TWI615148B - 疫苗 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種疫苗，該疫苗係可以於生物體內誘發針對PCSK9之抗體的形成。

Description

疫苗
本發明係關於一種疫苗，該疫苗係可以於生物體內誘發針對PCSK9之抗體的形成。
本發明係關於數個新穎胜肽，該數個胜肽可影響受前蛋白轉化酶枯草杆菌酶/kexin9(Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9，簡稱PCSK9)調控之低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，簡稱LDL)受器(Low Density Lipoprotein receptor，簡稱LDLR)的降解。該數個胜肽係與免疫原性的載體偶合，以形成一疫苗，用以預防及/或治療由高血脂症(hyperlipidemia)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)或動脈粥狀硬化(atherosclerosis)引起的PCSK9相關之健康疾病。
心血管疾病(cardiovascular disease，簡稱CVD)係世界主要死因之一，如高血脂症、血膽固醇過多、高血壓(hypertension)及動脈粥狀硬化疾病等因素係與該些心血管疾病相關。綜合流行病學研究顯示，血清膽固醇水平係與CVD的發生具有正相關。高水平的低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol，簡稱LDLc)係容易導致心血管疾病，且與動脈粥狀硬化之高風險具有直接相關。
該低密度脂蛋白受器，特別係肝臟低密度脂蛋白受器，係用以移除血漿(plasma)中低密度脂蛋白膽固醇的主要途徑。循環性LDLc係與LDLR結合，且其形成之複合物係藉由clathrin依賴性胞吞作用(clathrin-mediated endocytosis)進行內化作用(internalization)，隨後，當 低密度脂蛋白膽固醇進行降解，該低密度脂蛋白受器係會循環回到細胞表面。
PCSK9係為一分泌絲胺酸(serine)蛋白膽，其與該低密度脂蛋白受器結合並促使該受器降解。於2003年發現，體染色體顯性高膽固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia，簡稱ADH)係與第三基因座相關。PCSK9的〝獲得性功能突變(Gain of function mutations，簡稱GOF)〞係增強其與該低密度脂蛋白受器的交互作用，導致該低密度脂蛋白受器數量減少，顯著提高低密度脂蛋白膽固醇水平。因此，獲得性功能突變係與高膽固醇血症有關，且易造成動脈粥狀硬化。相反地，〝喪失性功能突變(Loss of function mutations，簡稱LOF)〞係導致該低密度脂蛋白受器水平增加，且大量減少低密度脂蛋白膽固醇，而隨之降低冠狀動脈性心臟病(coronary heart disease，簡稱CHD)發生的風險。人類PCSK9主要表現於肝臟、腸及腎臟，其被合成為一約72kDa的蛋白質，並經歷一自催化裂解(autocatalytic cleavage)，以被分泌為一約65kDa成熟蛋白質。
循環性PCSK9係專一地結合於該低密度脂蛋白受器之EGF-A區。該複合物係經由胞吞作用進行內化作用，使低密度脂蛋白受器於溶酶體(lysosomes)內進行降解，而不是再循環回到細胞表面。該PCSK9與該低密度脂蛋白受器間之交互作用的最終結果，係用於減少用以清除血漿中低密度脂蛋白膽固醇的低密度脂蛋白受器，顯示PCSK9調控低密度脂蛋白受器及低密度脂蛋白膽固醇之代謝的重要性。
許多動物實驗證實PCSK9扮演調控該低密度脂蛋白膽固醇水平之重要角色。於小鼠體內以腺病毒過度表現(adenoviral overexpression)PCSK9，係導致循環性低密度脂蛋白膽固醇水平顯著上升；相反地，相較於野生型(wild type)，PCSK9基因剔除小鼠顯示低密度脂蛋白受器之水平上升2.8倍，及低密度脂蛋白膽固醇水平減少大約50%。獲 得性功能突變及喪失性功能突變則顯示PCSK9扮演調控人體內低密度脂蛋白代謝之重要角色，使PCSK9成為醫藥調控上引人注目的目標，尤其是針對PCSK9喪失性功能突變的人類異種合子(heterozygous)似乎仍是健康且擁有正常壽命。此外，於一健康31歲非裔美國婦女體內，係證實存在於PCSK9具有二個失效性突變(inactivating mutation)之一複合雜合體(compound heterozygote)，且不存在循環性PCSK9，該婦女具有非常低的低密度脂蛋白膽固醇水平(14-34mg/dL)。
經臨床前及臨床試驗證實，許多複合物可以減少循環性PCSK9的數量或抑制其與低密度脂蛋白受器間的作用(例如單株抗體(monoclonal antibodies)、反義-寡核苷酸(antisense-oligonucleotides)或自催化的抑制劑)。雖然PCSK9於細胞內外皆作用在低密度脂蛋白受器，針對循環性PCSK9對於降低低密度脂蛋白膽固醇的治療是一有價手段。小鼠並聯共生(parabiosis)實驗中，施予重組蛋白(recombinant protein)係顯示胞外PCSK9足以降低肝臟低密度脂蛋白受器的數量。更重要的是，對PCSK9具有專一性之單株抗體於人體臨床研究結果證實以PCSK9作為標的係可以有效且安全地減少低密度脂蛋白膽固醇。此外，許多臨床試驗已成功地完成評估以PCSK9作為標的之安全性及功效。
WO 2012/059573 A1及WO 2011/027257 A2專利案揭示以PCSK9聚胜肽片段作為疫苗。Li等人(Rec.Pat.DNA & Gene Seq.3(2009),201-212)及Wierzbicki等人(Exp.Op.Invest.Drugs 21(2012),667-676)則報導抑制PCSK9以治療高血脂症之近期發展。
綜合上述，PCSK9是低密度脂蛋白受器的一主要調控者，進而調控低密度脂蛋白膽固醇水平。他汀(Statins)雖是作為調控膽固醇之第一線藥物，在特定條件下卻不足以或不適合用以達到該目標。此外，PCSK9經發現可以藉由他汀使其表現量增加(upregulated)而抵消其藥效； 因此，用鑑定(identification)附加或替代的藥物，以控制低密度脂蛋白膽固醇水平仍具有非常大的重要性。抑制PCSK9被預期作為單一藥物治療，以減少血漿中低密度脂蛋白膽固醇，且亦用於增加他汀或其他物質(例如纖維酸(fibrates)或菸鹼酸(nicotinic acid))降低膽固醇效果。
本發明之目的係提供手段及方法，以減少個體之低密度脂蛋白膽固醇。此目的係可以藉由提供數個胜肽來達成，該數個胜肽係模擬各自自身(native)的序列，又稱為模擬表位(mimotopes)。該些模擬表位可以誘發抗體，以專一地結合人類PCSK9和抑制受PCSK9調節之低密度脂蛋白受器的降解。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：本發明係關於一種疫苗、疫苗組合物或組合物，該疫苗、疫苗組合物或組合物係包含至少一胜肽，具有9至25個胺基酸殘基，且該胜肽係具有X1X2X3WX4X5X6RX7(X8)m(X9)n如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
其中，X1係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由絲胺酸(serine)、蘇胺酸(threonine)、纈胺酸(valine)及丙胺酸(alanine)所組成之群組。
X2係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由異白胺酸(isoleucine)、纈胺酸(valine)、甘胺酸(glycine)、穀氨醯胺(glutamine)及丙胺酸(alanine)所組成之群組，較佳為選自由異白胺酸、纈胺酸、穀氨醯胺及丙胺酸所組成之群組。
X3係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由脯胺酸(proline)、蘇胺酸(threonine)、丙胺酸(alanine) 及纈胺酸(valine)所組成之群組，較佳為脯胺酸。
X4係一胺基酸殘基，選自由天門冬醯胺(asparagine)、絲胺酸(serine)、丙胺酸(alanine)、穀氨醯胺(glutamine)及天門冬胺酸(aspartic acid)所組成之群組。
X5係一胺基酸殘基，選自由白胺酸(leucine)、甘胺酸(glycine)、丙胺酸(alanine)、酪胺酸(tyrosine)、天門冬胺酸(aspartic acid)、苯丙胺酸(phenylalanine)及纈胺酸(valine)所組成之群組，較佳為白胺酸(leucine)。
X6係一胺基酸殘基，選自由親水性、帶負電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由穀胺酸(glutamic acid)及天門冬胺酸(aspartic acid)所組成之群組。
X7係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由異白胺酸(isoleucine)、白胺酸(leucine)、丙胺酸(alanine)及蘇胺酸(threonine)所組成之群組。
X8係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由蘇胺酸(threonine)、白胺酸(leucine)、穀氨醯胺(glutamine)、丙胺酸(alanine)及絲胺酸(serine)所組成之群組。
X9係X10X11X12或一羧基端缺失片段包含一或二個胺基酸殘基。
X10係任意胺基酸殘基，特別是一胺基酸殘基選自不帶電之胺基酸殘基群組，特別是選自由脯胺酸(proline)、丙胺酸(alanine)及絲胺酸(serine)所組成之群組。
X11係任意胺基酸殘基，特別是一胺基酸殘基，選自不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由脯胺酸(proline)、丙胺酸(alanine)、纈胺酸(valine)、蘇胺酸(threonine)及天門冬醯胺(asparagine) 所組成之群組。
X12係任意胺基酸殘基，特別是一胺基酸殘基，選自由精胺酸(arginine)、丙胺酸(alanine)、賴胺酸(lysine)、絲胺酸(serine)及白胺酸(leucine)所組成之群組。
m係0或1。
n係0或1。
SEQ ID NO：1不是SIPWNLERITPPR或一羧基端缺失片段。
其中至少一胜肽偶合或融合於一醫藥上可接受之載體。
個體接種本發明之胜肽係導致產生結合PCSK9的多株抗體，該抗體可以與低密度脂蛋白受器之結合相競爭。是以，肝臟低密度脂蛋白受器水平增加，而血漿低密度脂蛋白膽固醇及總膽固醇減少。據此，投予本發明之疫苗，可以治療或預防高血脂症、高膽固醇血症及/或動脈粥狀硬化所造成之疾病。
本發明之該數個胜肽又稱為模擬表位。模擬表位係具有一胺基酸序列，該胺基酸序列不同於該模擬表位所衍生自之原始蛋白質/胜肽序列。該類模擬表位係被免疫系統認定為外來物，因此不會破壞自體耐受性(self-tolerance)。
本發明之胜肽係PCSK9片段之變異體(variants，胺基酸交換及選擇性缺失)，該變異體具有胺基酸序列SIPWNLERITPPR(如SEQ ID NO：2所示)，且由9至25個胺基酸殘基所組成，較佳為9至24、9至23、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、9至13、9至12、9至11、9至10或9個胺基酸殘基所組成，其中更佳為由9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25胺基酸殘基所組成。出乎意料之結果顯示，位於如SEQ ID NO：2所示序列之第4個位置的色胺酸殘基(tryptophan)及如SEQ ID NO：2 所示序列之第8個位置的精胺酸(arginine)殘基之修飾(如，突變)，係導致形成無法充分地與PCSK9結合之抗體。本發明之新穎胜肽序列(特別係與一免疫性載體偶合及/或製作為疫苗)，可以誘發針對PCSK9之抗體形成，因此有益於調控受PCSK9調節之低密度脂蛋白受器的降解而後降低血漿中低密度脂蛋白膽固醇水平。相較於自身(native)PCSK9序列，甚至相較於WO 2012/059573 A1及WO 2011/027257 A2專利案所揭示之胜肽序列，本發明之胜肽對於降低總膽固醇水平亦達到驚人之功效，此結果更進一步以代表性之動物模型揭示於本發明實驗段落。是以，較佳係提供如SEQ ID NO：1所示具有9至13個胺基酸殘基長度之胜肽(換言之，其中X12不存在且m為1；或，其中m為0且X10係脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸，X11係脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及天冬醯胺酸，X12係精胺酸、丙胺酸、賴胺酸、絲胺酸及白胺酸)。
本發明係為具有胺基酸序列SIPWNLERITPPR(如SEQ ID NO：2所示)的PCSK9片段之特定變異體，其原始序列(SIPWNLERITPPR)及其羧基端缺失片段(如，SIPWNLERITPP、SIPWNLERITP、SIPWNLERIT或SIPWNLERI，皆係源自經刪除羧基端胺基酸之SEQ ID NO：2)，係已為如SEQ ID NO：1所示之序列所排除，)。因此，與其自身(native)胜肽、藉由或不藉由一連接子(linker)與一基質偶合之胜肽、以一連接子(如一化學連接子或一半胱胺酸(cysteine)連接子等)連接之胜肽相同，當該些胜肽作為疫苗時，該些羧基端缺失胜肽亦會被排除。
本發明之疫苗係可以包含至少一、至少二、至少三、至少四、至少五或至少十胜肽，其具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，是以，該疫苗可以包含本發明所揭示之兩個或更多胜肽之組合。惟，本發明之疫苗亦可能包含如SEQ ID NO：1所示之一個或更多胜肽，及如模擬表位(即，PCSK9片段之突變體(mutants))或PCSK9之片段(請參閱WO 2011/027257號)之其它胜肽。PCSK9之較佳片段為SIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEV，特別係SIPWNLERIT、SIPWNLERI、SIPWNLERITPPR、SIPWNLERITPP或SIPWNLERITP。
本發明之胜肽可以經由本領域所習知之化學合成方法而得，亦可以藉由重組方法獲得該些胜肽，該些胜肽能夠以如細菌、酵母菌或真菌等微生物，或是以如哺乳動物細胞或昆蟲細胞等真核細胞，或是以如腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxvirus)、疱疹病毒(herpes virus)、塞姆利基森林病毒(simliki forest virus)、桿狀病毒(baculovirus)、噬菌體(bacteriophage)、披膜病毒(sindbis virus)或仙台病毒(sendai virus)等重組病毒載體生成。適合用以生成胜肽之細菌包含大腸桿菌(E.coli)，枯草桿菌(B.subtilis)或是其他可以表現該等胜肽之細菌；適合用以表現本發明之胜肽之酵母菌細胞係包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，念珠菌(Candida)，嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)或是其他可以表現該等胜肽之酵母菌；上述方法均為係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，以及，用以分離及純化重組胜肽之方法亦為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，其中包含凝膠層析法(gel filtration)、親和層析法(affinity chromatography)、離子交換層析法(ion exchange chromatography)等。
為幫助分離本發明之數個胜肽，係可以製備融合多胜肽，其中，該胜肽係於轉譯時融合(共價連結)一異源多胜肽，該異源多胜肽係可以由親和層析法進行分離，典型之異源多胜肽係組胺酸標籤(如His6，6個組胺酸殘基)、GST標籤(Glutathione-S-transferase)等。該融合多胜肽係不僅幫助純化該數個胜肽，更可以防止該胜肽於純化過程中降解。當於純化後欲移除該融合多胜肽，該融合多胜肽更可以於該胜肽及該融合多 胜肽之交接處包含一裂解位置(cleavage site)，該裂解位置係可以由一胺基酸序列所組成，且該胺基酸序列係可以為對該胺基酸序列具有特異性之酵素(如，蛋白酶)所裂解。
本發明之該疫苗及胜肽可以投予至任何哺乳動物，包括人類，較佳地，本發明之該疫苗及胜肽較佳係投予人類。
本發明之一較佳實施例中，X1係纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或丙胺酸，較佳為纈胺酸。
本發明之一較佳實施例中，X2係纈胺酸、丙胺酸、異白胺酸或穀氨醯胺，較佳為纈胺酸。
本發明之一較佳實施例中，X3係脯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸或纈胺酸。
如SEQ ID NO：1所示之序列中，X4較佳為絲胺酸或天門冬醯胺，特別係絲胺酸。
本發明之一較佳實施例中，X6係穀胺酸。
X7較佳為白胺酸、異白胺酸或蘇胺酸，特別是蘇胺酸。
X8較佳為穀氨醯胺、蘇胺酸或白胺酸。
本發明之一較佳實施例中，X1X2X3係選自由TIP、VIP、AIP、SVP、SQP、SAP、SGP、SIT、SIA、SIV及VQP所組成之群組。
本發明之一尤佳實施例中，X4X5X6係選自由SLE、ALE、QLE、DLE、NAE、NGE、NYE、NDE、NFE、NVE及NLD所組成之群組。
當m為1，X7(X8)m特別係選自由LT、TT、AT、IL、IQ、IA、IS、TL、LQ及LL所組成之群組。
本發明之一較佳實施例中，X9係選自由PPR、PP、P、APR、SPR、PAR、PVR、PTR、PNR、PPA、PPK、PPS及PPL所組成之群組。
本發明之一尤佳實施例中，該至少一胜肽係選自由 TIPWNLERIT、TIPWNLERITPPR、VIPWNLERIT、VIPWNLERITPPR、AIPWNLERIT、AIPWNLERITPPR、SVPWNLERIT、SVPWNLERITPPR、SQPWNLERIT、SQPWNLERITPPR、SAPWNLERIT、SAPWNLERITPPR、SGPWNLERITPPR、SGPWNLERIT、SITWNLERIT、SITWNLERITPPR、SIAWNLERIT、SIAWNLERITPPR、SIVWNLERITPPR、SIVWNLERIT、SIPWSLERIT、SIPWSLERITPPR、SIPWALERIT、SIPWALERITPPR、SIPWQLERITPPR、SIPWQLERIT、SIPWDLERITPPR、SIPWDLERIT、SIPWNAERIT、SIPWNAERITPPR、SIPWNGERIT、SIPWNGERITPPR、SIPWNYERIT、SIPWNYERITPPR、SIPWNDERIT、SIPWNDERITPPR、SIPWNFERITPPR、SIPWNVERITPPR、SIPWNLDRITPPR、SIPWNFERIT、SIPWNVERIT、SIPWNLDRIT、SIPWNLERLT、SIPWNLERLTPPR、SIPWNLERTT、SIPWNLERTTPPR、SIPWNLERAT、SIPWNLERATPPR、SIPWNLERIL、SIPWNLERILPPR、SIPWNLERIQ、SIPWNLERIQPPR、SIPWNLERIA、SIPWNLERIAPPR、SIPWNLERISPPR、SIPWNLERIS、SIPWNLERITAPR、SIPWNLERITSPR、SIPWNLERITPAR、SIPWNLERITPVR、SIPWNLERITPTR、SIPWNLERITPNR、SIPWNLERITPPA、SIPWNLERITPPK、SIPWNLERITPPS、SIPWNLERITPPL、VIPWNLERLT、VIPWNLERLTPPR、VIPWNLERTT、VIPWNLERTTPPR、VIPWNLERIL、VIPWNLERILPPR、VIPWNLERIQ、VIPWNLERIQPPR、SVPWNLERLT、SVPWNLERLTPPR、SVPWNLERTT、SVPWNLERTTPPR、SVPWNLERIL、SVPWNLERILPPR、SVPWNLERIQ、SVPWNLERIQPPR、SIPWSLERTTPPR、SQPWNLERLT、SQPWNLERLTPPR、SQPWNLERIL、SQPWNLERILPPR、SQPWNLERIQ、SQPWNLERIQPPR、SIPWSLERLT、SIPWSLERLTPPR、SIPWSLERTT、SIPWSLERIL、SIPWSLERILPPR、SIPWSLERIQ、SIPWSLERIQPPR、VQPWSLERTL、VQPWSLERTLPPR、SQPWSLERTL、SQPWSLERTLPPR、 VQPWNLERLQ、VQPWNLERLQPPR、VQPWSLERLL、VQPWSLERLLPPR、SVPWSLERLT及SVPWSLERLTPPR所組成之群組。
本發明之一尤佳實施例中，該疫苗包含之至少一胜肽係選自由SIPWSLERIT、SIPWSLERITPPR、SIPWSLERTTPPR,VIPWNLERILPPR、SVPWNLERIQPPR、SIPWSLERTT,SIPWSLERLT、SIPWSLERLTPPR、SIPWSLERIQ、SIPWSLERIQPPR、VIPWNLERIL及SVPWNLERIQ所組成之群組。
Figure TWI615148BD00001
本發明疫苗之一尤佳實施例中，該疫苗包含之至少一胜肽(如SEQ ID NO：1所示)係包含至少一半胱胺酸殘基直接或以一間隔序列(spacer sequence)結合至該胜肽之胺基端及/或羧基端上。
該半胱胺酸殘基係可以作為一反應團，使該胜肽與其他分子或一載體結合；舉例而言，該反應團能夠用以使該胜肽與一載體蛋白質結合。該半胱胺酸殘基可以直接與本發明之該等胜肽結合，或是透過一間隔序列與本發明之該等胜肽結合，該間隔序列係包含較佳至少一、較佳至少二、更佳至少三、特別是至少四、其最大值為十，較佳之最小值為五之小型、無極性胺基酸殘基，如甘胺酸。
本發明疫苗之一較佳實施例中，該載體係選自由鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)、CRM(較佳為CRM197)、破傷風類毒素(tetanus toxoid，TT)、白喉毒素(diphtheria toxin，DT)、蛋白質D或其他包含輔助T細胞抗原表位(epitopes)之其他蛋白質或胜肽所組成。
本發明中，該胜肽係與一藥學上可接受之載體偶合或融合，該藥學上可接受之載體較佳係鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、CRM、破傷風類毒素、白蛋白結合蛋白(albumin-binding protein)、胎牛血清蛋白(bovine serum albumin)、樹狀分子(dendrimer)、胜肽連接子(peptide linker或flanking region)，或是如Singh等人(請參照Singh等人，Nat.Biotech.17,(1999)：1075~1081，表一)及O'Hagan等人(請參照O'Hagan and Valiante,Nature Reviews,Drug Discovery 2(9)；(2003)：727~735，〝endogenous immuno-potentiating compounds and delivery systems〞段落)所發表之佐劑或其混合物。該胜肽與該載體偶合或融合之化學過程(如透過GMBS等及其他於〝Bioconjugate Techniques〞,Greg T.Hermanson發表之異源雙功能化合物)係可以選擇自本發明所屬技術領域具有通常知識者所習知之化學反應過程。
本發明之至少一胜肽亦可以利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所習知之方法與一蛋白質載體融合，此類蛋白質係包含一胜肽 及一無相關之免疫原蛋白質，較佳地，該免疫原蛋白質係可以誘導一召回反應(recall response)。舉例而言，該類蛋白質係包含破傷風、肺結核(tuberculosis)、肝炎蛋白質(hepatitis protein)及蛋白質D，係為革蘭氏陰性菌B型流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenza B)之表面蛋白質(請參照WO 91/18926)；較佳地，係可以使用一蛋白質D衍生物，其約包含該蛋白質之3分之1(如，胺基端前100~110個胺基酸)，且該衍生物係可以被脂質修飾(lipidate)。可以被用作融合蛋白質之另一載體如LYTA蛋白質，或是LYTA之片段(較佳為LYTA之羧基端片段)。LYTA係衍生自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，合成被稱為醯胺酶LYTA(amidase LYTA)之N-乙醯-L-丙胺酸醯胺酶(N-acetyl-L-alanine amidase，由LytA基因解碼而成，請參照Gene 43；(1986)：265~292所記載)，LYTA係一自溶素(autolysin)，可以特異地降解肽聚醣(peptidoglycan)骨架之某些鍵結。本發明較佳實施例中，LYTA之一重複部分係可以合併於一融合蛋白，該重複部分係位於LYTA之羧基端，且起始於第178個殘基，其較佳選擇為第188~305個殘基。
本發明較佳實施例中，該胜肽係與一佐劑(adjuvant)複合，較佳係與氫氧化鋁(aluminium hydroxide)吸附。
本發明之疫苗係可以與一佐劑複合，該佐劑較佳係為一低溶解度之鋁組成物，特別是氫氧化鋁(aluminum hydroxide)，當然地，該佐劑亦可以為MF59、磷酸鋁(aluminum phosphate)、磷酸鈣(calcium phosphate)、細胞激素(cytokine，如，IL-2、IL-12、GM-CSF)、皂素(saponin，如，QS21)、MDP衍生物、寡核苷酸CpG(CpG oligonucleotides)、LPS、MPL、聚磷腈(polyphosphazene)、乳劑(如，弗氏佐劑、SAF)、微脂囊(liposome)、仿病毒顆粒佐劑(virosome)、免疫刺激複合物(iscom)、螺旋型脂蛋白體(cochleate)、PLG微粒子、泊洛沙姆粒子(poloxamer particle)、類病毒粒子(virus-like particle)、不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)、霍亂毒素(cholera toxin，CT)、突變毒素(如，LTK63及LTR72)、微粒子及/或聚合微脂囊等。
適合之佐劑係為商業上可獲得之佐劑，舉例而言，如AS01B、AS02A、AS15、AS-2及其衍生物(GlaxoSmithKline,Philadelphia,PA)、CWS、TDM、Leif、氫氧化鋁膠(alum)或磷酸鋁等鋁鹽、鈣鹽、鐵或鋅、乙醯酪胺酸之一不溶性懸浮液、乙醯糖(acylated sugar)、帶陰離子或陽離子之多醣體衍生物、聚磷腈、生物可降解之微球(biodegradable microsphere)、單磷酸類脂A(monophosphoryl lipid A)及quil A，此外，GM-CSF或白細胞介素-2、白細胞介素-7或白細胞介素-12等細胞激素亦可以作為該佐劑。
較佳之佐劑係可以引發顯著之Th1類型反應，該佐劑係可以包含如單磷酸類脂A組合物，較佳為3-O-脫醯單磷酸類脂A(3-O-deacylated monophosphoryl lipid A，3D-MPL)，亦可以與一鋁鹽共同使用(舉例而言，如Ribi等人.,Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY,(1986)：407~419，或GB 2122204B、GB 2220211及US 4,912,094等專利案)，3D-MPL之較佳使用型態係為一乳劑，其中粒徑係小於0.2mm(直徑)，其製備方法係揭示於WO 94/21292專利案；包含單磷酸類脂A及一界面活性劑之液態配方已揭示於WO 98/43670專利案。例示中較佳的佐劑包含AS01B(MPL及QS21於一微脂囊配方)、3D-MPL及QS21於一微脂囊配方、AS02A(MPL及QS21及一水包油乳劑)、3D-MPL及QS21及一水包油乳劑及AS 15佐劑，MPL佐劑則已被US 4,436,727、US 4,877,611、US 4,866,034及US 4,912,094等專利案所揭示。
含CpG之寡核苷酸(其CpG雙核苷酸未被甲基化)亦可以 誘導產生顯著之Th1免疫反應，CpG係DNA之胞嘧啶-鳥糞嘌呤雙核苷酸結構(cytosine-guanosine dinucleotide motif)的簡稱，該寡核苷酸係為人熟知，且於WO 96/02555、WO 99/33488、US 6,008,200及US 5,856,462等專利案被提及，其促進免疫DNA序列另如Sato等人.,Science 273；(1996)：352所記載，CpG製成疫苗時，通常會與一游離抗原(free antigen)共同溶於一游離溶液(free solution)後投予(請參照WO 96/02555，McCluskie and Davis,supra)，或與一抗原共價結合(如WO 98/16247所示)後投予，或與如氫氧化鋁(肝炎表面抗原，Hepatitis surface antigen，請參照Davis等人.,supra；Brazolot-Millan等人.,PNAS USA,95(26),(1998)：15553~8所記載)等一載體複合後投予。此外，CpG較佳係能夠以全身及黏膜等路徑進行投予，係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知(如WO 96/02555、EP 0 468 520、Davis等人.,J.Immunol,160(2),(1998)：870~876及McCluskie and Davis,J.Immunol.,161(9),(1998)：4463~6所記載)。
另一較佳佐劑係一皂素或皂素類似物或衍生物，較佳為QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)，係可以獨自使用或與其他佐劑共同使用。舉例而言，包含一單磷酸類脂A及皂素衍生物之一增強系統，如WO 94/00153專利案所記載之QS21及3D-MPL組合物，或如WO 96/33739專利案所記載之包含以膽固醇結合之QS21之一較低反應原性組合物。其餘較佳配方係包含一水包油乳劑及生育酚(tocopherol)，如WO 95/17210所載之一較佳佐劑配方係包含QS21、3D-MPL及生育酚於一水包油乳劑。此外，本發明所使用之皂素佐劑係包含QS7(如WO 96/33739及WO 96/11711專利案所記載)及QS17(如US 5,057,540及EP 0 362 279 B1專利案所記載)。
另一較佳佐劑係包含Montanide ISA 720(Seppic,France)、SAF(Chiron,California,United States)、免疫刺激複合物(CSL)、MF-59 (Chiron)、SBAS系列佐劑(如SBAS-2、AS2'、AS2、SBAS-4或SBAS6，係購自GlaxoSmithKline)、Detox(Corixa)、RC-529(Corixa,Hamilton,MT)及他種氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽(amino-alkyl glucosaminide 4-phosphates，簡稱AGP)，更進一步之舉例則包含合成之MPL及以志賀毒素B次單元(Shiga toxin B subunit)為基底之佐劑(請參照WO 2005/112991專利案所記載)。特別係以氫氧化鋁為佐劑尤佳。
本發明之疫苗係能夠以皮下注射、肌肉注射、皮內注射、靜脈注射等途徑投予(請參照〝Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formula-tions〞,Sarfaraz Niazi,CRC Press Inc,2004所記載內容)，且根據投予途徑不同，該醫藥可以包含載體、佐劑及/或賦型劑。
包含本發明之胜肽及該醫藥上可接受之載體之一疫苗，係能夠經任何適當方式投予，如皮內注射(i.d.)、腹腔注射(i.p.)、肌肉注射(i.m.)、經鼻腔(intranasally)、口服、皮下注射(s.c.)等，並藉由任何合適的投予裝置(請參照O'Hagan等人.,Nature Reviews,Drug Discovery 2(9),(2003)：727~735所記載)。本發明之胜肽較佳為製備成供以皮內注射、皮下注射、或肌肉注射投予，其製備各自配方之手段及方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所習知(請參照“Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations”,Sarfaraz Niazi,CRC Press Inc,2004所記載內容)。
本發明較佳實施例中，該疫苗係用以治療及/或預防由高血脂症、高膽固醇血症及/或動脈粥狀硬化引起之疾病，較佳為哺乳動物的心血管疾病、中風(stroke)或周邊血管疾病(peripheral vascular disease)，特別是針對人類的。
如上述，本發明之胜肽係可以誘發形成可以特定地與PCSK9結合之抗體，該抗體與PCSK9間的作用導致活體內肝細胞低密度脂蛋白受 器增加，使血漿膽固醇吸收增加而後血漿低密度脂蛋白膽固醇水平下降，及降低總膽固醇含量。
該動脈粥狀硬化相關疾病，較佳係選自由周邊動脈阻塞性疾病(peripheral arterial occlusive disease)、冠狀動脈性心臟病、腦中風發作(apoplectic cerebral insultus)及中風所組成。
〝與高血脂症、高膽固醇血症及/或動脈粥狀硬化之相關疾病〞及〝由高血脂症、高膽固醇血症及/或動脈粥狀硬化引起之疾病〞，係指由高血脂症、高膽固醇血症及動脈粥狀硬化誘發之後續疾病，該些疾病包含周邊動脈阻塞性疾病、冠狀動脈性心臟病及腦中風發作其中之一(請參照Steinberg,D.J Lipid Res 46(2005)：179-190及Steinberg,D.J Lipid Res 47(2006)：1339-1351所記載)。
本發明之一較佳實施例中，該胜肽係以每劑0.1ng~10mg之劑量投予一哺乳動物或一個體，較佳為0.5~500μg，特別為1~100μg。於一較佳實施例中，該劑量係適用於該疫苗的所有胜肽(若疫苗中包含一個胜肽以上)，在另一較佳實施例中，該劑量則適用於該疫苗中每一單獨片段，該數個胜肽當然可以以不同或相同之劑量存在於該疫苗中，但本發明之胜肽可選擇性地以0.1ng~10mg之劑量投予一哺乳動物或一個體，較佳為10ng~1mg，特別為每公斤體重投予100~300ng。
可以與載體結合成一單一劑型之該胜肽的數量係會因宿主及其投藥途徑而不同。該疫苗之劑量可以根據該哺乳動物或個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，及抗體能力來改變，用以在該個體內誘導一理想反應，並可以調整劑量以達到最佳治療效果；舉例來說，係可以每天投予數個劑量，或該劑量可以依治療情形之需求，按比例減少，亦可以根據狀況改變該疫苗之劑量，以達到最佳預防效果。例如，本發明之該胜肽及疫苗係可以因應抗體結合於PCSK9上之數量，每隔數天、一或兩週，甚至是 數月或數年來投予一個體。
本發明之一較佳實施例中，該胜肽/疫苗投予二至十次，較佳為二至七次間，尤佳為至多五次，最佳為至多四次，該使免疫次數係可以引起一基本的免疫反應。本發明尤佳實施例中，後續投予疫苗的間隔時間為二週至五年間，較佳為一個月至三年內，尤佳為二個月至一年半。一例式之疫苗投予時程，可以選擇於六到八週期間至多六個月，進行三至四次疫苗初次接種，隨後疫苗可以於每二至十年再次接種。本發明之胜肽/疫苗重複投予可使疫苗治療達到最佳效果。
本發明之疫苗可以包含衍生自它種蛋白質之抗原，該它種蛋白質亦與人體內低密度脂蛋白及/或高密度脂蛋白的調控有關，舉例而言，本發明之PCSK9片段可以與源自人體CETP蛋白質的抗原表位結合，本發明之疫苗亦可以包含衍生自該PCSK9蛋白質之不同抗原表位的數個抗原。
典型地，該疫苗係包含0.5~500μg之本發明之該胜肽，較佳為1~100μg或0.1ng~10mg，較佳為10ng~1mg，特別是100ng~100μg或100fmol~10μmol，較佳為10pmol~1μmol，特別是100pmol~100nmol。典型地，該疫苗亦可以包含輔助物質，例如緩衝溶液，穩定劑(stabilizer)等。
本發明另一方面係關於治療罹患或具有罹患動脈粥狀硬化及其相關疾病之風險的個體，並使用本發明之胜肽及疫苗投予該個體。
除了本發明之疫苗，該個體亦能夠以其它活性物質治療，例如他汀、纖維酸、菸鹼酸、膽固醇吸收抑制劑(如怡妥錠(ezetimibe))、ApoA1 Milano、去脂化HDL、植物固醇(plant sterols)；當本發明之疫苗尤佳係與他汀一起(即同時地或連續地等)投予一個體。本發明之疫苗亦可以與如LDL血漿析離術(LDL apheresis)之方法結合使用，其中，LDL血漿析離術係一種用以消除血中含有膽固醇之低密度脂蛋白顆粒的分離 術。典型的LDL血漿析離術藉由引導靜脈血至一有抗體覆蓋之管柱，該抗體係為載體蛋白B(apolipoprotein B，LDL顆粒之主要蛋白質)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)或聚丙烯酸酯(polyacrylate)之抗體；或者，於酸性環境下藉由肝素(heparin)沉澱LDL；上述各種方法為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。
本發明所指之〝預防(preventing)〞，不只包含預防疾病的發生如減少風險因子，也包括阻止病情惡化及減輕其病痛症狀。
本發明所指之〝治療(treatment)〞或其同等詞則包含改善及/或使疾病症狀好轉。當一化合物，於本發明之篩選中，可以改善與疾病相關之任何參數，係可以被認可為一種治療化合物。〝治療〞一詞係關於治療或預防方法，舉例說明，可以經本發明之組成物及方法之治療而受惠之人(如使用本發明之預防治療)係包含患有疾病及/或異常和欲防止疾病及/或異常發生之人。
本發明之另一方面係關於一胜肽，其係由胺基酸序列X1X2X3WX4X5X6RX7(X8)m(X9)n(如SEQ ID NO：1所示)所組成。
第1圖係結合ELISA(binding ELISA)。第1圖係顯示藉由包含多株抗體之小鼠血清，偵測PCSK9模擬表位序列之結果，該多株抗體係專一於人體PCSK9之第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸。其中，第1A圖之模擬表位係包含單一置換；第1B圖之模擬表位則包含多重置換。此圖顯示所有模擬表位與無相關負控制組相比的中間力價(median titers)。作為正控制組之該原始人類PCSK9序列係包含第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸，其中，值超過1：50.000的模擬表位被視為良好候選。
第2圖係競爭型ELISA(competition ELISA)。第2圖係顯示與原始PCSK9序列相比，PCSK9模擬表位競爭結合小鼠血清產生的多株抗體之能力(第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸)。所有模擬表位係與負控制組(與一無相關胜肽有0%競爭)做比較。該原始PCSK9序列(第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸)係作為競爭型ELISA(competition ELISA)之正控制組。其中，第2A圖之模擬表位係包含單一置換；第2B圖之模擬表位則包含多重置換。此圖顯示該模擬表位與原始PCSK9序列(第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸)競爭結合多株抗體之競爭能力(以百分比表示)，其中，具有超過20%之競爭能力的模擬表位被視為良好候選。
第3圖係蛋白質ELISA(protein ELISA)。第3圖顯示以所指序列誘導產生之該中間力價(每組五隻小鼠)與人類PCSK9蛋白質之比較結果；其數據顯示該模擬表位誘導之抗體與人類PCSK9蛋白質交叉反應之能力。由無相關胜肽所產生之抗體係無法辨識該蛋白質。
第4圖係總膽固醇(與控制組相比之百分比)。第4圖顯示以模擬表位免疫之小鼠及以無相關胜肽免疫之小鼠的平均總膽固醇水平(每組五隻小鼠)之結果；其數據顯示該模擬表位之能力，實質地降低小鼠總膽固醇水平，高達將近30%。
第5圖係接種疫苗後之總膽固醇水平。第5圖顯示以原始PCSK9序列SIPWNLERIT及新穎序列SIPWSLERIT(直接比較)接種疫苗後總膽固醇水平。
第6圖係免疫反應後之總膽固醇水平。第6圖係顯示接種包含該新穎序列SIPWSLERIT、VIPWNLERIL及SVPWNLERIQ之疫苗後的總膽固醇水平。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
較佳實施例：
本發明第一較佳實施例之疫苗係包含至少一胜肽，該胜肽包含9~25個胺基酸殘基，且該胜肽之胺基酸序列係X1X2X3WX4X5X6RX7(X8)m(X9)n(如SEQ ID NO：1所示)。
其中X1係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸及丙胺酸所組成之群組。
X2係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由異白胺酸、纈胺酸、甘胺酸、穀氨醯胺及丙胺酸所組成之群組，較佳為由異白胺酸、纈胺酸、穀氨醯胺及丙胺酸所組成之群組。
X3係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由脯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸及纈胺酸所組成之群組，較佳為脯胺酸。
X4係一胺基酸殘基，選自由天門冬醯胺、絲胺酸、丙胺酸、穀氨醯胺及天門冬胺酸所組成之群組。
X5係一胺基酸殘基，選自由白胺酸、甘胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天門冬胺酸、苯丙胺酸及纈胺酸所組成之群組，較佳為白胺酸。
X6係一胺基酸殘基，選自由親水性帶負電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由穀胺酸及天門冬胺酸所組成之群組。
X7係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由異白胺酸、白胺酸、丙胺酸及蘇胺酸所組成之群組。
X8係一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由蘇胺酸、白胺酸、穀氨醯胺、丙胺酸及絲胺酸所組成之群組。
X9係X10X11X12或其羧基端缺失片段，該羧基端缺失片段包含一或二個胺基酸殘基。
X10係任意胺基酸殘基，特別是一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸所組成之群組。
X11係任意胺基酸殘基，特別是一胺基酸殘基，選自由不帶電之胺基酸殘基所組成之群組，特別是選自由脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及天門冬醯胺所組成之群組。
X12係任意胺基酸殘基，特別是一胺基酸殘基，選自由精胺酸、丙胺酸、賴胺酸、絲胺酸及白胺酸所組成之群組。
m係0或1。
n係0或1。
SEQ ID NO：1不是SIPWNLERITPPR或其羧基端缺失片段。
其中，該至少一胜肽偶合或融合於一醫藥上可接受之載體。
第一較佳實施例之疫苗中，其中X1係纈胺酸、絲胺酸或丙胺酸，較佳為纈胺酸。
第一或第二較佳實施例之疫苗中，其中該X2係纈胺酸、異白胺酸或穀氨醯胺，較佳為纈胺酸。
第一至三任一較佳實施例之疫苗中，其中該X3係脯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸或纈胺酸。
第一至四任一較佳實施例之疫苗中，其中該X4係絲胺酸或天門冬醯胺，較佳為絲胺酸。
第一至五任一較佳實施例之疫苗中，其中該X6係穀胺酸。
第一至六任一較佳實施例之疫苗中，其中該X7係白胺酸、異白胺酸或蘇胺酸，較佳為蘇胺酸。
第一至七任一較佳實施例之疫苗中，其中該X8係穀氨醯胺、蘇胺酸或白胺酸。
第一至八任一較佳實施例之疫苗中，其中X1X2X3係選自由TIP、VIP、AIP、SVP、SQP、SAP、SGP、SIT、SIA、SIV及VQP所組成之群組。
第一至九任一較佳實施例之疫苗中，其中X4X5X6係選自由SLE、ALE、QLE、DLE、NAE、NGE、NYE、NDE、NFE、NVE及NLD所組成之群組。
第一至十任一較佳實施例之疫苗中，其中當m為1，X7(X8)m特別係選自由LT、TT、AT、IL、IQ、IA、IS、TL、LQ及LL所組成之群組。
第一至十一任一較佳實施例之疫苗中，其中X9係選自由PPR、PP、P、APR、SPR、PAR、PVR、PTR、PNR、PPA、PPK、PPS及PPL所組成之群組。
第一至十二任一較佳實施例之疫苗中，其中該至少一胜肽係選自由TIPWNLERIT、TIPWNLERITPPR、VIPWNLERIT、VIPWNLERITPPR、AIPWNLERIT、AIPWNLERITPPR、SVPWNLERIT,、SVPWNLERITPPR、SQPWNLERIT、SQPWNLERITPPR、SAPWNLERIT、SAPWNLERITPPR、SGPWNLERITPPR、SGPWNLERIT、SITWNLERIT、SITWNLERITPPR、SIAWNLERIT、SIAWNLERITPPR、SIVWNLERITPPR、SIVWNLERIT、SIPWSLERIT、SIPWSLERITPPR、SIPWALERIT、SIPWALERITPPR、SIPWQLERITPPR,、SIPWQLERIT、SIPWDLERITPPR、SIPWDLERIT、SIPWNAERIT、SIPWNAERITPPR、SIPWNGERIT、SIPWNGERITPPR、SIPWNYERIT、SIPWNYERITPPR、SIPWNDERIT、SIPWNDERITPPR、SIPWNFERITPPR、SIPWNVERITPPR、SIPWNLDRITPPR、SIPWNFERIT、 SIPWNVERIT、SIPWNLDRIT、SIPWNLERLT、SIPWNLERLTPPR、SIPWNLERTT、SIPWNLERTTPPR、SIPWNLERAT、SIPWNLERATPPR、SIPWNLERIL、SIPWNLERILPPR、SIPWNLERIQ、SIPWNLERIQPPR、SIPWNLERIA、SIPWNLERIAPPR、SIPWNLERISPPR、SIPWNLERIS、SIPWNLERITAPR、SIPWNLERITSPR、SIPWNLERITPAR、SIPWNLERITPVR、SIPWNLERITPTR、SIPWNLERITPNR、SIPWNLERITPPA、SIPWNLERITPPK、SIPWNLERITPPS、SIPWNLERITPPL、VIPWNLERLT、VIPWNLERLTPPR、VIPWNLERTT、VIPWNLERTTPPR、VIPWNLERIL、VIPWNLERILPPR、VIPWNLERIQ、VIPWNLERIQPPR、SVPWNLERLT、SVPWNLERLTPPR、SVPWNLERTT、SVPWNLERTTPPR、SVPWNLERIL、SVPWNLERILPPR、SVPWNLERIQ、SVPWNLERIQPPR、SIPWSLERTTPPR、SQPWNLERLT、SQPWNLERLTPPR、SQPWNLERIL、SQPWNLERILPPR、SQPWNLERIQ、SQPWNLERIQPPR、SIPWSLERLT、SIPWSLERLTPPR、SIPWSLERTT、SIPWSLERIL、SIPWSLERILPPR、SIPWSLERIQ、SIPWSLERIQPPR、VQPWSLERTL、VQPWSLERTLPPR、SQPWSLERTL、SQPWSLERTLPPR、VQPWNLERLQ、VQPWNLERLQPPR、VQPWSLERLL、VQPWSLERLLPPR、SVPWSLERLT及SVPWSLERLTPPR所組成之群組。
第一至十三任一較佳實施例之疫苗中，其中包含至少一胜肽，該至少一胜肽係選自由SIPWSLERIT、SIPWSLERITPPR、SIPWSLERTTPPR,VIPWNLERILPPR、SVPWNLERIQPPR、SIPWSLERTT、SIPWSLERLT、SIPWSLERLTPPR、SIPWSLERIQ、SIPWSLERIQPPR、VIPWNLERIL及SVPWNLERIQ所組成之群組。
第一至十四任一較佳實施例之疫苗中，其中於該至少一胜肽係包含至少一半胱胺酸殘基直接或以一間隔序列結合至該胜肽之胺基端及/或羧基端。
第一至十五任一較佳實施例之疫苗中，其中該醫藥上可接受之載體係一蛋白質載體。
第十六較佳實施例之疫苗中，其中該蛋白質載體係選自由鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、破傷風類毒素(TT)、蛋白質D或白喉毒素(DT)所組成之群組，較佳為突變型白喉毒素，更佳為CRM197。
第一至十七任一較佳實施例之疫苗中，其中該化合物係與一佐劑複合，較佳係吸附於鋁水膠(Alhydrogel)。
第一至十八任一較佳實施例中，該疫苗用於一方法，以治療及/或預防由高血脂症、高膽固醇血症及/或動脈粥狀硬化引起之疾病，較佳為心血管疾病、中風或周邊血管疾病。
一胜肽，由一胺基酸序列X1X2X3WX4X5X6RX7(X8)m(X9)n(如SEQ ID NO：1所示)所組成，係如第一至十五任一較佳實施例所定義。
實驗：
材料與方法
疫苗：
該胜肽係透過異源雙功能連接子GMBS(4-馬來醯亞胺基丁酸-N-琥珀醯亞胺酯)結合於鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)。
動物實驗：
五隻Balb/c小鼠係經皮下免疫，小鼠可以自由攝取食物及飲水，且被放置於12小時亮/暗循環的環境，年齡於實驗初為8至10週大。
小鼠以兩週之間隔，共施打四次，其劑量係15μg總胜肽結合至KLH，且吸附於作為佐劑之鋁水膠(alhydrogel)，該鋁水膠於總量加入一毫升。
最終次注射後，大約每兩週進行採血。
競爭型ELISA：
20μg的各該所指之胜肽係與小鼠血清進行共培養，且該小鼠係注射原始PCSK9序列(第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸：SEQ ID NO：2)，接續將血清培養於披覆原始PCSK9序列(第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸：SEQ ID NO：2)的ELISA盤上，藉由抗小鼠IgG抗體進行偵測，ABTS則作為一呈色基質(chromogenic substrate)且測量在波長405nm下之光密度(OD)。
減少>20%之血清之多株抗體及披覆於該ELISA盤之該原始人類PCSK9抗原表位(第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸：SEQ ID NO：3)的模擬表位被視為競爭型模擬表位及良好候選。
結合ELISA：
模擬表位以1μmol/mL之濃度披覆至ELISA盤，以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中含有1%牛血清蛋白(bovine serum albumin)阻斷非特定結合後，以該原始人類PCSK9序列第153至162個胺基酸或第153至165個胺基酸(SEQ ID NO：3)注射之小鼠血清適當之稀釋液，係加入該ELISA盤：，共同培養約1小時，接著以抗小鼠IgG抗體進行偵測。ABTS係作為基質，測量在波長405nm下之OD值，且力價定義為達ODmax之50%之血清稀釋倍率。
蛋白質ELISA：
為要測量該疫苗之免疫原性，係將重組表現之人類PCSK9蛋白質披覆於ELISA盤，藉由於阻斷緩衝液(磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中含有1%牛血清蛋白(bovine serum albumin))培養以阻斷非特定結合，適當的血清稀釋液加入於盤孔中，接續以1：2倍稀釋並培養約1小時。另透過與抗小鼠IgG抗體之共培養偵測結合之抗體，ATBS係作為基質，測量在波長405nm下之OD值。注射無相關胜肽之控制組血清係作為負控制組。力價定義為達ODmax之50%之血清稀釋倍率。
總膽固醇分析：
總膽固醇係透過LabassayTM膽固醇套組來測量(購自Wako)。
結果
實驗1：下表格係為序列、其與負控制組相比(請參照第2A及2B圖所示)之對抗原始人類PCSK9序列之中間抗體力價(請參照第1A及1B圖所示)以及其與負控制組(請參照第2A及2B圖所示)相比的模擬表位之競爭能力(以百分比表示)。為了要促進該胜肽與鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)之偶合，該胜肽可以包含一半胱胺酸殘基作為位於該胜肽羧基端之連接子。
Figure TWI615148BD00002
Figure TWI615148BD00003
Figure TWI615148BD00004
實驗二：本發明之該胜肽的不可預期功效
進一步實驗係研究以本發明胜肽疫苗進行免疫所引起之抗體功能性，本實驗中，相較於以包含該原始PCSK9序列(SIPWNLERIT)及一負控制組序列之疫苗進行免疫結果，以包含新穎序列(SEQ ID NO：21，即SIPWSLERIT、SEQ ID NO：55，即VIPWNLERIL及SEQ ID NO：60，即SVPWNLERIQ)之疫苗進行免疫所產生之抗體具有高度功能性，該些疫苗所包含胜肽均與相同載體鑰孔蟲戚血藍蛋白KLH偶合(請參照第5及6圖所示)。
為達成此目的，HPLC純化之胜肽係偶合於KLH，且與一佐劑(Alum)複合，以形成一疫苗(序列-KLH/Alum)，小鼠係接種該疫苗(序列-KLH/Alum)。於第一個實驗中，係直接比較該原始PCSK9序列與該新穎序列SIPWSLERIT。於此，小鼠係接種作為負控制組之無相關胜肽疫苗(無相關胜肽-KLH/Alum)、原始PCSK9序列疫苗(SIPWNLERIT- KLH/Alum)及該新穎序列疫苗(SIPWSLERIT-KLH/Alum)。該新穎序列疫苗組別(SIPWSLERIT-KLH/Alum)不僅與原始PCSK9序列疫苗(SIPWNLERIT-KLH/Alum)比較其產生之抗體的功能性，亦作為不同實驗間的聯接組別。如結果所示與負控制組相比(請參照第5a及5b圖所示)，該原始PCSK9序列疫苗(SIPWNLERIT-KLH/Alum)及該新穎序列疫苗(SIPWSLERIT-KLH/Alum)皆可以顯著地降低總膽固醇水平。然而有趣的是，接種該新穎序列疫苗(SIPWSLERIT-KLH/Alum)後，該小鼠不僅相較負控制組具有顯著之總膽固醇降低現象，事實上，與接種包含該原始PCSK9序列SIPWNLERIT之疫苗亦具有顯著之總膽固醇降低現象(請參照第5a及5b圖所示)。
接著，進行第二個實驗，其中小鼠分別接種作為負控制組的無相關胜肽以及三種新穎序列SIPWSLERIT、VIPWNLERIL及SVPWNLERIQ，該些序列均與KLH偶合，且複合形成疫苗。如同上述，該新穎序列(SIPWSLERIT-KLH/Alum)係作為不同實驗間的連接組別。事實上，作為連接組別之新穎胜肽(SIPWSLERIT-KLH/Alum)於不同實驗皆得到相似結果(請參照第5a、5b、6a及6b圖所示)，最重要的是，分別包含SIPWSLERIT、VIPWNLERIL或SVPWNLERIQ其中之一個序列的三種疫苗對於減少血清中總膽固醇水平，皆有相似的結果(請參照第6a及6b圖所示)。
因此，藉由目前數據可以證實本發明疫苗之顯著功效，特別是包含序列SEQ ID NO：21(SIPWSLERIT)、SEQ ID NO：55(VIPWNLERIL)及SEQ ID NO：60(SVPWNLERIQ)之胜肽疫苗，以誘導該功能抗體，該功能抗體不僅相較無相關負控制組可以大幅降低血清總膽固醇水平，相較包含原始PCSK9序列的疫苗(SIPWNLERIT-KLH/Alum)亦可以顯著地降低血清總膽固醇水平。
第5a圖顯示相較接種包含該原始PCSK9序列SIPWNLERIT之疫苗及無相關(負)控制組(SEQ ID NO：2，即ERTKSDPGAQHREF)之結果，接種該新穎序列SIPWSLERIT之以mg/dL表示的血清平均值。相較於接種接種包含該原始PCSK9序列SIPWNLERIT之疫苗組別及負控制組，該新穎序列SIPWSLERIT之疫苗組別係顯著地降低總膽固醇水平，其結果可以由第5a圖得證。第5b圖提供各組與負控制組比較之下，所減少總膽固醇之百分比。值得注意的是，相較於無關負控制組，接種該原始PCSK9序列(SIPWNLERIT-KLH/Alum)之總膽固醇水平約減少20%，而該新穎序列(SIPWSLERIT-KLH/Alum)之總膽固醇水平則明顯地減少35~40%。
第6a圖顯示相較該無相關(負)控制組(SEQ ID NO：2，即ERTKSDPGAQHREF)之結果，接種包含該新穎序列SIPWSLERIT、VIPWNLERIL及SVPWNLERIQ之疫苗之以mg/dL表示的血清平均值。該三組新穎序列產生免疫反應後，與負控制組相比，皆明顯地減少總膽固醇水平，其結果可以由第6a圖得證。第6b圖提供分別注射三組新穎序列SIPWSLERIT、VIPWNLERIL及SVPWNLERIQ後，與負控制組比較之下，所減少總膽固醇之百分比。值得注意的是，接種該三組新穎序列後，至多可減少40%的總膽固醇。實際上，接種包含該新穎序列SIPWSLERIT之疫苗的組別(不同實驗間之連接組別)於各實驗皆有相似效果(請參照第5a及5b圖所示)，證實透過包含該三組新穎序列之疫苗所產生的抗體功能顯著高於包含該原始PCSK9序列SIPWNLERIT之疫苗所產生的抗體功能。
從上述數據中，相較於先前技術之疫苗，本發明之疫苗顯然具有驚人有益的效果，特別是包含序列SEQ ID NO：21(SIPWSLERIT)、SEQ ID NO：55(VIPWNLERIL)及SEQ ID NO：60(SVPWNLERIQ)之胜肽疫苗。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 亞佛瑞司股份有限公司
(Affiris AG)
<120> 疫苗
<130> R 60526
<160> 118
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工胜肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自不帶電之胺基酸殘基群組，特別是選自由絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸及丙胺酸所組成之群組。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自不帶電之胺基酸殘基群組，特別是選自由異白胺酸、纈胺 酸、甘胺酸、穀氨醯胺及丙胺酸所組成之群組，較佳為異白胺酸、纈胺酸、穀氨醯胺及丙胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自不帶電之胺基酸殘基群組，特別是選自由脯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸及纈胺酸所組成之群組，較佳為脯胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自由天門冬醯胺、絲胺酸、丙胺酸、穀氨醯胺及天門冬胺酸所組成之群組
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自由白胺酸、甘胺酸、丙胺酸、酪胺酸、天門冬胺酸、苯丙胺酸及纈胺酸所組成之群組，較佳為白胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自親水性帶負電之胺基酸殘基群組，特別是選自由穀胺酸及天門冬胺酸所組成之群組
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自不帶電之胺基酸殘基群組，特別是選自由異白胺酸、白胺酸、丙胺酸及蘇胺酸所組成之群組
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa係一胺基酸殘基選自不帶電之胺基酸殘基群組，特別是選自由蘇胺酸、白胺酸、穀氨醯胺、丙胺酸及絲胺酸所組成之群組或無
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa係本發明所指之X10X11X12或一羧基端缺失片段包含一或二個胺基酸殘基或無
<400> 1
Figure TWI615148BD00005
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PCSK9片段
<400> 2
Figure TWI615148BD00006
Figure TWI615148BD00007
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
Figure TWI615148BD00008
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
Figure TWI615148BD00009
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 5
Figure TWI615148BD00010
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 6
Figure TWI615148BD00011
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 7
Figure TWI615148BD00012
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 8
Figure TWI615148BD00013
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 9
Figure TWI615148BD00014
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 10
Figure TWI615148BD00015
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 11
Figure TWI615148BD00016
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 12
Figure TWI615148BD00017
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 13
Figure TWI615148BD00018
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 14
Figure TWI615148BD00019
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 15
Figure TWI615148BD00020
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 16
Figure TWI615148BD00021
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 17
Figure TWI615148BD00022
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 18
Figure TWI615148BD00023
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 19
Figure TWI615148BD00024
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 20
Figure TWI615148BD00025
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 21
Figure TWI615148BD00026
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 22
Figure TWI615148BD00027
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 23
Figure TWI615148BD00028
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 24
Figure TWI615148BD00029
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 25
Figure TWI615148BD00030
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 26
Figure TWI615148BD00031
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 27
Figure TWI615148BD00032
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 28
Figure TWI615148BD00033
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 29
Figure TWI615148BD00034
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 30
Figure TWI615148BD00035
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 31
Figure TWI615148BD00036
Figure TWI615148BD00037
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 32
Figure TWI615148BD00038
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 33
Figure TWI615148BD00039
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 34
Figure TWI615148BD00040
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 35
Figure TWI615148BD00041
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 36
Figure TWI615148BD00042
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 37
Figure TWI615148BD00043
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 38
Figure TWI615148BD00044
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 39
Figure TWI615148BD00045
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 40
Figure TWI615148BD00046
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 41
Figure TWI615148BD00047
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 42
Figure TWI615148BD00048
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 43
Figure TWI615148BD00049
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 44
Figure TWI615148BD00050
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 45
Figure TWI615148BD00051
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 46
Figure TWI615148BD00052
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 47
Figure TWI615148BD00053
<210> 48
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 48
Figure TWI615148BD00054
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 49
Figure TWI615148BD00055
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 50
Figure TWI615148BD00056
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 51
Figure TWI615148BD00057
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 52
Figure TWI615148BD00058
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 53
Figure TWI615148BD00059
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 54
Figure TWI615148BD00060
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 55
Figure TWI615148BD00061
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 56
Figure TWI615148BD00062
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 57
Figure TWI615148BD00063
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 58
Figure TWI615148BD00064
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 59
Figure TWI615148BD00065
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 60
Figure TWI615148BD00066
Figure TWI615148BD00067
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 61
Figure TWI615148BD00068
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 62
Figure TWI615148BD00069
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 63
Figure TWI615148BD00070
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 64
Figure TWI615148BD00071
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 65
Figure TWI615148BD00072
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 66
Figure TWI615148BD00073
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 67
Figure TWI615148BD00074
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 68
Figure TWI615148BD00075
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 69
Figure TWI615148BD00076
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 70
Figure TWI615148BD00077
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 71
Figure TWI615148BD00078
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 72
Figure TWI615148BD00079
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 73
Figure TWI615148BD00080
<210> 74
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 74
Figure TWI615148BD00081
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 75
Figure TWI615148BD00082
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 76
Figure TWI615148BD00083
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 77
Figure TWI615148BD00084
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 78
Figure TWI615148BD00085
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 79
Figure TWI615148BD00086
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 80
Figure TWI615148BD00087
<210> 81
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 81
Figure TWI615148BD00088
<210> 82
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 82
Figure TWI615148BD00089
<210> 83
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 83
Figure TWI615148BD00090
<210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 84
Figure TWI615148BD00091
<210> 85
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 85
Figure TWI615148BD00092
<210> 86
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 86
Figure TWI615148BD00093
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 87
Figure TWI615148BD00094
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 88
Figure TWI615148BD00095
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 89
Figure TWI615148BD00096
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 90
Figure TWI615148BD00097
<210> 91
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 91
Figure TWI615148BD00098
<210> 92
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 92
Figure TWI615148BD00099
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 93
Figure TWI615148BD00100
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 94
Figure TWI615148BD00101
<210> 95
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 95
Figure TWI615148BD00102
<210> 96
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 96
Figure TWI615148BD00103
Figure TWI615148BD00104
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 97
Figure TWI615148BD00105
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 98
Figure TWI615148BD00106
<210> 99
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 99
Figure TWI615148BD00107
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 100
Figure TWI615148BD00108
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 101
Figure TWI615148BD00109
<210> 102
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 102
Figure TWI615148BD00110
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 103
Figure TWI615148BD00111
<210> 104
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 104
Figure TWI615148BD00112
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 105
Figure TWI615148BD00113
<210> 106
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 106
Figure TWI615148BD00114
<210> 107
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 107
Figure TWI615148BD00115
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，模擬表位
<400> 108
Figure TWI615148BD00116
<210> 109
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
<400> 109
Figure TWI615148BD00117
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
<400> 110
Figure TWI615148BD00118
<210> 111
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
<400> 111
Figure TWI615148BD00119
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<211> 13
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
<400> 112
Figure TWI615148BD00120
<210> 113
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
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Figure TWI615148BD00121
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
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Figure TWI615148BD00123
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Figure TWI615148BD00124
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<213> 人工序列
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Figure TWI615148BD00125
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列，模擬表位
<400> 118
Figure TWI615148BD00126

Claims (10)

  1. 一種疫苗，係包含至少一胜肽，且該胜肽係由如SEQ ID NO：21所示之序列、如SEQ ID NO：55所示之序列，或如SEQ ID NO：60所示之序列所組成；其中，該至少一胜肽偶合或融合於一醫藥上可接受之載體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之疫苗，其中，該醫藥上可接受之載體係一蛋白質載體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之疫苗，其中，該蛋白質載體係選自由鑰孔蟲戚血藍蛋白、破傷風類毒素、蛋白質D或白喉毒素所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之疫苗，其中，該蛋白質載體為突變型白喉毒素。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之疫苗，其中，該蛋白質載體為CRM197。
  6. 如申請專利範圍第1~5項中任一項所述之疫苗，其中，該疫苗係與一佐劑複合。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之疫苗，其中，該疫苗係吸附於鋁水膠。
  8. 如申請專利範圍第1~5項中任一項所述之疫苗，該疫苗係用以治療及/或預防由高血脂症、高膽固醇血症及/或動脈粥狀硬化引起之不適。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之疫苗，其中，該疫苗係用以治療及/或預防心血管疾病、中風或周邊血管之不適。
  10. 一胜肽，係由如SEQ ID NO：21所示之序列、如SEQ ID NO：55所示之序列，或如SEQ ID NO：60所示之序列所組成。
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