BR112019011131A2 - anticorpo monoclonal, métodos para medir um analito em uma amostra e para produzir um anticorpo, uso de um anticorpo, kit de teste de imunoensaio e imunógeno - Google Patents

Abstract

a presente invenção diz respeito a um anticorpo monoclonal capaz de se ligar à biotina. em um exemplo de realização, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção também não se liga a uma porção biotina em uma molécula biotinilada, em que a porção biotina está ligada à molécula através do átomo de carbono da função carboxila da porção de ácido valérico da biotina. também é divulgado um método para geração de um anticorpo divulgado na presente invenção. o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção é de uso específico em um método para medir um analito em uma amostra, em que um par de (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação analito-específico biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

Description

“ANTICORPO MONOCLONAL, MÉTODOS PARA MEDIR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA E PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, USO DE UM ANTICORPO, KIT DE TESTE DE IMUNOENSAIO E IMUNÓGENO” [0001] A presente invenção diz respeito a um anticorpo monoclonal capaz de se ligar à biotina. Em um exemplo de realização, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção também não se liga a uma porção biotina em uma molécula biotinilada, em que a porção biotina está ligada à molécula através do átomo de carbono da função carboxila da porção de ácido valérico da biotina. Também é divulgado um método para geração de um anticorpo divulgado na presente invenção. O anticorpo monoclonal de acordo com a invenção é de uso específico em um método para medir um analito em uma amostra, em que um par de (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação analito-específico biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

Antecedentes Da Invenção [0002] Em organismos vivos, bem como na bioquímica in vitro, a função principal da biotina é a de um cosubstrato que é necessário como um grupo prostético para enzimas com atividade de carboxitransferase, por exemplo, piruvato carboxilase e acetil-CoA-carboxilase. Em bactérias, a biotina é ligada à proteína transportadora de biotina carboxila pela biotina ligase. Além disso, são conhecidos vários processos químicos com os quais a biotina pode ser covalentemente ligada a um grupo adequado em quase qualquer molécula de interesse. Como característica comum, o átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral de ácido valérico reage em uma reação de acoplamento a um grupo apropriado (receptor) na molécula de interesse, ou a um grupo reativo de um ligante, em que o ligante em si ou está já ligado à molécula de interesse ou o ligante é acoplado à molécula uma vez que a biotina esteja ligada ao ligante. Em geral, tal ligação de biotina a vários sítios

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2/116 químicos através do átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral de ácido valérico é referida como biotinilação.

[0003] A afinidade extraordinária da avidina e/ou estreptavidina (= (estrept)avidina), respectivamente, para a biotina (K_a = 10¹⁵ M’¹) é uma das mais fortes interações não covalentes conhecidas entre uma proteína e um ligante. Isso permite que moléculas biotiniladas em uma mistura complexa sejam especificamente ligadas pela (estrept)avidina. Por esta razão, a avidina e/ou a estreptavidina são utilizadas em um grande número de ensaios de detecção imunológica.

[0004] Além de uma forte afinidade pela (estrept)avidina, duas outras propriedades tornam a biotina particularmente adequada para marcação de proteínas e outras macromoléculas. Em primeiro lugar, a molécula de biotina é substancialmente menor que as proteínas. Seu tamanho molecular permite que uma ou mais moléculas de biotina sejam conjugadas a uma molécula de interesse, minimizando a perda da função biológica de tal molécula. Em segundo lugar, o átomo de carbono terminal da cadeia lateral do ácido valérico da biotina pode ser facilmente derivatizado, facilitando assim a conjugação com porções reativas em uma molécula de interesse, particularmente uma proteína. Notavelmente, a biotinilação não altera a estrutura da porção heterocíclica da biotina.

[0005] Após a biotinilação via átomo de carbono terminal da cadeia lateral do ácido valérico, a porção biotina preserva a capacidade de interagir especificamente com a (estrept)avidina, pois parte da molécula de biotina que é responsável pela interação específica com a bolso de ligação de proteínas tipo avidina é a estrutura heterocíclica representada pelo anel ureído que está fundida com o anel tetrahidrotiofeno não é afetada.

[0006] A estrutura heterocíclica da biotina também é alvo de anticorpos monoclonais (mAbs) da técnica anterior contra biotina. Kohen F. et al.

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3/116 (Methods in Enzymology 279 (1997) 451-463) geraram anticorpos monoclonais utilizando a albumina de soro bovino biotinilada como imunógeno (BSA conjugada com N-hidroxi-succinimidobiotina). O documento descreve a análise de sequências de aminoácidos de regiões de ligação ao antígeno de anticorpos capazes de se ligar à porção biotina de uma proteína biotinilada. Os alinhamentos de sequência foram feitos com trechos homólogos das sequências polipeptídicas de avidina e estreptavidina que foram relatadas como àquelas que interagem com o sistema de anel bicíclico de biotina. Notavelmente, foram identificadas semelhanças com as sequências polipeptídicas de avidina e estreptavidina nas CDR2 e CDR3 de anticorpos específicos para biotina. Os resultados foram interpretados de modo que nas sequências de aminoácidos dos bolsos de ligação à biotina é necessário um padrão comum para a ligação da biotina.

[0007] Dakshinamurti, K et al. (Biochem. J. 237 (1986) 477-482) relatam a geração e caracterização de mAbs murinos usando a hemocianina de molusco (keyhole limpet hemocyanin - KLH) como um imunógeno à qual uma forma ativada de biotina (N-hidroxissuccinimidobiotina) foi acoplada. Foram obtidos vários clones de hibridoma e os respectivos mAbs foram eficazes na ligação da biotina livre, biotina conjugada com hapteno, biotina conjugada com proteína e biocitina. Notavelmente, a biocitina é um derivado natural da biotina, uma amida formada a partir da função carboxílica do ácido valérico e do aminoácido L-lisina. O fato de essa biotina derivatizada ser ligada pelos mAbs de Dakshinamurti, K et al. (supra) indica uma especificidade de ligação que tem como alvo a estrutura heterocíclica da biotina, ou seja, o anel ureído que é fundido ao anel tetrahidrotiofeno.

[0008] Embora os mAbs divulgados por Dakshinamurti, K et al. (supra) não se liguem a biotina conjugada e também a biotina livre, o documento JP 2008-094721 descreve um mAb que se liga especificamente a biotina conjugada com proteína, mas não a biotina livre. A Tabela 1 resume as

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4/116 propriedades discutidas dos anticorpos da técnica anterior.

Tabelai

Propriedades De Ligação De Anticorpos Monoclonais Criados Contra

Biotina

Relato	Ligação ao alvo biotinilado	Ligação a biotina livre
Dakshinamurti, K etal. (Biochem. J. 237 (1986) 477-482)	Sim	Sim
Kohen F. et al. (M. Enzymol. 279 (1997) 451-463)	Sim	Não determinado
JP 2008-094721	Sim	Não
Nenhum relato até o momento	Não	Sim

[0009] Semelhante ao relato de Dakshinamurti, K et al. (supra), o documento WO 00/50088 A2 trata de anticorpos possuindo propriedades comparáveis; especificamente, são relatados anticorpos que têm uma afinidade para a biotina conjugada de uma a quatro ordens de grandeza maior do que a respectiva afinidade pela biotina livre. O documento divulga a imunização com um antigeno ao qual a biotina é conjugada através do átomo de carbono da função carboxila da porção de ácido valérico. Em uma primeira etapa de seleção, são identificados anticorpos que se ligam à biotina conjugada; é descrita uma segunda etapa de seleção subsequente que tem como objetivo a identificação de clones que secretam anticorpos monoclonais capazes de ligar à biotina conjugada mesmo na presença de uma quantidade definida de biotina livre. Notavelmente, o documento é omisso quanto aos anticorpos monoclonais que por um lado se ligam à biotina livre (biotina que não está covalentemente ligada a outra molécula e que está na forma dissociada em solução aquosa), mas que por outro lado não se ligam à porção biotina em uma molécula biotinilada, ou seja, uma porção biotina que também pode ser ligada pela (estrept)avidina. Indyk H.E. et al. International Dairy Journal 35 (2014) 25-31 relatam um ensaio de biossensores óticos para a detecção de biotina livre em leite. Foi usado um biossensor Biacore Q com um chip sensor CM5; em uma superfície do sensor modificada por amina, a biotina foi imobilizada por acoplamento covalente ao carbóxi-terminal do grupo ácido valérico ativado por

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NHS. De maneira notável, a orientação das moléculas de biotina acopladas ao chip sensor foi a mesma que para a biotina em moléculas biotiniladas, ou seja, corresponde a uma porção biotina que também pode ser ligada por (estrept)avidina. Assim, primeiramente, a estrutura heterocíclica da biotina foi exposta para a ligação do anticorpo. As propriedades de ligação de três diferentes anticorpos policlonais e dois anticorpos monoclonais diferentes específicos para biotina foram caracterizadas usando o chip sensor de biotina, na presença de diferentes concentrações de biotina livre como competidor.

[0010] Notavelmente, não foi encontrada nenhuma divulgação na técnica anterior, até agora, que descreva um anticorpo monoclonal que se ligue especificamente à biotina livre, mas não à biotina conjugada em uma molécula alvo biotinilada. Tal anticorpo ligaria a biotina principalmente a partir de sua “cauda”, ou seja, interagiría de maneira importante com a porção de ácido valérico da biotina. Notavelmente, nenhum anticorpo foi descrito, até agora, que por um lado se liga especificamente à biotina livre, mas por outro lado não se liga à biotina conjugada, de modo que a biotina conjugada é ligada à molécula alvo através do átomo de carbono da função carboxila da porção ácido valérico, em que a estrutura heterocíclica da “cabeça” da biotina está localizada distalmente da molécula alvo. Além disso, até agora, nenhum anticorpo monoclonal é conhecido que em solução aquosa seja caracterizado por uma afinidade para a biotina livre K_s[livre] que é mais elevada do que a afinidade do mesmo anticorpo monoclonal para a biotina conjugada K_s[conj.], em que a biotina conjugada é conjugada através do átomo de carbono da função carboxila da porção de ácido valérico (veja acima), e em que a K_s[livre] difere da K_s[conj.] por um fator de pelo menos 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000 ou pelo menos 100.000.

[0011] Johnson L.C. (“The synthesis of new biotin derivatives and their bioactivity’, dissertação de mestrado de dezembro de 2002, submetida à

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Faculdade de Pós-Graduação da Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College (EUA) recuperada da Internet em 16 de fevereiro 2017; URL: http://etd.lsu.edu/docs/available/etd-0927102135929/unrestricted/Johnson_thesis.pdf) descreve as reações químicas de derivatização da estrutura “cabeça” heterocíclica da biotina. São apresentados exemplos de realização em que o átomo 1’-N compreendido na estrutura heterocíclica da biotina é visado por derivatização.

[0012] Wu F.-B. et al. Clinica Chimica Acta 308 (2001) 117-126 divulgam um método para neutralizar a interferência da matriz em um imunoensaio competitivo. Um ajuste inicial de ensaio consistiu de um anticorpo secundário imobilizado ligado a um anticorpo específico para o alvo (tiroxina sérica) foi substituído. A substituição foi proporcionada pela imobilização inicial de albumina de soro bovino (BSA) biotinilada, seguida pela ligação da estreptavidina à BSA biotinilada, seguida pela ligação do anticorpo específico para o alvo à estreptavidina, em que antes desta etapa o anticorpo específico para o alvo foi biotinilado. Verificou-se que tal configuração forneceu maior capacidade de ligação para o alvo do ensaio (tiroxina sérica) e, assim, aumentou a resistência à interferência da matriz.

[0013] A presente invenção provê estruturas químicas de Fórmula I (vide abaixo) que apresentam especificamente a porção “cauda” de ácido valérico de uma biotina derivatizada como a parte distai (mais terminal) da respectiva estrutura. Pela derivatização da biotina e ligação da sua porção “cabeça” ao resto da estrutura de Fórmula I, a porção ácido valérico é principalmente exposta e apresentada para interação física, incluindo a interação com receptores de células imunes e anticorpos. Foi investigado se um anticorpo que interage com a biotina derivatizada de acordo com a Fórmula I teria propriedades de ligação que poderíam ter como alvo a porção “cauda” do ácido valérico. No presente estudo foi testado ainda se os anticorpos

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7/116 monoclonais que podem ser suscitados utilizando uma estrutura de Fórmula I e que são capazes de reagir com essa estrutura também teriam as propriedades de um anticorpo desejado de acordo com a invenção.

[0014] Consequentemente, um anticorpo desejado da invenção é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à biotina, em que a biotina não está covalentemente ligada a outra molécula. Também de acordo com o raciocínio acima, um anticorpo desejado da invenção é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à biotina, em que a biotina está na forma dissociada em solução aquosa. Ao mesmo tempo, um anticorpo desejado da invenção não se liga a biotina conjugada em uma molécula alvo biotinilada, em que a biotina está ligada à molécula alvo através do grupo carbóxi da porção ácido valérico. Nesta molécula alvo biotinilada, a forma conjugada da estrutura “cabeça” da biotina é apresentada e pode ser ligada, por exemplo, por uma (estrept)avidina.

[0015] Assim, os inventores procuraram descobrir se anticorpos poderíam ser produzidos e isolados para se ligarem especificamente à biotina não conjugada (livre). Essa ligação à biotina teria uma base estrutural completamente diferente em comparação com os anticorpos já descritos em relatórios anteriores que se ligam à porção “cabeça” da biotina.

[0016] Assim, um objetivo da presente invenção era o de proporcionar um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao composto de Fórmula I,

COOH (Fórmula I) caracterizado pelo fato de que ele também se liga a biotina, em

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8/116 que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2, X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)_p-O]k-(CH2)m com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)r-CONH]_s-(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5, e R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida, e Z, em que Z é A ou B, em que A é M-L com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante conectando X e M; e em que B é

com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que 0 átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

[0017] Um objetivo adicional da presente invenção foi 0 de proporcionar um anticorpo monoclonal que se liga a uma molécula de Fórmula I e a biotina, mas não se liga à biotina conjugada que está ligada a uma macromolécula pelo átomo de carbono da função carboxila da porção ácido valérico. Como objetivo adicional, 0 anticorpo da presente invenção se liga a biotina compreendendo uma porção de ácido valérico não modificada quimicamente. Foi, portanto, um objetivo isolar um anticorpo monoclonal com uma afinidade para biotina conjugada em uma molécula alvo biotinilada que é

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9/116 menor que a afinidade pela biotina livre por um fator selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais. Em outras palavras, foi um objetivo isolar um anticorpo monoclonal com uma afinidade pela biotina livre que é mais alta que a afinidade pela biotina conjugada em uma molécula alvo biotinilada por um fator selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 50, 100, 500, 1.000, 5.000 e pelo menos 10.000.

[0018] Foi agora descoberto de maneira surpreendente que tal anticorpo monoclonal pode ser gerado e isolado.

[0019] Recentemente, a suplementação de biotina em altas doses tornou-se “moda”. Acredita-se que a biotina seja um dos principais contribuintes para a queratina, e a alta dose de biotina pode, assim, melhorar a qualidade e a quantidade de cabelos, unhas e pele. A biotina é solúvel em água e rapidamente excretada. Entretanto, se a suplementação com biotina em alta dose for realizada, podem estar presentes níveis altos de biotina na circulação e a biotina na circulação também estará presente em uma amostra usada para análise in vitro para medição de um analito, ou seja, em uma amostra como o soro ou plasma. A biotina compreendida em uma amostra, se presente em níveis elevados, pode interferir em um ensaio para a medição de um analito, que emprega uma fase sólida revestida com (estrept)avidina e um agente de ligação específico biotinilado.

[0020] Portanto, com o aumento do uso de suplementos de biotina em altas doses, existe uma crescente necessidade de reduzir uma potencial interferência causada por níveis de biotina anormalmente altos em uma amostra ao se mensurar um analito utilizando ensaios baseados na ligação avidina-biotina.

[0021] Uma tarefa adicional da presente invenção foi investigar se os anticorpos aqui divulgados podem ser utilizados para reduzir a potencial interferência da biotina. Verificou-se surpreendentemente que um anticorpo

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10/116 monoclonal capaz de ligar a biotina, mas não se ligar à porção biotina em uma molécula alvo biotinilada é particularmente útil para neutralizar uma potencial interferência causada por níveis anormalmente elevados de biotina em uma amostra em um método para medir um analito em tal amostra, em que um ensaio baseado na ligação do par (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

Descrição Resumida Da Invenção [0022] É divulgado um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao composto de Fórmula I, ,O

COOH (Fórmula I) caracterizado pelo fato de que ele também se liga a biotina, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2, X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)_p-O]k-(CH2)m com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)r-CONH]_s-(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5, e R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida, e Z, em que Z é A ou B, em que A é M-L com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante conectando X e M; e em que B é

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com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

[0023]É divulgado ainda um método para medir um analito em uma amostra, em que um par de ligação (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação específico para 0 analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, cujo método compreende a adição à amostra de (a) um anticorpo conforme divulgado na presente invenção, (b) um agente de ligação específico para 0 analito biotinilado, (c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, seguido pela medição do analito ligado à fase sólida via (estrept)avidina e ao agente de ligação analito-específico biotinilado.

[0024]É divulgado ainda um método para medir um analito em uma amostra, em que um par de ligação (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação específico para 0 analito biotinilado a um marcador, cujo método compreende a adição à amostra de (a) um anticorpo conforme divulgado na presente invenção, (b) um agente de ligação específico para 0 analito biotinilado, (c) uma (estrept)avidina ligada a um marcador, seguido pela separação do complexo compreendendo 0 analito, 0 agente de ligação específico para 0 analito biotinilado e a estreptavidina marcada, e determinando a quantidade de marcador ligado

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12/116 ao analito.

[0025] É divulgado ainda o uso de um anticorpo conforme divulgado na presente invenção, em um método para medir um analito em uma amostra, em que um par de (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

[0026]É divulgado ainda um kit de teste de imunoensaio que compreende pelo menos (a) um anticorpo divulgado na presente invenção, (b) um agente de ligação específico para o analito biotinilado, e (c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina ou uma (estrept)avidina marcada.

[0027] Adicionalmente, é divulgado um imunógeno de Fórmula I O

(Fórmula I) em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n, com n sendo um número inteiro de 1 a 20; [(CH2)p-O]K-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30; e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t, com sendo r um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5 e com s sendo um número inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é M-L com M sendo um polipeptideo com pelo menos 30 aminoácidos, e é preferencialmente hemocianina de molusco lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin), e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

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com M sendo um polipeptídeo com pelo menos 30 aminoácidos, e é preferencialmente a hemocianina de molusco lapa californiana (KLH); e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está ligado covalentemente a um grupo CH2 adjacente de X.

[0028] É divulgado ainda um método para produzir um anticorpo conforme divulgado na presente invenção, cujo método compreende as etapas de (a) imunizar um animal experimental com um imunógeno como divulgado na presente invenção, induzindo desse modo células B que produzem anticorpos que se ligam ao imunógeno; (b) obtendo um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), quer via tecnologia de hibridoma quer por tecnologia de PCR de células B; (c) selecionando ainda 0 anticorpo da etapa (b) para ligação a biotina, obtendo-se assim anticorpo conforme divulgado na presente invenção.

[0029] É divulgado ainda um método para produzir um anticorpo conforme divulgado na presente invenção, cujo método compreende as etapas de (a) imunizar um animal experimental com um imunógeno divulgado na presente invenção, induzindo desse modo células B produtoras de anticorpos que se ligam ao imunógeno; (b) obtendo um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), quer via tecnologia de hibridoma quer por tecnologia de PCR de células B; (c) selecionando 0 anticorpo da etapa (b) para ligação a biotina; e (d) selecionando aqueles anticorpos que não se ligam ao composto de Fórmula II,

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(Fórmula II) obtendo assim um anticorpo conforme divulgado na presente invenção.

Descrição Detalhada Da Invenção [0030] Em um exemplo de realização, a presente invenção referese a um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao composto de Fórmula I,

caracterizado por também se ligar à biotina, em que

Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2,

X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n sendo n um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)p-O]k-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5, e;

R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida, e Z, em que Z é A ou B;

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15/116 em que A é M-L, sendo M selecionado a partir de (i) um hapteno que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante que liga X e M, e em que B é;

com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

[0031] Surpreendentemente verificou-se que um anticorpo monoclonal que se liga tanto a estrutura de Fórmula I (que é descrita mais detalhadamente abaixo) quanto a biotina pode ser gerado de forma fiável com base nos materiais e métodos divulgado na presente invenção que também são ilustrados de maneira mais detalhada abaixo.

[0032] Para os propósitos da presente divulgação, em todos os aspectos e exemplos de realização aqui mencionados, os termos “(estrept)avidina” e “proteína do tipo avidina” podem ser utilizados de maneira indistinta. Uma proteína do tipo avidina é geralmente entendida como uma proteína com pelo menos um bolso de ligação capaz de se ligar especificamente à estrutura heterocíclica da biotina que é representada pelo anel ureído que é fundido com o anel tetrahidrotiofeno. Em virtude desta propriedade, uma proteína do tipo avidina é capaz de se ligar a uma molécula alvo biotinilada, na qual a biotina está covalentemente ligada à molécula

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16/116 através do átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral do ácido valérico da biotina. Diversos exemplos de realização de proteínas do tipo avidina são conhecidos no estado da técnica. Mais especificamente, uma proteína do tipo avidina pode ser selecionada a partir do grupo que inclui a avidina, neutravidina, estreptavidina, bradavidina, traptavidina, uma forma variante de ligação à biotina, uma mistura das mesmas, um monômero, dímero, trímero, tetrâmero ou multímero destas, uma forma conjugada e um anticorpo que se liga a uma molécula convencionalmente biotinilada de interesse. Sabese que nas suas formas de ocorrência natural, várias proteínas do tipo avidina (especialmente àquelas que não são anticorpos), especificamente avidina e estreptavidina, são homotetrâmeros; ou seja, consistem em quatro subunidades idênticas. Em um exemplo de realização de uma variante de uma proteína do tipo avidina monomérica, a forma que ocorre naturalmente pode ser um di- tri- ou tetraoligômero com cada monômero possuindo um bolso de ligação de biotina. Em um exemplo de realização, a proteína do tipo avidina é selecionada a partir de um monômero, um homodímero, um homotrímero e um homotetrâmero.

[0033] De modo mais específico, uma proteína do tipo avidina pode ser um anticorpo com um bolso de ligação ao antigeno capaz de se ligar especificamente à estrutura heterocíclica da biotina que é representada pelo anel ureído que é fundido com o anel tetrahidrotiofeno. Exemplos de anticorpos com esta propriedade são conhecidos na técnica anterior e citados acima. Em um exemplo de realização ainda mais específico, uma proteína do tipo avidina pode ser identificada por se ligar especificamente à porção biotina da estrutura na Figura 3A. Em um exemplo de realização ainda mais específico, a proteína do tipo avidina não se liga especificamente à estrutura na Figura 2 K. Em um exemplo de realização ainda mais específico, a proteína do tipo avidina não se liga especificamente à estrutura na Figura 2L. Em um exemplo de realização

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17/116 ainda mais específico, a proteína do tipo avidina não se liga especificamente à estrutura na Figura 3B.

[0034] Em um exemplo de realização, a (estrept)avidina de acordo com a presente divulgação é selecionada a partir do grupo que inclui avidina, neutravidina, estreptavidina, bradavidina, traptavidina, uma variante de ligação a biotina das mesmas e uma mistura das mesmas.

[0035] Ao se referir a “(estrept)avidina” ou uma proteína do tipo avidina na presente divulgação, entende-se que estes termos incorporam igualmente qualquer variante com a condição de a variante seja capaz de se ligar a biotina de maneira não covalente com pelo menos um bolso de ligação capaz de se ligar especificamente à estrutura heterocíclica da biotina que é representada pelo anel ureído que é fundido ao anel tetrahidrotiofeno. A este respeito, uma variante é um “polipeptídeo funcionalmente equivalente” em que os aminoácidos que formam o pelo menos um bolso de ligação apresentam atributos eletrostáticos e esteroquímicos semelhantes à sequência de aminoácidos da proteína do tipo avidina original em questão, em que a forma variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras, substituições de aminoácidos análogos e/ou deleções e/ou adições de aminoácidos que não afetam ou alteram de maneira significativa a função dos aminoácidos do bolso de ligação. “Funcionalmente equivalente” também inclui uma sequência de aminoácidos homóloga em relação à respectiva sequência de aminoácidos referenciada.

[0036] A expressão “substituições conservadoras” aplica-se tanto às sequências de aminoácidos como às sequências de ácidos nucleicos. No que diz respeito a sequências particulares de ácidos nucleicos “conservadoramente substituídos” refere-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou quando o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências

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18/116 são essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para quaisquer códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de 5 ácidos nucleicos são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservadoramente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos na presente invenção que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um técnico hábil no assunto reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para render uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variante silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[0037] Quanto às sequências de aminoácidos, um especialista reconhecerá que as substituições individuais em um peptídeo, polipeptídeo ou sequência proteica que alteram um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência de aminoácidos é uma “substituição conservadora”, onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservadora que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas pelos especialistas no assunto. As tabelas de substituição conservadora que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas pelos especialistas no assunto. Cada um dos oito grupos a seguir contém aminoácidos que são substituições conservadoras entre si:

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19/116 [0038] 0 termo “substituições conservadoras de aminoácidos” refere-se a todas as substituições nas quais o aminoácido substituído possui propriedades estruturais ou químicas semelhantes ao do aminoácido correspondente na sequência de referência. Como exemplo, as substituições de aminoácidos conservadoras envolvem a substituição de um aminoácido alifático ou hidrofóbico, por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina ou triptofano por outro; a substituição de um aminoácido contendo hidroxila, por exemplo, serina e treonina, por outro; a substituição de um resíduo ácido, por exemplo, ácido glutâmico ou ácido aspártico, por outro; a substituição de um resíduo contendo amida, por exemplo, asparagina e glutamina, por outro; a substituição de um resíduo aromático, por exemplo, fenilalanina e tirosina, por outro; a substituição de um resíduo básico, por exemplo, lisina, arginina e histidina, por outro; e a substituição de um aminoácido pequeno, por exemplo, alanina, serina, treonina e glicina, por outro.

[0039] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “deleções” e “adições”, em referência à sequência de aminoácidos, indicam a eliminação ou a adição de um ou mais aminoácidos à extremidade aminoterminal, carbóxi-terminal, ao interior da sequência de aminoácidos ou uma combinação destes, por exemplo, a adição pode estar em um dos anticorpos sujeitos do presente pedido.

[0040] Conforme utilizado na presente invenção, “sequências homólogas” têm sequências de aminoácidos que são pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% homólogas às sequências de referência correspondentes. As sequências que são pelo menos 90% idênticas não têm mais do que 1 alteração, ou seja, qualquer combinação de deleções, adições ou substituições, por 10 aminoácidos da sequência de referência. A percentagem de homologia é determinada comparando a sequência de aminoácidos variante com a

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20/116 sequência de referência utilizando, por exemplo, o projeto MEGALIGN™ no programa DNASTAR™.

[0041] Os termos “idêntico” ou percentual de “identidade”, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. As sequências são substancialmente idênticas se elas tiverem uma porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (ou seja, possuindo cerca de 60% de identidade, cerca de 65% de identidade, cerca de 70% de identidade, cerca de 75% de identidade, cerca de 80% de identidade, cerca de 85% de identidade, cerca de 90% de identidade ou cerca de 95% de identidade sobre uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada medida usando um dos algoritmos de comparação da sequência, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição também se refere ao complemento de uma sequência teste. A identidade pode existir sobre uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou sobre uma região que tem 75-100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente divulgação, incluindo homólogos de espécies diferentes da humana, pode ser obtido por um processo que compreende as etapas de seleção de uma biblioteca sob condições de hibridização estringente com uma sonda marcada possuindo uma sequência polinucleotídica da presente divulgação ou um fragmento da mesma, e isolamento do cDNA de comprimento total e clones gênicos contendo a referida sequência polinucleotídica. Tais técnicas de hibridização são bem conhecidas pelos especialistas no assunto.

[0042] Para comparação de sequências, tipicamente uma

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21/116 sequência atua como uma sequência de referência com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando um algoritmo de comparação de sequência é utilizado, as sequências de teste e de referência são colocadas como entrada no computador, coordenadas subsequentes são designadas e, se necessário, os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros de programa pré-carregados (default) podem ser utilizados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então o percentual de identidade de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[0043] Para o propósito da presente divulgação, entende-se que os termos “biotina” ou “biotina livre” são usados de forma alternada e indicam o composto que ocorre naturalmente, ou seja, D(+)-biotina.

[0044] A biotina (D(+)-biotina; C10H16N2O3S; Mw = 244,31 g/mol; nome IUPAC: ácido 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahidrotieno[3,4d]imidazol-4-il]pentanóico), número CAS 58-85-5, compreende um anel ureído fundido com um anel tetrahidrotiofeno e um substituinte ácido valérico que está ligado a um dos átomos de carbono do anel tetrahidrotiofeno. A estrutura básica da biotina é, há muito tempo, conhecida e foi relatada, por exemplo, por Melville D.B. et al. (J. Biol. Chem. 146 (1942) 487-492). A biotina tem três átomos de carbono quirais contíguos e, portanto, quatro formas racêmicas diastereoméricas são possíveis. Das formas racêmicas diastereoméricas, somente a D(+)- biotina ocorre na natureza, enquanto os outros isômeros são de origem sintética. A forma biologicamente ativa é a configuração (3aS,4S,6aR) mostrada na Figura 1A e na Figura 1B.

[0045] Segundo Marquet A. (Pure & Appl. Chem. 49 (1977) 183196), na estrutura cristalina da D(+)-biotina, 0 anel ureído é plano, enquanto 0 anel tiofano tem uma conformação de envelope, conforme mostrado na Figura

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1B. A cadeia lateral do ácido valérico não está totalmente estendida, mas sim torcida, e há interação entre o átomo Ce da cadeia lateral e o átomo N’3 do anel ureído; alegadamente esta interação tem um impacto na reatividade da biotina. A conformação de envelope do anel tiofano também foi descrita em solução, conforme mostrado por estudos utilizando a RMN divulgados por Glasel J.A. (Biochemistry 5 (1966) 1851-1855) e Lett R. & Marquet A. /Tetrahedron 30 (1974) 3365-3377).

[0046] O termo “porção biotina” é usado para se referir à parte relacionada à biotina ou parte derivada da biotina de uma molécula como, por exemplo, uma molécula obtida por qualquer tipo de biotinilação ou acoplamento químico.

[0047] A ligação da biotina a um grupo químico apropriado em uma molécula de interesse através do átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral do ácido valérico é referida como “biotinilação” ou “biotinilação convencional”. Consequentemente, 0 resíduo de biotina de uma molécula “biotinilada” de interesse tem uma estrutura de anel voltada para fora (ou seja, 0 anel ureído que é fundido com um anel tetrahidrotiofeno), enquanto a porção linear do resíduo de biotina está voltada para dentro, em direção à superfície da molécula biotinilada. A estrutura do anel voltada para fora pode ser ligada por uma proteína do tipo avidina. Assim, é importante que a estrutura “cabeça” heterocíclica da biotina precise ser exposta para ligação específica por uma proteína do tipo avidina.

[0048] O termo “par de ligação (estrept)avidina/biotina” é perfeitamente conhecido pelo homem da técnica. O termo aponta para 0 fato de que a biotina (incluindo a porção biotina de uma molécula biotinilada) por um lado e a (estrept)avidina, por outro lado, representam os dois membros deste par de ligação. Conforme descrito acima, este par de ligação é excelente por ter uma das maiores afinidades de ligação conhecidas para interações não covalentes.

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23/116 [0049] Os artigos “um/uma” são utilizados na presente invenção para se referirem a um ou a mais de um (ou seja, pelo menos um) objeto gramatical do artigo. Por exemplo, “um anticorpo” significa um anticorpo ou mais do que um anticorpo.

[0050] O termo “anticorpo” abrange as diferentes formas de estruturas de anticorpos incluindo, mas não se limitando a, anticorpos e fragmentos de anticorpos inteiros. O anticorpo de acordo com a invenção é preferencialmente um anticorpo de cabra, ovelha, camundongo, coelho ou rato, ou um anticorpo quimérico, ou ainda um anticorpo geneticamente modificado contanto que as propriedades características de acordo com a invenção sejam mantidas.

[0051] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total (inteiro), de preferência os domínios variáveis deste, ou pelo menos o sítio de ligação ao antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem diacorpos (diabodies), moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Anticorpos scFv estão descritos, por exemplo, em Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Além disso, os fragmentos de anticorpos compreendem polipeptídeos de cadeia única possuindo as características de um domínio Vh, ou seja, são capazes de montar juntamente com um domínio Vi_, ou de um domínio de ligação Vl para IGF-1, ou seja, são capazes de montar juntamente com um domínio Vh, um sítio de ligação ao antígeno funcional, proporcionando desse modo as propriedades de um anticorpo de acordo com a invenção.

[0052] Os termos “anticorpo monoclonal” ou “composição de anticorpo monoclonal”, usados na presente invenção referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma composição de aminoácido única.

[0053] O termo “agente de ligação específico” é usado para indicar

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24/116 que um agente é usado, o qual é capaz de se ligar especificamente ou ser especificamente ligado por um analito de interesse. Muitas configurações de ensaio diferentes para imunoensaios são conhecidas no estado da técnica. Dependendo da configuração específica do ensaio, diversos agentes de ligação específica biotinilados podem ser utilizados. Em um exemplo de realização, o agente de ligação específico biotinilado é selecionado a partir do grupo que consiste em um agente de ligação específico para o analito biotinilado, um analito biotinilado ligado à fase sólida e um antígeno biotinilado ligado a fase sólida.

[0054] O termo “agente de ligação específico para o analito”, ou ainda, “agente de ligação analito-específico” refere-se a uma molécula que se liga especificamente ao analito de interesse. Um agente de ligação específico para o analito no sentido da presente divulgação compreende tipicamente moléculas de ligação ou captura capazes de se ligar a um analito (e outros termos como analito de interesse; molécula alvo, etc). Em um exemplo de realização, o agente de ligação específico para o analito tem uma afinidade de pelo menos 10⁷ L/mol para a sua molécula alvo correspondente, isto é, o analito. O agente de ligação específico para o analito em outros formas de realização tem uma afinidade de 10⁸ L/mol ou mesmo de 10⁹ L/mol para a sua molécula alvo. Tal como o técnico hábil reconhecerá, o termo específico é utilizado para indicar que outras biomoléculas presentes na amostra não se ligam significativamente ao agente de ligação específico para o analito. Em alguns exemplos de realização, o nível de ligação a uma biomolécula diferente da molécula alvo resulta em uma afinidade de ligação que é apenas 10%, mais preferivelmente apenas 5% da afinidade para a molécula alvo ou menos. Em um exemplo de realização, nenhuma afinidade de ligação para outras moléculas além do analito é mensurável. Em um exemplo de realização, o agente de ligação específico para o analito cumpre ambos os critérios mínimos

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25/116 acima tanto para a afinidade como para a especificidade.

[0055] O termo “ligação específica para o analito”, conforme utilizado no contexto de um anticorpo, refere-se à interação imunoespecífica do anticorpo com seu epítopo alvo sobre o analito, isto é, a ligação do anticorpo ao epítopo no analito. O conceito de ligação analito-específica de um anticorpo pelo seu epítopo em um analito é totalmente claro para o especialista na técnica.

[0056] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” referemse a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural, bem como a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são de aminoácidos não codificados naturalmente. Conforme utilizado na presente invenção, os termos abrangem cadeias de aminoácidos, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. Os polipeptídeos, peptídeos e proteínas são escritos usando anotação de sequência padrão, com o nitrogênio terminal estando à esquerda e o carobóxi terminal à direita. As anotações padrão de uma letra têm sido utilizadas da seguinte forma: A - alanina, C - cisteína, D - ácido aspártico, E - ácido glutâmico, F - fenilalanina, G - glicina, H - histidina, S - isoleucina, K - lisina, L - Leucina, M - metionina, N - asparagina, P - prolina, Q - glutamina, R arginina, S - serina, T - treonina, V - valina, W - triptofano, Y - tirosina. O termo “peptídeo”, conforme utilizado no presente, refere-se a um polímero de aminoácidos que tem um comprimento de até cinco aminoácidos. O termo “polipeptídeo”, conforme utilizado no presente, refere-se a um polímero de aminoácidos que tem um comprimento de até seis ou mais aminoácidos. O termo “proteína” significa uma cadeia polipeptídica ou uma cadeia polipeptídica com modificações adicionais, tais como glicosilação, fosforilação, acetilação ou outras modificações pós-traducionais.

[0057] “Haptenos” são pequenas moléculas (por exemplo,

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26/116 pesticidas, fungicidas, fármacos, hormônios, toxinas, peptídeos sintéticos, etc.) que não induzem diretamente uma resposta imune, tal como a formação de anticorpos. Foram estabelecidas técnicas para criar anticorpos contra haptenos pela conjugação destes com veículos imunogênicos, tais como macromoléculas antigênicas. Para o objetivo da presente divulgação, um hapteno é entendido como uma molécula de baixo peso molecular, possuindo especificamente um peso molecular de 10.000 Da ou menos, que não suscita uma resposta imune a menos que conjugada com um veículo imunogênico, tal como uma proteína. Uma vez formado o anticorpo, ele pode se ligar ao hapteno. Os anticorpos assim gerados são úteis em muitos campos, especificamente no desenvolvimento de kits de imunodiagnóstico ou biossensores. Assim, o termo “hapteno” denota uma pequena molécula de 10.000 Da ou menos que pode desencadear uma resposta imune apenas quando ligada a um veículo imunogênico, tal como um polipeptídeo com pelo menos 30 aminoácidos. Neste sentido, em um exemplo de realização, um hapteno é um antígeno incompleto que não pode, por si só, promover a formação de anticorpos, mas que pode fazê-lo quando conjugado com uma proteína de pelo menos 30 aminoácidos. Haptenos exemplares são anilina, ácidos o-, m- e p-aminobenzóico, quinona, histamina-succinil-glicina (HSG), hidralazina, halotano, índio-DTPA, fluoresceína, digoxigenina, teofilina, bromodeoxiuridina, compostos esteroides e dinitrofenol. Em um exemplo de realização específico, o hapteno não é biotina e não contém uma porção biotina. Em um exemplo de realização específico, o hapteno é digoxigenina ou teofilina ou fluoresceína ou bromodesoxiuridina. Um hapteno no contexto da presente divulgação do composto de acordo com a Fórmula I, um hapteno como uma porção do composto é entendido como um que está covalentemente acoplada à porção restante do composto, em que a porção hapteno (ou seja, a estrutura química de 10.000 Da ou menos) é capaz de desencadear uma

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27/116 resposta imune apenas quando ligado a um veículo imunogênico, tal como um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos.

[0058] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderíam interferir no uso diagnóstico, terapêutico ou pesquisa para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em alguns exemplos de realização, um anticorpo é purificado em mais de 95% em peso de anticorpo e, em alguns exemplos de realização, mais de 99% tal como determinado por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando, por exemplo, azul de Coomassie ou corante de prata.

[0059] Os anticorpos do tipo imunoglobulina G são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (Vh), seguido por um número de domínios constante. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido específicos formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada.

[0060] A “região variável” ou “domínio variável” de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo.

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28/116 domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como “VH”. O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como “VL”. Estes domínios são geralmente as porções mais variáveis de um anticorpo e contém os sítios de ligação ao antígeno.

[0061] O termo “variável” refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem amplamente na sequência entre os anticorpos e são utilizados na especificidade de ligação de cada anticorpo específico para o seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos denominados de regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais ou regiões de arcabouço (frameworks) (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem 4 regiões FR cada, adotando em grande parte uma configuração de folha beta, conectadas por três HVRs, que formam alças (loops) que se conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha beta. As HVRs de cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.

[0062] As “cadeias leves” de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

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29/116 [0063] Os anticorpos utilizados em um método de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer origem animal. Em um exemplo de realização, os anticorpos são anticorpos humanos, murinos (por exemplo, de camundongo e rato), de burro, macaco, coelho, cabra, cobaia, camelo, cavalo ou galinha.

[0064] Dependendo das sequências de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, IgGz, IgGa, lgG4, IgAi e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados de α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas de maneira geral, por exemplo, em Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4^s Ed. (W. B. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma molécula de fusão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo com uma ou mais proteínas ou peptídeos diferentes.

[0065] As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são aqui utilizadas de forma alternada para se referirem a um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, e não como fragmentos de anticorpos conforme descrito abaixo. As expressões se referem particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que possui uma região Fc.

[0066] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma porção de um anticorpo intacto, compreendendo preferivelmente a região de ligação ao antigeno deste. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab’, F(ab’)2 e fragmentos Fv; moléculas de anticorpo de cadeia única; scFv, sc(Fv)2;

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30/116 diacorpos (diabodies) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0067] A digestão de anticorpos pela papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, denominados fragmentos “Fab”, cada qual com um único sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com a pepsina gera um fragmento F(ab’)2 que contém dois sítios de ligação a antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.

[0068] O fragmento Fab contém o domínio constante de cadeia leve e pesado e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CHi de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH é a designação da presente invenção para Fab’ no qual o(s) resíduo(s) de cisteína do domínio constante sustenta(m) um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab’ que possuem pontes de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos.

[0069] “Fv” é o menor fragmento de anticorpo que contém um sítio de ligação ao antígeno completo. Em uma realização, uma cadeia de duas espécies de Fv consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e em um de cadeia leve em estreita associação não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um peptídeo ligante flexível de tal forma que a cadeias leves e pesadas possam se associar em uma estrutura “dimérica” análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias (sc(Fv)2). É nesta configuração que as três HVRs de cada

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31/116 domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem a especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três HVRs específicos para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer e ligar ao antígeno, embora em menor afinidade do que o site de ligação inteiro.

[0070] A presente divulgação inclui fragmentos Fab monovalentes e Fv de cadeia simples que são derivados de anticorpos monoclonais capazes de se ligarem especificamente a biotina livre tal como divulgado na presente invenção. Em comparação com formas de anticorpos que ocorrem naturalmente, as espécies monovalentes podem difundir-se mais rapidamente em solução aquosa, devido ao seu menor peso molecular. Outro aspecto é que sob condições adequadas, anticorpos scFv podem ser particularmente produzidos de forma recombinante em sistemas de expressão procarióticos.

[0071] O termo “diacorpos” (ou o termo em inglês diabodies) refere-se a fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, de modo que tais fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Por meio do uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia, e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Os diacorpos (diabodies) podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos (diabodies) são descritos em mais detalhes, por exemplo, na Patente EP 404097; Publicação WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Holliger etal., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Os triacorpos (triabodies) e tetracorpos (tetrabodies) também estão descritos em Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003).

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32/116 [0072] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme utilizado no presente refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que podem estar presentes em quantidades menores. Assim, o adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como não sendo obtido a partir de uma mistura de anticorpos distintos. Em certos exemplos de realização, tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeo que liga um alvo, em que a sequência de polipeptídeo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência peptídica de ligação alvo a partir de uma diversidade de sequências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone a partir de uma série de clones, tal como um conjunto (pool) de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve-se compreender que a sequência de ligação ao alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para aprimorar a afinidade ao alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para aprimorar sua produção na cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico e etc., e que um anticorpo que compreendendo a sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal desta invenção. Ao contrário das preparações com anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações com anticorpo monoclonal são vantajosas por serem tipicamente livre de contaminação por outras imunoglobulinas.

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33/116 [0073] O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma necessidade de se produzir o anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma série de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Haemmerling et al., in: Monoclonal Antibodies e T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, Patente US 4.816.567), tecnologias de exibição por fago (vide Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks etal., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu etal., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee etal., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou similares a de humanos em animais que possuem partes ou todos os locus ou genes de imunoglobulina humana que codificam as sequências de imunoglobulina humana (vide, documentos WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits etal., Nature362: 255-258 (1993); Bruggemann etal., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patente US 5.545.807; Patente US 5.545.806; Patente US 5.569.825; Patente US 5.625.126; Patente US 5.633.425; Patente US 5.661.016; Marks et al.,Bio.Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

[0074] Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem

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34/116 especificamente anticorpos “quiméricos” nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica com, ou homóloga a, sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie especifica, ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da cadeia é idêntico com, ou homóloga as, sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies, ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (por exemplo, Patente US 4.816.567 e Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos PPIMATIZED⁹ onde a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por, por exemplo, macacos imunizados com o antígeno de interesse.

[0075] O termo “região hipervariável”, “HVR”, ou “HV”, quando utilizado no presente refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; sendo três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade dentre as seis HVRs e acredita-se que a H3 em particular, desempenha um papel único na conferência da especificidade fina aos anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000);. Johnson e Wu, em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed, Human Press, Totowa, NJ, 2003). De fato, anticorpos camelídeos de ocorrência natural consistindo apenas de uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência da cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers Casterman et al, Nature 363:446-448 (1993) e Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0076] Diversos delineamentos da HVR são utilizados e englobados no presente documento. As HVRs que são regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de Kabat são baseadas na variabilidade das

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35/116 sequências e são as mais comumente usadas (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991). Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs do AbM representam um acordo entre as CDRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa “Oxford Molecular AbM antibody modeling software. O “contato” das HVRs é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino disponíveis. Os resíduos de cada uma destas HVRs são descritos a seguir

Alça	Kabat	AbM	Chothia	Contato
L1	L24-L34	L24-L34	L26-L32	L30-L36
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L52	L46-L55
L3	L89-L97	L89-L97	L91-L96	L89-L96
H1	H31-H35B	H26-H35B	H26-H32	H30-H35B
			(Numeração de Kabat)
H1	H31-H35	H26-H35	H26-H32	H30-H35
			(Numeração de Chothia)
H2	H50-H65	H50-H58	H53-H55	H47-H58
H3	H95-H102	H95-H102	H96-H101	H93-H101
[0077] As HVRs	podem compreender “	HVRs estendidas” da

seguinte forma: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et ai, supra para cada uma dessas definições de HVRs estendidas.

[0078] As expressões “numeração do resíduo de domínio variável como em Kabat” ou “numeração da posição do aminoácido como em Kabat” e variações destas referem-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da

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36/116 compilação de anticorpos em Kabat et al. supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos, o que corresponde a redução ou inserção em uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único aminoácido inserido (resíduo 52A, de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c, etc., de acordo com Kabat), após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.

[0079] O termo “animal experimental” denota um animal não humano. Em um exemplo de realização, o animal experimental é selecionado a partir de rato, camundongo, hamster, coelho, camelo, lhama, primatas não humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, tubarões e répteis. Em um exemplo de realização, o animal experimental é um coelho.

[0080] A presente divulgação baseia-se na biotina que é derivatizada em uma posição em sua estrutura em anel. Devido ao substituinte no átomo C5, uma molécula de acordo com a Fórmula I conforme divulgado na presente invenção, é incompatível com um bolso de ligação da (estrept)avidina, pois a interação justa essencial com a estrutura heterocíclica da biotina é estericamente impedida. Assim, hipotetiza-se que esta estrutura também previna a formação de anticorpos que se liguem a uma molécula convencionalmente biotinilada de interesse, uma vez que um composto de acordo com a Fórmula I é usado como um imunógeno. A estrutura da biotina derivatizada divulgada na presente invenção ainda preserva o aspecto “cauda” da biotina e, por isso, foi hipotetizado que compreendida em um imunógeno a diaminobiotina derivatizada pode ser adequada para gerar anticorpos monoclonais desejados contra biotina.

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37/116 [0081] De fato, em um exemplo de realização, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção não se liga a uma molécula biotinilada convencional, isto é, uma molécula conjugada com biotina, na qual o átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral do ácido valérico da porção biotina está covalentemente acoplado à molécula. Em um exemplo de realização específico o anticorpo de acordo com a invenção não se liga a um composto de Fórmula II, tal como representado na Figura 3A.

[0082] Pelo contrário, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção se liga a um composto de Fórmula I, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2, X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)_n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)_P-O]k(CH2)m com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3 e com k sendo 2 ou 30, e [(CH2)t-CONH]s-(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida e Z, e em que Z compreende um hapteno.

[0083] Em um exemplo de realização específico, 0 anticorpo monoclonal de acordo com a invenção se liga a um composto do grupo de compostos selecionados a partir da Fórmula III A (= composto [29]), representado na Figura 2 K e Fórmula III B (= composto [30]), representado na Figura 2 L.

[0084] Surpreendentemente, os anticorpos monoclonais de acordo com a invenção também se ligam a um composto de Fórmula III C, representado na Figura 3 B. Como característica chave da presente invenção, o átomo ΝΊ da porção heterocíclica da biotina é modificado e carrega 0 substituinte. Assim, há uma reatividade cruzada destes anticorpos monoclonais, em que um anticorpo desse grupo é capaz de se ligar especificamente (i) à biotina que é substituída no átomo ΝΊ do anel ureído, e à

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38/116 biotina que é substituída no átomo C5 do anel tiofeno que é adjacente ao átomo de enxofre (vide a Figura 1 A).

[0085] Em um exemplo de realização mais específico, a afinidade de ligação do anticorpo monoclonal para o composto do grupo de compostos selecionados a partir da Fórmula III A (= composto [29]), representado na Figura 2 K, Fórmula III B (= composto [30]), representado na Figura 2 L, e a Fórmula III C, representado na Figura 3 B, é maior por um fator de pelo menos 50 do que a afinidade de ligação para o composto de Fórmula II. Ainda em outro exemplo de realização mais específico, a afinidade de ligação do anticorpo monoclonal para o composto de Fórmula III é maior por um fator de pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, pelo menos 50.000 e pelo menos 100.000 do que a afinidade de ligação para o composto de Fórmula II.

[0086] Assim, em outro exemplo de realização específico de todos os aspectos aqui revelados, a afinidade do anticorpo monoclonal para biotina conjugada em uma molécula alvo biotinilada, incluindo, mas não se limitando ao composto exemplificativo de Fórmula II, é inferior a afinidade pela biotina livre por um fator que é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 50, 100, 500, 1.000, 5.000 e pelo menos 10.000. Em outras palavras, o anticorpo monoclonal da presente invenção tem uma afinidade para a biotina não conjugada (livre) que é mais alta do que a afinidade para a biotina conjugada em uma molécula alvo biotinilada por um fator selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 50, 100, 500, 1.000, 5.000 e pelo menos 10.000.

[0087] Diversos métodos e sistemas foram desenvolvidos para a detecção e quantificação de analitos de interesse em amostras bioquímicas e biológicas. Os métodos e sistemas que são capazes de medir quantidades vestigiais de microrganismos, fármacos, hormônios, vírus, anticorpos, ácidos

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39/116 nucleicos e outras proteínas são de grande valor para pesquisadores e clínicos.

[0088] Muitos métodos de ensaio fazem uso de um agente de ligação específico para o analito para capturar uma molécula alvo específica de interesse a partir de uma amostra, e tais métodos permitem a determinação da molécula alvo. Em outros ensaios, um analito de interesse pode ser detectado pela ligação competitiva de um analito ligado em fase sólida e o analito na amostra com um agente de ligação específico para o analito marcado de forma detectável. Em ensaios sorológicos, um anticorpo para um antígeno, por exemplo, um agente infeccioso, é detectado de maneira direta ou em um ensaio denominado ensaio sanduíche com duplo antígeno.

[0089] Normalmente, a existência de um analito de interesse é indicada pela presença ou ausência de um “marcador” ou “rótulo” observável ligado a um ou mais dos agentes de ligação específicos para o analito.

[0090] A grande maioria dos imunoensaios atuais, de uma forma ou de outra, emprega uma fase sólida. Normalmente, pelo menos um dos agentes de ligação específicos utilizados no ensaio se liga direta ou indiretamente à fase sólida. O par de ligação (estrept)avidina-biotina é caracterizado por uma afinidade de ligação extremamente elevada. Por esta razão, o par de ligação (estrept)avidina-biotina é largamente utilizado para ligação indireta de quaisquer agentes de ligação específicos biotinilados apropriados para uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

[0091] Um “ensaio sanduíche” é um tipo de ensaio que está entre os ensaios mais úteis e comumente utilizados. Existem diversas variações da técnica do ensaio tipo sanduíche, e pretende-se que todas elas sejam abrangidas pela presente invenção. Resumidamente, em um ensaio direto típico, um anticorpo não marcado é imobilizado em uma “fase sólida”, e a amostra a ser testada em colocada em contato com a molécula ligada. A imobilização deste anticorpo de captura pode ser por adsorção direta ou

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40/116 indireta a uma fase sólida, por exemplo, através de um par de ligação específica, por exemplo, pela utilização do par de ligação (estrept)avidinabiotina. Depois de um período adequado de incubação, por um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo antígeno-anticorpo, um segundo anticorpo específico para o antígeno, marcado com uma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável é adicionada e incubada, dando tempo suficiente para a formação de outro complexo anticorpo-antígenoanticorpo marcado. Qualquer material que não reagiu é lavado, e a presença do analito é determinada pela observação de um sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser tanto qualitativos pela simples observação do sinal visível, como podem ser quantitativos pela comparação com uma amostra de controle contendo quantidades conhecidas de analito.

[0092] Para o objetivo da presente invenção, em um ensaio tipo sanduíche típico, um primeiro agente de ligação específico para o analito que é biotinilado, por exemplo, um anticorpo biotinilado, se liga de maneira não covalente a uma fase sólida, que é revestida com (estrept)avidina. A fase sólida é geralmente de vidro ou um polímero, sendo os polímeros mais utilizados a celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinila, ou polipropileno. A fase sólida pode estar na forma de tubos, pérolas, discos de microplacas, ou qualquer outra superfície adequada para a realização de um imunoensaio. Os processos de revestimento são bem conhecidos no estado da técnica e consistem geralmente em reticulação, ligação covalente ou adsorção física. A fase sólida revestida com (estrept)avidina normalmente é tratada para bloquear a ligação não específica e lavada em preparação para esta no procedimento de teste. Uma alíquota da amostra a ser testada é colocada em contato com o anticorpo primário ou anticorpo de captura e um anticorpo secundário marcado, e é incubada por um período de tempo suficiente (por exemplo, 2-40 minutos ou durante a noite se for mais conveniente) e sob condições adequadas (por exemplo, a partir da temperatura

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41/116 ambiente (ta) até 40 ^SC, tal como entre 25^SC e 32^SC, inclusive) para permitir a ligação entre o anticorpo primário ou de captura e o antigeno correspondente, e o antigeno com o anticorpo secundário que se liga a outro epítopo no antigeno, formando um complexo sanduíche. Subsequentemente, a fase sólida revestida com (estrept)avidina é adicionada e incubada por um período de tempo suficiente (por exemplo, 2-40 minutos, ou durante a noite se mais conveniente) e em condições adequadas (por exemplo, a partir da temperatura ambiente até 40 ^SC inclusive, por exemplo, entre 25 ^SC e 32 ^SC inclusive) para permitir a ligação do anticorpo primário ou de captura e a fase sólida. O anticorpo secundário é ligado a uma molécula repórter que é utilizada para indicar a ligação do segundo anticorpo ao complexo formado pelo anticorpo primário e o antigeno de interesse.

[0093] Variações no ensaio incluem um ensaio simultâneo, em que tanto a amostra como o anticorpo marcado são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado ou ao anticorpo capaz de se ligar à fase sólida por meio de um par de ligação (estrept)avidina/biotina. Essas técnicas são bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto, incluindo pequenas variações que serão evidentes.

[0094] Em outra configuração alternativa, é formado um complexo sanduíche, em que um anticorpo primário biotinilado é fornecido, um anticorpo secundário marcado com um hapteno é fornecido, e os dois anticorpos são colocados em contato com uma amostra contendo o antigeno correspondente. Após a incubação sob condições permissivas com a formação de um sanduíche que compreende os anticorpos primário e secundário, e o antigeno, a (estrept)avidina transportando um marcador é adicionada, e o complexo é capturado por uma fase sólida capaz de se ligar especificamente ao hapteno que está ligado ao anticorpo secundário. Após uma etapa de lavagem, a quantidade de marcador ligado à fase sólida indica a presença e quantidade do antigeno de interesse.

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42/116 [0095] De modo geral, em relação a todos os aspectos e exemplos de realização, a presente divulgação provê um composto de Fórmula

(Fórmula I) em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2, X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)_p-O]k-(CH2)m com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5, e R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida, e Z, em que Z é A ou B, em que A é M-L com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante conectando X e M; e em que B é

M L com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que 0 átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

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43/116 [0096] Uma primeira característica chave da estrutura de Fórmula I é a porção biotina com uma cadeia lateral de ácido valérico não conjugada, não modificada. Foi especulado que a conformação da cadeia lateral em relação à estrutura heterocíclica da porção biotina não é totalmente aleatória. Essa visão parece ser corroborada por dados de RMN e pelo achado anterior de uma interação entre um átomo C6 sendo parte da cadeia lateral do ácido valérico por um lado, e o átomo N’3 por outro lado. Assim, uma questão não respondida, até o momento, era se a porção “cauda” da molécula de biotina que é oposta (distal a partir da) à porção “cabeça” heterocíclica que pode ser ligada pela (estrept)avidina é realmente adequada para o reconhecimento por uma anticorpo monoclonal.

[0097] O átomo N’3 na porção heterocíclica da biotina no átomo na Fórmula I é outra característica importante, a medida em que ele está livre de modificação direta. Novamente, se esse átomo estiver envolvido em uma interação com um átomo C6 que faz parte da cadeia lateral do ácido valérico, essa interação na conformação da cadeia lateral provavelmente será preservada.

[0098] Outra característica chave que subjaz a presente invenção é a substituição no átomo C5 do anel tiofeno adjacente ao átomo de enxofre (vide a Figura 1A). As substituições neste átomo de C foram descritas anteriormente, por exemplo, por Lett R. & Kuroki Y. Tetrahedron Letters 23 (1982) 5541-5544. Como uma característica chave das biotinas dreivativas aqui apresentadas, o C5 carrega o substituinte -Y-X-R, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2, X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)_n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)_PO]k-(CH2)m com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3 e com k sendo um número inteiro de 1ou 30, e [(CH2)t-CONH]_s-(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5, e R é selecionado a partir do grupo que consiste em H,

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OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida e Z.

[0099]Assim, a biotina substituída tal como fornecida na presente invenção é preparada como um bloco de construção que permite, entre outras coisas, formar imunógenos e moléculas úteis para detectar e selecionar anticorpos desejados. Especificamente para este fim, 0 grupo terminal R pode ser selecionado para ser Z, em que Z é A ou B, em que A é M-L com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que 0 átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

[0100] Em um exemplo de realização específico, R é um grupo azida que pode ser usado como um parceiro reativo em um tipo de reação conhecido como química “click”. Assim, um conjugado de hapteno e derivado da biotina pode ser formado com grupos reativos possuindo grupos funcionais bio-ortogonais. Um exemplo de realização específico de um grupo reativo é um grupo azida com o qual uma reação “click’ pode ser realizada com alcinos ou fosfina como parceiro de reação (J.C. Jewett, C.R. Bertozzi, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 127). Azidas com fosfinas realizam uma reação de Staudinger, azidas com alcinos uma cicloadição [3+2], De modo especial,

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45/116 os derivados de ciclo-octina são conhecidos pelos especialistas no assunto para a modificação de biomoléculas em condições suaves (WO 2006/050262). No exemplo de realização específico em que RéZeZé B, a porção biotina através do substituinte -Y -X no átomo C5 do anel tiofeno adjacente ao átomo de enxofre está ligada a M, em que B é obtido a partir de uma cicloadição [3+2] de um alcino com o grupo azida sendo um exemplo de realização de R.

[0101] O termo “ligante” significa uma porção bifuncional ou multifuncional que pode ser utilizada para conjugar (ligar) uma primeira porção com uma segunda porção ou mais porções. Os conjugados compreendendo uma primeira porção e uma segunda porção ligadas entre si podem ser convenientemente preparados utilizando um ligante que possui duas funcionalidades reativas. Em tal conjugado, as duas porções são ligadas por este ligante. Como seria óbvio para o técnico hábil no assunto, em tal conjugado as porções funcionais do ligante estão presentes como parte de uma ligação e não como uma porção funcional que não reagiu.

[0102] Tal como definido na presente invenção, o termo “grupo reativo” ou “funcionalidade reativa” significa qualquer grupo que seja adequado para reagir com grupos amina, de preferência um grupo N-hidroxisuccinimida, de modo a ligar um ligante a um grupo amino; ou um grupo, que é adequado para a ligação de uma segunda funcionalidade, por exemplo, para a reação com um grupo-SH, de preferência um grupo maleimida, de modo a ligar um ligante a um grupo-SH.

[0103] Em um exemplo de realização específico, um ligante heterobifuncional selecionado a partir do grupo que consistem ligantes NHSmaleimida, os quais são baseados em grupos reativos N-hidroxisuccinimida e maleimida; ligantes succinimidil-(PEG)_n NHS-PEG-maleimida, ligantes NHShaloacetila; e ligantes NHS-piridilditio. Em um exemplo de realização

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46/116 particularmente preferido, o ligante heterobifuncional é um ligante succinimidil(PEG)n NHS-PEG-maleimida.

[0104] Em um exemplo de realização específico, o L tem um comprimento da cadeia principal entre 1 e 200 átomos. Em outras palavras, se o comprimento da estrutura principal estiver entre 1 e 200 átomos, a conexão mais curta entre Z e R consiste de 1 a 200 átomos.

[0105] No caso de um sistema de anéis estar presente, o menor número de átomos no sistema de anéis é utilizado ao avaliar o comprimento do ligante. Como exemplo, um anel fenileno corresponde a um comprimento de quatro átomos em um ligante.

[0106] Em um exemplo de realização de Fórmula I, L é um ligante que tem como estrutura principal uma cadeia alquila-Ci-C2o linear ou ramificada, saturada, insaturada, não substituída ou substituída, ou uma cadeia com 1 a 200 átomos consistindo em átomos de carbono, átomos de carbono substituídos e/ou um ou mais átomos selecionados a partir de O, N, P e S, ou átomos de N, P, S substituídos, ou uma cadeia conforme descrito anteriormente com a estrutura principal contendo um ou mais sistemas de anéis aromáticos ou não aromáticos cíclicos ou heterocíclicos.

[0107] Em um exemplo de realização de Fórmula I, o ligante L tem como estrutura principal uma cadeia alquila-Ci-C100 linear ou ramificada, saturada, insaturada, não substituída ou substituída, ou uma cadeia com 1 a 100 átomos consistindo em átomos de carbono, átomos de carbono substituídos e/ou um ou mais átomos selecionados a partir de O, N, P e S, ou átomos de N, P ou S substituídos, ou uma cadeia conforme descrito anteriormente com a estrutura principal contendo um ou mais sistemas de anéis aromáticos ou não aromáticos cíclicos ou heterocíclicos.

[0108] Em um exemplo de realização de Fórmula I, o ligante L tem como estrutura principal uma cadeia alquila-Ci-C50 linear ou ramificada,

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47/116 saturada, insaturada, não substituída ou substituída, ou uma cadeia com 1 a 50 átomos consistindo em átomos de carbono, átomos de carbono substituídos e/ou um ou mais átomos selecionados a partir de O, N, P e S, ou átomos de N, P ou S substituídos, ou uma cadeia conforme descrito anteriormente com a estrutura principal contendo um ou mais sistemas de anéis aromáticos ou não aromáticos cíclicos ou heterocíclicos.

[0109] Em um exemplo de realização de Fórmula I adicional, o ligante L tem como estrutura principal uma cadeia alquila-Ci-C2o linear ou ramificada, saturada, insaturada, não substituída ou substituída, ou uma cadeia com 1 a 20 átomos consistindo em átomos de carbono, átomos de carbono substituídos e/ou um ou mais átomos selecionados a partir de O, N, P e S, ou átomos de N, P ou S substituídos, ou uma cadeia conforme descrito anteriormente com a estrutura principal contendo um ou mais sistemas de anéis aromáticos ou não aromáticos cíclicos ou heterocíclicos.

[0110]Em outro exemplo de realização específico de Fórmula I, L é um ligante, que é obtido pela reação de um agente de reticulação (homo-)bifuncional com um grupo químico apropriado em cada uma das duas porções ligadas pelo ligante, o reticulante (homo-)bifuncional é exemplificado por

O

Éster do ácido bis-(2,5-dioxo-pirrolidin-1 -il) octanedióico.

[0111] Em outro exemplo de realização específico de Fórmula I, L é um ligante, que é obtido pela reação de um agente de reticulação (hetero)bifuncional com um grupo químico apropriado em cada uma das duas porções ligadas pelo ligante, o reticulante (hetero-)bifuncional pode ser selecionado a

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48/116 partir do grupo que consiste em;

-Reticulantes NHS-maleimida, por exemplo,

AMAS (éster te N-a-malei^idoacet-oidisücdnirrada)

BMPS (éster te N-^-maleimtdepropil-exfeücdmmüte)

GMBS (éster de M-v-maieímitebutml-axis^cctaimtda

Süfib-GMBS (éster de

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MBS (éstw de irHnaleimidet)^zoil-N-h«!FOXfeucc»iimida)

Si<o-MB8 (êster de m-malemddbenzoií-N-ttí<froxísalfosüCOTimi<la)

SMCC (4-(H-:mafô:im^ometi^cidahexano-'1-caft3exiaíD de sacdrtmidila)

Sulfe-SMCC (4-(N4na^midGmetiI)dd0ti^^e-1 -carfeoxOato de suh’asucdnoidila)

EMCS (ester de N-E-^alem^do^pFoil-oxisyccinimida)

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Suffo-LyGS (éster de

SÜPB (4-Omaleímidoferal)Mrato de süCOTfcredila)

Stalfb-SMPB (4-(W-foal®midcfenl)t]iiitfcato de s^líGsticcmra^fe)

SMPH (€-((beta4realeãmídopr£psnamicto)hexanoaÈB de succwmidla))

LC-SMCC (4-^-mateimk1ofneffl)dctohaxancHl-caFbcKi-(6-arRidoca|^oato de

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Siilfc-KMÜS (ester de N-K-maieo^deundsca^eii-axisiilfestjcdnoida)

- Reticulantes succinimidil-(PEG)n-maleimida ou NHS-PEG-maleimida, por exemplo;

SM(PEG)2 (Rfitalante S^ICC PEGiiado)

NHS-PEGn-Malemida

Éster de sycdniHiidii-C^N-maleimideprcpisnamidof-dF^teMglicsB

SM(PEGM (Relajtote S^CC PEGilado)

NHS-PEGn-MsieMda

Éster de 5υ£€?η:ί«ιϊόίΕ([Ν-π^3;Ιβί:ΐτΐίί00ΡΓορίοπθπιίόο]-tetra-etifenoglicah

W(PEG)6 (Retalante SIICC de cadeia longa, PEGIado)

NHS-PEG^-Malemda

Éster desiJcdrHmi$H0^maãebnidQproplonamido]-hexa-eáieno!$i€oi)

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SM(PEG)8 (Reticolante SMCC de cadeia longa, PEGiado)

NHS-PEGn-Matekrada

Éster desucdnimidil-([iN-mãleimí(lopropidnamidoHda-eliienoglícõl)

GM(PEG)12 (Reüciáante SMCC de cadeia looga, PEGilado)

NHS-PEGn-Malemda

Ester de sycdnimidil-diN-matemdopreponam^oH^^s-etifenoggceO

Sfe<PEG)24 (Refictiante SMCC de cadeia longa, PEGilado)

NHS-PEGn-Maleimida

Ester de Ή:θ€€ΐποΐ(ϋ^-([Ν-^3ΐβίιτΐ:ί£1βρί©ρ©πάτπΐόοΗ^-β^3>ο-6ίί^ηϋ3ΐΐΩ>ΙΟ

- Reticulantes NHS-haloacetila, por exemplo,

GIA (iodoacelato de succmimfcfila}

SBAP (3--(lremoacetamidg)propb^ats de saoámídilá)

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SIAS ((4-icxíoaraW)aminoi>ef!zoato (fe succmimídila)

Salfo-SIA8 O-iadaacetiOammobenzoato de siÉfosyjxtaimkiila) e;

- Reticulasntes NHS-piridilditiol, por exemplo,

LC-SPDP 6-[3(2-pmidí1ditiõ0prõpionamidô]hexanoatG ds succinimidila

Süfe-LC-SPOP sülfesuccmmdla) (6-{3’-(2-piddii®s)pFsptonamido)hexanoate

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SM PT (4-5ücdnHTHdioxicarb^il-sl1a-meti-a(2-pàíi(ild^oMofeefi<>)

PEG4-SPDP (Retolante SPDP de cadeia ionga, PEGtecto)

PEG12-SPDP (ReticiJante SPDP de cadeia [onga_: PEGilado)

ai!a-[3-(d-piFtdildiSdlíidü)prspaosilamidG]-smega-CpTdp®natQ de SBCdnhMa) hexadeca (etileno ςΗίεοΙ) [0112] Em um exemplo de realização de Fórmula I, R é A ou B e A é M-L, e B compreende M-L, em que M é um polipeptídeo. Assim, outro aspecto geral da presente divulgação original, e da invenção, que também está relacionada a todos os outros aspectos e exemplos de realização aqui divulgados, é um imunógeno de acordo com a Fórmula I,

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em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)p-O]K-(CH2)m com p sendo um número inteiro de 1 a 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a

30, e [(CH2)r-CONH]s-(CH2)t com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é M-L sendo M um polipeptídeo com pelo menos 30 aminoácidos e, de um modo preferido, sendo hemocianina de lapa californiana (KLH), e L sendo um ligante que liga X e M e em que B é;

M L com M sendo um polipeptídeo com pelo menos 30 aminoácidos, e é preferencialmente a hemocianina de molusco lapa californiana (KLH); e L sendo um ligante, em que 0 átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está ligado covalentemente a um grupo CH2 adjacente de X.

[0113] De modo importante, 0 polipeptídeo é capaz de desencadear uma resposta imune à porção biotina, enquanto a imunogenicidade da porção biotina sozinha é baixa. Em um exemplo de realização, 0 polipeptídeo é selecionado a partir de albumina de soro de rato,

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56/116 coelho, camundongo, suíno ou bovino, tiroglobulina bovina ou suína, ovalbumina, toxoide tetânico, gelatina, inibidor de tripsina de soja, hemocianina do molusco lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin) e substâncias similares. Em um exemplo de realização específica, o polipeptídeo é a hemocianina do molusco lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin- KLH).

[0114] Em um exemplo de realização, a presente divulgação relacionada com todos os outros aspectos e exemplos de realização também proporciona métodos para produzir anticorpos policlonais (incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpo e seus fragmentos de ligação ao antígeno) que se ligam especificamente ao imunógeno de acordo com a presente divulgação. O método compreende: (a) o fornecimento de um imunógeno de acordo com a invenção; (b) a imunização de um animal experimental com o imunógeno sob condições nas quais o sistema imune do animal produza os anticorpos; e (c) a remoção dos anticorpos que se ligam especificamente à biotina a partir do animal. O animal pode ser uma ovelha, cabra, coelho, rato, camundongo e semelhantes.

[0115] Outro aspecto geral da presente divulgação original e da invenção, que também se relaciona com todos os outros aspectos e exemplos de realização conforme divulgado na presente invenção, é um método para produzir um anticorpo de acordo com a invenção, cujo método compreende as etapas de (a) imunização de um animal experimental com um imunógeno de acordo com a presente invenção, desse modo induzindo células B que produzem anticorpos que se ligam ao imunógeno; (b) obtenção de um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), quer via tecnologia de hibridoma quer por tecnologia de PCR de células B; (c) seleção do anticorpo da etapa (b) para ligação a biotina, obtendose assim o anticorpo de acordo com a presente invenção.

[0116] Em um exemplo de realização, na Fórmula I, R

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57/116 compreende M, e em um exemplo de realização específico M é um hapteno, em que o hapteno não contém uma porção biotina. Assim, outro aspecto geral da presente divulgação original, e da invenção, que também está relacionada a todos os outros aspectos e exemplos de realização aqui divulgados, é um composto de acordo com a Fórmula I,

O hCT NH COOH ^R\ /^Y—<T*h r *

(Fórmula I) em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n, com n sendo um número inteiro de 1 a 20; [(CH2)p-O]K-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30; e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t, com sendo r um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5 e com s sendo um número inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é M-L com M sendo um hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

M L com M sendo um hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante, em que 0 átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

[0117] Um composto de acordo com este aspecto é

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58/116 particularmente útil na captura de anticorpos desejados, por exemplo, em um processo de identificação de anticorpos policlonais ou monoclonais gerados usando um imunógeno de acordo com a invenção. Tais anticorpos irão se ligar especificamente à porção biotina do composto, ou seja, o composto é capaz de capturar os anticorpos desejados de acordo com a invenção. A este respeito, o hapteno não deve ser e/ou não deve conter uma porção biotina adicional, de modo a manter a especificidade de captura do composto. Assim, um hapteno adequado que não é biotina e/ou não contém biotina é selecionado a partir do grupo que consiste em dinitrofenol, anilina, ácido aminobenzoico, hidralazina, fluoresceína e digoxigenina. Em um exemplo de realização específico, Z é digoxigenina. Em um exemplo de realização específico de acordo com este aspecto é o composto de Fórmula III A (= composto [29]) divulgado na Figura 2 K. Outro exemplo de realização específico de acordo com este aspecto é o composto de Fórmula III B (= composto [30]) divulgado na Figura 2 K.

[0118] Assim, um exemplo de realização específico de acordo com todos os aspectos aqui divulgados é um anticorpo monoclonal que primeiramente se liga especificamente a um composto de acordo com a Fórmula I,

COOH (Fórmula I) em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e

CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n, com n sendo um número inteiro de 1 a 20; [(CH2)_P-O]K-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30; e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t, com sendo r um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro

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59/116 de 0 a 5 e com s sendo um número inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é M-L com M sendo urn hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

^N *

M L com M sendo um hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a X e, em segundo lugar, se liga especificamente a um composto de Fórmula III A (= composto [29]) divulgado na Figura 2 K.

[0119] Adicionalmente, um exemplo de realização específico de acordo com todos os aspectos aqui divulgados é um anticorpo monoclonal que primeiramente se liga especificamente a um composto de acordo com a Fórmula I, O

H«J* NH COOH ^R\ Λ ^X (Fórmula I) em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n, com n sendo um número inteiro de 1 a 20; [(CH2)_P-O]K-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30; e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t, com sendo r um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5 e com s sendo um número inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é

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M-L com M sendo urn hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

M .........L com M sendo um hapteno que não contém uma porção biotina, e

L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a X e, em segundo lugar, se liga especificamente a um composto de Fórmula III B (= composto [30]) divulgado na Figura 2 L.

[0120] Surpreendentemente verificou-se adicionalmente que os anticorpos monoclonais descritos nos aspectos e exemplos de realização da presente invenção não apenas se ligam aos compostos de Fórmula I, conforme especificado e descrito acima, como também se ligam à biotina derivatizada que é caracterizada, ao contrário da Fórmula I, pelo átomo C5 não ter substituição, mas o átomo N’i do anel ureído transportar adicionalmente um substituinte, através do qual a porção de biotina está ligada de forma covalente a um veículo. Assim, um exemplo de realização específico de acordo com todos os aspectos aqui divulgados é um anticorpo monoclonal que primeiramente se liga especificamente a um composto de acordo com a Fórmula I,

COOH (Fórmula I)

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61/116 em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n, com n sendo um número inteiro de 1 a 20; [(CH2)_P-O]K-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30; e [(CH2)t-CONH]_s(CH2)t, com sendo r um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5 e com s sendo um número inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é M-L com M sendo um hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

com M sendo um hapteno que não contém uma porção biotina, e L sendo um ligante, em que 0 átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a X.

e; em segundo lugar se liga especificamente a um composto de Fórmula III C, representado na Figura 3 B.

[0121] Outro aspecto geral da presente divulgação original e da invenção, que também se relaciona com todos os outros aspectos e exemplos de realização conforme divulgado na presente invenção, é um método para produzir um anticorpo de acordo com a invenção, cujo método compreende as etapas de (a) imunização de um animal experimental com um imunógeno de acordo com a presente invenção, desse modo induzindo células B que produzem anticorpos que se ligam ao imunógeno; (b) obtenção de um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), quer via tecnologia de hibridoma quer por tecnologia de PCR de

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62/116 células B; (c) seleção do anticorpo da etapa (b) para ligação a biotina, obtendose assim o anticorpo de acordo com a presente invenção.

[0122] A geração de linhagens de células que produzem anticorpos monoclonais por meio de tecnologia de hibridoma é bem conhecida pelos especialistas no assunto.

[0123] A tecnologia de PCR de células B, conhecida pelo técnico hábil no assunto, tira proveito do fato de que, a partir de células B, o mRNA total pode ser isolado e transcrito em cDNA. Com iniciadores (primers) específicos, o ácido nucleico que codifica a região VH e VL pode ser amplificado. Quase nenhuma sequência idêntica é obtida. O método fornece anticorpos altamente diversificados que se ligam ao mesmo antígeno.

[0124] Os iniciadores (primers) utilizados para a amplificação do ácido nucleico que codifica VH podem ser utilizados para o cDNA obtido a partir de células de camundongos NMRI, hamster-armênio, camundongos Balb/c, bem como de hamster-sírio e coelho.

[0125] Em um exemplo de realização de todos os métodos aqui descritos, a sequência de aminoácidos é derivada do ácido nucleico codificante de VH amplificado e o ponto inicial e final exato é identificado pela localização das sequências de aminoácidos EVQL/QVQL até VSS (região VH) e DIVM/DIQM até KLEIK (região VL).

[0126] Também é divulgado na presente invenção um método utilizando PCR de célula B para produzir um anticorpo, compreendendo as seguintes etapas: (a) o fornecimento de uma população de células B (maduras) (obtidas a partir do sangue de um animal experimental não humano), (b) a coloração das células da população de células B com pelo menos um corante fluorescente (em um exemplo de realização com um a três ou dois a três corantes fluorescentes), (c) a deposição de células individuais da população de células B coradas em recipientes individuais (em um exemplo de realização o

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63/116 recipiente ou contentor é um poço de uma placa de múltiplos poços), (d) o cultivo das células B individuais depositadas na presença de células alimentadoras, (e) a determinação da especificidade de ligação dos anticorpos secretados na cultura de células B, (f) a determinação da sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve e pesada dos anticorpos de ligação específica por uma PCR de transcriptase reversa e sequenciamento de nucleotídeos e, desse modo, a obtenção de um ácido nucleico codificante do domínio de cadeia leve e pesada de um anticorpo monoclonal, (g) a introdução do ácido nucleico codificante do domínio variável de cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal em um cassete de expressão para a expressão de um anticorpo, (h) a introdução do ácido nucleico em uma célula, (i) o cultivo da célula e a recuperação do anticorpo a partir da célula ou do sobrenadante de cultura celular; produzindo desse modo um anticorpo.

[0127] Em um exemplo de realização, o animal não humano é selecionado a partir de rato, camundongo, hamster, coelho, primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinha, anfíbio e répteis.

[0128] Em um exemplo de realização específico do método aqui divulgado para produzir um anticorpo monoclonal, na etapa (c) a seleção é realizada em um ensaio competitivo utilizando biotina como competidor para ligação do anticorpo a um composto do grupo de compostos selecionados a partir da Fórmula III A (= composto [29]), representado na Figura 2 K, Fórmula III B (= composto [30]), representado na Figura 2 L, e Fórmula III C representado na Figura 3 B. Este composto já foi discutido acima. Os compostos são particularmente úteis na captura de anticorpos desejados. Tais anticorpos irão ligar-se especificamente à porção biotina de um ou de ambos os compostos, isto é, um ou ambos os compostos são capazes de capturar os anticorpos desejados de acordo com a invenção. A este respeito, o hapteno não deve ser e/ou não deve conter uma porção biotina

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64/116 adicional, de modo a manter a especificidade de captura do respectivo composto. Assim, o hapteno é utilizado para ancorar o reagente de captura em uma fase sólida, por exemplo, conforme exemplificado com a digoxigenina como o hapteno.

[0129] Outra etapa importante é a seleção e/ou confirmação de que um anticorpo, especificamente um anticorpo monoclonal gerado utilizando um imunógeno divulgado na presente invenção, e através de um método conforme divulgado na presente invenção, é capaz de ligar a biotina. Um ensaio de ligação competitiva assegura assim que o anticorpo é capaz de se ligar a biotina quando colocado em contato com biotina livre em solução aquosa. Consequentemente, em um exemplo de realização do método divulgado na presente invenção para produzir um anticorpo monoclonal na etapa (c), a seleção é realizada em um ensaio competitivo utilizando biotina como um competidor para ligação do anticorpo ao imunógeno divulgado na presente invenção.

[0130] Em outro exemplo de realização do método divulgado na presente invenção para produzir um anticorpo monoclonal na etapa (c), a seleção é realizada em um ensaio competitivo utilizando biotina como um competidor para ligação do anticorpo a um composto de Fórmula III A (= composto [29]), também representado na Figura 2 K.

[0131] Em outro exemplo de realização do método divulgado na presente invenção para produzir um anticorpo monoclonal na etapa (c), a seleção é realizada em um ensaio competitivo utilizando biotina como um competidor para ligação do anticorpo a um composto de Fórmula III B (= composto [30]), também representado na Figura 2 L.

[0132] Em outro exemplo de realização do método divulgado na presente invenção para produzir um anticorpo monoclonal na etapa (c), a seleção é realizada em um ensaio competitivo utilizando biotina como um

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65/116 competidor para ligação do anticorpo a um composto de Fórmula III C, também representado na Figura 3B.

[0133] De modo mais abrangente, em outro exemplo de realização do método divulgado na presente invenção para produzir um anticorpo monoclonal na etapa (c), a seleção é realizada em um ensaio competitivo utilizando biotina como um competidor para ligação do anticorpo a um composto de acordo com a Fórmula I, em que R é um hapteno, em que o hapteno não contém uma porção biotina.

[0134] Como evidenciado nos Exemplos da presente divulgação, a invenção em seus aspectos e exemplos de realização proporciona agora um novo anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um composto de Fórmula I,

COOH (Fórmula I) caracterizado pelo fato de que ele também se liga a biotina, em que Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2; X é selecionado a partir do grupo que consiste em (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)p-O]k-(CH2)m, com p sendo 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)rCONH]_s-(CH2)t com R sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5; e R é A ou B, em que A é M-L com M sendo selecionado a partir de um hapteno que não contém uma porção biotina e um polipeptídeo, e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

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com M sendo selecionado a partir de um hapteno não contendo uma porção biotina e um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

[0135] O anticorpo monoclonal da invenção pode ser obtido por um método de acordo com a invenção e conforme divulgado na presente invenção.

[0136] Como descrito acima, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção é caracterizado por não se ligar a um composto de Fórmula II. Na Fórmula II, a porção biotina é acoplada a um hapteno através de um ligante via átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral do ácido valérico. Assim, a molécula exemplifica uma molécula convencionalmente biotinilada à qual os anticorpos desejados da invenção não se ligam.

[0137] Assim, outro aspecto geral da presente divulgação original, e da invenção, que também está relacionado com todos os outros aspetos e exemplos de realização divulgados na presente invenção, é um método para produzir um anticorpo que não se liga a uma molécula biotinilada, em que a porção biotina está acoplada através de um ligante a um hapteno via o átomo de carbono da função carboxila da cadeia lateral do ácido valérico, cujo método compreende as etapas de (a) imunização de um animal experimental com um imunógeno da invenção, induzindo desse modo células B que produzem anticorpos que se ligam ao imunógeno; (b) a obtenção de um anticorpo

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67/116 monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), quer via tecnologia de hibridoma quer por tecnologia de PCR de células B; (c) a seleção do anticorpo da etapa (b) para ligação a biotina; e (d) a seleção dos anticorpos que não se ligam à molécula biotinilada, obtendo assim um anticorpo da invenção que não se liga a uma molécula biotinilada. Em um exemplo de realização específico, a etapa (d) é realizada com um composto de acordo com a Fórmula II.

[0138] Assim, de modo mais específico, é divulgado um método para produzir um anticorpo que não se liga a um composto de Fórmula II, cujo método compreende as etapas de (a) imunização de um animal experimental com um imunógeno da invenção, induzindo desse modo células B que produzem anticorpos que se ligam ao imunógeno; (b) obtenção de um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), quer via tecnologia de hibridoma quer por tecnologia de PCR de células B; (c) seleção do anticorpo da etapa (b) pela ligação a biotina; e (d) seleção dos anticorpos que não se ligam ao composto de Fórmula II, obtendose assim um anticorpo de acordo com a invenção que não se liga a um composto de acordo com a Fórmula II.

[0139] Particularmente, em um método para mensurar um analito em uma amostra, em que um par de ligação (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, a medição do analito pode tornar-se imprecisa se a amostra contiver quantidades extraordinariamente altas de biotina. Por esta razão, é altamente desejável eliminar a biotina. Este problema técnico pode ser resolvido pelo pré-tratamento da amostra, isto é, com um processo de remoção da biotina livre antes que a amostra seja submetida ao método de medição do analito. Entretanto, isto envolvería um grande número indesejado de etapas discretas de trabalho como, por exemplo, a mistura da

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68/116 amostra com partículas magnéticas que são revestidas com (estrept)avidina, a incubação da mistura, dessa forma, ligando a biotina às partículas, seguido pela remoção magnética das partículas. Essa abordagem de pré-tratamento de amostras consome não apenas recursos, como também matérias-primas e tempo; além disso, tal abordagem acarreta o risco de alterar a amostra (por exemplo, seu volume e composição), o que, por sua vez, pode levar a efeitos indesejados na detecção e medição de analitos.

[0140] Surpreendentemente verificou-se que um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção capaz de se ligar a biotina e não se ligar a moléculas de interesse convencionalmente biotiniladas proporciona uma solução elegante para reduzir a interferência da biotina. Enquanto atua como sequestrador de biotina, a propriedade de ligação da biotina do anticorpo é tal que não interfere com a ligação, por exemplo, de um agente de ligação específico para o analito biotinilado à (estrept)avidina. Assim, o anticorpo monoclonal de acordo com a invenção acaba por ser uma ferramenta poderosa para neutralizar a interferência causada por um elevado nível de biotina que pode estar presente na amostra.

[0141] Outro aspecto geral da presente divulgação original e da invenção, que também está relacionado com todos os outros aspetos e exemplos de realização divulgados na presente invenção, é o uso de um anticorpo da invenção em um método para medir um analito em uma amostra, em que utiliza-se um par de (estrept)avidina/biotina para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

[0142] Outro aspecto geral da presente divulgação original e da invenção, que também se relaciona com todos os outros aspectos e exemplos de realização divulgados na presente invenção, é um método para medir um analito em uma amostra, em que um par de ligação (estrept)avidina/biotina é

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69/116 utilizado para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, em que o método compreende a adição à amostra de (a) um anticorpo da presente invenção, (b) um agente de ligação específico para o analito biotinilado, (c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, seguido pela medição do analito ligado à fase sólida via (estrept)avidina e agente de ligação específico para o analito biotinilado.

[0143] A presente divulgação provê meios para eliminar a biotina livre potencialmente interferente compreendida em uma amostra a partir da qual um analito deve ser medido e cujo método de medição utiliza o par de ligação (estrept)avidina/biotina. Preferencialmente, a etapa de eliminação/sequestro é realizada antes da formação do par (estrept)avidina/biotina. Assim, em um exemplo de realização, é proporcionado um método para a medição de um analito em uma amostra, em que um par de ligação (estrept)avidina/biotina é utilizado para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, cujo método compreende a adição à amostra de (a) um anticorpo da presente invenção, (b) um agente de ligação específico para o analito biotinilado, (c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, seguido pela medição do analito ligado à fase sólida através da (estrept)avidina e agente de ligação específico para o analito biotinilado, em que a etapa (a) e, opcionalmente, também a etapa (b), são realizadas antes da etapa (c). Ainda em outro exemplo de realização, a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas simultaneamente antes da etapa (c) ser realizada. Ainda em outro exemplo de realização, a etapa (b) e a etapa (c) são realizadas simultaneamente antes da etapa (a) ser realizada. Em outro exemplo de realização, todas as três etapas (a), (b) e (c) são realizadas simultaneamente. Surpreendentemente, um anticorpo monoclonal da invenção também é tecnicamente adequado como um eliminador/sequestrador eficaz de biotina livre para uso em um método para

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70/116 medir um analito em uma amostra, cuja amostra contém biotina livre, em que é utilizado um par de (estrept)avidina/biotina para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina ou a uma (estrept)avidina marcada, em que a amostra, o anticorpo monoclonal da invenção, um agente de ligação biotinilado e uma fase sólida revestida com (estrept)avidina ou uma (estrept)avidina marcada são colocados em contato um com o outro simultaneamente.

[0144] No que diz respeito a todos os aspectos e exemplos de realização da detecção e/ou medição do analito conforme revelado na presente invenção, pode-se utilizar uma amostra líquida aquosa em um método para detecção in vitro específica de um analito em um método de acordo com a presente divulgação. A amostra pode ser conhecida por compreender o analito ou pode ser suspeita de compreender o analito. Em um exemplo de realização, uma amostra para diagnóstico in vitro utilizada em um método de acordo com a presente divulgação é um fluido corporal selecionado a partir de sangue total, soro sanguíneo, plasma sanguíneo, liquor, urina ou saliva. Em um exemplo de realização, a amostra suspeita de compreender o analito é soro, plasma ou liquor. Em um exemplo de realização, a amostra suspeita de compreender o analito é soro ou plasma.

[0145] Outro aspecto geral da presente divulgação original, e da invenção, que também se relaciona a todos os outros aspectos e exemplos de realização divulgados na presente invenção, é um kit de teste de imunoensaio compreendendo em recipientes ou contentores separados pelo menos (a) um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de acordo com a invenção, (b) um agente de ligação específico para o analito biotinilado, e (c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina.

[0146] O termo unidade contentora única refere-se ao fato de que, para muitos analisadores automáticos, tal como o analisador Elecsys^ da

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Roche Diagnostics, os reagentes necessários para mensurar determinado analito são fornecidos na forma de um “pacote de reagente”, ou seja, como uma unidade contentora que se encaixa no analisador e contém em diferentes compartimentos todos os principais reagentes necessários para a medição do analito de interesse.

[0147] Em um exemplo de realização, a presente invenção diz respeito a um kit em que o referido primeiro parceiro de um par de ligação para a avidina ou estreptavidina e em que o referido segundo parceiro do referido par de ligação é(são) selecionado(s) a partir de biotina ou análogos da biotina, tais como aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotina.

[0148] Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo é estabelecido nas reivindicações anexas. Deve-se compreender que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos sem se afastar do espírito da presente invenção.

Descrição Das Figuras [0149] Figura 1: A: D(+)-biotina; B: D(+)-biotina.

[0150] Figura 2: Esquemas de síntese relacionados aos exemplos 1 e 2.

[0151] Figura 3: A: Composto de Fórmula II; B: composto de Fórmula III.

[0152] Figura 4: Assinaturas cinéticas exemplares do ensaio de seleção cinética de anticorpos. Linha pontilhada: Sinal de ligação SPR da injeção do complexo Dig-Biotina-conjugado-M-D.G-Fab’. Linha sólida: Sinal de ligação SPR do complexo Dig-Biotina-conjugado-M-D.G-Fab’ suplementado com 300 nM de D-biotina. Tipicamente, três classes de cinética de bloqueio de D-biotina livre foram observadas. A: competição completa da D-biotina. B: Bloqueio intermediário de D-biotina. C: Nenhum sinal de interferência pela D

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72/116 biotina. Candidatos de anticorpos adequados foram selecionados a partir das classes A e B para investigações detalhadas posteriores.

[0153] Figura 5: Gráfico de sobreposição de Sensorgrama SPR exemplar da medição ICso por SPR da ligação do anticorpo candidato clone G. 270 nM de conjugado Dig-Biotina foram misturados com concentrações de D-biotina livre a 270 nM (não mostrado), 90 nM, 30 nM (duas vezes), 10 nM, 3,3 nM e 1 nM. A mistura contendo 90 nM de concentração de D-biotina livre produziu o menor sinal de resposta e a mistura contendo 1 nM de D-biotina livre produziu o sinal de resposta mais elevado (marcado). X indica as posições dos pontos reportados, que foram usados para o cálculo da ICso. F [0154] Figura 6:

A. Configuração da SPR no Ensaio de Seleção Cinética experimental. Inicialmente, Dig-Biotina-conjugado-M-D.G-Fab' pré-formado foi usado como analito em solução para monitorar a ligação da d-biotina conjugada de peso molecular melhorado. Em segundo lugar, a d-biotina foi adicionada à mistura de analito para competir com a ligação do conjugado;

B. Configuração experimental do ensaio SPR. A interação de DigBiotina-conjugado foi medida na presença e ausência de uma série de concentrações de d-biotina. Na ausência de d-biotina, foram utilizadas séries dependentes de concentração de Dig-biotina-conjugado para determinar a cinética do anticorpo de coelho versus Dig-biotina-conjugado. As medições de ICso foram realizadas com uma concentração constante de Dig-biotinaconjugado e concentrações crescentes de d-biotina livre na mistura da amostra do analito;

C. Configuração experimental alternativa do ensaio SPR. A interação de Dig-Biotina-conjugado foi medida na presença e ausência de uma série de concentrações de d-biotina. Na ausência de d-biotina, foram utilizadas séries dependentes de concentração de Dig-biotina-conjugado para determinar

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73/116 a cinética do anticorpo de coelho versus Dig-biotina-conjugado. Neste caso, o conjugado Dig-biotina foi capturado pelo anticorpo M-D.G exibido na superfície, enquanto o anticorpo de coelho ou seus fragmentos foram utilizados como analito dependente da concentração em solução. As medições de ICso foram realizadas com uma concentração constante de anticorpo de coelho e concentrações crescentes de d-biotina livre na mistura da amostra de analito.

Exemplo 1

Derivatização De Biotina No Átomo C5 Do Anel Tiofeno E Etapas De Síntese Para Obter Um Imunógeno

1.1 [0155] A partir da biotina [1 ] para o composto [2]; vide a Fig. 2 A

[0156] Éster metílico do ácido (S)-5-((1S,6R)-2-Oxo-hexahidrotieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanóico [2], (S. A. Sundberg, R. W. Barrett, M. Pirrung, A. L. Lu, B. Kiangsoontra, C. P. Holmes J. Am. Chem. Soc. 1995, //7(49), 12050-12057) Cloreto de acetila (7,50 mL) foi adicionado lentamente em metanol seco sob agitação (160 mL) a 0^sC sob uma atmosfera de gás argônio. A mistura resultante foi agitada durante 30 minutos em temperatura ambiente (ta). Em seguida, a biotina ([1], 6,00 g, 24,6 mmol) foi adicionada em uma porção e agitada continuamente de um dia para o outro. Após a concentração in vacuo, o produto bruto foi redissolvido em uma mistura de CH2CI2 e metanol (200 mL, v/v = 95:5) e lavado com solução aquosa de NaHCOa saturada. A fase aquosa foi então novamente extraída com uma mistura de CH2CI2 e metanol (100 mL, v/v = 95:5, 3 vezes). As camadas

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74/116 orgânicas combinadas foram secas em Na2SCU e cuidadosamente concentradas in vacuo. Assim, a substância [2] (6,13 g, 23,7 mmol, 97%) foi obtida como um sólido macio, ligeiramente rosa.

Rr(EtOAc:MeOH = 3:1) = 0,65.

RMN ¹H (DMSO-de, 500 MHz): δ = 6,44 (s, br, 1H), 6,36 (s, br, 1H), 4,31 (dd, J= 7,6, 5,4 Hz, 1H), 4,14 (me, 1H), 3,59 (s, 3H), 3,11 (me, 1H), 2,83 (dd, J= 12,5, 5,2 Hz, 1H) 2,59 (d, J= 12,6 Hz, 1H), 2,31 (t, J= 7,57 Hz, 2H), 1,66-1,43 (m, 4H), 1,40-1,27 (m, 2H) ppm.

RMN ¹³C (DMSO-de,125 MHz): δ= 173,3, 162,7, 61,0, 59,2, 55,3, 51,2, 33,1, 28,0 (2C), 24,5 ppm. Nota Um sinal de carbono foi ocultado pelo

pico residual do solvente da RMN. ESI-LRMS CiiHi9N2O3S+ [MH+]:	para
alc.	59,1
	ncont.	59,2

1.2 [0157] A partir do composto [2] para o composto [3]; vide a Fig. 2

A

[0158]Éster metílico do ácido (S)-5-((3aS,4R)-2,5-Dioxohexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanóico [3]. (S. A. Slavoff, I. Chen, Y.-A. Choi, A. Y. Ting J. Am. Chem. Soc. 2008, 130(4), 1160-1162) O éster [2] (3,00 g, 11,6 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em metanol (140 mL) em temperatura ambiente. A esta mistura, foi lentamente adicionada

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75/116 uma solução de periodato de sódio (2,61 g, 12,2 mmol, 1,05 eq.) em água (24,0 mL). Após 5 minutos, a precipitação de um sólido incolor foi observada. A reação foi agitada de um dia para o outro, filtrada (lavagens com CH2Cl2:MeOH = 95:5) e concentrada in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 95:5 gradiente para 90:10) forneceu o sulfóxido [3] (2,79 g, 10,2 mmol, 88%) como um sólido incolor.

Rr(EtOAc:MeOH = 3:1) = 0,40.

RMN ¹H (DMSO-d₆, 500 MHz): δ = 6,79 (s, br, 1H), 6,68 (s, br, 1H), 4,44 (me, 1H), 4,32 (me, 1H), 3,34 (dd, J= 12,6, 1,6 Hz, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,11 (me, 1H), 2,94-2,86 (m, 2H) 2,32 (t, J= 7,6 Hz, 1H), 1,80-1,68 (m, 2H), 1,64-1,54 (m, 2H), 1,52-1,36 (m, 2H) ppm.

RMN ¹³C (DMSO-d₆,125 MHz): δ= 173,3, 161,2, 69,8, 58,6, 55,7,

52,7, 51,2, 33,0, 26,4, 25,0, 24,3 ppm.
ESI-LRMS	para
CiiHi9N2O4S+ [MH+]:	alc.	74,3

ncont. 74,3.

1.3

[0159] A partir da biotina [1 ] para o composto [4]; vide a Fig. 2 A
,|x coo hw w J	q ... .. . . íjRi QW	t
[1]		HI Κν ™ 334 *
[0160] Éster	benzílico do	ácido (S)-5-((1S,6R)-2-Oxo-

hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanóico [4], (D. R. Amspacher, C. Z.

Blanchard, F. R. Fronczek, M. C. Saraiva, G. L. Waldrop, R. M. Strongin Org.

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Lett. 1999, 1 (1), 99-102) Biotina [1] (5,00 g, 20,5 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvida em A/,A/-dimetilformamida seca (29mL) sob atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. Após a adição de monohidrato de hidroxbenzotriazol (0,31 g, 2,05 mmol, 10 mol-%), álcool benzílico (2,65 mL, 25,6 mmol, 1,25 eq.) e 4-dimetilaminopiridina (250 mg, 2,05 mmol, 10 mol-%), uma solução de N,N'diciclohexilcarbodiimida (4,86 g, 23,5 mmol, 1,15 eq.) em diclorometano seco (24 mL) foi adicionada por gotejamento durante 15 minutos. A mistura resultante foi agitada durante 24 horas, antes de outro lote de N,N'diciclohexilcarbodiimida (4,86 g, 23,5 mmol, 1,15 eq.) ser adicionado e agitado continuamente por mais 3 dias. Após a remoção dos voláteis in vacuo, uma purificação por cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 97:3 gradiente para 98:2) forneceu o éster [4] (5,80 g, 17,3 mmol, 84%) como um sólido incolor.

Rr(EtOAc:MeOH = 3:1) = 0,75.

RMN ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): δ = 7,38-7,28 (m, 5H), 6,40 (s, br, 1H), 6,33 (s, br, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,28 (me, 1H), 4,10 (me, 1H), 3,06 (ddd, J =

8.4, 6,1,4,6 Hz, 1H), 2,80 (dd, J= 12,4, 5,1 Hz, 1H), 2,56 (d, J= 12,4 Hz, 1H), 2,34 (t, J= 7,4 Hz, 1H), 1,64-1,36 (m, 6H) ppm.

RMN ¹³C (DMSO-d₆, 125 MHz): δ = 173,2, 163,1, 136,7, 128,9,

128.4, 128,4, 65,8, 61,5, 59,6, 55,8, 36,2, 33,8, 33,7, 28,4, 25,8, 25,0 ppm.

ESI-LRMS para

Ci7H₂₃N₂O₃S⁺[MH⁺]: alc. 35,1 ncont. 35,2.

1.4 [0161] A partir do composto [4] para o composto [17]; vide a Fig. 2 B

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Hl C17H22N2O3S

- 334.4340

NalÜ4

H₂O_s MeOH ta

[0162] Éster benzílico do ácido 5-((3aS,4S,5R,6aR)-2,5-Dioxohexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)-pentanóico [17] [0163] O éster [4] (2,00 g, 5,98 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em metanol (70 mL) em temperatura ambiente. A esta mistura, foi adicionada lentamente uma solução de periodato de sódio (1,22 g, 5,68 mmol, 0,95 eq.) em água (12,0 mL). Após 5 minutos, a precipitação de um sólido incolor foi observada. A reação foi agitada de um dia para 0 outro, filtrada (lavagens com CH2Cl2:MeOH = 95:5) e concentrada in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 98:2 gradiente para 90:10) forneceu 0 sulfóxido diasteriomericamente puro [17] (1,53 g, 4,37 mmol, 73%) como um sólido incolor.

Rr(EtOAc:MeOH = 4:1) = 0,60.

RMN ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): δ = 7,38-7,28 (m, 5H), 6,77 (s, br, 1H), 6,66 (s, br, 1H), 5,08 (s, 2H), 4,42 (ddt, J= 8,5, 6,7, 1,7 Hz, 1H), 4,29 (mc, 1H), 3,34-3,30 (m, 1H), 2,92-2,82 (m, 2H), 2,40-2,32 (m, 2H), 1,76-1,36 (m, 6H) ppm.

RMN ¹³C (DMSO-d₆, 100 MHz): δ = 172,7, 161,2, 136,3, 128,4, 128,0, 128,0, 69,8, 65,3, 58,6, 55,7, 52,7, 33,2, 26,4, 25,0 ppm.

1.5 [0164] A partir do composto [2] para 0 composto [5]; vide a Fig. 2 B

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[0165] O sulfóxido [5]. Ο éster [2] (2,00 g, 5,98 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em metanol (70 mL) em temperatura ambiente. A esta mistura, foi adicionada lentamente uma solução de periodato de sódio (1,22 g, 5,68 mmol, 0,95 eq.) em água (12,0 mL). Após 5 minutos, a precipitação de um sólido incolor foi observada. A reação foi agitada de um dia para o outro, filtrada (lavagens com CH2Cl2:MeOH = 95:5) e concentrada in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 98:2 gradiente para 90:10) forneceu o sulfóxido [5] (1,53 g, 4,37 mmol, 73%) como um sólido incolor.

Rr(EtOAc:MeOH = 4:1) = 0,60.

RMN ¹H (DMSO-d₆, 400 MHz): δ = 7,38-7,28 (m, 5H), 6,77 (s, br, 1H), 6,66 (s, br, 1H), 5,08 (s, 2H), 4,42 (ddt, J= 8,5, 6,7, 1,7 Hz, 1H), 4,29 (mc, 1H), 3,34-3,30 (m, 1H), 2,92-2,82 (m, 2H), 2,40-2,32 (m, 2H), 1,76-1,36 (m, 6H) ppm.

RMN ¹³C (DMSO-d₆, 100 MHz): δ = 172,7, 161,2, 136,3, 128,4, 128,0, 128,0, 69,8, 65,3, 58,6, 55,7, 52,7, 33,2, 26,4, 25,0 ppm.

1.6 [0166] A partir do composto [6] para o composto [7]; vide a Fig. 2 B

[0167] Éster 2-{2-[2-(2-hidroxi-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etílico do

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79/116 ácido tolueno-4-sulfônico [7], (K. Brunner, J. Harder, T. Halbach, J. Willibald, F. Spada, F. Gnerlich, K. Sparrer, A. Beil, L. Mõckl, C. Brãuchle, K.-K. Conzelmann, T. Carell Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54(6), 1946-1949.) Tetraetilenoglicol ([6], 10,0 g, 51,5 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tetrahidrofurano seco (31 mL) sob uma atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. A esta mistura foram adicionadas trimetilamina seca (35,8 mL, 257 mmol, 5,00 eq.) e 4-dimetilaminopiridina (314 mg, 2,57 mmol, 5 mol-%). A mistura agitada foi resfriada a 0^sC e cloreto de tosila (9,82 g, 51,5 mmol, 1,00 eq.) dissolvido em tetrahidrofurano seco (20 mL) foi adicionado lentamente. A reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente, foi colocada sob agitação de um dia para o outro e subsequentemente interrompida pela adição em uma mistura agitada de CH2CI2 (200 mL) e HCI aquoso (200 mL, 1 M). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com CH2CI2 (100 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2ÔO4 e concentradas in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, n-Hex:EtOAc = 50:50 gradiente para 5:95) produziu 0 tosilato [7] (7,63 g, 21,9 mmol, 42%) como uma cera incolor.

Rr(n-Hex:EtOAc = 1:1) = 0,15.

RMN ¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 7,78 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,33 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 4,15 (dd, J= 4,8, 4,8 Hz, 2H), 3,71-3,57 (m, 14H), 2,43 (s, 3H), 2,40 (s, br, 1H) ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ= 144,9, 133,1, 129,9, 128,1,72,6, 70,8, 70,8, 70,5, 70,4, 69,4, 68,8, 61,8, 21,7 ppm.

1.7 [0168] A partir do composto [7] para 0 composto [8]; vide a Fig. 2 B

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[0169] 2-{2-[2-(2-Azido-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etanol [8]. (K.

Brunner, J. Harder, T. Halbach, J. Willibald, F. Spada, F. Gnerlich, K. Sparrer, A. Beil, L. Mõckl, C. Brãuchle, K.-K. Conzelmann, T. Carell Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54(6), 1946-1949.) Tosilato [7] (5,00 g, 14,4 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em A/,A/-dimetilformamida seca (40 mL) sob uma atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. Após a adição de azida sódica (4,67 g, 71,8 mmol, 5,00 eq.) a suspensão resultante foi aquecida até 70^sC de um dia para o outro. Subsequentemente, o solvente foi removido in vacuo e o sólido remanescente foi redissolvido em uma mistura de CH2CI2 (200 mL) e salina meio concentrada (200 mL). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi re-extraída com CH2CI2 (50 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salina meio concentrada (200 mL), secas em Na2SO4 e concentradas in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, n-Hex:EtOAc = 50:50 gradiente para 5:95) produziu azida [8] (2,57 g, 11,7 mmol, 82%) como um óleo incolor.

Rr(n-Hex:EtOAc =1:4) = 0,20.

RMN ¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 3,69 (m, 2H), 3,62 (m, 10H), 3,55 (m, 2H), 3,34 (m, 2H), 2,74 (s, br, 1H) ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ= 72,5, 70,7, 70,7, 70,3, 70,0, 61,7, 50,7 ppm.

1.8 [0170]A partir do composto [9] para 0 composto [10]; vide a Fig. 2C

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[0171] Éster 10-hidroxi-decílico do ácido tolueno-4-sulfônico [10]. (K. Brunner, J. Harder, T. Halbach, J. Willibald, F. Spada, F. Gnerlich, K. Sparrer, A. Beil, L. Mõckl, C. Brãuchle, K.-K. Conzelmann, T. Carell Tetrahedron Lett. 2009, 50(7), 759-762) 1.10-Decandiol ([9], 10,0 g, 57,4 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em tetrahidrofurano seco (200 mL) sob uma atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. A esta mistura, foram adicionadas trimetilamina seca (40,0mL, 287 mmol, 5,00 eq.) e 4dimetilaminopiridina (350 mg, 2,87 mmol, 5 mol-%). A mistura agitada foi resfriada a 0^sC e cloreto de tosila (10,9 g, 57,4mmol, 1,00 eq.) dissolvido em tetrahidrofurano seco (100 mL) foi adicionado lentamente. A reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente, foi colocada sob agitação de um dia para o outro e subsequentemente interrompida pela adição em uma mistura agitada de CH2CI2 (300 mL) e HCI aquoso (300 mL, 1 M). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com CH2CI2 (100 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2ÔO4 e concentradas in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, n-Hex:EtOAc = 80:20 gradiente para 50:50) produziu 0 tosilato [10] (9,81 g, 29,9 mmol, 52%) como um óleo incolor, que congela se armazenado a 4^SC.

Rr(n-Hex:EtOAc = 1:1) = 0,80.

RMN ¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 7,77 (me, 2H), 7,33 (me, 2H), 4,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,61 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H), 1,65-1,50 (m, 5H), 1,35-1,18 (m, 12H) ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ= 144,7, 133,3, 129,9, 128,0, 70,8, 63,1,32,8, 29,5, 29,4, 29,4, 29,0, 28,9, 25,8, 25,4, 21,7 ppm.

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1.9 [0172] A partir do composto [10] para o composto [11]; vide a Fig. 2 C

[0173] 10-Azido-decan-1-ol [11]. (N. Ardes-Guisot, D. S. Alonzi, G. Reinkensmeier, T. D. Butters, C. Norez, F. Becq, Y. Shimada, S. Nakagawa, A. Kato, Y. Blériot, M. Sollogoub, B. Vauzeilles Org. Biomol. Chem. 2011, 9(15), 5373-5388.) Tosilato [10] (9,50 g, 28,9 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em N,Ndimetilformamida seca (50 mL) sob uma atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. Após a adição de azida sódica (5,64 g, 86,8 mmol, 3,00 eq.) a suspensão resultante foi aquecida até 75^SC por 8 horas. Subsequentemente, o solvente foi removido in vacuo e o sólido remanescente foi redissolvido em uma mistura de CH2CI2 (200 mL) e salina meio concentrada (200 mL). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi re-extraída com CH2CI2 (50 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salina meio concentrada (200 mL), secas em Na2SO4 e concentradas in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna flash (silica, n-Hex:EtOAc = 90:10 gradiente para 60:40) produziu azida [11] (5,30 g, 26,6 mmol, 93%) como um óleo incolor.

Rr(n-Hex:EtOAc = 3:2) = 0,80.

RMN¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 3,61 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,24 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 1,62-1,51 (m, 5H), 1,38-1,26 (m, 12H) ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ = 63,1, 51,6, 32,9, 29,6, 29,5, 29,5,

29,2, 28,9, 26,8, 25,8 ppm.

1.10 [0174] A partir do composto [11] para 0 composto [12]; vide a Fig. 2 C

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[0175] Éster 10-azido-decílico do ácido metanosulfônico [12].

A azida [11] (2,00 g, 10,0 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvida em diclorometano seco (15 mL) sob uma atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. Após a adição de trietilamina (4,20 mL, 30,0 mmol, 3,00 eq.) a mistura agitada foi resfriada a 0^QC e cloreto de mesila (1,55 mL, 20,0 mmol, 2,00 eq.) foi adicionado gota a gota durante 10 minutos. A reação foi deixada aquecer até chegar a temperatura ambiente durante uma hora, a reação foi agitada por mais 30 minutos e subsequentemente interrompida pela adição em uma mistura agitada de CH2CI2 (200 mL) e HCI aquoso (200 mL, 1 M). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com CH2CI2 (100 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SCU e concentradas in vacuo, produzindo mesilato [12] (2,75 g, 9,91 mmol, quant.) como um óleo ligeiramente laranja, que foi usado para reação adicional sem purificação adicional.

Rr(n-Hex:EtOAc = 2:1) = 0,85.

RMN¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 4,20 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,24 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,99 (s, 3H), 1,77-1,70 (m, 2H), 1,62-1,54 (m, 2H), 1,43-1,28 (m, 12H)ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ = 70,3, 51,5, 37,4, 31,7, 29,4, 29,4,

29,2, 29,0, 28,9, 26,8, 25,5 ppm.

1.11 [0176] A partir do composto [12] para 0 composto [13]; vide a Fig. 2 C

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[0177] Éster S-(IO-azido-decil) do ácido tioacético [13]. Ο mesilato [12] (2,75 g, 9,91 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em Λ/,Λ/dimetilformamida seca (50 mL) sob uma atmosfera de gás argônio em temperatura ambiente. Tioacetato de potássio (1,14 g, 10,0 mmol, 1,00 eq.) foi adicionado ao mesmo e a suspensão resultante foi agitada em ambiete escuro durante 24 horas. Em seguida, a reação foi diluída pela adição em uma mistura de éter dietílico (200 mL) e salina meio concentrada (200 mL). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com éter dietílico (100 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SCU e concentradas in vacuo. O tioacetato bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (silica, n-Hex:EtOAc = 95:5 gradiente para 85:15) produzindo substância [13] (2,09 g, 8,12 mmol, 81%) como um óleo ligeiramente amarelo.

Rr(n-Hex:EtOAc = 3:1) = 0,95.

RMN¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 3,24 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,84 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 2,30 (s, 3H), 1,61-1,51 (m, 4H), 1,36-1,23 (m, 12H) ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ = 195,9, 51,4, 30,6, 29,5, 29,3,

29,3, 29,1,29,1,29,0, 28,8, 28,7, 26,7 ppm.

1.12 [0178] A partir do composto [13] para o composto [14]; vide a Fig. 2 C

ôX AY-CíSs C;.·: J HijUS ^s- 2S ? íásSç [0179] 10-Azido-decano-1-tiol [14], Cloreto de hidrogênio (3,53 mL) foi adicionado lentamente em metanol desgaseificado agitado (20 mL) a

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O^SC sob uma atmosfera de gás argônio. A mistura resultante foi agitada durante 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, tioacetato [13] (2,00 g, 9,29 mmol, 1,00 eq.) dissolvido em metanol desgaseificado (5 mL) foi adicionado em uma porção deste e continuamente agitado de um dia para o outro. Em seguida, a reação foi interrompida pela adição em uma mistura de éter dietílico (150 mL) e solução aquosa de NaHCOa meio saturada (150 mL). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com éter dietílico (100 mL, 2 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SCU e concentradas in vacuo. O tiol bruto foi purificado por cromatografia em coluna flash (silica, n-Hex:EtOAc = 95:5 gradiente para 85:15) produzindo a substância [14] (1,49 g, 6,92 mmol, 89%) como um óleo ligeiramente amarelo, sendo contaminado com seu respectivo dímero dissulfeto (13 mol-%).

Rr(n-Hex:EtOAc = 9:1) = 0,70.

RMN ¹H (CDCh, 400 MHz): δ = 3,25 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,51 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 1,64-1,55 (m, 4H), 1,40-1,26 (m, 12H) ppm.

RMN ¹³C (CDCh, 100 MHz): δ = 51,6, 34,1,29,5, 29,2, 29,1,29,0,

28,6, 28,5, 26,8, 24,8 ppm.

1.13 [0180] A partir do composto [5] para o composto [15]; vide a Fig. 2 D

[0181] Éster metílico do ácido 5-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(2-{2-[2-(2-Azidoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico [15]. Sulfóxido [5] (400 mg, 1,46 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em clorofórmio seco (12,8 mL) sob uma atmosfera de gás argônio e subsequentemente resfriado a -60°C.

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Após a adição de anidrido trifluoroacético (0,62 mL, 4,37 mmol, 3,00 eq.) por gotejamento, a mistura resultante foi aquecida até a temperatura ambiente durante uma hora e agitada por mais 30 minutos. Em seguida, os voláteis foram removidos in vacuo (10^-2 mbar) por pelo menos duas horas. A cera incolor resultante foi redissolvida em tetrahidrofurano seco (3 mL) sob uma atmosfera de gás argônio e álcool-azido [8] (1,60 g, 7,29 mmol, 5,00 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada durante dois dias em temperatura ambiente, concentrada in vacuo e, em seguida, submetida à cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 99:1 gradiente para 95:5). A purificação final foi conseguida por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkhW, programa gradiente padrão) produzindo a azida [15] (181 mg, 0,38 mmol, 26%) como uma cera incolor.

tR(HPLC) = 24 min.

Rr(EtOAc:MeOH = 9:1) = 0,45.

RMN ¹H (DMSO-de, 400 MHz): δ = 6,57 (s, br, 1H), 6,56 (s, br, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,29 (ddd, J = 7,6, 4,2, 1,8 Hz, 1H), 4,17 (dd, J = 7,7, 1,3 Hz, 1H), 3,73-3,68 (m, 1H), 3,61-3,48 (m, 13H) 3,40-3,32 (m, 3H), 3,32 (s, 3H), 2,30 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 1,66-1,43 (m, 4H), 1,40-1,23 (m, 2H) ppm.

RMN ¹³C (DMSO-de, 100 MHz): δ= 173,2, 162,0, 95,1, 69,8 (3C),

69,7, 69,2, 67,2, 66,3, 60,4, 52,6, 51,2, 50,0, 33,1,27,9, 27,8, 24,5 ppm.

ESI-LRMS paraCi9H₃4N₅O7S⁺[MH⁺]: calc. 476,2 encont. 476,5.

1.14 [0182] A partir do composto [15] para o composto [16]; vide a Fig. 2 D

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87/116 [0183] Ácido 5-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(2-{2-[2-(2-Azido-etoxi)-etoxi]etoxi}-etoxi)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico [16]. A azida [15] (180 mg, 0,39 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvida em metanol (3,3 mL) sob uma atmosfera de gás argônio. Uma mistura de hidróxido de lítio (181 mg, 7,57 mmol, 20,0 eq.) em água (3,3 mL) foi adicionada a mesma. A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e subsequentemente interrompida pela adição em uma mistura agitada de CH2CI2 (25 mL) e HCI aquoso (25 mL, 1 M). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com CH2CI2 (25 mL, 2 vezes) e EtOAc (25 mL, 3 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SCU e concentradas in vacuo. A purificação por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkhteO, programa gradiente padrão) produziu biotina derivativa [16] (137 mg, 0,30 mmol, 78%) como uma cera incolor.

tR(HPLC) = 20 min.

Rr(EtOAc:MeOH = 4:1) = 0,25.

RMN¹H (CD3OD, 400 MHz): δ = 4,86 (s, 1 H), 4,44 (dd, J = 7,9, 4,4 Hz, 1H), 4,40 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 3,88-3,84 (m, 1H), 3,68-3,62 (m, 12H), 3,54 (me, 1H), 3,48 (me, 1H), 3,38 (t, J= 4,7 Hz, 2H), 2,32 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 1,791,72 (m, 1H), 1,69-1,58 (m, 3H), 1,49-1,42 (m, 2H) ppm.

RMN ¹³C (CD3OD, 125 MHz): δ = 177,5, 165,4, 96,4, 71,7 (2C), 71,6, 71,5, 71,2, 71,2, 68,7, 68,5, 62,9, 54,1,51,8, 34,7, 29,7, 29,4, 26,0 ppm.

ESI-LRMS paraCi8H₃2N₅O7S⁺[MH⁺]: calc. 462,2 encont. 462,2.

1.15 [0184] A partir do composto [17] para 0 composto [18]; vide a Fig. 2 D

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Ίιζ] Μ,·. ' '^CAT-Àxl Ji ΥΑ [0185]Éster benzílico do ácido 5-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(10azido-deciloxi)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico [18]. Sulfóxido [17] foi obtido a partir do composto [4] de maneira análoga ao exibido em 1.4 para a reação a partir do composto [2] para o composto [5]. Sulfóxido [17] (200 mg, 0,57 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em clorofórmio seco (5,0 mL) sob uma atmosfera de gás argônio e foi subsequentemente resfriado a -60°C. Após a adição de anidrido trifluoroacético (0,24 mL, 1,71 mmol, 3,00 eq.) por gotejamento, a mistura resultante foi aquecida até a temperatura ambiente durante uma hora e agitada por mais 30 minutos. Em seguida, os voláteis foram removidos in vacuo (10^-2 mbar) por pelo menos duas horas. A cera incolor resultante foi redissolvida em tetrahidrofurano seco (1,5 mL) sob uma atmosfera de gás argônio e álcoolazido [11] (0,34 g, 1,71 mmol, 3,00 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada durante dois dias em temperatura ambiente, concentrada in vacuo e, em seguida, submetida à cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 98:2 gradiente para 90:10). A purificação final foi conseguida por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkhkO, programa gradiente padrão) produzindo azida [18] (50,0 mg, 0,09 mmol, 16%) como um sólido ligeiramente púrpureo. A análise por RMN ¹H demonstrou que o estereocentro da função acetal subjaz uma relação diastereomérica de 3,33:1 em favor daquele representado.

tR(HPLC) = 37,2 minutos (pico largo).

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89/116

Rr(EtOAc:MeOH = 9:1) = 0,75.

RMN ¹H (CD₃OD, 400 MHz): δ = 7,37-7,27 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,75 (s, 1H), 4,39-4,33 (m, 2H), 3,73-3,65 (m, 1H) 3,46 (ddd, J= 9,3, 6,0, 3,9 Hz, 1H), 3,29-3,24 (m, 3H), 2,34 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 1,79-1,49 (m, 8H), 1,451,27 (m, 14H) ppm.

RMN ¹³C (CD3OD, 100 MHz): δ = 175,0, 165,4, 137,7 129,6, 129,2, 129,2, 96,2, 69,5, 68,5, 67,2, 62,8, 54,1, 52,4, 34,8, 30,6, 30,6, 30,4, 30,3, 30,3, 29,9, 29,6, 29,2, 27,8, 27,3, 25,9 ppm.

ESI-LRMS paraC₂7H42N₅O4S⁺[MH⁺]: calc. 532,3 encont. 532,1.

1.16 [0186] A partir do composto [18] para 0 composto [19]; vide a Fig. 2 E

[0187] Ácido 5-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(10-Azido-deciloxi)-2-oxohexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico [19], A azida [18] (50,0 mg, 0,09 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvida em metanol (0,8 mL) sob uma atmosfera de gás argônio. Uma mistura de hidróxido de lítio (45,0 mg, 1,88 mmol, 20,0 eq.) em água (0,8 mL) foi adicionada a esta. A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para 0 outro e subsequentemente interrompida pela adição em uma mistura agitada de CH2CI2 (20 mL) e HCI aquoso (20 mL, 1 M). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com CH2CI2 (15 mL, 2 vezes) e EtOAc (15 mL, 3 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SCU e concentradas in vacuo. A purificação por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCN:H2O, programa gradiente padrão) produziu

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90/116 biotina derivativa [19] (37 mg, 0,08 mmol, 89%) como um sólido ligeiramente púrpureo. A análise por RMN ¹H demonstrou que o estereocentro da função acetal subjaz uma relação diastereomérica de 3,33:1 em favor do representado.

Ir(HPLC) = 31,1 min.

Rr(EtOAc:MeOH = 4:1) = 0,30.

RMN ¹H (CD₃OD, 400 MHz): δ = 4,74 (s, 1 H), 4,42 (dd, J = 7,8, 4,0 Hz, 1H), 4,35 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 3,74-3,66 (m, 1H), 3,55-3,47 (m, 1H), 3,293,25 (m, 3H), 2,32 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 1,79-1,51 (m, 8H), 1,48-1,32 (m, 14H) ppm.

RMN ¹³C (CD3OD, 100 MHz): δ = 177,4, 165,4, 96,2, 69,5, 68,5,

62,8, 54,1,52,5, 34,7, 30,6, 30,6, 30,4, 30,3, 30,2, 29,9, 29,7, 29,4, 27,8, 27,3, 26,0 ppm.

ESI-LRMS paraC2oH₃6N₅04S⁺[MH⁺]: calc. 442,2 encont. 442,2.

1.17 [0188] A partir do composto [18] para 0 composto [19]; vide a Fig. 2 E

[0189] Éster benzílico do ácido 5-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(10-Azidodecilsulfanil)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico [20]. O sulfóxido [17] foi obtido a partir do composto [4] de maneira análoga ao exibido em 1.4 da reação do composto [2] para 0 composto [5]. Sulfóxido [17] (200 mg, 0,57 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvido em clorofórmio seco (5,0 mL) sob uma atmosfera de gás

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91/116 argônio e subsequentemente resfriado a -60°C. Após a adição de anidrido trifluoroacético (0,24 mL, 1,71 mmol, 3,00 eq.) por gotejamento, a mistura resultante foi aquecida até a temperatura ambiente durante uma hora e agitada por mais 30 minutos. Em seguida, os voláteis foram removidos in vacuo (10^-2 mbar) por pelo menos duas horas. A cera incolor resultante foi redissolvida em tetrahidrofurano seco (1,5 mL) sob uma atmosfera de gás argônio e álcool-azido [14] (0,42 g, 1,71 mmol, 3,00 eq.) foi adicionada. A reação foi agitada durante dois dias em temperatura ambiente, concentrada in vacuo e, em seguida, submetida à cromatografia em coluna flash (silica, CH2Cl2:MeOH = 98:2 gradiente para 90:10). A purificação final foi conseguida por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkhW, programa gradiente padrão) produzindo azida [20] (74,0 mg, 0,14 mmol, 24%) como um sólido ligeiramente púrpureo. A análise por RMN ¹H demonstrou que o estereocentro da função acetal subjaz uma relação diastereomérica de 4:1 em favor daquele representado.

tR(HPLC) = 38 minutos (pico largo).

Rr(EtOAc:MeOH = 9:1) = 0,83.

RMN ¹H (CD₃OD, 400 MHz): δ = 7,36-7,28 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,41 (ddd, J = 18,3, 7,9, 4,8 Hz, 1H), 4,35-4,28 (m, 2H), 3,70-3,65 (m, 1H) 3,28-3,25 (m, 2H), 2,71 (me, 1H), 2,59 (me, 1H), 2,44-2,37 (m, 2H), 1,79-1,50 (m, 8H), 1,49-1,30 (m, 14H) ppm.

RMN ¹³C (CD3OD, 100 MHz): δ = 175,0, 165,2, 137,7, 129,6, 129,2, 129,2, 68,0, 67,2, 63,2, 62,3, 55,0, 52,4, 34,8, 33,7, 30,5, 30,2, 30,2, 30,0, 29,9, 29,9, 29,6, 28,8, 27,8, 25,9 ppm.

ESI-LRMS paraC27H42N₅O₃S2⁺[MH⁺]: calc. 548,3 encont. 548,5.

1.18 [0190] A partir do composto [18] para 0 composto [19]; vide a Fig. 2 E

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92/116

[0191 ] Ác id o 5-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(10-Azido-decilsulfanil)2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico [21]. A azida [20] (74,0 mg, 0,14 mmol, 1,00 eq.) foi dissolvida em metanol (1,2 mL) sob uma atmosfera de gás argônio. Uma mistura de hidróxido de lítio (65,0 mg, 2,70 mmol, 20,0 eq.) em água (1,2 mL) foi adicionada a esta. A reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro e subsequentemente interrompida pela adição em uma mistura agitada de CH2CI2 (20 mL) e HCI aquoso (20 mL, 1 M). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com CH2CI2 (15 mL, 2 vezes) e EtOAc (15 mL, 3 vezes). As camadas orgânicas combinadas foram secas em NazSCU e concentradas in vacuo. A purificação por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkhkO, programa gradiente padrão) produziu biotina derivativa [21] (43 mg, 0,09 mmol, 69%) como um sólido ligeiramente púrpureo. A análise por RMN ¹H demonstrou que 0 estereocentro da função acetal subjaz uma relação diastereomérica de 4:1 em favor daquele representado.

tR(HPLC) = 32,8 min.

Rr(EtOAc:MeOH = 4:1) = 0,27.

RMN ¹H (CD3OD, 400 MHz): δ = 4,46^,42 (m, 1H), 4,36^,31 (m, 2H), 3,71 (ddd, J = 8,9, 5,9, 4,5 Hz, 1H), 3,39-3,26 (m, 2H), 2,73 (mc, 1H), 2,642,57 (m, 1H), 2,34-2,29 (m, 2H), 1,82-1,55 (m, 8H), 1,49-1,33 (m, 14H) ppm.

RMN ¹³C (CD3OD, 100 MHz): δ= 177,7, 165,5, 68,2, 63,4, 62,5, 55,2, 52,6, 34,9, 33,8, 30,7, 30,7, 30,4, 30,3, 30,2, 30,1,30,0, 29,8, 29,0, 28,0, 26,1 ppm.

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93/116

ESI-LRMS paraC2oH36N₅0₃S2⁺[MH⁺]: calc. 458,2 encont. 458,4.

1.19 [0192] KLH-SXA1028-Azido-PEG4-Biotina [22], Figura 2 F

[0193] A hemocianina de molusco lapa californiana (keyhole limpet hemocyaniri)(30 mg, Sigma Aldirch # 8283) em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2, 10 mL) foi reagida com Carbonato de (1R, 8S, 9s)-biciclo[6.1,0]non-4-in-9ilmetil-succinimidila (6,6 mg, 22,6 pmol, produto n° SX-A-1028 da Synaffix). A mistura foi agitada durante 5 horas à temperatura ambiente. A ciclo-octina que não reagiu foi removida por diálise contra tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2). Azido-PEG4-Biotina [16] (3,59 mg, 7,8 pmol) foi dissolvida em DMSO e adicionada à KLH derivatizada com ciclo-octila. A mistura foi agitada durante a noite a 4^SC. A Azido-PEG4-Biotina que não reagiu foi removida por diálise contra tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2). O teor de proteína foi determinado medindo a absorbância a 280 nm.

1.20 [0194] Éster ativo [24]

[0195]Biotina derivativa [16] (40,0 mg, 86,6 pmol, 1,00 eq.) e

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94/116 alcino [23] (39,0 mg, 13,0 pmol, 1,50 eq.) foram dissolvidos em Λ/,Λ/dimetilformamida seca (5,0 ml_) sob uma atmosfera de gás argônio e agitados em temperatura ambiente durante 18 horas. A solução resultante foi concentrada in vacuo a 45^SC. A purificação por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkFkO, programa gradiente padrão) produziu éster ativo [24] (57,2 mg, 7,60 pmol, 87%) como uma espuma incolor. Vide também a Figura 2 F.

tR(HPLC) = 19,2 min.

ESI-LRMS para C33H49NeOi2S⁺ [MH⁺]: calc. 753,3 encont. 753,6.

1.20 [0196] Etapa de síntese para obter conjugado KLH

KLH-N'^Z^^>O

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95/116 [0197] O éster ativo [24] também foi utilizado para sintetizar conjugados KLH pelo seguinte procedimento: 10 mg do éster NHS sintetizado conforme descrito acima foi dissolvido em 1000 μΙ_ de DMSO e adicionado a uma solução de 100 mg de KLH (Hemocianina de molusco lapa californiana Keyhole Limpet Hemocyanin, Sigma Η 8283). O pH foi ajustado para pH = 8,3 e a solução foi colocada sob agitação de um dia para o outro. A mistura foi purificada em uma célula Amicon agitada.

1.21 [0198] Etapa de síntese para obter conjugado KLH

Conjugado KLH [28], vide também a Figura 2 H [0199]O conjugado KLH do éster NHS descrito acima pode ser

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96/116 sintetizado pelo seguinte procedimento: 10 mg do éster NHS [27] sintetizado conforme descrito acima (éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1 -ila do ácido 7-{2-[2-(2-{2-[(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-Carboxi-butil)-2-oxo-hexahidrotieno[3,4-d]imidazol-6-iloxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-heptanóico) são dissolvidos em 1000 μΙ_ de DMSO e a mistura é adicionada a uma solução de 100 mg de KLH (Hemocianina de molusco lapa californiana Keyhole Limpet Hemocyanin, Sigma Η 8283). O pH é ajustado para pH = 8,3 e a solução colocada sob agitação de um dia para o outro. A mistura é purificada em uma célula Amicon agitada.

Exemplo 2

Síntese de um reagente para seleção de anticorpos monoclonais in vitro

2.1 α

ο [0200] Ο reagente de seleção [30] foi sintetizado utilizando

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97/116 condições de reação padrão, pela reação do éster NHS [24] descrito acima comm uma amino derivativo de digoxigenina como Card-20(22)-enolida, 3-[2[[2-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]etil]amino]-2-oxoetoxi]-12,14-dihidroxi-, (3β,5β, 12β)(9CI), número de registro CAS 185523-10-8, que foi sintetizado conforme descrito no documento EP 0747447, com o éster NHS descrito acima em DMF por 2 h em temperatura ambiente. Em seguida, o solvente foi removido e o produto isolado por cromatografia HPLC preparativa. A estrutura de [30] também é mostrada na Figura 2L.

2.2

Í26j

1' '''-V ' C -O-S _Λ ; ^£V(!

Ácido 5-[(3aS,4S,6R,6aR)-6-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]etoxi}-etoxi)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]-pentanóico [0201] A biotina derivada [16] (5,00 mg, 11,4 pmol, 1,00 eq.) foi dissolvida em metanol (1,0 mL) sob uma atmosfera de gás argônio. Pd/C (17 mg, 1,50 eq., 10% em peso de Pd) foi adicionado e a suspensão resultante foi retirada e preenchida com hidrogênio por três vezes. Após agitação por 16 horas em temperatura ambiente, a reação mistura foi filtrada em Celite® (lavagens com MeOH) e concentrada in vacuo. A substância [26] (3,53 mg, 8,10 pmol, 71%) foi obtida como uma cera incolor e foi usada para reação adicional sem purificação adicional. Vide também a Figura 2 G.

RMN ¹H (CD3OD, 400 MHz, sinais característicos): δ = 3,02 (t, 2 H) ppm.

RMN ¹³C (CD3OD, 100 MHz): δ = 182,7, 165,4, 96,5, 71,6, 71,5, 71,4, 71,3, 71,2, 69,6, 68,6, 68,4, 62,8, 54,2, 38,8, 30,8, 30,1,29,4, 27,5 ppm.

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98/116

ESI-LRMS para

Ci₈H34N₃O7S⁺ [MH⁺]: ale. 36,2 cont. 36,5.

2.3

C; xíNjO/S C SçH

Mw ’“· 435.5360 Mw ~ 595.79ÕO

2,5-Dioxo-pirrolidin-1-il éster do ácido 7-{2-[2-(2-{2[(3aS,4S,6R,6aR)-4-(4-Carboxi-butil)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-

6-iloxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-etilcarbamoil}-heptanóico [0202] Amina [26] (3,53 mg, 8,10 pmol, 1,00 eq.) e reagente éster bis-hidroxisuccinimida do ácido subérico (CAS 68528-80-3) (3,73 mg, 10,1 pmol, 1,25 eq.) são dissolvidos em A/,A/-dimetilformamida seca (1,0 mL) sob uma atmosfera de gás argônio. Trietilamina (1,3 mg, 12,1 pmol, 1,50 eq.) é adicionada e a solução resultante é agitada em temperatura ambiente por 6 horas. Em seguida, a mistura é concentrada in vacuo. A purificação por HPLC (coluna de silica C-18 de fase reversa, MeCIXkFEO, programa gradiente padrão) produziu o éster ativo [27] (3,06 mg, 4,46 pmol, 55%) como uma cera incolor. Vide também a Figura 2 G.

2.4

Reagente de seleção [0203] Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-biotina [29] [0204] O éster Digoxigenina-3-CME-AMCAP-NHS (outros nomes: éster-Digoxigenina NHS, Card-20(22)-enolida, 3-[2-[[6-[(2,5-dioxo-1pirrolidinil)oxi]-6-oxohexil]amino]-2-oxoetoxi]-12,14-dihidroxi-, (3β,5β,12β)-) =

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99/116

CAS N^s. 129273-26-3 foi sintetizado conforme descrito no documento DE3836656A1, ou foi obtido como um produto comercialmente disponível (Merck-Sigma).

[0205] O éster de digoxigenina-3-CME-AMCAP-NHS é dissolvido em 3 mL de DMF e 6 pL de trimetilamina é adicionada. Em seguida, ácido 5[(3aS,4S,6R,6aR)-6-(2-{2-[2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-2-oxohexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]-pentanóico é adicionado e a mistura é agitada em temperatura ambiente por 2 h. O solvente é removido por evaporação e o produto [Fórmula do produto [29] conforme ilustrado na Figura 2 K; e edutos ilustrados na Figura 2 J] é isolado por cromatografia HPLC preparativa.

Exemplo 3

Derivatização da biotina no átomo ΝΊ e síntese de um reagente de seleção (1) FMOC-beta-alanina-cloreto ácido [0206] Em 4,7 g de FMOC-beta-alanina (IRIS, FAA1300) em um frasco sob condições secas cerca de 20 mL de cloreto de tionila foram adicionados lentamente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 50 minutos e, em seguida, aquecida até o refluxo por 10 minutos. Após o arrefecimento, a mistura foi evaporada, o resíduo foi dissolvido em tolueno absoluto por três vezes e evaporado a cada vez.

[0207] O rendimento foi de 5,1 g.

(2) FMOC-beta-alanil-biotina [0208] O ácido carboxílico de biotina foi protegido pela reação da biotina (2,48 g) com t-butilclorodifenilsilano (6,5 ml) em 15 mL de piridina seca na presença de DMAP (0,63 g) de um dia para o outro em temperatura ambiente e em uma atmosfera inerte de argônio conforme descrito por Fang e Bergstrom em Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 2, 708.

[0209] 4,9 g de FMOC-beta-alanina-cloreto ácido dissolvidos em

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100/116 mL de diclorometano foram adicionados e agitados por 3,5 h em temperatura ambiente. A mistura foi evaporada, foi adicionado DMF e a mistura foi novamente evaporada. O resíduo foi dissolvido em DMF-H2O (3:1) e 50 mmol de carbonato de potássio foram adicionados, e a mistura foi agitada por 30 minutos. Após a acidificação com ácido cítrico para um pH de 4, 0 produto foi extraído com acetato de etila e purificado por cromatografia em coluna (silica, eluente acetato de etila/metanol).

[0210] HPLC-ESI-MS: M⁺ = 538,3 Da. O rendimento foi de 1,5 g.

(3) Beta-alanil-biotina = ácido 5-[3-(3-Amino-oroDionil)-2-oxohexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-Dentanóico [0211] O grupo de proteção FMOC foi clivado pela dissolução de 1,67 g de FMOC-beta-alanil-biotina em uma mistura de 20% de piperidina em DMF (60 ml). A mistura foi evaporada e seca em vácuo. Em seguida, 0 produto foi isolado por HPLC preparativa utilizando silica de fase reversa e um gradiente de FW-acetonitrila.

[0212] HPLC-ESI-MS: M⁺ = 316,3 Da. O rendimento foi de 0,55 g.

Exemplo 4

Síntese De Reagentes Adicionais Para A Seleção De Anticorpos Monoclonais (1) Diq-3-CME-AMCAP-DADOO-biotina [0213] Éster de digoxigenina-3-CME-AMCAP-NHS (outros nomes: Éster de NHS-Digoxigenina, Card-20(22)-enolida, 3-[2-[[6-[(2,5-dioxo-1pirrolidinil)oxi]-6-oxohexil]amino]-2-oxoetoxi]-12,14-di-hidroxi-,(3p,5p, 12β)-)

CAS N^s. 129273-26-3; foi sintetizado conforme descrito no documento DE3836656A1, ou foi obtido como um produto comercialmente disponível (Merck-Sigma).

[0214] 21 mg de éster de digoxigenina-3-CME-AMCAP-NHS foram dissolvidos em 3 mL DMF e 6 pL de trimetilamina foram adicionados. Em

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101/116 seguida, 14 mg de Biotina-DADOO foram adicionados e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. O solvente foi removido por evaporação e o produto foi isolado por cromatografia de HPLC preparativa.

[0215] HPLC-ESI-MS: M⁺ = 918,7 Da. Rendimento: 23 mg.

(2) Diq-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina [0216] Beta-alanil-biotina = beta-ala-biotina = ácido 5-[3-(3-Aminopropionil)-2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il]-pentanóico foi sintetizada conforme descrito acima (Exemplo 1).

[0217] Éster de digoxigenina-3-CME-AMCAP-NHS (outros nomes: Éster de NHS-Digoxigenina, Card-20(22)-enolida, 3-[2-[[6-[(2,5-dioxo-1pirrolidinil)oxi]-6-oxohexil]amino]-2-oxoetoxi]-12,14-di-hidroxi-,(33,53,123)-) CAS N^s. 129273-26-3; foi sintetizado conforme descrito no documento DE3836656A1, ou foi obtido como um produto comercialmente disponível (Merck-Sigma).

[0218] 20 mg de éster de digoxigenina-3-CME-AMCAP-NHS foram dissolvidos em 3 mL DMF e 6 μΙ_ de trietilamina foram adicionados. Em seguida, 10,5 mg de beta-ala-biotina foram adicionados e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3,5 h. O solvente foi removido por evaporação e o produto foi isolado por cromatografia de HPLC preparativa.

[0219] HPLC-ESI-MS: M⁺ = 859,6 Da. Rendimento: 16 mg.

Exemplo 5

Imunização De Coelhos Para Geração De Anticorpos Que Se Ligam À Biotina Livre [0220] Na presente divulgação, é descrito o desenvolvimento de anticorpos com a capacidade de eliminar a biotina livre. Para este fim, geramos anticorpos que se ligam à biotina apenas se o grupo-COOH da porção ácido valérico da biotina está acessível e não é utilizada para a conjugação. Os anticorpos de acordo com a invenção não se ligam a moléculas biotiniladas, ou

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102/116 seja, conjugados com biotina convencionais nos quais a biotina está covalentemente acoplada através do átomo de carbono do grupo carboxila.

[0221] Para a geração de tais anticorpos, coelhos NZW com 12-16 semanas de idade foram imunizados com conjugado KLH-biotina (vide acima, Exemplo 2, Conjugados KLH [22], [28]). Todos os coelhos foram submetidos a imunizações repetidas. No primeiro mês, os animais foram imunizados semanalmente. A partir do segundo mês, os animais foram imunizados uma vez por mês. Para a primeira imunização, 500 pg de KLH-SXA1028-AzidoPEG4-Biotina [22] foram dissolvidos em 1 mL de NaCI a 140 mM e emulsificados em 1 mL de CFA (adjuvantes completos de Freund). Para todas as imunizações seguintes, o CFA foi substituído por IFA (adjuvantes incompletos de Freund). Os títulos séricos dos animais foram avaliados no dia 45 após o início da imunização.

Exemplo 6

Análises dos Títulos de Anticorpos Dos Animais Imunizados [0222] A configuração experimental de titulações séricas foi projetada para determinar a quantidade de anticorpos policlonais que podem discriminar entre (i) uma biotina conjugada do tipo convencional, ou seja, uma biotina que é conjugada ao veículo via átomo de carbono da função carboxila da porção ácido valérico, e (ii) um conjugado de biotina no qual a estrutura em anel está covalentemente ligada a um veículo.

[0223] São fornecidos os compostos de Fórmula III A-C (representados nas Figuras 2 K, 2 L e 3 B). Além disso, é fornecido o composto de Fórmula II (representado na Fig. 3 A).

[0224] Em todos os exemplos de realização, placas com 96 poços foram primeiro revestidas com 5 pg/mL de um anticorpo policlonal de ovelha anti-Dig (Sigma). Após uma etapa de lavagem, as placas foram bloqueadas com BSA a 5% (Roche) para reduzir os sinais de fundo. Para capturar os

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103/116 diferentes conjugados de biotina-Dig (CME-AMCAP-beta-ala-biotina (Fórmula III C) e Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-biotina (Fórmula II)) as placas revestidas com anti-Dig foram incubadas com 250 ng/mL de conjugados, em poços separados. Após uma etapa de lavagem adicional, os soros de cada camundongo foram diluídos em PBS com 1% de BSA e as diluições foram adicionadas às placas. Os soros foram testados nas diluições de 1:300, 1:900, 1:2.700, 1:8.100, 1:24.300, 1:72.900, 1:218.700 e 1:656.100. O anticorpo ligado foi detectado com um F(ab')2 de cabra anti-Fcy de coelho marcado com HRP (Dianova) e ABTS (Roche) foi usado como substrato. O título dos animais analisados foi estabelecido por redução de 50% no sinal da curva de diluição.

[0225] Como controles negativos adicionais, as placas também foram revestidas com diferentes moléculas convencionalmente biotiniladas, um conjugado peptídeo-biotina (CD68-bi), um conjugado proteína recombinantebiotina (CD4-bi) e um conjugado recombinante F(ab’)2-biotina, rK-F(ab’)2. Em um dos três controles negativos, a biotina foi acoplada ao ligante através do átomo de carbono da função carboxila da porção ácido valérico e, portanto, não deve ser detectada pelos soros policlonais. A tabela 2 mostra os resultados.

Tabela 2

Titulação dos Soros de Animais Experimentais Imunizados com o Imunógeno Biotina-KLH, em que a Biotina está Acoplada à KLH através do átomo ΝΊ

Animal	rK-F(ab)2	do An CD68-bi (peptídeo)	el Ureído. CD4-bi (proteína)	Comp. de Fórmula III	Comp. de Fórmula II
1#E40441	-	-	-	56286	816
2#E40466	-	-	-	29416	1400
3#E40444	[0226] É n	lostrado qu(	í os soros	313707 policlonais do	900 s 3 animais

imunizados se ligam apenas a Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina, que é semelhante ao imunógeno (em que um átomo do sistema de anel de biotina

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104/116 carrega uma substituição) e onde o grupo COOH da cadeia lateral do ácido valérico é acessível. Todos os reagentes de seleção nos quais a biotina está acoplada através do respectivo transportador via átomo de carbono da função carboxila da porção ácido valérico (rK-F(ab)2, CD68-bi, CD4-bi e Dig-3-CMEAMCAP-DADOO-biotina) foram detectados apenas fracamente ou não foram detectados.

Exemplo 7

Desenvolvimento de Anticorpos Monoclonais Que Se Ligam à Biotina Livre [0227] Para o desenvolvimento de anticorpos capazes de se ligar à biotina em solução (ou seja, biotina livre) e sem reatividade cruzada com alvos convencionalmente biotinilados, foi usada a clonagem de células B tal como descrito em Seeber et al. (2014), PLoS One. 4 de fevereiro de 2014, 9 (2). Para o enriquecimento de células B reativas ao antígeno, um anticorpo anti-Dig de camundongo biotinilado (Roche) foi ligado a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Miltenyi). Posteriormente, foi preparado um pool de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) dos animais imunizados e o pool foi incubado com 250 ng/mL de Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina. Após 1 h de incubação, as células foram lavadas com PBS e incubadas com as esferas magnéticas anti-Dig pré-revestidas. Para o enriquecimento de células B reativas ao antígeno foram utilizadas colunas MACS (Miltenyi). A seleção/triagem e incubação das células B foi realizada como descrito em Seeber etal. (2014), PLoS One. 4 de fevereiro de 2014; 9 (2). 24 horas antes de realizar o ensaio ELISA, para identificar clones reativos ao antígeno, adicionou-se 2 pg/mL de estreptavidina aos sobrenadantes das culturas celulares para neutralizar a biotina livre. Isto foi feito como precaução uma vez que a biotina livre do meio de cultura ou de origem celular podería bloquear a interação dos anticorpos no sobrenadante com o reagente de seleção Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina (Fórmula III C). Para o ensaio ELISA, placas com 96 poços foram revestidas com 5 pg/mL de anticorpo policlonal de

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105/116 cabra anti-lgG de coelho. Após uma etapa de lavagem, as placas foram bloqueadas com BSA a 5% para reduzir os sinais de fundo. As placas foram novamente lavadas e 30 pL das culturas de células B de coelho foram transferidas para as placas de 96 poços e incubadas durante 1 h em temperatura ambiente. Após outra etapa de lavagem, 50 ng/mL do reagente de seleção positivo, Dig-3-CME-AMCAP-beta-alabiotina, ou o reagente de seleção negativo, Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-biotina (Fórmula II), foram adicionados aos poços e incubados durante 1 h em temperatura ambiente. Para a detecção de anticorpos ligados aos reagentes de seleção, foram adicionados 3 pg/mL de um anticorpo policlonal anti-Dig de ovelha marcado com POD às placas. Após uma etapa de lavagem final, foi adicionado ABTS (Roche) como substrato para POD e os clones positivos foram identificados pela medição da OD a 405 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Resultados Do ELISA De 4 Clones Identificados Que Produzem Anticorpos Caracterizados Por Ligação Específica Ao Reagente De Seleção Positivo De Acordo Com A Fórmula III Mas Não Ao Reagente De Seleção Negativo De Acordo Com A Fórmula II.

Clone	Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina (Fórmula III)	Dig-3-CME-AMCAP-DADOO-biotina (Fórmula II)
D	3,204	0,139
K	3,189	0,027
F	3,177	0,076
G	2,841	0,068
H	3,160	0,075

Exemplo 8

Ligação de Biotina por Anticorpos Monoclonais [0228] Um ensaio competitivo ELISA foi concebido e realizado para demonstrar que os novos anticorpos desejados gerados (incluindo os representados pelos clones mostrados na Tabela 3) se ligam adicionalmente a

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106/116 biotina livre. Para isso, os anticorpos foram primeiramente clonados conforme descrito em Seeber etal. (2014), PLoS One. 4 de fevereiro de 2014; 9 (2). Para gerar sobrenadantes contendo anticorpo, as células HEK foram transitoriamente transfectadas com os plasmídeos de expressão que codificam as cadeias pesada e leve relevantes dos anticorpos antibiotina. Após 1 semana de cultura, a concentração de anticorpos antibiotina nas transfecções transitórias foi determinada e as concentrações de cada um dos clones selecionados foram ajustadas para 5 pg/mL.

[0229] Para o ensaio ELISA, placas com 96 poços foram revestidas com 5 pg/mL de anticorpo policlonal de cabra anti-lgG de coelho. Após a lavagem, as placas foram bloqueadas com BSA a 5% para reduzir os sinais de fundo. As placas foram novamente lavadas e 30 pL dos sobrenadantes de anticorpo das transfecções transitórias (5/mL) foram transferidos para cada poço das placas de 96 poços, e as placas foram incubadas durante 1 h em temperatura ambiente.

[0230] Cada um dos clones selecionados foi adicionado a 8 diferentes poços em uma fila para realizar uma titulação de biotina.

[0231] Após a incubação, as placas foram lavadas novamente por 3 vezes para eliminar os complexos estreptavidina/biotina presentes nos sobrenadantes dos clones. Para o controle positivo, adicionou-se 50 ng/mL de reagente de seleção positivo, Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina (Fórmula III C) a um dos poços para cada anticorpo e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente.

[0232] Para testar a ligação da biotina livre foi feita uma titulação. Para isso, a biotina livre foi adicionada ao Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina em concentrações crescentes. A biotina foi adicionado a uma concentração de 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 160 ng/ml, 320 ng/mL e 640 ng/mL para uma quantidade de 50 ng/mL de Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina. Em

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107/116 seguida, as placas foram lavadas novamente e para a detecção de anticorpos ligados à Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina, 3 pg/mL de um anticorpo antiDig de ovelha policlonal marcado com POD foram adicionados às placas. Após uma etapa de lavagem final, foi adicionado ABTS (Roche) como substrato para POD e os sinais foram detectados pela medição da OD (Densidade Ótica) a 405 nm. Notavelmente, a redução do sinal foi observada como resultado do aumento dos concentrados de biotina na presença do reagente de seleção. Isto indica que a solução de biotinina livre e a Dig-3-CME-AMCAP-beta-ala-biotina estão competindo pela ligação aos anticorpos selecionados.

Exemplo 9

Neutralizando a Interferência da Biotina em um Ensaio Imunológico [0233] A amostra de controle para o ensaio Elecsys TSH, PreciControl Universal 2, é contaminada com concentrações crescentes de biotina (por exemplo, 0, 100 e 200 ng/mL de concentração final de biotina).

[0234] O reagente 2 do kit de venda Elecsys TSH contendo o anticorpo anti-TSH de detecção é utilizado em uma versão não modificada (controle), e em uma versão modificada, contendo adicionalmente 300 pg/mL de um anticorpo monoclonal antibiotina de acordo com a invenção.

[0235] O ensaio sanduíche é realizado de acordo com o protocolo de ensaio de rotina para o ensaio Elecsys TSH: Resumidamente, 50 pL de Amostra (PreciControl Universal 2 com ou sem biotina) são incubados com 60 pL de Reagente 1 do kit Elecsys TSH contendo o Anticorpo anti-TSH biotinilado e 50 pL de Reagente 2 contendo o anticorpo anti-TSH rutenilado com ou sem adição adicional de 300 pg/mL do anticorpo monoclonal anti-Biotina. Após incubação a 37^SC por 9 min, 40 pL de suspensão de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina do kit Elecsys TSH são adicionados, a reação é incubada por mais 9 minutos e finalmente a mistura de reação é aspirada na célula de medição onde as micropartículas são magneticamente capturadas na superfície do eletrodo. As

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108/116 substâncias não ligadas são então removidas com ProCell. A aplicação de uma tensão ao eletrodo induz a emissão de luz baseada em eletroquimioluminescência, a qual é medida por um fotomultiplicador.

[0236] A Tabela 4 mostra os sinais obtidos para as variantes do Reagente TSH com ou sem diferentes clones de anticorpo anti-biotina:

[0237] Utilizando o reagente de controle, a presença de 100 ou 200 ng/mL de biotina na amostra resulta em uma proeminente queda de sinal para 53% ou 16% do sinal de referência (amostra sem biotina).

[0238] Em contrapartida, na versão modificada do kit contendo o anticorpo de ligação à biotina no reagente R2, o efeito de interferência da biotina é notavelmente reduzido.

Tabela 4

Sinal E Recuperação De Sinal Da Amostra Com Diferentes Concentrações De Biotina Usando Reagente Sem Ou Com Diferentes Clones De

Anticorpos Monoclonais Antibiotina

		Sinal ECL [contagens]	Recuperação de sinal na presença de biotina
	Cone, de biotina na amostra [ng/mL]	Cone, de biotina na amostra [ng/mL]
0	100	200	0	100	200
	Controle sem anticorpo antibiotina	132610	70338	20947	100%	53%	16%
Clone de anticor po antibiotina	C	132542	120282	102562	100%	91%	77%
D	131625	126955	111922	100%	96%	85%
E	131661	127444	110127	100%	97%	84%
G	131072	127034	116162	100%	97%	89%
J	131626	123232	106335	100%	94%	81%
K	131752	127877	115760	100%	97%	88%

Exemplo 10

Seleção Cinética de Anticorpos [0239] A seleção cinética foi realizada a 37^SC em um instrumento

Biacore 4000 da GE Healthcare. O chip sensor serie S BIAcore CM5 foi

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109/116 montado dentro do instrumento e foi hidrodinamicamente endereçado e précondicionado de acordo com as instruções do fabricante. O sistema tampão do instrumento era HBS-EP (10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCI, 1 mM de EDTA e 0,05 % de p20 (p/v)). O tampão de amostra foi o sistema tampão suplementado com 1 mg/ml de CMD (carboximetildextrano, Fluka).

[0240] Um sistema de captura de anticorpo de coelho foi estabelecido no biossensor. Um anticorpo policlonal de cabra de captura antiFc de IgG de coelho GARbFcy (Código N^s: 111-005-046, lote n^s 105332, Jackson Immuno Research) foi imobilizado de acordo com as instruções do fabricante utilizando química NHS/EDC. 30 pg/mL de GARbFcy em tampão acetato de sódio a 10 mM (pH 4,5) foram pré-concentrados nos spots 1,2, 4 e 5 nas células de fluxo 1, 2, 3 e 4 e imobilizados com 10.000 RU de GARbFcy. O sensor foi subsequentemente saturado com etanolamina 1 M, pH 8,5. Os pontos (spots) 1 e 5 foram utilizados para as medidas de interação e os pontos 2 e 4 foram utilizados como referências. Cada suspensão de clone de anticorpo de coelho foi diluída 1:2 em tampão de amostra e foi injetada a uma velocidade de fluxo de 30 μΙ/min. durante 1 minuto. O nível de captura (CL) de anticorpos de coelho em unidades de resposta (RU) foi monitorado. Uma vez que o peso molecular do conjugado Dig-biotina de 0,9 kDa é muito pequeno para a faixa de sensibilidade do instrumento de seleção/triagem por SPR, 300 nM de conjugado Dig-Biotina (Dig-3-cme-Amcap-B-Ala-Biotina (BMC N^s. 15420318)) foram pré-incubados durante 2 horas à temperatura ambiente com 900 nM de <Dig>M-D.G-Fab'. O mAb <Dig>M-D.G-Fab se liga à digoxigenina com uma afinidade Kd de 5 pM. O M-D.G-Fab’ também se liga com afinidade picomolar à porção digoxigenina no Dig-biotina-conjugado e não interfere com o sistema de captura do GARbFcv. O M-D.G-Fab’ não interfere com clones de coelho antibiotina e com a d-biotina livre. Utilizando o M-D.G-Fab’ de 50 kDa, o DigBiotina-conjugado de 0,9 kDa foi carregado com uma massa adicional. Isto

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110/116 resulta em um imunocomplexo altamente estável com um peso molecular de 50,9 kDa, o qual é ótimo para a faixa de sensibilidade do instrumento de seleção SPR. O M-D.G-Fab’ é monomérico e nenhum efeito sobre a avidez do analito foi gerado nem detectável. O complexo dig-biotina-conjugado-M-D.GFab’ pré-formado foi injetado individualmente a 30 pL/min. durante 5 min. para monitorar a fase de associação com a respectiva superfie exibida de mAb de coelho antibiotina. A dissociação do conjugado a partir do clone de coelho foi monitorada durante 5 min. Após cada ciclo de determinação das taxas cinéticas, os clones de coelho foram completamente lavados do sistema de captura do biossensor por uma injeção de glicina a 10 mM, pH 2,0, durante 1 min. seguido de uma injeção de glicina 10 mM, pH 2,25, durante 2 min. a 20 pL/min.

[0241] Em uma segunda configuração de seleção, foram identificados anticorpos antibiotina de coelho que eram sensíveis à interferência da ligação da d-biotina. Uma mistura de analito foi preparada por incubação durante a noite à temperatura ambiente, consistindo em Dig-Biotinaconjugado a 300 nM, <Dig>M-D.G-Fab’ a 900 nM e d-biotina livre a 300 nM (dBiotina, CAS N^s: 58-85-5, Catalogo N^s: 47868, Supelco). A seleção cinética foi realizada como descrito anteriormente, mas com esta mistura de analito em solução. Em outro exemplo de realização, foram utilizados diferentes DigBiotina-conjugado e concentrações de <Dig>M-D.G-Fab’.

[0242] A Figura 6 explica a configuração experimental para a seleção.

[0243] Os traços cinéticos da cinética de concentração de analito único foram monitorados pelo software Biacore 4000 Evaluation. Além disso, os dados cinéticos foram interpretados por meio de caracterizações de pontos de sinalização e determinações cinéticas. Dois pontos de sinalização, o sinal gravado imediatamente antes do fim da injeção de analito, indicado como

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111/116 ligação tardia (BL - Binding Late) e o sinal gravado pouco antes do fim do tempo de dissociação, estabilidade tardia (SL - Stability Late), foram utilizados para caracterizar a estabilidade de ligação do antígeno/analito. Além disso, a constante da velocidade de dissociação Kd (1/s) foi calculada de acordo com um modelo de Langmuir e a meia-vida do complexo anticorpo/antígeno foi calculada em minutos de acordo com a Fórmula ln(2)/(60*kd). A razão molar, a estequiometria de ligação foi calculada com a fórmula: Mw (anticorpo) / Mw (antígeno) * BL (antígeno)/CL (anticorpo).

[0244] Finalmente, os traços cinéticos de cada mAb de coelho antibiotina foram sobrepostos em um gráfico de análise. Principalmente por inspeção visual destes gráficos de sobreposição, foram selecionados anticorpos que exibiram uma redução eficaz do sinal de ligação a Dig-Biotinaconjugado na presença de 300 nM de d-biotina livre. Eficaz significa mais de 90% de redução do sinal de ligação a Dig-Biotina-conjugado. Em outro exemplo de realização, foram selecionados anticorpos com redução de sinal em 80%, 70%, 60% e 50%. Os anticorpos selecionados foram transferidos para análises detalhadas de ICso.

[0245] A Figura 4 mostra de um modo exemplificativo três assinaturas de bloqueio de anticorpo medidas por seleção cinética baseada em SPR. A classe A mostra o bloqueio total de d-biotina da ligação do Dig-Biotinaconjugado. A classe B apresenta um anticorpo com sensibilidade apenas moderada para a interferência do sinal da d-biotina e a classe C não é suscetível à d-biotina.

Análises funcionais baseadas em SPR detalhadas [0246] As investigações cinéticas detalhadas foram realizadas a 37^SC em um instrumento T200 da GE Healthcare. O chip sensor serie S BIAcore CM5 foi montado dentro do instrumento e foi hidrodinamicamente endereçado e précondicionado de acordo com as instruções do fabricante. O sistema tampão do

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112/116 instrumento era HBS-EP (10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCI, 1 mM de EDTA e 0,05 % de p20 (p/v)). O tampão de amostra foi o sistema tampão suplementado com 1 mg/ml de CMD (carboximetildextrano, Fluka).

[0247] Em um exemplo de realização, um sistema de captura de anticorpo de coelho foi estabelecido no biossensor CM5. Um anticorpo policlonal de cabra de captura anti-Fc de IgG de coelho GARbFcv (Código N^s: 111-005-046, lote n^s 105332, Jackson Immuno Research) foi imobilizado de acordo com as instruções do fabricante utilizando química NHS/EDC. 30 pg/mL de GARbFcv em tampão acetato de sódio a 10 mM (pH 4,5) foram pré-concentrados nas células de fluxo 1, 2, 3 e 4 e imobilizados com 10.000 RU de GARbFcv. O sensor foi subsequentemente saturado com etanolamina 1 M, pH 8,5.

[0248] Os clones de anticorpo de coelho selecionados da etapa de seleção cinética inicial foram diluídos em tampão de amostra a 500 nM cada e foram capturados no biossensor a uma velocidade de fluxo de 5 pL/min durante 2 min, seguido por uma etapa de lavagem de 2 minutos com o sistema tampão HBS-EP concentrado 10x a 60 pL/min. O nível de captura (CL) de anticorpos de coelho em unidades de resposta (RU) foi monitorado. A maior sensibilidade do instrumento T200 contornou a carga adicional de massa molecular da <Dig>M-D.G-Fab’. Uma série de analitos foi injetada a 60 pl/min. durante 5 min. de fase de associação e a fase de dissociação foi monitorada por 5 min. Primeiro, o analito Dig-Biotina-conjugado foi injetado a 300 nM omitindo a dbiotina em solução. Em seguida, concentrações crescentes de d-biotina de 4 nM, 8 nM, 15 nM, 30 nM, 90 nM e 270 nM foram adicionadas à mistura de DigBiotina-conjugado. Gráficos de sobreposição dos sensorgramas foram produzidos para analisar a supressão do sinal de ligação do Dig-Biotinaconjugado pela presença de concentrações crescentes de d-biotina. Os pontos de sinalização de ligação tardia (BL) do platô de sinal da fase de associação do analito foram traçados sobre as concentrações crescentes de d-biotina e os

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113/116 valores de IC50 da d-biotina foram determinados usando o método ponto-aponto no software Bioevaluation. Além disso, os gráficos de sobreposição do sensorgrama foram visualmente investigados quanto ao desempenho competitivo da d-biotina e uma supressão da % sinal foi estimada. Em outro exemplo de realização, a % de bloqueio de sinal foi calculado por comparação das injeções de amostra de 0 nM de biotina e 270 nM de d-biotina.

[0249] A Figura 6 mostra a configuração experimental da SPR das medições de IC50. A Figura 6B mostra o exemplo de realização preferido.

[0250] A Figura 5 exemplar mostra um resultado deste ensaio competitivo. É mostrado o principal candidato anticorpo G. Quanto maior a concentração de d-biotina livre na amostra, menor é o sinal de ligação ao DigBiotina-conjugado e, portanto, foi estimada a suscetibilidade do anticorpo para a ligação à d-biotina. A determinação da IC50 do clone G foi IC50 = 30 nM de dbiotina.

[0251] Em outro exemplo de realização os parâmetros cinéticos ka [1/Ms], kd [1/s], t1 /2 diss, [min], Kd [M] e a estequiometria de ligação (Relação Molar (MR)) do anticorpo de ligação ao Dig-Biotina-conjugado foram determinados.

[0252] A cinética a 37^SC do clone G foi determinada como: ka = 5,8*10E5 1/Ms, kd = 2,1*10E-2 (1/s), t1/2 diss. = 1 min, MR = 1,2. A afinidade por Dig-Biotina-conjugado foi de uma Kd = 36 nM.

[0253] A cinética a 37^SC do clone A foi determinada como: ka = 1,0*10E6 1/Ms, kd = 3,0*10E-4 (1/s), t1/2 diss. = 39 min, MR = 1,5. A afinidade por Dig-Biotina-conjugado foi de uma Kd = 0,3 nM.

[0254] Em um exemplo de realização, a configuração do ensaio do instrumento T200 foi conforme descrito acima. O Dig-biotina-conjugado foi injetado em concentrações seriadas de 0 nM, 4 nM, 8 nM, 15 nM, 30 nM, 90 nM e 270 nM. Os parâmetros cinéticos foram determinados usando o software

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Biacore evaluation.

[0255] Em outro exemplo de realização os parâmetros cinéticos ka [1 /Ms], kd [1/s], t1 /2 diss, [min], Kd [M] e a estequiometria de ligação (Relação Molar (MR)) do anticorpo de ligação ao Dig-Biotina-conjugado foram determinados por uma configuração alternativa da superfície do sensor. Em um exemplo de realização, um sistema de captura de anticorpo murino foi estabelecido no biossensor CM5. Um anticorpo policlonal de coelho de captura anti-lgG de camundongo (RbAMIgG (IgG de coelho anti-lgG de camundongo), pAb<M-lgG>Rb-lgG(IS), BR-1008-38, 2017-08, GE Healthcare) foi imobilizado de acordo com as instruções do fabricante usando química NHS/EDC. 30 pg/mL de GARbFcy em tampão acetato de sódio a 10 mM (pH 5,0) foram préconcentrados nas células de fluxo 1,2, 3 e 4 e imobilizados com 10.000 RU. O sensor foi subsequentemente saturado com etanolamina 1 M, pH 8,5.

[0256] Aproximadamente 300 RU de mAb <Dig>M-19/11-lgG (Q) a 30 nM (Roche, 28.1.1999, entrada 19.5.2017, Id. 2157861) foram capturados a 10 pL/min. durante 1 min. O conjugado Dig-biotina foi injetado a 150 nM durante 2 min. a 30 pL/min. para ser estavelmente capturado pelo M-19/11 -IgG.

[0257] A Figura 6 descreve a configuração do ensaio. Este ensaio foi preferencialmente utilizado para a determinação cinética de fragmentos Fab’ antibiotina de coelho expressos de forma recombinante.

[0258] Em seguida, os anticorpos antibiotina de coelho ou seus fragmentos foram injetados em séries dependentes da concentração, conforme descrito acima, para determinar a cinética de ligação.

Exemplo 11 Experimentos ITC [0259] O objetivo dos experimentos ITC foi determinar diretamente a afinidade dos anticorpos selecionados para a biotina livre em solução e os parâmetros termodinâmicos e a estequiometria da reação de ligação.

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115/116 [0260] Todos os experimentos ITC foram conduzidos em um microcalorímetro VP-ITC (Malvern Instruments). Os experimentos foram realizados a 25^SC em tampão fosfato (fosfato de potássio a 25 mM, pH 7,4, cloreto de potássio a 150 mM). As concentrações proteicas eram de 750 pg/mL para os anticorpos monoclonais, resultando em uma concentração molar de 10 pM para os paratopos. As concentrações de biotina eram de 100 pM. As titulações foram realizadas com uma velocidade de agitação de 310 rpm e intervalos de tempo de 200 segundos entre injeções de 10 pL. A primeira injeção para cada amostra foi excluída do ajuste de dados. Os dados experimentais foram ajustados a uma curva teórica utilizando o pacote de software NanoAnalyze Data Analysis (versão 3.6.0), para se obter os valores para a Kd (constante de dissociação em Μ), n (estequiometria de ligação) e ΔΗ (a alteração na entalpia em kcal/mol). Os parâmetros termodinâmicos (AG e AS) foram calculados a partir da Kd e AH usando a equação:

AG = RTIn(Kd) = AH -TAS onde R é a constante universal de gás, T é a temperatura e AG,

AH e AS são as mudanças na energia livre de Gibbs, entalpia e entropia.

Anticorpo monoclonal	Kd	n	ΔΗ	AG	-TAS
	nM		kcal/mol	kcal/mol	kcal/mol
N	5,5	1,09	-13	-11,3	2
M	10,5	0,92	-21	-10,9	10
L	4,4	1,07	-17	-11,4	5
J	1,6	1,03	-20	-12,0	8
K	0,7	1,00	-16	-12,5	3
G	1,0	1,04	-15	-12,3	3
F	1,0	1,00	-20	-12,3	8

Exemplo 12 Purificação de Fragmentos Fab A Partir Da Fermentação De Células Procarióticas [0261] Os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados e recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. As

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116/116 células podem ser coletadas por centrifugação ou filtração. Após a resuspensão da biomassa em um tampão adequado com um pH entre 2,0 e 8,0 ou utilizando o caldo de fermentação completo, as células são lisadas por métodos físicos, químicos ou enzimáticos. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou células inteiras podem ser removidos por meio da centrifugação ou filtragem. A purificação dos polipeptídeos pode envolver diversas etapas de precipitação e fracionamento em cromatografia de troca catiônica, aniônica, de interação hidrofóbica, de modo misto, de afinidade ou por cromatografia de gel de filtração. Para a remoção de quantidades vestigiais de biotina ligada, pode ser necessário um tratamento da solução de polipeptídeo com um agente de ligação, por exemplo, a estreptavidina. Para a formulação final da diálise do polipeptídeo, podem ser realizadas etapas de ultrafiltração ou ultradiálise. O polipeptídeo pode ser armazenado como líquido, como um líquido congelado ou como um sólido seco por congelamento ou liofilização.

Claims (14)

1. Reivindicações

   1. ANTICORPO MONOCLONAL, que se liga especificamente ao composto de Fórmula I,

   COOH (Fórmula I) caracterizado por também se ligar à biotina, em que:

   Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2,

   X é selecionado a partir de (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)p-O]k -(CH2)m, com p ser 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)t-CONH]s -(CH2)t, com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5;

   e;

   R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH,

   H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida, e Z, em que;

   Z é A ou B;

   em que A é M-L; e em que B é;

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2. 2/8

   

   com Μ sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.

   2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por não se ligar a um composto de Fórmula II, também representado na Figura 3A.

   

   (Fórmula II)
3. 3. ANTICORPO MONOCLONAL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pela afinidade de ligação do anticorpo monoclonal para qualquer composto do grupo de compostos selecionados a partir da;

   Fórmula III A (= composto [29]), representado na Figura 2 K

   Fórmula III B (= composto [30]), representado na Figura 2 L; e Fórmula III C, representado na Figura 3 B;

   ser maior por um fator de pelo menos 50 do que a afinidade de ligação para 0 composto de Fórmula II.

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   3/8
4. 4. ANTICORPO MONOCLONAL, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela afinidade de ligação do anticorpo monoclonal para qualquer composto do grupo de compostos selecionados a partir da;

   Fórmula III A (= composto [29]), representado na Figura 2 K, Fórmula III B (= composto [30]), representado na Figura 2 L, e Fórmula III C, representado na Figura 3 B;

   ser superior por um fator de pelo menos 500, pelo menos 1.000, pelo menos 5.000, pelo menos 10.000, pelo menos 50.000 e pelo menos 100.000 do que a afinidade de ligação para o composto de fórmula II.
5. 5. MÉTODO PARA MEDIR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por utilizar um par de ligação de (estrept)avidina/biotina para ligar um agente de ligação analito-específico biotinilado a uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, cujo método compreende a adição à amostra de;

   a) um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4,

   b) um agente de ligação analito-específico biotinilado,

   c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina, seguido pela;

   medição do analito ligado à (estrept)avidina revestida na fase sólida e ao agente de ligação analito-específico biotinilado.
6. 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela etapa (a) da reivindicação 5 e, opcionalmente, também a etapa (b) da reivindicação 5, ser(em) realizada(s) antes da etapa (c) da reivindicação 5.
7. 7. USO DE UM ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por um par de (estrept)avidina/biotina ser utilizado para ligar um agente de ligação específico para o analito biotinilado a

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   4/8 uma fase sólida revestida com (estrept)avidina ou a uma (estrept)avidina marcada.
8. 8. KIT DE TESTE DE IMUNOENSAIO, caracterizado por compreender pelo menos;

   a) um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4,

   b) um agente de ligação analito-específico biotinilado, e

   c) uma fase sólida revestida com (estrept)avidina ou uma (estrept)avidina marcada.
9. 9. IMUNÓGENO, de Fórmula I;

   COOH (Fórmula I)

   Caracterizado pelo fato de que;

   Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2,

   X é selecionado a partir de (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)p-O]k -(CH2)m, com p ser 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)t-CONH]s -(CH2)t, com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo;

   um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5;

   e R é A ou B;

   em que A é M-L

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   5/8 com M sendo um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, e sendo preferencialmente hemocianina de molusco lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin), e L sendo um ligante conectando X e M, e em que B é;

   N-^N _x

   I ' J,

   M — L com M sendo um polipeptídeo com pelo menos 30 aminoácidos, e é preferencialmente a hemocianina de molusco lapa californiana (KLH); e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está ligado covalentemente a um grupo CH2 adjacente de X.
10. 10. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender as etapas de;

    a) imunização de um animal experimental com um imunógeno de acordo com a reivindicação 9, induzindo desse modo células B produtoras de anticorpos que se ligam ao imunógeno,

    b) obtenção de um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), por tecnologia de hibridoma ou por tecnologia de PCR de células B;

    c) seleção adicional do anticorpo da etapa (b) para ligação à biotina;

    obtendo-se assim um anticorpo de acordo com a reivindicação 1.
11. 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por na etapa (c) a seleção ser realizada em um ensaio competitivo utilizando a biotina como competidor para ligação do anticorpo a um composto de Fórmula

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    6/8

    

    em que;

    Y é selecionado a partir do grupo que consiste em O, S e CH2,

    X é selecionado a partir do grupo consistindo de;

    (CH2)n com n sendo um número inteiro de 1 a 20, [(CH2)p-O]k -(CH2)m, com p ser 2 ou 3, com m sendo 2 ou 3, e com k sendo um número inteiro de 1 a 30, e [(CH2)t-CONH]s -(CH2)t, com r sendo um número inteiro de 1 a 5, com t sendo um número inteiro de 0 a 5, e com s sendo um número inteiro de 1 a 5;

    e;

    R é selecionado a partir do grupo que consiste em H, OH, COOH, H2N, HO, um grupo azida, um grupo maleimida, e Z, em que;

    Z é A ou B;

    em que A é M-L com M sendo selecionado a partir de (i) um hapteno que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante que liga Xe M, e em que B é;

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    7/8

    

    com Μ sendo selecionado a partir de (i) um hapteno, que não contém uma porção biotina e (ii) um polipeptídeo, e L sendo um ligante, em que o átomo de nitrogênio marcado com um asterisco está covalentemente ligado a um grupo CH2 adjacente de X.
12. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por na etapa (c) a seleção ser realizada em um ensaio competitivo;

    utilizando biotina como competidor para ligação do anticorpo ao imunógeno da reivindicação 9.
13. 13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por na etapa (c) a seleção ser realizada em um ensaio competitivo utilizando a biotina como competidor para ligação do anticorpo a um composto de Fórmula III, também representado na Figura 3B;

    

    (Fórmula III)
14. 14. MÉTODO, para produzir um anticorpo de acordo com a

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    8/8 reivindicação 2, caracterizado por compreender as etapas de;

    a) imunização de um animal experimental com um imunógeno de acordo com a reivindicação 9, induzindo desse modo células B produtoras de anticorpos que se ligam ao imunógeno,

    b) obtenção de um anticorpo monoclonal que se liga ao imunógeno produzido pelas células B da etapa (a), por tecnologia de hibridoma ou por tecnologia de PCR de células B;

    c) seleção adicional do anticorpo da etapa (b) para ligação à biotina; e

    d) seleção daqueles anticorpos que não se ligam ao composto de Fórmula II,

    OH o

    '0'

    1 ^H 1

    Η I OH

    O ^HrAiH h— / r*H (Fórmula II) obtendo-se assim um anticorpo de acordo com a reivindicação 2.