ió n y u n a a c t iv id a d e n z im á tic a .
E n un te rc e r a s p e c to d e la p re s e n te d e s c r ip c ió n , s e p ro p o rc io n a un p o lin u c le ó t id o q u e c o d if ic a un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o u n a p ro te ín a d e fu s ió n c o m o s e d e s c r ib e e n la p re s e n te . T a m b ié n s e a b a rc a p o r e s ta d e s c r ip c ió n un m é to d o p a ra p ro d u c ir un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o u n a p ro te ín a d e fu s ió n c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te , q u e c o m p re n d e e x p re s a r e l p o lin u c le ó t id o ; un v e c to r d e e x p re s ió n q u e c o m p re n d e e l p o lin u c le ó t id o ; y u n a c é lu la h u é s p e d q u e c o m p re n d e e l v e c to r d e e x p re s ió n .
T a m b ié n se a b a rc a un m é to d o p a ra p ro d u c ir e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o u n a p ro te ín a d e fu s ió n , q u e c o m p re n d e c u lt iv a r d ic h a c é lu la h u é s p e d b a jo c o n d ic io n e s q u e p e rm ita n la e x p re s ió n d e l p o lip é p tid o d e s d e su v e c to r de e x p re s ió n , y a is la r e l p o lip é p tid o .
E l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o la p ro te ín a d e fu s ió n d e la p re s e n te d e s c r ip c ió n s e p u e d e n p ro d u c ir a lte rn a t iv a m e n te m e d ia n te s ín te s is n o b io ló g ic a d e p é p tid o s u t il iz a n d o a m in o á c id o s y /o d e r iv a d o s d e a m in o á c id o s q u e te n g a n c a d e n a s la te ra le s re a c t iv a s p ro te g id a s , la s ín te s is d e p é p tid o s n o b io ló g ic o s c o m p re n d e :
- a c o p la m ie n to p o r p a s o s d e lo s a m in o á c id o s y /o lo s d e r iv a d o s d e a m in o á c id o s p a ra fo rm a r un d ím e ro d e u n ió n al F c R n o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e te n g a c a d e n a s la te ra le s re a c t iv a s p ro te g id a s ,
- s e p a ra c ió n d e lo s g ru p o s p ro te c to re s d e la s c a d e n a s la te ra le s re a c t iv a s d e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o la p ro te ín a d e fu s ió n , y
- p le g a d o d e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n o la p ro te ín a d e fu s ió n e n s o lu c ió n a c u o s a .
E n un c u a rto a s p e c to d e la d e s c r ip c ió n , s e p ro p o rc io n a u n a c o m p o s ic ió n q u e c o m p re n d e un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n o un c o n ju g a d o c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te y a l m e n o s un e x c ip ie n te o p o r ta d o r fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le . E n u n a re a liz a c ió n d e l m is m o , la c o m p o s ic ió n c o m p re n d e , a d e m á s , a l m e n o s un a g e n te a c t iv o a d ic io n a l, ta l c o m o a l m e n o s d o s a g e n te s a c t iv o s a d ic io n a le s , ta l c o m o a l m e n o s t re s a g e n te s a c t iv o s a d ic io n a le s . E je m p lo s no lim ita n te s d e a g e n te s a c t iv o s a d ic io n a le s q u e p u e d e n d e m o s tra r s e r ú t ile s e n e s ta c o m b in a c ió n so n a g e n te s in m u n o s u p re s o re s , a g e n te s a n t i- in f la m a to r io s , a g e n te s a n t i-m ic ro b ia n o s y e n z im a s .
E n u n a re a liz a c ió n d e e s te a s p e c to , d ic h a c o m p o s ic ió n e s tá a d a p ta d a p a ra a d m in is tra c ió n m e d ia n te u n a ru ta s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en a d m in is tra c ió n o ra l, a d m in is tra c ió n in tra n a s a l, a d m in is tra c ió n p u lm o n a r , a d m in is t ra c ió n v a g in a l, a d m in is tra c ió n re c ta l, in y e c c ió n in tra v e n o s a , in y e c c ió n in tra p e r ito n e a l, in y e c c ió n in tra m u s c u la r , in y e c c ió n s u b c u tá n e a e in y e c c ió n in tra d é rm ic a .
E n e l s e n t id o en e l q u e se u t iliz a en la p re s e n te , la e x p re s ió n “ a d m in is tra c ió n s is té m ic a ” s e re f ie re a u n a ru ta d e a d m in is t ra c ió n d e ta l fo rm a q u e la s u s ta n c ia d e in te ré s in g re s e e n e l s is te m a c irc u la to r io d e ta l fo rm a q u e se a fe c te to d o e l c u e rp o . E l e x p e r to s c o n s c ie n te d e q u e la a d m in is tra c ió n s is té m ic a se p u e d e lle v a r a c a b o v ía a d m in is tra c ió n e n te ra l (a b s o rc ió n d e l fá rm a c o a t ra v é s d e l t ra c to g a s tro in te s t in a l) o a d m in is tra c ió n p a re n te ra l (e n g e n e ra l in y e c c ió n , in fu s ió n o im p la n ta c ió n ) .
E n u n a re a liz a c ió n , d ic h a c o m p o s ic ió n s e a d a p ta p a ra a d m in is tra c ió n s is té m ic a o lo c a lm e n te . E n c ie r ta s re a liz a c io n e s , se p u e d e u t il iz a r la a d m in is tra c ió n s is té m ic a d e d ic h a c o m p o s ic ió n . E n o tra re a liz a c ió n , d ic h a c o m p o s ic ió n e s tá a d a p ta d a p a ra a d m in is tra c ió n p o r u n a ru ta lo ca l. P o r e je m p lo , la a d m in is tra c ió n lo c a l p u e d e s e r tó p ic a e n un u n g ü e n to , p a s ta , e s p u m a o c re m a . En o tra re a liz a c ió n , d ic h a c o m p o s ic ió n e s tá a d a p ta d a p a ra a d m in is t ra c ió n a t ra v é s d e u n a c a p a e n d o te lia l o e p ite lia l. A q u í, la c o m p o s ic ió n s e p u e d e a d m in is t ra r m e d ia n te tra n s c ito s is a t ra v é s d e d ic h a ca p a .
E n u n a re a liz a c ió n , la v e lo c id a d d e a b s o rc ió n d e u n a c o m p o s ic ió n q u e c o m p re n d e u n a p ro te ín a d e fu s ió n o un c o n ju g a d o c o m o s e d e s c r ib e e n la p re s e n te e s m a y o r q u e la ta s a d e a b s o rc ió n d e lo s p o lip é p tid o s c o r re s p o n d ie n te s a lo s s e g u n d o s o re s to s a d ic io n a le s p e r se . E n u n a re a liz a c ió n , la ta s a d e a b s o rc ió n e s a l m e n o s 2 v e c e s m a y o r, ta l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s m a y o r, ta l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s m a y o r, ta l c o m o a l m e n o s 25 v e c e s m a y o r q u e la ta s a d e a b s o rc ió n d e l s e g u n d o o re s to s a d ic io n a le s p e r se.
S e d e b e e n te n d e r a p a r t ir d e la d e s c r ip c ió n a n te r io r q u e e l d ím e ro d e u n ió n a l F c R n , la p ro te ín a d e fu s ió n o e l c o n ju g a d o o la c o m p o s ic ió n c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te p o r e je m p lo p u e d e n s e r ú t ile s c o m o un a g e n te te ra p é u t ic o , y /o c o m o un m e d io p a ra p ro lo n g a r la s e m iv id a in v iv o d e un p a rt ic ip e d e fu s ió n , y /o c o m o un m e d io p a ra a u m e n ta r la ta s a d e e lim in a c ió n d e d ia n a s n o d e s e a b le s .
P o r lo ta n to , en un q u in to a s p e c to d e la p re s e n te d e s c r ip c ió n , se p ro p o rc io n a un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n , un c o n ju g a d o o u n a c o m p o s ic ió n c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te p a ra u s o c o m o un m e d ic a m e n to .
E n un s e x to a s p e c to re la c io n a d o d e la p re s e n te d e s c r ip c ió n , s e p ro p o rc io n a un m é to d o d e t ra ta m ie n to o p ro f ila x is d e un s u je to q u e n e c e s ite d e l m is m o , q u e c o m p re n d e el p a s o d e a d m in is t ra r u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a o p ro f ilá c t ic a m e n te a c t iv a d e un d ím e ro d e u n ió n a l F c R n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n , un c o n ju g a d o o u n a c o m p o s ic ió n c o m o s e d e s c r ib e e n la p re s e n te .
E n u n a re a liz a c ió n d e u n o c u a lq u ie ra d e e s to s d o s ú lt im o s a s p e c to s , e l m e d ic a m e n to o e l m é to d o se d e s t in a a la h u m a n o y e l d ia g ra m a (B ) m u e s tra la M F I a p a r t ir d e c é lu la s H e L a t r a n s d u c id a s c o n e l F c R n -e G F P d e ra tó n .
L a f ig u ra 5, m u e s tra g rá f ic a s d e p u n to s a p a r t ir d e un a n á lis is d e c ito m e tr ía d e f lu jo d e Ig G A le x a F lu o r® 647 d e s e r h u m a n o o ra tó n q u e s e u n e a c é lu la s H e L a F c R n -e G F P h u m a n a s (p a n e l s u p e r io r ) y d e ra tó n (p a n e l in fe r io r) , c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 5. D e b id o a la e x p re s ió n h e te ro g é n e a d e F c R n -e G F P p o r c é lu la s H e L a , la s c é lu la s se a c t iv a ro n d e a c u e rd o co n la a b u n d a n c ia d e F c R n -e G F P s o b re la s u p e r f ic ie c e lu la r. S e c o n s id e ra q u e la s c é lu la s en la a c t iv a c ió n M s e rá n F c R n -e G F P n e g a t iv a s y s e c o n s id e ra q u e la s c é lu la s e n la a c t iv a c ió n N s e rá n p o s it iv a s . La u n ió n d e Ig G -A le x a F lu o r® 647 h u m a n a o d e ra tó n 100 nM a c é lu la s H e L a tra n s d u c id a s a l F c R n s e m u e s tra n e n e l p a n e l iz q u ie rd o (0 n M ). L a f ig u ra m u e s tra q u e la u n ió n d e Ig G s e b lo q u e ó m e d ia n te Z 07918 m a rc a d o c o n H is 6 (S E Q ID N O : 1) d e u n a fo rm a d e p e n d ie n te d e la d o s is (1, 10, 100 y 1000 n M ). E l e je y m u e s tra la in te n s id a d d e A le x a F lu o r® 647 y e l e je x m u e s tra la a c t iv id a d d e e G F P .
L a f ig u ra 6 m u e s tra lo s v a lo re s d e in te n s id a d d e f lu o re s c e n c ia m e d ia (M F I) q u e re s u lta n d e la u n ió n a l F c R n d e Ig G A le x a F lu o r® 647 e n p re s e n c ia d e d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s d e Z 07918 m a rc a d o s c o n H is 6 (S E Q ID N O : 1) e n (A ) c é lu la s H e L a t r a n s d u c id a s a l F c R n -e G F P h u m a n o y (B ) c é lu la s H e L a t r a n s d u c id a s a l F c R n -e G F P d e ra tó n , c o m o se d e s c r ib e e n e l E je m p lo 5. La f ig u ra m u e s tra e l b lo q u e o d e p e n d ie n te d e la d o s is d e la u n ió n a Ig G -F c R n m e d ia n te la v a r ia n te Z.
L a s f ig u ra s 7 A -7 C m u e s tra n la c in é t ic a d e u n ió n d e t re s v a r ia n te s Z a l F c R n h u m a n o a pH 6 ,0 , c o m o s e d e s c r ib e en e l E je m p lo 6, u t i l iz a n d o un in s tru m e n to B ia c o re . S e e x h ib e n lo s s e n s o g ra m a s p a ra u n a s e r ie d e c o n c e n tra c io n e s d e (A ) Z 11948 (S E Q ID N O : 354 ), (B ) Z 11946 (S E Q ID N O : 355 ) y (C ) Z 11947 (S E Q ID N O : 356 ), re s p e c t iv a m e n te , en fu s ió n c o n e l p o lip é p tid o d e u n ió n a a lb ú m in a P P 013 (S E Q ID N O : 377 ) y la m o lé c u la Z d e la v a r ia n te c o n tro l Z 03638 (S E Q ID N O : 378 ; n o e s p e c íf ic a p a ra F c R n ). L a s c u rv a s a p a r t ir d e 640 n m ( lín e a d is c o n t in u a ) , 160 n m ( lín e a p u n te a d a ) y 40 nM ( lín e a g r is c o n t in u a ) s e s o m e tie ro n a a n á lis is c in é t ic o s u t il iz a n d o e l m o d e lo d e u n ió n 1:1 de L a n g m u ir . L o s p a rá m e tro s c in é t ic o s y la s a f in id a d e s s e c a lc u la ro n a p a rt ir d e c u rv a s a ju s ta d a s ( lín e a s n e g ra s c o n t in u a s ) y s e m u e s tra n e n la T a b la 6.
L a f ig u ra 8 m u e s tra lo s p e r f i le s fa rm a c o c in é t ic o s p a ra t re s v a r ia n te s Z d e u n ió n a l F c R n fu s io n a d a s a l p o lip é p tid o de u n ió n a a lb ú m in a P P 013 o b te n id o c o m o se d e s c r ib e e n e l E je m p lo 6. L a s v a r ia n te s Z 11947 (S E Q ID N O : 356 , c u a d ra d o s v a c ío s ) , Z 11946 (S E Q ID N O : 355 tr iá n g u lo s v a c ío s ) y Z 11948 (S E Q ID N O : 354 , ro m b o s v a c ío s ) d e Z, m u e s tra n to d a s u n a s e m iv id a p ro lo n g a d a en c o m p a ra c ió n c o n e l Z 03638 -P P 013 d e c o n tro l n e g a t iv o (c írc u lo s v a c ío s ) .
L a f ig u ra 9 m u e s tra e l b lo q u e o d e la Ig G h u m a n a p a ra e l F c R n h u m a n o m e d ia n te H is 6-Z 07918 (S E Q ID N O : 1; c í rc u lo s n e g ro s ) , IV Ig (c u a d ra d o s g r is e s ) y S C Ig ( t r iá n g u lo s g r is e s ) , re s p e c t iv a m e n te , a n a liz a d o s c o m o se d e s c r ib e e n e l E je m p lo 10.
L a f ig u ra 10 m u e s tra q u e e l b lo q u e o d e la s in te ra c c io n e s d e Ig G -F c R n c o n la s v a r ia n te s Z e s p e c íf ic a s p a ra e l F c R n e n ra to n e s d a p o r re s u lta d o n iv e le s re d u c id o s d e la IgG . C o m o s e d e s c r ib e a d ic io n a lm e n te e n e l E je m p lo 11, los ra to n e s fu e ro n tra ta d o s c o n c in c o in y e c c io n e s d ia r ia s d e V e h íc u lo (+ ), la v a r ia n te Z 07918 -P P 013 (c u a d ra d o v a c ío ) y Z 11948 (S E Q ID N O : 354 ; c írc u lo c e r ra d o ) d e Z fu s io n a d a s a A B D . L a c o n c e n tra c ió n d e Ig G e n d ó g e n a s e m id ió m e d ia n te E L IS A . L a c o n c e n tra c ió n d e Ig G e n ra to n e s in d iv id u a le s a 24 , 72 , 120 y 168 h s e re la c io n ó co n e l n iv e l a 0 h y lo s re s u lta d o s p o r lo ta n to s e p re s e n ta n c o m o e l p o rc e n ta je d e Ig G a 0 h.
L a f ig u ra 11 m u e s tra lo s v a lo re s d e in te n s id a d d e f lu o re s c e n c ia m e d ia (M F I) d e p o lip é p tid o s d im é r ic o s y m o n o m é r ic o s m a rc a d o s co n A le x a F lu o r® 647 q u e s e u n e n a c é lu la s H e L a tra n s fe c ta d a s co n F c R n -e G F P h u m a n o m e d id o s c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 13. (A ) D ím e ro s Z 11948 -(G 4S )3-Z 11948 (S E Q ID N O : 369 ) y Z 11948 -(G 4S ) -Z 11948 (S E Q ID N O : 368 ), y u n a v a r ia n te Z d e l m o n ó m e ro c o r re s p o n d ie n te , z 07918 (S E Q ID N O : 1), q u e se u n e a F c R n a pH 6 (n e g ro ) y pH 7 ,4 (b la n c o ) . (B ) V a r ia n te Z 07918 (s E q ID N O : 1) d e Z p r im a r ia m o n o m é r ic a y Z 13583 (S E Q ID N O : 23 ), Z 13621 (S E Q ID N O : 44 ), Z 13654 (S E Q ID N O : 65 ) y Z 13674 (S E Q ID N O : 75 ), d e las v a r ia n te s Z m a d u ra s m o n o m é r ic a s q u e s e u n e n a F c R n a pH 6 (n e g ro ) y pH 7 ,4 (b la n c o ) .
L a f ig u ra 12 m u e s tra e l b lo q u e o d e la Ig G h u m a n a q u e s e u n e a l F c R n h u m a n o m e d ia n te p o lip é p tid o s d im é r ic o s y m o n o m é r ic o s a n a liz a d o s c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 14. (A ) d ím e ro s Z 11948 -(G 4S ) 3-Z 11948 (S E Q ID N O : 369 ) y Z 11948 -(G 4S )-Z 11948 (S E Q ID N O : 368 ); u n a v a r ia n te Z d e l m o n ó m e ro c o r re s p o n d ie n te , Z 07918 (S E Q ID N O : 1), S C lg e IV Ig . B ) V a r ia n te Z p r im a r ia m o n o m é r ic a Z 07918 (S E Q ID N O : 1) y la s v a r ia n te s Z m a d u ra s m o n o m é r ic a s Z 13583 (S E Q ID N O : 23 ) y Z 13621 (S E Q ID N O : 44 ).
L a f ig u ra 13 m u e s tra la u n ió n d e p e n d ie n te d e l pH d e p o lip é p tid o s a l h F c R n a n a liz a d o s m e d ia n te E L IS A c o m o se d e s c r ib e e n e l E je m p lo 17. (A ) u n ió n d e lo s p o lip é p tid o s in d ic a d o s a pH 6. (B ) u n ió n d e lo s p o lip é p tid o s in d ic a d o s a pH 7 ,4. A a m b o s v a lo re s d e pH , se o b s e rv ó u n a u n ió n m á s e f ic ie n te p a ra lo s p o lip é p tid o s d im é r ic o s (Z A Z # # # # ) q u e p a ra la v a r ia n te Z m o n o m é r ic a (Z 13621 ) .
L a f ig u ra 14 m u e s tra la re d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e h Ig G e n ra to n e s tra n s g é n ic o s co n F c R n tra ta d o s c o n p o lip é p tid o s d im é r ic o s c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 20. (A ) L a re d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e h Ig G fu e ig u a lm e n te e f ic ie n te co n e l d o m in io d e u n ió n a a lb ú m in a P P 013 (S E Q ID N O : 377 ) s itu a d o e n tre lo s d o s re s to s Z (Z A Z 3715 ; S E Q ID N O : 371 ) o c o n P P 013 s itu a d o e n e l e x tre m o C d e l p o lip é p tid o (Z Z A 3716 ; S E Q ID N O : 372 ). (B ) S e o b tu v o u n a re d u c c ió n ig u a l d e lo s n iv e le s d e h Ig G c o n lo s p o lip é p tid o s Z A Z 3869 (S E Q ID N O : 374 ), Z A Z 3870 (S E Q ID N O : 375 ) y Z A Z 3871 (S E Q ID N O : 376 ).
Figure imgf000029_0001
L a f ig u ra 16 m u e s tra la s c o n c e n tra c io n e s s é r ic a s d e l Z A Z 3715 (S E Q ID N O : 371 ) y Z A Z 3824 (S E Q ID N O : 373 ), re s p e c t iv a m e n te , m e d id a s e n e l m is m o e s tu d io d e c a ta b o lis m o c o n Ig G c o m o se p re s e n ta e n la f ig u ra 15.
L a f ig u ra 17 e s u n a im a g e n d e un g e l S D S -P A G E q u e m u e s tra la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a l F c R n o r ig in a le s y m u ta d a s a n te s (0 ) y d e s p u é s d e un e n s a y o d e e s ta b il id a d d e 2 s e m a n a s (2 w ). P is ta 1: Z 11948 (0 ), P is ta 2: Z 11948 (2 w ), P s ita 3: M w , P is ta 4: Z 17347 (0 ), P is ta 5: Z 17347 (2 w ), P is ta 6: Z 17348 (0 ), P is ta 7: Z 17348 (2 w ). E l m a rc a d o r d e ta m a ñ o m o le c u la r (M w ) fu e N O V E X ® S h a rp P re -s ta in e d P ro te in S ta n d a rd (216 , 160 , 110 , 80 , 60 , 50 , 40 , 30 , 20 , 15, 10, 3 ,5 k D a ). L a s b a n d a s d ia g o n a le s o b s e rv a d a s e n la f ig u ra s o n un a r te fa c to re s u lta n te d e u n a im p re s ió n a p a r t ir d e un s e g u n d o g e l te ñ id o e n e l m is m o re c ip ie n te .
L a f ig u ra 18 m u e s tra la u n ió n a l F c R n h u m a n o y d e c y n o m o lg u s a pH 6 ,0 c o m o se d e s c r ib e en e l E je m p lo 25. S e e x h ib e n la s s u p e rp o s ic io n e s d e lo s s e n s o g ra m a s o b te n id o s a p a r t ir d e un in s tru m e n to B ia c o re q u e re p re s e n ta las re s p u e s ta s d e la in y e c c ió n d e la v a r ia n te Z m a rc a d a c o n H is 6 90 nM s o b re h F c R n (n e g ro ) y c F c R n (g r is ) p a ra (A ) Z 13578 ( lín e a c o n t in u a ) y Z 18632 ( lín e a d is c o n t in u a ) , (B ) Z 13616 ( lín e a c o n t in u a ) y Z 18633 ( lín e a d is c o n t in u a ) y ( c ) Z 13621 ( lín e a c o n t in u a ) y Z 18634 ( lín e a d is c o n t in u a ) .
Ejemplos
C o m p e n d io
L o s s ig u ie n te s e je m p lo s d e s c r ib e n e l d e s a rro llo d e la s m o lé c u la s d e n u e v a s v a r ia n te s Z q u e f ija n c o m o o b je t iv o e l re c e p to r F c n e o n a ta l (F c R n ). L a s v a r ia n te s Z s e o b tu v ie ro n u t il iz a n d o te c n o lo g ía p a ra p re s e n ta c ió n d e fa g o s . L o s g e n e s q u e c o d if ic a n lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a l F c R n d e s c r ito s en la p re s e n te se s e c u e n c ia ro n , y la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s c o r re s p o n d ie n te s s e lis ta n en la f ig u ra 1, y se d e s ig n a n p o r lo s id e n t if ic a d o re s S E Q ID N O : 1 -353. L o s m o t iv o s d e u n ió n (B M S ) a l F c R n d e d u c id o d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a l F c R n d e s c r ito s e n la p re s e n te se e x t ie n d e n d e s d e e l re s id u o 8 h a s ta e l 36 e n la s s e c u e n c ia s c o n la s S E Q ID N O : 1 -353. A d e m á s , s e in v e s t ig a ro n las p ro p ie d a d e s d e u n ió n a l F c R n y la c a p a c id a d p a ra b lo q u e a r la Ig G q u e s e u n e a l F c R n d e lo s p o lip é p tid o s en fo rm a d im é r ic a .
E je m p lo 1
P ro d u c c ió n d e a F c R n h u m a n o y p 2 -m ic ro q lo b u lin a (B 2 M ) h u m a n a
E n e s te E je m p lo s e p ro d u je ro n c o m o p ro te ín a s s o lu b le s e l d o m in io e x t ra c e lu la r (E C D ) d e l a F c R n h u m a n o (S E Q ID N O : 379 ) e n e l c o m p le jo co n la p 2 -m ic ro g lo b u lin a h u m a n a (S E Q ID N O : 380 ) (c o m p le jo d e s ig n a d o F c R n ) y la p 2 -m ic ro g lo b u lin a h u m a n a en fo rm a no c o m p le ja d a (d e s ig n a d o B 2 M ). E l F c R n h u m a n o y la B 2 M p ro d u c id o s e n e s te e je m p lo s e u t il iz a ro n p a ra a n á lis is d e s e le c c ió n d e fa g o s , E L IS A y B ia c o re e n lo s E je m p lo s 2 y 3.
M a te r ia le s y m é to d o s
C o n s tru c c ió n d e p lá s m id o s q u e c o n t ie n e n lo s g e n e s p a ra e l a F c R n h u m a n o y la p 2 -m ic ro g lo b u lin a h u m a n a q u e se u t il iz a rá n p a ra la c o -e x p re s ió n : L o s g e n e s q u e c o d if ic a n e l a F c R n h u m a n o (G e n B a n k B C 008734.2 ) y la p 2 -m ic ro g lo b u lin a h u m a n a (B 2 M ) (G e n B a n k B C 032589.1 ) se o b tu v ie ro n d e O p e n B io s y s te m s . U t il iz a n d o la e x te n s ió n d e s o la p a m ie n to m e d ia n te P C R , un fra g m e n to g é n ic o q u e c o d if ic a lo s a m in o á c id o s 24 -290 d e l a F c R n h u m a n o (a F c R n EC ü ) (S E Q ID N O : 379 ) s e a m p li f ic ó a u n a c o n s tru c c ió n q u e c o n s is t ió e n la s e c u e n c ia a t tB 1 -s it io /K o z a k s e g u id o p o r u n a c o d if ic a c ió n g é n ic a : u n a s e c u e n c ia c o n d u c to ra d e c a d e n a Ig k a p p a , h F c R n ECD, un e n la z a d o r G S y u n a e t iq u e ta fla g , s e g u id o s p o r un s it io a ttB 2. S e re a liz ó u n a c o n s tru c c ió n s im ila r q u e c o n te n ía un fra g m e n to g é n ic o q u e c o d if ic a lo s a m in o á c id o s 21 -119 d e la B 2 M h u m a n a (S E Q ID N O : 380 ), e x c e p to q u e u n a e t iq u e ta H is 6 re m p la z ó la e t iq u e ta f la g . L a s c o n s tru c c io n e s s e in s e r ta ro n e n e l p lá s m id o p D O N O R 221 ( In v it ro g e n , ca t. N o. 12536 -017 ) m e d ia n te re c o m b in a c ió n u t il iz a n d o e l s is te m a G a te w a y ( In v it ro g e n , ca t. N o . 11789020 , m e z c la d e la s e n z im a s a te w a y ® B P C lo n a s e ® II), d e a c u e rd o c o n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . D e s p u é s d e la v e r i f ic a c ió n d e las s e c u e n c ia s c o rre c ta s , la c o n s tru c c ió n d e l a F c R n ECD h u m a n o s e in s e rtó e n 2 K 7 bSd (S u te r e t a l. (2006 ) S te m C e lls 24 :615 -623 ) u t i l iz a n d o c lo n a c ió n d e a c c e s o m ú lt i-s it io ju n to c o n e l p lá s m id o q u e c o n t ie n e e l p ro m o to r p E N T R -C M V (T a i e t a l. (2012 ) P L o S O n e 7 (9 ) :e 46269 ) , d a n d o p o r re s u lta d o e l v e c to r 2 K 7 bSd-C M V -h F c R n ECD. L a e s tru c tu ra g é n ic a d e la B 2 M h u m a n a s e in s e rtó s im ila rm e n te en 2 K 7 neo (S u te r e t a l., s u p ra ) , p ro p o rc io n a n d o e l v e c to r 2 K 7 neo-C M V -H B 2 M .
C u lt iv o c e lu la r , p re p a ra c ió n d e v e c to re s le n t iv ira le s re c o m b in a n te s e in s e rc io n e s g é n ic a s e n la lín e a c e lu la r S K O V -3 : L a s lín e a s c e lu la re s H E K 293 T y S K O V -3 se o b tu v ie ro n d e A T C C . L a s c é lu la s s e h ic ie ro n c re c e r a 37 °C e n u n a in c u b a d o ra h u m id if ic a d a e n p re s e n c ia d e 5 % d e C O 2. E l m e d io c o m p le to p a ra la lín e a c e lu la r H E K 293 T fu e m e d io d e E a g le m o d if ic a d o p o r D u lb e c c o (D M E M ) s u p le m e n ta d o c o n s u e ro fe ta l d e b o v in o (F B S ) a l 10% , 1 % d e s o lu c ió n a n t im ic ó t ic a co n a n t ib ió t ic o (A A ) y 1 % d e s o lu c ió n d e a m in o á c id o s no e s e n c ia le s (N E A A ) d e M E M . E l m e d io c o m p le to p a ra la lín e a c e lu la r S K O V -3 fu e m e d io 5 A d e M c C o y c o m p le m e n ta d o c o n F B S a l 10 % y 1 % d e A A .
L o s p lá s m id o s 2 K 7 bsd-C M V -h F c R n ECD y 2 K 7 neo-C M V -H B 2 M s e c o - tra n s fe c ta ro n p o r s e p a ra d o ju n to c o n e l p lá s m id o c o n s o b re V S V -G y e m p a q u e g a g /p o l en c é lu la s H E K 293 T u tiliz a n d o t ra n s fe c c ió n d e c lo ru ro d e c a lc io (Z u f fe re y e t al. (1997 ) N a t B io te c h n o l 15 (9 ) :871 -5 ; J a k o b s s o n e t al. (2006 ) J N e u ro s c i R e s . 84 :58 -67 ). L o s s o b re n a d a n te s d e c u lt iv o H E K 293 q u e c o n te n ía n p a rt íc u la s le n t iv ira le s fo rm a d a s co n e l a F c R n ECD h u m a n o y lo s t ra n s g e n e s d e B 2 M h u m a n a , re s p e c t iv a m e n te , se a c la ra ro n a p a r t ir d e l d e s e c h o c e lu la r m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n y f i lt ra c ió n . L o s d o s t ip o s d e p a r t íc u la s le n t iv ira le s s e u t il iz a ro n p a ra t r a n s d u c ir s e c u e n c ia lm e n te c é lu la s S K O V -3. L o s in te g ra n te s d o b le e x ito s o s q u e c o n te n ía n ta n to e l a F c R n ECD h u m a n o c o m o lo s g e n e s d e B 2 M se s e le c c io n a ro n m e d ia n te la a d ic ió n d e b la s t ic id in a ( In v it ro g e n ) y s u lfa to d e G 418 ( In v it ro g e n ) a l m e d io d e c u lt iv o , m ie n tra s se s u b -c u lt iv a ro n la s c é lu la s d u ra n te d o s s e m a n a s . La lín e a c e lu la r S K O V -3 tra n s d u c id a e s ta b le m e n te , re s u lta n te , se d e s ig n ó S K O V -3 h F c R n ECD/h B 2 M .
E x p re s ió n d e F c R n h u m a n o re c o m b in a n te : C é lu la s S K O V -3 , a F c R n ECD h u m a n o d e c o -e x p re s ió n y B 2 M q u e d a p o r re s u lta d o e l F c R n h u m a n o , s e e x p a n d ie ro n y 1 ,5 x 107 c é lu la s s e s e m b ra ro n e n un H Y P E R F la s k (C o rn in g ) e n 560 m l d e m e d io d e c re c im ie n to c o m p le to . D e s p u é s d e c in c o d ía s , c u a n d o la s c é lu la s se h a b ía n s e d im e n ta d o y m u ltip l ic a d o , e l m e d io s e c a m b ió a m e d io d e c re c im ie n to c o m p le to s in F B S . D e s p u é s d e c in c o d ía s , e l c u lt iv o se te rm in ó y s e re c o le c tó e l s o b re n a d a n te , s e h iz o p a s a r a t ra v é s d e un f i lt ro d e 45 p m y s e c o n g e la ro n a -80 °C .
P u r if ic a c ió n d e l F c R n h u m a n o re c o m b in a n te u t i l iz a n d o c ro m a to g ra f ía co n Ig G h u m a n a : L a p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s s e lle v ó a c a b o e n un s is te m a Á K T A E x p lo re r (G E H e a lth c a re ) . L a Ig G h u m a n a (P h a rm a c ia ) , 1 m l e n N a H C O 3 0 ,2 M , N a C l 0 ,5 M pH 8 ,3 a u n a c o n c e n tra c ió n d e 10 m g /m l, s e a c o p ló a 1 m l d e u n a c o lu m n a H P a c t iv a d a c o n H iT ra p N H S (G E H e a lth c a re ) d e a c u e rd o c o n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . E l s o b re n a d a n te q u e c o n te n ía e l F c R n h u m a n o re c o m b in a n te p ro v e n ie n te d e la s c é lu la s S K O V -3 s e d e s c o n g e ló y e l pH s e a ju s tó a 5 ,8 c o n H C l. E l s o b re n a d a n te se c a rg ó p o s te r io rm e n te en lo te s d e 100 m l s o b re la c o lu m n a p re v ia m e n te e q u ilib ra d a c o n B is -T r is 20 m M pH 5 ,8. La c o lu m n a s e la v ó c o n 20 m l d e B is -T r is 20 m M pH 5 ,8 y s e e lu y ó e n f ra c c io n e s d e 1 m l u t i l iz a n d o T r is 50 m M , pH 8 ,1. E l in te rc a m b io d e ta m p ó n a P B S (s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a co n fo s fa to , fo s fa to 10 m M , N a C l 137 m M , K C l 2 ,68 m M , pH 7 ,4 ) s e re a liz ó u t i l iz a n d o d iá lis is .
S D S -P A G E y tra n s fe re n c ia W e s te rn : L a p u re z a d e la s f ra c c io n e s e lu id a s a p a r t ir d e la p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s se a n a liz ó m e d ia n te S D S -P A G E y t in c ió n c o n R e a c t iv o p a ra T in c ió n G e lC o d e B lu e (P ie rc e ) y k it p a ra t in c ió n S ilv e rX p re s s ® S ilv e r ( In v it ro g e n ) . La tra n s fe re n c ia W e s te rn se lle v ó a c a b o u t il iz a n d o u n a m e m b ra n a d e n it ro c e lu lo s a A m e rs h a m -H y b o n d ™ -C E x tra (G E H e a lth c a re ) . L a m e m b ra n a s e b lo q u e ó co n 5 % d e le c h e d e s h id ra ta d a s in g ra s a (S e m p e r ) en T b S T (b a s e T r iz m a 50 m M , N a C l 150 m M , T w e e n -20 a l 0 ,05 % , pH 8 ) d u ra n te 1 h o ra , lu e g o s e s o n d e ó c o n u n a m e z c la d e a n t ic u e rp o s p o lic lo n a le s a n t i-F C G R T d e c o n e jo (a n t ic u e rp o s A t la s ) a u n a c o n c e n tra c ió n d e 0 ,15 | jg /m l y e l a n t ic u e rp o p o lic lo n a l a n t i-B 2 M d e c o n e jo (a n t ic u e rp o s A t la s ) a u n a c o n c e n tra c ió n d e 0 ,23 g /m l e n T B S T . L a m e m b ra n a s e in c u b ó p o s te r io rm e n te co n e l a n t ic u e rp o a n t i-c o n e jo d e c a b ra e s ta b il iz a d o c o n ju g a d o co n p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te (P ie rc e ) d ilu id a 1 :10.000 en T B S T . D e s p u é s d e la a d ic ió n d e S u s tra to t M b (P ie rc e ) , s e o b tu v o u n a im a g e n d e la m e m b ra n a e n A m e rs h a m H y p e rf i lm E C L (G E H e a lth c a re ) . La h ip e r -p e líc u la s e p ro c e s ó u t il iz a n d o un re v e la d o r G B X y un f i ja d o r G B X (S ig m a -A ld r ic h ) .
P ro d u c c ió n d e u n a fo rm a n o c o m p le ja d a d e la B 2 M h u m a n a : S e p ro d u jo B 2 M h u m a n a e n E. co li. La e x p re s ió n y p u r if ic a c ió n se re a liz ó e s e n c ia lm e n te c o m o s e d e s c r ib e e n S a n d a lo v a e t a l. (2005 ) A c ta C h ry s t F 61 :1090 -1093 y M ic h a e ls s o n e t al. (2001 ) J Im m u n o l 166 :7327 -7334. La p ro te ín a p u r if ic a d a , q u e c o n s is t ió e n lo s a m in o á c id o s 21 -119 d e la B 2 M h u m a n a , en u re a s e s o m e tió a re p le g a d o c o n a rg in in a c o m o s ig u e ; 0 ,5 m g d e B 2 M se a g re g a ro n rá p id a m e n te a 2 m l d e ta m p ó n d e re p lie g u e (20 m l d e T r is -H C l 1 M pH 8 ,0 , 16 ,87 g d e L -a rg in in a ( ta m p o n a d a co n H C l), 0 ,8 m l d e E D T A 0 ,5 M , 61 m g d e G S S G , 307 m g d e G S H y a g u a m ill i-Q a un v o lu m e n f in a l d e 200 m l, pH 8 ,0 , y c o m p le m e n ta d a c o n un in h ib id o r d e p ro te a s a (R o c h e , ca t. no . 11 873 580 001 )) . E l p ro c e d im ie n to d e re p le g a d o se re a liz ó a 4 °C d u ra n te 4 h o ra s . La p ro te ín a B 2 M re p le g a d a se in te rc a m b io p o r ta m p ó n a P B S u t il iz a n d o u n a c o lu m n a P D -10 (G E H e a lth c a re ) .
R e s u lta d o s
C o n s tru c c ió n d e p lá s m id o s q u e c o n t ie n e n lo s g e n e s p a ra e l a F c R n h u m a n o y la p 2 -m ic ro g lo b u lin a h u m a n a q u e se u t il iz a rá n p a ra la c o -e x p re s ió n : L o s g e n e s q u e c o d if ic a n e l d o m in io e x t ra c e lu la r d e la c a d e n a a d e l F c R n h u m a n o (a F c R n ECD) y la B 2 M h u m a n a se in s e rta ro n e n lo s p lá s m id o s d e tra n s fe re n c ia le n t iv ira l 2 K 7 bSd y 2 K 7 neo , re s p e c t iv a m e n te . E n a m b o s c a s o s , e l g e n in s e r ta d o e s tá b a jo e l c o n tro l d e un p ro m o to r C M V . L o s g e n e s se e x te n d ie ro n d e ta l fo rm a q u e la s p ro te ín a s re s u lta n te s p u d ie ra n te n e r u n a s e c u e n c ia c o n d u c to ra d e c a d e n a s k a p p a Ig e n e l e x tre m o N p a ra f i ja r c o m o o b je t iv o la p ro te ín a p a ra e x p o r ta r a t ra v é s d e l re t íc u lo e n d o p la s m á tic o a l m e d io d e c u lt iv o ( la s e c u e n c ia d e s e ñ a l s e e s c in d ió t ra s la s e c re c ió n ) . A d e m á s , a F c R n ECD te n ía u n a s e c u e n c ia s e p a ra d o ra C -te rm in a l s e g u id a p o r u n a e t iq u e ta F L A G p a ra d e te c c ió n p o te n c ia l. La B 2 M h u m a n a te n ía u n a s e c u e n c ia s e p a ra d o ra C - te rm in a l s e g u id a p o r u n a e t iq u e ta H is 6 p a ra u n a d e te c c ió n p o te n c ia l. La s e c u e n c ia s e p a ra d o ra se a g re g ó p a ra m e jo ra r la a c c e s ib il id a d d e la e t iq u e ta . L o s p lá s m id o s d e tra n s fe re n c ia le n t iv ira l ta m b ié n c o n te n ía n d o s d ife re n te s g e n e s d e re s is te n c ia a a n t ib ió t ic o s p a ra p e rm it ir la s e le c c ió n d e la s c é lu la s d o n d e s e h a b ía n in s e r ta d o a m b a s e s tru c tu ra s .
E x p re s ió n y p u r if ic a c ió n d e l F c R n h u m a n o re c o m b in a n te : L o s g e n e s q u e c o d if ic a n a F c R n ECD y B 2 M s e in s e rta ro n en R e s u l t a d o s
S e l e c c i ó n p a r a p r e s e n t a c i ó n d e f a g o s d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a l F c R n : S e o b t u v i e r o n c l o n e s i n d i v i d u a l e s d e s p u é s d e c u a t r o c i c l o s d e s e l e c c i o n e s p a r a p r e s e n t a c i ó n d e f a g o s c o n t r a e l F c R n h u m a n o b i o t i n i l a d o .
S e c u e n c i a c i ó n : S e r e a l i z ó u n a s e c u e n c i a c i ó n s o b r e l o s c l o n e s s e l e c c i o n a d o s e n f o r m a a l e a t o r i a a p a r t i r d e c u a t r o r o n d a s d e s e l e c c i ó n . A c a d a v a r i a n t e Z # # # # # s e l e p r o p o r c i o n ó u n n ú m e r o d e i d e n t i f i c a c i ó n ú n i c o y l a s v a r i a n t e s i n d i v i d u a l e s s e d e n o m i n a r o n c o m o Z / / / / / / / / / / . L a s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s d e l a s v a r i a n t e s Z l a r g a s c o n 58 r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s s e l i s t a n e n l a f i g u r a 1, c o m o l a s S E Q ID N O : 1 - 16 y S E Q ID N O : 353.
L o s m o t i v o s d e u n i ó n a l F c R n d e d u c i d o d e e s t a s v a r i a n t e s Z s e e x t i e n d e n d e s d e e l r e s i d u o 8 h a s t a e l r e s i d u o 36 e n l a s s e c u e n c i a s c o n l a s S E Q ID N O : 1 - 16 y S E Q ID N O : 353 e n l a f i g u r a 1. L a s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s d e l o s p o l i p é p t i d o s l a r g o s c o n 49 r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s ( B M o d ) s e p r e d i j e r o n p a r a c o n s t i t u i r e l p a q u e t e t r i - h e l i c o i d a l c o m p l e t o c o n c a d a u n a d e e s t a s v a r i a n t e s Z q u e s e e x t i e n d e n d e s d e e l r e s i d u o 7 h a s t a e l r e s i d u o 55.
Figure imgf000033_0001
E j e m p l o 3
P r o d u c c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n
E n e s t e E j e m p l o , s e p r o d u j e r o n d i e c i s i e t e v a r i a n t e s Z e n E . c o l i , s e p u r i f i c a r o n y a n a l i z a r o n c o n t r a F c R n h u m a n a e n B i a c o r e . T a m b i é n s e a n a l i z ó u n s u b c o n j u n t o d e l a s v a r i a n t e s c o n t r a e l F c R n d e r a t ó n . S e r e a l i z ó u n a e s p e c t r o s c o p i a d e d i c r o í s m o c i r c u l a r ( C D ) p a r a u n s u b c o n j u n t o d e v a r i a n t e s Z p a r a l a i n v e s t i g a c i ó n d e s u e s t r u c t u r a s e c u n d a r i a . M a t e r i a l e s y m é t o d o s
S u b c l o n a c i ó n d e v a r i a n t e s Z : E l A D N d e d i e c i s i e t e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a l F c R n ( S E Q ID N O : 1 - 16 y S E Q ID N O : 353 ) s e a m p l i f i c ó a p a r t i r d e l v e c t o r d e l a c o l e c c i ó n p A Y 02592. S e a p l i c ó u n a e s t r a t e g i a d e s u b c l o n a c i ó n p a r a l a c o n s t r u c c i ó n d e m o l é c u l a s d e l a v a r i a n t e s Z m o n o m é r i c a c o n l a e t i q u e t a H i s 6 N - t e r m i n a l u t i l i z a n d o t é c n i c a s d e b i o l o g í a m o l e c u l a r e s t á n d a r ( e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n d e t a l l e e n e l d o c u m e n t o W O 2009 / 077175 p a r a l a s v a r i a n t e s Z q u e s e u n e n a o t r a d i a n a ) . L o s f r a g m e n t o s g é n i c o s Z s e s u b c l o n a r o n e n e l v e c t o r d e e x p r e s i ó n p A Y 01448 , d a n d o p o r r e s u l t a d o l a s e c u e n c i a c o d i f i c a d a M G S S H H H H H H L Q - [ Z # # # # # ] - V D .
A d e m á s , la v a r ia n te Z 07918 d e u n ió n a F c R n (S E Q ID N O : 1), p e ro q u e se in ic ia c o n lo s a m in o á c id o s A E e n lu g a r d e V D y d e s ig n a d a Z 11948 (S E Q ID N O : 354 ), s e c lo n ó c o m o e s tru c tu ra s h o m o d im é r ic a s c o n d o s d ife re n te s e n la z a d o re s e n tre la s v a r ia n te s Z y s e g u id o d e la e t iq u e ta H is 6 C -te rm in a l. E s to s e re a liz ó u t iliz a n d o m é to d o s d e b io lo g ía m o le c u la r c o n v e n c io n a le s in c lu y e n d o a m p lif ic a c ió n d e A D N , re s tr ic c ió n c o n e n z im a s d e re s tr ic c ió n a d e c u a d a s y l ig a m ie n to d e l A D N . L o s d o s e n la z a d o re s s e o b tu v ie ro n d e T h e rm o F is h e r S c ie n tif ic . L o s f r a g m e n to s d e l g e n Z s e s u b c lo n a ro n e n e l v e c to r d e e x p re s ió n (o r ig e n p E T -26 , N o v a g e n ) , d a n d o p o r re s u lta d o la s e c u e n c ia c o d if ic a d a [Z # # # # # ]-G T -(G 4 S ) -P r -[Z # # # # # ]-L E H H H H H H y [Z # # # # # ]-G T -(G 4 S ) a-[Z # # # # # ]-L E H H H H H H , re s p e c t iv a m e n te .
C u lt iv o y p u r if ic a c ió n : C é lu la s d e E. c o li B L21 (D E 3 ) (N o v a g e n ) se tra n s fo rm a ro n c o n lo s p lá s m id o s q u e c o n te n ía n e l f ra g m e n to g é n ic o d e c a d a v a r ia n te Z d e u n ió n a F c R n re s p e c t iv a y s e c u lt iv a ro n a 37 °C e n 800 o 1000 m l d e m e d io T S B -Y E c o m p le m e n ta d o co n 50 p g /m l d e k a n a m ic in a . A O D 600 = 2, s e a g re g ó IP T G p a ra in d u c ir la e x p re s ió n a u n a c o n c e n tra c ió n f in a l d e 0 ,17 o 0 ,2 m M y e l c u lt iv o s e in c u b ó a 37 °C d u ra n te o tra s 5 h. L a s c é lu la s s e re c o le c ta ro n m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n .
A p ro x im a d a m e n te 2 -5 g d e c a d a u n o d e lo s s e d im e n to s c e lu la re s s e re s u s p e n d ió e n 10 -25 m l d e ta m p ó n d e u n ió n ( fo s fa to d e s o d io 20 m M , N a C l 0 ,5 M , im id a z o l 20 m M , pH 7 ,4 ) c o m p le m e n ta d o c o n B e n z o n a s e ® (M e rc k , ca t. No.
1.01654.0001 ) a u n a c o n c e n tra c ió n d e 15 U /m l y la lis o z im a (S ig m a , ca t. no . L -7651 ) a u n a c o n c e n tra c ió n d e 0 ,5 m g /m l. D e s p u é s d e la in te r ru p c ió n c e lu la r m e d ia n te t re s c ic lo s d e c o n g e la c ió n -d e s c o n g e la c ió n o t ra ta m ie n to co n u ltra s o n id o s , e l d e s e c h o c e lu la r s e re t iró m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n y c a d a s o b re n a d a n te s e a p lic ó s o b re u n a c o lu m n a H is G ra v iT ra p IM A C d e 1 m l (G E H e a lth c a re , ca t. no . 11 -0033 -99 ) . L o s c o n ta m in a n te s s e s e p a ra ro n m e d ia n te la v a d o c o n ta m p ó n d e la v a d o ( fo s fa to d e s o d io 20 m M , N a C l 0 ,5 M , im id a z o l 20 o 60 m M , pH 7 ,4 ), y la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a l F c R n s e e lu y e ro n p o s te r io rm e n te c o n ta m p ó n d e e lu c ió n 1 ( fo s fa to d e s o d io 20 m M , c lo ru ro d e s o d io 0 ,5 M, im id a z o l 250 m M , pH 7 ,4 ) o ta m p ó n d e e lu c ió n 2 (á c id o a c é tic o 0,1 M , c lo ru ro d e s o d io 0 ,5 M , pH 4 ,5 ). L a s v a r ia n te s Z p u r if ic a d a s s e in te rc a m b ia ro n p o r ta m p ó n a P B S u t il iz a n d o c o lu m n a s P D -10 (G E H e a lth c a re ) , d e a c u e rd o c o n e l p ro to c o lo d e l fa b r ic a n te .
L a s c o n c e n tra c io n e s d e p ro te ín a s s e d e te rm in a ro n a l m e d ir la a b s o rb a n c ia a 280 nm , u t i l iz a n d o un e s p e c tro fo tó m e tro N a n o D ro p ® N D -1000 , y u t i l iz a n d o e l c o e f ic ie n te d e e x t in c ió n d e la p ro te ín a re s p e c tiv a . L a p u re z a d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a l F c R n s e a n a liz ó m e d ia n te S D S -P A G E te ñ id o c o n a z u l C o o m a s s ie . L a id e n tid a d d e c a d a u n a d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n p u r if ic a d a s e c o n f irm ó u t il iz a n d o a n á lis is L C /M S .
A n á lis is C D : S e d ilu y e ro n v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s c o n H is 6 p u r if ic a d a s a 0 ,5 m g /m l en P B S . P a ra c a d a u n a d e las v a r ia n te s Z d ilu id a s , s e o b tu v o a 20 °C un e s p e c tro C D a 250 -195 n m o 250 -190 nm . A d e m á s , s e re a liz ó u n a m e d ic ió n d e la te m p e ra tu ra v a r ia b le (V T M ) p a ra d e te rm in a r la te m p e ra tu ra d e fu s ió n (T m ). En la V T M se m id ió la a b s o rb a n c ia a 221 n m m ie n tra s q u e la te m p e ra tu ra s e a u m e n tó d e 20 a 90 °C , c o n un d e c liv e d e te m p e ra tu ra d e 5 °C /m in . S e o b tu v o un n u e v o e s p e c tro C D a 20 °C d e s p u é s d e l p ro c e d im ie n to d e c a le n ta m ie n to c o n e l f in d e e s tu d ia r la c a p a c id a d d e re p le g a d o d e la s v a r ia n te s Z . L a s m e d ic io n e s C D s e re a liz a ro n s o b re un e s p e c tro p o la r ím e tro J a s c o J -810 (J a s c o S c a n d in a v ia A B ) u t i l iz a n d o u n a c e ld a c o n u n a lo n g itu d d e t ra y e c to r ia ó p tic a d e 1 m m .
A n á lis is d e u n ió n y c in é t ic a co n B ia c o re : L a in te ra c c ió n d e la s v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s c o n H is 6 d e u n ió n a F c R n co n e l F c R n h u m a n o se a n a liz ó e n un in s tru m e n to B ia c o re 2000 (G E H e a lth c a re ) . L a F c R n h u m a n a s e in m o v iliz ó e n u n a c e ld a d e f lu jo s o b re la c a p a d e d e x tra n o c a rb o x ila d o d e u n a s u p e r f ic ie co n c h ip C M 5 (G E H e a lth c a re ) . La in m o v iliz a c ió n s e re a liz ó u t i l iz a n d o q u ím ic a d e a c o p la m ie n to c o n a m in a d e a c u e rd o c o n e l p ro to c o lo d e l fa b r ic a n te y u t i l iz a n d o H B S -E P (G E H e a lth c a re ) c o m o ta m p ó n d e m ig ra c ió n . U n a s u p e r f ic ie d e la c e ld a d e f lu jo s o b re e l c h ip se a c t iv ó y se d e s a c tiv ó p a ra u t i l iz a rs e c o m o un v a c ío d u ra n te la s in y e c c io n e s d e a n a lito s . En lo s d o s e x p e r im e n to s d e u n ió n p re s e n ta d o s m á s a d e la n te , se u t iliz ó c o m o ta m p ó n d e m ig ra c ió n e l ta m p ó n fo s fa to -c it ra to M c llv a in e s pH 6 ,0 c o m p le m e n ta d o c o n T w e e n -20 a l 0 ,005 % ( P C T al 0 ,005 % ). E n to d o s lo s e x p e r im e n to s , s e u t iliz ó un c a u d a l d e 50 p l/m in .
E n un e x p e r im e n to , la d is o c ia c ió n a pH 6 ,0 s e c o m p a ró co n la d is o c ia c ió n a pH 7 ,4. S e d ilu y e ro n la s v a r ia n te s Z m a rc a d a s c o n H is 6 , y u n a IgG 1 m o n o c lo n a l h u m a n a e n ta m p ó n d e m ig ra c ió n a u n a c o n c e n tra c ió n f in a l d e 250 nM o 2 ,5 nM , re s p e c t iv a m e n te , y s e in y e c ta ro n s o b re e l c h ip d e F c R n d u ra n te 1 m in u to u t i l iz a n d o e l p ro c e d im ie n to d e c o ­ in y e c c ió n . L a s e g u n d a in y e c c ió n d e l p ro c e d im ie n to d e c o - in y e c c ió n , q u e re p re s e n ta la fa s e d e d is o c ia c ió n d e las in te ra c c io n e s , c o n te n ía y a s e a e l ta m p ó n d e m ig ra c ió n (p H 6 ,0 ) o P C T a l 0 ,005 % , pH 7 ,4. L a s v a r ia n te s Z s e d e ja ro n d is o c ia r d u ra n te 1 m in u to , e x c e p to p a ra Z 07918 y Z 10193 , q u e s e d e ja ro n d is o c ia r d u ra n te 4 m in u to s , a n te s d e un e q u ilib r io d e la s u p e r f ic ie d u ra n te 5 m in u to s en ta m p ó n d e m ig ra c ió n . La Ig G s e d e jó d is o c ia r d u ra n te 4 m in u to s a n te s d e l e q u ilib ra d o . L a s in y e c c io n e s d e ta m p ó n s e re a liz a ro n d e u n a fo rm a s im ila r; la c o - in y e c c ió n e n ta m p ó n pH 6 ,0 s e g u id a d e pH 6 ,0 o la c o - in y e c c ió n d e l ta m p ó n pH 6 ,0 s e g u id a d e pH 7 ,4. L o s re s u lta d o s s e a n a liz a ro n e n e l s o f tw a re B IA e v a lu a t io n 4.1 (G E H e a lth c a re ) . L a s c u rv a s en la s u p e r f ic ie v a c ía se e n re s ta ro n d e la s c u rv a s d e la s u p e r f ic ie co n lig a n d o . A d e m á s , la s c u rv a s d e la s in y e c c io n e s d e ta m p ó n s e re s ta ro n d e la s c u rv a s d e la v a r ia n te Z y d e la s c u rv a s co n Ig G p a ra a ju s ta r lo s e fe c to s d e l ta m p ó n .
E n o tro e x p e r im e n to , se d e te rm in a ro n la s c o n s ta n te s c in é t ic a s a p ro x im a d a s (K on y koff) y la s a f in id a d e s (K d ) p a ra un s u b c o n ju n to d e v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s co n H is 6. T re s c o n c e n tra c io n e s d e las v a r ia n te s Z s e in y e c ta ro n d u ra n te 1 m in u to s e g u id a d e la d is o c ia c ió n e n ta m p ó n d e m ig ra c ió n d u ra n te 1 m in u to . L o s s u s tra to s s e e q u ilib ra ro n c o n e l ta m p ó n d e m ig ra c ió n d u ra n te 7 ,5 m in u to s a n te s d e in ic ia r e l s ig u ie n te c ic lo . L a s c o n c e n tra c io n e s in y e c ta d a s fu e ro n
Figure imgf000035_0001
E n u n e x p e r i m e n t o p o r s e p a r a d o , l a a f i n i d a d d e l a s i n t e r a c c i o n e s d e l a s v a r i a n t e s Z p o r h F c R n ( S E Q ID N O : 379 ) y m F c R n ( S E Q ID N O : 384 ) , r e s p e c t i v a m e n t e , s e m i d i ó t a n t o a p H 6 , 0 c o m o a p H 7 , 4 e n u n i n s t r u m e n t o B i a c o r e 3000 ( G E H e a l t h c a r e ) . S e p r o d u j e r o n h F c R n y m F c R n e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 1, p e r o u t i l i z a n d o c é l u l a s 3 T 3 d e r a t ó n e n l u g a r d e c é l u l a s S K O V - 3 h u m a n a s p a r a l a p r o d u c c i ó n d e m F c R n , y s e i n m o v i l i z a r o n e n c e l d a s d e f l u j o s e p a r a d a s e n u n c h i p C M 5 e n t a m p ó n a c e t a t o a p H 4 , 65. E l n i v e l d e i n m o v i l i z a c i ó n f u e d e a p r o x i m a d a m e n t e 1000 R U p a r a a m b o s r e c e p t o r e s . S e c r e ó u n a c e l d a d e f l u j o d e r e f e r e n c i a m e d i a n t e a c t i v a c i ó n y d e s a c t i v a c i ó n . S e u t i l i z ó P C T a l 0 , 005 % , p H 6 , 0 o 7 , 4 c o m o t a m p ó n d e m i g r a c i ó n y p a r a d i l u c i ó n d e l o s a n a l i t o s . T o d o s l o s a n á l i s i s s e r e a l i z a r o n a 25 ° C . L a s c o n s t a n t e s d e a f i n i d a d p a r a l a s v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n H i s 6 Z 07918 ( S E Q ID N O : 1 ) , Z 07960 ( S E Q ID N O : 4 ) y Z 10193 ( S E Q ID N O : 2 ) s e d e t e r m i n a r o n a l i n y e c t a r u n a s e r i e d e d i l u c i o n e s d e 1024 n M a 0 , 5 n M ( p H 6 , 0 ) o d e 10240 n M a 5 n M ( p H 7 , 4 ) . L a s a f i n i d a d e s s e d e r i v a r o n u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e G r a p h P a d P r i s m 5 , u t i l i z a n d o u n m o d e l o d e s a t u r a c i ó n d e u n i ó n d e s i t i o ú n i c o .
Figure imgf000035_0002
R e s u l t a d o s
C u l t i v o y p u r i f i c a c i ó n : L a s d i e c i s i e t e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n ( S E Q ID N O : 1 - 16 y S E Q ID N O : 353 ) , c o n s t r u i d a s c o n u n a e t i q u e t a H i s 6 N - t e r m i n a l , s e p r o d u j e r o n e n E . c o l i . L a c a n t i d a d d e l a p r o t e í n a p u r i f i c a d a p o r I M A C p r o v e n i e n t e d e a p r o x i m a d a m e n t e 2 - 5 g d e s e d i m e n t o s b a c t e r i a n o s , d e t e r m i n a d a e s p e c t r o f o t o m é t r i c a m e n t e a l m e d i r l a a b s o r b a n c i a a 280 n m , v a r i ó d e a p r o x i m a d a m e n t e 10 m g a 20 m g p a r a l a s d i f e r e n t e s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n . E l a n á l i s i s p o r S D S - P A G E d e c a d a p r e p a r a c i ó n p r o t e í n i c a f i n a l m o s t r ó q u e é s t a s c o n t e n í a n p r e d o m i n a n t e m e n t e l a v a r i a n t e Z d e u n i ó n a l F c R n . L a i d e n t i d a d y e l p e s o m o l e c u l a r c o r r e c t o s d e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n s e c o n f i r m a r o n m e d i a n t e a n á l i s i s p o r H P L C - M S .
A n á l i s i s C D : L o s e s p e c t r o s C D d e t e r m i n a d o s p a r a s e i s v a r i a n t e s Z m o s t r a r o n q u e c a d a u n a t e n í a u n a e s t r u c t u r a a -h e l i c o i d a l a 20 ° C . E s t e r e s u l t a d o t a m b i é n s e v e r i f i c ó e n l a s m e d i c i o n e s d e t e m p e r a t u r a v a r i a b l e , e n d o n d e s e d e t e r m i n a r o n l a s t e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n ( T m ) ( T a b l a 3 ) . S e o b s e r v ó u n p l i e g u e r e v e r s i b l e p a r a l a s s e i s v a r i a n t e s Z c u a n d o s e m i d i e r o n l o s e s p e c t r o s d e s u p e r p o s i c i ó n a n t e s y d e s p u é s d e l c a l e n t a m i e n t o a 90 ° C .
T a b l a 3. T e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n p a r a u n a s e l e c c i ó n d e v a r i a n t e s Z .
V a r i a n t e Z S E Q ID N O : T m ( ° C )
Z 07909 13 56
Z 07918 1 49
Z 07930 6 56
Z 07960 4 58
Z 10109 3 61
Z 10193 2 59
A n á l i s i s d e u n i ó n y c i n é t i c a c o n B i a c o r e : L a u n i ó n d e d i e c i s i e t e v a r i a n t e s Z e t i q u e t a d a s c o n H i s 6 a l F c R n h u m a n o y l a d i s o c i a c i ó n a d i f e r e n t e p H s e s o m e t i e r o n a e n s a y o e n u n i n s t r u m e n t o B i a c o r e a l i n y e c t a r s e c u e n c i a l m e n t e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z a p H 6 , 0 y , c u a l q u i e r t a m p ó n a p H 6 , 0 o p H 7 , 4 s o b r e u n a s u p e r f i c i e d e l c h i p q u e c o n t e n í a F c R n . E l n i v e l d e i n m o v i l i z a c i ó n d e l i g a n d o d e l a s u p e r f i c i e f u e F c R n h u m a n o R U 1668. L a s d i e c i s i e t e v a r i a n t e s Z m o s t r a r o n u n i ó n a l F c R n a p H 6 , 0 , y p a r a t o d a s l a s v a r i a n t e s , s e o b s e r v a r o n c o n s t a n t e s d e d i s o c i a c i ó n m á s r á p i d a s a p H 7 , 4 e n c o m p a r a c i ó n c o n p H 6 , 0. E l r e s u l t a d o p a r a l a I g G f u e s i m i l a r , p r e s e n t a n d o u n a c o n s t a n t e d e d i s o c i a c i ó n m á s r á p i d a a p H 7 , 4. L a s v a r i a n t e s Z 07918 y Z 10193 m o s t r a r o n l a s c u r v a s d e d i s o c i a c i ó n m á s l e n t a s . L o s s e n s o g r a m a s p a r a u n s u b c o n j u n t o d e v a r i a n t e s e I g G s e e x h i b e n e n l a s f i g u r a s 2 A - E .
T a b l a 4. C o n s t a n t e s c i n é t i c a s c o n B i a c o r e y a f i n i d a d e s p a r a l a u n i ó n d e h F c R n a p H 6 , 0.
V a r i a n t e Z S E Q ID N O : kon ( M - V ) koff ( s -1) K d ( M ) Z 07918 1 1. 4 x 106 0.022 1.6 x 10 -8 Z 10140 5 1. 4 x 106 0.12 8.6 x 10 -8 Z 10156 11 7. 6 x 105 0.28 3.7 x 10 -7 Z 10183 7 1. 0 x 106 0.13 1.3 x 10 -7 Z 10193 2 1. 5 x 106 0.033 2.2 x 10 -8
S e d e t e r m i n a r o n l a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s d e c i n c o v a r i a n t e s Z q u e i n t e r a c t u a n c o n F c R n a p H 6 , 0 ( v é a s e l a T a b l a 4 ) . E l n i v e l d e i n m o v i l i z a c i ó n d e l a s u p e r f i c i e f u e F c R n h u m a n o 2015 R U . P a r a c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z , s e c a l c u l a r o n l a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s u t i l i z a n d o u n a j u s t e d e c u r v a d e t r e s c o n c e n t r a c i o n e s i n y e c t a d a s .
T a m b i é n s e d e t e r m i n a r o n l a s c o n s t a n t e s d e a f i n i d a d ( K d ) p a r a l a s v a r i a n t e s Z e t i q u e t a d a s c o n H i s 6 Z 07918 ( S E Q ID N O : 1) , Z 07960 ( S E Q ID N O : 4 ) y Z 10193 ( S E Q ID N O : 2 ) q u e i n t e r a c t ú a n c o n F c R n d e s e r h u m a n o y d e r a t ó n a p H 6 , 0 y p H 7 , 4 ( T a b l a 5 ) . P a r a l a s t r e s v a r i a n t e s , l o s v a l o r e s K d f u e r o n m e n o r e s a p H 6 , 0 e n c o m p a r a c i ó n c o n p H 7 , 4.
T a b l a 5. A f i n i d a d e s m e d i a n t e B i a c o r e p a r a h F c R n y m F c R n a p H 6 , 0 y p H 7 , 4.
S E Q ID N O : K d ( M ) h F c R n K d ( M ) m F c R n
V a r i a n t e Z
p H 6.0 p H 7.4 p H 6.0 p H 7.4
Z 07918 1 1.2 x 10 a > 5 x 107 9.0 x 10 a > 5 x 107
Z 07960 4 5.0 x 10 a > 1 x 10 ® 3.5 x 1 c ) 7 > 5 x 106
Z 10193 2 1.4 x 10 a > 5 x 107 9.5 x 10 a > 5 x 107
Figure imgf000036_0001
E j e m p l o 4
U n i ó n d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a l F c R n a c é l u l a s H e L a t r a n s f e c t a d a s Z F c R n / e G F P d e s e r h u m a n o o r a t ó n E n e s te E je m p lo , s e in v e s t ig ó la c a p a c id a d d e u n ió n d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n . S e d e s c r ib e la p ro d u c c ió n d e c é lu la s H e L a q u e e x p re s a n e l t ra n s g é n d e l g e n F c R n -e G F P h u m a n o y m u r in o y e l u s o d e e s ta s c é lu la s p a ra a n á lis is d e c ito m e tr ía d e f lu jo c o n v a r ia n te s Z m a rc a d a s c o n A le x a F lu o r® 647.
M a te r ia le s y m é to d o s
C lo n a c ió n d e v e c to re s v ira le s F c R n -e G F P y B 2 M : L o s g e n e s q u e c o d if ic a n F c R n m u r in a (m F c R n , G e n b a n k B C 003786.1 , O p e n B io s y s te m s ) y B 2 M m u r in a (B C 085164.1 m B 2 M , G e n B a n k , O p e n B io s y s te m s ) s e a m p lif ic a ro n de u n a fo rm a s im ila r a lo s g e n e s p a ra F c R n h u m a n a y B 2 M h u m a n a c o m o se d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 1. L o s g e n e s de F c R n y B 2 M d e s e r h u m a n o y m u r in o s e a m p li f ic a ro n c o m o s ig u e : p a ra h F c R n s e a m p li f ic ó la s e c u e n c ia q u e c o d if ic a lo s a m in o á c id o s 1 -365 (S E Q ID N O : 382 ); p a ra H B 2 M s e a m p lif ic ó la s e c u e n c ia q u e c o d if ic a los a m in o á c id o s 21 -119 (S E Q ID N O : 380 ); p a ra m F c R n s e a m p lif ic ó la s e c u e n c ia q u e c o d if ic a lo s a m in o á c id o s 1 -369 (S E Q ID N O : 383 ); y p a ra m B 2 M s e a m p lif ic ó la s e c u e n c ia q u e c o d if ic a lo s a m in o á c id o s 21 -119 (S E Q ID N O : 381 ). E l v e c to r p H R -c P P T -C M V -E G F P (J a k o b s s o n e t a l. (2003 ) J N e u ro s c i R e s 73 :876 -85 ) y lo s a m p lic o n e s P C R d e F c R n (s e r h u m a n o y m u r in o ) s e c o r ta ro n u t il iz a n d o la s e n z im a s d e re s tr ic c ió n B a m H I (h u m a n a ) o B c ll (m u r in a ) y M lu l (N e w E n g la n d B io la b s , ca t. n o s . R 0136 M , R 0160 L y R 0198 L , re s p e c t iv a m e n te ) , y s e lig a ro n u t iliz a n d o la l ig a s a d e A D N T 4 (N e w E n g la n d B io la b s , ca t. no. M 0202 M ). L a m e z c la d e l ig a m ie n to s e t ra n s fo rm ó q u ím ic a m e n te en R R IAM 15 d e E. c o li y s e e x te n d ió s o b re p la c a s c o n a m p ic i l in a . L a s c o lo n ia s s e re c o le c ta ro n y s e s e le c c io n a ro n co n p a re s d e c e b a d o re s a d e c u a d o s . L a e s tru c tu ra q u e c o d if ic a e l p é p tid o s e ñ a l o r ig in a l, F c R n h u m a n a o m u r in a y e G F P e n la c o la c ito p lá s m ic a se v e r i f ic a ro n m e d ia n te s e c u e n c ia c ió n y s e d e s ig n a ro n p H R -c P P T -C M V -h F c R n -e G F P y p H R -c P P T -C M V -m F c R n -e G F P , re s p e c t iv a m e n te .
L o s a m p lic o n e s P C R d e B 2 M h u m a n a y m u r in a s e in s e r ta ro n e n e l p lá s m id o p D O N O R 221 ( In v it ro g e n , ca t. no.
12536 -017 ) m e d ia n te re c o m b in a c ió n u t il iz a n d o e l s is te m a G a te w a y ( In v it ro g e n , ca t. N o . 11789020 , G a te w a y ® B P C lo n a s e ® II E n z y m e m ix ) d e a c u e rd o c o n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . D e s p u é s d e la v e r i f ic a c ió n d e las s e c u e n c ia s c o rre c ta s , s e in s e r tó B 2 M h u m a n a o m u r in a e n p 2 k 7 _ g tc (S u te r e t a l., s u p ra ) u t i l iz a n d o un s is te m a d e c lo n a c ió n c o n a c c e s o d e m ú lt ip le s s it io s ( In v it ro g e n , ca t. N o. 11791020 , G a te w a y ® L R C lo n a s e ® II E n z y m e m ix ) ju n to c o n e l p lá s m id o q u e c o n t ie n e e l p ro m o to r p E N T R -C M V (T a i e t a l. s u p ra ) , d a n d o p o r re s u lta d o los v e c to re s 2 K 7 neo-C M V -h B 2 M y 2 k 7 neo-C M V -m B 2 M , re s p e c t iv a m e n te .
T ra n s d u c c ió n le n t iv ira l d e c é lu la s H e L a : L o s p a re s d e v e c to re s 2 k 7 neo-C M V -H B 2 M y P H R -c P P T -C M V -h F c R n -e G F P o 2 k 7 neo-C M V -m B 2 M y P H R -c P P T -C M V -m F c R n -e G F P se c o - tra n s fe c ta ro n ju n to co n e l p lá s m id o c o n e n v o ltu ra V S V -G y d e e m p a q u e g a g /p o l e n c é lu la s H E K 293 T u t il iz a n d o t ra n s fe c c ió n co n c lo ru ro d e c a lc io (Z u ffe re y e t a l., s u p ra ; J a k o b s s o n e t al. (2006 ) s u p ra ) . L o s s o b re n a d a n te s d e c u lt iv o H E K 293 T q u e c o n te n ía n la s p a r t íc u la s le n tiv ira le s fo rm a d a s c o n lo s t ra n s g e n e s F c R n y B 2 M , re s p e c t iv a m e n te s e u t il iz a ro n p a ra t r a n s d u c ir s e c u e n c ia lm e n te c é lu la s de a d e n o c a rc in o m a H e L a C e rv ix (C e ll L in e S e rv ic e ) a n ú m e ro d e p a s a je b a jo . L a s d o s lín e a s d e c é lu la s H e L a t r a n s d u c id a s e s ta b le m e n te re s u lta n te s e s tá n en e l s ig u ie n te d e s ig n a d o h F c R n -e G F P ( t ra n s d u c id o c o n los g e n e s p a ra F c R n -e G F P y H B 2 M h u m a n o s ) y m F c R n -e G F P ( tra n s d u c id o c o n lo s g e n e s p a ra F c R n -e G F P y m B 2 M de ra tó n ).
M a rc a je c o n A le x a F lu o r® 647 d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n : L a s t re s v a r ia n te s Z m a rc a d a s c o n H is 6 Z 07918 , Z 07930 Z 07960 se m a rc a ro n c o n s u c c in im id i lé s te r d e l á c id o c a rb o x í lic o A le x a F lu o r® 647 ( In v it ro g e n ca t. No. A 20106 ) . A n te s d e m a rc a r, e l ta m p ó n s e in te rc a m b ió a ta m p ó n c a rb o n a to 0 ,2 M , pH 8 ,3 , u t i l iz a n d o u n id a d e s d e f ilt ro p a ra c e n tr í fu g a V iv a s p in 500 (10 k D a M W C O , V iv a p ro d u c ts ca t. no. 512 -2838 ) c e n tr ifu g a d a s a 10.000 g. E l m a rc a je s e re a liz ó e n e l V iv a s p in 500 y 1 p l d e c o lo ra n te d e s u c c in im id i lé s te r A le x a F lu o r® 647 (40 p g /p l e n D M S O c o rre s p o n d ie n te a 1 ,3 x d e e x c e s o m o la r ) s e a g re g ó a 200 p g /25 p l d e la v a r ia n te Z. L a s m e z c la s s e in c u b a ro n a R T e n la o s c u r id a d d u ra n te 40 m in u to s e n u n a ro to m e z c la d o ra c o n m o v im ie n to . L a s m e z c la s d e re a c c ió n s e c o lo c a ro n p o s te r io rm e n te s o b re h ie lo d u ra n te 3 ,5 h o ra s y e l c o lo ra n te lib re s e re t iró m e d ia n te la v a d o c o n 15 x 100 p l d e P B S e n e l V iv a s p in 500.
T in c ió n p o r in m u n o f lu o re s c e n c ia d e c é lu la s H e L a tra n s fe c ta d a s c o n F c R n -e G F P h u m a n a y d e ra tó n c o n v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n : M e d ia n te tr ip s in iz a c ió n s e re c o le c ta ro n c é lu la s H e L a d e h F c R n -e G F P y m F c R n -e G F P y se la v a ro n d o s v e c e s e n P B S a pH 6 ,0 a n te s d e l re c u e n to . S e p ip e te a ro n 100.000 c é lu la s p o r p o c illo d e u n a p la c a d e 96 p o c il lo s d e fo n d o e n v (N u n c , ca t. no. 277143 ) y la s c é lu la s en la p la c a s e s e d im e n ta ro n p o s te r io rm e n te a 1.700 rp m d u ra n te 4 m in a 4 °C . L o s s o b re n a d a n te s s e re t ira ro n y la s c é lu la s s e f i ja ro n co n 50 p l d e 2 % d e fo rm a ld e h íd o (S ig m a A ld r ic h , ca t. N o . F 8775 ) e n P B S a pH 6 ,0 d u ra n te 10 m in u to s a R T . L a s c é lu la s s e la v a ro n d e s p u é s d e e s to c o n 2 x 100 p l d e P B S , pH 6 ,0 , se s a tu ra ro n c o n c a s e ín a (P B S C ), y s e re -s u s p e n d ie ro n e n P B S C c o n 0 ,1 % d e s a p o n in a (A p p liC h e m , ca t. N o . A 4518.0100 ) q u e c o n te n ía 620 nM d e v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s co n H is 6 m a rc a d a s c o n A le x a F lu o r® 647 ; Z 07960 , Z 07930 y Z 07918. L a s c é lu la s H e L a tra n s d u c id a s , in c u b a d a s co n ta m p ó n so lo , se u t iliz a ro n c o m o c o n tro l. L a s c é lu la s s e in c u b a ro n d u ra n te 1 h a 8 °C e n u n a m e z c la d o ra e n la o s c u r id a d , s e la v a ro n c o n 2 x 100 p l d e P B S C y s e re -s u s p e n d ie ro n e n 180 p l d e P B S , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía 1 % d e B S A ( fra c c ió n V, M e rc k , ca t. No.
1.12018.0100 ) . S e a n a liz a ro n 10.000 c é lu la s /p o c il lo e n un c itó m e tro d e f lu jo G a llio s (B e c k m a n C o u lte r ) y lo s d a to s s e a n a liz a ro n u t il iz a n d o e l s o f tw a re d e K a lu z a (B e c k m a n C o u lte r) .
R e s u lta d o s
S e u t iliz ó a n á lis is p o r c ito m e tr ía d e f lu jo p a ra d e te rm in a r s i la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n s e p o d ría n u n ir a F c R n
Figure imgf000038_0001
E j e m p l o 5
B l o q u e o d e l a u n i ó n d e I g G a F c R n c o n l a v a r i a n t e Z d e u n i ó n a F c R n Z 07918
Figure imgf000038_0002
E j e m p l o 6
E s t u d i o f a r m a c o c i n é t i c o d e t r e s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a l F c R n
E n e s t e E j e m p l o s e i n v e s t i g ó l a c a p a c i d a d d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n d e p r o l o n g a r l a s e m i v i d a e n s u e r o d e u n a v a r i a n t e Z n o e s p e c í f i c a m e d i a n t e u n e s t u d i o f a r m a c o c i n é t i c o r e a l i z a d o e n r a t o n e s .
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
S u b c l o n a c i ó n d e v a r i a n t e s Z : U n s u b c o n j u n t o d e v a r i a n t e s Z ( Z 07918 , Z 07960 Z 10193 ) s e s o m e t i ó a u n a s e g u n d a s u b c l o n a c i ó n . S e u t i l i z ó c o m o m o l d e e l A D N p r o v e n i e n t e d e l a s v a r i a n t e s e t i q u e t a d a s c o n H i s 6 s u b c l o n a d a s e n e l E j e m p l o 3. E n p r i m e r l u g a r , s e r e a l i z ó u n a a m p l i f i c a c i ó n m e d i a n t e P C R u t i l i z a n d o p a r e s d e c e b a d o r e s a d e c u a d o s p a r a c r e a r g e n e s q u e c o d i f i c a n l a s v a r i a n t e s Z p a r t i e n d o d e l o s a m i n o á c i d o s A E e n l u g a r d e V D . L a s v a r i a n t e s Z m u t a d a s s e l i s t a n e n l a f i g u r a 1, y s e d e s i g n a n Z 11948 ( S E Q ID N O : 354 ) , Z 11946 ( S E Q ID N O : 355 ) y Z 11947 ( S E Q ID N O : 356 ) , q u e c o r r e s p o n d e n a l a s Z 07918 , Z 07960 y Z 10193 m u t a d a s , r e s p e c t i v a m e n t e . L o s g e n e s q u e c o d i f i c a n l a s n u e v a s v a r i a n t e s Z s e e s c i n d i e r o n m e d i a n t e r e s t r i c c i ó n y s e l i g a r o n e n u n v e c t o r q u e a l b e r g a l o s g e n e s q u e c o d i f i c a n l a v a r i a n t e d e u n i ó n c o n a l b ú m i n a P P 013 ( S E Q ID N O : 377 ) y Z 03638 ( s E q ID N O : 378 ) c o n s e c u e n c i a s s e p a r a d o r a s q u e d a n p o r r e s u l t a d o u n a c o d i f i c a c i ó n d e f u s i ó n g é n i c a [ Z # # # # # ] - G A P ( G 4 S ) 4 T S -[ P P 013 ] -G T ( G 4 S ) 4 P R -[ Z 03638 ] ( t a m b i é n d e s i g n a d o “Z # # # # # - P P 013 - Z 03638 ” o “v a r i a n t e Z e n f u s i ó n c o n P P 013 - Z 03638 ”). L a m o l é c u l a d e c o n t r o l n e g a t i v o [ Z 03638 ] - G A P ( G 4 S ) 4 T S -[ P P 013 ] s e s u b c l o n ó d e u n a f o r m a s i m i l a r a l l i g a r Z 03638 e n u n v e c t o r q u e c o n t i e n e u n e n l a z a d o r ( G 4 S )4 y l a s e c u e n c i a p a r a P P 013. L o s p a s o s p o s t e r i o r e s p a r a l a t r a n s f o r m a c i ó n d e v e c t o r e s e n E . c o l i s e r e a l i z a r o n c o m o e n e l E j e m p l o 3.
C u l t i v o y p u r i f i c a c i ó n : S e p r o d u j e r o n v a r i a n t e s Z e n f u s i ó n c o n P P 013 - Z 03638 e n E . c o l i c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3. A p r o x i m a d a m e n t e 3 g d e c a d a u n o d e l o s s e d i m e n t o s c e l u l a r e s s e r e - s u s p e n d i ó e n 30 m l d e t a m p ó n T S T ( T r i s - H C l 25 m M , E D T A 1 m M , N a C l 200 m M , T w e e n 20 a l 0 , 05 % , p H 8 , 0 ) c o m p l e m e n t a d o c o n B e n z o n a s e ® ( M e r c k ) .
D e s p u é s d e l a r u p t u r a d e c é l u l a s m e d i a n t e u l t r a s o n i d o s y c l a r i f i c a c i ó n m e d i a n t e c e n t r i f u g a c i ó n , c a d a u n o d e l o s s o b r e n a d a n t e s s e a p l i c ó s o b r e u n a c o l u m n a d e f l u j o p o r g r a v e d a d c o n 5 m l d e a g a r o s a i n m o v i l i z a d a c o n u n l i g a n d o a n t i - A B D ( v é a s e e l d o c u m e n t o W O 2014 / 064237 ) . D e s p u é s d e l a v a r c o n t a m p ó n T S T y t a m p ó n N H 4A c 5 m M , p H 5 , 5 , l a s v a r i a n t e s Z s e e l u y e r o n c o n H A c 0 , 1 M . S e a g r e g ó a c e t o n i t r i l o ( A C N ) a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 10 % a l a s f r a c c i o n e s e l u i d a s p r o v e n i e n t e s d e l p a s o d e p u r i f i c a c i ó n m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a p o r a f i n i d a d c o n a g a r o s a a n t i - A B D y l a s m u e s t r a s s e c a r g a r o n e n u n a c o l u m n a R e s o u r c e 15 R P C d e 3 m l ( G E H e a l t h c a r e ) , e q u i l i b r a d a p r e v i a m e n t e c o n d i s o l v e n t e R P C A ( á c i d o t r i f l u o r o a c é t i c o ( T F A ) a l 0 , 1 % , 10 % d e A C N , 90 % d e a g u a ) . D e s p u é s d e l a v a r l a c o l u m n a c o n e l d i s o l v e n t e R P C A , s e e l u y ó l a p r o t e í n a u n i d a c o n u n g r a d i e n t e l i n e a l 0 - 50 % d e d i s o l v e n t e R P C B ( T F A a l 0 , 1 % , 80 % d e A C N , 20 % d e a g u a ) d u r a n t e 60 m i n . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n l a v a r i a n t e Z p u r a s e i d e n t i f i c a r o n m e d i a n t e a n á l i s i s S D S - P A G E y s e a g r u p a r o n . D e s p u é s d e l a p u r i f i c a c i ó n m e d i a n t e R P C , e l t a m p ó n d e l a a g r u p a c i ó n s e i n t e r c a m b i ó a P B S u t i l i z a n d o u n a c o l u m n a d e d e s a l a c i ó n H i P r e p 26 / 10 ( G E H e a l t h c a r e ) . P o r ú l t i m o , l a s v a r i a n t e s Z s e p u r i f i c a r o n e n c o l u m n a s E n d o T r a p R e d d e 1 m l ( H y g l o s , c a t . n o . 321063 ) p a r a a s e g u r a r e l b a j o c o n t e n i d o d e e n d o t o x i n a s .
L a s c o n c e n t r a c i o n e s d e p r o t e í n a s , l a s p u r e z a s y l a i d e n t i d a d d e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z p u r i f i c a d a s s e a n a l i z a r o n c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3.
A n á l i s i s B i a c o r e : L a s v a r i a n t e s Z e x p r e s a d a s y p u r i f i c a d a s f u s i o n a d a s a P P 013 - Z 03638 s e a n a l i z a r o o n f r e n t e a F c R n h u m a n a a p H 6 , 0 e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó p a r a e l a n á l i s i s c i n é t i c o e n e l E j e m p l o 3. L a s v a r i a n t e s Z y l a Z 03638 - P P 013 d e c o n t r o l n e g a t i v o s e i n y e c t a r o n a 40 n M , 160 n M y 640 n M d u r a n t e 1 m i n u t o , s e g u i d o d e d i s o c i a c i ó n d u r a n t e 2 , 5 m i n u t o s y e q u i l i b r a d o d u r a n t e 1 m i n u t o . L a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s y a f i n i d a d e s s e d e t e r m i n a r o n p a r a l a s v a r i a n t e s Z u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e B i a E v a l u a t i o n .
Figure imgf000039_0001
R e s u l t a d o s
C u l t i v o y p u r i f i c a c i ó n : L a s t r e s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n Z 11947 , Z 11946 y Z 11948 ( S E Q ID N O : 356 , 355 y 354 ) , c o n s t r u i d a s c o m o Z # # # # # - P P 013 - Z 03638 , y l a Z 03638 - P P 013 d e c o n t r o l n e g a t i v o , s e p r o d u j e r o n e n E . c o l i . L a c a n t i d a d d e p r o t e í n a p u r i f i c a d a p r o v e n i e n t e d e a p r o x i m a d a m e n t e 3 g d e s e d i m e n t o s b a c t e r i a n o s , d e t e r m i n a d a e s p e c t r o f o t o m é t r i c a m e n t e a l m e d i r l a a b s o r b a n c i a a 280 n m , v a r i ó d e a p r o x i m a d a m e n t e 10 a 25 m g p a r a l a s d i f e r e n t e s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n . E l a n á l i s i s S D S - P A G E d e c a d a u n a d e l a s p r e p a r a c i o n e s d e p r o t e í n a s f i n a l e s d e m o s t r ó q u e c o n t e n í a n p r e d o m i n a n t e m e n t e l a v a r i a n t e Z d e u n i ó n a F c R n r e s p e c t i v a . E l p e s o m o l e c u l a r c o r r e c t o d e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n s e c o n f i r m ó m e d i a n t e a n á l i s i s L C / M S .
T a b l a 7. C o n s t a n t e s c i n é t i c a s y a f i n i d a d e s p a r a e l F c R n a p H 6 , 0 d e l a s v a r i a n t e s Z p r o d u c i d a s c o m o f u s i o n e s a P P 013 - Z 03638 .
V a r i a n t e Z S E Q ID N O : kon ( M - V ) k o f f ( s - 1) K d ( M )
Z 11948 354 7 .73 x 105 0. 047 6.2 x 10 -8 Z 11946 355 3 .35 x 105 0. 275 8. 2 x 10 -7 Z 11947 356 6. 54 x 105 0. 064 9. 8 x 10 -8
A n á l i s i s B i a c o r e : S e a n a l i z ó l a u n i ó n a F c R n p a r a l a s t r e s v a r i a n t e s Z f u s i o n a d a s a P P 013 - Z 03638. E l n i v e l d e i n m o v i l i z a c i ó n d e l a s u p e r f i c i e f u e 548 R U d e F c R n h u m a n a . L a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s e n b r u t o y a f i n i d a d e s r e s u l t a n t e s p a r a l a d i a n a q u e s e u n e a p H 6 , 0 s e e x h i b e n e n l a T a b l a 7. L a s c u r v a s a j u s t a d a s s e e x i b e n e n l a s f i g u r a s 7 A - C . E l Z 03638 - P P 013 d e c o n t r o l n e g a t i v o f u e n e g a t i v o f r e n t e a F c R n .
E s t u d i o f a r m a c o c i n é t i c o : L o s p e r f i l e s f a r m a c o c i n é t i c o s d e l a s e s t r u c t u r a s m e n c i o n a d a s a n t e r i o r m e n t e d e l a s v a r i a n t e s Z f u s i o n a d a s a P P 013 - Z 03638 s e c o m p a r a r o n c o n e l Z 03638 - P P 013 d e c o n t r o l n e g a t i v o e n u n e s t u d i o f a r m a c o c i n é t i c o e n r a t o n e s . E n u n t r a b a j o a n t e r i o r , p o r e j e m p l o , c o m o s e d e s c r i b e e n l a s o l i c i t u d P C T W O 2009 / 016043 , s e d e m u e s t r a q u e l a s p r o t e í n a s d e f u s i ó n A B D t i e n e n u n a s e m i v i d a l a r g a e n s u e r o , p r o v o c a d a p o r l a u n i ó n A B D a l a a l b ú m i n a s é r i c a . D e a c u e r d o c o n l o s r e s u l t a d o s a n t e r i o r e s , l a s e m i v i d a t e r m i n a l d e l a m o l é c u l a d e l a v a r i a n t e Z f u s i o n a d a A B D ( Z 03638 - P P 013 ) f u e d e a p r o x i m a d a m e n t e 43 h o r a s , l a c u a l s e p u d o c o m p a r a r c o n la s e m i v i d a d e a l b ú m i n a d e r a t ó n ( 35 h o r a s ) . L a s s e m i v i d a s t e r m i n a l e s d e l a s c o n s t r u c c i o n e s q u e c o n t i e n e n la m o l é c u l a d e l a v a r i a n t e Z d e u n i ó n a F c R n , a d e m á s d e A B D , f u e r o n d o s a t r e s v e c e s m á s l a r g a s ( f i g u r a 8 ) . L a s s e m i v i d a s t e r m i n a l e s c a l c u l a d a s f u e r o n 99 h o r a s ( Z 11947 ) , 69 h o r a s ( Z 11946 ) y 58 h o r a s ( Z 11948 ) , lo q u e s u g i e r e q u e l a u n i ó n a F c R n d e l a s v a r i a n t e s Z c o n t r i b u y ó a l a s e m i v i d a p r o l o n g a d a .
E j e m p l o 7
D i s e ñ o y c o n s t r u c c i ó n d e u n a c o l e c c i ó n d e m a d u r a c i ó n d e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n
E n e s t e E j e m p l o s e c o n s t r u y ó u n a c o l e c c i ó n m a d u r a d a . L a c o l e c c i ó n s e u t i l i z ó p a r a s e l e c c i o n e s d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n . L a s s e l e c c i o n e s a p a r t i r d e l a s c o l e c c i o n e s m a d u r a d a s u s u a l m e n t e s e e s p e r a q u e d e n p o r r e s u l t a d o a g l u t i n a n t e s c o n a f i n i d a d i n c r e m e n t a d a ( O r l o v a e t a l . , ( 2006 ) C a n c e r R e s 66 ( 8 ) : 4339 - 48 ) . E n e s t e e s t u d i o , s e g e n e r a r o n e n l a z a d o r e s d e c a d e n a i n d i v i d u a l s o r t e a d o s a l e a t o r i a m e n t e u t i l i z a n d o s í n t e s i s d e g r u p o s d i v i d i d o s , lo q u e p e r m i t e l a i n c o r p o r a c i ó n d e c o d o n e s d e f i n i d o s e n l a s p o s i c i o n e s d e s e a d a s e n l a s í n t e s i s .
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
D i s e ñ o d e l a c o l e c c i ó n : L a c o l e c c i ó n s e b a s ó e n l a s d i e c i s é i s s e c u e n c i a s d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n h u m a n a e n l a T a b l a 1 y s e d e s c r i b e a d i c i o n a l m e n t e e n l o s E j e m p l o s 2 - 6. E n l a n u e v a c o l e c c i ó n , 13 p o s i c i o n e s v a r i a b l e s e n e l a r m a z ó n d e l a m o l é c u l a Z s e d e s v i a r o n h a c i a c i e r t o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s , d e a c u e r d o c o n u n a e s t r a t e g i a b a s a d a p r i n c i p a l m e n t e e n l o s m o t i v o s d e u n i ó n d e l a s v a r i a n t e s Z d e f i n i d o s e n l a s S E Q ID N O : 1 - 16. S e g e n e r ó u n e n l a z a d o r d e A D N u t i l i z a n d o s í n t e s i s d e g r u p o s d i v i d i d o s q u e c o n t e n í a l a s h é l i c e s 1 y 2 a l e a t o r i z a d a s p a r c i a l m e n t e d e m a n e r a a l e a t o r i a c o n 147 p b d e l a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s : 5 ' - A A A T A A A T C T C G A G G T A G A T G C C A A A T A C G C C A A A G A A N N N N N N N N N G C G N N N N N N G A G A T C N N N N N N T T A C C T A A C T T A A C C N N N N N N C A A N N N N N N G C C T T C A T C N N N A A A T T A N N N G A T G A C C C A A G C C A G A G C T C A T T A T T T A - 3 ' ( S E Q ID N O : 388 ; l o s c o d o n e s a l e a t o r i z a d o s s e i l u s t r a n c o m o N N N ) f l a n q u e a d o s p o r l o s s i t i o s d e r e s t r i c c i ó n X h o l y S a c I , s e o r d e n ó a p a r t i r d e A D N 2.0 ( M e n l o P a r k , C A , U S A ) . E n l a T a b l a 8 s e p r o p o r c i o n a n l a s d i s t r i b u c i o n e s t e ó r i c a s d e l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s e n l a n u e v a c o l e c c i ó n , i n c l u y e n d o o c h o p o s i c i o n e s d e a m i n o á c i d o s v a r i a b l e s ( 9 , 10 , 11 , 13 , 14 , 24 , 32 y 35 ) y c i n c o p o s i c i o n e s d e a m i n o á c i d o s c o n s t a n t e s ( 17 , 18 , 25 , 27 y 28 ) e n e l a r m a z ó n d e l a m o l é c u l a Z . E l t a m a ñ o t e ó r i c o d e l a c o l e c c i ó n r e s u l t a n t e e s d e 5 , 3 x 108 v a r i a n t e s .
T a b l a 8 : D i s e ñ o d e u n a c o l e c c i ó n p a r a m a d u r a c i ó n .
Figure imgf000040_0001
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C o n s tru c c ió n d e la c o le c c ió n : La c o le c c ió n s e a m p lif ic ó u t i l iz a n d o la p o lim e ra z a A m p liT a q G o ld (A p p lie d B io s y s te m s , c a t. no. 4311816 ) d u ra n te 12 c ic lo s d e P C R y lo s p ro d u c to s a g ru p a d o s s e p u r if ic a ro n co n e l k it d e p u r if ic a c ió n Q IA q u ic k P C R (Q IA G E N , ca t. no. 28106 ) d e a c u e rd o co n la s re c o m e n d a c io n e s d e l p ro v e e d o r. L a a g ru p a c ió n p u r if ic a d a d e lo s f ra g m e n to s d e la c o le c c ió n a le a to r iz a d o s se d ig ir ió c o n la s e n z im a s d e re s tr ic c ió n X h o I y S a c I-H F (N e w E n g la n d B io la b s , ca t. no. R 0146 L , y ca t. no . R 3156 M ) y s e c o n c e n tró u t i l iz a n d o un k it d e p u r if ic a c ió n P C R . P o s te r io rm e n te , e l p ro d u c to s e s o m e tió a e le c tro fo re s is e n g e l p re p a ra tiv a co n a g a ro s a a l 2 ,5 % (N u is ie v e G T C a g a ro s e , C a m b re x , In v it ro g e n ) y s e p u r if ic ó u t iliz a n d o e l k it p a ra e x tra c c ió n d e g e l Q IA G E N (Q IA G E N , ca t. No.
28706 ) d e a c u e rd o c o n la s re c o m e n d a c io n e s d e l p ro v e e d o r.
E l v e c to r fa g é m id o p A Y 02592 (e s e n c ia lm e n te c o m o e l p A ffi1 d e s c r ito e n G ro n w a ll e t a l., s u p ra ) s e re s tr in g ió c o n las m is m a s e n z im a s , se p u r if ic ó u t i l iz a n d o e x tra c c ió n c o n fe n o l/c lo ro fo rm o y p re c ip ita c ió n co n e ta n o l. L o s fra g m e n to s re s tr in g id o s y e l v e c to r re s tr in g id o s e lig a ro n e n u n a re la c ió n m o la r d e 5 :1 co n la l ig a s a T 4 A D N (F e rm e n ta s , c a t. no. E L 0011 ) d u ra n te 2 h o ra s a R T , s e g u id o d e in c u b a c ió n d u ra n te la n o c h e a 4 °C . E l A D N lig a d o se re c u p e ró m e d ia n te e x tra c c ió n co n fe n o l/c lo ro fo rm o y p re c ip ita c ió n d e e ta n o l, s e g u id o d e d is o lu c ió n e n T r is -H C l 10 m M , pH 8 ,5. D e e s ta fo rm a , la c o le c c ió n re s u lta n te e n la s v a r ia n te s Z c o d if ic a d a s p o r e l v e c to r p A Y 02592 , c a d a u n a se fu s io n ó a un d o m in io d e u n ió n a a lb ú m in a (A B D ) d e r iv a d o d e la p ro te ín a G e s tre p to c ó c ic a .
L a s re a c c io n e s d e lig a m ie n to (a p ro x im a d a m e n te 160 ng d e A D N /t ra n s fo rm a c ió n ) s e s o m e tie ro n a e le c t ro p o re s is en c é lu la s E R 2738 d e E. c o li e le c t ro c o m p e te n te s (50 pl, L u c ig e n , M id d le to n , W I, U S A ). In m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la e le c t ro p o ra c ió n , s e a g re g ó a p ro x im a d a m e n te 1 m l d e l m e d io d e re c u p e ra c ió n (s u m in is tra d o c o n la s c é lu la s E R 2738 ). L a s c é lu la s t r a n s fo rm a d a s s e in c u b a ro n a 37 °C d u ra n te 60 m in . S e e x tra je ro n m u e s tra s p a ra t itu la c ió n y p a ra la d e te rm in a c ió n d e l n ú m e ro d e tra n s fo rm a n te s . L a s c é lu la s se a g ru p a ro n d e s p u é s d e e s to y se c u lt iv a ro n d u ra n te la n o c h e a 37 °C e n 1 l d e m e d io T S B -Y E , c o m p le m e n ta d o co n 2 % d e g lu c o s a , 10 p g /m l d e te t ra c ic l in a y 100 p g /m l d e a m p ic i l in a . L a s c é lu la s s e s e d im e n ta ro n d u ra n te 7 m in a 4.000 g y s e re -s u s p e n d ie ro n en u n a s o lu c ió n de P B S /g lic e ro l ( a p ro x im a d a m e n te 40 % d e g lic e ro l) . L a s c é lu la s s e d iv id ie ro n en p a rte s a líc u o ta s y s e a lm a c e n a ro n a -80 °C . L o s c lo n e s p ro v e n ie n te s d e la c o le c c ió n d e v a r ia n te s Z s e s e c u e n c ia ro n p a ra v e r i f ic a r e l c o n te n id o y e v a lu a r e l re s u lta d o d e la c o le c c ió n c o n s tru id a v is -a -v is e l d is e ñ o d e la c o le c c ió n . L a s e c u e n c ia c ió n s e re a liz ó c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 1 y s e v e r i f ic ó la d is tr ib u c ió n d e a m in o á c id o s .
P re p a ra c ió n d e la re s e rv a d e fa g o s : S e p re p a ró u n a re s e rv a d e fa g o s q u e c o n te n ía la c o le c c ió n d e fa g é m id o s e n un fe rm e n ta d o r d e 20 l (B e la c h B io te k n ik ) . L a s c é lu la s p ro v e n ie n te s d e u n a re s e rv a d e g lic e ro l q u e c o n te n ía la c o le c c ió n d e fa g é m id o s s e in o c u la ro n e n 10 l d e T S B -Y E (c a ld o d e s o ja t r íp t ic a -e x tra c to d e le v a d u ra ; 30 g /l d e T S B , 5 g /l d e e x tra c to d e le v a d u ra ) c o m p le m e n ta d o c o n 1 g /l d e g lu c o s a , 100 m g /l d e a m p ic i l in a y 10 m g /l d e te tra c ic lin a . C u a n d o la s c é lu la s a lc a n z a ro n u n a d e n s id a d ó p t ic a a 600 n m (O D 600 ) d e 0 ,6 , a p ro x im a d a m e n te 1 ,5 l d e l c u lt iv o se in fe c ta ro n u t il iz a n d o un e x c e s o 5 x m o la r d e l fa g o a u x il ia r M 13 K 07. L a s c é lu la s s e in c u b a ro n d u ra n te 30 m in , d e s p u é s d e lo c u a l e l fe rm e n ta d o r s e lle n ó h a s ta 10 l co n m e d io c o m p le jo d e fe rm e n ta c ió n [2 ,5 g /l d e ( N H ^ S O 4 ; 5 ,0 g /l d e e x tra c to d e le v a d u ra ; 30 g /l d e tr ip to n a , 2 g /l d e K 2 H P O 4 ; 3 g /l d e K H 2 P O 4 , 1 ,25 g /l; N a 3 C 6 H 5O 7 • 2 H 2O ; B re o x F M T 30 a g e n te a n t ie s p u m a n te 0,1 m l/l]. S e a g re g a ro n lo s s ig u ie n te s c o m p o n e n te s : 10 m l d e c a rb e n ic i l in a 25 m g /m l; 5 m l d e k a n a m ic in a 50 m g /m l; 1 m l d e is o p ro p il-p -D -1 - t io g a la c to p ira n ó s id o 1 M ( IP T G ); 17 ,5 m l/l d e 300 g /l de M g S O 4 y 5 m l d e u n a s o lu c ió n d e o lig o -e le m e n to s [35 g /l d e F e C h • 6 H 2O ; 10 ,56 g /l d e Z n S O 4 • 7 H 2 O ; 2 ,64 g /l de C u S O 4 • 5 H 2O ; 13 ,2 g /l d e M n S O 4 • H 2O ; 13 ,84 g /l d e C a C h • 2 H 2 O , d is u e lto e n H C l 1 ,2 M ]. S e in ic ió un c u lt iv o a lim e n ta d o p o r lo te s lim ita d o a g lu c o s a en d o n d e se a lim e n ta ro n a l re a c to r 600 g /l d e s o lu c ió n d e g lu c o s a (3 ,5 g /h al in ic io , 37 ,5 g /h d e s p u é s d e 20 h y h a s ta e l té rm in o d e l c u lt iv o ). E l pH s e c o n tro ló a pH 7 a t ra v é s d e la a d ic ió n a u to m á tic a d e 25 % d e N H 4O H , e l a ire s e c o m p le m e n tó (5 l/m in ), y e l a g ita d o r s e a ju s tó a 500 rpm . D e s p u é s d e 24 h d e c u lt iv o a lim e n ta d o p o r lo te s , la O D 600 fu e d e 33 ,2. L a s c é lu la s e n e l c u lt iv o s e s e d im e n ta ro n m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n a 15.900 g. L a s p a rt íc u la s d e fa g o s se p re c ip ita ro n a p a r t ir d e l s o b re n a d a n te d o s v e c e s e n P E G /N a C l, s e f i lt ra ro n y s e d is o lv ie ro n e n P B S y g lic e ro l c o m o e n e l E je m p lo 2. L a s re s e rv a s d e fa g o s s e a lm a c e n a ro n a -80 °C h a s ta q u e s e u t il iz a ro n e n la s e le c c ió n .
R e s u l t a d o s
C o n s t r u c c i ó n d e l a c o l e c c i ó n : L a n u e v a c o l e c c i ó n s e d e s i g n ó e n b a s e a u n c o n j u n t o d e 16 v a r i a n t e s Z d e F c R n c o n p r o p i e d a d e s d e u n i ó n v e r i f i c a d a s ( E j e m p l o s 2 - 6 ) . E l t a m a ñ o t e ó r i c o d e l a c o l e c c i ó n d e s i g n a d o f u e d e 5 , 3 x 108 v a r i a n t e s Z . E l t a m a ñ o r e a l d e l a c o l e c c i ó n , d e t e r m i n a d o p o r t i t u l a c i ó n d e s p u é s d e l a t r a n s f o r m a c i ó n e n c é l u l a s E R 2738 d e E . c o l i , f u e 4 , 5 x 109 t r a n s f o r m a n t e s .
L a c a l i d a d d e l a c o l e c c i ó n s e s o m e t i ó a e n s a y o m e d i a n t e l a s e c u e n c i a c i ó n d e 96 t r a n s f o r m a n t e s y a l c o m p a r a r s u s s e c u e n c i a s r e a l e s c o n e l d i s e ñ o t e ó r i c o . L o s c o n t e n i d o s d e l a c o l e c c i ó n r e a l c o m p a r a d o s c o n l a c o l e c c i ó n d e s i g n a d a d e m o s t r a r o n q u e e r a n s a t i s f a c t o r i o s . D e e s t a f o r m a s e c o n s t r u y ó c o n é x i t o u n a c o l e c c i ó n m a d u r a d a d e a g l u t i n a n t e s p o t e n c i a l e s p a r a F c R n .
E j e m p l o 8
S e l e c c i ó n y r e v i s i ó n d e v a r i a n t e s Z p r o v e n i e n t e s d e u n a c o l e c c i ó n m a d u r a d a
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
S e l e c c i ó n p a r a p r e s e n t a c i ó n d e f a g o s d e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n m a d u r a d a : L a s p r o t e í n a s d i a n a F c R n h u m a n a ( B i o r b y t , c a t . n o . o r b 84388 ) y F c R n m u r i n a ( B i o r b y t , c a t . n o . o r b 99076 ) s e b i o t i n i l a r o n e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 2 , u t i l i z a n d o b i o t i n a a u n e x c e s o 10 x m o l a r . L a s s e l e c c i o n e s p a r a l a p r e s e n t a c i ó n d e f a g o s , u t i l i z a n d o l a n u e v a c o l e c c i ó n d e m o l é c u l a s d e l a v a r i a n t e Z d e s c r i t a s e n e l E j e m p l o 7 , s e r e a l i z a r o n e n c u a t r o c i c l o s f r e n t e a F c R n h u m a n a o F c R n m u r i n a e s e n c i a l m e n t e c o m o e n e l E j e m p l o 2 , a u n q u e c o n l a s s i g u i e n t e s e x c e p c i o n e s . L o s t a m p o n e s d e s e l e c c i ó n f u e r o n 0 , 1 % d e t a m p ó n P C T G , p H 5 , 5 ( t a m p ó n f o s f a t o - c i t r a t o M c l l v a i n e s , p H 5 , 5 , c o m p l e m e n t a d o c o n T w e e n - 20 a l 0 , 1 % y 0 , 1 % d e g e l a t i n a ) o 0 , 1 % d e t a m p ó n P C T G , p H 7 , 4 , ( t a m p ó n f o s f a t o - c i t r a t o M c l l v a i n e s , p H 7 , 4 , c o m p l e m e n t a d o c o n T w e e n - 20 a l 0 , 1 % y 0 , 1 % d e g e l a t i n a ) , r e s p e c t i v a m e n t e . A n t e s d e l a s e l e c c i ó n , s e a g r e g ó a l o s t a m p o n e s d e s e l e c c i ó n H S A a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 1, 5 p M . T o d o s l o s t u b o s y p e r l a s u t i l i z a d o s e n l a s e l e c c i ó n s e p r e - b l o q u e a r o n c o n c u a l q u i e r a d e l o s d o s t a m p o n e s d e s e l e c c i ó n d i f e r e n t e s . E n e l c i c l o 1 s e r e a l i z ó u n p a s o d e p r e - s e l e c c i ó n , m e d i a n t e l a i n c u b a c i ó n d e l a r e s e r v a d e f a g o s c o n p e r l a s d e S A d u r a n t e 45 m i n . P a r a l a c a p t u r a d e l o s c o m p l e j o s d e f a g o s - d i a n a , s e u t i l i z ó 1 m g p e r l a s p o r 1, 1 p g d e F c R n h u m a n a b i o t i n i l a d a o 1, 6 p g d e F c R n m u r i n a b i o t i n i l a d a . L o s l a v a d o s s e r e a l i z a r o n c o n 0 , 1 % d e t a m p ó n P C T p H 5 , 5 o p H 7 , 4 , e x c e p t o p a r a l a s p i s t a s 2 - 1 - 2 - 1 y 2 - 1 - 2 - 2 d o n d e 0 , 1 % d e P C T c o m p l e m e n t a d o c o n I g G 25 n M ( H e r c e p t i n ® ) o I g G 10 n M , r e s p e c t i v a m e n t e , s e u t i l i z ó c o m o s e s e ñ a l a e n l a T a b l a 9.
L a s c i n c o p i s t a s ( 1 - 5 ) e n e l c i c l o 1 s e d i v i d i e r o n e n e l s e g u n d o a c u a r t o c i c l o s , d a n d o p o r r e s u l t a d o t o t a l m e n t e s i e t e p i s t a s ( 1 - 1 a 5 - 1 ) e n e l c i c l o 2 , o n c e p i s t a s ( 1 - 1 - 1 a 5 - 1 - 1 ) e n e l c i c l o 3 y c a t o r c e p i s t a s ( 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 a 5 - 1 ) e n e l c i c l o 4. L a s p a r t í c u l a s d e f a g o u n i d a s s e e l u y e r o n c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 2.
E n l a T a b l a 9 s e m u e s t r a u n a p e r s p e c t i v a d e l a e s t r a t e g i a d e s e l e c c i ó n , d e s c r i b i e n d o u n a r i g u r o s i d a d a u m e n t a d a e n c i c l o s p o s t e r i o r e s , u t i l i z a n d o u n a c o n c e n t r a c i ó n d e d i a n a d i s m i n u i d a y u n n ú m e r o i n c r e m e n t a d o d e l a v a d o s .
Figure imgf000042_0001
s p e c tiv a d e lo s d a to s p a ra s e le c c ió n d e m a d u ra c ió n
Figure imgf000043_0001
S e c u e n c ia c ió n d e a g lu t in a n te s p o te n c ia le s : S e s e le c c io n a ro n p a ra la s e c u e n c ia c ió n c lo n e s in d iv id u a le s p ro v e n ie n te s d e la s d ife re n te s ru ta s d e s e le c c ió n . S e s e c u e n c ia ro n to d o s lo s c lo n e s e je c u ta d o s e n la d e te c c ió n m e d ia n te E L IS A . L a a m p lif ic a c ió n d e fra g m e n to s g é n ic o s y e l a n á lis is d e s e c u e n c ia s d e lo s f ra g m e n to s g é n ic o s se re a liz a ro n e s e n c ia lm e n te c o m o s e d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 2.
R a s tre o m e d ia n te E L IS A d e la s v a r ia n te s Z: C o lo n ia s in d iv id u a le s q u e c o n t ie n e n las v a r ia n te s Z (e x p re s a d a s c o m o p ro te ín a s d e fu s ió n d e l A B D d e la v a r ia n te Z c o m o se d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 2 ) s e s e le c c io n a ro n a le a to r ia m e n te a p a r t ir d e lo s c lo n e s s e le c c io n a d o s d e la c o le c c ió n m a d u ra d a d e l F c R n y se h ic ie ro n c re c e r en 1 m l d e c u lt iv o s e s e n c ia lm e n te c o m o se d e s c r ib ió en e l E je m p lo 2. La p re p a ra c ió n d e lo s s o b re n a d a n te s p e r ip lá s m ic o s se re a liz ó c o m o e n e l E je m p lo 2 c o n o c h o c ic lo s d e c o n g e la c ió n -d e s c o n g e la c ió n y la s f ra c c io n e s p e r ip lá s m ic a s s e u t il iz a ro n s in d i lu ir e n la d e te c c ió n m e d ia n te E L IS A . L a s d e te c c io n e s m e d ia n te E L IS A s e re a liz a ro n ta n to a pH 6 ,0 c o m o a pH 7 ,4 e s e n c ia lm e n te c o m o s e d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 2 u t i l iz a n d o F c R n h u m a n a b io t in ila d a a u n a c o n c e n tra c ió n d e 2 nM e n c a d a u n o d e lo s p o c illo s . La f ra c c ió n p e r ip lá s m ic a d e l a g lu t in a n te d e F c R n p r im a r ia Z 10193 (S E Q ID N O : 2; a n a liz a d a en e x p e r im e n to s a n te r io re s ) s e u t i l iz ó c o m o un c o n tro l p o s it iv o . E l p e r ip la s m a q u e c o n t ie n e la p o rc ió n de l A B D s o lo s e u t iliz ó c o m o un c o n tro l n e g a tiv o .
A n á lis is E L IS A K d d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n : U n a s e le c c ió n d e lo s a g lu t in a n te s d e F c R n s e s o m e tió a un a n á lis is d e la s s e r ie s d e re s p u e s ta f re n te a u n a d ilu c ió n d e F c R n h u m a n a b io t in ila d a u t il iz a n d o E L IS A ta n to a pH 6 ,0 c o m o a pH 7 ,4 c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te . S e a g re g ó F c R n h u m a n a b io t in ila d a a u n a c o n c e n tra c ió n d e 30 nM y s e d ilu y ó p o c o a p o c o 1 :3 d e s c e n d ie n d o a 14 pM . C o m o un c o n tro l a n te c e d e n te , to d a s la s v a r ia n te s Z ta m b ié n se a n a liz a ro n s in n in g u n a p ro te ín a d ia n a a g re g a d a . L a s m u e s tra s p e r ip lá s m ic a s q u e c o n t ie n e n e l a g lu t in a n te d e F cR n p r im a r ia Z 07918 (S E Q ID .N O :1 ) se in c lu y e ro n y a n a liz a ro n c o m o un c o n tro l p o s it iv o . E l p e r ip la s m a q u e c o n t ie n e la p o rc ió n d e l A B D s o lo s e u t iliz ó c o m o un c o n tro l n e g a tiv o . L o s d a to s se a n a liz a ro n u t iliz a n d o G ra p h P a d P r is m 5 y re g re s ió n n o lin e a l y s e c a lc u la ro n lo s v a lo re s K d ( la c o n c e n tra c ió n e fe c t iv a m á x im a m e d ia ) .
R e s u lta d o s
S e le c c ió n p a ra p re s e n ta c ió n d e fa g o s d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n m a d u ra d a :
L a s e le c c ió n s e re a liz ó e n to ta lm e n te 14 ru ta s p a ra le la s q u e c o n te n ía n c u a tro c ic lo s c a d a u n a . L a s d ife re n te s ru ta s d e s e le c c ió n d if ir ie ro n en la c o n c e n tra c ió n d ia n a , e l t ip o d e d ia n a (F c R n h u m a n a o F c R n m u r in a ) , e l t ie m p o de s e le c c ió n , y la s c o n d ic io n e s d e la v a d o .
S e c u e n c ia c ió n d e a g lu t in a n te s p o te n c ia le s : S e s e c u e n c ia ro n c lo n e s s e le c c io n a d o s a le a to r ia m e n te . A c a d a u n a de la s v a r ia n te s Z in d iv id u a le s se le p ro p o rc io n ó un n ú m e ro d e id e n t if ic a c ió n , Z # # # # # , c o m o s e d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 2. E n to ta l, se id e n t if ic a ro n 445 n u e v a s m o lé c u la s ú n ic a s d e la v a r ia n te Z.
E n la f ig u ra 1 se lis ta n la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e un s u b c o n ju n to d e las 58 v a r ia n te s Z la rg a s d e los re s id u o s d e a m in o á c id o s y en e l lis ta d o d e s e c u e n c ia s c o m o la s S E Q ID N O : 17 -352. L o s m o t iv o s d e u n ió n a F cR n d e d u c id o s d e e s ta s v a r ia n te s Z se e x t ie n d e n d e s d e e l re s id u o 8 h a s ta e l re s id u o 36 en la s s e c u e n c ia s co n la s S E Q ID N O : 17 -352. L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e lo s 49 p o lip é p tid o s la rg o s d e lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s (B M o d ) p re d ic h o s p a ra c o n s t itu ir e l p a q u e te tr ih e lic o id a l c o m p le to d e n tro d e c a d a u n a d e e s ta s v a r ia n te s Z se e x t ie n d e n d e s d e e l re s id u o 7 h a s ta e l re s id u o 55.
R a s tre o m e d ia n te E L IS A d e la s v a r ia n te s Z: S e p ro d u je ro n c lo n e s o b te n id o s d e s p u é s d e c u a tro c ic lo s d e s e le c c ió n e n p la c a s d e 96 -p o c il lo s y s e ra s tre a ro n e n c u a n to a la a c t iv id a d d e u n ió n a F c R n u t il iz a n d o E L IS A . S e a n a liz a ro n to d o s lo s c lo n e s s e le c c io n a d o s a le a to r ia m e n te . A pH 6 ,0 , se e n c o n tró q u e 333 d e la s 445 v a r ia n te s Z ú n ic a s p ro p o rc io n a ro n u n a re s p u e s ta d e 0 ,3 A U o m a y o r ( c o r re s p o n d ie n te a a l m e n o s 3 x e l c o n tro l n e g a t iv o ) f re n te a F cR n h u m a n a a u n a c o n c e n tra c ió n d e 2 n M . A p H 7 ,4 , s e e n c o n tró q u e 278 d e la s 445 v a r ia n te s Z ú n ic a s p ro p o rc io n a ro n u n a re s p u e s ta d e 0 ,3 A U o m a y o r (c o r re s p o n d ie n te a a l m e n o s 3 x e l c o n tro l n e g a t iv o ) f re n te a F c R n h u m a n a a u n a c o n c e n tra c ió n d e 2 nM . S e e n c o n tra ro n c lo n e s c o n u n a s e ñ a l p o s it iv a fre n te a F c R n h u m a n a en to d a s la s ru ta s ( in c lu y e n d o a q u e lla s co n d ia n a m u r in a ) e x c e p to 1 -1 -1 -1. L o s c o n tro le s n e g a t iv o s te n ía n a b s o rb a n c ia s d e 0 ,070 ­ 0 ,096 A U (p H 6 ,0 ) y 0 ,060 -0 ,112 A U (p H 7 ,4 ), re s p e c t iv a m e n te . La re s p u e s ta p ro m e d io d e lo s c o n tro le s e n b la n c o fu e 0 ,070 A U (p H 6 ,0 ) y 0 ,062 (p H 7 ,4 ).
A n á lis is E L IS A K d d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n : S e s e le c c io n ó un s u b c o n ju n to d e la s v a r ia n te s Z c o n b a s e en e l re s u lta d o e n e l e x p e r im e n to E L IS A d e s c r ito a n te r io rm e n te ( v a lo r E L IS A m á s a lto a pH 6 ,0 y /o pH 7 ,4 ) y s e s o m e tió a u n a t i tu la c ió n d ia n a e n e l fo rm a to E L IS A . S e in c u b a ro n m u e s tra s p e r ip lá s m ic a s c o n u n a d ilu c ió n e n s e r ie d e F c R n h u m a n a b io t in ila d a . T a m b ié n s e a n a liz ó c o m o un c o n tro l p o s it iv o u n a m u e s tra p e r ip lá s m ic a co n e l a g lu t in a n te p r im a r io Z 07918 (S E Q ID N O : 1). S e a n a liz a ro n lo s v a lo re s o b te n id o s y se c a lc u la ro n s u s v a lo re s K d re s p e c t iv o s (T a b la 10).
T a b l a 10 : V a l o r e s K d c a l c u l a d o s a p a r t i r d e a n á l i s i s d e t i t u l a c i ó n p o r E L I S A d e l a s v a r i a n t e s Z - A B D a p a r t i r d e l a m a d u r a c i ó n .
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
E j e m p l o 9
P r o d u c c i ó n y c a r a c t e r i z a c i ó n d e v a r i a n t e s Z a p a r t i r d e u n a c o l e c c i ó n m a d u r a d a
E n e s t e E j e m p l o , s e p r o d u j e r o n d o c e v a r i a n t e s Z e n E . c o l i , s e p u r i f i c a r o n y s e a n a l i z a r o n e n c u i a n t o a l a e s t a b i l i d a d , l a u n i ó n a F c R n , a s í c o m o l a i n h i b i c i ó n d e l a I g G q u e s e u n e a F c R n .
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
S u b c l o n a c i ó n d e v a r i a n t e s Z e n v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n : E l A D N d e d o c e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n ( Z 13577 ( S E Q ID N O : 19 ) , Z 13578 ( S E Q ID N O : 20 ) , Z 13583 ( S E Q ID N O : 23 ) , Z 13592 ( S E Q ID N O : 28 ) , Z 13616 ( S E Q ID N O : 41 ) , Z 13621 ( S E Q ID N O : 44 ) , Z 13654 ( S E Q ID N O : 65 ) , Z 13663 ( S E Q ID N O : 70 ) , Z 13669 ( S E Q ID N O : 73 ) , Z 13674 ( S E Q ID N O : 75 ) , Z 13675 ( S E Q ID N O : 76 ) y Z 13676 ( S E Q ID N O : 77 ) ) s e a m p l i f i c ó a p a r t i r d e l v e c t o r d e l a c o l e c c i ó n p A Y 02592. L a s u b - c l o n a c i ó n s e r e a l i z ó c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3. L o s f r a g m e n t o s d e l g e n Z s e s u b ­ c l o n a r o n e n e l v e c t o r d e e x p r e s i ó n p A Y 01448 d a n d o p o r r e s u l t a d o l a s e c u e n c i a c o d i f i c a d a M G S S H H H H H H L Q -[ Z # # # # # ] - V D .
P r o d u c c i ó n d e v a r i a n t e s Z : E l c u l t i v o y l a p u r i f i c a c i ó n d e l a s v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n H i s 6 s e r e a l i z a r o n e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3. C o n e l f in d e o b t e n e r u n a m a y o r p u r e z a , s e a g r e g ó u n p a s o d e c r o m a t o g r a f í a e n f a s e i n v e r s a ( R P C ) d e s p u é s d e l a p u r i f i c a c i ó n I M A C d e u n s e g u n d o l o t e d e l a s d o c e v a r i a n t e s m a d u r a d a s y l a v a r i a n t e Z p r i m a r i a Z 07918. L a s m u e s t r a s p r o v e n i e n t e s d e e s t e l o t e s e u t i l i z a r o n d o n d e s e i n d i c ó . A n á l i s i s C D : C o n e l f in d e d e t e r m i n a r l a s t e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n ( T m ) y e v a l u a r l a e s t r u c t u r a s e c u n d a r i a d e l a s v a r i a n t e s Z ( l o t e p u r i f i c a d o m e d i a n t e R P C ) , s e l l e v ó a c a b o c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 3 u n a n á l i s i s C D .
A n á l i s i s d e u n i ó n y c i n é t i c o B i a c o r e : L a i n t e r a c c i ó n d e l a s v a r i a n t e s Z e t i q u e t a d a s c o n H i s 6 d e u n i ó n a F c R n c o n la F c R n h u m a n a s e a n a l i z ó e n u n i n s t r u m e n t o B i a c o r e 2000 e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3. F c R n h u m a n a ( h F c R n ) o F c R n d e c y n o m o l g u s ( c F c R n ) a d q u i r i d o d e B i o r b y t ( c a t . n o . o r b 84388 y o r b 99075 , r e s p e c t i v a m e n t e ) s e u t i l i z a r o n c o m o l a p r o t e í n a d i a n a . E n u n p r i m e r c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s , s e i n y e c t a r o n 100 n M d e l a s v a r i a n t e s Z a p H 6 , 0 d u r a n t e 2 m i n a 30 p l / m i n s o b r e h F c R n i n m o v i l i z a d a , s e g u i d o d e d i s o c i a c i ó n e n t a m p o n e s d e p H 6 , 0 o p H 7 , 4 u t i l i z a n d o u n p r o c e d i m i e n t o d e c o - i n y e c c i ó n . L a f a s e d e d i s o c i a c i ó n f u e d e 4 m i n y e l t i e m p o d e e q u i l i b r i o e n t r e l a s i n y e c c i o n e s d e a n a l i t o s f u e d e 30 m i n .
E n u n s e g u n d o c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s , l a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s a p r o x i m a d a s (K on y k o f ) y l a s a f i n i d a d e s ( K d ) s e d e t e r m i n a r o n p a r a u n s u b c o n j u n t o d e v a r i a n t e s Z i n y e c t a d a s a c o n c e n t r a c i o n e s d e 540 n M , 180 n M , 60 n M , 20 n M y 6 , 7 n M s o b r e h F c R n i n m o v i l i z a d a . C o m o a r r i b a , l o s a n a l i t o s s e i n y e c t a r o n d u r a n t e 2 m i n a 30 p l / m i n , l a f a s e d e d i s o c i a c i ó n f u e d e 4 m i n y e l t i e m p o d e e q u i l i b r i o e n t r e l a s i n y e c c i o n e s d e a n a l i t o s f u e d e 30 m i n .
E n u n t e r c e r c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s s e r e a l i z ó a p H 6 u n a n á l i s i s c i n é t i c o d e d o c e v a r i a n t e s Z m a d u r a d a s y l a v a r i a n t e Z p r i m a r i a Z 07918 ( S E Q ID N O : 1 ) ( l o t e s p u r i f i c a d o s m e d i a n t e R P C ) q u e s e u n e a h F c R n y c F c R n a p H 6. U n a s e r i e d e c o n c e n t r a c i o n e s d e v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n H i s 6 ( 270 , 90 , 30 y 10 n M ) s e i n y e c t a r o n d u r a n t e 4 m i n a 30 p l / m i n s o b r e h F c R n y c F c R n , i n m o v i l i z a d a s e n d i f e r e n t e s c e l d a s d e f l u j o d e u n a s u p e r f i c i e c o n c h i p C M 5. S e u t i l i z ó 0 , 005 % d e P C T p H 6 , 0 c o m o e l t a m p ó n d e m i g r a c i ó n y p a r a l a s d i l u c i o n e s d e l a s v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n H i s 6. L a d i s o c i a c i ó n e n e l t a m p ó n d e m i g r a c i ó n s e d e j ó d u r a n t e 20 m i n , s e g u i d o d e r e g e n e r a c i ó n s u p e r f i c i a l m e d i a n t e l a i n y e c c i ó n d e 3 x 30 p u l s o s p o r s e g u n d o d e 0 , 005 % d e P C T p H 7 , 4 y e q u i l i b r a d o d u r a n t e d i e z m i n u t o s a n t e s d e i n i c i a r e l s i g u i e n t e c i c l o .
Figure imgf000047_0001
R e s u l t a d o s
P r o d u c c i ó n d e v a r i a n t e s Z : L a s d o c e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n c o n s t r u i d a s c o n u n a e t i q u e t a H i s 6 N - t e r m i n a l s e p r o d u j e r o n e n E . c o l i . L o s a n á l i s i s S D S - P A G E d e c a d a u n a d e l a s p r e p a r a c i o n e s f i n a l e s d e p r o t e í n a s d e m o s t r a r o n q u e e s t o s c o n t e n í a n p r e d o m i n a n t e m e n t e l a v a r i a n t e Z d e u n i ó n a F c R n . L a i d e n t i d a d c o r r e c t a y e l p e s o m o l e c u l a r d e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n s e c o n f i r m ó m e d i a n t e a n á l i s i s H P L C - M S .
A n á l i s i s C D : E n l a T a b l a 11 s e m u e s t r a n l a s t e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n d e t e r m i n a d a s . S e o b s e r v ó u n p l e g a d o r e v e r s i b l e p a r a l a t o t a l i d a d d e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n c u a n d o s e s u p e r p u s i e r o n l o s e s p e c t r o s m e d i d o s a n t e s y d e s p u é s d e c a l e n t a m i e n t o a 90 ° C .
A n á l i s i s d e u n i ó n y c i n é t i c o B i a c o r e : E n u n p r i m e r c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s , l a u n i ó n d e l a s d o c e v a r i a n t e s Z a F c R n h u m a n a y l a d i s o c i a c i ó n a d i f e r e n t e p H s e s o m e t i e r o n a e n s a y o e n u n i n s t r u m e n t o B i a c o r e a l i n y e c t a r s e c u e n c i a l m e n t e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z a p H 6 , 0 y , y a s e a e l t a m p ó n a p H 6 , 0 o e l t a m p ó n a p H 7 , 4 s o b r e u n a s u p e r f i c i e d e c h i p q u e c o n t e n í a F c R n . E l n i v e l d e i n m o v i l i z a c i ó n d e l i g a n d o s d e l a s u p e r f i c i e f u e 890 R U d e F c R n h u m a n a . L a s d o c e v a r i a n t e s Z m o s t r a r o n u n i ó n a l F c R n a p H 6 , 0 , y p a r a t o d a s l a s v a r i a n t e s s e o b s e r v a r o n c o n s t a n t e s d e d i s o c i a c i ó n m á s r á p i d a s a p H 7 , 4 e n c o m p a r a c i ó n c o n p H 6 , 0.
L a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s d e l a s v a r i a n t e s Z Z 13577 ( S E Q ID N O : 19 ) y Z 13621 ( S E Q ID N O : 44 ) q u e i n t e r a c t ú a c o n e l F c R n a p H 6 , 0 s e d e t e r m i n a r o n e n u n s e g u n d o c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s ( v é a s e l a T a b l a 12 ) . L a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s s e c a l c u l a r o n u t i l i z a n d o a j u s t e s d e c u r v a s d e d o s o c u a t r o c o n c e n t r a c i o n e s i n y e c t a d a s d e Z 13577 y Z 13621 , r e s p e c t i v a m e n t e .
T a b l a 11. T e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n p a r a u n c o n j u n t o d e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a l F c R n m a d u r a d o
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000048_0002
T a b l a 12. C o n s t a n t e s c i n é t i c a s y a f i n i d a d e s B i a c o r e p a r a l a u n i ó n a l F c R n a p H 6.0.
V a r i a n t e Z S E Q ID N O : k o n ( M - 1 s - 1 ) k o f f ( s - 1 ) K D ( M )
Z 13577 19 3.0 x 105 4.0 x 10 - 3 13 x 10 - 9 Z 13621 44 6.4 x 105 3.7 x 10 - 3 6 x 10 - 9
E n u n t e r c e r c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s , s e d e t e r m i n a r o n l a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s d e t r e c e v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n H i s 6 q u e i n t e r a c t ú a n c o n F c R n h u m a n o o d e l c y n o m o l g u s a p H 6 , 0 ( T a b l a 13 ) . L o s n i v e l e s d e i n m o v i l i z a c i ó n d e F c R n d e l a s s u p e r f i c i e s d e l c h i p f u e r o n 1196 R U ( h u m a n o ) y 788 R u ( c y n o m o l g u s ) , r e s p e c t i v a m e n t e . P a r a c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z , s e c a l c u l a r o n l a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s u t i l i z a n d o u n a c u r v a a j u s t a d a d e c u a t r o c o n c e n t r a c i o n e s i n y e c t a d a s .
T a b l a 13. C o n s t a n t e s c i n é t i c a s y a f i n i d a d e s B i a c o r e p a r a F c R n y d e c y n o m o l g u s d e u n i ó n a p H 6.0.
h F c R n c F c R n
S E
kon k on
V a r i a n t e Z Q ID k o f f ( s - 1) K d ( M ) koff ( s -1) K d ( M )
( M ' V 1) ( M ' V 1)
N O :
Z 13577 19 7.2 x 105 2.9 x 10 - 3 4.1 x 10 -9 8. 2 x 105 4.4 x 10 -3 5 .4 x 10 -9 Z 13578 20 4.1 x 105 7.3 x 10 - 3 1.8 x 10 - 8 5. 6 x 105 1.1 x 10 -2 2.1 x 10 -8 Z 13583 23 4 .5 x 105 2.6 x 10 - 3 5.8 x 10 -9 6.7 x 105 4.4 x 10 -3 6. 6 x 10 -9 Z 13592 28 5.9 x 105 7.2 x 10 -3 1.2 x 10 - 8 7. 5 x 105 1.1 x 10 -2 1.5 x 10 -8 Z 13616 41 2 .9 x 105 3.1 x 10 - 3 1.0 x 10 - 8 4.3 x 105 4.8 x 10 -3 1.1 x 10 -8 Z 13621 44 4.1 x 105 2.8 x 10 -3 6.8 x 10 -9 6.1 x 105 4.6 x 10 -3 7 .6 x 10 -9 Z 13654 65 6 .0 x 105 9.5 x 10 -3 1.6 x 10 - 8 8. 4 x 105 1.3 x 10 -2 1.5 x 10 -8 Z 13663 70 3.9 x 105 3.4 x 10 -3 8.7 x 10 -9 5. 2 x 105 5.3 x 10 -3 1.0 x 10 -8 Z 13669 73 5.6 x 105 2.8 x 10 -3 4.9 x 10 -9 8. 2 x 105 4.6 x 10 -3 5 .6 x 10 -9 Z 13674 75 5.3 x 105 3.7 x 10 -3 7.0 x 10 -9 8. 3 x 105 5.9 x 10 -3 7.1 x 10 -9 Z 13675 76 4 .9 x 105 5.1 x 10 - 3 1.0 x 10 - 8 7. 5 x 105 8.0 x 10 -3 1.1 x 10 -8 Z 13676 77 6 .5 x 105 3.6 x 10 -3 5.5 x 10 -9 9. 6 x 105 5.9 x 10 -3 6. 2 x 10 -9 Z 07918 1 2 .6 x 105 4.2 x 10 -3 1.6 x 10 - 8 3. 8 x 105 7.0 x 10 -3 1.9 x 10 -8
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
A n á lis is d e b lo q u e o A lp h a L IS A : S e s o m e tió a e n s a y o la c a p a c id a d d e d o c e v a r ia n te s Z m o n o m é r ic a s e t iq u e ta d a s c o n H is 6 m a d u ra d a s p a ra in h ib ir la Ig G q u e se u n e a F c R n en un a n á lis is d e b lo q u e o A lp h a L IS A . D ilu c io n e s e n s e r ie d e v a r ia n te s Z s e in c u b a ro n c o n F c R n h u m a n a b io t in ila d a y la c a p a c id a d d e b lo q u e o d e c a d a u n a d e la s v a r ia n te s re s p e c t iv a s e m id ió d e s p u é s d e la a d ic ió n d e p e r la s a c e p to ra s re c u b ie r ta s co n Ig G y p o s te r io rm e n te p e r la s d o n a n te s re c u b ie r ta s c o n e s tre p ta v id in a . L a in h ib ic ió n se p o d ría m e d ir c o m o u n a d is m in u c ió n e n lo s re c u e n to s m e d ia n te A lp h a L IS A p a ra la s v a r ia n te s Z p o s it iv a s . S e d e m o s tró q u e la to ta lid a d d e d o c e v a r ia n te s Z s o m e tid a s a e n s a y o b lo q u e a n Ig G q u e s e u n e a l F c R n y lo s v a lo re s IC 50 c a lc u la d o s s e m u e s tra n en la T a b la 14.
E je m p lo 10
C o m p a ra c ió n d e la c a p a c id a d d e b lo q u e o d e Ig G q u e s e u n e a F c R n
E n e s te E je m p lo , la c a p a c id a d d e b lo q u e o d e Ig G d e la v a r ia n te Z d e u n ió n a F c R n H is 6-Z 07918 (S E Q ID N O : 1) se c o m p a ró c o n in m u n o g lo b u lin a in tra v e n o s a ( IV Ig ) e in m u n o g lo b u lin a s u b c u tá n e a (S C lg ) u t i l iz a d a s a c tu a lm e n te e n e l t ra ta m ie n to d e a lg u n o s t r a s to rn o s a u to in m u n e s .
M a te r ia le s y m é to d o s
B lo q u e o d e la t in c ió n p o r in m u n o f lu o re s c e n c ia d e Ig G -F c R n : C o m o se d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 4, s e p re p a ra ro n c é lu la s H e L a t r a n s d u c id a s co n F c R n -e G F P h u m a n a s o m u r in a s . L a s c é lu la s f i ja d a s s e re -s u s p e n d ie ro n en 5 o p l d e u n a m e z c la d e Ig G h u m a n a c o n ju g a d o s c o n A le x a F lu o r™ 647 50 n m ( J a c k s o n la b o ra to r ie s , ca t. no. 009 -600 -003 ) y Z 07918 e t iq u e ta d a s co n H is 6 , IV Ig (O c ta g a m ®, O c ta p h a rm a ) o S C lg (G a m m a n o rm ®, O c ta p h a rm a ) , re s p e c t iv a m e n te , d ilu id o s a c o n c e n tra c io n e s d e 1000 , 100 , 10, 1, 0 ,1 o 0 (c o n tro l ta m p ó n ) nM e n ta m p ó n d e M c llv a n e s pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S al 2 ,5 % Ig G u ltra b a ja (L ife T e c h n o lo g ie s ) y 0 ,1 % d e s a p o n in a (A p p liC h e m ) . L a s c é lu la s se in c u b a ro n d u ra n te 1 h a 37 °C e n la o s c u r id a d , se la v a ro n co n 2 x 100 p l d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S al 2 ,5 % Ig G u ltra b a ja y se re -s u s p e n d ie ro n e n 180 p l d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía B S A al 1% . L o s d a to s p ro v e n ie n te s d e 10.000 c é lu la s G F P /F c R n p o s it iv a s se o b tu v ie ro n u t il iz a n d o un F A C S C a lib u r (B e c k m a n C o u lte r ) y lo s d a to s se a n a liz a ro n u t il iz a n d o e l s o f tw a re F lo w in g 2.5.0 (T u rk u U n iv e rs ity ) .
R e s u lta d o s
E l e x p e r im e n to s e re a liz ó p a ra d e te rm in a r s i la v a r ia n te Z d e u n ió n a F c R n H is 6-Z 07918 (S E Q ID N O : 1) b lo q u e a la in te ra c c ió n d e Ig G -F c R n y c o m p a ra e l e fe c to d e b lo q u e o co n IV Ig y S C lg . S e in c u b a ro n c é lu la s H e L a tra n s d u c id a s c o n F c R n -e G F P h u m a n a o m u r in a c o n Ig G c o n ju g a d a c o n A le x a F lu o r® h u m a n a 647. L a u n ió n s e b lo q u e ó c o n H is 6-Z 07918 , s in m a rc a r , IV Ig o S C lg a d ife re n te s c o n c e n tra c io n e s . L o s re s u lta d o s m o s tra ro n q u e H is 6-Z 07918 b lo q u e a b a d e m a n e ra e f ic a z la h lg G q u e se u n e a h F c R n a un g ra d o s im ila r a la IV Ig o la S C lg ( f ig u ra 9).
E je m p lo 11
C a ta b o l is m o in c re m e n ta d o d e Ig G p o r la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n e n ra to n e s
L a c a p a c id a d d e la v a r ia n te Z d e u n ió n a F c R n Z 07918 p a ra b lo q u e a r la Ig G q u e s e u n e a F c R n in v it ro s e m o s tró en e l E je m p lo 10. En e s te e je m p lo , la c a p a c id a d d e b lo q u e o d e la m is m a v a r ia n te Z s e e v a lu ó in v iv o . E l b lo q u e o d e las in te ra c c io n e s Ig G -F c R n in v iv o c o n d u c irá a un c a ta b o lis m o in c re m e n ta d o d e Ig G y a n iv e le s re d u c id o s c o n c o m ita n te s d e Ig G (M e z o 2008 , s u p ra ) .
M a te r ia le s y m é to d o s
E s tu d io e n a n im a le s : L a s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n Z 11948 (S E Q ID N O : 354 ) y Z 07918 -P P 013 (Z 07918 (S E Q ID N O : 1) id é n t ic a s a Z 11948 , p e ro c o n e l e x tre m o N q u e c o m ie n z a co n lo s a m in o á c id o s V D e n lu g a r d e A E , e n fu s ió n c o n la v a r ia n te A B D P P 013 (S E Q ID N O : 377 )) o e l v e h íc u lo ( ta m p ó n d e P B S ), s e a d m in is tra ro n a N M R I m a c h o s (C h a r le s R iv e r) , a d o s is d e 16 ,3 p m o l/k g .L o s ra to n e s fu e ro n t r a ta d o s c o n c in c o in y e c c io n e s in tra v e n o s a s a d m in is t ra d a s a 0, 24 , 48 , 72 y 96 h. L a s m u e s tra s s é r ic a s s e e x tra je ro n a 0, 72 , 120 y 168 h (a l té rm in o d e l e s tu d io ) y s e a lm a c e n a ro n a -20 °C . M e d ia n te E L IS A se c u a n tif ic ó la c o n c e n tra c ió n d e la Ig G d e ra tó n en s u e ro .
E L IS A d e Ig G d e ra tó n : L a c o n c e n tra c ió n d e la Ig G d e ra tó n e n m u e s tra s d e s u e ro d e ra tó n s e a n a liz ó m e d ia n te un k it d e E L IS A p a ra Ig G d e ra tó n (M a b te c h 3825 -1 A D -6 ) y se re a liz ó c o m o s e d e s c r ib e p o r e l fa b r ic a n te . La c o n c e n tra c ió n d e m lg G s e c a lc u ló a p a r t ir d e u n a c u rv a e s tá n d a r p ro p o rc io n a d a y G ra p h P a d P r is m 5 u t il iz a n d o u n a fó rm u la d e re g re s ió n no lin e a l. L a c o n c e n tra c ió n d e Ig G e n ra to n e s in d iv id u a le s a 24 , 72 , 120 y 168 h se re la c io n ó c o n e l n iv e l a 0 h, y lo s re s u lta d o s p o r lo ta n to se p re s e n ta n c o m o p o rc e n ta je d e Ig G (0 h).
R e s u lta d o s
L o s re s u lta d o s m o s tra ro n u n a re d u c c ió n d e la c o n c e n tra c ió n d e Ig G d e ra tó n e n lo s ra to n e s tra ta d o s c o n v a r ia n te s Z -F c R n e s p e c íf ic a s . T a n to Z 11948 c o m o la v a r ia n te fu s io n a d a A B D Z 07918 -P P 013 d is m in u y e ro n la c o n c e n tra c ió n d e Ig G e n d ó g e n a e n ra to n e s in v iv o .
L a m a y o r ía d e e fe c to s p ro n u n c ia d o s s e o b tu v ie ro n c o n la v a r ia n te fu s io n a d a a A B D y d e s p u é s d e 120 h o ra s . D e e s ta fo rm a , los re s u lta d o s in d ic a n q u e las v a r ia n te s Z -F c R n e s p e c íf ic a s b lo q u e a n e l re c ic la je d e Ig G d a n d o p o r re s u lta d o un c a ta b o lis m o in c re m e n ta d o d e Ig G y p o s te r io re s n iv e le s m e n o re s d e Ig G e n ra to n e s .
E je m p lo 12
T ra n s c ito s is in v it ro d e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a l F c R n
E n e s te E je m p lo se s o m e te n a e n s a y o la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n e n c u a n to a su c a p a c id a d p a ra s e r t ra n s p o r ta d a s a t ra v é s d e c é lu la s e p ite lia le s o e n d o te lia le s o re c ic la d a s m e d ia n te F c R n in v itro . U n fá rm a c o q u e c o n te n ía u n a v a r ia n te Z c o n e l p o d e r d e tra n s c ito s is fa c il ita rá la in g e s t ió n d e l fá rm a c o d e s p u é s de , p o r e je m p lo , u n a a d m in is tra c ió n o ra l o p u lm o n a r .
M a te r ia le s y m é to d o s
C é lu la s , p o r e je m p lo c é lu la s T 84 , M D C K , H e L a , C a C o 2 , C a L u -1 y /o C a L u -3 , c o n o s in u n a e x p re s ió n e n d ó g e n a o re c o m b in a n te d e F c R n , s e h a c e n c re c e r e n m e d io d e c re c im ie n to re s p e c t iv o e n u n a m e m b ra n a e n u n a p a re d tra n s v e rs a l p a ra fo rm a r u n a m o n o c a p a . L a in te g r id a d d e las m o n o c a p a s s e p u e d e e v a lu a r a l m e d ir la re s is te n c ia e lé c t r ic a o a l a g re g a r u n a s o lu c ió n d e e n s a y o q u e n o s e a c a p a z d e p e n e tra r o q u e s e a t ra n s p o r ta d a a c t iv a m e n te s o b re la m o n o c a p a c e lu la r. U n a m o n o c a p a d e f in id a d e c é lu la s s e p u ls a d e s d e e l c o s ta d o a p ic a l o b a s o la te ra l co n e l lig a n d o ta l c o m o la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n , H S A o Ig G e n un ta m p ó n ta l c o m o H B S S (s o lu c ió n s a lin a e q u ilib ra d a d e H a n k s , S ig m a -A ld r ic h , ca t. no. H 9269 ) o m e d io d e c re c im ie n to a un pH y te m p e ra tu ra a d e c u a d o s , y se e x p u ls ó co n ta m p o n e s ta le s c o m o H B S S o m e d io d e c re c im ie n to a un pH y te m p e ra tu ra a d e c u a d o s e n e l la d o o p u e s to .
E n u n a v a r ia n te d e e s te a n á lis is , los lig a n d o s s e p u e d e n e x p u ls a r c o n ta m p o n e s ta le s c o m o H B S S o m e d io d e c re c im ie n to a pH y te m p e ra tu ra a d e c u a d o s en e l m is m o c o s ta d o a s í c o m o la a d m in is tra c ió n p a ra m e d ir lig a n d o re c ic la d o . E s to se p u e d e re a liz a r en un tra n s -p o c il lo o e n u n a p la c a p a ra c u lt iv o c e lu la r. L a s c é lu la s s e s ie m b ra n en e l t ra n s -p o c il lo o la s p la c a s p a ra c u lt iv o c e lu la r y s e p u ls a n co n lig a n d o s ta le s c o m o la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F cR n , H S A o IgG . L o s lig a n d o s t r a ta d o s p o r e n d o c ito s is se u n irá n a F c R n y re g re s a ra n a la s u p e r f ic ie c e lu la r a l m is m o o a un la d o o p u e s to , a m e d id a q u e se c a rg a ro n . D e s p u é s d e p u ls a r, lo s lig a n d o s lib re s s e re t ira ro n a l la v a r la s c é lu la s c o n ta m p ó n fr ío . P a ra e x p u ls a r lo s l ig a n d o s , se a g re g ó a la s c é lu la s ta m p ó n o m e d io t ib io y, d e s p u é s d e un p e río d o e n la v a r ia c ió n d e 10 m in u to s h a s ta v a r ia s h o ra s , e l ta m p ó n o m e d io se re t iró y s e a n a liz ó p a ra la p re s e n c ia d e lig a n d o s .
E n u n a v a r ia n te d e e s te a n á lis is , lo s lig a n d o s ta le s c o m o la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n , H S A o Ig G s e p u e d e n u t il iz a r p a ra b lo q u e a r la u n ió n a F c R n m e d ia n te lo s lig a n d o s ta le s c o m o o tra s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n , H S A o Ig G a l a d m in is t ra r la s a l m is m o t ie m p o o s e c u e n c ia lm e n te a las c é lu la s .
L a c a n t id a d d e lig a n d o se p u e d e c u a n t i f ic a r m e d ia n te m é to d o s ta le s c o m o E L IS A , H P L C -M S , c o lo ra n te f lu o re s c e n te o ra d io m a rc a je .
L o s re s u lta d o s d e l e x p e r im e n to d e s c r ito a n te r io rm e n te s e e s p e ra q u e m u e s tre n q u e la s v a r ia n te s Z -F c R n e s p e c íf ic a s s e p u e d e n s o m e te r a t ra n s c ito s is y /o re c ic la r in v itro .
E je m p lo 13
U n ió n d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o d im é r ic a a c é lu la s H e L a tra n s fe c ta d a s c o n F c R n /e G F P h u m a n a s
E n e s te E je m p lo , la c a p a c id a d d e u n ió n d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o d im é r ic a s e in v e s t ig ó y c o m p a ró c o n la c a p a c id a d d e u n ió n d e la s v a r ia n te s Z p r im a r ia s m o n o m é r ic a s y m a d u ra d a s . La p ro d u c c ió n d e c é lu la s H e L a q u e e x p re s a n e l t ra n s g é n d e l g e n F c R n -e G F P h u m a n o s e re a liz ó c o m o se d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 4 y se d e s c r ib e e l u s o d e e s ta s c é lu la s p a ra a n á lis is d e c ito m e tr ía d e f lu jo c o n v a r ia n te s Z m a rc a d a s c o n A le x a F lu o r® 647.
M a te r ia le s y m é to d o s
M a rc a je co n A le x a F lu o r® 647 d e p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n : L o s d o s p o lip é p tid o s m a rc a d o s co n H is 6 h o m o d im é r ic o s Z 11948 -(G 4S ) a-Z 11948 (S E Q ID N O : 369 ) y Z 11948 -(G 4S )-Z 11948 (S E Q ID N O : 368 ), la v a r ia n te Z e t iq u e ta d a c o n H is 6 m o n o m é r ic a p r im a r ia Z 07918 (S E Q ID N O : 1) y la s v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s co n H is 6 m o n o m é r ic a s m a d u ra d a s Z 13583 (S E Q ID N O : 23 ), Z 13621 (S E Q ID N O : 44 ), Z 13654 (S E Q ID N O : 65 ) y Z 13674 (S E Q ID N O : 75 ) se m a rc a ro n c o n s u c c in im id i lé s te r d e l á c id o c a rb o x í lic o A le x a F lu o r® 647 ( In v it ro g e n ca t. no. A 20106 ) . A n te s d e l m a rc a je , e l pH e n la s s u s p e n s io n e s d e m u e s tra s (e n P B S pH 7 ,4 ) s e a ju s tó a 8 ,3 m e d ia n te la a d ic ió n d e 10 p l d e ta m p ó n d e b ic a rb o n a to d e s o d io 0 ,1 M , pH 8 ,3 , h a s ta 90 p l d e la s u s p e n s ió n d e m u e s tra s . A 100
Figure imgf000051_0001
R e s u l t a d o s
S e u t i l i z ó a n á l i s i s d e c i t o m e t r í a d e f l u j o p a r a d e t e r m i n a r s i l o s d í m e r o s d e u n i ó n a F c R n s e p o d r í a n u n i r a F c R n h u m a n a s o b r e c é l u l a s H e L a t r a n s d u c i d a s d e F c R n / e G F P h u m a n a s y p a r a c o m p a r a r s u c a p a c i d a d d e u n i ó n a l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n m o n o m é r i c a s . E l a n á l i s i s t a m b i é n s e r e a l i z ó p a r a d e t e r m i n a r s i l a s e p a r a c i ó n d e p e n d i e n t e d e l p H d e l a p r o t e í n a F c R n s e v i ó a f e c t a d a p o r e l f o r m a t o d i m é r i c o . E l e x p e r i m e n t o s e r e a l i z ó a p H 6 , 0 c o n l a v a d o s a p H 6 , 0 o p H 7 , 4 c o n l o s d í m e r o s m a r c a d o s c o n A l e x a F l u o r ® 647 Z 11948 - ( G 4 S ) 3 - Z 11948 y Z 11948 -( G 4 S ) - Z 11948 , y l o s m o n ó m e r o s Z 07918 , Z 13583 , Z 13621 , Z 13654 y Z 13674. Z 11948 y Z 07918 s o n i d é n t i c a s e n la s e c u e n c i a a p a r t e d e l o s p r i m e r o s d o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s ( A E f r e n t e a V D ) . L o s v a l o r e s d e M F I c a l c u l a d o s s e p r e s e n t a n e n l a f i g u r a 11. L o s r e s u l t a d o s d e m u e s t r a n q u e e l f o r m a t o d i m é r i c o a u m e n t a l a c a p a c i d a d d e u n i ó n d e l o s p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n e n c o m p a r a c i ó n c o n e l m o n ó m e r o c o r r e s p o n d i e n t e ( f i g u r a 11 A ) y q u e l a s v a r i a n t e s Z m a d u r a d a s ( Z 13583 , Z 13621 , Z 13654 y Z 13674 ) t i e n e n u n a m a y o r c a p a c i d a d d e u n i ó n q u e l a v a r i a n t e Z p r i m a r i a Z 07918 ( f i g u r a 11 B ) . L o s d a t o s d e m u e s t r a n q u e l a s e p a r a c i ó n d e p e n d i e n t e d e l p H d e F c R n d i s m i n u y e c o n e l u s o d e l f o r m a t o d i m é r i c o , lo q u e s u g i e r e q u e l o s d í m e r o s d e u n i ó n a F c R n p u e d e n t e n e r u n p e r f i l d e u n i ó n m e j o r a d o d e p e n d i e n t e d e l p H e n c o m p a r a c i ó n c o n l a s v a r i a n t e s m o n o m é r i c a s c o r r e s p o n d i e n t e s .
E j e m p l o 14
C o m p a r a c i ó n d e l a c a p a c i d a d d e b l o q u e o d e l a u n i ó n d e I g G a F c R n
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
E j e m p l o 15
P r o d u c c i ó n d e p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n d i m é r i c a
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
L a s v a r i a n t e s Z , Z 17303 ( S E Q ID N O : 357 ) , Z 18632 ( S E Q ID N O : 365 ) , Z 18633 ( S E Q ID N O : 366 ) y Z 18634 ( S E Q ID N O : 367 ) s e c o n s t r u y e r o n c o m o d í m e r o s e n f u s i ó n c o n l a v a r i a n t e d e u n i ó n a a l b ú m i n a P P 013 ( s E q ID N O : 377 ) e n e l f o r m a t o g e n e r a l [ Z # # # # # ] - A S G S - P P 013 - G T - ( G 4 S ) - [ Z # # # # # ] . L o s p o l i p é p t i d o s r e s u l t a n t e s s e d e s i g n a r o n Z A Z 3824 ( S E Q ID N O : 373 ) , Z A Z 3869 ( S E Q ID N O : 374 ) , Z A Z 3870 ( S E Q ID N O : 375 ) y Z A Z 3871 ( S E Q ID N O : 376 ) , r e s p e c t i v a m e n t e . L o s p o l i p é p t i d o s d i m é r i c o s d e l a v a r i a n t e Z , Z 17303 e n f u s i ó n c o n P P 013 t a m b i é n s e c o n s t r u y e r o n c o n d i f e r e n t e s e n l a z a d o r e s d e f u s i ó n C - t e r m i n a l d e P P 013 , d a n d o p o r r e s u l t a d o l o s p o l i p é p t i d o s Z 17303 - G A P ( G 4 S ) a T S - P P 013 - G T ( G 4 S ) a P R - Z 17303 y Z 17303 - G A P ( G 4 S ) a T S - Z 17303 - G T ( G 4 S ) a P R - P P 013 , d e s i g n a d o s Z A Z 3715 ( S E Q ID N O : 371 ) y Z Z A 3716 ( S E Q ID N O : 372 ) , r e s p e c t i v a m e n t e . A d e m á s , Z 17303 s e c o n s t r u y ó c o m o u n d í m e r o s i n P P 013 , p e r o c o n u n a e t i q u e t a H i s 6 N - t e r m i n a l , d a n d o p o r r e s u l t a d o e l p o l i p é p t i d o G S S - H i s 6 - L Q - Z 17303 - G T ( G 4 S ) a - Z 17303 , d e s i g n a d o Z Z 3556 ( S E Q ID N O : 370 ).
E l c u l t i v o s e r e a l i z ó c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3. L a p u r i f i c a c i ó n d e l o s p o l i p é p t i d o s q u e c o n t e n í a n P P 013 s e l l e v ó a c a b o m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a d e a f i n i d a d a n t i - A B D y R P C t a l c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 6 , m i e n t r a s q u e l a p u r i f i c a c i ó n d e Z Z 3556 e t i q u e t a d a c o n H i s 6 s e r e a l i z ó e n I M A C c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3.
R e s u l t a d o s
L o s s i e t e p o l i p é p t i d o s d i m é r i c o s d e u n i ó n a F c R n , c o n s t r u i d o s y a s e a c o n u n a e t i q u e t a H i s 6 o u n r e s t o A B D , s e p r o d u j e r o n e n E . c o l i . L a c a n t i d a d d e l a p r o t e í n a p u r i f i c a d a p o r a f i n i d a d , d e t e r m i n a d a e s p e c t r o f o t o m é t r i c a m e n t e a l m e d i r l a a b s o r b a n c i a a 280 n m , v a r i ó d e 2 - 18 m g p o r g d e s e d i m e n t o b a c t e r i a n o . E l a n á l i s i s S D S - P A G E d e c a d a u n a d e l a s p r e p a r a c i o n e s p r o t e í n i c a s f i n a l e s d e m o s t r ó q u e é s t a s c o n t e n í a n p r e d o m i n a n t e m e n t e e l p o l i p é p t i d o d e u n i ó n a F c R n . L a i d e n t i d a d c o r r e c t a y e l p e s o m o l e c u l a r d e c a d a u n o d e l o s p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n s e c o n f i r m ó m e d i a n t e a n á l i s i s p o r H P L C - M S .
E j e m p l o 16
U n i ó n d e p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n h o m o y / o h e t e r o d i m é r i c a a c é l u l a s H e L a t r a n s f e c t a d a s c o n F c R n / e G F P h u m a n a
E n e s t e E j e m p l o s e i n v e s t i g ó l a c a p a c i d a d d e u n i ó n d e l o s p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n h o m o - y / o h e t e r o d i m é r i c a q u e c o m p r e n d í a n l a s v a r i a n t e s Z m a d u r a d a s . L a s c é l u l a s H e L a q u e e x p r e s a n e l t r a n s g é n d e l g e n F c R n - e G F P h u m a n o , p r o d u c i d o c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 4 , s e u t i l i z a r o n p a r a a n á l i s i s d e c i t o m e t r í a d e f l u j o c o n l a s v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n A l e x a F l u o r ® 647.
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
M a r c a j e c o n A l e x a F l u o r ® 647 d e v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n : L o s p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n h o m o - y / o h e te ro d im é r ic a s e m a rc a ro n c o n s u c c in im id i lé s te r d e l á c id o c a rb o x í lic o A le x a F lu o r® 647 ( In v it ro g e n ca t. no . A 20106 ) c o m o s e d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 13.
T in c ió n p o r in m u n o f lu o re s c e n c ia d e c é lu la s H e L a t r a n s fe c ta d a s c o n F c R n -e G F P h u m a n a s co n p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n : S e re c o le c ta ro n c é lu la s H e L a d e h F c R n -e G F P m e d ia n te tr ip s in iz a c ió n y s e la v a ro n d o s v e c e s en ta m p ó n d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , a n te s d e l re c u e n to . 100.000 c é lu la s s e p ip e te a ro n p o r p o c illo d e u n a p la c a d e 96 p o c il lo s de fo n d o en V (N u n c , ca t. no. 277143 ) y la s c é lu la s e n la p la c a s e s e d im e n ta ro n p o s te r io rm e n te a 1.700 rp m d u ra n te 4 m in a 4 °C . L o s s o b re n a d a n te s s e re t ira ro n y la s c é lu la s s e f i ja ro n co n 50 p l d e 2 % d e fo rm a ld e h íd o (S ig m a A ld r ic h , ca t. no. F 8775 ) en ta m p ó n d e M c llv a n e s d u ra n te 10 m in a R T . D e s p u é s d e e s to , la s c é lu la s se la v a ro n c o n 2 x 100 p l d e ta m p ó n d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía S F B a l 2 ,5 % Ig G u ltra b a ja (L ife T e c h n o lo g ie s ) , y s e re -s u s p e n d ie ro n e n ta m p ó n d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja y 0 ,1 % d e s a p o n in a (A p p liC h e m , ca t. no .
4518.0100 ) q u e c o n te n ía 640 nM d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o - y /o h e te ro d im é r ic a e t iq u e ta d o c o n H is 6 m a rc a d o c o n A le x a F lu o r® 647 y u n a v a r ia n te Z m o n o m é r ic a c o r re s p o n d ie n te .
E je m p lo s d e fo rm a to s p a ra h o m o - y /o h e te ro d ím e ro s in c lu y e n Z // / / / / / / / / - (G 4 S )3 - Z # # # # # y Z # # # # # - (G 4 S )-Z # # # # # , en d o n d e Z # # # # , p o r e je m p lo , se s e le c c io n a d e Z 13583 (S E Q ID N O : 23 ), Z 13621 (S E Q ID N O : 44 ), Z 13654 (S E Q ID N O : 65 ) o Z 13674 (S E Q ID N O : 75 ), o las m is m a s v a r ia n te s Z q u e c o m ie n z a n co n lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s d e A E en lu g a r d e V D c o m o , p o r e je m p lo , e n Z 17303 (S E Q ID N O : 357 ), q u e e s id é n tic a a Z 13621 (S E Q ID N O : 44 ), a p a r te d e l A E N - te rm in a l. L a c lo n a c ió n se p u e d e re a liz a r o p c io n a lm e n te co n u n a e t iq u e ta H is 6 C - te rm in a l c o m o se d e s c r ib e e n e l E je m p lo 3 o c o n u n a e t iq u e ta H is 6 N - te rm in a l c o m o e n S E Q ID N O : 362.
L a s c é lu la s H e L a tra n s d u c id a s , in c u b a d a s co n ta m p ó n so lo , s e u t iliz a n c o m o c o n tro l. L a s c é lu la s se in c u b a ro n d u ra n te 1 h a 8 °C e n un a g ita d o r v ig o ro s o e n la o s c u r id a d . L a s c é lu la s se s o m e tie ro n lu e g o a d o s d ife re n te s c o n d ic io n e s d e la v a d o ; 2 x 150 p l d e ta m p ó n d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja o 2 x 150 p l d e P B S , pH 7 ,4 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja y un p a s o d e in c u b a c ió n d e 20 m in e n P B S , pH 7 ,4 , q u e c o n te n ía f B s a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja . D e s p u é s d e la v a r, to d a s la s m u e s tra s s e re -s u s p e n d ie ro n e n 180 p l d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % d e Ig G U ltra b a ja . L o s d a to s p ro v e n ie n te s d e 10.000 c é lu la s G F P /F c R n p o s it iv a s s e o b tu v ie ro n u t il iz a n d o un F A C S C a lib u r (B e c k m a n C o u lte r ) y lo s d a to s s e a n a liz a ro n u t il iz a n d o e l s o f tw a re d e f lu jo 2.5.0 (T u rk u U n iv e rs ity ) .
R e s u lta d o s
S e u t iliz a a n á lis is d e c ito m e tr ía d e f lu jo p a ra d e te rm in a r s i lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o - y /o h e te ro d im é r ic a q u e c o m p re n d e n la s v a r ia n te s Z m a d u ra d a s s e p u e d e n u n ir a F c R n h u m a n a s o b re c é lu la s H e L a tra n s d u c id a s co n F c R n /e G F P h u m a n a s y c o m p a ra r la c a p a c id a d d e u n ió n a la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n m o n o m é r ic a s o las v a r ia n te s d ím é r ic a s q u e c o m p re n d e n la s v a r ia n te s Z p r im a r ia s . T a m b ié n s e re a liz a e l a n á lis is p a ra d e te rm in a r s i la s e p a ra c ió n d e p e n d ie n te d e l pH d e la p ro te ín a F c R n s e v e a fe c ta d a p o r e l fo rm a to d im é r ic o . L o s e x p e r im e n to s se re a liz a n a pH 6 ,0 c o n la v a d o s a pH 6 ,0 o pH 7 ,4 co n v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n m a rc a d a s c o n A le x a F lu o r® 647. S e e s p e ra q u e lo s re s u lta d o s a p a r t ir d e l e x p e r im e n to d e m u e s tre n q u e lo s fo rm a to s h o m o - y /o h e te ro d im é r ic o s , a s í c o m o la in c lu s ió n d e v a r ia n te s Z m a d u ra d a s c o n u n a a f in id a d m e jo ra d a p o r F c R n , a u m e n te n la c a p a c id a d d e u n ió n d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n y q u e la s e p a ra c ió n d e p e n d ie n te d e l pH d e F c R n s e d is m in u y a p a ra d ic h o s p o lip é p tid o s .
E je m p lo 17
U n ió n d e p e n d ie n te d e l pH d e p o lip é p tid o s d im é r ic o s a F c R n h u m a n a
E n e s te E je m p lo se in v e s tig ó m e d ia n te E L IS A la c a p a c id a d d e lo s p o lip é p tid o s d im é r ic o s d e u n irs e a F c R n a d ife re n te s v a lo re s d e pH y s e c o m p a ró c o n la c a p a c id a d d e u n ió n d e u n a v a r ia n te Z m o n o m é ric a .
M a te r ia le s y m é to d o s
L a c a p a c id a d d e lo s p o lip é p tid o s d im é r ic o s Z A Z 3824 (S E Q ID N O : 373 ), Z A Z 3869 (S E Q ID N O : 374 ), Z A Z 3870 (S E Q ID N O : 375 ) y Z A Z 3871 (S E Q ID N O : 376 ), a s í c o m o la v a r ia n te Z m o n o m é r ic a Z 13621 (S E Q ID N O : 44 ), d e u n irs e a F c R n h u m a n a a d ife re n te s v a lo re s d e pH s e s o m e tió a e n s a y o en un E L IS A , en d o n d e s e re a liz a ro n to d o s lo s p a s o s d e u n ió n y la v a d o y a s e a a pH 6 ,0 o a pH 7 ,4. P la c a s E L IS A d e 96 p o c illo s a la m ita d s e re c u b r ie ro n a 4 °C d u ra n te la n o c h e c o n 4 g /m l d e h F c R n (B io rb y t, ca t. no. O rb 84388 ) d ilu id o s e n P B S . L a s p la c a s s e la v a ro n d o s v e c e s e n a g u a d e l g r ifo y lo s p o c illo s s e b lo q u e a ro n co n 100 p l d e P B S C (P B S , pH 7 ,4 , c o m p le m e n ta d o c o n 1 % d e c a s e ín a ) d u ra n te 1 ,5 h a R T . L a s o lu c ió n d e b lo q u e o s e v a c ío y lo s p o c illo s s o m e tid o s a t ra ta m ie n to a pH 6 ,0 se la v a ro n u n a v e z co n ta m p ó n fo s fa to -c it ra to d e M c llv a in e s , pH 6 ,0. S e a g re g a ro n d ife re n te s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n a u n a c o n c e n tra c ió n d e 100 nM y s e d ilu y e ro n p o r p a s o s 1 :10 h a s ta 0,1 pM en P C C ( ta m p ó n fo s fa to -c it ra to de M c llv a in e s , pH 6 ,0 , c o m p le m e n ta d o c o n 1 % d e c a s e ín a ) o P B S C . S e tra n s f ir ie ro n p o r p o c illo 50 p l d e la s d ilu c io n e s y la s p la c a s E L IS A s e in c u b a ro n d u ra n te 1 ,5 h a R T . L a s p la c a s se la v a ro n c u a tro v e c e s y a s e a e n P C T ( ta m p ó n fo s fa to -c it ra to d e M c llv a in e s , pH 6 ,0 , c o m p le m e n ta d o c o n T w e e n -20 a l 0 ,05 % ) o P B S T (P B S , pH 7.4 , c o m p le m e n ta d o c o n T w e e n -20 a l 0 ,05 % ). S e d e te c ta ro n lo s p o lip é p tid o s u n id o s c o n 50 p l/p o c il lo d e un a n t ic u e rp o d e ra tó n Z e s p e c íf ic o (p ro d u c id o in te rn a m e n te ) d ilu id o a 2 p g /m l e n y a s e a P C C o P B S C . L a s p la c a s s e in c u b a ro n p o s te r io rm e n te d u ra n te 1 ,5 h a R T , s e g u id o d e la v a d o c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te . S e a g re g ó la Ig a n ti- ra tó n d e c a b ra H R P c o n ju g a d a o b te n id a d e D A K O (P 0447 ) , d ilu id a 1 :5000 e n y a s e a P C C o P B S C , y la s p la c a s se
Figure imgf000054_0001
T a b l a 16. V a l o r e s E C 50 c a l c u l a d o s a p a r t i r d e l a n á l i s i s d e u n i ó n a p H 6 , 0 y p H 7 , 4
Figure imgf000054_0003
E j e m p l o 18
C o m p a r a c i ó n d e l a c a p a c i d a d d e b l o q u e o d e l a u n i ó n d e I g G a F c R n
E n e s t e E j e m p l o s e a n a l i z ó e l p o t e n c i a l d e l o s p o l i p é p t i d o s p a r a i n h i b i r l a u n i ó n d e I g G a F c R n u t i l i z a n d o d o s d i f e r e n t e s m é t o d o s in v i t r o : E n s a y o A l p h a L I S A y u n e n s a y o d e b a s e c e l u l a r .
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
Figure imgf000054_0002
R e s u l t a d o s
Figure imgf000055_0001
E je m p lo 19
C o m p a ra c ió n d e la c a p a c id a d d e b lo q u e o d e l re c ic la je d e Ig G
E n e s te E je m p lo s e in v e s t ig ó e l e fe c to d e los p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o - y /o h e te ro d im é r ic a s o b re e l re c ic la je d e Ig G e n c é lu la s M D C K .2 tra n s d u c id a s a F c R n .
M a te r ia le s y m é to d o s
T ra n s d u c c ió n le n t iv ira l d e c é lu la s M D C K .2 : L o s p a re s d e v e c to re s 2 k 7 neo-C M V -h B 2 M y p H R -c P P T -C M V -h F c R n -e G F P s e c o - tra n s fe c ta ro n c o n ju n ta m e n te c o n e l p lá s m id o co n e n v o ltu ra V S V -G y e m p a q u e g a g /p o l e n c é lu la s H E K 293 T u t il iz a n d o t ra n s fe c c ió n c o n c lo ru ro d e c a lc io (Z u f fe re y e t a l., s u p ra ; J a k o b s s o n et. a l. (2006 ) s u p ra ) . L o s s o b re n a d a n te s d e l c u lt iv o H E K 293 T q u e c o n te n ía n la s p a r t íc u la s le n t iv ira le s fo rm a d a s c o n lo s t ra n s g e n e s F c R n y B 2 M , re s p e c t iv a m e n te , s e u t i l iz a ro n p a ra t r a n s d u c ir s e c u e n c ia lm e n te c é lu la s M D C K .2 (A T C C ca t. no . C R L -2936 ) a un n ú m e ro d e p a s o b a jo . L a s lín e a s d e c é lu la s M D C K .2 tra n s d u c id a s e s ta b le m e n te re s u lta n te s se d e s ig n a ro n h F c R n -e G F P ( tra n s d u c id a s co n lo s g e n e s p a ra e l F c R n -e G F P h u m a n o y H B 2 M ).
C a p a c id a d d e b lo q u e o d e re c ic la je d e IgG : C é lu la s M D C K .2 t r a n s d u c id a s c o n F c R n -E G F P h u m a n o s e c o lo c a ro n en p la c a s a ra z ó n d e 25.000 c é lu la s /p o c il lo e n u n a p la c a d e 96 p o c il lo s y s e in c u b a ro n d u ra n te la n o c h e a 37 °C , 5 % d e C O 2. L a s c é lu la s s e in c u b a ro n co n lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o - y /o h e te ro d im é r ic a a c o n c e n tra c io n e s q u e v a r ía n d e 200 h a s ta 0 ,01 nM e n ta m p ó n d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja a n te s d e la a d ic ió n d e 500 n g /m l d e Ig G h u m a n a c o n ju g a d a c o n A le x a F lu o r® 647 (J a c k s o n la b o ra to r ie s , ca t. no . 009 -600 ­ 003 ) e in c u b a c ió n d u ra n te u n a h o ra a d ic io n a l. L a s c é lu la s se la v a n c o n ta m p ó n d e M c llv a n e s , pH 6 ,0 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja y lu e g o s e in c u b a ro n en P B S , pH 7 ,4 , q u e c o n te n ía F B S a l 2 ,5 % Ig G U ltra b a ja d u ra n te 2 h a 37 °C , 5 % d e C O 2. L o s s o b re n a d a n te s s e a n a liz a ro n lu e g o e n c u a n to a la p re s e n c ia d e la Ig G h u m a n a c o n ju g a d a c o n A le x a F lu o r® 647 e n un le c to r d e m ú ltip le s p la c a s E n S p ire (P e rk in E lm e r). L a s c u rv a s d e in h ib ic ió n s e a n a liz a n m e d ia n te re g re s ió n n o lin e a l u t i l iz a n d o e l s o f tw a re G ra p h P a d P r is m 5 p a ra d e te rm in a r lo s v a lo re s IC 50.
R e s u lta d o s
S e e s p e ra q u e lo s re s u lta d o s a p a r t ir d e l e x p e r im e n to d e m u e s tre n u n a re d u c c ió n d e p e n d ie n te d e la d o s is e n e l re c ic la je d e Ig G a t ra v é s d e la a c c ió n d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n d im é r ic a .
E je m p lo 20
C a ta b o l is m o in c re m e n ta d o d e Ig G p o r p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n d im é r ic a e n ra to n e s tra n s g é n ic o s co n F cR n
E n e s te E je m p lo se in v e s tig ó e l e fe c to d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o d im é r ic a s o b re e l c a ta b o lis m o de Ig G e n ra to n e s tra n s g é n ic o s co n F c R n h u m a n a e n d o s o c a s io n e s d ife re n te s .
M a te r ia le s y m é to d o s
E s tu d io s e n a n im a le s : E n e l p r im e r e s tu d io , e l p o lip é p tid o d e u n ió n a F c R n h o m o d im é r ic a Z A Z 3715 (S E Q ID N O : 371 ) o Z Z A 3716 (S E Q ID N O : 372 ), o e l v e h íc u lo ( ta m p ó n P B S ), s e a d m in is tró a 0 h o ra s m e d ia n te in y e c c ió n i.v. a ra to n e s m a c h o B 6.C g -F c g r t tm 1 D c r T g (F C G R T )32 D c r /D c rJ (J a c k s o n L a b o ra to ry , re s e rv a no . 14565 ) a u n a d o s is d e 6 m g /k g . 24 h o ra s a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e l p o lip é p tid o , s e a d m in is tra ro n m e d ia n te in y e c c ió n i.v. 500 m g /k g de h lg G (K io v ig , B a x te r ) . S e re c o le c ta ro n m u e s tra s d e s u e ro a -168 , 0, 24 , 72 , 120 y 144 h ( té rm in o d e l e s tu d io ) y se a lm a c e n a ro n a -20 °C .
E n e l e s tu d io s e c u n d a r io , e l p o lip é p tid o d e u n ió n a F c R n h o m o d im é r ic a Z A Z 3869 (S E Q ID N O : 374 ), Z A Z 3870 (S E Q ID N O : 375 ) o Z A Z 3871 (S E Q i D N o : 376 ), o e l v e h íc u lo ( ta m p ó n P B S ), s e a d m in is tró a 0 h o ra s m e d ia n te in y e c c ió n i.v . a ra to n e s m a c h o B 6.C g -F c g r t tm 1 D c r T g (F C G R T )32 D c r /D c rJ (J a c k s o n L a b o ra to ry , re s e rv a no . 14565 ) a u n a d o s is d e 6 m g /k g . 24 h o ra s a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e l p o lip é p tid o , s e a d m in is tra ro n m e d ia n te in y e c c ió n i.v. 500 m g /k g d e h lg G (K io v ig , B a x te r) . S e re c o le c ta ro n m u e s tra s d e s u e ro a -168 , 0, 24 , 72 , 120 y 144 h ( té rm in o d e l e s tu d io ) y s e a lm a c e n a ro n a -20 °C .
E L IS A d e Ig G h u m a n a : La c o n c e n tra c ió n d e Ig G h u m a n a en m u e s tra s s é r ic a s d e ra tó n re c o le c ta d a s a p a r t ir d e los d o s e s tu d io s s e a n a liz ó co n un k it A lp h a L IS A d e Ig G h u m a n a (P e rk in E lm e r, c a t. no. A L 205 C ) c o m o s e d e s c r ib e p o r e l fa b r ic a n te . L a c o n c e n tra c ió n d e Ig G h u m a n a se c a lc u ló a p a r t ir d e u n a c u rv a e s tá n d a r y G ra p h P a d P r is m 5 u t il iz a n d o u n a fó rm u la d e re g re s ió n n o lin e a l.
R e s u lta d o s
L o s re s u lta d o s a p a r t ir d e los e x p e r im e n to s d e m u e s tra n u n a re d u c c ió n en la s c o n c e n tra c io n e s d e Ig G h u m a n a a t ra v é s d e l t ie m p o co n la a c c ió n d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n . E x is te p o c a o n in g u n a d ife re n c ia e n la re d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e Ig G e n tre lo s d o s g ru p o s q u e re c ib ie ro n lo s p o lip é p tid o s Z A Z 3715 y Z Z A 3716 ( f ig u ra 14 A ). E s to s re s u lta d o s in d ic a n q u e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n co n u n a c o lo c a c ió n c e n tra l o C - te rm in a l d e A B D s o n ig u a lm e n te e f ic ie n te s p a ra a u m e n ta r e l c a ta b o lis m o d e IgG . L o s p o lip é p tid o s Z A Z 3869 , Z A Z 3870 y Z A Z 3871 , re s p e c t iv a m e n te , re d u je ro n lo s n iv e le s d e Ig G h u m a n a a un g ra d o s im ila r ( f ig u ra 14 B ). L o s re s u lta d o s a p a r t ir de l s e g u n d o e x p e r i m e n t o e s t u v i e r o n e n l a m i s m a v a r i a c i ó n q u e l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s e n e l p r i m e r e x p e r i m e n t o .
Figure imgf000057_0001
E j e m p l o 21
C a t a b o l i s m o i n c r e m e n t a d o d e I g G m e d i a n t e p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n d i m é r i c a e n r a t o n e s N M R I
Figure imgf000057_0002
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
E s t u d i o e n a n i m a l e s : E l p o l i p é p t i d o d e u n i ó n a F c R n h o m o d i m é r i c a Z A Z 3715 ( S E Q ID N O : 371 ) o Z Z A 3824 ( S E Q ID N O : 373 ) , o e l v e h í c u l o ( t a m p ó n P B S ) , s e a d m i n i s t r ó a 0 h o r a s m e d i a n t e i n y e c c i ó n i.v . a r a t o n e s h e m b r a N M R I , a u n a d o s i s d e 0 , 6 o 1, 7 p m o l / k g . S e r e c o l e c t a r o n m u e s t r a s d e s u e r o a 0 , 24 , 48 y 72 h ( t é r m i n o d e l e s t u d i o ) y s e a l m a c e n a r o n a - 20 ° C .
Figure imgf000057_0003
A n á l i s i s f a r m a c o c i n é t i c o : E n l a f i g u r a 16 s e m u e s t r a n l o s p e r f i l e s f a r m a c o c i n é t i c o s d e Z A Z 3715 y Z A Z 3824. L a s e m i v i d a d e Z A Z 3824 f u e d e a p r o x i m a d a m e n t e 62 h o r a s , q u e e s t á e n l í n e a c o n l a s e m i v i d a o b t e n i d a e n e l e s t u d i o f a r m a c o c i n é t i c o p r e s e n t a d o e n e l E j e m p l o 6 , lo q u e d e m u e s t r a q u e l a s p r o p i e d a d e s f a r m a c o c i n é t i c a s d e l o s p o l i p é p t i d o s s e m e j o r a n a d i c i o n a l m e n t e m e d i a n t e l a u n i ó n a F c R n , a d e m á s d e l a s e m i v i d a p r o l o n g a d a r e s u l t a n t e d e l a u n i ó n a a l b ú m i n a .
E j e m p l o 22
C a t a b o l i s m o i n c r e m e n t a d o d e I g G m e d i a n t e d í m e r o s d e u n i ó n a F c R n e n m o n o s c y n o m o l g u s
Figure imgf000057_0004
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
E s t u d i o e n a n i m a l e s : S e p r e p a r a r o n p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n h o m o - y / o h e t e r o d i m é r i c a f u s i o n a d o s d e f o r m a r e c o m b i n a n t e a P P 013 ( S E Q ID N O : 377 ) . E j e m p l o s d e e s t o s d í m e r o s d e u n i ó n a F c R n i n c l u y e n S E Q ID N O : 371 ­ 376 d e s c r i t a s e n l a p r e s e n t e .
L o s d ím e ro s d e u n ió n a F c R n q u e in c lu y e n un d o m in io d e u n ió n a a lb ú m in a se a d m in is tra n lu e g o a m o n o s c y n o m o lg u s a u n a d o s is d e 2 , 0 ,4 y 0,1 p m o l/k g . L o s p o lip é p tid o s d im é r ic o s se in y e c ta n p o r v ía in tra v e n o s a a 0 h o ra s . L o s m o n o s s e d e s a n g ra n 1 h a n te s d e la p r im e ra a d m in is tra c ió n y d ia r ia m e n te h a s ta e l d ía 21 , y lu e g o u n a v e z a la s e m a n a h a s ta e l d ía 50. L o s s u e ro s s e p re p a ra n y s e a lm a c e n a n a -20 °C . L a c o n c e n tra c ió n d e Ig G de c y n o m o lg u s s e d e te rm in a m e d ia n te E L IS A .
L o s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o - y /o h e te ro d im é r ic a s in un d o m in io d e u n ió n a a lb ú m in a s e a d m in is tra n a m o n o s c y n o m o lg u s a u n a d o s is d e 2, 0 ,4 y 0 ,1 p m o l/k g . L o s p o lip é p tid o s d im é r ic o s s e a d m in is tra n t re s v e c e s a la s e m a n a d u ra n te d o s s e m a n a s . L o s m o n o s s e d e s a n g ra n 1 h a n te s d e la p r im e ra a d m in is tra c ió n y d ia r ia m e n te h a s ta e l d ía 21 , y lu e g o u n a v e z a la s e m a n a h a s ta e l d ía 50. L o s s u e ro s s e p re p a ra n y a lm a c e n a n a -20 °C . La c o n c e n tra c ió n d e Ig G d e c y n o m o lg u s s e d e te rm in a m e d ia n te E L IS A .
E L IS A c o n Ig G d e c y n o m o lg u s : L a c o n c e n tra c ió n d e Ig G d e c y n o m o lg u s e n m u e s tra s s é r ic a s s e d e te rm in a c o n un k it p a ra E L IS A d e Ig G h u m a n a /c y n o m o lg u s (p o r e je m p lo M a b te c h 3850 -1 A D -6 , q u e t ie n e re a c c ió n c ru z a d a co n Ig G ta n to h u m a n a c o m o d e c y n o m o lg u s ) c o m o s e d e s c r ib e p o r e l fa b r ic a n te .
R e s u lta d o s
S e e s p e ra q u e lo s re s u lta d o s d e l e x p e r im e n to d e m u e s tre n u n a re d u c c ió n d e p e n d ie n te d e la d o s is e n las c o n c e n tra c io n e s d e Ig G d e c y n o m o lg u s a t ra v é s d e la a c c ió n d e lo s d ím e ro s d e u n ió n a F c R n , c o n un e fe c to m á s p ro n u n c ia d o p a ra e s to s d ím e ro s , q u e ta m b ié n c o m p re n d e n un d o m in io d e u n ió n a a lb ú m in a .
E je m p lo 23
E s tu d io fa rm a c o c in é tic o d e p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n d im é r ic a
E n e s te e je m p lo , se in v e s tig a la s e m iv id a en s u e ro d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n h o m o - y /o h e te ro d im é r ic a en un e s tu d io fa rm a c o c in é t ic o re a liz a d o e n ra to n e s .
M a te r ia le s y m é to d o s
E s tu d io fa rm a c o c in é tic o : L o s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n , c o m o h o m o - y /o h e te ro d ím e ro s s o lo s o fu s io n a d o s re c o m b in a n te m e n te a P P 013 (S E Q ID N O : 377 ) s e a d m in is tra n p o r v ía in tra v e n o s a ( i.v .) a ra to n e s m a c h o N M R I (C h a r le s R iv e r, A le m a n ia ) a u n a d o s is d e 92 n m o l/. S u e ro s d e g ru p o s d e t re s ra to n e s s e o b t ie n e n a 0 ,08 , 6, 18, 78, 120 , 168 y 240 h o ra s . L a c o n c e n tra c ió n d e l p o lip é p tid o re s p e c t iv o s e d e te rm in a m e d ia n te E L IS A .
E L IS A : P la c a s p a ra E L IS A d e 96 p o c il lo s a la m ita d se re c u b re n a 4 °C d u ra n te la n o c h e c o n 50 p l/p o c il lo d e un a n t ic u e rp o d e c a b ra e s p e c íf ic o p a ra la s v a r ia n te s Z e n g e n e ra l (p ro d u c id a s in te rn a m e n te ) d ilu id a s a ra z ó n d e 4 m g /m l e n ta m p ó n d e re c u b r im ie n to (c a rb o n a to d e s o d io 50 m M , pH 9 ,6 ). L a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o s se v e r t ió y los p o c il lo s s e b lo q u e a ro n co n 100 p l d e P B S C d u ra n te 1 ,5 h a R T . L o s s u e ro s se d ilu y e ro n e n P B S C q u e c o n te n ía s u e ro d e ra tó n a l 1 % (m a tr iz ) d e 1 :100 a 1 :51 , 200 en u n a s e r ie d e d ilu c io n e s d e d o s v e c e s en u n a p la c a p a ra d ilu c io n e s . E n c a d a u n a d e la s p la c a s s e in c lu y e ro n u n a t itu la c ió n e s tá n d a r p a ra e l p o lip é p tid o d e la v a r ia n te Z re s p e c t iv a y c u a tro c o n tro le s d e c a lid a d (c o n tro l m u y b a jo , b a jo , m e d io y a lto ) d ilu id o s en la m a tr iz . S e t ra n s f ie re n p o r p o c illo 50 p l d e la s d ilu c io n e s y la s p la c a s d e E L IS A s e in c u b a n d u ra n te 1 ,5 h a R T . L a s p la c a s se la v a n c u a tro v e c e s c o n P B S T . L o s p o lip é p tid o s d e la s v a r ia n te s Z u n id a s s e d e te c ta n c o n 50 p l/p o c il lo d e a n t i-P P 013 Ig d e c o n e jo (p ro d u c id o in te rn a m e n te ) o 50 p l/p o c il lo d e m A b a n t i-Z d e ra tó n (p ro d u c id o in te rn a m e n te ) d ilu id o a ra z ó n d e 4 p g /m l e n P B S C . L a s p la c a s s e in c u b a n p o s te r io rm e n te d u ra n te 1 ,5 h a R T , s e g u id o d e la v a d o s c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te . S e a g re g ó H R P a n t i-c o n e jo d e a s n o c o n ju g a d o co n H R P (J a c k s o n la b o ra to r ie s ; ca t. no . 711 -035 ­ 152 ), d ilu id o 1 :20.000 en P B S C , y las p la c a s s e in c u b a n d u ra n te 1 h. D e s p u é s d e la v a r c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te , s e a g re g a n a lo s p o c il lo s 50 p l d e l s u s tra to Im m u n o P u re T M B y la s p la c a s s e d e s a rro lla n d e a c u e rd o c o n la s re c o m e n d a c io n e s d e l fa b r ic a n te . D e s p u é s d e 15 m in u to s d e d e s a rro llo , se m id ió la a b s o rb a n c ia a 450 n m u t il iz a n d o un le c to r d e p la c a s d e m ú lt ip le s p o c il lo s (V ic to r3). L o s v a lo re s d e la a b s o rb a n c ia s e a n a liz a n u t iliz a n d o G ra p h P a d P r is m 5 p a ra d e te rm in a r la s c o n c e n tra c io n e s (a ju s te s d e c u rv a s s p lin e -c ú b ic a ) y e l á re a b a jo la c u rv a (A U C ). L a s c o n c e n tra c io n e s s e re p re s e n ta n lu e g o c o m o s u s lo g a r itm o s n a tu ra le s f re n te a l t ie m p o . S e e s p e ra q u e las c u rv a s re s u lta n te s s ig a n un m o d e lo d e d o s c o m p a r t im e n to s y s e c a lc u la la s e m iv id a te rm in a l c o m o In2 d iv id id a e n tre la p e n d ie n te c o n b a s e e n lo s ú lt im o s t re s p u n to s d e t ie m p o .
R e s u lta d o s
S e e s p e ra q u e lo s re s u lta d o s a p a r t ir d e l e x p e r im e n to d e s c r ito e n la p re s e n te m u e s tre n u n a fa s e d e e l im in a c ió n de d o s c o m p a r t im e n to s c o n u n a s e m iv id a te rm in a l d e a p ro x im a d a m e n te 60 m in p a ra lo s p o lip é p tid o s s in A B D y d e a p ro x im a d a m e n te 90 h o ra s p a ra lo s p o lip é p tid o s q u e c o m p re n d a n A B D .
E je m p lo 24
G e n e ra c ió n , e s tu d io d e e s ta b il id a d y v a lo ra c ió n d e la u n ió n d e lo s p o lip é p tid o s d e u n ió n a F c R n m o d if ic a d o s en e l a rm a z ó n
E l s ig u ie n te E je m p lo d e s c r ib e la s v a r ia n te s Z d e u n ió n a F c R n m o d if ic a d a s en e l a rm a z ó n q u e e x h ib e n u n a e s ta b il id a d m e jo ra d a a te m p e ra tu ra s e le v a d a s . L a s v a r ia n te s Z Z 17347 (S E Q ID N O : 358 ), c o n la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s N 52 S y D 53 E , y Z 17348 (S E Q ID N O : 359 ), co n la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s D 36 R , D 37 Q , S 39 E , N 52 S y D 53 E , s e c o m p a ra n c o n su m o lé c u la o r ig in a l Z 11948 (S E Q ID N O : 354 ) e n té rm in o s d e e s ta b il id a d y c a p a c id a d d e u n ió n a F cR n .
M a te r ia le s y m é to d o s
G e n e ra c ió n d e p o lip é p tid o s m o d if ic a d o s en e l a rm a z ó n : Z 17347 (S E Q ID N O : 358 ), Z 17348 (S E Q ID N O : 359 ) y Z 11948 (S E Q ID N O : 354 ) se c lo n a ro n c o n u n a e t iq u e ta d e 6 x h is t id in a N - te rm in a l (H is a ) y se o b tu v ie ro n c o n s tru c c io n e s d e p o lip é p tid o s c o d if ic a d o s e n e l fo rm a to M G S S H H H H H H L Q -[Z # # # # # ] . S e in tro d u je ro n m u ta c io n e s e n lo s p lá s m id o s d e la s v a r ia n te s Z m o d if ic a d a s u t il iz a n d o p a re s d e c e b a d o re s d e o l ig o n u c le ó t id o s s o la p a n te s q u e c o d if ic a n las s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s d e s e a d a s y a p lic a n d o té c n ic a s d e b io lo g ía m o le c u la r e s ta b le c id a s . L a s s e c u e n c ia s c o r re c ta s d e p lá s m id o s se v e r if ic a ro n m e d ia n te s e c u e n c ia c ió n d e l A D N .
C é lu la s d e E co li ( c e p a T 7 E 2 ) (G e n e B r id g e ) s e tra n s fo rm a ro n c o n p lá s m id o s q u e c o n te n ía n lo s f ra g m e n to s g é n ic o s q u e c o d if ic a n la s v a r ia n te s Z o r ig in a le s y la s m o d if ic a d a s en e l a rm a z ó n . L a s c é lu la s se c u lt iv a ro n a 37 °C en m e d io T S B -Y E c o m p le m e n ta d o c o n 50 p g /m l d e k a n a m ic in a y la e x p re s ió n d e la p ro te ín a se in d u jo p o s te r io rm e n te m e d ia n te la a d ic ió n d e IP T G . L a s c é lu la s s e d im e n ta d a s s e d e s o rg a n iz a ro n u t il iz a n d o un h o m o g e n e iz a d o r F a s tP re p ®-24 (N o rd ic B io la b s ) y e l d e s e c h o c e lu la r s e re t iró m e d ia n te c e n tr ifu g a c ió n .
C a d a u n o d e lo s s o b re n a d a n te s q u e c o n te n ía la v a r ia n te Z c o m o u n a p ro te ín a e t iq u e ta d a c o n H is a s e p u r if ic ó m e d ia n te c ro m a to g ra f ía d e a f in id a d ió n ic a p o r m e ta le s in m o v iliz a d o s ( IM A C ) u t il iz a n d o c o lu m n a s H is G ra v iT ra p ™ (G E H e a lth c a re ) d e a c u e rd o co n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . L a s v a r ia n te s Z p u r if ic a d a s se in te rc a m b ia ro n p o r ta m p ó n a s o lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a co n fo s fa to (P B S ; K H 2 P O 4 1 ,47 m M , N a 2 H P O 4 8,1 m M , N a C l 137 m M , K C l 2 ,68 m M , pH 7 ,4 ) u t i l iz a n d o c o lu m n a s d e d e s a lin iz a c ió n P D -10 (G E H e a lth c a re ) . L a id e n tid a d c o rre c ta d e c a d a u n o d e los p o lip é p tid o s s e v e r i f ic ó m e d ia n te S D S -P A G E y H P L C -M S .
A n á lis is d e e s p e c tro s c o p ía p o r d ic ro ís m o c irc u la r : E l a n á lis is p o r d ic ro ís m o c ir c u la r (C D ) s e lle v ó a c a b o c o m o se d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 3 p a ra d e te rm in a r la s te m p e ra tu ra s d e fu s ió n (T m ) y e v a lu a r lo s c a m b io s p o te n c ia le s e n la e s t ru c tu ra s e c u n d a r ia d e l p o lip é p tid o d e la in v e n c ió n c o m o re s u lta d o d e la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s .
E s tu d io d e e s ta b il id a d c o m p a ra t iv a : L a s v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s co n H is a , fo rm u la d a s e n P B S pH 7 ,4 , s e d ilu y e ro n a ra z ó n d e 1 m g /m l y 200 p l d e p a rte s a líc u o ta s s e in c u b a ro n a 37 °C d u ra n te 2 s e m a n a s . L a s m u e s tra s re c o le c ta d a s a n te s y d e s p u é s d e l e n s a y o d e e s ta b il id a d s e a n a liz a ro n m e d ia n te S D S -P A G E u t il iz a n d o 10 % d e g e le s B is -T h s N u P A G e ( In v it ro g e n ) y a l c a rg a r 5 p g d e la p ro te ín a e n c a d a u n o d e lo s p o c illo s . La e s ta b il id a d s e e v a lu ó m e d ia n te la a p a r ic ió n d e n u e v a s v a r ia n te s d e s p u é s d e la in c u b a c ió n a la te m p e ra tu ra e le v a d a y la s v a r ia n te s m u ta d a s se c o m p a ra ro n c o n e l p o lip é p tid o o rig in a l.
E v a lu a c ió n d e la u n ió n d e p o lip é p tid o s m o d if ic a d o s e n e l a rm a z ó n : L a s v a r ia n te s Z e t iq u e ta d a s c o n H is a se e v a lu a ro n a d ic io n a lm e n te e n lo s té rm in o s d e la c a p a c id a d d e u n ió n p re s e rv a d a a F c R n d e s p u é s d e la in tro d u c c ió n o a lte ra c io n e s e n e l a rm a z ó n , a s í c o m o d e s p u é s d e q u e se h a b ía n s o m e tid o a la p ru e b a d e e s ta b il id a d , e s d e c ir, in c u b a d o a 37 °C d u ra n te 2 s e m a n a s . S e d e te rm in a ro n la s c o n s ta n te s c in é t ic a s c o m p a ra t iv a s ( k on y kcf f ) y las a f in id a d e s (K d ) u t i l iz a n d o un in s tru m e n to B ia c o re 2000. L a p ro te ín a F c R n h u m a n a d ia n a (B io rb y t, ca t. no. o rb 84388 ) s e in m o v iliz ó s o b re la s u p e r f ic ie d e la c a p a d e d e x tra n o c a rb o x ila d a d e un c h ip c o n C M 5 (G E H e a lth c a re ) . La in m o v iliz a c ió n s e re a liz ó u t i l iz a n d o q u ím ic a d e a c o p la m ie n to c o n a m in a d e a c u e rd o c o n e l p ro to c o lo d e l fa b r ic a n te y u t iliz a n d o H B S -E P c o m o ta m p ó n d e m ig ra c ió n . U n a s u p e r f ic ie d e c é lu la s d e f lu jo s o b re e l c h ip se a c t iv ó y d e s a c tiv ó p a ra u t iliz a rs e c o m o v a c ío d u ra n te la s in y e c c io n e s d e a n a lito s . E l n iv e l d e in m o v iliz a c ió n d e h F c R n s o b re la s u p e r f ic ie fu e d e a p ro x im a d a m e n te 750 R U . L a s v a r ia n te s Z s e d i lu y e ro n e n ta m p ó n d e m ig ra c ió n a c o n c e n tra c io n e s f in a le s d e 3 ,33 , 10 y 30 nM y se in y e c ta ro n d u ra n te 3 m in , s e g u id o d e 15 m in d e d is o c ia c ió n e n ta m p ó n de m ig ra c ió n . L a re g e n e ra c ió n m e d ia n te t re s p u ls o s d e H B S -E P , s e g u id a p o r 10 m in d e e q u ilib r io e n ta m p ó n de m ig ra c ió n s e a p lic ó d e s p u é s d e c a d a u n a d e la s in y e c c io n e s d e a n a lito s . L a s c o n s ta n te s c in é t ic a s se c a lc u la ro n a p a r t ir d e lo s s e n s o g ra m a s u t il iz a n d o e l m o d e lo L a n g m u ir 1:1 d e l s o f tw a re B ia E v a lu a t io n 4.1 (G E H e a lth c a re ) . L a s c u rv a s d e la s u p e r f ic ie v a c ía s e re s ta ro n d e la s c u rv a s d e la s s u p e r f ic ie s c o n lig a n d o s y lo s d a to s p ro v e n ie n te s d e los c ic lo s d e ta m p ó n s e re s ta ro n d e lo s d a to s d e lo s c ic lo s d e la m u e s tra d e e n s a y o p a ra c o r re g ir c u a lq u ie r d e s v ia c ió n e n la s e ñ a l.
R e s u lta d o s
A n á lis is d e e s p e c tro s c o p ía p o r d ic ro ís m o c irc u la r : La T m d e c a d a u n a d e la s v a r ia n te s Z re s p e c t iv a s , s e g ú n se d e te rm in ó a p a r t ir d e l p u n to m e d io d e la t r a n s ic ió n en la g rá f ic a d e la s e ñ a l d e C D fe n te a la te m p e ra tu ra s e m u e s tra e n la T a b la 19. L a s v a r ia n te s Z m u ta d a s m o s tra ro n u n a e s tru c tu ra a lfa h e l ic o id a l p re s e rv a d a y s e re p le g a ro n re v e rs ib le m e n te d e s p u é s d e l c a le n ta m ie n to a 90 °C .
T a b l a 19 : T e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n p a r a l a s v a r i a n t e s Z o r i g i n a l e s y m u t a d a s
Figure imgf000060_0001
E s t u d i o c o m p a r a t i v o d e e s t a b i l i d a d : L a s v a r i a n t e s Z m o d i f i c a d a s e n e l a r m a z ó n Z 17347 y Z 17348 m o s t r a r o n u n a e s t a b i l i d a d m e j o r a d a e n c o m p a r a c i ó n c o n e l p o l i p é p t i d o o r i g i n a l Z 11948. L a s e g u n d a b a n d a v i s i b l e e n e l g e l j u s t o p o r e n c i m a d e l a b a n d a p r i n c i p a l p a r a Z 11948 n o f u e v i s i b l e e n l a s m u e s t r a s d e Z 17347 y Z 17348 ( f i g u r a 17 ) , e s d e c i r , l a s m u t a c i o n e s d e l a r m a z ó n e v i t a r o n l a f o r m a c i ó n d e l a e s p e c i e a l t e r n a t i v a o b s e r v a d a p a r a l a m u e s t r a e n e l a r m a z ó n o r i g i n a l .
E v a l u a c i ó n d e l a u n i ó n d e p o l i p é p t i d o s m o d i f i c a d o s e n e l a r m a z ó n : E n l a T a b l a 20 s e m u e s t r a n l a s c o n s t a n t e s c i n é t i c a s c o m p a r a t i v a s p a r a l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n . L a a f i n i d a d s e e f e c t u ó m a r g i n a l m e n t e m e d i a n t e l a s s u s t i t u c i o n e s d e a m i n o á c i d o s N D a S E e n l a p o s i c i ó n 52 - 53 , t a l c o m o e n Z 17347 ( S E Q ID N O : 358 ) , a s í c o m o m e d i a n t e l a s s u s t i t u c i o n e s N D a S E e n l a p o s i c i ó n 52 - 53 e n c o m b i n a c i ó n c o n D 36 R , D 37 Q y S 39 E , t a l c o m o e n Z 17348 ( S E Q ID N O : 359 ) , y l o s a g l u t i n a n t e s f u n c i o n a l e s s e o b t u v i e r o n c o n K d e n l a v a r i a c i ó n d e 10 ' 9 M . L a s v a r i a n t e s e v a l u a d a s t a m b i é n t e n í a n c a p a c i d a d e s p r e s e r v a d a s d e u n i ó n d e s p u é s d e 2 s e m a n a s d e i n c u b a c i ó n a 3 7 ° C .
T a b l a 20. A n á l i s i s c i n é t i c o c o m p a r a t i v o d e v a r i a n t e s Z o r i g i n a l e s y m o d i f i c a d a s
Figure imgf000060_0002
E j e m p l o 25
G e n e r a c i ó n y e v a l u a c i ó n d e p o l i p é p t i d o s d e u n i ó n a F c R n m o d i f i c a d o s e n e l a r m a z ó n a d i c i o n a l e s
E n e s t e E j e m p l o l a s v a r i a n t e s a d i c i o n a l e s c o n l a s s u s t i t u c i o n e s d e a m i n o á c i d o s N 52 S y D 53 E d e l a r m a z ó n , y a l g u n a s c o n l a s u s t i t u c i ó n d e l a m i n o á c i d o Y 5 F , s e a n a l i z a r o n e n l o s t é r m i n o s d e s u e s t a b i l i d a d y u n i ó n a F c R n e n c o m p a r a c i ó n c o n s u v a r i a n t e Z d e u n i ó n a F c R n o r i g i n a l r e s p e c t i v a . L o s r e s u l t a d o s d e m u e s t r a n q u e l a e s t r u c t u r a , l a e s t a b i l i d a d y l a c a p a c i d a d d e u n i ó n a F c R n s e c o n s e r v a n e n l a s v a r i a n t e s m u t a d a s .
M a t e r i a l e s y m é t o d o s
G e n e r a c i ó n d e p o l i p é p t i d o s m o d i f i c a d o s e n e l a r m a z ó n : L a s s u s t i t u c i o n e s d e a m i n o á c i d o s N 52 S y D 53 E s e i n t r o d u j e r o n e n l o s p l á s m i d o s d e Z 13578 ( S E Q ID N O : 20 ) , Z 13583 ( S E Q ID N O : 23 ) , Z 13616 ( S E Q ID N O : 41 ) , Z 13621 ( S E Q ID n O : 44 ) y Z 13674 ( S E Q ID N O : 75 ) e t i q u e t a d o s c o n H i s 6 u t i l i z a n d o t é c n i c a s d e b i o l o g í a m o l e c u l a r e s t a b l e c i d a s q u e d i e r o n p o r r e s u l t a d o l a s v a r i a n t e s Z r e s p e c t i v a s Z 18614 ( S E Q ID N O : 360 ) , Z 18615 ( S E Q ID N O : 3 61 ) , Z 18616 ( S E Q ID N O : 362 ) , Z 18617 ( S E Q ID N O : 363 ) y Z 18618 ( S E Q ID N O : 364 ) . M o d i f i c a c i o n e s a d i c i o n a l e s e n l a p o s i c i ó n 5 f u e r o n e l r e s i d u o d e t i r o s i n a q u e s e s u s t i t u y ó p o r f e n i l a l a n i n a , a s í c o m o u n a m o d i f i c a c i ó n N - t e r m i n a l p a r a c o m e n z a r c o n l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s A E e n l u g a r d e V D , q u e d i o p o r r e s u l t a d o l a s v a r i a n t e s Z Z 18632 ( S E Q ID N O : 365 ) , Z 18633 ( S E Q ID N O : 366 ) y Z 18634 ( S E Q ID N O : 367 ) q u e t e n í a m o t i v o s d e u n i ó n ( B M ) i d é n t i c o s a Z 13578 , Z 13616 y Z 13621 , r e s p e c t i v a m e n t e . E l c u l t i v o y l a p u r i f i c a c i ó n s e r e a l i z ó e s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3 y e l E j e m p l o 9. L a s c i n c o v a r i a n t e s d e Z Z 18614 - Z 18618 s e p u r i f i c a r o n m e d i a n t e I M A C ú n i c a m e n t e , m i e n t r a s q u e l a s t r e s v a r i a n t e s d e Z Z 18632 - Z 18634 s e p u r i f i c a r o n a d i c i o n a l m e n t e m e d i a n t e R P C . A n á l i s i s C D : E l a n á l i s i s C D s e l l e v ó a c a b o t a l c o m o s e d e s c r i b e e n e l E j e m p l o 3 p a r a d e t e r m i n a r l a s t e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n ( T m ) y e v a l u a r l o s c a m b i o s p o t e n c i a l e s e n l a e s t r u c t u r a s e c u n d a r i a d e l a s v a r i a n t e s Z m u t a d a s e n c o m p a r a c i ó n c o n s u v a r i a n t e Z o r i g i n a l r e s p e c t i v a .
A n á l i s i s d e u n i ó n B i a c o r e : E s e n c i a l m e n t e c o m o s e d e s c r i b i ó e n e l E j e m p l o 3 , s e r e a l i z ó u n a n á l i s i s d e u n i ó n a p H 6 , 0 , u t i l i z a n d o u n i n s t r u m e n t o B i a c o r e . U n a s e r i e d e c o n c e n t r a c i o n e s ( 270 , 90 , 30 , 10 y 3 , 3 n M ) d e l a s v a r i a n t e s Z m a r c a d a s c o n H i s 6 , Z 18632 , Z 18633 y Z 18634 y s u s v a r i a n t e s Z o r i g i n a l e s c o r r e s p o n d i e n t e r e s p e c t i v a s Z 13578 , Z 13616 y Z 13621 , s e i n y e c t a r o n d u r a n t e 4 m i n a r a z ó n d e 30 p l / m i n s o b r e h F c R n ( B i o r b y t , c a t . n o . o r b 84388 ) y c F c R n ( B i o r b y t , c a t . n o . o r b 99075 ) , i n m o v i l i z a d o s e n d i f e r e n t e s c e l d a s d e f l u j o d e u n a s u p e r f i c i e c o n c h i p d e C M 5. S e u t i l i z ó P C T a l 0 , 005 % p H 6 , 0 c o m o e l t a m p ó n d e m i g r a c i ó n y p a r a l a s d i l u c i o n e s d e l a s v a r i a n t e s Z e t i q u e t a d a s c o n H i s 6. S e p e r m i t i ó l a d i s o c i a c i ó n e n e l t a m p ó n d e m i g r a c i ó n d u r a n t e 20 m i n , s e g u i d o d e r e g e n e r a c i ó n e n la s u p e r f i c i e p o r i n y e c c i ó n d e 3 x 30 p u l s o s p o r s e g u n d o d e P C T a l 0 , 005 % p H 7 , 4 y e q u i l i b r a d o d u r a n t e 15 m i n a n t e s d e c o m e n z a r e l s i g u i e n t e c i c l o .
R e s u l t a d o s
C u l t i v o y p u r i f i c a c i ó n : L a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n s e c o n s t r u y e r o n c o n u n a e t i q u e t a H i s 6 N - t e r m i n a l y s e p r o d u j e r o n e n E . c o l i . E l a n á l i s i s S D S - P A G E d e c a d a u n a d e l a s p r e p a r a c i o n e s f i n a l e s d e p r o t e í n a s d e m o s t r ó q u e c o n t e n í a p r e d o m i n a n t e m e n t e l a v a r i a n t e Z . L a i d e n t i d a d c o r r e c t a y e l p e s o m o l e c u l a r d e c a d a u n a d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n s e c o n f i r m ó m e d i a n t e a n á l i s i s H P L C - M S .
A n á l i s i s C D : L a T m d e l a s v a r i a n t e s Z d e u n i ó n a F c R n m u t a d a s f u e r o n i d é n t i c a s , o c a s i i d é n t i c a s , a l a T m d e la v a r i a n t e Z o r i g i n a l r e s p e c t i v a ( T a b l a 21 ) . A d e m á s , s e o b s e r v ó u n p l e g a d o r e v e r s i b l e p a r a l a t o t a l i d a d d e l a s s i e t e v a r i a n t e s Z m e d i a n t e e s p e c t r o s d e s o l a p a m i e n t o o b t e n i d o s a n t e s y d e s p u é s d e l c a l e n t a m i e n t o a 90 ° C .
A n á l i s i s d e u n i ó n B i a c o r e : L o s p e r f i l e s d e u n i ó n p a r a l a s i n t e r a c c i o n e s c o n F c R n a p H 6 , 0 s e c o m p a r a r o n p o r p a r e s c o n t r e s v a r i a n t e s Z m u t a d a s y s u s v a r i a n t e s Z o r i g i n a l e s r e s p e c t i v a s ; Z 18632 / Z 13578 ( S E Q ID N O : 365 / 20 ) , Z 18633 / Z 13616 ( S E Q ID N O : 366 / 41 ) y Z 18634 / Z 13621 ( S E Q ID N O : 367 / 44 ) . L a s s u p e r p o s i c i o n e s d e s e n s o g r a m a s a p a r t i r d e l a s i n y e c c i o n e s d e 90 n M d e l a s v a r i a n t e s Z c o n r e s p e c t o a l a s s u p e r f i c i e s c o n h F c R n y c F c R n d e m o s t r a r o n q u e l a s v a r i a n t e s Z m u t a d a s c o n s e r v a r o n s u c a p a c i d a d p a r a u n i r s e a F c R n h u m a n a y d e c y n o m o l g u s ( f i g u r a 18 A - C ) .
L o s n i v e l e s d e i n m o v i l i z a c i ó n d e F c R n d e l a s s u p e r f i c i e s d e c h i p f u e r o n 1577 R U p a r a l a F c R n h u m a n a y 1098 R U p a r a l a F c R n d e c y n o m o l g u s .
T a b l a 21 : T e m p e r a t u r a s d e f u s i ó n p a r a l a s v a r i a n t e s Z m u t a d a s e n e l a r m a z ó n y o r i g i n a l e s
Figure imgf000061_0001
L i s t a d o d e t a l l a d o d e l a d e s c r i p c i ó n
1. U n d í m e r o d e u n i ó n a F c R n , q u e c o m p r e n d e u n a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a , u n a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a y u n e n l a z a d o r d e a m i n o á c i d o s , e n d o n d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e c a d a u n a u n m o t i v o d e u n i ó n ( B M ) a F c R n , m o t i v o q u e c o n s i s t e e n l a s e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s
E X 2 X 3 X 4 A X 6 X 7 E I R W L P N L X 16X 17 X 18 Q R X 21 A F I X 25 X 26 L X 28 X 29
Figure imgf000062_0001
X 7 s e s e le c c io n a d e A , F, H, K, N, Q , R, S y V;
X 16 s e s e le c c io n a d e N y T;
X 17 s e s e le c c io n a d e F, W e Y;
X 18 s e s e le c c io n a d e A , D , E y N;
X 21 s e s e le c c io n a d e A , S, V y W ;
X 25 se s e le c c io n a d e D, E, G , H, I, K, L, N, Q , R, S , T , V , W e Y;
X 26 s e s e le c c io n a d e K y S;
X 28 s e s e le c c io n a d e A , D, E, F, H, I, K, L, N, Q , R, S, T , V , W e Y ; y
X 29 s e s e le c c io n a d e D y R,
y en d o n d e d ic h o d ím e ro d e u n ió n a F c R n se u n e a F c R n co n u n a m a y o r c a p a c id a d d e u n ió n en c o m p a ra c ió n co n d ic h a p r im e ra u n id a d m o n o m é r ic a o d ic h a s e g u n d a u n id a d m o n o m é r ic a so la s .
2. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 1, e n d o n d e , in d e p e n d ie n te m e n te e n tre sí,
Figure imgf000062_0002
X 7 s e s e le c c io n a d e A , F, H, K, N, Q , R, S y V;
X 16 s e s e le c c io n a d e N y T;
X 17 se s e le c c io n a d e F e Y;
X 18 e s D;
X 21 e s V;
X 25 s e s e le c c io n a d e D, E, H, I, K, L, N, Q , R, S , T , V , W e Y;
X 26 s e s e le c c io n a d e K y S;
X 28 s e s e le c c io n a d e A , D, E, F, H, I, K, L, N , Q , R , S, T , V y W ; y
X 29 s e s e le c c io n a d e D y R.
3. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 1, en d o n d e e l B M d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o n s is te e n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a de:
i) E X 2 X 3 X 4 A X a H E IR W L P N L T X 17 X 18 Q R X 21 A F IX 25 K L X 28 D
e n d o n d e , in d e p e n d ie n te m e n te e n tre sí,
Figure imgf000062_0003
X 6 s e s e le c c io n a d e A , G , K, R, S y V;
X 17 s e s e le c c io n a d e F, W e Y;
X 18 s e s e le c c io n a d e A , D , E y N;
X 21 s e s e le c c io n a d e A , S, V y W ;
X 25 s e s e le c c io n a d e D, G , H, K, L, N, R, V y W ;
X 28 s e s e le c c io n a d e A , D , E, H, K, L, N , Q , R, S, T , W e Y;
y
ii) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 96 % d e id e n tid a d c o n u n a s e c u e n c ia d e f in id a p o r i).
4. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -3 , e n d o n d e X 6X 7 se s e le c c io n a d e A H y G H e n a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é ric a s .
5. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 4 , e n d o n d e X 6X 7 e s A H e n a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é ric a s .
6. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 4, e n d o n d e X 6X 7 e s G H e n a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é ric a s .
7. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e X 17X 18 se s e le c c io n a d e F D e Y D en a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é ric a s .
8. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 7, e n d o n d e X 17X 18 e s F D en a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é ric a s .
9. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , e n d o n d e la s e c u e n c ia d e l B M d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c u m p le co n a l m e n o s t re s d e la s s e is c o n d ic io n e s I-V I:
I. X6 s e s e le c c io n a d e A , G , K y S, ta l c o m o e n p a r t ic u la r A ;
II. X 7 e s H;
III. X 17 s e s e le c c io n a d e F e Y, ta l c o m o e n p a r t ic u la r F;
IV . X 18 e s D;
V . X 21 s e s e le c c io n a d e V y W , ta l c o m o e n p a r t ic u la r V;
V I. X 25 s e s e le c c io n a d e H y R, ta l c o m o e n p a r t ic u la r H.
10. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 9, en d o n d e la s e c u e n c ia c u m p le c o n a l m e n o s c u a tro d e las s e is c o n d ic io n e s I-V I.
11. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 10, e n d o n d e la s e c u e n c ia c u m p le co n a l m e n o s c in c o d e las s e is c o n d ic io n e s I-V I.
12. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 11, e n d o n d e la s e c u e n c ia c u m p le co n to d a s la s s e is c o n d ic io n e s I-V I.
13. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , e n d o n d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n s e c u e n c ia s co n B M id é n tic a s .
14. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -12 , en d o n d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n s e c u e n c ia s c o n B M d ife re n te s .
15. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e al m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e un m o tiv o d e u n ió n B M a F c R n c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -353 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -352.
16. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 15, e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -15 , S e Q ID N O : 17 -140 y S E Q ID N O : 353.
17. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 16, e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -2 y S E Q ID N O : 17 -140 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -140.
18. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 17, e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e un B M c o rre s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1 -2 , S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 ­ 103 , S E Q ID N O : 105 -125 y S E Q ID N O : 127 -140 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 y S E Q ID N O : 127 -140.
19. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 16, e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -8 , S E Q Id N O : 13, S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 y S E Q ID N O : 353 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77.
20. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 18 o 19, e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77.
21. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 20 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n las S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77.
22. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 21 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75.
23. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 22 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 75.
24. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 22 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n la S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 41 ; e l g ru p o q u e c o n s is te e n la S E Q ID N O : 20 y S E Q ID N O : 44 ; o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44.
25. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 22 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q i D N O : 23 y S E Q ID N O : 44 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 44.
26. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 24 o 25 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n la s e c u e n c ia S E Q ID N O : 44.
27. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n in d e p e n d ie n te m e n te un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a c o m o s e d e fin e en u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 15 ­ 26.
28. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 27 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n in d e p e n d ie n te m e n te un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44.
29. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 28 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n la S E Q ID N O : 44.
30. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e d ic h o m o t iv o d e u n ió n B M a F c R n e s a l m e n o s u n o d e d ic h o s p r im e ro y s e g u n d o m o n ó m e ro s q u e fo rm a p a rte d e un d o m in io p ro te ín ic o co n p a q u e te tr ih e lic o id a l.
31. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 30 , e n d o n d e d ic h o B M fo rm a e s e n c ia lm e n te p a rte d e d o s h é lic e s c o n un b u c le d e in te rc o n e x ió n , d e n tro d e l d o m in io p ro te ín ic o c o n p a q u e te tr i-h e lic o id a l.
32. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 31 , e n d o n d e d ic h o d o m in io p ro te ín ic o co n p a q u e te tr ih e lic o id a l se s e le c c io n a d e d o m in io s c o n re c e p to re s b a c te r ia n o s .
33. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 32 , e n d o n d e d ic h o d o m in io p ro te ín ic o co n p a q u e te t r ih e lic o id a l se s e le c c io n a d e lo s d o m in io s d e la p ro te ín a A p ro c e d e n te d e S ta p h y lo c o c c u s a u re u s o d e r iv a d o s d e la m is m a .
34. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e al m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un m ó d u lo d e u n ió n (B M o d ) , m ó d u lo q u e c o n s is te e n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a de :
iii) K -[B M ]-D P S Q S X aX bL L X c E A K K L X dX eX fQ ;
e n d o n d e
[B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n s e g ú n se d e fin e en c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 , co n la c o n d ic ió n d e q u e X 29 s e a D;
X a s e s e le c c io n a d e A y S;
X b s e s e le c c io n a d e N y E;
X c s e s e le c c io n a d e A , S y C;
X d s e s e le c c io n a d e E, N y S;
X e s e s e le c c io n a d e D, E y S;
X f s e s e le c c io n a d e A y S;
y
iv ) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 93 % d e id e n tid a d co n u n a s e c u e n c ia d e f in id a p o r iii).
35. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -33 , e n d o n d e a l m e n o s u n a de d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un m ó d u lo d e u n ió n (B M o d ) , m ó d u lo q u e c o n s is te en u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a de :
v ) K -[B M ]-Q P E Q S X aX bL L X c E A K K L X dX eX fQ ;
e n d o n d e
[B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n s e g ú n se d e fin e e n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 , co n la c o n d ic ió n d e q u e X 29 s e a R;
X a s e s e le c c io n a d e A y S;
X b s e s e le c c io n a d e N y E;
X c s e s e le c c io n a d e A , S y C;
X d s e s e le c c io n a d e E, N y S;
X e s e s e le c c io n a d e D, E y S;
X f s e s e le c c io n a d e A y S;
y
v i) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 93 % d e id e n tid a d co n u n a s e c u e n c ia d e f in id a p o r v ).
36. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 34 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -353 , S e Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -352 y S E Q ID N O : 360 -364.
37. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 36 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -15 , s E q ID N O : 17 -140 , S E Q ID N O : 353 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364.
38. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 37 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1 -2 , S E Q ID N O : 17 -140 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 17 -140 y S E Q ID N O : 360 -364.
39. D ím e ro d e u n ió n a l F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 38 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1 -2 , S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 , S E Q ID N O : 127 -140 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te d e la s S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 , S E Q ID N O : 127 -140 y S E Q ID N O : 360 -364.
40. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 36 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1 -8 , S E Q ID N O : 13, S E Q ID N O : 19 ­ 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 , S E Q ID N O : 353 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 y S E Q ID N O : 360 -364.
41. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 39 o 40 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 y S E Q ID N O : 360 -364.
42. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 41 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 ,S E Q ID N O : 77 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 , S E Q ID N O : 77 y S E Q ID N O : 360 -364.
43. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 42 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 , S E Q ID N O : 358 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 360 -364.
44. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 43 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 75, S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 361 y S E Q ID n O : 364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 75 , S E Q ID N O : 361 y S E Q ID N O : 364.
45. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 43 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 360 , S E Q ID N O : 362 y S E Q ID N O : 363 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 360 y S E Q ID N O : 362 ; e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 360 y S E Q ID N O : 363 ; o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 362 y S E Q ID N O : 363.
46. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 43 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 358 , S E Q ID N O : 361 y S E Q ID N O : 363 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 361 y S E Q ID N O : 363.
47. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 46 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e un B M o d c o rre s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 e n la S E Q ID N O : 44.
48. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -13 y 15 -47 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o s e g ú n s e d e f in e e n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 36 -47.
49. D íím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 48 , en d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 360 -364 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 360 , S E Q ID N O : 362 y S E Q ID N O : 363.
50. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 49 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un B M o d c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 7 h a s ta la p o s ic ió n 55 e n la S E Q ID N O : 44.
51. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e al m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en:
v ii) Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L X c E A K K L N D S Q A P;
e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n s e g ú n s e d e fin e e n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 y X c se s e le c c io n a d e A , S y C ; y v ii i) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e n a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d c o n u n a s e c u e n c ia d e f in id a p o r v ii) .
52. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -50 , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en :
ix ) F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L X c E A K K L S E S Q A P ;e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n s e g ú n se d e fin e en c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 y X c se s e le c c io n a d e A , S y C ; y x ) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d c o n u n a s e c u e n c ia d e fin id a p o r ix).
53. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -50 , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en :
x i) F N K -[B M ]-D P S Q S A N L L X c E A K K L N D A Q A P;
e n d o n d e [B M ] e s un m o tiv o d e u n ió n a l F c R n s e g ú n se d e f in e en u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 y X c se s e le c c io n a d e A y C ; y
x ii) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d c o n u n a s e c u e n c ia d e fin id a p o r x i). 54. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 33 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a de :
A D N N F N K -[B M ]-D P S Q S A N L L S E A K K L N E S Q A P K ;
A D N K F N K -[B M ]-D P S Q S A N L L A E A K K L N D A Q A P K ;
A D N K F N K -[B M ]-D P S V S K E IL A E A K K L N D A Q A P K ;
A D A Q Q N N F N K -[B M ]-D P S Q S T N V L G E A K K L N E S Q A P K ;
A Q H D E -[B M ]-D P S Q S A N V L G E A Q K L N D S Q A P K ;
V D N K F N K -[B M ]-D P S Q S A N L L A E A K K L N D A Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S E S S E L L S E A K K L N K S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L N D A Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L N D S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P ;
A E A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
A E A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L N D A Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P ;
A E A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
A E A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L S E A Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-Q P E Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L E S A Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-Q P E Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L S D A Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-Q P E Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
V D A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L N D A Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
V D A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L S E A Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-Q P E Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L E S A Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-Q P E Q S S E L L S E A K K L E S S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L S D A Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-Q P E Q S S E L L S E A K K L S D S Q A P K ;
V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L N K A Q A P K ;
A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L A E A K K L N K A Q A P K ; a n d
A D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;
e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n c o m o s e d e f in e e n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29.
55. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e al m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en: x ii i) A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o tiv o d e u n ió n a F c R n c o m o se d e fin e e n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 ; y
x iv ) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d c o n la s e c u e n c ia d e f in id a e n x iii) .
56. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 55 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x i i i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 354 ­ 357 , ta l c o m o s e le c c io n a d a d e la s S E Q ID N O : 354 y 357.
57. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 56 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x i i i) q u e e s la S E Q ID N O : 357.
58. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -54 , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en :
x v ) A E A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o tiv o d e u n ió n a F c R n c o m o se d e fin e e n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 ; y
x v i) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d c o n la s e c u e n c ia d e f in id a e n xv ).
59. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 58 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d o ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x v ) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 365 ­ 367.
60. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -54 , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en:
x v ii) V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n c o m o s e d e f in e e n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 ; y
x v ii i) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d d e la s e c u e n c ia d e fin id a e n x v ii) .
61. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 60 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x v ii) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 360 ­ 364.
62. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en:
x ix ) A E A K Y A K -[B M ]-R Q P E S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n c o m o se d e fin e e n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 ; y
x x ) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d d e la s e c u e n c ia d e fin id a e n x ix ) .
63. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 62 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x ix ) q u e e s la S E Q ID N O : 359.
64. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -54 , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en:
x x i) V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a l F c R n c o m o s e d e f in e e n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -29 ; y
x x ii) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n t id a d d e la s e c u e n c ia d e f in id a e n xx i) .
65. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 64 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1­ 353 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -352.
66. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 65 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1 -15 , S E Q ID N O : 17 -140 y S E Q ID N O : 353 , o c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en las S E Q ID N O : 1 -2 y s E q ID N O : 17 -140 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -140.
67. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 66 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1-2, S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 y S E Q ID N O : 127 -140 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 y S E Q ID N O : 127 -140.
68. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 67 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1-8, S E Q ID N O : 13, S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 y S E Q ID N O : 353 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n las S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77.
69. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 66 o 68 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77.
70. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 69 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77.
71. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 70 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 75.
72. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 71 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 23 y S E Q ID N O : 75.
73. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 71 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44.
74. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 71 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 23 y S E Q ID n O : 44 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la S E Q iD n O : 23 y S E Q ID N O : 44.
75. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 73 o 74 , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) q u e e s la S E Q ID N O : 44.
76. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 1 -13 y 15 -75 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o r re s p o n d e n a u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o s e g ú n s e d e f in e e n c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 55 , 56 y 62 -75.
77. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 76 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o r re s p o n d e n a u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 , S E Q ID N O : 354 , S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 360 -367 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 360 , S E Q ID N O : 362 , S E Q ID N O : 363 , S E Q ID N O : 365 , S E Q ID N O : 366 y S E Q ID N O : 367.
78. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 77 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o r re s p o n d e n a la S E Q ID N O : 1 o a la S E Q ID N O : 357.
79. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 77 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o r re s p o n d e n a las S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 360 ó la S E Q ID N O : 365.
80. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 77 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o r re s p o n d e n a las S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 362 ó la S E Q ID N O : 366.
81. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n e l p u n to 77 , e n d o n d e ta n to d ic h a p r im e ra c o m o d ic h a s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o r re s p o n d e n a la s S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 363 o la S E Q ID N O : 367.
82. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n c u a lq u ie r p u n to a n te r io r , e n d o n d e e l e n la z a d o r s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s i s t e e n e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s f l e x i b l e s , e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s r í g i d o s y e n l a z a d o r e s d e a m i n o á c i d o s e s c i n d i b l e s .
83. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 82 , e n d o n d e e l e n l a z a d o r e s t á d i s p u e s t o e n t r e d i c h a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a y d i c h a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a .
84. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 82 u 83 , e n d o n d e e l e n l a z a d o r e s u n e n l a z a d o r f l e x i b l e q u e c o m p r e n d e l o s r e s i d u o s d e a m i n o á c i d o s s e l e c c i o n a d o s d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n g l i c i n a , s e r i n a y t r e o n i n a .
85. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n l a r e i v i n d i c a c i ó n 84 , e n d o n d e e l e n l a z a d o r t i e n e u n a f ó r m u l a g e n e r a l s e l e c c i o n a d a d e :
( G n S m ) p y ( S n G m ) p ,
e n d o n d e , i n d e p e n d i e n t e m e n t e ,
n = 1 - 7 ,
m = 0 - 7 ,
n m < 8 y
p = 1 - 7.
8 6 . D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n l a r e i v i n d i c a c i ó n 85 , e n d o n d e n = 1 - 5.
87. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 85 - 86 , e n d o n d e m = 0 - 5.
8 8 . D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 85 - 87 , e n d o n d e p = 1 - 5.
89. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n u n a c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 8 6 - 8 8 , e n d o n d e n = 4 , m = 1 y p
= 1 - 4.
90. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n l a r e i v i n d i c a c i ó n 89 , e n d o n d e d i c h o e n l a z a d o r e s ( G 4 S ) 3.
91. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 89 , e n d o n d e d i c h o e n l a z a d o r e s G 4 S .
92. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , q u e e s c a p a z d e u n i r s e a F c R n c o n a l m e n o s
2 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 3 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 4 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 6 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 7 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 8 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 9 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 25 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 50 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 100 v e c e s m a y o r c a p a c i d a d q u e l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a o l a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a c o r r e s p o n d i e n t e s s o l a s .
93. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 92 , q u e e s c a p a z d e u n i r s e a F c R n a p H 6 , 0 c o n a l m e n o s 2 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 3 v e c e s m a y o r c a p a c i d a d q u e l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a o l a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a c o r r e s p o n d i e n t e s s o l a s .
94. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 92 , q u e e s c a p a z d e u n i r s e a F c R n a p H 7 , 4 c o n a l m e n o s 2 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 3 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 4 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 6 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 7 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 8 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 9 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s m a y o r c a p a c i d a d q u e l a p r i m e r a u n i d a d m o n o m é r i c a o l a s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a c o r r e s p o n d i e n t e s s o l a s .
95. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , q u e e s c a p a z d e u n i r s e a F c R n a p H 6 , 0 d e t a l f o r m a q u e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n s e a a lo s u m o d e 1 x 10 ' 7 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 ' 8 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 ' 9 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 ' 1° M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x 10 ' 11 M , t a l c o m o a lo s u m o d e 1 x
1 0 -12 M .
96. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , e n d o n d e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l p o l i p e p t i d o d e u n i ó n a F c R n y l a F c R n a p H 7 , 4 e s m a y o r q u e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n a p H 6 , 0 , t a l c o m o a l m e n o s 2 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 50 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 100 v e c e s m a y o r q u e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n a p H 6 , 0.
97. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , e n d o n d e e l v a l o r K d d e l a i n t e r a c c i ó n e n t r e e l p o l i p é p t i d o d e u n i ó n a F c R n y F c R n a p H 7 , 4 e s a l m e n o s 1 x 10 ' 10 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 ' 9 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 ' 8 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 ' 7 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 ' 6 M , t a l c o m o a l m e n o s 1 x 10 ' 5 M .
98. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 1 - 94 a n t e r i o r e s , e n d o n d e e l v a l o r K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 7 , 4 e s i g u a l o m e n o r q u e e l v a l o r K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 6 , 0.
99. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 1 - 94 a n t e r i o r e s , e n d o n d e e l v a l o r K d d e d i c h a i n t e r a c c i ó n a p H 7 , 4 e s a lo s u m o 1 x 10 -7 M , t a l c o m o a lo s u m o 1 x 10 -8 M , t a l c o m o a lo s u m o 1 x 10 -9 M , t a l c o m o a lo s u m o 1 x 10 ' 1° M , t a l c o m o a lo s u m o 1 x 10 -11 M , t a l c o m o a l o s u m o 1 x 10 -12 M .
100. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d i c h a s p r i m e r a y s e g u n d a u n i d a d e s m o n o m é r i c a s c o m p r e n d e a l m e n o s u n a m i n o á c i d o a d i c i o n a l e n e l e x t r e m o C - t e r m i n a l y / o N -t e r m i n a l .
101. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 100 , e n d o n d e a l m e n o s u n a e x t e n s i ó n a d i c i o n a l d e a m i n o á c i d o s m e j o r a o s i m p l i f i c a l a p r o d u c c i ó n , p u r i f i c a c i ó n , e s t a b i l i z a c i ó n in v i v o o in v i t r o , a c o p l a m i e n t o o d e t e c c i ó n d e l p o l i p é p t i d o .
102. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o , q u e c o m p r e n d e :
- u n p r i m e r r e s t o q u e c o n s i s t e e n u n d í m e r o d e u n i ó n a F c R n d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r ; y
- u n s e g u n d o r e s t o q u e c o n s i s t e e n u n p o l i p é p t i d o q u e t i e n e u n a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a .
103. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 102 , e n d o n d e l a s e m i v i d a in v i v o d e d i c h a p r o t e í n a d e f u s i ó n o d i c h o c o n j u g a d o e s m a y o r q u e l a s e m i v i d a in v i v o d e l p o l i p é p t i d o q u e t i e n e u n a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a p e r s e .
104. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 102 - 103 , e n d o n d e d i c h a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a e s u n a a c t i v i d a d t e r a p é u t i c a .
105. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 100 - 102 , e n d o n d e d i c h a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a e s u n a a c t i v i d a d d e u n i ó n a u n a d i a n s e l e c c i o n a d a .
106. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 105 , e n d o n d e d i c h a d i a n a s e l e c c i o n a d a e s a l b ú m i n a .
107. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 106 , e n d o n d e d i c h a a c t i v i d a d d e u n i ó n a a l b ú m i n a s e p r o p o r c i o n a p o r e l d o m i n i o d e u n i ó n a a l b ú m i n a d e l a p r o t e í n a G e s t r e p t o c ó c i c a , o u n d e r i v a d o d e l a m i s m a .
108. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 106 - 107 , e n d o n d e d i c h a a c t i v i d a d d e u n i ó n a a l b ú m i n a a u m e n t a l a s e m i v i d a in v i v o d e l a p r o t e í n a d e f u s i ó n o d e l c o n j u g a d o .
109. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 103 - 104 , e n d o n d e d i c h a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a e s u n a a c t i v i d a d e n z i m á t i c a .
110. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 103 - 105 , e n d o n d e d i c h o s e g u n d o r e s t o q u e t i e n e u n a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a e s u n p o l i p é p t i d o t e r a p é u t i c a m e n t e a c t i v o .
111. P r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n u n o c u a l q u i e r a d e l o s p u n t o s 103 - 105 y 109 - 110 , e n d o n d e e l s e g u n d o r e s t o q u e t i e n e u n a a c t i v i d a d b i o l ó g i c a d e s e a d a s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n e n z i m a s , h o r m o n a s , f a c t o r e s d e c r e c i m i e n t o , q u i m i o c i n a s y c i t o c i n a s .
Figure imgf000072_0001
113. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n , p r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 112 , q u e s e u n e a F c R n d e t a l f o r m a q u e l a c a p a c i d a d d e l d í m e r o d e u n i ó n a F c R n p a r a b l o q u e a r l a u n i ó n d e I g G a F c R n e s a l m e n o s 2 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 3 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 4 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 5 v e c e s m a y o r , t a l c o m o a l m e n o s 10 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 15 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 20 v e c e s , t a l c o m o a l m e n o s 25 v e c e s m a y o r e n c o m p a r a c i ó n c o n l a c a p a c i d a d d e b l o q u e o d e l a p r i m e r a o s e g u n d a u n i d a d m o n o m é r i c a c o r r e s p o n d i e n t e s o l a .
Figure imgf000072_0002
115. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n , p r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , q u e c o m p r e n d e a d e m á s u n a m a r c a .
116. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n , p r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n e l p u n t o 115 , e n d o n d e d i c h a m a r c a s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e e n c o l o r a n t e s f l u o r e s c e n t e s y m e t a l e s , c o l o r a n t e s c r o m o f ó b i c o s , c o m p u e s t o s q u i m i o l u m i n i s c e n t e s y p r o t e í n a s b i o l u m i n i s c e n t e s , e n z i m a s , r a d i o n u c l e i d o s y p a r t í c u l a s r a d i a c t i v a s .
117. D í m e r o d e u n i ó n a F c R n , p r o t e í n a d e f u s i ó n o c o n j u g a d o d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r p u n t o a n t e r i o r , q u e c o m p r e n d e u n e n t o r n o q u e l a n t e p r o p o r c i o n a d o p o r u n q u e l a n t e d e p o l i a m i n o p o l i c a r b o x i l a t o c o n j u g a d o c o n e l p o l i p é p t i d o d e u n i ó n a F c R n a t r a v é s d e u n g r u p o t i o l d e u n r e s i d u o d e c i s t e í n a o u n g r u p o a m i n a d e u n r e s i d u o d e lis in a .
118. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o co n e l p u n to 117 , en d o n d e e l q u e la n te de p o lia m in o p o lic a rb o x ila to e s á c id o 1 ,4 ,7 ,10 - te t ra a z a c ic lo d o d e c a n o -1 ,4 ,7 ,10 - te tra a c é t ic o o un d e r iv a d o d e l m is m o . 119. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o c o n e l p u n to 118 , en d o n d e e l d e r iv a d o d e á c id o 1 ,4 ,7 ,10 - te t ra a z a c ic lo d o d e c a n o -1 ,4 ,7 ,10 - te tra a c é t ic o e s á c id o 1 ,4 ,7 ,10 - te t ra a z a c ic lo d o d e c a n o -1 ,4 ,7 - t r is -a c é t ic o -10 -m a le im id o e t ila c e ta m id a .
120. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o co n e l p u n to 117 , en d o n d e e l q u e la n te p o lia m in o p o lic a rb o x ila to e s á c id o 1 ,4 ,7 - t r ia z a c ic lo n o n a n o -1 ,4 ,7 - t r ia c é tic o o un d e r iv a d o d e l m is m o .
121. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o c o n e l p u n to 117 , en d o n d e e l q u e la n te de p o lia m in o p o lic a rb o x ila to e s á c id o d ie t i le n t r ia m in p e n ta c é t ic o o d e r iv a d o s d e l m is m o .
122. C o m p o s ic ió n q u e c o m p re n d e un d ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -121 y a l m e n o s un e x c ip ie n te o p o r ta d o r fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le .
123. C o m p o s ic ió n d e a c u e rd o c o n e l p u n to 122 , q u e c o m p re n d e , a d e m á s , a l m e n o s un a g e n te a c t iv o a d ic io n a l. 124. C o m p o s ic ió n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s a n te r io re s 122 -123 , q u e e s tá a d a p ta d a p a ra a d m in is tra c ió n a t ra v é s d e u n a ru ta s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en a d m in is tra c ió n o ra l, a d m in is tra c ió n in tra n a s a l, a d m in is tra c ió n p u lm o n a r , a d m in is tra c ió n v a g in a l, a d m in is tra c ió n re c ta l, in y e c c ió n in tra v e n o s a , in y e c c ió n in t ra p e r ito n e a l, in y e c c ió n in tra m u s c u la r , in y e c c ió n s u b c u tá n e a e in y e c c ió n in tra d é rm ic a .
125. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 1 -121 o c o m p o s ic ió n d e a c u e rd o co n u n o c u a lq u ie ra d e lo s p u n to s 122 -124 p a ra u so c o m o un m e d ic a m e n to .
126. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n , c o n ju g a d o o c o m p o s ic ió n p a ra u s o d e a c u e rd o co n e l p u n to 125, e n d o n d e d ic h o m e d ic a m e n to e s tá d e s t in a d o p a ra e l t ra ta m ie n to o la p ro f ila x is d e u n a a fe c c ió n a u to in m u n e .
127. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n , c o n ju g a d o o c o m p o s ic ió n p a ra u s o d e a c u e rd o co n e l p u n to 125, e n d o n d e d ic h o m e d ic a m e n to e s tá d e s t in a d o p a ra e l t ra ta m ie n to o la p ro f ila x is d e u n a a fe c c ió n a lo - in m u n e .
132. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n , c o n ju g a d o o c o m p o s ic ió n p a ra u s o d e a c u e rd o co n e l p u n to 125, e n d o n d e d ic h o m e d ic a m e n to e s tá d e s t in a d o p a ra e l t ra ta m ie n to o la p ro f ila x is d e u n a a fe c c ió n s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n e p ile p s ia y c o n v u ls io n e s .
Listado de secuencias
< 110 > A F F IB O D Y A B
< 120 > N U E V O S P O L IP É P T ID O S
< 130 > 21078161
< 150 > E P 14185140.2
< 151 > 2014 -09 -17
< 160 > 388
< 170 > P a te n tIn v e rs ió n 3.5
< 210 > 1
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a r t if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 1
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 43
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Ser Lys Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 44
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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< 400 > 52
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< 212 > P R T
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< 40 0 74
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Gln Ser Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
< 210 > 75
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 75
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu H e Glu Asp Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 76
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 76
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Gln Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 77
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Thr Ser Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Val 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 78
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 78
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asp Glu Gln Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 79
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< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 79
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asn Gln Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 80
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 80
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Thr Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 81
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Asp Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 82
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Met Gln Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 83
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 83
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ser Asp Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asn Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 84
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 84
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Asp Ala Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 85
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 86
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 86
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Asp Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 87
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Lys Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 88
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Asp Gln Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 89
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Lys Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 90
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< 210 > 91
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 92
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 92
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Lys Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe AspGln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000106_0001
< 210 > 94
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 95
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 95
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Asp Glu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 97
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< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000107_0002
< 210 > 98
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 99
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< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 99
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 100
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Ala Glu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 101
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000108_0001
< 210 > 102
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000109_0001
< 210 > 103
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 103
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Glu Glu Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 104
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 104
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gln Thr Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 105
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000110_0001
< 210 > 106
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000110_0002
< 210 > 107
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000110_0003
< 210 > 108
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000111_0001
< 210 > 109
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 109
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
< 210 > 110
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 110
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Glu Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 111
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 111
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Glu Glu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 112
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a r t if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 112
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 113
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 113
Figure imgf000113_0001
< 210 > 114
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000113_0002
< 210 > 115
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 115
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Ala Thr Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 116
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 116
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Met Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 117
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 117
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Arg Glu Gln Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 118
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000114_0001
< 210 > 119
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 119
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu His Asn Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 120
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000115_0001
< 210 > 121
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 121
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Arg Ala Glu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 122
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000116_0001
< 210 > 123
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 123
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Arg Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 124
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 124
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Asn Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 125
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000117_0001
< 210 > 126
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 126
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Gln Glu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Trp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 127
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 127
Figure imgf000118_0001
< 210 > 128
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 129
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 130
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 131
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Glu lie Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
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< 210 > 136
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50 55
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< 400 > 137
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu His Leu Asn Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 138
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50 55
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 139
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Ala Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 210 > 141
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< 210 > 142
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< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 142
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Ser Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 400 > 143
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Asn Leu Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 400 > 144
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Glu Val Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 145
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Ala Glu Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 146
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Asp 20 25 30
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< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 147
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Asn Asn Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie lie 20 25 30
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50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 148
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Glu Phe Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asn Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 149
< 211 > 58
< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 150
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Leu Lys Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Thr 20 25 30
Lys Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
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< 40 0 151
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Ala Asn Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
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< 400 > 152
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Met Lys Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Val 20 25 30
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50 55
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< 210 > 155
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< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 157
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< 40 0 159
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Asp Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Gln 20 25 30
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50 55
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Arg His Glu Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 40 0 161
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Ser Asp Ala lie His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Glu Thr Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Arg Tyr Trp Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Asp Trp Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 400 > 167
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Glu Gln Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Asn 20 25 30
Lys Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 169
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Asp Tyr Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 171
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Ala Thr Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 172
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 172
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Arg Val Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Gln 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 173
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 173
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Val Ser Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 174
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Ala Gln Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
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< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 178
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 179
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Val Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Trp 20 25 30
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 180
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 40 0 185
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50 55
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 400 > 187
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 188
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 189
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 190
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 191
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50 55
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000140_0001
< 210 > 193
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000141_0001
< 210 > 194
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000141_0002
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 196
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50 55
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< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 197
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 400 > 198
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50 55
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< 400 > 200
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000144_0001
< 210 > 203
< 211 > 58
< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 203
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 204
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 204
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Leu His Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 205
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
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< 40 0 205
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Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asn Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 206
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 206
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Ser Lys Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 207
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 207
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Met Thr Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 208
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000146_0001
< 210 > 209
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000146_0002
< 210 > 210
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 210 > 211
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 211
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Gln Ser Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 212
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 213
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 213
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Met Arg Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 214
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Lys Asn Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 215
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Glu Ser Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 400 > 216
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Val Gln Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Ala Ser Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 400 > 218
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Met Asp Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
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< 210 > 220
< 211 > 58
< 212 > P R T
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 221
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< 212 > P R T
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< 400 > 223
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Ala Ala Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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< 400 > 224
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Val Lys Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 40 0 225
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Glu Arg Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
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< 210 > 227
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< 212 > P R T
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< 400 > 227
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Arg Ala Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
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< 210 > 229
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< 212 > P R T
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< 400 > 229
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< 40 0 230
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Asn Arg Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 210 > 233
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< 212 > P R T
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Ala Gln Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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Figure imgf000158_0001
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Figure imgf000159_0001
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< 40 0 246
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
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< 212 > P R T
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< 400 > 247
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Met Glu Ala Ala Ala Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 248
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000160_0001
< 210 > 249
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a r t if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Phe Glu Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Gln 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
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< 400 > 250
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Lys Ser Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 251
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 251
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Lys Asn Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gln Glu Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 253
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 253
Figure imgf000162_0001
< 210 > 254
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000162_0002
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 256
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 256
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Ala Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 257
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 257
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asn Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
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< 210 > 259
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 259
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Ala Ser Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 260
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser lie Val Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
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< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 261
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Lys Gln Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 262
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Ala Thr Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 400 > 263
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Asn Ala Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 400 > 264
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Lys Arg Ala Gly His Glu lie A 1
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50 55
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< 210 > 267
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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50 55
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< 400 > 270
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50 55
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 272
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Leu Gln Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Ser Gln Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Arg Val Ala Ala Lys Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 210 > 276
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< 210 > 278
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50 55
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Figure imgf000174_0002
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< 400 > 290
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Lys Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
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Figure imgf000175_0001
< 210 > 292
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 292
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 293
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 293
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie lie Gln Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 294
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< 212 > P R T
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< 40 0 294
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Thr Asn Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 295
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 295
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Gln Leu Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
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< 212 > P R T
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< 400 > 296
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie His Asp Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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50 55
< 210 > 297
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 297
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Lys lie Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 298
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 298
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln His Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Arg 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 299
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 299
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Phe Ala Ala Ser Ala Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 300
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 301
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 302
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 302
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< 210 > 303
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 303
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Asn Leu Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 304
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Thr Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Tyr 20 25 30
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50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 305
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Phe Val Asp Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Gln 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 307
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 307
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Val Asp Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 309
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 309
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Ser Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 310
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Ala Val Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Tyr Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Val 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 311
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 311
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ser Ala Glu Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Glu 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 312
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 312
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Val Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 313
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 313
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Phe Gln lie Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Asn 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 314
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Met Val Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 315
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 315
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr Asp Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Tyr Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Leu 20 25 30
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50 55
< 210 > 316
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 316
Figure imgf000184_0001
< 210 > 317
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000184_0002
< 210 > 318
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000184_0003
< 210 > 319
< 211 > 58
< 212 > P R T
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Figure imgf000185_0001
< 210 > 320
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000185_0002
< 210 > 321
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000185_0003
< 210 > 322
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
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< 400 > 322
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 324
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000186_0001
< 210 > 325
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 325
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Glu Asn Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
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50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 326
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Asn Arg Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 327
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Arg Leu Leu Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
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< 40 0 328
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50 55
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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50 55
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< 210 > 331
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Figure imgf000189_0002
< 210 > 333
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000189_0003
< 210 > 334
< 211 > 58
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000190_0001
< 210 > 335
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000190_0002
< 210 > 336
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< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 210 > 337
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 337
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50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 338
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Leu Lys Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Asn 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 339
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 339
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Glu Arg Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Lys 20 25 30 Lys Leu Thr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 340
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Glu Trp Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 341
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 341
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Lys Ala Ser Ala Gln His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 342
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 342
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Thr Glu lie Ala Lys His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 343
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 343
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Asn Leu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Thr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 344
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 344
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Glu Glu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 345
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000194_0001
< 210 > 346
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
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< 210 > 347
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000194_0003
< 210 > 348
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 348
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Asn Ala Asp Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Gln 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 349
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000195_0001
< 210 > 350
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 350
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Ala Leu Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asn Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 351
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala His Ala Ala Ser His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Asp Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 352
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 352
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Val Asp Asn Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie Gln 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 353
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000196_0001
< 210 > 354
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 354
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 355
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 355
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Phe Glu Ser Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Tyr Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 356
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 356
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Met Arg Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
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50 55
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000198_0001
< 210 > 358
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000198_0002
< 210 > 359
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000198_0003
< 210 > 360
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 360
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Thr Asp Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 361
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Glu Lys Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 362
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Trp Gln Gln Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 363
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
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< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 364
Val Asp Ala Lys Tyr Ala Lys Glu lie Glu Asp Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 365
< 211 > 58
< 212 > P R T
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< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 365
Figure imgf000201_0001
< 210 > 366
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
Figure imgf000201_0002
< 210 > 367
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 367
Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 368
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< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > D ím e ro d e u n ió n d e F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 368
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Gly Thr Gly Gly Gly Gly 50 55 60
Ser Pro Arg Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala 65 70 75 80
His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 85 90 95
Phe lie His Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu 100 105 110
Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu His 115 120 125
His His His His His
130
< 210 > 369
< 211 > 141
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > D ím e ro d e u n ió n d e F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 369
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Gly Thr Gly Gly Gly Gly 50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Tyr 65 70 75 80
Ala Lys Glu Gln Asp Ala Ala Ala His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn 85 90 95
Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His Lys Leu Ala Asp Asp 100 105 110
Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 115 120 125
Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu His His His His His His
130 135 140
< 210 > 370
< 211 > 144
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > D ím e ro d e u n ió n d e F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 370
Gly Ser Ser His His His His His His Leu Gln Ala Glu Ala Lys Tyr 1 5 10 15
Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn 20 25 30
Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His Lys Leu Arg Asp Asp 35 40 45
Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 50 55 60
Ser Gln Ala Pro Lys Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp 85 90 95
Ala Ala Gly His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln 100 105 110
Arg Val Ala Phe lie His Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser 115 120 125
Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 130 135 140
< 210 > 371
< 211 > 201
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > D ím e ro d e u n ió n d e F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 371
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Gly Ala Pro Gly Gly Gly 50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Leu Ala 65 70 75 80
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 85 90 95
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 100 105 110
Glu Ala Leu Lys Asp Ala lie Leu Ala Ala Leu Pro Gly Thr Gly Gly 115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Ala 130 135 140
Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie Arg 145 150 155 160
Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His Lys 165 170 175
Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys 180 185 190
Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
195 200
< 210 > 372
< 211 > 201
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > D ím e ro d e u n ió n d e F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 372
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Gly Ala Pro Gly Gly Gly 50 55 60
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Ala Glu 65 70 75 80
Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie Arg Trp 85 90 95
Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His Lys Leu 100 105 110
Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys 115 120 125
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Arg Leu Ala Glu Ala Lys 145 150 155 160
Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser Asp Phe Tyr 165 170 175
Lys Arg Leu lie Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala Leu 180 185 190
Lys Asp Ala lie Leu Ala Ala Leu Pro
195 200
< 210 > 373
< 211 > 173
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 400 > 373
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gly Ser Leu Ala 50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95
Glu Ala Leu Lys Asp Ala lie Leu Ala Ala Leu Pro Gly Thr Gly Gly 100 105 110
Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly 115 120 125
His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 130 135 140
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165 170
< 210 > 374
< 211 > 173
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a r t if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 374
Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Trp Thr Asp Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30 Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gly Ser Leu Ala 50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95
Glu Ala Leu Lys Asp Ala lie Leu Ala Ala Leu Pro Gly Thr Gly Gly 100 105 110
Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Trp Thr Asp Ala Ala 115 120 125
His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 130 135 140
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Ser Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
165 170
< 210 > 375
< 211 > 173
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 375
Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Trp Gln Gln Ala Ala His Glu lie 1 5 10 15
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Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
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Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Trp Gln Gln Ala Ala 115 120 125
His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 130 135 140
Phe lie His Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu 145 150 155 160
Ser Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
165 170
< 210 > 376
< 211 > 173
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a F c R n d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 376
Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu lie 1 5 10 15
Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe lie His 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gly Ser Leu Ala 50 55 60
Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80
Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95
Glu Ala Leu Lys Asp Ala lie Leu Ala Ala Leu Pro Gly Thr Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly 115 120 125
His Glu lie Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 130 135 140
Phe lie His Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu 145 150 155 160
Ser Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys
165 170
< 210 > 377
< 211 > 46
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n a a lb ú m in a d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía
< 40 0 377
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu lie Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala lie Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
< 210 > 378
< 211 > 58
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P o lip é p t id o d e u n ió n d is e ñ a d o
< 400 > 378
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gly Trp Ala Thr Trp Glu lie 1 5 10 15
Phe Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Val Gln Val Lys Ala Phe lie Asp 20 25 30
Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
< 210 > 379
< 211 > 267
< 212 > P R T
< 213 > H O M O S A P IE N S
< 400 > 379
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 35 40 45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60
Thr Thr Asp Leu Arg lie Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 85 90 95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 115 120 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala lie Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 170 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 180 185 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 210 215 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys lie Val Gln His 245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu
260 265
< 210 > 380
< 211 > 99
< 212 > P R T
< 213 > H O M O S A P IE N S
Figure imgf000212_0001
< 210 > 382
< 211 > 365
< 212 > P R T
< 213 > S e c u e n c ia a rt if ic ia l
< 220 >
< 223 > P ro te ín a d e fu s ió n h F c R n -e G F P
< 400 > 382

Claims (20)

REIVINDICACIONES:
1. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , q u e c o m p re n d e u n a p r im e ra u n id a d m o n o m é ric a , u n a s e g u n d a u n id a d m o n o m é r ic a y un e n la z a d o r d e a m in o á c id o s , en d o n d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e c a d a u n a un m o t iv o d e u n ió n B M a F c R n , m o tiv o q u e c o n s is te e n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s
E X 2 X 3 X 4 A X a X 7 E IR W L P N L X 16X 17 X 18 Q R X 21 A F IX 25 X 26 L X 28 X 29
e n d o n d e , in d e p e n d ie n te m e n te e n tre sí,
X 2 s e s e le c c io n a d e A , D, E, F, H, I, K, L, N, Q , R, S, T , V , W e Y;
X 3 s e s e le c c io n a d e A , D, E, F, G , H, I, K, L, M , N, Q , R, S , T , V , W e Y;
X 4 s e s e le c c io n a d e A , D, E, F, G , H, I, K, L, N, Q , R, S, T , V , W e Y;
X 7 s e s e le c c io n a d e A , F, H, K, N, Q , R, S y V;
X 16 s e s e le c c io n a d e N y T;
X 17 s e s e le c c io n a d e F, W e Y;
X 18 s e s e le c c io n a d e A , D , E y N;
X 21 s e s e le c c io n a d e A , S, V y W ;
X 25 s e s e le c c io n a d e D, E, G , H, I, K, L, N , Q , R, S, T , V , W e Y;
X 26 s e s e le c c io n a d e K y S;
X 28 s e s e le c c io n a d e A , D , E, F, H , I, K, L, N, Q , R , S, T , V , W e Y ; y
X 29 s e s e le c c io n a d e D y R,
y en d o n d e d ic h o d ím e ro d e u n ió n a F c R n se u n e a F c R n co n u n a m a y o r c a p a c id a d d e u n ió n en c o m p a ra c ió n co n d ic h o p r im e r m o n ó m e ro o d ic h o s e g u n d o m o n ó m e ro s o lo s .
2. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 1, en d o n d e el B M d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o n s is te e n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s s e le c c io n a d a de:
i) E X 2 X 3 X 4 A X a H E IR W L P N L T X 17 X 18 Q R X 21 A F IX 25 K L X 28 D
e n d o n d e , in d e p e n d ie n te m e n te e n tre sí,
X 2 s e s e le c c io n a d e A , D, E, F, H, I, K, L, N, Q , R, S , T , V , W e Y;
X 3 s e s e le c c io n a d e A , D, E, G , H, K, L, M , N, Q , R, S , T , V e Y;
X 6 s e s e le c c io n a d e A , G , K, R , S y V;
X 17 s e s e le c c io n a d e F, W e Y;
X 18 s e s e le c c io n a d e A , D, E y N;
X 21 s e s e le c c io n a d e A , S, V y W ;
X 25 s e s e le c c io n a d e D, G , H, K, L, N, R, V y W ;
X 28 s e s e le c c io n a d e A , D, E, H, K, L, N, Q , R, S, T , W e Y;
y
ii) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 96 % d e id e n tid a d c o n u n a s e c u e n c ia d e f in id a p o r i).
3. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r re iv in d ic a c ió n a n te r io r , e n d o n d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n s e c u e n c ia s co n B M id é n tic o s .
4. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -2 , en d o n d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n s e c u e n c ia s c o n B M d ife re n te s .
5. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r re iv in d ic a c ió n a n te r io r , en d o n d e al m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e un m o tiv o d e u n ió n B M a F c R n c o r re s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 e n u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n las S E Q ID N O : 1 -353 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -352 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n las S E Q ID N O : 17 -140 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 y S E Q ID N O : 127 -140 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44.
6. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 5, en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n un m o t iv o d e u n ió n B M a F c R n c o rre s p o n d ie n te a la s e c u e n c ia d e s d e la p o s ic ió n 8 h a s ta la p o s ic ió n 36 en u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n las S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44 , ta l c o m o la S E Q ID N O : 44.
7. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r re iv in d ic a c ió n a n te r io r , en d o n d e al m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en :
x i) A E A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ; x v ) A E A K F A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;x v ii) V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L S E S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n s e g ú n se d e fin e en u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -2 ; y u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % d e id e n tid a d c o n la s e c u e n c ia d e fin id a e n x i) , x v ) o x v ii) .
8. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 7, en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 354 -357 y S E Q ID N O : 360 -367 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n S E Q ID N O : 357 y S E Q ID N O : 360 -367.
9. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -6 , en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en :
x x i) V D A K Y A K -[B M ]-D P S Q S S E L L S E A K K L N D S Q A P K ;e n d o n d e [B M ] e s un m o t iv o d e u n ió n a F c R n s e g ú n se d e fin e e n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -2 ; y x x ii) u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e a l m e n o s e l 94 % de id e n t id a d c o n la s e c u e n c ia d e fin id a e n xx i) .
10. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 9, e n d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n las S E Q ID N O : 1 -353 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -352 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -140 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 17 -92 , S E Q ID N O : 94 -103 , S E Q ID N O : 105 -125 y S E Q ID N O : 127 -140 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 19 -20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 70 , S E Q ID N O : 73 , S E Q ID N O : 75 -77 , ta l c o m o el g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 28 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 73 y S E Q ID N O : 75 -77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te en la s S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44.
11. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 10, en d o n d e a l m e n o s u n a d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia x x i) s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 , S E Q ID N O : 75 y S E Q ID N O : 77 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 23 , S E Q ID N O : 41 , S E Q ID N O : 44 , S E Q ID N O : 65 y S E Q ID N O : 75 , ta l c o m o e l g ru p o q u e c o n s is te e n la s S E Q ID N O : 1, S E Q ID N O : 20 , S E Q ID N O : 41 y S E Q ID N O : 44 , ta l c o m o la S E Q ID N O : 44.
12. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 8, en d o n d e d ic h a s p r im e ra y s e g u n d a u n id a d e s m o n o m é r ic a s c o m p re n d e n la S E Q ID N O : 365 y S E Q ID N O : 365 ; S E Q ID N O : 366 y S e Q ID N O : 366 ; o la S E Q ID N O : 367 y S E Q ID N O : 367 , re s p e c t iv a m e n te .
13. D ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s a n te r io re s , e n d o n d e d ic h o e n la z a d o r t ie n e u n a fo rm u la g e n e ra l s e le c c io n a d a de:
( G nS m)p y (S nG m)p ,
e n d o n d e , in d e p e n d ie n te m e n te ,
n = 1-7,
m = 0 -7 ,
n m < 8 y
p = 1-7.
Figure imgf000222_0001
15. P ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o , q u e c o m p re n d e :
- un p r im e r re s to q u e c o n s is te e n un d ím e ro d e u n ió n a F c R n d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r re iv in d ic a c ió n a n te r io r ; y
- un s e g u n d o re s to q u e c o n s is te e n un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a a c t iv id a d b io ló g ic a d e s e a d a .
16. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r re iv in d ic a c ió n a n te r io r , q u e in h ib e la u n ió n d e la Ig G a F cR n .
Figure imgf000222_0002
5
18. C o m p o s ic ió n , q u e c o m p re n d e un d ím e ro d e u n ió n a F c R n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n o un c o n ju g a d o d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie r re iv in d ic a c ió n a n te r io r y a l m e n o s un e x c ip ie n te o p o r ta d o r fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le .
19. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o d e a c u e rd o co n la re iv in d ic a c ió n 18, p a ra u s o c o m o un m e d ic a m e n to .
20. D ím e ro d e u n ió n a F c R n , p ro te ín a d e fu s ió n o c o n ju g a d o o c o m p o s ic ió n p a ra u so d e a c u e rd o c o n la re iv in d ic a c ió n 19, en d o n d e d ic h o m e d ic a m e n to s e d e s tin a p a ra e l t ra ta m ie n to o la p ro f ila x is d e u n a a fe c c ió n s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n a fe c c io n e s a u to in m u n e s , a fe c c io n e s a lo - in m u n e s , e p ile p s ia y c o n v u ls io n e s .
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