JP7413624B2

JP7413624B2 - 血清ビタミンｄ代謝物の濃度の推定方法

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Publication number: JP7413624B2
Application number: JP2020124121A
Authority: JP
Inventors: 拓也串岡; 利之榊; 寛生真野
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2024-01-16
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: JP2022020884A

Description

本発明は、対象者の尿中のビタミンＤ代謝物を指標として、非侵襲的に血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法に関する。

ビタミンＤは、カルシウム恒常性や骨代謝に重要な栄養素であるとともに、免疫系、生殖、がん予防など、カルシウム代謝調節以外の生理作用にも関与することが報告されている。小児期においてビタミンＤが欠乏すると、くる病や骨軟化症を引き起こす危険性がある。また、加齢に伴うビタミンＤの欠乏は、骨粗鬆症、がん、糖尿病、動脈硬化、自己免疫疾患、さらには、アルツハイマー病やパーキンソン病等の脳疾患とも関連があると言われている。
皮膚で生合成もしくは経口摂取されたビタミンＤは、肝臓で２５－ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）に変換される。肝臓で変換された２５（ＯＨ）Ｄは、ビタミンＤ結合蛋白（ＤＢＰ）と結合して血中を循環する。２５（ＯＨ）Ｄの血中半減期は約３週間と長く安定しているため、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度はビタミンＤ充足度の指標として用いられている。

現在、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度は、液体クロマトグラフィー法、免疫測定法（例：ＣＬＥＩＡ法、ＥＣＬＩＡ法、ＣＬＩＡ法）、質量分析法（例：ＬＣ－ＭＳＭＳ）等により測定されている。
液体クロマトグラフィー法の場合、血液は夾雑物が多いため、分離条件が不適切であると血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度の濃度を過大評価してしまう可能性がある（非特許文献１）。
質量分析法の場合、血液の夾雑物がイオン増強効果やイオン抑制効果によって、血清２５（ＯＨ）Ｄ濃度の濃度を過大評価（又は過小評価）してしまう可能性がある（非特許文献２）。
免疫測定法の場合、抗原反応、洗浄、ブロッキング、１次抗体／２次抗体反応、発色などの段階的な作業が必要となり、時間が掛かるだけなく操作が煩雑である（非特許文献３）。
また、いずれの測定方法も検体は血液であるため、対象者は針を穿刺して採血若しくは指先微量採血を要する。指先微量採血は、侵襲性は少ないが、対象者は煩わしさとともに精神的ストレスと苦痛を余儀なくされるうえ、感染症の危険性を伴う等の様々な問題がある。

また、本発明者らは、発光酵素の１種であるルシフェラーゼ由来のドメインと、ビタミンＤ受容体のビタミンＤ結合ドメインとを有する融合タンパク質を含むバイオセンサーにより、ビタミンＤ、２５（ＯＨ）Ｄ等のビタミンＤ代謝物を検量できることを報告している（特許文献１、２）。

特開２０１６－１６３５５９号公報国際公開第２０１９／０８８２００号

ＥｉｓｍａｎＪｅｔａｌ．，ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｖｉｔａｍｉｎＤｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ１９７８；５２：３８８－９８ＱｉＹｅｔａｌ．，Ｏｎｔｈｅｉｓｏｂａｒｉｃｓｐａｃｅｏｆ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤｉｎｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｒｒｏｒｓａｎｄａｃｃｕｒａｃｙｉｓｓｕｅｓ．ＲａｐＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ２０１５；２９：１-９ＨｅｉｊｂｏｅｒＡＣｅｔａｌ．，Ａｃｃｕｒａｃｙｏｆ６ｒｏｕｔｉｎｅ２５－ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤａｓｓａｙｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｖｉｔａｍｉｎＤｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ２０１２；５８：５４３－８

非侵襲的な血清ビタミンＤ代謝物の濃度の推定方法を提供することを課題とする。

本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．ビタミンＤ受容体のビタミンＤ結合ドメインと、ルシフェラーゼ由来ドメインとを有する融合タンパク質を含むバイオセンサーを用いて算出した対象者の尿中ビタミンＤ代謝物濃度を指標として、血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法。
２．さらに、尿中カルシウム濃度、尿中マグネシウム濃度のいずれか、または両方を指標とすることを特徴とする１．に記載の血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法。
３．１．または２．に記載の血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法で推定された濃度から、ビタミンＤ摂取量の過不足を判定し、対象者のビタミンＤ不足量を算出し、ビタミンＤ不足量を補うための経口組成物を提供するシステム。

本発明は、尿中ビタミンＤ代謝物濃度を指標として、血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定することができ、採血が不要なため、対象者への負担を大幅に減らすことができる。尿サンプルは、店頭や自宅で採尿キットなどを用いた簡便な方法で採取することができ、採取したサンプルを郵送等することにより、対象者は病院等に行く必要がない。
バイオセンサーは、不純物が含まれていても正確にビタミンＤ代謝物の濃度を求めることができるため、尿検体の調製が容易である。また、バイオセンサーは、７．５倍程度に濃縮した尿検体を用いることができるため、測定誤差を小さくすることができる。

本発明の推定方法により、ビタミンＤが不足していることが判明した対象者は、日常の食事に加えてビタミンＤを効率的に経口摂取することができるサプリメントやドリンク等の経口組成物の提供を受けることができる。さらに、対象者が経口組成物を一定期間摂取したに、再検査を気軽に行うことができ、摂取後の経過について気軽にモニタリングすることができる。

バイオセンサーを用いて算出した尿中ビタミンＤ代謝物濃度による血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定。多変量モデルによる血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定（尿中ビタミンＤ代謝物、尿中カルシウム）。多変量モデルによる血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定（尿中ビタミンＤ代謝物、尿中マグネシウム）。多変量モデルによる血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定（尿中ビタミンＤ代謝物、尿中カルシウム、尿中マグネシウム）。尿中カルシウム濃度による血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定。多変量モデルによる血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定（尿中ビタミンＤ代謝物、尿比重）。多変量モデルによる血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定（尿中ビタミンＤ代謝物、尿・尿素窒素）。バイオセンサー法による尿検体の測定（希釈直線性試験）。バイオセンサー法による尿検体の測定（添加回収試験）。ＥＬＩＳＡ法による尿検体の測定（希釈直線性試験）。

本発明は、ビタミンＤ受容体のビタミンＤ結合ドメインと、ルシフェラーゼ由来ドメインとを有する融合タンパク質を含むバイオセンサーを用いて算出した対象者の尿中のビタミンＤ代謝物濃度を指標として、非侵襲的に血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法に関する。

本発明において、尿中ビタミンＤ代謝物濃度は、ビタミンＤ受容体のビタミンＤ結合ドメインと、ルシフェラーゼ由来ドメインとを有する融合タンパク質を含むバイオセンサーを用いて算出する。この融合タンパク質は、リンカー配列、ＬＸ^１Ｘ^２ＬＬ配列（Ｘ^１は、Ｍ、Ｗ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｖ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｌ又はＨであり、Ｘ^２は、Ｎ、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｙ又はＫである）を有することもできる。このようなバイオセンサーとしては、特許文献１、２に記載のバイオセンサーを用いることができ、特許文献２に記載のバイオセンサーを用いることが好ましい。特許文献２に記載のバイオセンサーは、ビタミンＤ代謝物と結合すると発光が増加するタイプであり、迅速に高い精度でビタミンＤ代謝物の濃度を算出できる。

本発明において、「ビタミンＤ代謝物」とは、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）に対して結合性を有する物質であり、例えば、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、２５－ヒドロキシビタミンＤ３（カルシジオール）、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、３－ｅｐｉー２５－ヒドロキシビタミンＤ３、２５－ヒドロキシビタミンＤ３硫酸、２５－ヒドロキシビタミンＤ３グルクロニド、１７－ヒドロキシビタミンＤ３、２０－ヒドロキシビタミンＤ３、２２－ヒドロキシビタミンＤ３、１α，２３，２５－トリヒドロキシビタミンＤ３、２３，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、１α，２５Ｒ，ジヒドロキシビタミンＤ３－２６，２３Ｓ－ラクトン、（２３Ｓ，２５Ｒ）２５－ヒドロキシビタミンＤ３－（２６，２３）－ラクトール、カルシトロン酸、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、２０－ヒドロキシビタミンＤ２、１７，２０－ジヒドロキシビタミンＤ２、１７，２０，２４－トリヒドロキシビタミンＤ２、２５－ヒドロキシビタミンＤ２（エルカルシジオール）、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２４，２５－トリヒドロキシビタミンＤ２、１α，２４，２５，２８－テトラヒドロキシビタミンＤ２、１α，２４，２５，２６－テトラヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５，２６－トリヒドロキシ－２４－オキソービタミンＤ２、１α，２３，２５，２８－テトラヒドロキシ－２４－オキソービタミンＤ２、１α－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５，２８－トリヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５，２６－トリヒドロキシビタミンＤ２、２４－ヒドロキシビタミンＤ２、３－ｅｐｉ－２５－ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２６－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２４－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２４，２６－トリヒドロキシビタミンＤ２、２６－アルデヒドー１α，２４－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２４，ジヒドロキシ－２６－カルボキシル－ビタミンＤ２、シトクロムＰ４５０ファミリーに属するＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１１Å１及びＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素、硫酸抱合酵素によって代謝された物質からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上を組み合わせたものを挙げることができる。

本発明者らは、尿中のビタミンＤ代謝物の濃度と、血清ビタミンＤ代謝物の濃度が高い相関を有し、尿中ビタミンＤ代謝物の濃度を指標として、血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定できることを見出した。さらに、尿中ビタミンＤ代謝物濃度に加えて、尿中カルシウム濃度、尿中マグネシウム濃度のいずれか、または両方を指標とすることにより、さらに高い精度で血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定できることを見出した。

尿中のビタミンＤ代謝物の濃度、または尿中のビタミンＤ代謝物の濃度と尿中カルシウム濃度、尿中マグネシウム濃度のいずれか、または両方とから、血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法としては、回帰分析で導かれる推定式を用いることができ、この推定式は、一次式、多項式、対数式、指数式等とすることができる。一例として、下記推定式１、２が挙げられる。

（推定式１）
Ｙ＝（α１）Ｘ_ＶＤ＋（δ１）
（Ｙ＝血清ビタミンＤ代謝物ｎＭ（ＣＬＥＩＡ法）、
Ｘ_ＶＤ＝尿ビタミンＤ代謝物／クレアチニンｐＭ／ｍｇ・ｄＬ^－１（バイオセンサー法））
（α１）は、１～３が好ましく、１．５～２．５がより好ましい。（δ１）は、１０～４０が好ましく、２０～３０がより好ましい。

（推定式２）
Ｙ＝（α２）Ｘ_ＶＤ－（β２）Ｘｃａ＋（δ２）
（Ｙ＝血清ビタミンＤ代謝物ｎＭ（ＣＬＥＩＡ法）、
Ｘ_ＶＤ＝尿ビタミンＤ代謝物／クレアチニンｐＭ／ｍｇ・ｄＬ^－１（バイオセンサー法）、
Ｘｃａ＝尿カルシウム／クレアチニンｍｇ・ｄＬ^－１／ｍｇ・ｄＬ^－１）
（α２）は、１～３が好ましく、１．５～２．５がより好ましい。（β２）は、３～１５が好ましく、７～１１がより好ましい。（δ２）は３０～４５が好ましく、３３～４１がより好ましい。

（推定式３）
Ｙ＝（α３）Ｘ_ＶＤ＋（β３）Ｘｍｇ＋（δ３）
（Ｙ＝血清ビタミンＤ代謝物ｎＭ（ＣＬＥＩＡ法）
Ｘ_ＶＤ＝尿ビタミンＤ代謝物／クレアチニンｐＭ／ｍｇ・ｄＬ^－１（バイオセンサー法）
Ｘｍｇ＝尿マグネシウム／クレアチニンｍｇ・ｄＬ^－１／ｍｇ・ｄＬ^－１）
（α３）は、１～４が好ましく、２～３がより好ましい。（β３）は、１４０～１８０が好ましく、１５０～１７０がより好ましい。（δ３）は、３～１５が好ましく、７～１１がより好ましい。

（推定式４）
Ｙ＝（α４）Ｘ_ＶＤ－（β４）Ｘｃａ－（γ４）Ｘｍｇ＋（δ４）
（Ｙ＝血清ビタミンＤ代謝物ｎＭ（ＣＬＥＩＡ法）
Ｘ_ＶＤ＝尿ビタミンＤ代謝物／クレアチニンｐＭ／ｍｇ・ｄＬ^－１（バイオセンサー法）
Ｘｃａ＝尿カルシウム／クレアチニンｍｇ・ｄＬ^－１／ｍｇ・ｄＬ^－１
Ｘｍｇ＝尿マグネシウム／クレアチニンｍｇ・ｄＬ^－１／ｍｇ・ｄＬ^－１）
（α４）は、１～４が好ましく、２～３がより好ましい。（β４）は、４～１３が好ましく、６～１１がより好ましい。（γ４）は、９０～１４０が好ましく、１００～１３０がより好ましい。（δ４）は、２０～３０が好ましく、２２～２８がより好ましい。

本発明の血清ビタミンＤ代謝物の濃度の推定方法は、治療的であっても非治療的であっても使用できる。治療的とは、例えば糖尿病の方が治療経過を観察するために、医療機関での治療と併用して使用するものであり、非治療的とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

本発明において、尿を採取するタイミングとして、特に限定されるものではないが、１日の中で最初に食事を摂取するまでに採取することが好ましく、起床後すぐ（早朝）に採取する第１尿が特に好ましい。

尿中成分濃度は食事や水分摂取、発汗などの影響を受けやすく、そのときの尿量によって大きく変動するため、２４時間蓄尿を用いて測定する方法が一般的である。２４時間蓄尿は対象者の負担が大きいため、随時尿を用いて対象者の負担を軽減した測定方法もある。随時尿を用いて測定する場合、前述のとおり、尿中成分濃度は食事や水分摂取、発汗などの影響を受けやすく、尿の濃さによって成分濃度が大きく変動するため、尿の濃度を補正する必要があり、その手段として、同時に測定したクレアチニン値との比率を求めるクレアチニン補正が行われる。

本発明で用いる採尿容器は、病院や検査機関等で実施されている尿検査のために使用される尿中成分の変質を引き起こさない形状、材質であれば特に限定されず用いることができる。

本発明により推定した血清ビタミンＤ代謝物の濃度から、ビタミンＤの充足状態を、「ビタミンＤ不足・欠乏の判定指針」（一般社団法人日本内分泌学会）を参考に、血清ビタミンＤ代謝物濃度が３０ｎｇ／ｍｌ以上をビタミンＤ充足状態、血清ビタミンＤ代謝物濃度が３０ｎｇ／ｍｌ未満をビタミンＤ非充足状態、血清ビタミンＤ代謝物濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上３０ｎｇ／ｍｌ未満をビタミンＤ不足、血清ビタミンＤ代謝物濃度が２０ｎｇ／ｍｌ未満をビタミンＤ欠乏と求めることができる。
対象者のビタミンＤ充足状態を求めることにより、対象者毎にビタミンＤ活性を有する化合物の配合量を最適化した経口組成物を提供することができ、対象者は１日に必要とするビタミンＤ化合物を摂取することができる。

本発明で提供する経口組成物は、医薬品（医薬部外品を含む）や、栄養補助食品、栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品、病者用食品等の機能性食品、一般的な食品、食品添加剤として用いることができる。継続的な摂取が行いやすいように、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、チュアブル錠、口腔内崩壊錠、ドリンク剤、ゼリー状の形態を有することが好ましい。棒状、板状、グミ状に加工した食品や、一般的な食品形態に添加したものであってもよい。中でも錠剤、カプセル剤の形態が、摂取の簡便さの点からとくに好ましい。このような剤形を有する製剤は、慣用法によって調整することができ、ビタミンＤの放出性を制御した、速放性、徐放性の製剤であってもよい。

本発明の経口組成物に配合するビタミンＤ活性を有する化合物としては、当技術分野で知られているビタミンＤ３類似体やビタミンＤ２類似体等を用いることができ、限定されるものではないが、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、２５－ヒドロキシビタミンＤ２（エルカルシジオール）、２５－ヒドロキシビタミンＤ３（カルシジオール）、１α，２４－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２－ジヒドロキシビタミンＤ４、１α，２４－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール）、１αヒドロキシビタミンＤ２（ドキセルカルシフェロール）、１αヒドロキシビタミンＤ３（カルシドール）、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ４及び１α，２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ２、セオカルシトール、カルシポトリオール、２２－オキサカルシトリオール（マキサカルシトール）からなる群から選ばれる少なくとも１種又は２種以上を組み合わせたものを挙げることができる。

本発明で提供する経口組成物は、ビタミンＤ活性を有する化合物以外にも、ビタミンＤ活性を有する化合物の生体利用率を高めるための補助成分を配合することができ、例えば、他のビタミン、カルシウム等のミネラル、アミノ酸、魚油といった栄養素を配合することができる。また、ビタミンＤ活性を有する化合物の生体利用率を高めるための製剤的加工を加えることができる。

（臨床試験プロトコール内容）
年齢が２０歳以上６５歳未満の健康な男女を被験者として臨床試験を実施した。
以下の除外規準に抵触しない２３名を最終解析対象とした。
・消化器疾患、腎疾患、肝機能疾患を有する者
・同意取得時から検査終了まで服薬の予定がある者
・妊娠、授乳中の者
・習慣的に喫煙をしている者
・検査日に月経の者
・その他試験責任者による本試験への参加が適切でないと判断された者
本臨床試験は倫理的配慮として、倫理的、科学的及び医学的妥当性の観点からファンケル臨床研究倫理審査委員会に当該試験を行うことの適否についての審査を受け、最新の「ヘルシンキ宣言に基づく倫理原則」及び「人を対象とする医学系試験に関する倫理指針（文部科学省・厚生労働省）」に則り、試験計画書を遵守して実施した。
本臨床試験の実施に際しては、事前に被験者全員に試験の主旨を十分に説明したうえで、本人の自由意思で書面による参加の同意を得た。

本臨床試験は、オープン試験として行い、被験者から早朝第一尿の採尿及び早朝空腹時の採血を実施した。
血液は肘窩静脈から血清分離剤入り採血管で採取した。採取した血液は、よく混和した後に３０分から１時間静置し血餅を確認後、３０００ｒｐｍ、１０分の条件下で遠心分離することで血清成分を分離した。溶血の有無を目視で確認し、溶血の有無を症例報告書に記載した。分離した血清成分を測定まで－８０℃で保存した。
尿は、採尿ボトルを被験者に渡し、部分尿を採取した。

・血清ビタミンＤ代謝物の測定（化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法））
分離した血清成分を用いてＣＬＥＩＡ法により、血清ビタミンＤ代謝物の測定を行った。ＣＬＥＩＡ法は、臨床検査受託機関（株式会社ＬＳＩメディエンス）に依頼し、測定した。

・尿カルシウム、尿マグネシウム、尿比重、尿・尿素窒素、尿クレアチニンの測定
臨床検査受託機関（株式会社ＬＳＩメディエンス）に依頼し、測定を行った。なお、本発明においては、尿中ビタミンＤ代謝物の濃度はクレアチニン濃度で除した値を用いた。

・ビタミンＤ代謝物の測定（バイオセンサー法）
バイオセンサー法を用いて、血清ビタミンＤ代謝物及び、尿中ビタミンＤ代謝物を測定した。

（血清検体調製）
血清５０μＬに対して５倍量のアセトニトリルを添加し、１分間ボルテックスミキサーを用いて混合後、１５００×ｇ、１０分、４℃の条件で遠心分離する事で夾雑物を除去し、上澄み液を１００μＬ回収した。
回収検体に、２５％のアセトニトリルを含む酢酸バッファー（ｐＨ５．０）を添加し、アセトニトリル濃度が３０％となるように調整後、ＯａｓｉｓＰｒｉｍｅＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出を行った。ＯａｓｉｓＰｒｉｍｅＨＬＢは、酢酸エチル２ｍＬ、メタノール２ｍＬ、超純水２ｍＬの順で平衡化後、検体をロードした。その後、超純水２ｍＬ、６０％メタノール２ｍＬ、ヘキサン１ｍＬの順で洗浄を行い、酢酸エチル２ｍＬで溶出させ、溶出液を回収した。溶出液は遠心エバポレーターを用いて乾固させた後に、エタノールを１５０μＬ添加した。

（尿検体調製）
尿５００μＬに対して、β－グルクロニダーゼ溶液を等量加えて転倒混和した後に、３７℃で２時間保温した。β－グルクロニダーゼ溶液は、β－グルクロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように溶解して作製した。β－グルクロニダーゼ処理を行った尿に対して２倍量のアセトニトリルを添加し、１分間ボルテックスミキサーを用いて混合後、１５００×ｇ、１０分、４℃の条件で遠心分離する事で夾雑物を除去し、上澄み液を回収した。
回収検体に超純水を添加し、アセトニトリル濃度が３０％となるように調整後、ＯａｓｉｓＰｒｉｍｅＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出を行った。ＯａｓｉｓＰｒｉｍｅＨＬＢは、酢酸エチル２ｍＬ、メタノール２ｍＬ、超純水２ｍＬの順で平衡化後、検体をロードした。その後、超純水２ｍＬ、６０％メタノール２ｍＬ、ヘキサン１ｍＬの順で洗浄を行い、酢酸エチル２ｍＬで溶出させ、溶出液を回収した。溶出液は遠心エバポレーターを用いて乾固させた後に、エタノールを１００μＬ添加した。

（バイオセンサー法による測定条件）
２５（ＯＨ）Ｄ_３標準品（フナコシ社製）を２．５ｍＭとなるようエタノールにて調整後、０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０ｎＭとなるようエタノールにて適宜希釈し、標準溶液とした。
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ、富士フイルム和光純薬社製）を超純水で溶解し、塩酸（ＨＣｌ、富士フイルム和光純薬社製）でｐＨが７．４になるように調整した後に、１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を作製し、これを超純水で希釈し、２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を作製した。
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、富士フイルム和光純薬社製）を超純水で溶解し、２．５ＭＮａＣｌ溶液を作製した。
ジチオスレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社製）を超純水で溶解し、１ＭＤＴＴ溶液を作製した。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製）５００ｍｇを超純水で溶解し、１００ｍｇ／ｍＬＢＳＡ溶液を作製した後に、０．２２μｍフィルターでろ過を行った。これを、２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液で希釈し、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ溶液を作製した。

バイオセンサータンパク質は、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ溶液で１００倍に希釈した。
バイオセンサー反応液の組成は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び、ＮａＣｌ、ＤＴＴ、ＢＳＡの各々の終濃度が、２５ｍＭ及び、６２．５ｍＭ、１．２５ｍＭ、０．１２５ｍＭとなるように調製した。

白色９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ／ＬｕｍｉＮｕｎｃ９６－ＷｅｌｌＰｌａｔｅｓ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて発光測定を行った。
１ウェル毎に、バイオセンサー反応液を７５μＬ、バイオセンサータンパク質を各２μＬ（ｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＬＢＤ（ＶＤＲ１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉｔ－ｔａｇ－ＮｏｔＩ及び、ｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉｔ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮｔａｇ－ＮｏｔＩ）、標準溶液または試料溶液を１μＬ添加した後に、室温で３０分間インキュベーションして、バイオセンサータンパク質とリガンド物質を反応させた。
その後、発光基質溶液（Ｎａｎｏ－ＧｌｏＬｉｖｅＣｅｌｌＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μＬ添加し、室温で１５分間インキュベーションした後に、マイクロプレートリーダー（ＩｎｆｉｎｉｔｅＭＰｌｅｘ、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて発光強度を測定した。
試料溶液の濃度は、標準溶液から算出した回帰式に発光強度を代入し、希釈倍率を乗ずることで算出した。

（ＬｇＢｉＴ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮおよびＬＢＤ－ＳｍＢｉＴバイオセンサータンパク質の作製方法）
実施例で使用したバイオセンサータンパク質の作製方法について以下に詳細に記載する。なお、ＬｇＢｉＴ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮおよびＬＢＤ－ＳｍＢｉＴの内、ルシフェラーゼドメインは、ＬｇＢｉＴとＳｍＢｉｔであり、ビタミンＤ結合ドメインは、ＬＢＤである。ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮは、２つのドメイン以外の配列を意味する。

ｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＬＢＤ（ＶＤＲ１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉｔ－ｔａｇ－ＮｏｔＩ及びｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉｔ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮｔａｇ－ＮｏｔＩバイオセンサーを発現させるためのベクターの作製

製造１：ヒトＶＤＲ（ｈＶＤＲ）遺伝子のクローニング
ヒト急性単球性白血病由来のＴＨＰ－１細胞からｔＲＮＡを抽出し、逆転写して合成したｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１および２（配列番号１および２）を用い、ＰＣＲによってヒトＶＤＲを増幅した。ＰＣＲは、反応１（９４℃ ２分後、９８℃ １０秒、５６℃ ３０秒、６８℃ １分、３０サイクル；鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、ＭｇＳＯ_４１．５ｍＭ、ｄＮＴＰｓ０．２ｍＭ、ＫＯＤ－ｐｌｕｓｎｅｏ－ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）０．２Ｕ、１０ｘＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤｐｌｕｓｎｅｏ）、プライマー各０．３μＭ、最終液量１０μＬの条件で行った。
ＰＣＲ産物１μＬを１％アガロースゲルにより電気泳動した結果、目的の位置（約１．３ｋｂ）に特異的な増幅が認められた（以下、１％アガロースゲルでの電気泳動は、単に電気泳動と略称する）。

電気泳動による目的断片の増幅確認後、ＺｅｒｏｂｌｕｎｔＴＯＰＯＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取り扱い説明書に従い、ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローニングし、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＳＴ０８株を形質転換し、カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地（ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。
得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、２ｍＬのＬＢ液体培地（カナマイシン３０μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪培養を行った。その後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミド濃度を２６０ｎｍの吸光度を用いて測定し、鋳型ＤＮＡとした。サイクルシークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。配列解析の結果、ｈＶＤＲをコードする遺伝子であることが確認できた。
このプラスミドをｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ－ｈＶＤＲと命名した。

配列番号１：
５’－ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣ－３’
配列番号２：
５’－ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣ－３’

製造２：ＬｇＢｉＴおよびＳｍＢｉＴのクローニング
ｐＢｉＴ．１－Ｎ［ＴＫ／ＬｇＢｉＴ］ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を鋳型とし、プライマー３および４（配列番号３および４）を用い、ＰＣＲによってＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩを増幅した。ＰＣＲは、反応１（９４℃ ２分後、９８℃ １０秒、５６℃ ３０秒、６８℃ ２０秒、３０サイクル；鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、ＭｇＳＯ_４１．５ｍＭ、ｄＮＴＰｓ０．２ｍＭ、ＫＯＤ－ｐｌｕｓｎｅｏ－ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）０．２Ｕ、１０ｘＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤｐｌｕｓｎｅｏ）、プライマー各０．３μＭ、最終液量１０μＬの条件で行った。
ＰＣＲ産物１μＬを電気泳動した結果、目的の位置（約４００ｂｐ）に特異的な増幅が認められた。

電気泳動による目的断片の増幅確認後、ＺｅｒｏｂｌｕｎｔＴＯＰＯＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取り扱い説明書に従い、ＰＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローニングし、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＳＴ０８株を形質転換し、カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地（ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に塗布した。
得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、２ｍＬのＬＢ液体培地（カナマイシン３０μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間振盪培養を行った。その後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミド濃度を２６０ｎｍの吸光度を用いて測定し、鋳型ＤＮＡとした。サイクルシークエンス反応は、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。配列解析の結果、ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩをコードする遺伝子であることが確認できた。
このプラスミドをｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩと命名した。

次に、プライマー５と６（配列番号５と６）各１０μＭ、１０×ＰＮＫｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭＡＴＰ、１ＵＴ４ＰＮＫを混合し、３７℃で１時間半反応後、９５℃ １０分、７５℃ １０分後、３７℃まで温度を低下させて、ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩをコードする２本鎖断片を作製した。なお、ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩをコードする２本鎖断片の作製に必要なプライマー５と６（配列番号５と６）は、Ｐｒｏｍｅｇａ社の許可を得て作製した。

配列番号３：
５’－ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＣ－３’
配列番号４：
５’－ＡＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴＧＧＴＴＡＣＴＣＧＧＡＡＣＡＧ－３’
配列番号５：
５’－ＧＡＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＴＧＴＡＧＣ－３’
配列番号６：
５’－ＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧ－３’

製造３：ｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩおよびｐＩＲＥＳ２－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩｖｅｃｔｏｒの作製
製造２で作製したｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩｖｅｃｔｏｒを、制限酵素ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで処理後、得られたＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩ断片を、ｐＩＲＥＳ２－ＡｃＧＦＰｖｅｃｔｏｒのＸｈｏＩ／ＳａｌＩサイトに組み込んだ。
得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩと命名した。
同様にして、製造２で作製したＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩの２本鎖断片を、ｐＩＲＥＳ２－ＡｃＧＦＰｖｅｃｔｏｒのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩサイトに組み込んだ。
得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩｖｅｃｔｏｒと命名した。

製造４：ｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩおよびｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬＢＤ（１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩｖｅｃｔｏｒの作製
製造１で作製した、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯ－ｈＶＤＲを鋳型とし、プライマー７および８（配列番号７および８）を用い、ＰＣＲによってＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬＢＤ（１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩを増幅した。ＰＣＲは、反応１（９４℃ ２分後、９８℃ １０秒、５６℃ ３０秒、６８℃ ４０秒、３０サイクル；鋳型ＤＮＡ１０ｎｇ、ＭｇＳＯ_４１．５ｍＭ、ｄＮＴＰｓ０．２ｍＭ、ＫＯＤ－ｐｌｕｓｎｅｏ－ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）０．２Ｕ、１０ｘＰＣＲＢｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤｐｌｕｓｎｅｏ）、プライマー各０．３μＭ、最終液量１０μＬの条件で行った。
ＰＣＲ産物１μＬを電気泳動した結果、目的の位置（約１０００ｂｐ）に特異的な増幅が認められた。

ＰＣＲ産物は、制限酵素ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで処理し、電気泳動後に目的のＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
プライマー９と１０（配列番号９と１０）各１０μＭ、１０×ＰＮＫｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭＡＴＰ、１ＵＴ４ＰＮＫを混合し、３７℃で１時間半反応後、９５℃ １０分、７５℃ １０分後、３７℃まで温度を低下させて、ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩをコードする２本鎖断片を作製した。
これらをインサート断片とした。

製造３で作製したｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩのＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトに、上述のインサート断片（ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩ）を組み込んだ。
得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩと命名した。
同様に、製造３で作製したｐＩＲＥＳ２－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩｖｅｃｔｏｒのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに、上述のインサート断片（ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬＢＤ（１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ）を組み込んだ。
得られたプラスミドＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬＢＤ（１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩｖｅｃｔｏｒと命名した。

配列番号７：
５’－ＡＴＣＴＣＧＡＧａｔｇＣＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧ－３’
配列番号８：
５’－ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＧ－３’
配列番号９：
５’－ＴＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＣＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＡＧＣ－３’
配列番号１０：
５’－ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＴＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＧＧＴＧＧＴＴＧ－３’

製造５：大腸菌でバイオセンサータンパク質を発現させるためのベクター作製
プライマー１１および１２（配列番号１１および１２）各１０μＭ、１０×ＰＮＫｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭＡＴＰ、１ＵＴ４ＰＮＫを混合し、３７℃で１時間半反応後、９５℃ １０分、７５℃ １０分後、３７℃まで温度を低下させて２本鎖断片を作製した。ｐＥＴ－１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）ベクターのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに、得られた２本鎖断片を組み込み、得られたプラスミドＤＮＡをｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓベクターと命名した。
次に、プライマー１３および１４（配列番号１３および１４）各１０μＭ、１０×ＰＮＫｂｕｆｆｅｒ、１ｍＭＡＴＰ、１ＵＴ４ＰＮＫを混合し、３７℃で１時間半反応後、９５℃ １０分、７５℃ １０分後、３７℃まで温度を低下させて２本鎖断片を作製した。前述のｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×ＨｉｓベクターにＮｏｔＩサイトを挿入するために、得られた２本鎖断片をｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×ＨｉｓベクターのＸｈｏＩサイトに組み込み、ｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩベクターを作製した。

配列番号１１：
５’－ＣＡＴＧＣＧＣＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴ－３’
配列番号１２：
５’－ＧＡＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＣＧＣＧ－３’
配列番号１３：
５’－ＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧ－３’
配列番号１４：
５’－ＴＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣ－３’

製造６：大腸菌発現ベクターへのクローニング
製造４で作製したｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩおよびｐＩＲＥＳ２－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬＢＤ（１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩを、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで処理してインサート断片を切り出したものを、実施例５で作製したｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩベクターのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトに組み込んだ。
得られたプラスミドＤＮＡをｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉＴ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩおよびｐＥＴ－１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬＢＤ（１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉＴ－ＴＡＧ－ＮｏｔＩと命名した。

（プラスミドＤＮＡを用いたタンパク質の発現）
ｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＬＢＤ（ＶＤＲ１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉｔ－ｔａｇ－ＮｏｔＩ及びｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉｔ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮｔａｇ－ＮｏｔＩバイオセンサータンパク質の発現
ｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＬＢＤ（ＶＤＲ１２１－４２７ａａ）－ＢａｍＨＩ－ＳｍＢｉｔ－ｔａｇ－ＮｏｔＩ及びｐＥＴ１１ｄ－Ｎ－６×Ｈｉｓ－ＸｈｏＩ－ＡＴＧ－ＬｇＢｉｔ－ＳａｌＩ－ＮＨＰＭＬＭＮＬＬＫＤＮｔａｇ－ＮｏｔＩプラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質添加し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布した。
得られた大腸菌コロニーのうち数個を選択し、５ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間振とう培養を行った。
１５０μＬの大腸菌培養液は、１００ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有）に植え継いで３７℃でＯＤ_６００＝０．４まで培養し、０．１ｍＭＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ、ナカライテスク社製）を添加し、１５℃、３時間培養することでタンパク質を発現させた。

培養後、４℃、５０００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行い、菌体を回収した。
菌体は、２５ｍＭＴｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク社製）を含む溶液に懸濁後、氷上で２０秒間×７回の超音波破砕処理を行った。
その後、４℃、２００００×ｇ、３０分間の条件で遠心分離を行い、上清を回収してバイオセンサータンパク質溶液とした。

・ビタミンＤ代謝物の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法を用いて、尿中ビタミンＤ代謝物を測定した。
なお、ＥＬＩＳＡ法により尿中ビタミンＤ濃度を測定するためのキットは市販されていない。そのため、血中ビタミンＤ濃度測定用である２５（ＯＨ）ＶｉｔａｍｉｎＤＥＬＩＳＡＫｉｔ（Ｅｎｚｏ社；ＡＤＩ－９００－２１５）を用いて、尿中ビタミンＤ濃度の測定を行った。
なお、ビタミンＤ代謝物のひとつである２５（ＯＨ）Ｄ３を基準とした場合、尿中２５（ＯＨ）Ｄ３濃度は、通常数ｐｇ／ｍＬ～数十ｐｇ／ｍＬであるため、当該ＥＬＩＳＡＫｉｔの適正感度１．９８ｎｇ／ｍＬにするためには、尿を１００～１０００倍に濃縮する必要がある。ＥＬＩＳＡ法で尿中のビタミンＤ代謝物濃度を測定することは、大変な作業負荷がかかり、また、濃縮倍率が多いため測定誤差が生じやすい。具体的な測定方法を以下に示す。

（尿検体調製）
尿２０ｍＬに対して、β－グルクロニダーゼ溶液を等量加えて転倒混和した後に、３７℃で２時間保温した。
β－グルクロニダーゼ溶液は、β－グルクロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように溶解して作製した。
β－グルクロニダーゼ処理を行った尿に対して２倍量のアセトニトリルを添加し、１分間ボルテックスミキサーを用いて混合後、１５００×ｇ、１０分、４℃の条件で遠心分離する事で夾雑物を除去し、上澄み液を回収した。
回収検体に超純水を添加し、アセトニトリル濃度が３０％となるように調整後、ＯａｓｉｓＰｒｉｍｅＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出を行った。
ＯａｓｉｓＰｒｉｍｅＨＬＢは、酢酸エチル２ｍＬ、メタノール２ｍＬ、超純水２ｍＬの順で平衡化後、検体をロードした。
その後、超純水２ｍＬ、６０％メタノール２ｍＬ、ヘキサン１ｍＬの順で洗浄を行い、酢酸エチル２ｍＬで溶出させ、溶出液を回収した。
溶出液は遠心エバポレーターを用いて乾固させた後に、当該ＥＬＩＳＡＫｉｔに添付のサンプル希釈液を２００μＬ添加した。

ＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｎＢｕｆｆｅｒを、ロバ，抗ヒツジポリクローナル抗体が固相化された９６ウェルプレートに対して、１ウェルあたり９０μＬとなるよう添加した。
キットに添付の標品または、調製した尿検体を、１０μＬ／ウェルとなるよう添加し、室温で５分間インキュベーションした後に、１×２５（ＯＨ）ＶｉｔａｍｉｎＤ３Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを５０μＬ添加した。２５（ＯＨ）ＶｉｔａｍｉｎＤＡｎｔｉＢｏｄｙを、５０μＬ／ウェルとなるよう添加し、室温で６０分間インキュベーションした。
１×Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ４を、３２５μＬ／ウェルとなるよう添加し吸引する作業を３回繰り返しおこなった。ｐＮｐｐＳｕｂｓｔｒａｔｅを、２００μＬ／ウェル添加し、室温で３０分間インキュベーションした。
ＳｔｏｐＳｏｌｕｔｉｏｎを５０μＬ添加した後に、マイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ、モレキュラーデバイス社製）を用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
試料溶液の濃度は、標準溶液から算出した回帰式に吸光度を代入し、算出した。

（解析方法）
統計解析は、統計処理ソフトＪＭＰ１４（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅＪａｐａｎ社）及びＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）を用いて行い、血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定式を求めた。得られた推定式を表１に示す。

バイオセンサー法を用いて算出した尿中ビタミンＤ代謝物の濃度と、ＣＬＥＩＡ法により求めた血清ビタミンＤ代謝物の濃度との間には高い相関関係（推定式１：Ｒ２＝０．３４２７、図１）があることを確認できた。また、バイオセンサー法を用いて算出した尿中ビタミンＤ代謝物の濃度と、バイオセンサー法により求めた血清ビタミンＤ代謝物の濃度との間にも高い相関関係（Ｒ２＝０．３８１）があることを確認できた。

バイオセンサー法を用いて測定した尿中ビタミンＤ代謝物濃度と尿中カルシウム濃度とを指標として求めた血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定値（推定式２より算出）と、ＣＬＥＩＡ法により測定した血清ビタミンＤ代謝物濃度との間には高い相関関係（ｒ２＝０．５４１１、図２）があることを確認できた。

バイオセンサー法を用いて測定した尿中ビタミンＤ代謝物濃度と尿中マグネシウム濃度とを指標として求めた血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定値（推定式３より算出）と、ＣＬＥＩＡ法により測定した血清ビタミンＤ代謝物濃度との間には、高い相関関係（ｒ２＝０．４２３７、図３）があることを確認できた。

バイオセンサー法を用いて測定した尿中ビタミンＤ代謝物濃度と尿中カルシウム濃度と尿中マグネシウム濃度を指標として求めた血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定値（推定式４より算出）と、ＣＬＥＩＡ法により測定した血清ビタミンＤ代謝物濃度との間には、高い相関関係（ｒ２＝０．５８４８、図４）があることを確認できた。

比較例１

尿中カルシウム濃度と、ＣＬＥＩＡ法で測定した血清ビタミンＤ代謝物濃度との間には相関（推定式５：Ｒ２＝０．２０１３、図５）がないことが確認できた。

比較例２

バイオセンサー法を用いて測定した尿中ビタミンＤ代謝物濃度と尿比重とを指標として求めた血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定値（推定式６より算出）と、ＣＬＥＩＡ法により測定した血清ビタミンＤ代謝物濃度との間の相関関係は、指標として尿中カルシウム濃度を用いた場合の相関関係（ｒ２＝０．５４１１）よりも低い相関関係（ｒ２＝０．３５８２、図６）であることを確認できた。

比較例３

バイオセンサー法を用いて測定した尿中ビタミンＤ代謝物濃度と、尿中尿素窒素濃度とを指標として求めた血清ビタミンＤ代謝物濃度の推定値（推定式７より算出）と、ＣＬＥＩＡ法により測定した血清ビタミンＤ代謝物濃度との間の相関関係は、指標として尿中カルシウム濃度を用いた場合の相関関係（ｒ２＝０．５４１１）よりも低い相関関係（ｒ２＝０．３４２７、図７）であることを確認できた。

（添加回収試験）
尿検体に含まれる成分による干渉の有無を確認するため、添加回収試験を行った。各検体に濃度既知の２５（ＯＨ）Ｄ_３標準品（フナコシ社製）を添加した。その添加量が測定値に正しく反映されるかを確認した。添加回収率が１００％に近い程、正確に測定できることを意味する。
添加回収率（％）＝実測値÷理論値×１００
理論値：２５（ＯＨ）Ｄを添加していない検体濃度と添加した標品既知濃度を足した値

試験１（希釈直線性試験：バイオセンサー法）
尿検体は、バイオセンサー法の尿検体調製に従って固相抽出まで実施した後に、測定時の希釈倍率が７．５倍（希釈率０．１３）、１０倍（希釈率０．１）、１２．５倍（希釈率０．０８）、１５倍（希釈率０．０６７）となるようにエタノールで希釈し、バイオセンサー法の分析条件に従って測定した。結果を図８に示す。
希釈直線性の結果より、少なくとも７．５倍以上希釈することで、良好な直線性が得られた（Ｒ２＝０．９９３７）。

試験２（添加回収試験：バイオセンサー法）
尿検体は、バイオセンサー法の尿検体調製に従って固相抽出まで実施した後に、標品の既知濃度が２０ｐＭ及び２００ｐＭとなるように、尿検体に標品を添加した。
尿検体は、測定時の希釈倍率が７．５倍、１０倍、１２．５倍、１５倍となるようにエタノールで希釈し、バイオセンサー法の分析条件に従って測定した。結果を図９に示す。
添加回収試験の結果より、低濃度（２０ｐＭ）及び高濃度（２００ｐＭ）の標品を添加した時の回収率は、±１５％以内でいずれも良好であった。これらの結果より、バイオセンサー法では、尿検体に含まれる成分による干渉を受けずに高い感度でビタミンＤ代謝物を測定できることが確認できた。

試験３（希釈直線性試験：ＥＬＩＳＡ法）
尿検体は、ＥＬＩＳＡ法の尿検体調製に従って固相抽出まで実施した後に、標品の既知濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように、尿検体に標品を添加した。
濃縮倍率が１００倍～０．７８１１２５倍となるように、当該ＥＬＩＳＡＫｉｔに添付のサンプル希釈液で希釈した。結果を図１０に示す。
希釈直線性の結果より、濃縮倍率が１００倍から０．７８１１２５倍の範囲では、直線性が得られず（Ｒ２＝０．８２０５）、濃縮倍率が５０倍から０．７８１１２５倍の範囲では、ＥＬＩＳＡ法の定量下限値未満であった。
これらの結果より、ＥＬＩＳＡ法では、尿中ビタミンＤ代謝物を測定するための感度がバイオセンサー法よりも低いため尿の濃縮を行う必要があり、濃縮を行うと尿検体に含まれる成分による干渉を強く受けてしまい、尿中ビタミンＤ代謝物の濃度を測定することができないことを確認した。

Claims

ビタミンＤ受容体のビタミンＤ結合ドメインと、ルシフェラーゼ由来ドメインとを有する融合タンパク質を含むバイオセンサーを用いて算出した対象者の尿中ビタミンＤ代謝物濃度を指標として、血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法（ただし、尿中ビタミンＤ代謝物および血清ビタミンＤ代謝物は、それぞれ尿中、血清中のビタミンＤ受容体に対して結合性を有する物質を意味する。）。
さらに、尿中カルシウム濃度、尿中マグネシウム濃度のいずれか、または両方を指標とすることを特徴とする請求項１に記載の血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法。
請求項１または２に記載の血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する方法で血清ビタミンＤ代謝物の濃度を推定する手段を有し、
前記手段により推定された血清ビタミンＤ代謝物の濃度から、ビタミンＤ摂取量の過不足を判定し、対象者のビタミンＤ不足量を算出し、ビタミンＤ不足量を補うための経口組成物を提供するシステム。