ビタミンD−C22分子および抗原性化合物の化学構造を示す図である。図1(a)に非コンジュゲーション型ビタミンD−C22分子を示す。図1(b)に、一般的なビタミンD−C22抗原性化合物を表示する。図1(c)および1(d)に、ビタミンD−C22分子がリンカーによってBSAまたはKLHのいずれかにコンジュゲーションされた特異的ビタミンD−C22抗原性化合物であるD−C22ジアミノブタン−スベロイル−BSA(図1(c))およびD−C22ジアミノブタン−スベロイル−KLH(図1(d))を示す。
vit D−C22酸の化学的製造方法を示す図である。
vit D−C22酸をvitD−DAB−スベロイル−NHSまたはvitD−DAB−PEG5−NHSのいずれかに変換する化学的方法を示す図である。
タンパク質担体にvit D−C22、vitD−DAB−スベロイル−NHSまたはvitD−DAB−PEG5−NHSをコンジュゲーションするための化学反応スキームを説明する図である。
ビタミンD−DAB−PEG5−BSA−フルオレセインコンジュゲートを製造するための二段階反応を示す図である。
25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3のいずれかの存在下または不在下での、ビタミンD−C22−ジアミノブタン−スベロイルKLHと、ハイブリドーマ10H9上清からの抗体との間の結合度のグラフ表示である。
25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3のいずれかの存在下または不在下での、ビタミンD C22−ジアミノブタン−スベロイル−アルカリホスファターゼと精製10H9モノクローナル抗体との間の結合度のグラフ表示である。
ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイの模式図を示す図である。この図は、説明だけを目的とし、決して限定として見なしてはならない。
ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイの検出限界(LoD)および実効感度(functional sensitivity)(点線)を示す精度プロファイルを示す図である。
119人のドナーからセラムレッドトップ(serum red top)チューブおよびSSTチューブ中に採取された総ビタミンDレベルと、実効感度の間の相関を示す図である。
119人のドナーからセラムレッドトップチューブおよびEDTAチューブ中に採取された総ビタミンDレベルの相関を示す図である。
ADVIA Centaurと市販の総ビタミンDアッセイとの相関を示す図である。
ADVIA CentaurとLC−MS/MS総ビタミンDアッセイとの相関を示す図である。
10H9モノクローナル抗体重鎖可変領域の注釈付きの説明を提供する図である。
10H9モノクローナル抗体軽鎖可変領域の注釈付きの説明を提供する図である。
例証的態様の詳細な説明
説明の局面に関する様々な用語が、本明細書および特許請求の範囲にわたり使用される。そのような用語は、別段の指示がない限り、それらの通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書に提供される定義と一致するように解釈すべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する単数形「a」、「an」および「the」には、内容について別段のはっきりした指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば「細胞(a cell)」への参照には、2個以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
量、持続時間(temporal duration)などの測定可能な値を参照するときに、規定値から最大±20%の変動が開示の方法を行うために適するので、本明細書に使用する用語「約」は、その変動を包含することが意味される。別段の指示がない限り、明細書および特許請求の範囲に使用される成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表現する全ての数字は、全ての場合に用語「約」によって修飾されると理解されたい。したがって、特に正反対のことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得ようと努められる所望の性質に応じて変動しうる近似である。最低限でも、そして特許請求の範囲への均等論の適用を限定しようとするのではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め処理(rounding techniques)を適用することによって解釈すべきである。
本発明の広い範囲を述べている数値域および数値パラメーターは、近似であるにもかかわらず、具体例に示された数値は、できる限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、本質的に、それらの個々の試験測定から見出される標準偏差に必然的に起因するある程度の誤差を含有する。
「単離された」は、自然状態から「人工的に」変化されたことを意味する。分子または組成物が自然界に存在する場合に、それがその本来の環境から変えられるか、もしくは取り出されたならば、またはその両方ならば、それは「単離」されている。例えば、生きた植物または動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」おらず、その自然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に採用された用語として「単離されて」いる。
同意語として「核酸分子」または「核酸」と呼ばれる「ポリヌクレオチド」は、未改変のRNAもしくはDNAまたは改変されたRNAもしくはDNAでありうる任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるRNA、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子(一本鎖、またはより典型的には二本鎖、もしくは一本鎖領域と二本鎖領域との混合でありうる)が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む三本鎖領域を表す。ポリヌクレオチドという用語には、また、1個または複数の改変塩基を含有するDNAまたはRNA、および安定性または他の理由のために改変されたバックボーンを有するDNAまたはRNAが含まれる。「改変された」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの珍しい塩基が含まれる。DNAおよびRNAに多様な改変を加えることができることから、「ポリヌクレオチド」は、自然界に典型的に見出されるものに比べて化学的、酵素的または代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学形態のDNAおよびRNAを包含する。「ポリヌクレオチド」は、また、しばしばオリゴヌクレオチドとも呼ばれる相対的に短い核酸鎖を包含する。
核酸またはアミノ酸配列に関して「実質的に同じ」は、2種以上の配列の間の少なくとも65%の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、2種以上の配列の間の少なくとも70%の同一性、より好ましくは少なくとも75%の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、より好ましくは少なくとも85%の同一性、より好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも91%の同一性、より好ましくは少なくとも92%の同一性、より好ましくは少なくとも93%の同一性、より好ましくは少なくとも94%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、より好ましくは少なくとも99%以上の同一性を表す。そのような同一性は、mBLASTアルゴリズムを用いて決定することができる(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7)。
「ベクター」は、別の核酸セグメントの複製または発現をもたらすように、そのセグメントが作動可能に挿入されうるプラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルスなどのレプリコンである。
「作動可能に連結される」または「作動可能に挿入される」という用語は、コード配列の発現を可能にするように、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列に対して適切な位置の核酸分子内に置かれることを意味する。例として、プロモーターが、コード配列の転写または発現をコントロールする能力がある場合、そのプロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向でプロモーターまたは調節配列と作動可能に連結されうる。「作動可能に連結される」という用語は、時に、発現ベクター内の他の転写制御エレメント(例えばエンハンサー)の配置に適用される。
DNAなどの外因性核酸または異種核酸が細胞内部に導入されている場合、細胞は「トランスフォーメーション」されている。トランスフォーメーション性DNAは、細胞のゲノム内に組み込まれている(共有結合)場合も、または組み込まれていない場合もある。例えば、原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、トランスフォーメーション性DNAは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持することができる。真核細胞に関して、安定トランスフォーメーションされた細胞、または「安定細胞」は、真核細胞が、トランスフォーメーション性DNAを含有する娘細胞集団から構成される細胞系またはクローンを樹立する能力によって実証される。「クローン」は、単一細胞または共通祖先から有糸分裂によって得られる細胞集団である。「細胞系」は、in vitroで多世代にわたり安定成長する能力がある初代細胞のクローンである。本明細書に提供されるいくつかの実施例では、細胞は、その細胞にDNAをトランスフェクションすることによってトランスフォーメーションされる。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または改変ペプチド結合、すなわちペプチドイソスターによって相互に結合された2個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を表す。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および広くタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を表す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる20種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有しうる。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセッシングなどの自然過程、または当技術分野で周知の化学的改変技法のいずれかによって改変されたアミノ酸配列が含まれる。そのような改変は、基礎的な教科書、研究書、および研究文献に詳細に記載されている。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、ポリペプチド内の任意の場所に存在しうる。同じ種類の改変が、所与のポリペプチド内のいくつかの部位に、同じまたは多様な程度で存在しうる。また、所与のポリペプチドは、多種類の改変を含有しうる。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐している場合があり、それらが分岐を伴って、または伴わずに、環状の場合もある。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、自然翻訳後過程に起因しうるか、または合成法によって製造されうる。改変には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジル(phosphotidyl)イノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などの、タンパク質へのアミノ酸の転移RNA介在性付加、およびユビキチン化が挙げられる(例えば、Proteins - Structure and Molecular Properties,2nd Ed.,T. E. Creighton,W. H. Freeman and Company,New York,1993およびWold,F.,Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects,pgs. 1-12、出典:Posttranslational Covalent Modification of Proteins,B. C. Johnson,Ed.,Academic Press,New York,1983; Seifter et al.,Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors,Meth Enzymol (1990) 182:626-646およびRattan et al.,Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging,Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62参照)。
「生体分子」には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、単糖、多糖、およびその全てのフラグメント、アナログ、ホモログ、コンジュゲート、および誘導体が含まれる。
「発現する」および「産生する」という用語は、本明細書において同義語的に使用され、遺伝子産物の生合成を表す。これらの用語は、RNAへの遺伝子転写を包含する。これらの用語は、また、1種または複数のポリペプチドへのRNAの翻訳を包含し、さらに、全ての自然の転写後改変および翻訳後改変を包含する。抗体またはその抗原結合フラグメントの発現または産生は、細胞の細胞質でのもの、または細胞培養の成長培地などの細胞外環境内へのものでありうる。
「抗体」は、別段の記載がない限り、各アイソタイプの様々なモノマー形態およびポリマー形態を含めた全てのアイソタイプの免疫グロブリン(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD、およびIgY)を表す。
抗原結合フラグメントは、特定抗原に対して結合親和性を示しうる任意のタンパク質性構造である。いくつかの抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持する、インタクトな抗体の部分から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定抗原と結合することが知られている抗体の少なくとも1種の可変領域(重鎖もしくは軽鎖可変領域のいずれか)または1種もしくは複数のCDRを含みうる。適切な抗原結合フラグメントの例には、非限定的に、二重特異性抗体および単鎖分子、ならびにFab、F(ab’)2、Fc、Fabc、およびFv分子、単鎖(Sc)抗体、個別の抗体軽鎖、個別の抗体重鎖、抗体鎖またはCDRと他のタンパク質、タンパク質足場、または分子とのキメラ融合体、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、1本の重鎖および1本の軽鎖から成るダイマーなどが挙げられる。抗原結合フラグメントを産生するために全ての抗体アイソタイプを使用することができる。追加的に、抗原結合フラグメントは、関心が持たれる所与の抗原に対する親和性を付与する配向でポリペプチドセグメントをうまく組み入れることができる、タンパク質足場などの非抗体タンパク質性フレームワークを含みうる。抗原結合フラグメントは、リコンビナント産生させるか、またはインタクトな抗体の酵素もしくは化学切断によって産生させることができる。語句「抗体またはその抗原結合フラグメント」は、所与の抗原結合フラグメントが、その語句中で参照される抗体の1個または複数のアミノ酸セグメントを組み入れていることを意味するために使用することができる。
「抗体組成物」は、本明細書記載の少なくとも1種の薬学的に許容される担体、化学療法剤、または診断部分と一緒にされる抗体またはその結合フラグメントを表す。
「特異的結合」は、抗体または抗原結合フラグメントが、他の生体分子と結合できる親和性よりも大きな親和性で特定の生体分子と結合する能力を表す。この用語は、特定の結合相互作用が、他のそのような相互作用の全てではなく大部分よりも、相互作用要素に恵まれていることを意味する「優先的」結合の同義語として使用される。
本明細書記載の態様は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されず、もちろん変動しうる。さらに、本明細書において使用される用語は、特定の抗体または抗原結合フラグメントを説明することだけを目的とし、限定するつもりはない。
抗原性分子および抗原性化合物
本明細書において、ビタミンD由来分子と結合する能力がある抗体を発生させるために使用することができる抗原性分子が提供される。いくつかの態様では、抗原性化合物を形成させるために、抗原性分子を担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗原性分子への担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって生じうる。いくつかの態様では、抗原タンパク質は、異なるビタミンD誘導体と等しく結合する抗体を生じうる。
本明細書記載の抗原性分子は、図1(a)に示すように、未コンジュゲーション型でC22カルボキシ基を含むビタミンD炭素数22誘導体(ビタミンD−C22)の使用に基づく(Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993))。この化合物に基づく抗原性分子は、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3(これらの分子は、ビタミンD−C22分子に不在の側枝(side arm)だけが構造的に異なる)の共通部分を保持する。ビタミンD−C22、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の間の構造共通性を考えると、ビタミンD−C22に基づく抗原を使用して発生された抗体は、25−ヒドロキシビタミンD2と25−ヒドロキシビタミンD3との両方を認識することができる可能性がある。
本明細書に開示された抗原性分子は、抗原性化合物を産生させるために担体タンパク質と組み合わせることができる。担体タンパク質の使用は、抗原性分子が哺乳類での免疫応答を誘発する能力を高めるために有用でありうる。例えば、担体タンパク質は、ホストでのより長い半減期を可能にすることができ、または複数の抗原性分子を同じ担体と結合させて多価抗原性化合物を産生させることができる。いくつかの態様では、記載された抗原性分子は、タンパク質担体に直接取り付ける(affix)ことができる。例えば、ビタミンD−C22は、ウシ血清アルブミン(BSA)と直接コンジュゲーションすることができる。いくつかの態様では、多価抗原性化合物を産生させるために、複数の抗原性分子を同じ担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションされうる抗原性分子の数は、使用される担体に基づき変動する。例えば、BSAは、比較的適度な数の、おそらく約10〜約25個の抗原性分子の連結に対応し;または、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの担体は、約200〜約300個の抗原性分子に対応しうる。一態様では、約7〜約21個の抗原性分子が担体とコンジュゲーションされるように、ビタミンD−C22がBSAとコンジュゲーションされる。一態様では、約12〜約16個の抗原性分子が担体とコンジュゲーションされるように、ビタミンD−C22がBSAとコンジュゲーションされる。別のそのような態様では、約14個のビタミンD−C22分子がBSA担体とコンジュゲーションされる。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、KLH、PEG化KLH、Concholepas concholepasヘモシアニン(CCH)、カチオン化BSA、および卵白アルブミンが含まれる。いくつかの態様では、抗原性分子は、担体タンパク質上に存在するアミン基を介して担体タンパク質とコンジュゲーションされる。この性質のコンジュゲーション化学反応は、当業者に一般に公知である。
本明細書記載の抗原性化合物の別の局面は、前記担体タンパク質への前記抗原性分子の間接的コンジュゲーションを可能にする化学リンカーでありうる。化学リンカーは、アルキル、アリール、アルキルオキシ、アミド、スルホンアミドまたはカルボニルまたはペプチド基から構成されうる。タンパク質へのビタミンD誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基と、ビタミンd誘導体の反応性N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)基との間の反応によって達成することができる。リンカーの長さは、使用される担体および担体とコンジュゲーションされる抗原性分子の数に応じて変動しうる。しかし、他の態様では、BSAまたはKLHなどの多様な担体タンパク質とのコンジュゲーションのために、同じ抗原性分子を同じリンカーと共に使用することができる。いくつかの態様では、リンカーは、式
[式中、xおよびyは、独立して、約1から約12まで変動しうる]
を有する直鎖から構成される。このリンカーは、図1(b)に示される式を有する一般抗原性化合物を与える。いくつかの態様では、xは3でありえ、yは6でありうる。いくつかの態様では、xは3でありえ、yは7でありうる。いくつかの態様では、xは4でありえ、yは7でありうる。いくつかの態様では、xは5でありえ、yは7でありうる。いくつかの態様では、xは4でありえ、yは6でありうる。いくつかの態様では、xは5でありえ、yは6でありうる。いくつかの態様では、xは3でありえ、yは5でありうる。いくつかの態様では、xは4でありえ、yは5でありうる。いくつかの態様では、xは5でありえ、yは5でありうる。いくつかの態様では、xは3でありえ、yは4でありうる。いくつかの態様では、xは4でありえ、yは4でありうる。いくつかの態様では、xは5でありえ、yは4でありうる。いくつかの態様では、リンカーは、ビタミンD−C22とBSAをコンジュゲーションしてビタミンD−C22ジアミノブタン−スベロイル−BSA(vit D−C22 BSA)(図1(c))を産生させるために使用される。別の態様では、リンカーは、ビタミンD−C22とKLHコンジュゲーションしてビタミンD−C22ジアミノブタン−スベロイル−KLH(vit D−C22 KLH)(図1(d))を産生させるために使用される。
本明細書に提供される抗原性分子および抗原性化合物は、哺乳類において抗原反応性抗体を産生させるために使用することができる。抗体を産生させるために使用することができる哺乳類には、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ウサギ、ロバ、ヒトなどが挙げられる。一態様では、哺乳類はマウスである。抗原陽性血清を有する哺乳類は、抗体産生B細胞の供給源として使用することができ、そのB細胞を単離して、ハイブリドーマ細胞などの長寿命抗体産生細胞を産生させるために使用することができる。いくつかの態様では、免疫処置されたマウスから単離されたB細胞は、ビタミンD−C22またはビタミンD誘導体と結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を産生させるために使用することができる。
抗体
本明細書において、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログと優先的に結合する、単離された抗体または抗原結合フラグメントが記載される。一態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである。
5個のクラスの免疫グロブリンがあり、その際、Fc領域中の重鎖の一次構造が免疫グロブリンのクラスを決定する。具体的には、α、δ、ε、γ、およびμ鎖は、それぞれIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMアイソタイプに対応する。前記抗体または抗原結合フラグメントには、4本鎖免疫グロブリンの構造の全てのアイソタイプおよび合成マルチマーが挙げられる。前記抗体または抗原結合フラグメントには、また、一般にメンドリまたはシチメンチョウの血清およびメンドリまたはシチメンチョウの卵黄から見出されるIgYアイソタイプが挙げられる。抗体または抗原結合フラグメントは、非共有結合的に、優先的に、そして可逆的に抗原と結合する。
開示された主題の抗体または抗原結合フラグメントは、任意の種から得ることができる。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ウサギ、ロバ、ヒトなどから得ることができる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、マウスから得られる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、本明細書記載の免疫原性化合物を免疫処置されたマウスから得られる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、ビタミンD−C22 BSAを免疫処置されたマウスから得られる。いくつかの態様では、抗体は、本明細書記載の免疫原性分子または化合物を使用して産生されたモノクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、本明細書記載の免疫原性分子または化合物の任意の1種以上を免疫処置されたマウスから得ることができる。例えば、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログと優先的に結合する能力があるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ビタミンD−C22免疫原性分子または化合物を免疫処置されたマウスから得ることができる。
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、キメラでありうる。本明細書に使用される用語「キメラ」抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト哺乳類、げっ歯類、または爬虫類の抗体アミノ酸配列由来の少なくとも1種の可変ドメインの少なくともいくつかの部分を有する一方で、その抗体またはその抗原結合フラグメントの残りの部分がヒト由来である、抗体またはその抗原結合フラグメントを意味する。例えば、キメラ抗体は、ヒトFcまたは他のそのような構造ドメインを有するマウス抗原結合ドメインを含みうる。
いくつかの態様では、前記抗体は、ヒト化されうる。例えば、ヒト抗体のCDRを本明細書記載の重鎖および軽鎖CDRと交換して、本明細書記載の抗体と同じまたは実質的に類似の結合特徴を有する抗体またはその抗原結合フラグメントであるが、ヒト定常領域およびヒトフレームワーク領域から構成される抗体またはその抗原結合フラグメントを産生させることができる。そのような抗体を産生させる方法は、当業者に一般に公知であり、したがって本開示の範囲内であると見なすべきである。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば診断応用のために、様々な化学的部分または生体分子部分と、ラベル化またはその他の方法でコンジュゲーションすることができる。その部分は、検出可能なラベル、例えば化学発光ラベル(例えば、アクリジニウムエステルおよびスルホンアミド、ルミノールおよびイソルミノール)、リン光ラベル、蛍光ラベル(例えばFITC)、電気化学発光ラベル(例えばルテニウム(II)キレート)、クローニングされた酵素ドナー、LOCI(luminescent oxygen channeling immunoassay)用の光増感粒子または化学発光粒子、TR−FIA(time-resolved fluorescence immunoassay)用のランタニドキレート、放射性ラベル、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素など、例えば、非限定的にトリチウム、炭素14、鉛212、ビスマス212、アスタチン211、ヨウ素131、スカンジウム47、レニウム186、レニウム188、イットリウム90、ヨウ素123、ヨウ素124、ヨウ素125、臭素77、インジウム111などの放射性核種、およびホウ素10またはアクチニドなどの核分裂性核種でありうる。いくつかの態様では、試料中の結合型抗体を検出するために、酵素が前記抗体または抗原結合タンパク質とコンジュゲーションされる場合がある。そのような酵素コンジュゲートには、非限定的に、アルカリホスファターゼ(AP)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)が挙げられる。溶液に基づくイムノアッセイで抗体結合を決定するために使用される他の酵素は、本明細書記載の抗体および抗原結合フラグメント用のコンジュゲートとしての使用に適していることが、当業者によって理解されている。加えて、イムノアッセイでの検出を可能にするために、アクリジニウムエステルなどの化合物も、提供された抗体および抗原結合フラグメントとコンジュゲーションすることができる。
抗体結合は、主に、6個のCDR領域、特にH鎖CDR3によって決定される(Kala et al., 132 J. Biochem. 535-41 (2002); Morea et al., 275 J. Mol. Biol. 269-94 (1998); and Chothia et al., 196 J. Mol. Biol. 901-17 (1987))。しかし、抗体フレームワーク領域は、抗原抗体相互作用に(Panka et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3080-4 (1988))、特にCDRループのコンフォメーションに影響を及ぼすことに役割を果たしうる(Foote et al., 224 J. Mol. Biol. 487-99 (1992))。したがって、記載された抗体または抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3またはビタミンD−C22に基づく免疫原に対する優先的結合を付与する、HまたはL鎖のCDRまたはFWR領域の任意の組み合わせを含みうる。当技術分野で日常的に実施されるドメインシャフリング実験(Jirholt et al., 215 Gene 471-6 (1998); Soederlind et al., 18 Nature Biotechnology 852-6 (2000))を、ここに記載および例示された明細書にしたがって25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3またはビタミンD−C22に基づく免疫原と優先的に結合する抗体を発生させるために採用することができる。そのようなドメインシャフリング実験によって発生した抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントの範囲内である。さらに、CDRは、また、CDR足場形成として役立つ抗体様タンパク質を工学処理することによって、所与の抗原と結合するように配置することができる(Nicaise et al., 13 Protein Sci. 1882 (2004))。そのような抗原結合タンパク質は、本明細書記載の抗体の範囲内である。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、多様な形態で存在することができるが、表1に示される抗体セグメントの1個または複数を含むであろう。
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号10と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR1アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号11と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR2アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号12と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR3アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号27と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR2アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号28と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR3アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号10と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR1アミノ酸配列;配列番号11と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号12と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1アミノ酸配列;配列番号27と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号28と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含む場合があり、ここで、重鎖は、配列番号10と実質的に同じまたは同一のCDR1アミノ酸配列;配列番号11と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号12と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列を有し;軽鎖は、配列番号26と実質的に同じまたは同一のCDR1アミノ酸配列;配列番号27と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号28と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列を有する。CDRの抗原結合配置は、また、CDR足場形成として抗体様タンパク質を使用して工学処理することができる。そのような工学処理された抗原結合タンパク質は、本開示の範囲内である。
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号13と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR1アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号14と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR2アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号15と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR3アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号29と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR1アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号30と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR2アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号31と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR3アミノ酸配列を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号13と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号14と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号15と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を有する重鎖を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号29と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号30と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号31と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含む場合があり、ここで、重鎖は、配列番号13と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号14と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号15と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を含み;軽鎖は、配列番号29と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号30と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号31と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号10と実質的に同じまたは同一のCDR1アミノ酸配列;配列番号11と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号12と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列;配列番号13と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号14と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号15と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を有する重鎖を含みうる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26と実質的に同じまたは同一のCDR1アミノ酸配列;配列番号27と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号28と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列;配列番号29と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号30と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号31と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を有する軽鎖を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖は、配列番号10と実質的に同じまたは同一のCDR1アミノ酸配列;配列番号11と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号12と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列;配列番号13と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号14と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号15と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を含み;軽鎖は、配列番号26と実質的に同じまたは同一のCDR1アミノ酸配列;配列番号27と実質的に同じまたは同一のCDR2アミノ酸配列;および配列番号28と実質的に同じまたは同一のCDR3アミノ酸配列;配列番号29と実質的に同じまたは同一のFWR1アミノ酸配列;配列番号30と実質的に同じまたは同一のFWR2アミノ酸配列;および配列番号31と実質的に同じまたは同一のFWR3アミノ酸配列を含む。CDRおよびFWRの抗原結合配置は、また、CDR足場形成として抗体様タンパク質を使用して工学処理することができる。そのような工学処理された抗原結合タンパク質は、本開示の範囲内である。
いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウス重鎖を有する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウス軽鎖を有する。記載された抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を有する場合があり、ここで、重鎖はマウス重鎖であり、軽鎖はマウス軽鎖である。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウスIgG1重鎖を有する。いくつかの態様では、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、マウスIgκ軽鎖を有する。前記抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を有する場合があり、ここで、重鎖はマウスIgG1重鎖であり、軽鎖はマウスIgκ鎖である。
抗体をコードするポリヌクレオチド
25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログと優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドも記載される。記載されたポリヌクレオチドは、多様な形態で存在することができ、したがって、ネイティブなポリヌクレオチド、リコンビナントポリヌクレオチド(cDNAなど)、または合成的に産生されたポリヌクレオチドでありうる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号10と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR1配列、例えば配列番号2を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号11と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR2、例えば配列番号3を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号12と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR3、例えば配列番号4を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1、例えば配列番号18を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号27と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR2、例えば配列番号19を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号28と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR3、例えば配列番号20を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。ポリヌクレオチドは、配列番号10と実質的に同じまたは同一のCDR1、例えば配列番号2;配列番号11と実質的に同じまたは同一のCDR2、例えば配列番号3;および配列番号12と実質的に同じまたは同一のCDR3、例えば配列番号4を有する重鎖を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードしうる。ポリヌクレオチドは、配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1、例えば配列番号18;配列番号27と実質的に同じまたは同一のCDR2、例えば配列番号19;および配列番号28と実質的に同じまたは同一のCDR3、例えば配列番号20を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードしうる。ポリヌクレオチドは、配列番号10と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR1、例えば配列番号2;配列番号11と実質的に同じまたは同一のヌクレオチド配列、例えば配列番号3によってコードされるCDR2;および配列番号12と実質的に同じまたは同一のヌクレオチド配列、例えば配列番号4によってコードされるCDR3;および配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1、例えば配列番号18;配列番号27と実質的に同じまたは同一のCDR2、例えば配列番号19;および配列番号28と実質的に同じまたは同一のCDR3、例えば配列番号20を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードしうる。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号13と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR1、例えば配列番号5を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号14と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR2、例えば配列番号6を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号15と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR3、例えば配列番号7を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号29と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR1、例えば配列番号21を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号30と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR2、例えば配列番号22を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号31と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR3、例えば配列番号23を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号13と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR1、例えば配列番号5;配列番号14と実質的に同じまたは同一のFWR2、例えば配列番号6;および配列番号15と実質的に同じまたは同一のFWR3、例えば配列番号7を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号29と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR1、例えば配列番号21;配列番号30と実質的に同じまたは同一のFWR2、例えば配列番号22;および配列番号31と実質的に同じまたは同一のFWR3、例えば配列番号23を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードし、ここで、重鎖FWR1は、配列番号13と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号5であり;重鎖FWR2は、配列番号14と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号6であり;重鎖FWR3は、配列番号15と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号7であり;軽鎖FWR1は、配列番号29と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号21であり;軽鎖FWR2は、配列番号30と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号22であり;軽鎖FWR3は、配列番号31と実質的に同じまたは同一、例えば配列番号23である。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号10と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR1、例えば配列番号2;配列番号11と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR2、例えば配列番号3;および配列番号12と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR3、例えば配列番号4;配列番号13と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR1、例えば配列番号5;配列番号14と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR2、例えば配列番号6;および配列番号15と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR3、例えば配列番号7を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1、例えば配列番号18;配列番号27と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR2、例えば配列番号19;および配列番号28と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR3、例えば配列番号20;配列番号29と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR1、例えば配列番号21;配列番号30と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR2、例えば配列番号22;および配列番号31と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR3、例えば配列番号23を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする。
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖を有する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードし、ここで、そのポリヌクレオチドは、配列番号10と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR1、例えば配列番号2;配列番号11と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR2、例えば配列番号3;配列番号12と実質的に同じまたは同一の重鎖CDR3、例えば配列番号4;配列番号13と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR1、例えば配列番号5;配列番号14と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR2、例えば配列番号6;および配列番号15と実質的に同じまたは同一の重鎖FWR3、例えば配列番号7;および配列番号26と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR1、例えば配列番号18;配列番号27と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR2、例えば配列番号19;配列番号28と実質的に同じまたは同一の軽鎖CDR3、例えば配列番号20;配列番号29と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR1、例えば配列番号21;配列番号30と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR2、例えば配列番号22;および配列番号31と実質的に同じまたは同一の軽鎖FWR3、例えば配列番号23をコードする。
工学処理された抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本開示の範囲内である。
いくつかの態様では、前記ポリヌクレオチド(およびそれらがコードするペプチド)は、リーダー配列を含む。当技術分野において公知の任意のリーダー配列を採用することができる。いくつかの態様では、リーダー配列は、抗体の重鎖または軽鎖リーダー配列であるか、またはそれに基づきうる。リーダー配列には、非限定的に、制限部位または翻訳開始部位が含まれうる。
重鎖および軽鎖ならびにそれらをコードする遺伝子の間に存在するおそれがある自然配列変異のせいで、独特な結合特性(例えば特異性および親和性)にほとんどまたは全く影響なしに、そのアミノ酸配列または本明細書記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に多少のレベルの変異が見出されることが予期されよう。そのような予期は、一部に遺伝コードの縮重のせいであり、さらにはコードされるタンパク質の性質をあまり変化させない保存的アミノ酸配列変異の進化的成功のせいである。したがって、いくつかの態様は、本明細書における抗体または抗原結合フラグメントと90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有する抗体または抗原結合フラグメントを含む。他の態様は、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログと優先的に結合する抗体またはそのような抗体の抗原結合フラグメントであって、本明細書記載の抗体および抗原結合フラグメントと顕著な相同性を共有しないフレームワーク、足場、または他の非結合領域を有するが、結合性を付与するために必要な1種または複数のCDRまたは他の配列(本明細書記載のそのような配列と90%、95%、96%、97%、98%、または99%相同である)を実際に組み入れている、抗体または抗原結合フラグメントを含む。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントには、前記抗体または抗原結合フラグメントの生物学的性質(例えば結合親和性または結合選好性)を有する1個または複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する変異体が含まれる。当業者は、1個または複数のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する変異体を産生させることができる。これらの変異体には:(a)1個以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換された変異体、(b)1個以上のアミノ酸がポリペプチドから付加または欠失された変異体、(c)1個以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、および(d)ポリペプチドが、例えば抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分などの、ポリペプチドに有用な性質を付与しうる、融合パートナー、タンパク質タグまたは他の化学部分などの別のペプチドまたはポリペプチドと融合された変異体が含まれうる。本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントには、ある種からのアミノ酸残基が、保存された位置または保存されていない位置のいずれかで、別の種での対応する残基に置換されている変異体が含まれうる。他の態様では、保存されていない位置のアミノ酸残基は、保存的または非保存的残基で置換されている。遺伝的(抑制、欠失、突然変異など)、化学的、および酵素的技法を含めた、これらの変異体を得るための技法は、当業者に公知である。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEなどのいくつかの抗体アイソタイプを具体化しうる。抗体またはその抗原結合フラグメントの特異性は、主として、CDRのアミノ酸配列および配置によって決定される。したがって、抗原特異性を変化させずに、あるアイソタイプのCDRを別のアイソタイプに移行させることができる。または、抗原特異性を変化させずに、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプから別のアイソタイプへとスイッチさせる(アイソタイプスイッチング)技法が確立されている。したがって、そのような抗体アイソタイプは、前記抗体または抗原結合フラグメントの範囲内である。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログに対して、1×10−2未満の解離定数(KD)が含まれる結合親和性(M単位)を有する。いくつかの態様では、KDは、1×10−3未満である。他の態様では、KDは、1×10−4未満である。いくつかの態様では、KDは、1×10−5未満である。なお他の態様では、KDは、1×10−6、2×10−6、3×10−6、4×10−6、5×10−6、6×10−6、7×10−6、8×10−6、または9×10−6未満である。他の態様では、KDは、1×10−7、2×10−7、または3×10−7、2×10−7、3×10−7、4×10−7、5×10−7、6×10−7、7×10−7、8×10−7、または9×10−7未満である。他の態様では、KDは、1×10−8、2×10−8、3×10−8、4×10−8、5×10−8、6×10−8、7×10−8、8×10−8、または9×10−8未満である。他の態様では、KDは、1×10−9、2×10−9、3×10−9、4×10−9、5×10−9、6×10−9、7×10−9、8×10−9、または9×10−9未満である。他の態様では、KDは、1×10−10、2×10−10、3×10−10、2×10−10、3×10−10、4×10−10、5×10−10、6×10−10、7×10−10、8×10−10、または9×10−10未満である。なお他の態様では、KDは、1×10−11、2×10−11、3×10−11、4×10−11、5×10−11、6×10−11、7×10−11、8×10−11、または9×10−11未満である。いくつかの態様では、KDは、1×10−12未満である。他の態様では、KDは、1×10−13未満である。他の態様では、KDは、1×10−14未満である。なお他の態様では、KDは、1×10−15未満である。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、いくつかの態様では、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の等モル認識を行う。
例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントがそのエピトープと結合するのを共有結合が阻止しないように、任意の種類の分子を抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合させることによって、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントを改変することができる。適切な改変の例には、非限定的に、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化などが挙げられる。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体、公知の保護/ブロッキング基、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって誘導体化することができる。抗体または抗原結合フラグメントは、活性または安定性を改善する翻訳後部分を抗体またはその抗原結合フラグメント上に有しうる。これらの部分には、硫黄、メチル、糖質、リンおよび免疫グロブリン分子上に通常見出される他の化学基が挙げられる。さらに、抗体または抗原結合フラグメントは、1個以上の非古典的アミノ酸を含有しうる。
本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントは、診断ラベルでラベル、または診断ラベルとコンジュゲーションすることができる。
本明細書記載のポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。ベクターは、発現ベクターでありうる。したがって、関心が持たれるポリペプチドをコードする配列を含有するリコンビナント発現ベクターが提供される。発現ベクターは、非限定的に、調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー)、選択マーカー、およびポリアデニル化シグナルなどの1種以上の追加的な配列を含有しうる。いくつかの態様では、ベクターは、本明細書記載の抗体または抗原結合タンパク質の重鎖セグメントをコードしうる。いくつかの態様では、ベクターは、本明細書記載の抗体または抗原結合タンパク質の軽鎖セグメントをコードしうる。ときには、重鎖および軽鎖構成要素は、単一のベクターによってコードされうる。他の態様では、重鎖および軽鎖構成要素は、異なるベクターによってコードされうる。多種多様なホスト細胞をトランスフォーメーションするためのベクターは、周知であり、それには、非限定的に、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、ならびに他の細菌、酵母およびウイルスベクターが挙げられる。
本明細書の範囲内のリコンビナント発現ベクターは、適切な調節エレメントと作動可能に連結されうる、少なくとも1種のリコンビナントタンパク質をコードする合成、ゲノム、またはcDNA由来核酸フラグメントを含む。そのような調節エレメントには、転写プロモーター、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止をコントロールする配列が含まれうる。発現ベクター、特に哺乳類発現ベクターは、また、複製起点、発現されるべき遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、他の5’または3’フランキング非転写配列、5’または3’非翻訳配列(必要なリボソーム結合部位など)、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、または転写終止配列などの1種または複数の非転写エレメントを含みうる。ホストにおいて複製する能力を付与する複製起点もまた、組み入れることができる。
脊椎動物細胞をトランスフォーメーションする際に使用されるべき、発現ベクター中の転写および翻訳コントロール配列は、ウイルス起原によって提供することができる。例示的なベクターは、Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983)に記載のように構築することができる。
いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントをコードする配列は、以下の遺伝子用のプロモーターなどの、強力な構成的プロモーターのコントロール下に置かれる:ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンなど。加えて、多数のウイルスプロモーターが、原核細胞で構成的に機能し、前記態様での使用に適している。そのようなウイルスプロモーターには、非限定的に、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、SV40の初期および後期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、マロニー(Maloney)白血病ウイルスの末端反復配列(LTR)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、および他のレトロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。一態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントのコード配列は、メタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーター、ドキシサイクリン誘導プロモーター、プロテインキナーゼR、2’,5’−オリゴアデニル酸合成酵素、Mx遺伝子、ADAR1などの1個以上のインターフェロン活性化応答エレメント(ISRE)を含有するプロモーターなどの誘導プロモーターのコントロール下に置かれる。
本明細書記載のベクターは、1個以上の配列内リボソーム進入部位(IRES)を含有しうる。融合ベクター内へのIRES配列の包含は、いくつかのタンパク質の発現を高めるために有益でありうる。いくつかの態様では、ベクター系は、任意の上述の核酸配列の上流または下流でありうる1個または複数のポリアデニル化部位(例えばSV40)を含む。ベクター構成要素は、遺伝子産物を発現させるために最適な間隔を提供するように(すなわちORFの間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することによって)、連続的に連結もしくは配置する、または別の方法で位置付けることができる。IRESモチーフなどの調節エレメントも、発現のために最適な間隔を提供するように配置することができる。
ベクターは、当技術分野において周知の選択マーカーを含みうる。選択マーカーには、正のおよび負の選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子(例えばネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子)、グルタミン酸合成酵素遺伝子、HSV−TK、ガンシクロビル選択用のHSV−TK誘導体、または6−メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる(Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000))。選択マーカーまたはクローニング部位をコードする核酸配列は、関心が持たれるポリペプチドをコードする核酸配列またはクローニング部位の上流または下流でありうる。
本明細書記載のベクターは、様々な細胞に、前記抗体または抗原結合フラグメントをコードする遺伝子をトランスフォーメーションするために使用することができる。例えば、ベクターは、抗体または抗原結合フラグメントを産生する細胞を発生させるために使用することができる。したがって、別の局面は、本明細書において記載および例示された抗体または抗原結合フラグメントなどの、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログと結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターをトランスフォーメーションされたホスト細胞を特徴とする。
細胞に外来遺伝子を導入するための多数の技法が、当技術分野において公知であり、それらの方法は、本明細書において記載および例示された多様な態様にしたがって前記方法を実施する目的でリコンビナント細胞を構築するために使用することができる。異種遺伝子配列が細胞後代によって遺伝および発現可能であるように、その結果、レシピエント細胞の必要な発生および生理機能が破壊されないように、使用される技法は、ホスト細胞に異種遺伝子配列が安定導入されるよう備えるべきである。使用できる技法には、非限定的に、染色体導入(例えば、細胞融合、染色体介在性遺伝子導入、微小細胞介在性遺伝子導入)、物理的方法(例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体)、ウイルスベクター導入(例えば、リコンビナントDNAウイルス、リコンビナントRNAウイルス)などが挙げられる(Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)に記載)。リン酸カルシウム沈殿およびポリエチレングリコール(PEG)誘導性の細菌プロトプラストと哺乳類細胞との融合も、細胞をトランスフォーメーションするために使用することができる。
本明細書記載の抗体または抗体結合フラグメントの発現に使用するために適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは植物、げっ歯類、またはヒト起源の細胞、例えば、非限定的にNSO、CHO、perC.6、Tk−ts13、BHK、HEK293細胞、COS−7、T98G、CV−1/EBNA、L細胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0ミエローマ細胞、およびとりわけBHK細胞系である。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して果たすことができる。ハイブリドーマを産生させるための方法は、当技術分野において十分に確立されている。
本明細書記載の発現ベクターをトランスフォーメーションされた細胞は、本明細書記載の抗体または抗体結合フラグメントのリコンビナント発現について選択またはスクリーニングすることができる。リコンビナント陽性細胞がエクスパンションされ、所望の表現型(高レベル発現、増強された成長特性、または例えばタンパク質の改変または翻訳後改変の変化により所望の生化学的特徴を有するタンパク質を産生する能力など)を示すサブクローンについてスクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの固有の性質または突然変異が原因でありうる。突然変異は、化学物質、UV波長光、放射線、ウイルス、挿入突然変異原、DNAミスマッチ修復阻害、またはそのような方法の組み合わせの使用によりもたらすことができる。
所望のタンパク質を発現している細胞が同定されたならば、それをエクスパンションさせて選択することができる。トランスフォーメーションされた細胞は、いくつかの方法で選択することができる。例えば、関心が持たれるポリペプチドの発現について細胞を選択することができる。蛍光タンパク質の産生などの選択マーカーを含有するベクターをトランスフォーメーションされた細胞は、そのマーカーの発現についてポジティブ選択することができる。他の態様では、薬物耐性遺伝子を有するベクターを含有する細胞は、選択条件下で成長する能力についてポジティブ選択することができる。
アッセイおよび方法
本明細書記載の抗体および抗原結合フラグメントは、試料中のビタミンD誘導体またはアナログを検出するために使用することができる。いくつかの態様では、抗体および抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および/もしくは25−ヒドロキシビタミンD3などのビタミンD誘導体、またはビタミンD−C22免疫原性分子もしくは化合物などの25−ヒドロキシビタミンDアナログを検出するために使用される。いくつかの態様では、前記抗体および抗原結合フラグメントは、患者または対象から得られた生物学的試料中のビタミンD誘導体またはアナログを検出するために使用することができる。いくつかの態様では、試料は、血液、または血清などの血液成分でありうる。好ましい態様では、患者または対象はヒトである。いくつかの局面では、生物学的試料は、ヒト患者または対象から、例えばヒト血液から得ることができる。記載された方法は、抗体および抗原結合フラグメント単独で、または他の容易に入手可能な抗体または検出試薬と共に使用することができる。
本明細書において、対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法が提供される。好ましい態様では、対象はヒトである。方法は、対象から得られた生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定することを含み、ここで、正常対照中のレベルまたは閾値レベル30ng/mLに対する、生物学的試料中のレベルの減少または低下は、対象でのビタミンD欠乏を示す。
25−ヒドロキシビタミンDは、2種の形態、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3のいずれかでありうる。対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法の好ましい態様では、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3のレベルは、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールを、対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法の実施に採用することができる。好ましい態様では、方法は、連続競合イムノアッセイによって行われる。Centaur(商標)、Vista(商標)、およびImmulite(商標)は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法によると、生物学的試料中の25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の総レベルは、強化化学発光(ECL)、酵素イムノアッセイ(EIA)、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別(immunodifferentiation)、または酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンD2および/またはビタミンD3と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26で示されるLc CDR1、配列番号27で示されるLc CDR2、および配列番号28で示されるLc CDR3、配列番号10で示されるHc CDR1、配列番号11で示されるHc CDR2および配列番号12で示されるHc CDR3を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3について等モル認識する性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体10H9である。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法に使用することができる、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物(例えばアクリジニウムエステル化合物)、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸/塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子;商標SEPHADEX(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)で入手可能な架橋デキストラン;アガロース;ポリスチレンビーズ;シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ;またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法への使用前に、生物学的条件下で最大24時間保存することができる。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、生物学的試料は、その生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、また、その生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、25−ヒドロキシビタミンDアナログは、接触させるステップの後に、生物学的試料に添加される。25−ヒドロキシビタミンDアナログはラベルすることができる。25−ヒドロキシビタミンDアナログまたはラベルされた25−ヒドロキシビタミンDアナログは、また、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。
本明細書記載のビタミンDアナログは、図1(a)に示すような未コンジュゲーションのときにC22カルボキシ基を含むビタミンD炭素数22誘導体(ビタミンD−C22)の使用に基づきうる(Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993))。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、ビタミンD−C22でありうる。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、前記ビタミンDアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンD−C22は、ウシ血清アルブミン(BSA)と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションされうるビタミンDアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、KLH、PEG化KLH、Concholepas concholepasヘモシアニン(CCH)、カチオン化BSA、および卵白アルブミンが含まれる。
ビタミンDアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。化学リンカーは、アルキル、アリール、アルキルオキシ、アミド、スルホンアミドまたはカルボニルまたはペプチド基から構成されうる。タンパク質へのビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体の反応性N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)基との間の反応によって果たすことができる。
対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法のいくつかの態様では、ビタミンDレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して20分以内に検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンD欠乏に関連する疾患には:くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
本明細書において、また、対象から得られた生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定すること、および正常対照でのレベルまたは閾値レベル30ng/mLに対する生物学的試料中のレベルの減少が決定された場合、対象にビタミンD欠乏の処置を施すことによって、ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法が提供される。好ましい態様では、対象はヒトである。ビタミンD欠乏を処置するためにいくつもの適切な方法がある。ビタミンD欠乏は、ビタミンD摂取の補充または光線療法によって処置することができる。光線療法には、自然太陽光への曝露増加または紫外線Bの人工光源への曝露が含まれうる。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法の好ましい態様では、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3のレベルは、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法を行う際に、競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールを採用することができる。好ましい態様では、その方法は、連続競合イムノアッセイによって行われる。Centaur(商標)、Vista(商標)、およびImmulite(商標)は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法によると、生物学的試料中の25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の総レベルは、強化化学発光(ECL)、酵素イムノアッセイ(EIA)、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって検出することができる。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンD2および/またはビタミンD3と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26で示されるLc CDR1、配列番号27で示されるLc CDR2、および配列番号28で示されるLc CDR3、配列番号10で示されるHc CDR1、配列番号11で示されるHc CDR2および配列番号12で示されるHc CDR3を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の等モル認識の性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体10H9である。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法に使用することができる、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物(例えばアクリジニウムエステル化合物)、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸/塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
本明細書記載の方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子;商標SEPHADEX(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)で入手可能な架橋デキストラン;アガロース;ポリスチレンビーズ;シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ;またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法に使用する前に、生物学的条件下で最大24時間、保存することができる。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、また、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、25−ヒドロキシビタミンDアナログが、接触させるステップの後に生物学的試料に添加される。25−ヒドロキシビタミンDアナログはラベルすることができる。25−ヒドロキシビタミンDアナログまたはラベルされた25−ヒドロキシビタミンDアナログは、また、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。
本明細書記載のビタミンDアナログは、図1(a)に示すような未コンジュゲーションのときにC22カルボキシ基を含むビタミンD炭素数22誘導体(ビタミンD−C22)の使用に基づきうる(Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993))。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、ビタミンD−C22でありうる。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、記載されたビタミンDアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンD−C22は、ウシ血清アルブミン(BSA)と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションできるビタミンDアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、KLH、PEG化KLH、Concholepas concholepasヘモシアニン(CCH)、カチオン化BSA、および卵白アルブミンが含まれる。
ビタミンDアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。化学リンカーは、アルキル、アリール、アルキルオキシ、アミド、スルホンアミドまたはカルボニルまたはペプチド基から構成されうる。タンパク質へのビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体の反応性N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)基との間の反応によって果たすことができる。
ビタミンD欠乏を有すると疑われる対象を処置するための方法のいくつかの態様では、ビタミンDレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して20分以内に検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンD欠乏に関連する疾患には:くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
本明細書において、さらに、1回目に、対象から得られた第1の生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定すること、および次に1回目よりも後の2回目に対象から得られた第2の生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定することによって、ビタミンD欠乏の進行をモニタリングする必要のある対象でのそのモニタリングのための方法が提供され、ここで、第1の生物学的試料中のレベルから第2の生物学的試料中のレベルの間の減少は、対象でのビタミンD欠乏の進行を示し、ここで、第1の生物学的試料中のレベルから第2の生物学的試料中のレベルの間でほとんどまたは全く変化ないことは、対象でのビタミンD欠乏の安定化を示し、ここで、第1の生物学的試料中のレベルから第2の生物学的試料中のレベルの間の増加は、対象でのビタミンD欠乏の軽減を示す。好ましい態様では、対象はヒトである。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法の好ましい態様では、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3のレベルは、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールは、対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法の実施に採用することができる。好ましい態様では、方法は、競合イムノアッセイによって行われる。Centaur(商標)、Vista(商標)、およびImmulite(商標)は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法によると、生物学的試料中の25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の総レベルは、強化化学発光(ECL)、酵素イムノアッセイ(EIA)、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンD2および/またはビタミンD3と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26で示されるLc CDR1、配列番号27で示されるLc CDR2、および配列番号28で示されるLc CDR3、配列番号10で示されるHc CDR1、配列番号11で示されるHc CDR2および配列番号12で示されるHc CDR3を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の等モル認識の性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体10H9である。
これらの方法に使用することができる、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物(例えばアクリジニウムエステル化合物)、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸/塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子;商標SEPHADEX(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)で入手可能な架橋デキストラン;アガロース;ポリスチレンビーズ;シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ;またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法に使用する前に、生物学的条件下で最大24時間、保存することができる。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、また、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、25−ヒドロキシビタミンDアナログが、接触させるステップの後に生物学的試料に添加される。25−ヒドロキシビタミンDアナログはラベルすることができる。25−ヒドロキシビタミンDアナログまたはラベルされた25−ヒドロキシビタミンDアナログは、また、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。
本明細書記載のビタミンDアナログは、図1(a)に示すような未コンジュゲーションのときにC22カルボキシ基を含むビタミンD炭素数22誘導体(ビタミンD−C22)の使用に基づきうる(Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993))。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、ビタミンD−C22でありうる。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、記載されたビタミンDアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンD−C22は、ウシ血清アルブミン(BSA)と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションできるビタミンDアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、KLH、PEG化KLH、Concholepas concholepasヘモシアニン(CCH)、カチオン化BSA、および卵白アルブミンが含まれる。
ビタミンDアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。タンパク質へのビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体の反応性N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)基との間の反応によって果たすことができる。
対象でのビタミンD欠乏の進行をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、ビタミンDレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して20分以内に検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンD欠乏に関連する疾患には:くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
本明細書において、また、1回目に、対象から得られた第1の生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定すること、および次に1回目よりも後の2回目に、ビタミンD欠乏について対象を処置後に、対象から得られた第2の生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定することによって、該ビタミンD欠乏の処置を必要とする対象でのその処置のモニタリングのための方法が提供され、ここで、第1の生物学的試料中のレベルに対する第2の生物学的試料中のレベルの増加または安定化は、該対象でのビタミンD欠乏の処置の有効性を示し、ここで、第1の生物学的試料中のレベルに対する第2の生物学的試料中のレベルの減少は、該対象でのビタミンD欠乏の処置の無効果を示す。好ましい態様では、対象はヒトである。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法の好ましい態様では、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3のレベルは、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させることによって決定される。
競合的または非競合的のいずれかの様々な異種および同種プロトコールは、対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法の実施に採用することができる。好ましい態様では、方法は、連続競合イムノアッセイによって行われる。Centaur(商標)、Vista(商標)、およびImmulite(商標)は、競合イムノアッセイを行うために使用することができるアッセイ系である。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法によると、生物学的試料中の25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の総レベルは、強化化学発光(ECL)、酵素イムノアッセイ(EIA)、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫蛍光、平衡透析、免疫識別、または酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法の好ましい態様では、その方法にしたがって使用される抗体または抗原結合フラグメントは、ビタミンD2および/またはビタミンD3と交差反応しない。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメントである。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26で示されるLc CDR1、配列番号27で示されるLc CDR2、および配列番号28で示されるLc CDR3、配列番号10で示されるHc CDR1、配列番号11で示されるHc CDR2および配列番号12で示されるHc CDR3を含む。いくつかの態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3を等モル認識する性質を有する。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体10H9である。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法に使用することができる、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3を認識する抗体および抗原結合フラグメントは、例えば、検出可能なラベルでラベルすることができる。例示的なラベルには、非限定的に、化学発光化合物(例えばアクリジニウムエステル化合物)、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素が挙げられる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸/塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。
抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。抗体または抗原結合タンパク質と担体タンパク質との間の複合体も、固相支持体上に固定化することができる。
本明細書記載の方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子;商標SEPHADEX(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)で入手可能な架橋デキストラン;アガロース;ポリスチレンビーズ;シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ;またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子に直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
生物学的試料は、血液、血清または血漿でありうる。いくつかの態様では、生物学的試料は、本明細書記載の方法に使用する前に、生物学的条件下で最大24時間保存することができる。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSは、例えば、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)と共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、また、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させる前に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合される。または、生物学的試料を、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方を認識する抗体または抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、その生物学的試料は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールで処理またはそれと混合することができる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。ANSおよびエチレングリコールは、置換緩衝液中に存在しうる。場合により、生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させる前に、または生物学的試料を抗体もしくは抗原結合フラグメントと接触させるのと同時に、メタノールを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)およびエチレングリコールと共に使用することができる。メタノールは、例えば、置換緩衝液中に入れることができる。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、接触させるステップの後に25−ヒドロキシビタミンDアナログが生物学的試料に添加される。25−ヒドロキシビタミンDアナログはラベルすることができる。25−ヒドロキシビタミンDアナログまたはラベルされた25−ヒドロキシビタミンDアナログは、また、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。
本明細書記載のビタミンDアナログは、図1(a)に示すような未コンジュゲーションのときにC22カルボキシ基を含むビタミンD炭素数22誘導体(ビタミンD−C22)の使用に基づきうる(Hollis et al., Clin. Chem. 39(3):529-33 (1993))。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、ビタミンD−C22でありうる。いくつかの態様では、ビタミンDアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションしている場合がある。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、記載されたビタミンDアナログは、タンパク質担体に直接取り付けることができる。例えば、ビタミンD−C22は、ウシ血清アルブミン(BSA)と直接コンジュゲーションすることができる。所与のタンパク質担体とコンジュゲーションできるビタミンDアナログの数は、使用される担体に基づき変動する。例えば、BSAは、比較的適度な数の、おそらく約10〜約25個のタンパク質の連結に対応し;または、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などの担体は、約200〜約300個の抗原性分子に対応しうる。当業者は、本明細書記載の目的のために、多種多様な担体タンパク質を使用できることを理解している。いくつかの適切な担体には、少数だけ挙げると、KLH、PEG化KLH、Concholepas concholepasヘモシアニン(CCH)、カチオン化BSA、および卵白アルブミンが含まれる。
ビタミンDアナログへの担体タンパク質のコンジュゲーションは、化学リンカーの使用によって起こりうる。タンパク質へのビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体のコンジュゲーションは、タンパク質のアミノ基とビタミンDアナログまたはビタミンD誘導体の反応性N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)基との間の反応によって果たすことができる。
対象でのビタミンD欠乏の処置をモニタリングするための方法のいくつかの態様では、ビタミンDレベルは、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して20分以内に検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏は、疾患を示すか、または疾患に関連しうる。ビタミンD欠乏に関連する疾患には:くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
本明細書において、また、25−ヒドロキシビタミンDアナログを8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)と接触させることによって25−ヒドロキシビタミンDアナログを安定化するための方法が提供される。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で安定化された25−ヒドロキシビタミンDアナログは、アッセイ系外で2ヶ月間よりも長く保存することができる。8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)で安定化された25−ヒドロキシビタミンDアナログは、アッセイ系内で7日間よりも長く保存することができる。
本明細書において、また、対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法が提供される。好ましい態様では、対象はヒトである。その方法に使用するための生物学的試料は、対象から得られた血液、血清または血漿でありうる。対象でのビタミンD欠乏を検出するための方法は、生物学的試料と置換緩衝液を混合することによって、対象から得られた生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルを決定することを伴う。アッセイ混合物を形成させるために、生物学的試料を置換緩衝液に添加する、またはその逆にすることができる。置換緩衝液は、ビタミンD結合タンパク質からビタミンDを置換する。好ましい態様では、置換緩衝液は、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)を含有する。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。置換緩衝液は、さらに、エチレングリコールを含有しうる。いくつかの態様では、置換緩衝液は、ANSおよびメタノールを含有する。いくつかの好ましい態様では、置換緩衝液は、ANS、エチレングリコール、およびメタノールを含有する。
次に、第1のラベルとコンジュゲーションされた、25−ヒドロキシビタミンD2、25−ヒドロキシビタミンD3、またはビタミンD−C22に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントが、アッセイ混合物と混合される。抗体または抗原結合フラグメントは、アッセイ混合物に添加する、またはその逆にすることができ、その一構成要素になる。25−ヒドロキシビタミンD2、および25−ヒドロキシビタミンD3、またはビタミンD−C22に基づく免疫原と優先的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、上記抗体または抗原結合フラグメントである。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号26で示されるLc CDR1、配列番号27で示されるLc CDR2、および配列番号28で示されるLc CDR3、配列番号10で示されるHc CDR1、配列番号11で示されるHc CDR2および配列番号12で示されるHc CDR3を含む。好ましい態様では、抗体は、モノクローナル抗体10H9である。25−ヒドロキシビタミンD2、25−ヒドロキシビタミンD3、またはビタミンD−C22に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、固相支持体上に固定化することができる。25−ヒドロキシビタミンD2、25−ヒドロキシビタミンD3、またはビタミンD−C22に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、担体タンパク質とコンジュゲーションすることができる。25−ヒドロキシビタミンD2、25−ヒドロキシビタミンD3、またはビタミンD−C22に基づく免疫原と優先的に結合する抗体または抗原結合フラグメントと、担体タンパク質との複合体は、また、固相支持体上に固定化することができる。
第1のラベルは、好ましくは、検出可能なラベルである。第1のラベルは、化学発光化合物(例えば、アクリジニウムエステル化合物)、リン光化合物、蛍光化合物、放射性ラベル、ビオチン、または酵素でありうる。言及された例示的なラベルは、通常、非限定的に、異なる化学物質の添加、光による刺激、または基質もしくは他の化合物への曝露が含まれる方法によって励起された場合にのみ検出することができる。アクリジニウムエステル化合物を使用する場合、化学発光は、適切な計装によって読み取ることができる閃光を生じるペルオキシドおよび酸/塩基によってトリガーされる。検出可能なラベルが検出可能になり始める前に、随意の洗浄ステップを用いることができる。
次に、第2のラベルを有する25−ヒドロキシビタミンDアナログが、アッセイ混合物と混合される。25−ヒドロキシビタミンDアナログは、アッセイ混合物に添加する、またはその逆にすることができ、その一構成要素になる。第2のラベルは、抗フルオレセイン抗体と結合するためのフルオレセイン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくは抗ビオチン抗体と結合するためのビオチン、抗ジゴキシゲニン抗体と結合するためのジゴキシゲニン、または他のハプテンおよび結合パートナーでありうる。25−ヒドロキシビタミンDアナログは、8−アニリノ−1−ナフタレンスルホネート(ANS)を含む安定化緩衝液中に存在しうる。ANSは、ANSの酸または塩(例えば、ANSナトリウム塩、ANSカリウム塩、ANSヘミマグネシウム塩またはANSアンモニウム塩)の形態でありうる。いくつかの態様では、25−ヒドロキシビタミンDアナログは、担体タンパク質とコンジュゲーションされる。担体タンパク質は、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、免疫グロブリン、またはウシγグロブリンIgGでありうる。
第2のラベルを認識する抗体とコンジュゲーションされた固相支持体は、また、アッセイ混合物と混合される。第2のラベルを認識する抗体とコンジュゲーションされた固相支持体は、アッセイ混合物に添加する、またはその逆にすることができ、アッセイ混合物の一構成要素になる。固相支持体とコンジュゲーションされた抗体は、フルオレセインと結合する抗体でありうる。
本明細書記載の方法に使用するための固相支持体には、常磁性粒子;商標SEPHADEX(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.)で入手可能な架橋デキストラン;アガロース;ポリスチレン粒子もしくはビーズ;シート、ストリップもしくはパドルなどの、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンベースのウェブ;またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製などのチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。常磁性粒子を使用する場合、随意の洗浄ステップの間に、ある磁場源を用いて、粒子および粒子と直接または間接的に結合している分子を保持することができる。分子は、共有結合的に、塩橋、水素結合または別の種類の結合によって、結合することができる。
生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルは、第1のラベルによって送り出されるシグナルを測定することによって決定され、ここで、正常対照でのレベルまたは閾値レベル30ng/mLに対して生物学的試料中の総25−ヒドロキシビタミンDレベルが低下していることは、対象でのビタミンD欠乏を示す。
本明細書記載の任意の診断系の免疫試薬は、分散液として溶液中に、または実質的に乾燥した粉末として、例えば凍結乾燥された形態で提供することができる。
いくつかの態様では、ビタミンD欠乏は、生物学的試料が置換緩衝液と混合された時点から開始して20分以内に検出することができる。
対象でのビタミンD欠乏は、疾患を示しうる。その疾患には:くる病、骨軟化症、高血圧症、骨粗鬆症、自己免疫病、心血管疾患、統合失調症、うつ病、神経系疾患、糖尿病、感染症、喘息、アレルギーまたはガンを挙げることができる。
キット
キットは、本明細書記載の抗体または抗原結合フラグメント、ならびに例えば、対象から生物学的試料を採取するための、および/または生物学的試料中の総ビタミンD量を決定するために抗体または抗原結合フラグメントを使用するための説明書を含みうる。好ましい態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書記載の検出可能なラベルを含む。キットは、また、固体支持体と連結したビタミンDアナログを含みうる。いくつかの態様では、キットは、正常および/または欠乏ビタミンDレベルとのビタミンDの量またはレベルの相関を示す、標準曲線またはデータセットを含みうる。
本明細書記載の態様をより詳細に説明するために、以下の実施例を提供する。それらは、態様を限定するのでなく、例示することを目的とする。
実施例
実施例I ビタミンD−C22に基づく分子および化合物の合成
ビタミンD−C22に基づく抗原を産生させるために、操作可能な形態の分子が必要であった。これを成し遂げるために、HollisおよびNapoli(Clin.Chem、31:1815-1819 (1985))の合成スキームに基づく合成スキームによりビタミンD−C22酸を産生させるよう努力した。簡潔には、23,24−ビスノル−5−コレン酸−3β−オール−アセテート(2.50g)をジクロロメタン(25mL)中でメタノール(0.312mL)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.59g)およびN,N−ジメチルアミノピリジン(160mg)と3時間反応させ、23,24−ビスノル−5−コレン酸−3β−オール−アセテートメチルエステル(1.808g)を得た。ヘキサン(200mL)中で還流下にて30分間メチルエステル(1.808g)をN−ブロモスクシンイミド(1.05g)/アゾイソブチロニトリル(51.7mg)で臭素化し、続いてTHF(112mL)中でフッ化テトラブチルアンモニウム(THF中に1M、23.8mL)を用いて室温で2時間、脱臭化水素し、23,24−ビスノル−5,7−コレジエン酸(choledienic acid)−3β−オール−アセテートメチルエステル(1.21g)を得た。23,24−ビスノル−5,7−コレジエン酸−3β−オール−アセテートメチルエステル(1.21g)をメタノール(18mL)およびエチルエーテル(22mL)中で水酸化カリウム(0.50g)と室温で2.5時間反応させて、23,24−ビスノル−5,7−コレジエン酸−3β−オール−メチルエステル(0.962g)を産生させた。エーテル(1100mL)中で、Vycorフィルターを備える450w水銀灯を23,24−ビスノル−5,7−コレジエン酸−3β−オール−メチルエステル(0.960g)に−10〜0℃で3分間および30秒×2回照射し、次に、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離し、プレビタミンD−C22メチルエステルを得、それをエタノール(100mL)中で3時間還流し、ビタミンD−C22メチルエステル(0.389g)を産生させた。ビタミンD−C22メチルエステル(249mg)をメタノール(30mL)中で水酸化カリウム(6.25g)と60℃で5時間反応させ、ビタミンD−C22酸(165mg)を得た(図2)。
ビタミンD−C22とコンジュゲーションされた化合物を形成させるためにNHS前駆体が必要であった。これを達成するために、ビタミンD−C22酸(165mg)をジシクロヘキシカルボジイミド(dicyclohexycarbodiimide)(116mg)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(64mg)と1,4−ジオキサン中で反応させ、次に1,4−ジアミノブタン(480uL)と室温で2時間反応させてビタミンD−DAB(141mg)を得た。タンパク質反応性試薬であるビタミンD−DAB−スベロイル−NHSおよびビタミンD−DAB−PEG5−NHSは、ビタミンD−DABから、過剰のジスクリンイミジルスベレートまたはPEG5−ジ−NHSとの反応によって調製した。NHSエステルは、C18カラムを通過させる分取逆相HPLCによって精製した。DMF(1.2mL)およびトリエチルアミン(15uL)中で、ビタミンD−DAB(30mg)を過剰のジスクシンイミジルスベレート(DSS、133mg)と3.5時間反応させた。Synergi Hydro-RPカラムを通過させる分取HPLCによって生成物(24.5mg)を精製し、ビタミンD−DAB−スベロイル−NHSを産生させた。DMF(2.0mL)およびトリエチルアミン(20uL)中で、ビタミンD−DAB(41mg)を過剰のBis−PEG5−NHS(282mg)と3.5時間反応させた。Synergi Hydro-RPカラムを通過させる分取HPLCによって生成物(33.7mg)を精製してビタミンD−DAB−PEG5−NHSを産生させた(図3)。タンパク質コンジュゲートは、図4に示すようにNHSエステルとタンパク質のリシンアミノ基との間の反応によって調製した。Vit D−DAB−スベロイル−BSAは、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.5)(1mL)とDMF(0.4mL)との混液中で、Vit D−DAB−スベロイル−NHS(5mg)をBSA(10mg)と室温で2時間反応させることによって調製し、緩衝液交換のためにPBS(pH7.2)を用いた遠心分離によって精製した。MALDI−TOF質量分析から、BSA1個あたり14個のビタミンDラベルのロードが示された。
ビタミンD−DAB−PEG5−BSA−フルオレセインコンジュゲート(図5)は、BSAの遊離チオールとフルオレセイン−5−マレイミドとの間の反応に続くリシンアミノ基とビタミンD−DAB−PEG5−NHSとの反応による2段階コンジュゲーションを経て調製した。Sephadex G25カラムを用いたゲル濾過によってコンジュゲートを単離した。10:1のフルオレセイン−5−マレイミド:BSAのモル比を用い、続いて20:1のビタミンD−DAB−PEG5−NHS:BSAのモル比でのコンジュゲーションで調製されたコンジュゲートが最良のCentaur(登録商標)アッセイ曲線を生じたことが分かった。
ビタミンD−フルオレセインコンジュゲートを調製し、Centaur(登録商標)アッセイ用の磁性粒子コーティング抗原として使用した。小分子誘導体であるビタミンD−DAB−PEG5−アミノペンチル−チオウレイジルフルオレセイン、MW1208(構造は下記)を磁性粒子コーティング抗原として使用しても、良好なイムノアッセイの結果が得られた。
実施例II ビタミンD−C22抗原性化合物と反応性の抗体の産生
ビタミンD−C22抗原性分子の構造局面を有する分子と優先的に結合できる抗体を産生させるために実験を行った。これらの実験は、Galfreら(Nature, 266:550 (1977))の方法をOiおよびHerzenberg(Selected Methods in Cellular Immunology (1980))が改変したものにしたがって行った。まず、フロイント完全アジュバント中に乳化したビタミンD−C22 BSAをBALB/cマウスに免疫処置し、続いてフロイント不完全アジュバントを用いて二次免疫した。2回目の免疫処置の2週間後に、免疫処置後のマウスの血清を採取した。
採取した血清を、以下のようなELISAによって抗原反応性について試験した:ビタミンD−C22 KLHでコーティングしたマイクロタイタープレートをマウス抗血清と共にインキュベーションし、希釈緩衝液で1時間希釈した。プレートを洗浄し、希釈緩衝液中の、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRPO)とコンジュゲーションした二次抗体(ヤギ抗マウスIgG)を添加し、30分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、比色分析用基質3,3’,5,5’−テトラメチルバンジジン(TMB)を添加した。1N硫酸を用いて発色を止め、吸光度を450nmで測定した。被験マウス5匹全てからの血清は、正常マウス血清(NMS)に比べてかなりの反応性を示した(表2)。
実施例III ビタミンD−C22抗原性化合物と反応性のモノクローナル抗体の産生
ビタミンD−C22抗原に対して正の免疫応答を示すマウスをモノクローナル抗体発生のために選択した。簡潔には、選択されたマウスから回収した脾臓細胞をマウスSp2/0ミエローマ細胞と融合させた。結果として生じた、25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3と反応性の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、限界希釈手順によって少なくとも2回クローニングしてモノクローナル抗体産生細胞を得た。同定され、さらに試験された一つのモノクローナル細胞系は、10H9ハイブリドーマであった。
ハイブリドーマクローンの単離後に、抗体が25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方と結合する相対能力を決定するために研究を行った。これを判断するために、ビタミンD−C22と、抗原に対して産生された抗体(10H9)との間の結合が25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3の存在によって破壊されうる程度を決定する抗体置換アッセイを行った。ビタミンD−C22と反応性の抗体を産生する10H9ハイブリドーマ細胞系からの細胞培養上清を、ビタミンD−C22 KLHをコーティングしたマイクロタイタープレート上で25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3の存在下または不在下で1時間同時インキュベーションした。プレートを洗浄後に、ヤギ抗マウスIgG−HRPOを添加し、30分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、次にテトラメチルベンジジン(TMB)と共にインキュベーションした。1N硫酸を用いて発色を止め、吸光度を450nmで測定した。表3に示すように(そして図6に示すように)、ビタミンD−C22 KLHへの抗体結合は、25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3のいずれかとの同時インキュベーションによって濃度依存的に破壊された。25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方は、被験抗体の等モル親和性の特徴である、実質的に類似の結合破壊プロファイルを示した。
次に、細胞上清ではなく精製抗体を使用して置換実験を行った。この実験では、2時間インキュベーションを経て関心が持たれる抗体をマイクロタイタープレート上に直接コーティングした。コーティング後のプレートを洗浄し、次に、これを、アルカリホスファターゼとコンジュゲーションしたビタミンD−C22−ジアミノブタン−スベロイルの存在下で25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3のいずれかと共に同時インキュベーションした。30分後にプレートを洗浄し、基質p−ニトロフェニルホスフェート(PNPP)を添加することによって発色させた。着色した溶液の吸光度を405nmで測定した。再び、25−ヒドロキシビタミンD2または25−ヒドロキシビタミンD3のいずれかと共に同時インキュベーションすることによってビタミンD−C22への10H9結合を濃度依存的に破壊した(表4)。25−ヒドロキシビタミンD2および25−ヒドロキシビタミンD3の両方は、被験抗体の等モル親和性の特徴である、実質的に類似の結合破壊プロファイルを示した(図7)。
実施例IV
ビタミンDアッセイ
生物学的試料に続いて置換緩衝液を反応キュベットに加え、4.5分間反応させる。アクリジニウムエステルとコンジュゲーションしたモノクローナル抗体を添加し、5.5分間反応させて試料中の25−ヒドロキシビタミンDと結合させる。ウシ血清アルブミンおよびフルオレセインとコンジュゲーションした25−ヒドロキシビタミンDアナログを、抗フルオレセイン抗体をコーティングした常磁性粒子と一緒に添加し、3.75分間反応させる。反応キュベットを洗浄し、酸および塩基試薬を添加し、化学発光反応を開始する。結果までの時間は18分である。患者の試料中の25−ヒドロキシビタミンDの量と、系によって検出された相対光単位(RLU)の量との間に逆相関の関係が存在する。
アッセイ:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイは、常磁性粒子(PMP)と共有結合した、ラベルされた抗フルオレセインモノクローナル抗体、アクリジニウムエステル(AE)でラベルされたモノクローナル抗体1種、およびフルオレセインでラベルされたビタミンDアナログを使用する18分間のワンパス型抗体競合イムノアッセイである(図8)。総ビタミンDアッセイは、1回の判定のために試料体積20μLを要する。初回結果までの時間は18分であり、処理量は240回/時間である。
簡潔には、化学発光技法を用いた連続ステップハプテン/抗体競合イムノアッセイの第1のステップは、アナライザーでキュベットに生物学的試料20μLを分注し、続いて8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩(Sigma-aldrich, St. Louis, MO)およびエチレングリコール(Sigma-aldrich, St. Louis, MO)を含有する置換緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、0.09%アジ化ナトリウム、pH=7.5)200μlを添加し、37℃で4.5分間インキュベーションすることで開始する。アクリジニウムエステルでラベルされた抗25−ヒドロキシビタミンDモノクローナル抗体(モノクローナル抗体10H9)を含有するLite試薬(50μL)をその混合物に添加し、37℃で5.5分間インキュベーションする。C22−PEG−BSA−フルオレセインコンジュゲート(50μL)および抗フルオレセインモノクローナル抗体でコーティングされた常磁性ミクロパーティクル(100μL)をその混合物に添加し、37℃で3.75分間インキュベーションする。第4のステップは、C22−PEG−BSA−フルオレセインコンジュゲートおよびアクリジニウムエステルでラベルされた抗25−ヒドロキシビタミンDモノクローナル抗体が結合した固相複合体を分離し、続いて3回洗浄して遊離のLite試薬がもしあれば除去することである。最後のステップは、酸試薬の次に塩基試薬をそれぞれ300μL連続的に分注し、化学発光反応を開始することである。試料から結果までの総インキュベーション時間は18分である。生物学的試料中に存在する25−ヒドロキシビタミンDの量と、相対光単位(RLU)として定量された化学発光の量との間に間接的関係がある。Centaurに基づくアッセイでは、アクリジニウムエステルによって発光したRLUとビタミンDの量との間に逆相関関係があるが、それは、血漿中の担体タンパク質から放出された25−ヒドロキシビタミンDが、限られた量のアクリジニウムラベル型10H9モノクローナル抗体との結合を、ビタミンD−BSA−フルオレセインと競合するからである。患者試料中の25(OH)Dレベルがより高いと、磁性粒子上のアクリジニウム−MAb−VitD−BSA−フルオレセイン複合体の量が低下し、より低いRLUが生じるであろう。
精度:精度の研究は、CLSIプロトコールEP5−A2(1台のADVIA Centaurシステムで1日2回、10日間)に基づいた。総ビタミンDが4〜120ng/mLの試料を用いてアッセイ精度を決定した。
分析感度:分析感度は、最低標準から得られた平均シグナル+2SDを相対光単位(RLU)で表現したものに対応する濃度として定義される。分析感度の研究は、CLSIプロトコールEP5−A2にしたがって行った。分析感度は、最低標準の60回の繰り返しを用いて決定した。
ブランク限界(limit of blank)、検出限界、および実効感度:ブランク限界は、ヒト陰性基本プールの分布の95パーセンタイルに対応する分析物の濃度として定義される。3システムで2ロットの試薬を用いて総ビタミンDの低濃度標準を20回アッセイした(n=120)。検出限界(LoD)は、CLSIプロトコールEP17−Aにより決定する。検出限界は、確率95%で検出できるビタミンDの最低濃度として定義される。LoDは、3システムで2ロットの試薬を用いて20回アッセイした低レベルビタミンD試料を使用することによって決定した(n=120)。機能感度(functional sensitivity)は、1台の機器を使用して10日間にわたり決定した。1日に2回の運転を二つ組で行い、合計60回繰り返した。ADVIA Centaur総ビタミンD感度パネルのメンバーの濃度は、3.0〜20.0ng/mLであった。ロット内の0日目の2点検量線を使用して濃度を計算した。
妨害研究:内因性および非内因性物質からの妨害は、NCCLS EP−7Aのガイドラインにしたがって評価した。各試料に妨害物を添加し、マッチする未添加対照と比較した。
交差反応性:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイを用いて5種のビタミンD誘導体を分析した。27ng/mLの総ビタミンDを含有する試料にビタミンD誘導体を添加した。添加された試料を3回の繰り返し(replicate)でアッセイし、総ビタミンD濃度を決定した。
チューブの種類の研究:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイを用いて、EDTAチューブと血清セパレーターチューブ(SST)との間の相関を分析した。119人のドナーからセラムレッドトップチューブ、SSTチューブ、およびEDTAチューブに血清を採取し、Centaur総ビタミンDアッセイを用いてアッセイした。各試料を3回の繰り返しで評価した。セラムとSSTとの間、およびセラム対EDTAの直線回帰相関を決定した。
方法の相関:患者の検体199個を使用して、各方法について1回の繰り返し(replicate)で、ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイを市販のFDA認可(FDA-cleared)総ビタミンDイムノアッセイと比較した。検体濃度は5〜150ng/mLであった。加えて、患者の試料23個をLC−MS/MSおよびADVIA Centaur総ビタミンDアッセイによってアッセイした。この第2集団の検体は、11〜82ng/mLであった。
結果
ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイで得られたデータは、25(OH)D2および25(OH)D3の等モル検出を実証し、LC−MS/MSへのトレーサビリティーを示した。25(OH)D2の交差反応性は、50ng/mLで105%と決定された。アッセイは、検出限界(LoD)3.0ng/mL未満、機能感度(functional sensitivity)(総CVの20%用量)4ng/mL未満、および上限250ng/mLを示した。22.1、52.3、121、および153ng/mLの試料について、総アッセイCVは、それぞれ6.4%、7.1%、4.2%、および3.7%であった。最大240ng/mLの直線性が示された。血清試料150個を用いてLC−MS/MSに対する相関研究を行い、傾き0.96、切片1.0、および回帰係数0.97を得た。
精度:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイの精度プロファイルから、総CVが7.65ng/mL総25(OH)ビタミンDでの8.8%から123.36ng/mLでの2.0%の間であることが示される。精度分析を表5に示す。
分析感度:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイの分析感度は2.4ng/mLであった。分析感度を表6に示す。
ブランク限界、検出限界、および機能感度:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイのブランク限界は2.8ng/mLであり、検出限界は3.8ng/mLであり、機能感度は4ng/mLであった(図9)。
妨害研究:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイは、内因性妨害物について検査された濃度で≦10%のバイアスを示した。内因性妨害研究の結果を表7に示す。
交差反応性:ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイは、非ヒドロキシル化型のビタミンD2およびビタミンD3、ならびに3−エピ−25(OH)D3と非常に低い交差反応性を示した。交差反応性分析の結果を表8に示す。
チューブの種類の研究:セラムレッドトップ、SST、およびEDTAの種類のチューブ中に採取したドナーの検体119個で試料チューブの種類の対比を行った。セラムレッドトップとSSTとの間の回帰分析から、相関係数(R)0.999、傾き1.01、および切片−0.14が示される(図10)。セラムレッドトップとEDTAとの間の回帰分析から、相関係数(R)0.997、傾き1.00、および切片0.41が示される(図11)。
方法の比較:検体199個を用いて、ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイと市販のFDA認可総ビタミンDアッセイを比較する試料の対比を行った。回帰分析から、相関係数(R)0.993、傾き1.00、および切片1.61が示された(図12)。加えて、ADVIA Centaur総ビタミンDアッセイと市販の総ビタミンD LC−MS/MSアッセイを比較して検体23個をアッセイした。回帰分析から、相関係数(R)0.98、傾き1.03、および切片−2.3が示された(図13)。