KR102507298B1 - 면역증강을 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 COVID-19 바이러스 유래의 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 COVID-19 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 또는 S2 단백질과 S2 단백질의 ECD(extracellular domain)를 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 전술한 조성물에 S100A9 단백질이 추가된 면역증강을 위한 조성물에 관한 것이다.

Description

면역증강을 위한 조성물{Composition for enhancing immunity}

본 발명은 면역증강을 위한 조성물에 관한 것으로서 보다 상세하게는 COVID-19 바이러스 유래의 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물에 관한 것이다.

면역기능은 크게 ① 저하된 면역의 증강을 목적으로 하는 것과 ② 민감해진 면역반응(알레르기)을 조절해주는 것 등 두 가지로 분류된다. 즉, 면역관련 각종 식약품들은 면역증진(Immunity; 면역능, 면역항원, 항감염, 면역증강)용과 면역관용(Tolerance; 알레르기개선, 항염증, 과대면역개선, 과민면역개선)용으로 구분된다.

면역학적 관점에서 본다면 질병은 면역 시스템 항상성의 불균형에 의해 나타나는 결과물이다. 예를 들어 면역반응에 비해 면역관용 기작이 강해질 경우 면역계는 암의 발생이나 외부 바이러스 병원성 균 등의 침입이 용이하게 되어 암 또는 바이러스 및 세균성 질환을 발생시키게 된다.

WO 2014/089036은 인간 파필로마바이러스(Human Papillomavirus; HPV)의 병원균의 항원과 바이러스 특정 단백질의 융합 단백질이 병원균 항원-특이적인 T 세포 반응을 유도한다는 점에 착안한 항원-특이적인 T 세포 반응을 유도하는 면역 강화제로서의 사용을 위한 융합 단백질에 관한 것이다.

등록특허 10-2099366은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(PRRSV)의 Nsp1단백질이 대식세포의 식세포 작용을 증진시킨다는 사실을 확인하고, 바이러스 Nsp1단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제시하고 있다.

한편, 코로나바이러스감염증-19(코로나19, coronavirus disease 2019, COVID-19)는 SARS-CoV-2 바이러스(코로나19 바이러스)에 의해 발생하는 동물 기원의 바이러스성 호흡기 질환이다. 이 질병은 2019년 12월 처음 발견되어 2020년 12월 현재 전세계 7천만명 이상이 확진되고 160만명 이상이 사망하는 등 전세계적인 팬데믹을 초래하고 있다.

만일 코로나19 바이러스의 게놈이 아닌 바이러스 단백질이 면역강화 효과가 있다면 그 자체로도 유용할 것이며, 나아가 이 단백질이 코로나19에 대한 항원 즉, 백신으로도 작용할 가능성이 있으므로 매우 의미가 있을 것이다. 그러나 현재까지 코로나19 바이러스의 단백질이 인체에서 면역증진 효과가 있는지 여부는 확인된 바 없다.

WO 2014/089036 등록특허 10-2099366

본 발명은 저하된 면역기능을 증진시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 COVID-19 바이러스 유래의 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 COVID-19 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 또는 S2 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물인 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게, 본 발명은 COVID-19 바이러스의 S2 단백질의 ECD(extracellular domain)를 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 전술한 조성물에 S100A9 단백질이 추가된 면역증강을 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 COVID-19 바이러스의 단백질을 적절하게 처방함으로써 면역 증진효과를 얻을 수 있게 된다.

또한 본 발명에 의하면 COVID-19 바이러스의 단백질을 사용하기 때문에 면역증강 효과 뿐만 아니라 COVID-19 바이러스에 대한 백신의 역할도 기대할 수 있게 된다.

도 1은 COVID-19 바이러스의 스파이크 당단백질의 구성을 보여주는 개략도.
도 2a~4b는 각 처리구에서 특정 면역관련 인자들의 발현량을 비교한 그래프.
도 5는 S2구의 면역 블롯 분석 결과 사진.
도 6은 S2구와 S2+구S에서 IL1B의 RT-qPCR 결과 그래프.

이하 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

발명자들은 COVID-19 바이러스 연구과정에서 이 바이러스의 단백질이 인간 면역세포를 활성화할 수 있을 것으로 보이는 실험결과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

전술하였듯이 본 발명은, COVID-19 바이러스 유래의 단백질, 바람직하게는 COVID-19 바이러스의 뉴클레오캡시드(NC) 단백질 또는 S2 단백질, 보다 바람직하게는 COVID-19 바이러스의 S2 단백질의 ECD를 유효성분으로 하는 면역증강을 위한 조성물에 관한 것이다. 전술한 조성물에 S100A9 단백질이 추가되면 더욱 좋다.

본 발명에서 상기 단백질들의 면역증강 효과는 아래 실시예에서 확인할 수 있다.

COVID-19 바이러스 (=SARS-CoV-2)는 Coronaviridae과의 Coronavirinae 아과에 속한다.

캡시드(capsid)는 바이러스 게놈을 둘러싸고 있는 단백질 껍질을 의미한다. 캡시드는 바이러스의 유전체를 외부의 핵산 분해 효소 등으로부터 보호하며, 숙주 세포막의 수용체에 잘 부착할 수 있도록 돕기도 한다. 캡시드는 바이러스가 세포에 침입한 후 세포 또는 바이러스 자신의 효소에 의해 제거된다. 바이러스 게놈과 캡시드의 복합체를 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)라고 하는데, 본 발명에서는 증식과 감염에 작용하는 바이러스 게놈이 제거된 뉴클레오캡시드 단백질을 유효물질로 한다.

스파이크(spike) 단백질은 바이러스가 숙주세포 속으로 들어갈 때 중요한 역할을 하는 단백질이다. 캡시드에 배열돼 있는 돌기상(突起狀) 구조물인데 길이는 10~15nm로 세포막에 있는 단백질 수용체와 결합해 세포에 침투되도록 한다. COVID-19 바이러스의 스파이크 당단백질은 S1/S2 서브유닛, 서브유닛 사이의 단백질분해효소인 '퓨린'과 유사한 분절 부위(furin-like cleavage site) 및 수용체 결합 도메인(receptor binding domain; RBD)으로 구성되어 있는데, S2 서브유닛는 바이러스가 숙주세포에 부착되었을 때 세포 외부에 위치하는 도메인(extracellular domain; ECD)을 가지고 있다(도 1 참조). 본 발명에서는 S2 단백질 또는 S2 단백질의 ECD를 유효성분으로 한다.

S100A9 단백질은, 염증 매개체인 알라민 및 TLR4의 리간드 중 하나로서 이동방지요소관련 단백질 14 (MRP14) 또는 칼그래뉼린 B (calgranulin B)로 알려진 칼슘 결합 단백질이다. S100A8과 함께 칼프로텍틴(calprotectin)이라는 이종다이머를 형성한다.

[실시예]

1. 세포, 재조합 단백질의 준비 및 처리

종래 알려진 프로토콜에 따라 Ficoll-Hypaque (Lymphoprep; Alere Technologies, 노르웨이 오슬로)를 사용하여 건강한 지원자의 헤파린화된 정맥혈에서 인간 말초 혈액 단핵세포 (PBMC; peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다.

단핵구 유래 대식세포 (MDM; monocyte-derived macrophage) 분화를 위해 부착성 단핵구를 5 % 풀링된 인간 혈청 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1 % L- 글루타민을 함유하는 Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (Lonza, Basel, 스위스)에서 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후 비부착성 세포를 제거하였다.

Sino Biological (Beijing, China)로부터 아래 표와 같은 COVID-19 바이러스의 재조합 단백질을 구입하였다.

각 단백질의 염기서열은 이미 알려져 있어 예를 들면 아래의 사이트에서 확인할 수 있다.

https://kr.sinobiological.com/research/virus/2019-ncov-antigen

전술한 NC, S1, S2 ECD 또는 RBD 재조합 단백질을 인간 1차 PBMC와 MDM에 각각 2 μg / mL, 6 μg / mL농도로 6시간 처리하였다(아래 표 참조).

2. 처리 결과의 분석

통상의 RT-qPCR 분석(도 2a~4b), 면역 블롯 분석(도 5), ELISA 분석 등을 통해 각 처리구에서 면역반응과 관련된 cytokines/chemokines의 발현과 및 NF-κB 시그날 작용이 유도되었는지를 확인하였다. 도 2a, 3a, 4a, 5 및 6은 PBMC 처리구들에 대한 결과이고, 도 2b, 3b 및 4b는 MDM 처리구들에 대한 결과이다.

첨부된 도 2a~4b에서 확인되듯이, PBMC와 MDM 모두에 대한 NC 및 S2 처리구에서 대부분의 면역관련 인자들의 발현이 유의하게 증가되었으나 S1 및 RBD 처리구에서는 면역관련 인자들의 발현 변화가 거의 나타나지 않는 유사한 결과를 나타내었다.

P-S2 처리구 (S2 ECD 2 μg/mL로 처리된 인간 1차 PBMC)에서 phospho-p65 (NF-κB)의 면역 블롯 분석 결과를 도 5에, S2 처리구와 S2+처리구(S2와 S100A9를 동시에 처리한 구)에서 IL1B의 RT-qPCR 결과를 도 6에 도시하였다.

도면에서 볼 수 있듯이, S2 단백질은 인간 PBMC에서 30 분 이내에 NF-κB 신호 전달 활성화를 유발하였다. 나아가 재조합 S100A9와 S2 단백질이 동시 처리되는 경우(S2+구) S2 단백질 또는 S100A9 단독으로 자극된 것과 비교하여 PBMC에서 IL1B mRNA 발현을 유의하게 유도하였다.

이상의 결과들에서 COVID-19 바이러스의 NC 및 스파이크 단백질 S2 ECD가 면역반응 및 NF-κB 신호전달 활성화를 유발할 수 있으며 S100A9가 인간 PBMC에서 면역신호 활성화의 양성 피드포워드 루프에서 매개체 역할을 할 수 있음을 강력하게 시사한다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 삭제
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4. COVID-19 바이러스 S2 단백질의 ECD(extracellular domain)과 S100A9 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역증강을 위한 조성물.

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