ES2693572T3 - Vacuna peptídica de PCSK9 - Google Patents

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ES2693572T3 ES13756108.0T ES13756108T ES2693572T3 ES 2693572 T3 ES2693572 T3 ES 2693572T3 ES 13756108 T ES13756108 T ES 13756108T ES 2693572 T3 ES2693572 T3 ES 2693572T3
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Gabriele Winsauer
Erika Bilcikova
Claudia Juno
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Abstract

Vacuna que comprende por lo menos un péptido seleccionado de entre el grupo SIPWSLERIT (SEC ID nº 21), VIPWNLERIL (SEC ID nº 55) y SVPWNLERIQ (SEC ID nº 60), en la que dicho por lo menos un péptido se acopla o fusiona con un portador farmacéuticamente aceptable.

Description

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DESCRIPCION
Vacuna peptidica de PCSK9.
La presente invencion se refiere a una vacuna apta para inducir la formacion de anticuerpos dirigidos contra PcSk9 in vivo.
La presente invencion se refiere a nuevos peptidos que son aptos para influir en la degradacion mediada por proprotema convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) del receptor de lipoprotema de baja densidad (LDL) (LDLR). Los peptidos estan acoplados con un portador inmunogeno y formulados en una vacuna para la prevencion y/o el tratamiento de trastornos de la salud relacionados con PCSK9 causados por hiperlipidemia, hipercolesterolemia o ateroesclerosis.
Una de las causas principales de muerte en todo el mundo son las enfermedades cardiovasculares (ECV). Se asocian a estas enfermedades factores tales como la hiperlipidemia, hipercolesterolemia, hipertension y ateroesclerosis. En estudios epidemiologicos exhaustivos, ha podido demostrarse una correlacion positiva entre el nivel serico de colesterol y la incidencia de ECV. Los niveles elevados de colesterol-LDL (LDLc) constituyen un riesgo cardiovascular elevado y se correlacionan directamente con un riesgo incrementado de ateroesclerosis.
El LDLR, principalmente el LDLR hepatico, es la ruta primaria para la eliminacion del LDLc del plasma. El LDLc circulante se une al LDLR y el complejo formado es internalizado por endocitosis mediada por clatrina. Despues, mientras el LDLc es dirigido a su degradacion, el LDLR se recicla de vuelta a la superficie celular.
PCSK9 es una serina proteasa secretada que se une a LDLR y fomenta la degradacion del mismo. Se descubrio en 2003 que era el tercer locus genico asociado a hipercolesterolemia dominante autosomica (ADH) La "mutaciones de ganancia de funcion" (GOF) de PCSK9 potencian su interaccion con el LDLR y resultan en una reduccion de los niveles de LDLR y en niveles de LDLc marcadamente mas elevados. En consecuencia, las GOF se asocian a hipercolesterolemia y a predisposicion a ateroesclerosis. A la inversa, las "mutaciones de perdida de funcion" (LOF) conducen a niveles incrementados de LDLR y drasticamente reducidos de LDLc, con una reduccion consecuente del riesgo de enfermedad cardiaca coronaria (CHD). El PCSK9 humano se expresa principalmente en Idgado, intestino y rinon. Se sintetiza en forma de una protema de ~72 kDa que experimenta corte autocatalftico antes de secretarse en forma de una protema madura de ~65 kDa.
El PCSK9 circulante se une espedficamente al dominio EGF-A del LDLR. El complejo es internalizado mediante endocitosis y en lugar de reciclar el LDLR de vuelta a la superficie celular, el LDLR es consecuentemente degradado en los lisosomas. El efecto neto de la interaccion PCSK9-LDLR es la reduccion del LDLR disponible para la eliminacion de LDLc del plasma, lo que indica la importancia de PCSK9 como regulador del LDLR y, de esta manera, del metabolismo del LDLc.
Varios estudios animales han demostrado el papel esencial de PCSK9 como regulador de los niveles de LDLc. La sobreexpresion adenovmca de PCSK9 en ratones ha conducido a un incremento significativo de LDLc circulante. En contraste, los ratones PCSK9-/- muestran un incremento de 2,8 veces de los niveles de LDLR y una reduccion de LDLc a ~50% respecto a animales de tipo salvaje. Las mutaciones GOF y PDF indican el papel importante de PCSK9 en la regulacion del metabolismo de LDL en el ser humano, convirtiendo a PCSK9 en una diana atractiva para la intervencion farmacologica. Especialmente, el ser humano heterocigotico para mutaciones de PDF en PCSK9 aparentemente son sanos y presentan una esperanza de vida normal. Ademas, un heterocigoto compuesto con dos mutaciones inactivadoras de PCSK9 y sin PCSK9 circulante se ha informado de que es una madre afroamericana de 31 anos sana con niveles muy bajos de LDLc (14 a 34 mg/dl).
Se han sometido a ensayo con exito preclmica y clmicamente varios compuestos que reducen el nivel circulante de PCSK9 o que inhiben su interaccion con el LDLR (tales como anticuerpos monoclonales, oligonucleotidos antisentido o inhibidores de la autocatalisis). Aunque PCSK9 actua intracelular y extracelularmente sobre LDLR, utilizar como diana el PCSK9 circulante es un enfoque valioso para terapeuticos de reduccion del nivel de LDLc. Los experimentos de parabiosis en ratones, asf como la administracion de protema recombinante han indicado que el PCSK9 extracelular resulta suficiente para reducir el numero de LDLR hepaticos. Mas importante, los resultados de estudios clmicos humanos con anticuerpos monoclonales (mAb) espedficos de PCSK9 indican que utilizar PCSK9 como diana permite una reduccion eficiente y segura del LDLc. Ademas, se han finalizado con exito varios ensayos clmicos para evaluar la seguridad y eficacia del uso de PCSK9 como diana.
Los documentos WO 2013/037889 A2, WO 2012/059573 A1 y WO 2011/027257 A2 dan a conocer fragmentos del polipeptido PCSK9 como vacunas. Li et al. (Rec. Pat. DNA & Gene Seq. 3:201-212, 2009), Genest (
http://www.acclakelouise.com/downloads/slides/2012/1_Sunday/Sunday_03_Genest_New_Lipids_Rx.pdf) y Wierzbicki et al. (Exp. Op. Invest. Drugs 21:667-676, 2012) informan de recientes desarrollos en la inhibicion de PCSK9 para el tratamiento de la hiperlipidemia.
En resumen, PCSK9 es un regulador importante del LDLR y, de esta manera, de los niveles de LDLc. Aunque las
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estatinas representan la primera lmea de intervencion para el control del colesterol, las estatinas no resultan suficientes o apropiadas en determinados sujetos para conseguir los objetivos. Ademas, se encontro que PCSK9 se encuentra regulada positivamente por estatinas, contrarrestando su efecto farmacologico. De acuerdo con lo anterior, la identificacion de medicacion adicional o alternativa para controlar los niveles de LDLc resulta de gran importancia. La inhibicion de PCSK9 se espera que reduzca el LDLc plasmatico como monoterapia, aunque tambien que potencie el efecto reductor del colesterol de las estatinas o de otras sustancias (tales como, por ejemplo, los fibratos o el acido nicotmico).
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar medios y metodos para reducir el LDLc en un individuo. Este objetivo puede conseguirse proporcionando peptidos que imitan la secuencia nativa respectiva, denominados mimotopos. Tales mimotopos son capaces de inducir anticuerpos que se unen espedficamente a PCSK9 humano e inhiben la degradacion mediada por PCSK9 del LDLR.
Por lo tanto, la presente invencion se define segun las reivindicaciones.
Se da a conocer ademas una vacuna, composicion de vacuna o composicion que comprende por lo menos un peptido que consiste en 9 a 25 residuos aminoacidos con la secuencia de aminoacidos:
XiX2X3WX4X5X6RX7 (Xa)m(Xg)n, (SEC ID n° 1)
en la que:
Xi es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de residuos aminoacidos no cargados, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en serina, treonina, valina y alanina,
X2 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de los residuos aminoacidos no cargados, preferentemente seleccionado de entre el grupo de isoleucina, valina, glicina, glutamina y alanina, mas preferentemente isoleucina, valina, glutamina y alanina.
X3 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de residuos aminoacidos no cargados, preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en prolina, treonina, alanina y valina, mas preferentemente prolina,
X4 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo que consiste en asparagina, serina, alanina, glutamina y acido aspartico,
X5 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo que consiste en leucina, glicina, alanina, tirosina, acido aspartico, fenilalanina y valina, preferentemente leucina,
X6 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de residuos aminoacidos cargados negativamente hidrofilos, preferentemente un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo que consiste en acido glutamico y acido aspartico,
X7 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de residuos aminoacidos no cargados, preferentemente seleccionados de entre el grupo que consiste en isoleucina, leucina, alanina y treonina,
X8 es un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de residuos aminoacidos no cargados seleccionados de entre el grupo que consiste en treonina, leucina, glutamina, alanina y serina,
Xg es X10X11X12 o un fragmento truncado C-terminal del mismo que consiste en 1 o 2 residuos aminoacidos,
X10 es cualquier residuo aminoacido, preferentemente un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de los residuos aminoacidos no cargados, preferentemente seleccionados de entre el grupo que consiste en prolina, alanina y serina,
X11 es cualquier residuo aminoacido, preferentemente un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo de residuos aminoacidos no cargados, preferentemente seleccionados de entre el grupo que consiste en prolina, alanina, valina, treonina y asparagina,
X12 es cualquier residuo aminoacido, preferentemente un residuo aminoacido seleccionado de entre el grupo que consiste en arginina, alanina, lisina, serina y leucina,
m es 0 o 1;
n es 0 o 1, y
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SEC ID n° 1 no es SIPWNLERITPPR o un fragmento truncado C-terminal del mismo,
en el que dicho peptido o peptidos se acoplan o se fusionan con un portador farmaceuticamente aceptable.
La vacunacion de individuos con los peptidos de la presente invencion conduce a la produccion de anticuerpos policlonales que se unen a PCSK9. Tales anticuerpos son capaces de competir con la union de LDLR. En consecuencia, se incrementan los niveles hepaticos de LDLR y se reducen los de LDLc y colesterol total plasmaticos. Por lo tanto, la administracion de una vacuna segun la presente invencion permite tratar o prevenir enfermedades causadas por hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis.
Los peptidos de la presente invencion son los denominados mimotopos. Los mimotopos presentan una secuencia de aminoacidos que es diferente de la secuencia de protema/peptido original a partir de la que se derivaron. Estos mimotopos son considerados foraneos por el sistema inmunologico y, por lo tanto, no necesitan romper la autotolerancia.
Los peptidos de la presente invencion son variantes (intercambios de aminoacidos y truncados opcionales) del fragmento de PcSk9 que presenta la secuencia de aminoacidos SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2). Inesperadamente resulto que una modificacion (p.ej., una mutacion) del residuo triptofano en la posicion 4 de la SEC ID n° 2 y del residuo arginina en la posicion 8 de la SEC ID n° 2 resulta en la formacion de anticuerpos que no pueden unirse suficientemente a PCKS9.
Las nuevas secuencias pepffdicas segun la presente invencion, en caso de acoplarse o fusionarse con un portador farmaceuticamente aceptable y formularse como vacunas, son capaces de inducir la formacion de anticuerpos dirigidos contra PCSK9 y, por lo tanto, de modificar beneficiosamente la degradacion de LDLR mediada por PCSK9 y, de esta manera, de reducir a continuacion los niveles plasmaticos de LDLc. Los peptidos definidos con la presente invencion tambien consiguen resultados inesperadamente superiores de reduccion de los niveles de colesterol total en comparacion con las secuencias de PCSK9 nativas, incluso en comparacion con las dadas a conocer en los documentos WO 2012/059573 A1 y WO 2011/027257 A2. Ello se muestra adicionalmente en la seccion de ejemplos de la presente solicitud mediante la utilizacion de un modelo animal representativo.
Se da a conocer ademas un peptido segun la SEC ID n° 1 con una longitud de 9 a 13 residuos aminoacidos (es decir, en la que no se encuentra presente X12 y en la que m=1, o en la que m=0 y X10 es prolina, alanina y serina, y X11 es prolina, alanina, valina, treonina y asparagina, y X12 es arginina, alanina, lisina, serina y leucina).
Se da a conocer ademas una vacuna que comprende por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5 o por lo menos 10 peptidos con la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 1 tal como se define en la presente memoria. La vacuna segun la presente invencion puede comprender una combinacion de dos o mas peptidos tal como se da a conocer en la presente memoria. Sin embargo, tambien resulta posible que una vacuna tal como se da a conocer en la presente memoria comprenda uno o mas peptidos dados a conocer en la presente memoria, tal como segun la SEC ID n° 1 y tal como se define en la presente memoria tambien otros peptidos, tales como mimotopos (es decir, mutantes de fragmentos de PCSK9) o fragmentos de PCSK9 (ver, por ejemplo, el documento WO 2011/027257). Son fragmentos particularmente preferentes de PCSK9, fragmentos de SIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEV, en particular SIPWNLERIT, SIPWNLERI, SIPWNLERITPPR, SIPWNLERITPP o SIPWNLERITP.
Los peptidos de la presente invencion pueden sintetizarse qmmicamente mediante metodos que son bien conocidos de la tecnica. Evidentemente tambien resulta posible producir los peptidos de la presente invencion utilizando metodos recombinantes. Los peptidos pueden producirse en microorganismos, tales como bacterias, levaduras u hongos; en celulas eucarioticas, tales como celulas de mairnfero o insecto, o en un vector vmco recombinante, tal como adenovirus, poxvirus, herpesvirus, virus del bosque de Simliki. Baculovirus, bacteriofagos, virus sindbis o virus Sendai. Entre las bacterias adecuadas para producir los peptidos se incluyen E. coli, B. subtilis o cualquier otra bacteria que sea capaz de expresar tales peptidos. Entre las celulas de levadura adecuadas para expresar los peptidos de la presente invencion se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar peptidos. Los medios y metodos correspondientes son bien conocidos de la tecnica. Tambien los metodos para aislar y purificar peptidos producidos recombinantemente son bien conocidos de la tecnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la filtracion en gel, la cromatograffa de afinidad, la cromatograffa de intercambio ionico, etc.
Con el fin de facilitar el aislamiento de los peptidos de la presente invencion, pueden generarse polipeptidos de fusion, en donde los peptidos se fusionan traduccionalmente (se unen covalentemente) a un polipeptido heterologo que permite el aislamiento mediante cromatograffa de afinidad. Los polipeptidos heterologos ffpicos son la etiqueta de His (por ejemplo, His6: 6 residuos de histidina), etiqueta GST (glutation-S-transferasa), etc. El polipeptido de fusion facilita no solo la purificacion de los peptidos sino que tambien evita la degradacion de los peptidos durante las etapas de purificacion. En el caso de que se desee el polipeptido heterologo despues de la purificacion, el polipeptido de fusion puede comprender un sitio de corte en la union entre el peptido y el
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polipeptido heterologo. El sitio de corte puede consistir en una secuencia de aminoacidos que se corta con un enzima espedfico para la secuencia de aminoacidos en el sitio (p.ej., proteasas).
La vacuna y los peptidos de la presente invencion pueden administrarse en cualquier tipo de mairnfero, incluyendo seres humanos. Sin embargo, resulta preferente administrar la vacuna y los peptidos de la presente invencion en seres humanos.
Segun una forma de realizacion preferida de SEC ID n° 1, X1 es valina, serina, treonina o alanina, preferentemente valina.
Segun una forma de realizacion preferida adicional de SEC ID n° 1, X2 es valina, alanina, isoleucina o glutamina, preferentemente valina.
Segun una forma de realizacion preferida de SEC ID n° 1, X3 es prolina, treonina, alanina o valina.
X4 de SEC ID n° 1 es preferentemente serina o asparagina, preferentemente serina.
Segun una forma de realizacion preferida de SEC ID n° 1, X6 es acido glutamico.
X7 es preferentemente leucina, isoleucina o treonina, preferentemente treonina.
X8 es preferentemente glutamina, treonina o leucina.
Segun una forma de realizacion preferida de SEC ID n° 1, X1X2X3 se selecciona del grupo que consiste en TIP, VIP, AIP, SVP, SQP, SAP, SGP, SIT, SIA, SIV y VQP.
Segun una forma de realizacion preferida adicional de SEC ID n° 1, X4X5X6 se selecciona del grupo que consiste en SLE, ALE, QLE, DLE, NAE, NGE, NYE, NDE, NFE, NVE y NLD.
X7(X8)m, donde m es 1, preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste en LT, TT, AT, IL, IQ, IA, IS, TL, LQ y LL.
Segun una forma de realizacion preferida de SEC ID n° 1, X9 se selecciona del grupo que consiste en PPR, PP, P, APR, SPR, PAR, PVR, PTR, PNR, PPA, PPK, PPS y PPL.
Segun una forma de realizacion particularmente preferida de SEC ID n° 1, el peptido o peptidos se seleccionan del grupo que consiste en TIPWNLERIT, TIPWNLERITPPR, VIPWNLERIT, VIPWNLERITPPR, AIPWNLERIT, AIPWNLERITPPR, SVPWNLERIT, SVPWNLERITPPR, SQPWNLERIT, SQPWNLERITPPR, SAPWNLERIT, SAPWNLERITPPR, SGPWNLERITPPR, SGPWNLERIT, SITWNLERIT, SITWNLERITPPR, SIAWNLERIT, SIAWNLERITPPR, SIVWNLERITPPR, SIVWNLERIT, SIPWSLERIT, SIPWSLERITPPR, SIPWALERIT,
SIPWALERITPPR, SIPWQLERITPPR, SIPWQLERIT, SIPWDLERITPPR, SIPWDLERIT, SIPWNAERIT,
SIPWNAERITPPR, SIPWNGERIT, SIPWNGERITPPR, SIPWNYERIT, SIPWNYERITPPR, SIPWNDERIT,
SIPWNDERITPPR, SIPWNFERITPPR, SIPWNVERITPPR, SIPWNLDRITPPR, SIPWNFERIT, SIPWNVERIT, SIPWNLDRIT, SIPWNLERLT, SIPWNLERLTPPR, SIPWNLERTT, SIPWNLERTTPPR, SIPWNLERAT, SIPWNLERATPPR, SIPWNLERIL, SIPWNLERILPPR, SIPWNLERIQ, SIPWNLERIQPPR, SIPWNLERIA,
SIPWNLERIAPPR, SIPWNLERISPPR, SIPWNLERIS, SIPWNLERITAPR, SIPWNLERITSPR, SIPWNLERITPAR, SIPWNLERITPVR, SIPWNLERITPTR, SIPWNLERITPNR, SIPWNLERITPPA, SIPWNLERITPPK,
SIPWNLERITPPS, SIPWNLERITPPL, VIPWNLERLT, VIPWNLERLTPPR, VIPWNLERTT, VIPWNLERTTPPR, VIPWNLERIL, VIPWNLERILPPR, VIPWNLERIQ, VIPWNLERIQPPR, SVPWNLERLT, SVPWNLERLTPPR, SVPWNLERTT, SVPWNLERTTPPR, SVPWNLERIL, SVPWNLERILPPR, SVPWNLERIQ, SVPWNLERIQPPR, SIPWSLERTTPPR, SQPWNLERLT, SQPWNLERLTPPR, SQPWNLERIL, SQPWNLERILPPR, SQPWNLERIQ, SQPWNLERIQPPR, SIPWSLERLT, SIPWSLERLTPPR, SIPWSLERTT, SIPWSLERIL, SIPWSLERILPPR, SIPWSLERIQ, SIPWSLERIQPPR, VQPWSLERTL, VQPWSLERTLPPR, SQPWSLERTL, SQPWSLERTLPPR, VQPWNLERLQ, VQPWNLERLQPPR, VQPWSLERLL, VQPWSLERLLPPR, SVPWSLERLT y
SVPWSLERLTPPR.
Tabla A: residuos aminoacidos
Aminoacido
Codigo de tres letras Codigo de una letra
alanina
ala A
arginina
arg R
asparagina
asn N
acido aspartico
asp D
cistema
cys C
acido glutamico
glu E
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Aminoacido
Codigo de tres letras Codigo de una letra
glutamina
gln Q
glicina
gly G
histidina
his H
isoleucina
ile I
leucina
leu L
lisina
lys K
metionina
met M
fenilalanina
phe F
prolina
pro P
serina
ser S
treonina
thr T
triptofano
trp W
tirosina
tyr Y
valina
val V
Segun una forma de realizacion particularmente preferida, por lo menos un peptido (SEC ID n° 1) comprendido en la vacuna de la presente invencion comprende en su extremo N-terminal y/o C-terminal por lo menos un residuo de cistema unido directamente o mediante un espaciador a la misma.
Este residuo de cistema puede servir como grupo reactivo para unir el peptido a otra molecula o a un portador. Por ejemplo, este grupo puede utilizarse para unir el peptido a una protema portadora. El residuo de cistema puede unirse directamente a los peptidos de la presente invencion o mediante una secuencia espaciadora. La secuencia espaciadora comprende preferentemente por lo menos un, preferentemente por lo menos dos, mas preferentemente por lo menos tres, todavfa mas preferentemente por lo menos cuatro y opcionalmente un maximo de diez, preferentemente un maximo de cinco residuos aminoacidos no polares pequenos, tal como glicinas.
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el portador se selecciona del grupo que consiste en hemocianina de lapa americana (KLH, por sus siglas en ingles), CRM (preferentemente CRM197), toxoide tetanico (TT), toxina difterica (TD), protema D o cualquier otra protema o peptido que contiene epttopos de celulas T ayudantes.
Segun la presente invencion, los peptidos SEC ID n° 21, 55 y 60 se acoplan o se fusionan con un portador farmaceuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa americana), CRM, toxoide tetanico, protema de union a albumina, albumina de suero bovino, un dendnmero, conectores peptfdicos (o regiones flanqueantes) y puede contener sustancias adyuvantes descritas en Singh et al. (Singh et al., Nat. Biotech. 17:1075-1081, 1999 (en particular aquellos en la Tabla 1 de dicho documento) y O'Hagan et al. (O'Hagan and Valiante, Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9): 727-735, 2003 (en particular los compuestos inmunopotenciadores y sistemas de administracion endogenos indicados en dicha referencia) o mezclas de los mismos. La reaccion de conjugacion (por ejemplo Mediante compuestos heterobifuncionales, tales como GMB y, evidentemente, tambien otros tal como se indica en "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson) en este contexto pueden seleccionarse de entre las reacciones conocidas por el experto en la materia.
Alternativamente, tambien resulta posible fusionar el peptido o peptidos de la presente invencion con un portador protema mediante metodos conocidos de la tecnica. Tales protemas comprenden un peptido tal como se indica en la presente memoria junto con una protema inmunogena no relacionada. Preferentemente, la protema inmunogena es aptar para inducir una respuesta de recuerdo. Entre los ejemplos de tales protemas se incluyen las protemas del tetanos, de la tuberculosis y de la hepatitis, y la protema D, una protema de superficie de la bacteria Gram-negativa Haemophilus influenza B (documento n° WO 91/18926). Preferentemente, se utiliza un derivado de la protema D que comprende aproximadamente el primer tercio de la protema (p.ej., los primeros 100 a 110 aminoacidos N-terminales) y que puede lipidarse. Otro portador que puede utilizarse para proporcionar protemas de fusion puede ser la protema conocida como LYTA, o una parte de la misma (preferentemente una parte C-terminal). LYTA se deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43:265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada espedficamente determinados enlaces en el esqueleto peptidoglicano. En una forma de realizacion preferente, una parte repetida de LYTA puede incorporarse en una protema de fusion. Una parte repetida se encuentra en la region C-terminal que se inicia en el residuo 178. Una parte repetida particularmente preferente incorpora los residuos 188 a 305.
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, los peptidos segun la presente invencion (SEC ID n° 21, 55 y 60) se formulan con un adyuvante, preferentemente adsorbidos a hidroxido de aluminio.
La vacuna segun la presente invencion puede formularse con un adyuvante, preferentemente una composicion de aluminio de baja solubilidad, en particular hidroxido de aluminio. Evidentemente, tambien pueden utilizarse
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adyuvantes como MF59, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, citoquinas (p.ej., IL-2, IL-12, GM-CSF), saponinas (p.ej., QS21), derivados de MDP, oligonucleotidos CpG, LPS, MPL, polifosfacenos, emulsiones (p.ej., de Freund, SaF), liposomas, virosomas, iscoms, cocleatos, micropartfculas de PLG, partfculas de poloxamero, partfculas de tipo vmco, enterotoxina termolabil (LT), toxina del colera (TC), toxinas mutantes (p.ej., LTK63 y LTR72), micropartfculas y/o liposomas polimerizados.
Los adyuvantes adecuados se encuentran disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, AS01B, AS02A, AS15, AS-2 y derivados de los mismos (GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA); tambien pueden utilizarse como adyuvantes, CWS, TDM, Leif, sales de aluminio, tales como gel de hidroxido de aluminio (alumina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc, una suspension insoluble de tirosina acilada; azucares acilados; polisacaridos derivados cationica o anionicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil- ifpido A y quil-A. Citoquinas, tales como GM-CSF, o interleuquina-2, 7 o 12.
Entre los adyuvantes preferidos para la utilizacion en la induccion de una respuesta predominantemente de tipo Th1 se incluyen, por ejemplo, una combinacion de monofosforil-lfpido A, preferentemente monofosforil lfpido A 3- O-desacilado (3D-MPL), opcionalmente con una sal de aluminio (ver, por ejemplo, Ribi et al., Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxinas, Plenum Publ. Corp., NY, 407-419, 1986; y las patentes n° GB 2122204b, n° GB 2220211 y n° US 4.912.094). Una forma preferente de 3D-MPL es una emulsion con un tamano de partfcula pequeno, con un diametro inferior a 0,2 mm y su metodo de fabricacion se da a conocer en el documento n° WO 94/21292. Se han descrito formulaciones acuosas que comprenden monofosforil lfpido A y un tensioactivo en el documento WO 98/43670. Entre los adyuvantes preferentes ejemplificados se incluyen AS01B (MPL y QS21 en una formulacion de liposomas), 3D-MPL y QS21 en una formulacion de liposomas, AS02A (MPL y QS21 y una emulsion de aceite-en-agua), 3D-MPL y QS21 y una emulsion de aceite-en-agua, y AS 15 Los adyuvantes MPL se dan a conocer en, por ejemplo, las patentes US n° 4.436.727, US n° 4.877.611, US n° 4.866.034 y US n° 4.912.094.
Los oligonucleotidos que contienen CpG (en los que el dinucleotido CpG no esta metilado) tambien inducen una respuesta predominantemente de Th1. CpG es una abreviatura de motivos dinucleotido citosina-guanosina presentes en el ADN. Tales oligonucleotidos son bien conocidos y se describen en, por ejemplo, los documentos WO 96/02555 y WO 99/33488, y en las patentes US n° 6.008.200 y US n° 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras tambien se describen en, por ejemplo, Sato et al., Science 273:352, 1996. CpG formulado en vacunas se administra generalmente libre en solucion junto con antfgeno libre (documento n° Wo 96/02555; McCluskie y Davis, supra) o conjugado covalentemente con un antfgeno (documento n° WO 98/16247) o formulado con un portador, tal como hidroxido de aluminio (antfgeno de superficie de la hepatitis; Davis et al., supra; Brazolot-Millan et al., PNAS USA 95(26):15553-8, 1998). CpG es conocido de la tecnica como adyuvante que puede administrarse por vfas tanto sistemica como de las mucosas (documento WO 96/02555, patente n° Ep 0 468 520; Davis et al., J. Immunol. 160(2):870-876, 1998; McCluskie y Davis, J. Immunol. 161(9):4463-6, 1998).
Otro adyuvante preferido es una saponina o mimetico o derivado de saponina, preferentemente QS21 (Aqila Biopharmaceuticals Inc.), que puede utilizarse solo o en combinacion con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinacion de un monofosforil-lfpido A y derivado de saponina, tal como la combinacion de QS21 y 3D-MPL, tal como se indica en el documento WO 94/00153, o una composicion menos reactogena en la que QS21 se desactiva con colesterol tal como se indica en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferentes comprenden una emulsion de aceite-en-agua y tocoferol. Una formulacion adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsion de aceite-en-agua se describe en el documento WO 95/17210. Entre los adyuvantes de saponina adicionales de utilizacion en la presente invencion se incluyen QS7 (descrito en los documentos WO 96/33739 y WO 96/11711) y QS17 (descrito en la patente US n° 5.057.540 y el documento EP 0 362 279 B1).
Entre otros adyuvantes preferentes se incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCoMs (CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes (p.ej., sBaS-2, AS2', AS2, SBAS-4, o SBAS6, disponibles de GlaxoSmithKline), Detox (Corixa), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros 4- fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGP). Entre los adyuvantes de ejemplo adicionales se incluyen MPL sinteticos y adyuvantes basados en la subunidad B de la toxina Shiga (ver el documento n° WO 2005/112991). Resulta particularmente preferente utilizar hidroxido de aluminio como adyuvante.
La vacuna de la presente invencion puede administrarse por via subcutanea, intramuscular, intradermica, intravenosa (ver, p.ej., "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc., 2004). Segun la via de administracion, el medicamento puede comprender los portadores, adyuvantes y/o excipientes respectivos.
Una vacuna que comprende un peptido de la presente invencion y el portador farmaceuticamente aceptable puede administrarse mediante cualquier modo de aplicacion adecuado, por ejemplo por via intradermica (i.d.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.), intranasal, oral, subcutanea (s.c.), etc., y en cualquier dispositivo de administracion adecuado (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9):727-735, 2003). Los peptidos de
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la presente invencion se formulan preferentemente para la administracion intradermica, subcutanea o intramuscular. Los medios y metodos para obtener las formulaciones respectivas son conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, la vacuna se utiliza en el tratamiento y/o la prevencion de trastornos causados por hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis, preferentemente enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular o enfermedades vasculares perifericas, en particular en mairnferos, preferentemente seres humanos.
Tal como se ha descrito de manera general, los peptidos de la presente invencion son capaces de inducir la formacion de anticuerpos que son capaces de unirse espedficamente a PCSK9. La interaccion de los anticuerpos con PCSK9 conduce al incremento del receptor de lipoprotemas de baja densidad en los hepatocitos del hugado in vivo, a una incorporacion incrementada del colesterol en plasma y la consiguiente reduccion de los niveles plasmaticos de colesterol-LDL y, de esta manera, de los niveles totales de colesterol.
La enfermedad asociada a la ateroesclerosis preferentemente se selecciona del grupo que consiste en enfermedad oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria, insulto cerebral apopletico y accidente cerebrovascular.
La expresion "enfermedades asociadas a hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis" y "trastornos causados por hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis" se refiere a enfermedades que son una consecuencia de hiperlipidemia, hipercolesterolemia y ateroesclerosis. Entre estas enfermedades se incluyen, entre otras, la enfermedad oclusiva arterial periferica y el insulto cerebral apopletico (ver, p.ej., Steinberg D., J. Lipid Res. 46:179-190, 2005 y Steinberg D., J. Lipid Res. 47:1339-1351, 2006).
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, los peptidos de la presente invencion se administran en un marnffero o en un individuo en una cantidad de 0,1 ng a 10 mg, preferentemente de 0,5 a 500 |jg, mas preferentemente de 1 a 100 |jg por cada inmunizacion. En una forma de realizacion preferente, dichas cantidades se refieren a todos los peptidos (en caso de utilizar mas de un peptido en la vacuna) presentes en la vacuna. En otra forma de realizacion preferente, dichas cantidades se refieren a cada fragmento individual presente en la vacuna. Evidentemente resulta posible proporcionar una vacuna en la que los peptidos se encuentran presentes en cantidades diferentes o iguales. Sin embargo, el peptido de la presente invencion puede alternativamente administrarse en un mamffero o individuo en una cantidad de 0,1 ng a 10 mg, preferentemente de 10 ng a 1 mg, en particular de 100 ng a 300 jg/kg de peso corporal.
La cantidad de peptidos que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de administracion individual variara segun el huesped bajo tratamiento y el modo de administracion particular. La dosis de la vacuna puede variar segun factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del mamffero o individuo, y la capacidad del anticuerpo de inducir una respuesta deseada en el individuo. El regimen de administracion puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente segun exija la situacion terapeutica. La dosis de la vacuna tambien puede modificarse para proporcionar una respuesta a dosis preventiva optima segun las circunstancias. Por ejemplo, los peptidos y la vacuna de la presente invencion pueden administrarse en un individuo a intervalos de varios dfas, una o dos semanas o incluso meses o anos, en todo caso segun el nivel de anticuerpos dirigidos contra PCSK9.
En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el peptido/vacuna se aplica 2 a 10 veces, preferentemente 2 a 7, todavfa mas preferentemente hasta 5 y lo mas preferentemente hasta 4 veces. Este numero de inmunizaciones puede conducir a una inmunizacion basica. En una forma de realizacion particularmente preferida, el intervalo de tiempo entre las vacunas consecutivas se selecciona de entre 2 semanas y 5 anos, preferentemente de entre 1 mes y hasta 3 anos, mas preferentemente de entre 2 meses y 1,5 anos. Un programa de vacunacion ejemplificado puede comprender 3 a 4 vacunaciones iniciales durante un periodo de 6 a 8 semanas y de hasta 6 meses. Posteriormente, la vacunacion puede repetirse cada dos a diez anos. La administracion repetida del peptido/vacuna de la presente invencion puede maximizar el efecto final de una vacunacion terapeutica.
La vacuna de la presente invencion puede comprender ademas antfgenos derivados de otras protemas que tambien participan en la regulacion de los niveles de LDL y/o HDL en el cuerpo humano. Por ejemplo, los fragmentos de PCSK9 de la presente invencion pueden combinarse con epttopos derivados de la protema CETP humana. La vacuna de la presente invencion puede comprender ademas antfgenos derivados de un epftopo diferente de la protema PCSK9.
Tfpicamente, la vacuna contiene los peptidos de la presente invencion en una cantidad de 0,5 a 500 jg, preferentemente de 1 a 100 jg y alternativamente de 0,1 ng a 10 mg, preferentemente de 10 ng a 1 mg, en particular de 100 ng a 100 jg, o alternativamente, p.ej., de 100 fmoles a 10 jmoles, preferentemente de 10
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pmoles a 1 pmol, en particular de 100 pmoles a 100 nmoles. ^picamente, la vacuna puede contener ademas sustancias auxiliares, p.ej., tampones, estabilizadores, etc.
Todavfa otro aspecto de la presente exposicion se refiere a un metodo para tratar un individuo que sufre o que esta en riesgo de sufrir de ateroesclerosis o una enfermedad asociada a ateroesclerosis durante el curso de la cual un peptido o vacuna segun la presente invencion se administra en dicho individuo.
Junto con la vacuna de la presente invencion, el individuo que debe tratarse puede recibir tambien otros principios activos que es conocido que influyen sobre los niveles de LDL y/o HDL en el ser humano y en los mairnferos, tales como estatinas, fibratos, acido nicotmico, inhibidor de la incorporacion del colesterol (p.ej., ezetimibe), ApoA1 Milano, HDL deslipidado o esteroles vegetales. Resulta particularmente preferente administrar en el individuo la vacuna de la presente invencion junto con (es decir, simultaneamente, consecutivamente, etc.) con estatinas. La vacuna de la presente invencion puede combinarse ademas con metodos como la aferesis de LDL. La aferesis de LDL es una forma de aferesis para eliminar las partfculas de colesterol-lipoprotema de baja densidad (LDL) del torrente sangumeo. Tfpicamente, la aferesis de lDl funciona conduciendo sangre venosa por una columna recubierta con anticuerpos contra la apolipoprotema B (la protema principal de las partfculas de LDL), sulfato de dextrano o poliacrilato, o mediante precipitacion del LDL con heparina a pH bajo. Los metodos respectivos son conocidos por el experto en la materia.
El termino "prevenir", tal como se utiliza en la presente memoria, cubre medidas no solo para evitar la incidencia de la enfermedad, tal como la reduccion de los factores de riesgo, sino tambien para detener su avance y reducir sus consecuencias una vez establecida.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "tratamiento" o equivalentes gramaticales comprende la mejora y/o reversion de los smtomas de la enfermedad. Un compuesto que causa una mejora en cualquier parametro asociado a la enfermedad utilizado en los metodos de cribado de la presente invencion puede identificarse de esta manera como compuesto terapeutico. El termino "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapeutico como profilactico o a medidas preventivas. Por ejemplo, entre aquellos que pueden beneficiarse del tratamiento con composiciones y metodos de la presente invencion se incluyen aquellos ya con una enfermedad y/o trastorno, asf como aquellos en lso que debe prevenirse una enfermedad y/o trastorno (p.ej., utilizando un tratamiento profilactico de la presente invencion).
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos XiX2X3WX4X5X6RX7(x8)m(Xg)n (SEC ID n° 1) tal como se ha definido anteriormente.
La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante las formas de realizacion, figuras y ejemplo a continuacion, aunque sin limitarse a los mismos.
Figura 1 ELISA de union
La figura 1 representa la deteccion de secuencias de mimotopo de PCSK9 por sueros de raton que contienen anticuerpos policlonales espedficos para PCSK9 humana aa 153 a 162 o a 153 a 165.
A) Mimotopos que contienen intercambios unicos
B) Mimotopos que contienen multiples intercambios
Los graficos muestran medianas de tttulos de todos los mimotopos comparados con el control negativo irrelevante. Como control positivo, se incluye la secuencia de PCSK9 humana original: aa 153 a 162 o aa 153 a 165. Los mimotopos con valores superiores a 1:50.000 se consideran buenos candidatos.
Figura 2 ELISA de competicion
La figura 2 muestra la capacidad de los mimotopos de PCSK9 de competir con la secuencia de PCSK9 original (aa 153 a 162 o aa 153 a 165) para la union de anticuerpos policlonales en sueros de raton generados espedficamente contra estos ultimos.
Todos los mimotopos se comparan con el grupo negativo (0% de competicion por un peptido irrelevante). Como control positivo para cada ELISA de competicion, se utilizaron las secuencias de PCSK9 originales (aa 153 a 162 o aa 153 a 165).
A) Mimotopos que contienen intercambios unicos
B) Mimotopos que contienen multiples intercambios
Los graficos muestran la capacidad (en porcentaje) de los mimotopos de competir con la secuencia de PCSK9 original (aa 153 a 162 o aa 153 a 165) para la union de anticuerpos policlonales generados contra estos ultimos.
g
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los mimotopos con una capacidad de competicion superior a 20% se consideran buenos candidatos.
Figura 3 ELISA de protemas
La figura 3 muestra una comparacion entre las medianas de tftulos (n=5 ratones/grupo) contra la protema PCSK9 humana inducida por las secuencias indicadas. Los datos revelan la capacidad de los mimotopos de inducir la reaccion cruzada de anticuerpos con la protema PCSK9 humana. Los anticuerpos generados por un peptido irrelevante no reconocen la protema.
Figura 4 Colesterol total (% respecto al grupo de control)
La figura 4 muestra una comparacion del nivel medio (n=5 ratones/grupo) de colesterol total de los ratones inmunizados con mimotopos en comparacion con un grupo de control inmunizado con peptido irrelevante. Los datos revelan la capacidad de los mimotopos de reducir sustancialmente los niveles de colesterol total en los ratones hasta en aproximadamente 30%.
Figura 5 Niveles de colesterol total (TC) tras la vacunacion
La figura 5 muestra los niveles de colesterol total (TC) tras la vacunacion con la secuencia de PCSK9 original, SIPWNLERIT y la nueva secuencia SIPWSLERIT (comparacion directa).
Figura 6 Niveles de colesterol total (TC) tras la inmunizacion
La figura 6 muestra los niveles de colesterol total (TC) tras la inmunizacion con vacunas que contienen las nuevas secuencias SIPWSLERIT, VIPWNLERIL y SVPWNLERIQ.
Ejemplos
Materiales y metodos:
Vacuna:
Los peptidos se conjugaron mediante el conector heterobifuncional GMBS (ester de N-hidroxisuccinimida de acido 4-maleimidobutmco) con KLH (hemocianina de lapa americana).
Experimentos de animales:
Se inmunizaron 5 ratones Balb/c por via subcutanea. Los ratones dispoman de acceso a alimentos y agua ad libitum y se mantuvieron bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. La edad de los ratones al inicio de los experimentos era 8 a 10 semanas.
Los ratones recibieron cuatro inyecciones a intervalos de 2 semanas, de 15 |jg de peptido neto acoplado con KLH y adsorbido a Alhydrogel como adyuvante en un volumen total de 1 ml.
Se extrajo sangre aproximadamente 2 semanas despues de la inyeccion final.
ELISA de competicion:
Se incubaron 20 jg de cada peptido indicado con sueros procedentes de ratones en los que se habfa inyectado la secuencia de PCSK9 original (aa 153 a 162 o aa 153 a 165: SEC ID n° 2). A continuacion, se incubaron los sueros en placas de ELISA recubiertas con la secuencia de PCSK9 original (aa 153 a 162 o aa 153 a 165: SEC ID n° 2). La deteccion se llevo a cabo con anticuerpos anti-IgG de raton, se utilizo ABTS como sustrato cromogeno y se midio la densidad optica (DO) a 405 nm.
Los mimnotopos que redudan >20% la union posterior de los anticuerpos policlonales de los sueros al epftopo de PCSK9 humano original (aa 153 a 162 o 153 a 165: SEC ID n° 3) utilizados para recubrir las placas de ELiSa se consideraron mimotopos de competicion y buenos candidatos.
ELISA de union:
Se utilizaron los mimotopos para recubrir placas de ELISA a una concentracion de 1 jmol/ml. Tras bloquear la union no espedfica (BSA al 1% en PBS), se anadieron diluciones apropiadas de sueros procedentes de ratones en los que se habfa inyectado la secuencia de PCSK9 humana original, aa 153 a 162 o aa 153 a 165 (SEC ID n° 3) y se incubaron durante aproximadamente 1 hora. Despues, se llevo a cabo la deteccion con anticuerpos anti- IgG de raton. Se utilizo ABTS como sustrato. Las mediciones de DO se llevaron a cabo a 405 nm y los tftulos se definieron como la dilucion del suero a la que se alcanza 50% de la DOmax.

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Vacuna que comprende por lo menos un peptido seleccionado de entre el grupo SIPWSLERIT (SEC ID n° 21), VIPWNLERIL (SEC ID n° 55) y SVPWNLERIQ (SEC ID n° 60), en la que dicho por lo menos un peptido se acopla o fusiona con un portador farmaceuticamente aceptable.
  2. 2. Vacuna segun la reivindicacion 1, en la que por lo menos un peptido comprende en su extremo N y/o C por lo menos un residuo de cistema unido directamente o mediante una secuencia espaciadora unida al mismo.
  3. 3. Vacuna segun la reivindicacion 1 o 2, en la que el portador farmaceuticamente aceptable es un portador protemico.
  4. 4. Vacuna segun la reivindicacion 3, en la que el portador protemico se selecciona de entre el grupo que consiste en hemocianina de lapa americana (KLH), toxoide tetanico (TT), protema D o toxina difterica (TD), preferentemente una toxina difterica mutada, mas preferentemente CRM197.
  5. 5. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la vacuna se formula con un adyuvante, preferentemente adsorbida a Alhydrogel.
  6. 6. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la utilizacion en un metodo para tratar y/o prevenir los trastornos causados por hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis, preferentemente enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular o enfermedades vasculares perifericas.
  7. 7. Vacuna que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo SIPWSLERIT (SEC ID n° 21), VIPWNLERIL (SEC ID n° 55) y SVPWNLERIQ (SEC ID n° 60).
  8. 8. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 6, en la que los peptidos se administran a un mairnfero o individuo en una cantidad de 0,1 ng a 10 mg, preferentemente de 0,5 a 500 |jg, mas preferentemente 1 a 100 |jg por inmunizacion.
  9. 9. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 6 o 8, en la que la vacuna se aplica entre 2 y 10, preferentemente entre 2 y 7, todavfa mas preferentemente hasta 5 y de la manera mas preferida hasta 4 veces.
  10. 10. Vacuna para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 o 9, en la que la vacuna contiene los peptidos en una cantidad de 0,5 a 500 jg, preferentemente 1 a 100 jg o, alternativamente de 100 fmoles a 10 jmoles, preferentemente 10 pmoles a 1 jmol, especialmente 100 pmoles a 100 nmoles.
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