KR20170054440A - 신규 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 신생아 Fc 수용체 FcRn에 대하여 결합 친화성을 가지는 조작된 폴리펩티드의 이량체에 관한 것이고, 제1 단량체 단위, 제2 단량체 단위 및 아미노산 링커를 포함하는 FcRn 결합 이량체로서, 여기서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 FcRn 결합 모티프를 포함하는 것인 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 상기 FcRn 결합 이량체는 상기 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독과 비교하였을 때, 더 높은 능력으로 FcRn에 결합한다. 본 개시내용은 또한 약동학적 및 약력학적 특성을 개질시키기 위한 작용제로서, 및 치료제로서의 상기 FcRn 결합 이량체의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 폴리펩티드{NEW POLYPEPTIDES}
본 발명의 기술분야
본 개시내용은 신생아 Fc 수용체 (이하에서, FcRn으로 지칭됨)에 대하여 결합 친화성을 가지는 조작된 폴리펩티드의 이량체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 생체분자, 예컨대, 제약의 약동학적 및 약력학적 성질을 개질시키는 작용제로서, 및 치료제로서의 상기 이량체의 용도에 관한 것이다.
배경
신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 막관통 MHC 클래스 I-유사 중쇄 (FcRn α-쇄) 및 β2-마이크로글로불린 경쇄로 이루어진 이종이량체 단백질이며, 후자는 또한 MHC 클래스 I 분자의 일부를 형성한다 (문헌 [Simister and Mostov (1989) Nature 337:184-7]; [Burmeister et al. (1994) Nature 372:379-83]).
FcRn은 주로 엔도좀 내에 위치하고, pH ≤ 6.5에서 면역글로불린 G (IgG) 및 혈청 알부민에 결합할 수 있고, pH ≥ 7.0에서 이들을 방출할 수 있다 (문헌 [Roopenian (2007) Nat Rev Immunol 7:715-25]에서 리뷰).
FcRn은 포유동물에서 수개의 별개의 역할을 수행한다 (문헌 [Roopenian, 상기 문헌 동일]). FcRn은 엔도시토시스된 IgG 및 혈청 알부민의 재순환에 관여하어, 리소좀에서의 그의 분해를 피하게 함으로써, 혈액에서 다른 혈청 단백질보다 더욱 긴 반감기 및 더 높은 이용가능성을 제공한다. IgG, 및 혈청 알부민 및 다른 혈청 단백질이 혈액과 접촉한 세포에 의해 수동적으로 피노시토시스되면, 형성된 엔도좀의 pH가 점진적으로 낮아지는데, 이는 IgG 및 혈청 알부민이 FcRn에 결합하도록 한다. 이어서, 수용체는, 수용체에 결합된 리간드와 함께, 재순환되는 엔도좀을 통해 혈장막으로 다시 수송된다. 혈장막으로 돌아간 후, pH는 결합된 리간드가 방출되는 기점인 7 초과로 증가된다.
FcRn은 또한 IgG를 장벽, 예컨대, 태반, 상기도 상피, 혈뇌장벽 및 소장 근위부를 가로질러 수송할 수 있는 능력에 대해서도 인지되고 있다.
포유동물에서, FcRn의 특성은 태반을 통해 모체로부터 태아로 IgG를 트랜스시토시스하고, 모유로부터의 IgG를 유아의 소장 근위부 내의 혈류로 트랜스시토시스하는 데 이용된다.
FcRn의 발현 패턴은 종 간에 상이하다. 그러나, FcRn은 대부분의 종에서 혈뇌 장벽, 상기도 상피, 신장 및 혈관 내피 내의 세포 및 항원 제시 세포 및 다른 조혈 기원 세포에서 광범위하게 발현된다 (문헌 [Roopenian (2007), 상기 문헌 동일]).
내인성 IgG와 FcRn 사이의 결합을 억제시키기 위한 목적으로 FcRn (문헌 [Liu et al. (2007) J Immunol 179:2999-3011], [Mezo et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105:2337-42]) 및 β2-마이크로글로불린 (문헌 [Getman and Balthasar (2005) J Pharm Sci 94:718-29])에 대해 친화성을 가지는 항체 및 펩티드가 개발되어 왔다. 또 다른 접근법은 FcRn에 대한 더 높은 친화성을 가지도록 하기 위해 IgG의 Fc 영역을 돌연변이화시켰다 (문헌 [Petkova et al. (2006) Int Immunol 18:1759-69], [Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23:1283-8]).
Fc 도메인 또는 알부민에의 융합은 단백질의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 널리 사용되던 전략법이다. 그러나, 이러한 융합 단백질의 큰 크기는 조직 투과에 부정적인 영향을 미치고, 융합 파트너에 대한 특이성을 감소시킨다 (문헌 [Valles et al. (2011) J Interferon Cytokine Res 32:178-184]). 다른 한편으로는, 반감기를 연장시키기 위해 비인간 영장류에게 투여되는 항체의 Fc 단편에서 돌연변이화가 이루어져 왔다 (문헌 [Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279:6213-6]). 그러나, 이러한 접근법은 단지 치료용 항체에서의 사용으로만 제한되며, 해당 단백질이, 또한, 큰 크기의 분자를 야기하는, Fc 단편에 융합되어 있지 않는 한, 다른 치료용 단백질로 확대하여 추정될 수 없다. 예컨대, PEG화 및 IgG의 Fc 도메인 또는 알부민과 단백질의 유전적 융합과 같은 다수의 화학적 및 재조합 방법이 단백질 반감기를 개선시키기 위해 고안되어 왔다 (문헌 [Schellenberger et al. (2009) Nat Biotechnol 21:1186-1190]에서 리뷰). 단백질의 PEG화는 단백질의 효능을 감소시키고, 단백질에게 면역반응성을 부여하는 것으로 보고되어 왔다.
Fc-융합 단백질은 또한 FcRn에 의해 매개되는 경구 및 폐 전달을 위해 사용되어 왔지만 (문헌 [Low et al., (2005) Human reproduction Jul;20(7):1805-13]), 융합 분자의 크기로 인한 조직 투과 및 특이성 감소에 관한 유사 문제점들이 여전히 남아있다.
따라서, 본 분야에서는 FcRn에 대해 높은 친화성을 가지는 분자를 지속적으로 제공하는 것이 크게 요구되고 있다. 특히, 융합 파트너로서 존재할 때, 이들이 융합되는 분자의 특성에 부정적인 영향을 미치지 않고, 면역반응성을 기여하지 않는 작은 결합 분자가 요구된다.
본 발명의 요약
본 개시내용은 이량체 형태의 FcRn 결합 폴리펩티드가 단량체 형태의 상응하는 FcRn 결합 폴리펩티드에 비하여 유의적으로 개선된 FcRn 결합 특성을 나타낸다는 예상 밖의 깨달음에 기초한 것이다. 본 발명자들은 이량체 형태의 상기 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합 특성의 개선이 단순히 두 FcRn 결합 폴리펩티드의 융합으로 예상되는 것보다 더 크다는 것을 발견하게 되었다.
따라서, 본 개시내용의 목적은 신규한 FcRn 결합인자를 제공하는 것이다.
본 개시내용의 목적은 또한 생체분자, 예컨대, 제약의 약동학적 및/또는 약력학적 성질을 개질시키는 데 사용하기 위한 상기 작용제를 제공하는 것이다.
본 개시내용의 목적은 또한 그들 자체 단독으로, 또는 조합 치료에서 치료제로서 사용하기 위한 상기 작용제를 제공하는 것이다.
본 개시내용의 목적은 현행 요법의 상기에서 언급된 단점 및 다른 단점들을 완화시키면서, FcRn의 효율적인 표적화가 이루어질 수 있도록 하는 분자를 제공하는 것이다.
당업자에게 명백한, 본 개시내용으로부터의 상기 목적 및 다른 목적들은 첨부된 청구범위에서 주장하고, 본원에 일반적으로 개시된 본 발명의 상이한 측면들에 의해 충족된다.
따라서, 본 개시내용의 제1 측면에서, 이량체 형태의 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 결합 폴리펩티드, 즉, 제1 단량체 단위, 제2 단량체 단위 및 아미노산 링커를 포함하는 "FcRn 결합 이량체"로서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 FcRn 결합 모티프 (BM)를 포함하고, 상기 모티프는 하기 아미노산 서열로 이루어진 것인 것이고,
여기서, 상기 FcRn 결합 이량체는 상기 제1 단량체 단위 또는 상기 제2 단량체 단위 단독과 비교하였을 때, 더 높은 결합능으로 FcRn에 결합하는 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다:
EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16 X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X7은 A, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X29는 D 및 R로부터 선택된다.
한 부류의 FcRn 결합 모티프 관련 서열에 관한 상기의 정의는 수개의 상이한 선택 실험에서 FcRn과 그의 상호작용에 대하여 선택되었던 모체 스캐폴드의 다수의 무작위 폴리펩티드 단량체 변이체의 통계학적 분석에 기초한다. 확인된 FcRn 결합 모티프, 또는 "BM"은 모체 스캐폴드의 표적 결합 영역에 상응하며, 이 영역은 3개의 나선 다발 단백질 도메인 내의 2개의 알파 나선을 구성한다. 모체 스캐폴드에서, 2개의 BM 나선의 다양화된 아미노산 잔기가 항체의 불변 Fc 부위와의 상호작용을 위한 결합 표면을 구성한다. 본 개시내용에서, 결합 표면 잔기의 무작위 변이 및 후속되는 변이체 선택은 Fc와 상호작용하는 능력을 FcRn과 상호작용하기 위한 능력으로 대체한다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 FcRn 결합 모티프는 하기 아미노산 서열로 이루어진다:
EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X7은 A, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택된다.
본 개시내용의 제1 측면의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 상기 결합 모티프는 하기 아미노산 서열로 이루어진다:
EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, E, F, G, H, I, K, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
X7은 A, F, H, K, N, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X29는 D 및 R로부터 선택된다.
제1 측면의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 상기 결합 모티프는 상기 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, E, F, G, H, I, K, Q, R 및 S로부터 선택되고;
X7은 A, F, H, K, N, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F 및 Y로부터 선택되고;
X18은 D이고;
X21은 V이고;
X25는 D, E, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 W로부터 선택되고;
X29는 D 및 R로부터 선택된다.
제1 측면의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 상기 BM은
i) EX2 X3 X4 AX6 HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, G, K, R, S 및 V로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 D, G, H, K, L, N, R, V 및 W로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택되는 것; 및
ii) 상기 서열과 96% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
상기 측면의 추가의 또 다른 실시양태에서, 서열 i)의 상기 BM은
EX2 X3 X4 AX6 HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, N, Q, R, S 및 W로부터 선택되고;
X3은 D, E, G, H, K, M, N, Q, S 및 T로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, G, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, G, S 및 V로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 D, G, H, K, L, N, R 및 V부터 선택되고;
X28은 A, E, H, L, N, Q, R, S, T, W 및 Y부터 선택되는 것으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 개시내용의 이량체의 FcRn 결합능을 비롯한, 임의의 폴리펩티드의 기능은 폴리펩티드의 3차 구조에 의존한다. 그러므로, 폴리펩티드의 기능에는 영향을 주지 않으면서, 폴리펩티드 중의 아미노산 서열을 최소로 변이시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 개시내용은 FcRn 결합 이량체의 변이체, 예를 들어, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 변형되었지만, FcRn 결합 특징은 유지하는 것인 변이체를 포함한다.
그러므로, 상기 기술된 바와 같이, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 i)에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드와 96% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 FcRn 결합 모티프 (BM)를 포함하는 것인 FcRn 결합 이량체 또한 본 개시내용에 포함된다.
일부 실시양태에서, 상기와 같은 변이는 본원에 개시된 바와 같은 BM의 서열의 모든 위치에서 이루어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기와 같은 변이는 스캐폴드 아미노산 잔기로도 또한 나타낸 비가변 위치에서만 오직 이루어질 수 있다. 상기 경우에, 변이는 가변 위치, 즉, 서열 i) 내 "X"로 나타낸 위치에서는 허용되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 특정 기능 군 (예컨대, 소수성, 친수성, 극성 등)에 속하는 아미노산 잔기는 동일한 기능 군으로부터의 또 다른 아미노산 잔기 대신으로 교체될 수 있다.
본 명세서 전역에 걸쳐 사용되는 바, "동일성(%)"이라는 용어는 예를 들어, 하기와 같이 계산될 수 있다. CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 표적 서열에 대해 질의 서열을 정렬한다 (문헌 [Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Research 22:4673-4680]). 정렬된 서열 중 가장 짧은 서열에 상응하는 윈도우에 걸쳐 비교가 이루어진다. 일부 경우에서, 정렬된 서열 중 가장 짧은 서열이 표적 서열일 수 있다. 다른 경우에서, 질의 서열은 정렬된 서열 중 가장 짧은 서열로 구성될 수 있다. 각 위치의 아미노산 잔기를 비교하고, 표적 서열에서 동일하게 상응하는 질의 서열 중의 위치의 백분율(%)을 동일성(%)으로서 기록한다.
본원에서 사용되는 바, "Xn" 및 "Xm"은 상기 정의된 바와 같은 BM의 서열에서 n 및 m번째 위치의 아미노산을 나타내는 데 사용되며, 여기서, n 및 m은 상기 서열의 N 말단 단부로부터 계수되는, 상기 서열 내의 아미노산의 위치를 나타내는 정수이다. 예를 들어, X3 및 X7은 각각 상기 BM의 N 말단 단부로부터 3번 및 7번 위치의 아미노산을 나타낸다.
제1 측면에 따른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 FcRn 결합 모티프를 포함하고, 여기서, Xn은 독립적으로 하기 표 1에 따른 가능한 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 당업자는 Xn이 열거된 가능한 잔기 군들 중 어느 하나로부터 선택될 수 있고, 이러한 선택은 Xm에서의 아미노산 선택과는 독립적이며, 여기서, n≠m이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 표 1에서 위치 Xn에서의 열거된 가능한 잔기 중 임의의 것은 표 1에서 임의의 다른 가변 위치의 본원에 개시된 가능한 잔기 중 임의의 것과 독립적으로 조합될 수 있다.
표 1은 하기와 같이 판독되어야 한다는 것을 당업자는 이해할 것이다: 제1 측면에 따른 한 실시양태에서, 상기 제1 단량체 단위 및 상기 제2 단량체 단위가 각각 FcRn 결합 모티프 (BM)를 포함하고, 여기서, 상기 제1 단량체 단위 및 상기 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 BM에서 아미노산 잔기 "Xn"은 "가능한 잔기"로부터 선택되는 것인 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 제1 단량체 단위의 BM에서 아미노산 잔기 "Xn"은 제2 단량체 단위의 BM에서 아미노산 잔기 "Xn"과는 독립적으로 선택되다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 표 1은 본 개시내용의 제1 단량체 단위 및 제2 단량체 단위의 수개의 구체적이고, 개별화된 변이체를 개시한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 제1 또는 제2 단량체 단위 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서, BM에서 X2는 A, I, L, N, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되는 것인 FcRn 결합 이량체를 제공하고, 또 다른 실시양태에서, 제1 또는 제2 단량체 단위 중 적어도 하나를 포함하고, 여기서, BM에서 X2는 A, I, L 및 Q로부터 선택되는 것인 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 의심의 여지를 없애기 위하여, 상기 제1 및 제2 단량체 단위는 다른 실시양태에서 자유롭게 조합될 수 있다. 예를 들어, 상기의 한 실시양태에서, X3은 A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고, 동시에, X7은 A 및 H로부터 선택되고, X25는 H, L, R, V 및 W로부터 선택된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 X6X7이 AH 및 GH로부터 선택되는 것인 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, X6X7은 AH이다. 한 실시양태에서, X6X7은 GH이다. 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 X17X18은 FD 및 YD로부터 선택된다. 한 실시양태에서, X17X18은 FD이다.
FcRn 결합 이량체의 하위부류를 정의하는 더욱 구체적인 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 BM의 서열은 하기 6개의 조건 I-VI 중 3개 이상을 충족시킨다:
I. X6은 A, G, K 및 S로부터 선택되고, 예컨대, 특히, A이고;
II. X7은 H이고;
III. X17은 F 및 Y로부터 선택되고, 예컨대, 특히, F이고;
IV. X18은 D이고;
V. X21은 V 및 W로부터 선택되고, 예컨대, 특히, V이고;
VI. X25는 H 및 R로부터 선택되고, 예컨대, 특히, H이다.
제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체의 일부 예에서, 상기 서열은 6개의 조건 I-VI 중 4개 이상을 충족시킨다. 더욱 구체적으로, 서열은 6개의 조건 I-VI 중 5개 이상, 예컨대, 6개의 조건 I-VI 모두를 충족시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위의 BM 서열은 동일한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위의 BM 서열은 상이한 것이다.
하기 실험 섹션에서 상세하게 기술되는 바와 같이, FcRn 결합 폴리펩티드 단량체 단위 선별을 통해 다수의 개별 FcRn 결합 모티프 (BM) 서열을 확인할 수 있었다. 이들 서열이 본원에 개시된 제1 및 제2 단량체 단위로서 유용한 개별 변이체를 구성한다. 개별 FcRn 결합 모티프 (BM)의 서열은 도 1에 제시되어 있고, 서열번호 1-353으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 그러므로, 제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 서열번호 1-353으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예컨대, 17-352로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 BM 서열은 서열번호 1-15, 서열번호 17-140 및 서열번호 353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1-2 및 서열번호 17-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1-2, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1-8, 서열번호 13, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20 및 서열번호 41로 이루어진 군; 서열번호 20 및 서열번호 44로 이루어진 군; 또는 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 23 또는 서열번호 44 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 20 또는 서열번호 41 또는 서열번호 44 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다.
본원에 개시된 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 상기 정의된 군 중 하나로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진다. 한 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 서열번호 1 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 BM은 서열번호 20 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BM은 서열번호 23 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BM은 서열번호 41 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BM은 서열번호 44 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응한다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 BM은 3 나선 다발 단백질 도메인"의 일부를 형성한다." BM의 서열은 BM이 원래의 도메인에서 유사한 구조적 모티브를 대체하도록, 원래의 3 나선 다발 도메인의 서열에 "삽입"되거나 "이식"된다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 이론에 의해 제한받지 않고자 하면서, BM은 3 나선 다발의 3개의 나선 중 2개를 구성하는 것으로 간주되며, 따라서, 임의의 3 나선 다발 내에서 상기 2 나선 모티브를 대체할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 2개의 BM 나선에 의한 3 나선 다발 도메인 중 2개의 나선 대체는 폴리펩티드의 기본 구조에 영향을 주지 않도록 수행되어야 한다. 즉, 본 발명의 상기 실시양태에 따른 폴리펩티드의 Cα 백본의 전체 폴딩은, 예컨대, 2차 구조의 동일한 요소를 동일한 순서로 가지는 것 등과 같이, 일부를 형성하는 3 나선 다발 단백질 도메인의 것과 실질적으로 동일하다. 따라서, 본 측면의 상기 실시양태에 따른 폴리펩티드가 원래의 도메인과 동일한 폴드를 가지는 경우, 본 개시내용에 따른 BM은 3 나선 다발 도메인의 "일부를 형성"하고, 이는 예컨대, 유사한 CD 스펙트럼을 초래하는 특성과 같은 기본 구조적 특성을 공유한다는 것을 암시한다. 당업자는 관련된 다른 파라미터를 알고 있다.
특정 실시양태에서, 따라서, 상기 제1 및 제2 단량체 중 적어도 하나에서 FcRn 결합 모티프 (BM)는 3 나선 다발 도메인의 일부를 형성한다. 예를 들어, BM은 본질적으로 상기 3 나선 다발 단백질 도메인 내에 서로 연결하는 루프와 함께 2개의 알파 나선을 구성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 3 나선 다발 단백질 도메인은 박테리아 수용체 단백질의 도메인으로부터 선택된다. 상기 도메인의 비제한적인 예로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 5가지의 상이한 3 나선 도메인, 예컨대, 도메인 B 및 그의 유도체가 있다. 일부 실시양태에서, 3 나선 다발 단백질 도메인은 스타필로코쿠스 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된 단백질 Z의 변이체이다.
본원에 개시된 FcRn 결합 모티프가 3 나선 다발 단백질 도메인의 일부를 형성하는 것인 실시양태에서, FcRn 결합 이량체의 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 결합 모듈 (BMod)을 포함할 수 있고, 상기 모듈은 하기의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다:
iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ;
상기 식에서,
[BM]은 본원에서 정의된 FcRn 결합 모티프이되, 단, X29는 D이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 E, N 및 S로부터 선택되고;
Xe는 D, E 및 S로부터 선택되고;
Xf는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및
iv) iii)에 의해 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
본원에 개시된 FcRn 결합 모티프가 3 나선 다발 단백질 도메인의 일부를 형성하는 것인 실시양태에서, FcRn 결합 이량체의 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 결합 모듈 (BMod)을 포함할 수 있고, 상기 모듈은 하기의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다:
v) K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ;
상기 식에서,
[BM]은 본원에서 정의된 FcRn 결합 모티프이되, 단, X29는 R이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 E, N 및 S로부터 선택되고;
Xe는 D, E 및 S로부터 선택되고;
Xf는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및
vi) v)에 의해 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
상기 논의된 바와 같이, 상기 아미노산 서열과 비교하여, 폴리펩티드의 3차 구조 및 기능에 크게 영향을 미치지 않는 최소의 변이를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 서열 iv) 또는 서열 vi)은 각각 iii) 및 v)에서 정의된 서열과 95% 이상, 예컨대, 97% 이상의 동일성을 가진다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xa는 A인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 대안적 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xa는 A이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xa는 A이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xa는 S이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xb는 N인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xb는 E이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xc는 A인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xc는 S이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xc는 C이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xd는 E인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xd는 N이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xd는 S이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xe는 D인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xe는 E이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xe는 S이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, XdXe는 EE, ES, SD, SE 및 SS로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 XdXe는 ES이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 XdXe는 SE이다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 XdXe는 SD이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xf는 A인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열 iii) 또는 v)를 포함하고, 여기서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고, Xf는 A인 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고; XdXe는 ND이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고; XdXe는 ND이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고; XdXe는 ND이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고; XdXe는 ND이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고; XdXe는 ND이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고; XdXe는 SE이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고; XdXe는 SE이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고; XdXe는 SE이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고; XdXe는 SE이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고; XdXe는 SE이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고; XdXe는 SE이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고; XdXe는 ES이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고; XdXe는 ES이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고; XdXe는 ES이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고; XdXe는 ES이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 A이고; XdXe는 SD이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 A이고; XdXe는 SD이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 A이고; Xb는 N이고; Xc는 C이고; XdXe는 SD이고, Xf는 A이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 S이고; XdXe는 SD이고, Xf는 S이다.
한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, Xa는 S이고; Xb는 E이고; Xc는 C이고; XdXe는 SD이고, Xf는 S이다.
제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 서열번호 1-353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는, 서열 iii)에 따른 BMod를 포함한다. 그러므로, 제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 서열번호 1-353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-352 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1-15, 서열번호 17-140, 서열번호 353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1-2, 서열번호 17-140, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1-2, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125, 서열번호 127-140, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125, 서열번호 127-140 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1-8, 서열번호 13, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77, 서열번호 353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73, 서열번호 75-77, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 75 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 23 서열번호 75, 서열번호 358, 서열번호 361 및 서열번호 364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 75, 서열번호 361 및 서열번호 364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다.
한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 360, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 360 및 서열번호 362로 이루어진 군; 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 360 및 서열번호 363으로 이루어진 군; 또는 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다.
한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 358, 서열번호 361 및 서열번호 363으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 361 및 서열번호 363으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 1 또는 서열번호 23 또는 서열번호 44 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 20 또는 서열번호 41 또는 서열번호 44 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 360 또는 서열번호 362 또는 서열번호 363 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다.
본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두 상기 군 중 하나로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 75 및 서열번호 360-364로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 360-364로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 360, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 360, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진다. 한 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두 서열번호 1 또는 서열번호 358 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 20 또는 서열번호 360 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 23 또는 서열번호 361 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 41 또는 서열번호 362 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 44 또는 서열번호 363 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 상기 BMod는 서열번호 75 또는 서열번호 364 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응한다.
또한, 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
vii) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
여기서, [BM]은 상기에서 정의된 FcRn 결합 모티프이고, Xc는 A, S 및 C로부터 선택되는 것; 및
viii) vii)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 이량체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
ix) FAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL SESQA P;
여기서, [BM]은 상기에서 정의된 FcRn 결합 모티프이고, Xc는 A, S 및 C로부터 선택되는 것; 및
x) ix)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 이량체를 제공한다.
한 실시양태에서, ix)에 의해 정의되는 서열 중 Xc는 S이다.
대안적으로, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xi) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
여기서, [BM]은 상기에서 정의된 FcRn 결합 모티프이고, Xc는 A 및 C로부터 선택되는 것; 및
xii) xi)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 이량체를 제공한다.
상기 논의된 바와 같이, 상기 아미노산 서열과 비교하여, 폴리펩티드의 3차 구조 및 기능에 크게 영향을 미치지 않는 최소의 변이를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 정의된 FcRn 결합 이량체는 각각 vii), ix) 또는 xi)에서 정의된 서열과 97% 이상, 예컨대, 98% 이상 동일한 서열 viii), x) 또는 xii)를 포함할 수 있다.
FcRn 결합 이량체의 일부 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 모티프이다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체의 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
xiii) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 모티프이다); 및
xiv) xiii)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
한 실시양태에서, 서열 xiii)은 서열번호 354-357로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예컨대, 특히, 서열번호 354 및 357로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두 서열번호 354-357로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예컨대, 특히, 서열번호 354 및 357로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xiii)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xiii)은 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두에서 서열번호 354이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xiii)은 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두에서 서열번호 357이다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체 중 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
xv) AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 모티프이다); 및
xvi) xv)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
한 실시양태에서, 서열 xv)는 서열번호 365-367로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xv)는 서열번호 365, 서열번호 366 또는 서열번호 367이다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체의 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
xvii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 모티프이다); 및
xviii) xvii)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
한 실시양태에서, 서열 xvii)은 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xvii)은 서열번호 360, 서열번호 361. 서열번호 362, 서열번호 363 또는 서열번호 364이다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체의 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
xix) AEAKYAK-[BM]-RQPESSELLSEAKKLSESQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 모티프이다); 및
xx) xix)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
한 실시양태에서, 서열 xix)는 서열번호 359이다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체의 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 하기로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
xxi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 바와 같은 FcRn 결합 모티프이다); 및
xxii) xxi)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.
이 또한 다시, 상기 아미노산 서열과 비교하여, 폴리펩티드의 3차 구조 및 기능에 크게 영향을 미치지 않는 최소의 변이를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 정의된 FcRn 결합 이량체는 각각 xiii), xv), xvii), xix) 또는 xxi)에 의해 정의된 서열과 96% 이상, 예컨대, 98% 이상 동일한 서열 xiv), xvi), xviii), xx) 또는 xxii)를 포함할 수 있다.
제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나는 서열번호 1-353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-352로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1-15, 서열번호 17-140 및 서열번호 353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1-2 및 서열번호 17-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1-2, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1-8, 서열번호 13, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xiii)은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20 및 서열번호 41로 이루어진 군; 서열번호 20 및 서열번호 44로 이루어진 군; 또는 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 1이거나, 또는 서열번호 20이거나, 또는 서열번호 23이거나, 또는 서열번호 41이거나, 또는 서열번호 44이다.
본원에 개시된 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 상기 정의된 군 중 하나로부터 선택되는 서열 xxi) 또는 xiii)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 354 및 서열번호 357로 이루어지거나, 예컨대, 군은 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 354 및 서열번호 357로 이루어지거나, 예컨대, 군은 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어지거나, 또는 군은 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 354 및 서열번호 357로 이루어진다.
본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 상기 정의된 군 중 하나로부터 선택되는 서열 xiii), xv), xvii), xix) 또는 xxi)을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 군은 서열번호 1, 서열번호 20; 서열번호 23, 서열번호 41; 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 354, 서열번호 357 및 서열번호 360-367로 이루어지거나, 또는 예컨대, 군은 서열번호 20; 서열번호 23, 서열번호 41; 서열번호 44, 서열번호 75, 서열번호 357 및 서열번호 360-367로 이루어지거나, 또는 예컨대, 군은 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 357, 서열번호 360, 서열번호 362, 서열번호 363, 서열번호 365, 서열번호 366 및 서열번호 367로 이루어지거나, 또는 예컨대, 군은 서열번호 357, 서열번호 360, 서열번호 362, 서열번호 363, 서열번호 365, 서열번호 366 및 서열번호 367로 이루어진다. 한 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함한다. 한 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 서열번호 1에 상응하는 서열 xxi)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 20이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 23이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 41이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 44이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xxi)은 서열번호 75이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 서열번호 354에 상응하는 서열 xiii)을 포함한다.
한 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 서열번호 360에 상응하는 서열 xix)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xix)는 서열번호 361이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xix)는 서열번호 362이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xix)는 서열번호 363이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xix)는 서열번호 364이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 둘 모두 서열번호 365에 상응하는 서열 xv)를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xv)는 서열번호 366이다. 한 실시양태에서, 상기 서열 xv)는 서열번호 367이다.
FcRn 결합 이량체의 구체적인 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 1; 서열번호 1 및 서열번호 23; 서열번호 1 및 서열번호 44; 서열번호 1 및 서열번호 65; 서열번호 1 및 서열번호 75; 서열번호 1 및 서열번호 354; 서열번호 1 및 서열번호 357; 서열번호 23 및 서열번호 23; 서열번호 23 및 서열번호 44; 서열번호 23 및 서열번호 65; 서열번호 23 및 서열번호 75; 서열번호 23 및 서열번호 354; 서열번호 23 및 서열번호 357; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 44 및 서열번호 65; 서열번호 44 및 서열번호 75; 서열번호 44 및 서열번호 354; 서열번호 44 및 서열번호 357; 서열번호 65 및 서열번호 65; 서열번호 65 및 서열번호 75; 서열번호 65 및 서열번호 354; 서열번호 65 및 서열번호 357; 서열번호 75 및 서열번호 354; 서열번호 75 및 서열번호 357; 서열번호 354 및 서열번호 354; 서열번호 354 및 서열번호 357; 또는 서열번호 357 및 서열번호 357을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 1; 서열번호 1 및 서열번호 23; 서열번호 1 및 서열번호 44; 서열번호 1 및 서열번호 354; 서열번호 1 및 서열번호 357; 서열번호 23 및 서열번호 23; 서열번호 23 및 서열번호 44; 서열번호 23 및 서열번호 354; 서열번호 23 및 서열번호 357; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 44 및 서열번호 354; 서열번호 44 및 서열번호 357; 서열번호 354 및 서열번호 354; 서열번호 354 및 서열번호 357; 또는 서열번호 357 및 서열번호 357을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 1; 서열번호 23 및 서열번호 23; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 354 및 서열번호 354; 또는 서열번호 357 및 서열번호 357을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 44 및 서열번호 44; 또는 서열번호 357 및 서열번호 357을 포함한다.
FcRn 결합 이량체의 구체적인 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 1; 서열번호 1 및 서열번호 20; 서열번호 1 및 서열번호 23; 서열번호 1 및 서열번호 41; 서열번호 1 및 서열번호 44; 서열번호 1 및 서열번호 65; 서열번호 1 및 서열번호 75; 서열번호 1 및 서열번호 354; 서열번호 1 및 서열번호 357; 서열번호 1 및 서열번호 365; 서열번호 1 및 서열번호 366; 서열번호 1 및 서열번호 367; 서열번호 20 및 서열번호 20; 서열번호 20 및 서열번호 23; 서열번호 20 및 서열번호 41; 서열번호 20 및 서열번호 44; 서열번호 20 및 서열번호 357; 서열번호 20 및 서열번호 365; 서열번호 20 및 서열번호 366; 서열번호 20 및 서열번호 367; 서열번호 23 및 서열번호 23; 서열번호 23 및 서열번호 41; 서열번호 23 및 서열번호 44; 서열번호 23 및 서열번호 65; 서열번호 23 및 서열번호 75; 서열번호 23 및 서열번호 354; 서열번호 23 및 서열번호 357; 서열번호 23 및 서열번호 365; 서열번호 23 및 서열번호 366; 서열번호 23 및 서열번호 367; 서열번호 41 및 서열번호 41; 서열번호 41 및 서열번호 44; 서열번호 41 및 서열번호 357; 서열번호 41 및 서열번호 365; 서열번호 41 및 서열번호 366; 서열번호 41 및 서열번호 367; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 44 및 서열번호 65; 서열번호 44 및 서열번호 75; 서열번호 44 및 서열번호 354; 서열번호 44 및 서열번호 357; 서열번호 44 및 서열번호 365; 서열번호 44 및 서열번호 366; 서열번호 44 및 서열번호 367; 서열번호 65 및 서열번호 65; 서열번호 65 및 서열번호 75; 서열번호 65 및 서열번호 354; 서열번호 65 및 서열번호 357; 서열번호 75 및 서열번호 354; 서열번호 75 및 서열번호 357; 서열번호 354 및 서열번호 354; 서열번호 354 및 서열번호 357; 서열번호 357 및 서열번호 357; 서열번호 357 및 서열번호 365; 서열번호 357 및 서열번호 366; 서열번호 357 및 서열번호 367; 서열번호 365 및 서열번호 365; 서열번호 365 및 서열번호 366; 서열번호 365 및 서열번호 367; 서열번호 366 및 서열번호 366; 서열번호 366 및 서열번호 367; 또는 서열번호 367 및 서열번호 367을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 1; 서열번호 1 및 서열번호 20; 서열번호 1 및 서열번호 23; 서열번호 1 및 서열번호 41; 서열번호 1 및 서열번호 44; 서열번호 1 및 서열번호 354; 서열번호 1 및 서열번호 357; 서열번호 1 및 서열번호 365; 서열번호 1 및 서열번호 366; 서열번호 1 및 서열번호 367; 서열번호 20 및 서열번호 20; 서열번호 20 및 서열번호 23; 서열번호 20 및 서열번호 41; 서열번호 20 및 서열번호 44; 서열번호 20 및 서열번호 357; 서열번호 20 및 서열번호 365; 서열번호 20 및 서열번호 366; 서열번호 20 및 서열번호 367; 서열번호 23 및 서열번호 23; 서열번호 23 및 서열번호 41; 서열번호 23 및 서열번호 44; 서열번호 23 및 서열번호 354; 서열번호 23 및 서열번호 357; 서열번호 23 및 서열번호 365; 서열번호 23 및 서열번호 366; 서열번호 23 및 서열번호 367; 서열번호 41 및 서열번호 41; 서열번호 41 및 서열번호 44; 서열번호 41 및 서열번호 357; 서열번호 41 및 서열번호 365; 서열번호 41 및 서열번호 366; 서열번호 41 및 서열번호 367; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 44 및 서열번호 354; 서열번호 44 및 서열번호 357; 서열번호 44 및 서열번호 365; 서열번호 44 및 서열번호 366; 서열번호 44 및 서열번호 367; 서열번호 354 및 서열번호 354; 서열번호 354 및 서열번호 357; 서열번호 357 및 서열번호 357; 서열번호 357 및 서열번호 365; 서열번호 357 및 서열번호 366; 서열번호 357 및 서열번호 367; 서열번호 365 및 서열번호 365; 서열번호 365 및 서열번호 366; 서열번호 365 및 서열번호 367; 서열번호 366 및 서열번호 366; 서열번호 366 및 서열번호 367; 또는 서열번호 367 및 서열번호 367을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 1 및 서열번호 1; 서열번호 20 및 서열번호 20; 서열번호 23 및 서열번호 23; 서열번호 41 및 서열번호 41; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 354 및 서열번호 354; 서열번호 357 및 서열번호 357; 서열번호 365 및 서열번호 365; 서열번호 366 및 서열번호 366; 또는 서열번호 367 및 서열번호 367을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 20 및 서열번호 20; 서열번호 41 및 서열번호 41; 서열번호 44 및 서열번호 44; 서열번호 357 및 서열번호 357; 서열번호 365 및 서열번호 365; 서열번호 366 및 서열번호 366; 또는 서열번호 367 및 서열번호 367을 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 서열번호 365 및 서열번호 365; 서열번호 366 및 서열번호 366; 또는 서열번호 367 및 서열번호 367을 포함한다.
명확하게 하기 위해, 본 개시내용의 전역에 걸쳐 사용되는 바, 제1 및 제2 단량체 단위로 지정하는 것은 그들 간의 명확하게 하기 위한 이유로 이루지는 것이며, 이는 FcRn 결합 이량체의 폴리펩티드 쇄에서의 상기 단량체 단위의 실제 순서를 의미하고자 하는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 상기 제1 단량체 단위는 상기 제2 단량체 단위와 관련하여 폴리펩티드 쇄에서 N-말단에 또는 C-말단에 출현할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 융합 단백질 구축은 대개 융합시키고자 하는 기능성 모이어티 사이에 링커를 사용하는 것을 포함한다. 다른 특성을 가진 다른 종류의 링커, 예컨대, 가요성 아미노산 링커, 강성 아미노산 링커 및 절단가능한 아미노산 링커가 존재한다는 것을 당업자는 알고 있다. 링커는 예를 들어, 안정성을 증가시키기 위해, 또는 융합 단백질의 폴딩을 개선시키는 데, 융합 단백질의 발현을 증가시키고, 그의 생물학적 활성을 개선시키고, 그의 표적화를 가능하게 하고, 그의 약동학적 성질을 변경시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 제1 측면의 한 실시양태에서, 상기 링커가 가용성 아미노산 링커, 강성 아미노산 링커 및 절단가능한 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 정의된 바와 같은 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 본원에 정의된 바와 같은 FcRn 결합 이량체의 한 실시양태에서, 상기 링커는 제1 단량체 단위와 제2 단량체 단위 사이에 배열된다. 제1 단량체 단위와 제2 단량체 단위 사이에 배열된 링커의 존재가 추가 링커의 존재를 배제하지 않는다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
가용성 링커는 당업계에서 대개 결합된 도메인이 특정 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 할 때에 사용되고, FcRn 결합 이량체의 일부 실시양태에서, 이는 특히 유용할 수 있다. 상기 링커는 일반적으로 작은, 비극성 (예를 들어, G) 또는 극성 (예를 들어, S 또는 T) 아미노산으로 구성된다. 일부 가용성 링커는 주로 G 및 S 잔기로 이루어진 스트레치, 예를 들어, (GGGGS)p 및 (SSSSG)p로 구성된다. 기능성 모이어티 사이를 적절히 분리시키기 위해, 또는 모이어티 사이의 필요한 상호작용을 유지시키기 위해 카피수 "p"를 조정함으로써 링커를 최적화시킬 수 있다. G 및 S 링커 이외에도, 다른 가용성 링커, 예컨대, 가요성 유지를 위한, 추가의 아미노산 잔기, 예컨대, T, A, K 및 E를 함유하는 G 및 S 링커 뿐만 아니라, 가용성을 개선시키기 위한, 극성 아미노산 잔기를 함유하는 G 및 S 링커가 당업계에 공지되어 있다.
추가 링커에 관한 비제한적인 예로는 GGGGSLVPRGSGGGGS, (GS)3, (GS)4, (GS)8, GGSGGHMGSGG, GGSGGSGGSGG, GGSGG, GGSGGGGG, GGGSEGGGSEGGGSEGGG, AAGAATAA, GGGGG, GGSSG, GSGGGTGGGSG, GSGGGTGGGSG, GT, GSGSGSGSGGSG, GSGGSGGSGGSGGS 및 GSGGSGSGGSGGSG를 포함한다. 당업자는 다른 적합한 링커도 알고 있다.
한 실시양태에서, 상기 링커는 글리신 (G), 세린 (S) 및/또는 트레오닌 (T) 잔기를 포함하는 가용성 링커이다. 한 실시양태에서, 상기 링커는 (GnSm)p 및 (SnGm)p (상기 식에서, 독립적으로, n = 1-7, m = 0-7, n + m ≤ 8 및 p = 1-7)로부터 선택되는 일반식을 가진다. 한 실시양태에서, n = 1-5이다. 한 실시양태에서, m = 0-5이다. 한 실시양태에서, p = 1-5이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, n = 4, m = 1 및 p = 1-4이다. 한 실시양태에서, 상기 링커는 S4G, (S4G)3 및 (S4G)4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 상기 링커는 GS, G4S 및 (G4S)3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, 상기 링커는 G4S이고, 또 다른 실시양태에서, 상기 링커는 (G4S)3이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "FcRn 결합" 및 "FcRn에 대한 결합 친화도"라는 용어는 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 사용, 또는 ELISA에 의해 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 나타낸다.
예를 들어, 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, FcRn 결합 친화도는 FcRn 또는 그의 올바르게 폴딩된 단편이 기기의 센서 칩 상에 고정되고, 시험하고자 하는 폴리펩티드를 함유하는 샘플을 칩 위로 통과시키는 실험으로 시험될 수 있다. 대안적으로, 시험하고자 하는 폴리펩티드를 기기의 센서 칩 상에 고정시키고, FcRn 또는 그의 올바르게 폴딩된 단편을 포함하는 샘플을 칩 위로 통과시킨다. 이어서, 당업자는 상기 실험으로부터 수득한 결과를 해석하여 적어도 FcRn에 대한 폴리펩티드의 결합 친화도의 정성적인 측정을 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 KD 값을 측정하기 위한 정량적인 측정을 원하는 경우, 표면 플라스몬 공명 방법 또한 사용될 수 있다. 결합 값은, 예를 들어, 비아코어(Biacore) (GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 또는 프로테온(ProteOn) XPR 36 (바이오-래드(Bio-Rad)) 기기에서 정의될 수 있다. FcRn을 기기의 센서 칩 상에 적합하게 고정시키고, 그의 친화도를 측정하고자 하는 것인 폴리펩티드의 샘플을 연속 희석하여 제조하고, 무작위적인 순서로 주입한다. 이어서, 예를 들어, BIA이벨류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어의 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 또는 기기 제조자에 의해 제공되는 다른 적합한 소프트웨어를 사용하여, 결과로부터 KD 값을 계산할 수 있다.
대안적으로, 하기 실시예에 기술되는 바와 같이, FcRn 결합 친화도는, 폴리펩티드의 샘플을 항체가 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 포획하고, 비오티닐화된 FcRn을 첨가한 후, 스트렙트아비딘에 접합된 HRP를 첨가하는 실험으로 시험할 수 있다. 시험될 수 있다. TMB 기질을 첨가하고, 다중 웰 플레이트 판독기, 예컨대, 빅토르(Victor)3 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 이어서, 당업자는 적어도, 상기 실험에 의해 수득된 결과를 해석하여 FcRn에 대한 폴리펩티드의 결합 친화도의 정성적인 측정을 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 KD 값 (반수 최대 유효 농도)을 측정하기 위해 정량적인 측정을 원하는 경우, ELISA 또한 사용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 ELISA를 사용하여 비오티닐화된 FcRn의 희석액 시리즈에 대한 폴리펩티드의 반응을 측정한다. 이어서, 당업자는 상기 실험에 의해 수득된 결과를 해석할 수 있고, KD 값은 예를 들어, 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5) 및 비선형 회귀를 사용하여 상기 결과로부터 계산될 수 있다.
대안적으로, FcRn에 대한 친화도는 또한 IgG의 FcRn에의 결합을 차단하는 FcRn 결합 폴리펩티드의 능력을 관찰함으로써 간접적으로 연구될 수 있다. 따라서, 단, FcRn 결합 이량체가 IgG와 동일하거나, 또는 적어도 부분적으로 중첩되는 FcRn의 영역에서 FcRn과 상호작용한다면, 상기 결합을 차단하는 FcRn 결합 폴리펩티드의 능력이 FcRn 결합 폴리펩티드가 FcRn에 결합할 수 있는 결합 능력과 상관관계가 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드의 FcRn에의 결합 능력이 높을수록, FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 능력은 더 우수하다.
FcRn 결합 폴리펩티드와 FcRn의 상호작용은 FACS (형광 활성화 세포 분류) 분석에 의해 평가될 수 있으며, 여기서, 수득된 평균 형광 강도 (MFI) 값은 같은 실험에서 시험된 다른 폴리펩티드에 대해 상대적인, 시험된 폴리펩티드의 결합 강도에 관한 간접적인 판독치라는 것 또한 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 더 높은 MFI 값은 더 높은 상대적인 친화도와 상관관계가 있고, 더 낮은 MFI-값은 더 낮은 상대적인 친화도와 상관관계가 있다.
본원에서 사용되는 바, FcRn에 대한 결합 친화도 또는 FcRn의 결합과 관련하여 "더 높은 결합 능력"이라는 용어는 친화도에 대한 직접 또는 간접적인 평가를 위한 상기 언급된 검정법들 중 임의의 하나 이상의 것과 관련하여 해석되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, FcRn 결합 이량체는 상기 제1 또는 제2 단량체 단위 단독과 비교하였을 때, 더 높은 결합 능력으로 FcRn에 결합한다. 한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체는 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독의 것보다 2배 이상, 예컨대, 3배 이상, 예컨대, 4배 이상, 예컨대, 5배 이상, 예컨대, 6배 이상, 예컨대, 7배 이상, 예컨대, 8배 이상, 예컨대, 9배 이상, 예컨대, 10배 이상, 예컨대, 25배 이상, 예컨대, 50배 이상, 예컨대, 100배 이상 더 높은 능력으로 FcRn에 결합할 수 있다. 이러한 관계는 pH 6.0 및 pH 7.4, 또는 pH 6.0에서만, 또는 pH 7.4에서만 오직 그러할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이, FcRn 결합 이량체는 IgG의 FcRn에의 결합을 억제시킨다. 상기 실시양태에서, 상기 FcRn 결합 이량체는, FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 FcRn 결합 이량체의 능력이 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독의 것보다 2배 이상 더 높도록, 예컨대, 3배 이상 더 높도록, 예컨대, 4배 이상 더 높도록, 예컨대, 5배 이상 더 높도록, 예컨대, 10배 이상 더 높도록, 예컨대, 15배 이상 더 높도록, 예컨대, 20배 이상 더 높도록, 예컨대, 25배 이상 더 높도록 FcRn에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 FcRn 결합 이량체는 FcRn과 FcRn 결합 이량체 사이의 상호작용의 MFI 값이 FcRn과, 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독의 것 사이의 상호작용의 MFI 값보다 2배 이상 더 높도록, 예컨대, 3배 이상 더 높도록, 예컨대, 4배 이상 더 높도록, 예컨대, 5배 이상 더 높도록, 예컨대, 10배 이상 더 높도록 FcRn에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 FcRn 결합 이량체는 FcRn과 FcRn 결합 이량체 사이의 상호작용의 KD 값이 FcRn과, 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독의 것 사이의 상호작용의 KD 값보다 2배 이상 더 낮도록, 예컨대, 3배 이상 더 낮도록, 예컨대, 4배 이상 더 낮도록, 예컨대, 5배 이상 더 낮도록, 예컨대, 10배 이상 더 낮도록, 25배 이상 더 낮도록, 예컨대, 50배 이상 더 낮도록, 예컨대, 100배 이상 더 낮도록, 예컨대, 1,000배 이상 더 낮도록 FcRn에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 상호작용의 KD 값이 최대 1 x 10-7 M, 예컨대, 최대 1 x 10-8 M, 예컨대, 최대 1 x 10-9 M, 예컨대, 최대 1 x 10-10 M, 예컨대, 최대 1 x 10-11 M, 예컨대, 최대 1 x 10-12 M이 되도록 pH 6.0에서 FcRn에 결합할 수 있는 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 본 실시양태에 따른 FcRn 결합 이량체는 예를 들어, 엔도솜 내의 산성 pH 조건, 예컨대, pH 6.0에서 FcRn에 결합하거나, 결합한 상태 그대로 유지될 것이다. 상기 폴리펩티드가 점점 더 산성화가 증가되는 세포내 환경으로 진입하게 되면, 폴리펩티드는 FcRn과의 그의 상호작용을 통해 원형질 막으로 재순환될 수 있고, 이로써, 분해를 피할 수 있다.
한 실시양태에서, pH 7.4에서의 FcRn 결합 이량체와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값은 pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD 값보다 높다. 따라서, FcRn 결합 폴리펩티드는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 더 높은 친화도로 FcRn에 결합하게 될 것이다. 한 실시양태에서, pH 7.4에서의 상기 상호작용의 KD 값은 pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD 값보다 2배 이상 더 높거나, 예컨대, 5배 이상 더 높거나, 예컨대, 10배 이상 더 높거나, 예컨대, 25배 이상 더 높거나, 예컨대, 50배 이상 더 높거나, 예컨대, 100배 이상 더 높거나, 예컨대, 1,000배 이상 더 높다.
상기 언급한 바와 같이, FACS 분석을 사용하여 FcRn 결합 이량체와 FcRn 사이의 상호작용을 분석할 수 있다. pH 6.0 및 pH 7.4에서의 FcRn 결합 이량체와 FcRn 사이의 상호작용을 평가할 수 있다. pH 6.0 및 pH 7.4에서의 MFI 값을 하기 실험 섹션에 개시되는 바와 같이 비교할 수 있다. 수득된 더 높은 상대적인 MFI 값은 더 높은 친화도에 상응하고, 더 낮은 상대적인 MFI 값은 더 낮은 친화도에 상응하되, 단, 상기 MFI 값을 같은 실험 설정 환경에서 비교하였을 때에 그러하다. 따라서, 한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체는 pH 7.4에서보다는 pH 6.0에서 더 높은 친화도로 예컨대, 10% 이상 더 높은, 예컨대, 20% 이상 더 높은, 예컨대, 35% 이상 더 높은, 예컨대, 50% 이상 더 높은, 예컨대, 100% 이상 더 높은 친화도로 FcRn에 결합한다.
한 실시양태에서, pH 7.4에서 FcRn 결합 이량체와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값은 적어도 1 x 10-10 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-9 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-8 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-7 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-6 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-5 M이다. 일부 실시양태에서, pH 7.4에서 FcRn 결합 이량체와 FcRn 사이의 상호작용을 위한 유일한 기준은 더욱 산성인 조건하에 있는 동안 FcRn에 결합한 임의의 FcRn 결합 이량체는 pH 값이 증가하면 FcRn으로부터 더욱 빠르게 유리된다는 것이다.
대안적 실시양태에서, pH 7.4에서의 상기 상호작용의 KD가 pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD와 동일하거나, 또는 그보다 낮은 것인, FcRn 결합 이량체를 제공한다. 본 실시양태에 따른 FcRn 결합 이량체는 예를 들어, 엔도솜 내와 같은 산성 pH 조건에서 FcRn에 결합하거나, 결합한 상태 그대로 유지될 것이며 (즉, pH 6.0에서는 유리되는 것을 피하기 위해 충분히 느린 속도인 오프 속도를 가질 것이며), 그뿐만 아니라, 예를 들어, 원형질 막 상과 같은 중성 또는 약염기 pH 조건에서도 또한 그러할 것이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, pH 7.4에서의 상기 상호작용의 KD 값은 pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD 값보다 2배 이상 더 낮거나, 예컨대, 5배 이상 더 낮거나, 예컨대, 10배 이상 더 낮거나, 예컨대, 50배 이상 더 낮거나, 예컨대, 100배 이상 더 낮다.
또 다른 실시양태에서, 상호작용의 KD 값이 최대 1 x 10-7 M, 예컨대, 최대 1 x 10-8 M, 예컨대, 최대 1 x 10-9 M, 예컨대, 최대 1 x 10-10 M, 예컨대, 최대 1 x 10-11 M, 예컨대, 최대 1 x 10-12 M이 되도록, pH 7.4에서 FcRn에 결합할 수 있는 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 본 실시양태에 따른 FcRn 결합 이량체는 예를 들어, 원형질 막 상과 같은 중성 또는 약염기 pH 조건에서, 예컨대, pH 7.4에서 장기간 동안 FcRn에 결합하거나, 결합한 상태 그대로 유지될 것이다. "결합한 상태 그대로 유지된다"라는 용어는 상호작용이 주어진 조건하에서 느린 오프 속도를 가진다는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
일반적으로, 당업자는 상호작용의 KD 값이 오프 속도 (k오프)와 온 속도 (k온) 사이의 비로 정의된다는 것을 알고 있다. 따라서, KD 값이 높은 것은 k오프가 높거나, k온이 낮거나, 또는 그 둘 모두에 기인할 수 있고, 반대로, KD 값이 낮은 것은 k오프가 낮거나, k온이 높거나, 또는 그 둘 모두에 기인할 수 있다.
당업자는 본 개시내용의 범주로부터 벗어나지 않으면서 특정한 적용에 폴리펩티드를 적합화시키기 위해 본원에 개시된 임의의 측면에 따른 FcRn 결합 이량체를 다양하게 변형 및/또는 첨가할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 C-말단 및/또는 N-말단 단부에 1종 이상의 추가의 아미노산을 포함하는 것인, 본원에 기술된 FcRn 결합 이량체를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄 중의 가장 첫번째 및/또는 가장 마지막 위치에 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기를 가지는 폴리펩티드로서 이해하여야 한다. 따라서, 상기의, 본원에서 정의된 바와 같은 FcRn 결합 이량체의 상기 단량체 단위 중 적어도 하나는 임의의 적합한 개수의 추가의 아미노산 잔기, 예를 들어, 1종 이상의 추가의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 각각의 추가의 아미노산 잔기는 예를 들어, 폴리펩티드의 생성, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링, 또는 검출을 개선시키거나, 또는 간소화시키기 위해 개별적으로 또는 집합적으로 부가될 수 있다. 상기 추가의 아미노산 잔기는 화학적 커플링 목적으로 부가되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 한 예로는 시스테인 잔기의 부가가 있다. 상기 추가의 아미노산 잔기는 또한 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 위한 "태그," 예컨대, His6 태그 또는 "myc" (c-myc) 태그 또는 "FLAG" 태그를, 태그에 특이적인 항체와의 상호작용 또는 헥사히스티딘 태그의 경우, 고정화 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)를 위해 제공할 수 있다.
상기에서 논의된 추가적인 아미노산은 (공지된 유기 화학 방법을 이용하는) 화학적 접합에 의해 또는 임의의 다른 수단, 예컨대, 융합 단백질로서 또는 직접적 또는 링커, 예를 들어, 상기 기술된 아미노산 링커를 통한 임의의 다른 방식의 결합에 의한 FcRn 결합 이량체의 발현에 의해 FcRn 결합 이량체, 또는 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 어느 하나 또는 그 둘 모두에 커플링될 수 있다.
상기에서 논의된 추가의 아미노산은, 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩티드 도메인(들)을 포함할 수 있다. 추가의 폴리펩티드 도메인은 FcRn 결합 이량체에 또 다른 기능, 예컨대, 예를 들어, 또 다른 결합 기능, 또는 효소적 기능, 또는 독성 기능 또는 형광성 신호전달 기능, 또는 그의 조합을 제공할 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 제2 측면에서, 제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체로 이루어진 제1 모이어티, 및 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어진 제2 모이어티를 포함하는, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질 또는 접합체는 제2 모이어티의 생물학적 활성과 동일하거나, 상이할 수 있는 원하는 생물학적 활성을 포함하는, 추가의 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 접합체의 한 실시양태에서, 분자의 전체 크기는 포유동물 대상체에게 투여되었을 때, 효율적인 신장 제거를 위한 임계치보다 작다.
상기 융합 단백질 또는 접합체의 또 다른 실시양태에서, 분자의 전체 크기는 포유동물 대상체에게 투여되었을 때, 효율적인 신장 제거를 위한 임계치보다 크다.
상기 융합 단백질 또는 접합체의 한 실시양태에서, 상기 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기는 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드 그 자체의 생체내 반감기보다 길다.
원하는 생물학적 활성의 비제한적인 예로는 치료학적 활성, 결합 활성 및 효소적 활성을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 원하는 생물학적 활성은 선택된 표적에의 결합 활성이다.
상기 결합 활성의 한 예는 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기를 연장시키는 결합 활성이다. 상기 융합 단백질 또는 접합체는 1종 이상의 추가 모이어티를 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 상기 표적은, 그와의 결합이 상기 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기를 연장시키는 것인, 알부민이다. 한 실시양태에서, 상기 알부민 결합 활성은 연쇄상구균 단백질 G의 알부민 결합 도메인 (ABD) 또는 그의 유도체에 의해 제공된다. 예를 들어, 1종 이상의 추가의 모이어티를 포함하는 상기 융합 단백질 또는 접합체는 [ FcRn 결합 이량체 ] - [알부민 결합 모이어티 ] - [선택된 표적에 대해 친화성을 가지는 모이어티 ]을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 융합 단백질 또는 접합체는 알부민 결합 모이어티 또는 본원에 기술된 FcRn 결합 이량체를 구성하는 두 FcRn 결합 단량체 단위 사이를 차지하는 다른 표적 결합 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서, 비제한적인 예로서, [ FcRn 결합 단량체 모이어티 ] - [알부민 결합 모이어티 ] - [ FcRn 결합 단량체 모이어티 ] - [선택된 표적에 대해 친화성을 가지는 모이어티 ]에 따라, 또는 [ FcRn 결합 단량체 모이어티] - [선택된 표적에 대해 친화성을 가지는 모이어티 ] - [ FcRn 결합 단량체 모이어티] - [알부민 결합 모이어티 ]에 따라 배열될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 융합 단백질 또는 접합체 중의 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단에서부터 C-말단으로 임의 순서로 자유롭게 배열될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 한 실시양태에서, 상기 생체내 반감기는 융합 단백질 또는 접합체 그 자체의 생체내 반감기와 비교하였을 때, 10배 이상, 예컨대, 25배 이상, 예컨대, 50배 이상, 예컨대, 75배 이상, 예컨대, 100배 이상 연장된다.
한 실시양태에서, 예컨대, pH 6.0과 같은 산성 pH에서 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질 또는 접합체와 표적 사이의 복합체가 형성되었을 때, 표적은 리소좀 분해에 의한 제거로부터 구제된다. 따라서, 표적 반감기는 연장된다. 반감기 연장은, 상기 융합 단백질 또는 접합체와 상호작용하였을 때의 표적의 제거률이 상기 융합 단백질 또는 접합체의 부재하에서의 표적 분자의 제거율보다 낮다는 것을 의미한다. 추가로, 본 실시양태에서, 융합 단백질 또는 접합체에 의한 표적의 결합이 표적의 기능을 실질적으로 방해하지 않아야 하는 것이 바람직하다.
한편, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질 또는 접합체와 표적 사이의 복합체가 산성 pH에서 형성되지 않거나, 유지되지 않을 때, 표적은 세포내 리소좀으로 유도되고, 거기서, 분해된다.
한 실시양태에서, 선택된, 원치 않는 표적의 대상체로부터의 제거율이 증가된, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 바람직하지 못한 표적의 제거 증가는, 표적 분자 자체, 즉, 즉, 융합 단백질 또는 접합체와의 이전의 상호작용이 없는 것의 "일반적인" 제거율과 비교하였을 때, 다세포 유기체의 신체로부터의 표적의 제거율이 증가되었다는 것을 의미한다.
또 다른 실시양태에서, 선택된, 바람직하지 못한 표적의 결합이 표적의 기능을 불활성화시킬 수 있고, 이로써, 그의 생물학적 활성이 바람직한 경우인 상황하에서 그 활성을 차단할 수 있다. 상기 생물학적 활성은 예를 들어, 수용체 또는 효소적, 또를 다르게는 독성 또는 바람직하지 못한 활성의 활성화 또는 차단일 수 있다. 상기 바람직하지 못한 표적은 내인성 호르몬, 효소, 사이토카인, 케모카인 또는 일부 다른 생물학적 활성을 가지는 표적일 수 있다. 불활성화 표적 결합을 이용함으로써, 생물학적 활성은, 표적이 분해를 위해 전달되고, 낮은 pH 값에서 유리되고, 표적 결합 융합 단백질이 순환으로 재순환될 때까지 차단된다. (그의 FcRn 결합 모이어티를 통한) 표적 결합 융합 단백질의 상기와 같은 재순환은, 표적 결합 융합 단백질이 1 초과의 선택된 바람직하지 못한 표적 분자의 제거를 "촉매화"시킬 수 있도록 한다.
바람직하지 못한 표적은, 예를 들어, 의학적 상태에 따라 혈장에서 상승된 수준을 나타내고, 상기 단백질의 제거로 치료학적 효과를 달성할 수 있는, 외래 단백질 및 화합물, 또는 자연적으로 발현되는 단백질일 수 있다. 원치 않는 표적이 반드시 혈장에 고르게 분포되어 있어야 할 필요는 없으며, 특정 영역, 예를 들어, 종양의 주위 또는 염증 부위에 농축되어 있을 수 있다.
표적의 비제한적인 예는 알레르기원, 아밀로이드, 항체, 자가-항원, 혈액 응고 인자, 호르몬, 종양 세포, 약물 분자, 사이토카인, 케모카인, 프로테아제, 과민증 매개인자, 염증유발성 인자, 독소, 예컨대, 박테리아 독소 및 뱀독; 오염원, 금속 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적이다.
특정 조건하에서, 예컨대, 특정 암 질환에서, 내인성 분자, 예를 들어, VEGF, PDGF, HGF 및 다른 성장 자극 호르몬을 제거하는 것이 바람직하다. 상기 분자는 또한 상기 융합 단백질 또는 접합체의 결합 기능에 의해 표적화될 수 있다.
다른 조건하에서, 예컨대, 특정 면역학적 질환에서, 일시적으로 내인성 분자, 예컨대, 선택된 인터류킨 또는 TNF를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 분자는 또한 상기 융합 단백질 또는 접합체의 결합 기능에 의해 표적화될 수 있다.
한 실시양태에서, 원하는 생물학적 활성을 가지는 제2 모이어티는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드이다. 치료학적으로 활성인 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 생체분자, 예컨대, 효소, 예를 들어, 알가시다제 α 및 β, 글루코세레브로시다제, 라로니다제, 아릴술파타제, 아글루코시다제-α, 아스파라기나제, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 Xa; 호르몬 및 성장 인자, 예를 들어, 성장 호르몬, 형질전환 성장 인자-β2, 에리트로포이에틴, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자-1, 미오스타틴, 골 유래 성장 인자 및 글루카곤 유사 펩티드-1; 케모카인, 예를 들어, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL27, XCL1 및 CXC3CL1; 및 사이토카인, 예를 들어, 인터류킨 (IL)-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-22, IL-27, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 종양 괴사 인자 (TNF), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 대식세포-CSF, 및 과립구/대식세포-CSF로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체는 융합 단백질에서 또는 임의의 다른 모이어티에 대한 접합체 파트너로서 유용할 수 있다. 따라서, 치료학적으로 활성인 폴리펩티드에 관한 상기 목록은 어느 방식으로든 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
융합 폴리펩티드 또는 접합체의 생성을 위한 다른 가능성 또한 고려된다. 따라서, 본 발명의 제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체는, 표적 결합 이외에도 또는 그 대신에 다른 기능을 보이는 제2의 또는 추가의 모이어티 또는 모이어티들에 공유적으로 커플링될 수 있다. 한 예는 하나 이상의 FcRn 결합 이량체와 리포터 또는 이펙터 모이어티로서의 역할을 하는 효소적으로 활성인 폴리펩티드 사이의 융합이다.
본 개시내용에 따른 FcRn 결합 이량체를 포함하는 상기 융합 단백질 또는 접합체에 관한 기술과 관련하여, 제1, 제2 및 추가의 모이어티로 지정하는 것은 한편으로는 본 개시에 따른 FcRn 결합 이량체와 다른 한편으로는 다른 기능을 보이는 모이어티 간의 구분을 명확하게 하기 위한 이유로 이루지는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 지정은 융합 단백질 또는 접합체의 폴리펩티드 쇄 중의 상이한 도메인들의 실제 순서를 나타내고자 하는 의도가 아니다. 따라서, 예를 들어, 상기 제1 모이어티는, 제한 없이, 융합 단백질 또는 접합체의 N-말단 단부에, 중간에, 또는 C-말단 단부에 출현할 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 FcRn 결합 이량체는 FcRn 결합 이량체의 두 FcRn 결합 단량체 단위 사이를 차지하는 제2모이어티를 포함할 수 있다.
반수 최대 억제 농도 (IC50)는 정량가능한 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 데 있어서 물질의 효능을 나타내는 척도이다. 이러한 정량적 척도는 특정의 생물학적 프로세스를 50%만큼 억제시키는 데 특정 물질이 얼마만큼 필요한지를 나타내는 것이며, 이는 당업계에서 보편적으로 사용된다. 한 특정 실시양태에서, 차단에 관한 반수 최대 억제 농도 (IC50)가 최대 1 x 10-8 M, 예컨대, 최대 6 x 10-9 M, 예컨대, 최대 4 x 10-9 M, 예컨대, 최대 1 x 10-9 M, 예컨대, 최대 1 x 10-10 M, 예컨대, 최대 1 x 10-11 M이 되도록 FcRn에의 IgG 결합을 차단할 수 있는, 본원에서 정의된 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 한 실시양태에서, 차단에 관한 반수 최대 억제 농도 (IC50)가 상응하는 제1 또는 제2 단량체 단위 단독의 것에 의한 차단에 관한 IC50과 비교하였을 때, 10배 이상 더 낮도록, 예컨대, 100배 이상 더 낮도록, 예컨대, 1,000배 이상 더 낮도록 FcRn에의 IgG 결합을 차단할 수 있는, 본원에서 정의된 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다.
억제는 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체의 IgG와 동일하거나 적어도 부분적으로 중첩되는 FcRn의 영역에의 결합에 기인할 수 있다. 대안적으로, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체는 IgG와는 상이한 FcRn의 영역에 결합할 수 있지만, IgG의 FcRn에의 결합을 입체적으로 방해할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 FcRn 결합 이량체에 의한 FcRn 결합 부위의 점유로 인해, FcRn로 매개되는 IgG의 재순환이 전체적으로 또는 부분적으로 이용불가능할 수 있기 때문에, IgG의 리소좀 분해 증가에 기인하여 순환계로부터의 IgG의 제거율 또는 청소율은 증가될 수 있다. 즉, 본 개시내용에 따른 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체의 투여는 순환 IgG 항체의 이화작용을 증가시키는 작용을 할 것이다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값은 IgG와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값보다 낮다. 이러한 관계는 pH 6.0 및 pH 7.4, 둘 모두에서, 또는 pH 6.0에서만 오직 그러할 수 있다.
상기 측면은, 제1 측면에 따른 FcRn 결합 이량체, 또는 제2 측면에 따른 융합 단백질 또는 접합체에 포함되어 있는 것과 같은 FcRn 결합 이량체가 표지, 예컨대, 형광 염료 및 금속, 발색단 염료, 화학발광 화합물 및 생체발광 단백질, 효소, 방사성핵종 및 방사성 입자로 이루어진 군으로부터 선택된 표지를 추가로 포함하는, 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 상기 표지는, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출을 위해 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 표지된 FcRn 결합 이량체는 원하는 생물학적 활성 및/또는 상기 기술된 바와 같은 결합 기능을 포함하는 제2 모이어티 또한 포함하는 융합 단백질 또는 접합체에서 모이어티로서 존재한다. 일부 경우에서, 표지는 오직 FcRn 결합 이량체에만 (예를 들어, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 하나, 둘, 또는 그 둘 모두에) 커플링 될 수 있고, 일부 경우에서는, FcRn 결합 이량체 및 접합체 또는 융합 단백질의 제2 모이어티 둘 다에 커플링 될 수 있다. 추가로, 표지가 제2 모이어티에만 커플링되고, FcRn 결합 모이어티에는 커플링되지 않는 것도 가능할 수 있다. 따라서, 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 표지가 제2 모이어티에만 커플링된 것인, 제2 모이어티를 포함하는 FcRn 결합 이량체를 제공한다.
표지된 폴리펩티드에 대해 언급할 때, 이는 FcRn 결합 이량체 및 제2 모이어티 및 임의적으로 추가의 모이어티를 포함하는 융합 단백질 및 접합체를 비롯한, 본원에 기술된 FcRn 결합 이량체의 모든 측면에 대해 언급하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 표지된 폴리펩티드는 오직 FcRn 결합 이량체와, 예컨대, FcRn 결합 이량체에 킬레이팅되거나, 공유적으로 커플링된 치료용 방사성핵종만을 함유할 수 있거나, 또는 FcRn 결합 이량체, 치료용 방사성핵종 및 예컨대, 치료학적 효능을 야기하는 원하는 생물학적 활성을 가지는 소분자와 같은 제2 모이어티를 함유할 수 있다.
FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체가 방사선 표지된 것인 실시양태에서, 상기 방사선 표지된 폴리펩티드는 방사성핵종을 포함할 수 있다. 방사성핵종 다수는 금속성 성질을 가지고, 이온 형태로서 사용되고, 전형적으로 단백질 및 펩티드에 존재하는 원소와 안정적인 공유 결합을 형성하지 못한다. 이러한 이유로, 방사성 금속으로 단백질 및 펩티드를 표시하는 것은 금속 이온과, 킬레이트라고 불리는 비공유결합 화합물을 형성하는 킬레이터, 즉, 여러자리 리간드를 사용함으로써 수행된다. FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체의 한 실시양태에서, 방사성핵종을 포함하는 것은 킬레이팅 환경을 제공함으로써 이루어질 수 있고, 이를 통해 방사성핵종이 폴리펩티드에 배위되거나, 킬레이팅되거나, 착체를 형성할 수 있다.
킬레이터의 한 예로는 폴리아미노폴리카르복실레이트 유형의 킬레이터가 있다. 상기 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터의 두 부류는 거대환 및 비환 킬레이터로 구분될 수 있다.
한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체는, 시스테인 잔기의 티올 기 또는 리신 잔기의 엡실론 아민 기를 통해 FcRn 결합 이량체에 커플링된 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터에 의해 제공되는 킬레이팅 환경을 포함한다. 대안적으로, 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터는 본원에 개시된 융합 단백질 또는 접합체의 임의의 부분에, 예컨대, 상기 융합 단백질 또는 접합체의 제2 또는 추가의 모이어티에 커플링될 수 있다.
인듐, 갈륨, 이트륨, 비스무트, 방사성 악티니드 및 방사성 란타니드의 방사성 동위 원소를 위한 것으로 가장 보편적으로 사용되는 거대환 킬레이터는 DOTA( 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)의 상이한 유도체이다. 한 실시양태에서, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체의 킬레이팅 환경은 DOTA 또는 그의 유도체에 의해 제공된다. 더욱 구체적으로, 한 실시양태에서, 본 개시내용에 포함되는 킬레이팅 폴리펩티드는 DOTA 유도체인 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리스-아세트산-10-말레이미도에틸아세트아미드 (말레이미도모노아미드-DOTA)를 상기 폴리펩티드와 반응시킴으로써 수득된다.
추가로, 1,4,7-트리아자사이클로노네인-1,4,7-트리아세트산 (NOTA) 및 그의 유도체는 킬레이터로서 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이트제가 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산 또는 그의 유도체인 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다.
가장 보편적으로 사용되는 비환 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터는 DTPA (디에틸렌트리아민-펜타아세트산)의 상이한 유도체들이다. 따라서, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 또는 그의 유도체들에 의해 제공되는 킬레이팅 환경을 가지는 폴리펩티드 또한 본 개시내용에 의해 포함된다.
추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 발현을 통해 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된, FcRn 결합 이량체는, 예를 들어, 그의 유체역학 반경을 증가시키기 위해 하나 이상의 합성 중합체에 접합된다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 이러한 목적을 위해 보편적으로 사용되지만, 당업계에서는 다른 중합체 또한 사용되어 왔다. 이러한 "PEG화"는 본원에 기술된 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체의 크기를 유효 신장 배출을 위한 임계치보다 큰 크기로 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 합성 중합체는 하나 이상의 화학적으로 합성된 FcRn 결합 이량체(들)에 접합된다. 다른 관능기 또한 동일한 합성 중합체에 접합될 수 있다. FcRn 결합 이량체 및 다른 구성 성분이 화학적으로 합성된 경우, 이를 원하지 않는다면, 어떠한 구성 성분도 생물학적 시스템 내에서 제조되어야 할 필요는 없을 것이다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 합성적 또는 생물학적으로 제조된 FcRn 결합 이량체가 합성 중합체에 접합되어, 효율적인 신장 제거와 관련된 크기를 초과하는 크기를 달성하고, IgG의 FcRn에의 결합을 차단하기 위해 사용된다. FcRn 결합 이량체의 단량체 단위 중의 고유의 시스테인은 부위 특이적 접합에 사용될 수 있으며, 예를 들어, C-말단에 위치하는 시스테인이 이러한 목적을 위해 도입된다. 분지된 합성 중합체의 경우, 2개 초과의 FcRn 결합 모이어티가, 결합력을 증진시키고, 이로서, 차단 효능을 증진시키기 위해 동일한 중합체에 접합될 수 있다.
본 개시내용의 제3 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 상기 기술된 바와 같은 FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질을 제조하는 방법; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 본 개시내용에 포함된다.
상기 발현 벡터로부터 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질을 제조하는 방법 또한 포함한다.
본 개시내용의 FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질은 대안적으로
- 아미노산 및/또는 아미노산 유도체를 단계적으로 커플링하여 보호된 반응성 측쇄를 가지는 FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질을 형성,
- FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질의 반응성 측쇄로부터 보호기 제거, 및
- 수용액 중에서 FcRn 결합 이량체 또는 융합 단백질의 폴딩을 포함하며, 보호된 반응성 측쇄를 가지는 아미노산 및/또는 아미노산 유도체를 사용하는 비생물학적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
본 개시내용의 제4 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 그의 한 실시양태에서, 상기 조성물은 1종 이상의 추가의 활성제, 예컨대, 2종 이상의 추가의 활성제, 예컨대, 3종 이상의 추가의 활성제를 추가로 포함한다. 상기 조합에서 유용한 것으로 입증될 수 있는 추가의 활성제에 관한 비제한적인 예로는 면역억제제, 항염증제, 항미생물제 및 효소가 있다.
상기 측면의 한 실시양태에서, 상기 조성물은 경구 투여, 비내 투여, 폐 투여, 질 투여, 직장 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사 및 피내 주사로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의한 투여를 위해 적합화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "전신 투여"라는 용어는 관심의 대상이 되는 물질이 순환계로 유입되어 전신이 영향을 받게 되는 투여 경로를 의미한다. 당업자는 전신 투여가 장관 투여 (위장관을 통한 약물의 흡수) 또는 비경구 투여 (일반적으로 주사, 주입 또는 이식)를 통해 일어날 수 있다는 것을 알고 있다.
한 실시양태에서, 상기 조성물은 전신으로 또는 국소적으로 투여하기 위한 것으로 적합화된다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물의 전신 투여가 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 국소 경로에 의한 투여를 위한 것으로 적합화된다. 예를 들어, 국소 투여는 연고, 페이스트, 폼 또는 크림으로의 국부적인 것일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 내피 또는 표피층을 통해 투여하기 위한 것으로 적합화된다. 여기서, 조성물은 상기 층을 가로질러 트랜스시토시스될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 조성물의 흡수율은 제2 또는 추가의 모이어티에 상응하는 폴리펩티드 그 자체의 흡수율보다 더 높다. 한 실시양태에서, 흡수율은 제2 또는 추가의 모이어티 그 자체의 흡수율보다 2배 이상 높거나, 예컨대, 5배 이상 높거나, 예컨대, 10배 이상 높거나, 예컨대, 25배 이상 높다.
본원에 기술된 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체 또는 조성물은 예를 들어, 치료제로서 및/또는 융합 파트너의 생체내 반감기를 연장시키기 위한 수단으로서, 및/또는 바람직하지 못한 표적의 제거율을 증가시키기 위한 수단으로서 유용할 수 있다는 것을 상기 개시내용으로부터 이해하여야 한다.
따라서, 본 개시내용의 제5 측면에서, 의약으로 사용하기 위한, 본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 제공한다.
본 개시내용의, 관련된, 제6 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 치료학적으로 또는 예방학적으로 활성인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
상기의 두 후자 측면 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 의약 또는 방법은 그를 필요로 하는 대상체에서 IgG 수준을 감소시키고자 하는 것이다.
상기의 두 후자 측면 중 어느 하나의 한 실시양태에서, 의약 또는 방법은 IgG의 FcRn에의 결합을 적어도 부분적으로 차단하는 FcRn 결합 이량체의 능력이 이용되는 치료 또는 예방, 예를 들어, IgG 항체의 이화작용 증가가 바람직한 것인 치료 또는 예방을 위해 의도되는 것이다.
IgG 차단 능력이 사용되는 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 FcRn 결합 이량체 투여는 항-약물 특성을 보이는 항체를 차단함으로써 약물의 효능을 개선시키는 효과를 가진다. 특히, 항체에 의해 제거되거나, 또는 그에 대하여 중화 항체가 유도되는 것인 약물 작용은 해당 약물을 투여하기 이전에 FcRn 결합 이량체의 투여에 의해 이러한 방식으로 개선될 수 있다.
IgG 차단 능력이 사용되는 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 FcRn 결합 이량체 투여는 대상체의 혈류 중에서 항체를 제거하거나, 또는 그의 순환 시간을 단축시킴으로써 항체의 유해한 효과를 감소시키는 효과를 가진다. 예를 들어, 방하선 표지된 또는 독소 접합된 항체는 본원에 개시된 FcRn 결합 이량체의 후속 투여에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로, 독성 역효과가 치료학적 항체 약물에 대한 반응으로서 발생하는 경우, 상기 역효과는 상기 항체를 제거하거나, 그의 순환 시간을 단축시키는 FcRn 결합 이량체의 후속 투여에 의해 호전되거나, 중화될 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 치료 또는 예방이 지시될 수 있는 병태는 자가면역 병태이다. 명시된 병태의 비제한적인 예로는 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, ANCA-관련 혈관염, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질항체 증후군 (APS), 자가면역 혈관 부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율 신경 장애, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍증, 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 변연부 뇌염, 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 혈소판감소성 자반병 (ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 축삭 신경병증(axonal & anal neuropathy), 발로병, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 캐슬만병, 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처그-스트라우스 증후군, 반창성 유천포창/양성 점막성 유천포창, 크론병, 코간 증후군, 한랭 응집소증, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 질환, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 탈수초성 신경병증, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병 (시속 척수염), 확장성 심근증, 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁 내막증, 호산성 혈관중심성 섬유증, 호산성 근막염, 후천성 표피 수포증, 결절성 홍반, 실험 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염 (측두 동맥염), 사구체신염, 굿파스처 증후군, 다발혈관염을 동반한 육아종증 (GPA; 베게너), 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반병, 임신 헤르페스, 저감마글로불린혈증, 특발성 저보체혈성 요세관간질 신염, 특발성 막성 신장병증, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), IgA 신장병증, IgG4-관련 질환, IgG4-관련 경화성 질환, 면역조절성 지방단백질, 염증성 대동맥류, 염증성 가성종양, 봉입체 근염, 인슐린-의존성 당뇨병 (1형), 간질성 방광염, 연소성 관절염, 연소성 당뇨병, 가와사키 증후군, 쿠트너 종양, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴성 혈관염, 편평 태선, 경화 태선, 목질 결막염, 선상 IgA 질환 (LAD), 라임병, 만성 종격 섬유증, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 미쿨리츠 증후군, 혼합 결합 조직병 (MCTD), 무렌 궤양, 몰반 증후군, 무차-하버만 질환(Mucha-Habermann disease),점액 막 유천포창, 다초점 섬유경화증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근육염, 기면증, 시속 척수염 (데빅스), 신경근육긴장증 (이삭 증후군), 호중구 감소증, 안구 반창성 유천포창, 시신경염, 올몬드병 (후복막 섬유증), 재발성 류마티즘, PANDAS (연쇄상구균 관련 소아성 자가면역 신경 정신병성 장애), 신생물딸림 소뇌 변성, 파라단백혈증 다발성 신경병증, 발작성 야간 헤모글로빈뇨 (PNH), 패리 롬버그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 평면부염 (말초형 포도막염), 유천포창 임신, 심상성 천포창, 대동맥주위염, 동맥주위염, 말초 신경병증, 정맥 주위 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 다발성 관절염, I, II, & III형 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발성 근육통증, 다발성 근육염, 심근경색후 증후군, 심막절개후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐 섬유증, 괴저성 농피증, 진성 적혈구계 무형성증, 레이노 증후군, 반사성 교감신경 위축증, 라이터 증후군, 재발성 다발성 연골염, 하지 불안 증후군, 후복막 섬유증 (올몬드병), 류마티스 열, 류마티스 관절염, 리델 갑상선염, 사르코이드증, 슈미트 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 & 고환 자가면역, 전신근 강직 증후군, 아급성 박테리아 심내막염 (SBE), 수삭 증후군, 교감성 안염, 다카야스 동맥염, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 톨로사-헌트 증후군, 횡단 척수염, 궤양성 대장염, 미분화성 결합 조직 질환 (UCTD), 포도막염, 혈관염, 대소수포성 피부병, 백반증, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증 및 온난 특발성 용혈성 빈혈을 언급할 수 있다.
제5 및 제6 측면의 또 다른 실시양태에서, 상기 치료 또는 예방이 지시될 수 있는 병태는 동종면역 병태이다. 명시된 병태의 비제한적인 예로서, 항-HLA 항체에 기인하는 이식 공여자 불일치; 태아 및 신생아 동종면역 혈소판 감소증, FNAIT (또는 신생아 동종면역 혈소판 감소증, NAITP 또는 NAIT 또는 NAT, 또는 태아-모체 동종면역 혈소판 감소증, FMAITP 또는 FMAIT)를 언급할 수 있다.
제5 및 제6 측면의 또 다른 실시양태에서, 상기 치료 또는 예방이 지시될 수 있는 병태는 자가면역 다선 증후군 1형 (APECED 또는 휘터커 증후군) 및 2형 (슈미트 증후군); 전신 탈모증; 근무력증 위기; 갑상선 발작; 갑상선 관련 눈 질환; 갑상선 눈병증; 자가면역 당뇨병; 자가항체 관련 뇌염 및/또는 뇌병증; 낙엽성 천포창; 수포성 표피박리증; 포진성 피부염; 시드넘 무도병; 급성 운동 축삭 신경병증 (AMAN); 밀러-피셔 증후군; 다초점 운동 신경병증 (MMN); 안구간대경련; 염증성 근육병증; 이삭 증후군 (자가면역 신경근육긴장증), 신생물딸림 증후군 및 변연부 뇌염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제5 및 제6 측면의 또 다른 실시양태에서, 상기 치료 또는 예방이 지시될 수 있는 병태는 간질 및 발작으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 순환으로부터 바람직하지 못한 표적을 차단하거나, 또는 제거하는 데 사용하기 위한, 본원에 기술된 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 바람직하지 못한 표적은 알레르기원, 아밀로이드, 항체, 자가-항원, 혈액 응고 인자, 호르몬, 종양 세포, 약물 분자, 사이토카인, 케모카인, 과민증 매개인자, 염증유발성 인자, 독소, 예컨대, 박테리아 독소 및 뱀독, 오염원, 금속 및 항산화제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 다양한 예시적인 측면 및 실시양태를 참조로 하여 기술되었지만, 당업자는 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이, 다양하게 변형될 수 있고, 그의 요소 대신으로 등가물이 치환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 그의 필수적인 범주로부터 벗어남 없이, 특정한 상황 또는 분자를 본 발명의 교시에 맞게 적합화시키기 위해 많은 변형을 수행할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 고려되는 임의의 특정 실시양태로 제한되는 것이 아니라, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 모든 실시양태를 포함할 것이라는 것이 의도된다.
본 도면의 간단한 설명
도 1은 단량체 형태의 FcRn 결합 폴리펩티드 (서열번호 1-367) 및 이량체 형태의 FcRn 결합 폴리펩티드 (서열번호 368-376) 예의 아미노산 서열 뿐만 아니라, 알부민 결합 폴리펩티드 변이체 PP013 (서열번호 377), Taq 폴리머라제 결합 Z 변이체 Z03638 (서열번호 378), 인간 αFcRn (서열번호 379), 뮤린 αFcRn (서열번호 384), 인간 β2-마이크로글로불린 (서열번호 380), 뮤린 β2-마이크로글로불린 (서열번호 381), 인간 FcRn-eGFP 내의 인간 αFcRn (서열번호 382) 및 뮤린 FcRn-eGFP 내의 뮤린 αFcRn (서열번호 383)의 아미노산 서열의 목록이다. 본원에 개시된 FcRn 결합 폴리펩티드의 도출된 FcRn 결합 모티프 (BM)는 서열번호 1-367을 가진 서열에서 잔기 8에서부터 잔기 36까지에 이른다. 상기의 각 Z 변이체 내의 완전한 3개의 나선 다발을 구성하는 것으로 예측되는 49개의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드 (BMod)의 아미노산 서열은 잔기 7에서부터 잔기 55까지에 이른다.
도 2a-2e는 실시예 3에 기술된 바와 같이, His6-태그 부착된 Z 변이체 및 IgG에 대한, pH 6.0에서의 인간 FcRn에의 결합 및 pH 6.0 및 7.4에서의 해리를 보여주는 것이다. pH 6.0에서의 주입 이후, pH 6.0에서의 해리 (실선) 및 pH 6.0에서의 주입 이후, pH 7.4에서의 해리 (파선)를 나타내는, 비아코어 기기로부터 수득한 센소그램의 중첩이 (a) Z07918 (서열번호 1), (b) Z07960 (서열번호 4), (c) Z10109 (서열번호 3), (d) Z10193 (서열번호 2) 및 (e) IgG에 대해 제시되어 있다.
도 3은 실시예 4에 기술된 바와 같이, 인간 (상부 패널) 및 마우스 (하부 패널) FcRn-eGFP HeLa 세포에의 FcRn 결합 Z 변이체의 결합의 유세포 분석법 분석으로부터의 점도표를 보여주는 것이다. HeLa 세포에 의한 FcRn-eGFP의 이질성 발현에 기인하여, 세포를 FcRn-eGFP 발현 수준에 따라 게이팅하였다. 게이트 H 내의 세포를 FcRn-eGFP 음성으로 간주하고, 게이트 I 내의 세포를 양성으로 간주한다. 알렉사 플루오르? 647 표지된 Z 변이체와 인큐베이션시킴으로써 알렉사 플루오르? 647 및 eGFP, 둘 모두에 대하여 양성인 집단을 얻은 반면, 완충제 (완충제 대조군)와 함께 인큐베이션시켰을 때에는 얻지 못했다. 본 도면은 3개의 변이체 Z07960 (서열번호 4), Z07930 (서열번호 6) 및 Z07918 (서열번호 1)이 인간 FcRn 및 마우스 FcRn에 결합한다는 것을 보여준다. y축은 알렉사 플루오르? 647 강도를 나타내고, x축은 eGFP 활성을 나타낸다.
도 4는 실시예 4에 기술된 세포 결합 검정법에서 측정된, 알렉사 플루오르? 647 표지된 Z07960 (서열번호 4), Z07930 (서열번호 6) 및 Z07918 (서열번호 1)의 평균 형광 강도 (MFI) 값을 보여주는 것이다. 다이어그램 (a)는 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포로부터의 MFI를 보여주는 것이고, 다이어그램 (b)는 마우스 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포로부터의 MFI를 보여주는 것이다.
도 5는 실시예 5에 기술된 바와 같이, 인간 (상부 패널) 및 마우스 (하부 패널) FcRn-eGFP HeLa 세포에의 인간 또는 마우스 IgG 알렉사 플루오르? 647 결합의 유세포 분석법 분석으로부터의 점도표를 보여주는 것이다. HeLa 세포에 의한 FcRn-eGFP의 이질성 발현에 기인하여, 세포를 세포 표면 상의 FcRn-eGFP의 존배지에 따라 게이팅하였다. 게이트 M 내의 세포를 FcRn-eGFP 음성으로 간주하고, 게이트 N 내의 세포를 양성으로 간주한다. FcRn 형질도입된 HeLa 세포에의 100 nM 인간 또는 마우스 IgG-알렉사 플루오르? 647의 결합은 좌측 패널(0 nM)에 제시되어 있다. 본 도면은 IgG 결합이 His6-태그 부착된 Z07918 (서열번호 1)에 의해 용량에 의존하는 방식으로 (1, 10, 100 및 1,000 nM) 차단되었다는 것을 보여주는 것이다. y축은 알렉사 플루오르? 647 강도를 나타내고, x축은 eGFP 활성을 나타낸다.
도 6은 실시예 5에 기술된 바와 같이, 상이한 농도의 His6-태그 부착된 Z07918 (서열번호 1)의 존재하에, (a) 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포 및 (b) 마우스 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포 상에서 IgG 알렉사 플루오르? 647의 FcRn 결합에 기인한 평균 형광 강도(MFI) 값을 보여주는 것이다. 본 도면은 Z 변이체에 의한 IgG-FcRn 결합의 용량 의존적 차단을 보여주는 것이다.
도 7a-7c는 실시예 6에 기술된 바와 같이, 비아코어 기기를 사용하여, pH 6.0에서 3개의 Z 변이체의 인간 FcRn에의 결합의 동역학적 성질을 보여주는 것이다. 각각, 알부민 결합 폴리펩티드 PP013 (서열번호 377)에 융합된 (a) Z11948 (서열번호 354), (b) Z11946 (서열번호 355) 및 (c) Z11947 (서열번호 356)의 농도 시리즈 및 대조군 Z 변이체 분자 Z03638 (서열번호 378; FcRn에 대해 특이적이지 않음)의 센소그램이 제시되어 있다. 640 nM (파선), 160 nM (점선) 및 40 nM (회색 실선)으로부터의 곡선을 랭뮤어 1:1 결합 모델을 사용하여 동역학적 분석을 수행하였다. 동역학적 파라미터 및 친화도를 피팅된 곡선 (검은색 실선)으로부터 계산하였고, 하기 표 6에 제시되어 있다.
도 8은 실시예 6에 기술된 바와 같이 수득된 알부민 결합 폴리펩티드 PP013에 융합된 3개의 FcRn 결합 Z 변이체에 대한 약동학적 프로파일을 보여주는 것이다. Z 변이체 Z11947 (서열번호 356, 개방형 사각형), Z11946 (서열번호 355, 개방형 삼각형) 및 Z11948 (서열번호 354, 개방형 다이아몬드) 모두 음성 대조군 Z03638-PP013 (개방형 동그라미)과 비교하였을 때, 연장된 반감기를 나타내었다.
도 9는 각각, 실시예 10에 기술된 바와 같이 검정된, His6-Z07918 (서열번호 1; 검은색 동그라미), IVIg (회색 사각형) 및 SCIg (회색 삼각형)에 의한 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 차단을 보여주는 것이다.
도 10은 마우스에서 FcRn 특이적인 Z 변이체와의 IgG-FcRn 상호작용의 차단이 IgG 수준을 감소시킨다는 것을 보여주는 것이다. 실시예 11에 추가로 기술된 바와 같이, 마우스를 비히클 (+), ABD 융합된 Z 변이체 Z07918-PP013 (개방형 사각형) 및 Z11948 (서열번호 354; 폐쇄형 동그라미)을 5일 매일 주사하여 처리하였다. ELISA에 의해 내인성 IgG의 농도를 측정하였다. 개별 마우스에서 24, 72, 120 및 168 h째의 IgG의 농도는 0 h째의 수준과 관련이 있었고, 이에 결과는 IgG (0 h)에 대한 상대적인 비율로서 제시되어 있다.
도 11은 실시예 13에 기술된 바와 같이 측정된, 인간 FcRn-eGFP로 형질감염된 HeLa 세포에의 알렉사 플루오르? 647 표지된 이량체 및 단량체 폴리펩티드 결합의 평균 형광 강도 (MFI) 값을 보여주는 것이다. (a) pH 6 (검은색) 및 pH 7.4 (흰색)에서 FcRn에 결합하는, 이량체 Z11948-(G4S)3-Z11948 (서열번호 369) 및 Z11948-(G4S)-Z11948 (서열번호 368), 및 상응하는 단량체 Z 변이체, Z07918 (서열번호 1). (b) pH 6 (검은색) 및 pH 7.4 (흰색)에서 FcRn에 결합하는, 단량체 1차 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1) 및 단량체 성숙 Z 변이체 Z13583 (서열번호 23), Z13621 (서열번호 44), Z13654 (서열번호 65) 및 Z13674 (서열번호 75).
도 12는 실시예 14에 기술된 바와 같이 검정된 이량체 및 단량체 폴리펩티드에 의한 인간 FcRn에의 인간 IgG 결합 차단을 보여주는 것이다. (a) 이량체 Z11948-(G4S)3-Z11948 (서열번호 369) 및 Z11948-(G4S)-Z11948 (서열번호 368); 상응하는 단량체 Z 변이체, Z07918 (서열번호 1), SCIg 및 IVIg. b) 단량체 1차 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1) 및 단량체 성숙 Z 변이체 Z13583 (서열번호 23) 및 Z13621 (서열번호 44).
도 13은 실시예 17에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 검정된, pH 의존성의, 폴리펩티드의 hFcRn에의 결합을 보여주는 것이다. (a) pH 6에서의 명시된 폴리펩티드의 결합. (b) pH 7.4에서의 명시된 폴리펩티드의 결합. 상기 두 pH 값 모두에서, 단량체 Z 변이체 (Z13621)보다 이량체 폴리펩티드 (ZAZ####) 경우에 더욱 효율적인 결합이 관찰되었다.
도 14는 실시예 20에 기술된 바와 같이 이량체 폴리펩티드로 처리된 FcRn 트랜스제닉 마우스에서의 hIgG 수준 감소를 보여주는 것이다. (a) 두 Z 모이어티 (ZAZ3715; 서열번호 371) 사이에 알부민 결합 도메인 PP013 (서열번호 377)이 위치하는 경우, hIgG 수준 감소가 PP013이 폴리펩티드 (ZZA3716; 서열번호 372)의 C-말단에 위치하는 경우에서와 같이 동일하게 효율적으로 이루어졌다. (b) 폴리펩티드 ZAZ3869 (서열번호 374), ZAZ3870 (서열번호 375) 및 ZAZ3871 (서열번호 376)의 경우에 hIgG 수준 감소가 동일하게 이루어졌다.
도 15는 실시예 21에 기술된 바와 같이 이량체 폴리펩티드 ZAZ3715 (서열번호 371) 및 ZAZ3824 (서열번호 373)로 처리된 NMRI 마우스에서의 용량 의존성의 hIgG 수준 감소를 보여주는 것이다.
도 16은 도 15에 제시된 바와 동일한 IgG 이화작용 연구에서와 같이 측정된, 각각 ZAZ3715 (서열번호 371) 및 ZAZ3824 (서열번호 373)의 혈청 농도를 보여주는 것이다.
도 17은 안정성 시험 이전 (0) 및 2주 후 (2w) 원래의 FcRn 결합 Z 변이체 및 돌연변이화된 FcRn 결합 Z 변이체를 보여주는 SDS-PAGE 겔의 영상이다. 레인 1: Z11948 (0), 레인 2: Z11948 (2w), 레인 3: Mw, 레인 4: Z17347 (0), 레인 5: Z17347 (2w), 레인 6: Z17348 (0), 레인 7: Z17348 (2w). 분자 크기 마커 (Mw)는 노벡스? 샤프 프리-스테인드 프로테인 스탠다드(Novex? Sharp Pre-stained Protein Standard)였다 (216, 160, 110, 80, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 3.5 kDa). 도면에서 관찰되는 대각선 밴드는 같은 용기에서 염색된 2차 겔로부터의 임프린트로부터 생성된 아티팩트이다.
도 18은 실시예 25에 기술된 바와 같이, pH 6.0에서의 인간 및 시노몰구스 FcRn에의 결합을 보여주는 것이다. hFcRn (검은색) 및 cFcRn (회색) 상에의 90 nM His6-태그 부착된 Z 변이체의 주입으로부터의 반응을 나타내는, 비아코어 기기로부터 수득된 센소그램의 중첩이 (a) Z13578 (실선) 및 Z18632 (파선), (b) Z13616 (실선) 및 Z18633 (파선), 및 (c) Z13621 (실선) 및 Z18634 (파선)에 대해 제시되어 있다.
실시예
요약
하기의 실시예는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 표적화하는 신규한 Z 변이체 분자 개발을 개시한다. Z 변이체는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 수득하였다. 본원에 기술된 FcRn 결합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 서열분석하였고, 상응하는 아미노산 서열은 도 1에 열거되어 있으며, 식별자 서열번호 1-353으로 나타낸다. 본원에 개시된 FcRn 결합 폴리펩티드의 도출된 FcRn 결합 모티프 (BM)는 서열번호 1-353을 가진 서열에서 잔기 8에서부터 잔기 36까지에 이른다. 추가로, 이량체 형태의 상기 폴리펩티드의 FcRn 결합 특성 및 FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 능력을 조사하였다.
실시예 1
인간 αFcRn 및 인간 β2 -마이크로글로불린 ( B2M )의 제조
본 실시예에서는, 인간 β2-마이크로글로불린 (서열번호 380)과 복합체를 형성한 인간 αFcRn (서열번호 379)의 세포외 도메인 (ECD) (FcRn으로 나타낸 복합체) 및 비복합체 형태의 인간 β2-마이크로글로불린 (B2M으로 나타냄)을 가용성 단백질로서 제조하였다. 본 실시예에서 제조된 인간 FcRn 및 B2M은 실시예 2 및 3에서 파지 선택, ELISA 및 비아코어 검정에 사용되었다.
물질 및 방법
공동 발현에 사용되는 인간 αFcRn 및 인간 β2 -마이크로글로불린에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 구축 : 인간 αFcRn (진뱅크(Genback) BC008734.2) 및 인간 β2-마이크로글로불린 (B2M) (진뱅크 BC032589.1)을 코딩하는 유전자를 오픈바이오시스템즈(OpenBiosystems)로부터 입수하였다. PCR 중첩 연장을 사용하여, 인간 αFcRn (αFcRnECD) (서열번호 379)의 아미노산 24-290을 코딩하는 유전자 단편을 attB1-부위/코작(Kozak) 서열, 이어서, Ig 카파 쇄 리더 서열, hFcRnECD, GS-링커 및 flag 태그를 코딩하는 유전자, 이어서, attB2 부위로 이루어진 구축물로 증폭시켰다. His6 태그가 flag 태그를 대체하였다는 것을 제외하고는 유사한, 인간 B2M (서열번호 380)의 아미노산 21-119를 코딩하는 유전자 단편을 함유하는 구축물을 제조하였다. 제조사의 권고에 따라, 게이트웨이 시스템(Gateway system) (인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호 11789020, 게이트웨이? BP 클로나제? II 엔자임 믹스(Gateway? BP Clonase? II Enzyme mix))를 사용하여 재조합에 의해 플라스미드 pDONOR221 (인비트로겐, 카탈로그 번호 12536-017) 내로 상기 구축물을 삽입하였다. 정확한 서열의 확인 후, 다중 부위 게이트웨이 클로닝을 사용하여 프로모터 함유 플라스미드 pENTR-CMV (문헌 [Tai et al. (2012) PLoS One 7(9):e46269])와 함께 2K7bsd (문헌 [Suter et al. (2006) Stem Cells 24:615-623]) 내로 인간 αFcRnECD 구축물을 삽입하여 벡터 2K7bsd-CMV-hFcRnECD를 수득하였다. 인간 B2M 유전자 구축물을 유사하게 2K7neo (문헌 [Suter et al., 상기 문헌 동일]) 내로 삽입하여 벡터 2K7neo-CMV-hB2M을 수득하였다.
세포 배양, 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조 및 SKOV -3 세포주 내로의 유전자 삽입: HEK293T 및 SKOV-3 세포주를 ATCC로부터 입수하였다. 세포를 5% CO2의 존재하에 37℃ 습윤화된 인큐베이터에서 성장시켰다. HEK293T 세포주에 대한 완전 배지는 10% 우태아 혈청 (FBS), 1% 항생제 항진균 용액 (AA) 및 1% MEM 비필수 아미노산 용액 (NEAA)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)였다. SKOV-3 세포주에 대한 완전 배지는 10% FBS 및 1% AA로 보충된 맥코이 5A 배지였다.
플라스미드 2K7bsd-CMV-hFcRnECD 및 2K7neo-CMV-hB2M을 별개로 VSV-G 외피 및 gag/pol 패키징 플라스미드와 함께 염화칼슘 형질감염을 사용하여 HEK293T 세포 내로 공동 형질감염시켰다 (문헌 [Zufferey et al. (1997) Nat Biotechnol 15(9):871-5]; [Jakobsson et al. (2006) J Neurosci Res 84:58-67]). 각각, 인간 αFcRnECD 및 인간 B2M 트랜스진과 함께, 형성된 렌티바이러스 입자를 함유하는 HEK293 배양 상청액을 원심분리 및 여과에 의해 세포 파편으로부터 제거하였다. 2가지 유형의 렌티바이러스 입자를 사용하여 순차적으로 SKOV-3 세포를 형질도입시켰다. 2주 동안 세포를 계대접종하면서, 블라스티시딘 (인비트로겐) 및 G418 술페이트 (인비트로겐)를 배양 배지에 첨가함으로써 인간 αFcRnECD 및 B2M 유전자, 둘 모두를 함유하는 성공적인 이중 통합체를 선별하였다. 생성된, 안정적으로 형질도입된 SKOV-3 세포주를 SKOV-3 hFcRnECD/hB2M으로 나타내었다.
재조합 인간 FcRn의 발현: 인간 αFcRnECD 및 B2M을 공동 발현하여 인간 FcRn을 생성하는 SKOV-3 세포를 확장시키고, 560 ml 완전 성장 배지 중 HYPER플라스크(HYPERFlask) (코닝(Corning)) 중에 1.5 x 107개의 세포를 시딩하였다. 5일 후, 세포가 정착하고, 증식되었을 때, 배지를 FBS가 없는 완전 성장 배지로 교체하였다. 5일 후, 배양을 중단하고, 상청액을 수집하고, 45 ㎛ 필터를 통과시키고, -80℃에서 냉동시켰다.
인간 IgG 크로마토그래피를 사용한 재조합 인간 FcRn 정제: AKTA 익스플로러(AKTA Explorer) 시스템 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 단백질 정제를 수행하였다. 제조사의 설명서에 따라, 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl (pH 8.3) 중 인간 IgG (파마시아(Pharmacia)), 1 ml를 10 mg/ml 농도로 1 ml HiTrap NHS-활성화된 HP 칼럼 (GE 헬쓰케어)에 커플링시켰다. SKOV-3 세포로부터의 재조합 인간 FcRn을 함유하는 상청액을 해동하고, HCl로 pH를 5.8로 조정하였다. 100 ml의 배치 중, 20 mM 비스-트리스(Bis-Tris) (pH 5.8)로 미리 평형화된 칼럼 상에 상청액을 순차적으로 로딩하였다. 칼럼을 20 ml의 20 mM 비스-트리스 (pH 5.8)로 세척하고, 50 mM 트리스(Tris) (pH 8.1)를 사용하여 1 ml의 분획으로 용리시켰다. 투석을 사용하여 완충제를 PBS (포스페이트 완충처리된 염수, 10 mM 포스페이트, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)로 교체하였다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯: 단백질 정제로부터 용리된 분획의 순도를 SDS-PAGE 및 겔코드 블루 스테인 리에이젼트(GelCode Blue Stain Reagent) (피어스(Pierce)) 및 실버X프레스? 실버 스테이닝 키트(SilverXpress? Silver Staining Kit) (인비트로겐)에 의해 분석하였다. 아머샴 하이본드™-C 엑스트라(Amersham Hybond™-C Extra) 니트로셀룰로스 막 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 막을 1시간 동안 TBS+T (50 mM Trizma base, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈(Tween)-20, pH 8) 중 5% 무지방 분유 (셈퍼(Semper))로 차단한 후, TBS+T 중 0.15 ㎍/ml 농도의 토끼 항-FCGRT 폴리클로날 항체 (아틀라스 안티바디즈(Atlas Antibodies)) 및 0.23 ㎍/ml 농도의 토끼 항-B2M 폴리클로날 항체 (아틀라스 안티바디즈)의 혼합물로 프로빙하였다. 이어서, 막을 TBS+T 중에서 1:10,000으로 희석된 호스 래디쉬 퍼옥시다제 (피어스)로 접합된, 안정화된 염소 항-토끼 항체와 함께 인큐베이션시켰다. TMB 기질 (피어스)을 첨가한 후, 아머샴 하이퍼필름 ECL(Amersham Hyperfilm ECL) (GE 헬쓰케어) 상에서 막 영상을 획득하였다. GBX 현상액 및 GBX 고정액 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))을 사용하여 하이퍼필름을 프로세싱하였다.
비복합체 형태의 인간 B2M 제조: 인간 B2M을 E. 콜라이(E. coli)에서 제조하였다. 발현 및 정제는 본질적으로 문헌 [Sandalova et al. (2005) Acta Chryst F61:1090-1093] 및 [Michaelsson et al. (2001) J Immunol 166:7327-7334]에 기술되어 있는 바와 같이 수행하였다. 인간 B2M의 아미노산 21-119로 이루어진, 정제된 단백질에 대해 우레아 중에서 하기와 같이 아르기닌 리폴딩을 수행하였다; 0.5 mg의 B2M을 2 ml 리폴딩 완충제 (20 ml 1 M 트리스-HCl (pH 8.0), 16.87 g L-아르기닌 (HCl로 완충처리된 것), 0.8 ml 0.5 M EDTA, 61 mg GSSG, 307 mg GSH 및 밀리-Q 수 (최종 부피 200 ml), pH 8.0, 및 프로테아제 억제제 (로슈(Roche), 카탈로그 번호 11 873 580 001)로 보충)에 신속하게 첨가하였다. 4℃에서 4시간 동안 리폴딩 방법을 수행하였다. 리폴딩된 B2M 단백질의 완충제를 PD-10 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 PBS로 교체하였다.
결과
공동 발현을 위해 사용하고자 하는 인간 αFcRn 및 인간 β2 -마이크로글로불린에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드의 구축: 인간 FcRn (αFcRnECD) 및 인간 B2M의 α-쇄의 세포외 도메인을 코딩하는 유전자가 각각 렌티바이러스 전달 플라스미드 2K7bsd 및 2K7neo 내로 삽입되었다. 두 경우 모두, 삽입된 유전자는 CMV 프로모터의 제어하에 있다. 유전자를 연장시킴에 따라 생성된 단백질은, 소포체를 거쳐 배양 배지로의 외수송을 위한 단백질을 표적화하도록 N-말단에 Ig 카파 쇄 리더 서열을 가지게 되었다 (신호 서열은 분비시에 절단되었다). 추가로, αFcRnECD는 C-말단 스페이서 서열에 이어서, 잠재적인 검출을 위해 FLAG 태그를 가졌다. 인간 B2M은 C-말단 스페이서 서열에 이어서, 잠재적인 검출을 위해 His6 태그를 가졌다. 스페이서 서열은 태그의 접근가능성을 증진시키기 위해 부가하였다. 렌티바이러스 전달 플라스미드는 또한 두 구축물 모두가 삽입된 세포가 선별될 수 있도록 하기 위해 2종의 상이한 항생제 저항성 유전자를 함유하였다.
재조합 인간 FcRn의 발현 및 정제: αFcRnECD 및 B2M을 코딩하는 유전자를 렌티바이러스에 의해 SKOV-3의 게놈 내로 삽입하였고, 생성된 FcRn 단백질은 배양 배지로 분비되었다. pH-의존성 IgG 결합을 보유하는 FcRn만을 포획하기 위해, 수용체가 pH 5.8에서 포획되고, pH 8.1에서 용리되는, 고정화된 IgG를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 사용하였다. 포획된 단백질은 3개의 분획으로 용리되었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯: 제조된 FcRn 단백질의 두 펩티드 쇄 (αFcRnECD 및 B2M)의 존재를 조사하기 위해, 및 용리된 물질의 순도를 분석하기 위해, 용리된 분획에 대해 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 겔코드 블루 스테인으로 염색된 겔의 경우, 분자량이 각각 12 및 36 kDa인 2개의 밴드가 검출되었다. 이는, B2M의 경우, 12 kDa이고, αFcRnECD의 경우, 31 kDa인, 비글리코실화된 펩티드 쇄의 분자량 이론치에 거의 상응한다. 상기 단백질의 αFcRnECD 부분은 하나의 글리코실화 부위를 함유하고, 따라서, 그의 분자 질량은 31 kDa보다 높을 것으로 예상되었다. 감도를 증가시키고, 가능하게는 불순물을 검출하기 위해 상기 겔을 은으로도 또한 염색하였다. 제1 용리된 분획에서 대략 66 kDa의 밴드가 검출되었으며, 이는 세포 부착으로부터 기원하는 BSA (우혈청 알부민)에 상응하는 것일 수 있다. 분획 2 및 3에서 회수된 단백질의 총량은 배양 배지 1 ℓ당 1.4 mg에 상응하였다. 풀링된 물질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 이는 본질적으로는 2개의 주요 밴드를 나타내었고, 추가로, 분해 생성물에 상응하는 것일 수 있는, 12 kDa 미만의 매우 약한 밴드도 나타내었다.
실시예 2
FcRn 결합 Z 변이체의 선별 및 ELISA 결합
본 실시예에서는 인간 FcRn을 Z 변이체의 파지 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 선별에서 표적으로 사용하였다. 선별된 클론을 DNA 서열분석하고, E. 콜라이 주변세포질 분획에서 제조하고, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법)로 FcRn에 대하여 검정하였다.
물질 및 방법
표적 단백질 FcRn의 , 및 B2M의 비오티닐화: 제조사의 권고 사항에 따라 31 x (FcRn) 및 10 x (B2M) 몰 과량으로 노-웨이트 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴(No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin) (피어스, 카탈로그 번호 21327)을 이용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 인간 FcRn 및 인간 B2M을 비오티닐화하였다. 반응은 실온 (RT)에서 30 min 동안 수행하였다. 이어서, 슬라이드-a-라이저(Slide-a-lyzer) 투석 카세트 (FcRn; 피어스, 카탈로그 번호 66380, 10,000 MWCO 및 B2M; 피어스, 카탈로그 번호 66333, 3,500 MWCO)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 완충제를 PBS로 교체하였다.
FcRn 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 본질적으로 문헌 [Groenwall et al. (2007) J Biotechnol, 128:162-183]에 기술된 바와 같이 파지미드 pAY02592에서 구축된, 박테리오파지 상에 디스플레이된 단백질 Z의 무작위 변이체의 라이브러리를 사용하여 FcRn 결합 Z 변이체를 선별하였다. 상기 라이브러리에서, 알부민 결합 도메인 (ABD, 스타필로코쿠스(Streptococcus) 균주 G148로부터의 단백질 G의 GA3)을 Z 변이체에의 융합 파트너로서 사용한다. 본 라이브러리를 Zlib006Naive.II로 나타내고, 1.5 x 1010개의 라이브러리 구성원 (Z 변이체)으로 이루어진 크기를 가진다. 파지미드 라이브러리 Zlib006Naive.II를 함유하는 글리세롤 스톡으로부터의 E. 콜라이 RRIΔM15 세포 (문헌 [Ruether et al., (1982) Nucleic Acids Res 10:5765-5772])를 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된, 20 ℓ의 규정된 프롤린 무함유 배지 [디포타슘 히드로겐포스페이트 7 g/ℓ, 트리소듐 시트레이트 이수화물 1 g/ℓ, 우라실 0.02 g/ℓ, YNB (디프코™ 이스트 니트로겐 베이스(Difco™ Yeast Nitrogen Base) w/o 아미노산, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 6.7 g/ℓ, 글루코스 알수화물 5.5 g/ℓ, L-알라닌 0.3 g/ℓ, L-아르기닌 모노히드로클로라이드 0.24 g/ℓ, L-아스파라긴 알수화물 0.11 g/ℓ, L-시스테인 0.1 g/ℓ, L-글루탐산 0.3 g/ℓ, L-글루타민 0.1 g/ℓ, 글리신 0.2 g/ℓ, L-히스티딘 0.05 g/ℓ, L-이소류신 0.1 g/ℓ, L-류신 0.1 g/ℓ, L-리신 모노히드로클로라이드 0.25 g/ℓ, L-메티오닌 0.1 g/ℓ, L-페닐알라닌 0.2 g/ℓ, L-세린 0.3 g/ℓ, L-트레오닌 0.2 g/ℓ, L-트립토판 0.1 g/ℓ, L-티로신 0.05 g/ℓ, L-발린 0.1 g/ℓ] 중에서 접종하였다. 배양물을 발효조 (벨라치 바이오테크니크(Belach Bioteknik), BR20)에서 37℃에서 성장시켰다. 세포의 600 nm (OD600)에서의 광학 밀도가 0.75에 도달하였을 때, 10 x 몰 과량의 M13K07 헬퍼 파지 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 카탈로그 번호 N0315S)를 이용하여 대략 2.6 ℓ의 배양물을 감염시켰다. 세포를 30 min 동안 인큐베이션시키고, 그 후, 발효조를, 발현 유도를 위해 100 μM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 보충되고, 25 ㎍/ml 카나마이신 및 12.5 ㎍/ml 카르베니실린으로 보충된, TSB-YE (트립틱 소이 브로쓰-이스트 익스트랙트(Tryptic Soy Broth-효모 추출물); 30 g/ℓ TSB, 5 g/ℓ 효소 추출물)로 최대 20 ℓ까지 충전시키고, 30℃에서 22 h 동안 성장시켰다. 15,900 g로 원심분리하여 배양물 중 세포를 펠릿화하였다. 문헌 [Groenwall et al., 상기 문헌 동일]에 기술된 바와 같이, 파지 입자를 PEG/NaCl (폴리에틸렌 글리콜/염화나트륨) 중에서 2회에 걸쳐 상청액으로부터 침전시키고, 여과하고, PBS 및 글리세롤 중에 용해시켰다. 파지 스톡을 사용 전 -80℃에서 보관하였다.
비오티닐화된 인간 FcRn에 대한 선별은 2개의 다른 트랙으로 나누어진 4 사이클로 수행하였다. 파지 스톡 제조 및 선별 방법은 본질적으로 WO2009/077175에 또 다른 비오티닐화된 표적에 대한 선별에 대하여 기술된 바와 같이 수행하였다. 선별 사이클 사이의 파지의 증폭은 E. 콜라이 RRIΔM15를 파지로 감염시킨 후, 하기와 같이 용액 내에서 배양함으로써 수행하였다. 용리된 파지 및 박테리아에 비해 10　x 과량의 M13K07 헬퍼 파지를 동시에 회전 없이 30 min 동안 37℃에서 로그기의 박테리아를 감염시키도록 한 후, 30 min 동안 천천히 회전시켰다. 감염에 앞서, 박테리아를 전상기 기술된, 규정된 프롤린 무함유 배지에서 로그기까지 성장시켰다. 파지 제조를 위해, 감염된 박테리아를 4,300 g로 10 min 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 0.1 mM IPTG, 25 ㎍/ml 카나마이신 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 200 ml TSB+YE 배지에 재현탁시키고, 30℃에서 밤새도록 배양하였다.
염산으로 pH 5.5로 조정되고, 0.1% 겔라틴 및 0.1% 트윈-20으로 보충된 선별 완충제는 100 mM 인산나트륨 및 150 mM 염화나트륨으로 이루어졌다. 선별시, 인간 혈청 알부민 (HSA, 알부컬트(Albucult), 노보자임즈(Novozymes))을 1.5 μM의 최종 ? 농도로 선별 완충제에 첨가하였다. 배경 결합 인자의 양을 감소시키기 위해, 파지 스톡을 다이나비즈? M-280 스트렙트아비딘(Dynabeads? M-280 Streptavidin) (SA-비즈(SA-beads), 다이날(Dynal), 카탈로그 번호 112.06)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 사전 선별을 수행하였다. 면역튜브 (눈크(Nunc), 카탈로그 번호 444474) 중에 고정화된 인간 B2M에 대하여 RT에서 30 min 동안 2차 사전 선별을 수행하였다. 카르보네이트 완충제 (시그마(Sigma), 카탈로그 번호 068K8214) 중 5 ㎍/ml의 인간 B2M를 7℃에서 >1 h 동안 튜브에 고정화시켰다. 수돗물로 2회 세척한 후, 사용 전, 튜브를 RT에서 30 min 동안 PBS　+　0.5% 카제인 (시그마, 카탈로그 번호 C8654)으로 차단하였다. 선별에 사용된 모든 튜브 및 비드는 PBS　+　0.1% 겔라틴으로 미리 차단시켰다. 선별은 RT에서 용액 중에서 수행하였고, 이어서, SA-비드 (2.9 ㎍의 비오티닐화된 FcRn 당 1 mg의 비드 사용) 상의 표적 파지 복합체의 포획이 이어졌다. 선별 사이클 1에서, 100 nM 비오티닐화된 FcRn이 사용되었고, 선별 완충제를 사용하여 각각 2 min 동안 2회의 세척을 수행하였다. 낮은 표적 농도 및 증가된 횟수의 세척을 사용하는 증가된 엄격도를 후속 사이클에 적용하였다: 50 nM/5회 세척, 25 nM/8회 세척 및 10 nM/12회 세척을 사이클 2, 3 및 4에 각각 적용하였다. 세척 후, 결합된 파지를 2개의 상이한 방법을 사용하여 두 선별 트랙으로부터 용리하였다; 1) 500 ㎕ 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.2, 50 ㎕ 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 및 450 ㎕ PBS로의 즉각적인 중화가 이어짐; 또는 2) 500 ㎕의 100 mM 인산나트륨 및 150 mM 염화 나트륨 (pH 8.0) 및 500 ㎕ PBS로 의 중화.
서열분석: 표준 PCR 프로그램 및 프라이머 AFFI-21 (5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg (서열번호 385)) 및 AFFI-22 (5'-cggaaccagagccaccaccgg (서열번호 386))를 이용하여 단일 콜로니로부터 PCR 단편을 증폭시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 사용된, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드 AFFI-72 (5'-비오틴-cggaaccagagccaccaccgg (서열번호 387)) 및 빅다이? 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트(BigDye? Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용하여 증폭된 단편의 서열분석을 수행하였다. 마그나트릭스(Magnatrix) 8000 (마그네틱 바이오솔루션(Magnetic Biosolution)) 장치를 이용하여 자기 스트렙트아비딘 코팅된 비드 (디태취 스트렙트아비딘 비즈(Detach Streptavidin Beads), 노르디아그(Nordiag), 카탈로그 번호 2012-01)에의 결합에 의해 서열분석 반응물을 정제하고, ABI 프리즘? 3130xl 제네틱 애널라이저(ABI PRISM? 3130xl Genetic Analyzer) (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems)) 상에서 분석하였다.
ELISA를 위한 Z 변이체의 제조: 100 ㎍/ml 암피실린 및 0.1 mM IPTG로 보충된, 10 ml TSB-YE 배지 로 선별로부터의 단일 콜로니를 접종함으로써 서열분석된 Z 변이체를 제조하고, 37℃에서 24 h 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 2 ml PBST (0.05% 트윈-20으로 보충된 PBS) 중에 재현탁시키고, -80℃에서 냉동시키고, 수조에서 해동시켜 세포의 주변세포질 분획을 유리시켰다. 냉동-해동 방법을 7회 반복한 후, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 주변세포질 추출물의 상청액은, AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG로 표시되는, ABD에의 융합물로서 Z 변이체를 함유하였다 (문헌 [Groenwall et al., 상기 문헌 동일]). Z#####은 개별, 58개의 아미노산 잔기 Z 변이체를 나타낸다.
Z 변이체의 ELISA K D 분석: ELISA 검정법으로 Z 변이체의 FcRn에의 결합을 분석하였다. 96 웰 ELISA 플레이트 면적의 절반부를 코팅 완충제 (50 mM 탄산나트륨, pH 9.6) 중에 희석된 2 ㎍/ml의 항-ABD 염소 항체 (자체적으로 제조)로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 항체 용액을 따라 내고, 웰을 RT에서 1.5 h 동안 100 ㎕의 PBSC (0.5% 카세인으로 보충된 PBS)로 차단시켰다. 차단 용액을 폐기하고, 1:4로 희석된, 50 ㎕ 주변세포질 용액을 웰에 첨가하고, 천천히 진탕시키면서, RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 따라 내고, 웰을 0.05% PCT 완충제 (pH 6.0) (맥일바인스(McIlvaines) 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 6.0), 0.05% 트윈-20으로 보충된 것) 또는 0.05% PCT 완충제 (pH 7.4 (맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 7.4), 0.05% 트윈-20으로 보충된 것)로 4회에 걸쳐 세척하였다. 표적 단백질인 비오티닐화된 인간 FcRn을 각각 PCC 완충제 pH 6.0 또는 pH 7.4, (맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 pH 6.0 또는 pH 7.4, 0.5% 카제인으로 보충된 것) 중에 2 ㎍/ml (45 nM) 내지 0.3 ng/ml (6.9 pM)의 1:3으로 희석된 농도 시리즈로 웰에 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기술된 바와 같이 세척하였다. 스트렙트아비딘 접합된 HRP (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 N100)를 각각 PCC 완충제 pH 6.0 또는 pH 7.4 중에 1:30,000으로 희석하고, 웰에 첨가한 후, 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 상기 기술된 바와 같이 세척한 후, 50 ㎕ 이뮤노퓨어(ImmunoPure) TMB 기질 (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 34021)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조사의 권고 사항에 따라 처리하였다. 다중 웰 플레이트 판독기, 빅토르3 (퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 비관련 특이 단백질에 결합하는 Z 변이체를 음성 대조군으로서 사용하였고, 주변세포질 단계를 생략함으로써 블랭크를 생성하였다. 실험 전 FcRn에 결합한 Z 변이체 (Z07918, 서열번호 1)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 상호작용의 친화도 (KD)를 측정하기 위해 그래프패드 프리즘 5 (그래프패드 소프트웨어, 인크.(GraphPad Software, Inc.)) 및 비선형 회귀를 사용하여 측정된 값을 분석하였다.
Z 변이체의 ELISA 특이성 분석: 또 다른 ELISA 실험에서, Z 변이체의 특이성을, Z 변이체를 각각 2 ㎍/ml 비오티닐화된 인간 단백질 B2M, PSMA (자체적으로 제조) 및 IgG (폴리클로날, 파마시아), 및 PCC 완충제 pH 6.0 또는 pH 7.4에 대하여 검정함으로써 시험하였다. 상기 기술된 바와 같이, 각각, pH 6.0 및 pH 7.4에서 검정을 수행하였다. 비오티닐화된 단백질 또는 완충제를 표적 단백질 단계에서 FcRn을 대신하여 웰에 첨가하였다.
결과
FcRn 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 비오티닐화된 인간 FcRn에 대한 파지 디스플레이 선별을 4 사이클에 걸쳐 수행한 후, 개별 클론을 수득하였다.
서열분석: 4회차 선별로부터 무작위로 채집된 클론에 대해 서열분석을 수행하였다. 각 Z 변이체에 고유 식별 번호 #####을 제공하고, 개별 변이체를 Z#####으로 지칭한다. 58개의 잔기 길이인 Z 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1-16 및 서열번호 353로서 도 1에 열거되어 있다.
상기 Z 변이체의 도출된 FcRn 결합 모티프 (BM)는 도 1의 서열번호 1-16 및 서열번호 353을 가지는 서열에서 잔기 8에서부터 잔기 36까지에 이른다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3 나선 다발을 구성하는 것으로 예측된, 49개의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열 (BMod)은 잔기 7에서부터 잔기 55까지에 이른다.
Z 변이체로의 ELISA 검정법: E. 콜라이에서 16개의 클론을 ABD 융합 단백질로서 제조하였다. 주변세포질 분획이 인간 FcRn의 희석 시리즈에 대한 ELISA에 사용되었다. 클론은 Z07909 (서열번호 13), Z07918 (서열번호 1), Z07930 (서열번호 6), Z07960 (서열번호 4), Z10109 (서열번호 3), Z10111 (서열번호 8), Z10127 (서열번호 12), Z10129 (서열번호 9), Z10140 (서열번호 5), Z10141 (서열번호 10), Z10145 (서열번호 15), Z10152 (서열번호 14), Z10156 (서열번호 11), Z10161 (서열번호 16), Z10183 (서열번호 7) 및 Z10193 (서열번호 2)이었다. pH 6.0에서는 모든 변이체에 대해 및 pH 7.4에서의 3개의 변이체에 KD 값을 측정하였다 (하기 표 2). pH 7.4에서는 13개의 변이체에 대한 KD 분석에 대한 데이터를 얻지 못했다. 인간 B2M, IgG 또는 PSMA에 대해 검정되었을 때, 16개의 변이체 중 어떤 것도 비특이적인 결합을 나타내지 않았다.
Figure pct00005
실시예 3
FcRn 결합 Z 변이체의 제조 및 특징 규명
본 실시예에서는 17개의 Z 변이체를 E. 콜라이에서 제조하고, 정제하고, 비아코어에서 인간 FcRn에 대하여 검정하였다. 상기 변이체의 서브세트 또한 마우스 FcRn 에 대하여 검정하였다. Z 변이체의 서브세트의 2차 구조를 조사하기 위해 Z 변이체의 서브세트에 대한 원편광 이색성 (CD) 분광분석을 수행하였다.
물질 및 방법
Z 변이체의 서브클로닝: 17개의 FcRn 결합 Z 변이체 (서열번호 1-16 및 서열번호 353)의 DNA를 라이브러리 벡터 pAY02592로부터 증폭시켰다. (또 다른 표적에 결합하는 Z 변이체에 대하여 본질적으로 WO2009/077175에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이) 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 N 말단 His6 태그를 사용하여 단량체 Z 변이체 분자를 구축하는 서브클로닝 전략법를 적용시켰다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 pAY01448로 서브클로닝하여 코딩된 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD를 얻었다.
추가로, VD 대신에 아미노산 AE로 시작하고, Z11948 (서열번호 354)로 나타낸 FcRn 결합 변이체 Z07918 (서열번호 1)을, Z 변이체들 사이에 2개의 상이한 링커를 가지고, C-말단 His6 태그가 이어지는 동종이량체 구축물로서 클로닝하였다. 클로닝은 DNA 증폭, 적합한 제한 효소로의의 제한 및 DNA의 라이게이션을 포함하는 종래의 분자생물학 방법을 이용하여 수행하였다. 2개의 링커는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 입수하였다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 (pET-26 기원, 노바겐(Novagen)) 내로 서브클로닝하여 각각 코딩된 서열 [Z#####]-GT-(G4S)-PR-[Z#####]-LEHHHHHH 및 [Z#####]-GT-(G4S)3-[Z#####]-LEHHHHHH를 얻었다.
배양 및 정제: 각 FcRn 결합 Z 변이체 각각의 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이 BL21(DE3) 세포 (노바겐)를 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 800 또는 1,000 ml의 TSB-YE 배지 중 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현을 유도하기 위해, IPTG를 OD600 = 2에서 최종 농도 0.17 또는 0.2 mM으로 첨가하고, 37℃에서 추가로 5 h 동안 배양물을 인큐베이션시켰다. 원심분리에 의해 세포를 수거하였다.
대략 2-5 g의 각 세포 펠릿을 벤조나제(Benzonase)? (머크(Merck), 카탈로그 번호 1.01654.0001)로 보충된, 10-25 ml 결합 완충제 (20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.4) 중에 15 U/ml 농도까지, 및 리소자임 (시그마, 카탈로그 번호 L-7651) 중에 0.5 mg/ml 농도까지 재현탁시켰다. 3회의 냉동-해동 사이클 또는 초음파처리에 의한 세포 파괴 후, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하고, 각 상청액을 1 ml His 그라비트랩(GraviTrap) IMAC 칼럼 (GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 11-0033-99)에 적용하였다. 세척 완충제 (20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 20 또는 60 mM 이미다졸, pH 7.4)로 세척하여 오염물을 제거하고, 이어서, FcRn 결합 Z 변이체를 용리 완충제 1 (20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, 250 mM 이미다졸, pH 7.4) 또는 용리 완충제 2 (0.1 M 아세트산, 0.5 M 염화나트륨, pH 4.5)으로 용리시켰다. 정제된 Z 변이체를, 제조자의 프로토콜에 따라, PD-10 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 PBS로 완충제 교환하였다. 단백질 농도를, 나노드롭? ND-1000(NanoDrop? ND-1000) 분광광도계를 사용하고, 각 단백질의 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 측정하였다. FcRn 결합 Z 변이체의 순도를 코마시 블루(Coomassie Blue)로 염색된 SDS-PAGE로 분석하였다. 각각의 정제된 FcRn 결합 Z 변이체의 아이덴티티는 LC/MS 분석을 이용하여 확인하였다.
CD 분석: 정제된 His6-태그 부착된 Z 변이체를 PBS 중에서 0.5 mg/ml로 희석하였다. 각각의 희석된 Z 변이체에 대해, 20℃에서 250-195 nm 또는 250-190 nm에서의 CD 스펙트럼을 수득하였다. 추가로, 융점 (Tm)을 측정하기 위해 다양한 온도 측정 (VTM)을 수행하였다. VTM에서, 5℃/min 온도 기울기로 온도를 20℃에서 90℃로 승온시키면서, 221 nm에서의 흡광도를 측정하였다. Z 변이체의 리폴딩 능력을 연구하기 위해 가열 절차 후 20℃에서 신규한 CD 스펙트럼을 수득하였다. 광로 길이가 1 mm인 셀을 사용하여, 자스코(Jasco) J-810 분광편광계 (자스코 스칸디나비아 AB(Jasco Scandinavia AB))에서 CD 측정을 수행하였다.
비아코어 결합 및 동역학적 분석: 비아코어 결합 및 동역학 분석: FcRn 결합 His6-태그 부착된 Z 변이체와 인간 FcRn의 상호작용을 비아코어 2000 기기 (GE 헬쓰케어)에서 분석하였다. 인간 FcRn을 유동 셀 중에서 CM5 칩 표면 (GE 헬쓰케어)의 카르복실화된 덱스트란 층 상에 고정화시켰다. 고정화는 제조자의 프로토콜에 따라 아민 커플링 화학을 사용하고, 러닝 완충제으로서 HBS-EP (GE 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. 분석물 주입 동안 블랭크로 사용하기 위해 칩 상의 하나의 유동 셀 표면을 활성화 및 탈활성화시켰다. 하기에 제시하는 2개의 결합 실험에서, 0.005% 트윈-20 (0.005% PCT)으로 보충된 맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 6.0)를 러닝 완충제로 사용하였다. 모든 실험에서, 50 ㎕/min의 유속이 사용되었다.
한 실험에서, pH 6.0에서의 해리를 pH 7.4에서의 해리와 비교하였다. His6-태그 부착된 Z 변이체 및 인간 모노클로날 IgG1을, 각각 250 nM 또는 2.5 nM의 최종 농도로 러닝 완충제 중에서 희석하고, 공동 주입 절차를 이용하여 FcRn 칩 위에 1분간 주입하였다. 상호작용의 해리 단계를 나타내는, 공동 주입 절차의 2차 주입은, 러닝 완충제 (pH 6.0) 또는 0.005% PCT (pH 7.4)를 함유하였다. 러닝 완충제 중에서의 5분 동안의 표면 평형화 이전에, Z07918 및 Z10193을 제외한 Z 변이체들은 4분간 해리되도록 하고, 상기 Z07918 및 Z10193은 1분간 해리되도록 한다. IgG는 평형화 전에 4분간 해리되도록 하였다. 완충제 주입을 유사한 방식으로 수행하였다; 완충제 pH 6.0에 이어서, pH 6.0의 공동 주입 또는 완충제 pH 6.0에 이어서, pH 7.4의 공동 주입. 결과는 비아이벨류에이션 소프트웨어 4.1 (GE 헬쓰케어)에서 분석하였다. 블랭크 표면의 곡선을 리간드 표면의 곡선으로부터 감산하였다. 추가로, 완충제 효과를 조정하기 위해, 완충제 주입의 곡선을 Z 변이체 곡선 및 IgG 곡선으로부터 감산하였다.
또 다른 실험에서, His6-태그 부착된 Z 변이체의 서브세트에 대한 대략적 동역학적 상수 (k온 및 k오프) 및 친화도 (KD)를 측정하였다. 3가지 농도의 Z 변이체를 1분 동안 주입한 후, 러닝 완충제 중에서 1분 동안 해리시켰다. 다음 사이클 시작 이전에, 표면을 러닝 완충제로 7.5분 동안 평형화시켰다. 주입된 농도는 675 nM, 225 nM 및 75 nM (Z10140, Z10156 및 Z10183) 또는 225 nM, 75 nM 및 25 nM (Z07918 및 Z10193) 중 하나였다. 동역학적 상수를 비아이벨류에이션 소프트웨어 4.1 (GE 헬쓰케어)의 랭뮤어 1:1 모델을 이용한 센소그램으로부터 계산하였다.
별개의 실험에서, 각각 hFcRn (서열번호 379) 및 mFcRn (서열번호 384)에 대한 Z 변이체의 상호작용의 친화도를 pH 6.0 및 pH 7.4 둘 모두에서 비아코어 3000 기기 (GE 헬쓰케어)로 측정하였다. hFcRn 및 mFcRn을, 본질적으로, 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였지만, mFcRn의 제조를 위해 인간 SKOV-3 세포 대신 마우스 3T3 세포를 사용하였고, pH 4.65에서 아세테이트 완충제 중 CM5 칩 상의 별도의 유동 셀에 고정화시켰다. 두 수용체 모두에 대한 고정화 수준은 대략 1,000 RU였다. 활성화 및 탈활성화로 참조 유동 셀을 제조하였다. 0.005% PCT pH 6.0 또는 7.4를 러닝 완충제로서 및 분석물의 희석을 위해서 사용하였다. 모든 분석은 25℃에서 수행하였다. His6-태그 부착된 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1), Z07960 (서열번호 4) 및 Z10193 (서열번호 2)에 대한 친화도 상수를 1,024 nM 내지 0.5 nM (pH 6.0) 또는 10,240 nM 내지 5 nM (pH 7.4)의 희석액 시리즈를 주입함으로써 측정하였다. 한 부위 결합 포화 모델을 이용하여 친화도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 사용하여 도출해 내었다.
알파LISA ( AlphaLISA ) 차단 검정법: 알파LISA 검정법에서 엔스파이어(EnSpire) 다중플레이트 판독기 2300 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 사용하여 IgG의 FcRn에의 결합을 억제시킬 수 있는 Z 변이체의 잠재능을 분석하였다. 인간 IgG (록템라)(Roactemra)를 제조자의 권고 사항에 따라 알파LISA 어셉터 비드 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6772002) 상에 고정화시켰다. His-태그 부착된 Z 변이체의 1:3의 단계식으로 연속하여 최종 250 nM 내지 38 pM로 희석된 희석액을 384-웰 플레이트 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 G6005350)에서 제조하였고, HCl을 이용하여 pH 6.0으로 조정된 알파LISA 완충제 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AL000F) 중에서 10 nM 비오티닐화된 인간 FcRn (바이오바이트(Biorbyt), 카탈로그 번호 orb84388; 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 비오티닐화된 것)과 함께 45 min 동안 인큐베이션시켰다. IgG로 코팅된 어셉터 비드를 10 μM의 최종 농도까지 첨가하고, 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 스트렙트아비딘으로 코팅된 도너 비드 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6772002)를 40 ㎍/ml의 최종 농도까지 첨가하고, 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 모든 인큐베이션은 암실에서 RT에서 수행하였다. 플레이트를 엔스파이어 기기로 분석하였고, 그래프패드 프리즘 5를 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
결과
배양 및 정제: N-말단 His6과 함께 구축된, 17개의 FcRn 결합 Z 변이체 (서열번호 1-16 및 서열번호 353)를 E. 콜라이에서 제조하였다. 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광분석법으로 측정된, 대략 2-5 g의 박테리아 펠릿으로부터 IMAC-정제된 단백질의 양은 상이한 FcRn 결합 Z 변이체에 대해 대략 10 mg 내지 20 mg 범위였다. 각각의 최종 단백질 제제에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 이들은 FcRn 결합 Z 변이체를 우세하게 함유하는 것으로 나타났다. 각 FcRn 결합 Z 변이체의 정확한 아이덴티티 및 분자량을 HPLC-MS 분석으로 확인하였다.
CD 분석: 6개의 Z 변이체에 대하여 측정된 CD 스펙트럼 결과, 각각 20℃에서 α-나선 구조를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 또한, 융점 (Tm)이 측정된 가변 온도 측정으로 입증되었다 (하기 표 3). 90℃까지 가열하기 이전 및 이후에 측정된 스펙트럼들을 중첩하였을 때, 6개의 Z 변이체에 대한 가역적인 폴딩이 관찰되었다.
Figure pct00006
비아코어 결합 및 동역학적 분석: pH 6.0에서 및 완충제 pH 6.0 또는 pH 7.4 중 하나에서 Z 변이체를 각각 FcRn을 함유하는 칩 표면 위에 순차적으로 주입함으로써 인간 FcRn에의 17개의 His6-태그 부착된 Z 변이체의 결합 및 상이한 pH에서의 해리를 비아코어 기기에서 시험하였다. 표면의 리간드 고정화 수준은 1668 RU 인간 FcRn이었다. 17개의 Z 변이체는 pH 6.0에서 FcRn에의 결합을 보였고, 모든 변이체의 경우, pH 6.0에 비해 pH 7.4에서 더 빠른 오프 속도를 나타내었다. IgG에 대한 결과도 유사하였는데, pH 7.4에서 더 빠른 오프 속도를 보였다. 변이체 Z07918 및 Z10193은 가장 느린 해리 곡선을 나타내었다. 변이체의 서브세트 및 IgG에 대한 센소그램은 도 2a-e에 제시되어 있다.
Figure pct00007
pH 6.0에서 FcRn과 상호작용하는 5개의 Z 변이체의 동역학적 상수를 측정하였다 (하기 표 4 참조). 표면의 고정화 수준은 2015 RU 인간 FcRn이었다. 각각의 Z 변이체에 대한 동역학적 상수는 3개의 주입 농도의 곡선 세트를 사용하여 계산하였다.
pH 6.0 및 pH pH 7.4에서 인간 및 마우스 FcRn과 상호작용하는 His6-태그 부착된 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1), Z07960 (서열번호 4) 및 Z10193 (서열번호 2)에 대한 친화도 (KD) 상수도 또한 측정하였다 (하기 표 5). 3개의 변이체 모두, pH 7.4과 비교하였을 때 pH 6.0에서의 KD 값이 더 낮았다.
Figure pct00008
Figure pct00009
알파LISA 차단 검정법: 17개의 His6-태그 부착된 단량체 Z 변이체 (서열번호 1-16 및 서열번호 353) 및 2개의 이량체 변이체, Z11948-G4S-Z11948 및 Z11948-(G4S)3-Z11948의 FcRn에의 IgG 결합을 억제시킬 수 있는 능력을 알파LISA 차단 검정법으로 시험하였다. Z 변이체의 연속 희석액을 비오티닐화된 인간 FcRn과 함께 인큐베이션시키고, 각 변이체 각각의 차단 능력을 IgG로 코팅된 어셉터 비드, 및 이어서, 스트렙트아비딘으로 코팅된 도너 비드의 첨가 후 측정하였다. 억제는 양성 Z 변이체에 대한 알파LISA 계수의 감소로 측정할 수 있다. 본 검정법에서, FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 것으로 나타난 10개의 단량체 변이체 및 2개의 이량체 변이체에 대하여 계산된 IC50 값은 표 6에 제시되어 있다.
실시예 4
FcRn 결합 Z 변이체의 인간 또는 마우스 FcRn / eGFP로 형질감염된
HeLa 세포에의 결합
본 실시예에서는, FcRn 결합 Z 변이체의 결합 능력을 조사하였다. 인간 및 뮤린 FcRn-eGFP 유전자 트랜스진을 발현하는 HeLa 세포의 제조 및 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)? 647로 표지된 Z 변이체를 이용하는 유세포 분석법을 위한 상기 세포의 용도를 기술한다.
물질 및 방법
FcRn - eGFP 및 B2M 바이러스 벡터의 클로닝: 뮤린 FcRn (mFcRn, 진뱅크 BC003786.1, 오픈바이오시스템즈) 및 뮤린 B2M (mB2M, 진뱅크 BC085164.1, 오픈바이오시스템즈)을 코딩하는 유전자를 실시에 1에 기술된 바와 같이 인간 FcRn 및 인간 B2M에 대한 유전자와 유사한 방식으로 증폭시켰다. 인간 및 뮤린 FcRn 및 B2M 유전자를 하기와 같이 증폭시켰다: hFcRn의 경우, 아미노산 1-365 (서열번호 382)를 코딩하는 서열을 증폭시키고; hB2M의 경우, 아미노산 21-119 (서열번호 380)를 코딩하는 서열을 증폭시키고; mFcRn의 경우, 아미노산 1-369 (서열번호 383)를 코딩하는 서열을 증폭시키고; mB2M의 경우, 아미노산 21-119 (서열번호 381)를 코딩하는 서열을 증폭시켰다. 벡터 pHR-cPPT-CMV-EGFP (문헌 [Jakobsson et al. (2003) J Neurosci Res 73:876-85]) 및 FcRn PCR 앰플리콘 (인간 및 뮤린)을 제한 효소 BamHI (인간) 또는 BclI (뮤린) 및 MluI (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 각각 카탈로그 번호 R0136M, R0160L 및 R0198L)를 사용하여 절단하고, T4 DNA 리가제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 카탈로그 번호 M0202M)를 사용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션 믹스를 E. 콜라이 RRIΔM15에 화학적으로 형질전환시켰고, 암피실린 플레이트에 도말하였다. 콜로니를 채취하고, 적합한 프라이머 쌍으로 스크리닝하였다. 세포질 테일에 원래의 신호 펩티드, 인간 또는 뮤린 FcRn 및 eGFP를 코딩하는 구축물을 서열분석에 의해 확인하고, 각각,pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP 및 pHR-cPPT-CMV-mFcRn-eGFP로 지정하였다.
인간 및 뮤린 B2M PCR 앰플리콘을 제조자의 권고 사항에 따라 게이트웨이 시스템 (인비트로겐, 카탈로그 번호 11789020, 게이트웨이? BP 클로나제? II 엔자임 믹스)를 사용하여 재조합에 의해 플라스미드 pDONOR221 (인비트로겐, 카탈로그 번호 12536-017) 내로 삽입하였다. 정확한 서열의 확인 후, 다중 부위 게이트웨이 클로닝 시스템 (인비트로겐, 카탈로그 번호 11791020, 게이트웨이? LR 클로나제? II 엔자임 믹스)을 사용하여 프로모터 함유 플라스미드 pENTR-CMV (문헌 [Tai et al. 상기 문헌 동일])와 함께 p2k7_gtc (문헌 [Suter et al., 상기 문헌 동일]) 내로 인간 또는 뮤린 B2M을 삽입하여 각각 벡터 2k7neo-CMV-hB2M 및 2k7neo-CMV-mB2M을 수득하였다.
HeLa 세포의 렌티바이러스 형질도입: 벡터 쌍 2k7neo-CMV-hB2M 및 pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP 또는 2k7neo-CMV-mB2M 및 pHR-cPPT-CMV-mFcRn-eGFP를 VSV-G 외피 및 gag/pol 패키징 플라스미드와 함께 염화칼슘 형질감염을 사용하여 HEK293T 세포 내로 공동 형질감염시켰다 (문헌 [Zufferey et al., 상기 문헌 동일]; [Jakobsson et al. (2006) 상기 문헌 동일]). 각각 FcRn 및 B2M 트랜스진과 함께, 형성된 렌티바이러스 입자를 함유하는 HEK293T 배양 상청액을 사용하여 계대접종수가 낮은 HeLa 자궁경부 선암종 세포 (셀 라인 서비스(Cell line Service))에 순차적으로 형질도입하였다. 생성된 2개의 안정적으로 형질도입된 HeLa 세포주를 하기에서 hFcRn-eGFP (인간 FcRn-eGFP 및 hB2M에 대한 유전자로 형질도입됨) 및 mFcRn-eGFP (마우스 FcRn-eGFP 및 mB2M에 대한 유전자로 형질도입됨)로 지정한다.
FcRn 결합 Z 변이체의 알렉사 플루오르? 647 표지: 3개의 His6-태그 부착된 Z 변이체 Z07918, Z07930 및 Z07960을 알렉사 플루오르? 647 카르복실산 숙신이미딜 에스테르 (인비트로겐 카탈로그 번호 A20106)로 표지하였다. 표지 전에, 완충제를 10,000 g로 회전하는 비바스핀500(Vivaspin500) 원심분리 필터 유닛 (10 kDa MWCO, 비바프로덕츠(Vivaproducts) 카탈로그 번호 512-2838)을 사용하여 0.2 M 카르보네이트 완충제 (pH 8.3)로 교체하였다. 비바스핀500 중에서 표지를 수행하고, 1 ㎕의 알렉사 플루오르? 647 숙신이미딜 에스테르 염료 (1.3 x 몰 과량에 상응하는, DMSO 중 40 ㎍/㎕)를 200 ㎍/25 ㎕ Z 변이체에 첨가하였다. 믹스를 암실에서 위글링 로타 믹서(wiggling rota mixer)에서 RT에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 반응 믹스를 3.5시간 동안 얼음 위에 놓고, 비바스핀500 중 15 x 100 ㎕ PBS로 세척하여 유리 염료를 제거하였다.
FcRn 결합 Z 변이체를 이용한, 인간 및 마우스 FcRn - eGFP로 형질감염된 HeLa-세포의 면역형광 염색: hFcRn-eGFP 및 mFcRn-eGFP HeLa 세포를 트립신 처리하여 수거하고, 계수 이전에 PBS (pH 6.0) 중에서 2회에 걸쳐 세척하였다. v-바닥 96 웰 플레이트 (눈크, 카탈로그 번호 277143)의 웰 당 100,000개의 세포를 피펫팅한 후, 플레이트 중의 세포를 4℃에서 4 min 동안 1,700 rpm으로 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 RT에서 10 min 동안 PBS (pH 6.0) 중 50 ㎕의 2% 포름알데히드 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 F8775)로 고정시켰다. 이후, 세포를, 카제인으로 포화된, 2 x 100 ㎕ PBS (pH 6.0) (PBSC)로 세척하고, 620 nM의 알렉사 플루오르? 647 표지된 His6-태그 부착된 Z 변이체; Z07960, Z07930 및 Z07918을 함유하는, 0.1% 사포닌 (알리켐(AppliChem), 카탈로그 번호 A4518.0100)을 포함하는 PBSC 중에 재현탁시켰다. 완충제 단독으로 이와 함께 인큐베이션된, 형질도입된 HeLa 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 암실에서 진탕기 상에서 8℃로 1 h 동안 인큐베이션시키고, 2 x 100 ㎕ PBSC로 세척하고, 1% BSA (분획 V, 머크(Merck), 카탈로그 번호 1.12018.0100)를 함유하는, 180 ㎕의 PBS (pH 6.0) 중에 재현탁시켰다. 10,000개의 세포/웰을 갈리오스(Gallios) 유세포 분석기 (베크만 쿨터(Beckman Coulter))에서 분석하고, 데이터를 칼루자(Kaluza) 소프트웨어 (베크만 쿨터)를 사용하여 분석하였다.
결과
유세포 분석법 분석을 사용하여, FcRn 결합 Z 변이체가 인간 또는 마우스 FcRn/eGFP가 형질도입된 HeLa 세포 상의 인간 및/또는 마우스 FcRn에 결합할 수 있는지 여부를 측정하였다. 실험은 pH 6.0에서 알렉사 플루오르? 647로 표지된 Z07960, Z07930 및 Z07918 (각각 서열번호 4, 6 및 1)을 사용하여 수행하였다. 점도표 분석 (y축:알렉사 플루오르? 647, x축: eGFP) 결과, 형질도입된 세포 집단이 FcRn-eGFP 음성 및 양성 집단 (도 3, 각각 게이트 H 및 I)으로 나누어질 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 HeLa 세포에 의한 FcRn-eGFP 융합 단백질의 이질성 발현을 나타내는 것이다 (도 3). 따라서, 게이트 I에서 알렉사 플루오르? 647에 대한 평균 형광 강도 (MFI) 값에서 게이트 H에서의 알렉사 플루오르? 647의 배경 MFI 값을 감산하였다. 계산된 MFI 값은 도 4에 제시되어 있다. 본 결과는 Z07960, Z07930 및 Z07918이 인간 (도 4a) 또는 뮤린(도 4b) FcRn-eGFP를 나타내는 HeLa 세포에 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 5
FcRn 결합 Z 변이체 Z07918을 이용한 FcRn에의 IgG 결합 차단
본 실시예에서는 세포 기반 검정법으로 FcRn에의 결합에 대하여 IgG와 FcRn 결합 Z 변이체의 잠재적인 경쟁을 조사하였다. 상기 결합을 통해 IgG-FcRn 상호작용은 차단될 것이다.
물질 및 방법
IgG - FcRn 면역형광 염색의 차단: 인간 또는 뮤린 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. 고정된 세포를 100 nM 알렉사 플루오르? 647-접합된 인간 또는 마우스 IgG (잭슨 라보라토리즈(Jackson laboratories), 각각 카탈로그 번호 009-600-003 및 015-600-003) 및 0.1% 사포닌 (알리켐)을 함유하는, PBS-카제인 (pH 6.0)에 희석된 1,000, 100, 10, 1 또는 0 (완충제 대조군) nM His6-태그 부착된 Z07918로 이루어진 50 ㎕ 믹스에 재현탁시켰다. 세포를 암실에서 진탕기 상에서 37℃로 1 h 동안 인큐베이션시키고, 2 x 100 ㎕ PBS-카제인 (pH 6.0)으로 세척하고, 1% BSA를 함유하는, 180 ㎕의 PBS (pH 6.0)에 재현탁시켰다. 10,000개의 세포/웰 (마우스 100 nM mIgG-알렉사 플루오르? 647의 경우, 다소 더 적은 세포 제외)로부터 얻은 데이터를 갈리오스 유세포 분석기 (베크만 쿨터)를 사용하여 수득하였고, 데이터를 칼루자 소프트웨어 ((베크만 쿨터))를 사용하여 분석하였다.
결과
FcRn 결합 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1)이 IgG-FcRn 상호작용을 차단하는지 여부를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 인간 또는 뮤린 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 인간 또는 마우스 알렉사 플루오르? 647-접합된 IgG와 함께 인큐베이션시켰다. 결합을 상이한 농도의 비표지 Z07918로 차단하였다. 형질도입된 HeLa 세포에 의한 FcRn의 이질성 바현에 기인하여 (실시예 4에 기술됨), 게이트 N에서의 각 샘플의 알렉사 플루오르? 647에 대한 MFI 값에서 게이트 M에서의 상응하는 MFI 값을 감산하였다 (도 5). 상이한 MFI 값들을 블랭크 대조군에 대한 MFI로 나누어 IgG 알렉사 플루오르? 647 결합율(%)을 계산하였다. 본 결과, Z07918이 용량에 의존하는 방식으로 hFcRn에의 hIgG 결합을 효과적으로 차단시키는 것으로 나타났다 (도 6a). 추가로, 비록 hIgG 결과과 비교하였을 때에는 그에 비하여 덜 효율적이었지만, Z07918 또한 mFcRn에의 mIgG 결합을 차단시켰다 (도 6b).
실시예 6
3개의 FcRn 결합 Z 변이체에 대한 약동학적 연구
본 실시예에서는 마우스에서 수행된 약동학적 연구에 의해 비특이적 Z 변이체의 혈청 반감기를 연장하시킬 수 있는 FcRn 결합 Z 변이체의 능력을 조사하였다.
물질 및 방법
Z 변이체의 서브클로닝: Z 변이체의 서브세트 (Z07918, Z07960 및 Z10193) 에 대해 2차 서브클로닝을 수행하였다. 실시예 3에서 서브클로닝된 His6-태그 부착된 변이체로부터의 DNA를 주형으로 사용하였다. 먼저, 적합한 프라이머 쌍을 사용한 PCR 증폭을 수행하여, VD 대신에 아미노산 AE로 시작하는 Z 변이체를 코딩하는 유전자를 제조하였다. 돌연변이화된 Z 변이체는 도 1에 열거되어 있고, 각각 돌연변이화된 Z07918, Z07960 및 Z10193에 상응하는 것인, Z11948 (서열번호 354), Z11946 (서열번호 355) 및 Z11947 (서열번호 356)로 지정하였다. 신규한 Z 변이체를 코딩하는 유전자를 제한 절단하고, 스페이서 서열과 함께 알부민 결합 변이체 PP013 (서열번호 377) 및 Z03638 (서열번호 378)을 코딩하는 유전자를 보유하는 벡터 내로 라이게이션시켜 [Z#####]-GAP(G4S)4TS-[PP013]-GT(G4S)4PR-[Z03638] (이는 또한 "Z#####-PP013-Z03638" 또는 "PP013-Z03638과 융합된 "Z 변이체"로도 나타냄)을 코딩하는 유전자 융합물을 얻었다. (G4S)4 링커 및 PP013에 대한 서열을 함유하는 벡터 내로 Z03638을 라이게이션시킴으로써 음성 대조군 분자 [Z03638]-GAP(G4S)4TS-[PP013]을 유사한 방식으로 서브클로닝하였다. 후속되는, E. 콜라이로의 벡터 형질전환 단계를 실시예 3과 같이 수행하였다.
배양 및 정제: 실시예 3에 기술된 바와 같이 E. 콜라이에서 PP013-Z03638과 융합된 Z 변이체를 제조하였다. 대략 3 g의 각 세포 펠릿을, 벤조나제? (머크)로 보충된, 30 ml TST-완충제 (25 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.05% 트윈20, pH 8.0) 중에 재현탁시켰다. 초음파 처리에 의해 세포를 파괴하고, 원심분리에 의해 정화시킨 후, 각 상청액을 항-ABD 리간드로 고정화된 5 ml 아가로스와 함께 중력 유동 칼럼 상에 적용시켰다 (WO2014/064237 참조). TST-완충제 및 5 mM NH4Ac 완충제 (pH 5.5)로 세척한 후, Z 변이체를 0.1 M HAc로 용리시켰다. 항-ABD 아가로스 친화도 크로마토그래피 정제 단계로부터의 용리된 분획에 아세토니트릴 (ACN)을 10%의 최종 농도로 첨가하고, RPC 용매 A (0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA), 10% ACN, 90% 물)로 사전에 평형화된, 3 ml 리소스(Resource) 15RPC 칼럼 (GE 헬쓰케어) 상에 샘플을 로딩하였다. RPC 용매 A로 칼럼을 세척한 후, 결합된 단백질을 60 ml 중의 선형 구배 0-50% RPC 용매 B (0.1% TFA, 80% ACN, 20% 물)로 용리시켰다. 순수한 Z 변이체를 함유하는 분획을 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하고, 풀링하였다. RPC 정제 후, 풀의 완충제를 HiPrep 26/10 탈염 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 PBS로 교체하였다. 마지막으로, Z 변이체를 1 ml 엔도트랩(EndoTrap) 레드 칼럼 (하이글로스(Hyglos), 카탈로그 번호 321063)에서 정제하여 확실히 내독소 함량이 낮게 하였다.
정제된 Z 변이체 각각의 단백질 농도, 순도 및 아이덴티티를 실시예 3에 기술된 바와 같이 분석하였다.
비아코어 분석: 발현 및 정제된, PP013-Z03638에 융합된 Z 변이체를, 본질적으로, 실시예 3에서의 동역학적 분석에 대해 기술된 바와 같이 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대하여 검정하였다. Z 변이체 및 음성 대조군 Z03638-PP013을 1분 동안 40 nM, 160 nM 및 640 nM로 주입하고, 2.5분 동안 해리시키고, 1분 동안 평형화시켰다. 비아이벨류에이션 소프트웨어를 사용하여 Z 변이체에 대한 동역학적 상수 및 친화도를 측정하였다.
약동학적 연구: PP013-Z03638에 융합된 ZZ11947, Z11946 및 Z11948을 수컷 NMRI 마우스 (찰스 리버(Charles River: 독일))에게 92 nmol/kg (체중)의 용량으로 정맥내 (i.v.) 투여하였다. 0.08, 6, 18, 78, 120, 168 및 240시간째에 3마리의 마우스로 이루어진 군으로부터 혈청을 수득하였다. 각각의 Z 변이체의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.
ELISA: 반면적 96-웰 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 (50 mM 탄산나트륨, pH 9.6) 중에 4 ㎍/ml로 희석된, 50 ㎕/웰의 Z 특이적 염소 항체 (자체적으로 제조)로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 항체 용액을 따라 버리고, 웰을 100 ㎕의 PBSC로 RT에서 1.5 h 동안 차단하였다. 혈청을 희석 플레이트 내에서 1% 마우스 혈청 (매트릭스)을 함유하는 PBSC 중에서 1:100에서부터 1:51,200까지 2배 희석 시리즈로 희석하였다. 매트릭스에 희석된 4개 품질의 대조군 (매우 낮음, 낮음, 중간 및 높은 대조군) 및 각각의 Z 변이체에 대한 표준 역가를 각 플레이트에 포함시켰다. 웰당 50 ㎕의 희석액을 옮겨 놓고, ELISA 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. 결합된 Z 변이체를 PBSC 중에 4 ㎍/ml로 희석된 50 ㎕/웰의 토끼 항-PP013 Ig (자체적으로 제조)로 검출하였다. 이어서, 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기술한 바와 같이 세척하였다. PBSC 중에서 1:20,000으로 희석된, 잭슨 라보라토리즈로부터 입수한, HRP 접합된 당나귀 항-토끼 HRP (카탈로그 번호 711-035-152)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 기술한 바와 같이 세척한 후, 50 ㎕ 이뮤노퓨어 TMB 기질을 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조사의 권고 사항에 따라 현상시켰다. 15분 동안 현장시킨 후, 다중 웰 플레이트 판독기 (빅토르3)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값을 그래프패드 프리즘 5를 이용하여 분석하여 농도 (3차 스플라인 곡선 피트) 및 곡선하 면적 (AUC)을 측정하였다. 이어서, 농도를 시간에 대한 자연 로그로 플롯팅하였다. 작성된 곡선은 2 구획 모델을 따라 진행하였고, 종말 반감기를, 마지막 3개의 시점에 기초한 기울기로 나눈 ln2로서 계산하였다.
결과
배양 및 정제: Z#####-PP013-Z03638, 및 음성 대조군 Z03638-PP013으로 구축된 3개의 FcRn 결합 Z 변이체 Z11947, Z11946 및 Z11948 (서열번호 356, 355 및 354)을 E. 콜라이에서 제조하였다. 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광분석법으로 측정된, 대략 3 g 박테리아 펠릿으로부터 정제된 단백질의 양은, 상이한 FcRn 결합 Z 변이체에 대하여 대략 10 내지 25 mg 범위였다. 각각의 최종 단백질 제제에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 이들은 각 FcRn 결합 Z 변이체를 우세하게 함유하는 것으로 나타났다. 각각의 FcRn 결합 Z 변이체에 대한 정확한 분자량은 LC/MS 분석에 의해 확인하였다.
Figure pct00010
비아코어 분석: 3개의 PP013-Z03638 융합 Z 변이체의 FcRn에의 결합을 분석하였다. 표면의 고정화 수준은 548 RU 인간 FcRn이었다. pH 6.0에서의 표적 결합에 대해 얻은 대략적인 동역학적 상수 및 친화도는 표 7에 제시되어 있다. 피팅된 곡선은 도 7a-c에 제시되어 있다. 음성 대조군 Z03638-PP013은 FcRn에 대하여 음성이었다.
약동학적 연구: 마우스 약동학적 연구에서, PP013-Z03638에 융합된 Z 변이체의 상기 기술된 구축물의 약동학적 프로파일을 음성 대조군 Z03638-PP013과 비교하였다. 예를 들어, PCT 출원 WO2009/016043에 기술된 바와 같은 이전의 연구에서는, 혈청 알부민에의 ABD 결합으로 인해, ABD 융합 단백질이 혈청 중에서 긴 반감기를 가진다는 것을 보여주고 있다. 이전의 결과에 따르면, ABD가 융합된 Z 변이체 분자 (Z03638-PP013)의 종말 반감기는 대략 43시간이었고, 이는 마우스 알부민의 반감기 (35 시간)에 필적한다. ABD 이외에도 FcRn 결합 Z 변이체 분자를 함유하는 구축물의 종말 반감기는 2 내지 3배 더 길었다 (도 8). 계산된 종말 반감기는 99시간 (Z11947), 69시간 (Z11946) 및 58시간 (Z11948)이었으며, 이는 Z 변이체의 FcRn 결합이 연장된 반감기에 기여하였다는 것을 시사한다.
실시예 7
FcRn 결합 Z 변이체의 성숙 라이브러리의 디자인 및 구축
본 실시예에서는 성숙 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리는 FcRn 결합 Z 변이체의 선별을 위해 사용하였다. 일반적으로는 성숙 라이브러리로부터의 선별을 통해서 친화도가 증가된 결합 인자를 얻게 될 것으로 예상된다 (문헌 [Orlova et al., (2006) Cancer Res 66(8):4339-48]). 본 연구에서는 합성 중 원하는 위치에 정의된 코돈을 도입할 수 있는 스플릿-풀 합성(split-pool synthesis)을 사용하여 무작위화된 단일 가닥 링커를 생성하였다.
물질 및 방법
라이브러리 디자인: 라이브러리는 표 1 및 실시예 2-6에 추가로 기술된 인간 FcRn 결합 Z 변이체의 16개의 서열을 기반으로 하였다. 신규 라이브러리에서, Z 분자 스캐폴드 내 13개의 가변 위치는 주로 서열번호 1-16에 정의된 Z 변이체의 결합 모티프를 기반으로 하는 전략에 따라 특정 아미노산 잔기로 편향되었다. 하기 아미노산 서열의 147 bp의 부분적으로 무작위화된 나선 1 및 2를 함유하는 DNA 링커를 스플릿-풀 합성을 사용하여 생성하였다: 제한 부위 XhoI 및 SacI 측면에 위치하는 5'- AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A -3' (서열번호 388; 무작위화된 코돈은 NNN로 표시)을 DNA 2.0 (멘로 파크(Menlo Park: 미국 캘리포니아주))으로부터 주문하였다. Z 분자 스캐폴드 중의 8개의 가변 아미노산 위치 (9, 10, 11, 13, 14, 24, 32 및 35) 및 5개의 불변 아미노산 위치 (17, 18, 25, 27 및 28)를 포함하는, 신규 라이브러리 중의 아미노산 잔기의 이론적인 분포는 하기 표 8에 제시되어 있다. 생성된 이론상의 라이브러리 크기는 5.3 x 108 변이체이다.
Figure pct00011
라이브러리 구축: 라이브러리를 12 사이클의 PCR 동안 암플리Taq 골드(AmpliTaq Gold) 폴리머라제 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 카탈로그 번호 4311816)를 사용하여 증폭시키고, 풀링된 생성물을 공급자의 권고 사항에 따라 QIA퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (퀴아제(QIAGEN), 카탈로그 번호 28106)로 정제하였다. 무작위화된 라이브러리 단편의 정제된 풀을 제한 효소 Xho I 및 SacI-HF (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 카탈로그 번호 R0146L, 및 제한 효소 XhoI 및 SacI-HF (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 카탈로그 번호 R0146L, 및 카탈로그 번호 R3156M)로 분해하고, PCR 정제 키트를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성물에 대하여 분취용 2.5% 아가로스 (누이시브(Nuisieve) GTC 아가로스, 캄브랙스(Cambrex), 인비트로겐) 겔 전기영동을 수행하고, 공급자의 권고 사항에 따라 퀴아젠 겔 추출 키트 (퀴아젠, 카탈로그 번호 28706)를 사용하여 정제하였다.
파지미드 벡터 pAY02592 (본질적으로, 문헌 [Gronwall et al., 상기 문헌 동일]에 기술된 pAffi1)를 동일한 효소로 제한하고, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 이용하여 정제하였다. 제한된 단편 및 제한된 벡터를 5:1의 몰비로 T4 DNA 리가제 (퍼멘타스(Fermentas), 카탈로그 번호 EL0011)로 RT에서 2시간 동안 라이게이션시킨 후, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 회수한 후, 10 mM 트리스-HCl (pH 8.5)에 용해시켰다. 따라서, 벡터 pAY02592에서의 생성된 라이브러리는, 각각이 연쇄상구균 단백질 G로부터 유래된 알부민 결합 도메인 (ABD)에 융합된 것인 Z 변이체를 코딩하였다.
라이게이션 반응물 (대략 160 ng DNA/형질전환)을 전기적격 E. 콜라이 ER2738 세포 (50 ㎕, 루시겐(Lucigen: 미국 위스콘신주 미들턴)) 내로 전기천공시켰다. 전기천공 직후, (ER2738 세포로 보충된) 대략 1 ml의 회수 배지를 첨가하였다. 형질전환된 세포를 37℃에서 60 min 동안 인큐베이션시켰다. 역가 측정 및 형질전환체 개수 측정을 위해 샘플을 취하였다. 이어서, 세포를 풀링하고, 2% 글루코스, 10 ㎍/ml 테트라사이클린 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된, 1 ℓ의 TSB-YE 배지 중에서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 세포를 4,000 g로 7 min 동안 펠릿화하고, PBS/글리세롤 용액 (대략 40% 글리세롤) 중에 재현탁시켰다. 세포를 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 라이브러리 디자인에 대하여 구축된 라이브러리의 결과를 평가하고, 내용물을 확인하기 위해, Z 변이체의 라이브러리로부터의 클론을 서열분석하였다. 서열분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하고, 아미노산 분포를 확인하였다.
파지 스톡 제조: 파지미드 라이브러리를 함유하는 파지 스톡을 20 ℓ 발효조 (벨라치 바이오테크니크)에 제조하였다. 파지미드 라이브러리를 함유하는 글리세롤 스톡으로부터의 세포를 1 g/ℓ 글루코스, 100 mg/ℓ 암피실린 및 10 mg/ℓ 테트라사이클린으로 보충된 10 ℓ의 TSB-YE (트립틱 소이 브로쓰-이스트 익스트랙트; 30 g/ℓ TSB, 5 g/ℓ 효모 추출물)에 접종하였다. 세포의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)가 0.6에 도달하였을 때, 5 x 몰 과량의 M13K07 헬퍼 파지를 이용하여 대략 1.5 ℓ의 배양물을 감염시켰다. 세포를 30 min 동안 인큐베이션시켰고, 그 후, 발효조를 복합 발효 배지 [2.5 g/ℓ (NH4)2SO4; 5.0 g/ℓ 효모 추출물; 30 g/ℓ 트립톤, 2 g/ℓ K2HPO4; 3 g/ℓ KH2PO4, 1.25 g/ℓ; Na3C6H5O7 · 2 H2O; 브레옥스(Breox) FMT30 소포제 0.1 ml/ℓ]로 최대 10 ℓ까지 충전시켰다. 하기 성분을 첨가하였다: 10 ml 카르베니실린 25 mg/ml; 5 ml 카나마이신 50 mg/ml; 1 ml 1 M 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG); 17.5 ml/ℓ의 300 g/ℓ MgSO4 및 5 ml의 미량 원소 용액 [35 g/ℓ FeCl3·6 H2O; 10.56 g/ℓ ZnSO4·7 H2O; 2.64 g/ℓ CuSO4·5 H2O; 13.2 g/ℓ MnSO4·H2O; 13.84 g/ℓ CaCl2·2 H2O, 1.2 M HCl 중 용해된 것]. 반응기에 600 g/ℓ 글루코스 용액을 공급한 글루코스 제한된 유가 배양을 시작하였다 (시작 시점에 3.5 g/h, 20 h 후 및 배양 종료시까지, 37.5 g/h). 25% NH4OH 자동 첨가를 통해 pH를 pH 7로 조절하고, 대기를 보충하고 (5 ℓ/min), 교반기를 500 rpm로 설정하였다. 24 h의 유가 배양 후, OD600은 33.2였다. 15,900 g로 원심분리하여 배양물 중 세포를 펠릿화하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 PEG/NaCl 중 상청액으로부터 2회에 걸쳐 파지 입자를 침전시키고, 여과하고, PBS 및 글리세롤 중에 용해시켰다. 선별에서 사용할 때까지 파지 스톡을 -80℃에서 보관하였다.
결과
라이브러리 구축: 결합 특성이 확인된 16개의 FcRn 결합 Z 변이체로 이루어진 세트에 기초하여 신규 라이브러리를 디자인하였다 (실시예 2-6). 디자인된 라이브러리의 이론상의 크기는 5.3 x 108개의 Z 변이체였다. E. 콜라이 ER2738 세포에의 형질전환 후 역가 측정에 의해 측정된, 라이브러리의 실제 크기는 4.5 x 109개의 형질전환체였다.
96개의 형질전환체의 서열분석에 의해, 및 그의 실제 서열을 이론상의 디자인과 비교함으로써 라이브러리 품질을 시험하였다. 디자인된 라이브러리와 비교된 실제 라이브러리의 내용물은 만족스러운 것으로 나타났다. 따라서, FcRn에의 잠재적인 결합인자의 성숙 라이브러리가 성공적으로 구축되었다.
실시예 8
성숙 라이브러리로부터의 Z 변이체의 선별 및 스크리닝
물질 및 방법
성숙화된 FcRn 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 표적 단백질 인간 FcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb84388) 및 뮤린 FcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb99076)을 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 10x 몰 과량의 비오틴을 사용하여 비오티닐화하였다. 실시예 7에 기술된 Z 변이체 분자의 신규 라이브러리를 사용하여, 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이, 단, 하기 사항을 예외로 하여 4 사이클로 인간 FcRn 또는 뮤린 FcRn에 대해 파지 디스플레이 선별을 수행하였다. 선별 완충제는, 각각, 0.1% PCTG 완충제 (pH 5.5) (0.1% 트윈-20 및 0.1% 젤라틴으로 보충된 맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 5.5)) 또는 0.1% PCTG 완충제 (pH 7.4) (0.1% 트윈-20 및 0.1% 젤라틴으로 보충된 맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 7.4))였다. 선별에 앞서, HSA를 선별 완충제에 1.5 μM의 최종 농도까지 첨가하였다. 선별에 사용된 모든 튜브 및 비드를 2종의 상이한 선별 완충제 중 하나로 미리 차단하였다. SA-비드로 45 min 동안 파지 스톡의 인큐베이션에 의한 사전 선별 단계를 사이클 1에서 수행하였다. 파지 표적 복합체의 포획을 위해, 1.1 ㎍ 비오티닐화된 인간 FcRn 또는 1.6 ㎍ 비오티닐화된 뮤린 FcRn 당 1 mg 비드를 사용하였다. 각각, 하기 표 9에 개략된 바와 같이, 25 nM IgG (허셉틴(Herceptin)?) 또는 10 nM IgG로 보충된 0.1% PCT를 사용하는 트랙 2-1-2-1 및 2-1-2-2를 제외하고는, 0.1% PCT 완충제 pH 5.5 또는 pH 7.4로 세척을 수행하였다.
사이클 1에서의 5개의 트랙 (1-5)을 제2 내지 제4 사이클로 나누어, 사이클 2에서는 총 7개의 트랙 (1-1 내지 5-1), 사이클 3에서 11개의 트랙 (1-1-1 내지 5-1-1) 및 사이클 4에서는 14개의 트랙 (1-1-1-1 내지 5-1-1-1)이 생성되었다. 결합된 파지 입자를 실시예 2에 기술된 바와 같이 용리시켰다.
후속 사이클에서, 저하된 표적 농도 및 증가된 세척 횟수를 사용하는 증가된 엄격도를 기술하는 선별 전략법에 관한 개요는 하기 표 9에 제시되어 있다.
파지 입자의 증폭: 단, 하기 사항을 예외로 하여, 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이, 선별 사이클 1과 2 사이에 파지 입자의 증폭을 수행하였다. 파지 증폭을 위해 E. 콜라이 ER2738을 사용하였고, 5 x 과량으로 M13K07 헬퍼 파지를 사용하였다. 하기와 같이 용액 중 박테리아 감염을 수행하여 선별 사이클 2와 4 사이에 파지 입자의 증폭을 수행하였다. 파지 입자로 로그기 E. 콜라이 ER2738을 감염시킨 후, 2% 글루코스, 10 ㎍/ml 테트라사이클린 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 TSB를 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 회전시킨면서 인큐베이션시켰다. 그 후에, 박테리아를 5 x 과량으로 M13K07 헬퍼 파지로 감염시켰다. 감염된 박테리아를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 100 μM IPTG, 25 ㎍/ml 카나마이신 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 TSB-YE 배지에 재현탁시키고, 30℃에서 밤새도록 성장시켰다. 밤새도록 배양된 배양물을 원심분리에서 펠릿화하고, 상청액 중 파지 입자를 PEG/NaCl 완충제로 2회에 걸쳐 침전시켰다. 마지막으로, 다음 선별 사이클로 진입하기 이전에 파지 입자를 선별 완충제 중에 재현탁시켰다.
최종 선별 사이클에서, 로그기 박테리아를 용리액으로 감염시고, 0.2 g/ℓ 암피실린으로 보충된 TBAB 플레이트 (30 g/ℓ 트립토스 혈액 아가 베이스, 옥소이다(Oxoid) 카탈로그 번호 CMO233B) 상에 도말하기 전에 희석하여, ELISA 스크리닝에서 사용하기 위한 단일 콜로니를 형성하였다.
Figure pct00012
잠재적인 결합인자의 서열분석: 서열분석을 위해 상이한 선별 트랙으로부터 개별적인 클론을 취하였다. ELISA 스크리닝에 적용된 모든 클론을 서열분석하였다. 유전자 단편의 증폭 및 유전자 단편의 서열 분석을, 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: (실시예 2에 기술된 바와 같은 Z 변이체 ABD 융합 단백질로서 발현된) Z 변이체를 함유하는 단일 콜로니를 FcRn 성숙 라이브러리의 선별된 클론으로부터 무작위로 취하고, 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 1 ml 배양물에서 성장시켰다. 실시예 2에서와 같이, 8회의 냉동 해동 사이클로 주변세포질 상청액의 제조를 수행하였고, 주변세포질 분획을 ELISA 스크리닝에서 희석하지 않고 사용하였다. 각 웰에서 2 nM의 농도로 비오티닐화된 인간 FcRn을 사용하여, 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이, pH 6.0 및 pH 7.4, 둘 모두에서 ELISA 스크리닝을 수행하였다. 1차 FcRn 결합인자 Z10193 (서열번호 2; 상기 실험에서 검정됨)의 주변세포질 분획을 양성 대조군으로 사용하였다. ABD 모이어티만을 함유하는 주변세포질을 음성 대조군으로 사용하였다.
FcRn 결합 Z 변이체의 ELISA K D 분석: 상기 기술된 바와 같이, pH 6.0 및 pH 7.4, 둘 모두에서 ELISA를 사용하여 비오티닐화된 인간 FcRn의 희석액 시리즈에 대한 FcRn 결합인자의 선별물의 반응을 분석하였다. 비오티닐화된 인간 FcRn을 30 nM의 농도로 첨가하고, 14 pM까지 1:3 감소로 단계적으로 희석하였다. 배경 대조군으로서, 모든 Z 변이체를 또한 표적 단백질을 첨가하지 않고 검정하였다. 1차 FcRn 결합인자 Z07918 (서열번호 1)을 함유하는 주변세포질 샘플을 포함시키고, 양성 대조군으로 분석하였다. ABD 모이어티만 함유하는 주변세포질을 음성 대조군으로 사용하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘 5 및 비선형 회귀 분석을 사용하여 분석하였고, KD 값 (반수 최대 유효 농도)을 계산하였다.
결과
성숙 FcRn 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 각 4회의 사이클을 포함하는 총 14개 병렬 트랙에서 선별을 수행하였다. 상이한 선별 트랙은 표적 농도, 표적 유형 (인간 FcRn 또는 뮤린 FcRn), 선별 시간, 및 세척 조건에서 차이가 있었다.
잠재적인 결합인자의 서열분석: 무작위로 고른 클론을 서열분석하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 각각의 개별 Z 변이체에게 식별 번호 Z#####을 제공하였다. 총 445개의 신규한 고유의 Z 변이체 분자가 확인되었다.
58개의 아미노산 잔기 길이 Z 변이체 서브세트의 아미노산 서열은 서열번호 17-352로 서열 목록에 및 도 1에 열거되어 있다. 이들 Z 변이체의 도출된 FcRn 결합 모티프는 서열번호 17-352를 가진 서열에서 잔기 8에서부터 잔기 36까지에 이른다. 이들 각각의 Z 변이체 내에 완전한 3개 나선 다발을 구성하는 것으로 예측되는 49개 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드 (BMod)의 아미노산 서열이 잔기 7에서부터 잔기 55까지에 이른다.
Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 4회의 선별 사이클 후 수득된 클론을 96-웰 플레이트에서 제조하였고, ELISA를 사용하여 FcRn 결합 활성에 대하여 스크리닝하였다. 무작위적으로 고른 모든 클론을 분석하였다. pH 6.0에서, 445개의 고유한 Z 변이체 중 333개가 2 nM의 농도에서 인간 FcRn에 대해 0.3 AU 이상 (음성 대조군의 3x 이상에 상응)의 반응을 제공하는 것으로 밝혀졌다. pH 7.4에서, 445개의 고유한 Z 변이체 중 278개가 2 nM의 농도에서 인간 FcRn에 대해 0.3 AU 이상 (음성 대조군의 3x 이상에 상응)의 반응을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 인간 FcRn에 대하여 양성 신호를 가지는 클론이 1-1-1-1을 제외한 모든 트랙 (뮤린 표적을 가지는 것 포함)에서 발견되었다. 음성 대조군은 각각 0.070~0.096 AU (pH 6.0) 및 0.060-0.112 AU (pH 7.4)의 흡광도를 가졌다. 블랭크 대조군의 평균 반응은 0.070 AU (pH 6.0) 및 0.062 (pH 7.4)였다.
FcRn 결합 Z 변이체의 ELISA K D 분석: Z 변이체의 서브세트를 상기 기술된 ELISA 실험에서의 결과 (pH 6.0 및/또는 pH 7.4에서의 가장 높은 ELISA 값)를 기반으로 하여 선별하고, ELISA 포맷으로 표적 역가 측정을 수행하였다. 주변세포질 샘플을 비오티닐화된 인간 FcRn의 연속 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 1차 결합인자 Z07918 (서열번호 1)을 포함하는 주변세포질 샘플 또한 양성 대조군으로서 검정하였다. 수득된 값을 분석하고, 그들 각각의 KD 값을 계산하였다 (하기 표 10).
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 9
성숙 라이브러리로부터의 Z 변이체의 제조 및 특징 규명
본 실시예에서는 12개의 Z 변이체를 E. 콜라이에서 제조하고, 정제하고, 안정성에 대하여, FcRn에의 결합에 대하여 뿐만 아니라, FcRn에의 IgG 결합 억제에 대하여 검정하였다.
물질 및 방법
발현 벡터로의 Z 변이체의 서브클로닝: 12개의 FcRn 결합 Z 변이체 (Z13577 (서열번호 19), Z13578 (서열번호 20), Z13583 (서열번호 23), Z13592 (서열번호 28), Z13616 (서열번호 41), Z13621 (서열번호 44), Z13654 (서열번호 65), Z13663 (서열번호 70), Z13669 (서열번호 73), Z13674 (서열번호 75), Z13675 (서열번호 76) 및 Z13676 (서열번호 77))의 DNA를 라이브러리 벡터 pAY02592로부터 증폭시켰다. 실시예 3 에 기술된 바와 같이 서브클로닝을 수행하였다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 벡터 pAY01448 내로 서브클로닝하여 코딩된 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD를 얻었다.
Z 변이체의 제조: His6-태그 부착된 Z 변이체의 배양 및 정제를 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하였다. 더 높은 순도를 얻기 위해, 12개의 성숙 변이체 및 1차 Z 변이체 Z07918의 제2 배치의 IMAC 정제 이후에 역상 크로마토그래피 (RPC) 단계를 첨가하였다. 상기 배치로부터의 샘플은 명시된 경우에 사용하였다.
CD 분석: Z 변이체 (RPC 정제된 배치)의 융점 (Tm)을 측정하고, 그의 2차 구조를 평가하기 위해, 실시예 3에 기술된 바와 같이 CD 분석을 수행하였다.
비아코어 결합 및 동역학적 분석: FcRn 결합 His6-태그 부착된 Z 변이체의 인간 FcRn과의 상호작용을 비아코어 2000 기기에서 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 분석하였다. 각각 바이오바이트 (카탈로그 번호 orb84388 및 orb99075)로부터 구입한 인간 FcRn (hFcRn) 또는 시노몰구스 FcRn (cFcRn)을 표적 단백질로서 사용하였다. 제1 세트의 실험에서, 100 nM의 Z 변이체를 pH 6.0에서 2 min 동안 30 ㎕/min으로 고정화된 hFcRn 상에서 주입한 후, 공동 주입 방법을 사용하여 pH 6.0 또는 pH 7.4의 완충제 중에서 해리시켰다. 해리 단계는 4 min이었고, 분석물 주입 사이의 평형화 시간은 30 min이었다. 제2 세트의 실험에서, 고정화된 hFcRn 상에서 540 nM, 180 nM, 60 nM, 20 nM 및 6.7 nM 농도로 주입된 Z 변이체의 서브세트에 대한 대략적 동역학적 상수 (k온 및 k오프) 및 친화도 (KD)를 측정하였다. 상기와 같이, 분석물을 2 min 동안 30 ㎕/min으로 주입하였고, 해리 단계는 4 min이었고, 분석물 주입 사이의 평형화 시간은 30 min이었다.
제3 세트의 실험에서, 12개의 성숙 Z 변이체 및 1차 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1) (RPC 정제된 배치)의 hFcRn 및 cFcRn에의 결합의 동역학적 분석을 pH 6에서 수행하였다. 농도 시리즈의 His6-태그 부착된 Z 변이체 (270, 90, 30 및 10 nM)를 hFcRn 및 cFcRn 상에서 4 min 동안 30 ㎕/min으로 주입하고, CM5 칩 표면의 상이한 유동 셀에 고정화시켰다. 0.005% PCT (pH 6.0을) 러닝 완충제로서, 및 His6-태그 부착된 Z 변이체의 희석을 위해 사용하였다. 러닝 완충제 중에서 20 min 동안 해리되도록 한 후, 다음 사이클 시작 전, 0.005% PCT (pH 7.4)의 3 x 30초 펄스의 주입으로 표면을 재생시키고, 10분 동안 평형화시켰다.
알파LISA 차단 검정법: IgG의 FcRn에의 결합을 억제시킬 수 있는 Z 변이체의 잠재능을 실시예 3에 기술된 알파LISA 검정법으로 분석하였다.
결과
Z 변이체의 제조: N-말단 His6과 함께 구축된, 12개의 FcRn 결합 Z 변이체를 E. 콜라이에서 제조하였다. 각각의 최종 단백질 제제에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 이들은 FcRn 결합 Z 변이체를 우세하게 함유하는 것으로 나타났다. 각 FcRn 결합 Z 변이체의 정확한 아이덴티티 및 분자량을 HPLC-MS 분석으로 확인하였다.
CD 분석: 측정된 융점은 하기 표 11에 제시되어 있다. 90℃까지 가열하기 이전 및 이후에 측정된 스펙트럼들을 중첩하였을 때, 모든 FcRn 결합 Z 변이체에 대한 가역적인 폴딩이 관찰되었다.
비아코어 결합 및 동역학적 분석: 제1 세트의 실험에서, FcRn을 함유하는 칩 표면 위에 각각의 Z 변이체를 pH 6.0, 및 완충제 pH 6.0 또는 pH 7.4 중 하나에서 순차적으로 주입하여 비아코어 기기에서 인간 FcRn에의 12개의 Z 변이체의 결합 및 상이한 pH에서의 해리를 시험하였다. 표면의 리간드 고정화 수준은 890 RU 인간 FcRn이었다. 12개의 Z 변이체는 pH 6.0에서 FcRn에의 결합을 보였고, 모든 변이체의 경우, pH 6.0에 비해 pH 7.4에서 더 빠른 오프 속도를 나타내었다.
제2 세트의 실험에서, pH 6.0에서 FcRn과 상호작용하는 Z 변이체 Z13577 (서열번호 19) 및 Z13621 (서열번호 44)의 동역학적 상수를 측정하였다 (하기 표 12 참조). 각각 2 또는 4개의 주입 농도의 Z13577 및 Z13621의 곡선 세트를 사용하여 동역학적 상수를 계산하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
제3 세트의 실험에서, pH 6.0에서 인간 또는 시노몰구스 FcRn과 상호작용하는 13개의 His6-태그 부착된 Z 변이체의 동역학적 상수를 측정하였다 (하기 표 13). 칩 표면의 FcRn 고정화 수준은 각각 1196 RU (인간) 및 788 RU (시노몰구스)였다. 각 Z 변이체에 대하여 4개의 주입 농도의 곡선 세트를 사용하여 동역학적 상수를 계산하였다.
Figure pct00017
Figure pct00018
알파LISA 차단 분석: 12개의 성숙 His6-태그 부착된 단량체 Z 변이체의 FcRn에의 IgG 결합을 억제시킬 수 있는 능력을 알파LISA 차단 검정법으로 시험하였다. Z 변이체의 연속 희석액을 비오티닐화된 인간 FcRn과 함께 인큐베이션시키고, 각 변이체 각각의 차단 능력을 IgG로 코팅된 어셉터 비드, 및 이어서, 스트렙트아비딘으로 코팅된 도너 비드의 첨가 후 측정하였다. 억제는 양성 Z 변이체에 대한 알파LISA 계수의 감소로 측정할 수 있다. 시험된 12개의 Z 변이체 모두 FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 것으로 나타났고, 계산된 IC50 값은 표 14에 제시되어 있다.
실시예 10
FcRn에의 IgG 결합의 차단 능력 비교
본 실시예에서는 FcRn 결합 Z 변이체 His6-Z07918 (서열번호 1)의 IgG 차단 능력을, 일부 자가면역 장애의 치료에서 현재 사용되는 정맥내 면역글로불린 (IVIg) 및 피하 면역글로불린 (SCIg)과 비교하였다.
물질 및 방법
IgG - FcRn 면역형광 염색의 차단: 인간 또는 뮤린 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. 고정된 세포를, 2.5% FBS 울트라(Ultra) 저 IgG (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)) 및 0.1% 사포닌 (알리켐)을 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에 1,000, 100, 10, 1, 0.1 또는 0 (완충제 대조군) nM 농도로 희석된, 50 nM 알렉사 플루오르? 647-접합된 인간 IgG (잭슨 라보라토리즈, 카탈로그 번호 009-600-003) 및 His6-태그 부착된 Z07918, IVIg (옥타갬(Octagam)?, 옥타파마(Octapharma)) 또는 SCIg (감마노름(Gammanorm)?, 옥타파마)의 믹스 50 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 세포를 암실에서 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시키고, 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 2 x 100 ㎕ 맥일바인스 (pH 6.0)로 세척하고, 1% BSA를 함유하는 180 ㎕ 맥일바인스 (pH 6.0) 중에 재현탁시켰다. FACS 캘리부르(Calibur) (베크만 쿨터)를 사용하여 10,000 GFP/FcRn 양성 세포로부터의 데이터를 수득하고, 플로잉 소프트웨어(Flowing software) 2.5.0 (투르쿠 대학(Turku University))을 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
FcRn 결합 Z 변이체 His6-Z07918 (서열번호 1)이 IgG-FcRn 상호작용을 차단하는지 여부를 측정하고, 차단 효과를 IVIg 및 SCIg와 비교하는 실험을 수행하였다. 인간 또는 뮤린 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 인간 알렉사 플루오르? 647-접합된 IgG와 함께 인큐베이션시켰다. 결합은 상이한 농도의 비표지된 His6-Z07918, IVIg 또는 SCIg로 차단되었다. 본 결과, His6-Z07918은 hFcRn에의 hIgG 결합을 IVIg 또는 SCIg와 유사한 정도로 효과적으로 차단한 것으로 나타났다 (도 9).
실시예 11
마우스에서 FcRn 결합 Z 변이체에 의한 IgG 이화작용 증가
시험관내에서 FcRn에의 IgG 결합을 차단시킬 수 있는 FcRn 결합 Z 변이체 Z07918의 능력은 실시예 10에서 제시하였다. 본 실시예에서는 같은 Z 변이체의 차단 능력을 생체내에서 평가하였다. 생체내에서의 IgG-FcRn 상호작용 차단이 IgG 이화작용을 증가시키고, 그에 동반하여 IgG 수준을 감소시키게 될 것이다 (문헌 [Mezo 2008, 상기 문헌 동일]).
물질 및 방법
동물 연구: Z11948과 동일하지만, AE 대신 아미노산 VD로 시작하는 N-말단을 가지는, ABD 변이체 PP013 (서열번호 377)에 융합된 Z 변이체 Z11948 (서열번호 354) 및 Z07918-PP013 (Z07918 (서열번호 1) 또는 비히클 (PBS 완충제)을 수컷 NMRI (찰스 리버)에 16.3 μmol/kg의 용량으로 투여하였다. 0, 24, 48, 72 및 96 h 시점에 5회에 걸쳐 정맥 주사하여 마우스를 처리하였다. 0, 72, 120 및 168 h (연구 종료 시점)에 혈청 샘플을 채취하고, -20℃에서 보관하였다. 혈청 중 마우스 IgG의 농도를 ELISA에 의해 정량화하였다.
마우스 IgG ELISA: 마우스 혈청 샘플 중 마우스 IgG의 농도를 마우스 IgG ELISA 키트 (맙테크(Mabtech) 3825-1AD-6)로 분석하였고, 제조자에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. mIgG의 농도를 비선형 회귀 공식을 사용하여, 제공된 표준 곡선 및 그래프패드 프리즘 5로부터 계산하였다. 24, 72, 120 및 168 h 시점에 개별 마우스에서의 IgG 농도는 0시간째의 수준과 관련이 있었고, 이에 결과는 IgG (0 h)에 대한 상대적인 비율로서 제시되어 있다.
결과
본 결과, FcRn-특이적 Z 변이체로 처리된 마우스에서 마우스 IgG 농도의 감소가 나타났다. Z11948 및 ABD-융합 변이체 Z07918-PP013, 둘 모두 마우스 생체내에서 내인성 IgG의 농도를 저하시켰다. 가장 눈에 띄는 효과는 ABD-융합된 변이체에서 120시간 후에 얻어졌다. 따라서, 본 결과는 FcRn-특이적 Z 변이체가 IgG의 재순환을 차단하였고, 이로써, 마우스에서 IgG 이화작용이 증가되었고, 이어서, IgG 수준이 감소되었다는 것을 나타낸다.
실시예 12
FcRn 결합 Z 변이체의 시험관내 트랜스사이토시스
본 실시예에서는 시험관내에서 FcRn 결합 Z 변이체를 표피 또는 내피 세포를 통해 수송되거나, FcRn에 의해 재순환될 수 있는 그의 능력에 대해 시험한다. 트랜스사이토시스 능력을 가지는 Z 변이체를 함유하는 약물은, 예를 들어, 경구 또는 폐 투여 후 약물 흡수를 용이하게 할 것이다.
물질 및 방법
FcRn을 내인성 또는 재조합 발현을 하거나, 또는 발현하지 않는, 세포, 예를 들어, T84, MDCK, HeLa, CaCo2, CaLu-1 및/또는 CaLu-3 세포를 트랜스웰 중 막 상의 각 성장 배지 중에서 성장시켜 단일 층을 형성한다. 단일 층의 온전성은 전기 저항을 측정하거나, 또는 세포 단일 층을 투과할 수 없거나, 세포 단일 층 너머로 능동적으로 수송될 수 없는 프로브를 첨가함으로써 평가할 수 있다. 세포의 규정된 단일 층을 적합한 pH 및 온도에서 정단부 또는 기저 측으로부터 완충제, 예컨대, HBSS (행크스 균형 염 용액, 시그마 알드리치, 카탈로그 번호 H9269) 또는 성장 배지 중에서 리간드, 예컨대, FcRn 결합 Z 변이체, HSA 또는 IgG로 펄싱하고, 적합한 pH 및 온도에서 완충제, 예컨대, HBSS 또는 성장 배지로 반대쪽에서 추적한다.
본 검정의 변형에서, 리간드를 적합한 pH 및 온도에서 완충제, 예컨대, HBSS 또는 성장 배지로 투여와 동일한 측에서 추적하여 재순환된 리간드도 측정할 수 있다. 이는 트랜스웰 또는 세포 배양 디쉬에서 수행될 수 있다. 세포를 트랜스웰 또는 세포 배양 디쉬에 시딩하고, 리간드, 예컨대, FcRn 결합 Z 변이체, HSA 또는 IgG로 펄싱한다. 엔도시토시스된 리간드는 FcRn에 결합하고, 그들이 로딩된 곳과 동일하거나, 또는 반대쪽인 세포 표면으로 복귀하게 될 것이다. 펄싱 후, 세포를 냉 완충제로 세척하여 유리 리간드를 제거한다. 리간드를 추적하기 위해, 가온 완충제 또는 배지를 세포에 첨가하고, 10분 내지 수 시간의 범위의 기간이 경과한 후에, 완충제 또는 배지를 제거하고, 리간드의 존재에 대해 검정한다.
본 검정의 변형에서, FcRn 결합 Z 변이체, HSA 또는 IgG와 같은 리간드는, 이들을 동시에 또는 순차적으로 세포에 투여함으로써, 리간드, 예컨대, 다른 FcRn 결합 Z 변이체, HSA 또는 IgG에 의한 FcRn에의 결합을 차단시키는 데 사용될 수 있다.
리간드의 양은 예컨대, ELISA, HPLC-MS, 형광 염료 또는 방사성 표지와 같은 방법으로 정량할 수 있다.
상기 기술된 실험의 결과는 FcRn-특이적 Z 변이체가 시험관내에서 트랜스사이토시스될 수 있고/거나, 재순환될 수 있다는 것을 보여줄 것으로 예상된다.
실시예 13
인간 FcRn / eGFP로 형질감염된 HeLa 세포에의
동종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합
본 실시예에서는 동종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합 능력을 조사하고, 단량체 1차 및 성숙 Z 변이체의 결합 능력과 비교하였다. 인간 FcRn-eGFP 유전자 트랜스진을 발현하는 HeLa 세포 제조는 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였고, 알렉사 플루오르? 647 표지된 Z 변이체를 이용하는 유세포 분석법 분석을 위한 상기 세포의 용도를 기술한다.
물질 및 방법
FcRn 결합 폴리펩티드의 알렉사 플루오르? 647 표지: 2개의 동종이량체 His6-태그 부착된 폴리펩티드 Z11948-(G4S)3-Z11948 (서열번호 369) 및 Z11948-(G4S)-Z11948 (서열번호 368), 1차 단량체 His6-태그 부착된 Z 변이체 Z07918 (서열번호 1) 및 성숙 단량체 His6-태그 부착된 Z-변이체 Z13583 (서열번호 23), Z13621 (서열번호 44), Z13654 (서열번호 65) 및 Z13674 (서열번호 75)를 알렉사 플루오르? 647 카르복실산 숙신이미딜 에스테르 (인비트로겐 카탈로그 번호 A20106)로 표지하였다. 표지 전에, (PBS pH 7.4에서의) 샘플 현탁액의 pH를 10 ㎕의 0.1 M 중탄산나트륨 완충제 (pH 8.3)를 90 ㎕ 샘플 현탁액에 첨가하여 pH 8.3으로 조정하였다. 10 ㎕의 알렉사 플루오르? 647 숙신이미딜 에스테르 염료 (4 x 몰 과량에 상응하는 DMSO 중 10 mg/ml)를 100 ㎕의 각 샘플 현탁액에 첨가하였다. 믹스를 암실에서 위글링 로타 믹서에서 RT에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 반응 믹스를 즉시 투석 카세트 (3500 MWCO) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 카탈로그 번호 66333)으로 옮기고, PBS (pH 7.4)에서 투석하여 유리 염료를 제거하였다.
FcRn 결합 폴리펩티드를 이용한, 인간 FcRn - eGFP로 형질감염된 HeLa 세포의 면역형광 염색: hFcRn-eGFP HeLa 세포를 트립신 처리하여 수거하고, 계수 이전에 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에서 2회에 걸쳐 세척하였다. v-바닥 96 웰 플레이트 (눈크, 카탈로그 번호 277143)의 웰 당 100,000개의 세포를 피펫팅한 후, 플레이트 중의 세포를 4℃에서 4 min 동안 1,700 rpm으로 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 RT에서 10 min 동안 맥일바인스 완충제 중 50 ㎕의 2% 포름알데히드 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 F8775)로 고정시켰다. 이후, 세포를 2.5% FBS 울트라 저 IgG (라이프 테크놀러지즈)를 함유하는 2 x 100 ㎕ 맥일바인스 완충제 (pH 6.0)로 세척하고, 640 nM의 알렉사 플루오르? 647 표지된 His6-태그 부착된 폴리펩티드; Z11948-(G4S)3-Z11948 및 Z11948-(G4S)-Z11948 및 Z07918을 함유하는, 2.5% FBS 울트라 저 IgG 및 0.1% 사포닌 (알리켐, 카탈로그 번호 A4518.0100)을 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에 재현탁시켰다. 완충제 단독으로 이와 함께 인큐베이션된, 형질도입된 HeLa 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 암실에서 진탕기 상에서 8℃로 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 2개의 세척 조건; 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 2 x 150 ㎕ 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 또는 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 2 x 150 ㎕ PBS (pH 7.4) 및 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 PBS (pH 7.4)에서의 인큐베이션 단계를 수행하였다. 세척 후, 모든 샘플을 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 맥일바인스 (pH 6.0) 180 ㎕ 중에 재현탁시켰다. FACS 캘리부르 (베크만 쿨터)를 사용하여 10,000 GFP/FcRn 양성 세포로부터의 데이터를 수득하고, 플로잉 소프트웨어 2.5.0 (투르쿠 대학)을 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
유세포 분석법 분석을 사용하여 FcRn 결합 이량체가 인간 FcRn/eGFP가 형질도입된 HeLa 세포 상에서 인간 FcRn에 결합할 수 있는지 여부를 측정하고, 그의 결합 능력과 단량체 FcRn 결합 Z 변이체를 비교하였다. pH 의존성의 FcRn 단백질로부터의 단리가 이량체 포맷에 의해 영향을 받는지 여부에 관한 분석 또한 수행하였다. 알렉사 플루오르? 647 표지된 이량체 Z11948-(G4S)3-Z11948 및 Z11948-(G4S)-Z11948, 및 단량체 Z07918, Z13583, Z13621, Z13654 및 Z13674를 이용하여 pH 6.0 또는 pH 7.4에서의 세척을 통해 pH 6.0에서의 실험도 수행하였다. Z11948 및 Z07918은 처음 2개의 아미노산 (AE 대 VD)을 제외하면 서열이 동일하다. 본 결과는 상응하는 단량체와 비교하였을 때, 이량체 포맷이 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합 능력을 증가시키고 (도 11a), 성숙 Z 변이체 (Z13583, Z13621, Z13654 및 Z13674)가 1차 Z 변이체 Z07918보다 더 높은 결합 능력을 가진다는 것을 나타낸다 (도 11b). 본 데이터 결과, pH 의존성의 FcRn으로부터의 분리는 이량체 포맷 사용에 따라 감소하는 것으로 나타났고, 이는 FcRn 결합 이량체가 상응하는 단량체 변이체와 비교하였을 때, pH 의존성 결합 프로파일을 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 14
FcRn에의 IgG 결합의 차단 능력 비교
본 실시예에서는 FcRn 결합 이량체 Z11948-(G4S)3-Z11948 및 Z11948-(G4S)-Z11948의 IgG 차단 능력을 단량체 FcRn 결합 Z 변이체의 것 뿐만 아니라, 일부 자가면역 장애의 치료에서 현재 사용되는 정맥내 면역글로불린 (IVIg) 및 피하 면역글로불린 (SCIg)과 비교하였다.
물질 및 방법
IgG - FcRn 면역형광 염색의 차단: 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. 고정된 세포를 각각 2.5% FBS 울트라 저 IgG (라이프 테크놀러지즈) 및 0.1% 사포닌 (알리켐)을 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에 1,000, 100, 10, 1, 0.1 또는 0 (완충제 대조군) nM 농도로 희석된, 50 nM 알렉사 플루오르? 647-접합된 인간 IgG (잭슨 라보라토리즈, 카탈로그 번호 009-600-003) 및 His6-태그 부착된 Z11948-(G4S)3-Z11948 (서열번호 369), Z11948-(G4S)-Z11948 (서열번호 368), Z07918 (서열번호 1), Z13583 (서열번호 23), Z13621 (서열번호 44); IVIg (옥타갬?, 옥타파마) 또는 SCIg (감마노름?, 옥타파마)의 믹스 50 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 세포를 암실에서 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시키고, 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 2 x 100 ㎕ 맥일바인스 (pH 6.0)로 세척하고, 1% BSA를 함유하는 180 ㎕ 맥일바인스 (pH 6.0) 중에 재현탁시켰다. FACS 캘리부르 (베크만 쿨터)를 사용하여 10,000 GFP/FcRn 양성 세포로부터의 데이터를 수득하고, 플로잉 소프트웨어 2.5.0 (투르쿠 대학)을 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과
FcRn 결합 이량체 Z11948-(G4S)3-Z11948 및 Z11948-(G4S)-Z11948이 IgG-FcRn 상호작용을 차단하는지 여부를 측정하고, 차단 효과를 단량체 FcRn 결합 Z 변이체 Z07918, Z13583 및 Z13621의 것 뿐만 아니라, IVIg 및 SCIg와 비교하는 실험을 수행하였다. 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 인간 알렉사 플루오르? 647 접합된 IgG와 함께 인큐베이션시켰다. 결합은 상이한 농도의 비표지된 Z 변이체, IVIg 또는 SCIg로 차단되었다. 본 결과, 단량체 Z 변이체 Z07918, IVIg 및 SCIg와 비교하였을 때, FcRn 결합 이량체는 hFcRn에의 hIgG 결합에 있어서 개선된 차단 효과를 가지는 것으로 나타났다 (도 12a). 추가로, 1차 단량체 Z 변이체 Z07918의 차단 능력과 비교하였을 때, 성숙 단량체 Z 변이체 Z13583 및 Z13621의 차단 능력은 개선되어 있었다 (도 12b). 차단 검정법의 계산된 IC50 값은 하기 표 15에 요약되어 있다.
Figure pct00019
실시예 15
이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 제조
물질 및 방법
Z 변이체 Z17303 (서열번호 357), Z18632 (서열번호 365), Z18633 (서열번호 366) 및 Z18634 (서열번호 367)를 일반 포맷 [Z#####]-ASGS-PP013-GT-(G4S)-[Z#####]의, 알부민 결합 변이체 PP013에 융합된 이량체로서 구축하였다. 생성된 폴리펩티드를 각각 ZAZ3824 (서열번호 373), ZAZ3869 (서열번호 374), ZAZ3870 (서열번호 375) 및 ZAZ3871 (서열번호 376)로 지정하였다. PP013에 융합된 Z 변이체 Z17303의 이량체 폴리펩티드를 또한 상이한 링커 또는 PP013의 C-말단 융합물과 함께 구축하여 각각 ZAZ3715 (서열번호 371) 및 ZZA3716 (서열번호 372)으로 지정되는 폴리펩티드 Z17303-GAP(G4S)3TS-PP013-GT(G4S)3PR-Z17303 및 Z17303-GAP(G4S)3TS-Z17303-GT(G4S)3PR-PP013을 수득하였다. 추가로, PP013은 포함하지 않지만, N-말단 His6-태그와 함께 Z17303을 구축하여 ZZ3556 (서열번호 370)으로 지정된 폴리펩티드 GSS-His6-LQ-Z17303-GT(G4S)3-Z17303을 생성하였다.
실시예 3에 기술된 바와 같이 배양을 수행하였다. 폴리펩티드를 함유하는 PP013의 정제는 실시예 6에 기술된 바와 같이 항-ABD 친화성 크로마토그래피 및 RPC에 의해 수행한 반면, His6-태그 부착된 ZZ3556의 정제는 실시예 3에 기술된 바와 같이 IMAC에 의해 수행하였다.
결과
His6-태그 또는 ABD 모이어티와 함께 구축된, 7개의 FcRn 결합 이량체 폴리펩티드를 E. 콜라이에서 제조하였다. 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광분석법으로 측정된, 친화성 정제된 단백질의 양은 박테리아 펠릿 1 g당 2-18 mg 범위였다. 각각의 최종 단백질 제제에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 이들은 FcRn 결합 폴리펩티드를 우세하게 함유하는 것으로 나타났다. 각 FcRn 결합 폴리펩티드의 정확한 아이덴티티 및 분자량을 HPLC-MS 분석으로 확인하였다.
실시예 16
인간 FcRn / eGFP로 형질감염된 HeLa 세포에의
동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합
본 실시예에서는 성숙 Z 변이체를 포함하는 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합 능력을 조사한다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조된 인간 FcRn-eGFP 유전자 트랜스진을 알렉사 플루오르? 647 표지된 Z 변이체를 이용하는 유세포 분석법 분석을 위해 사용한다.
물질 및 방법
FcRn 결합 Z 변이체의 알렉사 플루오르? 647 표지: 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드를 실시예 1에서와 같이 알렉사 플루오르? 647 카르복실산 숙신이미딜 에스테르 (인비트로겐 카탈로그 번호 A20106)로 표지한다.
FcRn 결합 폴리펩티드를 이용한, 인간 FcRn - eGFP로 형질감염된 HeLa -세포의 면역형광 염색: hFcRn-eGFP HeLa 세포를 트립신 처리하여 수거하고, 계수 이전에 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에서 2회에 걸쳐 세척한다. v-바닥 96 웰 플레이트 (눈크, 카탈로그 번호 277143)의 웰 당 100,000개의 세포를 피펫팅한 후, 플레이트 중의 세포를 4℃에서 4 min 동안 1,700 rpm으로 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 세포를 RT에서 10 min 동안 맥일바인스 완충제 중 50 ㎕의 2% 포름알데히드 (시그마 알드리치, 카탈로그 번호 F8775)로 고정시킨다. 이후, 세포를 2.5% FBS 울트라 저 IgG (라이프 테크놀러지즈)를 함유하는 2 x 100 ㎕ 맥일바인스 완충제 (pH 6.0)로 세척하고, 640 nM의 알렉사 플루오르? 647 표지된 His6-태그 부착된 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드 및 상응하는 단량체 Z 변이체를 함유하는, 2.5% FBS 울트라 저 IgG 및 0.1% 사포닌 (알리켐, 카탈로그 번호 A4518.0100)을 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에 재현탁시킨다.
동종 및/또는 이종이량체에 대한 포맷의 예로는 Z#####-(G4S)3-Z##### 및 Z#####-(G4S)-Z#####을 포함하고, 여기서, Z####은 예를 들어, Z13583 (서열번호 23), Z13621 (서열번호 44), Z13654 (서열번호 65) 또는 Z13674 (서열번호 75), 또는 예를 들어, N-말단 AE를 제외하면 Z13621 (서열번호 44)과 동일한 Z17303 (서열번호 357)에서와 같이, VD 대신에 아미노산 잔기 AE로 시작하는 동일한 Z 변이체로부터 선택된다. 임의적으로, 실시예 3에 기술된 바와 같은 C-말단 His6 태그를 사용하여, 또는 서열번호 362에서와 같은 N-말단 His6 태그를 이용하여 클로닝을 수행할 수 있다.
완충제 단독으로 이와 함께 인큐베이션된, 형질도입된 HeLa 세포를 대조군으로 사용한다. 세포를 암실에서 진탕기 상에서 8℃로 1 h 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 세포를 2개의 세척 조건; 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는2 x 150 ㎕ 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 또는 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 2 x 150 ㎕ PBS (pH 7.4) 및 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 PBS (pH 7.4)에서의 인큐베이션 단계를 수행한다. 세척 후, 모든 샘플을 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 맥일바인스 (pH 6.0) 180 ㎕ 중에 재현탁시킨다. FACS 캘리부르 (베크만 쿨터)를 사용하여 10,000 GFP/FcRn 양성 세포로부터의 데이터를 수득하고, 플로잉 소프트웨어 2.5.0 (투르쿠 대학)을 사용하여 데이터를 분석한다.
결과
유세포 분석법 분석을 사용하여 성숙 Z 변이체를 포함하는 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드가 인간 FcRn/eGFP가 형질도입된 HeLa 세포 상에서 인간 FcRn에 결합할 수 있는지 여부를 측정하고, 상기 결합 능력과, 1차 Z 변이체를 포함하는 단량체 FcRn 결합 Z 변이체 또는 이량체 변이체를 비교한다. pH 의존성의 FcRn 단백질로부터의 단리가 이량체 포맷에 의해 영향을 받는지 여부에 관한 분석 또한 수행한다. 알렉사 플루오르? 647 표지된 FcRn 결합 Z 변이체를 이용하여 pH 6.0 또는 pH 7.4에서의 세척을 통해 pH 6.0에서의 실험도 수행한다. 본 실험으로부터의 결과는, 동종 및/또는 이종이량체 포맷 뿐만 아니라, FcRn에 대한 친화도가 개선된 성숙 Z 변이체 포함물이 FcRn 결합 폴리펩티드의 결합 능력을 증가시키고, 상기 폴리펩티드의 경우, pH 의존성의 FcRn으로부터의 분리가 감소된다는 것을 보이는 것으로 예상된다.
실시예 17
이량체 폴리펩티드의 인간 FcRn에의 pH 의존성 결합
본 실시예에서는 상이한 pH 값에서 FcRn에 결합할 수 있는 이량체 폴리펩티드의 능력을 ELISA에 의해 조사하고, 단량체 Z 변이체의 결합 능력과 비교하였다.
물질 및 방법
상이한 pH 값에서 인간 FcRn에 결합할 수 있는 이량체 폴리펩티드 ZAZ3824 (서열번호 373), ZAZ3869 (서열번호 374), ZAZ3870 (서열번호 375) 및 ZAZ3871 (서열번호 376) 뿐만 아니라, 단량체 Z 변이체 Z13621 (서열번호 44)의 능력을 ELISA으로 시험하였고, 여기서, 결합 및 세척 단계는 pH 6.0 또는 pH 7.4에서 수행하였다. 반면적 96-웰 ELISA 플레이트를 PBS 중에 희석된 4 ㎍/ml의 hFcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb84388)으로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 플레이트를 수돗물로 2회 세척하고, 웰을 RT에서 1.5 h 동안 100 ㎕의 PBSC (PBS, pH 7.4, 1% 카제인으로 보충됨)로 차단하였다. 차단 용액을 따라 버리고, pH 6.0 처리된 웰을 맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 6.0)로 1회 세척하였다. 상이한 FcRn 결합 폴리펩티드를 100 nM 농도로 첨가하고, PCC (맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 6.0), 1% 카제인으로 보충됨) 또는 PBSC 중에서 0.1 pM 까지 1:10 감소로 단계적으로 희석하였다. 웰당 50 ㎕의 희석액을 옮겨 놓고, ELISA 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PCT (맥일바인스 포스페이트-시트레이트 완충제 (pH 6.0), 0.05% 트윈-20으로 보충됨) 또는 PBST (PBS (pH 7.4), 0.05% 트윈-20으로 보충됨)로 4회 세척하였다. 결합된 폴리펩티드를 PCC 또는 PBSC 중에 2 ㎍/ml로 희석된 50 ㎕/웰의 Z 특이적 마우스 항체 (자체적으로 제조)로 검출하였다. 이어서, 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기술한 바와 같이 세척하였다. PCC 또는 PBSC 중에서 1:5,000으로 희석된, DAKO (P0447)로부터 입수한,HRP-접합된 염소 항-마우스 Ig를 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. (상기와 같이) 세척한 후, 50 ㎕ 이뮤노퓨어 TMB 기질을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조사의 권고 사항에 따라 현상시켰다. 30분 동안 현장시킨 후, 다중 웰 플레이트 판독기 (빅토르3)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하고, 그래프패드 프리즘 5를 이용하여 EC50 값을 계산하였다.
결과
상이한 pH에서의 단량체 대 이량체 포맷의 결합 잠재능을 비교할 뿐만 아니라, 도입된 스캐폴드 돌연변이 (Y5F, N52S 및 D53E; 실시예 24 및 25를 추가로 참조)가 pH 의존성의 FcRn에의 결합에 영향을 주는지 여부를 측정하는 분석을 수행하였다. 본 실험은 pH 6.0 또는 pH 7.4에서 ELISA 포맷으로 수행하였다. 본 결과, pH와 상관없이, FcRn에의 결합에 있어서 이량체 포맷이 단량체 포맷보다 우수한 것으로 나타났다 (pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 최대 10x 및 85x까지 개선). pH 6.0 및 pH 7.4, 둘 모두에서 가장 강력한 결합은 이량체 폴리펩티드 ZAZ3824의 경우에서 관찰되었으며, 이는 또한 pH 6.0 및 pH 7.4에서 유사한 결합 능력 (EC50 값)을 보였다. ELISA 역가 측정 곡선이 도 13에 제시되어 있고, 계산된 EC50 값은 하기 표 16에 요약되어 있다.
Figure pct00020
실시예 18
FcRn에의 IgG 결합의 차단 능력 비교
본 실시예에서는 2개의 상이한 시험관내 방법: 알파LISA 및 세포 기반 검정법을 사용하여 IgG의 FcRn에의 결합을 억제시킬 수 있는 폴리펩티드의 잠재능을 분석하였다.
물질 및 방법
알파LISA 차단 검정법: 알파LISA 검정법을 사용하여 이량체 FcRn 결합 폴리펩티드 ZZ3556 (서열번호 370), ZAZ3715 (서열번호 371) 및 ZZA3716 (서열번호 372) 뿐만 아니라, 단량체 Z13621 (서열번호 44)의, IgG-FcRn 상호작용을 차단하는 능력을 분석하였다. 인간 IgG (록템라)를 제조자의 권고 사항에 따라 알파LISA 어셉터 비드 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6772002) 상에 고정화시켰다. 본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 인간 FcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb84388)을 비오티닐화시켰다. 폴리펩티드를 384-웰 플레이트 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 G6005350)에서 알파LISA 완충제 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AL000F) pH 6.0 (HCl을 이용하여 조정됨) 중에서 250 nM 내지 13 pM의 최종 농도로 1:3의 단계식으로 연속하여 희석시키고, 10 nM 비오티닐화된 hFcRn과 함께 45 min 동안 인큐베이션시켰다. IgG로 코팅된 어셉터 비드를 10 ㎍/ml의 최종 농도까지 첨가하고, 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 스트렙트아비딘으로 코팅된 도너 비드 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6772002)를 40 ㎍/ml의 최종 농도까지 첨가하고, 30 min 동안 인큐베이션시켰다. 모든 인큐베이션은 암실에서 RT에서 수행하였다. 플레이트를 엔스파이어 다중플레이트 판독기 2300 (퍼킨 엘머)으로 분석하였고, 그래프패드 프리즘 5를 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
HeLa 세포 IgG - FcRn 차단 검정법: 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. 폴리펩티드 ZZ3556 (서열번호 370), ZAZ3715 (서열번호 371), ZZA3716 (서열번호 372), ZAZ3824 (서열번호 373), ZAZ3869 (서열번호 374), ZAZ3870 (서열번호 375), ZAZ3871 (서열번호 376), Z13621 (서열번호 44), Z18632 (서열번호 365), Z18633 (서열번호 366) 및 Z18634 (서열번호 367) 뿐만 아니라, IVIg (옥타갬?, 옥타파마) 또는 SCIg (감마노름?, 옥타파마)를 각각 2.5% FBS 울트라 저 IgG (라이프 테크놀러지즈) 및 0.1% 사포닌 (알리켐) 및 50 nM 알렉사 플루오르? 647-접합된 인간 IgG (잭슨 라보라토리즈, 카탈로그 번호 009-600-003)를 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에 1,000, 100, 10, 1, 0.1 또는 0 (완충제 대조군) nM 농도로 희석시켰다. 고정된 세포를 100 ㎕의 혼합물에 재현탁시키고, 암실에서 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중에서 세척하고, 재현탁시켰다. FACS 캘리부르 (베크만 쿨터)를 사용하여 10,000 GFP/FcRn 양성 세포로부터의 데이터를 수득하고, 플로잉 소프트웨어 2.5.0 (투르쿠 대학)을 사용하여 데이터를 분석하고, 그래프패드 프리즘 5를 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
결과
알파LISA: 알파LISA 차단 검정법으로 FcRn에의 IgG 결합을 억제시킬 수 있는 1개의 단량체 및 3개의 이량체 폴리펩티드의 능력을 시험하였다. 본 결과, 이량체 폴리펩티드가 단량체 포맷과 비교하였을 때, 더 우수한 IgG 차단 능력을 가지는 것으로 나타났다. 2개의 ABD 융합된 이량체 폴리펩티드, ZAZ3715 및 ZZA3716은 ABD 모이어티를 함유하지 않는 ZZ3556의 것과 매우 유사한 IC50 값을 가졌다. 알파LISA 차단 검정법의 계산된 IC50 값은 하기 표 17에 요약되어 있다.
HeLa 세포 IgG 차단 검정법: 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 HeLa 세포를 인간 알렉사 플루오르 647-접합된 IgG 및 선택된 폴리펩티드와 함께 인큐베이션시켜 IgG-FcRn 상호작용을 차단하는 폴리펩티드의 능력을 평가하였다. 일부 자가면역 장애의 치료에서 현재 사용되는 정맥내 면역글로불린 (IVIg) 및 피하 면역글로불린 (SCIg) 또한 본 시험에 포함시켰다. 실험은 pH 6.0에서 수행하였다. 본 결과, 이량체 포맷이 단량체 포맷과 비교하였을 때, 개선된 IgG 차단 능력을 가진 것으로 나타났다. ZAZ3715 (더 긴 링커)를 ZAZ3824 (더 짧은 링커)와 비교하였고, 두 구축물은 유사한 IC50 값을 보였다. ZAZ3715 및 ZZA3716, 즉, 상이한 위치에 ABD를 가지는 이량체 구축물에 대하여 수득된 IC50 값 사이에는 어떤 차이도 없었다. 시험된 폴리펩티드 모두 IVIg 및 SCIg와 비교하였을 때, 우수한 IgG 차단 효과를 가졌다. 세포 차단 검정법의 계산된 IC50 값은 하기 표 18에 요약되어 있다.
Figure pct00021
Figure pct00022
실시예 19
IgG 재순환의 차단 능력 비교
본 실시예에서는 FcRn 형질도입된 MDCK.2 세포에서 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드가 IgG 재순환에 미치는 효과를 조사한다.
물질 및 방법
MDCK .2 세포의 렌티바이러스 형질도입: 벡터 쌍 2k7neo-CMV-hB2M 및 pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP를 VSV-G 외피 및 gag/pol 패키징 플라스미드와 함께 염화칼슘 형질감염을 사용하여 HEK293T 세포 내로 공동 형질감염시킨다 (문헌 [Zufferey et al., 상기 문헌 동일]; [Jakobsson et al. (2006) 상기 문헌 동일]). 각각 FcRn 및 B2M 트랜스진과 함께, 형성된 렌티바이러스 입자를 함유하는 HEK293T 배양 상청액을 사용하여 계대접종수가 낮은 MDCK.2 세포 (ATCC 카탈로그 번호 CRL-2936)에 순차적으로 형질도입하였다. 생성된 안정적으로 형질도입된 MDCK.2 세포주를 hFcRn-eGFP (인간 FcRn-eGFP 및 hB2M에 대한 유전자로 형질도입됨)로 지정한다.
IgG 재순환의 차단 능력: 인간 FcRn-eGFP가 형질도입된 MDCK.2 세포를 96-웰 플레이트 중에 25,000개의 세포/웰로 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새도록 인큐베이션시킨다. 500 ng/ml 알렉사 플루오르? 647-접합된 인간 IgG (잭슨 라보라토리즈, 카탈로그 번호 009-600-003)의 첨가 및 추가의 1시간 동안 인큐베이션 이전에, 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0) 중 200 내지 0.01 nM 범위 농도의 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드와 함께 세포를 인큐베이션시킨다. 세포를, 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 맥일바인스 완충제 (pH 6.0)로 세척한 후, 2.5% FBS 울트라 저 IgG를 함유하는 PBS (pH 7.4) 중에서 37℃, 5% CO2에서 2 h 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 엔스파이어 다중플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)에서 알렉사 플루오르? 647-접합된 인간 IgG의 존재에 대해 상청액을 분석한다. 억제 곡선을 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀에 의해 분석하여 IC50 값을 측정한다.
결과
본 실험으로부터의 결과는 이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 작용을 통해 IgG 재순환이 용량에 의존하는 방식으로 감소될 것으로 예상된다.
실시예 20
FcRn 트랜스제닉 마우스에서 이량체 FcRn 결합 폴리펩티드에 의한
IgG 이화작용 증가
본 실시예에서는 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서의 2가지 다른 경우에서 동종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드가 IgG 이화작용에 미치는 효과를 조사하였다.
물질 및 방법
동물 연구: 제1 연구에서는 0시간째에 동종이량체 FcRn-결합 폴리펩티드 ZAZ3715 (서열번호 371) 또는 ZZA3716 (서열번호 372), 또는 비히클 (PBS 완충제)을 6 mg/kg의 용량으로 수컷 B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ 마우스 (잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory), 저장 번호 14565)에 i.v. 주사에 의해 투여하였다. 폴리펩티드를 투여하기 24시간 전에, 500 mg/kg hIgG (키오비그(Kiovig), 박스터(Baxter))를 i.v. 주사에 의해 투여하였다. -168, 0, 24, 72, 120 및 144 h (연구 종료 시점)에 혈청 샘플을 수집하고, -20℃에서 보관하였다.
제2 연구에서는 0시간째에 동종이량체 FcRn-결합 폴리펩티드 ZAZ3869 (서열번호 374), ZAZ3870 (서열번호 375) 또는 ZAZ3871 (서열번호 376), 또는 비히클 (PBS 완충제)을 6 mg/kg의 용량으로 수컷 B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ 마우스 (잭슨 라보라토리, 저장 번호 14565)에 i.v. 주사에 의해 투여하였다. 폴리펩티드를 투여하기 24시간 전에, 500 mg/kg hIgG (키오비그, 박스터)를 i.v. 주사에 의해 투여하였다. -168, 0, 24, 72, 120 및 144 h (연구 종료 시점)에 혈청 샘플을 수집하고, -20℃에서 보관하였다.
인간 IgG ELISA: 상기 두 연구로부터 수집된 마우스 혈청 샘플 중 인간 IgG의 농도를 제조사에 의해 기술된 바와 같이 인간 IgG 알파LISA 키트 (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AL205C)를 사용하여 분석하였다. 비선형 회귀 공식을 사용하여 표준 곡선 및 그래프패드 프리즘 5로부터 hIgG의 농도를 계산하였다.
결과
본 실험으로부터의 결과, FcRn 결합 폴리펩티드의 작용을 통하여 시간이 경과함에 따라 인간 IgG의 농도가 감소되는 것으로 보인다. IgG 수준 감소에 있어서는 폴리펩티드 ZAZ3715 및 ZZA3716을 받은 2개 군 사이에 차이가 거의 없거나, 또는 차이가 전혀 없었다 (도 14a). 본 결과는 ABD가 중앙부 또는 C-말단에 위치하는 FcRn 결합 폴리펩티드가 IgG 이화작용을 증가시키는 데 있어서 동등하게 효율적이라는 것을 나타낸다. 폴리펩티드 ZAZ3869, ZAZ3870 및 ZAZ3871은 각각 hIgG 수준을 유사한 정도로 감소시켰다 (도 14b). 제2 연구로부터의 결과는 제1 실험에서 얻은 결과와 동일한 범위에 있었다.
따라서, 상기 두 실험으로부터의 결과는 FcRn 특이적 폴리펩티드가 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 IgG의 재순화를 차단시켰고, 이로써, IgG 이화작용을 증가시켰으며, 이어서, IgG 수준을 감소시켰다는 것을 시사한다.
실시예 21
NMRI 마우스에서 이량체 FcRn 결합 폴리펩티드에 의한
IgG 이화작용 증가
본 실시예에서는 NMRI 마우스에서 동종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드가 IgG 이화작용에 미치는 효과를 조사하였다.
물질 및 방법
동물 연구: 0시간째에 동종이량체 FcRn-결합 폴리펩티드 ZAZ3715 (서열번호 371) 또는 ZZA3824 (서열번호 373), 또는 비히클 (PBS 완충제)을 0.6 또는 1.7 μmol/kg의 용량으로 암컷 NMRI 마우스에 i.v. 주사에 의해 투여하였다. 0, 24, 48 및 72 h (연구 종료 시점)에 혈청 샘플을 수집하고, -20℃에서 보관하였다.
마우스 IgG ELISA: 마우스 혈청 샘플 중 마우스 IgG의 농도를 마우스 IgG ELISA 키트 (맙테크 3825-1AD-6)로 분석하였고, 제조자에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. mIgG의 농도를 비선형 회귀 공식을 사용하여, 표준 곡선 및 그래프패드 프리즘 5로부터 계산하였다. 24, 48 및 72 h 시점에 개별 마우스에서의 IgG 농도는 0시간째의 수준과 관련이 있었고, 이에 결과는 IgG (0 h)에 대한 상대적인 비율로서 제시되어 있다.
PK ELISA: 마우스 혈청 샘플 중 FcRn-결합 폴리펩티드의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 본 검정법에서는 96-웰 반면적 플레이트를 PBS (50 ㎕/웰) 중 4 ㎍/ml 농도로 마우스 항 Z 폴리클로날 항체 (자체적으로 제조)로 코팅하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 수돗물로 2회 세정하고, 1시간 동안 차단 완충제로 차단시켰다. 자제적으로 제조된 Z 변이체 표준을 3배 희석액 시리즈 (0.003-300 ng/ml)에서 역가 측정하고, 희석된 혈청 샘플을 코팅된 ELISA 플레이트 (50 ㎕/웰)에 첨가하고, RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 자동 ELISA 세척기에서 4회 세척하고, 4 ㎍/ml (50 ㎕/웰) 염소 항-ABD 폴리클로날 항체 (자체적으로 제조)를 첨가하였다. 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 세척하고, 50 ㎕의 항-염소 IgG-HRP (잭슨, 카탈로그 번호 711-035-152)를 20 ng/ml 농도로 각 웰에 첨가하였다. 1시간 더 인큐베이션시키고, 이어서, 세척한 후, 플레이트를 웰당 50 ㎕ TMB로 현상시키고, 50 ㎕ 2 M H2SO4로 반응을 정지시켰다. 96-웰 플레이트 판독기 (빅토르3)에서 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
결과
IgG 이화작용: 본 결과, 각각 FcRn-특이적 폴리펩티드 ZAZ3715 및 ZAZ3824로 처리된 마우스에서 마우스 IgG 농도가 감소된 것으로 나타났다 (도 15). 폴리펩티드 ZAZ3824를 이용하였을 때 수득된 결과는 내인성 IgG 수준의 감소는 용량의 의존하고, 가장 눈에 띄는 효과는 72 h째에 관찰된 것으로 나타났다. 비록 단량체가 반복적으로 및 이량체보다 훨씬 더 높은 용량으로 투여되었지만, 특히, 이량체를 이용하였을 때 수득된 IgG 수준 감소는 실시예 11에서 단량체 Z07918을 이용하여 수득된 감소보다 더 컸다 (도 15 및 10의 72 h째의 결과 비교). 따라서, 본 결과는 본원에 개시된 FcRn-특이적 폴리펩티드가 마우스에서 IgG의 재순환을 차단시킬 수 있고, 이로써, IgG 이화작용을 증가시키고, 이어서, IgG 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다.
약동학적 분석: ZAZ3715 및 ZAZ3824의 약동학적 프로파일은 도 16에 제시되어 있다. ZAZ3824의 반감기는 대략 62시간이었고, 이는 실시예 6에 제시된 약동학적 연구에서 수득된 반감기와 일치하며, 이는 폴리펩티드의 약동학적 특성이 알부민 결합으로부터 초래되는 반감기 연장 이외에도 FcRn에의 결합에 의해 추가로 개선된다는 것을 입증한다.
실시예 22
시노몰구스 원숭이에서 FcRn 결합 이량체에 의한
IgG 이화작용 증가
본 실시예에서는 시노몰구스 원숭이에서 동종 또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드가 IgG 이화작용에 미치는 효과를 조사한다.
물질 및 방법
동물 연구: PP013 (서열번호 377)에 재조합적으로 융합된 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드를 제조한다. 상기 FcRn 결합 이량체의 예는 본원에 개시된 서열번호 371-376을 포함한다.
이어서, 알부민 결합 도메인을 포함하는 FcRn 결합 이량체를 2, 0.4 및 0.1 μmol/kg의 용량으로 시노몰구스 원숭이에게 투여한다. 이량체 폴리펩티드를 0시간째에 정맥내로 주사한다. 원숭이를 제1 투여 1 h 전, 및 최대 21일째까지 매일, 및 이어서, 최대 50일째까지 주 1회 출혈시킨다. 혈청을 준비하고, -20℃에서 보관한다. 시노몰구스 IgG 농도를 ELISA에 의해 측정한다.
알부민 결합 도메인을 포함하지 않는 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드를 2, 0.4 및 0.1 μmol/kg의 용량으로 시노몰구스 원숭이에 투여한다. 이량체 폴리펩티드를 2주 동안 주 3회 투여한다. 원숭이를 제1 투여 1 h 전, 및 최대 21일째까지 매일, 및 이어서, 최대 50일째까지 주 1회 출혈시킨다. 혈청을 준비하고, -20℃에서 보관한다. 시노몰구스 IgG 농도를 ELISA에 의해 측정한다.
시노몰구스 IgG ELISA: 혈청 샘플 중 시노몰구스 IgG의 농도를 인간/시노몰구스 IgG ELISA 키트 (예를 들어, 맙테크 3850-1AD-6, 인간 및 시노몰구스 IgG, 둘 모두와 교차 반응성임)를 이용하여 제조자에 의해 기술된 바와 같이 측정한다.
결과
본 실험으로부터의 결과는 FcRn 결합 이량체의 작용을 통해 시노몰구스 IgG의 농도가 용량에 의존하는 방식으로 감소되고, 알부민 결합 도메인 또한 포함하는 상기 이량체의 경우에 더욱 뚜렷한 효과를 보일 것으로 예상된다.
실시예 23
이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 약동학적 연구
본 실시예에서는 마우스에서 수행된 약동학적 연구에서 동종 및/또는 이종이량체 FcRn 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기를 조사한다.
물질 및 방법
약동학적 연구: FcRn 결합 폴리펩티드를 동종 및/또는 이종이량체 단독으로 또는 PP013 (서열번호 377)에 재조합적으로 융합된 것으로 92 nmol/의 용량으로 수컷 NMRI 마우스 (찰스 리버, 독일)에 정맥내로 (i.v.) 투여한다. 0.08, 6, 18, 78, 120, 168 및 240시간째에 3마리의 마우스로 이루어진 군으로부터 혈청을 수득한다. ELISA에 의해 각 폴리펩티드의 농도를 측정한다.
ELISA: 반면적 96-웰 ELISA 플레이트를 코팅 완충제 (50 mM 탄산나트륨, pH 9.6) 중에 4 ㎍/ml로 희석된, 50 ㎕/웰의, 일반적으로 Z 특이적인 염소 항체 (자체적으로 제조)로 4℃에서 밤새도록 코팅한다. 항체 용액을 따라 버리고, 웰을 100 ㎕의 PBSC로 RT에서 1.5 h 동안 차단시킨다. 혈청을 희석 플레이트 내에서 1% 마우스 혈청 (매트릭스)을 함유하는 PBSC 중에서 1:100에서부터 1:51,200까지 2배 희석 시리즈로 희석한다. 매트릭스에 희석된 4개 품질의 대조군 (매우 낮음, 낮음, 중간 및 높은 대조군) 및 각각의 Z 변이체 폴리펩티드에 대한 표준 역가를 각 플레이트에 포함시킨다. 웰당 50 ㎕의 희석액을 옮겨 놓고, ELISA 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한다. 결합된 Z 변이체 폴리펩티드를 PBSC 중에 4 ㎍/ml로 희석된 50 ㎕/웰의 토끼 항-PP013 Ig (자체적으로 제조) 또는 50 ㎕/웰의 마우스 항-Z mAb (자체적으로 제조)로 검출한다. 이어서, 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기술한 바와 같이 세척한다. PBSC 중에서 1:20,000으로 희석된, HRP 접합된 당나귀 항-토끼 HRP (잭슨 라보라토리즈; 카탈로그 번호 711-035-152)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 상기 기술한 바와 같이 세척한 후, 50 ㎕ 이뮤노퓨어 TMB 기질을 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조사의 권고 사항에 따라 현상시킨다. 15분 동안 현장시킨 후, 다중 웰 플레이트 판독기 (빅토르3)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 흡광도 값을 그래프패드 프리즘 5를 이용하여 분석하여 농도 (3차 스플라인 곡선 피트) 및 곡선하 면적 (AUC)을 측정한다. 이어서, 농도를 시간에 대한 자연 로그로 플롯팅한다. 작성된 곡선은 2 구획 모델을 따라 진행할 것으로 예상되고, 종말 반감기를, 마지막 3개의 시점에 기초한 기울기로 나눈 ln2로서 계산한다.
결과
본원에 기술된 본 실험으로부터의 결과는 ABD를 포함하지 않는 폴리펩티드의 경우, 말단 반감기는 대략 60 min이고, ABD를 포함하는 폴리펩티드의 경우, 말단 반감기는 대략 90시간인, 2개 구획의 제거기를 보일 것으로 예상된다.
실시예 24
스캐폴드 -변형된 FcRn 결합 폴리펩티드의
생성, 안정성 연구 및 결합 평가
하기 실시예는 승온에서 개선된 안정성을 보이는 스캐폴드 변형된 FcRn 결합 Z 변이체를 개시한다. 안정성, 및 FcRn에의 결합 능력에 대하여, 아미노산 치환 N52S 및 D53E를 가지는 Z 변이체 Z17347 (서열번호 358), 및 아미노산 치환 D36R, D37Q, S39E, N52S 및 D53E를 가지는 Z17348 (서열번호 359)을 그의 모체 분자 Z11948 (서열번호 354)과 비교한다.
물질 및 방법
스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 생성: Z17347 (서열번호 358), Z17348 (서열번호 359) 및 Z11948 (서열번호 354)을 N-말단 6 x 히스티딘-태그 (His6)와 함께 클로닝하고, 포맷 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]의 구축물 코딩된 폴리펩티드를 수득하였다. 원하는 아미노산 치환을 코딩하는 중첩 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 사용하고, 확립된 분자 생물학 기술을 적용하여 변형된 Z 변이체의 플라스미드에 돌연변이를 도입하였다. DNA 서열분석에 의해 정확한 플라스미드 서열을 확인하였다.
원래의 Z 변이체 및 스캐폴드 변형된 Z 변이체를 코딩하는 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이 (균주 T7E2) 세포 (진브릿지(GeneBridge))를 형질전환시켰다. 세포를 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 TSB-YE 배지 중 37℃에서 배양하고, 이어서, IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 패스트프렙?-24(FastPrep?-24) 균질기 (노르딕 바이오랩스(Nordic Biolabs))를 사용하여 펠릿화된 세포를 파괴하고, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다. His6-태그 부착된 단백질로서 Z 변이체를 함유하는 각 상청액을 제소사의 설명서에 따라 His 그라비트랩™ 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 정제하였다. PD-10 탈염 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 정제된 Z 변이체의 완충제를 포스페이트-완충처리된 염수 (PBS; 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)으로 교체하였다.
원편광 이색성 분광분석법 분석: 원편광 이색성 (CD) 분석을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하여 융점 (Tm)을 측정하고, 아미노산 치환의 결과로서의, 본 발명의 폴리펩티드의 2차 구조의 잠재적인 변화를 평가하였다.
비교를 통한 안정성 연구:
PBS (pH 7.4)에서 제제화된 His6-태그 부착된 Z 변이체를 1 mg/ml로 희석시키고, 200 ㎕ 분취량을 37℃에서 2주 동안 인큐베이션시켰다. 안정성 시험 이전 및 이후에 수집된 샘플을 10% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (인비트로겐)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해, 및 각 웰에 5 ㎍의 단백질을 로딩하여 분석하였다. 승온에서 인큐베이션시킨 후, 신규한 변이체의 출현에 의해 안정성을 평가하고, 돌연변이화된 변이체를 원래의 폴리펩티드와 비교하였다.
스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 결합 평가: 스캐폴드에 변경을 도입한 후, 그뿐만 아니라, 안정성 시험을 수행한 후, 즉, 37℃에서 2주 동안 인큐베이션시킨 후, FcRn에의 결한 능력 보존에 대하여 His6-태그 부착된 Z 변이체를 추가로 평가하였다. 비아코어 2000 기기를 사용하여 비교를 통한 동역학적 상수 (k온 및 k오프) 및 친화도 (KD)를 측정하였다. 표적 단백질 인간 FcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb 84388)을 CM5 칩 (GE 헬쓰케어) 표면의 카르복실화된 덱스트란 층 상에 고정화시켰다. 고정화는 제조자의 프로토콜에 따라 아민 커플링 화학을 사용하고, 러닝 완충제으로서 HBS-EP를 사용하여 수행하였다. 분석물 주입 동안 블랭크로 사용하기 위해 칩 상의 하나의 유동 셀 표면을 활성화 및 탈활성화시켰다. 표면 상의 hFcRn의 고정화 수준은 대략 750 RU였다. Z 변이체를 러닝 완충제 중에서 3.33, 10 및 30 nM의 최종 농도로 희석시키고, 3 min 동안 주입한 후, 러닝 완충제 중에서 15 min 동안 해리시켰다. 각 분석물 주입 후, 러닝 완충제 중에서 HBS-EP의 3회 펄스에 의해 재생, 이어서, 20 min 동안 평형화하는 것을 적용시켰다. 동역학적 상수를 비아이벨류에이션 소프트웨어 4.1 (GE 헬쓰케어)의 랭뮤어 1:1 모델을 이용한 센소그램으로부터 계산하였다. 블랭크 표면의 곡선을 리간드 표면의 곡선으로부터 감산하고, 완충제 사이클로부터의 데이터를 시험-샘플 사이클의 데이터로부터 감산하여 임의의 신호 드리프트에 대해 보정하였다.
결과
원편광 이색성 분광분석법 분석: CD 신호 변이 중점 대 온도 플룻으로부터 측정된 각 Z 변이체 각각의 Tm은 하기 표 19에 제시되어 있다. 돌연변이화된 Z 변이체는 보존된 알파 나선 구조를 보였고, 90℃까지로의 가열 후 가역적으로 리폴딩되었다.
비교를 통한 안정성 연구: 스캐폴드 변형된 Z 변이체 Z17347 및 Z17348은 원래의 폴리펩티드 Z11948과 비교하였을 때, 개선된 안정성을 보였다. 겔 상에서 Z11948에 대한 주요 밴드 바로 위에서 관찰가능한 두번째 밴드는 Z17347 및 Z17348 샘플에서는 관찰되지 않았고 (도 17), 즉, 스캐폴드 돌연변이화는 원래의 스캐폴드에서의 샘플에 대해 관찰되는 대안적 종의 형성을 막는다.
스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 결합 평가: 비교를 통한 FcRn-결합 Z 변이체에 대한 동역학적 상수는 하기 표 20에 제시되어 있다. 친화도는 예컨대, Z17347 (서열번호 358)에서 52-53번 위치에서의 아미노산 치환 ND → SE에 의해서 뿐만 아니라, 예컨대, Z17348 (서열번호 359)에서 D36R, D37Q 및 S39E의 조합으로 52-53번 위치에서의 아미노산 치환 ND → SE에 의해서 약간의 영향을 받았고, KD가 10-9 M 범위인 기능성 결합입자를 수득하였다. 평가된 변이체는 또한 37℃에서의 2주 인큐베이션 후에도 결합 능력을 보존하였다.
Figure pct00024
실시예 25
추가의 스캐폴드 -변형된 FcRn 결합 폴리펩티드의 생성 및 평가
본 실시예에서는 스캐폴드 아미노산 치환 N52S 및 D53E를 포함하는 추가의 변이체, 및 또한 아미노산 치환 Y5F를 포함하는 일부 변이체를 그의 안정성 및 FcRn에의 결합에 대하여 그의 각 모체 FcRn 결합 Z 변이체와 비교하여 분석하였다. 본 결과는 돌연변이화된 변이체에서 구조, 안정성 및 FcRn 결합능이 보존된다는 것을 나타낸다.
물질 및 방법
스캐폴드 -변형된 폴리펩티드의 생성: 확립된 분자 생물학 기술을 사용하여 His6-태그 부착된 Z13578 (서열번호 20), Z13583 (서열번호 23), Z13616 (서열번호 41), Z13621 (서열번호 44) 및 Z13674 (서열번호 75)의 플라스미드에 아미노산 치환 N52S 및 D53E를 도입하여 각각의 Z 변이체 Z18614 (서열번호 360), Z18615 (서열번호 361), Z18616 (서열번호 362), Z18617 (서열번호 363) 및 Z18618 (서열번호 364)을 수득하였다. 5번 위치에서의 추가의 변형은 티로신 잔기의 페닐알라닌으로의 치환이었고, 그뿐만 아니라, VD 대신 아미노산 잔기 AE로 시작되는 N-말단 변형을 가짐으로써 각각 Z13578, Z13616 및 Z13621과 동일한 결합 모티프 (BM)를 가지는 Z 변이체 Z18632 (서열번호 365), Z18633 (서열번호 366) 및 Z18634 (서열번호 367)를 얻었다. 본질적으로 실시예 3 및 실시예 9에 기술된 바와 같이 배양 및 정제를 수행하였다. 5개의 Z 변이체 Z18614-Z18618은 오직 IMAC에 의해서만 정제한 반면, 3개의 Z 변이체 Z18632-Z18634는 추가로 RPC에 의해서도 정제하였다.
CD 분석: 실시예 3에 기술된 바와 같이 CD 분석을 수행하여 융점 (Tm)을 측정하고, 돌연변이화된 Z 변이체를 그의 각 모체 Z 변이체와의 비교를 통해 그의 2차 구조의 잠재적인 변화에 대해 평가하였다.
비아코어 결합 분석: 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 비아코어 기기를 사용하여 pH 6.0에서의 결합 분석을 수행하였다. 농도 시리즈 (270, 90, 30, 10 및 3.3 nM)의 His6-태그 부착된 Z 변이체 Z18632, Z18633 및 Z18634 및 그의 각각의 상응하는 모체 Z 변이체 Z13578, Z13616 및 Z13621을 hFcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb84388) 및 cFcRn (바이오바이트, 카탈로그 번호 orb99075) 상에 30 ㎕/min으로 4 min 동안 주입하고, CM5 칩 표면의 상이한 유동 셀에 고정화시켰다. 0.005% PCT (pH 6.0)를 러닝 완충제로서 및 His6-태그 부착된 Z 변이체의 희석을 위해 사용하였다. 러닝 완충제 중에서 20 min 동안 해리되도록 한 후, 다음 사이클 시작 전, 0.005% PCT (pH 7.4)의 3 x 30초 펄스의 주입으로 표면을 재생시키고, 15 min 동안 평형화시켰다.
결과
배양 및 정제: N-말단 His6-태그와 함께 FcRn 결합 Z 변이체를 구축하고, E. 콜라이에서 제조하였다. 각각의 최종 단백질 제제에 대한 SDS-PAGE 분석 결과, 이들은 Z 변이체를 우세하게 함유하는 것으로 나타났다. 각 FcRn 결합 Z 변이체의 정확한 아이덴티티 및 분자량을 HPLC-MS 분석으로 확인하였다.
CD 분석: 돌연변이화된 FcRn 결합 Z 변이체의 Tm은 각각의 모체 Z 변이체의 Tm과 동일하거나, 또는 거의 동일하였다 (하기 표 21). 추가로, 90℃까지 가열하기 이전 및 이후에 수득된 스펙트럼들을 중첩하였을 때, 7개의 Z 변이체 모두, 그에 대해 가역적인 폴딩이 관찰되었다.
비아코어 결합 분석: pH 6.0에서의 FcRn과의 상호작용에 대한 결합 프로파일을 3개의 돌연변이화된 Z 변이체 및 그의 각각의 모체 Z 변이체; Z18632/Z13578 (서열번호 365/20), Z18633/Z13616 (서열번호 366/41) 및 Z18634/Z13621 (서열번호 367/44)에 대하여 쌍별로 비교하였다. hFcRn 및 cFcRn 표면 상의 Z 변이체의 90 nM 주입으로부터 얻은 센서그램을 중첩시킨 결과, 돌연변이화된 Z 변이체는 인간 및 시노몰구스 FcRn에 결합할 수 있는 그의 능력을 보유한 것으로 나타났다 (도 18a-c). 칩 표면의 FcRn 고정화 수준은 인간 FcRn의 경우, 1577 RU이고, 시노몰구스 FcRn의 경우, 1098 RU였다.
Figure pct00025
실시양태의 항목별 목록
1. 제1 단량체 단위, 제2 단량체 단위 및 아미노산 링커를 포함하는 FcRn 결합 이량체로서, 여기서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 FcRn 결합 모티프 (BM)를 포함하고, 상기 모티프는 하기 아미노산 서열로 이루어진 것인 것이고,
여기서, 상기 FcRn 결합 이량체는 상기 제1 단량체 단위 또는 상기 제2 단량체 단위 단독과 비교하였을 때, 더 높은 결합능으로 FcRn에 결합하는 것인, FcRn 결합 이량체:
EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, E, F, G, H, I, K, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
X7은 A, F, H, K, N, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X29는 D 및 R로부터 선택된다.
2. 항목 1에 있어서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, E, F, G, H, I, K, Q, R 및 S으로부터 선택되고;
X7은 A, F, H, K, N, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
X16은 N 및 T로부터 선택되고;
X17은 F 및 Y로부터 선택되고;
X18은 D로부터 선택되고;
X21은 V로부터 선택되고;
X25는 D, E, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X26은 K 및 S로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 W로부터 선택되고;
X29는 D 및 R로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체.
3. 항목 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 BM이
i) EX2 X3 X4 AX6 HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
(상기 식에서, 서로 독립적으로,
X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X3은 A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X4는 A, D, E, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X6은 A, G, K, R, S 및 V로부터 선택되고;
X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
X25는 D, G, H, K, L, N, R, V 및 W로부터 선택되고;
X28은 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택된다); 및
ii) i)에 의해 정의된 서열과 96% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, FcRn 결합 이량체.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, X6X7이 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 AH 및 GH로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체.
5. 항목 4에 있어서, X6X7가 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 AH인 것인, FcRn 결합 이량체.
6. 항목 4에 있어서, X6X7가 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 GH인 것인, FcRn 결합 이량체.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, X17X18이 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 FD 및 YD로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체.
8. 항목 7에 있어서, X17X18이 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나에서 FD인 것인, FcRn 결합 이량체.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 BM의 서열이 하기 6개의 조건 I-VI 중 3개 이상을 충족시키는 것인, FcRn 결합 이량체:
I. X6은 A, G, K 및 S로부터 선택되고, 예컨대, 특히, A이고;
II. X7은 H이고;
III. X17은 F 및 Y로부터 선택되고, 예컨대, 특히, F이고;
IV. X18은 D이고;
V. X21은 V 및 W로부터 선택되고, 예컨대, 특히, V이고;
VI. X25는 H 및 R로부터 선택되고, 예컨대, 특히, H이다.
10. 항목 9에 있어서, 서열이 6개의 조건 I-VI 중 4개 이상을 충족시키는 것인, FcRn 결합 이량체.
11. 항목 10에 있어서, 서열이 6개의 조건 I-VI 중 5개 이상을 충족시키는 것인, FcRn 결합 이량체.
12. 항목 11에 있어서, 서열이 6개의 조건 I-VI 모두를 충족시키는 것인, FcRn 결합 이량체.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위가 동일한 BM 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
14. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위가 상이한 BM 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-352로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 FcRn 결합 모티프 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
16. 항목 15에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-15, 서열번호 17-140 및 서열번호 353으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
17. 항목 16에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-2 및 서열번호 17-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
18. 항목 17에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-2, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
19. 항목 16에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-8, 서열번호 13, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
20. 항목 18 또는 19에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
21. 항목 20에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
22. 항목 21에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
23. 항목 22에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
24. 항목 22에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20 및 서열번호 41로 이루어진 군; 서열번호 20 및 서열번호 44로 이루어진 군; 또는 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
25. 항목 22에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
26. 항목 24 또는 25에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 44 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
27. 항목 1 내지 26 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 독립적으로 항목 15 내지 26 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같이 선택된 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
28. 항목 27에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 독립적으로 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
29. 항목 28에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 44 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
30. 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 중 적어도 하나에서 상기 FcRn 결합 모티프 BM이 3 나선 다발 단백질 도메인의 일부를 형성하는 것인, FcRn 결합 이량체.
31. 항목 30에 있어서, 상기 BM이 본질적으로 상기 3 나선 다발 단백질 도메인 내에서 서로 연결하는 루프와 함께 2개의 나선의 일부를 형성하는 것인, FcRn 결합 이량체.
32. 항목 31에 있어서, 상기 3 나선 다발 단백질 도메인이 박테리아 수용체 도메인으로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체.
33. 항목 32에 있어서, 상기 3 나선 다발 단백질 도메인이 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 도메인 또는 그의 유도체로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체.
34. 항목 1 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 결합 모듈 (BMod)을 포함하고, 상기 모듈은
iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ;
(상기 식에서,
[BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이되, 단, X29는 D이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 E, N 및 S로부터 선택되고;
Xe는 D, E 및 S로부터 선택되고;
Xf는 A 및 S로부터 선택된다); 및
iv) iii)에 의해 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, FcRn 결합 이량체.
35. 항목 1 내지 33 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 결합 모듈 (BMod)을 포함하고, 상기 모듈은
v) K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ;
(상기 식에서,
[BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이되, 단, X29는 R이고;
Xa는 A 및 S로부터 선택되고;
Xb는 N 및 E로부터 선택되고;
Xc는 A, S 및 C로부터 선택되고;
Xd는 E, N 및 S로부터 선택되고;
Xe는 D, E 및 S로부터 선택되고;
Xf는 A 및 S로부터 선택된다); 및
vi) v)에 의해 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, FcRn 결합 이량체.
36. 항목 34에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-352 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
37. 항목 36에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-15, 서열번호 17-140, 서열번호 353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
38. 항목 37에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-2, 서열번호 17-140, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
39. 항목 38에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-2, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125, 서열번호 127-140, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125, 서열번호 127-140 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
40. 항목 36에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-8, 서열번호 13, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77, 서열번호 353, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
41. 항목 39 또는 40에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73, 서열번호 75-77, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
42. 항목 41에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 77 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
43. 항목 42에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 358 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 75 및 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
44. 항목 43에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 23, 서열번호 75, 서열번호 358, 서열번호 361 및 서열번호 364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 75, 서열번호 361 및 서열번호 364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
45. 항목 43에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 360, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 360 및 서열번호 362로 이루어진 군; 서열번호 20, 서열번호 44, 서열번호 360 및 서열번호 363으로 이루어진 군; 또는 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
46. 항목 43에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 23 , 서열번호 44, 서열번호 358, 서열번호 361 및 서열번호 363으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23, 서열번호 44, 서열번호 361 및 서열번호 363으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
47. 항목 46에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 44 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
48. 항목 1 내지 13 및 15 내지 47 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 항목 36 내지 47 중 어느 한 항목에서 정의된 바와 같은 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
49. 항목 48에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 , 서열번호 75 및 서열번호 360-364로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 360, 서열번호 362 및 서열번호 363으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
50. 항목 49에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 44 중 7번 위치 내지 55번 위치의 서열에 상응하는 BMod를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
51. 항목 1 내지 50 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
vii) YAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이고, Xc는 A, S 및 C로부터 선택된다); 및
viii) vii)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
52. 항목 1 내지 50 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
ix) FAK-[BM]-DPSQS SELLXc EAKKL SESQA P;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이고, Xc는 A, S 및 C로부터 선택된다); 및
x) ix)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
53. 항목 1 내지 50 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xi) FNK-[BM]-DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이고, Xc는 A 및 C로부터 선택된다); 및
xii) xi)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
54. 항목 33에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
Figure pct00026
Figure pct00027
로부터 선택되는 서열을 포함하고,
상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프인 것인, FcRn 결합 이량체.
55. 항목 1 내지 54 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xiii) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
xiv) xiii)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
56. 항목 55에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 354-357로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예컨대, 서열번호 354 및 357로부터 선택되는 서열 xiii)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
57. 항목 56에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 357인 서열 xiii)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
58. 항목 1 내지 54 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xv) AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
xvi) xv)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
59. 항목 58에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 365-367로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xv)를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
60. 항목 1 내지 54 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xvii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
xviii) xvii)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
61. 항목 60에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 360-364로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xvii)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
62. 항목 1 내지 61 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xix) AEAKYAK-[BM]-RQPESSELLSEAKKLSESQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
xx) xix)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
63. 항목 62에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 359인 서열 xix)를 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
64. 항목 1 내지 54 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
xxi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(상기 식에서, [BM]은 항목 1 내지 29 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
xxii) xxi)에 의해 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
65. 항목 64에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-352로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
66. 항목 65에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-15, 서열번호 17-140 및 서열번호 353으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하거나, 또는 서열번호 1-2 및 서열번호 17-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
67. 항목 66에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-2, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
68. 항목 67에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-8, 서열번호 13, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77 및 서열번호 353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
69. 항목 66 또는 68에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
70. 항목 69에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
71. 항목 70에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
72. 항목 71에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 75로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
73. 항목 71에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
74. 항목 71에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 23 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
75. 항목 73 또는 74에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 44인 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
76. 항목 1 내지 13 및 15 내지 75 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 항목s 55, 56 및 62 내지 75 중 어느 한 항목에서 정의된 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 것인, FcRn 결합 이량체.
77. 항목 76에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75, 서열번호 354, 서열번호 357 및 서열번호 360-367로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 360, 서열번호 362, 서열번호 363, 서열번호 365, 서열번호 366 및 서열번호 367로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 상응하는 것인, FcRn 결합 이량체.
78. 항목 77에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 1 또는 서열번호 357에 상응하는 것인, FcRn 결합 이량체.
79. 항목 77에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 20, 서열번호 360 또는 서열번호 365에 상응하는 것인, FcRn 결합 이량체.
80. 항목 77에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 41, 서열번호 362 또는 서열번호 366에 상응하는 것인, FcRn 결합 이량체.
81. 항목 77에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위, 둘 모두가 서열번호 44, 서열번호 363 또는 서열번호 367에 상응하는 것인, FcRn 결합 이량체.
82. 항목 1 내지 81 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 링커가 가용성 아미노산 링커, 강성 아미노산 링커 및 절단가능한 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체.
83. 항목 82에 있어서, 상기 링커가 상기 제1 단량체 단위와 상기 제2 단량체 단위 사이에 배열되어 있는 것인, FcRn 결합 이량체.
84. 항목 82 또는 83에 있어서, 상기 링커가 글리신, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 포함하는 가용성 링커인 것인, FcRn 결합 이량체.
85. 제84항에 있어서, 상기 링커가
(GnSm)p 및 (SnGm)p으로부터 선택되는 일반식을 가지고,
상기 식에서, 독립적으로
n = 1-7,
m = 0-7,
n + m ≤ 8 및
p = 1-7인 것인, FcRn 결합 이량체.
86. 제85항에 있어서, n = 1-5인 것인, FcRn 결합 이량체.
87. 제85항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, m = 0-5인 것인, FcRn 결합 이량체.
88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, p = 1-5인 것인, FcRn 결합 이량체.
89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, n = 4, m = 1 및 p = 1-4인 것인, FcRn 결합 이량체.
90. 제89항에 있어서, 상기 링커가 (G4S)3인 것인, FcRn 결합 이량체.
91. 항목 89에 있어서, 상기 링커가 G4S인 것인, FcRn 결합 이량체.
92. 항목 1 내지 91 중 어느 한 항목에 있어서, 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독보다 2배 이상, 예컨대, 3배 이상, 예컨대, 4배 이상, 예컨대, 5배 이상, 예컨대, 6배 이상, 예컨대, 7배 이상, 예컨대, 8배 이상, 예컨대, 9배 이상, 예컨대, 10배 이상, 예컨대, 25배 이상, 예컨대, 50배 이상, 예컨대, 100배 이상 더 높은 능력으로 FcRn에 결합할 수 있는 것인, FcRn 결합 이량체.
93. 항목 92에 있어서, pH 6.0에서 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독보다 2배 이상, 예컨대, 3배 이상 더 높은 능력으로 FcRn에 결합할 수 있는 것인, FcRn 결합 이량체.
94. 항목 92에 있어서, pH 7.4에서 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독보다 2배 이상, 예컨대, 3배 이상, 예컨대, 4배 이상, 예컨대, 5배 이상, 예컨대, 6배 이상, 예컨대, 7배 이상, 예컨대, 8배 이상, 예컨대, 9배 이상, 예컨대, 10배 이상 더 높은 능력으로 FcRn에 결합할 수 있는 것인, FcRn 결합 이량체.
95. 항목 1 내지 94 중 어느 한 항목에 있어서, 상호작용의 KD 값이 최대 1 x 10-7 M, 예컨대, 최대 1 x 10-8 M, 예컨대, 최대 1 x 10-9 M, 예컨대, 최대 1 x 10-10 M, 예컨대, 최대 1 x 10-11 M, 예컨대, 최대 1 x 10-12 M이 되도록 pH 6.0에서 FcRn에 결합할 수 있는 것인, FcRn 결합 이량체.
96. 항목 1 내지 95 중 어느 한 항목에 있어서, pH 7.4에서의 FcRn 결합 폴리펩티드와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값이 pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD 값보다 높고, 예컨대, pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD 값보다 2배 이상 더 높거나, 예컨대, 5배 이상 더 높거나, 예컨대, 10배 이상 더 높거나, 예컨대, 50배 이상 더 높거나, 예컨대, 100배 이상 더 높은 것인, FcRn 결합 이량체.
97. 항목 1 내지 96 중 어느 한 항목에 있어서, pH 7.4에서의 FcRn 결합 폴리펩티드와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값이 적어도 1 x 10-10 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-9 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-8 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-7 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-6 M, 예컨대, 적어도 1 x 10-5 M인 것인, FcRn 결합 이량체.
98. 항목 1 내지 94 중 어느 한 항목에 있어서, pH 7.4에서의 상기 상호작용의 KD 값이 pH 6.0에서의 상기 상호작용의 KD 값과 동일하거나, 또는 그보다 낮은 것인, FcRn 결합 이량체.
99. 항목 1 내지 94 중 어느 한 항목에 있어서, pH 7.4에서의 상기 상호작용의 KD 값이 최대 1 x 10-7 M, 예컨대, 최대 1 x 10-8 M, 예컨대, 최대 1 x 10-9 M, 예컨대, 최대 1 x 10-10 M, 예컨대, 최대 1 x 10-11 M, 예컨대, 최대 1 x 10-12 M인 것인, FcRn 결합 이량체.
100. 항목 1 내지 99 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 C-말단 및/또는 N-말단 단부에 1종 이상의 추가의 아미노산을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
101. 항목 100에 있어서, 상기 1종 이상의 추가의 아미노산 연장이 폴리펩티드의 생성, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링, 또는 검출을 개선시키거나, 또는 간소화시키는 것인, FcRn 결합 이량체.
102. - 항목 1 내지 101 중 어느 한 항목에 따른 FcRn 결합 이량체로 이루어진 제1 모이어티; 및
- 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어진 제2 모이어티를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체.
103. 항목 102에 있어서, 상기 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기가 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드 그 자체의 생체내 반감기보다 더 긴 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
104. 항목 102 내지 103 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 원하는 생물학적 활성이 치료학적 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
105. 항목 100 내지 102 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 원하는 생물학적 활성이 선택된 표적에의 결합 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
106. 항목 105에 있어서, 상기 선택된 표적이 알부민인 것인 융합 단백질 또는 접합체.
107. 항목 106에 있어서, 상기 알부민 결합 활성이 연쇄상구균 단백질 G의 알부민 결합 도메인, 또는 그의 유도체에 의해 제공되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
108. 항목 106 내지 107 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 알부민 결합 활성이 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기를 연장시키는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
109. 항목 103 내지 104 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 원하는 생물학적 활성이 효소 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
110. 항목 103 내지 105 중 어느 한 항목에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 가지는 제2 모이어티가 치료학상 활성인 폴리펩티드인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
111. 항목 103 내지 105 및 109 내지 110 중 어느 한 항목에 있어서, 원하는 생물학적 활성을 가지는 제2 모이어티가 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모카인 및 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.
112. 항목 1 내지 111 중 어느 한 항목에 있어서, IgG의 FcRn에의 결합을 억제시키는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
113. 항목 112에 있어서, FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 FcRn 결합 이량체의 능력이 상응하는 제1 또는 제2 단량체 단위 단독의 것의 차단 능력과 비교하였을 때, 2배 이상 더 높도록, 예컨대, 3배 이상 더 높도록, 예컨대, 4배 이상 더 높도록, 예컨대, 5배 이상 더 높도록, 예컨대, 10배 이상 더 높도록, 예컨대, 15배 이상 더 높도록, 예컨대, 20배 이상 더 높도록, 예컨대, 25배 이상 더 높도록 FcRn에 결합하는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
114. 항목 112 또는 113에 있어서, 상기 FcRn 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값이 IgG와 FcRn 사이의 상호작용의 KD 값보다 낮은 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
115. 항목 1 내지 114 중 어느 한 항목에 있어서, 표지를 추가로 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
116. 항목 115에 있어서, 상기 표지가 형광 염료 및 금속, 발색단 염료, 화학발광 화합물 및 생체발광 단백질, 효소, 방사성핵종 및 방사성 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
117. 항목 1 내지 116 중 어느 한 항목에 있어서, 시스테인 잔기의 티올 기 또는 리신 잔기의 아민 기를 통해 FcRn 결합 폴리펩티드에 접합된 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터에 의해 제공되는 킬레이팅 환경을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
118. 항목 117에 있어서, 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터가 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 또는 그의 유도체인 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
119. 항목 118에 있어서, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 유도체가 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리스-아세트산-10-말레이미도에틸아세트아미드인 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
120. 항목 117에 있어서, 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터가 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산 또는 그의 유도체인 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
121. 항목 117에 있어서, 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터가 디에틸렌트리아민펜타아세트산 또는 그의 유도체인 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
122. 항목 1 내지 114 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
123. 항목 122에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
124. 항목 123에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
125. - 상기 발현 벡터로부터 상기 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 항목 124에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
- 상기 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, 항목 1 내지 114 중 어느 한 항목에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법.
126. 항목 1 내지 121 중 어느 한 항목에 따른 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
127. 항목 126에 있어서, 1종 이상의 추가의 활성제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
128. 항목 126 내지 127 중 어느 한 항목에 있어서, 경구 투여, 비내 투여, 폐 투여, 질 투여, 직장 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사 및 피내 주사로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의한 투여를 위해 적합화된 것인 조성물.
129. 의약으로서 사용하기 위한, 항목 1 내지 121 중 어느 한 항목의 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 항목 126 내지 128 중 어느 한 항목의 조성물.
130. 항목 129에 있어서, 상기 의약이 자가면역 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체, 또는 조성물.
131. 항목 129에 있어서, 상기 의약이 동종면역 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체, 또는 조성물.
132. 항목 129에 있어서, 상기 의약이 간질 및 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체, 또는 조성물.
133. 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료학상 또는 예방학상 활성인 양의 항목 1 내지 121 중 어느 한 항목에 따른 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체 또는 항목 126 내지 128 중 어느 한 항목에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 치료 또는 예방 방법.
134. 항목 133에 있어서, 자가면역 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, 방법.
135. 항목 133에 있어서, 동종면역 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, 방법.
136. 항목 133에 있어서, 간질 및 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, 방법.
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Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly Thr Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Trp Gln Gln Ala Ala 115 120 125 His Glu Ile Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 130 135 140 Phe Ile His Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu 145 150 155 160 Ser Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 165 170 <210> 376 <211> 173 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Engineered FcRn binding polypeptide <400> 376 Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly His Glu Ile 1 5 10 15 Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala Phe Ile His 20 25 30 Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Ser Gly Ser Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser 65 70 75 80 Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val 85 90 95 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly Thr Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Ala Glu Ala Lys Phe Ala Lys Glu Ala Asp Ala Ala Gly 115 120 125 His Glu Ile Arg Trp Leu Pro Asn Leu Thr Phe Asp Gln Arg Val Ala 130 135 140 Phe Ile His Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu 145 150 155 160 Ser Glu Ala Lys Lys Leu Ser Glu Ser Gln Ala Pro Lys 165 170 <210> 377 <211> 46 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Engineered albumin binding polypeptide <400> 377 Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 378 <211> 58 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Engineered binding polypeptide <400> 378 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Leu Gly Trp Ala Thr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Phe Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Val Gln Val Lys Ala Phe Ile Asp 20 25 30 Lys Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 379 <211> 267 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 379 Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30 Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60 Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 115 120 125 Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160 His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 170 175 Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 180 185 190 Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 210 215 220 Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240 Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His 245 250 255 Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu 260 265 <210> 380 <211> 99 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 380 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 381 <211> 99 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 381 Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro 20 25 30 Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys 35 40 45 Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile 50 55 60 Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 382 <211> 365 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> hFcRn - eGFP fusion protein <400> 382 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 275 280 285 Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 305 310 315 320 Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 325 330 335 Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 340 345 350 Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro Ala Thr Ala 355 360 365 <210> 383 <211> 369 <212> PRT <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> mFcRn - eGFP fusion protein <400> 383 Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu 20 25 30 Thr Ala Val Ser Asn Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr 35 40 45 Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln 50 55 60 Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp 65 70 75 80 Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Glu Ala Leu Lys Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Gln Lys Arg 100 105 110 Gly Thr Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp 115 120 125 Asn Ser Ser Val Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe 130 135 140 Met Lys Phe Asn Pro Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Ile Val Ala Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg 165 170 175 Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly 180 185 190 His Leu Glu Arg Gly Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser 195 200 205 Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr 210 215 220 Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu 225 230 235 240 Arg Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn 245 250 255 Gly Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly 260 265 270 Asp Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln 275 280 285 Pro Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val 290 295 300 Val Gly Ile Val Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Trp Gly Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp 325 330 335 Leu Ser Leu Ser Gly Asp Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn 340 345 350 Leu Pro Pro Glu Ala Glu Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr 355 360 365 Ser <210> 384 <211> 273 <212> PRT <213> MUS MUSCULUS <400> 384 Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Asn 1 5 10 15 Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30 Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys 35 40 45 Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60 Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Leu Lys 65 70 75 80 Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Gln Lys Arg Gly Thr Tyr Thr Leu 85 90 95 Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val Pro 100 105 110 Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn Pro 115 120 125 Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val Ala 130 135 140 Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly 165 170 175 Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala 180 185 190 Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser 195 200 205 Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala 210 215 220 Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser Phe 225 230 235 240 His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His Tyr 245 250 255 Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val Asp 260 265 270 Leu <210> 385 <211> 24 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> PCR primer <400> 385 tgcttccggc tcgtatgttg tgtg 24 <210> 386 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> PCR primer <400> 386 cggaaccaga gccaccaccg g 21 <210> 387 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Sequencing primer <400> 387 cggaaccaga gccaccaccg g 21 <210> 388 <211> 147 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> Library polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (63)..(68) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(89) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (93)..(98) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (108)..(110) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (117)..(119) <223> n is a, c, g, or t <400> 388 aaataaatct cgaggtagat gccaaatacg ccaaagaann nnnnnnngcg nnnnnngaga 60 tcnnnnnntt acctaactta accnnnnnnc aannnnnngc cttcatcnnn aaattannng 120 atgacccaag ccagagctca ttattta 147

Claims (20)

  1. 제1 단량체 단위, 제2 단량체 단위 및 아미노산 링커를 포함하는 FcRn 결합 이량체로서, 여기서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위는 각각 FcRn 결합 모티프 BM을 포함하고, 상기 모티프는 하기 아미노산 서열로 이루어진 것인 것이고,
    여기서, 상기 FcRn 결합 이량체는 상기 제1 단량체 또는 상기 제2 단량체 단독과 비교하였을 때, 더 높은 결합능으로 FcRn에 결합하는 것인, FcRn 결합 이량체:
    EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29
    상기 식에서, 서로 독립적으로,
    X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X3은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X4는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X6은 A, E, F, G, H, I, K, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
    X7은 A, F, H, K, N, Q, R, S 및 V로부터 선택되고;
    X16은 N 및 T로부터 선택되고;
    X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
    X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
    X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
    X25는 D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X26은 K 및 S로부터 선택되고;
    X28은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X29는 D 및 R로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나의 BM이
    i) EX2 X3 X4 AX6 HEIR WLPNLTX17 X18 QR X21 AFIX25 KLX28 D
    (상기 식에서, 서로 독립적으로,
    X2는 A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
    X3은 A, D, E, G, H, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
    X4는 A, D, E, F, G, I, K, L, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
    X6은 A, G, K, R, S 및 V로부터 선택되고;
    X17은 F, W 및 Y로부터 선택되고;
    X18은 A, D, E 및 N으로부터 선택되고;
    X21은 A, S, V 및 W로부터 선택되고;
    X25는 D, G, H, K, L, N, R, V 및 W로부터 선택되고;
    X28은 A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T, W 및 Y로부터 선택된다); 및
    ii) i)에 의해 정의된 서열과 96% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, FcRn 결합 이량체.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위가 동일한 BM 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  4. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위가 상이한 BM 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-352로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 FcRn 결합 모티프 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 44로부터 선택되는 서열 중 8번 위치 내지 36번 위치의 서열에 상응하는 FcRn 결합 모티프 BM을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
    xi) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
    xv) AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
    xvii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
    (상기 식에서, [BM]은 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
    xi), xv) 또는 xvii)에서 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 354-357 및 서열번호 360-367로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 357 및 서열번호 360-367로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가
    xxi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
    (상기 식에서, [BM]은 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항목에서 정의된 FcRn 결합 모티프이다); 및
    xxii) xxi)에서 정의된 서열과 94% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1-353으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-152으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 17-92, 서열번호 94-103, 서열번호 105-125 및 서열번호 127-140으로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 19-20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 73 및 서열번호 75-77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41, 서열번호 44 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위 중 적어도 하나가 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65, 서열번호 75 및 서열번호 77로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 41, 서열번호 44, 서열번호 65 및 서열번호 75로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 1, 서열번호 20, 서열번호 41 및 서열번호 44로 이루어진 군, 예컨대, 서열번호 44로부터 선택되는 서열 xxi)을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  12. 제8항에 있어서, 상기 제1 및 제2 단량체 단위가 각각 서열번호 365 및 서열번호 365; 서열번호 366 및 서열번호 366; 또는 서열번호 367 및 서열번호 367을 포함하는 것인, FcRn 결합 이량체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가
    (GnSm)p 및 (SnGm)p으로부터 선택되는 일반식을 가지고,
    상기 식에서, 독립적으로
    n = 1-7,
    m = 0-7,
    n + m ≤ 8 및
    p = 1-7인 것인, FcRn 결합 이량체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상응하는 제1 단량체 단위 또는 제2 단량체 단위 단독보다 2배 이상, 예컨대, 3배 이상, 예컨대, 4배 이상, 예컨대, 5배 이상, 예컨대, 6배 이상, 예컨대, 7배 이상, 예컨대, 8배 이상, 예컨대, 9배 이상, 예컨대, 10배 이상, 예컨대, 25배 이상, 예컨대, 50배 이상, 예컨대, 100배 이상 더 높은 능력으로 FcRn에 결합할 수 있는 것인, FcRn 결합 이량체.
  15. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 FcRn 결합 이량체로 이루어진 제1 모이어티; 및
    - 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어진 제2 모이어티를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, IgG의 FcRn에의 결합을 억제시키는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
  17. 제16항에 있어서, FcRn에의 IgG 결합을 차단하는 FcRn 결합 이량체의 능력이 상응하는 제1 또는 제2 단량체 단위 단독의 차단 능력과 비교하였을 때, 2배 이상 더 높도록, 예컨대, 3배 이상 더 높도록, 예컨대, 4배 이상 더 높도록, 예컨대, 5배 이상 더 높도록, 예컨대, 10배 이상 더 높도록, 예컨대, 15배 이상 더 높도록, 예컨대, 20배 이상 더 높도록, 예컨대, 25배 이상 더 높도록 FcRn에 결합하는 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  19. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 FcRn 결합 이량체, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 제18항의 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 의약이 자가면역 병태, 동종면역 병태, 간질 및 발작으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병태의 치료 또는 예방을 위한 것인, FcRn 결합 이량체, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.
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