ES2704272T3

ES2704272T3 - Preparaciones combinadas para el tratamiento del cáncer o infección

Info

Publication number: ES2704272T3
Application number: ES16700138T
Authority: ES
Inventors: Frédéric Triebel; Chrystelle Brignone
Original assignee: Immutep SAS
Current assignee: Immutep SAS
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2019-03-15
Anticipated expiration: 2036-01-08
Also published as: CN107249619A; CN114146161A; RU2017127000A3; US20230330182A1; GB201500374D0; EP3242678A1; LT3473263T; WO2016110593A1; PT3473263T; PL3473263T3; PL3242678T3; JP2024015265A; CY1124462T1; US11684654B2; SI3473263T1; KR102704108B1; JP7116547B2; MX2017009003A; US20200121757A1; AU2024204196A1

Abstract

Una preparación combinada, que comprende: (a) proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, y opcionalmente el dominio D2, de la proteína LAG-3, o en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3; y (b) un inhibidor de la ruta de proteína-1 de muerte celular programada (PD-1), en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, o en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-L1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-L1 a PD-1.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparaciones combinadas para el tratamiento del cáncer o infección

Esta invención se refiere a preparaciones combinadas y a composiciones farmacéuticas, y a su uso como medicamentos, en particular para el tratamiento del cáncer o infección. También se describen métodos para el tratamiento del cáncer o infección.

Tras surgir del timo, los linfocitos T vírgenes circulan en la sangre a través de los ganglios linfáticos y buscan antígenos exógenos ("no propios") presentados por células presentadoras de antígeno (APC) específicas, típicamente células dendríticas. Los linfocitos T pueden reconocer no solamente los antígenos asociados a patógenos, sino también proteínas propias expresadas de forma anómala que indican células tumorigénicas mutadas o transformadas como "no propias". Si los linfocitos T encuentran su antígeno específico en el contexto de moléculas coestimuladoras apropiadas, las células quedan activadas y regulan por aumento la activación y guiado de las moléculas. Estos linfocitos T, llamados linfocitos T efectores, pueden entrar en los tejidos inflamados en busca de células infectadas o cancerosas. Entre otras funciones, los linfocitos T efectores pueden producir citocinas inflamatorias y/o gránulos citolíticos, que dan lugar a apoptosis o necrosis de células infectadas o tumorales.

A lo largo de todo lo que dura una respuesta inmunitaria, las fuerzas reguladoras por disminución locales y sistémicas minimizan el daño a las células y tejidos sanos. Estas pueden implicar citocinas inmunosupresoras, linfocitos T reguladores (Treg) y señalización negativa desde otras células. Los linfocitos T específicos de antígeno tumoral presentan función efectora alterada y un fenotipo agotado caracterizado por producción disminuida de citocinas proinflamatorias e hiposensibilidad a restimulación antigénica. Esto está mediado por mecanismos extrínsecos celulares, tales como linfocitos T reguladores (Treg) y mecanismos intrínsecos celulares, tales como moléculas inhibidoras que están reguladas por aumento en linfocitos de infiltración tumoral (TIL) agotados.

Las rutas de comprobación inmunitarias regulan por disminución fuertemente la activación de los linfocitos T con intención de mantener las respuestas de linfocitos T emergentes en comprobación y reducir la probabilidad de un ataque inmunitario contra los tejidos normales. Durante la tumorigénesis, sin embargo, las células cancerosas pueden explotar estas rutas coinhibidoras para resistir la detección o evitar la eliminación por el sistema inmunitario adaptativo. La proteína-1 de muerte celular programada (PD-1) es una molécula de comprobación crítica que se expresa por linfocitos T tras la activación. La ruta de comprobación de PD-1 se cree que actúa principalmente en tejidos periféricos para amortiguar las respuestas inmunitarias en curso y/o para prevenir el daño a tejidos propios. PD-1 se expresa por linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK), células dendríticas y monocitos activados, además de linfocitos T. Los ligandos PD-1, que incluyen PD-L1 y PD-L2, entre otros, se expresan por macrófagos y monocitos, y estos pueden inducirse en numerosos tipos celulares en un entorno inflamatorio.

La capacidad de las células no inmunitarias de expresar ligandos para PD-1, principalmente PD-L1, se explota por los tumores como una manera de evitar el ataque inmunitario. Las células tumorales también pueden regular por disminución la expresión de antígenos para evitar la detección. Además, la producción de mediadores inmunosupresores y la retención de Treg y células inmunosupresoras dentro del microentorno tumoral puede amortiguar las respuestas inmunitarias antitumorales.

La figura 1 (obtenida de Harvey, Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2014, Vol. 96(2), páginas 214-223) representa la función de la ruta de PD-1 en la evasión inmunitaria tumoral y el mecanismo de acción del bloqueo de la ruta de PD-1: (a) PD-1 en la activación de linfocitos T. Los linfocitos T se activan mediante (i) unión a ^mH^cmás péptido en una APC al TCR y después (ii) unión de CD80/86 de APC al CD28 del linfocito T. En pacientes con cáncer, las células tumorales también sirven como APC. Tras la activación de los linfocitos T, se induce la expresión de PD-1; (b) PD-1 en agotamiento de linfocitos T. En situaciones de infección crónica o estimulación persistente, PD-L1 señaliza mediante PD-1 de linfocitos T para "inactivar" los linfocitos T para minimizar el daño al tejido sano (la señalización de activación está bloqueada). Las células tumorales pueden regular por aumento PD-L1 para "inactivar" los linfocitos T que podrían destruirlas. (c) El bloqueo de la ruta de señalización de PD-1/PD-L1 permite que los linfocitos T mantengan sus funciones efectoras. En pacientes con cáncer, los linfocitos T específicos de tumor activados pueden eliminar las células tumorales y secretar citocinas que activan/reclutan otras células inmunitarias para participar en la respuesta antitumoral.

La clonación de PD-1 se describe por Ishida, et al., (The EMBO Journal (1992), vol. 11(11), pág. 3887-3895). La secuencia del ADNc de PD-1 humana está registrada en el número de acceso a GenBank NM_005018. La secuencia del ADNc de PD-L1 humano se proporciona en el número de acceso a GenBank AF233516, y la secuencia del ADNc de PD-L2 humano se proporciona en el número de acceso a GenBank NM_025239.

En septiembre de 2014, la Food and Drug Administration (FDA) de Estados Unidos concedió la aprobación acelerada a Keytruda (pembrolizumab) para el tratamiento de pacientes con melanoma avanzado o no resecable que ya no responden a otros fármacos. Keytruda (Merck & Co.) es un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado contra PD-1. Comprende secuencias de la región variable de un anticuerpo de ratón de muy alta afinidad anti-PD-1 humana injertado en una inmunoglobulina IgG4 humana, con una alteración para aumentar la estabilidad. Keytruda bloquea la unión de PD-1 a PD-L1 y PD-L2.

En diciembre de 2014, la FDA de Estados Unidos también concedió la aprobación acelerada a Opdivo (nivolumab), un nuevo tratamiento para pacientes con melanoma no resecable o metastásico que ya no responden a otros fármacos. Opdivo (Bristol-Myers Squibb) es un anticuerpo IgG4 monoclonal completamente humano contra PD-1 que bloquea la unión de PD-1 a PD-L1 y PD-L2.

Nivolumab ha experimentado la evaluación clínica más amplia en cáncer broncopulmonar entre los inhibidores de la ruta de PD-1. Las evidencias de actividad como monoterapia en carcinoma broncopulmonar no microcítico escamoso y no escamoso (NSCLC) y en combinación con quimioterapia convencional se han demostrado en pacientes con NSCLC. Pembrolizumab se está evaluando en un ensayo clínico en curso en pacientes con NSCLC (NCT01295827).

Otros varios agentes prometedores dirigidos a la ruta de PD-1 (inhibidores de la ruta de PD-1) están en desarrollo clínico (véase la tabla 1.1 a continuación):

Tabla 1.1: Inhibidores de la ruta de PD-1 en desarrollo clínico, además de pembrolizumab y nivolumab (obtenidos de =1 ^

Un inhibidor de la ruta de PD-1 adicional en desarrollo clínico es Avelumab (también conocido como MSB0010718C), un anticuerpo monoclonal IgG 1 anti-PD-L1 completamente humano, en desarrollo conjunto de Merck KGaA y Pfizer.

A pesar de la reciente aprobación por la FDA de Keytruda y Opdivo para el tratamiento de melanoma avanzado, y los resultados prometedores contra NSCLC en ensayos clínicos de agentes dirigidos a la ruta de PD-1, sigue existiendo una necesidad de proporcionar tratamientos contra el cáncer más eficaces, para proporcionar tratamientos que sean eficaces para una cantidad más amplia de pacientes con cáncer, para proporcionar tratamientos eficaces para otros cánceres y para proporcionar tratamientos eficaces contra el cáncer con efectos secundarios reducidos.

El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) es una proteína de membrana de tipo I homóloga a CD4 con cuatro dominios de la superfamilia de inmunoglobulina extracelular. Similar a CD4, LAG-3 oligomeriza en la superficies de linfocitos T y se une a moléculas MHC de clase II en células presentadoras de antígeno (APC) pero con afinidad significativamente mayor que CD4. LAG-3 se expresa en linfocitos T CD4+ y CD8+ activados donde se asocia con el complejo de CD3/receptor de linfocitos T en la superficie celular y regula negativamente la transducción de señales. Como consecuencia, regula negativamente la proliferación de linfocitos T, la función y la homeostasis. LAG-3 está regulado por aumento en linfocitos T agotados en comparación con linfocitos T efectores o de memoria. LAG-3 también está regulado por aumento en linfocitos de infiltración tumoral (TIL) y el bloqueo de LAG-3 usando anticuerpo anti-LAG-3 puede potenciar las respuestas de linfocitos T antitumorales.

Blackburn et al., (Nat Immunol. 2009; 10(1): 29-37) describen la corregulación del agotamiento de linfocitos T CD8+ durante infección vírica crónica por múltiples receptores inhibidores. Usando un modelo de ratón de virus de la coriomeningitis linfocítica crónica (LCMV), los autores demuestran que los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno agotados tenían expresión aumentada de hasta siete receptores inhibidores (PD-1, LAG3, 2B4, CD160, CTLA-4, PIR-B y GP49) en comparación con linfocitos T CD8+ de memoria o vírgenes. La coexpresión de múltiples receptores inhibidores distintos se asoció con mayor agotamiento de linfocitos T e infección más grave. El bloqueo de los receptores inhibidores de linfocitos T PD-1 y LAG-3 (usando anticuerpos anti-PD-L1 y anti-LAG-3 ) mejoró las respuestas de linfocitos T y disminuyó la carga vírica in vivo.

Woo et al., (Cancer Research 2011; 72(4): 917-927) describen la coexpresión de PD-1 y LAG-3 en linfocitos T CD4+ y CD8+ de infiltración tumoral en tumores trasplantables. El tratamiento doble con anticuerpo anti-LAG-3/anti-PD-1 curó la mayoría de los ratones de los tumores establecidos que eran en gran medida resistentes a tratamiento con un único anticuerpo.

Basándose en la función inmunomoduladora de LAG-3 sobre la función de linfocitos T en infección crónica y cáncer, el mecanismo de acción previsto para anticuerpos monoclonales específicos de LAG-3 es inhibir la regulación negativa de los linfocitos T efectores específicos de tumor.

LAG-3 también codifica una variante de corte y empalme alternativo que se traduce en una forma soluble de LAG-3 (sLAG-3). Como molécula soluble, LAG-3 activa las células presentadoras de antígeno (APC) mediante la señalización de MHC de clase II, que da lugar a respuestas aumentadas de linfocitos T específicos de antígeno in vivo (Triebel, Trends Immunol., 2003, 24: 619-622).

La respuesta inmunitaria antitumoral principal está mediada mediante la activación de linfocitos T CD8 citotóxicos de tipo 1 (Tc1), linfocitos NK y monocitos/macrófagos. En ensayos ex vivo a corto plazo, una forma soluble de la proteína LAG-3 (IMP321) induce una respuesta de tipo citotóxica apropiada en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Brignone et al, Journal of Immunology, 2007, 179: 4202-4211). IMP321 se une a una mínima cantidad de células MHC de clase II+ en PBMC, incluyendo todas las células dendríticas mieloides y una pequeña fracción de monocitos. Cuatro horas después de la adición de IMP321 a las PBMC, estas células mieloides producen TNF-a y CCL4. A las 18 horas, un 1 % de los linfocitos T CD8+ y un 3,7 % de los linfocitos NK producen citocinas Tc1 tales como IFN-a y/o TNF-a. La activación de APC temprana por IMP321 es necesaria para esta activación de tipo Tc1 porque los linfocitos T CD8+ clasificados puros no podían activarse por IMP321. Únicamente los linfocitos T CD8 granzima+ completamente diferenciados, contactados con el antígeno (linfocitos T efectores y efectores de memoria, pero no vírgenes o centrales de memoria) se inducen por IMP321 a activación Tc1 completa.

Ahora se ha descubierto que un inhibidor de la ruta de PD-1 (un anticuerpo anti-PD-1, o un anticuerpo anti-PD-L1) y un derivado soluble de LAG-3 (IMP321), que actúa como activador de APC, activan conjuntamente de forma sinérgica los linfocitos T (en particular, linfocitos T CD8+) in vitro.

Esta activación sinérgica de linfocitos T es sorprendente. En el tratamiento doble con anticuerpo anti-LAG-3/anti-PD-1 descrito por Woo et al., (supra), se cree que el anticuerpo anti-LAG-3 está inhibiendo la regulación negativa de los linfocitos T efectores específicos de tumor por LAG-3, mientras que se cree que el derivado soluble de LAG-3 (IMP321) está actuando mediante un mecanismo diferente, como un activador de APC.

De acuerdo con la invención, se proporciona una preparación combinada, que comprende:

(a) proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, y opcionalmente el dominio D2, de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana, o en la que el derivado de la proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana; y

(b) un inhibidor de la ruta de PD-1, en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, o en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-L1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-L1 a PD-1.

La expresión "preparación combinada", como se usa en este documento, se refiere a un "kit de partes" en el sentido de que los componentes (a) y (b) de la combinación como se definen anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de combinaciones fijas diferentes con cantidades distinguidas de los componentes (a) y (b) de la combinación. Los componentes pueden administrarse simultáneamente o uno después del otro. Si los componentes se administran uno después del otro, preferiblemente el intervalo de tiempo entre la administración se elige de modo que el efecto terapéutico del uso combinado de los componentes sea mayor que el efecto que se obtendría mediante el uso de únicamente uno cualquiera de los componentes (a) y (b) de la combinación.

Los componentes de la preparación combinada pueden estar presentes en una forma galénica unitaria combinada, o como una primera forma galénica unitaria de componente (a) y una segunda forma galénica unitaria diferente de componente (b). La relación de las cantidades totales del componente (a) de la combinación al componente (b) de la combinación a administrar en la preparación combinada puede variarse, por ejemplo, para afrontar las necesidades de una subpoblación de pacientes a tratar, o las necesidades del paciente individual, que pueden deberse, por ejemplo, a la enfermedad particular, la edad, el género o el peso corporal del paciente.

Preferiblemente, hay al menos un efecto beneficioso, por ejemplo, una potenciación del efecto del inhibidor de la ruta de PD-1, o una potenciación del efecto de la proteína LAG-3, o derivado de la misma, o una potenciación mutua del efecto de los componentes (a) y (b) de la combinación, por ejemplo, un efecto más que aditivo, efectos ventajosos adicionales, menos efectos secundarios, menos toxicidad o un efecto terapéutico combinado en comparación con una dosificación eficaz de uno o ambos componentes (a) y (b) de la combinación, y muy preferiblemente sinergia de los componentes (a) y (b) de la combinación.

Una preparación combinada de la invención puede proporcionarse como una preparación combinada farmacéutica para la administración a un mamífero, preferiblemente un ser humano. La proteína LAG-3, o derivado de la misma, puede proporcionarse opcionalmente junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, y/o el inhibidor de la ruta de PD-1 puede proporcionarse opcionalmente junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La LAG-3, o derivado de la misma, puede estar presente a una dosis que es un equivalente molar de 0,25-30 mg, 1 30 mg o 6-30 mg del derivado de LAG-3 proteína de fusión LAG-3Ig IMP321. Las dosis de 6-30 mg por inyección subcutánea (s.c.) de IMP321 han demostrado ser seguras y proporcionar una exposición sistémica aceptable basándose en los resultados de los datos farmacocinéticos obtenidos en pacientes con cáncer metastásico de células renales. Se obtiene una concentración en sangre de IMP321 superior a 1 ng/ml durante al menos 24 horas después de la inyección s.c. en pacientes a los se ha inyectado dosis de IMP321 de más de 6 mg.

Una preparación combinada de la invención puede comprender una pluralidad de dosis de la proteína LAG-3, o derivado de la misma.

El inhibidor de la ruta de PD-1 puede ser un agente que inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2. En particular, el agente puede inhibir la unión de PD-1 humana a PD-L1 humano y/o PD-L2 humano. El agente puede inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2 en al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %. Se describen ensayos adecuados para determinar la unión de PD-1 a PD-L1 o PD-L2, por análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR), o análisis de citometría de flujo, en Ghiotto et al., (Int. Immunol. Agosto de 2010; 22(8): 651-660). El agente puede inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, por ejemplo, mediante la unión a PD-1, a PD-L1 o a PD-L2. El agente comprende un anticuerpo, adecuadamente un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo monoclonal humano o humanizado, o un fragmento o derivado de un anticuerpo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2.

Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 adecuados para su uso de acuerdo con la invención incluyen: Pembrolizumab (MK-3475), un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado; Nivolumab, un anticuerpo IgG4 monoclonal completamente humano; Pidilizumab (CT-011), un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado. Un ejemplo de un inhibidor de la ruta de PD-1 que inhibe PD-1, pero no es un anticuerpo, es AMP-224. AMP-224 es una proteína de fusión recombinante del dominio extracelular de PD-L2 y la región Fc de IgG humana. AMP-224 causa la reducción de linfocitos T de alta expresión de PD-1. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 adecuados para su uso de acuerdo con la invención incluyen: BMS-936559, un anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humano; MEDI4736 (Durvalumab), un anticuerpo monoclonal completamente humano; MPDL3280A, un anticuerpo monoclonal humano que contiene un dominio Fc de IgG genomanipulado para evitar ADCC; Avelumab (también conocidos como MSB0010718C), un anticuerpo monoclonal IgG1 completamente humano anti-PD-L1.

La dosis del inhibidor de la ruta de PD-1 dependerá del inhibidor de la ruta de PD-1 particular que está usando. En general, una dosis típicamente prescrita de un inhibidor de la ruta de PD-1 para un sujeto humano puede ser de 0,1 a 10 mg/kg, por ejemplo, de 0,1 a 1 mg/kg o de 1 a 10 mg/kg. La expresión "dosis típicamente prescrita" se usa en este documento para incluir una dosis que es igual a la dosis, o dentro del intervalo de dosis, que es segura y terapéuticamente eficaz para su administración a un sujeto (adecuadamente un sujeto humano) como monoterapia, o que está aprobada por la autoridad reguladora apropiada para su administración a un sujeto (adecuadamente un sujeto humano) como monoterapia. Los ejemplos de dosis típicamente prescritas a seres humanos de inhibidores de la ruta de PD-1 conocidos cuando se usan como monoterapia incluyen:

Pembrolizumab (MK-3475): 2-10 mg/kg cada dos o tres semanas. Por ejemplo, la FDA de EE.UU. ha aprobado la administración de 2 mg/kg de Keytruda (pembrolizumab) como infusión intravenosa durante 30 minutos cada 3 semanas;

Nivolumab: 0,1-10 mg/kg cada dos semanas. Por ejemplo, la FDA de EE.UU. ha aprobado la administración de 3 mg/kg de Opdivo (nivolumab) como infusión intravenosa durante 60 minutos cada 2 semanas;

BMS-936559: 0,3-10 mg/kg cada dos semanas.

El inhibidor de la ruta de PD-1 puede administrarse por cualquier adecuada, por ejemplo, por vía parenteral (incluyendo mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular). Los inhibidores de la ruta de PD-1 actualmente aprobados o en desarrollo se administran como infusión intravenosa.

Una preparación combinada de la invención puede comprender una pluralidad de dosis del inhibidor de la ruta de PD-1.

La proteína LAG-3 puede ser una proteína LAG-3 natural o recombinante aislada. La proteína LAG-3 puede comprender una secuencia amino de la proteína LAG-3 de cualquier especie adecuada, tal como una proteína LAG-3 de primate o murina, pero preferiblemente una proteína LAG-3 humana. La secuencia de aminoácidos de la proteína LAG-3 humana y murina se proporciona en la figura 1 de Huard et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997). La secuencia de la proteína LAG-3 humana se repite en la figura 15 a continuación (SEQ ID NO: 1). Las secuencias de aminoácidos de los cuatro dominios de la superfamilia de Ig extracelulares (D1, D2, D3 y D4) de LAG-3 humana también se identifican en la figura 1 de Huard et al., en los restos de aminoácido: 1-149 (D1); 150 239 (D2); 240-330 (D3); y 331-412 (D4).

Los derivados de la proteína LAG-3 incluyen fragmentos solubles, variantes o mutantes de la proteína LAG-3 que pueden unirse a moléculas MHC de clase II. Se conocen varios derivados de la proteína LAG-3 que pueden unirse a moléculas MHC de clase II. Muchos ejemplos de dichos derivados se describen en Huard et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997). Este documento describe la caracterización del sitio de unión de MHC de clase II en la proteína LAG-3. Se describen métodos para generar mutantes de LAG-3, así como un ensayo de adhesión celular cuantitativo para determinar la capacidad de los mutantes de LAG-3 de unirse a células Daudi positivas para clase II. Se determinó la unión de varios mutantes diferentes de LAG-3 a moléculas MHC de clase II. Algunas mutaciones pueden reducir la unión de clase II, mientras que otras mutaciones aumentaban la afinidad de LAG-3 por moléculas de clase II. Muchos de los restos esenciales para la unión de proteínas MHC de clase II están agrupados en la base de una estructura grande de bucle adicional de 30 aminoácidos en el dominio D1 de LAG-3. La secuencia de aminoácidos de la estructura de bucle adicional del dominio D1 de la proteína LAG-3 humana es GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 2), la secuencia subrayada en la figura 15.

El derivado de la proteína LAG-3 puede comprender la secuencia de bucle adicional de 30 aminoácidos del dominio D1 de LAG-3, o una variante de dicha secuencia con una o más sustituciones de aminoácido conservativas. La variante pueden comprender la secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de bucle adicional de 30 aminoácidos del dominio D1 de LAG-3 humana. El derivado de la proteína LAG-3 puede comprender una secuencia de aminoácidos del dominio D1, y opcionalmente el dominio D2 de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana.

El derivado de la proteína LAG-3 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, o con el dominio D1 y D2, de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana.

El derivado de la proteína LAG-3 puede comprender una secuencia de aminoácidos de los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana.

El derivado de la proteína LAG-3 puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 90 % o 95 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, D2 y D3, o con el dominio D1, D2, D3, y D4, de la proteína LAG-3, preferiblemente LAG-3 humana.

La identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos puede determinarse comparando una alineación de las secuencias. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por el mismo aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La puntuación de una alineación con un porcentaje de identidad es una función del número de aminoácidos idénticos en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Cuando se comparan secuencias, las alineaciones óptimas pueden requerir la introducción de huecos en una o más de las secuencias para tener en cuenta posibles inserciones y eliminaciones en las secuencias. Los métodos de comparación de secuencias pueden emplear penalizaciones de hueco de modo que, para el mismo número de moléculas idénticas en secuencias que se están comparando, una alineación de secuencias con la mínima cantidad posible de huecos, que refleje mayor relación entre las dos secuencias comparadas, conseguirá una mayor puntuación que una con muchos huecos. El cálculo del porcentaje máximo de identidad implica la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco.

Los programas informáticos adecuados para realizar comparaciones de secuencia están ampliamente disponibles en el sector comercial y público. Los ejemplos incluyen MatGat (Campanella et al., 2003, b Mc Bioinformatics 4: 29; programa disponible en http://bitincka.com/ledion/matgat), Gap (Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 453), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; programa disponible en http://www.ebi.ac.uk/fasta), Clustal W 2.0 y X 2.0 (Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948; programa disponible en http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2) y algoritmos de alineación por pares EMBOSS (Needleman y Wunsch, 1970, supra; Kruskal, 1983, en: Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, Sankoff & Kruskal (eds), pág. 1-44, Addison Wesley; programas disponibles en http://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/align). Todos los programas pueden ejecutarse usando parámetros por defecto. Por ejemplo, pueden emprenderse comparaciones de secuencia usando el método de "needle" de los algoritmos de alineación por pares EMBOSS, que determina una alineación óptima (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se consideran sobre su longitud completa y proporciona una puntuación de porcentaje de identidad. Los parámetros por defecto para comparaciones de secuencias de aminoácidos (opción "molécula proteínica") puede ser penalización por extensión de hueco: 0,5, penalización por abertura de hueco: 10,0, Matriz: Blosum 62.

La comparación de secuencias puede realizarse sobre la longitud completa de la secuencia de referencia.

El derivado de la proteína LAG-3 puede fusionarse a la secuencia de aminoácidos de Fc de inmunoglobulina, preferiblemente la secuencia de aminoácidos de Fc de IgG1 humana, opcionalmente mediante una secuencia de aminoácidos conectora.

La capacidad de un derivado de proteína LAG-3 de unirse a moléculas MHC de clase II puede determinarse usando un ensayo de adhesión celular cuantitativo como se describe en Huard et al,. (supra). La afinidad de un derivado de proteína LAG-3 por moléculas MHC de clase II puede ser de al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% de la afinidad de la proteína LAG-3 humana por moléculas de clase II. Preferiblemente, la afinidad de un derivado de proteína LAG-3 por moléculas MHC de clase II es al menos un 50 % de la afinidad de la proteína LAG-3 humana por moléculas de clase II.

Los ejemplos de derivados adecuados de proteína LAG-3 que pueden unirse a moléculas MHC de clase II incluyen derivados que comprenden:

los restos de aminoácido 23 A 448 de la secuencia de LAG-3 humana;

la secuencia de aminoácidos de los dominios D1 y D2 de LAG-3;

la secuencia de aminoácidos de los dominios D1 y D2 de LAG-3 con una sustitución de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: posición 73 donde ARG está sustituida con GLU; posición 75 donde ARG está sustituida con ALA o GLU; posición 76 donde ARG está sustituida con GLU; posición 30 donde ASP está sustituida con ALA; posición 56 donde HIS está sustituida con ALA; posición 77 donde TYR está sustituida con PHE; posición 88 donde ARG está sustituida con ALA; posición 103 donde ARG está sustituida con ALA; posición 109 donde ASP está sustituida con GLU; posición 115 donde ARG está sustituida con ALA;

la secuencia de aminoácidos del dominio D1 de LAG-3 con una eliminación de los restos de aminoácido 54 a 66; una proteína de fusión de LAG-3lg humana soluble recombinante (IMP321), un dímero de 200 kDa producido en células de ovario de hámster chino transfectadas con un plásmido que codifica el dominio extracelular de hLAG-3 fusionado al Fc de IgG1. La secuencia de IMP321 se proporciona en la SEQ ID NO: 17 del documento US 2011/0008331.

De acuerdo con la invención, también se proporciona una composición farmacéutica, que comprende:

(a) proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, y opcionalmente el dominio D2, de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana, o en la que el derivado de la proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3, preferiblemente la proteína LAG-3 humana;

(b) un inhibidor de la ruta de PD-1, en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, o en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-L1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-L1 a PD-1; y

(c) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la invención, se proporciona además una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención para su uso como medicamento.

La invención también proporciona una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención para prevenir, tratar o mejorar el cáncer.

Se proporciona además de acuerdo con la invención el uso de una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir, tratar o mejorar el cáncer.

También se proporciona un método de prevención, tratamiento o mejora del cáncer, que comprende administrar proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, y un inhibidor de la ruta de PD-1, a un sujeto que necesita dicha prevención, tratamiento o mejora.

Se ha apreciado que preparaciones combinadas y composiciones de la invención también pueden usarse para la prevención, tratamiento o mejora de una infección, en particular infección crónica o persistente.

Durante infección aguda, los linfocitos T CD8 citotóxicos (CTL) específicos de patógeno activados proliferan y adquieren funciones efectoras, tales como producción de citocinas y capacidad citotóxica, que les posibilita eliminar de forma eficaz la infección. Después de la eliminación, una pequeña combinación de linfocitos T de memoria específicos de patógeno permanece, que tiene la capacidad de reactivar muy rápidamente y adquirir sus funciones de eliminación después de una nueva exposición al mismo patógeno. Sin embargo, durante infección crónica, esto no sucede, ya que los CTL específicos de patógeno se encuentra que son funcionalmente deficientes e incapaces de eliminar la infección. Estos CTL agotados se definen por su capacidad proliferativa, producción de citocinas alterada y pérdida de capacidades citotóxicas (véase la figura 1(b), y la revisión de Hofmeyer et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volumen 2011, Artículo ID 451694).

Este fenómeno se definió originalmente usando un modelo de ratón bien establecido de infección vírica crónica en ratones, el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (Zajac, et al., The Journal of Experimental Medicine, vol.

188, n.° 12, pág. 2205-2213, 1998; Gallimore, et al., The Journal of Experimental Medicine, vol. 187, n.° 9, pág.

1383-1393, 1998.). La cepa Armstrong de LCMV causa una infección aguda que se elimina por el sistema inmunitario, generando una memoria de CTL robusta. Por otro lado, el Clon 13 de la cepa de LCMV establece una infección crónica en ratones que hace que los CTL se agoten y no puedan eliminar la infección. Adicionalmente, en comparación con linfocitos T normales, los CTL agotados tienen deficiencias metabólicas y expresión alterada de genes implicados en quimiotaxis, adhesión y migración (Wherry, et al., Immunity, vol. 27, n.° 4, pág. 670-684, 2007). En un estudio realizado para revelar los mecanismos que dan lugar al agotamiento, se comparó el perfil genético de los CTL agotados de una infección por LMCV crónica con el de CTL funcionales que responden a una infección por LCMV aguda (Barber, et al., Nature, vol. 439, n.° 7077, pág. 682-687, 2006). Se descubrió que los CTL agotados tienen sobreexpresión significativa de PD-1, mientras que los CTL específicos de LCMV funcionales no tenían expresión apreciable de PD-1. Se descubrió que la expresión de PD-1 se correlaciona con la alteración funcional definida observada en linfocitos T agotados y, a su vez, cargas víricas mayores. El bloqueo de la ruta de PD-1/PD-L1, con un anticuerpo anti-PD-L1, en ratones infectados de forma crónica, provocó una respuesta de CTL potenciada que causaba una disminución en las cargas víricas. La expresión de PD-1 por los CTL agotados depende de la estimulación específica de antígeno persistente, ya que la pérdida de presentación de epítopo específico durante infección crónica da lugar a restauración funcional y expresión disminuida de PD-1 en los CTL específicos de epítopo (Blattman, et al., Journal of Virology, vol. 83, n.°9, pág. 4386-4394, 2009). La estimulación antigénica persistente durante infección vírica crónica tiene un efecto progresivo sobre la pérdida de función de CTL y un aumento correlacionado en la expresión de PD-1, lo que significa que los CTL más agotados (PD-1hi) son menos susceptibles al rescate funcional por el bloqueo de PD-1 que otros (PD-1int) (Blackburn, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 105, n.° 39, pág. 15016-15021,2008).

De acuerdo con la invención, se proporciona además una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de una infección.

También se proporciona de acuerdo con la invención el uso de una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir, tratamiento o mejora de una infección.

También se proporciona un método de prevención, tratamiento o mejora de una infección, que comprende administrar proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, y un inhibidor de la ruta de PD-1, a un sujeto que necesita dicha prevención, tratamiento o mejora.

En realizaciones particulares, la infección es una infección crónica o persistente. La expresión "infección crónica o persistente" se usa en este documento para hacer referencia a una infección por un patógeno que ha inducido una respuesta CTL clásica en un sujeto infectado, pero la infección no se ha eliminado, provocando la presencia de CLT específicos de patógeno que expresan PD-1 agotados con capacidad proliferativa, producción de citocinas alteradas y pérdida de capacidades citotóxicas.

Los ejemplos de infecciones que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen infecciones víricas, bacterianas, fúngicas o por protozoos, especialmente infecciones víricas, bacterianas, fúngicas o por protozoos crónicas o persistentes.

La infección vírica puede estar causada por, por ejemplo, un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus B (herpesvirus I macacino), un virus BK, un bunyavirus, un chikungunya virus, un cocksackie virus, un coronavirus, un citomegalovirus, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus del ébola, un enterovirus, un virus de Epstein-Barr, un hantavirus, un virus de la hepatitis A, un virus de la hepatitis B, un virus de la hepatitis C, un virus de la hepatitis D, un virus de la hepatitis E, un herpes virus, un virus 1 del herpes simple, un virus 2 del herpes simple, un virus espumoso humano, un virus 3 del herpes humano, un virus 5 del herpes humano, un virus 6 del herpes humano, un virus 7 del herpes humano, un virus de la inmunodeficiencia humana, un papilomavirus humano, un virus plinfotrópico humano, un virus I de la leucemia de linfocitos T humana, un virus II de la leucemia de linfocitos T humana, un virus de la gripe, un virus JC, un JEV, un herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi, un virus Lassa, un virus de la coriomeningitis linfocítica, un virus Marburg, un virus del sarampión, un virus de las paperas, un virus Nipah, un norovirus, un virus Norwalk, un ortorreovirus, un virus de la parainfluenza, un parvovirus, un poliovirus, un virus de la rabia, un reovirus, un virus respiratorio sincitial, rinovirus, un virus de la fiebre del valle del Rift, un rotavirus, virus de la rubéola, un virus de la viruela, un virus de la encefalitis de St Louis, un virus de la viruela mayor, un virus de la viruela menor, un virus de varicela-zoster, un virus del Nilo occidental, un virus de la encefalitis equina oriental o un virus de la fiebre amarilla).

En realizaciones particulares, la infección vírica está causada por un virus de hepatitis (por ejemplo, un virus de la hepatitis B, un virus de la hepatitis C), un lentivirus (por ejemplo, un virus de la inmunodeficiencia humana) o un herpesvirus (por ejemplo, un virus 1 del herpes simple, un virus 2 del herpes simple).

La infección bacteriana puede estar causada por, por ejemplo, Escherichia coli, Clostridium difficile, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonia o Chlamydia trachomatis.

La infección fúngica puede estar causada por, por ejemplo, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Coccidioides, Histoplasma, Pneumocystis o Stachybotrys.

La infección por protozoos puede estar causada por, por ejemplo, Amoebozoa, Excavata, Chromalveolata, Entamoeba, Plasmodium, Giardia, Trypanosoma, Coccidia, Besnoitia, Dicrocoelium o Leishmania.

Se proporciona además de acuerdo con la invención una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad, trastorno o afección que puede prevenirse, tratarse o mejorarse mediante la activación de linfocitos T, en particular por la activación de linfocitos T CD8 positivos.

También se proporciona de acuerdo con la invención el uso de una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir, tratamiento o mejora de una enfermedad, trastorno o afección que puede prevenirse, tratarse o mejorarse mediante la activación de linfocitos T, en particular por la activación de linfocitos T CD8 positivos.

También se proporciona un método de prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad, trastorno o afección que puede prevenirse, tratarse o mejorarse mediante la activación de linfocitos T, en particular por la activación de linfocitos T CD8 positivos, que comprende administrar proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, y un inhibidor de la ruta de PD-1, a un sujeto que necesita dicha prevención, tratamiento o mejora.

En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección que puede prevenirse, tratarse o mejorarse mediante la activación de linfocitos T puede excluir el cáncer.

También se proporciona de acuerdo con la invención una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención para su uso en la potenciación de la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T, en particular respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T CD8 positivos.

La invención también proporciona el uso de una preparación combinada, o composición farmacéutica, de la invención en la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T, en particular respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T CD8 positivos.

Se proporciona además un método de potenciación de una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T, en particular una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T CD8 positivos, que comprende administrar proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, y un inhibidor de la ruta de PD-1, a un sujeto que necesita dicha respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T potenciada.

En algunas realizaciones, la potenciación de la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T, o respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T CD8 positivos, puede excluir la prevención, tratamiento o mejora de cáncer.

La proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1 pueden administrarse secuencialmente al sujeto, es decir, la proteína LAG-3, o derivado de la misma, puede administrarse antes, con o después del inhibidor de la ruta de PD-1.

La proteína LAG-3, o derivado de la misma, y un inhibidor de la ruta de PD-1 pueden administrarse al sujeto en 96 horas, 72 horas, 48 horas, 24 horas o 12 horas, entre sí.

Como alternativa, La proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1 pueden coadministrarse al sujeto, por ejemplo, como una composición que comprende la proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1, o por administración simultánea de dosis diferentes de la proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1.

De acuerdo con algunas realizaciones, se administra una pluralidad de dosis de la proteína LAG-3, o derivado de la misma, y/o una pluralidad de dosis del inhibidor de la ruta de PD-1 al sujeto.

De acuerdo con algunas realizaciones, se administra una dosis de la proteína LAG-3 o derivado de la misma, antes, con o después de cada administración de dos o más dosis del inhibidor de la ruta de PD-1.

Por ejemplo, puede administrarse una dosis de la proteína LAG-3 o derivado de la misma, en 96 horas, 72 horas, 48 horas, 24 horas o 12 horas, de cada administración de dos o más dosis del inhibidor de la ruta de PD-1.

La elección de dosificaciones apropiadas de los componentes usados en tratamiento de combinación de acuerdo con la presente invención puede determinarse y optimizarse por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante observación del paciente, incluyendo la salud general del paciente y la respuesta al tratamiento de combinación. La optimización, por ejemplo, puede ser necesaria si se determina que un paciente no está mostrando el efecto terapéutico deseado o a la inversa, si el paciente está experimentando efectos secundarios indeseables o adversos que son demasiados numerosos o son de gravedad problemática.

Las dosis de los componentes usados en tratamiento de combinación de acuerdo con la invención deben elegirse para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de los componentes en la combinación.

Una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación puede ser una cantidad que provoca una reducción de al menos un parámetro patológico asociado con el cáncer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz del tratamiento de combinación es una cantidad que es eficaz para conseguir una reducción de al menos aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, en el parámetro patológico, en comparación con la reducción esperada en el parámetro asociado con el cáncer sin el tratamiento de combinación. Por ejemplo, el parámetro patológico puede ser crecimiento tumoral o tasa de crecimiento tumoral.

Como alternativa, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación puede ser una cantidad que provoca un aumento en un beneficio clínico asociado con el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación es una cantidad que es eficaz para conseguir un aumento de al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en el beneficio clínico, en comparación con el beneficio clínico esperado sin el tratamiento de combinación. Por ejemplo, el beneficio clínico puede ser tasa de respuesta tumoral, supervivencia sin progresión, supervivencia global o sensibilización aumentada a tratamientos posteriores.

Como alternativa, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación puede ser una cantidad que provoca un cambio de al menos un parámetro beneficioso relacionado con el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación es una cantidad que es eficaz para conseguir un cambio de al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en el parámetro, en comparación con el cambio esperado en el parámetro asociado con el cáncer si el tratamiento de combinación. Por ejemplo, el parámetro puede ser un aumento en la cantidad de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno tumoral en circulación o una reducción en la cantidad de linfocitos T reguladores específicos de antígeno tumoral, o un aumento en la cantidad de linfocitos T activados, en particular linfocitos T CD8+ activados, una reducción en la cantidad de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno agotados o un aumento en la cantidad de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno funcionales (es decir, no agotados) en circulación.

En realizaciones que se refieren al tratamiento de una infección, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación puede ser una cantidad que provoca una reducción de al menos un parámetro patológico asociado con la infección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una cantidad eficaz del tratamiento de combinación es una cantidad que es eficaz para conseguir una reducción de al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en el parámetro patológico, en comparación con la reducción esperada en el parámetro asociada con la infección sin el tratamiento de combinación. Por ejemplo, el parámetro patológico puede ser la carga vírica (por ejemplo, el número de partículas víricas o cantidad de ADN vírico por ml de sangre), la carga bacteriana (por ejemplo, la cantidad de ADN bacteriano por ml de sangre, o el número de colonias bacterianas de un periodo de 1-21 días de crecimiento en diferentes placas de agar).

Los métodos adecuados de medición de la carga vírica y bacteriana son bien conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, se comparan métodos de medición de la carga vírica por ELISA en Goldschmidt et al., (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, julio de 1998, pág. 513-518). Se comparan métodos de medición de la carga vírica usando diferentes ensayos comerciales para la detección de ácido nucleico vírico en Holguin et al., (Eur J Clin Microbiol Infect Dis. abril de 1999; 18(4):256-9) y en Swenson et al., (J. Clin. Microbiol. febrero de 2014; 52(2): 517 523). Un ejemplo de un artículo que describe la medición de la carga bacteriana por PCR en tiempo real es Nadkarni et al., (Microbiology (2002), 148, 257-266). Este artículo cita el manual de bacteriología determinante de Bergey, ahora sustituido por el manual de bacteriología sistémica de Bergey, 2.a Edición. Se describe un ensayo molecular de carga bacteriana por Honeyborne et al., (J. Clin. Microbiol. 2011 49:3905-3911, y J. Clin. Microbiol. agosto de 2014;52(8):3064-7). Puede encontrarse una lista de ensayos de cribado aprobados por la FDA para medir las cargas víricas y bacterianas en el sitio web de la FDA en: www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/licensedProductsBLAs/BloodDonor-Screening/InfectiousDisease/ucm080466.htm.

Como alternativa, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación puede ser una cantidad que provoca un aumento en un beneficio clínico asociado con el tratamiento de la infección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación es una cantidad que es eficaz para conseguir un aumento de al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en el beneficio clínico, en comparación con el beneficio clínico esperado sin el tratamiento de combinación.

Como alternativa, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación puede ser una cantidad que provoca un cambio de al menos un parámetro beneficioso relacionado con el tratamiento de la infección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "cantidad eficaz" del tratamiento de combinación es una cantidad que es eficaz para conseguir un cambio de al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en el parámetro, en comparación con el cambio esperado en el parámetro asociado con el tratamiento sin el tratamiento de combinación. Por ejemplo, el parámetro puede ser un aumento en el número de linfocitos T activados, en particular linfocitos T CD8+ activados, un aumento en el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno funcionales (es decir, no agotados) en circulación o una reducción en el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno agotados, o una reducción en el número de linfocitos T reguladores específicos de antígeno.

De acuerdo con la invención, el tratamiento de combinación puede emplearse para aumentar el efecto terapéutico del inhibidor de la ruta de PD-1, o proteína LAG-3, o derivado de la misma, en comparación con el efecto del inhibidor de la ruta de PD-1, o proteína LAG-3, o derivado de la misma, como una monoterapia, o para disminuir las dosis de los componentes individuales en las combinaciones resultantes evitando al mismo tiempo o reduciendo adicionalmente el riesgo de efectos secundarios indeseados o peligrosos de los componentes individuales.

En una realización, la proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1 se prescriben cada uno a una dosis que está dentro de un intervalo de dosis típicamente prescrito para cada compuesto como monoterapia. Los compuestos pueden prescribirse como dosificaciones diferentes o como una dosificación de combinación. Dichas combinaciones proporcionan eficacia aumentada en comparación con el efecto de cualquier compuesto como monoterapia.

En otra realización, la proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1 se prescriben cada uno a una dosis que está por debajo de una dosis típicamente prescrita para cada componente como monoterapia, pero a dosis que tienen eficacia terapéutica en combinación.

Los componentes pueden prescribirse como dosificaciones separadas como una dosificación de combinación. Las dosificaciones de los componentes en combinación pueden seleccionarse para proporcionar un nivel similar de eficacia terapéutica que la proteína LAG-3, o derivado de la misma, o el inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia, pero con la ventaja de que las dosis inferiores de la proteína LAG-3, o derivado de la misma, y el inhibidor de la ruta de PD-1 reducen el riesgo de efectos secundarios adversos en comparación con las dosificaciones prescritas de cada compuesto como monoterapia.

En otra realización, la dosificación prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1 está dentro de un intervalo de dosis típicamente prescrito para monoterapia, y la proteína LAG-3, o derivado de la misma, se prescribe a una dosificación que está por debajo de una dosis típicamente prescrita para monoterapia.

En una realización adicional, la dosificación prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1 está por debajo de una dosis típicamente prescrita para monoterapia, y la proteína LAG-3, o derivado de la misma, se prescribe a una dosificación que está dentro de un intervalo de dosis típicamente prescrito para monoterapia.

Las dosificaciones preferidas por debajo de la dosis típicamente prescrita para monoterapia son dosis que son hasta un 50 %, o hasta un 25 %, de la dosis típicamente prescrita. Por ejemplo, dosificaciones por debajo de la dosis típicamente prescrita para monoterapia pueden ser dosis que son un 1-50%, 1-25%, 1-10%, 2-50%, 2-25%, 2-10%, de la dosis típicamente prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1 y/o la proteína LAG-3, o derivado de la misma.

Una dosis típicamente prescrita de una proteína LAG-3, o derivado de la misma, para monoterapia en un sujeto humano puede ser una dosis que es un equivalente molar de 0,25-30 mg, 1-30 mg o 6-30 mg del derivado de ^lAG-3, proteína de fusión de LAG-3lg IMP321.

Una dosis típicamente prescrita de un inhibidor de la ruta de PD-1 para monoterapia en un sujeto humano puede ser de 0,1 a 10mg/kg, de 0,1 a 1 mg/kg o de 1 a 10mg/kg. Por ejemplo, una dosis típicamente prescrita de pembrolizumab para monoterapia en un sujeto humano puede ser de 2-10 mg/kg, por ejemplo, 2 mg/kg, una dosis típicamente prescrita de nivolumab para monoterapia en un sujeto humano puede ser de 0,1-10 mg/kg, por ejemplo, 3 mg/kg, y una dosis típicamente prescrita de BMS-936559 para monoterapia en un sujeto humano puede ser de 0,3-10 mg/kg.

En realizaciones particulares de preparaciones combinadas o composiciones de la invención, la dosificación prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1 está por debajo de una dosis típicamente prescrita para monoterapia, por ejemplo, un 1-50%, 1-25%, 1-20%, 1-10%, 2-50%, 2-25%, 2-20%, 2-10%, 0,1-50%, 0,1-25%, 0,1-20%, 0,1 10 %, <20 %, <10 %, 0,1-<20 %, 0,1-<10 %, 0,01-<20 % o 0,01-<10 % de la dosis típicamente prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1.

Se exponen ejemplos de dosis adecuadas del inhibidor de la ruta de PD-1 y proteína LAG-3, o derivado de la misma, de acuerdo con la invención, en la tabla 1.2 a continuación:

Tabla 1.2: Ejemplos de dosis del inhibidor de la ruta de PD-1 y proteína LAG-3 o derivado de la misma, de acuerdo n r liz i n r r i n m in m i i n l inv n i n

El derivado de LAG-3 puede ser cualquiera de los derivados de LAG-3 descritos anteriormente, o mostrados en la figura 7. En realizaciones particulares, el derivado de LAG-3 es IMP321.

Cuando se administra en dosificaciones diferentes, la proteína LAG-3 o derivado de la misma y el inhibidor de la ruta de PD-1 pueden administrarse de forma sustancialmente simultánea (por ejemplo, en aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente 1 minuto entre sí) o separados en el tiempo en aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 72 horas o aproximadamente 96 horas o más.

El experto en la materia será capaz de determinar y optimizar, un ciclo temporal adecuado para la administración secuencial, dependiendo de la combinación particular de la proteína LAG-3 o derivado de la misma y el inhibidor de la ruta de PD-1. El ciclo temporal se selecciona preferiblemente de modo que haya al menos un efecto beneficioso, por ejemplo, una potenciación del efecto de la proteína LAG-3 o derivado de la misma o el inhibidor de la ruta de PD-1 o una potenciación mutua del efecto de los componentes en combinación, por ejemplo, un efecto más que aditivo, efectos ventajosos adicionales, menos efectos secundarios, menos toxicidad o un efecto terapéutico combinado en comparación con una dosificación no eficaz de uno o ambos componentes de la combinación, y muy preferiblemente sinergia de los componentes de la combinación.

Se apreciará que el ciclo temporal óptimo dependerá de factores tales como el tiempo que tarda la concentración en plasma máxima del compuesto en alcanzarse después de la administración, y la semivida de eliminación de cada compuesto. Preferiblemente, la diferencia temporal es menor que la semivida del primer componente a administrar. El experto en la materia será capaz de determinar la cronología apropiada para la administración. En determinadas realizaciones, el inhibidor de la ruta de PD-1 puede administrase por la mañana, y la proteína LAG-3 o derivado de la misma, puede administrarse al menos una vez después en el día. En otras realizaciones, el inhibidor de la ruta de PD-1 y la proteína LAG-3 o derivado de la misma, pueden administrarse sustancialmente al mismo tiempo.

En algunas realizaciones, el inhibidor de la ruta de PD-1 puede administrarse al sujeto, por ejemplo, mediante un facultativo médico y al sujeto se le puede proporcionar una dosis de la proteína LAG-3 o derivado de la misma, por ejemplo, en una jeringa prellenada, a administrarse posteriormente (por ejemplo, después el mismo día o el siguiente día).

El inhibidor de la ruta de PD-1 y la proteína LAG-3 o derivado de la misma, pueden administrarse diariamente, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas, mensualmente, cada 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años o más.

El sujeto puede recibir dosis del inhibidor de la ruta de PD-1 y proteína LAG-3 o derivado de la misma, durante un periodo de semanas, meses o años. Por ejemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años o más.

El sujeto puede ser un sujeto mamífero, adecuadamente un sujeto humano.

Los cánceres que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen cánceres en que las células tumorales del cáncer expresan PD-L1 y/o PD-L2 (es decir, cánceres positivo para PD-L1- y/o PD-L2).

La expresión de PD-L1 se ha detectado en carcinoma broncopulmonar, de ovario, renal y de colon y en melanoma maligno, pero no en tejidos normales, incluyendo el pulmón, el útero, el riñón, el colon o la piel (Benson et al., Blood 116, 2286-2294 (2010); Blank et al., Int. J. Cancer 119, 317-327 (2006); Dong, et al., Nat. Med. 8, 793-800 (2002)). La expresión de PD-L1 por células tumorales está asociada con un peor pronóstico en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer esofágico, carcinoma hepatocelular, melanoma maligno, cáncer de ovario, cáncer pancreático, carcinoma de células renales y cáncer urotelial (Zou yChen, Nat. Rev. Immunol. 8, 467-477 (2008)).

También hay evidencias de que los tumores humanos pueden expresar PD-L2 (Rozali, et al., Clin. Dev. Immunol.

2012, 656340 (2012); Karim, et al., Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009)). Los fibroblastos asociados a cáncer broncopulmonar no microcítico (NSCLC) expresan de forma constitutiva tanto PD-L1 como PD-L2. También se ha descrito la supervivencia disminuida en pacientes con cáncer esofágico, de ovario o hepatocelular positivo para PD-L2 (frente a negativo para PD-L2).

Los cánceres que pueden tratarse de acuerdo con la invención también incluyen cánceres en que los linfocitos de infiltración tumoral (TIL), especialmente TIL CD8+, expresan PD-1 o cánceres en que los TIL expresan niveles mayores de PD-1 que los linfocitos en circulación.

En pacientes tanto de NSCLC como de melanoma, se observaron niveles mayores de PD-1 en los TIL que en los linfocitos en circulación (Blank, et al., Int. J. Cancer 119, 317-327 (2006); Zhang et al., Cell. Mol. Immunol. 7, 389-395 (2010)). En la sangre periférica de pacientes con melanoma vacunados, tanto los linfocitos citotóxicos específicos de antígeno de melanoma como los Treg expresaban PD-1 (Wan, et al., Int. Immunol. 21, 1065-1077 (2009)). También había una correlación negativa entre la expresión de PD-L2 en tumor y la presencia de TIL CD8+ en cáncer esofágico (Rozali, et al., Clin. Dev. Immunol. 2012, 656340 (2012)).

Los TIL CD8+ aislados de NSCLC tenían expresión aumentada de PD-1 y respuestas funcionales alteradas (proliferación in vitro y producción de citocinas inflamatorias) en comparación con linfocito T CD8+ en circulación o linfocitos T CD8+ de voluntarios sanos. La adición de anticuerpo anti-PD-L1 mejoraba significativamente la capacidad de los TIL CD8+ de proliferar y producir interferón-Y in vitro (Zhang, et al., Cell. Mol. Immunol. 7, 389-395 (2010)). En un estudio similar usando cultivos de células dendríticas derivadas de tumor y TIL de pacientes con cáncer de ovario, la adición de anticuerpo anti-PD-L1 aumentaba significativamente la producción de interferón-Y por los TIL en respuesta a antígenos tumorales. Cuando estos TIL se transferían a ratones inmunodeficientes que tienen los tumores de ovario, se observaba crecimiento del tumor reducido en comparación con el de ratones en grupos de control (Curiel, et al., Nat. Med. 9, 562-567 (2003)).

En particular, los cánceres que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen cáncer de piel, broncopulmonar (especialmente NSCLC escamoso o no escamoso), de ovario, renal, de colon, colorrectal, de mama, gástrico, esofágico, pancreático, de vejiga, urotelial y hepático.

Otros ejemplos de cánceres que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata resistente a hormonas), cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma escamocelular de cabeza y cuello), cáncer cervicouterino, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma (por ejemplo, linfoma de linfocitos B), cáncer de glándula suprarrenal, cáncer asociado a SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumor astrocítico, cáncer de huesos, cáncer cerebral y médula espinal, tumor cerebral metastásico, tumor del cuerpo carotídeo, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de células renales cromófobo, carcinoma de células claras, histiocitoma fibroso benigno cutáneo, tumor de células redondas pequeñas desmoplásico, ependimoma, tumor de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cáncer de vesícula biliar o conducto biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumor de células germinales, neoplasia hemática, carcinoma hepatocelular, tumor de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer renal, lipoma/tumor lipomatoso benigno, liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, meduloblastoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome de mielodisplasia, neuroblastoma, tumor neuroendocrino, carcinoma de tiroides papilar, tumor paratiroideo, cáncer pediátrico, tumor de la vaina de los nervios periféricos, feocromocitoma, tumor de pituitaria, cáncer de próstata, melanoma de la úvea posterior, trastorno hemático infrecuente, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdomiosarcoma, sarcoma, sarcoma de tejido blando, cáncer escamocelular, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastático de tiroides o cáncer uterino.

En general, los componentes de una combinación de la invención, o una composición de la invención, pueden administrarse por medios conocidos, en cualquier formulación adecuada, por cualquier vía adecuada. En algunas realizaciones, la proteína LAG-3 o derivado de la misma, se administra por vía parenteral (incluyendo mediante inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular). En algunas realizaciones, el inhibidor de la ruta de PD-1 se administra por vía intravenosa. En realizaciones particulares, la proteína LAG-3 o derivado de la misma, se administra por vía subcutánea y el inhibidor de la ruta de PD-1 se administra por vía intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas y formas galénicas adecuadas pueden prepararse usando métodos convencionales conocidos para los expertos en el campo de la formulación farmacéutica y se describen en los textos y la bibliografía pertinentes, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Easton, Pa.: Mack Publishing Co., 1995).

Es especialmente ventajoso formular combinaciones o composiciones de la invención en forma galénica unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La expresión "formas galénicas unitarias", como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los individuos a tratar. Es decir, las composiciones se formulan en unidades de dosificación diferenciadas que contienen cada una cantidad "de dosificación unitaria" predeterminada de un agente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones de formas galénicas unitarias de la invención dependen de las características únicas del agente activo a suministrar. Las dosificaciones pueden determinarse además por referencia a la dosis habitual y la manera de administración de los ingredientes. Debe apreciarse que, en algunos casos, dos o más unidades de dosificación individuales en combinación proporcionan una cantidad terapéuticamente eficaz del agente activo, por ejemplo, dos comprimidos o cápsulas tomadas juntas pueden proporcionar una dosificación terapéuticamente eficaz, de modo que la dosificación unitaria en cada comprimido o cápsula es aproximadamente un 50 % de la cantidad terapéuticamente eficaz.

Las preparaciones de acuerdo con la invención para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas y no acuosas estériles. Las soluciones acuosas inyectables contienen el agente activo en forma soluble en agua. Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos incluyen aceites grasos, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, ésteres de ácido graso sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, alcoholes de bajo peso molecular tales como propilenglicol, polímeros hidrófilos sintéticos tales como polietilenglicol, liposomas y similares. Las formulaciones parenterales también pueden contener adyuvantes tales como solubilizantes, conservantes, agentes humectantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes, y las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y dextrano. Las formulaciones inyectables pueden volverse estériles mediante la incorporación de un agente de esterilización, filtración a través de un filtro de retención de bacterias, radiación o calor. También pueden fabricarse usando un medio inyectable estéril. El agente activo también puede estar en forma seca, por ejemplo, liofilizada, que puede rehidratarse con un vehículo adecuado inmediatamente antes de la administración mediante inyección.

Además de las formulaciones descritas previamente, el agente activo puede formularse como una preparación de depósito para liberación controlada del agente activo, preferiblemente liberación sostenida durante un periodo de tiempo prolongado. Estas formas galénicas de liberación sostenida se administran en general por implante (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular o mediante inyección intramuscular).

Las preparaciones combinadas de la invención pueden envasarse con instrucciones para la administración de los componentes de la combinación. Las instrucciones pueden estar grabadas en un medio de grabación o sustrato adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plástico. Las instrucciones pueden estar presentes como un prospecto, en la etiqueta del recipiente o los componentes del mismo (es decir, asociado con el envase o subenvase). En otras realizaciones, las instrucciones están presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, por ejemplo, CD-ROM, disquete. Algunos o todos los componentes de la preparación combinada pueden envasarse en envases adecuados para mantener la esterilidad.

Las realizaciones de la invención se describen a continuación, a modo de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos adjuntos en que:

la figura 1 representa la función de la ruta de PD-1 en la evasión inmunitaria tumoral y el mecanismo de acción del bloqueo de la ruta de PD-1 (APC, célula presentadora a antígeno; IFN-y, interferón-Y; MHC, complejo principal de histocompatibilidad; PD-1, muerte programada-1; PD-L1, ligando 1 de PD; TCR, receptor de linfocito T);

la figura 2 muestra el efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de IFN-y inducida por estimulación antigénica;

la figura 3 muestra el efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de IFN-^yinducida por estimulación antigénica;

la figura 4 muestra el efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de IFN-y inducida por estimulación antigénica;

la figura 5 muestra el efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de TNF-a, IL-6, RANTES inducida por estimulación antigénica;

la figura 6 muestra el efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la expresión de marcadores de activación inducida por estimulación antigénica. Obsérvese que la condición para la columna final en cada gráfico de la figura 6 es "1000 ng/ml de anti-PD1 30 ng/ml de LAG-3Ig", en lugar de "30 ng/ml de anti-PD1 1000 ng/ml de LAG-3Ig" como se indica en la figura;

la figura 7 muestra una ilustración de derivados de proteína LAG-3 fusionados a la secuencia de Fc de inmunoglobulina (IgFc);

la figura 8 muestra la unión de derivados de LAG-3 a células positivas para MHC de clase II;

la figura 9 la inhibición de la unión de un derivado de LAG-3 a células positivas para MHC de clase II por anticuerpos que bloquean la unión de LAG-3 a moléculas MHC de clase II;

la figura 10 muestra la activación de células THP-1 por derivados de LAG-3, determinada por la secreción de CCL4;

la figura 11 muestra la activación de células THP-1 por derivados de LAG-3, determinada por la secreción de TNF-a;

la figura 12 la inhibición de la activación de monocitos inducida por derivado LAG por anticuerpos que bloquean la unión de LAG-3 a moléculas MHC de clase II;

la figura 13 muestra la activación de células presentadoras de antígeno (APC) por derivaos de LAG-3;

la figura 14 muestra la activación de linfocito T CD8 positivos por derivados de LAG-3;

la figura 15 muestra la secuencia de amino ácidos de la proteína LAG-3 humana madura. Las cuatro dominios de la superfamilia de Ig extracelulares están en los restos de aminoácido: 1-149 (D1); 150-239 (D2); 240-330 (D3); y 331-412 (D4). La secuencia de aminoácidos de la estructura del bucle adicional del dominio D1 de la proteína LAG-3 humana se muestra subrayada en negrita;

la figura 16 muestra el efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD-L1 sobre la expresión de marcadores de activación inducida por estimulación antigénica;

la figura 17 muestra el efecto de LAG-3Ig y diferentes anticuerpos anti-PD-1 (Ab1 y Ab2) sobre la secreción de IFN-y y TNF-a inducida por estimulación antigénica;

la figura 18 muestra el efecto de LAG-3Ig y diferentes anticuerpos anti-PD-L1 (Ab3, Ab4, Ab5 y Ab6) sobre la secreción de IFN-^yy TNF-a inducida por estimulación antigénica; y

la figura 19 muestra el efecto de diferentes derivados de LAG-3 (IMP321, IMP321 R75A, LAG3 D1D4-conector2-Ig) y anticuerpo anti-PD-1 sobre la secreción de IFN-y inducida por estimulación antigénica.

En los ejemplos, las tablas y las figuras a continuación, la expresión "anticuerpo anti-PD1" se usa indistintamente con "anticuerpo anti-PD-1", y la expresión "anticuerpo anti-PDL1" se usa indistintamente con "anticuerpo anti-PD-L1".

Ejemplo 1

Efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de IFN-v inducida por estimulación antigénica Este ejemplo demuestra el efecto de un derivado soluble de LAG-3 (LAG-3Ig, también conocido como IMP321) y un anticuerpo anti-PD1, sobre la activación de linfocitos T in vitro usando un ensayo de secreción de IFN-y. las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) incluye linfocitos (linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK), monocitos y células dendríticas. IFN-y se secreta de forma predominante por linfocitos T de memoria y efectores CD4+ y CD8+ activados y por linfocitos NK tras la activación. Después de volver a estimular con antígeno específico in vitro, se induce la secreción de IFN-y.

Se incubaron PBMC de tres donadores sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106 M/ml en Complete Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suero bovino fetal (FBS) al 10 %) con una combinación de péptidos que cubren la secuencia de pp65 de citomegalovirus (CMV) humano por triplicado (pp65 de CMV PepTivator® de Miltenyi Biotec, n.° de Cat. 130-093-435), en presencia o ausencia de 30 ng/ml de LAG-3Ig y concentraciones indicadas de mAb anti-PD1 (clone EH12.1, BD biosciences, n.° de Cat. 562138). La combinación de péptidos consistía principalmente en secuencias de 15 monómeros, con un solapamiento de 11 aminoácidos, que cubre la secuencia completa de la proteína pp65 de la cepa de CMV humano AD169 (n.° de acceso a Swiss-Prot P06725).

La respuesta de linfocitos T se evaluó midiendo la concentración de IFN-y en sobrenadantes celulares dos días después de la estimulación usando matriz de microesferas citométricas BD.

Las concentraciones de IFN-y presentes en los triplicados combinados para cada donador se registraron en la tabla 2 a continuación. La figura 2 muestra las concentraciones de IFN-y representadas frente a la concentración de mAb anti-PD1 para cada donador.

T l 2: r i n IFN- in i r ní n n r n i ni r ni-PD1 n in LA - I

Los resultados muestran que la secreción de IFN-y se aumentaba drásticamente cuando las PBMC se incubaban en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg y concentraciones menores de anticuerpo anti-PD1, en comparación con anticuerpo anti-PD1 en solitario. Por ejemplo, para cada donador, el aumento en la concentración de IFN-y por encima del nivel de fondo (es decir, la concentración IFN-^yen presencia de anti-PD1 y LAG-3lg) en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 fue mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg en solitario y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario, como se muestra en la tabla 3 a continuación. El efecto de la combinación de LAG-3lg y anticuerpo anti-PD1 para cada donador fue, por lo tanto, sinérgico.

Los resultados también muestran que la secreción IFN-^yinducida por una combinación de LAG-3lg y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD1 (30 ng/ml) era equivalente a la secreción de IFN-y inducida por una concentración mucho mayor (300 ng/ml-1000 ng/ml, 10 a más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD1 en solitario. Para los donadores n.° 1 y 3, se secretaron concentraciones similares de IFN-^ycuando las PBMC se incubaban con 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 y 30 ng/ml de LAG-3lg en comparación con 1000 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario. Para el donador n.° 2, se secretaron concentraciones similares de IFN-^ycuando las PBMC se incubaban con 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 y 30 ng/ml de LAG-3lg en comparación con 300 ng/ml y 1000 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario.

Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T in vitro (medida por secreción de IFN-y) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD1 se aumentaba de forma sinérgica (en aproximadamente ~7,5, 1,5 y 2 veces para los donadores n.° 1, 2 y 3, respectivamente) mediante un derivado de LAG-3 soluble. También se concluyó que se obtiene una respuesta de linfocitos T in vitro equivalente usando aproximadamente 10-30 veces menos de anticuerpo anti-PD1 si este se combina con un derivado de LAG-3 soluble.

Ejemplo 2

Efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de IFN-v inducida por estimulación antigénica Este ejemplo demuestra el efecto de un derivado soluble de LAG-3 (LAG-3Ig) y un anticuerpo anti-PD1, sobre la activación de linfocitos T in vitro usando un ensayo de secreción de IFN-y.

Se incubaron PBMC de 10 donadores sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106 M/ml en RPMI completo FBS al 10%) con una combinación de péptidos que cubren la secuencia de pp65 de CMV por triplicado (pp65 de CMV PepTivator® de Miltenyi Biotec, n.° de Cat. 130-093-435), sin ningún aditivo (medio), con 30 ng/ml o 1000 ng/ml de mAb anti-PD1 (clon EH12.1, BD biosciences n.° de Cat. 562138), con 30 ng/ml de LAG-3Ig o con 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 mg/ml de mAb anti-PD1.

La respuesta de linfocitos T se evaluó midiendo la concentración de IFN-^yen sobrenadantes celulares dos días después de la estimulación usando matriz de microesferas citométricas BD.

Las concentraciones de IFN-y en los triplicados combinados para cada condición de estimulación, para cada donador, se registran en la tabla 4 a continuación. La media de los resultaos obtenidos para los 10 donadores se muestra en la tabla 5. Los resultados para cada donador también se representan en las figuras 3 y 4. Las diferencias estadísticas (*p<0,05) se muestran en negro en la figura 3.

T l 4: r i n IFN- in i ^ r ní n n r n i ni r ni-PD1 n in LA - I

T l : M i n nr i n IFN- r n i i n im l i n if r n

Los resultados muestran que la secreción de IFN-^yera mucho mayor para cada donador cuando las PBMC se incubaban en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1, en comparación con 30 ng/ml de LAG-3lg o 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario. La tabla 5 muestra que el aumento en la concentración media de IFN-^ypor encima de la media del nivel de fondo (es decir, la concentración media de IFN-^yen presencia de anti-PD1 y LAG-3lg) en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 era mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg en solitario y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario (es decir, 765 > 239 172). El efecto de la combinación de LAG-3lg y anticuerpo anti-PD1 fue, por lo tanto, sinérgico.

Los resultados también muestran que la secreción de IFN-y inducida por una combinación de LAG-3Ig y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD1 (30 ng/ml) era equivalente a la secreción de IFN-^yinducida por una concentración mucho mayor (1000 ng/ml, más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD1 en solitario. Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T in vitro (medida por secreción de IFN-^y) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD1 se aumentaba de forma sinérgica (en aproximadamente 2 veces de promedio) mediante un derivado de LAG-3 soluble. También se concluyó que se obtiene una respuesta de linfocitos T in vitro equivalente usando más de 30 veces menos de anticuerpo anti-PD1 si este se combina con un derivado de LAG-3 soluble.

Ejemplo 3

Efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la secreción de TNF-a, IL-6, RANTES inducida por estimulación antigénica

Este ejemplo demuestra el efecto de un derivado soluble de LAG-3 (LAG-3Ig) y un anticuerpo anti-PD1, sobre la activación de linfocitos T in vitro midiendo la secreción de TNF-a, IL-6 y RANTES (CCL5).

La respuesta de linfocitos T se evaluó midiendo la concentración de TNF-a, IL-6 y RANTES (CCL5) en sobrenadantes celulares 2 días después de la estimulación usando matriz de microesferas citométricas BD.

La concentración de citocinas/quimiocinas en los triplicados combinados para cada condición de estimulación, para cada donador, se registran en las tablas 6-8 a continuación. La media de los resultaos obtenidos para los 10 donadores se muestra en la tabla 9, y el aumento de las medias por encima de la media del fondo se muestra en la tala 10. Los resultados para cada donador también se representan en la figura 5, y las diferencias estadísticas (*p<0,05) se muestran en negro.

T l 7: r i n IL- in i r ní n n r n i ni r ni-PD1 n in LA - I

Tabla 8: Secreción de RANTES (CCL5) inducida por antígeno en presencia de anticuerpo anti-PD1 con y sin LAG-

3I

T l : n nr i n m i TNF- IL- RANTE L r n i i n im l i n if r n

Tabla 10: Aumento en la concentración media de TNF-a, IL-6 y RANTES (CCL5) por encima de la media del fondo r n i i n ^ im l i n if r n

Los resultados muestran que la secreción de IL-6 era mucho mayor para cada donador cuando las PBMC se incubaban en presencia de 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1, en comparación con 30 ng/ml de LAG-3Ig o 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario. La tabla 10 muestra que el aumento en la concentración media de IL-6 por encima de la media del nivel de fondo (es decir, la concentración media de IL-6 en ausencia de anti-PD1 y LAG-3Ig) en presencia de 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 era mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia de 30 ng/ml de LAG-3Ig en solitario y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD1 en solitario (es decir, 8594 > 732 2964). El efecto de la combinación de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 fue, por lo tanto, sinérgico.

Los resultados también muestran que la secreción de IL-6 inducida por una combinación de LAG-3Ig y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD1 (30 ng/ml) era equivalente a la secreción de IL-6 inducida por una concentración mucho mayor (1000 ng/ml), más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD1 en solitario. Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T in vitro (medida por secreción de IL-6) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD1 está sinérgicamente aumentada (en más de 2,3 veces de promedio) por un derivado de ^lAG-3 soluble.

Ejemplo 4

Efecto de LAG-3Ig y anticuerpo anti-PD1 sobre la expresión de marcadores de activación inducida por estimulación antigénica

Este ejemplo demuestra el efecto de un derivado soluble de LAG-3 (LAG-3Ig) y un anticuerpo anti-PD1, sobre la expresión de marcadores de activación de linfocitos T.

Se incubaron PBMC de 7 donadores sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106 M/ml en RPMI completo FBS al 10 %) con una combinación de péptidos que cubren la secuencia de pp65 de CMV por triplicado (pp65 de CMV PepTivator® de Miltenyi Biotec, n.° de Cat.130-093-435), sin ningún aditivo (medio), con 30 ng/ml o 1000 ng/ml de mAb anti-PD1 (clon EH12.1, BD biosciences n.° de Cat.562138), con 30 ng/ml de LAG-3Ig o con 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 o 1000 mg/ml de mAb anti-PD1.

La repuesta de linfocitos T se evaluó fenotipando las células para la expresión de tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 y CD25) dos días después de estimulación por citometría de flujo.

El porcentaje de células CD8 que expresan LAG-3, CD69 o CD25, al menos uno de los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25), o los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 y CD25), en los triplicados combinados, para cada condición de estimulación, se registra en las tablas 11-15 a continuación. La media de los resultados obtenidos para los 7 donadores se muestran en la tabla 16, y el aumento de las medias por encima de la media del fondo se muestra en la tabla 17. Los resultados para cada donador también se representan en la figura 6, y las diferencias estadísticas (*p<0,05) se muestran en negro.

T l 11: Pr n ll D xr n LA - r niin im l in if rn

T l 12: Pr n ll D xr n D r nii n iml i n if rn

T l 1: Pr n ll D xr n D2 r nii n iml in if rn

Tabla 14: Porcentaje de células CD8 que expresan uno cualquiera de los tres marcadores de activación (LAG-3.

D D2 r niin iml in if r n

Tabla 15: Porcentaje de células CD8 que expresan los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25) para nii n iml i n if rn

Tabla 16: Porcentaje medio de células CD8 que expresan LAG-3, CD69, CD25, uno cualquiera de los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25), o los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25) para nii n iml i n if rn

Tabla 17: Aumento en el porcentaje medio de células CD8 que expresan LAG-3, CD69, CD25, uno cualquiera de los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25), o los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 y CD25) r n im l m i l f n r n i i n im l i n if r n

Los resultados muestran que la estimulación con 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 y 30 ng/ml de LAG-3Ig, o 1000 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 y 30 ng/ml de LAG-3Ig, provocaba un aumento sinérgico en el porcentaje medio de células CD8 que expresan alguno o los tres marcadores de activación.

Los resultados también muestran que la estimulación con 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 y 30 ng/ml de LAG-3Ig provocaba un porcentaje medio significativamente mayor de células CD8 que expresan alguno o los tres marcadores de activación que la estimulación con 1000 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1.

Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T CD8+ in vitro (medida mediante la expresión de marcadores de activación de linfocitos T) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD1 se aumenta sinérgicamente mediante un derivado de LAG-3 soluble. También se concluyó que se obtiene una respuesta de linfocitos T CD8+ in vitro drásticamente mejorada usando más de 30 veces menos anticuerpo anti-PD1 si este se combina con un derivado de LAG-3 soluble.

Como los inhibidores de la ruta de PD-1 (tales como Keytruda y Opdivo) son conocidos por activar los linfocitos T CD8+, y esta activación está asociada con efectos antineoplásicos, los resultados presentados en los ejemplos anteriores proporcionan evidencias de que pueden obtenerse efectos antineoplásicos mejorados mediante la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II. Como alternativa, pueden conseguirse efectos antineoplásicos similares mediante la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3 (o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II) a dosis inferiores (por ejemplo, dosis 10-30 veces inferiores) del inhibidor de la ruta de PD-1 en comparación con la administración del inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia. Se espera que dicha coadministración reduzca los efectos secundarios causados por el inhibidor de la ruta de PD-1.

Asimismo, como también se sabe que la activación de los linfocitos T CD8+ es eficaz contra infección, incluyendo infección crónica o persistente, los resultados presentados en los ejemplos anteriores también proporcionan evidencias de que la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, puede usarse para prevenir, tratar o mejorar una infección de forma más eficaz. Como alternativa, pueden conseguirse efectos similares contra la infección mediante la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3 (o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II) a dosis inferiores (por ejemplo, dosis de 30 a 100 veces inferiores) del inhibidor de la ruta de PD-1 en comparación con la administración del inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia. Se espera que dicha coadministración reduzca los efectos secundarios causados por el inhibidor de la ruta de PD-1. Ejemplo 5

Unión de derivados de LAG-3 a células positivas a MHC de clase II

Se ensayaron varios derivados de LAG-3 para su capacidad de unirse a células positivas a MHC de clase II:

i) dominios D1-D4 de LAG-3 unidos a la secuencia Fc de inmunoglobulina (Fc de Ig) mediante un primer conector (LAG-3 D1D4-conector1-Ig, sLAG-3 D1D4-Ig, LAG-3Ig o IMP321);

ii) dominios D1-D4 de LAG-3, unidos a la secuencia Fc de Ig mediante un segundo conector (LAG-3 D1D4-conector2-Ig o sLAG-3 D1D4-conectorB-Ig);

iii) dominios D1 y D2 de LAG-3, unidos a la secuencia Fc de Ig mediante el segundo conector (LAG-3 D1D2-conector2-Ig o sLAG-3 D1D2-conectorB-Ig); y

iv) dominios D1-D4 de LAG-3 unidos a la secuencia Fc de Ig mediante el primer conector, pero con una mutación en el sitio de unión a MHC de clase II del dominio D1 de LAG-3, en la posición R75 (R75A), que potencia la unión a moléculas MHC de clase II en tres veces o más (Huard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94:5744) (IMP321 R75A).

Los derivados se ilustran en la figura 7.

Se incubaron células Raji MHC de clase II+ durante 45 minutos a 4°C con diversas concentraciones de los derivados de LAG-3, o con un anticuerpo IgG1 humano (hlgGI) como control negativo. Las moléculas de LAG-3 unidas a la superficie celular se revelaron con un Ig de cabra antirratón conjugado a FITC (Coulter). Las células se analizaron por citometría de flujo. Los resultados, expresados como unidades de intensidad de fluorescencia, se muestran en la figura 8. Los resultados muestran que todos los derivados de LAG-3 se unían a células positivas a MHC de clase II.

Ejemplo 6

Inhibición de la unión del derivado de LAG-3 IMP321 a células positivas a MHC de clase II mediante anticuerpos que bloquean la unión de LAG-3 a moléculas MHC de clase II

17B4 y 11E3 son anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 que se sabe que bloquean la unión de LAG-3 a moléculas MHC de clase II. La unión de un conjugado IMP321 (LAG-3Ig-Alexa 488) a linfocitos B positivos a MHC de clase II (células Raji) se determinó después de preincubación del conjugado (4 pg/ml a 4 °C) con anticuerpo de bloqueo 17B4 o 11E3, o con un anticuerpo monoclonal de control negativo de isotipo coincidente (mlgGI). El análisis de la fluorescencia unida a células se realizó usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los resultados se muestran en la Figura 9.

Los resultados muestran que la unión de IMP321 a células Raji se inhibía por anticuerpo monoclonal específico de LAG-3 que bloquea la unión de LAG-3 a moléculas MHC de clase II.

Ejemplo 7

Activación de monocitos mediante derivados de LAG-3

Se incubaron células THP-1 durante 4 horas a 4 °C con los derivados de LAG-3 ilustrados en la figura 5, o con IgG1 humana como control negativo. La cantidad de secreción mediante las células THP-1 de la quimiocina CCL4, y la citocina factor de necrosis tumoral a, TNF-a, se determinó y se usó como medida de la activación de monocitos. Se cuantificó la secreción de CCL4 y TNF-a en los sobrenadantes celulares usando una matriz de microesferas citométricas. Los resultados de las determinaciones de CCL4 se muestran en la figura 10, y los resultados de las determinaciones de TNF-a se muestran en la figura 11.

Los resultados muestran que los derivados de LAG-3 pueden todos activar células monocíticas THP-1.

Ejemplo 8

Inhibición de activación de monocitos inducida por IMP321 por anticuerpos que bloquean la unión de LAG-3 a moléculas MHC de clase II

IMP321 (20 ng/ml) se preincubó con anticuerpo 17B4 o 11E3 (5 minutos a 37 °C), antes de incubación de la mezcla con células THP-1 durante 4 horas a 37 °C. La cantidad de secreción de CCL4 por las células THP-1 se usó para determinar el nivel de activación de monocitos. Los resultados de dos experimentos se muestran en la figura 12.

Los resultados demuestran que la activación de monocitos inducida por IMP321 se inhibe por los mAb anti-LAG-3 de bloque 17B4 y 11E3. Esto indica que la capacidad de IMP321 de activar monocitos depende de la unión de IMP321 a moléculas MHC de clase II.

Ejemplo 9

Activación de células presentadoras de antígeno (APC) primarias mediante derivados de LAG-3

Se incubaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas durante 4 horas a 37 °C con los derivados de LAG-3 ilustrados en la figura 7, o con IgG1 humana como control negativo, en presencia de brefeldina, un inhibidor de secreción. La respuesta de citocinas de las APC presentes en las PBMC se determinó mediante tinción intracelular de CCL4, una quimiocina que se sabe que favorece la respuesta Th1 y CD8 positiva, y TNF-a, una citocina multifuncional que inhibe directamente la tumorigénesis. Los resultados se analizaron por citometría. Los resultados, representados por el porcentaje de células que expresan CCL4 y/o TNF-a en células positivas a MHC de clase II, se muestran en la figura 13.

Los resultados muestran que todos los derivados de LAG-3 ensayados inducían la producción de CCL4 y TNF-a en APC primarias.

Ejemplo 10

Activación de linfocitos T CD8+ por derivados de LAG-3

Se incubaron PBMC humanas durante 18 horas con los derivados de LAG-3 ilustrados en la figura 7, o con IgG1 humana como control negativo. Estaba presente brefeldina durante las últimas 16 horas de la incubación. Las respuesta de citocinas de linfocitos T CD8+después de exposición de 18 horas a derivas de LAG-3 estuvo seguida de tinción intracelular de CCL4, IFN-y y TNF-a y se analizó por citometría. Los resultados, representados como el porcentaje de células que expresan CCL4, IFN-y y/o TNF-a en linfocitos T CD3+/CD8+, se muestran en la figura 14. Los resultados muestran que todos los derivados de LAG-3 ensayados inducían activación de linfocitos T CD8 positivos citotóxicos de tipo 1 (linfocitos Tc1). Se concluyó que, mediante la unión a moléculas MHC de clase II expresadas por las APC, los derivados de LAG-3 inducían la activación de linfocitos Tc1. La activación de linfocitos Tc1 forma la respuesta inmunitaria antitumoral principal.

Ejemplo 11

Efecto de LAG-3Ig y anti-PD-L1 sobre la expresión de marcadores de activación inducida por estimulación antigénica

Este ejemplo demuestra el efecto de un derivado soluble de LAG-3 (LAG-3Ig) y un anticuerpo anti-PD-L1, sobre la expresión de marcadores de activación de linfocitos T.

Se incubaron PBMC de 12 donadores sanos (0,2 x 106 células/pocillo, a 1 M/ml en RPMI completo FBS al 10 %) con una combinación de péptidos que cubre la secuencia de pp35 de CMV por triplicado, sin ningún aditivo (medio), con 30 ng/ml o 3000 ng/ml de anticuerpo humanizado anti-PD-L1 (BPS Bioscience, n.° de catálogo 71213), con 30 ng/ml de LAG-3Ig o con 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-L1.

La repuesta de linfocitos T se evaluó fenotipando las células para la expresión de tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 y CD25) tres días después de la estimulación por citometría de flujo.

El porcentaje de células CD8 que expresan LAG-3, CD69 o CD25, al menos uno de los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25), o los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 y CD25), en los triplicados combinados, para cada condición de estimulación, se registran en las tablas 18-22 a continuación. Las medias de los resultados obtenidos para los 12 donadores se muestran en la tabla 23, y el aumento de las medias por encima de la media del fondo se muestra en la tabla 24. Los resultados para cada donador también se representan en la figura 16, y las diferencias estadísticas (*p<0,05) se muestran en negro.

Tabla 23: Porcentaje medio de células CD8 que expresan LAG-3, CD69, CD25, uno cualquiera de los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25), o los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25) para n i i n im l i n if r n

Tabla 24: Aumento en el porcentaje medio de células CD8 que expresan LAG-3, CD69, CD25, uno cualquiera de los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 o CD25), o los tres marcadores de activación (LAG-3, CD69 y CD25) r n im l m i l f n r n i i n im l i n if r n

Los resultados muestran que la estimulación con 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-L1 y 30 ng/ml de LAG-3Ig, provocaba un aumento sinérgico en el porcentaje medio de células CD8 que expresan alguno o los tres marcadores de activación.

Los resultados también muestran que la estimulación con 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-L1 y 30 ng/ml de LAG-3Ig provocaba un porcentaje medio significativamente mayor de células CD8 que expresan alguno o los tres marcadores de activación que la estimulación con 3000 ng/ml de anticuerpo anti-PD-L1 en solitario.

Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T CD8+ in vitro (medida mediante la expresión de marcadores de activación de linfocitos T) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD-L1 se aumenta sinérgicamente mediante un derivado de lAG-3 soluble. También se concluyó que se obtiene una respuesta de linfocitos T CD8+ in vitro drásticamente mejorada usando 100 veces menos anticuerpo anti-PD-L1 si este se combina con un derivado de LAG-3 soluble.

Como los inhibidores de la ruta de PD-1 (tales como Keytruda y Opdivo) son conocidos por activar los linfocitos T CD8+, y esta activación está asociada con efectos antineoplásicos, los resultados presentados en los ejemplos anteriores proporcionan evidencias de que pueden obtenerse efectos antineoplásicos mejorados mediante la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II. Como alternativa, pueden conseguirse efectos antineoplásicos similares mediante la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3 (o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II) a dosis inferiores (por ejemplo, dosis de 30 a 100 veces inferiores) del inhibidor de la ruta de PD-1 en comparación con la administración del inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia. Se espera que dicha coadministración reduzca los efectos secundarios causados por el inhibidor de la ruta de PD-1.

Asimismo, como también se sabe que la activación de los linfocitos T CD8+ es eficaz contra infección, incluyendo infección crónica o persistente, los resultados presentados en los ejemplos anteriores también proporcionan evidencias de que la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, puede usarse para prevenir, tratar o mejorar una infección de forma más eficaz. Como alternativa, pueden conseguirse efectos similares contra la infección mediante la coadministración de un inhibidor de la ruta de PD-1 con una proteína LAG-3 (o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II) a dosis inferiores (por ejemplo, dosis de 30 a 100 veces inferiores) del inhibidor de la ruta de PD-1 en comparación con la administración del inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia. Se espera que dicha coadministración reduzca los efectos secundarios causados por el inhibidor de la ruta de PD-1. Ejemplo 12

Efecto de LAG-3Ig y diversos anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1 sobre la producción de IFN-v y TNF-a inducida por estimulación antigénica

Este ejemplo demuestra el efecto de un derivado soluble de LAG-3 (LAG-3Ig) y diversos anticuerpos anti-PD-1 o anti-PD-L1 diferentes sobre la activación de linfocitos T in vitro usando ensayos de secreción de IFN-y y TNF-a. Se incubaron PBMC de donadores sanos (0,2 x 106 células/pocillo, a 1 M/ml en RPMI completo FBS al 10 %) con una combinación de péptidos que cubre la secuencia de pp35 de CMV por triplicado, sin ningún aditivo (medio), con 30 ng/ml o 1000 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 (Ab1 o Ab2) o anticuerpo anti-PD-L1 (Ab3, Ab4, Ab5 o Ab6) con 10 o 30 ng/ml de LAG-3Ig o con 10 o 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1.

Se evaluó la respuesta de linfocitos T midiendo la concentración de IFN-y y TNF en el sobrenadante de cultivo celular tres días después de la estimulación usando matriz de microesferas citométricas BD.

Anti-PD-1: Ab1 (clon MIH4 de BD Pharmingen, n.° de catálogo 557823) y Ab2 (anti-PD-1 humanizado de BPS bioscience, n.° de catálogo 71120);

Anti-PD-L1: Ab3 (clon MIH1 de eBioscience, n.° de catálogo 16-5983-82), Ab4 (clon MIH5 de eBioscience n.° de catálogo 16-5982-81), Ab5 (clon 1-111A de eBioscience n.° de catálogo 14-9971-81) y Ab6 (anti-PD-L1 humanizado de BPS bioscience, n.° de catálogo 71213).

Las concentraciones de IFN-^yy TNF-a en los triplicados combinados para cada condición de estimulación para los anticuerpos anti-PD-1 se registran en la tabla 25. Los resultados se representan en la Figura 17.

- - - - -

Los resultados muestran que, para cada anticuerpo anti-PD-1, la secreción de IFN-^yse aumentaba cuando las PBMC se incubaban en presencia de LAG-3lg y concentraciones inferiores de anticuerpo anti-PD-1, en comparación con anticuerpo anti-PD-1 en solitario. Por ejemplo, el aumento en la concentración de IFN-^ypor encima del nivel de fondo (es decir, la concentración IFN-y en ausencia de anti-PD-1 y LAG-3lg) en presencia de 30 ng/ml de LAG-3lg y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 Ab1, o 10 ng/ml de LAG-3lg y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 Ab2 era mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia de LAG-3lg en solitario y de 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 en solitario (es decir, para AB1, 235,1 > -53,3 144,6; para Ab2, 273,8 > 176,1 18,2). El efecto de la combinación de LAG-3lg y cada anticuerpo anti-PD-1 diferente fue, por lo tanto, sinérgico.

Los resultados también muestran que la secreción de IFN-y inducida por una combinación de LAG-3lg y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD-1 (30 ng/ml) era mucho mayor que la secreción de IFN-^yinducida por una concentración mucho mayor (1000 ng/ml, más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD-1 en solitario (es decir, para Ab1, 235,1 > 107,7; para Ab2, 273,8 > 27,3).

Respecto a la secreción de TNF-a, ningún anticuerpo anti-PD-1 en solitario (a concentración relativamente baja o alta) obtuvo un efecto significativo sobre la secreción de TNF-a. Sin embargo, para cada anticuerpo anti-PD-1, la secreción de TNF-a se aumentaba cuando las PBMC se incubaban en presencia de LAG-3Ig y concentraciones inferiores de anticuerpo anti-PD-1, en comparación con anticuerpo anti-PD-1 en solitario. Por ejemplo, el aumento en la concentración de TNF-a por encima del nivel de fondo (es decir, la concentración de TNF-a en ausencia de anti-PD-1 y LAG-3Ig) en presencia de 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 Ab1, o 10 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo Ab2 era mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia de LAG-3Ig en solitario y de 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 en solitario (es decir, para AB1, 118,7 > 0,9 82,2; para Ab2, 12,778 > 2,563 9,858). El efecto de la combinación de LAG-3Ig y cada anticuerpo anti-PD-1 diferente fue, por lo tanto, sinérgico.

Los resultados también muestran que la secreción de TNF-a inducida por una combinación de LAG-3Ig y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD-1 (30 ng/ml) era drásticamente mayor que la secreción de TNF-a inducida por una concentración mucho mayor (1000 ng/ml, más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD-1 en solitario (es decir, para Ab1, 118,7 > 1,6; para Ab2, 12,778 > 2,494).

Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T in vitro (medida por la secreción de IFN-y y TNF-a) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD-1 se aumenta sinérgicamente mediante un derivado de LAG-3 soluble. También se concluyó que se obtiene una respuesta de linfocitos T in vitro significativamente mayor usando más de 30 veces menos de anticuerpo anti-PD-1 si este se combina con un derivado de LAG-3 soluble. Estos efectos se observaron con diferentes anticuerpos anti-PD-1.

Las concentraciones de IFN-^yy TNF-a en los triplicados combinados para cada condición de estimulación para los anticuerpos anti-PD-L1 se registran en la tabla 26. Los resultados se representan en la Figura 18.

Tabla 26: Secreción de IFN-y y TNF-a inducida por antígeno en presencia de anticuerpo anti-PD-L1 con y sin LAG-

Los resultados muestran que, para cada anticuerpo anti-PD-LI, la secreción de IFN-y se aumentaba cuando las PBMC se incubaban en presencia de LAG-3Ig y concentraciones inferiores de anticuerpo anti-PD-L1, en comparación con anticuerpo anti-PD-LI en solitario. Por ejemplo, el aumento en la concentración de IFN-y por encima del nivel de fondo (es decir, la concentración de IFN-y en ausencia de anti-PD-LI y LAG-3Ig) en presencia de 10 o 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-LI, era mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia 10 o de 30 ng/ml de LAG-3Ig en solitario y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-LI en solitario (es decir para Ab3, 226,5 > 28,5 79,1; para Ab4, 126,03 > 2,31 8,00; para Ab5, 180,34 > 19,84 30,11; para Ab6, 95,14 > -16,51 19,84). El efecto de la combinación de LAG-3Ig y cada anticuerpo anti-PD-L1 diferente fue, por lo tanto, sinérgico.

Los resultados también muestran que la secreción de IFN-^yinducida por una combinación de LAG-3Ig y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD-L1 (30 ng/ml) era drásticamente mayor que la secreción de IFN-y inducida por una concentración mucho mayor (1000 ng/ml, más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD-L1 en solitario (es decir, para Ab3, 226,5 > 55,5; para Ab4, 126,03 > -10,66; para Ab5, 180,34 > 10,89; para Ab695,14 > -49,61).

Respecto a la secreción de TNF-a, para los anticuerpos anti-PD-L1 Ab3, Ab4, y Ab5, la secreción de TNF-a se aumentaba cuando las PBMC se incubaban en presencia de LAG-3Ig y concentraciones inferiores de anticuerpo anti-PD-L1, en comparación con anticuerpo anti-PD-L1 en solitario. Por ejemplo, el aumento en la concentración de TNF-a por encima del nivel de fondo (es decir, la concentración de TNF-a en ausencia de anti-PD-L1 y LAG-3Ig) en presencia de 10 o 30 ng/ml de LAG-3Ig y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-L1 Ab3, Ab4 o Ab5 fue mayor que la suma del aumento correspondiente en presencia de LAG-3Ig en solitario y 30 ng/ml de anticuerpo anti-PD-L1 Ab3, Ab4 o Ab5 en solitario (es decir, para Ab3, 9,0 > -1,8 2,4; para Ab4, 80,34 > 2,08 58,71; para Ab5, 137,84 > 5,53 84,21). El efecto de la combinación de LAG-3Ig y estos anticuerpos anti-PD-L1 diferentes fue, por lo tanto, sinérgico. Aunque no se observó efecto sinérgico sobre la secreción de TNF-a para el anticuerpo anti-PD-L1 Ab6 en combinación con LAG-3Ig, esto puede deberse al alto nivel de secreción de TNF-a en presencia de este anticuerpo en solitario. No obstante, el nivel de secreción de TNF-a en presencia de la combinación de Ab6 y LAG-3Ig fue mayor que en presencia del anticuerpo Ab6 en solitario (a 30 ng/ml y a 1000 ng/ml).

Los resultados también muestran que la secreción de TNF-a inducida por una combinación de LAG-3Ig y una concentración relativamente baja de anticuerpo anti-PD-L1 (30 ng/ml) era drásticamente mayor que la secreción de TNF inducida por una concentración mucho mayor (1000 ng/ml, más de 30 veces mayor) de anticuerpo anti-PD-L1 en solitario (es decir, para Ab3, 9,0 > 0,6; para Ab4, 80,34 > 2,50; para Ab5, 137,84 > 4,00; para Ab6 100,99 > 47,81).

Se concluyó a partir de estos resultados que la respuesta de linfocitos T in vitro (medida por la secreción de IFN-^yy TNF) inducida por dosis relativamente bajas de anticuerpo anti-PD-L1 se aumenta sinérgicamente mediante un derivado de LAG-3 soluble. También se concluyó que se obtiene una respuesta de linfocitos T in vitro significativamente mayor usando más de 30 veces menos de anticuerpo anti-PD-L1 si este se combina con un derivado de LAG-3 soluble. Estos efectos se observaron con diferentes anticuerpos anti-PD-L1.

Ejemplo 13

Efecto de derivados de LAG-3 y anticuerpo anti-PD-1 sobre la producción de IFN-v inducida por estimulación antigénica

Este ejemplo demuestra el efecto de diversos derivados solubles diferentes de LAG-3 (derivados (i), (ii) y (iii) descritos en el ejemplo 5 e ilustrados en la figura 7) y anticuerpo anti-PD-1 sobre la activación de linfocitos T in vitro usando un ensayo de secreción de IFN-^y.

Se incubaron PBMC de donadores sanos (0,2 x 106 células/pocillo, a 1 M/ml en RPMI completo FBS al 10 %) con una combinación de péptidos que cubre la secuencia de pp35 de CMV por triplicado, sin ningún aditivo (medio), con 30 ng/ml o 1000 ng/ml de anticuerpo anti-PD-1 (clon EH12), con 30 ng/ml de derivado de LAG-3 (IMP321, IMP321 R75A, o LAG3 D1D4-conector2-Ig), o con 30 ng/ml de derivado de LAG-3 y 30 ng/ml de anti-PD-1.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparación combinada, que comprende:

(a) proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, y opcionalmente el dominio D2, de la proteína LAG-3, o en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3; y

(b) un inhibidor de la ruta de proteína-1 de muerte celular programada (PD-1), en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, o en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-LI, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-L1 a PD-1.

2. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a) proteína LAG-3, o un derivado de la misma que puede unirse a moléculas MHC de clase II, en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con el dominio D1, y opcionalmente el dominio D2, de la proteína LAG-3, o en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3;

(b) un inhibidor de la ruta de PD-1, en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-1, 0 un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, o en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-L1, o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-L1 a PD-1; y

(c) un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. Una preparación combinada de acuerdo con la reivindicación 1, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2, para la coadministración o administración secuencial de la proteína LAG-3 o derivado de la misma y el inhibidor de la ruta de PD-1.

4. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína LAG-3 o derivado de la misma, está separada del inhibidor de la ruta de PD-1.

5. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína LAG-3 o derivado de la misma, está presente a una dosis que es un equivalente molar de 0,25 30 mg de proteína de fusión LAG-3Ig IMP321.

6. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende una pluralidad de dosis de la proteína LAG-3 o derivado de la misma y/o una pluralidad de dosis del inhibidor de la ruta de PD-1.

7. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 comprende:

un anticuerpo anti-PD-1 o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-1 a PD-L1 y/o PD-L2, y en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 es pembrolizumab o nivolumab o pidilizumab; o un anticuerpo anti-PD-L1 o un derivado o fragmento del mismo que retiene la capacidad de inhibir la unión de PD-L1 a PD-1, y en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 es BMS-936559, MEDI4736, MPDL3280A o MSB0010718C.

8. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 está presente a una dosis que es de hasta un 50 %, un 1-50 %, un 1-25 % o un 1-10 %, de una dosis típicamente prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia, o en la que el inhibidor de la ruta de PD-1 está presente a una dosis que es de un 0,1-50 %, 0,1-25 %, 0,1-20 %, 0,1-10 %, <20 %, <10 %, 0,1-<20 %, 0,1-<10 %, 0,01-<20 % o 0,01-<10 % de una dosis típicamente prescrita del inhibidor de la ruta de PD-1 como monoterapia.

9. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la proteína LAG-3 o derivado de la misma y el inhibidor de la ruta de PD-1, están presentes en cualquiera de las combinaciones de cantidades de dosificación mostradas en la tabla a continuación:

10. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de aminoácidos con el dominio D1, y opcionalmente el dominio D2, de la proteína LAG-3 humana, o en la que el derivado de proteína LAG-3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de aminoácidos con los dominios D1, D2, D3, y opcionalmente D4, de la proteína LAG-3 humana.

11. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el derivado de proteína LAG-3 se fusiona a la secuencia de Fc de inmunoglobulina, preferiblemente en la que el derivado de proteína LAG-3 es la proteína de fusión de LAG-3Ig humana soluble recombinante IMP321.

12. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para su uso como medicamento.

13. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en la prevención, tratamiento o mejora del cáncer.

14. Una preparación combinada o una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el cáncer es un cáncer PD-L1 positivo o PD-L2 positivo o en la que el cáncer es de piel, broncopulmonar (especialmente carcinoma broncopulmonar no microcítico escamoso y no escamoso, NSCLC), de ovario, renal, de colon, colorrectal, de mama, gástrico, esofágico, pancreático, de vejiga, urotelial o hepático, o un melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata resistente a hormonas), cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, carcinoma escamocelular de cabeza y cuello), cáncer cervicouterino, cáncer de tiroides, glioblastoma, glioma, leucemia, linfoma (por ejemplo, linfoma de linfocitos B), cáncer de glándula suprarrenal, cáncer asociado a SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumor astrocítico, cáncer de huesos, cáncer cerebral y médula espinal, tumor cerebral metastásico, tumor del cuerpo carotídeo, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de células renales cromófobo, carcinoma de células claras, histiocitoma fibroso benigno cutáneo, tumor de células redondas pequeñas desmoplásico, ependimoma, tumor de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cáncer de vesícula biliar o conducto biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumor de células germinales, neoplasia hemática, carcinoma hepatocelular, tumor de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer renal, lipoma/tumor lipomatoso benigno, liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, meduloblastoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome de mielodisplasia, neuroblastoma, tumor neuroendocrino, carcinoma de tiroides papilar, tumor paratiroideo, cáncer pediátrico, tumor de la vaina de los nervios periféricos, feocromocitoma, tumor de pituitaria, cáncer de próstata, melanoma de la úvea posterior, trastorno hemático infrecuente, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdomiosarcoma, sarcoma, sarcoma de tejido blando, cáncer escamocelular, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastático de tiroides o cáncer uterino.

15. Una preparación combinada o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de una infección.

16. Una preparación combinada para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la infección es una infección crónica o persistente.

17. Una preparación combinada para su uso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en la que la infección es una infección vírica, bacteriana, fúngica o por protozoos, preferiblemente en la que la infección vírica está causada por un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus B (herpesvirus I macacino), un virus BK, un bunyavirus, un chikungunya virus, un cocksackie virus, un coronavirus, un citomegalovirus, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus del ébola, un enterovirus, un virus de Epstein-Barr, un hantavirus, un virus de la hepatitis A, un virus de la hepatitis B, un virus de la hepatitis C, un virus de la hepatitis D, un virus de la hepatitis E, un herpes virus, un virus 1 del herpes simple, un virus 2 del herpes simple, un virus espumoso humano, un virus 3 del herpes humano, un virus 5 del herpes humano, un virus 6 del herpes humano, un virus 7 del herpes humano, un virus de la inmunodeficiencia humana, un papilomavirus humano, un virus p-linfotrópico humano, un virus I de la leucemia de linfocitos T humana, un virus II de la leucemia de linfocitos T humana, un virus de la gripe, un virus JC, un JEV, un herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi, un virus Lassa, un virus de la coriomeningitis linfocítica, un virus Marburg, un virus del sarampión, un virus de las paperas, un virus Nipah, un norovirus, un virus Norwalk, un ortorreovirus, un virus de la parainfluenza, un parvovirus, un poliovirus, un virus de la rabia, un reovirus, un virus respiratorio sincitial, rinovirus, un virus de la fiebre del valle del Rift, un rotavirus, virus de la rubéola, un virus de la viruela, un virus de la encefalitis de St Louis, un virus de la viruela mayor, un virus de la viruela menor, un virus de varicela-zoster, un virus del Nilo occidental, un virus de la encefalitis equina occidental o un virus de la fiebre amarilla, o en la que la infección bacteriana está causada por Escherichia coli, Clostridium difficile, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumonia, o Chlamydia trachomatis, o en la que la infección fúngica está causada por Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Coccidioides, Histoplasma, Pneumocystis, o Stachybotrys, o en la que la infección por protozoos está causada porAmoebozoa, Excavata, Chromalveolata, Entamoeba, Plasmodium, Giardia, Trypanosoma, Coccidia, Besnoitia, Dicrocoelium o Leishmania.