ES2710449T3 - Anticuerpos para 25-hidroxivitamina D2 y D3 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado, que comprende una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, en donde el anticuerpo aislado tiene una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID NO: 32.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos para 25-hidroxivitamina D2 y D3 y usos de los mismos

Referenda cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de los Estados Unidos n.° 13/458.847, presentada el 27 de abril de 2012, que reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 61/488.630, presentada el 20 de mayo de 2011.

Campo tecnico

Se proporcionan en el presente documento metodos y reactivos para la deteccion o cuantificacion de 25-hidroxivitamina D2 y D3, metodos para estabilizar analogos de vitamina D y metodos para separar 25-hidroxivitamina D2 y D3 de proteina de union a vitamina D en una muestra biologica.

Antecedentes

La vitamina D es una hormona esteroidea implicada en la absorcion intestinal del calcio y la regulacion de la homeostasis del calcio. La vitamina D es esencial para la formacion y el mantenimiento de huesos fuertes, sanos.

La deficiencia en vitamina D puede resultar de exposicion insuficiente al sol, consumo alimentario insuficiente, absorcion reducida, metabolismo anomalo o resistencia a la vitamina D. La deficiencia en vitamina D se ha asociado al raquitismo, osteomalacia, osteoporosis, tension arterial alta, enfermedad cardiovascular, esquizofrenia, depresion, enfermedades del sistema nervioso, diabetes, enfermedades infecciosas, asma, alergias, cancer y varias enfermedades autoinmunitarias.

Bien consumida o bien producida, ambas formas de vitamina D (D2 y D3) son metabolizadas por el higado a 25­ hidroxivitamina D (25(OH)D) y despues se convierten en el higado o rinon a 1,25-dihidroxivitamina D. Los metabolitos de vitamina D se unen con una proteina vehiculo en el plasma y se distribuyen por todo el cuerpo. Se admite en general que 25(OH)D es el metabolito que es el indicador clinico mas fiable del estado de vitamina D debido a que los niveles de 25(OH)D en suero reflejan los niveles de almacenamiento del cuerpo de la vitamina D y se correlacionan con sintomas clinicos de la deficiencia en vitamina D.

A pesar del valor de la deteccion de la vitamina D para la gestion sanitaria, los ensayos precisos y sensibles para la deteccion de vitamina D o sus derivados estan limitados. Un obstaculo para el desarrollo de ensayos exitosos para la vitamina D ha sido la dificultad tecnica para el aislamiento de 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 unidas estrechamente de su proteina de union a vitamina D (DBP) en muestras biologicas de ensayo. DBP es una glucoproteina del suero que se une con esteroles de vitamina D, G-actina, acidos grasos y agentes quimiotacticos. Swamy et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 402: 14-23 (2002). En plasma, 25-hidroxivitamina D3 y 25-hidroxivitamina D2 tienen una semivida de dos a tres semanas y aun asi solo estan presentes en menos de 0,05 % en forma libre. La mayoria esta unida a DBP con una afinidad de asociacion de hasta 10⁹ M^-1 que implica union a hidrogeno asi como interacciones hidrofobas. Ademas, el documento WO2011/051348 A1 se dirige a un proceso para la produccion de un hibridoma y un anticuerpo obtenido del mismo capaz de reconocer 25-hidroxivitamina D² y 25­ hidroxivitamina D³, en donde el reconocimiento de D² y D³ varia entre 75 % y 110 %.

Otro obstaculo en el desarrollo de un inmunoensayo de union competitiva para vitamina D es la inestabilidad del analogo de vitamina D usado para competir por los sitios de union a anticuerpo con la vitamina D en muestras biologicas. La vitamina D en ausencia de DBP es altamente inestable en muestras biologicas o soluciones tamponadas.

Existe por lo tanto la necesidad de metodos de ensayo que detectan y/o cuantifican con precision vitamina D y derivados de vitamina D presentes en muestras biologicas en forma libre o unidos a DBP.

Sumario

Se describen en el presente documento moleculas antigenicas que pueden usarse para generar anticuerpos capaces de unirse con moleculas procedentes de vitamina D. En algunas realizaciones, la molecula antigenica puede conjugarse con una proteina transportadora para formar un compuesto antigenico. La conjugacion de proteina transportadora con la molecula antigenica puede producirse mediante el uso de un conector quimico. En algunas realizaciones la proteina antigenica puede dar lugar a anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, que se unen con diferentes derivados de vitamina D. Muchas de las moleculas antigenicas descritas incorporan un inmunogeno de vitamina D-C22 (Figura 1 (a)). Mas especificamente, se desvelan en el presente documento inmunogenos de vitamina D-C22 conjugados con albumina de suero bovino (BSA) para producir vitamina D-C22 diaminobutano-suberoil-BSA (vitamina D-C22 BSA) (Figura 1(c)). Como alternativa, la vitamina D-C22 puede conjugarse con KLH para producir vitamina D-C22 diaminobutano-suberoil-KLH (vit D-C22 KLH) (Figura 1(d)). Las moleculas antigenicas y los compuestos antigenicos descritos proporcionados en el presente documento pueden usarse para producir anticuerpos reactivos a antigeno en un mamifero, tal como un raton. A su vez, los mamiferos inmunizados pueden usarse como una fuente de linfocitos B para producir lineas celulares de hibridomas clonales que producen anticuerpos monoclonales reactivos a antigeno.

Tambien se desvelan en el presente documento anticuerpos aislados segun la reivindicacion 1 que pueden unirse con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22, En algunas realizaciones los anticuerpos descritos son anticuerpos monoclonales. En algunos aspectos los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno descritos tienen una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28. Dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 10H9 que se describe en el presente documento. Como se describira adicionalmente, los anticuerpos proporcionados en el presente documento, aunque son de naturaleza monoclonal, tiene la capacidad de unirse preferentemente con mas de un antigeno. A este respecto, algunos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden unirse con 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 de una manera esencialmente indistinguible. Tambien se proporcionan polinucleotidos que codifican los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno descritos para propagacion y/o expresion de los polinucleotidos descritos.

Se desvelan ademas en el presente documento metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una muestra biologica procedente del sujeto en donde una reduccion entre el nivel en la muestra biologica en relacion con el nivel en una muestra de control o un nivel umbral de 30 ng/ml es indicativa de una deficiencia en vitamina D en el sujeto.

Tambien se desvelan en el presente documento metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una muestra biologica procedente del sujeto y, en el caso de que se detecte una reduccion entre el nivel en la muestra biologica en relacion con el nivel en un control normal o un nivel umbral de 30 ng/ml, administrar al sujeto un tratamiento para deficiencia en vitamina D.

Tambien se desvelan en el presente documento metodos para supervisar la progresion, regresion o estabilizacion de deficiencia en vitamina D en un sujeto que lo necesite determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D en una primera muestra biologica procedente del sujeto en un primer momento y determinar despues el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una segunda muestra biologica procedente del sujeto en un segundo momento posterior al primer momento en donde una reduccion entre el nivel de la primera muestra biologica y el nivel en la segunda muestra biologica es indicativa de la progresion o el empeoramiento de una deficiencia en vitamina D en el sujeto, en donde poco o ningun cambio entre el nivel en la primera muestra biologica y el nivel en la segunda muestra biologica es indicativo de estabilizacion de una deficiencia en vitamina D en el sujeto, y en donde un aumento entre el nivel en la primera muestra biologica y el nivel en la segunda muestra biologica es indicativo de regresion o mejora de una deficiencia en vitamina D en el sujeto.

Tambien se desvelan en el presente documento metodos para supervisar el tratamiento de la deficiencia en vitamina D en un sujeto que lo necesita determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una primera muestra biologica procedente del sujeto en un primer momento y determinando despues el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una segunda muestra biologica procedente del sujeto en un segundo momento posterior al primer momento y despues del tratamiento del sujeto para dicha deficiencia en vitamina D en donde un aumento o una estabilizacion del nivel en la segunda muestra biologica en relacion con el nivel en la primera muestra biologica es indicativo de eficacia del tratamiento de la deficiencia en vitamina D en dicho sujeto, y en donde una reduccion del nivel en la segunda muestra biologica es indicativa de ineficacia del tratamiento de la deficiencia en vitamina D en dicho sujeto.

Se desvelan metodos para estabilizar analogos de 25-hidroxivitamina D poniendo en contacto el analogo de 25-hidroxivitamina D con sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS).

Tambien se desvelan en el presente documento metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto. Los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto implican determinar el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una muestra biologica procedente del sujeto combinando la muestra biologica y un tampon de desplazamiento. En realizaciones preferidas, el tampon de desplazamiento contiene sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El tampon de desplazamiento puede contener ademas etilenglicol. En algunas realizaciones, el tampon de desplazamiento contiene ANS y metanol. En algunas realizaciones preferentes, el tampon de desplazamiento contiene ANS, etilenglicol y metanol. A continuacion, un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que se une preferentemente con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22, conjugado con un primer marcador se combina con la mezcla de ensayo. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno que se une preferentemente con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22, es preferentemente un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describe en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que comprende una CDR1 de Lc de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de Lc de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de Lc de la SEQ ID NO: 28, una CDR1 de Hc de la SEQ ID n O: 10, una CDR2 de Hc de la SEQ ID NO: 11 y una CDR3 de Hc de la SEQ ID NO: 12. El anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 10H9. A continuacion se combina un analogo de 25-hidroxivitamina D que tiene un segundo marcador con la mezcla de ensayo. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede estar presente en un tampon de estabilizacion que comprende sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). En algunas realizaciones, el analogo de 25-hidroxivitamina D esta conjugado con una proteina transportadora. Un soporte de fase solida conjugado con un anticuerpo que reconoce el segundo marcador tambien se combina con la mezcla de ensayo. El nivel de 25-hidroxivitamina D total en la muestra biologica se determina midiendo la senal emitida por el primer marcador, en donde un nivel reducido de 25-hidroxivitamina D en la muestra biologica en relacion con el nivel en un control normal o un nivel umbral de 30 ng/ml es indicativo de una deficiencia en vitamina D en el sujeto.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 representa la estructura quimica de moleculas y compuestos antigenicos de vitamina D-C22. La Figura 1 (a) representa una molecula de vitamina D-C22 no conjugada. La Figura 1 (b) proporciona una representacion de un compuesto antigenico de vitamina D-C22 general. Las Figuras 1(c) y 1(d) muestran compuestos antigenicos de vitamina D-C22 especificos, donde la vitamina D-C22 esta conjugada con BSA o KLH mediante un conector: D-C22 diaminobutano-suberoil-BSA (Figura 1 (c)) y D-C22 diaminobutano-suberoil-KLH (Figura 1 (d)).

La Figura 2 muestra un proceso quimico para producir acido de vit D-C22.

La Figura 3 representa un proceso quimico para convertir acido de vit D-C22 a vitD-DAB-Suberoil-NHS o vitD-DAB-PEG5-NHS.

La Figura 4 ilustra esquemas de reaccion quimica para conjugar vit D-C22, vitD-DAB-Suberoil-NHS o vitD-DAB-PEG5-NHS con un vehiculo proteico.

La Figura 5 muestra una reaccion de dos etapas para producir un conjugado de vitamina D-DAB-PEG5-BSA-Fluoresceina.

La Figura 6 proporciona una representacion grafica del grado de union entre vitamina D-C22-Diaminobutano-Suberoil KLH y el anticuerpo del sobrenadante de hibridoma 10H9 en presencia o ausencia de 25-hidroxivitamina D2 o 25­ hidroxivitamina D3.

La Figura 7 es una representacion grafica del grado de union entre vitamina D C22-diaminobutano-suberoil-fosfatasa alcalina y anticuerpo monoclonal 10H9 purificado en presencia o ausencia de 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3.

La Figura 8 muestra un esquema del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur. Este esquema es solamente para fines ilustrativos y no deberia interpretarse como limitante en modo alguno.

La Figura 9 muestra el perfil de precision que muestra el limite de deteccion (LoD) y la sensibilidad funcional (linea discontinua) del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur.

La Figura 10 muestra la correlacion de los niveles de Vitamina D Total recogidos de 119 donantes en tubos de suero de tapon rojo y SST y la sensibilidad funcional.

La Figura 11 muestra la correlacion de niveles de Vitamina D Total recogidos de 119 donantes en tubos de suero de tapon rojo y EDTA.

La Figura 12 muestra la correlacion del ADVIA Centaur y un ensayo de Vitamina D Total disponible en el mercado.

La Figura 13 muestra la correlacion de los ensayos de Vitamina D Total ADVIA Centaur y CL-EM/EM.

La Figura 14 proporciona una descripcion anotada de la region variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal 10H9.

La Figura 15 proporciona una descripcion anotada de la region variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal 10H9.

Descripcion detallada de las realizaciones ilustrativas

A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones se usan diversos terminos relacionados con aspectos de la descripcion. A tales terminos se les debe proporcionar su significado habitual en la tecnica, a menos que se indique lo contrario. Otros terminos definidos especificamente deben interpretarse de un modo coherente con las definiciones proporcionadas en el presente documento.

Como se usan en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una", y "el" o "la", incluyen referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una celula" incluye una combinacion de dos o mas celulas, y similares.

Se entiende que el termino "aproximadamente" como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duracion temporal, y similares, abarca variaciones de hasta ±20 % desde el valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los metodos desvelados.

A menos que se indique de otro modo, debe entenderse que todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reaccion y asi sucesivamente que se usan en la memoria descriptiva y reivindicaciones estan modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos expuestos en la siguiente memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invencion. Como minimo, y no en un intento de limitar la aplicacion de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse al menos a la luz del numero de digitos significativos indicados y mediante la aplicacion de tecnicas de redondeo habituales.

A pesar de que los intervalos numericos y parametros que establecen el amplio alcance de la invencion sean aproximaciones, los valores numericos establecidos en los ejemplos especificos se presentan de la forma mas precisa posible. Cualquier valor numerico, sin embargo, contiene de forma inherente algunos errores que son necesariamente el resultado de la desviacion tipica que se encuentra en sus respectivas mediciones de ensayo.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" con respecto al estado natural. Si una molecula o composicion aparece en la naturaleza, se ha "aislado" si se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleotido o un polipeptido presente de forma natural en una planta o un animal vivo no esta "aislado", pero el mismo polinucleotido o polipeptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural esta "aislado" como se emplea el termino en el presente documento.

"Polinucleotido", denominado de forma sinonima "molecula de acido nucleico" o "acidos nucleicos", se refiere a cualquier polirribonucleotido o polidesoxirribonucleotido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleotidos" incluyen, sin limitacion, a Dn mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moleculas hibridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, mas habitualmente, regiones bicatenarias o una mezcla de mono y bicatenarias. Ademas, "polinucleotido" se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El termino polinucleotido tambien incluye ADN o ARN que contienen una o mas bases modificadas y ADN o ARN con cadenas principales modificadas para mayor estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases infrecuentes tales como inosina. Puede realizarse una diversidad de modificaciones al ADN y ARN; por lo tanto, "polinucleotido" abarca formas modificadas quimicamente, enzimaticamente o metabolicamente de polinucleotidos como se encuentran habitualmente en la naturaleza, asi como las formas quimicas de ADN y ARN caracteristicas de virus y celulas. "Polinucleotido" tambien abarca cadenas de acido nucleico relativamente cortas, que a menudo se denominan oligonucleotidos.

"Sustancialmente igual" con respecto a secuencias de acido nucleico o aminoacidos, significa al menos 65 % de identidad entre dos o mas secuencias. Preferentemente, la expresion se refiere a al menos 70 % de identidad entre dos o mas secuencias, mas preferentemente al menos 75 % de identidad, mas preferentemente al menos 80 % de identidad, mas preferentemente al menos 85 % de identidad, mas preferentemente al menos 90 % de identidad, mas preferentemente al menos 91 % de identidad, mas preferentemente al menos 92 % de identidad, mas preferentemente al menos 93 % de identidad, mas preferentemente al menos 94 % de identidad, mas preferentemente al menos 95 % de identidad, mas preferentemente al menos 96 % de identidad, mas preferentemente al menos 97 % de identidad, mas preferentemente al menos 98 % y mas preferentemente al menos 99 % o mayor identidad. Dicha identidad puede determinarse usando el algoritmo mBLAST (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).

Un "vector" es un replicon, tal como un plasmido, fago, cosmido o virus en el que otro segmento de acido nucleico puede insertarse operativamente para causar la replicacion o expresion del segmento.

La expresion "unido operativamente" o "insertado operativamente" significa que las secuencias reguladoras necesarias para expresion de la secuencia codificante se situan en una molecula de acido nucleico en las posiciones apropiadas relativas a la secuencia codificante para permitir la expresion de la secuencia codificante. A modo de ejemplo, un promotor se une operativamente con una secuencia codificante cuando el promotor es capaz de controlar la transcripcion o expresion de esa secuencia codificante. Las secuencias codificantes pueden unirse operativamente a promotores o secuencias reguladoras en una orientacion con sentido o antisentido. La expresion "unido operativamente" se aplica en ocasiones a la disposicion de otros elementos de control de la transcripcion (por ejemplo, potenciadores) en un vector de expresion.

Una celula se ha "transformado" cuando se han introducido acidos nucleicos exogenos o heterologos tales como ADN dentro de la celula. El ADN transformante puede integrarse (unirse de forma covalente) o no en el genoma de la celula. En procariotas, levadura y celulas de mamifero por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomico tal como un plasmido. Con respecto a celulas eucariotas, una celula transformada de forma estable o "celula estable" es demostrada por la capacidad de la celula eucariota para establecer lineas celulares o clones comprendidos por una poblacion de celulas descendientes que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una poblacion de celulas procedentes de una unica celula o ancestro comun por mitosis. Una "linea celular" es un clon de una celula primaria que tiene capacidad de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones. En algunos ejemplos proporcionados en el presente documento, las celulas se transforman transfectando las celulas con ADN.

"Polipeptido" se refiere a cualquier peptido o proteina que comprende dos o mas aminoacidos unidos entre si mediante enlaces peptidicos o enlaces peptidicos modificados, es decir, isosteros peptidicos. "Polipeptido" se refiere tanto a cadenas cortas, habitualmente denominadas peptidos, oligopeptidos u oligomeros, como a cadenas mas largas, generalmente denominadas proteinas. Los polipeptidos pueden contener aminoacidos distintos de los 20 aminoacidos codificados por genes. Los "polipeptidos" incluyen secuencias de aminoacidos modificadas mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante tecnicas de modificacion quimica que son bien conocidas en este campo. Dichas modificaciones estan bien descritas en textos basicos, monografias y bibliografia de investigacion. Pueden producirse modificaciones en cualquier parte de un polipeptido, incluyendo la cadena principal peptidica, las cadenas laterales de aminoacidos y los extremos amino o carboxilo. El mismo tipo de modificacion puede estar presente en el mismo o diversos grados en varios sitios en un polipeptido dado. Ademas, un polipeptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipeptidos pueden ramificarse como resultado de la ubiquitinacion y pueden ser ciclicos, con o sin ramificacion. Los polipeptidos ciclicos, ramificados y ciclicos ramificados pueden resultar de procesos postraduccionales naturales o pueden realizarse mediante metodos sinteticos. Las modificaciones incluyen acetilacion, acilacion, ADP-ribosilacion, amidacion, union covalente de flavina, union covalente de un resto hemo, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un lipido o derivado de lipido, union covalente de fosfatidilinositol, reticulacion, ciclacion, formacion de enlaces disulfuro, desmetilacion, formacion de reticulaciones covalentes, formacion de cistina, formacion de piroglutamato, formilacion, gamma-carboxilacion, glucosilacion, formacion de anclaje a GPI, hidroxilacion, yodacion, metilacion, miristoilacion, oxidacion, procesamiento proteolitico, fosforilacion, prenilacion, racemizacion, selenoilacion, sulfatacion, adicion mediada por ARN de transferencia de aminoacidos a proteinas tal como arginilacion y ubiquitinacion (vease, por ejemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pag. 1-12 en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter et al., Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62).

Las "biomoleculas" incluyen proteinas, polipeptidos, acidos nucleicos, lipidos, monosacaridos, polisacaridos y todos los fragmentos, analogos, homologos, conjugados y derivados de los mismos.

Los terminos "expresar" y "producir" se usan de forma sinonima en el presente documento y se refieren a la biosintesis de un producto genico. Estos terminos abarcan la transcripcion de un gen a ARN. Estos terminos tambien abarcan la traduccion de ARN a uno o mas polipeptidos y abarcan ademas todas las modificaciones postranscripcionales y postraduccionales de origen natural. La expresion o produccion de un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo puede ser dentro del citoplasma de la celula o al medio extracelular tal como el medio de cultivo de un cultivo celular.

"Anticuerpo" se refiere a todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD e IgY) incluyendo diversas formas monomericas y polimericas de cada isotipo, a menos que se especifique lo contrario.

Un fragmento de union a antigeno es cualquier estructura proteica que pueda mostrar afinidad de union por un antigeno particular. Algunos fragmentos de union a antigeno estan compuestos de partes de anticuerpos intactos que conservan la especificidad de union a antigeno de la molecula de anticuerpo parental. Por ejemplo, los fragmentos de union a antigeno pueden comprender al menos una region variable (una region variable bien de cadena pesada o bien de cadena ligera) o una o mas CDR de un anticuerpo que se sabe que se une con un antigeno particular. Los ejemplos de fragmentos de union a antigeno adecuados incluyen, sin limitacion, diacuerpos y moleculas monocatenarias asi como moleculas de Fab, F(ab’)2, Fc, Fabc y Fv, anticuerpos monocatenarios (Mc), cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quimericas entre cadenas de anticuerpos o CDR y otras proteinas, armazones proteicos o moleculas, monomeros o dimeros de cadena pesada, monomeros o dimeros de cadena ligera, dimeros que consisten en una cadena pesada y una ligera, y similares. Todos los isotipos de anticuerpos pueden usarse para producir fragmentos de union a antigeno. Adicionalmente, los fragmentos de union a antigeno pueden incluir estructuras proteicas distintas de anticuerpos que pueden incorporar con exito segmentos polipeptidicos en una orientacion que confiere afinidad para un antigeno de interes dado, tales como armazones proteicos. Los fragmentos de union a antigeno se pueden producir de forma recombinante o producirse mediante escision enzimatica o quimica de anticuerpos intactos. La expresion "un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo" puede usarse para indicar que un fragmento de union a antigeno dado incorpora uno o mas segmentos de aminoacidos del anticuerpo al que se hace referencia en la expresion.

Las "composiciones de anticuerpos" se refieren a anticuerpos o fragmentos de union de los mismos que estan acoplados con al menos un vehiculo, agente quimioterapeutico o resto de diagnostico farmaceuticamente aceptable, como se describe en el presente documento.

La "union especifica" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno, para unirse con una biomolecula particular con una afinidad que es mayor que con la que puede unirse a otras biomoleculas. Esta expresion se usa de forma sinonima con union "preferente", lo que significa que una interaccion de union particular esta favorecida por los componentes de interaccion sobre una mayoria de, pero no todas, otras de estas interacciones.

Las realizaciones descritas en el presente documento no estan limitadas a metodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biologicos particulares, que pueden, por supuesto, variar. Asimismo, la terminologia usada en el presente documento es con el fin de describir solamente anticuerpos o fragmentos de union a antigeno particulares y no se pretende que sea limitante.

Moleculas antigenicas y compuestos antigenicos

Se proporcionan en el presente documento moleculas antigenicas que pueden usarse para generar anticuerpos capaces de unirse con moleculas procedentes de vitamina D. En algunas realizaciones, la molecula antigenica puede conjugarse con una proteina transportadora para formar un compuesto antigenico. La conjugacion de proteina transportadora con la molecula antigenica puede producirse mediante el uso de un conector quimico. En algunas realizaciones la proteina antigenica puede dar lugar a anticuerpos que se unen igualmente con diferentes derivados de vitamina D.

Las moleculas antigenicas descritas en el presente documento se basan en el uso de un derivado de vitamina D de carbono 22 (vitamina D-C22), que incluye un grupo carboxilo C22 cuando no esta conjugado, como se representa en la Figura 1(a) (Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)). Las moleculas antigenicas basadas en este compuesto conservan la parte comun de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3, ya que estas moleculas difieren estructuralmente solamente en sus ramas laterales, que estan ausentes de la molecula de vitamina D-C22. Dadas las semejanzas estructurales entre vitamina D-C22, 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3, los anticuerpos generados usando antigenos basados en vitamina D-C22 pueden ser capaces de reconocer tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3.

Las moleculas antigenicas desveladas en el presente documento pueden combinarse con proteinas transportadoras para producir compuestos antigenicos. El uso de proteinas transportadoras puede ser util para potenciar la capacidad de la molecula antigenica para inducir una respuesta inmunitaria en un mamifero. Por ejemplo, las proteinas transportadoras pueden permitir una semivida mas larga en el hospedador o permitir que multiples moleculas antigenicas se unan con el mismo vehiculo, produciendo de este modo un compuesto antigenico multivalente. En algunas realizaciones, las moleculas antigenicas descritas pueden fijarse directamente al vehiculo proteico. Por ejemplo, la vitamina D-C22 puede conjugarse directamente con albumina de suero bovino (BSA). En algunas realizaciones, una pluralidad de moleculas antigenicas pueden conjugarse con la misma proteina transportadora para producir un compuesto antigenico multivalente. El numero de moleculas antigenicas que puede conjugarse con un vehiculo proteico dado variara basandose en el vehiculo usado. Por ejemplo, BSA alojara la union de un numero relativamente bajo de moleculas antigenicas, quizas de aproximadamente 10 a aproximadamente 25; como alternativa, un vehiculo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) puede alojar de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 moleculas antigenicas. En una realizacion, la vitamina D-C22 se conjuga con BSA de modo que se conjugan de aproximadamente 7 a aproximadamente 21 moleculas antigenicas con el vehiculo. En una realizacion, la vitamina D-C22 se conjuga con BSA de modo que se conjugan de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 moleculas antigenicas con el vehiculo. En otra realizacion de este tipo, se conjugan aproximadamente 14 moleculas de vitamina D-C22 con un vehiculo de BSA. Los expertos en la materia entenderan que puede usarse una amplia diversidad de proteinas transportadoras para los fines descritos en el presente documento. Algunos vehiculos adecuados incluyen, KLH, KLH PEGilada, hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), BSA cationizada y ovoalbumina, por nombrar solo algunos. En algunas realizaciones las moleculas antigenicas se conjugan con la proteina transportadora mediante grupos amina presentes en la proteina transportadora. La quimica de conjugacion de esta naturaleza es conocida habitualmente por los expertos en la materia.

Otro aspecto de los compuestos antigenicos descritos en el presente documento puede ser un conector quimico que permite la conjugacion indirecta de una molecula antigenica descrita con una proteina transportadora descrita. El conector quimico puede estar compuesto por alquilo, arilo, alquiloxi, amida, sulfonamida o carbonilo o grupos peptidicos. La conjugacion del derivado de vitamina D con la proteina puede realizarse mediante reaccion entre grupos amino de la proteina y un grupo de ester de N-hidroxisuccinimida (ester de NHS) reactivo del derivado de vitamina D. La longitud del conector puede variar dependiendo del vehiculo usado y el numero de moleculas antigenicas conjugadas con el vehiculo. En otras realizaciones, sin embargo, la misma molecula antigenica puede usarse con el mismo conector para conjugacion con una diversidad de proteinas transportadoras, tales como BSA o KLH. En algunas realizaciones, el conector esta compuesto de una cadena lineal que tiene la formula

donde x e y pueden variar, independientemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 12. Esto posibilita un compuesto antigenico general que tiene la formula representada en la Figura 1(b). En algunas realizaciones x puede ser 3 e y puede ser 6. En algunas realizaciones x puede ser 3 e y puede ser 7. En algunas realizaciones x puede ser 4 e y puede ser 7. En algunas realizaciones x puede ser 5 e y puede ser 7. En algunas realizaciones x puede ser 4 e y puede ser 6. En algunas realizaciones x puede ser 5 e y puede ser 6. En algunas realizaciones x puede ser 3 e y puede ser 5. En algunas realizaciones x puede ser 4 e y puede ser 5. En algunas realizaciones x puede ser 5 e y puede ser 5. En algunas realizaciones x puede ser 3 e y puede ser 4. En algunas realizaciones x puede ser 4 e y puede ser 4. En algunas realizaciones x puede ser 5 e y puede ser 4. En algunas realizaciones, el conector se usa para conjugar vitamina D-C22 y BSA para producir vitamina D-C22 diaminobutano-suberoil-BSA (vit D-C22 BSA) (Figura 1(c)). En otra realizacion el conector se usa para conjugar vitamina D-C22 y KLH para producir vitamina D-C22 diaminobutano-suberoil-KLH (vit D-C22 KLH) (Figura 1(d)).

Las moleculas antigenicas y los compuestos antigenicos proporcionados en el presente documento pueden usarse para producir anticuerpos reactivos a antigeno en un mamifero. Los mamiferos que pueden usarse para producir anticuerpos incluyen raton, rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, conejo, burro, ser humano y similares. En una realizacion, el mamifero es un raton. Pueden usarse mamiferos que tienen sueros positivos para antigeno como una fuente de linfocitos B productores de anticuerpos que pueden aislarse y usarse para producir celulas productoras de anticuerpos de larga vida, tales como celulas de hibridoma. En algunas realizaciones, los linfocitos B aislados de ratones inmunizados pueden usarse para producir celulas de hibridomas que producen anticuerpos que se unen con vitamina D-C22 o derivados de vitamina D.

Anticuerpos

Se describen en el presente documento anticuerpos o fragmentos de union a antigeno aislados que se unen preferentemente con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22. En una realizacion, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o fragmento de union a antigeno.

Hay cinco clases de inmunoglobulinas en donde la estructura primaria de la cadena pesada, en la region Fc, determina la clase de inmunoglobulina. Especificamente, las cadenas alfa delta, epsilon, gamma y mu corresponden a isotipos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos incluyen todos los isotipos y multimeros sinteticos de la estructura de inmunoglobulina tetracatenaria. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos tambien incluyen el isotipo IgY hallado en general en suero de gallina o pavo y yema de huevo de gallina o pavo. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno se unen de forma no covalente, preferentemente, y de forma no reversible con un antigeno.

Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 de la materia objeto desvelada pueden proceder de cualquier especie. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno pueden proceder de raton, rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, conejo, burro, ser humano y similares. En algunas realizaciones los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno proceden de un raton. En algunas realizaciones los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno proceden de un raton inmunizado con un compuesto inmunogenico descrito en el presente documento. En algunas realizaciones los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno proceden de un raton inmunizado con vitamina D-C22 BSA. Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 son anticuerpos monoclonales producidos usando las moleculas inmunogenicas o compuestos descritos en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales descritos pueden proceder de un raton inmunizado con una cualquiera o mas de las moleculas inmunogenicas o compuestos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de union a antigeno del mismo, capaz de unirse preferentemente con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22 puede proceder de un raton inmunizado con una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno pueden ser quimericos. Como se usa en el presente documento, el termino anticuerpo "quimerico", o fragmento de union a antigeno del mismo, significa un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, que tiene al menos alguna parte de al menos un dominio variable procedente de la secuencia de aminoacidos del anticuerpo de un mamifero no humano, un roedor o un reptil, mientras que las partes restantes del anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, proceden de un ser humano. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender un dominio de union a antigeno de raton con un Fc humano u otro de dichos dominios estructurales.

En algunas realizaciones los anticuerpos descritos pueden ser humanizados. Por ejemplo, las CDR de un anticuerpo humano pueden reemplazarse con las CDR de cadena pesada y ligera descritas en el presente documento para producir un anticuerpo, o fragmento de union a antigeno del mismo, que tiene caracteristicas de union iguales o sustancialmente similares a los anticuerpos descritos en el presente documento, pero esta compuesto de regiones constante y marco conservada humanas. Los expertos en la materia conocen habitualmente metodos para producir dichos anticuerpos.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden marcarse o conjugarse de otro modo con diversos restos quimicos o biomoleculares, por ejemplo, para aplicaciones de diagnostico. Los restos pueden ser marcadores detectables, por ejemplo, marcadores quimioluminiscentes (por ejemplo, esteres de acridinio y sulfonamidas, luminol e isoluminol), marcadores fosforescentes, marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC), marcadores quimioluminiscentes (por ejemplo, quelatos de rutenio (II)), donante de enzima clonada, particula fotosensibilizadora o particula quimioluminiscente para inmunoensayo de canalizacion de oxigeno luminiscente (LOCI), quelato de lantanido para inmunoensayo de fluorescencia resuelto en el tiempo (TRFIA), radiomarcadores, biotina, digoxigenina, enzimas y similares, por ejemplo, radionuclidos, tales como, pero sin limitacion, tritio, carbono-14, plomo-212, bismuto-212, astatina-211, yodo-131, escandio-47, renio-186, renio-188, itrio-90, yodo-123, yodo-124, yodo-125, bromo-77, indio-111 y nuclidos fisionables tales como boro-10 o un actinido. En algunas realizaciones las enzimas pueden conjugarse con los anticuerpos descritos o proteinas de union a antigeno para los fines de detectar anticuerpo unido en una muestra. Dichos conjugados de enzimas incluyen, pero sin limitacion, fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rabano picante, beta-galactosidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Los expertos en la materia entenderian que otras enzimas usadas para determinar union a anticuerpo en inmunoensayos basados en solucion son adecuadas para su uso como un conjugado para los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento. Ademas, tambien pueden conjugarse compuestos tales como esteres de acridinio con los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno proporcionados para permitir la deteccion en un inmunoensayo.

La union a anticuerpo se determina principalmente por las seis regiones CDR, especialmente CDR3 de cadena H (Kala e ta l, 132 J. Biochem. 535-41 (2002); Morea e ta l, 275 J. Mol. Biol. 269-94 (1998); y, Chothia e ta l, 196 J. Mol. Biol. 901-17 (1987)). Las regiones de marco conservado de anticuerpo, sin embargo, pueden desempenar un papel en interacciones de antigeno-anticuerpo (Panka et a l, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3080-4 (1988)), particularmente influyendo en la conformacion de bucles de CDR (Foote et a l, 224 J. Mol. Biol. 487-99 (1992)). Por lo tanto, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos pueden comprender cualquier combinacion de regiones FWR o CDR de cadena H o L que confieren union preferente para 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3 o inmunogenos basados en vitamina D-C22. Pueden emplearse experimentos de redistribucion de dominios que se llevan a cabo rutinariamente en la tecnica (Jirholt et al., 215 Gene 471-6 (1998); Soderlind et al., 18 Nature Biotechnology 852-6 (2000)), para generar anticuerpos que se unen preferentemente con 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3 o inmunogenos basados en vitamina D-C22 segun las especificaciones descritas y ejemplificadas en el presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno generados por dichos experimentos de redistribucion de dominios estan dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento. Asimismo, las CDR pueden disponerse tambien para unirse con un antigeno dado modificando por ingenieria genetica proteinas de tipo anticuerpo para actuar como armazon de CDR (Nicaise et al., 13 Protein Sci. 1882 (2004)). Dichas proteinas de union a antigeno estan dentro del alcance de los anticuerpos descritos en el presente documento.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden aparecer en una diversidad de formas, pero incluiran uno o mas de los segmentos de anticuerpos mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1. Segmentos de anticuerpos de los anticuerpos descritos y fragmentos de union a antigeno de los mismos ("Lc" indica cadena ligera y "Hc" indica cadena pesada).

Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 10. Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 11. Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 12.

Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 26.

Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 27.

Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 28.

Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 10;

una CDR2 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 11; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 12. Los anticuerpos segun la reivindicacion 1 comprenden una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 26; una CDR2 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 27; y una CDR3 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 28. Los anticuerpos segun la presente invencion comprenden una cadena pesada y una cadena ligera segun la reivindicacion 1. Las disposiciones de union a antigeno de CDR tambien pueden modificarse por ingenieria genetica usando proteinas de tipo anticuerpo como armazon de CDR. Dichas proteinas de union a antigeno modificadas por ingenieria genetica estan dentro del alcance de la divulgacion.

En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una secuencia de aminoacidos de FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una secuencia de aminoacidos de FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una secuencia de aminoacidos de FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una secuencia de aminoacidos de FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una secuencia de aminoacidos de FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una secuencia de aminoacidos de FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de FWR1 que es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13; una secuencia de aminoacidos de FWR2 que es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 que es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de FWR1 que es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29; una secuencia de aminoacidos de FWR2 que es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 que es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada incluye una secuencia de aminoacidos de FWR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13; una secuencia de aminoacidos de FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15; y la cadena ligera incluye una secuencia de aminoacidos de FWR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29; una secuencia de aminoacidos de FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31.

En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que pueden incluir una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos de CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoacidos de CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12; una secuencia de aminoacidos de FWR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13; una secuencia de aminoacidos de FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que incluyen una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoacidos de CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 26; una secuencia de aminoacidos de CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28; una secuencia de aminoacidos de FWR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29; una secuencia de aminoacidos de FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31. En el presente documento, se describen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que incluyen una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada incluye una secuencia de aminoacidos de CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoacidos de CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12; una secuencia de aminoacidos de FWR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13; una secuencia de aminoacidos de FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15; y la cadena ligera incluye una secuencia de aminoacidos de CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 26; una secuencia de aminoacidos de CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27; y una secuencia de aminoacidos de CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28; una secuencia de aminoacidos de FWR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29; una secuencia de aminoacidos de FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30; y una secuencia de aminoacidos de FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31. Las disposiciones de union a antigeno de CDR y FWR tambien pueden modificarse por ingenieria genetica usando proteinas de tipo anticuerpo como armazon de CDR. Dichas proteinas de union a antigeno modificadas por ingenieria genetica estan dentro del alcance de la divulgacion.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden tener una cadena pesada murina. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento tienen una cadena ligera murina. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos pueden tener una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada es una cadena pesada murina y la cadena ligera es una cadena ligera murina. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento tienen una cadena pesada de IgG1 murina. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento tienen una cadena ligera de Ig kappa murina. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos pueden tener una cadena pesada y una ligera, en donde la cadena pesada es una cadena pesada de IgG1 murina y la cadena ligera es una cadena de Ig kappa murina.

Polinucleotidos que codifican los anticuerpos

Tambien se describen polinucleotidos que codifican anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que se unen preferentemente con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22. Los polinucleotidos descritos pueden aparecer en una diversidad de formas y, por lo tanto, pueden ser polinucleotidos nativos, polinucleotidos recombinantes (tales como ADNc) o polinucleotidos producidos de forma sintetica. En algunas realizaciones, los polinucleotidos codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una secuencia de CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10, por ejemplo la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, los polinucleotidos codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11, por ejemplo la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, los polinucleotidos codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12, por ejemplo la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, los polinucleotidos codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 26, por ejemplo la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, los polinucleotidos codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27, por ejemplo la SEQ ID NO: 19. En algunas realizaciones, los polinucleotidos codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28, por ejemplo la SEQ ID NO: 20. Los polinucleotidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una cadena pesada con una CDR1 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10, por ejemplo la SEQ ID NO: 2; una CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11, por ejemplo la SEQ ID NO: 3; y una CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12, por ejemplo la SEQ ID NO: 4. Los polinucleotidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 26, por ejemplo la SEQ ID NO: 18; una CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27, por ejemplo la SEQ ID NO: 19; y una CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28, por ejemplo la SEQ ID NO: 20. Los polinucleotidos pueden codificar un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10, por ejemplo la s Eq ID NO: 2; una CDR2 codificada por una secuencia de nucleotidos sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11, por ejemplo la SEQ ID NO: 3; y una CDR3 codificada por una secuencia de nucleotidos sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12, por ejemplo la SEQ ID NO: 4; y una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID n O: 26, por ejemplo la SEQ ID n O: 18; una CDR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27, por ejemplo la SEQ ID NO: 19; y una CDR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28, por ejemplo la SEQ ID NO: 20. La presente invencion esta dirigida a polinucleotidos aislados segun las reivindicaciones 5 a 11.

En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13, por ejemplo la SEQ ID NO: 5. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14, por ejemplo la SEQ ID NO: 6. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15, por ejemplo la SEQ ID NO: 7. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29, por ejemplo la SEQ ID NO: 21. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30, por ejemplo la SEQ ID NO: 22. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31, por ejemplo la SEQ ID NO: 23. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13, por ejemplo la SEQ ID NO: 5; una FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14, por ejemplo la SEQ ID NO: 6; y una FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15, por ejemplo la SEQ ID NO: 7. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una FWR1 ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29, por ejemplo la SEQ ID NO: 21; una FWR2 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30, por ejemplo la SEQ ID NO: 22; y una FWR3 sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31, por ejemplo la SEQ ID NO: 23. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera, en donde una FWR1 de cadena pesada es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13, por ejemplo la SEQ ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14, por ejemplo la SEQ ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15, por ejemplo la SEQ ID NO: 7; y una FWR1 de cadena ligera es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29, por ejemplo la SEQ ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera es sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30, por ejemplo la SEQ ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID n O: 31, por ejemplo la SEQ ID NO: 23.

En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10, por ejemplo la SEQ ID NO: 2; una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11, por ejemplo la SEQ ID NO: 3; y una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12, por ejemplo la SEQ ID NO: 4; una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13, por ejemplo la SEQ ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14, por ejemplo la SEQ ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15, por ejemplo la SEQ ID NO: 7. En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 26, por ejemplo la SEQ ID NO: 18; una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27, por ejemplo la SEQ ID NO: 19; y una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28, por ejemplo la SEQ ID NO: 20; una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29, por ejemplo la SEQ ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30, por ejemplo la SEQ ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31, por ejemplo la SEQ ID NO: 23.

En el presente documento, se describen los polinucleotidos que codifican un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que tiene una cadena pesada y una ligera, en donde los polinucleotidos codifican una CDR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 10, por ejemplo la SEQ ID NO: 2; una CDR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 11, por ejemplo la SEQ ID NO: 3; una CDR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 12, por ejemplo la SEQ ID NO: 4; una FWR1 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 13, por ejemplo la SEQ ID NO: 5; una FWR2 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 14, por ejemplo la SEQ ID NO: 6; y una FWR3 de cadena pesada sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 15, por ejemplo la SEQ ID NO: 7; y una CDR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 26, por ejemplo la SEQ ID NO: 18; una CDR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 27, por ejemplo la SEQ ID NO: 19; una CDR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 28, por ejemplo la SEQ ID NO: 20; una FWR1 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 29, por ejemplo la SEQ ID NO: 21; una FWR2 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 30, por ejemplo la SEQ ID NO: 22; y una FWR3 de cadena ligera sustancialmente igual que, o identica a, la SEQ ID NO: 31, por ejemplo la SEQ ID NO: 23.

Los polinucleotidos que codifican proteinas de union a antigeno modificadas por ingenieria genetica estan dentro del alcance de la divulgacion.

En algunas realizaciones, los polinucleotidos descritos (y los peptidos que codifican) incluyen una secuencia lider. Se puede emplear cualquier secuencia lider conocida en la tecnica. En algunas realizaciones, la secuencia lider puede ser, o basarse en, la secuencia lider de cadena pesada o ligera de un anticuerpo. La secuencia lider puede incluir, pero sin limitacion, un sitio de restriccion o un sitio de inicio de la traduccion.

Debido a la variacion de secuencia natural que probablemente exista entre cadenas pesadas y ligeras y los genes que los codifican, se esperaria encontrar algun nivel de variacion en las secuencias de aminoacidos o los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento, con poca o ninguna influencia sobre sus propiedades union unicas (por ejemplo, especificidad y afinidad). Dicha expectativa se debe en parte a la degeneracion del codigo genetico, asi como al exito evolutivo de variaciones de secuencias de aminoacidos, que no alteran de forma apreciable la naturaleza de la proteina. En consecuencia, algunas realizaciones incluyen anticuerpos o fragmentos de union a antigeno que tienen 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homologia con los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno en el presente documento. Otras realizaciones incluyen anticuerpos que se unen preferentemente con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22, o fragmentos de union a antigeno de dichos anticuerpos, que tienen regiones marco conservadas, de armazon u otras que no se unen que no comparten homologia significativa con los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento, pero si incorporan una o mas CDR u otras secuencias necesarias para conferir union que son 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homologas de dichas secuencias descritas en el presente documento.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento incluyen variantes que tienen sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos individuales o multiples que conservan las propiedades biologicas (por ejemplo, afinidad de union o preferencia de union) de los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos. El experto en la materia puede producir variantes que tienen sustituciones, supresiones o adiciones de aminoacidos individuales o multiples. Estas variantes pueden incluir: (a) variantes en las que uno o mas restos de aminoacidos se sustituyen con aminoacidos conservativos o no conservativos, (b) variantes en las que uno o mas aminoacidos se anaden a o se suprimen del polipeptido, (c) variantes en las que uno o mas aminoacidos incluyen un grupo sustituyente y (d) variantes en las que el polipeptido se fusiona con otro peptido o polipeptido tal como un companero de fusion, un marcador proteico u otro resto quimico, que puede conferir propiedades utiles al polipeptido, tales como, por ejemplo, un epitopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, un resto de biotina y similares. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden incluir variantes en las que restos de aminoacidos de una especie sustituyen el resto correspondiente en otra especie, en posiciones conservadas o no conservadas. En otras realizaciones, los restos de aminoacidos en posiciones no conservadas se sustituyen con restos conservativos o no conservativos. Las tecnicas para obtener estas variantes, incluyendo tecnicas geneticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), quimicas y enzimaticas, son conocidas por el experto habitual en la materia.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden representar varios isotipos de anticuerpos, tales como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. La especificidad de anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se determina en gran medida por la secuencia de aminoacidos, y la disposicion, de las CDR. Por lo tanto, las CDR de un isotipo pueden transferirse a otro isotipo sin alterar la especificidad antigenica. Como alternativa, se han establecido tecnicas que provocan que los hibridomas cambien de produccion de un isotipo de anticuerpo a otro (cambio de isotipo) sin alterar la especificidad antigenica. En consecuencia, dichos isotipos de anticuerpo estan dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento tienen afinidades de union (en M) por un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22 que incluye una constante de disociacion (K^d) de menos de 1 x 10-2. En algunas realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-3. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-4. En algunas realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-5. En otras realizaciones mas, la K^d es menor de 1 x 10-6, 2 x 10-6, 3 x 10-6, 4 x 10-6, 5 x 10-6, 6 x 10-6, 7 x 10-6, 8 x 10-6, o 9 x 10-6. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-7, 2 x 10-7, o 3 x 10-72 x 10-73 x 10-7, 4 x 10-7, 5 x 10-76 x 10-7, 7 x 10-78 x 10-7, o 9 x 10-7. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-8, 2 x 10-8, 3 x 10-8, 4 x 10-8, 5 x 10-8, 6 x 10-8, 7 x 10-8, 8 x 10-8, o 9 x 10­ 8. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-9, 2 x 10-9, 3 x 10-9, 4 x 10-9, 5 x 10-9, 6 x 10-9, 7 x 10-9, 8 x 10-9, o 9 x 10-9. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-10, 2 x 10-10, 3 x 10-10, 2 x 10-103 x 10-10, 4 x 10-105 x 10-106 x 10-10, 7 x 10-108 x 10-10, o 9 x 10-10. En otras realizaciones mas, la K^d es menor de 1 x 10-11, 2 x 10-11, 3 x 10-11, 4 x 10­ 11, 5 x 10-11, 6 x 10-11, 7 x 10-11, 8 x 10-11, o 9 x 10-11. En algunas realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-12. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-13. En otras realizaciones, la K^d es menor de 1 x 10-14. En otras realizaciones mas, la K^d es menor de 1 x 10-15.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento, en algunas realizaciones, tienen reconocimiento equimolar de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden modificarse, por ejemplo, mediante la union covalente de cualquier tipo de molecula con el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo de modo que la union covalente no evite que el anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se una con su epitopo. Los ejemplos de modificaciones adecuadas incluyen, pero sin limitacion glucosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion y similares. En algunas realizaciones los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno pueden en si mismos derivatizarse mediante grupos de proteccion/bloqueo conocidos, escision proteolitica, union a un ligando celular u otras proteinas, y similares. Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno pueden tener restos postraduccionales que mejoran la actividad o estabilidad de los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno. Estos restos incluyen azufre, metilo, hidrato de carbono, fosforo asi como otros grupos quimicos hallados habitualmente en moleculas de inmunoglobulina. Asimismo, los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno pueden contener uno o mas aminoacidos no convencionales.

Los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento pueden marcarse o conjugarse con marcadores de diagnostico.

Tambien se proporcionan vectores que comprenden los polinucleotidos descritos en el presente documento. Los vectores pueden ser vectores de expresion. Se proporcionan por lo tanto vectores de expresion recombinante que contienen una secuencia que codifica un polipeptido de interes. El vector de expresion puede contener una o mas secuencias adicionales tales como, pero sin limitacion, secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador), un marcador de seleccion y una senal de poliadenilacion. En algunas realizaciones, los vectores pueden codificar el segmento de cadena pesada de un anticuerpo o proteina de union a antigeno descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, los vectores pueden codificar el segmento de cadena ligera de un anticuerpo o proteina de union a antigeno descrito en el presente documento. En algunos casos los componentes de cadena pesada y ligera pueden estar codificados por un unico vector. En otras realizaciones, los componentes de cadena pesada y ligera pueden estar codificados por diferentes vectores. Se conocen bien vectores para transformar una amplia diversidad de celulas hospedadoras e incluyen, pero sin limitacion, plasmidos, fagemidos, cosmidos, baculovirus, bacmidos, cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales de levaduras (YAC), asi como otros vectores bacterianos, de levadura y viricos.

Los vectores de expresion recombinantes en el alcance de la descripcion incluyen fragmentos de acido nucleico sinteticos, genomicos o procedentes de ADNc que codifican al menos una proteina recombinante que puede unirse operativamente con elementos reguladores adecuados. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de la transcripcion, secuencias que codifican sitios de union al ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminacion de la transcripcion y la traduccion. Los vectores de expresion, especialmente vectores de expresion de mamiferos, tambien pueden incluir uno o mas elementos no transcritos tales como un origen de replicacion, un promotor adecuado y potenciador ligado al gen para expresar, otras secuencias no transcritas flanqueantes 5’ o 3’, secuencias no traducidas 5’ o 3’ (tales como sitios de union a ribosomas necesarios), un sitio de poliadenilacion, sitios donantes y aceptores de corte y empalme o secuencias de terminacion de la transcripcion. Tambien puede incorporarse un origen de replicacion que confiere la capacidad de replicar en un hospedador.

Las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion en vectores de expresion para usar en la transformacion de celulas de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes viricas. Los vectores ejemplares pueden construirse como se describe en Okayama y Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).

En algunas realizaciones, la secuencia codificante del anticuerpo o fragmento de union a antigeno se coloca bajo el control de un promotor constitutivo potente, tal como los promotores para los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y otros. Ademas, muchos promotores viricos actuan de forma constitutiva en celulas eucariotas y son adecuados para su uso con las realizaciones descritas. Dichos promotores viricos incluyen, sin limitacion, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), los promotores tempranos y tardios de SV40, el promotor del virus de tumor mamario de raton (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de leucemia de Moloney, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus Epstein-Barr (VEB), el virus del sarcoma de Rous (VSR) y otros retrovirus, y el promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. En una realizacion, la secuencia codificante del anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo se coloca bajo el control de un promotor inducible tal como el promotor de metalotioneina, promotor inducible por tetraciclina, promotor inducible por doxiciclina, promotores que contienen uno o mas elementos de respuesta estimulados por interferon (ISRE) tales como proteina quinasa R 2’,5’-oligoadenilato sintetasas, genes de Mx, ADAR1 y similares.

Los vectores descritos en el presente documento pueden contener uno o mas sitios de entrada de ribosomas internos (IRES). La inclusion de una secuencia de IRES en vectores de fusion puede ser beneficiosa para potenciar la expresion de algunas proteinas. En algunas realizaciones el sistema de vector incluira uno o mas sitios de poliadenilacion (por ejemplo, SV40), que pueden estar cadena arriba o cadena abajo de cualquiera de las secuencias de acido nucleico anteriormente mencionadas. Los componentes de vectores pueden ligarse de forma contigua o disponerse de una manera que proporcione separacion optima para expresar los productos genicos (es decir, mediante la introduccion de nucleotidos "espaciadores" entre las ORF) o situarse de otra manera. Los elementos reguladores, tales como el motivo IRES, tambien pueden disponerse para proporcionar separacion optima para la expresion.

Los vectores pueden comprender marcadores de seleccion, que son bien conocidos en la tecnica. Los marcadores de seleccion incluyen marcadores de seleccion positivos y negativos, por ejemplo, genes de resistencia a antibioticos (por ejemplo, gen de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a kanamicina, un gen de resistencia a tetraciclina, un gen de resistencia a penicilina), genes de glutamato sintasa, HSV-TK, derivados de HSV-TK para seleccion de ganciclovir, o gen de nucleosido de purina fosforilasa bacteriana para seleccion de 6-metilpurina (Gadi et a/., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Una secuencia de acido nucleico que codifica un marcador de seleccion o el sitio de clonacion puede estar cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de interes o sitio de clonacion.

Los vectores descritos en el presente documento pueden usarse para transformar diversas celulas con los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos. Por ejemplo, los vectores pueden usarse para generar celulas productoras de anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Por lo tanto, otro aspecto presenta celulas hospedadoras transformadas con vectores que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que se une con un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22 tales como los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos y ejemplificados en el presente documento.

Se conocen en este campo numerosas tecnicas para la introduccion de genes ajenos en celulas y pueden usarse para construir las celulas recombinantes con el fin de llevar a cabo los metodos descritos, de acuerdo con las diversas realizaciones descritas y ejemplificadas en el presente documento. La tecnica usada deberia proporcionar la transferencia estable de la secuencia genica heterologa a la celula hospedadora, de modo que la secuencia genica heterologa sea heredable y expresable por la descendencia celular y de modo que el desarrollo y las funciones fisiologicas necesarios de las celulas receptoras no se alteren. Las tecnicas que pueden usarse incluyen, pero sin limitacion, transferencia cromosomica (por ejemplo, fusion celular, transferencia genica mediada por cromosomas, transferencia genica mediada por microcelulas), metodos fisicos (por ejemplo, transfeccion, fusion de esferoplastos, microinyeccion, electroporacion, vehiculo liposomico), transferencia de vector virico (por ejemplo, virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinante) y similares (descritos en Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). Tambien puede usarse precipitacion con fosfato calcico y fusion inducida por polietilenglicol (PEG) de protoplastos bacterianos con celulas de mamifero para transformar celulas.

Las celulas adecuadas para su uso en la expresion de los anticuerpos o fragmentos de union a antigeno descritos en el presente documento son preferentemente celulas eucariotas, mas preferentemente celulas de origen vegetal, de roedor o humano, por ejemplo, pero sin limitacion, NSO, CHO, perC.6, Tk-ts13, BHK, celulas HEK293, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, celulas L, C127, 3T3, HeLa, NS1, celulas de mieloma Sp2/0 y lineas celulares BHK, entre otras. Ademas, puede conseguirse expresion de anticuerpos usando celulas de hibridoma. Los metodos para producir hibridomas estan bien establecidos en la tecnica.

Las celulas transformadas con vectores de expresion descritos en el presente documento pueden seleccionarse o explorarse para determinar la expresion recombinante de los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno descritos en el presente documento. Las celulas positivas para recombinantes se expanden y exploran para determinar subclones que muestran un fenotipo deseado, tal como un nivel alto de expresion, propiedades de crecimiento potenciadas o la capacidad para producir protefnas con caracterfsticas bioqmmicas deseadas, por ejemplo, debido a la modificacion de protefnas o modificaciones postraduccionales alteradas. Estos fenotipos pueden deberse a propiedades inherentes de un subclon dado o a mutacion. Pueden efectuarse mutaciones mediante el uso de productos qufmicos, luz de longitud de onda UV, radiacion, virus, mutagenos de insercion, inhibicion de la reparacion de desapareamiento de ADN o una combinacion de dichos metodos.

Una vez que se ha identificado una celula que expresa la protefna deseada, esta puede expandirse y seleccionarse. Las celulas transformadas pueden seleccionarse de varias formas. Por ejemplo, las celulas pueden seleccionarse para expresion del polipeptido de interes. Las celulas transformadas con un vector que contiene un marcador seleccionable, tal como produccion de protefna fluorescente, puede seleccionarse positivamente para expresion del marcador. En otras realizaciones, las celulas que contienen un vector con un gen de resistencia a farmacos pueden seleccionarse positivamente para la capacidad de crecer en condiciones selectivas.

Ensayos y metodos

Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno descritos en el presente documento pueden usarse para detectar derivados o analogos de vitamina D en una muestra. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno se usan para detectar un derivado de vitamina D, tal como 25-hidroxivitamina D2 y/o 25-hidroxivitamina D3, o un analogo de 25-hidroxivitamina D, tal como una molecula inmunogenica o compuesto de vitamina D-C22. En algunas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno descritos pueden usarse para detectar derivados o analogos de vitamina D en una muestra biologica obtenida de un paciente o un sujeto. En algunas realizaciones, la muestra puede ser sangre o un componente sangufneo, tal como suero. En realizaciones preferidas, el individuo o sujeto es un ser humano. En algunos aspectos la muestra biologica puede obtenerse de un paciente o sujeto humano, por ejemplo, sangre humana. Los metodos descritos pueden usarse con los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno solamente o junto con otros anticuerpos o reactivos de deteccion facilmente disponibles.

Se proporcionan en el presente documento metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano. Los metodos comprenden determinar el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una muestra biologica procedente del sujeto en donde una reduccion o disminucion del nivel en la muestra biologica en relacion con el nivel en una muestra de control o con un nivel umbral de 30 ng/ml es indicativa de una deficiencia en vitamina D en el sujeto.

25-hidroxivitamina D puede estar en una de dos formas, 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3. En realizaciones preferidas de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 se determina poniendo en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3.

Pueden emplearse diversos protocolos heterogeneos y homogeneos, bien competitivos o bien no competitivos, para realizar los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto. En realizaciones preferidas, los metodos se realizan mediante inmunoensayo competitivo secuencial. El Centaur™, Vista™ e Immulite™ son sistemas de ensayo que pueden usarse para realizar un inmunoensayo competitivo.

De acuerdo con los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 total en una muestra biologica puede detectarse mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL), inmunoensayo enzimatico (EIA), inmunohistoqufmica (IHC), analisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, dialisis en equilibrio, inmunodiferenciacion o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En realizaciones preferidas de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno usado de acuerdo con los metodos no tiene reaccion cruzada con vitamina D2 y/o vitamina D3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno comprende una CDR1 de Lc de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de Lc de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de Lc de la SEQ ID NO: 28, una CDR1 de Hc de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de Hc de la SEQ ID NO: 11 y una CDR3 de Hc de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno tiene la propiedad de reconocimiento equimolar para 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3. El anticuerpo segun la presente invencion es el anticuerpo monoclonal 10H9.

Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno que reconocen 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 que pueden usarse en los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador detectable. Los marcadores ejemplares incluyen, pero sin limitacion, compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, un compuesto de ester de acridinio), un compuesto fosforescente, un compuesto fluorescente, un radiomarcador, biotina o una enzima. Los marcadores ejemplares mencionados pueden habitualmente detectarse solo cuando se excitan mediante metodos que incluyen, pero sin limitacion, la adicion de diferentes productos quimicos, estimulacion por luz o exposicion a sustrato u otros compuestos. Cuando se usa compuesto de ester de acridinio, la quimioluminiscencia es desencadenada por peroxido y acido/base lo que da como resultado un destello que puede leerse mediante instrumentacion apropiada. Puede usarse una etapa de lavado opcional antes de iniciar la capacidad de deteccion del marcador detectable.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede conjugarse con una proteina transportadora. El complejo entre el anticuerpo o la proteina de union a antigeno y proteina transportadora tambien puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

Los soportes de fase solida para su uso en los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto incluyen particulas paramagneticas; dextrano reticulado disponible con la marca comercial SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.); agarosa; perlas de poliestireno; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, redes a base de nitrocelulosa o nailon tales como laminas, tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de microtitulacion tales como las hechas de poliestireno o polivinilcloruro. Cuando se usan particulas paramagneticas, puede usarse alguna fuente de un campo magnetico para retener las particulas y moleculas unidas directa o indirectamente a las particulas durante una etapa de lavado opcional. Las moleculas pueden unirse covalentemente, mediante enlaces salinos, enlaces de hidrogeno u otro tipo de enlace.

La muestra biologica puede ser sangre, suero sanguineo o plasma sanguineo. En algunas realizaciones, La muestra biologica puede almacenarse en condiciones biologicas durante hasta 24 horas antes de su uso en los metodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, la muestra biologica se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS puede estar presente, por ejemplo, en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, la muestra biologica tambien se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS y etilenglicol pueden estar presentes en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, se anade un analogo de 25-hidroxivitamina D a la muestra biologica despues de la etapa de contacto. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede marcarse. El analogo de 25-hidroxivitamina D o analogo de 25-hidroxivitamina D marcado puede estar presente tambien en un tampon de estabilizacion que comprende sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS).

Los analogos de vitamina D descritos en el presente documento se pueden basar en el uso de un derivado de vitamina D de carbono 22 (vitamina D-C22), que incluye un grupo carboxilo C22 cuando no esta conjugado, como se representa en la Figura 1(a) (Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)). En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede ser vitamina D-C22. En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede estar conjugado con una proteina transportadora.

En algunas realizaciones de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, los analogos de vitamina D descritos pueden fijarse directamente al vehfculo proteico. Por ejemplo, la vitamina D-C22 puede conjugarse directamente con albumina de suero bovino (BSA). El numero de analogos de vitamina D que puede conjugarse con un vehfculo proteico dado variara basandose en el vehfculo usado. Los expertos en la materia entenderan que puede usarse una amplia diversidad de protefnas transportadoras para los fines descritos en el presente documento. Algunos vehfculos adecuados incluyen, KLH, KLH PEGilada, hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), BSA cationizada y ovoalbumina, por nombrar solo algunos.

La conjugacion de protefna transportadora con el analogo de vitamina D puede producirse mediante el uso de un conector qufmico. El conector qufmico puede estar compuesto por alquilo, arilo, alquiloxi, amida, sulfonamida o carbonilo o grupos peptfdicos. La conjugacion del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D con la protefna puede realizarse mediante reaccion entre grupos amino de la protefna y un grupo de ester de N-hidroxisuccinimida (ester de NHS) reactivo del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D.

En algunas realizaciones de los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto, los niveles de vitamina D pueden detectarse en 20 minutos o menos partiendo del punto en el que la muestra biologica se combina con el tampon de desplazamiento.

La deficiencia en vitamina D en el sujeto puede ser indicativa de o asociada con una enfermedad. Las enfermedades asociadas con deficiencia en vitamina D pueden incluir: raquitismo, osteomalacia, tension arterial alta, osteoporosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, esquizofrenia, depresion, enfermedades del sistema nervioso, diabetes, enfermedad infecciosa, asma, alergia o cancer.

Tambien se proporcionan en el presente documento metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una muestra biologica procedente del sujeto y, si se determina una reduccion entre el nivel en la muestra biologica en relacion con el nivel en un control normal o un nivel umbral de 30 ng/ml, administrar al sujeto un tratamiento para deficiencia en vitamina D. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano. Hay varias formas adecuadas para tratar una deficiencia en vitamina D. La deficiencia en vitamina D puede tratarse complementando el consumo de vitamina D o mediante fototerapia. La fototerapia puede incluir exposicion aumentada a luz del sol natural o exposicion a fuentes artificiales de luz ultravioleta B.

En realizaciones preferidas de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 se determina poniendo en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3.

Diversos protocolos heterogeneos y homogeneos, competitivos o no competitivos, pueden emplearse para realizar los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D. En realizaciones preferidas, los metodos se realizan mediante inmunoensayo competitivo secuencial. El Centaur™, Vista™ e Immulite™ son sistemas de ensayo que pueden usarse para realizar un inmunoensayo competitivo.

De acuerdo con los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 total en una muestra biologica puede detectarse mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL), inmunoensayo enzimatico (EIA), inmunohistoqufmica (IHC), analisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, dialisis en equilibrio, inmunodiferenciacion o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En realizaciones preferidas de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno usado de acuerdo con los metodos no tiene reaccion cruzada con vitamina D2 y/o vitamina D3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno comprende una CDR1 de Lc de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de Lc de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de Lc de la SEQ ID NO: 28, una CDR1 de Hc de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de Hc de la SEQ ID NO: 11 y una CDR3 de Hc de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno tiene la propiedad de reconocimiento equimolar para 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3. El anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 10H9.

Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno que reconocen 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 que pueden usarse en los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador detectable. Los marcadores ejemplares incluyen, pero sin limitacion, compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, un compuesto de ester de acridinio), un compuesto fosforescente, un compuesto fluorescente, un radiomarcador, biotina o una enzima. Los marcadores ejemplares mencionados pueden habitualmente detectarse solo cuando se excitan mediante metodos que incluyen, pero sin limitacion, la adicion de diferentes productos quimicos, estimulacion por luz o exposicion a sustrato u otros compuestos. Cuando se usa compuesto de ester de acridinio, la quimioluminiscencia es desencadenada por peroxido y acido/base lo que da como resultado un destello que puede leerse mediante instrumentacion apropiada. Puede usarse una etapa de lavado opcional antes de iniciar la capacidad de deteccion del marcador detectable.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede conjugarse con una proteina transportadora. El complejo entre el anticuerpo o la proteina de union a antigeno y proteina transportadora tambien puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

Los soportes de fase solida para su uso en los metodos descritos en el presente documento incluyen particulas paramagneticas; dextrano reticulado disponible con la marca comercial SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.); agarosa; perlas de poliestireno; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, redes a base de nitrocelulosa o nailon tales como laminas, tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de microtitulacion tales como las hechas de poliestireno o polivinilcloruro. Cuando se usan particulas paramagneticas, puede usarse alguna fuente de un campo magnetico para retener las particulas y moleculas unidas directa o indirectamente a las particulas durante una etapa de lavado opcional. Las moleculas pueden unirse covalentemente, mediante enlaces salinos, enlaces de hidrogeno u otro tipo de enlace.

La muestra biologica puede ser sangre, suero sanguineo o plasma sanguineo. En algunas realizaciones, La muestra biologica puede almacenarse en condiciones biologicas durante hasta 24 horas antes de su uso en los metodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, la muestra biologica se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS puede estar presente, por ejemplo, en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, la muestra biologica tambien se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS y etilenglicol pueden estar presentes en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, se anade un analogo de 25-hidroxivitamina D a la muestra biologica despues de la etapa de contacto. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede marcarse. El analogo de 25-hidroxivitamina D o analogo de 25-hidroxivitamina D marcado puede estar presente tambien en un tampon de estabilizacion que comprende sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS).

Los analogos de vitamina D descritos en el presente documento se pueden basar en el uso de un derivado de vitamina D de carbono 22 (vitamina D-C22), que incluye un grupo carboxilo C22 cuando no esta conjugado, como se representa en la Figura 1(a) (Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)). En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede ser vitamina D-C22. En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede estar conjugado con una proteina transportadora.

En algunas realizaciones de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, los analogos de vitamina D descritos pueden fijarse directamente al vehiculo proteico. Por ejemplo, la vitamina D-C22 puede conjugarse directamente con albumina de suero bovino (BSA). El numero de analogos de vitamina D que puede conjugarse con un vehiculo proteico dado variara basandose en el vehiculo usado. Los expertos en la materia entenderan que puede usarse una amplia diversidad de proteinas transportadoras para los fines descritos en el presente documento. Algunos vehiculos adecuados incluyen, KLH, KLH PEGilada, hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), BSA cationizada y ovoalbumina, por nombrar solo algunos.

La conjugacion de proteina transportadora con el analogo de vitamina D puede producirse mediante el uso de un conector quimico. El conector quimico puede estar compuesto por alquilo, arilo, alquiloxi, amida, sulfonamida o carbonilo o grupos peptidicos. La conjugacion del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D con la proteina puede realizarse mediante reaccion entre grupos amino de la proteina y un grupo de ester de N-hidroxisuccinimida (ester de NHS) reactivo del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D.

En algunas realizaciones de los metodos para tratar a un sujeto que se sospecha que tiene una deficiencia en vitamina D, los niveles de vitamina D pueden detectarse en 20 minutos o menos partiendo del punto en el que la muestra biologica se combina con el tampon de desplazamiento.

La deficiencia en vitamina D en el sujeto puede ser indicativa de o asociada con una enfermedad. Las enfermedades asociadas con deficiencia en vitamina D pueden incluir: raquitismo, osteomalacia, tension arterial alta, osteoporosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, esquizofrenia, depresion, enfermedades del sistema nervioso, diabetes, enfermedad infecciosa, asma, alergia o cancer.

Se proporcionan ademas en el presente documento metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto que lo necesite determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D en una primera muestra biologica procedente del sujeto en un primer momento y determinando despues el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una segunda muestra biologica procedente del sujeto en un segundo momento posterior al primer momento en donde una reduccion entre el nivel de la primera muestra biologica y el nivel en la segunda muestra biologica es indicativa de la progresion o el empeoramiento de una deficiencia en vitamina D en el sujeto, en donde poco o ningun cambio entre el nivel en la primera muestra biologica y el nivel en la segunda muestra biologica es indicativo de estabilizacion de una deficiencia en vitamina D en el sujeto, y en donde un aumento entre el nivel en la primera muestra biologica y el nivel en la segunda muestra biologica es indicativo de regresion de una deficiencia en vitamina D en el sujeto. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano.

En realizaciones preferidas de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 se determina poniendo en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3.

Diversos protocolos heterogeneos y homogeneos, competitivos o no competitivos, pueden emplearse para realizar los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto. En realizaciones preferidas, los metodos se realizan mediante inmunoensayo competitivo. El Centaur™, Vista™ e Immulite™ son sistemas de ensayo que pueden usarse para realizar un inmunoensayo competitivo.

De acuerdo con los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 total en una muestra biologica puede detectarse mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL), inmunoensayo enzimatico (EIA), inmunohistoquimica (IHC), analisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, dialisis en equilibrio, inmunodiferenciacion o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En realizaciones preferidas de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno usado de acuerdo con los metodos no tiene reaccion cruzada con vitamina D2 y/o vitamina D3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno es un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno comprende una CDR1 de Lc de la SeQ ID NO: 26, una CDR2 de Lc de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de Lc de la SEQ ID NO: 28, una CDR1 de Hc de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de Hc de la SEQ ID NO: 11 y una CDR3 de Hc de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno tiene la propiedad de reconocimiento equimolar para 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3. El anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 10H9.

Los anticuerpos y fragmentos de union a antigeno que reconocen 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 que pueden usarse en estos metodos pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador detectable. Los marcadores ejemplares incluyen, pero sin limitacion, compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, un compuesto de ester de acridinio), un compuesto fosforescente, un compuesto fluorescente, un radiomarcador, biotina o una enzima. Los marcadores ejemplares mencionados pueden habitualmente detectarse solo cuando se excitan mediante metodos que incluyen, pero sin limitacion, la adicion de diferentes productos quimicos, estimulacion por luz o exposicion a sustrato u otros compuestos. Cuando se usa compuesto de ester de acridinio, la quimioluminiscencia es desencadenada por peroxido y acido/base lo que da como resultado un destello que puede leerse mediante instrumentacion apropiada. Puede usarse una etapa de lavado opcional antes de iniciar la capacidad de deteccion del marcador detectable.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede conjugarse con una proteina transportadora. El complejo entre el anticuerpo o la proteina de union a antigeno y proteina transportadora tambien puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

Los soportes de fase solida para su uso en los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto incluyen particulas paramagneticas; dextrano reticulado disponible con la marca comercial SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.); agarosa; perlas de poliestireno; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, redes a base de nitrocelulosa o nailon tales como laminas, tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de microtitulacion tales como las hechas de poliestireno o polivinilcloruro. Cuando se usan particulas paramagneticas, puede usarse alguna fuente de un campo magnetico para retener las particulas y moleculas unidas directa o indirectamente a las particulas durante una etapa de lavado opcional. Las moleculas pueden unirse covalentemente, mediante enlaces salinos, enlaces de hidrogeno u otro tipo de enlace.

La muestra biologica puede ser sangre, suero sanguineo o plasma sanguineo. En algunas realizaciones, La muestra biologica puede almacenarse en condiciones biologicas durante hasta 24 horas antes de su uso en los metodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, la muestra biologica se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS puede estar presente, por ejemplo, en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, la muestra biologica tambien se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS y etilenglicol pueden estar presentes en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, se anade un analogo de 25-hidroxivitamina D a la muestra biologica despues de la etapa de contacto. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede marcarse. El analogo de 25-hidroxivitamina D o analogo de 25-hidroxivitamina D marcado puede estar presente tambien en un tampon de estabilizacion que comprende sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS).

Los analogos de vitamina D descritos en el presente documento se pueden basar en el uso de un derivado de vitamina D de carbono 22 (vitamina D-C22), que incluye un grupo carboxilo C22 cuando no esta conjugado, como se representa en la Figura 1(a) (Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)). En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede ser vitamina D-C22. En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede estar conjugado con una proteina transportadora.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, los analogos de vitamina D descritos pueden fijarse directamente al vehfculo proteico. Por ejemplo, la vitamina D-C22 puede conjugarse directamente con albumina de suero bovino (BSA). El numero de analogos de vitamina D que puede conjugarse con un vehfculo proteico dado variara basandose en el vehfculo usado. Los expertos en la materia entenderan que puede usarse una amplia diversidad de protefnas transportadoras para los fines descritos en el presente documento. Algunos vehfculos adecuados incluyen, KLH, KLH PEGilada, hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), BSA cationizada y ovoalbumina, por nombrar solo algunos.

La conjugacion de protefna transportadora con el analogo de vitamina D puede producirse mediante el uso de un conector qufmico. La conjugacion del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D con la protefna puede realizarse mediante reaccion entre grupos amino de la protefna y un grupo de ester de N-hidroxisuccinimida (ester de NHS) reactivo del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar la progresion de deficiencia en vitamina D en un sujeto, los niveles de vitamina D pueden detectarse en 20 minutos o menos partiendo del punto en el que la muestra biologica se combina con el tampon de desplazamiento.

La deficiencia en vitamina D en el sujeto puede ser indicativa de o asociada con una enfermedad. Las enfermedades asociadas con deficiencia en vitamina D pueden incluir: raquitismo, osteomalacia, tension arterial alta, osteoporosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, esquizofrenia, depresion, enfermedades del sistema nervioso, diabetes, enfermedad infecciosa, asma, alergia o cancer.

Tambien se proporcionan en el presente documento metodos para supervisar el tratamiento de la deficiencia en vitamina D en un sujeto que lo necesita determinando el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una primera muestra biologica procedente del sujeto en un primer momento y determinando despues el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una segunda muestra biologica procedente del sujeto en un segundo momento posterior al primer momento y despues del tratamiento del sujeto para dicha deficiencia en vitamina D en donde un aumento o una estabilizacion del nivel en la segunda muestra biologica en relacion con el nivel en la primera muestra biologica es indicativo de eficacia del tratamiento de la deficiencia en vitamina D en dicho sujeto, y en donde una reduccion del nivel en la segunda muestra biologica es indicativa de ineficacia del tratamiento de la deficiencia en vitamina D en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano.

En realizaciones preferidas de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 se determina poniendo en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3.

Diversos protocolos heterogeneos y homogeneos, competitivos o no competitivos, pueden emplearse para realizar los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto. En realizaciones preferidas, los metodos se realizan mediante inmunoensayo competitivo secuencial. El Centaur™, Vista™ e Immulite™ son sistemas de ensayo que pueden usarse para realizar un inmunoensayo competitivo.

De acuerdo con los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, el nivel de 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 total en una muestra biologica puede detectarse mediante quimioluminiscencia potenciada (ECL), inmunoensayo enzimatico (EIA), inmunohistoqufmica (IHC), analisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, dialisis en equilibrio, inmunodiferenciacion o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En realizaciones preferidas de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno usado de acuerdo con los metodos no tiene reaccion cruzada con vitamina D2 y/o vitamina D3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno es un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno comprende una CDR1 de Lc de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de Lc de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de Lc de la SEQ ID NO: 28, una CDR1 de Hc de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de Hc de la SEQ ID NO: 11 y una CDR3 de Hc de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno tiene la propiedad de reconocimiento equimolar para 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3. El anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 10H9.

Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno que reconocen 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 que pueden usarse en los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador detectable. Los marcadores ejemplares incluyen, pero sin limitacion, compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, un compuesto de ester de acridinio), un compuesto fosforescente, un compuesto fluorescente, un radiomarcador, biotina o una enzima. Los marcadores ejemplares mencionados pueden habitualmente detectarse solo cuando se excitan mediante metodos que incluyen, pero sin limitacion, la adicion de diferentes productos qufmicos, estimulacion por luz o exposicion a sustrato u otros compuestos. Cuando se usa compuesto de ester de acridinio, la quimioluminiscencia es desencadenada por peroxido y acido/base lo que da como resultado un destello que puede leerse mediante instrumentacion apropiada. Puede usarse una etapa de lavado opcional antes de iniciar la capacidad de deteccion del marcador detectable.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

El anticuerpo o fragmento de union a antigeno puede conjugarse con una proteina transportadora. El complejo entre el anticuerpo o la proteina de union a antigeno y proteina transportadora tambien puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

Los soportes de fase solida para su uso en los metodos descritos en el presente documento incluyen particulas paramagneticas; dextrano reticulado disponible con la marca comercial SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.); agarosa; perlas de poliestireno; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, redes a base de nitrocelulosa o nailon tales como laminas, tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de microtitulacion tales como las hechas de poliestireno o polivinilcloruro. Cuando se usan particulas paramagneticas, puede usarse alguna fuente de un campo magnetico para retener las particulas y moleculas unidas directa o indirectamente a las particulas durante una etapa de lavado opcional. Las moleculas pueden unirse covalentemente, mediante enlaces salinos, enlaces de hidrogeno u otro tipo de enlace.

La muestra biologica puede ser sangre, suero sanguineo o plasma sanguineo. En algunas realizaciones, La muestra biologica puede almacenarse en condiciones biologicas durante hasta 24 horas antes de su uso en los metodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, la muestra biologica se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS puede estar presente, por ejemplo, en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, la muestra biologica tambien se trata o combina con sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. Como alternativa, la muestra biologica se puede tratar o combinar con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo que reconoce tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 o fragmento de union a antigeno. El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El ANS y etilenglicol pueden estar presentes en un tampon de desplazamiento. Puede usarse opcionalmente metanol con el sulfonato de 8-amino-1-naftaleno (ANS) y etilenglicol antes de poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno o simultaneamente con la puesta en contacto de la muestra biologica con un anticuerpo o fragmento de union a antigeno. Puede incluirse metanol, por ejemplo, en el tampon de desplazamiento.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, se anade un analogo de 25-hidroxivitamina D a la muestra biologica despues de la etapa de contacto. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede marcarse. El analogo de 25-hidroxivitamina D o analogo de 25-hidroxivitamina D marcado puede estar presente tambien en un tampon de estabilizacion que comprende sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS).

Los analogos de vitamina D descritos en el presente documento se pueden basar en el uso de un derivado de vitamina D de carbono 22 (vitamina D-C22), que incluye un grupo carboxilo C22 cuando no esta conjugado, como se representa en la Figura 1(a) (Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993)). En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede ser vitamina D-C22. En algunas realizaciones, el analogo de vitamina D puede estar conjugado con una proteina transportadora.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, los analogos de vitamina D descritos pueden fijarse directamente al vehiculo proteico. Por ejemplo, la vitamina D-C22 puede conjugarse directamente con albumina de suero bovino (BSA). El numero de analogos de vitamina D que puede conjugarse con un vehfculo proteico dado variara basandose en el vehfculo usado. Por ejemplo, BSA alojara la union de un numero relativamente bajo de protefnas, quizas de aproximadamente 10 a aproximadamente 25; como alternativa, un vehfculo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) puede alojar de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 moleculas antigenicas. Los expertos en la materia entenderan que puede usarse una amplia diversidad de protefnas transportadoras para los fines descritos en el presente documento. Algunos vehfculos adecuados incluyen, KLH, KLH PEGilada, hemocianina de Concholepas concholepas (CCH), BSA cationizada y ovoalbumina, por nombrar solo algunos.

La conjugacion de protefna transportadora con el analogo de vitamina D puede producirse mediante el uso de un conector qufmico. La conjugacion del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D con la protefna puede realizarse mediante reaccion entre grupos amino de la protefna y un grupo de ester de N-hidroxisuccinimida (ester de NHS) reactivo del analogo de vitamina D o derivado de vitamina D.

En algunas realizaciones de los metodos para supervisar el tratamiento de deficiencia en vitamina D en un sujeto, los niveles de vitamina D pueden detectarse en 20 minutos o menos partiendo del punto en el que la muestra biologica se combina con el tampon de desplazamiento.

La deficiencia en vitamina D en el sujeto puede ser indicativa de o asociada con una enfermedad. Las enfermedades asociadas con deficiencia en vitamina D pueden incluir: raquitismo, tension arterial alta por osteomalacia, osteoporosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, esquizofrenia, depresion, enfermedades del sistema nervioso, diabetes, enfermedad infecciosa, asma, alergia o cancer.

Tambien se proporcionan en el presente documento metodos para estabilizar el analogo de 25-hidroxivitamina D poniendo en contacto el analogo de 25-hidroxivitamina D con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El analogo de 25-hidroxivitamina D estabilizado con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) puede almacenarse durante mas de 2 meses fuera de un sistema de ensayo. El analogo de 25-hidroxivitamina D estabilizado con sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS) puede almacenarse durante mas de 7 dfas dentro de un sistema de ensayo.

Tambien se proporcionan en el presente documento metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto. En realizaciones preferidas, el sujeto es un ser humano. Las muestras biologicas para su uso en los metodos pueden ser sangre, suero sangufneo o plasma sangufneo procedentes del sujeto. Los metodos para detectar deficiencia en vitamina D en un sujeto implican determinar el nivel de 25-hidroxivitamina D total en una muestra biologica procedente del sujeto combinando la muestra biologica y un tampon de desplazamiento. La muestra biologica puede anadirse al tampon de desplazamiento o viceversa para formar una mezcla de ensayo. El tampon de desplazamiento desplaza la vitamina D de la protefna de union a vitamina D. En realizaciones preferidas, el tampon de desplazamiento contiene sulfonato de 8-anilino-1 -naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). El tampon de desplazamiento puede contener ademas etilenglicol. En algunas realizaciones, el tampon de desplazamiento contiene ANS y metanol. En algunas realizaciones preferentes, el tampon de desplazamiento contiene ANS, etilenglicol y metanol.

A continuacion, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que se une preferentemente con 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 o inmunogeno basado en vitamina D-C22 conjugado con un primer marcador se combina con la mezcla de ensayo. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno puede anadirse a la mezcla de ensayo o viceversa y se convierte en un componente de la misma. El anticuerpo que se une preferentemente con 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 o inmunogeno basado en vitamina D-C22, o fragmento de union a antfgeno del mismo, es preferentemente un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno como se ha descrito anteriormente. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno comprende una CDR1 de Lc de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de Lc de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de Lc de la SEQ ID NO: 28, una CDR1 de Hc de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de Hc de la SEQ ID n O: 11 y una CDR3 de Hc de la SEQ ID NO: 12. El anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 10H9. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que se une preferentemente con 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 o inmunogeno basado en vitamina D-C22 puede inmovilizarse en un soporte de fase solida. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que se une preferentemente con 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 o inmunogeno basado en vitamina D-C22 puede conjugarse con una protefna transportadora. El complejo del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno que se une preferentemente con 25-hidroxivitamina D2, 25-hidroxivitamina D3 o inmunogeno basado en vitamina D-C22 y la protefna transportadora tambien puede inmovilizarse en un soporte de fase solida.

El primer marcador es preferentemente un marcador detectable. El primer marcador puede ser un compuesto quimioluminiscente (por ejemplo, un compuesto de ester de acridinio), un compuesto fosforescente, un compuesto fluorescente, un radiomarcador, biotina o una enzima. Los marcadores ejemplares mencionados pueden habitualmente detectarse solo cuando se excitan mediante metodos que incluyen, pero sin limitacion, la adicion de diferentes productos quimicos, estimulacion por luz o exposicion a sustrato u otros compuestos. Cuando se usa compuesto de ester de acridinio, la quimioluminiscencia es desencadenada por peroxido y acido/base lo que da como resultado un destello que puede leerse mediante instrumentacion apropiada. Puede usarse una etapa de lavado opcional antes de iniciar la capacidad de deteccion del marcador detectable.

A continuacion se combina un analogo de 25-hidroxivitamina D que tiene un segundo marcador con la mezcla de ensayo. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede anadirse a la mezcla de ensayo o viceversa y se convierte en un componente de la misma. El segundo marcador puede ser fluoresceina para union con anticuerpo antifluoresceina, biotina para union con avidina, estreptavidina o anticuerpo anti-biotina, digoxigenina para union con anticuerpo antidigoxigenina u otro hapteno y companero de union. El analogo de 25-hidroxivitamina D puede estar presente en un tampon de estabilizacion que comprende sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS). El ANS puede estar en forma de un acido o una sal de ANS (por ejemplo, sal de sodio de ANS, sal de potasio de ANS, sal de magnesio de ANS o sal de amonio de ANS). En algunas realizaciones, el analogo de 25-hidroxivitamina D esta conjugado con una proteina transportadora. La proteina transportadora puede ser albumina de suero bovino, ovoalbumina, inmunoglobulina o gamma globulina IgG bovina.

Un soporte de fase solida conjugado con un anticuerpo que reconoce el segundo marcador tambien se combina con la mezcla de ensayo. El soporte de fase solida conjugado con el anticuerpo que reconoce el segundo marcador puede anadirse a la mezcla de ensayo o viceversa y se convierte en un componente de la mezcla de ensayo. El anticuerpo que se conjuga con el soporte de fase solida puede ser un anticuerpo que se une con fluoresceina.

Los soportes de fase solida para su uso en los metodos descritos en el presente documento incluyen particulas paramagneticas; dextrano reticulado disponible con la marca comercial SEPHADEX (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.); agarosa; particulas o perlas de poliestireno; cloruro de polivinilo, poliestireno, poliacrilamida reticulada, redes a base de nitrocelulosa o nailon tales como laminas, tiras o palas; o tubos, placas o los pocillos de una placa de microtitulacion tales como las hechas de poliestireno o polivinilcloruro. Cuando se usan particulas paramagneticas, puede usarse alguna fuente de un campo magnetico para retener las particulas y moleculas unidas directa o indirectamente a las particulas durante una etapa de lavado opcional. Las moleculas pueden unirse covalentemente, mediante enlaces salinos, enlaces de hidrogeno u otro tipo de enlace.

El nivel de 25-hidroxivitamina D total en la muestra biologica se determina midiendo la senal emitida por el primer marcador, en donde un nivel reducido de 25-hidroxivitamina D en la muestra biologica en relacion con el nivel en un control normal o un nivel umbral de 30 ng/ml es indicativo de una deficiencia en vitamina D en el sujeto.

Los inmunorreactivos de cualquier sistema de diagnostico descrito en el presente documento pueden proporcionarse en solucion, como una dispersion liquida o como un polvo sustancialmente seco, por ejemplo, en forma liofilizada.

En algunas realizaciones, la deficiencia en vitamina D pueden detectarse en 20 minutos o menos partiendo del punto en el que la muestra biologica se combina con el tampon de desplazamiento.

La deficiencia en vitamina D en el sujeto puede ser indicativa de una enfermedad. La enfermedad puede incluir: raquitismo, osteomalacia, tension arterial alta, osteoporosis, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, esquizofrenia, depresion, enfermedades del sistema nervioso, diabetes, enfermedad infecciosa, asma, alergia o cancer.

Kits

Los kits pueden comprender un anticuerpo o fragmento de union a antigeno como se describe en el presente documento e instrucciones, por ejemplo, para recoger una muestra biologica de un sujeto y/o para usar el anticuerpo o fragmento de union a antigeno para determinar la cantidad de vitamina D total en una muestra biologica. En realizaciones preferidas, el anticuerpo o fragmento de union a antigeno comprende un marcador detectable como se describe en el presente documento. El kit tambien puede comprender un analogo de vitamina D unido a un soporte solido. En algunas realizaciones, el kit puede comprender una curva patron o conjunto de datos que muestran una correlacion de la cantidad o el nivel de vitamina D con niveles normales y/o deficientes de vitamina D.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para describir las realizaciones descritas en el presente documento en mayor detalle. Su objetivo es ilustrar, no limitar, las realizaciones.

Ejemplos

EJEMPLO I - Sl'NTESIS DE MOLECULAS Y COMPUESTOS BASADOS EN VITAMINA D-C22

Para producir antigenos basados en vitamina D-C22 fue necesaria una forma manipulable de la molecula. Para conseguir esto, se acometieron intentos de producir acido de vitamina D-C22 mediante un esquema de sintesis basado en el de Hollis y Napoli (Clin.Chem, 31:1815-1819 (1985)). En resumen, se hizo reaccionar acetato de acido 23, 24-Bisnor-5-colenico-3p-OL (2,50 g) con metanol (0,312 ml), diciclohexilcarbodiimida (1,59 g) y N,N-dimetilaminopiridina (160 mg) en diclorometano (25 ml) durante 3 horas para proporcionar acetato de acido 23, 24-bisnor-5-colenico-3p-OL, ester metilico (1,808 g). El ester metilico (1,808 g) se bromo con N-bromosuccinimida (1,05 g) /azoisobutironitrilo (51,7 mg) en hexano (200 ml) a reflujo durante 30 minutos, seguido de deshidrobromacion con fluoruro de tetrabutilamonio (1 M en THF, 23,8 ml) en THF (112 ml) a temperatura ambiente durante 2 horas para proporcionar ester metilico de acetato de acido 23, 24-Bisnor-5, 7-coledienico-3p-OL (1,21 g).

Acetato de acido 23, 24-Bisnor-5, 7-coledienico-3p-OL, ester metilico (1,21 g) se hizo reaccionar con hidroxido de potasio (0,50 g) en metanol (18 ml) y eter etilico (22 ml) a temperatura ambiente durante 2,5 horas para producir ester metilico de acido 23, 24-bisnor-5, 7-coledienico-3p-OL (0,962 g). acido 23, 24-Bisnor-5, 7-coledienico-3p-OL, ester metilico (0,960 g) se irradio bajo una lampara de mercurio a 450 w con un filtro Vycon en eter (1100 ml) de -10 a 0 °C durante 3 minutos y 30 segundos dos veces, despues se separo por cromatografia en columna en gel de silice para proporcionar ester metilico de previtamina D-C22 que se sometio a reflujo en etanol (100 ml) durante 3 horas para producir ester metilico de vitamina D-C22 (0,389 g). Se hizo reaccionar ester metilico de vitamina D-C22 (249 mg) con hidroxido de potasio (6,25 g) en metanol (30 ml) a 60 °C durante 5 horas para proporcionar acido de vitamina D-C22 (165 mg). (Figura 2.)

Para formar compuestos conjugados con vitamina D-C22 fue necesario un precursor de NHS. para conseguir esto se hizo reaccionar acido de vitamina D-C22 (165 mg) con diciclohexicarbodiimida (116 mg) y N-hidroxisuccinimida (64 mg) en 1 ,4-dioxano, despues se hizo reaccionar con 1 ,4-diaminobutano (480 ul) a temperatura ambiente durante 2 horas para proporcionar vitamina D-DAB (141 mg). Los reactivos sensibles a proteinas, vitamina D-DAB-Suberoil-NHS y vitamina D-DAB-PEG5-NHS, se prepararon a partir de vitamina D-DAB mediante reaccion con exceso de suberato de disuccinimidilo o PEG5-Di-NHS. Los esteres de NHS se purificaron mediante HPLC de fase inversa preparatoria a traves de una columna C18. La vitamina D-DAB (30 mg) se hizo reaccionar con exceso de suberato de disuccinimidilo (DSS, 133 mg) en DMF (1,2 ml) y trietilamina (15 ul) durante 3,5 horas. El producto (24,5 mg) se purifico mediante HPLC preparatoria a traves de una columna de Synergi Hydro-RP para producir vitamina D-DAB-Suberoil-NHS. La vitamina D-DAB (41 mg) se hizo reaccionar con exceso de Bis-PEG5-NHS (282 mg) en DMF (2,0 ml) y trietilamina (20 ul) durante 3,5 horas. El producto (33,7 mg) se purifico mediante HPLC preparatoria a traves de una columna de Synergi Hydro-RP para producir vitamina D-DAB-PEG5-NHS. (Figura 3.) Se prepararon conjugados proteicos mediante reaccion entre ester de NHS y los grupos amino de lisina de las proteinas como se representa en la Figura 4. Se preparo Vit D-DAB-Suberoil-BSA mediante la reaccion de Vit D-DAB-Suberoil-NHS (5 mg) con BSA (10 mg) en una mezcla de tampon de fosfato 0,1 M, pH 7,5 (1 ml) y DMF (0,4 ml) a temperatura ambiente durante 2 h y se purifico por centrifugacion usando PBS, pH 7,2 para intercambio de tampon. La espectrometria de masas de MALDl-TOF mostro carga de 14 marcadores de Vitamina D por BSA.

Se prepararon conjugados de Vitamina D-DAB-PEG5-BSA-Fluoresceina (Figura 5) mediante una conjugacion de dos etapas por reaccion entre el tiol libre de BSA con fluoresceina-5-maleimida seguido de reaccion de los grupos amino de lisina con vitamina D-DAB-PEG5-NHS. Los conjugados se aislaron mediante filtracion en gel usando una columna Sephadex G25. Se descubrio que el conjugado preparado usando una relacion molar de fluoresceina-5-maleimida con respecto a BSA 10:1 seguido de conjugacion a relacion molar de vitamina D-DAB-PEG5-NHS con respecto a BSA 20:1 produjo las mejores curvas de ensayo Centaur®.

Se prepararon conjugados de vitamina D-fluoresceina y se usaron como antigeno de recubrimiento de particulas magneticas para el ensayo Centaur®. Tambien se obtuvieron buenos resultados de inmunoensayo usando un derivado de moleculas pequenas, vitamina D-DAB-PEG5-aminopentil-tioureidil fluoresceina, PM 1208 (estructura posterior), como un antigeno de recubrimiento de particulas magneticas.

EJEMPLO II - PRODUCCION DE ANTICUERPOS REACTIVOS A COMPUESTOS ANTIGENICOS DE VITAMINA D-C22

Se realizaron experimentos para producir anticuerpos que podrian unirse preferentemente con moleculas que tienen aspectos estructurales de la molecula antigenica de vitamina D-C22. Estos experimentos se realizaron de acuerdo con el metodo de Galfre et al. (Nature, 266:550 (1977)), modificado por Oi y Herzenberg (Selected Methods in Cellular Immunology (1980)). Inicialmente, se inmunizaron ratones BALB/c con vitamina D-C22 BSA emulsionada en adyuvante completo de Freund seguido de una inmunizacion secundaria usando adyuvante incompleto de Freund. Se recogieron sueros de ratones inmunizados dos semanas despues de la inmunizacion secundaria.

Se ensayaron sueros recogidos para determinar la reactividad de antigenos mediante ELISA de la siguiente manera: se incubaron placas de microtitulacion recubiertas con vitamina D-C22 KLH con antisueros de raton, diluidos en tampon de dilucion, durante una hora. Las placas se lavaron y se anadio un anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de raton) conjugado con peroxidasa de rabano picante (HPRO) en tampon de dilucion y se incubaron durante 30 minutos. Las placas se lavaron y se anadio el sustrato colorimetrico 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). El color generado se detuvo usando acido sulfurico IN y la densidad optica se midio a 450 nm. Los sueros de los cinco ratones ensayados mostraron reactividad sustancial en relacion con suero de raton normal (NMS) (Tabla 2).

Tabla 2: Deteccion de vitamina D-C22 mediante sueros de ratones inmunizados

EJEMPLO III - PRODUCCION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES REACTIVOS A COMPUESTOS ANTIGENICOS DE VITAMINA D-C22

Se seleccionaron ratones que muestran una respuesta inmunitaria positiva a antigenos de vitamina D-C22 para desarrollo de anticuerpos monoclonales. En resumen, se fusionaron celulas del bazo recogidas de ratones seleccionados con celulas de mieloma Sp2/0 de raton. Se seleccionaron hibridomas resultantes que produjeron anticuerpos reactivos a 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 y se clonaron al menos dos veces por el procedimiento de dilucion limitante para obtener lineas celulares productoras de anticuerpos monoclonales. Una linea celular monoclonal que se identifico y ensayo adicionalmente fue el hibridoma 10H9.

Despues del aislamiento de clones de hibridoma, se realizaron estudios para determinar la capacidad relativa de los anticuerpos para unirse tanto con 25-hidroxivitamina D2 como con 25-hidroxivitamina D3. Para evaluar esto, se realizaron ensayos de desplazamiento de anticuerpos para determinar el grado en que la union entre vitamina D-C22 y un anticuerpo reactivo inducido contra el antigeno (10H9) podria alterarse por la presencia de 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3. El sobrenadante de cultivo celular de las lineas celulares de hibridoma 10H9 reactivas a vitamina D-C22 se coincubaron en presencia o ausencia de 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3 en placas de microtitulacion recubiertas con vitamina D-C22 KLH durante 1 hora. Despues de lavar las placas, se anadio HRPO-IgG de cabra anti raton y se incubo durante 30 minutos. Las placas se lavaron y despues se incubaron con tetrametil benzidina (TMB). El color generado se detuvo usando acido sulfurico IN y la densidad optica se midio a 450 nm. Como se expone en la Tabla 3 (y como se representa en la Figura 6), la union de anticuerpos con vitamina D-C22 KLH se altero de una manera dependiente de la concentracion mediante coincubacion con 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3. Tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 mostraron perfiles de alteracion de la union sustancialmente similares lo que es caracteristico de afinidad equimolar del anticuerpo ensayado.

Tabla 3: Desplazamiento de anticuerpos reactivos a vitamina D-C22 mediante 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3.

A continuacion, se realizaron experimentos de desplazamiento usando anticuerpo purificado, en lugar de sobrenadante celular. En este experimento, el anticuerpo de interes se aplico directamente sobre la placa de microtitulacion mediante una incubacion de dos horas. Las placas recubiertas se lavaron y despues se coincubaron con 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3 en presencia de vitamina D-C22-diaminobutano-suberoilo conjugado con fosfatasa alcalina. Despues de 30 minutos las placas se lavaron y se revelo color anadiendo el sustrato fosfato de p-nitrofenilo (PNPP). La densidad optica de la solucion coloreada se midio a 405 nm. De nuevo, la union de 10H9 con vitamina D-C22 se altero de una manera dependiente de la concentracion mediante coincubacion con 25-hidroxivitamina D2 o 25­ hidroxivitamina D3 (Tabla 4). Tanto 25-hidroxivitamina D2 como 25-hidroxivitamina D3 mostraron perfiles de alteracion de la union sustancialmente similares lo que es caracteristico de afinidad equimolar del anticuerpo ensayado (Figura 7).

Tabla 4: Desplazamiento de anticuerpos reactivos a vitamina D-C22 mediante 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3.

EJEMPLO IV

ENSAYO DE VITAMINA D

Se anade muestra biologica a una cubeta de reaccion seguida de tampon de desplazamiento y se permitio que reaccionara durante 4,5 minutos. Se anade anticuerpo monoclonal conjugado con ester de acridinio y se permite que reaccione durante 5,5 minutos para unirse con 25-hidroxivitamina D en la muestra. Se anade un analogo de 25-hidroxivitamina D conjugado con albumina de suero bovino y fluoresceina junto con particulas paramagneticas recubiertas con antifluoresceina y se permite que reaccionen durante 3,75 minutos. La cubeta de reaccion se lava y se anaden reactivos acidos y basicos para iniciar la reaccion quimioluminiscente. El tiempo hasta el resultado es de 18 minutos. Existe una relacion inversa entre la cantidad de 25-hidroxivitamina D en la muestra de paciente y la cantidad de unidades de luz relativas (ULR) detectadas por el sistema.

Ensayo: El ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur es un inmunoensayo competitivo de anticuerpos de un pase, de 18 minutos, que usa un anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceina unido covalentemente con particulas paramagneticas (PPM), un anticuerpo monoclonal marcado con ester de acridinio (AE) y un analogo de vitamina D marcado con fluoresceina (Figura 8). El ensayo de Vitamina D total requiere 20 pl de volumen de muestra para una unica determinacion. El tiempo hasta el primer resultado es de 18 minutos y el rendimiento es de 240 ensayos/hora.

En resumen, la primera etapa del inmunoensayo competitivo de hapteno/anticuerpo de etapas secuenciales usando tecnologia quimioluminiscente comienza con el analizador distribuyendo 20 pl de muestra biologica a una cubeta seguido de la adicion de 200 pl de tampon de desplazamiento (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, azida de sodio al 0,09 %, pH=7,5) que contiene sal de amonio de acido 8-anilino-1 -naftalenosulfonico (Sigma-aldrich, San Luis, MO) y etilenglicol (Sigma-aldrich, San Luis, MO) e incubacion durante 4,5 minutos a 37 °C. Se anade reactivo ligero (50 pl) que contiene un anticuerpo monoclonal anti 25-hidroxi Vitamina D marcado con ester de acridinio (anticuerpo monoclonal 10H9) a la mezcla y se incuba durante 5,5 min a 37 °C. Se anaden conjugado de C22-PEG-BSA-fluoresceina (50 pl) y microparticulas paramagneticas recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-fluoresceina (100 pl) a la mezcla y se incuban durante 3,75 minutos a 37 °C. La cuarta etapa es separacion de complejo de fase solida con conjugado de C22-PEG-BSA-fluoresceina unido y anticuerpo monoclonal anti 25-hidroxi vitamina D marcado con ester de acridinio, seguido de lavado tres veces para retirar cualquier reactivo ligero. La ultima es la distribucion secuencial de 300 pl de cada reactivo acido y despues reactivo basico para iniciar la reaccion quimioluminiscente. El tiempo de incubacion total de la muestra al resultado es de 18 minutos. Hay una relacion indirecta entre la cantidad de 25-hidroxivitamina D presente en la muestra biologica y la cantidad de quimioluminiscencia cuantificada como unidades de luz relativas (ULR). En el ensayo basado en Centaur, hay una relacion inversa entre las ULR emitidas por el ester de acridinio y la cantidad de vitamina D debido a que la 25-hidroxivitamina D liberada de la proteina transportadora en el plasma compite con la Vitamina D-BSA-Fluoresceina por la union con una cantidad limitada del anticuerpo monoclonal 10H9 marcado con acridinio. Niveles mayores de 25(OH)D en la muestra del paciente reducirian la cantidad de complejo de acridinio-MAb-VitD-BSA-Fluoresceina en las particulas magneticas dando como resultado ULR menores.

Precision: El estudio de precision se baso en el protocolo de CLSI EP5-A2: dos ciclos al dia durante 10 dias en un unico sistema de ADVIA Centaur. Se determino la precision del ensayo usando muestras con Vitamina D Total que varia de 4 a 120 ng/ml.

Sensibilidad analitica: La sensibilidad analitica se define como la concentracion que corresponde a la senal media mas 2 DT obtenida del patron mas bajo, expresada en unidades de luz relativas (ULR). Es estudio de sensibilidad analitica se realizo siguiendo el protocolo de CLSI EP5-A2. La sensibilidad analitica se determino usando 60 repeticiones del patron mas bajo.

Li'mite de blanco, li'mite de deteccion y sensibilidad funcional: El limite de blanco se define como la concentracion de analito que corresponde al percentil 95 de la distribucion de un grupo basico negativo humano. El patron bajo de vitamina D total se ensayo 20 veces usando dos lotes de reactivos en tres sistemas (n = 120). El limite de deteccion (LoD) se determina segun el protocolo de CLSI EP17-A. El limite de deteccion se define como la menor concentracion de vitamina D que puede detectarse con 95 % de probabilidad. El LoD se determino usando muestras de vitamina D de bajo nivel que se ensayaron 20 veces usando dos lotes de reactivos en tres sistemas (n = 120). La sensibilidad funcional se determino usando un unico instrumento durante 10 dias. Se realizaron dos ciclos al dia por duplicado para un total de 60 repeticiones. Las concentraciones de miembros del panel de sensibilidad de Vitamina D Total ADVIA Centaur variaron de 3,0 a 20,0 ng/ml. Las concentraciones se calcularon usando curvas de calibracion de dos puntos, de dia cero, dentro del lote.

Estudios de interferencia: Se evaluo la interferencia de sustancias endogenas y no endogenas siguiendo las directrices en NCCLS EP-7A. A cada muestra se anadio un interferente y se comparo con un control coincidente sin adicion.

Reactividad cruzada: Se analizaron cinco derivados de vitamina D usando el ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur. Los derivados de vitamina D se anadieron a una muestra que contenia 27 ng/ml de vitamina D total. Se ensayaron tres repeticiones de las muestras anadidas y se determino la concentracion de vitamina D total.

Estudio de tipo tubo: La correlacion de tubos separadores de EDTA y suero (SST) se analizo usando el ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur. Se recogieron tubos de tapon rojo de suero, SST y EDTA de 119 donantes y se ensayaron usando el ensayo total de Vitamina D Total Centaur. Se evaluaron tres repeticiones de cada muestra. Se determino la correlacion de regresion lineal entre suero y SST y suero frente a EDTA.

Correlacion de metodos: El ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur se comparo con un inmunoensayo de Vitamina D Total, con FDA eliminado, disponible en el mercado usando 199 muestras de pacientes, una unica repeticion para cada metodo. La concentracion de las muestras vario de 5 a 150 ng/ml. Ademas, se ensayaron 23 muestras de pacientes mediante CL-EM/EM y el ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur. Las muestras en esta segunda poblacion variaron de 11 a 82 ng/ml.

Resultados

Los datos obtenidos con el ensayo de vitamina D ADVIA Centaur demostraron la deteccion equimolar de 25(OH)D² y 25(OH)D³ y mostraron la trayectoria hasta CL-EM/EM. Se determino que la reactividad cruzada con 25(OH)D² era 105 % a 50 ng/ml. El ensayo demostro un limite de deteccion (LoD) de menos de 3,0 ng/ml, una sensibilidad funcional (20 % de dosis total de CV) de menos de 4 ng/ml y un limite superior de 250 ng/ml. Los CV de ensayos totales fueron 6,4 %, 7,1 %, 4,2 % y 3,7 % para muestras a 22,1, 52,3, 121 y 153 ng/ml, respectivamente. Se ha demostrado la linealidad hasta 240 ng/ml. Se realizo un estudio de correlacion frente a CL-EM/EM con 150 muestras de suero, produciendo una pendiente de 0,96, interseccion de 1,0 y coeficiente de regresion de 0,97.

Precision: El perfil de precision del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur demuestra un CV total entre 8,8 % a 7,65 ng/ml y 2,0 % a 123,36 ng/ml de vitamina D total 25(OH). Se muestra analisis de precision en la Tabla 5.

Tabla 5. Analisis de precision de ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur

Sensibilidad anali'tica: La sensibilidad analitica del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur fue de 2,4 ng/ml. En la Tabla 6 se muestra la sensibilidad analitica.

Tabla 6. Sensibilidad analitica del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur

Limite de blanco, limite de deteccion y sensibilidad funcional: El limite de blanco del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur fue de 2,8 ng/ml, el limite de deteccion fue de 3,8 ng/ml y la sensibilidad funcional fue de 4 ng/ml (Figura 9).

Estudios de interferencia: El ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur demostro <10 % de desviacion a las concentraciones ensayadas para interferentes endogenos. Los resultados de estudios de interferencia endogena se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Resultados de estudios de interferencia para ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur

Reactividad cruzada: El ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur demostro reactividad cruzada muy baja con las formas no hidroxiladas de vitamina D2 y vitamina D3, y con 3-epi-25(OH)D3. Los resultados del analisis de reactividad cruzada se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Reactividad cruzada del ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur

Estudio de tipo tubo: Se realizo una correlacion de tipo tubo de muestras con 119 muestras de donantes recogidas en tipos de tubos de tapon rojo de suero, SST y EDTA. El analisis de regresion entre tapon rojo de suero y SST demuestra un coeficiente de correlacion (R) de 0,999, una pendiente de 1,01 y una interseccion de -0,14 (Figura 10). El analisis de regresion entre tapon rojo de suero y EDTA demuestra un coeficiente de correlacion (R) de 0,997, una pendiente de 1,00 y una interseccion de 0,41 (Figura 11).

Comparacion de metodos: Se realizo una correlacion de muestras con 199 muestras que compara el ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur con un ensayo de Vitamina D Total, con FDA eliminado, disponible en el mercado. El analisis de regresion demostro un coeficiente de correlacion (R) de 0,993, una pendiente de 1,00 y una interseccion de 1,61 (Figura 12). Ademas se ensayaron 23 muestras comparando el ensayo de Vitamina D Total ADVIA Centaur con un ensayo de CLEM/EM de Vitamina D Total disponible en el mercado. El analisis de regresion demostro un coeficiente de correlacion (R) de 0,98, una pendiente de 1,03 y una interseccion de -2,3 (Figura 13).

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, que comprende una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28, en donde el anticuerpo aislado tiene una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 16, y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la ID NO: 32.

2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo se une con 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3.

3. El anticuerpo de la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo se une con 25-hidroxivitamina D2 y 25-hidroxivitamina D3 con afinidad similar.

4. Una celula aislada que expresa el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un polinucleotido aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. El polinucleotido aislado de la reivindicacion 5, en donde el polinucleotido es un ADNc.

7. Un polinucleotido aislado segun la reivindicacion 5, en donde el polinucleotido comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2, que codifica CDR1 de cadena pesada; la secuencia de la SEQ ID NO: 3, que codifica CDR2 de cadena pesada; y la secuencia de la SEQ ID NO: 4, que codifica CDR3 de cadena pesada y la secuencia de la SEQ ID NO: 18, que codifica CDR1 de cadena ligera; la secuencia de la SEQ ID NO: 19, que codifica CDR2 de cadena ligera; y la secuencia de la SEQ ID NO: 20, que codifica CDR3 de cadena ligera.

8. El polinucleotido aislado de la reivindicacion 7, que comprende las SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 24.

9. Una celula de hibridoma que produce un anticuerpo que comprende una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11, una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 12, una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28 en donde el anticuerpo tiene una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 16 y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de la ID NO: 32.