ES2710126T3 - Extracto de saliva completa de sanguijuela - Google Patents

Extracto de saliva completa de sanguijuela Download PDF

Info

Publication number
ES2710126T3
ES2710126T3 ES13841434T ES13841434T ES2710126T3 ES 2710126 T3 ES2710126 T3 ES 2710126T3 ES 13841434 T ES13841434 T ES 13841434T ES 13841434 T ES13841434 T ES 13841434T ES 2710126 T3 ES2710126 T3 ES 2710126T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
lse
leech
activity
saliva
extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13841434T
Other languages
English (en)
Inventor
Ahmed Merzouk
Abbas Ghawi
Abdualrahman Abdualkader
Mohamed Alaama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biopep Solutions Inc
Original Assignee
Biopep Solutions Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biopep Solutions Inc filed Critical Biopep Solutions Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2710126T3 publication Critical patent/ES2710126T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/62—Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)

Abstract

Una formulación para su uso en el tratamiento de la hiperglucemia diabética, comprendiendo la formulación un extracto de saliva completa de una sanguijuela y un vehículo farmacéuticamente eficaz, en donde el extracto es un extracto de saliva completa liofilizado.

Description

DESCRIPCION
Extracto de saliva completa de sanguijuela
Antecedentes
Campo de la invencion
Las ensenanzas proporcionadas en el presente documento generalmente se refieren a procedimientos de aislamiento y uso de un extracto de saliva completa de sanguijuela en el tratamiento de un sujeto.
Descripcion de la tecnica relacionada
La historia de seres humanos que usan sanguijuelas se remonta a varios miles de anos, y practicamente todas las civilizaciones humanas describieron el uso de sanguijuelas para tratar diferentes enfermedades. Desafortunadamente, debido, al menos, a una falta de comprension de los procesos qulmicos y mecanismos asociados con tales usos, el estado actual de la tecnica no ha podido comercializar con exito el uso de extractos de saliva de sanguijuela en el tratamiento de enfermedades.
Ha habido intentos de sacrificar sanguijuelas para extraer compuestos activos de todo el cuerpo de las sanguijuelas, de las cabezas de las sanguijuelas o de sus glandulas salivales. Se ha investigado mucho para identificar protelnas a partir de extractos de saliva de sanguijuela. Ninguno de estos esfuerzos, sin embargo, ha podido reproducir el efecto de usar una sanguijuela entera viva, con la excepcion de, quizas, del aislamiento y uso de la hirudina como anticoagulante.
Ha habido intentos de no sacrificar sanguijuelas pero, mas bien, extrayendo una solucion de saliva muy diluida de una sanguijuela viva. Desafortunadamente, estos esfuerzos se han enfrentado a dos grandes problemas: (i) la extraccion de saliva requiere una compresion manual de la sanguijuela y, como tal, no es facilmente escalable; y (ii) la saliva permanece diluida, que solo se puede usar en fresco y cualquier intento de liofilizacion reducira o eliminara completamente la actividad terapeutica del extracto de saliva de sanguijuela. Como tal, un tratamiento dependiente de la dosis o un tratamiento a concentraciones elevadas, no esta disponible para la prueba.
Un experto apreciara (i) un procedimiento para aislar un extracto refinado activo de saliva de sanguijuela (LSE) que puede almacenarse con exito durante meses o incluso anos; (ii) un procedimiento para reutilizar las sanguijuelas para producir el LSE; (iii) un procedimiento para comercializar el aislamiento y la reutilizacion de las sanguijuelas a una cantidad escalable que sea practico para la comercializacion; (iv) un procedimiento para tratar un tumor solido con la LSE; (v) un procedimiento para tratar un tumor llquido con el LSE; (vi) un procedimiento para tratar la diabetes con el LSE; (vii) un procedimiento para tratar un virus con el LSE; (viii) un procedimiento para tratar una enfermedad parasitaria con el LSE; (ix) un procedimiento para usar el LSE como antioxidante; y (x) un procedimiento para usar el LSE como antibacteriano.
Ghawi et al.: “Free radical scavenging activity of the medicinal Malaysian leech saliva extract, Hirudinaria manillensis ”, J Bioequiv Availab, 2012, S14 desvela estudios dirigidos hacia el examen de la actividad antioxidante de la secrecion de la glandula salival de la sanguijuela malaya medicinal mediante el procedimiento de la actividad de captacion de radicales libres DPPH.
Ghawi et al.: “Season variation and starvation period influence on the antithrombotic activity of leech saliva extract from the medicinal Malaysian leech, Hirudinaria manillensis ”, J Bioequiv Availab, 2012, S14 desvela la recoleccion de extracto de saliva de sanguijuela (LSE) despues de suministrar sanguijuelas en la solucion fagoestimulante a traves de una membrana de parafilm. La concentracion de protelna total se estimo utilizando el ensayo de Bradford. La actividad antitrombina se evaluo utilizando el ensayo amidolltico del sustrato sintetico S-2238 y el ensayo del tiempo de trombina in vitro.
Sumario
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona una formulacion para su uso en el tratamiento de la hipoglucemia diabetica, la formulacion comprende un extracto de saliva completa de una sanguijuela y un vehlculo farmaceuticamente eficaz, en el que el extracto es un extracto de saliva completa liofilizado.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invencion, se proporciona una formulacion para su uso en el tratamiento de la hipoglucemia diabetica como se ha descrito anteriormente, en el que la formulacion se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas de:
alimentar un agente fagoestimulante a una sanguijuela;
inducir una regurgitacion en la sanguijuela, incluyendo la induccion colocar la sanguijuela en un ambiente con una temperatura inferior a 0 °C;
recoger una saliva completa sin refinar en la regurgitacion de la sanguijuela enfriada;
retirar componentes solidos de la saliva completa sin refinar crear una saliva completa refinada; y,
liofilizar volumenes separados del extracto de saliva completa, sin que los volumenes superen los 2 ml cada uno. Las ensenanzas proporcionadas en el presente documento generalmente se refieren a procedimientos de aislamiento y uso de un extracto de sanguijuela de saliva completa en el tratamiento de un sujeto. Se proporcionan formulaciones farmaceuticas que comprenden los extractos de sanguijuela y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
Las ensenanzas incluyen un procedimiento para eliminar la saliva completa de una sanguijuela. En estas realizaciones, los procedimientos pueden incluir la alimentacion de un agente fagoestimulante a una sanguijuela; inducir una regurgitacion en la sanguijuela, incluyendo la induccion colocar la sanguijuela en un ambiente con una temperatura inferior a aproximadamente 0 °C; y, recoger la saliva completa sin refinar en la regurgitacion de la sanguijuela enfriada.
Las ensenanzas incluyen un procedimiento para crear un liofilizado, extracto de saliva completa de una sanguijuela que tiene una estabilidad mejorada. En estas realizaciones, el procedimiento puede incluir la alimentacion de un agente fagoestimulante a una sanguijuela; inducir la regurgitacion en la sanguijuela, incluyendo la induccion colocar la sanguijuela en un ambiente con una temperatura que varla de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 15 °C; recoger una saliva completa sin refinar en la regurgitacion de la sanguijuela enfriada; retirar componentes solidos de la saliva completa sin refinar crear una saliva completa refinada; y, liofilizar volumenes separados del extracto de saliva completa refinada, sin que los volumenes superen aproximadamente los 2 ml cada uno.
En algunas realizaciones, la recoleccion incluye apretar la sanguijuela para aumentar la cantidad de la saliva completa sin refinar recogida. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas revitalizar la sanguijuela calentando la sanguijuela en un bano de agua que tiene una temperatura que oscila entre aproximadamente 5 °C y aproximadamente 40 °C. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas la creacion de un extracto de saliva completa refinada; incluyendo la creacion extraer los componentes solidos de la saliva completa sin refinar. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas la creacion de un extracto de saliva completa refinada; incluyendo la creacion extraer los componentes solidos de la saliva completa sin refinar. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas liofilizar volumenes separados del extracto de saliva completa refinada, sin que los volumenes superen aproximadamente los 2 ml cada uno. Y, en algunas realizaciones, la sanguijuela es Hirudinaria manillensis.
Las ensenanzas incluyen un extracto de saliva completa de una sanguijuela liofilizado estable. En estas realizaciones, el extracto comprende un extracto de saliva completa de una sanguijuela refinada liofilizada en volumenes que no excedan de 2 ml cada uno, el extracto refinado mediante la extraccion de componentes solidos de saliva completa sin refinar para crear saliva completa refinada; en la que, el extracto tiene una actividad estable cuando se almacena para su uso a una temperatura inferior a aproximadamente -20 °C, manteniendo el extracto al menos el 70 % de la actividad durante al menos 6 meses. Y, la sanguijuela puede ser Hirudinaria manillensis.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 ilustra un procedimiento de alimentacion de un agente fagoestimulante a una sanguijuela usando una membrana, de acuerdo con algunas realizaciones.
Las figuras 2A-2C ilustran la recoleccion de extracto de saliva completa sin refinar, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 3 ilustra un espectro UV del extracto de saliva de sanguijuela refinado, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 4 ilustra una curva estandar para un ensayo de protelna de Bradford colorimetrico, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 5 muestra los resultados de la distribution del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel Laemmli SDS-PAGE al 15 %, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 6 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel Laemmli SDS-PAGE al 15 %, en la que el LSE se concentro usando precipitation con acetona, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 7 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel Laemmli SDS-PAGE al 15 %, en el que el LSE se precipito de la solution utilizando una precipitacion con acido tricloroacetico (TCA), de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 8 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel SDS-PAGE sin urea de Okajima, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 9 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando el procedimiento de electroforesis en gel Tricina SDS-PAGE, de acuerdo con algunas realizaciones.
Las figuras 10A y 10B muestran los resultados de RP-HPLC en el analisis de LSE, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 11 muestra el aislamiento de protelnas del LSE usando RP-HPLC, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 12 muestra los pesos moleculares de las dos protelnas aisladas utilizando electroforesis en gel de Tricina SDS-PAGE, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 13 ilustra la CI50 del LSE con respecto a la actividad antitrombina, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 14 muestra la relacion entre el tiempo de trombina y la concentration de protelna LSE, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 15 muestra los efectos de las condiciones de liofilizacion y las condiciones de almacenamiento sobre la actividad y la estabilidad del LSE, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 16 muestra el efecto del tiempo de liofilizacion sobre la actividad antitrombina del LSE, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 17 muestra el efecto de la luz y el recipiente sobre la actividad antitrombina de muestras de LSE (liofilizadas y no liofilizadas) almacenadas a temperatura ambiente hasta durante 7 dlas, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 18 muestra el efecto de la temperatura de almacenamiento, la luz y el recipiente sobre la actividad antitrombina de muestras de LSE (liofilizadas y no liofilizadas) durante hasta 180 dlas a 4 °C, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 19 muestra el efecto del recipiente y la liofilizacion sobre la actividad antitrombina de muestras de LSE durante hasta 180 dlas a -20 °C, de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 20 muestra que el LSE mostro una notable actividad antiproliferativa contra el cancer de pulmon microcltico (llnea celular SW1271), de acuerdo con algunas realizaciones.
Las figuras 21 y 22 muestran el efecto citotoxico de mezclas de LSE con irinotecan o carboplatino, de acuerdo con algunas realizaciones.
Las figuras 23 y 24 muestran el efecto de diferentes dosis de LSE e insulina sobre la glucemia en ayunas (mmol/l) en ratas normales y diabeticas a diversos intervalos de tiempo (h), de acuerdo con algunas realizaciones.
La figura 25 muestra que el LSE tiene un efecto profilactico sobre el inicio de la diabetes, de acuerdo con algunas realizaciones.
Las figuras 26 y 27 comparan la actividad de secuestro de radicales libres del LSE con acido L-ascorbico (vitamina C), de acuerdo con algunas realizaciones.
Descripcion detallada
Las ensenanzas proporcionadas en el presente documento generalmente se refieren a procedimientos de aislamiento y uso de un extracto de saliva completa de sanguijuela en el tratamiento de un sujeto. Se proporcionan formulaciones farmaceuticas que comprenden los extractos de sanguijuela y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
Debe apreciarse que el termino "extracto" se puede usar para hacer referencia a una forma en polvo de los compuestos de interes, una forma llquida de los compuestos de interes o uno cualquiera o cualquier combinacion de los compuestos de interes en forma de polvo o llquido. Un experto apreciara que el termino "extracto" se puede usar para hacer referencia a los compuestos de interes antes, durante, o despues de su extraccion de la sanguijuela. En algunas realizaciones, los compuestos de interes pueden sintetizarse qulmicamente utilizando procedimientos estandar conocidos por un experto, de tal manera que puedan sintetizarse y usarse solos, o en cualquier combinacion, por los expertos en la materia sin el uso de los procedimientos de extraccion ensenados en el presente documento. Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden denominarse extractos, composiciones, compuestos, agentes, agentes activos, agentes bioactivos, suplementos, farmacos y similares. En algunas realizaciones, los terminos "LSE", "extracto", "composicion de LSE", "composicion", "compuesto", "agente", "sustancia activa", "agente activo", "agente bioactivo", "suplemento", y "farmaco" se puede usar indistintamente y, deberla apreciarse que, una "formulacion" puede comprender uno cualquiera o cualquier combinacion de estos. Analogamente, en algunas realizaciones, la composicion tambien puede estar en forma llquida o seca, donde una forma seca puede ser una forma de polvo en algunas realizaciones y una forma llquida puede incluir un componente acuoso o no acuoso. Por otra parte, los terminos "actividad" o "bioactividad" pueden hacer referencia a la funcion del compuesto in vitro, en un ensayo, por ejemplo, o in vivo cuando se administra a un sujeto.
Debe apreciarse que los extractos de sanguijuela pueden aislarse o purificarse. En algunas realizaciones, los terminos "aislado" y "purificado" se pueden usar indistintamente. En algunas realizaciones, el termino "aislado" se puede usar para hacer referencia al extracto que se extrae del ambiente quimico natural de la sanguijuela, de tal manera que el extracto no esta en la forma en que existe en la naturaleza. Debe apreciarse que el termino "purificado" se puede usar para hacer referencia a un extracto de una sanguijuela Hirudinaria manillensis, en algunas realizaciones, de tal manera que los compuestos de interes se aislen del resto de la sanguijuela en una forma que se pueda administrar a un sujeto, tal como una forma soluble o una forma que puede ir en solucion acuosa. Como tal, un experto apreciara que los compuestos de interes a veces pueden ir acompanados de otros componentes que se llevan junto con el extracto. Por ejemplo, dichos otros componentes pueden incluir una o cualquier combinacion de proteinas que se encuentran activas en la sanguijuela. En algunas realizaciones, el termino "purificado" se puede usar para hacer referencia a un extracto que consiste en, o que consiste esencialmente en, uno cualquiera o cualquier combinacion de los compuestos de interes. En algunas realizaciones, el extracto incluye una solucion fagoestimulante o un componente de la solucion fagoestimulante. En algunas realizaciones, un extracto "consiste esencialmente en" uno cualquiera o cualquier combinacion de los compuestos de interes, en el que la presencia de cualquier otro componente de la sanguijuela o del procedimiento de extraccion tenga un efecto insignificante sobre la actividad de los compuestos de interes. La expresion "efecto despreciable" se puede usar para significar que la actividad no aumenta ni disminuye mas de aproximadamente el 10 % en comparacion con uno cualquiera o cualquier combinacion de los compuestos de interes, respectivamente, sin los otros componentes. En algunas realizaciones, el termino "efecto despreciable" puede usarse para hacer referencia a un cambio inferior al 10 %, inferior al 9 %, inferior al 8 %, inferior al 7 %, inferior al 6 %, inferior al 5 %, inferior al 4 % e inferior al 3 %. En algunas realizaciones, la expresion "efecto despreciable" se puede usar para hacer referencia a un cambio que oscila entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 10 %, en incrementos del 1 %. Por ejemplo, la actividad de los compuestos de interes se puede mejorar en una cantidad que oscila entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 300 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 200 %, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 250 %, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 300 %, de aproximadamente el 35 % a aproximadamente el 275 %, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 225 %, de aproximadamente el 15 % a aproximadamente el 100 %, o cualquier intervalo en ellos en incrementos del 1 %.
Se proporcionan procedimientos para extraer saliva completa de una sanguijuela. En estas realizaciones, los procedimientos pueden incluir la alimentacion de un agente fagoestimulante a una sanguijuela; inducir una regurgitacion en la sanguijuela, incluyendo la induccion colocar la sanguijuela en un ambiente con una temperatura inferior a aproximadamente 0 °C; y, recoger la saliva completa sin refinar en la regurgitacion de la sanguijuela enfriada.
Un experto apreciara que cualquier sanguijuela que tenga una saliva terapeutica puede usarse en las ensenanzas proporcionadas en el presente documento. En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia hirudinidae, a la subfamilia hirudinariae, o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en hirudo; hirudinaria; aliolimantis; limantis; asiaticobdella; goddardobdella; limnobdella; macrobdella; oxyptychus; philobdella. En algunas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en hirudo medicinalis; hirudo troctina, hirudo nipponia; hirudo orientalis; hirudo verbana; hirudinaria manillensis; hirudinaria javanica; aliolimantis africana; aliolimantis michaelseni; aliolimantis oligodonta; aliolimantis buntonesis; limantis nilotica; limantis of. nilotica; limantis paluda; asiaticobdella fenestrata; goddardobdella elegans; limnobdella mexicana; macrobdella decora; macrobdella diploteria; macrobdella diletra; oxyptychus brasiliensis; oxyptychus striatus; philobdella floridana; philobdella gracilis.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia de haemadipsidae, o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en chtonobdella; haemadipsa; idiobdella; malagdbdella; nesophilaemon. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en chtonobdella bilineata; chtonobdella whitmani; haemadipsa interrupta; haemadipsa sylvestris; haemadipsa sumatrana; idiobdella seychellensis; malagdbdella fallax; nesophilaemon skottsbergi.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia de xerobdellidae o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en diestecostoma; mesobdella; xerobdella. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en diestecostoma magna; diestecostoma mexicana; diestecostoma trujillensis; mesobdella gemmata; xerobdella lecomtei.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia de haemopidae o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en haemopis; whitmania. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en haemopis grandis; haemopis kingi; haemopis sanguisuga; haemopis terrestris; whitmania laevis.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia de semiscolecidae o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en patagoniobdella; semiscolex. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en patagoniobdella fraternal; patagoniobdella variabilis; semiscolex intermedius; semiscolex lamothei; semiscolex similis.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia de americobdellidae o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en americobdella. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en americobdella valdiviana.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia de cylicobdellidae o puede pertenecer a un genero seleccionado del grupo que consiste en cylicobdella. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en cylicobdella coccinea.
En algunas realizaciones, la sanguijuela puede pertenecer a la familia erpobdellidae. En estas realizaciones, la sanguijuela se puede seleccionar de una especie seleccionada del grupo que consiste en erpobdella mentezuma. Las sanguijuelas se pueden clasificar de acuerdo con la Tabla 1, en algunas realizaciones.
Tabla 1.
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
Se puede usar cualquier agente fagoestimulante conocido por un experto. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante puede incluir una proteina, un polipeptido, un oligopeptido o un aminoacido. En algunas realizaciones, el aminoacido es un L-aminoacido seleccionado del grupo que consiste en arginina, alanina, leucina, acido aspartico, serina, treonina, isoleucina, histidina, lisina, triptofano, glicina, fenilalanina, tirosina, valina, acido glutamico, asparagina, glutamina, cisteina, metionina y prolina. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante es arginina. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante es glicina. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante es prolina. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante es un azucar. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante es un azucar seleccionado del grupo que consiste en fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa, rafinosa, trehalosa, robosa y galactosa. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante es aceite de malz. En algunas realizaciones, el agente fagoestimulante comprende una cualquiera o cualquier combinacion de aminoacidos y/o azucares mostrados en el presente documento. Se puede utilizar cualquier disolvente adecuado para portar el fagoestimulante, polar o no polar, siempre que el disolvente no afecte sustancialmente a la actividad o la estabilidad del extracto de saliva de sanguijuela.
La temperatura de la sanguijuela que induce la regurgitacion puede oscilar entre aproximadamente -5° C y aproximadamente 15 °C, de aproximadamente -4 °C a aproximadamente 14 °C, de aproximadamente -3 °C a aproximadamente 13 °C, de aproximadamente -2 °C a aproximadamente 12 °C, de aproximadamente -1 °C a aproximadamente 11 °C, de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 10 °C, de aproximadamente -2 °C a aproximadamente 2 °C, de aproximadamente -3 °C a aproximadamente 3 °C, de aproximadamente -4 °C a aproximadamente 4 °C, de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 5 °C, o cualquier temperatura o intervalo de temperaturas en los mismos en incrementos de 1 °C. La temperatura se puede establecer utilizando cualquier procedimiento conocido por un experto. En algunas realizaciones, la temperatura se establece a 0 °C o aproximadamente 0 °C utilizando un bano de agua helada. En algunas realizaciones, se puede usar un bano de agua salada para bajar la temperatura por debajo de 0 °C, y en algunas realizaciones, se pueden utilizar otros llquidos para obtener otras temperaturas. Se puede usar cualquier procedimiento de enfriamiento que conozca a un experto para inducir el vomito a las sanguijuelas. La velocidad de congelation puede ser de 0,1 a 2 °C por minuto y, en algunas realizaciones, de 1 °C a 1,5 °C por minuto. El tiempo a la temperatura frla puede variar y puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 45 minutos, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 40 minutos, de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 25 minutos, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 35 minutos, de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 12 minutos, o cualquier tiempo en los intervalos en incrementos de 1 minuto.
Los procedimientos de creation de un extracto de saliva completa liofilizada de una sanguijuela que tiene una estabilidad mejorada se proporcionan en las ensenanzas del presente documento. En estas realizaciones, el procedimiento puede incluir la alimentation de un agente fagoestimulante a una sanguijuela; inducir la regurgitacion en la sanguijuela, incluyendo la induction colocar la sanguijuela en un ambiente con una temperatura que varla de aproximadamente -5 °C a aproximadamente 15 °C; recoger una saliva completa sin refinar en la regurgitacion de la sanguijuela enfriada; retirar componentes solidos de la saliva completa sin refinar crear una saliva completa refinada; y, liofilizar volumenes separados del extracto de saliva completa refinada, sin que los volumenes superen aproximadamente los 2 ml cada uno.
En algunas realizaciones, la recoleccion incluye apretar la sanguijuela para aumentar la cantidad de la saliva completa sin refinar recogida. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas revitalizar la sanguijuela calentando la sanguijuela en un bano de agua que tiene una temperatura que oscila entre aproximadamente 5 °C y aproximadamente 40 °C. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas la creacion de un extracto de saliva completa refinada; incluyendo la creacion extraer los componentes solidos de la saliva completa sin refinar. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas liofilizar volumenes separados del extracto de saliva completa refinada, sin que los volumenes superen aproximadamente los 2 ml cada uno. Y, en algunas realizaciones, la sanguijuela es Hirudinaria manillensis.
Las ensenanzas del presente documento proporcionan extractos de saliva completa liofilizada estable de una sanguijuela. En estas realizaciones, el extracto comprende un extracto de saliva completa de una sanguijuela refinada liofilizada en volumenes que no excedan de 2 ml cada uno, el extracto refinado mediante la extraccion de componentes solidos de saliva completa sin refinar para crear saliva completa refinada; en la que, el extracto tiene una actividad estable cuando se almacena para su uso a una temperatura inferior a aproximadamente -20 °C, manteniendo el extracto al menos el 70 % de la actividad durante al menos 6 meses. Y, la sanguijuela puede ser Hirudinaria manillensis.
En el presente documento se ha demostrado que la temperatura de almacenamiento tiene un gran efecto sobre la estabilidad de los extractos. En algunas realizaciones, por ejemplo, la saliva completa refinada se puede almacenar a una temperatura que varla entre 0 °C y -80 °C, de -20 °C a -270 °C, de -20 °C a -196 °C, de -20 °C a -80 °C, de -80 °C a -196 °C, o cualquier temperatura, o cualquier intervalo entre ellos en incrementos de 1 °C.
Un experto apreciara que los extractos pueden variar en estabilidad, pero que las ensenanzas proporcionadas en el presente documento muestran extractos con mayor estabilidad en comparacion con el estado actual de la tecnica. Un experto apreciara que las composiciones o formulaciones deben permanecer estables, o al menos sustancialmente estables, hasta que se use o active, y esto puede relacionarse con una vida util, o un tiempo entre la creacion y administration de la composition, o alguna combinacion de las mismas. En algunas realizaciones, la composition es estable, o sustancialmente estable, cuando sea utilizable segun lo previsto dentro de un perlodo de tiempo razonable, un tiempo que sea considerado razonable por un experto en las aplicaciones que se ensenan en el presente documento. En algunas realizaciones, la composicion debe ser utilizable dentro de un tiempo razonable desde la fabricacion hasta la administration de la composition y, en algunas realizaciones, la composition debe tener una vida util comercial razonable, una vida util que un experto considera razonable. Una vida util razonable puede ser de al menos 6 meses, al menos 1 ano, al menos 18 meses, al menos 2 anos, al menos 3 anos, o cualquier tiempo intermedio en incrementos de aproximadamente 1 mes, en algunas realizaciones.
En algunas realizaciones, una composicion o formulation puede considerarse "estable" si pierde menos del 10 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % de su actividad original. En algunas realizaciones, la composicion o formulacion puede considerarse "sustancialmente estable" si pierde mas de aproximadamente el 10 % de su actividad original, siempre que la composicion pueda realizar su uso previsto con un grado razonable de eficacia. En algunas realizaciones, la composicion puede considerarse sustancialmente estable si pierde actividad en una cantidad superior a aproximadamente el 12 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, o incluso aproximadamente el 70 %. La perdida de actividad se puede medir comparando la actividad en el momento del envasado con la actividad en el momento de la administracion, y esto puede incluir una vida util razonable. En algunas realizaciones, la composicion es estable o sustancialmente estable, si sigue siendo util por un perlodo que varla desde 3 meses a 3 anos, 6 meses a 2 anos, 1 ano, o cualquier perlodo de tiempo en el mismo en incrementos de aproximadamente 1 mes.
Metodos de tratamiento
Los terminos "tratar" "que trata" y "tratamiento" se pueden usar indistintamente en algunas realizaciones y se refieren a la administracion o aplicacion de las composiciones y formulaciones que se ensenan en el presente documento, incluyendo dicha administracion como un suplemento saludable o nutricional, y todas las administraciones dirigidas a la prevention, la inhibition, la mejora de los slntomas, o incluso la cura de una afeccion que se ensena en el presente documento. Los terminos “enfermedad”, "afeccion", "trastorno" y "dolencia" se puede usar indistintamente en algunas realizaciones.
El termino "sujeto" y "paciente" se pueden usar indistintamente en algunas realizaciones y se refieren a un animal tal como un mamlfero, incluyendo, pero sin limitation, no primates tales como, por ejemplo, una vaca, cerdo, un caballo, un gato, un perro, rata y raton; y primates tales como, por ejemplo, un mono o un ser humano. Como tal, los terminos "sujeto" y "paciente" tambien se pueden aplicar a aplicaciones biologicas no humanas, incluyendo, pero sin limitacion, veterinaria, animales de companla, ganado comercial, y similares.
Tratamiento del cancer (No forma parte de la invention)
El LSE ensenado en el presente documento se puede usar en el tratamiento de cancer. En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen el tratamiento de un tumor solido y, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen el tratamiento de un tumor llquido. Un experto apreciara que los canceres que pueden tratarse usando los procedimientos ensenados en el presente documento pueden incluir cualquier tejido hiperproliferativo. En algunas realizaciones, por ejemplo, cualquier cancer enumerado en la Tabla 2 puede tratarse usando los procedimientos que se ensenan en el presente documento.
Tabla 2.
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Tratamiento de la diabetes
El LSE ensenado en el presente documento se puede usar en el tratamiento de la diabetes. Ejemplos de diabetes incluyen diabetes de tipo 1, de tipo 2 y gestacional. Como tal, un experto apreciara que el LSE ensenado en el presente documento se puede usar para tratar y prevenir desequilibrios metabolicos, diabetes mellitus, un estado prediabetico, slndrome metabolico y otros trastornos relacionados, tales como diabetes autoinmune latente en adultos (denominada diabetes de tipo 1.5). Como tal, las afecciones medicas secundarias relacionadas con la diabetes tambien pueden tratarse utilizando el LSE que se ensena en el presente documento, indirecta o directamente, incluyendo cardiopatlas, ictus, tension arterial alta, complicaciones oculares (retinopatla, cataratas), enfermedad renal (nefropatla), enfermedad del sistema nervioso (neuropatla), vasculopatla periferica, enfermedad dental, gastroparesia, disfuncion sexual, y complicaciones durante el embarazo.
El termino "diabetico" en una rata puede hacer referencia a una glucemia aleatoria > 225 mg/dl o un nivel de glucemia en ayunas de > 110 mg/dl. El termino "diabetico" en un ser humano puede hacer referencia a una concentracion aleatoria de glucosa en sangre o en plasma de >200 mg/dl (> 11,1 mmol/l) o un nivel de glucosa en plasma en ayunas >126 mg/dl (>7,0 mmol/l) o un nivel de glucosa poscarga de 2 horas > 200 mg/dl (>11,1 mmol/l) durante una prueba de tolerancia oral a la glucosa. El termino "no diabetico" en una rata generalmente significa un nivel de glucosa en plasma en ayunas de <80 mg/dl o un nivel de glucosa en plasma aleatorio <200 mg/dl. El termino "no diabetico" en un ser humano puede hacer referencia a un nivel de glucosa en plasma en ayunas de <100 mg/dl (5,6 mmol/dl) o una glucosa poscarga de 2 horas <140 mg/dl (<7,8 mmol/dl) durante una prueba de tolerancia oral a la glucosa. El termino "prediabetico" en una rata puede hacer referencia a un nivel de glucosa en plasma en ayunas de aproximadamente 80 a aproximadamente 110 mg/dl. El termino "prediabetico" en un ser humano puede hacer referencia a un nivel de glucosa en plasma en ayunas de 100-125 mg/dl (5,6-6,9 mmol/l) o un nivel de glucosa poscarga de 2 horas de 140-199 mg/l (7,8- 11,1 mmol/l) durante una prueba de tolerancia oral a la glucosa. Los terminos "aleatorio" y "sin ayuno" se pueden usar en referencia a cualquier hora del dla o de la noche sin tener en cuenta el tiempo transcurrido desde la ultima comida, y el termino "ayuno" generalmente significa que no hay ingesta calorica durante al menos 12 horas. La expresion "desequilibrio metabolico" puede hacer referencia a cualquier Afeccion asociada con un aumento del nivel de glucosa en plasma. Un desequilibrio metabolico, por ejemplo, comprende diabetes mellitus, diabetes gestacional, defectos geneticos de la funcion de las celulas beta, defectos geneticos en la accion de la insulina, enfermedades del pancreas exocrino, endocrinopatlas, infecciones inducidas por farmacos o productos qulmicos, otros slndromes geneticos asociados a la diabetes, un estado prediabetico y slndrome metabolico. La expresion "slndrome metabolico" puede hacer referencia a un grupo de factores de riesgo metabolico en una persona, incluyendo, pero sin limitacion, obesidad abdominal, dislipidemia aterogenica, hipertension, resistencia a la insulina o intolerancia a la glucosa, estado protrombotico (nivel alto del inhibidor 1 del activador del plasminogeno o fibrinogeno) y estado proinflamatorio (protelna C reactiva elevada). En algunas realizaciones, el slndrome metabolico puede ser la presencia de tres o mas de los siguientes componentes: circunferencia de la cintura elevada (varones: >40 pulgadas, mujeres >35 pulgadas), trigliceridos en ayunas >150 mg/dl, HDL reducido (varones: <40 mg/dl, mujeres <50 mg/dl), presion arterial >130/85 mm Hg, y glucosa en ayunas >100 mg/dl.
Las definiciones anteriores para la diabetes siguen los patrones de la Asociacion Americana de Diabetes (ADA), la Asociacion Americana del Corazon (AHA) y el Instituto Nacional del Corazon, Pulmon y Sangre. Se pueden usar otras definiciones y pueden variar segun la region o el pals, y pueden depender del grupo o institucion (por ejemplo, ADA, Organization Mundial de la Salud (OMS), Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK/NIH), Centro para el Control de Enfermedades (CDC), etc.) proporcionando otras pautas. Los medicos tambien pueden utilizar la experiencia cllnica, el historial medico pasado de un paciente, y similares al decidir sobre un diagnostico y tratamiento. Como tal, un experto apreciara que los intervalos y medidas particulares son meramente relativos en lugar de crlticos para establecer un diagnostico o planificar un tratamiento. En algunas realizaciones, por ejemplo, cualquiera de las medidas anteriores puede variar en aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 7 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, el 40 %, el 50 %, o cualquier intervalo o cantidad en el mismo en incrementos de 0,1 %.
Tratamiento de una enfermedad viral (no parte de la invention)
El LSE ensenado en el presente documento se puede usar en el tratamiento de varios tipos diferentes de enfermedades virales. En algunas realizaciones, el virus puede ser una especie de Adenoviridae, Herpesviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae, Parvoviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridaem, Filoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae o Reoviridae.
En algunas realizaciones, las especies de virus tratados pueden seleccionarse del grupo que consiste en Adenovirus, herpes simple, tipo 1, herpes simple, tipo 2, virus Varicela zoster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus humano, herpesvirus humano, tipo 8, virus del papiloma humano, virus BK, virus JC, viruela, virus de la hepatitis B, bocavirus humano, parvovirus B19, astrovirus humano, virus de Norwalk, virus coxsackie, virus de la hepatitis A, poliovirus, rinovirus, virus del slndrome respiratorio agudo severo, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus del Nilo Occidental, virus de la rubeola, virus de la hepatitis E y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
En algunas realizaciones, la afeccion viral puede ser una afeccion identificada regionalmente seleccionada de las afecciones virales en la Tabla 3:
Tabla 3.
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
En algunas realizaciones, las composiciones ensenadas en el presente documento pueden administrarse con un segundo agente, tal como abacavir, aciclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, aoceprevir, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de la entrada, famciclovir, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidor de la fusion, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidor de la integrasa, interferon de tipo III, interferon de tipo II, interferon de tipo I, interferon, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, oseltamivir, peginterferon alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconarilo, podofilotoxina, inhibidor de la proteasa. Raltegravir, inhibidor de la transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, estavudina, potenciador sinergico (antirretroviral), aceite del arbol del te, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir y zidovudina.
Tratamiento de una enfermedad parasitaria (no parte de la invencion)
El LSE ensenado en el presente documento se puede usar en el tratamiento de varios tipos diferentes de enfermedades parasitarias. En algunas realizaciones, la enfermedad parasitaria tratada puede clasificarse como una afeccion causada por protozoos (que causan una infeccion por protozoos), helmintos (helmintiasis) y ectoparasitos. En algunas realizaciones, la enfermedad parasitaria puede seleccionarse del grupo que consiste en queratitismo por Acanthamoeba, amebiasis, ascariasis, babesiosis, balantidiasis, bailisascariasis, enfermedad de Chagas, clonorquiasis, cochliomyia, criptosporidiosis, difilobotriasis, dracunculiasis (causada por el gusano de Guinea), equinococosis, elefantiasis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isosporiasis, fiebre de Katayama, leishmaniasis, enfermedad de Lyme, Malaria, metagonimiasis, miasis, oncocercosis, pediculosis, sarna, esquistosomiasis, enfermedad del sueno, estrongiloidiasis, teniasis (causa de cisticercosis), toxocariasis, toxoplasmosis, triquinosis y tricuriasis.
En algunas realizaciones, las composiciones ensenadas en el presente documento pueden administrarse con un segundo agente, tal como tiabendazol, pamoato de pirantel, mebendazol, praziquantel, niclosamida, bitionol, oxamniquina, metrifonato, ivermectina, albendazol, benznidazol, nifurtimox y nitroimidazol.
Tratamiento de una enfermedad bacteriana (no parte de la invencion)
El LSE ensenado en el presente documento puede usarse en el tratamiento de varios tipos diferentes de enfermedades bacterianas. En algunas realizaciones, la enfermedad bacteriana puede incluir, por ejemplo, tuberculosis por Mycobacterium tuberculosis; neumonla por estreptococos y pseudomonas; una enfermedad transmitida por los alimentos de Shigella, Campylobacter o Salmonella; y, ya sea tetanos, fiebre tifoidea, difteria, slfilis o lepra. En algunas realizaciones, la enfermedad bacteriana puede ser una vaginosis bacteriana; meningitis bacteriana; neumonla bacteriana; infeccion del tracto urinario, incluyendo infecciones por E. coli; gastroenteritis bacteriana, incluyendo tambien E. coli; e infecciones bacterianas de la piel, incluyendo impetigo por S. aureus y S. pyogenes, erisipelas por Streptococcus y celulitis que puede incluir tejido conjuntivo. En algunas realizaciones, la enfermedad bacteriana puede seleccionarse del grupo que consiste en las enfermedades de la Tabla 4.
Tabla 4.
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Administration de una terapia antioxidante
El LSE ensenado en el presente documento se puede usar en terapia antioxidante. Un experto apreciara que se cree ampliamente que las especies reactivas de oxlgeno (ROS) causan o agravan varias patologlas humanas, tales como artritis, enfermedades neurodegenerativas, cancer, cardiopatla, accidente cerebrovascular y muchas otras dolencias. Se pueden usar antioxidantes para contrarrestar los efectos daninos de las ROS y, por lo tanto, prevenir o tratar enfermedades relacionadas con el estres oxidativo. En algunas realizaciones, el lEs ensenado en el presente documento puede usarse como secuestrante de radicales libres, o para prevenir la oxidation en el cuerpo. En algunas realizaciones, el LES ensenado en el presente documento se puede usar para tratar trastornos inflamatorios, trastornos endocrinos, enfermedad cardiovascular, envejecimiento, as! como servir como agente neuroprotector. En algunas realizaciones, el LES ensenado en el presente documento puede usarse para tratar la aterosclerosis. Y, en algunas realizaciones, el LES se puede administrar en combination con un medicamento para el colesterol como un bloqueador de la absorcion, un inhibidor de slntesis y un farmaco a base de niacina. En algunas realizaciones, se puede utilizar una alternativa no farmacologica, tal como beta-glucano de avena o cebada completas; psilio del salvado de trigo; o, fitoesteroles y/o fitostanoles.
En algunas realizaciones, el bloqueador de la absorcion puede ser colestiramina o ZETIA. En algunas realizaciones, el inhibidor de la slntesis puede ser una estatina, incluyendo, pero sin limitation, MEVACOR, PRAVACHOL, ZOCOR, LIPITOR, LESCOL, CRESTOR o LIVALO. En algunas realizaciones, el inhibidor de la slntesis puede ser LOVASTATINA, PRAVASTATINA o SIMVASTATINA. En algunas realizaciones, la medication a base de niacina puede ser NIASPAN o NIACOR. En algunas realizaciones, la medication para el colesterol puede ser una combination de productos como MEVACOR con NIASPAN o ZETIA con ZOCOR.
Metodos de administration
Cualquier vehlculo de administration conocido por un experto es adecuado para la administration de los compuestos, composiciones y formulaciones ensenadas en el presente documento. Un "vehlculo" puede hacer referencia a, por ejemplo, un diluyente, excipiente o portador con el que se administra un compuesto a un sujeto.
Los terminos "administration" o "administrar" pueden usarse para hacer referencia a un procedimiento para incorporar una composition en o sobre las celulas o tejidos de un sujeto, ya sea in vivo o ex vivo para probar la actividad de un sistema, as! como para diagnosticar, prevenir, tratar o mejorar un slntoma de una enfermedad o afeccion. En un ejemplo, se puede administrar un compuesto a un sujeto in vivo usando cualquier medio de administration que se ensena en el presente documento. En otro ejemplo, un compuesto puede administrarse ex vivo combinando el compuesto con tejido celular del sujeto para fines que incluyen, pero sin limitation, Ensayos para determinar la utilidad y eficacia de una composition. Y, por supuesto, las composiciones se pueden usar in vitro para probar su estabilidad, actividad, toxicidad, eficacia y similares. Cuando el compuesto se incorpora en el sujeto en combination con uno o agentes activos, los terminos "administration" o "administrar" pueden incluir la incorporation secuencial o concurrente del compuesto con los otros agentes tales como, por ejemplo, cualquier agente descrito anteriormente. Una composition puede formularse, en algunas realizaciones, de modo que sea compatible unicamente con su via de administration prevista.
Cualquier forma de dosificacion conocida por un experto puede usarse para administraciones que incluyen, por ejemplo, administraciones parenterales y no parenterales. En algunas realizaciones, la composition esta en una forma de dosificacion para administration topica. Y, en algunas realizaciones, la composition esta en una forma de dosificacion para administration por via oral. En algunas realizaciones, la forma de dosificacion puede ser una capsula o un fluido inyectable. La composition tambien se puede utilizar como suplemento dietetico. La expresion "unidad de dosificacion" puede hacer referencia a cantidades pequenas predeterminadas de un compuesto que pueden administrarse como dosis unitarias a un sujeto. Se puede seleccionar una cantidad predeterminada de compuesto activo para producir un efecto terapeutico deseado y se puede administrar con un vehlcuio farmaceuticamente aceptabie. La cantidad predeterminada en cada dosis unitaria puede depender de factores que inciuyen, pero sin iimitacion, (a) ias caracterlsticas unicas dei compuesto activo y ei efecto terapeutico particular que debe iograrse, y (b) ias iimitaciones inherentes a ia tecnica de crear y administrar taies unidades de dosificacion.
Un "vehlcuio farmaceuticamente aceptabie" es un diiuyente, adyuvante, excipiente, o vehlcuio con ei que se administra ia composicion. Un vehlcuio es farmaceuticamente aceptabie despues de ia aprobacion por parte de una agencia reguiadora estatai o federai, o de su inciusion en ia Convencion de ia Farmacopea de Estados Unidos u otras fuentes generaimente reconocidas para su uso en sujetos. Los vehlcuios farmaceuticos inciuyen cuaiquiera y todos ios disoiventes fisioiogicamente compatibies, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes retardantes de ia absorcion e isotonicos, y simiiares. Los ejempios de vehlcuios farmaceuticos inciuyen, pero sin iimitacion, ilquidos esteriies, tai como agua, aceites y ilpidos, taies como, por ejempio, fosfoilpidos y giicoilpidos. Estos ilquidos esteriies inciuyen, pero sin iimitacion, ios derivados dei petroieo, de origen animai, vegetai o sintetico tai como, por ejempio, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite minerai, aceite de sesamo y simiiares.
Los excipientes farmaceuticos adecuados inciuyen, pero sin iimitacion, aimidon, azucares, poilmeros inertes, giucosa, iactosa, sacarosa, geiatina, maita, arroz, harina, creta, gei de sliice, estearato de sodio, monoestearato de giiceroi, taico, cioruro de sodio, ieche desnatada en poivo, giiceroi, propiiengiicoi, agua, etanoi, y simiiares. En aigunas reaiizaciones, ia composicion tambien puede contener pequenas cantidades de agentes humectantes, agentes emuisionantes, agentes tamponadores dei pH, o una combination de ios mismos. Las formuiaciones oraies, por ejempio, pueden inciuir vehlcuios estandar taies como, por ejempio, caiidades farmaceuticas de manitoi, iactosa, aimidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, ceiuiosa, carbonato de magnesio y simiiares. Vease Martin, E.W. Remington's Pharmaceuticai Sciences.
Como se describe en ei presente documento, ias composiciones pueden tomar ia forma de iociones, cremas, suspensiones, emuisiones, comprimidos, plidoras, capsuias, poivos, formuiaciones de iiberacion sostenida y simiiares. En aigunas reaiizaciones, ias composiciones o formuiaciones pueden administrarse a un sujeto de cuaiquier manera no parenterai conocida por un experto, mientras que, por ei contrario, una administration parenterai impiica perforar ia piei o una membrana mucosa. Dependiendo dei tejido objetivo, ia administracion puede ser topica, orai, ocuiar, otica, nasai, urogenitai, rectai, dermica, vaginai o de otro tipo a una membrana mucosa. La administracion orai, por ejempio, puede inciuir ia administracion en ei tracto digestivo, bucai y subiinguai, y se puede usar un vehlcuio soiido o ilquido. Un experto apreciara que ei programa terapeutico seieccionado, ios agentes administrados, ei estado dei sujeto y ios efectos deseados pueden afectar a ia pauta posoiogica y ai programa utiiizado.
Las composiciones o formuiaciones pueden estar contenidas en formas que inciuyen comprimidos, trociscos, capsuias, eiixires, bebidas, suspensiones, jarabes, obieas, chicies, geies, hidrogeies y simiiares. Los comprimidos, plidoras, capsuias, trociscos ilquidos y simiiares tambien pueden contener agiutinantes, excipientes, agente disgregante, iubricantes, emoiientes, agentes queiantes, tampones, modificadores de ia tonicidad, tensioactivos, agentes eduicorantes y aromatizantes. Aigunos ejempios de agiutinantes inciuyen ceiuiosa microcristaiina, goma de tragacanto o geiatina. Aigunos ejempios de excipientes inciuyen aimidon o maitodextrina. Aigunos ejempios de agentes disgregantes inciuyen acido aiglnico, aimidon de malz y simiiares. Aigunos ejempios de iubricantes inciuyen estearato de magnesio o estearato de potasio. Un ejempio de un agente queiante es EDTA. Aigunos ejempios de tampones son acetatos, citratos o fosfatos. Aigunos ejempios de modificadores de ia tonicidad inciuyen cioruro de sodio y dextrosa. Aigunos ejempios de tensioactivos para ia miceiizacion o ei aumento de ia permeation ceiuiar inciuyen jabon de coco, detergentes anionicos, cationicos o etoxiiados. Un ejempio de un desiizante es ei dioxido de siiicio coioidai. Aigunos ejempios de agentes eduicorantes inciuyen sacarosa, sacarina y simiiares. Aigunos ejempios de agentes aromatizantes inciuyen menta, camomiia, saborizante de naranja y simiiares.
En ei tracto digestivo, por ejempio, un soiido puede inciuir una plidora, una capsuia, comprimido o tecnoiogla de iiberacion en ei tiempo en aigunas reaiizaciones; y, un ilquido puede inciuir una soiucion, gei suave, suspension, emuision, jarabe, eiixir, tintura o un hidrogei. La administracion dei tracto digestivo puede inciuir ia administracion orai o rectai utiiizando cuaiquier procedimiento conocido por un experto. Para ia administracion bucai, subiinguai y subiabiai, un soiido puede inciuir un comprimido de disgregacion orai, una peilcuia, una piruieta, una pastiiia o goma de mascar; y, un ilquido puede inciuir un coiutorio bucai, una pasta de dientes, un unguento, o un puiverizador orai.
Un experto entiende que ia cantidad de agentes administrados puede variar de acuerdo con factores taies como, por ejempio, ei tipo de enfermedad, ia edad, ei sexo y ei peso dei sujeto, as! como ei procedimiento de administracion. Los reglmenes de dosificacion tambien pueden ajustarse para optimizar una respuesta terapeutica. En aigunas reaiizaciones, se puede administrar un unico boio; se pueden administrar varias dosis divididas a io iargo dei tiempo; ia dosis puede reducirse o aumentarse proporcionaimente; o, cuaiquier combinacion de ios mismos, segun io indicado por ias exigencias de ia situation terapeutica y ios factores conocidos por un experto en ia tecnica. Cabe senaiar que ios vaiores de dosificacion pueden variar con ia gravedad de ia afeccion a aiiviar, as! como si ia administracion es profiiactica, de tai manera que ia afeccion en reaiidad no ha comenzado o producido slntomas. Los reglmenes de dosificacion se pueden ajustar a io iargo dei tiempo de acuerdo con ia necesidad individuai y ei criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y cualquier intervalo de dosis establecido en el presente documento es solo un ejemplo y no limita los intervalos de dosis que se pueden seleccionar.
Se puede usar una "cantidad eficaz" de un compuesto para describir una cantidad terapeuticamente eficaz o una cantidad profilacticamente eficaz. Una cantidad eficaz tambien puede ser una cantidad que mejore los slntomas de una enfermedad. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" puede hacer referencia a una cantidad que es eficaz a las dosis y perlodos de tiempo necesarios para lograr un resultado terapeutico deseado y tambien puede hacer referencia a una cantidad de compuesto activo, profarmaco o agente farmaceutico que provoca cualquier respuesta biologica o medicinal en un tejido, sistema, o tema que buscado un investigador, veterinario, medico u otro medico cllnico que pueda ser parte de un plan de tratamiento que lleve a un efecto deseado. En algunas realizaciones, la cantidad terapeuticamente eficaz debe administrarse en una cantidad suficiente para dar como resultado una mejorla de uno o mas slntomas de un trastorno, prevencion del avance de un trastorno o regresion de un trastorno.
En algunas realizaciones, por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz puede hacer referencia a la cantidad de un agente que proporciona una respuesta medible de al menos el 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos el 95 %, o al menos el 100 % de una accion deseada de la composicion.
En los casos de prevencion o inhibition de la aparicion de una enfermedad o trastorno, o cuando una administracion se considere profilactica, se puede usar una cantidad profilacticamente eficaz de una composicion o formulation ensenada en el presente documento. Una "cantidad profilacticamente eficaz" puede hacer referencia a una cantidad que es eficaz a las dosis y perlodos de tiempo necesarios para lograr un resultado profilactico deseado, tales como prevenir la aparicion de una quemadura de sol, una inflamacion, alergia, nauseas, diarrea, infection, y similares.
Normalmente, una dosis profilactica se usa en un sujeto antes de la aparicion de una enfermedad, o en una etapa temprana de la aparicion de una enfermedad, para prevenir o inhibir la aparicion de la enfermedad o los slntomas de la enfermedad. Una cantidad profilacticamente eficaz puede ser menor que, mayor que o igual que una cantidad terapeuticamente eficaz.
En algunas realizaciones, una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de una composicion puede variar en concentration desde aproximadamente 0,01 nM hasta aproximadamente 0,10 M; desde aproximadamente 0,01 nM hasta aproximadamente 0,5 M; desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 150 nM; desde aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 500 pM; desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 1000 nM, 0,001 pM a aproximadamente 0,10 M; desde aproximadamente 0,001 pM hasta aproximadamente 0,5 M; desde aproximadamente 0,01 pM hasta aproximadamente 150 pM; desde aproximadamente 0,01 pM hasta aproximadamente 500 pM; desde aproximadamente 0,01 pM hasta aproximadamente 1000 nM, o cualquier intervalo en los mismos. En algunas realizaciones, las composiciones pueden administrarse en una cantidad que oscila de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg; desde aproximadamente 0,005 mg/kg hasta aproximadamente 400 mg/kg; desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 300 mg/kg; desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 250 mg/kg; desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg; desde aproximadamente 0,2 mg/kg hasta aproximadamente 150 mg/kg; desde aproximadamente 0,4 mg/kg hasta aproximadamente 120 mg/kg; de aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, o cualquier intervalo en los mismos, en el que a menudo se supone que un sujeto humano tiene un promedio de alrededor de 70 kg.
En algunas realizaciones, las composiciones o formulaciones pueden administrarse junto con al menos otro agente terapeutico para la afeccion que se esta tratando. Las cantidades de los agentes se pueden reducir, incluso sustancialmente, de tal manera que la cantidad del agente o agentes deseados se reduzca en la medida en que se observe una respuesta significativa del sujeto. Una "respuesta significativa" puede incluir, aunque sin limitation, una reduction o elimination de un slntoma, un aumento visible en un efecto terapeutico deseable, una respuesta mas rapida al tratamiento, una respuesta mas selectiva al tratamiento o una combination de los mismos. En algunas realizaciones, el otro agente terapeutico puede administrarse, por ejemplo, en una cantidad que varla desde aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0,5 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 250 pg/kg, desde aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 100 pg/kg desde aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 50 pg/kg, o cualquier intervalo en ellos. Pueden administrarse terapias de combinacion, por ejemplo, durante 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 1 dlas, 2 dlas, 3 dlas, 4 dlas, 5 dlas, 6 dlas, 7 dlas, 8 dlas, 9 dlas, 10 dlas, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, cualquier combinacion de los mismos, o cualquier cantidad de tiempo considerada deseable por un experto. Los agentes pueden administrarse concomitantemente, secuencialmente, o clclicamente a un sujeto. La terapia de ciclado implica administrar un primer agente durante un perlodo de tiempo predeterminado, administrar un segundo agente o terapia durante un segundo perlodo de tiempo predeterminado, y repetir este ciclo para cualquier proposito deseado tal como, por ejemplo, para mejorar la eficacia del tratamiento. Los agentes tambien pueden administrarse concurrentemente. El termino "concurrentemente" no se limita a la administracion de agentes exactamente al mismo tiempo, sino que mas bien significa que los agentes pueden administrarse en una secuencia y en un intervalo de tiempo tal que los agentes pueden trabajar juntos para proporcionar un beneficio adicional. Cada agente puede administrarse por separado o en conjunto en cualquier forma apropiada utilizando cualquier medio apropiado de administrar el agente o agentes. Un experto puede seleccionar facilmente la frecuencia, la duracion, y quizas el ciclo de cada administracion concurrente.
Cada uno de los agentes descritos en el presente documento puede administrarse a un sujeto en terapia de combinacion. En algunas realizaciones, los agentes pueden administrarse en puntos en el tiempo que varlan en aproximadamente 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 48 horas o 1 semana en el tiempo. En algunas realizaciones, al menos uno de los agentes es un agente inmunomodulador. En otras realizaciones, los agentes pueden incluir antiproliferativos, antineoplasicos, antimitoticos, antiinflamatorios, antiagregantes plaquetarios, anticoagulantes, antifibrinas, antitrombinas, antibioticos, antialergicos, antioxidantes, y cualquier profarmaco, cofarmaco, metabolitos, analogos, homologos, congeneres, derivados, sales y combinaciones de los mismos.
Sin pretender limitarse a ninguna teorla o mecanismo de accion, los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente las ensenanzas presentadas en el presente documento. Debe apreciarse que hay varias variaciones contempladas dentro de la experiencia en la tecnica, y que los ejemplos no pretenden interpretarse como que proporcionan limitaciones a las reivindicaciones.
Ejemplo 1. Un procedimiento para extraer toda la saliva de una sanguijuela.
Este ejemplo muestra que las sanguijuelas pueden ser alimentadas con un agente fagoestimulante, inducidas a regurgitar el agente para recolectar toda la saliva como una saliva completa sin refinar en la regurgitacion, y luego revitalizar para reprocesar para recolectar mas saliva. La regurgitacion puede inducirse, por ejemplo, reduciendo significativamente la temperatura corporal de las sanguijuelas a un estado de paralisis o casi paralisis para inducir un vomito. A continuacion, se pueden calentar las sanguijuelas para reanimar, o revitalizar, las sanguijuelas para el almacenamiento y/o el reprocesamiento para recoger mas saliva.
Las sanguijuelas fueron recolectadas por un proveedor local del lago natural, Cheneh, localizado en Terengganu, Malasia. Las sanguijuelas se mantuvieron a temperatura ambiente durante un ciclo de 12 horas:12 horas de luz y oscuridad en recipientes de plastico bien aireados llenos de agua corriente sin clorar, que se cambio regularmente cada 2-3 dlas.
La figura 1 ilustra un procedimiento de alimentacion de un agente fagoestimulante a una sanguijuela usando una membrana, de acuerdo con algunas realizaciones. Como se muestra en la figura 1, las sanguijuelas 105 se alimentaron con una solucion del agente fagoestimulante 110 que comprendla arginina 0,001 M en solucion salina normal. Las sanguijuelas 105 se alimentaron utilizando el dispositivo de alimentacion que tiene la membrana 120 de parafilm estirada a traves del embudo de vidrio 100 lleno con la solucion fagoestimulante 110 calentada a una temperatura de 37 °C. Las sanguijuelas muertas de hambre 105 se unen a la membrana 120, se alimentan succionando la solucion fagoestimulante 110 a traves de la membrana 120 hasta que se hayan saciado y se caen espontaneamente.
Las figuras 2A-2C ilustran la recoleccion de extracto de saliva completa sin refinar, de acuerdo con algunas realizaciones. Las sanguijuelas engordadas 105 que se alimentaron con la solucion fagoestimulante 110 se transfirieron a recipientes de polipropileno 205 como se muestra en la figura 2A, se sumergieron en un bano de hielo 210 durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos como se muestra en la figura 2B y se indujo el vomito de una saliva sin refinar 215 como se muestra en la figura 2C.
La baja temperatura indujo una regurgitacion de la solucion fagoestimulante 110, as! como una especie de paralisis o casi paralisis de la sanguijuela 105. Las sanguijuelas paralizadas 105 se exprimieron para extraer la saliva completa sin refinar 215 adicional sin danar a las sanguijuelas 105. Una valiosa consideracion del proceso es que se encontro que las sanguijuelas 105 recuperan facilmente su actividad al sumergirlas en un bano de agua tibia a 37 °C durante aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos, despues de lo cual se revitalizan y se pueden almacenar para su reutilizacion.
La saliva completa sin refinar fue un fluido incoloro que se agrupo y centrifugo a 4 °C y 9000 rpm durante 15 minutos para eliminar los solidos y refinar toda la saliva. Para refinar aun mas la saliva completa, el sobrenadante se filtro utilizando un papel de filtro de 0,45 pm. El extracto refinado de saliva de sanguijuela se dividio en allcuotas en tubos de vidrio de fondo plano de color ambar en cantidades que no excedlan los 2 ml para un ciclo de liofilizacion de 24 horas. Antes de la liofilizacion, los extractos refinados se congelaron a -80 °C durante 30 minutos. Despues de las liofilizaciones, los extractos refinados se mantuvieron a -80 °C en los tubos de vidrio de fondo plano color ambar cerrados.
Ejemplo 2. Caracterizacion quimica del extracto de saliva de sanguijuela.
Este ejemplo proporciona una caracterizacion quimica del extracto de saliva refinado de sanguijuela (LSE).
Se usaron los procedimientos estandar conocidos por los expertos en la tecnica para producir espectros UV del LSE. Los espectros se obtuvieron escaneando y midiendo la Amax, mostrando un espectro de proteinas optimo con valores de 2 Amax a 199 nm y 207 nm.
La figura 3 ilustra un espectro UV del extracto de saliva de sanguijuela refinado, de acuerdo con algunas realizaciones. Los espectros del extracto de saliva de las sanguijuelas se determinaron utilizando un espectrofotometro UV en las siguientes etapas: a) la lampara UV se calento durante aproximadamente 15 minutos, b) el instrumento se ajusto al modo de espectro, c) las longitudes de onda se ajustaron a Amin = 190 nm, y una Amax = 800 nm, d) se uso un blanco (la solucion fagoestimulante) para calibrar a cero.
Se usaron procedimientos estandar conocidos por los expertos para producir un ensayo cuantitativo de proteno colorimetrico, en el que se uso un kit de reactivos con seroalbumina bovina (BSA) como proteina estandar. Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72: 248-254(1976). Se uso una solucion fagoestimulante con arginina 0,001 M en NaCl 0,15 M como blanco, y se preparo una serie de concentraciones conocidas de BSA (10 pg/ml a 250 pg/ml) en la solucion fagoestimulante. Se prepararon tres diluciones de LSE en la solucion fagoestimulante y volumenes de 100 pl de BSA, se introdujeron alicuotas de LSE y blanco en tubos EPPENDROF con un volumen igual de reactivo de Bradford y se mezclaron bien. La absorbancia a 595 nm (A595) se midio utilizando un lector de microplacas. Los valores A595 del blanco se restaron de los valores de BSA y LSE, y se preparo una curva estandar de las concentraciones conocidas de BSA contra sus valores de A595 para determinar la concentracion de proteina total del extracto de saliva de sanguijuela del grafico.
La figura 4 ilustra una curva estandar para un ensayo de proteina de Bradford colorimetrico, de acuerdo con algunas realizaciones. La curva estandar fue Y = 0,001X-0,011, en la que: X = concentracion de BSA (pg/ml) e Y = absorbancia a 595 nm, R2=0,993. Se descubrio que la concentracion de proteina total del LSE incoloro recolectado de las sanguijuelas sin alimento durante 16 semanas fue de 119,691 ± 8,690 pg/ml, mientras que las sanguijuelas sin alimento durante 22 semanas produjeron LSE con una concentracion de proteina total de 62,682 ± 2,459 pg/ml. La Tabla 2 describe los resultados de la concentracion de proteina total de LSE recolectada de las sanguijuelas sin alimento durante 16 y 22 semanas como la media de los triplicados., expresado como la media ± desviacion estandar SD (n = 3).
Tabla 2.
Figure imgf000020_0001
Se usaron procedimientos de electroforesis en gel estandar conocidos por los expertos en la materia para producir distribuciones de peso molecular del LSE. La separation de las moleculas dentro de un gel esta determinada por el tamano relativo de los poros formados dentro del gel. El tamano de los poros de un gel esta determinado por dos factores, la cantidad total de acrilamida presente (designada como % T) y la cantidad de reticulante (% C). A medida que aumenta la cantidad total de acrilamida, el tamano de los poros disminuye.
Electroforesis en gel Laemmli SDS-PAGE de LSE
El procedimiento de electroforesis en gel SDS-PAGE de Laemmli se usa habitualmente y es conocido por los expertos en la tecnica. El procedimiento es ampliamente utilizado para separar protelnas basadas en la movilidad electroforetica.
SOLUCIONES MADRE Y TAMPONES: Se prepararon soluciones madre y tampones para la electroforesis en gel de Laemmli SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio) de la siguiente manera:
En la preparation de soluciones madre, se preparo una acrilamida/bisacrilamida (30 % de T, 2,67 % de C) (AB 30), calculando el % de C y el % de T segun (Hjerten, 1962):
g de a c r ila m id a g b is a c r ila m id a . %T = 100 m l de so lu c io n ’
y
%c = ( g de a c r ila m id a
g d e a c r ila m id a g b isa c r ila m id a)x100;
de modo que se disolvieron 29,2 g de acrilamida 29,2 g y 0,8 g de bisacrilamida en agua destilada y el volumen se llevo a 100 ml en un matraz volumetrico. La solucion se filtro utilizando papel de filtro WHATMAN de grado 1 al vaclo. La solucion se mantuvo en un recipiente oscuro a 4 °C. Se preparo un SDS al 10 % (p/v) disolviendo 10 g de SDS en 90 ml de agua con agitation suave y el volumen se llevo a 100 ml con agua destilada en un matraz volumetrico. La solucion se mantuvo a temperatura ambiente.
En la preparacion del 10 % de APS (persulfato de amonio; preparado y usado fresco a diario) solucion madre como iniciador de la polimerizacion, se disolvieron 100 mg de APS en 1 ml de agua destilada y se uso inmediatamente. En la preparacion de un tampon Tris-HCI 1,5 m, pH 8,8 se disolvieron 18,15 g de base Tris (tris (hidroximetil)aminometano) en 80 ml de agua destilada y el pH se ajusto a 8,8 con HCl 6N. El volumen total se llevo a 100 ml con agua destilada y se almaceno a 4 °C.
En la preparacion de un tampon tris-HCI 0,5 M, pH 6,8, se disolvieron 6 g de base Tris en 60 ml de agua destilada. El pH se ajusto a 6,8 con HCl 6N. El volumen total se llevo a 100 ml con agua destilada y se almaceno a 4 °C.
En la preparacion de un tampon reductor de SDS (tampon de muestra), se mezclaron 1,25 ml de tris-HCl 0,5 M con 2,5 ml de glicerol, 2 ml de s Ds al 10 % y 0,2 ml de azul de bromofenol al 0,5 % (p/v). El volumen total se llevo a 10 ml con agua destilada en un matraz volumetrico. El tampon se almaceno a temperatura ambiente. Se anadieron 50 pl de p-mercaptoetanol a 950 pl de tampon de muestra en el momento de su uso.
En la preparacion de un tampon de electrodo 10x (de carrera), pH 8,3, se disolvieron 30,3 g de la base Tris, 144,0 g de glicina y 10,0 g de SDS en agua destilada con agitacion suave y el ultimo volumen se llevo a 1 litro con agua destilada. El tampon se mantuvo a temperatura ambiente. Cuando se paso el gel, se tomaron 100 ml de este tampon y el volumen se llevo a 1 litro.
PREPARACION DEL GEL: El procedimiento de electroforesis en gel se llevo a cabo utilizando un instrumento BIO RAD de mini protelna tetra celular. El gel (6X8 cm X1 mm) se preparo usando placas de vidrio, un vertedor de gel, un gel de resolution y un gel de apilamiento de la siguiente manera:
En la preparacion de un gel de resolucion al 15 %, se mezclaron 5 ml de la solucion madre de acrilamida/bisacrilamida, 2,4 ml de agua destilada, 2,5 ml del tampon tris a pH 8,8 y 0,1 ml de la solucion madre de SDS y se desgasificaron durante aproximadamente 15 minutos, y se anadieron 50 pl de la solucion madre de APS y 5 pl de TEMED (N, N, N', N'-tetrametiletilendiamina).
En la preparacion del gel de apilamiento, se mezclaron 1,7 ml de la solucion madre de acrilamida/bisacrilamida, 5,7 ml de agua destilada, 2,5 ml del tampon tris a pH 6,8 y 0,1 ml de SDS y se desgasificaron durante aproximadamente 15 minutos. Se anadieron 50 pl de la solucion madre de APS y 10 pl de TEMED.
El gel de resolucion se vertio en las placas de gel utilizando una jeringa de plastico y 1,5 cm sobre el gel de separacion se dejo vaclo para el gel de apilamiento. Se colocaron 100 pl de isopropanol sobre la superficie del gel para suavizar y evitar la deshidratacion, y se dejo que el gel polimerizara durante aproximadamente 45 minutos. El isopropanol se elimino despues de la polimerizacion del gel de resolucion y el gel de apilamiento se anadio despues de lavar la superficie del gel de resolucion con un tampon de gel de separacion. Se anadio un peine para formar celulas y el gel de apilamiento se dejo polimerizar durante aproximadamente 30 minutos y el peine se retiro del gel. Las celulas se lavaron con el tampon de electroforesis, la placa de gel se coloco en el tanque de electroforesis y el tanque se lleno con el tampon de electroforesis.
PREPARACION DE LSE: el LSE se liofilizo como se describe en el presente documento y el polvo de LSE se disolvio en un tampon de muestra y se calento a 95 °C durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio SDS al tampon de muestra para ayudar en la desnaturalizacion de las protelnas, enmascarar la superficie de protelnas con cargas negativas para equilibrar la relacion carga/tamano para todas las protelnas, de tal manera que la separacion se basara solo en el tamano de la protelna. El calentamiento de las muestras de protelnas antes de cargarlas ayuda a desnaturalizar completamente todas las protelnas, aumenta la solubilidad y la reduccion de la reduccion de disulfuro sin degradation de las protelnas (Voerman, 1998).
CARRERA DEL GEL: la muestra se aplico a las celulas utilizando una micropipeta y se aplico un marcador peptldico a una celula. La tapa de la electroforesis se coloco con cuidado, los electrodos se conectaron a una fuente de energla y la electroforesis se paso durante 35 minutos a 200V.
El colorante azul brillante de Coomassie se utilizo para visualizar protelnas y determinar los pesos moleculares de los geles de poliacrilamida. Se preparo una solution colorante madre de 1 l disolviendo 1 g de azul brillante Coomassie R-250 en 450 ml de metanol y 100 ml de acido acetico glacial. Se anadio agua destilada para aumentar el volumen total a 1 l. La solucion de colorante madre se filtro utilizando papel de filtro WHATMAN de grado 1 y se mantuvo a temperatura ambiente. Se preparo una solucion decolorante de 1 l mezclando 100 ml de metanol con 100 ml de acido acetico glacial y anadiendo agua destilada para aumentar el volumen total a 1 l.
Tras la electroforesis, El gel se transfirio a un recipiente de plastico que contenla solucion de colorante madre y se dejo all! durante 30 minutos. La solucion de tincion se descarto y el gel se incubo en la solucion decolorante durante 30 minutos con agitation. Esta etapa se repitio de tres a cuatro veces con una solucion decolorante nueva y el gel se incubo en una solucion decolorante durante la noche. Se tomo una imagen y se documento el gel utilizando un generador de imagenes de gel BIO RAD.
Electroforesis en gel de SDS-PAGE sin urea de LSE para peptidos
Esta parte del analisis de electroforesis en gel se realizo de acuerdo con el procedimiento de Okajima, que se considera que da mejores resultados para los peptidos. (Okajima, et al., 1993). El procedimiento generalmente utiliza las mismas soluciones madre y tampones como el procedimiento Laemmli SDS-PAGE, siendo una exception el tampon de gel de separacion.
TAMPON DE GEL DE SEPARACION/APILACION: Se preparo un tampon tris-HCI 3M, pH 8,45 disolviendo 36,3 g de la base Tris en agua destilada, el pH se ajusto a 8,45 con HCl 6N y el volumen total se llevo a 100 ml con agua destilada.
PREPARACION DEL GEL: En la preparation del gel de resolucion (separacion) al 19,2 %, se mezclaron 10 ml de la solucion madre de AB 30 con 3,75 ml del tampon de separacion, 0,15 ml de SDS y 1 ml de agua. La mezcla se desgasifico durante 15 minutos utilizando el sonicador y se anadieron 50 pl de la solucion madre de APS y 10 pl de la solucion madre TEMED. La mezcla se vertio en las placas de gel utilizando una jeringa de plastico y se dejo polimerizar durante 45 minutos. En la preparacion del gel de apilamiento al 4%, se mezclaron 1,3 ml de la solucion madre de AB 30 con 2,5 ml de tampon de gel de apilamiento, 0,1 ml de SDS y 6 ml de agua. La mezcla se desgasifico durante 15 minutos antes de anadir 50 pl de APS y 10 pl de TEMED. El tampon de muestra utilizado para el procedimiento de Laemmli anterior se uso para este procedimiento.
PREPARACION DE LSE Y CARRERA DEL GEL: el LSE se liofilizo como se describe en el presente documento y el polvo de LSE se disolvio en un tampon de muestra y se calento a 95 °C durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio SDS al tampon de muestra para ayudar en la desnaturalizacion de las protelnas, enmascarar la superficie de protelnas con cargas negativas para equilibrar la relacion carga/tamano para todas las protelnas, de tal manera que la separacion se basara solo en el tamano de la protelna. Se aplicaron 20 pl de la muestra para el gel. El gel se paso durante 100 minutos a 100V. Se uso tincion con azul de Commassie para tenir el gel.
Electroforesis en gel de Tricina SDS-PAGE del LSE para peptidos en el intervalo de 1-100 kDa
Esta parte del analisis de electroforesis en gel se realizo de acuerdo con un procedimiento de tricina SDS-PAGE usado habitualmente para separar protelnas en el intervalo de peso molecular mas pequeno de 1-100 kDa y preferentemente se uso para resolver protelnas menores de 30 kDa. El uso de tricina en lugar de glicina como agente de reduccion proporciona una mejor separacion de los peptidos que tienen tales pesos moleculares bajos.
SOLUCIONES MADRE Y TAMPONES: La solucion madre AB 30, 10 % (p/v) de SDS, 10 % (p/v) de APS y el tampon de muestra (tampon reductor de SDS) es la misma que se utilizo en el procedimiento de Laemmli SDS-PAGE descrito en el presente documento; y, se utiliza el tampon de gel de separacion (apilamiento) del procedimiento Okajima. De otro modo, este procedimiento generalmente utiliza las mismas soluciones madre y tampones que el procedimiento Laemmli SDS-PAGE.
Se preparo un tampon de catodo 10x disolviendo 12,1 g de base Tris, tricina y 1 g de SDS en agua destilada. El volumen total se llevo a 100 ml y la solucion se mantuvo a temperatura ambiente. El tampon se diluyo 10 veces antes de su uso. Ademas, se preparo un tampon de anodo 10x disolviendo 12,1 g de base Tris en agua y ajustando el pH a 8,9 con HCl 6 N. El volumen total se llevo a 100 ml y la solucion se mantuvo a temperatura ambiente. El tampon se diluyo 10 veces antes de su uso.
Se preparo una solucion de fijacion de glutaraldehldo al 5 % anadiendo 10 ml de glutaraldehldo al 50 % a agua destilada y llevando el volumen total a 100 ml. La solucion se filtro utilizando papel de filtro WHATMAN de grado 1 bajo una campana de extraccion y se uso fresco.
PREPARACION DEL GEL: Los geles se prepararon de acuerdo con procedimientos conocidos en la tecnica. (Schagger & von Jagow, 1987). En la preparacion del gel de resolucion (separacion) al 16 %, se mezclaron 5 ml de AB 30 con 5 ml del tampon de separacion, 1,5 ml de glicerol y 1,5 ml de agua destilada. La mezcla se desgasifico durante 15 minutos y se anadieron 50 pl de la solucion madre de APS y 5 pl de la solucion madre de TEMED. El gel se vertio en la placa de gel sin demora. La superficie del gel se cubrio con 100 pl de isopropanol y se dejo polimerizar durante 45 minutos. En la preparacion del gel de apilamiento al 4%, Se mezclo 1 ml de AB 30 con 3 ml de tampon de gel y 11 ml de agua destilada. La mezcla se desgasifico durante 15 minutos y se anadieron 100 pl de la solucion madre de APS y 10 pl de la solucion madre de TEMED. Sin demora, el gel se vertio sobre la placa de gel. El peine se coloco y el gel se dejo polimerizar durante 30 minutos.
PREPARACION DE LSE Y CARRERA DEL GEL: el LSE se liofilizo como se describe en el presente documento y el polvo de LSE se disolvio en un tampon de muestra y se calento a 95 °C durante 5 minutos en un bano de agua. Se anadio SDS al tampon de muestra para ayudar en la desnaturalizacion de las protelnas, enmascarar la superficie de protelnas con cargas negativas para equilibrar la relacion carga/tamano para todas las protelnas, de tal manera que la separacion se basara solo en el tamano de la protelna. Se aplicaron 20 pl de la muestra para el gel. El gel se paso durante 5 horas, funcionando a 40 V durante las primeras 3 horas y aumentando el voltaje en 10 V cada 30 minutos. Tras la electroforesis, el gel se lavo con agua destilada durante 5 minutos y se repitio tres veces. El gel lavado se transfirio a un recipiente de la solucion fijadora durante 1 hora y se lavo con agua destilada para eliminar el glutaraldehldo. El gel fijo se coloco en una solucion de tincion con azul de Commassie durante 30 minutos con agitacion suave. La solucion decolorante se aplico durante 30 minutos con agitacion y esta etapa se repitio varias veces hasta que la banda se aclaro.
Los resultados de la electroforesis en gel
La figura 5 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel Laemmli SDS-PAGE al 15 %, de acuerdo con algunas realizaciones. El carril 1 es el marcador peptldico y los carriles 1-4 representan el numero de la semana en que se extrajo la saliva por duplicado; en la que, los carriles 1-T son la semana 2, los carriles 2-2 son la semana 3, los carriles 3-3' son la semana 4, y los carriles 4-4' son la semana 0. Tal como se puede observar, el procedimiento funciona bien, como los resultados mostraron buena resolucion con bandas altamente aisladas.
La figura 6 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel Laemmli s DS-PAGE al 15 %, en la que el LSE se concentro usando precipitacion con acetona, de acuerdo con algunas realizaciones. Este procedimiento mostro una alta resolucion y bandas claras, con una distribucion de peso molecular de protelnas que va desde 10812 Da hasta 88210 Da. Los carriles 1 y 2 son LSE, y el carril 4 es el marcador peptldico.
La figura 7 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel Laemmli s DS-PAGE al 15 %, en el que el LSE se precipito de la solucion utilizando una precipitacion con acido tricloroacetico (TCA), de acuerdo con algunas realizaciones. Los resultados muestran bandas claras con una alta resolucion, aunque la precipitacion con acetona dio mejor resolucion para las bandas de protelnas. Los carriles 2 y 3 son LSE, y el carril 1 es el marcador peptldico. La figura 8 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando la electroforesis en gel SDS-PAGE sin urea de Okajima, de acuerdo con algunas realizaciones. Se mostro que los peptidos y protelnas de peso molecular mas pequeno tenlan buena resolucion con bandas claras. El intervalo de peso molecular es mas amplio en comparacion con el procedimiento clasico Laemmli SDS-PAGE, dado que se detectaron protelnas tan pequenas como de 6,5 kDa. Los carriles 2 y 3 son LSE, y el carril 1 es el marcador peptldico.
La figura 9 muestra los resultados de la distribucion del peso molecular de la protelna de LSE de una sanguijuela de Malasia, Hirudinaria manillensis, utilizando el procedimiento de electroforesis en gel Tricina SDS-PAGE, de acuerdo con algunas realizaciones. Los resultados mostraron mas de 20 protelnas y peptidos con un peso molecular de 4276 Da a 44386 Da. Los carriles 2 y 3 son LSE, y el carril 1 es el marcador peptldico.
Los datos se compararon bien con los valores bibliograficos conocidos de especies de Hirudinaria, tal como bufridina (7 kDa), manilasa (58 kDa), hirulina P18 (6,8 kDa) y gelina (8,2 kDa). Los datos sugieren que otras protelnas pueden ser compartidas con otras especies, tal como Calin (65 kDa), lisozima de Destabilase (12 kDa), lefaxina (30 kDa), Hirudina (7 kDa) y hialuronidasa (28,5 kDa).
HPLC de fase inversa de LSE
Este ejemplo muestra como usar la cromatografla analltica (Tampon (A), 0,1 % de TFA en agua y tampon (B), 0,1 % de TFA en acetonitrilo) del extracto de saliva en bruto para identificar mas de 30 picos con alta resolucion en el LSE. En particular, puede usarse HPLC de fase inversa (RP-HPLC).
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS: Una columna Agilent C18 RP, tampon (A) TFA al 0,1 % en agua, tampon (B) TFA al 0,1 % en acetonitrilo, un caudal de 1 ml/min y un gradiente del 5 %: 5 % (B) durante 5 minutos, 5-90 % (B) durante 40 minutos de longitud de onda 214 nm, Una saliva liofilizada, B saliva fresca. El extracto de saliva liofilizado despues de la reconstitucion en destilado se aplico a la columna C18 RP a un caudal de 1 ml/min y un gradiente de 5 % de (B) durante 5 minutos, seguido de 5 %-90 % (B) durante 40 minutos y luego 90 % de (B) en 5 minutos y finalmente 90 % -5 % de (B) durante 5 minutos. El detector de UV se ajusto a 214 nm y se inyecto un volumen de 100 pl en el bucle. Se ejecuto un blanco (solucion salina 0,15 M arginina 0,001 M) antes de cada analisis.
Las figuras 10A y 10B muestran los resultados de RP-HPLC en el analisis de LSE, de acuerdo con algunas realizaciones. Tal como se muestra, los resultados fueron los mismos, o al menos sustancialmente similares, para extractos de saliva liofilizados (Figura 10A) y frescos (Figura 10B).
La figura 11 muestra el aislamiento de protelnas del LSE usando RP-HPLC, de acuerdo con algunas realizaciones. Tal como se puede observar, se aislaron 30 picos del LSE. Los ejemplos de dos protelnas aisladas del LSE se indican mediante flechas.
La figura 12 muestra los pesos moleculares de las dos protelnas aisladas utilizando electroforesis en gel de Tricina SDS-PAGE, de acuerdo con algunas realizaciones. El carril 1 es el marcador peptldico, el carril 2 es la protelna 2 y el carril 3 es la protelna 1. Los pesos moleculares de las dos protelnas aisladas, protelna 1 y protelna 2, fueron 6289,799 Da y 14244,58 Da, respectivamente.
Actividad anticoagulante de LSE (no parte de la invencion)
Este ejemplo muestra que (i) el LSE liofilizado retiene la actividad anticoagulante y (ii) los componentes activos del LSE se pueden identificar utilizando procedimientos conocidos. El LSE se congelo a -40 °C, se liofilizo, se disolvio en 60 pl de agua destilada y se uso para evaluar la actividad anticoagulante de porciones aisladas de LSE. Las protelnas aisladas se identificaron y evaluaron para determinar la actividad anticoagulante y los resultados revelaron dos protelnas activas que prolongan el tiempo de trombina. Les dieron los nombres, “protelna 1” y “protelna 2” y tiempo de trombina prolongado en 26,23 % y 31,65 %, respectivamente. Las protelnas aisladas tambien se evaluaron para determinar la inhibicion de la actividad amidolltica de la trombina, y los resultados muestran que inhibieron la actividad amidolltica de la trombina en un 30,61 % y en un 41,22 % para la protelna 1 y la protelna 2, respectivamente, confirmando los resultados obtenidos respecto al tiempo de trombina.
La determinacion de la actividad amidolltica del LSE se baso en su efecto inhibidor sobre la liberacion de pnitroanilida inducida por la trombina del sustrato sintetico de la trombina S-2238 utilizando procedimientos conocidos. Mao et al., 1987; Schmied, Hoeffken, Hornberger, y Bernard, 1995).
MATERIALES Y METODOS
1. Preparacion del tampon de reaccion: Todos los reactivos utilizados para este experimento se prepararon en solucion salina tamponada con fosfato y seroalbumina bovina (PBS-BSA, pH 7,4) que contiene NaCl 0,12 M, fosfato de sodio 0,01M, 0,01 % de NaN3 y 0,1 % de seroalbumina bovina.
2. Reactivo de trombina y sustrato de trombina S-2238: se prepararon en PBS-BSA a una concentracion final de trombina 0,6 NIHU/ml y 100 pM, respectivamente. La solucion de sustrato de trombina se conservo a -20 °C para su uso en un mes segun las condiciones de almacenamiento proporcionadas por el fabricante.
3. Procedimientos de ensayos amidollticos: Se mezclaron volumenes de 50 pl de reactivo de trombina con volumenes iguales de diferentes diluciones de LSE en la placa de 96 pocillos. La placa se agito suavemente y se incubo durante 10 minutos a 25 °C en el lector de microplacas. Posteriormente, Se pipetearon 100 pl del sustrato y se agito la mezcla. La absorbancia a 405 nm (A405) se controlo durante ocho horas a intervalos de 5 minutos. Se realizaron los mismos procedimientos utilizando la solucion fagoestimulante (PhS) como control negativo. El tampon de reaccion PBS-BSA se considero como un control.
4. Calculos: Todas las mediciones se repitieron por triplicado y se consideraron los medios. El porcentaje de inhibition (% de inhibition) se calculo a partir de la ecuacion:
A b so rb a n cia de control -A b s o r b a n c ia de LSE % de inhibicion = ( A b so rb a n cia del control )x100
La figura 13 ilustra la CI50 del LSE con respecto a la actividad antitrombina, de acuerdo con algunas realizaciones. El LSE inhibio eficazmente la liberation mediada por trombina de la p-nitroanilida del sustrato sintetico (S-2238). La concentration de protelna que inhibe el 50 % de la actividad de la trombina (CI50) se determino representando el % de inhibicion contra la concentracion de protelna total en el LSE, y se encontro que era 49,391 ± 2,219 pg/ml. La curva de respuesta a la dosis de la actividad amidolltica del extracto de saliva de sanguijuela. Y = 2,28X 38,26, en la que: Y = % de inhibicion y X = concentracion de protelna (pg/ml), R2=0,878.
La actividad antitrombina se determino utilizando un ensayo de tiempo de trombina (TT) in vitro. Los siguientes protocolos estandar se usaron segun lo provisto con el reactivo THROMBOCLOTINA y un COAGULOMETRO SYSMIX CA 50:
1. Preparation de plasma citrado: preparado a partir de sangre humana fresca tomada por venopuncion inmediatamente antes del experimento. Se mezclo sangre humana fresca (4,5 ml) con citrato de sodio en un tubo de citrato que contiene 0,5 ml de 0,11 mol/l de citrato de sodio (9 partes de sangre: 1 parte de citrato de sodio). La mezcla se centrifugo a temperatura ambiente (25 °C) durante 10 minutos a 3000 rpm. El plasma citrado del sobrenadante se mantuvo a temperatura ambiente (+ 25 °C) para su uso dentro de las cuatro horas de preparacion.
2. Preparacion del reactivo de trombina: Cada vial de TROMBOCLOTINA se reconstituyo con 10,0 ml de agua destilada. La solution resultante contiene 2.5NIHU de trombina/ml y fue estable durante una semana cuando se almaceno entre 2 °C y 8 °C.
3. Preparacion del plasma control: se uso una prueba de plasma control antes de cada experimento para evaluar la precision y la exactitud de los reactivos utilizados y el coagulometro. Se disolvio un vial de CONTROL N (un plasma de control utilizado para probar el instrumento) en 1,0 ml de agua destilada, se agito suavemente y se dejo reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. El plasma de control reconstituido se mantuvo a -20 °C durante un perlodo maximo de cuatro semanas.
4. Ensayo de tiempo de trombina: Una parte allcuota de 100 pl del plasma citrado preparado se pipeteo en el tubo de coagulation precalentado provisto con el coagulometro y posteriormente se incubo a 37 °C en el pocillo del analizador de coagulacion durante 3 minutos. Se anadieron 100 pl del reactivo de trombina reconstituido (trombina 2,5NIHU/ml) y el tiempo hasta que comenzo la coagulacion se midio con el coagulometro. Se mezclaron diferentes diluciones del LSE fresco con el plasma citrado recien preparado para producir un volumen final de 100 pl y se midieron los valores de TT de las mezclas. La solucion fagoestimulante se utilizo como control negativo.
5. Calculos: Todas las mediciones se repitieron por triplicado y se consideraron los medios. El incremento en porcentaje del tiempo de trombina (%TT) se calculo a partir de la ecuacion:
TT de l a m u e s tr a -T T del pl asm a citrado %TT = ( TT del pl asm a citrado )x100
El LSE fresco recolectado de sanguijuelas sometidas a inanition durante 16 semanas prolongo el tiempo de trombina (TT) del plasma citrado de manera dependiente de la dosis. La concentracion de protelna de la saliva de sanguijuela que puede aumentar el TT dos veces (CI100) se estimo trazando el % de los valores de TT frente a las concentraciones de protelna de LA saliva que se mezclaron con el plasma citrado.
La figura 14 muestra la relation entre el tiempo de trombina y la concentracion de protelna LSE, de acuerdo con algunas realizaciones. La concentracion de protelna DEL LSE que aumento el TT dos veces (CI100) se estimo a partir de la curva de concentracion de protelna de la saliva (pg/ml de plasma) frente al aumento porcentual de TT (% de TT). Por consiguiente, se descubrio que la CI100 fue 22,558 pg/ml de plasma. Los resultados muestran que la actividad antitrombotica del LSE era una funcion lineal con la concentracion de protelnas en plasma, Y = 4,953X-11,73, en la que: Y =% de TT y X = concentracion de protelna (pg/ml), R2= 0,984.
Ejemplo 3. Un procedimiento para crear un extracto de saliva completa liofilizada estable de sanguijuela
Este ejemplo muestra el efecto sustancial de las condiciones de liofilizacion y las condiciones de almacenamiento sobre la actividad y la estabilidad del LSE. La actividad antitrombina se uso como una medida de la actividad y la estabilidad del LSE en las diferentes condiciones. Condiciones de liofilizacion tales como el tipo de vaso, la temperatura de pre-congelation, el tiempo de liofilizacion y las condiciones de almacenamiento variaron para determinar sus efectos sobre la actividad del LSE.
El LSE se dividio en allcuotas en tubos separados de vidrio y polipropileno que contenlan cada uno 1 ml. Las muestras se congelaron despues a -20 °C o -40 °C, y las muestras congeladas se liofilizaron durante 12, 24, 48 o 72 horas. La actividad antitrombina (% de TT) de cada muestra liofilizada se determino y comparo con la del LSE fresco. Ademas, los tubos de vidrio o polipropileno, cada uno con 1 ml de LSE liofilizado o no liofilizado se almacenaron a temperatura ambiente, 4 °C, y -20 °C. Algunos tubos a temperatura ambiente se protegieron de la luz envolviendolos con papel de aluminio. La actividad antitrombina (% de TT) de cada muestra se controlo durante un perlodo de seis meses y se comparo con la del LSE fresco.
La figura 15 muestra los efectos de las condiciones de liofilizacion y las condiciones de almacenamiento sobre la actividad y la estabilidad del LSE, de acuerdo con algunas realizaciones. Los resultados son la media de los triplicados ± el error estandar de la media SEM (n = 3), analizados utilizando ANOVA de una via y la prueba post hoc HSD de Tukey; la p <0,05 se considero estadlsticamente significativo. La congelacion a -40 °C antes de la liofilizacion disminuyo significativamente (p <0,05) la actividad antitrombotica del LSE en un 31-34 % en comparacion con la actividad del LSE fresco. La congelacion a -20 °C antes de la liofilizacion proporciono una actividad antitrombina (% de TT = 60-65 %) similar a la del LSE fresco (% de TT = 62 %), independientemente del tipo de vaso. El recipiente no tuvo un efecto significativo sobre la actividad del LSE durante la liofilizacion.
La figura 16 muestra el efecto del tiempo de liofilizacion sobre la actividad antitrombina del LSE, de acuerdo con algunas realizaciones. Todas las muestras se liofilizaron durante 24 horas en un tubo de vidrio. a p <0,001 en comparacion con el LSE fresco. Los resultados son la media de los triplicados ± el error estandar de la media SEM (n = 3), analizados utilizando ANOVA de una via y la prueba post hoc HSD de Tukey; la p <0,05 se considero estadlsticamente significativo. La liofilizacion durante mas de 24 horas condujo a una disminucion espectacular del 67-80 % (p <0,001) en la actividad antitrombina. La liofilizacion durante 12-24 horas, por otro lado, retuvo aproximadamente el 95 % de su actividad original.
Almacenamiento a temperatura ambiente
Despues de un dla de almacenamiento, todas las muestras (liofilizadas o no liofilizadas) almacenadas a temperatura ambiente con el tiempo perdieron actividad en comparacion con la actividad inicial del LSE fresco.
Las muestras recien preparadas almacenadas en tubos de vidrio expuestos a la luz perdieron mas del 90 % de actividad despues de un dla. El LSE no liofilizado mantenido en tubos de vidrio protegidos de la luz perdio un 62,2 % de actividad despues de un dla de almacenamiento, y mas del 90 % despues de 3 dlas de almacenamiento. Las muestras no liofilizadas mantenidas en tubos de polipropileno mostraron mas del 90 % de perdida de actividad despues de un perlodo de almacenamiento de un dla, independientemente de la proteccion frente a la luz. El LSE liofilizado se mantuvo en tubos de vidrio protegidos de la luz durante uno, tres y siete dlas perdieron aproximadamente el 26,5 %, 75 % y 95 % de actividad, respectivamente. El LSE liofilizado expuesto a la luz durante un dla perdio aproximadamente el 48 % de actividad y aproximadamente el 90 % despues de 3-7 dlas. El LSE liofilizado mantenido en tubos de polipropileno en la oscuridad durante un dla perdio un 57 % de actividad y mas de un 90 % de actividad despues de 3 dlas. El LSE liofilizado mantenido en tubos de polipropileno y expuesto a la luz perdio el 80 % -99 % de actividad durante 7 dlas.
La luz afecto significativamente a la actividad del LSE a temperatura ambiente. El LSE liofilizado mantenido en tubos de vidrio protegidos de la luz perdio un 26,5 % de actividad en un dla, en comparacion con una perdida de actividad del 48 % (p <0,05) para muestras expuestas a la luz. Las muestras no liofilizadas mantenidas en tubos de polipropileno protegidos de la luz perdieron un 62,2 % de actividad despues de un dla y perdieron aproximadamente el 92 % (p <0,001) de su actividad cuando se expusieron a la luz.
El tipo de recipiente afecto a la actividad del LSE cuando se almaceno a temperatura ambiente. Las muestras liofilizadas almacenadas en tubos de vidrio perdieron un 26,5 % -47,8 % de actividad, mientras que las almacenadas en tubos de polipropileno perdieron un 57,1 % -84,5 % (p <0,05) de actividad. Las muestras no liofilizadas mantenidas en tubos de vidrio protegidos de la luz perdieron un 62 % de actividad, mientras que las muestras almacenadas en tubos de polipropileno perdieron un 92 % (p <0,001) de actividad en un dla protegidas de la luz. La liofilizacion proporciono estabilidad al LSE a temperatura ambiente. Las muestras no liofilizadas muestran una perdida sustancial de actividad en comparacion con las muestras liofilizadas cuando se almacenaron en las mismas condiciones. El LSE no liofilizado almacenado en tubos de vidrio protegidos de la luz perdio un 62,2 % de actividad despues de un dla, mientras que el LSE liofilizado perdio un 26,5 % de actividad despues de un dla (p <0,001). Despues de 3-7 dlas de almacenamiento, no se observaron diferencias significativas entre las muestras porque las muestras perdieron una gran parte de su actividad biologica (75-95 %).
La figura 17 muestra el efecto de la luz y el recipiente sobre la actividad antitrombina de muestras de LSE (liofilizadas y no liofilizadas) almacenadas a temperatura ambiente hasta durante 7 dlas, de acuerdo con algunas realizaciones. Los resultados son la media ± error estandar de la media SEM (n = 3) y se analizan mediante el modelo lineal general (GLM), medida repetida ANOVA, utilizando el software SPSS 18.0, y la p <0,05 se considero estadlsticamente significativa. a es significativo cuando se comparo con LSE fresco (control de referencia); p es significativo en comparacion con el LSE liofilizado almacenado en tubos de vidrio y protegidos de la luz. de la luz; y es significativo en comparacion con el LSE liofilizado almacenado en tubos de polipropileno y protegidos de la luz; £ es significativo en comparacion con el LSE no liofilizado almacenado en tubos de vidrio y protegido de la luz; y 5 es significativo cuando se compare con el LSE liofilizado en tubos de vidrio con luz.
Almacenamiento a 4 °C
A una temperatura reducida de 4 °C, no hubo perdida significativa de actividad en siete dlas, independientemente del tipo de muestra o las condiciones de almacenamiento. Sin embargo, todas las muestras mostraron una disminucion significativa (p <0,001) en la actividad despues de 15 dlas en comparacion con la actividad inicial de saliva fresca (referencia de control).
Las muestras no liofilizadas mantenidas en tubos de vidrio retuvieron una actividad del 100 %-97 % durante los siete dlas. Una fuerte disminucion (45 %) en la actividad se produjo despues de 15 dlas y los tiempos de almacenamiento mas prolongados mostraron mas de un 90 % de perdida de actividad. Las muestras liofilizadas mantenidas en tubos de vidrio retuvieron aproximadamente el 100 % de la actividad despues de siete dlas, perdio aproximadamente el 27 % de la actividad despues de 15 dlas, y perdio aproximadamente el 80-90 % de la actividad despues de 30 dlas. Las muestras no liofilizadas mantenidas en recipientes de polipropileno retuvieron el 100-95 % de actividad durante los siete dlas, perdieron aproximadamente el 47 % de actividad despues de 15 dlas y mas del 90 % de actividad despues de 30 dlas. Las muestras de saliva liofilizada mantenidas en recipientes de polipropileno perdieron aproximadamente el 0-9 % de actividad despues de 3 dlas, aproximadamente el 13 % despues de 7 dlas, aproximadamente el 32 % despues de 15 dlas y aproximadamente el 85-95 % despues de 30 dlas.
La figura 18 muestra el efecto de la temperatura de almacenamiento, la luz y el recipiente sobre la actividad antitrombina de muestras de LSE (liofilizadas y no liofilizadas) durante hasta 180 dlas a 4 °C, de acuerdo con algunas realizaciones. Despues de 30 dlas-180 dlas, todas las muestras perdieron el 81-98 % de su actividad. Los resultados son la media ± error estandar de la media SEM (n = 3) y se analizan mediante el modelo lineal general (GLM), medida repetida ANOVA, utilizando el software SPSS 18.0, y la p <0,05 se considero estadlsticamente significativo, a es significativo cuando se compare con el LSE fresco (control de referencia); p es significativo en comparacion con el LSE liofilizado almacenado en tubos de vidrio; y es significativo en comparacion con el LSE liofilizado almacenado en tubos de polipropileno. El tipo de recipiente solo tuvo un efecto menor, mientras que la liofilizacion tuvo un efecto significativo sobre la actividad despues de 15 dlas de almacenamiento. Las muestras no liofilizadas mostraron mucha mas perdida de actividad que las muestras liofilizadas. Las muestras no liofilizadas mantenidas en tubos de vidrio perdieron un 45 % de actividad, mientras que los homologos liofilizados perdieron el 27 % despues de 15 dlas de almacenamiento (p <0,05-0,001). Las muestras no liofilizadas mantenidas en tubos de polipropileno perdieron un 47 % en comparacion con una perdida del 32 % en muestras liofilizadas (p <0,05) durante el mismo perlodo de 15 dlas.
Almacenamiento a -20 °C
A la temperatura de almacenamiento de -20 °C, el tipo de recipiente y el estado del extracto no fueron estadlsticamente significativos. El LSE no liofilizado almacenado en tubos de vidrio perdio debido a una actividad del 0-6 % (estadlsticamente no significativo) en 15 dlas a -20 °C. Despues de 30 dlas, se perdio aproximadamente el 10% de actividad. Despues de 90-180 dlas, se observo una perdida significativa de aproximadamente 12-15 % (p <0,05) de actividad. El LSE no liofilizado mantenido en tubos de polipropileno perdio una actividad del 0-5 % (estadlsticamente no significativo) en 15 dlas, y aproximadamente el 13-16 % (p <0,05) despues de 30-180 dlas. El LSE liofilizado almacenado en tubos de vidrio perdio solo un 0-5 % de actividad en 180 dlas (estadlsticamente no significativo). Las muestras liofilizadas almacenadas en tubos de polipropileno perdieron aproximadamente el 3-6 % de actividad en 15 dlas y aproximadamente el 13 % -20 % (estadlsticamente significativo) despues de 30-180 dlas. La figura 19 muestra el efecto del recipiente y la liofilizacion sobre la actividad antitrombina de muestras de LSE durante hasta 180 dlas a -20 °C, de acuerdo con algunas realizaciones. Los resultados son la media ± error estandar de la media SEM (n = 3) y se analizan mediante el modelo lineal general (GLM), medida repetida ANOVA, utilizando el software SPSS 18.0, y la p <0,05 se considero estadlsticamente significativo.
Ejemplo 4. Un procedimiento para tratar un tumor solido. (No forma parte de la invencion)
Este ejemplo muestra la actividad citotoxica del LSE preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 en el tratamiento de un tumor solido.
REACTIVOS: todos los reactivos preparados segun lo deseado en condiciones esteriles estrictas segun el Gabinete de Seguridad Biologica de Clase II de ESCO; Medio L-15 de Leibovitz (de Sigma-Aldrich); solucion salina tamponada con fosfato (PBS), Solucion esteril 1X (de Amresco); L-glutamina (L-Glu, llquido, 200 mM), penicilina/estreptomicina (pen/estrep, 100X), suero bovino fetal FBS mycoplex y ACCUTASE (una combinacion de proteasa y colageno en PBS con EDTA 0,5 mM) (de The Cell Culture Company PAA); colorante azul tripan (de Merck); y el ensayo de viabilidad de celulas luminiscentes CELLTITER-GLO (de Promega); seroalbumina bovina y clorhidrato de arginina (de Sigma-Aldrich); cloruro de sodio (de Merck); kit de reactivos de Bradford (de Amresco); carboplatino (cis-diamina [1,1-ciclobutanodicarboxilato]platino II) (de Calbiochem); clorhidrato de irinotecan (estandar de referencia USP de Rockville, MD).
EQUIPO: una centrlfuga refrigerada Jouan CR22 (Jouan, Francia); una incubadora Memmert tipo BE-400 (Memmert, Alemania); un microscopio invertido (de Olympus modelo CK30); un luminometro de microplacas TECAN (TECAN, EE. UU.); un lector de microplacas multi deteccio Infinite M200, NanoQuant TECAN (de TECAN (EE.u U)); y un modelo de liofilizador Christ Alpha 1-4LD (Alemania).
METODOS
Se obtuvo un cancer de pulmon microcltico humano (llnea celular SW1271) de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo ATCC. Segun los protocolos estandar de la ATCC, la llnea celular dependiente de anclaje se cultivo a una concentracion celular de inoculo inicial de 104 celulas/cm2 en 15 ml de medio de crecimiento completo (CGM) que consiste en medio L-15 de Leibovitz suplementado con FBS al 10 % (v/v), 0,3 g/l de L-Glu y 1 % (v/v) de pen/estrep. en un matraz de cultivo de celulas de cuello inclinado CORNING de 75 cm2. Las celulas cultivadas se incubaron a 37 °C en una atmosfera humidificada libre de CO2. El CGM se almaceno a 4 °C y se calento (37 °C) durante 15 minutos en un bano de agua antes de su uso (ATCC, 2007). Los matraces que contenlan las celulas cultivadas se comprobaron a intervalos de 24 horas para determinar la viabilidad celular, adherencia, morfologla y estado de confluencia utilizando el microscopio invertido. Los cultivos se examinaron para detectar cualquier evidencia macroscopica de contaminacion microbiana con el microscopio invertido. Los medios se cambiaron segun sea necesario cuando el color del medio se vuelve amarillo, ya que el medio L-15 de Leibovitz contiene rojo fenol que se vuelve amarillo a niveles de pH bajos y rojo brillante a pH 7,4 que es adecuado para el cultivo de celulas (ATCC, 2007).
Cuando la monocapa de la llnea celular dependiente de anclaje SW1271 esta cerca del 90 % de confluencia, se subcultivaron segun los protocolos proporcionados por la ATCC. Despues de aspirar el CGM de los matraces, las celulas adherentes se disociaron de las paredes del matraz de cultivo celular pipeteando 3 ml de ACCUTASE. Despues de un perlodo de incubacion de 15 minutos con ACCUTASE a 37 °C, las celulas se examinaron bajo el microscopio invertido para asegurarse de que la mayorla (95 %) de las celulas se separaban y dispersaban en una suspension de una sola celula (ATCC, 2007).
El recuento de las celulas viables se realizo utilizando la exclusion del colorante azul tripan, que depende del recuento de las celulas no tenidas que no han captado el colorante que aparece redondeado con halos siguiendo el protocolo que se describe a continuacion (NSF, 2006):
1. La solucion de azul de tripan se preparo en BPS esteril hasta una concentracion final del 0,4 % (p/v).
2. La suspension celular se diluyo con BPS esteril hasta un volumen total de 4 ml para que las celulas no se superpusieran entre si, lo que harla que el recuento fuera diflcil e impreciso.
3. Tanto el hemocitometro como el cubreobjetos se limpiaron, se secaron y se montaron.
4. La suspension celular y el azul tripan se mezclaron completamente en una proportion de 1:1 (creando un factor de dilution de 2). Por consiguiente, se pipetearon 10 pl de la mezcla en la camara de recuento del hemocitometro. Es suficiente tocar las puntas con el borde del cubreobjetos para llenar la camara debido a la accion capilar.
5. Se conto el numero de celulas en el cuadrado en cada esquina y se considero el promedio.
6. El numero total de celulas se estimo utilizando la siguiente ecuacion:
Numero total de celulas = recuento promedio por cuadrado x factor de dilucion 104 x el volumen total de la suspension celular diluida
La suspension celular se homogeneizo mediante pipeteo suave y a continuation se dispenso a una densidad final de 104 celulas/cm2 en nuevos matraces de cultivo celular que contenlan 15 ml de CGM. Los matraces se monitorizaron regularmente para verificar la viabilidad celular y la contaminacion microbiana (ATCC, 2007).
Cuando las celulas alcanzaron aproximadamente el 90 % de confluencia, se cosecharon como se ha descrito anteriormente utilizando ACCUTASE como agente disociador. ACCUTASE se elimino mediante centrifugation suave (10 min, a 4 °C y 125xg) con la centrlfuga refrigerada, se desecho el sobrenadante y las celulas se resuspendieron en 4 ml de CGM. Las celulas se contaron utilizando exclusion con colorante azul tripan y se sembraron 104 celulas en una microplaca de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos CORNING COSTAr que contenla 200 pl de CGM utilizando una micropipeta EPPENDORF de 8 canales. Las microplacas se incubaron a 37 °C en un ambiente humidificado sin CO2 durante 24 horas (ATCC, 2007).
Despues de la incubacion durante 24 horas, se desecho el medio y se reemplazo por 180 pl de CGM nuevo. Se preparo una serie de diluciones dobles del extracto concentrado liofilizado de saliva de sanguijuela (10xLSE). El LSE se filtro 10 veces a traves de papel de filtro esteril SARTORIUS de 0,2 pm y se anadieron allcuotas de 20 pl a las primeras tres filas de la microplaca con la mayor concentracion en la primera fila y as! sucesivamente, de modo que se obtuvo un volumen total de 200 pl (180 pl de CGM 20 pl de 10xLSE). A las siguientes tres filas, se anadieron volumenes de 20 pl de otra serie de doble dilucion de una solucion fagoestimulante concentrada diez veces. Se preparo otra placa de control negativo que contenla celulas no tratadas (104 celulas/pocillo) cultivadas en 200 pi de CGM.
Se prepararon otras placas siguiendo los mismos protocolos reemplazando 10xLSE por carboplatino e irinotecan como controles positivos con una dilucion doble en serie de ambos a partir de 100 pM en la primera columna. Se prepararon dos placas utilizando volumenes de 20 pl de una serie de mezclas de dilucion doble que consiste en: 1. 10 pl de 10xLSE mezclados con 10 pl de carboplatino 100 pM.
2. 10 pl de 10xLSE mezclados con 10 pl de irinotecan 100 pM.
Todas las placas se incubaron a 37 °C en una atmosfera humidificada sin CO2 durante 5 dlas. El efecto antiproliferativo o citotoxico del extracto de saliva de sanguijuela se determino utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente CELLTITER-GLO basado en la medicion de la senal de luminiscencia de la reaccion entre la luciferasa recombinante ULTRA-GLO y las moleculas de ATP producidas por las celulas viables metabolicamente en presencia de Mg+2 y oxlgeno molecular (de Promega, 2009). Se realizo un ensayo CELLTITER-GLO de acuerdo con los protocolos estandar:
1. El reactivo CELLTITER-GLO se preparo mezclando tampon CELLTITER-GLO y el sustrato que se equilibro previamente a temperatura ambiente.
2. Las placas de 96 pocillos incubadas durante 5 dlas que contenlan las celulas experimentales se dejaron equilibrar a temperatura ambiente antes del ensayo. El medio se aspiro de todos los pocillos y se reemplazo por 100 pl de CGM nuevo.
3. Se pipeteo un volumen igual del reactivo CELLTITER-GLO preparado (100 pl) en el pocillo y a continuacion se mezclo durante 2 minutos usando el agitador de placas orbitales y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la senal luminiscente.
4. El medio de reaccion (reactivo CGM CELLTITER-GLO) se transfirio a una nueva placa blanca de 96 pocillos adecuada para el luminometro utilizado.
5. El luminometro registro la luminiscencia.
6. La inhibicion celular se calculo a partir de la ecuacion (Xu, Guo, Li, Wei, & Zhao, 2008):
% de inhibicion = Sen a l de c o n t r o l- s e h a l de m u e s tr a
Sen a l de c o n tr o l x100
7. La concentracion de la muestra de prueba (LSE o el control negativo) que inhibe el 50 % del crecimiento celular (CI50) se promedio a partir de tres repeticiones y se estimo a partir del trazado del porcentaje de inhibicion del crecimiento celular frente a la concentracion de la muestra de prueba. (Hsu et al., 2011). Los trazados se llevaron a cabo utilizando una ecuacion loglstica de cuatro parametros usando el software Sigma Plot 11.0. Despues de un perlodo de incubacion de 5 dlas a 37 °C en un ambiente humidificado sin CO2, las celulas alcanzaron casi el 90 % de confluencia. Las celulas se cosecharon desprendiendolas de las paredes del matraz de cultivo celular con ACCUTASE y se centrifugaron a 4 °C y 125 xg durante 10 minutos. El recuento de celulas con un procedimiento de azul tripan revelo que un matraz contenla aproximadamente 5,550-5,740 x106 celulas viables a casi un 90 % de confluencia.
La figura 20 muestra que el LSE mostro una notable actividad antiproliferativa contra el cancer de pulmon microcltico (llnea celular SW1271), de acuerdo con algunas realizaciones. La concentracion de protelna LSE total que inhibe el crecimiento del 50 % de las celulas despues de 5 dlas de incubacion (CI50) fue de 119,844 pg/ml, estimada mediante la representation del porcentaje de inhibicion frente a la concentracion de protelnas totales. La solution fagoestimulante por si sola no tuvo ningun efecto sobre la proliferation celular.
Las figuras 21 y 22 muestran el efecto citotoxico de mezclas de LSE con irinotecan o carboplatino, de acuerdo con algunas realizaciones. La CI50 de irinotecan y carboplatino fue de 5,813 pg/ml y 18,754 pg/ml, respectivamente. Todas las mediciones se repitieron por triplicado y se considero la media ± el error estandar de la media SEM (n = 3). Los graficos se generaron utilizando la ecuacion loglstica de cuatro parametros con el software Sigma Plot 11.0. Una combination de LSE e irinotecan mostro una CI50comb de 51,463 pg/ml, que es aproximadamente un 57,1 % menos que la CI50 de LSE utilizado solo. Una combinacion de LSE y carboplatino muestra una CI50comb de 114,261 pg/ml, una reduction del 4,6 % de la CI50. El carboplatino mostro una disminucion espectacular del valor de CI50 en un 65 %, de tal manera que la CI50comb de carboplatino y LSE fue 6,449 pg/ml.
Los resultados sugieren que el LSE, solo o en combinacion con otros agentes, de modo que irinotecan o carboplatino podrla ser util para tratar otras formas de cancer, tal como de prostata, de mama y canceres llquidos, tal como leucemias y linfomas. La leucemia mieloide aguda es de particular interes.
Ejemplo 5. Un procedimiento para tratar la diabetes.
Este ejemplo muestra la efectividad del LSE en el tratamiento de la diabetes. El aislamiento de LSE y la medicion de las proteinas totales se realizaron de acuerdo con los procedimientos que se ensenan en el presente documento.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS:
Cloruro de sodio, clorhidrato de arginina, etanol absoluto y formaldehido al 37 % (de Merck); kit de reactivo de Bradford (Amresco Inc.); membrana de parafilm (de American Can Company); glucosa anhidra (de Fisher Scientific); monohidrato de aloxano usado para inducir diabetes (de Sigma Aldrich); seroalbumina bovina (de Sigma Aldrich); insulina del pancreas bovino (>27unidades/mg) (de Sigma Aldrich); el procedimiento de preparacion de la solucion de aloxano en solucion salina normal enfriada con hielo inmediatamente antes de la inyeccion (de Lenzen, 2008);.
La centrifugacion se realizo utilizando la centrifuga Universal 32R (de Hettich ZenTrifugen, Alemania); lector de microplacas modelo INFINITE M200, NANOQUANT TECAN (de TEcAn USA); la liofilizacion se realizo utilizando un liofilizador CHRIST modelo Alpha 1-4LD (Alemania); un glucometro y tiras reactivas ONE TOUCH ULTRA para la determinacion de la concentracion de glucosa en sangre (de LifeScan Inc., EE.UU); y, un microscopio NIKON ECLIPSE 80i.
Las ratas macho de la cepa Sprague Dawley (SD) (de Mikro Makmur Enterprise, Kuantan, Pahang Darul Makmur, Malasia) se agruparon al azar y se guardaron en un laboratorio de posgrado de animales en Kulliyyah of Pharmacy, Universidad Islamica Internacional de Malasia (MUM), mantenidas con un sistema de aire acondicionado y extractores. Las ratas se mantuvieron con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h/12 h a temperatura ambiente (25 °C). Se aclimataron a estas condiciones durante una semana antes del experimento y se alojaron en jaulas de polipropileno forradas con corteza de madera de pino que se cambiaba cada dos dias. Las ratas tuvieron acceso libre a agua corriente y una dieta comercial de granulos secos, Gold Coin. Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con Principios y Guia para el uso etico de animales de laboratorio aprobada por el Ministerio de Salud de Malasia (Sinniah y Hussein, 2000). Los protocolos experimentales fueron aprobados por la Reunion del Comite de Etica (No. 1/2011 el 22 de abril de 2011) de Kulliyyah of Medicine, IIUM (n.° de ref. IIUM/305/20/4/10).
Las ratas se mantuvieron en ayunas durante la noche y se indujo una diabetes de tipo 1 mediante administracion intraperitoneal (i.p) de una sola dosis de una solucion de aloxano recien preparada 160 mg/kg de peso corporal (p.c.) (Rajakopal y Sasikala, 2008). Con el fin de prevenir la hipoglucemia fatal inducida por aloxano, se administro a las ratas una solucion de glucosa al 20 % por via intraperitoneal, seguida de una solucion de glucosa al 5 % por via oral durante las siguientes 12 horas (Lenzen, 2008). A continuacion, se alimento a las ratas con una dieta de granulos comercial ad libitum y se les dio acceso libre al agua del grifo. A todos los animales experimentales se les inyecto aloxano tres veces a intervalos de 24 horas.
Despues de 24 hora de aloxanizacion, la concentracion de glucosa en sangre en ayunas (FBG) se midio cada manana para verificar el estado diabetico de las ratas inyectadas. Todos los valores de FBG se obtuvieron de sangre capilar fresca de una puncion en la vena de la cola, y las mediciones se tomaron con un glucometro ONE TOUCH ULTRA. Despues de tres dias de inyeccion de aloxano, las ratas mostraron niveles de FBG de mas de 11.1 mmol/l, un nivel considerado diabetico para el estudio (Abeeleh et al., 2009).
Se dividio al azar a cuarenta ratas macho en ocho grupos, comprendiendo cada uno cinco ratas como se detalla a continuacion:
• Grupo I: ratas normales de control, en este grupo no se inyecto ni aloxano ni LSE.
• Grupo II: ratas de control con diabetes inducida a las que solo se inyecto solucion de aloxano i.p.
• Grupo III: ratas con diabetes inducida a las que se inyecto por via subcutanea (s.c) 500 pg/kg de p.c. de LSE, que corresponde a la cantidad/dosis de proteina administrada por una sanguijuela.
• Grupo IV: ratas con diabetes inducida a las que se inyecto s.c 1.000 pg/kg de p.c. de LSE, que corresponde a la cantidad/dosis de proteina administrada por dos sanguijuelas.
• Grupo V: ratas con diabetes inducida a las que se inyecto s.c una solucion fagoestimulante PhS1 (arginina 0,001 M en solucion salina normal) en una dosis de 20 ml/kg p.c. que contiene la cantidad de arginina y cloruro de sodio que se supone que acompana a la dosis mas alta de LSE inyectada en el grupo IV.
• Grupo VI: ratas con diabetes inducida a las que se inyecto s.c 20 unidades/kg de p.c. de una suspension de insulina de pancreas bovino en agua destilada (Booth y Brookover, 1968).
• Grupo VII: ratas con diabetes inducida a las que se inyecto s.c 10 unidades/kg de p.c. de una suspension de insulina de pancreas bovino en agua destilada (Booth y Brookover, 1968).
• Grupo VIII: ratas con diabetes inducida a las que se inyecto s.c 250 pg/kg de p.c. LSE 10 unidades/kg de p.c. de insulina de pancreas bovina.
La actividad antihiperglucemica del LSE se evaluo mediante la disminucion de los valores de FBG en ocho horas. La glucosa en sangre en ayunas (FBG) a intervalos de dos horas se registro durante el periodo experimental para todos los animales experimentales. El porcentaje de disminucion de la concentracion de glucosa en sangre en ayunas se calculo a partir de la siguiente ecuacion (Madubunyi, Onoja, y Asuzu, 2010):
FBG an te s del tratam ien to (0 h ) - FBG d espues del tratam ien to (x h) Porcentaje de disminucion de FBG = [ FBG antes del tratam ien to (0 h) x100]
Se dividio a treinta ratas macho al azar en seis grupos, comprendiendo cada uno cinco ratas como se detalla a continuacion:
• Grupo A-l: ratas a las que se inyecto i.p una dosis unica de aloxano (160 mg/kg de p.c.).
• Grupo A-ll: ratas a las que se inyectaron i.p dos dosis de aloxano (160 mg/kg de p.c.) con un intervalo de 24 horas.
• Grupo A-lll: ratas a las que se inyectaron i.p tres dosis de aloxano (160 mg/kg de p.c.) con un intervalo de 24 horas.
• Grupo A-IV: ratas a las que se inyecto s.c. una unica dosis de LSE (250 pg/kg de p.c.), seguido tras una hora por una unica dosis i.p. de aloxano (160 mg/kg de p.c.).
• Grupo A-V: ratas a las que se inyecto s.c dos dosis de LSE (250 pg/kg de p.c.) seguidas despues de una hora por dos dosis i.p. de aloxano (160 mg/kg de p.c.) a intervalos de 24 horas.
• Grupo A-VI: las ratas a las que se inyectaron s.c tres dosis de LSE (250 pg/kg de p.c.) seguidas despues de una hora por tres dosis i.p. de aloxano (160 mg/kg de p.c.) a intervalos de 24 horas.
La actividad profilactica del LSE se evaluo midiendo la FBG despues de 24 horas de cada inyeccion. Las ratas que mostraron valores de FBG entre 8.3 y 13.9 mmol/l se consideraron diabeticas leves y aquellas con FBG de mas de 13,9 mmol/l se consideraron diabeticas graves (Gupta et al., 2009).
Las figuras 23 y 24 muestran el efecto de diferentes dosis de LSE e insulina sobre la glucemia en ayunas (mmol/l) en ratas normales y diabeticas a diversos intervalos de tiempo (h), de acuerdo con algunas realizaciones. Despues de tres dlas de inyeccion intraperitoneal de aloxano (160 mg/kg de p.c.), la FBG aumento significativamente (p <0,001) en la FBG en las ratas diabeticas de control en comparacion con las de control normales. Los niveles de FBG se redujeron significativamente despues de inyectar a las ratas LSE por via subcutanea a ambas dosis de 1.000 y 500 pg/kg de p.c. EL LSE a una dosis de 1.000 pg/kg de p.c. produjo una disminucion significativa mayor (p <0,001) en FBG que la de la dosis 500 pg/kg (p <0,05). Ademas, se produjo una reduccion significativa de fBg (p <0,05) despues de dos horas de inyeccion de LSE, y se observo una mayor disminucion significativa despues de cuatro, seis y ocho horas (p <0,001).
Todas las ratas a las que se inyecto insulina experimentaron una fuerte disminucion significativa (p <0,001) de la FBG despues de dos horas de inyeccion. Las ratas a las que se inyecto la dosis mas baja de insulina (10 unidades/kg de p.c.) volvieron al estado diabetico con valores de FBG en rapido aumento despues de 8 horas de tratamiento. Las ratas que recibieron insulina (10 unidades/kg) y LSE (250 pg/kg) mostraron una disminucion significativa de FBG durante todo el perlodo de estudio de 8 horas. Las ratas diabeticas a las que se inyecto la solucion fagoestimulante no mostraron una reduccion significativa de la FBG en comparacion con el grupo de control diabetico. No se observaron diferencias significativas entre las ratas normales y las ratas diabeticas tratadas con LSE o insulina a cualquiera de las dosis.
No se observo mortalidad ni cambio de comportamiento en los animales a los que se inyecto saliva hasta el final del estudio. Todos estos animales exhibieron locomocion tlpica y actividad flsica, tal como ausencia de signos de debilidad o agresividad. No se observo reaccion de toxicidad, por ejemplo, no se observaron anorexia, ataxia, piloereccion, perdida de peso, diarrea, miccion, dificultad respiratoria y respiracion ruidosa. La administracion simultanea de LSE (250 pg/ml p.c.) e insulina (10 unidades/kg de p.c.) indujo hipoglucemia sin mortalidad. No se observaron signos de toxicidad aguda en ratas a las que se inyecto por via subcutanea LSE a ambas dosis de 1000 y 500 pg/kg de p.c., Por otro lado, la inyeccion de insulina a una dosis de 20 unidades/kg de p.c. dio como resultado una afeccion hipoglucemica en todas las ratas que llevo a la muerte de una rata. Las otras ratas que se mantuvieron vivas mostraron menos actividad flsica, especialmente durante las dos primeras horas de inyeccion.
La figura 25 muestra que el LSE tiene un efecto profilactico sobre el inicio de la diabetes, de acuerdo con algunas realizaciones. Por ejemplo, sin uso de LSE como profilactico, una dosis de aloxano (160 mg/kg de p.c.) no fue suficiente para inducir diabetes en las ratas, dos dosis hicieron que todas las ratas fueran levemente diabeticas (10,1 ± 2,0 mmol/l) y tres dosis indujeron diabetes grave (27,3 ± 2,1 mmol/l). Ninguna de las ratas a las que se inyecto una dosis de LSE (250 pg/kg de p.c.) antes de la aloxanizacion se volvio diabetica. Dos dosis de LSE pudieron prevenir la induction diabetica en todas las ratas cuando se les inyecto una hora antes de la inyeccion de aloxano. Solo las ratas que recibieron tres dosis de aloxano despues de tres dosis de LSE se volvieron diabeticas leves (11,5 ± 0,6 mmol/l). Los resultados son la media de los triplicados ± el error estandar de la media SEM (n = 5), analizados utilizando ANOVA de una via y la prueba post hoc HSD de Tukey; la p <0,05 se considero estadlsticamente significativo. P <0,05 cuando se comparo con ratas a las que se inyectaron dos dosis de aloxano y LSE. p <0,001 cuando se comparo con ratas a las que se inyectaron tres dosis de aloxano y LSE.
Ejemplo 6. Un procedimiento para tratar una enfermedad viral. (No forma parte de la invention)
Este ejemplo se utilizara para mostrar la efectividad del LSE en el tratamiento de una enfermedad viral. El aislamiento de LSE y la medicion de la protelna total se realizaran de acuerdo con los procedimientos que se ensenan en el presente documento.
Un cultivo de tejidos, generalmente un embrion de pollo de 3 a 6 dlas de edad, se infectara en el lado de la membrana del embrion por una dosis de virus vivos (hepatitis C, VIH, dengue, virus del Nilo occidental y gripe H1N1, H5N1) si es necesario, se utilizaran multiples infecciones hasta que se produzca la infeccion.
Despues de un perlodo de incubacion, el crecimiento del embrion y los cambios en sus tejidos se monitorizaran de acuerdo con los procedimientos establecidos. Este cultivo tisular infectado servira como control. Se prepararan otros tres tejidos cultivados mediante el mismo procedimiento. En el primero, se inyectaran cuatro dosis de LSE (100/250/500/1000 ug/de p.c.) antes de la infeccion viral. En el segundo cultivo tisular, se inyectaran cuatro dosis de LSE (100/250500/1000 ug/de p.c.) 1,2,3.4 horas despues de la infeccion viral. En un tercer tejido, se inyectaran cuatro dosis de LSE inactivado (100/250/500/1000 ug/de p.c.) antes y despues de la infeccion. El objetivo en el tercer experimento es analizar cualquier cambio en las vlas de senal y se realizara una comparacion con el LSE activo para tener una indicacion del mecanismo de accion. Los tres tejidos cultivados: se trataron despues y antes y con LSE inactivado se monitorizaran y compararan con el tejido control.
El efecto del LSE sobre la infeccion viral se deducira a continuation de acuerdo con los procedimientos establecidos y se comparara con los medicamentos convencionales como el interferon.
Ejemplo 7. Un procedimiento para tratar una enfermedad parasitaria. (No forma parte de la invention)
Este ejemplo se utilizara para mostrar la efectividad del LSE en el tratamiento de una enfermedad parasitaria. El aislamiento de LSE y la medicion de la protelna total se realizaran de acuerdo con los procedimientos que se ensenan en el presente documento.
En el caso del paludismo, un modelo animal, por lo general un modelo de raton, se inyectara una dosis de un parasito del paludismo (la dosis se determinara de acuerdo con la virulencia del parasito Spp) hasta que los animales desarrollen los slntomas deseados de paludismo. Se inyectara a los animales enfermos (s.c., i.v.) en dos dosis (500/1.000 ug/K de p.c. de LSE). Tras el tratamiento, se extraeran dos gotas de sangre de la cola de los ratones en portaobjetos de vidrio para examinarlas bajo el microscopio o para la prueba ELIZA.
Los inventores utilizaron ocho grupos de diez ratones cada uno de la siguiente manera:
1. Grupo A - control infectivo positivo
2. Grupo B: infectados y tratados con LSE (500 ug/kg de p.c.) despues de 1,2,3,4 horas
3. Grupo C: infectados y tratados con LSE (1.000 ug/kg de p.c.) despues de 1,2,3,4 horas
4. Grupo D - 1/2 hora antes de la infeccion con el parasito, los inventores les inyectaron LSE (500 ug/kg de p.c.) como medidas profilacticas.
5. Grupo E - 1/2 hora antes de la infeccion con el parasito, los inventores les inyectaron LSE (1.000 ug/kg de p.c.) como medidas profilacticas.
6. Grupo F y G - ratones infectados a los que se ha inyectado 500 y 1.000 ug/kg de p.c. de solution fagoestimulante.
Se tomaron frotis de sangre de la cola de los ratones diariamente y se examinaron bajo un microscopio optico durante siete dlas para monitorizar la actividad del LSE. El ultimo grupo infectado (H) se trato con un medicamento antipaludico estandar para controlar la actividad relativa y la potencia de LSE en el parasito.
Ejemplo 8. Un procedimiento para administrar una terapia antioxidante. (No forma parte de la invencion)
Este ejemplo muestra la actividad antioxidante del LSE. El aislamiento de LSE y la medicion de las protelnas totales se realizaron de acuerdo con los procedimientos que se ensenan en el presente documento.
MATERIALES Y METODOS
Metanol (MeOH) (de Fischer Scientific); Acido L-ascorbico (de Calbiochem); clorhidrato de arginina, seroalbumina bovina (BSA) y DPp H (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) (de Sigma Aldrich); cloruro de sodio (NaCl) (de Merck).
Un lector de microplacas multi detection Infinite M200, NanoQuant TECAN (de TECAN (EE.UU)); una centrlfuga Hettich ZenTrifugen Universal 32R (Alemania); un liofilizador CHRIST modelo Alpha 1-4LD (Alemania).
La actividad antioxidante se determino utilizando procedimientos conocidos (Blois, 1958) para medir la capacidad de secuestro de radicales utilizando 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) (Althunibat et al., 2009; Blois, 1958; Sanja, Sheth, Patel, Patel, y Patel, 2009):
1. Preparation de solucion de DPPH: se preparo una solucion de DPPH (0,002 M) disolviendo 4,3 mg de DPPH en 3,3 ml de MeOH. La solucion resultante se protegio de la luz cubriendo el recipiente con una lamina de aluminio.
2. Preparacion de la muestra de ensayo: El LSE liofilizado se disolvio en la cantidad minima de agua destilada (2 ml). El volumen se llevo a un volumen final de 6,6 ml mediante MeOH produciendo un LSE concentrado 3 veces y la solucion de metanol resultante se denomino 3xmlSE. Se pipetearon volumenes de 100 pl de diluciones dobles en serie del 3xmlSE en una placa de 96 pocillos. Todos los volumenes se llevaron a un volumen final de 300 pl mediante MeOH.
3. Preparacion de la solucion estandar: Se preparo una solucion madre de acido ascorbico (50 pg/ml) disolviendo 500 pg de acido ascorbico en 10 ml de MeOH con agitacion energica. Se prepararon diluciones en serie escalonadas en la placa de 96 pocillos tomando diferentes volumenes de la solucion madre y diluyendolos con MeOH hasta 300 pl, correspondientes a las concentraciones finales de 50, 40, 30, 20, 10, 5 y 2,5 pg/ml.
4. Protocolos experimentales: Se anadio un volumen de 15 pl de solucion de DPPH (0,002 M) a 300 pl de MeOH. Inmediatamente, la absorbancia a 516 nm (A516) se midio como una lectura de control. Se anadieron 15 pl de solucion de DPPH a las muestras de prueba y las soluciones estandar. La A516 de las muestras de prueba se tomo despues de 15 minutos y se utilizaron los mismos procedimientos con PhS1 como control negativo.
5. Calculos: La actividad de secuestro de radicales libres (% de actividad antirradicales) se estimo a partir de la ecuacion:
n , , .. . - - i- 1 C o n tr o l d e a b so r b a n c ia -M u e s t r a de a b so r b a n c ia A r\r\ % de actividad antirradicales = --------------- C- o-- n- t-r-o- l-- d-e-- a- b-- so-- r-b- a-- n- c- i-a-------------- x100
Las figuras 26 y 27 compara la actividad de secuestro de radicales libres de LSE al acido L-ascorbico (vitamina C), de acuerdo con algunas realizaciones. Todas las mediciones se repitieron por triplicado y se considero la media ± SEM. Se estimo la concentracion de acido ascorbico y las proteinas del LSE (pg/ml) requeridas para secuestrar el 50 % de DPPH (CI50) a partir de la curva resultante de la representacion del % de actividad antirradicales frente a las concentraciones (pg/ml). Los trazados se llevaron cabo utilizando una ecuacion logistica de cuatro parametros usando el software Sigma Plot 11.0.
Se demostro una actividad de secuestro de radicales libres dependiente de la dosis mediante el LSE que tiene una CI 50 de 7,282 pg/ml. De forma analoga, se descubrio que el acido L-ascorbico es un secuestrante de radicales libres con una CI50 de 5,803 pg/ml.
Ejemplo 10. Un procedimiento para administrar una terapia antibacteriana. (No forma parte de la invencion)
Este ejemplo muestra la efectividad del LSE como antibacteriano.
PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES
Agar Mueller-Hinton (MHA) y caldo Mueller-Hinton (MHB) (de Oxoid Ltd.); agar de dextrosa de patata (PDA) y caldo de dextrosa de patata (PDB) (de Liofilchem); discos de prueba de susceptibilidad antimicrobiana que contenian 5 pg/disco de ciprofloxacino y 100 unidades/disco de nistatina (de Oxoid Ltd); seroalbumina bovina y clorhidrato de arginina (de Sigma-Aldrich); cloruro de sodio (NaCl) (de Merck); kit de reactivo Bradford (de Amresco).
una campana de flujo laminar Jouan (Jouan SA, Francia); una incubadora Memmert/INB 400 y un bano de agua Memmert/WNB 22 (de Memmert GmbH, Alemania); una autoclave HIRAYAMA/HV-85 (HIRa Ya MA Corporation, Japon); un espectrofotometro HITACHI U-1900 (de HITACHI High-Tech (Japon)); placas esteriles de 96 pocillos (de Greiner Bio-One Corporation): una centrifuga Hettich ZenTrifugen Universal 32R (Alemania).
Se usaron cepas de referencia de patogenos humanos, incluyendo especies de bacterias grampositivas (Bacillus cereus ATCC25923 y Staphylococcus aureus ATCC25923), cepas bacterianas gramnegativas (Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Escherichia coli ATCC35218 y Salmonella typhi del Instituto de Investigacion Medica, Ministerio de Salud IMR) y dos cepas de hongos (Candida albicans ATCC10231 y Cryptococcus neoformans ATCC90112).
Todos los medios utilizados durante los procedimientos experimentales se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como lo siguiente:
1. Agar de Muller-Hinton (MHA): se preparo suspendiendo 38 g de MHA en 1 l de agua destilada con ebullicion y agitacion energica frecuente hasta que se disolvio completamente. Despues, se esterilizo en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
2. Caldo de Muller-Hinton (MHB): se preparo suspendiendo 21 g de MHB en 1 l de agua destilada con ebullicion y agitacion energica frecuente hasta que se disolvio completamente. Despues, se esterilizo en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. El caldo madre esteril resultante se mantuvo en una botella bien cerrada de 1.000 ml con tapon de rosca, se envolvio con membrana de parafilm en la tapa y se almaceno a 4 °C para su uso posterior. Antes de su uso, se calento el MHB (37 °C) en la incubadora durante 15 minutos.
3. Agar de dextrosa de patata (PDA): se prepare suspendiendo 39 g de PDA en 1 l de agua destilada con ebullicion y agitacion energica frecuente hasta que se disolvio completamente. Despues, se esterilizo en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
4. Caldo de dextrosa de Patata (PDB): se prepare suspendiendo 26,5 g en PDB 1 l de agua destilada con ebullicion y agitacion energica frecuente hasta que se disolvio completamente. Despues, se esterilizo en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. El caldo madre esteril resultante se mantuvo en una botella bien cerrada de 1.000 ml con tapon de rosca, se envolvio con membrana de parafilm en la tapa y se almaceno a 4 °C para su uso posterior. Antes de su uso, El PDB se calento (37 °C) en la incubadora durante 15 minutos.
Antes de verter el agar, el medio de agar esterilizado recien preparado MHA/PDA para cepas bacterianas/fungicas, se dejo enfriar en un bano de agua ajustado a 50 °C durante 15-30 minutos para evitar la formation de gotas de humedad por el fenomeno de condensation. Posteriormente, se vertio un volumen de aproximadamente 20-25 ml en placas Petri esteriles de fondo plano desechables (irradiadas con rayos gamma) hasta una altura de 4 mm evitando que se queden atrapadas burbujas de aire. Las placas con tapas a medio abrir se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos bajo el flujo laminar para eliminar el exceso de humedad y temperatura de la superficie. Por ultimo, se cubrieron las placas, se invirtieron hacia abajo y hacia arriba y se almacenaron en el refrigerador (+4 °C) para su uso en un perlodo maximo de una semana. Antes de la inoculation de las placas que contenlan agar, se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora para minimizar la condensacion (Coyle, 2005; Goldman & Green, 2009; Lalitha, 2004).
Se llevo a cabo un ensayo de turbidez metrica para estandarizar el numero de microorganismos utilizados para la inoculacion. El procedimiento de suspension directa de colonias se utilizo para preparar la suspension de inoculacion (Coyle, 2005; Goldman & Green, 2009; Lalitha, 2004; Rex, Pfaller, Rinaldi, Polak, y Galgiani, 1993). Los procedimientos experimentales incluyen las etapas siguientes:
1. Preparation de suspension estandar de sulfato de bario (0,5 McFarland): Se preparo mediante la adicion de 0,5 partes de BaCl20,048M a 99,5 partes de H2SO40.18M y se agito energicamente hasta obtener una suspension homogenea. La turbidez de la suspension se verifico midiendo la densidad optica a 625 nm (DO625) mediante el espectrofotometro. Se realizaron diluciones apropiadas para obtener un valor de absorbancia de 0. 008.0,10 que corresponde a 0,5 estandares de McFarland. La suspension estandar preparada se dividio en allcuotas en pequenas botellas de vidrio con tapones de rosca, se almaceno a temperatura ambiente y se protegio de la luz. Antes de la utilization, las botellas se agitaron bien con vortex para mantener una suspension uniforme.
2. Procedimiento de suspension directas de colonias:
a) En condiciones asepticas, se suspendieron cinco colonias aisladas mediante un asa de inoculacion esterilizada por ignition de placas de agar cultivadas 18-24 horas de cada microbio por separado en 20 ml de medio de caldo precalentado (37 °C) (MHB para cepas bacterianas o PDB para tinciones de hongos) mantenido en botellas con tapon de rosca e incubadas a 37 °C.
b) Durante el perlodo de incubation, se tomaron partes allcuotas de 1 ml del cultivo a intervalos de una hora y se midio la densidad optica (DO625 para la suspension bacteriana y DO530 para la suspension fungica) utilizando el espectrofotometro.
c) Se realizaron diluciones adecuadas con MHB/PDB para ajustar la suspension de microorganismos para que coincidan con los patrones de turbidez 0,5 de McFarland. La suspension del caldo y el patron de sulfato de bario 0,5 de McFarland se compararon a simple vista con una tarjeta con un fondo blanco y llneas negras. Por ultimo, las suspensiones de caldo resultantes contenlan 107 UFC/ml para las bacterias spp. y 104 UFC/ml para especies de hongos, que se utilizaron para todos los experimentos realizados.
d) Las suspensiones siempre se agitaron completamente antes de la medicion de la DO y la inoculacion. El procedimiento de difusion en disco de Kirby-Bauer se utilizo para determinar la actividad antimicrobiana del LSE: 1. Inoculacion de placas de ensayo: un hisopo de algodon esteril se sumergio y se giro muchas veces en la suspension de microorganismos ajustada. El hisopo sumergido se apreto fuertemente hasta que se elimino todo el exceso de llquidos. El hisopo se paso sobre la superficie de agar esteril desecado de placas que contenlan MHA para cepas bacterianas o placas que contenlan PDA para cepas fungicas. Estas etapas se repitieron tres veces extendiendo la suspension de caldo utilizando una varilla de vidrio para obtener placas inoculadas de manera uniforme. Las placas se dejaron abiertas bajo la campana de flujo laminar durante 5 minutos para permitir que la superficie absorbiera la humedad adicional.
2. Preparacion de discos de papel de filtro seco: Se utilizo papel de filtro WHATMAN N.° 1 para preparar discos de aproximadamente 6 mm de diametro. Estos discos se sumergieron en solucion de prueba (LSE o PhS1, esterilizados por filtracion a traves de papel de filtro SARTORIUS esteril de 0,2 pm). Posteriormente, se dejaron secar durante 5 minutos en la incubadora (37 °C) antes de la aplicacion en las placas de Petri. Los discos se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos antes de colocarlos en las placas de agar Petri inoculadas.
3. Colocacion de discos en las placas petri de agar petri inoculadas: Los discos de filtro cargados con la solucion de prueba (LSE/PhS1) y los discos que contienen los antibioticos de referencia (5 pg/disco de ciprofloxacino o 100 unidades/disco de nistatina) se colocaron en las placas de agar inoculadas utilizando pinzas esteriles con un prensado suave para asegurar una buena adherencia a la superficie del agar. Los discos se distribuyeron a una distancia de al menos 15 mm desde el borde de la placa y no mas cerca de 24 mm de centro a centro. Finalmente, las placas se invirtieron y se incubaron a 37 °C durante 24 horas y 48 horas para especies de bacterias y hongos, respectivamente.
Despues del perlodo de incubacion, la zona de inhibition (mm) alrededor de cada disco se midio utilizando una regla y se comparo con los antibioticos de referencia utilizados.
Se utilizo microdilucion para determinar la concentration inhibitoria minima (CIM), que es la concentration minima de contenido de protelna de LSE que puede inhibir el crecimiento del organismo de prueba. Se llevaron a cabo diluciones en serie de LSE de doble pliegue en una placa esteril de 96 pocillos. Se pipetearon 100 pl de caldo de Mueller-Hinton esteril en los pocillos de las primeras cinco columnas de la placa. Se mezclaron 100 pl de LSE con el caldo en los primeros tres pocillos de la primera fila de la placa. Las diluciones se realizaron transfiriendo allcuotas de 100 pl de la mezcla de los primeros tres pocillos a los siguientes verticalmente, y as! sucesivamente. Se pipetearon 10 pl del caldo de suspension del organismo de prueba que contenla (107UFC/ml) en cada pocillo de las primeras cuatro columnas, pero no se anadio inoculo a la quinta columna. La cuarta y quinta columnas se consideraron positivas (caldo con inoculo) y control negativo (solo caldo), respectivamente. Se tapo la placa, se envolvio con laminas de parafilm alrededor de los bordes para evitar la deshidratacion, y se incubo durante 24 horas a 37 °C. Despues del perlodo de incubacion, el punto final de la CIM se determino por la falta de turbidez en el pocillo.
Las actividades antibacterianas y antifungicas del LSE fresco y las muestras liofilizadas se muestran en la Tabla 3 con ciproflaxino y nistatina, en la que se muestra que el LSE tiene actividad deseada.
Tabla 3.
Figure imgf000035_0001
Ejemplo 11. Un procedimiento para probar, tipos de celulas tumorales solidas y liquidas. (No forma parte de la invention)
Este ejemplo analiza una evaluacion in vitro de la actividad de LSE aplicada a ilneas celulares cancerosas y no cancerosas.
Con el fin de probar el LSE para determinar su eficacia contra el cancer, se puede aplicar a llneas celulares adicionales que incluyen, por ejemplo, MCF-7 (mama), PC-3 (prostata), K562 (leucemia), MeWo (melanoma de piel), Mia PaCa-2 (carcinoma pancreatico), A549 (cancer de pulmon), U87MG (tumor cerebral, glioblastoma), MCF10A (celulas epiteliales normales), HT-29 (carcinoma de colon), CaCo-2 (celulas epiteliales intestinales normales), HEP 3B (cancer de hlgado hepatoma humano), ES-2 (carcinoma ovarico), HBEpC (celulas epiteliales humanas normales), CCRF-CEM (leucemia), HL-60 (TB) (leucemia), MOLT-4 (leucemia), RPMI-8226 (leucemia), SR (leucemia), EKVX (pulmon no microcltico), HOP-62 (pulmon no microcltico), HOP-92 (pulmon no microcltico). NCI-H226 (pulmon no microcltico), NCI-H23 (pulmon no microcltico), NCI-H322M (pulmon no microcltico), NCI-H460 (pulmon no microcltico), NCI-H522 (pulmon no microcltico), COlO 205 (colon), HCC-2998 (colon), HCT-116 (colon), HCT-15 (colon), KM12 (colon), SW-620 (colon), SF-268 (SNC), SF-295 (SNC), SF-539 (SNC), SNB-19 (SNC), SNB-75 (SNC), U251 (SNC), LOX IMVI (melanoma), MALME-3M (melanoma), M14 (melanoma), SK-MEL-2 (melanoma), SK-MEL-28 (melanoma), SK-MEL-5 (melanoma), UACC-257 (melanoma), UACC-62 (melanoma), IGR-Ov I (ovario), OVCAR-3 (ovario), Ov Ca R-4 (ovario), OVCAR-5 (ovario), OVCAR-8 (ovario), SK-OV-3 (ovario), 786-0 (renal), A498 (renal), ACHN (renal), CAKI-1 (renal), RXF-393 (renal), SN12C (renal), TK-10 (renal), UO-31 (renal), DU-145 (prostata), NCI/ADR-RES (mama), MDA-MB-231/ATCC (mama), HS 578T (mama), MDA-MB-435 (mama), MDA-MB-468 (mama), BT-549 (mama), T-47D (mama), Saos-2 (cancer de hueso).
MATERIALES Y METODOS
una placa de fondo plano de 96 pocillos; MTT (bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio) (Sigma n.° cat. M2128); reservorios de reactivos; una pipeta multicanal; una pipeta repetidora multicanal; un conjunto de pipetas individuales, 10 pl, 200 pl, 1000 pl; y varias puntas de pipeta.
Medios de crecimiento, reactivos y suero, incluidos los medios Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), rico en glucosa; RPMI-1640; De Iscove; solucion salina tamponada de Hank; L-glutamina; suero bovino fetal; y tripsina/EDTA.
Para realizar el ensayo de citotoxicidad MTT, producir una solucion madre de 5 mg de MTT/ml de PBS (solucion salina tamponada con fosfato); usar un filtro esteril con un filtro de jeringa de 0,22 pM; y almacenar a 4 °C en oscuridad. Producir una solucion de trabajo de 1 mg/ml de solucion madre de MTT diluida con 1:4 (v/v) en medio de cultivo precalentado.
Dla 1, celulas de la placa; Dla 2, anadir farmacos; Dias 3-5, Leer las placas.
Un ejemplo de un diseno de matriz de placa es el siguiente:
Figure imgf000036_0001
Dla 1: Siembra de celulas
Se pueden sembrar dos llneas celulares en una placa de 96 pocillos, de manera que las pruebas se completen por triplicado para cada una (K562 no es adherente, por ejemplo, por lo que debe estar en una placa separada). Las ilneas celulares adherentes deben sembrarse en placas un dla antes de anadir medicamentos para permitir que las celulas se adhieran a la placa, mientras que las celulas no adherentes (celulas en suspension) se pueden sembrar en placas el mismo dla (dla 2) antes de anadir medicamentos.
Las celulas se cuentan primero en el hemocitometro para observar la viabilidad de las celulas, que debe ser mayor o igual al 90 %. Si este no es el caso, las celulas vivas deben separarse de las celulas muertas utilizando Ficoll-Paque (3 ml por 4 ml de celulas, centrifugar durante 25 minutos a 1500 rpm, lavar las celulas una vez con medio de cultivo 5 min a 1500 rpm). El numero de celulas a sembrar por pocillo varla con la tasa de crecimiento de la llnea celular. La densidad optica ideal (DO) de las celulas de control debe estar entre 1,00 y 2,00 al final del tiempo de incubacion. Debido al aumento de la tasa de evaporacion a lo largo del borde de los pocillos de la placa, no se usa para el ensayo, pero se llena con 200 pl de agua esteril.
La columna B2-G2 se usa como el blanco y se llena con 200 pl de medio. La columna B3-G3 es la columna de control con 100 pl de celulas solamente. El farmaco se anade a las celulas por triplicado, por lo tanto las columnas B4-D4, B5-D5, B6-D6, etc. a B11-D11 permite que se analicen 8 concentraciones diferentes de farmaco. Esto se aplica a la mitad inferior de la placa tambien.
Cuando se anadan las celulas a la placa para asegurarse de que las celulas esten bien suspendidas, se anadira la misma cantidad de celulas a cada pocillo. Deje la placa en una incubadora durante la noche para que las llneas celulares adherentes se asienten en la placa.
Dla 2: Adicion de farmacos
Si hay celulas adherentes, aspirar el medio usado y anadir 100 pl de medio fresco. Anadir 100 pl de medicamento de la concentracion deseada en cada pocillo. Dado que el volumen total del medio por pocillo es de 200 pl, diluir el medicamento en consecuencia. Si desea que la concentracion final del medicamento sea de 10 pM en el pocillo, por ejemplo, tendra que hacer una solucion de 20 pM (100 pl de esto mas 100 pl de su medio le daran una solucion de 10 pmol en un total de 200 pl). Anadir 100 pl de medio a los pocillos en la columna de control (B3-G3). Devolver la placa a la incubadora 72 horas.
Lectura de la placa
Al final del periodo de incubacion, anadir 50 pl por pocillo de la solucion de trabajo MTT a todos los pocillos. Devolver la placa a la incubadora durante 3-4 horas y mantener constantes los tiempos de incubacion para repetir los experimentos. Configurar su molde de ensayo en el lector de placas. Despues de 3-4 horas, retirar las placas de la incubadora. Si las celulas no son adherentes, deben ponerse boca abajo durante 10 minutos a 1800 rpm. Inclinar la placa de 96 pocillos en un angulo de 45 ° hacia usted. Usar una punta de pipeta de 10-100 pl unida al vaclo, aspirar el sobrenadante de cada pocillo. Anadir 150 pl de DMSO por pocillo.
Resuspender las celulas colocando la placa en el agitador de placas (5-10 minutos debe ser suficientemente). En caso necesario, resuspender las celulas resistentes a mano usando la pipeta multicanal, teniendo cuidado de no crear burbujas. La mejor manera de deshacerse de cualquier burbuja en una placa de 96 pocillos es dirigir una suave corriente de aire hacia la placa. Colocar la placa en el espectrofotometro y leerla a 570 nm.
Recogida da datos
Se recopilaran los siguientes registros: optimizacion de celulas en crecimiento para cada llnea celular; citotoxicidad del LSE; y graficos de viabilidad celular.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Una formulacion para su uso en el tratamiento de la hiperglucemia diabetica, comprendiendo la formulacion un extracto de saliva completa de una sanguijuela y un vehiculo farmaceuticamente eficaz, en donde el extracto es un extracto de saliva completa liofilizado.
2. Una formulacion para su uso en el tratamiento de la hiperglucemia diabetica segun la reivindicacion 1, en donde la formulacion se prepara mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas de:
alimentar un agente fagoestimulante a una sanguijuela;
inducir una regurgitacion en la sanguijuela, incluyendo la induccion colocar la sanguijuela en un ambiente con una temperatura inferior a 0 °C;
recoger una saliva completa sin refinar en la regurgitacion de la sanguijuela enfriada;
retirar componentes solidos de la saliva completa sin refinar para crear una saliva completa refinada; y, liofilizar volumenes separados del extracto de saliva completa, sin que los volumenes superen los 2 ml cada uno.
3. Una formulacion para su uso en el tratamiento segun las reivindicaciones 1 o 2, en donde la sanguijuela es Hirudinaria manillensis.
4. Una formulacion para su uso en el tratamiento de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el extracto de saliva completa es un extracto de saliva completa liofilizado, refinado y estable que se refina mediante la extraccion de componentes solidos de una saliva completa sin refinar; y en donde el extracto tiene una actividad estable cuando se almacena para su uso a una temperatura por debajo de -20 °C, manteniendo los extractos al menos el 70 % de la actividad durante al menos seis meses.
ES13841434T 2012-09-17 2013-09-17 Extracto de saliva completa de sanguijuela Active ES2710126T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261701735P 2012-09-17 2012-09-17
US13/624,847 US8685462B1 (en) 2012-09-17 2012-09-21 Whole, leech saliva product and applications thereof
PCT/IB2013/002848 WO2014049447A2 (en) 2012-09-17 2013-09-17 A whole, leech saliva extract

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2710126T3 true ES2710126T3 (es) 2019-04-23

Family

ID=48876315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13841434T Active ES2710126T3 (es) 2012-09-17 2013-09-17 Extracto de saliva completa de sanguijuela

Country Status (10)

Country Link
US (17) US8501241B1 (es)
EP (1) EP2895178B1 (es)
JP (1) JP6220398B2 (es)
CN (1) CN104837495A (es)
AU (1) AU2013322269B2 (es)
CA (1) CA2882533A1 (es)
ES (1) ES2710126T3 (es)
IN (1) IN2015DN02729A (es)
MX (1) MX362375B (es)
WO (1) WO2014049447A2 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8501241B1 (en) 2012-09-17 2013-08-06 Biopep Solutions, Inc. Treating cancer with a whole, leech saliva extract
KR101341289B1 (ko) * 2013-07-09 2013-12-12 한선대 거머리 타액의 채취방법
CN104151425B (zh) * 2014-08-15 2017-02-08 周维海 一种天然水蛭素的规模化生产方法
CN104365560A (zh) * 2014-10-29 2015-02-25 颍上县永祥旱粮研究所 一种水蛭的养殖方法
CN105594666B (zh) * 2015-12-25 2020-04-03 贵州信邦制药股份有限公司 一种快速增加水蛭抗凝血酶活性的养殖方法
CN105418756B (zh) * 2015-12-25 2018-12-21 汤浩强 一种水蛭唾液重复提取的方法
CN108210523A (zh) * 2016-12-09 2018-06-29 江苏小潘园生态农业科技发展有限公司 一种水蛭酒的制作方法
CN107129962B (zh) * 2017-05-18 2019-03-05 中国计量大学 一种日本医蛭唾液腺细胞的原代培养方法
CN107519036A (zh) * 2017-09-06 2017-12-29 深圳肽之妃科技有限公司 一种含多肽的妊娠纹喷剂及其制备方法
CN107796183A (zh) * 2017-11-17 2018-03-13 广西远程水蛭养殖有限公司 水蛭干燥方法
CN109528773A (zh) * 2019-01-15 2019-03-29 昆明学院 水蛭唾液在制备镇痛药物中的应用
CN109662984B (zh) * 2019-02-13 2022-07-26 昆明医科大学 臭灵丹和迷迭香提取物在抗ⅱ型登革病毒药物中的应用
US10787338B1 (en) 2019-08-30 2020-09-29 Blazing Spools LLC Spool device and related methods
CN112915106A (zh) * 2021-02-05 2021-06-08 张虎山 一种肿瘤免疫微环境调控剂的制备及其应用
CN113577821B (zh) * 2021-07-07 2022-08-30 三峡大学 一种活体水蛭素的重复提取装置及方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588587A (en) 1983-03-01 1986-05-13 Pennsylvania Hospital Method of treatment to inhibit metastasis
WO1987000860A1 (en) 1985-08-10 1987-02-12 Biopharm (Uk) Limited Collagen-specific enzyme with platelet aggregation inhibition properties
US4832849A (en) 1988-06-16 1989-05-23 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii
IL86857A (en) * 1988-06-24 1994-04-12 Yissum Res Dev Co Platelet-aggregating inhibitory agents from leech saliva and pharmaceutical preparations containing the same
GB8826428D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Biopharm Ltd Antithrombin
ZA904622B (en) 1989-06-20 1991-03-27 Merrell Dow Pharma Ghilanten:antimetastatic principle from the south american leech,haementeria ghilanii
KR0185973B1 (ko) * 1989-06-20 1999-05-01 게리 디. 스트리트 남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐
DE4103649A1 (de) 1991-02-07 1992-08-13 Basf Ag Neue antikoagulatorisch wirksame peptide
AU659432B2 (en) 1991-03-08 1995-05-18 Novartis Ag A method for the inhibition or prevention of tumor cell metastasis with hirudin
DE4209110A1 (de) 1991-11-26 1993-05-27 Basf Ag Neue thrombininhibitorische proteine aus landblutegeln
DE4234921A1 (de) 1992-10-16 1994-04-21 Basf Ag Neues, die Gerinnungszeit des Blutes verlängerndes Protein aus dem Landblutegel Haemadipsa sylestris
ATE198710T1 (de) 1993-04-09 2001-02-15 Bio Technology General Corp Neuartiges polypeptid mit einer inhibierenden aktivität gegen faktor xa
GB9309509D0 (en) 1993-05-07 1993-06-23 Merck Patent Gmbh Thrombin inhibitors
AU7523194A (en) 1993-08-09 1995-02-28 Athena Neurosciences, Inc. Tick derived protease inhibitor
CA2235394A1 (en) * 1995-11-13 1997-05-22 Gerard Voerman Anti-viral isolates obtainable from leeches
US5866120A (en) 1995-11-22 1999-02-02 Advanced Corneal Systems, Inc. Method for accelerating clearance of hemorrhagic blood from the vitreous humor with hyaluronidase
US6610292B2 (en) 1995-11-22 2003-08-26 Ista Pharmaceuticals, Inc. Use of hyaluronidase in the manufacture of an ophthalmic preparation for liquefying vitreous humor in the treatment of eye disorders
EP0875564A1 (en) 1997-05-02 1998-11-04 Gerard Voerman Biologically active extract from the leech 'Limnatis nilotica'
SE512633C2 (sv) 1997-07-09 2000-04-17 Cecilia Johnsson Användning av hyaluronidas för reduktion av inflammatoriska cellinfiltrat
WO2000077221A1 (en) 1999-06-12 2000-12-21 Merck Patent Gmbh Hyaluronidase from the hirudinaria manillensis, isolation, purification and recombinant method of production
CN1525868A (zh) 2001-07-09 2004-09-01 埃弗顿有限公司 治疗和预防肝脏、肺脏和食道的癌症和癌症前期症状
CN1273012C (zh) * 2003-01-15 2006-09-06 周维海 从菲牛蛭活体中提取天然水蛭素的方法
CN101230086A (zh) * 2007-01-22 2008-07-30 广东海洋大学 一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺
WO2009018640A1 (en) 2007-08-07 2009-02-12 Universidade Federal De São Paulo Unifesp Use of platelet aggregation and coagulation inhibitors isolated from bauhinia sp.
US20110070184A1 (en) * 2008-03-24 2011-03-24 Carolus Therpeutics, Inc. Methods and compositions for treating atherosclerosis and related condidtions
EP2316465A1 (en) 2009-10-15 2011-05-04 Centre National De La Recherche Scientifique Use of extract of leeches' saliva as anti-bacterial agent for the manufacture of different compositons
CN102258771A (zh) 2011-07-13 2011-11-30 中国药科大学 重组水蛭素在防治糖尿病性白内障中的应用
US8501241B1 (en) 2012-09-17 2013-08-06 Biopep Solutions, Inc. Treating cancer with a whole, leech saliva extract
CN102964446B (zh) * 2012-11-28 2014-08-13 周维官 一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015528491A (ja) 2015-09-28
MX362375B (es) 2019-01-14
US20150086645A1 (en) 2015-03-26
US8932642B2 (en) 2015-01-13
US9017732B1 (en) 2015-04-28
US20140079799A1 (en) 2014-03-20
MX2015003352A (es) 2015-10-22
WO2014049447A2 (en) 2014-04-03
US8501241B1 (en) 2013-08-06
CA2882533A1 (en) 2014-04-03
US20140356448A1 (en) 2014-12-04
US20160120914A1 (en) 2016-05-05
US20140363518A1 (en) 2014-12-11
US9149498B2 (en) 2015-10-06
US20150359826A1 (en) 2015-12-17
US8685462B1 (en) 2014-04-01
CN104837495A (zh) 2015-08-12
US9480720B1 (en) 2016-11-01
IN2015DN02729A (es) 2015-09-04
US10064897B2 (en) 2018-09-04
WO2014049447A3 (en) 2014-06-19
US20150359825A1 (en) 2015-12-17
US20150196607A1 (en) 2015-07-16
EP2895178A4 (en) 2016-05-25
JP6220398B2 (ja) 2017-10-25
US20160331790A1 (en) 2016-11-17
US8790711B2 (en) 2014-07-29
EP2895178A2 (en) 2015-07-22
US9597361B2 (en) 2017-03-21
US9005667B1 (en) 2015-04-14
US20160120913A1 (en) 2016-05-05
AU2013322269A1 (en) 2015-03-05
US20140079800A1 (en) 2014-03-20
US20170239301A1 (en) 2017-08-24
US8962034B2 (en) 2015-02-24
EP2895178B1 (en) 2018-11-07
US9265802B2 (en) 2016-02-23
US9433649B2 (en) 2016-09-06
US20150182562A1 (en) 2015-07-02
US20160331789A1 (en) 2016-11-17
US8784896B2 (en) 2014-07-22
US9433648B2 (en) 2016-09-06
US20140079798A1 (en) 2014-03-20
US9144587B2 (en) 2015-09-29
US9265803B2 (en) 2016-02-23
US20150099006A1 (en) 2015-04-09
AU2013322269B2 (en) 2018-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2710126T3 (es) Extracto de saliva completa de sanguijuela
ES2462553A1 (es) Composición para mejora del bienestar sexual
Ismaiel et al. Modulation of nephrotoxicity induced by gentamicin with bone marrow mesenchymal stem cells and moringa oleifera extract
WHOLE 12, Patent Application Publication o Pub. No.: US 2015/0359825A1
WHOLE 12, Patent Application Publication o Pub. No.: US 2016/0120913A1
IEECH 12, Patent Application Publication o Pub. No.: US 2015/0359826 A1
RU2586283C1 (ru) ИНЪЕКЦИОННЫЙ ИЛИ ИНФУЗИОННЫЙ РАСТВОР L-АРГИНИНИЕВОЙ СОЛИ 5-МЕТИЛ-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[1,5-а]ПИРИМИДИН-7-ОНА МОНОГИДРАТА ДЛЯ ТЕРАПИИ ГРИППА И ДРУГИХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
KR20230133718A (ko) 항진균 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균용 조성물