ES2701448T3 - Proteínas de fusión para uso como mejoradores inmunogénicos para inducir respuestas técnicas específicas a los antígenos - Google Patents

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Chia-Mao Wu
Jiun-Ming Wu
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TheVax Genetics Vaccine Co Ltd
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Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91 que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en 5 las SEQ ID NOs: 1 y 8-11, ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión; (b) un péptido de translocación de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicada en el C-terminal del dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91; y (c) un antígeno de un patógeno; (d) una señal de exportación nuclear, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y (e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico de cuatro residuos de aminoácidos de longitud, ubicada en el C-terminal de la proteína de fusión; en donde la señal de exportación nuclear está localizada entre el antígeno y la secuencia de retención del retículo endoplásmico, o entre el péptido de translocación y el antígeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión para uso como mejoradores inmunogénicos para inducir respuestas técnicas específicas a los antígenos
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión e inmunología.
Antecedentes de la invención
La biología molecular ha permitido la producción de vacunas de subunidades, en las que el inmunógeno es un fragmento o una subunidad de una proteína o complejo principal. Sería deseable el desarrollo de una vacuna estable que pudiera provocar respuestas de sensibilización de las células T y ser lo suficientemente flexible como para incorporar secuencias de muchas cepas de un agente infeccioso.
La publicación de la patente de Estados Unidos N° 20120213811 A1 divulga una proteína de fusión que comprende: a) un péptido de exotoxina A de Pseudomonas (PE) que comprende un dominio de unión y un dominio de translocación de PE, estando el péptido PE desprovisto del dominio citotóxico III; b) opcionalmente gag24, que se fusiona con el péptido PE; c) un fragmento del dominio C1 de gp120, que se fusiona con el péptido PE o se fusiona con la gag24 si la gag24 está presente; d) un fragmento del dominio C5 de gp 120, que se fusiona con el fragmento del dominio C1 de gp120; e) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de gp41, que se fusiona con el fragmento del dominio C5 de gp 120, y f) opcionalmente una secuencia de retención del retículo endoplásmico, que se fusiona con el C-terminal del fragmento de gp41.
LaCour et al., publicaron los resultados del análisis y la predicción de señales de exportación nuclear ricas en leucina (Protein Engineering, Design & Selection vol. 17 no. 6 páginas 527-536, 2004).
La publicación de la patente de Estados Unidos N° 2010/0099613 A1 divulga proteínas de fusión inmunogénicas y una proteína que comprende una señal de exportación nuclear que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 13 (LXXKLXXLXL).
Zhang et al., publicó que la proteína recombinante de direccionamiento HER2 con el dominio de translocación de la endotoxina A truncada de Pseudomonas mata eficientemente células de cáncer de mama (Cancer Biology & Therapy 7: 8, 1226-1231; agosto de 2008).
Takemoto et al. (J. Controlled Release, 2009, 135: 11-18) divulgaron la generación mejorada de linfocitos T citotóxicos mediante el aumento de la administración citosólica del epítopo del MHC clase I fusionado a la proteína de choque térmico 70 de ratón mediante conjugación de polihistidina.
Manoharan et al. (US 2005/0119470) divulgaron compuestos oligoméricos conjugados y su uso en la modulación génica.
Fukuda et al. (J. Biol. Chem. 1996, 271 (33) 20024-20028) divulgaron la localización citoplásmica de la proteína quinasa quinasa activada por mitógeno dirigida por su secuencia corta de aminoácidos rica en leucina NH2-terminal, que actúa como señal de transporte nuclear.
El documento WO 2010/040023 A2 divulga métodos de terapia de proteínas y tratamiento de enfermedades usando una proteína TUS, una NLS o NES identificada a partir de TUS de longitud completa.
El documento WO 00/61772 A2 divulga métodos para generar respuestas inmunes utilizando sistemas de vectores basados en alfavirus.
Peter Heger et al. (Traffic, vol. 2, n° 8, páginas 544-555) divulgan señales de exportación nuclear cualitativas altamente divergentes que pueden regular la exportación por la composición para el transporte de cofactores in vivo.
Sumario de la invención
En un aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende:
(a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91 que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1 y 8-11, ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión;
(b) un péptido de translocación de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicada en el C-terminal del dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91; y
(c) un antígeno de un patógeno;
(d) una señal de exportación nuclear, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, en la que el aminoácido C-terminal de la SEQ ID NO: 13 es alanina; y
(e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico de cuatro residuos de aminoácidos de longitud, ubicada en el C-terminal de la proteína de fusión; en donde la señal de exportación nuclear está localizada entre el antígeno y la secuencia de retención del retículo endoplásmico, o entre el péptido de translocación y el antígeno.
En una realización de la invención, el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, 8, 9, 10 u 11.
En otra realización de la invención, la señal de exportación nuclear comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
En otra realización de la invención, la secuencia de retención del retículo endoplásmico consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
En otra realización de la invención, la señal de exportación nuclear se localiza entre el péptido de translocación y el antígeno.
En otra realización de la invención, la señal de exportación nuclear se localiza entre el antígeno y la secuencia de retención del retículo endoplásmico.
En otra realización de la invención, la señal de exportación nuclear y la secuencia de retención del ER forman un péptido de fusión que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
En otra realización de la invención, el péptido de translocación tiene 34-61 residuos de aminoácidos de longitud. También se divulga un caso en el que el péptido de translocación tiene 34-46 residuos de aminoácidos de longitud. En otra realización de la invención, el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 está libre de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión I de la exotoxina A de Pseudomonas (PE).
En otra realización de la invención, el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
En otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 es la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos del péptido de translocación es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2 o 3.
En otra realización de la invención, el antígeno es un antígeno de fusión de dos o más péptidos antigénicos de un patógeno.
En un aspecto de la divulgación, el péptido de translocación consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6.
En una realización específica de la invención, el péptido de translocación tiene una longitud de 34-61 residuos de aminoácidos y consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2 o 3.
En aspectos adicionales de la divulgación, el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 exhibe una característica de reconocimiento y unión a un receptor en una célula presentadora de antígeno (APC) seleccionada del grupo que consiste en células dendríticas, monocitos, células B y linfocitos.
En otros aspectos de la divulgación, el patógeno se selecciona del grupo que consiste en PRRSV, PCV, FMDV, CSFV, NDV, virus de gastroenteritis transmisible (TGEV), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de la influenza, virus de la pseudorrabia, parvovirus, virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV), virus de la viruela, rotavirus, neumonía por micoplasma, virus del herpes, bronquitis infecciosa y virus de la enfermedad de bursitis infecciosa. Además, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición de vacuna que comprende la proteína de fusión como se mencionó anteriormente y un adyuvante.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para inducir respuestas de células T específicas de antígeno patógeno mejoradas, que comprende: administrar una composición de vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión como se mencionó anteriormente a un sujeto que la necesita, y por lo tanto inducir respuestas de células T específicas de antígeno patógeno mejoradas.
La invención también se refiere a una proteína de fusión o una composición de vacuna como se ha mencionado anteriormente para uso en el tratamiento de infecciones induciendo respuestas de células T específicas de antígeno patógeno mejoradas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A es un dibujo esquemático que muestra una exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (PE) de longitud completa y un fragmento parcial de PE.
Las Figuras 1B-C muestran mapas vectoriales.
Las Figuras 2-5 son gráficos que muestran proteínas de fusión de acuerdo con la invención que producen inmunogenicidades mediadas por células T CD8+/IFN-Y+ mejoradas (Figuras 2A-5A) y células T CD4+/IFN-Y+ (Figuras 2B-5B), respectivamente.
La Figura 6 muestra los grupos de animales, vacunas y la dosis utilizada para inmunizar a los animales y los cronogramas de inmunización.
Las Figuras 7-8 son gráficos que muestran las curvas de tamaño del tumor y el porcentaje de ratones libres de tumores en los grupos de animales vacunados con diversas proteínas de fusión o placebo, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describe más particularmente en los siguientes ejemplos que pretenden ser ilustrativos solamente ya que numerosas modificaciones y variaciones en los mismos serán evidentes para los expertos en la técnica. Varias realizaciones de la invención se describen ahora en detalle. Con referencia a los dibujos, los números similares indican componentes similares en todas las vistas. Tal como se utiliza en la divulgación de este documento y en todas las reivindicaciones que vienen a continuación, el significado de "un", "uno, una" y "el, la" incluye una referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, tal como se utiliza en la divulgación de este documento y en todas las reivindicaciones que vienen a continuación, el significado de "en" incluye "en" y "sobre" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, los títulos o subtítulos pueden usarse en la memoria descriptiva para la comodidad del lector, que no tendrá influencia en el alcance de la presente invención. Además, algunos términos utilizados en esta memoria descriptiva se definen más específicamente a continuación.
Definiciones
Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de la invención, y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos que se usan para describir la invención se discuten a continuación, o en otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar una guía adicional al facultativo con respecto a la divulgación de la invención. Por conveniencia, ciertos términos pueden estar resaltados, por ejemplo, usando cursiva y/o comillas. El uso del resaltado no tiene influencia en el alcance y significado de un término; el alcance y significado de un término es el mismo, en el mismo contexto, esté o no resaltado. Se apreciará que lo mismo se puede decir de más de una manera. En consecuencia, se puede usar un lenguaje alternativo y sinónimos para uno o más de los términos discutidos en el presente documento, y no debe darse ningún significado especial sobre si un término se elabora o discute en el presente documento. Se proporcionan sinónimos para ciertos términos. La mención de uno o más sinónimos no excluye el uso de otros sinónimos. El uso de ejemplos en cualquier parte de esta memoria descriptiva, incluidos los ejemplos de los términos discutidos en este documento, es solo ilustrativo.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluidas las definiciones.
El término "una célula presentadora de antígeno (APC) o célula accesoria" se refiere a una célula que muestra antígenos foráneos complejados con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en sus superficies. Las células T pueden reconocer estos complejos utilizando sus receptores de células T (TCR). Estas células procesan los antígenos y los presentan a las células T. Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas (CD), los macrófagos, que también son CD4+ y, por lo tanto, también son susceptibles a la infección por el VIH; monocitos, y ciertas células B.
El término "un dominio de unión a célula presentadora de antígeno (APC)" se refiere a un dominio (que es un polipéptido) que puede unirse a una célula presentadora de antígeno (APC). El dominio de unión a la APC puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 y 8-11. Un dominio de unión a la APC es un ligando que reconoce y se une a un receptor en APC.
El grupo de diferenciación 91 (CD91) es una proteína que forma un receptor en la membrana de las células y está involucrada en la endocitosis mediada por el receptor.
El término "PEt" se refiere a un péptido de translocación (o un dominio de translocación) con 34-112 residuos de aminoácidos de longitud. PEt puede comprender la secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2-4 y 6. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de PEt puede ser un fragmento de aa 280 - aa 313 (SEQ ID NO: 4), aa 268 - aa 313 (SEQ ID NO: 3), aa 253 - aa 313 (SEQ ID NO: 2), o aa 253 - aa 364 (SEQ ID NO: 6) de PE. Es decir, la secuencia de aminoácidos de PEt puede contener cualquier región del dominio II de PE (aa 253 hasta aa 364: SEQ ID NO: 6) siempre que comprenda la secuencia esencial aa 280 - aa 313 (SEQ ID NO: 4) (es decir, el fragmento esencial).
El PE407 (SEQ ID NO. 7) se describe en la patente anterior (documento US 7.335.361 B2) como PE (ANI).
El término "péptido de translocación mínima" se refiere a PE253-313 (SEQ ID NO. 2), que puede traslocar un antígeno al citoplasma de una célula objetivo.
El término "una secuencia de retención del retículo endoplásmico (ER)" se refiere a un péptido cuya función es ayudar a la translocación de un antígeno del citoplasma al ER y retiene el antígeno en el lumen del e R. Una secuencia de retención del ER comprende la secuencia de Lys Asp Glu Leu (KDEL; SEQ ID NO: 15) o RDEL. Una secuencia de retención del ER puede comprender la secuencia KDEL, RDEL, KDELKDELKd El (K3; SEQ ID NO: 16), KKDLRDELKDEL (K3; SEQ ID NO: 17), KKDELRDELKDEL (K3; SEQ ID NO: 18), o KKDELRVELKDEL (K3; SEQ ID NO: 19).
Una señal de exportación nuclear (NES) se refiere a una secuencia corta de aminoácidos de 4 residuos hidrófobos en una proteína que la dirige para la exportación desde el núcleo celular al citoplasma a través del complejo de poros nucleares utilizando el transporte nuclear. La NES es reconocida y unida para la exportación. La separación más común de los residuos hidrófobos es LxxKLxxLxLx (SEQ ID NO. 13), donde "L" es leucina, "K" es lisina y "x" es cualquier aminoácido natural. Por ejemplo, una NES artificial puede comprender la secuencia Leu Gln Lys Lys Leu Glu Glu Leu Glu Leu Ala (LQKKLEELELA; SEQ ID NO: 14).
El término "NESK" se refiere a un péptido de fusión de una NES y una señal de retención del ER (es decir, una NES fusionada a una señal de retención del ER). Es un péptido artificial que posee la función de una señal de exportación nuclear (NES) y una secuencia de retención del ER. Por lo tanto, puede exportar un antígeno desde el núcleo celular al citoplasma a través del complejo de poros nucleares, y ayudar a la translocación de un antígeno desde al citoplasma al ER y retener el antígeno en el lumen del ER. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de NESK puede ser LQKKLEELELAKDEL (SEQ ID NO: 12).
Un antígeno puede ser una proteína, polipéptido o péptido patógeno que es responsable de una enfermedad causada por el patógeno, o es capaz de inducir una respuesta inmunológica en un huésped infectado por el patógeno, o antígeno asociado al tumor (TAA) que es un polipéptido expresado específicamente en células tumorales. El antígeno puede seleccionarse de un patógeno o células cancerosas que incluyen, pero no se limitan a, virus del papiloma humano (HPV), virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), virus de inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1), virus del dengue, virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis B (HBV), circovirus porcino 2 (PCV2), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de la influenza, virus de la pseudorrabia, virus de la viruela, virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV), virus de la viruela, rotavirus, neumonía por micoplasma, virus del herpes, bronquitis infecciosa o virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, cáncer de células no pequeñas, cáncer de mama, carcinoma de mama, melanoma, linfomas, carcinoma de colon, carcinoma hepatocelular y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, la proteína E7 de1HPV (E7), la proteína del núcleo del HCV (el núcleo del HCV), proteína X del HBV (HBx) se seleccionaron como antígenos para el desarrollo de la vacuna. El antígeno puede ser un antígeno de fusión de una fusión de dos o más antígenos seleccionados de una o más proteínas patógenas. Por ejemplo, un antígeno de fusión de los fragmentos ORF6 y ORF5 del PRRSV, o una fusión de proteínas antigénicas de los patógenos PRRSV y PCV2.
El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad efectiva de la proteína de fusión a un sujeto que la necesite, que tenga cáncer o infección, o un síntoma o predisposición hacia tal enfermedad, con el propósito de curar, aliviar, mitigar, remediar, mejorar o prevenir la enfermedad, los síntomas de la misma o la predisposición hacia ella. Un profesional del cuidado de la salud puede identificar dicho sujeto basándose en los resultados de cualquier método de diagnóstico adecuado.
El término "una cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado. Las dosis efectivas variarán, como lo reconocen los expertos en la materia, dependiendo de la ruta administración, el uso de excipientes y la posibilidad de uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.
La invención se refiere a proteínas de fusión para mejorar la administración del antígeno y modular la respuesta inmune mediada por células. La proteína de fusión comprende: (a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91, localizado en el N-terminal de la proteína de fusión; (b) un péptido de translocación de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2-4 y 6 y que se encuentra en el C-terminal del dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91; y (c) un antígeno de un patógeno, ubicado en el C-terminal del péptido de translocación; (d) una señal de exportación nuclear (NES); y (e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico (ER), ubicándose la secuencia de retención del ER en el C-terminal de la proteína de fusión, en donde la NES comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
Usando la proteína de fusión PE313-ORF2-NESK como ejemplo, la estrategia es que la proteína de fusión de la invención estimula la producción y activación de células T que pueden reconocer la proteína de la cápside ORF2 del circovirus porcino tipo 2 (PCV2). La proteína de fusión comprende, desde el N-terminal al C-terminal, un dominio I de PE (dominio de unión a la APC), un péptido de translocación de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, aa 253-313 del dominio II de PE), una proteína ORF2 del PCV2 truncada (señal de localización nuclear N-terminal eliminada), una señal NES y una secuencia de retención del ER (KDEL). Los mecanismos subyacentes para obtener mejores respuestas inmunitarias de células T específicas de ORF2 por PE313-ORF2-NESK implican las siguientes etapas: a) unión al receptor de superficie de células dendríticas (o células presentadoras de antígeno) (CD91); b) internalización por endocitosis; c) transporte al ER e hidrólisis proteolítica por furina frente al péptido de translocación; d) procesamiento y presentación por el complejo MHC I; y e) activación de células T CD4+ y CD8+ específicas del antígeno. Las células Th1 CD4+ son capaces de estimular y mejorar eficazmente la respuesta inmune de las células T CD8+ citotóxicas. Juntos, estos dos brazos del sistema inmune adaptativo tienen la especificidad y la potencia para matar al PCV2 y las células infectadas con PCV2.
La proteína de fusión PE313-ORF2-NESK aquí es distinguible de la vacuna de la proteína de fusión PE407-Ag-K3 divulgada por Lai en el documento US 7.335.361 en varios aspectos. En primer lugar, la longitud de PE313 (SEQ ID NO: 5) es de 94 residuos de aminoácidos más cortos que PE407 (SEQ ID NO: 7), cuya ventaja es que se minimiza o elimina la respuesta humoral no deseada por la presencia de un fragmento extra de PE. En segundo lugar, la secuencia de retención del ER se acorta. En lugar de K3 (es decir, 3 de KDER), solo se necesita un KDER o RDER. En tercer lugar, solo el antígeno citosólico puede procesarse y presentarse por la vía del MHC tipo I, por lo que la adición de una señal NES en la proteína de fusión es beneficiosa para mejorar las respuestas de las células T específicas del antígeno patógeno porque aumenta la posibilidad de translocación del antígeno al citosol. Los antígenos de un patógeno pueden importarse al núcleo celular. Al incorporar una señal NES, el antígeno importado en el núcleo celular puede ser exportado al citoplasma por la señal NES de la proteína de fusión.
Ejemplos
Los ejemplos de instrumentos, aparatos, métodos y sus resultados relacionados de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se dan a continuación.
Ejemplo 1
Construcción de vectores de expresión
La Figura 1A muestra que PE contiene 3 dominios (I, II y III). PE407 es la región de aa 1 hasta aa 407 de PE. PE407 no contiene el dominio III citotóxico y, por lo tanto, contiene los dominios I y II. PE313 es la región de aa 1 hasta aa 313 de PE. Por lo tanto, PE313 contiene solo el dominio Ia y una región N-terminal parcial del dominio II de PE.
Las Figuras 1B-C muestra construcciones de vectores de expresión, cada uno de los cuales comprende un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC), un péptido de translocación, un antígeno, con (panel inferior) o sin (panel superior) una señal de exportación nuclear (NES); y una secuencia de retención del retículo endoplásmico (ER) (panel superior, K3 o panel inferior, K), estando la secuencia de retención del ER ubicada en el C-terminal de la proteína de fusión. Los plásmidos pTac-2-PE313-NESK, pTac-2-PE407-K3, pTac-2-RAP1-PE268-313-NESK y pTac-2-RAP1-PE268 -313-K3 se generaron de la siguiente manera: Los fragmentos NdeIPE313-(Ec° RI,Xh° I)-NESKXh° I, NdeIPE407- (EcoRI’ XhoI)-K3Xho I, Ned IRAP1-(EcoR I>-PE268-313-(E“ r I ,Xho >-NESKXho I y Nde IRAP1-(E“ R I>-PE268-313-(E“ r I Xho I >-K3Xho I se sintetizaron mediante un método de PCR y luego se ligaron en un pUC18 que se une de nuevo con el gen de resistencia a la kanamicina para obtener los plásmidos respectivos.
Un ADN objetivo que codifica un antígeno o un antígeno de fusión de un patógeno de interés puede insertarse luego en los plásmidos mencionados anteriormente, lo que genera un vector de expresión para la expresión de una proteína de fusión. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican antígenos de la ORF2 del circovirus porcino tipo 2 (PCV2) (SEQ ID NO: 20), E2 del virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) (SEQ ID NO: 21), VP1-3A del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (SEQ ID NO: 24) y FNH del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (SEQ ID NO: 27) se sintetizaron e insertaron en los plásmidos pTac-2-PE313-NESK y pTac-2-PE407-K3, respectivamente, para generar los siguientes vectores de expresión: (1) PE313-ORF2-NESK; (2) PE407-ORF2-K3; (3) PE313-E2-NESK; (4) PE407-E2-K3; (5) PE313-VP1- 3A-NESK; (6) PE407-VP1-3A-K3; (7) PE313-FHN-NESK; y (8) PE407-FHN-K3. Los fragmentos de ADN que codifican el antígeno del virus del papiloma humano Tipo 16 E7 (SEQ ID NO: 28) se sintetizaron e insertaron en los plásmidos pTac-2-PE407-K3, pTac-2-RAP1-PE268-313-NESK y pTac-2-RAP1-PE268-313-K3, respectivamente, para generar los siguientes vectores de expresión: (9) PE407-E7-K3, (10) RAP1-PE268-313-E7-NESK y (11) RAP1-PE268-313-E7-K3.
Ejemplo 2
Expresión de la proteína
Se cultivaron respectivamente células E. coli BL21 que albergan plásmidos para la expresión de proteínas de fusión (1) PE313-ORF2-NESK; (2) PE407-ORF2-K3; (3) PE313-E2-NESK; (4) PE407-E2-K3; (5) PE313-VP1-3A-NESK; (6) PE407-VP1-3A-K3; (7) PE313-FHN-NESK; (8) PE407-FHN-K3; (9) PE407-E7-K3; (10) RAP1-PE268-313-E7-NESK y (11) RAP1 PE268-313-E7-K3 en caldo de Luria Bertani que contenía 25 ppm de kanamicina a 37°C. Cuando el cultivo alcanza la fase logarítmica temprana (A600 = 0,1 a 0,4), se añadió isopropil-1-tio-p-D-galactopiranósido (IPTG) con una concentración final de 0,5 a 2 mM para la inducción. Las células se recogieron después de la inducción luego de 4 horas y se almacenaron inmediatamente a -70°C. Las proteínas de fusión se purificaron mediante extracción con urea como se describió anteriormente (Liao et al., 1995. Appl, Microbiol. Biotechnol. 43: 498-507) y luego se replegaron mediante un método de diálisis frente a un volumen 50X de regulador TNE (Tris 50 mM, NaCl 50 mM y EDTA 1 mM) a 4°C durante toda la noche. Las proteínas replegadas se sometieron a análisis SDS-PAGE y se realizaron análisis cuantitativos utilizando el kit de ensayo de proteínas Bradford (Pierce). Los resultados indicaron que la mayoría de las proteínas replegadas eran monómeros en una condición no reducida, lo que indica que las proteínas de fusión se replegaron fácilmente y no se agregaron.
Ejemplo 3
Ensayo de inmunogenicidad de vacunas de la subunidad PCV2
Los ratones se vacunaron con 0,1 mL de vacuna de la subunidad PCV2 que contenía 40 |jg de PE313-ORF2-NESK o PE407-ORF2-K3 con fosfato de aluminio (una proteína absorbente para la liberación lenta de la proteína de fusión; 10% v/v) y 10 jg de saponina (un adyuvante extraído de Quillaja saponaria) a través de una inyección sc una vez por semana durante 3 semanas. El grupo de control (placebo) se inyectó con adyuvante solo sin la proteína de fusión. Todos los ratones se sacrificaron 14 días después de la última inmunización, y se recogieron los bazos. Los esplenocitos se aislaron y se cultivaron en una placa de 6 pozos (108 células/2 mL/pozo) con o sin la proteína ORF2 recombinante en presencia de 1 jg/m L de GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 37°C durante 16 h. Los esplenocitos estimulados se lavaron luego con regulador FACScan y se tiñeron con anticuerpos de rata anti-CD8a de ratón monoclonales conjugados con ficoeritrina y de rata anti-CD4 de ratón monoclonales conjugados con AF700. Las células se tiñeron con citoquina intracelular utilizando el kit Cytofix/Cytoperm de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen). El IFN-y intracelular se tiñó con IFN-y de rata anti-ratón conjugado con AF488 para medir la respuesta inmune y los niveles de citoquina. Los análisis por citometría de flujo se realizaron utilizando la citometría de flujo Gallios con el software de análisis Kaluza (Beckman Coulter).
Las Figuras 2A-B muestran los números de células T IFN-y positivas para CD8 y CD4 en los esplenocitos de ratones vacunados con un placebo (adyuvante solo sin la proteína de fusión) o proteínas de fusión, respectivamente. La producción de IFN-y por células T CD4+ y CD8+ en esplenocitos estimulados con ORF2 se detectó mediante tinción intracelular mediante citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran los números de células T IFN-Y+ CD4+ específicas para ORF2 (FIG. 2B) y células T IFN-Y+ CD8+ (FIG. 2A) de cada grupo con (barras grises) o sin (barras negras) la estimulación mediante el péptido ORF2. Los resultados indicaron que los ratones que habían sido vacunados con PE313-ORF2-NESK tenían más células CD4+ IFN-Y+ y CD8+ IFN-Y+ específicas para ORF2 que los ratones que habían sido vacunados con el grupo PE407-ORF2-K3.
Ejemplo 4
Ensayo de inmunogenicidad de vacunas subunidad de CSFV
Usando el mismo esquema de inmunización y dosificación, los ratones se vacunaron con subunidades de CSFV que contenían PE313-E2-NESK o PE407-E2-K3, y los esplenocitos se aislaron, cultivaron y ensayaron mediante un método de citometría de flujo como el descrito anteriormente, excepto que se añadió proteína E2 recombinante para estimular los esplenocitos en el cultivo.
Las Figuras 3A-B muestran los números de células T IFN-y positivas para CD8 y CD4 en los esplenocitos de ratones vacunados con un placebo (adyuvante solo sin la proteína de fusión) o proteínas de fusión, respectivamente. La producción de IFN-y por las células T CD4+ y CD8+ en esplenocitos estimulados con B2 se detectó mediante tinción intracelular mediante citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran los números de células T IFN-Y+ CD4+ específicas de E2 (Figura 3B) y células T IFN-Y+ CD8+ (Figura 3A) de cada grupo con (barras grises) o sin (barras negras) la estimulación mediante el péptido E2. Los resultados indicaron que los ratones que habían sido vacunados con PE313-E2-NESK tenían más células T CD4+ IFN-Y+ y CD8+ IFN-Y+ específicas de E2 estimuladas por el péptido E2 que los ratones que habían sido vacunados con el grupo PE407-E2 -K3.
Ejemplo 5
Ensayo de inmunogenicidad de vacunas de subunidad de FMDV
Usando el mismo programa de inmunización y dosificación, los ratones se vacunaron con vacunas de subunidad de FMDV que contenían PE313VP1-3A-NESK o PE407-VP1-3A-K3, y los esplenocitos se aislaron, cultivaron y ensayaron mediante un método de citometría de flujo como el descrito anteriormente, excepto que la proteína VP1-3A recombinante se agregó para estimular los esplenocitos en el cultivo.
Las Figuras 4A-B muestran el número de células T IFN-y positivas para CD8 y CD4 en los esplenocitos de ratones vacunados con un placebo o proteínas de fusión. La producción de IFN-y por las células T CD4+ y CD8+ en esplenocitos estimulados con Vp1-3Ase detectó mediante tinción intracelular mediante citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran los números de células T IFN-Y+ CD4+ específicas de VP1-3A (FIG. 4B) y células T CD8+ IFN-Y+ (FIG. 4A) de cada grupo con (barras grises) o sin (barras negras) estimulación por el péptido VP1-3A. Los resultados indicaron que los ratones que habían sido vacunados con PE313-VPI-3A-NESK tenían más células T CD4+ IFN-Y+ y CD8+ IFN-Y+ específicas de VP1-3A estimuladas por el péptido VP1-3A que los ratones que habían sido vacunados con el grupo PE407-VP1-3A-K3.
Ejemplo 6
Ensayo de inmunogenicidad de vacunas de subunidad de NDV
Usando el mismo esquema de inmunización y dosificación, los ratones se vacunaron con vacunas de subunidad de FMDV que contenían PE313-FHN-NESK o PE407-FHN-K3, y los esplenocitos se aislaron, cultivaron y ensayaron mediante un método de citometría de flujo como el descrito anteriormente, excepto que se añadió proteína FHN recombinante para estimular los esplenocitos en el cultivo.
Las Figuras 5A-B muestran los números de células T IFN-y positivas para CD8 y CD4 en los esplenocitos de ratones vacunados con un placebo o proteínas de fusión. La producción de IFN-y por las células T CD4+ y CD8+ en los esplenocitos estimulados con FHN se detectó mediante tinción intracelular mediante citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran los números de células T IFN-Y+ CD4+ (FIG. 5B) y células T IFN-Y+ CD8+ (FIG. 5A) específicas de FHN de cada grupo con (barras grises) o sin (barras negras) la estimulación mediante el péptido FUN. Los resultados indicaron que los ratones que habían sido vacunados con PE313-FHN-NESK tenían más células T CD4+ IFN-Y+ y CD8+ IFN-Y+ específicas de FHN estimuladas por el péptido FHN que los ratones que habían sido vacunados con el grupo PE407-FHN-K3.
Ejemplo 7
Inhibición mejorada del crecimiento tumoral inducida por la proteína E7 del virus del papiloma humano tipo 16. Las proteínas de fusión PE407-E7-K3, RAP1-PE268-313-E7-K3 y RAP1-PE268-313-E7-NESK se expresaron y se replegaron usando métodos similares a los descritos anteriormente. Los ratones se expusieron a 2 x 103 células TC-01 (células epiteliales de pulmón de ratón que albergan el gen E7 del HPV de tipo 16) a través de inyección sc para inducir el carcinoma tipo 16 del HPV. Doce días después de la exposición a las células TC-01, los ratones se vacunaron en forma sc con placebo (PBS), PE407-E7-K3 (100 mg/dosis), RAP1-PE268-313-E7-K3 (100 pg/dosis) o RAP1-PE268-313-E7-NESK (100 pg/dosis) con AS04C (GlaxoSmithKline) como adyuvante una vez por semana durante 3 semanas (FIG.
6). AS04C, que es un adyuvante que mejora los linfocitos T citotóxicos, comprende MPL (lípido A monofosforilo, un potenciador inmunitario) y fosfato de aluminio (una proteína absorbente para la administración de antígenos). El término "K3" se refiere a una secuencia de retención del ER que comprende KDEL. Por ejemplo, K3 puede ser la secuencia de aminoácidos KDELKDELKDEL (SEQ ID NO: 16). El término "NESK" se refiere a un péptido de fusión que comprende una señal de exportación nuclear y una secuencia de retención del ER. En una realización de la invención, la NESK es la secuencia de aminoácidos LQKKLEELELAKDEL (SEQ ID NO: 12). Se registraron el tamaño de los tumores y el número de animales libres de tumores en cada grupo (Figuras 7 y 8). El crecimiento del tumor fue suprimido significativamente por las vacunas PE407-E7-K3, RAP1-PE268-313-E7-K3 y RAP1-PE268-313-E7-NESK con AS04C como adyuvante. Sin embargo, la vacuna RAP1-PE268-313-E7-NESK fue superior a PE407-E7-K3 y mejor que RAP1-PE268 -313-E7-K3 en la supresión del crecimiento tumoral y en el aumento del porcentaje de animales libres de tumores.
Ejemplo 8
Se generan las siguientes proteínas de fusión: PE313-NES-antígeno-K, PE1-252-PE268-313-NES-antígeno-K, PE1-252-PE280-313-NES-antígeno-K. Además, el fragmento del dominio Ia de PE (PE1-252) de la proteína de fusión PE313-antígeno-NESK se reemplaza por el dominio 3 de RAP1 (SEQ ID NO: 8), A2M mínimo (SEQ ID NO: 9), HIV-Tat mínimo (SEQ ID NO: 10) o HSP mínimo (SEQ ID NO: 11) para generar vacunas de las proteínas de fusión del dominio 3 de RAP1-PE253-313-antígeno-NESK, A2M-PE253-313-antígeno-NESK, Tat-PE253-313-antígeno-NESK y HSP-PE253-313-antígeno-NESK, dominio 3 de RAP1-PE268-313-antígeno-NESK, A2M-PE268-313-antígeno-NESK, Tat-PE268-313-antígeno-NESKy HSP-PE268-313-antígeno-NESK, dominio S de RAP1-PE280-313-antígeno-NESK, A2M-PE280-313-antígeno-NESK, Tat-PE280 -313-antígeno-NESK y HSP-PE280-313-antígeno-NESK, respectivamente. Vacunas de RAP1 dominio 3-PE253-313-NES-antígeno-K, A2M-PE253-313-NES-antígeno-K, Tat-PE253-313-NES-antígeno-K y HSP-PE253-313-NES-antígeno-K, vacunas de RAP1 dominio 3-PE268-313-NES-antígeno-K, A2M-PE268-313-NES-antígeno-K, Tat-PE268-313-NES-antígeno-K y HSP-PE268-313-NES-antígeno-K, dominio 3 de RAP1-PE280-313-NES-antígeno-K, A2M-PE280-313-NES-antígeno-K, Tat-PE280 -313-NES-antígeno-K y HSP-PE280-313-NES-antígeno-K. Las respuestas inmunitarias mediadas por células mejoradas por estas vacunas se examinan utilizando métodos similares a los descritos anteriormente.
La Tabla 1 muestra las SEQ ID NOs. de péptidos utilizados para la fabricación de diversas proteínas de fusión.
Tabla 1
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende:
(a) un dominio de unión a células presentadoras de antígeno (APC) o un dominio de unión al receptor CD91 que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1 y 8-11, ubicado en el N-terminal de la proteína de fusión;
(b) un péptido de translocación de 34-112 residuos de aminoácidos de longitud, que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2, 3 o 6, ubicada en el C-terminal del dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91; y
(c) un antígeno de un patógeno;
(d) una señal de exportación nuclear, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y (e) una secuencia de retención del retículo endoplásmico de cuatro residuos de aminoácidos de longitud, ubicada en el C-terminal de la proteína de fusión; en donde la señal de exportación nuclear está localizada entre el antígeno y la secuencia de retención del retículo endoplásmico, o entre el péptido de translocación y el antígeno.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, 8, 9, 10 u 11.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la señal de exportación nuclear comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la secuencia de retención del retículo endoplásmico consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
5. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la señal de exportación nuclear se encuentra entre el péptido de translocación y el antígeno.
6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la señal de exportación nuclear está localizada entre el antígeno y la secuencia de retención del retículo endoplasmático.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la señal de exportación nuclear y la secuencia de retención del ER forman un péptido de fusión que consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido de translocación tiene 34-61 residuos de aminoácidos de longitud.
9. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 está libre de la secuencia de aminoácidos del dominio I de unión de la exotoxina A de Pseudomonas (PE).
10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, en la que el dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
11. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la APC o el dominio de unión al receptor CD91 es la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos del péptido de translocación es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2 o 3.
12. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el antígeno es un antígeno de fusión de dos o más péptidos antigénicos de un patógeno.
13. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el péptido de translocación tiene una longitud de 34-61 residuos de aminoácidos y consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 4, 2 o 3.
14. Una composición de vacuna que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 1 y un adyuvante.
15. Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para uso en el tratamiento de infecciones induciendo respuestas mejoradas de células T específicas del antígeno patógeno.
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