JP2017533885A - 新規ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、新生児のFc受容体(以下FcRnと称す)への結合親和性を有する操作されたポリペプチドの二量体に関する。本開示は、生体分子、例えば医薬品の薬物動態学的および薬力学的特性を改変するための薬剤として、および治療薬としてのかかる二量体の使用にも関する。
新生児のFc受容体(FcRn)は、膜貫通MHCクラスI様重鎖(FcRnα鎖)およびβ2−ミクログロブリン軽鎖からなるヘテロ二量体のタンパク質であり、β2−ミクログロブリン軽鎖は、MHCクラスI分子の一部も形成する(SimisterおよびMostov、(1989)、Nature、337:184−7;Burmeisterら、(1994)、Nature、372:379−83)。
本発明の開示は、二量体型のFcRn結合ポリペプチドは、対応する単量体型のFcRn結合ポリペプチドと比べ、有意に改善されたFcRn結合特性を示すという予想外の認識を基にしている。本発明者らは、前記二量体型のFcRn結合ポリペプチドの結合特性の改善は、2個のFcRn結合ポリペプチドの単なる融合により予想されるよりもより大きいことを認めた。
EX2X3X4AX6X7EIRWLPNLX16X17X18QRX21AFIX25X26LX28X29
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、D、E、F、G、H、I、K、L,N、Q、R、S、T、V,WおよびYから選択され;
X7は、A、F、H、I、K、L、N、Q、R、ST、V,WおよびYから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、A,D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;ならびに
X29は、DおよびRから選択される)
からなり、
且つここで前記FcRn結合二量体は、前記第一の単量体単位または前記第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能でFcRnへ結合する、新生児のFc受容体(FcRn)結合ポリペプチドが提供される。
EX2X3X4AX6X7EIRWLPNLTX17X18QRX21AFIX25KLX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X7は、A、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;ならびに
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択される)からなる。
EX2X3X4AX6X7EIRWLPNLX16X17X18QRX21AFIX25X26LX28X29
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、E、F、G、H、I、K、Q、R、SおよびVから選択され;
X7は、A、F、H、K、N、Q、R、SおよびVから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;ならびに
X29は、DおよびRから選択される)からなる。
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、E、F、G、H、I、K、Q、RおよびSから選択され;
X7は、A、F、H、K、N、Q、R、SおよびVから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、FおよびYから選択され;
X18は、Dであり;
X21は、Vであり;
X25は、D、E、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびWから選択され;ならびに
X29は、DおよびRから選択される。
i) EX2X3X4AX6HEIRWLPNLTX17X18QRX21AFIX25KLX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X6は、A、G、K、R、SおよびVから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、G、H、K、L、N、R、VおよびWから選択され;
X28は、A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、WおよびYから選択される);ならびに
ii) 前記配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる。
EX2X3X4AX6HEIRWLPNLTX17X18QRX21AFIX25KLX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、N、Q、R、SおよびWから選択され;
X3は、D、E、G、H、K、M、N、Q、SおよびTから選択され;
X4は、A、D、E、G、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X6は、A、G、SおよびVから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、G、H、K、L、N、RおよびVから選択され;ならびに
X28は、A、E、H、L、N、Q、R、S、T、WおよびYから選択される)
から選択されるアミノ酸配列からなる。
I. X6は、A、G、KおよびSから選択され、例えば特にAである;
II. X7は、Hである;
III. X17は、FおよびYから選択され、例えば特にFである;
IV. X18は、Dである;
V. X21は、VおよびWから選択され、例えば特にVである;
VI. X25は、HおよびRから選択され、例えば特にHである:
の少なくとも3つを満たしている。
iii) K−[BM]−DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ;
(配列中、
[BM]は、X29がDであるという条件で、本明細書に定義されたFcRn結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、E、NおよびSから選択され;
Xeは、D、EおよびSから選択され;
Xfは、AおよびSから選択される)、ならびに
iv) iii)により定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる。
v) K−[BM]−QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ:
(配列中、
[BM]は、X29がRであるという条件で、本明細書に定義されたFcRn結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、E、NおよびSから選択され;
Xeは、D、EおよびSから選択され;
Xfは、AおよびSから選択される)、ならびに
vi) v)により定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる。
vii) YAK−[BM]−DPSQSSELLXcEAKKLNDSQAP:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフであり、ならびにXcは、A、SおよびCから選択される);ならびに
viii) vii)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、先に定義したようなFcRn結合二量体が、提供される。
ix) FAK−[BM]−DPSQSSELLXcEAKKLSESQAP:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフであり、ならびにXcは、A、SおよびCから選択される);ならびに
x) ix)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、先に定義したようなFcRn結合二量体が提供される。
xi) FNK−[BM]−DPSQSANLLXcEAKKLNDAQAP:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフであり、ならびにXcは、AおよびCから選択される);ならびに
xii) xi)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、先に定義したようなFcRn結合二量体が提供される。
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLESSQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;および
ADAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(配列中、[BM]は、上記で定義されたFcRn結合モチーフである)から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
xiii) AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xiv) xiii)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
xv) AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xvi) xv)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
xvii) VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xviii) xvii)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
xix) AEAKYAK−[BM]−RQPESSELLSEAKKLSESQAPK:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xx) xix)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
xxi) VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK:
(配列中、[BM]は、先に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xxii) xxi)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
−保護された反応性側鎖を有するFcRn結合二量体または融合タンパク質を形成するためのアミノ酸および/またはアミノ酸誘導体の段階的なカップリング、
−FcRn結合二量体または融合タンパク質の反応性側鎖からの保護基の除去、および
−水溶液中でのFcRn結合二量体または融合タンパク質の折り畳み:を含む。
概要
以下の実施例は、新生児のFc受容体(FcRn)を標的とする新規なZ変異体分子の開発を開示する。Z変異体を、ファージディスプレイテクノロジーを使用して得た。本明細書に記載したFcRn結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、相当するアミノ酸配列を、図1において列挙し、識別名配列番号1〜353によって表示した。本明細書に開示されたFcRn結合ポリペプチドの推定されたFcRn結合モチーフ(BM)は、配列番号1−353の配列において、残基8から残基36まで伸びている。更に、FcRn結合特性および二量体型での前記ポリペプチドのFcRnへのIgG結合を遮断する能力を、調べた。
ヒトαFcRnおよびヒトβ2−ミクログロブリン(B2M)の作製
この実施例において、ヒトβ2−ミクログロブリン(配列番号380)との複合体であるヒトαFcRn(配列番号379)(FcRnと表示する複合体)および非複合型であるヒトβ2−ミクログロブリン(B2Mと表示する)の細胞外ドメイン(ECD)を、可溶性タンパク質として作製した。この実施例において作製されたヒトFcRnおよびB2Mを、実施例2および3において、ファージ選択、ELISAおよびBiacoreアッセイに使用した。
同時発現に使用されるヒトαFcRnおよびヒトβ2−ミクログロブリンに関する遺伝子を含有するプラスミドの構築:ヒトαFcRn(Genbank BC008734.2)およびヒトβ2−ミクログロブリン(B2M)(Genbank BC032589.1)をコードする遺伝子を、OpenBiosystemsから得た。PCR重複伸長を使用し、ヒトαFcRn(αFcRnECD)(配列番号379)のアミノ酸24〜290をコードする遺伝子断片を、attB1−部位/コザック配列、それに続くIgカッパ鎖リーダー配列、hFcRnECD、GSリンカーおよびflagタグをコードする遺伝子、それに続くattB2部位からなる構築物に増幅した。ヒトB2M(配列番号380)のアミノ酸21〜119をコードする遺伝子断片を含有する、His6タグがflagタグに置き換わっていること以外は同様の構築物を作製した。構築物を、製造業者の推奨に従って、Gatewayシステム(Invitrogen、カタログ番号11789020、Gateway(登録商標)BP Clonase(登録商標)II酵素ミックス)を使用した組換えによって、プラスミドpDONOR221(Invitrogen、カタログ番号12536−017)中に挿入した。正確な配列の検証後、ヒトαFcRnECD構築物を、プロモーター含有プラスミドpENTR−CMV(Taiら(2012)PLoS One 7(9):e46269)とともに、マルチサイトGatewayクローニングを使用して、2K7bsd(Suterら(2006)Stem Cells 24:615〜623)中に挿入し、ベクター2K7bsd−CMV−hFcRnECDを生じた。ヒトB2M遺伝子構築物を、同様に2K7neo(Suterら、前掲)中に挿入し、ベクター2K7neo−CMV−hB2Mを得た。
同時発現に使用されるヒトαFcRnおよびヒトβ2−ミクログロブリンに関する遺伝子を含有するプラスミドの構築: ヒトFcRnのα鎖の細胞外ドメイン(αFcRnECD)およびヒトB2Mをコードする遺伝子を、それぞれ、レンチウイルストランスファープラスミド2K7bsdおよび2K7neo中に挿入した。両方の場合において、挿入された遺伝子は、CMVプロモーターの制御下にあった。生じたタンパク質が、小胞体を通しての培地への排出のためのタンパク質を標的とするためのN末端におけるIgカッパ鎖リーダー配列(シグナル配列が分泌時に切断された)を有するように、遺伝子が伸長された。更に、αFcRnECDは、潜在的な検出のためのFLAG−タグが後に続くC末端スペーサー配列を有した。ヒトB2Mは、潜在的な検出のためのHis6タグが後に続くC末端スペーサー配列を有した。スペーサー配列は、タグの利便性を増強するために加えた。レンチウイルストランスファープラスミドは、両方の構築物が挿入された細胞の選択を可能にするための2つの異なる抗生物質耐性遺伝子も含有した。
FcRn結合Z変異体の選択およびELISA結合
この実施例において、ヒトFcRnを、Z変異体のファージライブラリーを使用した、ファージディスプレイ選択における標的として使用した。選択されたクローンを、DNA配列決定し、大腸菌ペリプラズム画分において作製し、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)においてFcRnに対してアッセイした。
標的タンパク質FcRnおよびB2Mのビオチン化: 実施例1において記載したように作製した、ヒトFcRnおよびヒトB2Mを、製造業者の推奨に従って、それぞれ、31×(FcRn)および10×(B2M)モル過剰でNo−Weigh EZ−Link Sulfo−NHS−LC−Biotin(Pierce、カタログ番号21327)を使用して、ビオチン化した。反応を、室温(RT)で30分間行った。それに続くPBSへの緩衝液交換を、製造業者の指示に従って、Slide−a−lyzer透析カセット(FcRn;Pierce、カタログ番号66380、10,000MWCOおよびB2M;Pierce、カタログ番号66333、3,500MWCO)を使用して、行った。
FcRn結合Z変異体のファージディスプレイ選択: 個々のクローンを、ビオチン化ヒトFcRnに対するファージディスプレイ選択の4つのサイクル後に得た。
FcRn結合Z変異体の作製および特徴付け
この実施例において、17種のZ変異体を大腸菌において作製し、精製し、BiacoreにおいてヒトFcRnに対してアッセイした。前記変異体のサブセットを、マウスFcRnに対してもアッセイした。円二色性(CD)分光法を、それらの二次構造の調査のために、Z変異体のサブセットに関して行った。
Z変異体のサブクローニング: 17種のFcRn結合Z変異体(配列番号1〜16および配列番号353)のDNAを、ライブラリーベクターpAY02592から増幅した。N末端His6タグを有する単量体Z変異体分子の構築のためのサブクローニング戦略を、(本質的に別の標的に結合するZ変異体に関してWO2009/077175において詳細に報告されているように)標準的な分子生物学的技法を使用して、適用した。Z遺伝子断片を、コードされた配列MGSSHHHHHHLQ−[Z#####]−VDを生じる発現ベクターpAY01448中にサブクローニングした。
培養および精製: N末端His6タグとともに構築された、17種のFcRn結合Z変異体(配列番号1〜16および配列番号353)を、大腸菌において作製した。280nmでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約2〜5g細菌ペレットからのIMAC−精製タンパク質の量は、種々のFcRn結合Z変異体に関して約10mgから20mgの範囲にわたった。各最終タンパク質調製物のSDS−PAGE分析は、これらがFcRn結合Z変異体を主に含有したことを示した。各FcRn結合Z変異体の正確な同一性および分子量を、HPLC−MS分析によって確認した。
ヒトまたはマウスFcRn/eGFPトランスフェクトHeLa細胞へのFcRn結合Z変異体の結合
この実施例において、FcRn結合Z変異体の結合能を調査した。ヒトおよびマウスFcRn−eGFP導入遺伝子を発現するHeLa細胞の作製およびAlexa Fluor(登録商標)647標識化Z変異体でのフローサイトメトリー分析に関するこれらの細胞の使用を、記載する。
FcRn−eGFPおよびB2Mウイルスベクターのクローニング: マウスFcRn(mFcRn、Genbank BC003786.1、OpenBiosystems)およびマウスB2M(mB2M、Genbank BC085164.1、OpenBiosystems)をコードする遺伝子を、実施例1において記載したヒトFcRnおよびヒトB2Mに関する遺伝子と同様の方法で増幅した。ヒトおよびマウスFcRnならびにB2M遺伝子を、以下のように増幅した:hFcRnに関して、アミノ酸1〜365(配列番号382)をコードする配列を増幅し;hB2Mに関して、アミノ酸21〜119(配列番号380)をコードする配列を増幅し;mFcRnに関して、アミノ酸1〜369(配列番号383)をコードする配列を増幅し;mB2Mに関して、アミノ酸21〜119(配列番号381)をコードする配列を増幅した。ベクターpHR−cPPT−CMV−EGFP(Jakobssonら(2003)J Neurosci Res 73:876〜85)およびFcRn PCR単位複製配列(ヒトおよびマウス)を、制限酵素BamHI(ヒト)またはBclI(マウス)およびMluI(New England Biolabs、それぞれ、カタログ番号R0136M、R0160Lお よびR0198L)を使用して切り、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、カタログ番号M0202M)を使用してライゲートした。ライゲーション混合物を、大腸菌RRIΔM15中に化学的に形質転換し、アンピシリンプレート上で広げた。コロニーを採取し、適したプライマー対でスクリーニングした。細胞質側末端で本来のシグナルペプチド、ヒトまたはマウスFcRnおよびeGFPをコードする構築物を、配列決定によって検証し、それぞれ、pHR−cPPT−CMV−hFcRn−eGFPおよびpHR−cPPT−CMV−mFcRn−eGFPと表示した。
フローサイトメトリー分析を利用して、FcRn結合Z変異体がヒトまたはマウスFcRn/eGFP形質導入HeLa細胞上のヒトおよび/またはマウスFcRnに結合するかどうかを決定した。実験を、Alexa Fluor(登録商標)647標識化Z07960、Z07930およびZ07918(それぞれ、配列番号4、6および1)を用いてpH6.0で行った。ドットプロット分析(y軸:Alexa Fluor(登録商標)647、x軸:eGFP)は、形質導入細胞集団が、HeLa細胞によるFcRn−eGFP融合タンパク質の不均一な発現を示す(図3)、FcRn−eGFP陰性および陽性集団(図3、それぞれ、ゲートHおよびI)に分けられることを示した。従って、ゲートIにおけるAlexa Fluor(登録商標)647に関する平均蛍光強度(MFI)値を、ゲートHにおけるAlexa Fluor(登録商標)647のバックグラウンドMFI値によって減算した。計算されたMFI値を、図4において提示する。結果は、Z07960、Z07930およびZ07918がヒト(図4A)またはマウス(図4B)FcRn−eGFPを提示するHeLa細胞に結合する能力があることを示している。
FcRn結合Z変異体Z07918によるFcRnへのIgG結合の遮断
この実施例において、FcRnへの結合に関するIgGとのFcRn結合Z変異体の潜在的な競合を、細胞に基づくアッセイにおいて調査した。かかる結合は、IgG−FcRn相互作用の遮断を生じることになる。
IgG−FcRn免疫蛍光染色のブロッキング: ヒトまたはマウスFcRn−eGFP形質導入HeLa細胞を、実施例4において記載したように調製した。固定された細胞を、100nM Alexa Fluor(登録商標)647をコンジュゲートしたヒトまたはマウスIgG(Jackson laboratories、それぞれ、カタログ番号009−600−003および015−600−003)および0.1%サポニン(AppliChem)を含有するPBS−カゼイン、pH6.0中に希釈した1000、100、10、1または0(緩衝液対照)nMのHis6−タグ付けZ07918の混合物50μlに再懸濁した。細胞を、暗所において振盪機上で37℃で1時間インキュベートし、2×100μl PBS−カゼインpH6.0で洗浄し、1%BSAを含有するPBS、pH6.0、180μlに再懸濁した。10,000細胞/ウェル(マウス100nM mIgG−Alexa Fluor(登録商標)647に関していくらか少ない細胞を除いて)からのデータを、Gallios Flow Cytometer(Beckman Coulter)を使用して得、データを、Kaluzaソフトウェア(Beckman Coulter)を使用して分析した。
実験を行って、FcRn結合Z変異体Z07918(配列番号1)がIgG−FcRn相互作用を遮断するかどうかを決定した。ヒトまたはマウスFcRn−eGFP形質導入HeLa細胞を、ヒトまたはマウスAlexa Fluor(登録商標)647をコンジュゲートしたIgGと共にインキュベートした。結合を、種々の濃度での非標識Z07918で遮断した。形質導入HeLa細胞(実施例4において記載した)によるFcRnの不均一な発現により、各サンプルのゲートNにおけるAlexa Fluor(登録商標)647に関するMFI値を、ゲートMにおける相当するMFI値によって減算した(図5)。IgG Alexa Fluor(登録商標)647結合の百分率を、種々のMFI値をブランク対照に関するMFIで除算することによって計算した。結果は、Z07918が用量依存的にhFcRnへのhIgG結合を効果的に遮断したことを示した(図6A)。更に、Z07918は、mFcRnへのmIgG結合も遮断した(図6B)が、hIgG結合と比較して、効率性は低かった。
3種のFcRn結合Z変異体の薬物動態学的研究
この実施例において、FcRn結合Z変異体が非特異的Z変異体の血清半減期を延長する能力を、マウスにおいて行った薬物動態学的研究によって調査した。
Z変異体のサブクローニング: Z変異体(Z07918、Z07960およびZ10193)のサブセットを、第二のサブクローニングにかけた。実施例3においてサブクローニングされたHis6−タグを付けた変異体からのDNAを、鋳型として使用した。最初に、適したプライマー対を使用したPCR増幅を行って、アミノ酸VDの代わりにAEで始まるZ変異体をコードする遺伝子を作った。変異導入したZ変異体を、図1において列挙し、それぞれ、変異導入したZ07918、Z07960およびZ10193に相当する、Z11948(配列番号354)、Z11946(配列番号355)およびZ11947(配列番号356)と表示した。新しいZ変異体をコードする遺伝子を制限切断し、スペーサー配列を有するアルブミン結合変異体PP013(配列番号377)およびZ03638(配列番号378)をコードする遺伝子を有するベクター中にライゲートし、[Z#####]−GAP(G4S)4TS−[PP013]−GT(G4S)4PR−[Z03638](「Z#####−PP013−Z03638」または「PP013−Z03638と融合したZ変異体」とも表示した)をコードする遺伝子融合物を生じた。陰性対照分子[Z03638]−GAP(G4S)4TS−[PP013]を、Z03638を(G4S)4リンカーおよびPP013に関する配列を含有するベクター中にライゲートすることによって同様の方法でサブクローニングした。大腸菌中へのベクター形質転換に関するそれに続く工程を、実施例3におけるように行った。
培養および精製: Z#####−PP013−Z03638として構築された、3種のFcRn結合Z変異体Z11947、Z11946およびZ11948(配列番号356、355および354)、および陰性対照Z03638−PP013を、大腸菌において作製した。280nmでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約3gの細菌のペレットからの精製タンパク質の量は、種々のFcRn結合Z変異体に関して約10から25mgの範囲にわたった。各最終タンパク質調製物のSDS−PAGE分析は、それらが、それぞれのFcRn結合Z変異体を主に含有したことを示した。各FcRn結合Z変異体の正確な分子量を、LC/MS分析によって確認した。
FcRn結合Z変異体の成熟ライブラリーの設計および構築
この実施例において、成熟したライブラリーを構築した。ライブラリーを、FcRn結合Z変異体の選択のために使用した。成熟したライブラリーからの選択は、増加した親和性を有する結合体を生じることが通常予想される(Orlovaら、(2006)Cancer Res、66(8):4339〜48)。この研究において、ランダム化された一本鎖リンカーを、合成における望ましい位置における定義されたコドンの組込みを可能にするスプリットプール合成を使用して、産出した。
ライブラリー設計: ライブラリーは、表1において、および実施例2〜6において更に記載したヒトFcRn結合Z変異体の16種の配列に基づいた。新しいライブラリーにおいて、Z分子骨格における13個の可変位置は、配列番号1〜16において定義されたZ変異体の結合モチーフに主に基づいた戦略に従って、いくつかのアミノ酸残基に向かって偏っていた。DNAリンカーを、DNA2.0(Menlo Park、CA、米国)から注文した、制限部位XhoIおよびSacIが隣接したアミノ酸配列:5’−AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A −3’(配列番号388;ランダム化されたコドンを、NNNとして例示する)の147bpの部分的にランダム化されたヘリックス1および2を含有するスプリットプール合成を使用して産出した。Z分子骨格における8つの可変のアミノ酸位置(9、10、11、13、14、24、32および35)および5つの定常アミノ酸位置(17、18、25、27および28)を含む新しいライブラリーにおけるアミノ酸残基の理論上の分布を、表8に示す。生じた理論上のライブラリーサイズは、5.3×108変異体である。
ライブラリー構築: 新しいライブラリーを、検証された結合特性を有する16種のFcRn結合Z変異体(実施例2〜6)のセットに基づいて設計した。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、5.3×108Z変異体であった。大腸菌ER2738細胞への形質転換後の滴定によって決定された、ライブラリーの実際のサイズは、4.5×109形質転換体であった。
成熟ライブラリーからのZ変異体の選択およびスクリーニング
材料および方法
成熟したFcRn結合Z変異体のファージディスプレイ選択: 標的タンパク質ヒトFcRn(Biorbyt、カタログ番号orb84388)およびマウスFcRn(Biorbyt、カタログ番号orb99076)を、10×モル過剰でビオチンを使用して、本質的に実施例2において記載したように、ビオチン化した。実施例7において記載したZ変異体分子の新しいライブラリーを使用して、ファージディスプレイ選択を、本質的に実施例2においてのように、しかし以下の例外を伴って、ヒトFcRnまたはマウスFcRnに対する4つのサイクルで行った。選択緩衝液は、それぞれ、0.1%PCTG緩衝液、pH5.5(0.1%ツイーン20および0.1%ゼラチンを補充したMcIlvainesリン酸−クエン酸緩衝液、pH5.5)または0.1%PCTG緩衝液、pH7.4、(0.1%ツイーン20および0.1%ゼラチンを補充したMcIlvainesリン酸−クエン酸緩衝液、pH7.4)であった。選択に先立って、HSAを、1.5μMの最終濃度まで選択緩衝液に加えた。選択において使用する全てのチューブおよびビーズを、2つの異なる選択緩衝液のどちらかで前もってブロッキングした。SA−ビーズとの45分間のファージストックのインキュベーションによる事前選択工程を、サイクル1において行った。ファージ−標的複合体の捕捉のために、1.1μgビオチン化ヒトFcRnまたは1.6μgビオチン化マウスFcRn当たり1mgビーズを使用した。洗浄を、表9において概要を述べたように、それぞれ、25nM IgG(Herceptin(登録商標))または10nM IgGを補充した0.1%PCTを使用したトラック2−1−2−1および2−1−2−2を除いて、0.1%PCT緩衝液pH5.5またはpH7.4で行った。
成熟したFcRn結合Z変異体のファージディスプレイ選択: 選択を、それぞれ4つのサイクルを含む全体で14個の平行したトラックにおいて行った。種々の選択トラックは、標的濃度、標的型(ヒトFcRnまたはマウスFcRn)、選択時間、および洗浄条件が異なった。
成熟ライブラリーからのZ変異体の作製および特徴付け
この実施例において、12種のZ変異体を、大腸菌において作製し、精製し、安定性に関して、FcRnへの結合に関しておよびFcRnへのIgG結合の阻害に関してアッセイした。
発現ベクター中へのZ変異体のサブクローニング: 12種のFcRn結合Z変異体(Z13577(配列番号19)、Z13578(配列番号20)、Z13583(配列番号23)、Z13592(配列番号28)、Z13616(配列番号41)、Z13621(配列番号44)、Z13654(配列番号65)、Z13663(配列番号70)、Z13669(配列番号73)、Z13674(配列番号75)、Z13675(配列番号76)およびZ13676(配列番号77))のDNAを、ライブラリーベクターpAY02592から増幅した。サブクローニングを、実施例3において記載したように行った。Z遺伝子断片を、発現ベクターpAY01448中にサブクローニングし、コードされた配列MGSSHHHHHHLQ−[Z#####]−VDを生じた。
Z変異体の作製: N末端His6タグとともに構築された12種のFcRn結合Z変異体を、大腸菌において作製した。各最終タンパク質調製物のSDS−PAGE分析は、これらが、FcRn結合Z変異体を主に含有したことを示した。各FcRn結合Z変異体の正確な同一性および分子量を、HPLC−MS分析によって確認した。
FcRnへのIgG結合の遮断能力の比較
この実施例において、FcRn結合Z変異体His6−Z07918(配列番号1)のIgG遮断能力を、いくつかの自己免疫障害の治療において現在使用されている静脈免疫グロブリン(IVIg)および皮下免疫グロブリン(SCIg)と比較した。
IgG−FcRn免疫蛍光染色のブロッキング: ヒトまたはマウスFcRn−eGFP形質導入HeLa細胞を、実施例4において記載したように調製した。固定された細胞を、それぞれ、50nM Alexa Fluor(登録商標)647をコンジュゲートしたヒトIgG(Jackson laboratories、カタログ番号009−600−003)およびHis6−タグ付けZ07918、IVIg(Octagam(登録商標)、Octapharma)またはSCIg(Gammanorm(登録商標)、Octapharma)の混合物50μlに再懸濁し、2.5%FBSウルトラロー (ultra low)IgG(Life technologies)および0.1%サポニン(AppliChem)を含有するMcIlvanes、pH6.0において1000、100、10、1、0.1または0(緩衝液対照)nMの濃度で希釈した。細胞を、暗所において37℃で1時間インキュベートし、2.5%FBSウルトラローIgG pH6.0を含有する、2×100μl McIlvanes、pH6.0で洗浄し、1%BSAを含有するMcIlvanes、pH6.0 180μlに再懸濁した。10,000GFP/FcRn陽性細胞からのデータを、FACS Calibur(Beckman Coulter)を使用して得、データを、Flowingソフトウェア2.5.0(Turku University)を使用して分析した。
実験を行って、FcRn結合Z変異体His6−Z07918(配列番号1)が、IgG−FcRn相互作用を遮断するかどうかを決定し、IVIgおよびSCIgと遮断効果を比較した。ヒトまたはマウスFcRn−eGFP形質導入HeLa細胞を、ヒトAlexa Fluor(登録商標)647をコンジュゲートしたIgGと共にインキュベートした。結合を、種々の濃度での非標識His6−Z07918、IVIgまたはSCIgで遮断した。結果は、His6−Z07918が、IVIgまたはSCIgと同程度までhFcRnへのhIgG結合を効果的に遮断したことを示した(図9)。
マウスにおけるFcRn結合Z変異体による増加したIgG異化
FcRn結合Z変異体Z07918がFcRnへのIgG結合をインビトロで遮断する能力が、実施例10において示された。この実施例においては、同じZ変異体の遮断能力を、インビボで評価した。インビボでのIgG−FcRn相互作用の遮断は、増加したIgG異化および随伴するIgGの減少したレベルにつながることになる(Mezo、2008、前掲)。
動物試験: FcRn結合Z変異体Z11948(配列番号354)およびZ07918−PP013(Z07918(配列番号1)(ABD変異体PP013(配列番号377)と融合した、Z11948と同一であるが、アミノ酸AEの代わりにVDで始まるN末端を有する)またはビヒクル(PBS緩衝液)を、16.3μmol/kgの用量で雄性NMRI(Charles River)に投与した。マウスを、0、24、48、72および96時間で与えた5回の静脈内注射で処置した。血清サンプルを、0、72、120および168時間(試験の終結)で採取し、−20℃で保管した。血清におけるマウスIgGの濃度を、ELISAによって定量化した。
結果は、FcRn特異的Z変異体で処置したマウスにおけるマウスIgG濃度の減少を示した。Z11948とABD−融合変異体Z07918−PP013の両方が、マウスにおける内在性IgGの濃度をインビボで低下させた。最も顕著な効果は、ABD−融合変異体で120時間後に得られた。従って、結果は、FcRn特異的Z変異体が、IgGの再利用を遮断し、マウスにおける増加したIgG異化およびそれに続くIgGの低いレベルを生じたことを示している。
FcRn結合Z変異体のインビトロ経細胞輸送
この実施例において、FcRn結合Z変異体を、上皮または内皮細胞を通して輸送されるまたはFcRnによって再利用されるそれらの能力に関してインビトロで試験した。経細胞輸送力を有するZ変異体を含有する薬物は、例えば経口または肺投与後に、薬物取り込みを促進することになる。
FcRnの内在性または組換え発現を有するかまたは有さない細胞、例えばT84、MDCK、HeLa、CaCo2、CaLu−1および/またはCaLu−3細胞を、トランスウェルにおける膜上のそれぞれの増殖培地において増殖させて、単層を形成した。単層の完全性は、電気抵抗を測定することまたは細胞単層上で透過することができないもしくは活発に輸送されることができないプローブを加えることによって評価することができる。細胞の規定された単層を、適したpHおよび温度でのHBSS(ハンクス平衡塩溶液、SigmaAldrich、カタログ番号H9269)または増殖培地のような緩衝液におけるFcRn結合Z変異体、HSAまたはIgGのようなリガンドで、頂端または側底側からパルスし、反対側上で適したpHおよび温度でのHBSSまたは増殖培地のような緩衝液で追跡した。
ホモ二量体FcRn結合ポリペプチドのヒトFcRn/eGFPトランスフェクトされたHeLa細胞への結合
この実施例において、ホモ二量体FcRn結合ポリペプチドの結合能を調べ、単量体のプライマリーおよび成熟したZ変異体の結合能と比較した。ヒトFcRn−eGFP導入遺伝子を発現しているHeLa細胞の作製は、実施例4に記載のように行い、Alexa Fluor(登録商標)647標識化されたZ変異体によるフローサイトメトリー分析のためのこれらの細胞の使用を説明する。
FcRn結合ポリペプチドのAlexa Fluor(登録商標)647標識化: 2つのホモ二量体His6−タグを付けたポリペプチドZ11948−(G4S)3−Z11948(配列番号369)およびZ11948−(G4S)−Z11948(配列番号368)、プライマリー単量体His6−タグ付けZ変異体Z07918(配列番号1)および成熟した単量体His6−タグ付けZ−変異体Z13583(配列番号23)、Z13621(配列番号44)、Z13654(配列番号65)およびZ13674(配列番号75)を、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(Invitrogen、カタログ番号A20106)により標識化した。標識化前に、サンプル懸濁液(PBS、pH7.4中)のpHを、0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH8.3 10μlをサンプル懸濁液90μlへ添加することにより、8.3に調整した。Alexa Fluor(登録商標)647スクシンイミジルエステル色素(4×モル過剰に相当するDMSO中の10mg/ml)10μlを、各サンプル懸濁液の100μlへ添加した。この混合物を、小刻みに揺れる回転ミキサーにおいて、暗所、RTで1時間インキュベートした。反応混合物を、透析カセット(3500MWCO)(Thermo Scientific、カタログ番号66333)へ直ちに移し、遊離色素を、PBS、pH7.4中での透析により、除去した。
フローサイトメトリー分析を利用し、FcRn結合二量体が、ヒトFcRn/eGFP形質導入されたHeLa細胞上のヒトFcRnに結合するかどうかを決定し、且つ単量体FcRn結合Z変異体へのそれらの結合能を比較した。この分析はまた、FcRnタンパク質からのpH依存性の脱離が、二量体フォーマットにより影響されるかどうかを決定するために行った。実験は、pH6.0で行い、Alexa Fluor(登録商標)647標識した二量体Z11948−(G4S)3−Z11948およびZ11948−(G4S)−Z11948、ならびに単量体Z07918、Z13583、Z13621、Z13654およびZ13674で、pH6.0またはpH7.4で洗浄した。Z11948とZ07918は、最初の2個のアミノ酸残基(AE対VD)以外は、配列は同じである。計算したMFI値を、図11に示す。結果は、二量体フォーマットは、FcRn結合ポリペプチドの結合能を、対応する単量体と比べ増大すること(図11A)、および成熟Z変異体(Z13583、Z13621、Z13654およびZ13674)は、プライマリーZ変異体Z07918よりも高い結合能を有すること(図11B)を示している。データは、FcRnからのpH依存性の脱離は、二量体フォーマットの使用により減少することを示し、このことは、FcRn結合二量体は、対応する単量体変異体と比べ、改善されたpH依存性結合プロファイルを有することを示唆している。
FcRnへのIgG結合の遮断能の比較
この実施例において、FcRn結合二量体Z11948−(G4S)3−Z11948およびZ11948−(G4S)−Z11948のIgG遮断能を、単量体FcRn結合Z変異体、ならびにいくつかの自己免疫疾患の治療において現在使用されている静脈内免疫グロブリン(IVIg)および皮下免疫グロブリン(SCIg)のそれと比較した。
IgG−FcRn免疫蛍光測定染色のブロッキング: ヒトFcRn−eGFP形質導入HeLa細胞を、実施例4に記載のように調製した。固定された細胞を、50nM Alexa Fluor(登録商標)647−コンジュゲートされたヒトIgG(Jackson laboratories、カタログ番号009−600−003)およびHis6−タグ付けZ11948−(G4S)3−Z11948(配列番号369)、Z11948−(G4S)−Z11948(配列番号368)、Z07918(配列番号1)、Z13583(配列番号23)、Z13621(配列番号44);IVIg(Octagam(登録商標)、Octapharma)またはSCIg(Gammanorm(登録商標)、Octapharma)の50μl混合物中にそれぞれ再懸濁し、2.5%FBSウルトラローIgG(Life Technologies)および0.1%サポニン(AppliChem)を含有する、McIlvanes緩衝液、pH6.0中に、濃度1000、100、10、1、0.1または0(緩衝液対照)nMで希釈した。細胞を、暗所において、37℃で1時間インキュベートし、2.5%FBSウルトラローIgGを含有する2×100μlのMcIlvanes緩衝液、pH6.0により洗浄し、1%BSAを含有するMcIlvanes緩衝液、pH6.0の180μl中に再懸濁した。10,000GFP/FcRn陽性細胞からのデータを、FACS Calibur(Beckman Coulter)を使用して得、データを、Flowingソフトウェア2.5.0(Turku University)を使用して分析した。
実験は、FcRn結合二量体Z11948−(G4S)3−Z11948およびZ11948−(G4S)−Z11948は、IgG−FcRn相互作用を遮断するかどうかを決定し、且つ単量体FcRn結合Z変異体Z07918、Z13583およびZ13621、ならびにIVIgおよびSCIgのそれと遮断効果を比較するために行った。ヒトFcRn−eGFP形質導入HeLa細胞を、ヒトAlexa Fluor(登録商標)647コンジュゲートされたIgGとインキュベートした。この結合は、種々の濃度の標識化されないZ変異体、IVIgまたはSCIgにより遮断された。結果は、FcRn結合二量体は、hFcRnへのhIgG結合に関して、単量体Z変異体Z07918、IVIgおよびSCIgと比べ、改善された遮断効果を有することを示している(図12A)。更に、成熟した単量体Z変異体Z13583およびZ13621の遮断能は、プライマリー単量体Z変異体Z07918の遮断能と比べ、改善された(図12B)。遮断アッセイの計算したIC50値を、表15にまとめている。
二量体FcRn結合ポリペプチドの作製
材料および方法
Z変異体Z17303(配列番号357)、Z18632(配列番号365)、Z18633(配列番号366)およびZ18634(配列番号367)を、アルブミン結合変異体PP013(配列番号377)と融合し、一般的フォーマット[Z#####]−ASGS−PP013−GT−(G4S)−[Z#####]の二量体として構築した。得られたポリペプチドを、各々、ZAZ3824(配列番号373)、ZAZ3869(配列番号374)、ZAZ3870(配列番号375)およびZAZ3871(配列番号376)と表示した。PP013と融合したZ変異体Z17303の二量体ポリペプチドはまた、異なるリンカーまたはPP013のC−末端融合によっても構築し、ポリペプチドZ17303−GAP(G4S)3TS−PP013−GT(G4S)3PR−Z17303およびZ17303−GAP(G4S)3TS−Z17303−GT(G4S)3PR−PP013を生じ、各々、ZAZ3715(配列番号371)およびZZA3716(配列番号372)と表示した。更に、Z17303は、PP013を有さないが、N−末端His6−タグを伴う二量体として構築し、ポリペプチドGSS−His6−LQ−Z17303−GT(G4S)3−Z17303を生じ、ZZ3556(配列番号370)と表示した。
His6−タグまたはABD部分のいずれかを伴い構築した7種のFcRn結合二量体ポリペプチドを、大腸菌において作製した。アフィニティ精製したタンパク質の量を、280nmでの吸光度を測定することにより、分光学的に決定し、1gの細菌ペレットにつき2mgから18mgの範囲にわたった。各最終タンパク質調製品のSDS−PAGE分析は、これらはFcRn結合ポリペプチドを主に含んだことを示した。各FcRn結合ポリペプチドの正確な同一性および分子量は、HPLC−MS分析により確認した。
ヒトFcRn/eGFPトランスフェクトHeLa細胞へのホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドの結合
この実施例において、成熟したZ変異体を含むホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドの結合能を調べた。実施例4に記載のように作製した、ヒトFcRn−eGFP導入遺伝子を発現しているHeLa細胞を、Alexa Fluor(登録商標)647標識したZ変異体によるフローサイトメトリー分析に使用した。
FcRn結合Z変異体のAlexa Fluor(登録商標)647標識化: ホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドを、実施例13に記載のように、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(Invitrogen、カタログ番号A20106)により標識化した。
フローサイトメトリー分析を使用し、成熟Z変異体を含むホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドは、ヒトFcRn/eGFP形質導入HeLa細胞上のヒトFcRnへ結合することができるかどうかを決定し、且つプライマリーZ変異体を含む単量体FcRn結合Z変異体または二量体変異体の結合能を比較した。この分析はまた、FcRnタンパク質からのpH依存性の脱離は、二量体フォーマットにより影響されるかどうかを決定するために行った。実験は、pH6.0で行い、Alexa Fluor(登録商標)647標識したFcRn結合Z変異体により、pH6.0またはpH7.4で洗浄した。この実験の結果は、ホモおよび/またはヘテロ二量体フォーマット、ならびにFcRnへの改善された親和性を伴う成熟Z変異体の封入は、FcRn結合ポリペプチドの結合能を増加すること、およびFcRnからのpH依存性の脱離は、前記ポリペプチドで減少されることを示すと予想される。
二量体ポリペプチドのヒトFcRnへのpH依存性結合
この実施例において、種々のpH値での二量体ポリペプチドのFcRnへ結合する能力を、ELISAにより調べ、単量体Z変異体の結合能と比較した。
二量体ポリペプチドZAZ3824(配列番号373)、ZAZ3869(配列番号374)、ZAZ3870(配列番号375)およびZAZ3871(配列番号376)、ならびに単量体Z変異体Z13621(配列番号44)の、種々のpH値でヒトFcRnへ結合する能力を、ELISAにより試験し、ここで全ての結合および洗浄工程は、pH6.0またはpH7.4のいずれかで行った。ハーフエリア96ウェルELISAプレートを、PBS中に希釈したhFcRn(Biorbyt、カタログ番号orb84388)4μg/mlにより、4℃で終夜コーティングした。プレートを、水道水により2回洗浄し、ウェルをPBSC(1%カゼインを補充したPBS、pH7.4)100μlによりRTで1.5時間ブロックした。このブロック液を捨て、pH6.0処理に供したウェルを、McIlvainesリン酸−クエン酸緩衝液、pH6.0により1回洗浄した。様々なFcRn結合ポリペプチドを、濃度100nMで添加し、PCC(1%カゼインを補充したMcIlvainesリン酸−クエン酸緩衝液、pH6.0)またはPBSCのいずれか中に、0.1pMまで1:10段階希釈した。希釈液50μlを、ウェル毎に移し、ELISAプレートを、RTで1.5時間インキュベートした。プレートを、PCT(0.05%ツイーン20を補充したMcIlvainesリン酸−クエン酸緩衝液、pH6.0)またはPBST(0.05%ツイーン20を補充したPBS、pH7.4)のいずれかにより、4回洗浄した。結合したポリペプチドを、PCCまたはPBSCのいずれか中に2μg/mlに希釈したZ特異性マウス抗体(内部で作製した)の50μl/ウェルで検出した。続けてプレートを、RTで1.5時間インキュベートし、引き続き前述のように洗浄した。DAKO(P0447)から入手したHRP−コンジュゲートされたヤギ抗−マウスIgを、PCCまたはPBSCのいずれかの中に1:5000に希釈し、添加し、これらのプレートを、RTで1時間インキュベートした。洗浄(前述)の後、ImmunoPure TMB基質50μlを、各ウェルに添加し、プレートを、製造業者の推奨に従い展開した。30分間の展開後、マルチウェルプレートリーダー(Victor3)を使用し、吸光度を450nmで測定し、EC50値を、GraphPad Prism 5を使用し計算した。
解析を行い、種々のpHでの単量体対二量体のフォーマットの結合の潜在力を比較したが、導入された骨格変異(Y5F、N52SおよびD53E:更に実施例24および25参照)が、FcRnへのpH依存性結合へ影響を及ぼすかどうかも決定した。実験は、pH6.0またはpH7.4で、ELISAフォーマットで行った。結果は、二量体フォーマットは、pHとは無関係に、FcRn結合において、単量体フォーマットよりも優れていた(pH6.0およびpH7.4で各々、最大10×および85×)ことを示した。pH6.0およびpH7.4の両方で最も強力な結合は、二量体ポリペプチドZAZ3824において認められ、これはまたpH6.0およびpH7.4で類似の結合能(EC50値)を示した。ELISA滴定曲線は、図13に示し、計算されたEC50値は、表16にまとめている。
FcRnへのIgG結合の遮断能の比較
この実施例において、IgGのFcRnへの結合を阻害するポリペプチドの能力を、2種の異なるインビトロ法を用いて分析した:AlphaLISAおよび細胞を基本としたアッセイ。
AlphaLISA遮断アッセイ: 二量体FcRn結合ポリペプチドZZ3556(配列番号370)、ZAZ3715(配列番号371)およびZZA3716(配列番号372)、ならびに単量体Z13621(配列番号44)のIgG−FcRn相互作用を遮断する能力を、AlphaLISAアッセイを用いて分析した。ヒトIgG(Roactemra)を、製造業者の推奨に従い、AlphaLISAアクセプタービーズ(Perkin Elmer、カタログ番号6772002)上に固定した。ヒトFcRn(Biorbyt、カタログ番号orb84388)を、本質的に実施例2に記載されたように、ビオチン化した。ポリペプチドは、AlphaLISA緩衝液(Perkin Elmer、カタログ番号AL000F)pH6.0(HClを用いて調整)中に、1:3で連続希釈し、384ウェルプレート(Perkin Elmer、カタログ番号G6005350)中に最終濃度250nMから13pMとし、10nMビオチン化hFcRnと一緒に45分間インキュベートした。IgG−コーティングされたアクセプタービーズを、最終濃度10μg/mlとなるよう添加し、45分間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンコーティングされたドナービーズ(Perkin Elmer、カタログ番号6760002)を、最終濃度40μg/mlとなるよう添加し、30分間インキュベートした。全てのインキュベーションは、暗所においてRTで行った。プレートを、EnSpireマルチプレートリーダー2300(Perkin Elmer)において分析し、IC50値を、GraphPad Prism 5を用いて計算した。
AlphaLISA: 1種の単量体ポリペプチドおよび3種の二量体ポリペプチドのFcRnへのIgG結合を阻害する能力を、AlphaLISA遮断アッセイにおいて試験した。結果は、二量体ポリペプチドは、単量体フォーマットと比べ、より良いIgG遮断能を有することを示している。2種のABD融合した二量体ポリペプチドZAZ3715およびZZA3716は、ABD部分を含まないZZ3556のIC50値に非常に類似したIC50値を有した。AlphaLISA遮断アッセイの計算したIC50値は、表17にまとめている。
IgG再利用の遮断能の比較
この実施例において、IgG再利用に対するホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドの効果を、FcRn形質導入されたMDCK.2細胞において調べる。
MDCK.2細胞におけるレンチウイルス形質導入:ベクター対2k7neo−CMV−hB2MおよびpHR−cPPT−CMV−hFcRn−eGFPを、塩化カルシウムトランスフェクションを使用し、HEK293T細胞へ、VSV−Gエンベロープおよびgag/polパッケージングプラスミドと一緒に同時トランスフェクトした(Zuffereyら、前掲;Jakobssonら、(2006)、前掲)。それぞれFcRnおよびB2M導入遺伝子と共に形成されたレンチウイルス粒子を含むHEK293T培養上清を使用し、低い継代数で順次MDCK.2細胞(ATCCカタログ番号CRL−2936)に形質導入した。生じた安定して形質導入されたMDCK.2細胞株を、hFcRn−eGFP(ヒトFcRn−eGFPおよびhB2Mの遺伝子で形質導入された)と表示する。
実験からの結果は、二量体FcRn結合ポリペプチドの作用による、IgG再利用の用量依存型の減少を示すと予想される。
FcRnトランスジェニックマウスにおける二量体FcRn結合ポリペプチドによる増大したIgG異化
この実施例において、ホモ二量体FcRn結合ポリペプチドのIgG異化に対する効果を、2つの異なる状況でヒトFcRnトランスジェニックマウスにおいて調べた。
動物試験: 第一の試験において、ホモ二量体FcRn−結合ポリペプチドZAZ3715(配列番号371)またはZZA3716(配列番号372)、またはビヒクル(PBS緩衝液)を、雄性B6.Cg−Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJマウス(Jackson Laboratory、ストック番号14565)へ、用量6mg/kgで、i.v.注射により0時間で投与した。ポリペプチド投与の24時間前に、500mg/kg hIgG(Kiovig、Baxter)を、i.v.注射により投与した。血清サンプルを、−168、0、24、72、120および144時間(試験の終了時)に収集し、−20℃で貯蔵した。
実験の結果は、FcRn結合ポリペプチドの作用による、経時的なヒトIgG濃度の減少を示す。ポリペプチドZAZ3715およびZZA3716を受け取る2群の間で、IgGレベルの減少に差は、ほとんどまたは全くない(図14A)。これらの結果は、中央またはC−末端位置のABDを伴うFcRn結合ポリペプチドは、IgG異化の増加に同等に有効であることを指摘している。ポリペプチドZAZ3869、ZAZ3870およびZAZ3871は、各々、hIgGレベルを、同程度減少した(図14B)。第二の実験の結果は、第一の実験で得られた結果と同じ範囲であった。
NMRIマウスにおける二量体FcRn結合ポリペプチドによる増大したIgG異化
この実施例において、ホモ二量体FcRn結合ポリペプチドのIgG異化に対する効果を、NMRIマウスにおいて調べた。
動物試験: ホモ二量体FcRn結合ポリペプチドZAZ3715(配列番号371)またはZZA3824(配列番号373)、またはビヒクル(PBS緩衝液)を、雌性NMRIマウスへ、用量0.6または1.7μmol/kgのi.v.注射により、0時間に投与した。血清サンプルを、0、24、48および72時間(試験の終了)に採取し、−20℃で貯蔵した。
IgG異化: 結果は、FcRn−特異性ポリペプチドZAZ3715およびZAZ3824で各々処理したマウス中のマウスIgG濃度の減少を示した(図15)。ポリペプチドZAZ3824で得られた結果は、内在性IgGレベルの減少は、用量依存性であり、且つ最も顕著な効果は72時間で観察されたことを示した。注目すべきは、単量体が繰り返し且つ二量体よりもはるかに高い用量で投与されたとしても、二量体の使用により得られたIgGレベルの減少は、実施例11における単量体Z07918により得られた減少よりも大きかったことである(図15および10の72時間を比較)。従って、これらの結果は、本明細書に開示されたFcRn−特異性ポリペプチドは、IgGの再利用を遮断することができ、マウスにおいて増大したIgG異化およびその後のより低いレベルのIgGを生じることを指摘している。
カニクイザルにおけるFcRn結合二量体により増加したIgG異化
この実施例において、ホモまたはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドのIgG異化に対する効果を、カニクイザルにおいて調べた。
動物試験: PP013(配列番号377)に組換えにより融合されたホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドを、調製した。かかるFcRn結合二量体の例は、本明細書に開示した配列番号371〜376を含む。
実験からの結果は、FcRn結合二量体の作用により、カニクイザルIgGの濃度の用量依存型の減少を示し、アルブミン結合ドメインも含むかかる二量体についてより顕著な効果を示すと予想される。
二量体FcRn結合ポリペプチドの薬物動態試験
この実施例において、ホモおよび/またはヘテロ二量体FcRn結合ポリペプチドの血清半減期を、マウスにおいて実行した薬物動態試験において調べた。
薬物動態試験: 単独のまたはPP013(配列番号377)へ組換えにより融合された、ホモおよび/またはヘテロ二量体としてのFcRn結合ポリペプチドを、雄性NMRIマウス(Charles River、独国)へ、用量92nmol/で、静脈内(i.v.)投与した。3匹のマウスの群からの血清を、0.08、6、18、78、120、168および240時間に得た。各々のポリペプチドの濃度を、ELISAにより決定した。
本明細書に記載した実験からの結果は、ABDを持たないポリペプチドに関して約60分間、およびABDを含むポリペプチドに関して約90時間の終末半減期を持つ、2コンパートメント排泄相を示すと予想される。
骨格修飾された(scaffold-modified)FcRn結合ポリペプチドの生成、安定性試験および結合評価
下記の実施例は、高温で改善された安定性を示す、骨格修飾されたFcRn結合Z変異体を明らかにしている。アミノ酸置換N52SおよびD53Eを有するZ変異体Z17347(配列番号358)、ならびにアミノ酸置換D36R、D37Q、S39E、N52SおよびD53Eを有するZ17348(配列番号359)を、安定性およびFcRnへの結合能に関して、それらの親分子Z11948(配列番号354)と比較した。
骨格修飾されたポリペプチドの生成: Z17347(配列番号358)、Z17348(配列番号359)およびZ11948(配列番号354)を、N−末端6×ヒスチジン−タグ(His6)とクローニングし、フォーマットMGSSHHHHHHLQ−[Z#####]の構築物をコードしたポリペプチドを得た。変異は、望ましいアミノ酸置換をコードしている重複するオリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、確立された分子生物学技術の適用により、修飾されたZ変異体のプラスミドに導入した。正確なプラスミド配列は、DNA配列決定により検証した。
円二色性スペクトル分析: CDシグナル、対、温度プロットにおいて転移の中間点から決定した各代表的Z変異体のTmを、表19に示している。変異導入されたZ変異体は、90℃の加熱後に、保存されたαヘリックス構造および可逆的再折り畳みを示した。
追加の骨格修飾されたFcRn結合ポリペプチドの生成および評価
この実施例において、骨格アミノ酸置換N52SおよびD53Eを伴う追加の変異体、ならびにアミノ酸置換Y5Fも伴ういくつかの変異体を、それらの安定性およびFcRnへの結合について、それらの各親FcRn結合Z変異体と比較し、分析した。結果は、構造、安定性およびFcRn結合能は、変異導入された変異体において維持されることを示している。
骨格修飾されたポリペプチドの生成: アミノ酸置換N52SおよびD53Eを、確立された分子生物学技術を使用し、His6−タグ付けZ13578(配列番号20)、Z13583(配列番号23)、Z13616(配列番号41)、Z13621(配列番号44)およびZ13674(配列番号75)のプラスミドに導入し、各Z変異体Z18614(配列番号360)、Z18615(配列番号361)、Z18616(配列番号362)、Z18617(配列番号363)およびZ18618(配列番号364)を生じた。チロシン残基である位置5での追加の修飾は、フェニルアラニンへ置換し、ならびにアミノ酸残基VDの代わりにAEで始まるようなN末端修飾は、各々、Z13578、Z13616およびZ13621と同じ結合モチーフ(BM)を有する、Z変異体Z18632(配列番号365)、Z18633(配列番号366)およびZ18634(配列番号367)を生じた。培養および精製を、本質的に実施例3および実施例9に記載されたように行った。5種のZ変異体Z18614−Z18618は、IMACのみにより精製したのに対し、3種のZ変異体Z18632−Z18634は、更にRPCにより精製した。
培養および精製: FcRn結合Z変異体を、N末端His6−タグにより構築し、大腸菌において生成した。各最終タンパク質調製品のSDS−PAGE分析は、これがZ変異体に主に含まれたことを示した。各FcRn結合Z変異体の正確な同一性および分子量は、HPLC−MS分析により確認した。
[項目1]
第一の単量体単位、第二の単量体単位およびアミノ酸リンカーを含む、FcRn結合二量体であって、ここで前記第一および第二の単量体単位が各々、FcRn 結合モチーフ(BM)を含み、このモチーフが、アミノ酸配列:
EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、E、F、G、H、I、K、Q、R、SおよびVから選択され;
X7は、A、F、H、K、N、Q、R、SおよびVから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;ならびに
X29は、DおよびRから選択される)
からなり、
且つここで前記FcRn結合二量体が、前記第一の単量体単位または前記第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能でFcRnへ結合する、前記FcRn結合二量体。
[項目2]
互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、E、F、G、H、I、K、Q、RおよびSから選択され;
X7は、A、F、H、K、N、Q、R、SおよびVから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、FおよびYから選択され;
X18は、Dであり;
X21は、Vであり;
X25は、D、E、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびWから選択され;ならびに
X29は、DおよびRから選択される、項目1記載のFcRn結合二量体。
[項目3]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのBMが、
i) EX2 X3 X4 AX6 HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X6は、A、G、K、R、SおよびVから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、G、H、K、L、N、R、VおよびWから選択され;
X28は、A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、WおよびYから選択される);ならびに
ii) i)に定義された配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる、項目1記載のFcRn結合二量体。
[項目4]
X6X7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてAHおよびGHから選択される、項目1〜3のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目5]
X6X7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてAHである、項目4記載のFcRn結合二量体。
[項目6]
X6X7が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてGHである、項目4記載のFcRn結合二量体。
[項目7]
X17X18が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてFDおよびYDから選択される、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目8]
X17X18が、前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つにおいてFDである、項目7記載のFcRn結合二量体。
[項目9]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのBMの配列が、6つの条件I〜VI:
I. X6は、A、G、KおよびSから選択され、例えば特にAである;
II. X7は、Hである;
III. X17は、FおよびYから選択され、例えば特にFである;
IV. X18は、Dである;
V. X21は、VおよびWから選択され、例えば特にVである;
VI. X25は、HおよびRから選択され、例えば特にHである:
の少なくとも3つを満たしている、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目10]
配列が、6つの条件I〜VIの少なくとも4つを満たしている、項目9記載のFcRn結合二量体。
[項目11]
配列が、6つの条件I〜VIの少なくとも5つを満たしている、項目10記載のFcRn結合二量体。
[項目12]
配列が、6つの条件I〜VIの全てを満たしている、項目11記載のFcRn結合二量体。
[項目13]
前記第一および第二の単量体単位が、同じBM配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目14]
前記第一および第二の単量体単位が、異なるBM配列を含む、項目1〜12のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目15]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜353からなる群、例えば配列番号17〜352からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するFcRn結合モチーフBMを含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目16]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜15、配列番号17〜140および配列番号353からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目15記載のFcRn結合二量体。
[項目17]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜2および配列番号17〜140からなる群、例えば配列番号17〜140からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目16記載のFcRn結合二量体。
[項目18]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜2、配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125および配列番号127〜140からなる群、例えば配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105−125および配列番号127〜140からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目17記載のFcRn結合二量体。
[項目19]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜8、配列番号13、配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73、配列番号75〜77および配列番号353からなる群、例えば配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73および配列番号75〜77からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目16記載のFcRn結合二量体。
[項目20]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73および配列番号75〜77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73および配列番号75〜77からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目18または19記載のFcRn結合二量体。
[項目21]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目20記載のFcRn結合二量体。
[項目22]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65および配列番号75からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65および配列番号75からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目21記載のFcRn結合二量体。
[項目23]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号23および配列番号75からなる群、例えば配列番号23および配列番号75からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目22記載のFcRn結合二量体。
[項目24]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群、例えば配列番号20および配列番号41からなる群;配列番号20および配列番号44からなる群;または、配列番号41および配列番号44からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目22記載のFcRn結合二量体。
[項目25]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号23および配列番号44からなる群、例えば配列番号23および配列番号44からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目22記載のFcRn結合二量体。
[項目26]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号44の配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目24または25記載のFcRn結合二量体。
[項目27]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、独立して、項目15〜26のいずれか一項に定義された選択された配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目28]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、独立して、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44および配列番号75からなる群、例えば配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目27記載のFcRn結合二量体。
[項目29]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号44の配列における位置8から位置36までの配列に対応するBMを含む、項目28記載のFcRn結合二量体。
[項目30]
前記第一および第二の単量体の少なくとも一つにおける前記FcRn結合モチーフBMが、3ヘリックス束タンパク質ドメインの一部を形成する、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目31]
前記BMが、前記3ヘリックス束タンパク質ドメイン内に、内部結合ループにより2ヘリックス部分を本質的に形成する、項目30記載のFcRn結合二量体方法。
[項目32]
前記3ヘリックス束タンパク質ドメインが、細菌受容体ドメインから選択される、項目31記載のFcRn結合二量体。
[項目33]
前記3ヘリックス束タンパク質ドメインが、黄色ブドウ球菌由来のプロテインAまたはそれらの誘導体のドメインから選択される、項目32記載のFcRn結合二量体。
[項目34]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、結合モジュール(BMod)を含み、前記モジュールが
iii) K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ;
(配列中、
[BM]は、X29がDであるという条件で、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフであり
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、E、NおよびSから選択され;
Xeは、D、EおよびSから選択され;
Xfは、AおよびSから選択される)、ならびに
iv) iii)により定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目35]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、結合モジュール(BMod)を含み、前記モジュールが
v) K−[BM]−QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ:
(配列中、
[BM]は、X29がRであるという条件で、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、E、NおよびSから選択され;
Xeは、D、EおよびSから選択され;
Xfは、AおよびSから選択される)、ならびに
vi) v)により定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる、項目1〜33のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目36]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜353、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号17〜352および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目34記載のFcRn結合二量体。
[項目37]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜15、配列番号17〜140、配列番号353、配列番号358および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目36記載のFcRn結合二量体。
[項目38]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜2、配列番号17〜140、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号17〜140および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目37記載のFcRn結合二量体。
[項目39]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜2、配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125、配列番号127〜140、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125、配列番号127〜140および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目38記載のFcRn結合二量体。
[項目40]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜8、配列番号13、配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73、配列番号75〜77、配列番号353、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73、配列番号75〜77および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目36記載のFcRn結合二量体。
[項目41]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73、配列番号75〜77、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73、配列番号75〜77および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目39または40記載のFcRn結合二量体。
[項目42]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75、配列番号77、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75、配列番号77および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目41記載のFcRn結合二量体。
[項目43]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75、配列番号358および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号75および配列番号360〜364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目42記載のFcRn結合二量体。
[項目44]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号23、配列番号75、配列番号358、配列番号361および配列番号364からなる群、例えば配列番号23、配列番号75、配列番号361および配列番号364からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目43記載のFcRn結合二量体。
[項目45]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号20、配列番号41、配列番号44、配列番号360、配列番号362および配列番号363からなる群、例えば配列番号20、配列番号41、配列番号360 および配列番号362からなる群;配列番号20、配列番号44、配列番号360および配列番号363からなる群;または、配列番号41、配列番号44、配列番号362および配列番号363からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目43記載のFcRn結合二量体。
[項目46]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号23 ,配列番号44、配列番号358、配列番号361および配列番号363からなる群、例えば配列番号23,配列番号44、配列番号361および配列番号363からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目43記載のFcRn結合二量体。
[項目47]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号44における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目46記載のFcRn結合二量体。
[項目48]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、項目36〜47のいずれか一項に定義された群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目1〜13および15〜47のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目49]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号75および配列番号360〜364からなる群、例えば配列番号20、配列番号41、配列番号44、配列番号360、配列番号362および配列番号363からなる群から選択される配列における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目48記載のFcRn結合二量体。
[項目50]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号44における位置7から位置55までの配列に対応するBModを含む、項目49記載のFcRn結合二量体。
[項目51]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
vii) YAK−[BM]−DPSQSSELLXcEAKKLNDSQAP:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフであり、ならびにXcは、A、SおよびCから選択される);ならびに
viii) vii)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目52]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
ix) FAK−[BM]−DPSQSSELLXcEAKKLSESQAP:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフであり、ならびにXcは、A、SおよびCから選択される);ならびに
x) ix)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、項目1〜50のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目53]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
xi) FNK−[BM]−DPSQSANLLXcEAKKLNDAQAP:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフであり、ならびにXcは、AおよびCから選択される);ならびに
xii) xi)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、項目1〜50のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目54]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLESSQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;および
ADAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである)
から選択される配列を含む、項目33記載のFcRn結合二量体。
[項目55]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
xiii) AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xiv) xiii)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目56]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号354〜357からなる群から選択される、例えば配列番号354および357から選択される配列xiii)を含む、項目55記載のFcRn結合二量体。
[項目57]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号357である配列xiii)を含む、項目56記載のFcRn結合二量体。
[項目58]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
xv) AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xvi) xv)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、項目1〜54のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目59]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号365〜367からなる群から選択される配列xv)を含む、項目58記載のFcRn結合二量体。
[項目60]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
xvii) VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xviii) xvii)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、項目1〜54のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目61]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号360〜364からなる群から選択される配列xvii)を含む、項目60記載のFcRn結合二量体。
[項目62]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
xix) AEAKYAK−[BM]−RQPESSELLSEAKKLSESQAPK:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xx) xix)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目63]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号359である配列xix)を含む、項目62記載のFcRn結合二量体。
[項目64]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが:
xxi) VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK:
(配列中、[BM]は、項目1〜29のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである);ならびに
xxii) xxi)に定義された配列と少なくとも94%の同一性を持つアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、項目1〜54のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目65]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜353からなる群、例えば配列番号17〜352からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目64記載のFcRn結合二量体。
[項目66]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜15、配列番号17〜140および配列番号353からなる群から選択される配列xxi)を含むか、または配列番号1〜2および配列番号17〜140からなる群、例えば配列番号17〜140からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目65記載のFcRn結合二量体。
[項目67]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜2、配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125および配列番号127〜140からなる群、例えば配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125および配列番号127〜140からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目66記載のFcRn結合二量体。
[項目68]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜8、配列番号13、配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73、配列番号75〜77および配列番号353からなる群、例えば配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73および配列番号75〜77からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目67記載のFcRn結合二量体。
[項目69]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73および配列番号75〜77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73および配列番号75〜77からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目66または68記載のFcRn結合二量体。
[項目70]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目69記載のFcRn結合二量体。
[項目71]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65および配列番号75からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65および配列番号75からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44および配列番号75からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目70記載のFcRn結合二量体。
[項目72]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号23および配列番号75からなる群、例えば配列番号23および配列番号75からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目71記載のFcRn結合二量体。
[項目73]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目71記載のFcRn結合二量体。
[項目74]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号23および配列番号44からなる群、例えば配列番号23および配列番号44からなる群から選択される配列xxi)を含む、項目71記載のFcRn結合二量体。
[項目75]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号44である配列xxi)を含む、項目73または74記載のFcRn結合二量体。
[項目76]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、項目55、56および62〜75のいずれか一項に定義された群から選択される配列に対応する、項目1〜13および15〜75のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目77]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75、配列番号354、配列番号357および配列番号360〜367からなる群、例えば配列番号20、配列番号41、配列番号44、配列番号360、配列番号362、配列番号363、配列番号365、配列番号366および配列番号367からなる群から選択される配列に対応している、項目76記載のFcRn結合二量体。
[項目78]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号1または配列番号357に対応している、項目77記載のFcRn結合二量体。
[項目79]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号20、配列番号360または配列番号365に対応している、項目77記載のFcRn結合二量体。
[項目80]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号41、配列番号362または配列番号366に対応している、項目77記載のFcRn結合二量体。
[項目81]
前記第一および第二の単量体単位の両方が、配列番号44、配列番号363または配列番号367に対応している、項目77記載のFcRn結合二量体。
[項目82]
前記リンカーが、可動性アミノ酸リンカー、剛性アミノ酸リンカーおよび切断可能なアミノ酸リンカーからなる群から選択される、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目83]
前記リンカーが、前記第一の単量体単位と前記第二の単量体単位の間に配置される、項目82記載のFcRn結合二量体。
[項目84]
前記リンカーが、グリシン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む可動性リンカーである、項目82または83記載のFcRn結合二量体。
[項目85]
前記リンカーが、
(GnSm)p および (SnGm)p
(式中、独立して、
n=1−7、
m=0〜7、
n+m≦8、および
p=1〜7である)
から選択される一般式を有する、請求項84記載のFcRn結合二量体。
[項目86]
n=1〜5である、請求項85記載のFcRn結合二量体。
[項目87]
m=0〜5である、請求項85〜86のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目88]
p=1〜5である、請求項85〜87のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目89]
n=4、m=1およびp=1〜4である、請求項86〜88のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目90]
前記リンカーが、(G4S)3である、請求項89記載のFcRn結合二量体。
[項目91]
前記リンカーが、G4Sである、項目89記載のFcRn結合二量体。
[項目92]
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも2倍、例えば少なくとも3倍、例えば少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも6倍、例えば少なくとも7倍、例えば少なくとも8倍、例えば少なくとも9倍、例えば少なくとも10倍、例えば少なくとも25倍、例えば少なくとも50倍、例えば少なくとも100倍より高い能力で、FcRnへ結合することが可能である、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目93]
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも2倍、例えば少なくとも3倍より高い能力で、pH6.0で、FcRnへ結合することが可能である、項目92記載のFcRn結合二量体。
[項目94]
対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも2倍、例えば少なくとも3倍、例えば少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも6倍、例えば少なくとも7倍、例えば少なくとも8倍、例えば少なくとも9倍、例えば少なくとも10倍より高い能力で、pH7.4で、FcRnへ結合することが可能である、項目92記載のFcRn結合二量体。
[項目95]
相互作用のKD値が、最大1×10-7M、例えば最大1×10-8M、例えば最大1×10-9M、例えば最大1×10-10M、例えば最大1×10-11M、例えば最大1×10-12Mであるように、pH6.0で、FcRnへ結合することが可能である、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目96]
FcRn結合ポリペプチドとFcRnの間のpH7.4での相互作用のKD値が、pH6.0での前記相互作用のKD値よりも高く、例えばpH6.0での前記相互作用のKD値よりも少なくとも2倍高く、例えば少なくとも5倍高く、例えば少なくとも10倍高く、例えば少なくとも50倍高く、例えば少なくとも100倍高い、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目97]
FcRn結合ポリペプチドとFcRnの間のpH7.4での相互作用のKD値が、少なくとも1×10-10M、例えば少なくとも1×10-9M、例えば少なくとも1×10-8M、例えば少なくとも1×10-7M、例えば少なくとも1×10-6M、例えば少なくとも1×10-5Mである、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目98]
前記pH7.4での相互作用のKD値が、pH6.0での前記相互作用のKD値と等しいかまたはより低い、項目1〜94のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目99]
前記pH7.4での相互作用のKD値が、最大1×10-7M、例えば最大1×10-8M、例えば最大1×10-9M、例えば最大1×10-10M、例えば最大1×10-11M、例えば最大1×10-12Mである、項目1〜94のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。
[項目100]
前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、C−末端および/またはN−末端に、少なくとも1個の追加のアミノ酸を含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
[項目101]
前記少なくとも1個の追加のアミノ酸伸長が、ポリペプチドの生成、精製、インビボまたはインビトロにおける安定化、カップリングおよび検出を改善または簡略化する、項目100記載のFcRn結合二量体。
[項目102]
融合タンパク質またはコンジュゲート体であって:
−先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体からなる第一の部分:および
−望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分:
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目103]
前記融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期が、それ自身望ましい生物活性を有するポリペプチドのインビボ半減期よりも長い、項目102記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目104]
前記望ましい生物活性が、治療的活性である、項目102〜103のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目105]
前記望ましい生物活性が、選択された標的への結合活性である、項目100〜102のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目106]
前記選択された標的が、アルブミンである、項目105記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目107]
前記アルブミン結合活性が、連鎖球菌のプロテインGのアルブミン結合ドメイン、またはそれらの誘導体により提供される、項目106記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目108]
前記アルブミン結合活性が、融合タンパク質またはコンジュゲート体のインビボ半減期を増加する、項目106〜107のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目109]
前記望ましい生物活性が、酵素活性である、項目103〜104のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目110]
望ましい生物活性を有する第二の部分が、治療活性ポリペプチドである、項目103〜105のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目111]
望ましい生物活性を有する第二部分が、酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカインおよびサイトカインからなる群から選択される、項目103〜105および109〜110のいずれか一項記載の融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目112]
IgGのFcRnへの結合を阻害する、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目113]
FcRn結合二量体のIgGのFcRnへの結合を遮断する能力が、対応する第一または第二の単量体単位単独の遮断能力と比べ、少なくとも2倍高い、例えば少なくとも3倍高い、例えば少なくとも4倍高い、例えば少なくとも5倍高い、例えば少なくとも10倍、例えば少なくとも15倍、例えば少なくとも20倍、例えば少なくとも25倍高いように、FcRnに結合する、項目112記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目114]
前記FcRn結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート体とFcRnの間の相互作用のKD値が、IgGとFcRnの間の相互作用のKD値よりも低い、項目112または113記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目115]
標識を更に含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目116]
前記標識が、蛍光色素および金属、色素体、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および放射性粒子からなる群から選択される、項目115記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目117]
FcRn結合ポリペプチドへ、システイン残基のチオール基またはリジン残基のアミン基を介してコンジュゲートされたポリアミノポリカルボン酸型キレート剤により提供されるキレート環境を含む、先行する項目のいずれかに記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目118]
ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸またはその誘導体である、項目117記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目119]
1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸誘導体が、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリス−酢酸−10−マレイミドエチルアセトアミドである、項目118記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目120]
ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、1,4,7−トリアザシクロノナン−1,4,7−トリ酢酸またはその誘導体である、項目117記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目121]
ポリアミノポリカルボン酸型キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸またはその誘導体である、項目117記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
[項目122]
項目1〜114のいずれか一項記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
[項目123]
項目122記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[項目124]
項目123記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[項目125]
ポリペプチドの生成方法であって:
−前記発現ベクターから前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、項目124記載の宿主細胞を培養する工程、および
−前記ポリペプチドを単離する工程、
を含む、項目1〜114のいずれか一項記載のポリペプチドの生成方法。
[項目126]
項目1〜121のいずれか一項記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体、および少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する、組成物。
[項目127]
少なくとも一種の追加の活性剤を更に含有する、項目126記載の組成物。
[項目128]
経口投与、鼻腔内投与、肺内投与、膣投与、直腸投与、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射および皮内注射からなる群から選択される経路による投与に適合される、項目126〜127のいずれか一項記載の組成物。
[項目129]
医薬品として使用するための、項目1〜121のいずれか一項記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体、または項目126〜128のいずれか一項記載の組成物。
[項目130]
前記医薬品が、自己免疫状態の治療または予防用である、項目129記載の使用のためのFcRn結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
[項目131]
前記医薬品が、同種免疫状態の治療または予防用である、項目129記載の使用のためのFcRn結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
[項目132]
前記医薬品が、てんかんおよび発作からなる群から選択される状態の治療または予防用である、項目129記載の使用のためのFcRn結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
[項目133]
項目1〜121のいずれか一項記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体、または項目126〜128のいずれか一項記載の組成物の治療的または予防的活性量を対象へ投与することを含む、それを必要とする対象の治療または予防の方法。
[項目134]
自己免疫状態の治療または予防のための、項目133記載の方法。
[項目135]
同種免疫状態の治療または予防のための、項目133記載の方法。
[項目136]
てんかんおよび発作からなる群から選択される状態の治療または予防のための、項目133記載の方法。
Claims (20)
- 第一の単量体単位、第二の単量体単位およびアミノ酸リンカーを含む、FcRn結合二量体であって、ここで前記第一および第二の単量体単位が各々、FcRn結合モチーフ(BM)を含み、このモチーフが、アミノ酸配列:
EX2X3X4AX6X7EIRWLPNLX16X17X18QRX21AFIX25X26LX28X29
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、A、E、F、G、H、I、K、Q、R、SおよびVから選択され;
X7は、A、F、H、K、N、Q、R、SおよびVから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;ならびに
X29は、DおよびRから選択される)
からなり、
且つここで前記FcRn結合二量体が、前記第一の単量体単位または前記第二の単量体単位単独と比べ、より高い結合能でFcRnへ結合する、前記FcRn結合二量体。 - 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つのBMが、
i) EX2X3X4AX6HEIRWLPNLTX17X18QRX21AFIX25KLX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、A、D、E、F、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X3は、A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X4は、A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X6は、A、G、K、R、SおよびVから選択され;
X17は、F、WおよびYから選択され;
X18は、A、D、EおよびNから選択され;
X21は、A、S、VおよびWから選択され;
X25は、D、G、H、K、L、N、R、VおよびWから選択され;
X28は、A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、T、WおよびYから選択される);ならびに
ii) i)に定義された配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列:
から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1記載のFcRn結合二量体。 - 前記第一および第二の単量体単位が、同一のBM配列を含む、請求項1又は2に記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位が、異なるBM配列を含む、請求項1又は2に記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜353からなる群、例えば配列番号17〜352からなる群、例えば配列番号17〜140からなる群、例えば配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125および配列番号127〜140からなる群、例えば配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73、配列番号75〜77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73および配列番号75〜77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44および配列番号75からなる群、例えば配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するFcRn結合モチーフBMを含む、請求項1〜4のいずれかに記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群、例えば配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65および配列番号75からなる群、例えば配列番号1、配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群、例えば配列番号44から選択される配列における位置8から位置36までの配列に対応するFcRn結合モチーフBMを含む、請求項5記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、
xi) AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
xv) AEAKFAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
xvii) VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
(配列中、[BM]は、請求項1〜2のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである)、ならびに
xi)、xv)またはxvii)により定義された配列と少なくとも94%の同一性を有するアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。 - 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号354〜357および配列番号360〜367からなる群、例えば配列番号357および配列番号360〜367からなる群から選択される配列xi)を含む、請求項7記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、
xxi) VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(配列中、[BM]は、請求項1〜2のいずれか一項に定義されたFcRn結合モチーフである)、ならびに
xxii) xxi)により定義された配列と少なくとも94%の同一性を有するアミノ酸配列:
からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のFcRn結合二量体。 - 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1〜353からなる群、例えば配列番号17〜352からなる群、例えば配列番号17〜140からなる群、例えば配列番号17〜92、配列番号94〜103、配列番号105〜125および配列番号127〜140からなる群、例えば配列番号19〜20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号70、配列番号73、配列番号75〜77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号28、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号73および配列番号75〜77からなる群、例えば配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群、例えば配列番号20、配列番号41、配列番号44および配列番号75からなる群、例えば配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群から選択される配列xxi)を含む、請求項9記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位の少なくとも一つが、配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65、配列番号75および配列番号77からなる群、例えば配列番号1、配列番号20、配列番号23、配列番号41、配列番号44、配列番号65および配列番号75からなる群、例えば配列番号1、配列番号20、配列番号41および配列番号44からなる群、例えば配列番号44から選択される配列xxi)を含む、請求項10記載のFcRn結合二量体。
- 前記第一および第二の単量体単位が、それぞれ、配列番号365および配列番号365;配列番号366および配列番号366;または、配列番号367および配列番号367を含む、請求項8記載のFcRn結合二量体。
- 前記リンカーが、
(GnSm)pおよび(SnGm)p
(式中、独立して、
n=1−7、
m=0〜7、
n+m≦8、および
p=1〜7である)
から選択される一般式を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のFcRn結合二量体。 - 対応する第一の単量体単位または第二の単量体単位単独よりも、少なくとも2倍、例えば少なくとも3倍、例えば少なくとも4倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも6倍、例えば少なくとも7倍、例えば少なくとも8倍、例えば少なくとも9倍、例えば少なくとも10倍、例えば少なくとも25倍、例えば少なくとも50倍、例えば少なくとも100倍より高い能力で、FcRnへ結合することが可能である、請求項1〜13のいずれか一項に記載のFcRn結合二量体。
- 融合タンパク質またはコンジュゲート体であって:
−先行する請求項のいずれかに記載のFcRn結合二量体からなる第一の部分:および
−望ましい生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分:
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート体。 - IgGのFcRnへの結合を阻害する、請求項1〜15のいずれか一項に記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
- FcRn結合二量体のIgGのFcRnへの結合を遮断する能力が、対応する第一または第二の単量体単位単独の遮断能力と比べ、少なくとも2倍高い、例えば少なくとも3倍高い、例えば少なくとも4倍高い、例えば少なくとも5倍高い、例えば少なくとも10倍、例えば少なくとも15倍、例えば少なくとも20倍、例えば少なくとも25倍高いように、FcRnに結合する、請求項16記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体。
- 請求項1〜17のいずれか一項記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質またはコンジュゲート体、および少なくとも一種の薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する、組成物。
- 医薬品として使用するための、請求項1〜17のいずれか一項記載のFcRn結合二量体、融合タンパク質もしくはコンジュゲート体、または請求項18記載の組成物。
- 前記医薬品が、自己免疫状態、同種免疫状態、てんかんおよび発作からなる群から選択される状態の治療または予防用である、請求項19記載の使用のためのFcRn結合二量体、融合タンパク質、コンジュゲート体または組成物。
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