ES2693371T3 - Edulcorantes no calóricos y métodos de síntesis - Google Patents

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Abstract

Un método de producción de rebaudiósido KA y/o rebaudiósido E a partir de rubusósido, comprendiendo el método: proporcionar una mezcla de reacción que comprende: (i) rubusósido, (ii) uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) como sustrato; y (iii) la glicosiltransferasa HVI que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. NO 5; o (i) rubusósido, (ii) sacarosa, UDP y UDP-glucosa como sustratos y (ii) la glicosiltransferasa HVI que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. NO: 5 con una sacarosa sintasa incubar la mezcla de reacción para producir el rebaudiósido KA, en el que una glucosa se acopla covalentemente al C2' de la glucosa 19-O de rubusósido para producir el rebaudiósido KA y/o rebaudiósido E, en el que la glucosa se acopla más covalentemente por dicha glicosiltransferasa al C2' de la 13-O-glucosa del rebaudiósido KA; y obtener el rebaudiósido KA de la mezcla de reacción para usar como edulcorante.

Description

DESCRIPCION
Edulcorantes no caloricos y metodos de smtesis.
Antecedentes de la divulgacion.
La presente divulgacion se refiere en general a edulcorantes naturales. Mas particularmente, la presente invencion se 5 refiere a metodos de smtesis de los edulcorantes no caloricos rebaudiosido KA y rebaudiosido E.
Los glicosidos de esteviol son productos naturales aislados de las hojas de Stevia rebaudiana. Los glicosidos de esteviol son ampliamente usados como edulcorantes de alta intensidad y bajos en calonas y son significativamente mas dulces que la sacarosa. Como edulcorantes naturales, los diferentes glucosidos de esteviol tienen diferentes grados de dulzor y regusto. El dulzor de los glicosidos de esteviol es significativamente mas alta que la de la sacarosa. Por ejemplo, el 10 esteviosido es 100-150 veces mas dulce que la sacarosa con regusto amargo. El rebaudiosido C es entre 40 y 60 veces mas dulce que la sacarosa. El dulcosido A es aproximadamente 30 veces mas dulce que la sacarosa.
Los glicosidos de esteviol de origen natural comparten la misma estructura basica de esteviol, pero difieren en el contenido de residuos de carbohidratos (por ejemplo, residuos de glucosa, ramnosa y xilosa) en las posiciones C13 y C19. Los glicosidos de esteviol con estructuras conocidas incluyen esteviol, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, 15 rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido F y dulcosido A (vease, por ejemplo, la tabla 1). Otros glicosidos de esteviol son rebaudiosido M, rebaudiosido N y rebaudiosido O.
Tabla 1. Glicosidos de esteviol.
Nombre
Estructura Formula molecular Peso molecular
Esteviol
OH CH H3CT / 19 HO C20H30O3 318
Esteviosido
HO. OH h°4_j d OH C H O 38 60 18 804
imagen1
Rebaudiosido-B
imagen2
C H O
°38n60^18
804
Rebaudiosido C
imagen3
C44H70O22
950
imagen4
Rebaudiosido E
C44H70O23
imagen5
966
Rebaudiosido F
CHO
43 68 22
936
imagen6
c H O
38 60 18
imagen7
Rebaudiosido D2 (Nota: la designacion Rebaudiosido D2se ha usado en algunos documentos de la tecnica anterior, por ejemplo, WO2014/193888 para una estructura de rebaudiosido diferente)
Rebaudiosido KA
imagen8
C50H80O
C38H60O
28
1128
18
804
imagen9
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15
20
25
30
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imagen10
En peso seco, el esteviosido, el rebaudiosido A, el rebaudiosido C y el dulcosido A representan el 9.1, 3.8, 0.6 y 0.3% del peso total de los glicosidos de esteviol en las hojas, respectivamente, mientras que los otros glicosidos de esteviol estan presentes en cantidades mucho mas bajas. Los extractos de la planta de Stevia rebaudiana estan disponibles comercialmente, que por lo general contienen esteviosido y rebaudiosido A como compuestos primarios. Los otros glicosidos de esteviol por lo general estan presentes en el extracto de stevia como componentes menores. Por ejemplo, la cantidad de rebaudiosido A en preparaciones comerciales puede variar desde aproximadamente 20% a mas del 90% del contenido total de glicosido de esteviol, mientras que la cantidad de rebaudiosido B puede ser desde aproximadamente 1-2%, la cantidad de rebaudiosido C puede ser aproximadamente 7-15%, y la cantidad de rebaudiosido D puede ser aproximadamente 2% del total de glicosidos de esteviol.
La mayona de los glucosidos de esteviol estan formados por varias reacciones de glicosilacion de esteviol, que por lo general son catalizadas por las UDP-glicosiltransferasas (UGTs) usando uridina 5'-difosfoglucosa (UDP-glucosa) como un donante de la unidad estructural de azucar. Las UGT en las plantas constituyen un grupo muy diverso de enzimas que transfieren un residuo de glucosa de UDP-glucosa a esteviol. Por ejemplo, la glicosilacion del C-3' de la C-13-O- glucosa del esteviosido produce rebaudiosido A; y la glicosilacion del C-2' de la 19-O-glucosa del esteviosido produce el rebaudiosido E. Ademas, la glicosilacion del rebaudiosido A (en C-2' -19-O-glucosa) o el rebaudiosido E (en C-3'- 13-O- glucosa) produce rebaudiosido D. (Figura 1).
Los edulcorantes alternativos estan recibiendo una atencion creciente debido al conocimiento de muchas enfermedades en proporcion con el consumo de alimentos y bebidas con alto contenido de azucar. Aunque hay edulcorantes artificiales disponibles, muchos edulcorantes artificiales tales como la dulzor, el ciclamato de sodio y la sacarina han sido prohibidos o restringidos por algunos pafses debido a preocupaciones sobre su seguridad. Por lo tanto, los edulcorantes no caloricos de origen natural son cada vez mas populares. Uno de los principales obstaculos para el uso generalizado de edulcorantes de stevia son sus atributos de sabor indeseables. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de desarrollar edulcorantes alternativos y metodos para su produccion para proporcionar la mejor combinacion de potencia de dulzor y perfil de sabor.
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona ahora un metodo de produccion de rebaudiosido KA y/o rebaudiosido E a partir de rubusosido, comprendiendo el metodo:
proporcionar una mezcla de reaccion que comprende:
(A)
(i) rubusosido,
(ii) uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) como sustrato; y
(iii) la glicosiltransferasa HVI que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ. ID. NO 5; o
(B)
(i) rubusosido,
(ii) sacarosa, UDP y UDP-glucosa as sustratos y
(ii) la glicosiltransferasa HVI que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ. ID. NO: 5 con una sacarosa sintasa;
incubar la mezcla de reaccion para producir el rebaudiosido KA, en el que una glucosa se acopla covalentemente al C2' de la glucosa 19-0 de rubusosido para producir el rebaudiosido KA y/o rebaudiosido E, en el que la glucosa se acopla covalentemente ademas por dicha glicosiltransferasa al C2' de la 13-O-glucosa del rebaudiosido KA; y obtener el 5 rebaudiosido KA de la mezcla de reaccion para usar como edulcorante.
Un metodo de la invencion puede comprender ademas incorporar el rebaudiosido KA como edulcorante en un producto de consumo por via oral, que es una bebida u otro producto de consumo por via oral.
Tambien se describen en este documento y se mencionan a continuacion, pero no reivindicados en las presentes reivindicaciones, son edulcorantes designados rebaudiosido V y rebaudiosido W que consisten en las estructuras 10 qmmicas mostradas a continuacion:
imagen11
En ciertas realizaciones, el rebaudiosido KA se puede obtener para uso como un unico edulcorante, y el producto tiene una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa.
15 En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el producto de consumo por via oral puede incluir ademas un edulcorante adicional, donde el producto tiene una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (% p/v) de solucion de sacarosa. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, cada ingrediente edulcorante en el producto puede ser un edulcorante de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las
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realizaciones precedentes, cada ingrediente edulcorante en el producto puede ser un edulcorante natural de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el edulcorante adicional puede ser uno o mas edulcorantes seleccionados de un extracto de stevia, un glicosido de esteviol, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido D2, rebaudiosido E, rebaudiosido F, rebaudiosido G, rebaudiosido M, dulcosido A, rubusosido, esteviolbiosido, sacarosa, jarabe de mafz con alto contenido de fructosa, glucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartame, neotame, sucralosa, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidina dihidrocalcona (NDHC), rubusosido, mogrosido IV, siamenosido I, mogrosido V, monatina, taumatina, monelina, brazzeina, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtain y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el producto de bebida y el producto de consumo pueden incluir ademas uno o mas aditivos seleccionados de un carbohidrato, un poliol, un aminoacido o sal del mismo, un poliaminoacido o sal del mismo, un acido de azucar o sal del mismo, un nucleotido, un acido organico, un acido inorganico, una sal organica, una sal de acido organico, una sal de base organica, una sal inorganica, un compuesto amargo, un saborizante, un ingrediente saborizante, un compuesto astringente, una protema, un hidrolizado de protemas, un surfactante, un emulsionante, un flavonoide, un alcohol, un polfmero y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido V tiene una pureza desde aproximadamente 50% a aproximadamente 100% en peso antes de anadirse al producto. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el W tiene una pureza desde aproximadamente 50% a aproximadamente 100% en peso antes de anadirse al producto. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido V en el producto es un rebaudiosido V polimorfo o rebaudiosido amorfo V. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido V en el producto es un estereoisomero de rebaudiosido V. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido W en el producto es un rebaudiosido W polimorfo o rebaudiosido W amorfo. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido W en el producto es un estereoisomero de rebaudiosido W.
Otros aspectos de la presente divulgacion se dirigen a un metodo de preparacion de un producto de bebida y un producto de consumo mediante la inclusion de rebaudiosido KA sintetizado en el producto o en los ingredientes para preparar el producto de bebida y el producto de consumo, donde el rebaudiosido KA esta presente en el producto a una concentracion desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm. Otros aspectos de la presente divulgacion se dirigen a un metodo para mejorar el dulzor de un producto de bebida y un producto de consumo mediante la adicion desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido KA sintetizado, donde el rebaudiosido KA sintetizado agregado mejora el dulzor del producto de bebida y el producto de consumo en comparacion con un producto de bebida o producto de consumo correspondiente que carece del rebaudiosido KA sintetizado.
Otros aspectos de la presente divulgacion se dirigen a un metodo de preparacion de un producto de bebida edulcorado o un producto de consumo edulcorado mediante: a) proporcionar un producto de bebida o un producto de consumo que contiene uno o mas edulcorantes; y b) anadir desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de uno o mas rebaudiosidos sintetizados, incluyendo el rebaudiosido KA, y seleccionado entre el rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M y el rebaudiosido G, y combinaciones de los mismos en el producto de bebida o el producto de consumo.
En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el metodo incluye ademas la adicion de uno o mas aditivos al producto de bebida o al producto de consumo. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el producto de consumo por via oral contiene ademas uno o mas aditivos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el uno o mas aditivos se seleccionan de un carbohidrato, un poliol, un aminoacido o sal del mismo, un poli- aminoacido o sal del mismo, un acido de azucar o sal del mismo, un nucleotido, un acido organico, un acido inorganico, una sal organica, una sal de acido organico, una sal de base organica, una sal inorganica, un compuesto amargo, un saborizante, un ingrediente saborizante, un compuesto astringente, una protema, una hidrolizado de protema, un surfactante, un emulsionante, un flavonoide, un alcohol, un polfmero y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, cada ingrediente edulcorante en el producto es un edulcorante de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, cada ingrediente edulcorante en el producto es un edulcorante natural de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el edulcorante se selecciona de un extracto de estevia, un glicosido de esteviol, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido D2, rebaudiosido E, rebaudiosido F, rebaudiosido G, rebaudiosido M, dulcosido A, rubusosido, esteviolbiosido, sacarosa, jarabe de mafz con alto en fructosa, fructosa, glucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, Acek, aspartame, neotame, sucralosa, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidina dihidrocalcona (NDHC), rubusosido, mogrosido IV, siamenosido I, mogrosido V, monatina, taumatina, monelina, brazzeina, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtain y combinaciones de los mismos. En ciertas
realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido V tiene una pureza desde aproximadamente 50% a aproximadamente 100% en peso antes de anadirse al producto. En ciertas
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realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido V en el producto es un rebaudiosido V polimorfo o rebaudiosido V amorfo. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido W tiene una pureza de aproximadamente 50% a aproximadamente 100% en peso antes de anadirse al producto. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido W en el producto es un rebaudiosido W polimorfo o rebaudiosido W amorfo.
Breve descripcion de los dibujos
La divulgacion se comprendera mejor y otras caractensticas, aspectos y ventajas distintas de las expuestas anteriormente se haran evidentes cuando se considere la siguiente descripcion detallada de la misma. Tal descripcion detallada hace referencia a los siguientes dibujos, en los que:
La figura 1 representa una ruta de biosmtesis de glucosidos de esteviol a partir de esteviol.
La figura 2 representa el analisis de SDS-PAGE de protemas recombinantes purificadas indicadas por las flechas: A: HV1, B: UGT76G1, C: EUGT11, D: AtSUSI, E: UGT76G1-SUS1 (GS), F: EUGT11-SUS1 (EUS).
La figura 3 representa la reaccion de catalisis HV1 para producir el rebaudiosido KA ("Reb KA") y rebaudiosido E ("Reb E") a partir de rubusosido. A-C: muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rubusosido ("Rub"), esteviosido ("Ste") y rebaudiosido E ("Reb E"). Reb kA producido enzimaticamente por HV1 solo a las 6 h (D), 12 h (F) y 24 horas (H); Reb KA y Reb E producidos enzimaticamente por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (HV1-AtSUSl) a las 6 h (E), 12 h (G) y 24 h (I).
La figura 4 representa la conversion de Reb E en rebaudiosido Z por HV1. (A): muestra el tiempo de retencion de HPLC del rebaudiosido E ("Reb E"). Rebaudiosido Z ("Reb Z") producido enzimaticamente por HV1 en el sistema de acoplamiento HV1-AtSUS1 a las 3 h (B), 7 h (C), 24 h (D) y 44 h (E).
La figura 5 representa la conversion de Reb KA a Reb E por HV1. (A-B): muestra los tiempos de retencion de HPLC de rebaudiosido KA ("Reb KA") y rebaudiosido E estandar ("Reb E"). Reb E enzimaticamente producido por HV1 solo a las 12 h (C); Reb E producido enzimaticamente por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (HV1-AtSUS1) a las 12 h (D).
La figura 6 representa la reaccion de catalisis EUGT11 para producir Reb KA y esteviosido a partir de rubusosido. (AF): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rubusosido ("Rub"), esteviosido ("Ste"), rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido E ("Reb E"), rebaudiosido D ("Reb D") y rebaudiosido D2 ("Reb D2"). Reaccion enzimatica por EUGT11 solo a las 12 h (G) y 48 h (J); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (EUGT11- AtSUS1) a las 12 h (H) y 48 h (K); reaccion enzimatica por la protema de fusion EUS a las 12 h (I) y 48 h (L).
La figura 7 representa la conversion de Reb KA a Reb E y Reb D2 por las protemas de fusion EUGT11 y EUS. (A-C): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rebaudiosido Ka ("Reb KA"), rebaudiosido E ("Reb E") y rebaudiosido D2 ("Reb D2"). Reaccion enzimatica por EUGT11 solo a las 12 h (D) y 48 h (G); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (EUGT11-AtSUS1) a las 12 h (E) y 48 h (H); reaccion enzimatica por la protema de fusion EUS a las 12 h (F) y 48 h (I).
La figura 8 representa la produccion UGT76G1 de rebaudiosido G in vitro. (A-B): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rubusosido ("Rub") y rebaudiosido G ("Reb G"). Reaccion enzimatica por UGT76G1 solo a las 12 h (C) y 24 h (F); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (EUGT11-AtSUS1) a las 12 h (D) y 24 h (G); reaccion enzimatica por la protema de fusion GS a las 12 h (E) y 48 h (H).
La figura 9 representa la reaccion de catalisis UGT76G1 para producir los glicosidos de esteviol Reb V y Reb W a partir del rebaudiosido KA. (A-D): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rubusosido ("Rub"), rebaudiosido D ("Reb D"), rebaudiosido E ("Reb E") y rebaudiosido KA ("Reb KA"). Reaccion enzimatica por UGT76G1 solo a las 6 h (e) y 12 h (H); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (UGT76G1-AtSUS1) a las 6 h (F) y 12 h (I); reaccion enzimatica por la protema de fusion GS a las 6 h (G) y 12 h (J).
La figura 10 representa la conversion UGT76G1 de Reb V a Reb W in vitro. (A-B): muestra los tiempos de retencion de HPLC de Reb V y Reb W. (C): reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT76G1-AtSUS1 a las 6 h.
La figura 11 representa la conversion HV1 de Reb G a Reb V. (A-C): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido A ("Reb A") y rebaudiosido E ("Reb E"). Reaccion enzimatica por HV1 solo a las 12 h (D) y 24 h (F); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UgT-SUS (HV1-AtSUS1) a las 12 h (E) y las 24 h (G).
La figura 12 representa la conversion EUGT11 de Reb G a Reb V. (A-D): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido A ("Reb A"), rebaudiosido E ("Reb E") y rebaudiosido D ("Reb D") patrones. Reaccion enzimatica por EUGT11 solo a las 12 h (E) y 24 h (H); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (EUGT11-AtSUSl) a las 12 h (F) y 24 h (I); reaccion enzimatica por la enzima de fusion EUS a las 12 h (G) y 24 h (J).
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La figura 13 representa la produccion in vitro de Reb W a partir de rubusosido catalizada por una combinacion de un polipeptido HV1 recombinante, una UGT76G1 recombinante, una enzima de fusion GS y un AtSUS1 recombinante. (A- F): muestra los patrones de rubusosido ("Rub"), esteviosido ("Ste"), Rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido A ("Reb A"), Rebaudiosido D ("Reb D") y rebaudiosido E ("Reb E"). Reb W producido enzimaticamente por HV1, UGT76G1 y AtSuSI a las 6 horas (G), 12 h (I) y 24 h (K); Reb W producido enzimaticamente por HV1 y protema de fusion GS a las 6 horas (H), 12 h (J) y 24 h (L).
La figura 14 representa la produccion in vitro de Reb W a partir de rubusosido catalizada por una combinacion de un polipeptido EUGT11 recombinante, una UGT76G1 recombinante, una enzima de fusion GS y un AtSUS1 recombinante. (A-E): muestra los patrones de rubusosido ("Rub"), esteviosido ("Ste"), rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido E ("Reb E") y rebaudiosido D ("Reb D"). Reb W producido enzimaticamente por EUGT11, UGT76G1 y AtSuS1 a las 12 horas (F) y 48 h (H); Reb W producido enzimaticamente por EUGT11 y protema de fusion GS a las 12 horas (G) y 48 horas (I).
La figura 15 representa la produccion in vitro de Reb W a partir de Reb G catalizada por una combinacion de un polipeptido HV1 recombinante, una UGT76G1 recombinante, una enzima de fusion GS y un AtSUS1 recombinante. A-D muestra los patrones de rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido A ("Reb A"), Rebaudiosido D ("Reb D"), rebaudiosido y rebaudiosido E ("Reb E"). Reb V y Reb W producidos enzimaticamente por HV1, UGT76G1 y AtSUS1 a las 6 horas (E), 12 h (G) y 36 h (l); Reb V y Reb W producidos enzimaticamente por HV1 y protemas de fusion GS a las 6 horas (F), 12 h (H) y 36 h (J).
La figura 16 representa la produccion in vitro de Reb W a partir de Reb G catalizada por una combinacion de un polipeptido EUGT11 recombinante, una UGT76G1 recombinante, una enzima de fusion GS y un AtSUS1 recombinante. (A-D): muestra los patrones de rebaudiosido G ("Reb G"), rebaudiosido A ("Reb A"), rebaudiosido E ("Reb E") y rebaudiosido D ("Reb D"). Reb W producido enzimaticamente por EUGT11, UGT76G1 y AtSUS1 a las 12 horas (E) y 48 h (G); Reb W producido enzimaticamente por EUGT11 y protema de fusion GS a las 12 horas (F) y 48 horas (H).
La figura 17 representa las estructuras de Reb V y Reb G.
La figura 18 representa las correlaciones de TOCSY y HMBC clave de Reb V.
La figura 19 representa las estructuras de Reb W y Reb V.
La figura 20 representa las correlaciones de TOCSY y HMBC clave de Reb W.
La figura 21 representa la ruta de biosmtesis de los glucosidos de esteviol.
La figura 22 representa la produccion in vitro de Reb M a partir de Reb D catalizada por UGT76G1 y enzima de fusion GS. (A-B): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rebaudiosido D ("Reb D") y rebaudiosido M ("Reb M"). Reaccion enzimatica por UGT76G1 solo a las 3 h (C) y 6 h (F); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (UGT76G1-AtSUS1) a las 3 h (D) y 6 h (G); reaccion enzimatica por la enzima de fusion GS a las 3 h (E) y 6 h (H).
La figura 23 representa la produccion in vitro de Reb D y Reb M a partir de Reb E catalizada por UGT76G1 y enzima de fusion GS. (A-C): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rebaudiosido E ("Reb E"), rebaudiosido D ("Reb D") y rebaudiosido M ("Reb M"). Reaccion enzimatica por UGT76G1 solo a las 3 h (D), 12 h (G) y 24 h (J); reaccion enzimatica por el sistema de acoplamiento UGT-SUS (UGT76G1-AtSUS1) a las 3 h (E), 12 h (H) y 24 h (k); reaccion enzimatica por la enzima de fusion GS a las 3 h (F), 12 h (I) y 24 h (L).
La figura 24 representa la produccion in vitro de Reb D y Reb M a partir de esteviosido catalizado por una combinacion de un HV1 recombinante, una UGT76G1 recombinante, una enzima de fusion GS y/o un AtSUS1 recombinante (A-D): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de esteviosido ("Ste"), rebaudiosido A ("Reb A"), rebaudiosido D ("Reb D") y rebaudiosido M ("Reb M). Reaccion enzimatica por HV1 y UGT76G1 en el sistema de acoplamiento UGT- SUS a las 6 h (E), 12 h (H) y 24 h (k); reaccion enzimatica por HV1 y enzima de fusion GS a las 6 h (f), 12 h (I) y 24 h (L). Reaccion enzimatica por UGT76G1 y HV1 a las 6 h (G), 12 h (J) y 24 h (M).
La figura 25 representa la produccion in vitro de Reb D y Reb M a partir del rebaudiosido A catalizada por una combinacion de HV1 recombinante, una UGT76G1 recombinante, una enzima de fusion GS y/o un AtSUS1 recombinante. (A-C): muestra los tiempos de retencion de HPLC de patrones de rebaudiosido A ("Reb A"), rebaudiosido D ("Reb D") y rebaudiosido M ("Reb M). Reaccion enzimatica por HV1 y UGT76G1 en el sistema de acoplamiento UGT- SUS a las 6 h (D), 12 h (G) y 24 h (J); reaccion enzimatica por HV1 y enzima de fusion GS a las 6 h (E), 12 h (H) y 24 h (K). Reaccion enzimatica por UGT76G1 y HV1 a las 6 h (F), 12 h (I) y 24 h (J).
La figura 26 representa la estructura de Reb M.
La figura 27 muestra las correlaciones de TOCSY y HMBC clave de Reb M.
Descripcion detallada
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A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en el arte a la que pertenece la divulgacion. Aunque cualquier metodo y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden usar en la practica o prueba de la presente divulgacion, los materiales y metodos preferidos se describen a continuacion.
El termino "complementario" se usa segun su significado comun y habitual, tal como lo entiende un experto en el arte, y se usa sin limitacion para describir la proporcion entre las bases de nucleotidos que son capaces de hibridar entre st Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. De acuerdo con lo anterior, la tecnologfa en cuestion tambien incluye fragmentos de acido nucleico aislados que son complementarios a las secuencias completas como se informa en la lista de secuencias que se acompana, asf como aquellas secuencias de acido nucleico sustancialmente similares.
Los terminos "acido nucleico" y "nucleotido" se usan segun sus respectivos significados comunes y habituales, tal como los entiende un experto en el arte, y se usan sin limitacion para referirse a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y polfmeros de los mismos ya sea en forma de cadena simple o doble. A menos que se limite espedficamente, el termino abarca acidos nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales que tienen propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleotidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de acido nucleico tambien abarca implfcitamente variantes modificadas de forma conservadora o degeneradas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, asf como la secuencia explfcitamente indicada.
El termino "aislado" se usa segun su significado comun y habitual, tal como lo entiende un experto en el arte, y cuando se usa en el contexto de un acido nucleico aislado o un polipeptido aislado, se usa sin limitacion para referirse a un acido nucleico o polipeptido que, de la mano del hombre, existe aparte de su entorno nativo y, por lo tanto, no es un producto de la naturaleza. Un acido nucleico o polipeptido aislado puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, en una celula huesped transgenica.
Los terminos "que incuba" e "incubacion", como se usan en este documento, se refieren a un proceso de mezcla de dos o mas entidades qmmicas o biologicas (tal como un compuesto qdmico y una enzima) y permitirles interactuar en condiciones favorables para producir una composicion de glicosido de esteviol.
El termino "variante degenerada" se refiere a una secuencia de acido nucleico que tiene una secuencia de residuos que difiere de una secuencia de acido nucleico de referencia en una o mas sustituciones de codones degenerados. Las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) esta sustituida con una base mixta y/o residuos de desoxinosina. Una secuencia de acido nucleico y todas sus variantes degeneradas expresaran el mismo aminoacido o polipeptido.
Los terminos "polipeptido", "protema" y "peptido" se usan segun sus respectivos significados comunes y habituales, tal como los entiende un experto en el arte; los tres terminos se usan indistintamente, y se usan sin limitacion para referirse a un polfmero de aminoacidos, o analogos de aminoacidos, independientemente de su tamano o funcion. Aunque la "protema" se usa a menudo en referencia a polipeptidos relativamente grandes, y el "peptido" se usa a menudo en referencia a polipeptidos pequenos, el uso de estos terminos en la tecnica se solapa y vana. El termino "polipeptido", como se usa en este documento, se refiere a peptidos, polipeptidos y protemas, a menos que se indique lo contrario. Los terminos "protema", "polipeptido" y "peptido" se usan indistintamente en este documento cuando se hace referencia a un producto polinucleotido. De este modo, los polipeptidos de ejemplo incluyen productos polinucleotfdicos, protemas de origen natural, homologos, ortologos, paralogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y analogos de los anteriores.
Los terminos "fragmento de polipeptido" y "fragmento", cuando se usan en referencia a un polipeptido de referencia, se usan segun sus significados comunes y habituales para un experto normal en el arte, y se usan sin limitacion para referirse a un polipeptido en el que los residuos de aminoacidos se eliminan en comparacion con el propio polipeptido de referencia, pero donde la secuencia de aminoacidos restante suele ser identica a las posiciones correspondientes en el polipeptido de referencia. Tales eliminaciones pueden ocurrir en el termino amino o en el termino carboxi del polipeptido de referencia, o alternativamente ambos.
El termino "fragmento funcional" de un polipeptido o protema se refiere a un fragmento peptfdico que es una porcion del polipeptido o protema de longitud completa, y tiene sustancialmente la misma actividad biologica, o realiza sustancialmente la misma funcion que la longitud completa polipeptido o protema (por ejemplo, llevando a cabo la misma reaccion enzimatica).
Los terminos "polipeptido variante", "secuencia de aminoacidos modificada" o "polipeptido modificado", que se usan indistintamente, se refieren a una secuencia de aminoacidos que es diferente del polipeptido de referencia por uno o mas aminoacidos, por ejemplo, por una o mas sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoacidos. En un aspecto, una variante es una "variante funcional" que conserva parte o toda la capacidad del polipeptido de referencia.
El termino "variante funcional" incluye ademas variantes conservativamente sustituidas. El termino "variante sustituida de manera conservadora" se refiere a un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos que difiere de un peptido de
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referencia en una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas, y mantiene parte o toda la actividad del peptido de referencia. Una "sustitucion conservadora de aminoacidos" es una sustitucion de un residuo de aminoacido con un residuo funcionalmente similar. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitucion de un residuo no polar (hidrofobo), tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro; la sustitucion de un residuo cargado o polar (hidrofilo) por otro tal como entre la arginina y la lisina, entre la glutamina y la asparagina, entre la treonina y la serina; la sustitucion de un residuo basico tal como lisina o arginina por otro; o la sustitucion de un residuo acido, tal como el acido aspartico o el acido glutamico por otro; o la sustitucion de un residuo aromatico, tal como fenilalanina, tirosina o triptofano por otro. Se espera que tales sustituciones tengan poco o ningun efecto sobre el peso molecular aparente o el punto isoelectrico de la protema o polipeptido. La frase "variante sustituida de forma conservadora" tambien incluye peptidos en los que un residuo se reemplaza con un residuo derivado qmmicamente, siempre que el peptido resultante mantenga parte o toda la actividad del peptido de referencia como se describe en este documento.
El termino "variante", en proporcion con los polipeptidos de la tecnologfa en cuestion, incluye ademas un polipeptido funcionalmente activo que tiene una secuencia de aminoacidos al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% identica a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de referencia.
El termino "homologo" en todas sus formas gramaticales y variaciones ortograficas se refiere a la proporcion entre polinucleotidos o polipeptidos que poseen un "origen evolutivo comun", incluidos polinucleotidos o polipeptidos de superfamilias y polinucleotidos o protemas homologas de diferentes especies (Reeck et al., Cell 50:667, 1987). Tales polinucleotidos o polipeptidos tienen homologfa de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en terminos de porcentaje de identidad o la presencia de aminoacidos espedficos o motivos en posiciones conservadas. Por ejemplo, dos polipeptidos homologos pueden tener secuencias de aminoacidos que son al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% identicas.
El "porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos (%)” con respecto a las secuencias polipeptfdicas variantes de la tecnologfa en cuestion se refiere al porcentaje de residuos de aminoacidos en una secuencia candidata que son identicos a los residuos de aminoacidos de un polipeptido de referencia despues de la alineacion de las secuencias y la introduccion de brechas, si es necesario, para lograr el porcentaje maximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitucion conservadora como parte de la identidad de secuencia.
La alineacion con el proposito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos se puede lograr de diversas maneras que estan dentro de la habilidad de la tecnica, por ejemplo, usando un software informatico disponible publicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALlGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en el arte pueden determinar los parametros apropiados para medir la alineacion, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineacion maxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de aminoacidos se puede determinar usando el programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2. El programa de comparacion de secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de ncbi.nlm.nih.gov. NCBI-BLAST2 usa varios parametros de busqueda, en el que todos esos parametros de busqueda se configuran en valores predeterminados que incluyen, por ejemplo, desenmascarar sf, hebra = todos, ocurrencias esperadas 10, longitud minima de complejidad baja = 15/5, evaluacion de multiples etapas = 0.01, constante para paso multiple = 25, reduccion para alineacion final con brechas = 25 y matriz de puntuacion = BLOSUM62. En situaciones en las que se emplea NCBI- BLAST2 para comparaciones de secuencias de aminoacidos, el % de identidad de la secuencia de aminoacidos de una secuencia de aminoacidos dada A, con o contra una secuencia de aminoacidos B dada (que alternativamente se puede expresar como una secuencia de aminoacidos A dada que tiene o comprende un cierto% de identidad de secuencia de aminoacidos con, con o contra una secuencia de aminoacidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fraccion X/Y donde X es el numero de residuos de aminoacidos marcados como coincidencias identicas por el programa de alineacion de secuencias NCBI-BLAST2 en la alineacion de A y B de ese programa, y donde Y es el numero total de residuos de aminoacidos en B. Se apreciara que donde la longitud de la secuencia de aminoacidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoacidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoacidos de A a B no sera igual al % de identidad de la secuencia de aminoacidos de B a A
En este sentido, las tecnicas para determinar la "similitud" de la secuencia de aminoacidos son bien conocidas en la tecnica. En general, "similitud" se refiere a la comparacion exacta de aminoacido a aminoacido de dos o mas polipeptidos en el lugar apropiado, donde los aminoacidos son identicos o poseen propiedades qmmicas y/o ffsicas similares, tal como la carga o la hidrofobicidad. Un denominado "porcentaje de similitud" puede entonces determinarse entre las secuencias polipeptfdicas comparadas. Las tecnicas para determinar la identidad de la secuencia de aminoacidos y acidos nucleicos tambien son bien conocidas en la tecnica e incluyen la determinacion de la secuencia de nucleotidos del ARNm para ese gen (generalmente a traves de un intermedio de ADNc) y la determinacion de la secuencia de aminoacidos codificada en este, y la comparacion de esta con una segunda secuencia de aminoacidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleotido a nucleotido o de aminoacido a
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aminoacido de dos polinucleotidos o secuencias polipeptidicas, respectivamente. Se pueden comparar dos o mas secuencias de polinucleotidos determinando su "porcentaje de identidad", al igual que dos o mas secuencias de aminoacidos. Los programas disponibles en el Paquete de Analisis de Secuencias de Wisconsin, Version 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wis.), por ejemplo, el programa GAP, son capaces de calcular tanto la identidad entre dos polinucleotidos como la identidad y similitud entre dos secuencias de polipeptidos, respectivamente. Los expertos en el arte conocen otros programas para calcular la identidad o similitud entre secuencias.
Una posicion de aminoacido "correspondiente a" una posicion de referencia se refiere a una posicion que se alinea con una secuencia de referencia, como se identifica al alinear las secuencias de aminoacidos. Tales alineaciones se pueden hacer a mano o usando programas de alineacion de secuencias bien conocidos como ClustalW2, Blast 2, etc.
A menos que se especifique lo contrario, el porcentaje de identidad de dos secuencias polipeptfdicas o polinucleotidicas se refiere al porcentaje de residuos de aminoacidos o nucleotidos identicos a lo largo de toda la longitud de la mas corta de las dos secuencias.
La "secuencia codificante" se usa segun su significado comun y habitual, tal como la entiende un experto en el arte, y se usa sin limitacion para referirse a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoacidos espedfica.
"Secuencias reguladoras apropiadas" se usa segun su significado comun y habitual, como lo entiende un experto en el arte, y se usa sin limitacion para referirse a secuencias de nucleotidos ubicadas aguas arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o aguas abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripcion, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traduccion de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias lfder de traduccion, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilacion.
El "promotor" se usa de acuerdo con su significado normal y habitual, tal como lo entiende un experto en la tecnica, y se usa sin limitacion para referirse a una secuencia de aDn capaz de controlar la expresion de una secuencia de codificacion o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se ubica 3' a una secuencia promotora. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintetico. Los expertos en el arte entenderan que diferentes promotores pueden dirigir la expresion de un gen en diferentes tipos de celulas, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores, que hacen que un gen se exprese en la mayona de los tipos de celulas en la mayona de los casos, se conocen comunmente como "promotores constitutivos". Ademas, se reconoce que dado que en la mayona de los casos los lfmites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora identica.
El termino "unido operativamente" se refiere a la asociacion de secuencias de acido nucleico en un unico fragmento de acido nucleico de modo que la funcion de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresion de esa secuencia codificante (esto es, que la secuencia codificante esta bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes se pueden unir operativamente a secuencias reguladoras en orientacion de sentido o antisentido.
El termino "expresion", como se usa en este documento, se usa segun su significado comun y habitual, tal como lo entiende un experto en el arte, y se usa sin limitacion para referirse a la transcripcion y la acumulacion estable de sentido (ARNm) o ARN antisentido derivado del fragmento de acido nucleico de la tecnologfa en cuestion. La "sobreexpresion" se refiere a la produccion de un producto genico en organismos transgenicos o recombinantes que excede los niveles de produccion en organismos normales o no transformados.
La "transformacion" se usa segun su significado comun y habitual, tal como lo entiende un experto en el arte, y se usa sin limitacion para referirse a la transferencia de un polinucleotido a una celula diana. El polinucleotido transferido se puede incorporar en el genoma o el ADN cromosomico de una celula diana, lo que resulta en una herencia geneticamente estable, o puede replicarse independientemente del cromosoma del huesped. Los organismos huesped que contienen los fragmentos de acido nucleico transformados se denominan organismos "transgenicos" o "recombinantes" o "transformados".
Los terminos "transformado", "transgenico" y "recombinante", cuando se usan en este documento en proporcion con las celulas huesped, se usan segun sus significados comunes y habituales segun entiende por un experto en el arte, y se usan sin limitacion para referirse a una celula de un organismo huesped, tal como una planta o celula microbiana, en la que se ha introducido una molecula de acido nucleico heterologa. La molecula de acido nucleico se puede integrar de manera estable en el genoma de la celula huesped, o la molecula de acido nucleico puede estar presente como una molecula extracromosomica. Dicha molecula extracromosomica puede ser autoreplicante. Se entiende que las celulas, tejidos o sujetos transformados abarcan no solo el producto final de un proceso de transformacion, sino tambien su progenie transgenica.
Los terminos "recombinante", "heterologo" y "exogeno", cuando se usan en este documento en proporcion con polinucleotidos, se usan segun sus significados comunes y habituales segun entiende un experto normal en el arte, y se
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usan sin limitacion para referirse a un polinucleotido (por ejemplo, una secuencia de ADN o un gen) que se origina en una fuente extrana a la celula huesped particular o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. De este modo , un gen heterologo en una celula huesped incluye un gen que es endogeno a la celula huesped particular pero que se ha modificado mediante, por ejemplo, el uso de mutagenesis dirigida al sitio u otras tecnicas recombinantes. Los terminos tambien incluyen copias multiples de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. De este modo, los terminos se refieren a un segmento de ADN que es extrano o heterologo a la celula, u homologo a la celula pero en una posicion o forma dentro de la celula huesped en la que el elemento no se encuentra normalmente.
De manera similar, los terminos "recombinante", "heterologo" y "exogeno", cuando se usan en este documento en proporcion con una secuencia de polipeptido o aminoacido, significan una secuencia de polipeptido o aminoacidos que se origina en una fuente extrana a la celula huesped particular o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. De este modo, los segmentos de ADN recombinante se pueden expresar en una celula huesped para producir un polipeptido recombinante.
Los terminos "plasmido", "vector" y "casete" se usan segun sus significados comunes y habituales, tal como los entiende un experto en el arte, y se usan sin limitacion para referirse a un elemento cromosomico adicional. a menudo portan genes que no forman parte del metabolismo central de la celula, y generalmente en forma de moleculas de ADN de doble cadena circular. Tales elementos pueden ser secuencias de replicacion autonoma, secuencias de integracion del genoma, secuencias de fagos o nucleotidos, lineales o circulares, de un ADN o ARN de cadena simple o doble, derivados de cualquier fuente, en la que se hayan unido o recombinado un numero de secuencias de nucleotidos en una construccion unica que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto genico seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una celula. El "casete de transformacion" se refiere a un vector espedfico que contiene un gen extrano y que tiene elementos ademas del gen extrano que facilita la transformacion de una celula huesped en particular. El "casete de expresion" se refiere a un vector espedfico que contiene un gen extrano y tiene elementos ademas del gen extrano que permite una expresion mejorada de ese gen en un huesped extrano.
El ADN recombinante estandar y las tecnicas de clonacion molecular usadas en este documento son bien conocidas en la tecnica y estan descritas, por ejemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 (en lo que sigue "Maniatis"); y por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1984; y por Ausubel, F. M. et al., in 'Current Protocols in Molecular Biology', publicado por Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987.
Como se usa en este documento, "sintetico" o "sintetizado organicamente" o "sintetizado qmmicamente" o "sintetizando organicamente" o "sintetizando qmmicamente" o "smtesis organica" o "smtesis qmmica" se usan para referirse a la preparacion de los compuestos a traves de una serie de reacciones qmmicas; esto no incluye la extraccion del compuesto, por ejemplo, de una fuente natural.
El termino "producto de consumo por via oral", como se usa en este documento, se refiere a cualquier bebida, producto alimenticio, suplemento dietetico, nutraceutico, composicion farmaceutica, composicion higienica dental y producto cosmetico que se ponen en contacto con la boca del hombre o animal, incluidas las sustancias que son ingeridos y posteriormente expulsados de la boca y sustancias que se beben, se comen, se tragan o se ingieren de otra manera; y que son seguros para el consumo humano o animal cuando se usan en un intervalo de concentraciones generalmente aceptable.
El termino "producto alimenticio" como se usa en este documento se refiere a frutas, verduras, jugos, productos carnicos tales como jamon, tocino y salchichas; productos de huevo, concentrados de frutas, gelatinas y productos similares a la gelatina, tales como mermeladas, jaleas, conservas y similares; productos lacteos tales como helado, crema agria, yogur y sorbete; glaseados, siropes incluyendo melaza; productos de mafz, trigo, centeno, soja, avena, arroz y cebada, productos de cereales, carnes de nuez y productos de nueces, pasteles, galletas, confitena tales como caramelos, gomas, gotas con sabor a frutas y chocolates, chicles, mentas, cremas, glaseado, helados, tartas y panes. "Producto alimenticio" tambien se refiere a condimentos tales como hierbas, especias y condimentos, potenciadores del sabor, tales como el glutamato monosodico. "Producto alimenticio" tambien se refiere a los productos envasados preparados, tales como edulcorantes dieteticos, edulcorantes lfquidos, aromatizantes de mesa, mezclas de sabores granulados que, al reconstituirse con agua, brindan bebidas no carbonatadas, mezclas de pudm instantaneo, cafe y te instantaneos, blanqueadores de cafe, mezclas de leche malteada, alimentos para mascotas, piensos para ganado, tabaco y materiales para aplicaciones de horneado, tales como mezclas para hornear en polvo para la preparacion de panes, galletas, pasteles, tortitas, rosquillas y similares. "Producto alimenticio" tambien se refiere a alimentos y bebidas dieteticos o bajos en calonas que contienen poca o nada de sacarosa.
Como se usa en este documento, el termino "estereoisomero" es un termino general para todos los isomeros de moleculas individuales que difieren solo en la orientacion de sus atomos en el espacio. "Estereoisomero" incluye enantiomeros e isomeros de compuestos con mas de un centro quiral que no son imagenes especulares entre sf (diastereoisomeros).
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Como se usa en este documento, el termino "rebaudiosido V amorfo" se refiere a una forma solida no cristalina de rebaudiosido V. Como se usa en este documento, el termino "rebaudiosido W amorfo" se refiere a una forma solida no cristalina de rebaudiosido W.
Como se usa en este documento, el termino "intensidad de dulzor" se refiere a la fuerza relativa de la sensacion dulce observada o experimentada por un individuo, por ejemplo, un ser humano, o un grado o cantidad de dulzor detectado por un catador, por ejemplo en una escala de brix.
Como se usa en este documento, el termino "potenciar el dulzor" se refiere al efecto del rebaudiosido V y/o el rebaudiosido W para incrementar, aumentar, intensificar, acentuar, magnificar y/o potenciar la percepcion sensorial de una o mas caractensticas de dulzor de un producto de bebida o un producto de consumo de la presente divulgacion sin cambiar su naturaleza o calidad, en comparacion con un producto de consumo por via oral correspondiente que no contiene rebaudiosido V y/o rebaudiosido W.
Como se usa en este documento, el termino "sabor(es) desagradable(s)" se refiere a una cantidad o grado de sabor que no se encuentra caractenstica o generalmente en un producto de bebida o un producto de consumo de la presente divulgacion. Por ejemplo, un sabor desagradable es un sabor indeseable de un consumible edulcorado para los consumidores, tal como, un sabor amargo, un sabor a regaliz, un sabor metalico, un sabor aversivo, un sabor astringente, un inicio tardfo de dulzor, un efecto persistente de regusto dulce, y similares, etc.
Como se usa en este documento, el termino "% p/v" se refiere al peso de un compuesto, tal como un azucar, (en gramos) por cada 100 ml de un producto lfquido consumible por via oral de la presente divulgacion que contiene tal compuesto. Como se usa en este documento, el termino "% p/p" se refiere al peso de un compuesto, tal como un azucar, (en gramos) por cada gramo de un producto de consumo por via oral de la presente divulgacion que contiene tal compuesto.
Como se usa en este documento, el termino "ppm" se refiere a parte (s) por millon en peso, por ejemplo, el peso de un compuesto, tal como el rebaudiosido V y/o el rebaudiosido W (en miligramos) por kilogramo de un producto de consumo por via oral de la presente divulgacion que contiene tal compuesto (esto es, mg/kg) o el peso de un compuesto, tal como el rebaudiosido V y/o el rebaudiosido W (en miligramos) por litro de un producto de consumo por via oral de la presente divulgacion que contiene tal compuesto (esto es, mg/L); o por volumen, por ejemplo, el volumen de un compuesto, tal como el rebaudiosido V y/o el rebaudiosido W (en mililitros) por litro de un producto de consumo por via oral de la presente divulgacion que contiene tal compuesto (esto es, ml/L).
La siguiente divulgacion se refiere a diversos edulcorantes no caloricos y a metodos de smtesis de edulcorantes no caloricos. Sin embargo, la invencion reivindicada debe entenderse por referencia a las presentes reivindicaciones.
Edulcorantes sinteticos no caloricos: Rebaudiosido V sintetico
En un aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante sintetico no calorico. El edulcorante sintetico no calorico es un glicosido de esteviol de tipo rebaudiosido sintetico y se le ha dado el nombre de "Rebaudiosido V". El rebaudiosido V ("Reb V") es un glicosido de esteviol que tiene cuatro unidades de p-D-glucosilo en su estructura conectada a la aglicona esteviol, una unidad estructural de esteviol aglicona con una unidad Glc pi-3-Glc pi en C-13 en la forma del enlace eter y otra unidad Glc pi-2-Glc pi en la posicion C-19 en forma de un enlace ester.
El rebaudiosido V tiene la formula molecular C44H70O23 y el nombre IUPAC, ester (2-O-p-D-glucopiranosil-p-D- glucopiranosilo) del acido 13-[(3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico sobre la base de RMN 1D y 2D extensa, asf como datos de espectros de masas de alta resolucion y estudios de hidrolisis.
Edulcorantes sinteticos no caloricos: Rebaudiosido sintetico W
En un aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante sintetico no calorico. El edulcorante sintetico no calorico es un glicosido de esteviol de tipo rebaudiosido sintetico y se le ha dado el nombre de "Rebaudiosido W". El rebaudiosido W ("Reb W") es un glicosido de esteviol que tiene cinco unidades de p-D-glucosilo en su estructura conectada al aglicona esteviol, una unidad estructural de esteviol aglicona con una unidad Glc pi-3-Glc pi en C-13 en la forma del enlace eter y una unidad Glc pi-2 (Glc pi-3) -Glc pi en la posicion C-19 en forma de un enlace ester.
El rebaudiosido W tiene la formula molecular C50H80O28 y el nombre IUPAC, ester [(2-O-p-D-glucopiranosil-3-O-p-D- glucopiranosil-p-D-glucopiranosilo) del acido i3-[(3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi]ent-kaur-i6-en-i9-oico.
Edulcorantes sinteticos no caloricos: Rebaudiosido sintetico KA
En un aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante sintetico no calorico. El edulcorante sintetico no calorico es un glicosido de esteviol de tipo rebaudiosido sintetico y se le ha dado el nombre de "Rebaudiosido KA". El rebaudiosido KA ("Reb KA") es un glicosido de esteviol que tiene tres unidades p-D-glucosilo en su estructura conectada al aglicona esteviol, una unidad estructural de esteviol aglicona con una unidad Glc pi en C-i3 en forma de enlace eter y una unidad Glc pi-2-Glc pi en C-i9 en forma de enlace eter. El rebaudiosido KA tiene la formula molecular C38H6oOi8
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y el nombre IUPAC, ester (2-O-p-D-glucopiranosN-p-D-glucopiranosilo) del acido 13-p-D-glucopiranosiloxi] ent-kaur-16- en-19-oico sobre la base de la RMN 1D y 2D extensa, as^ como los datos de espectros de masas de alta resolucion y los estudios de hidrolisis.
Edulcorantes sinteticos no caloricos: Rebaudiosido sintetico G
En un aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante sintetico no calorico. El edulcorante sintetico no calorico es un glicosido de esteviol de tipo rebaudiosido sintetico y se le ha dado el nombre de "Rebaudiosido G". Rebaudiosido G ("Reb G") es un glicosido de esteviol que tiene tres unidades de p-D-glucosilo en su estructura conectada a la aglicona esteviol, una unidad estructural de esteviol aglicona con una unidad Glc pi-3-Glc pi en C-13 en forma de enlace eter y una unidad Glc pi en C-19 en forma de enlace eter.
El rebaudiosido G tiene la formula molecular C38H60O18 y el nombre IUPAC, ester -p-D-glucopiranosilo del acido 13-[(3- O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico sobre la base de RMN 1D y 2D extensa, asf como los datos de espectros de masas de alta resolucion y estudios de hidrolisis.
Edulcorantes sinteticos no caloricos: Rebaudiosido sintetico M
En un aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante sintetico no calorico. El edulcorante sintetico no calorico es un glicosido de esteviol de tipo rebaudiosido sintetico y se le ha dado el nombre de "Rebaudiosido M". El rebaudiosido M ("Reb M") es un glicosido de esteviol que tiene seis unidades de p-D-glucosilo en su estructura conectada al aglicona esteviol, una unidad estructural de esteviol aglicona con una unidad Glc p1-2 (Glc p1-3) -Glc p 1 en la posicion C-13 en forma de un enlace eter y una unidad Glc p1-2 (Glc p1-3) -Glc1 en la posicion C-19 en forma de un enlace ester.
El rebaudiosido M tiene la formula molecular C56H90O33 y el nombre IUPAC, ester [(2-O-p-D-glucopiranosil-3-0-p-D- glucopiranosil-p-D-glucopiranosilo) del acido 13-[(2-O-p-D-glucopiranosil-3-0-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico sobre la base de RMN 1D y 2D extensa tambien como datos de espectros de masas de alta resolucion y estudios de hidrolisis.
Metodos para sintetizar glicosidos de esteviol
Metodo de produccion de rebaudiosido V a partir de rebaudiosido G. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido V a partir de rebaudiosido G. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido G; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); y una HV1 UDP-glicosiltransferasa; con o sin sacarosa sintasa (SUS) e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido V, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido G para producir el rebaudiosido V.
Metodo de produccion de rebaudiosido V a partir de rebaudiosido G. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido V a partir de rebaudiosido G. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido G; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una uridina difosfato glicosiltransferasa (UDP-glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una EUGT11, una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa (SUS); con o sin sacarosa sintasa (SUS) e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido V, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido G para producir el rebaudiosido V.
Metodo de produccion de rebaudiosido V a partir de rebaudiosido KA. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido V a partir de rebaudiosido KA. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido KA; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una uridina difosfo glicosiltransferasas (UDP- glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una UDP-glicosiltransferasa (UGT76G1) y una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa (SUS) e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido V, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido KA para producir el rebaudiosido V.
Metodo de produccion de rebaudiosido V a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido V a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); uridina difosfato glicosiltransferasa (s) (UDP-glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una UDP-glicosiltransferasa (UGT76G1), HV1 y una enzima de fusion UDP- glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa (SUS) e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido V, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rubusosido para producir el rebaudiosido KA. Continuamente, una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido KA para producir el rebaudiosido V.
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Metodo de produccion de rebaudiosido V de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de una mezcla de rebaudiosido A y rebaudiosido V a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); uridina difosfato glicosiltransferasa (s) (UDP-glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una UDP-glicosiltransferasa (UGT76G1), EUGT11 y una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido V, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rubusosido para producir el rebaudiosido KA y una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido KA para producir el rebaudiosido V. Una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido para producir el rebaudiosido G. Continuamente, una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido G para producir el rebaudiosido V.
Metodo de produccion de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido V. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido V. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido V; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una uridina difosfato glicosiltransferasa (UDP-glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una UDP-glicosiltransferasa (UGT76G1) y una enzima de fusion UDP- glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido W, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido V para producir el rebaudiosido W.
Metodo de produccion de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido G. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido G. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido G; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una uridina difosfo glicosiltransferasa (UDP-glicosiltransferasa) seleccionada entre el grupo que consiste en una uridina difosfo glicosiltransferasa (UGT76G1), una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa y un HV1; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido W, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido G para producir el rebaudiosido V por HV1. Continuamente, una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido V para producir el rebaudiosido W por UGT76G1.
Metodo de produccion de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido G. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido G. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido G; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una uridina difosfo glicosiltransferasa (UDP-glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una enzima de fusion UGT76G1, una EUGT11 y una UDP-glicosiltransferasa- sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido W, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido G para producir el rebaudiosido V por EUGT11. Continuamente, una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido V para producir el rebaudiosido W por UGT76G1.
Metodo de produccion de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido KA. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido W a partir de rebaudiosido KA. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido KA; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una uridina difosfo glicosiltransferasa (UDP- glicosiltransferasa) seleccionada del grupo que consiste en una uridina difosfo glicosiltransferasa (UGT76G1), y una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido W, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido kA para producir el rebaudiosido V. Continuamente, una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido V para producir el rebaudiosido W.
Metodo de produccion de rebaudiosido W a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido W a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); uridina difosfo glicosiltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en una enzima de fusion UGT76G1, HV1 y UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir una mezcla de rebaudiosido W.
Metodo de produccion de rebaudiosido W a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido W a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); uridina difosfo glicosiltransferasas seleccionadas del grupo que consiste en una enzima de fusion UGT76G1, EUGT11 y una UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido W.
Metodo de produccion de una mezcla de estaviosido y rebaudiosido KA a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de una mezcla de esteviosido y rebaudiosido KA a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos
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seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en una enzima de fusion EUGT11 y UDP- glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir una mezcla de esteviosido y rebaudiosido KA, en el que una glucosa se acopla covalentemente a C2'-19-O-glucosa de rubusosido para producir el rebaudiosido KA; una glucosa se acopla de manera covalente a C2'- 13-O-glucosa de rubusosido para producir el esteviosido.
Metodo de produccion de rebaudiosido KA a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de un rebaudiosido KA a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); y HV1 UDP-glicosiltransferasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido KA, en el que una glucosa se acopla covalentemente a la C2'-19-O-glucosa de rubusosido para producir un rebaudiosido KA.
Metodo de produccion de rebaudiosido G a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de un rebaudiosido G a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en UGT76G1 y una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido G, en el que una glucosa se acopla covalentemente a la C3'-13-O-glucosa de rubusosido para producir un rebaudiosido G.
Metodo de produccion de rebaudiosido E a partir de rebaudiosido KA. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido E a partir de rebaudiosido KA. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido KA; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); y HV1 UDP-glicosiltransferasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido E, en el que una glucosa se acopla covalentemente a las C2'13-O-glucosa del rebaudiosido KA para producir el rebaudiosido E.
Metodo de produccion de rebaudiosido E a partir de rebaudiosido KA. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido E a partir de rebaudiosido KA. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido KA; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una UDP-glicosiltransferasa de un grupo de EUGT11 y una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido E, en el que una glucosa se acopla covalentemente al C2' 13-O-glucosa del rebaudiosido Ka para producir el rebaudiosido E.
Metodo de produccion de rebaudiosido E a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido E a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; un sustrato seleccionado del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); y una UDP-glicosiltransferasa del grupo de EUGT11 y una enzima de fusion de UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido E, en el que una glucosa se acopla covalentemente a rubusosido para producir una mezcla de rebaudiosido KA y esteviosido. Continuamente, una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido KA y al esteviosido para producir el rebaudiosido E.
Metodo de produccion de rebaudiosido E a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido E a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); y HV1 UDP-glicosiltransferasa; con o sin sacarosa sintasa; incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido E, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rubusosido para producir el rebaudiosido KA; e incubar adicionalmente el rebaudiosido KA con HV1 para producir el rebaudiosido E.
Metodo de produccion de rebaudiosido D2 a partir de rubusosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido d2 a partir de rubusosido. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rubusosido; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); una UDP-glicosiltransferasa del grupo de EUGT11 y una enzima de fusion de UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa; con o sin sacarosa sintasa; incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D2, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rubusosido para producir una mezcla de esteviosido y rebaudiosido KA; incubar adicionalmente la mezcla de esteviosido y rebaudiosido KA con EUGT11 para producir el rebaudiosido E, en el que una glucosa esta acoplada covalentemente al esteviosido y el rebaudiosido KA para producir el rebaudiosido E; e incubar adicionalmente el rebaudiosido E con EUGT11 para producir el rebaudiosido D2, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido E para producir el rebaudiosido D2.
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Metodo de produccion de rebaudiosido D2 a partir de rebaudiosido KA. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido D2 a partir de rebaudiosido KA. El metodo incluye la preparacion de una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido KA, sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa), una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en un EUGT11 y una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa, con o sin sacarosa sintasa; incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D2, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido KA para producir el rebaudiosido E; incubar adicionalmente la mezcla de rebaudiosido E con EUGT11 para producir el rebaudiosido D2, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido E para producir el rebaudiosido D2.
Metodo de produccion de rebaudiosido Z a partir de rebaudiosido E. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido Z a partir de rebaudiosido E. El metodo comprende preparar una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido E; sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP) y uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa); y HV1 UDP-glicosiltransferasa; y sacarosa sintasa, incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido Z, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido E para producir el rebaudiosido Z, en el que una glucosa se acopla covalentemente a la C2'-13-O-glucosa del rebaudiosido E para producir el rebaudiosido Z1. Una glucosa se acopla de manera covalente a C2'-19-O-glucosa del rebaudiosido E para producir el rebaudiosido Z2.
Metodo de produccion de rebaudiosido M a partir de rebaudiosido D. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido M a partir de rebaudiosido D. El metodo incluye la preparacion de una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido D, sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP), uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) y combinaciones de los mismos, y una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en UGT76G1, una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa, y combinaciones de los mismos, con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido M, en el que una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido D para producir el rebaudiosido M.
Metodo de produccion de rebaudiosido D y rebaudiosido M a partir de esteviosido. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un metodo de smtesis de rebaudiosido D y rebaudiosido M a partir de esteviosido. El metodo incluye la preparacion de una mezcla de reaccion que comprende esteviosido, sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP), uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) y combinaciones de los mismos, y una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en HV1, UGT76G1, una enzima de fusion UDP- glicosiltransferasa-sacarosa sintasa, y combinaciones de los mismos, con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D y/o rebaudiosido M. Por ejemplo, en realizaciones, la mezcla de reaccion se puede incubar durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D, y la mezcla de reaccion que comprende el rebaudiosido D se incuba adicionalmente ( por ejemplo, con UGT76G1 y/o la enzima de fusion) para producir el rebaudiosido M. En ciertas realizaciones, la mezcla de reaccion comprendera HV1 y UGT76G1. En otras realizaciones, la mezcla de reaccion comprendera HV1 y la enzima de fusion.
En ciertas realizaciones, una glucosa se acopla covalentemente al esteviosido para producir el rebaudiosido A y/o rebaudiosido E. Por ejemplo, una glucosa se puede acoplar covalentemente al esteviosido mediante UGT76G1 o la enzima de fusion para producir el rebaudiosido A y/o una glucosa se puede acoplar covalentemente al esteviosido por HV1 para producir el rebaudiosido E. Continuamente, una glucosa se puede acoplar covalentemente al rebaudiosido A por HV1 para producir el rebaudiosido D y/o una glucosa se puede acoplar covalentemente al rebaudiosido E mediante UGT76G1 o la enzima de fusion para producir el rebaudiosido D. Una glucosa puede ademas ser acoplada covalentemente al rebaudiosido D mediante UGT76G1 o la enzima de fusion para producir el rebaudiosido M.
Metodo de produccion de rebaudiosido D y rebaudiosido M a partir de rebaudiosido A. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido D y rebaudiosido M a partir de rebaudiosido A. El metodo incluye la preparacion de una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido A, sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP), uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) y combinaciones de los mismos, y una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en HV1, UGT76G1, una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa-sacarosa sintasa, y combinaciones de las mismas, con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D y/o rebaudiosido M. Por ejemplo, en realizaciones, la mezcla de reaccion (por ejemplo, que comprende HV1) puede incubarse durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D, y la mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido D incubado adicionalmente (por ejemplo, con UGT76G1 y/o la enzima de fusion) para producir el rebaudiosido M. En ciertas realizaciones, la mezcla de reaccion comprendera HV1 y UGT76G1. En otras realizaciones, la mezcla de reaccion comprendera HV1 y la enzima de fusion.
Una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido A para producir el rebaudiosido D. Por ejemplo, una glucosa se puede acoplar covalentemente al rebaudiosido A por HV1 para producir el rebaudiosido D. Continuamente, una glucosa se puede acoplar covalentemente al rebaudiosido D mediante UGT76G1 o la enzima de fusion para producir el rebaudiosido M.
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Metodo de produccion de rebaudiosido D y rebaudiosido M a partir de rebaudiosido E. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un metodo de smtesis de rebaudiosido D y rebaudiosido M a partir de rebaudiosido E. El metodo incluye la preparacion de una mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido E, sustratos seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, uridina difosfato (UDP), uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa), y combinaciones de los mismos, y una UDP-glicosiltransferasa seleccionada del grupo que consiste en una UGT76G1, una fusion UDP- glicosiltransferasa-sacarosa sintasa enzima, y combinaciones de los mismos, con o sin sacarosa sintasa; e incubar la mezcla de reaccion durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D y/o rebaudiosido M. Por ejemplo, en realizaciones, la mezcla de reaccion (por ejemplo, que comprende UGT76G1 y/o la enzima de fusion) puede incubarse durante un tiempo suficiente para producir el rebaudiosido D, y la mezcla de reaccion que comprende rebaudiosido D se incuba mas para producir el rebaudiosido M.
Una glucosa se acopla covalentemente al rebaudiosido E para producir el rebaudiosido D. Por ejemplo, una glucosa se puede acoplar covalentemente al rebaudiosido E mediante UGT76G1 o la enzima de fusion para producir el rebaudiosido D. Continuamente, una glucosa se puede acoplar covalentemente el rebaudiosido D por UGT76G1 o la enzima de fusion para producir el rebaudiosido M.
La mayona de los glicosidos de esteviol estan formados por varias reacciones de glicosilacion de esteviol, que por lo general son catalizadas por las UDP-glicosiltransferasas (UGT) usando uridina 5'-difosfoglucosa (UDP-glucosa) como un donante de la unidad estructural de azucar. En las plantas, las UGT son un grupo de enzimas muy divergentes que transfieren un residuo de glucosa de UDP-glucosa a esteviol.
La uridina difosfo glicosiltransferasa (UGT76G1) es una UGT con una actividad de glicosilacion de 1,3-13-O-glucosa para producir un glicosido relacionado (rebaudiosido A y D). Sorprendente e inesperadamente, se descubrio que UGT76G1 tambien tiene actividad de glicosilacion de 1,3-19-O-glucosa para producir el rebaudiosido G a partir de rubusosido, y para producir el rebaudiosido M a partir de rebaudiosido D. UGT76G1 puede convertir el rebaudiosido KA a Reb V y continuar para formar Reb W. Una UGT76G1 particularmente apropiado tiene una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:1.
La EUGT11 (descrita en el documento WO 2013022989) es una UGT que tiene actividad de glicosilacion de 1,2-19-0- glucosa y 1,2-13-O-glucosa. Se sabe que EUGT11 cataliza la produccion de esteviosido para rebaudiosido E y rebaudiosido A para rebaudiosido D. Sorprendente e inesperadamente, se descubrio que EUGT11 se puede usar in vitro para sintetizar rebaudiosido D2 a partir de rebaudiosido E por una nueva actividad enzimatica (actividad de glicosilacion de pi,6 -13-O-glucosa) (Solicitud de Patente de EE. UU. No. de Serie 14/269,435, asignada a Conagen, Inc.). EUGT11 tiene actividad de glicosilacion de 1,2-19-O-glucosa para producir el rebaudiosido KA a partir de rubusosido. Un EUGT11 particularmente apropiado tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3.
HV1 es un UGT con una actividad de glicosilacion de 1,2-19-O-glucosa para producir glicosidos de esteviol relacionados (rebaudiosido E, D y Z). Sorprendente e inesperadamente, se descubrio que HV1 tambien tiene actividad de glicosilacion de 1,2-19-O-glucosa para producir el rebaudiosido KA a partir de rubusosido. HV1 tambien puede convertir Reb G en Reb V y Reb KA en Reb E. Un HV1 particularmente apropiado tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5.
El metodo puede incluir ademas anadir una sacarosa sintasa a la mezcla de reaccion que contiene la uridina difosfo (UDP) glicosiltransferasa. La sacarosa sintasa cataliza la reaccion qmmica entre NDP-glucosa y D-fructosa para producir NDP y sacarosa. La sacarosa sintasa es una glicosiltransferasa. El nombre sistematico de esta clase de enzimas es NDP-glucosa: D-fructosa 2-alfa-D-glucosiltransferasa. Otros nombres de uso comun incluyen la UDP glucosafructosa glucosiltransferasa, sacarosa sintasa, sacarosa-UDP glucosiltransferasa, la sacarosa-uridina difosfato glucosiltransferasa, y uridina difosfoglucosa-fructosa glucosiltransferasa. La adicion de la sacarosa sintasa a la mezcla de reaccion que incluye una uridina difosfoglicosiltransferasa crea un "sistema de acoplamiento UGT-SUS". En el sistema de acoplamiento UGT-SUS, la UDP-glucosa se puede regenerar a partir de UDP y sacarosa, lo que permite omitir la adicion de UDP-glucosa extra a la mezcla de reaccion o usar UDP en la mezcla de reaccion. La sacarosa sintasa apropiada puede ser, por ejemplo, una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis; una sacarosa sintasa 3 de Arabidopsis; y una sacarosa sintasa de Vigna radiata. Una sacarosa sintasa particularmente apropiada puede ser, por ejemplo, sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis. Una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis es la sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis thaliana (AtSUS1), que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7.
En otro aspecto, la enzima de fusion uridina difosfo glicosiltransferasa se puede usar en los metodos. Una enzima de fusion de uridina difosfo glicosiltransferasa particularmente apropiada puede ser una enzima de fusion UGT-SUS 1. La UDP-glicosiltransferasa puede ser una enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa que incluye un dominio de uridina difosfoglicosiltransferasa acoplado a un dominio de sacarosa sintasa. En particular, la enzima de fusion UDP- glicosiltransferasa incluye un dominio de uridina difosfo glicosiltransferasa acoplado a un dominio de sacarosa sintasa. Adicionalmente, la enzima de fusion UGT-SUS1 tiene actividad de sacarosa sintasa y, de este modo, puede regenerar UDP-glucosa a partir de UDP y sacarosa. Una enzima de fusion UGT-SUS1 particularmente apropiada puede ser, por ejemplo, una enzima de fusion UGT76G1-AtSUS1 (denominada como "GS") que tiene la secuencia de aminoacidos de la sEq ID NO: 9. Otra enzima de fusion UGT-SUS1 particularmente apropiada puede ser, por ejemplo, una EUGT11- SUS1 (denominada como "EUS") que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:11.
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Los dominios de sacarosa sintasa apropiados pueden ser, por ejemplo, una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis; una sacarosa sintasa 3 de Arabidopsis; y una sacarosa sintasa de Vigna radiata. Un dominio de sacarosa sintasa particularmente apropiado puede ser, por ejemplo, sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis sacarosa. Una sacarosa sintasa de Arabidopsis particularmente apropiada es la sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis thaliana (AtSUS1), que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7.
La enzima de fusion UGT76G1-AtSUS1 ("GS") puede tener una secuencia de polipeptidos con al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% e incluso 100% identica a la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:9. Adecuadamente, la secuencia de aminoacidos de la enzima de fusion de UGT-AtSUS1 tiene al menos 80% de identidad a la SEQ ID NO:9. Mas adecuadamente, la secuencia de aminoacidos de la enzima de fusion de UGT-AtSUS1 tiene al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos
94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de identidad de la
secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:9.
El acido nucleico aislado puede incluir una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la enzima de fusion UGT-AtSUS1 que tiene una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos
96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de homologfa de la secuencia a la secuencia del
acido nucleico establecida en la SEQ ID NO:10. Adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID NO: 9. Mas adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la enzima de fusion UDP-glicosiltransferasa que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:9. El acido nucleico aislado incluye, de este modo, aquellas secuencias de nucleotidos que codifican fragmentos funcionales de la SEQ ID NO:10, variantes funcionales de la SEQ ID NO: 9 u otros polipeptidos homologos que tienen, por ejemplo, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de identidad de la secuencia con SEQ ID NO:9. Como saben los expertos en el arte, la secuencia de acido nucleico que codifica la UDP glicosiltransferasa se puede optimizar en codones para la expresion en un organismo huesped apropiado tal como, por ejemplo, bacterias y levaduras.
La enzima de fusion EUGT11-SUS1 ("EUS") puede tener una secuencia de polipeptidos con al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% e incluso 100% identica a la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:11. Adecuadamente, la secuencia de aminoacidos de la enzima de fusion EUGT11-SUS1 tiene al menos 80% de identidad a la SEQ ID NO:11. Mas adecuadamente, la secuencia de aminoacidos de la enzima de fusion EUGT11-SUS1 tiene al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de identidad de la secuencia de aminoacidos con la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:11.
El acido nucleico aislado puede incluir una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la enzima de fusion EUGT11-SUS1 que tiene una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de homologfa de la secuencia a la secuencia del acido nucleico establecida en SEQ ID NO:12. Adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la enzima de fusion EUGT11-SUS1 que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:11. Mas adecuadamente, el acido nucleico aislado incluye una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la enzima de fusion EUGT11-SUS1 que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoacidos establecida en SEQ ID NO:11. El acido nucleico aislado, de este modo, incluye aquellas secuencias de nucleotidos que codifican fragmentos funcionales de la SEQ ID NO:11, variantes funcionales de la SEQ ID NO:11 u otros polipeptidos homologos que tienen, por ejemplo, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, e incluso 100% de identidad de la secuencia con SEQ ID NO:11. Como saben los expertos en el arte, la secuencia de acido nucleico que codifica el EUGT11-SUS1 se puede optimizar en codones para la expresion en un organismo huesped apropiado tal como, por ejemplo, bacterias y levaduras.
Productos de consumo por via oral
En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un producto de consumo por via oral que tiene una cantidad edulcorante de rebaudiosido V, seleccionado del grupo que consiste en un producto de bebida y un producto de consumo. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un producto de consumo por via oral que tiene una
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cantidad edulcorante de rebaudiosido W, seleccionado del grupo que consiste en un producto de bebida y un producto de consumo. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un producto de consumo por via oral quetiene una cantidad edulcorante de rebaudiosido KA, seleccionado del grupo que consiste en un producto de bebida y un producto de consumo. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un producto de consumo por via oral que tiene una cantidad edulcorante de rebaudiosido G, seleccionado del grupo que consiste en un producto de bebida y un producto de consumo. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un producto de consumo por via oral que tiene una cantidad edulcorante de rebaudiosido M, seleccionado del grupo que consiste en un producto de bebida y un producto de consumo.
El producto de consumo por via oral puede tener una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% (% p/v) a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa.
El producto de consumo por via oral puede tener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm rebaudiosido V. El producto de consumo por via oral puede tener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm rebaudiosido W. El producto de consumo por via oral puede tener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm rebaudiosido KA. El producto de consumo por via oral puede tener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm rebaudiosido G. El producto de consumo por via oral puede tener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm rebaudiosido M.
El rebaudiosido V puede ser el unico edulcorante en el producto de consumo por via oral. El rebaudiosido W puede ser el unico edulcorante en el producto de consumo por via oral. El rebaudiosido KA puede ser el unico edulcorante en el producto de consumo por via oral. El rebaudiosido G puede ser el unico edulcorante en el producto de consumo por via oral. El rebaudiosido M puede ser el unico edulcorante en el producto de consumo por via oral.
El producto de consumo por via oral tambien puede tener al menos un edulcorante adicional. El al menos un edulcorante adicional puede ser un edulcorante natural de alta intensidad, por ejemplo. El edulcorante adicional se puede seleccionar entre un extracto de stevia, un glicosido de esteviol, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido D2, rebaudiosido E, rebaudiosido F, dulcosido A, rubusosido, esteviolbiosido, sacarosa, jarabe de mafz de alta fructosa, fructosa, glucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartame, neotame, sucralosa, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidina dihidrocalcona (NDHC), rubusosido, mogrosido IV, siamenosido I, mogrosido V, monatin, taumatin, monellin, brazzein, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina, trilobtain, y combinaciones de los mismos.
El producto de consumo por via oral tambien puede tener al menos un aditivo. El aditivo puede ser, por ejemplo, un carbohidrato, un poliol, un aminoacido o una sal del mismo, un poliaminoacido o sal del mismo, un acido de azucar o una sal del mismo, un nucleotido, un acido organico, un acido inorganico, una sal organica, una sal de acido organico, una sal de base organica, una sal inorganica, un compuesto amargo, un saborizante, un ingrediente aromatizante, un compuesto astringente, una protema, un hidrolizado de protemas, un surfactante, un emulsionante, un flavonoide, un alcohol, un polfmero, y combinaciones de los mismos.
En un aspecto, la presente divulgacion se dirige a un producto de bebida que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido V. En un aspecto, la presente divulgacion se dirige a un producto de bebida que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido W. En un aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un producto de bebida que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido KA. En un aspecto, la presente divulgacion se dirige a un producto de bebida que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido G. En un aspecto, la presente divulgacion se dirige a un producto de bebida que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido M.
El producto de bebida puede ser, por ejemplo, un producto de bebida carbonatada y un producto de bebida no carbonatada. El producto de bebida tambien puede ser, por ejemplo, un refresco, una bebida de fuente, una bebida congelada y lista para tomar, cafe, te, una bebida lactea, un refresco en polvo, un concentrado lfquido, agua aromatizada, agua mejorada, jugo de fruta, una bebida con sabor a zumo de frutas, una bebida deportiva y una bebida energetica.
En algunas realizaciones, un producto de bebida de la presente divulgacion puede incluir uno o mas ingredientes de bebida tales como, por ejemplo, acidulantes, zumos de fruta y/o zumos de verduras, pulpa, etc., saborizantes, colorantes, conservantes, vitaminas, etc. minerales, electrolitos, eritritol, tagatosa, glicerina y dioxido de carbono. Tales productos de bebida se pueden proporcionare en cualquier forma apropiada, tal como un concentrado de bebida y una bebida carbonatada, lista para beber.
En ciertas realizaciones, los productos de bebida de la presente divulgacion pueden tener cualquiera de las numerosas formulaciones o constituciones espedficas diferentes. La formulacion de un producto de bebida de la presente divulgacion puede variar en cierta medida, dependiendo de factores tales como el segmento de mercado deseado del producto, sus caractensticas nutricionales deseadas, el perfil de sabor y similares. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, generalmente puede ser una opcion anadir ingredientes adicionales a la formulacion de un producto de bebida particular. Por ejemplo, se pueden anadir edulcorantes adicionales (esto es, mas y/u otros), aromatizantes, electrolitos, vitaminas, zumos de frutas u otros productos de frutas, saborizantes, agentes de enmascaramiento y similares, potenciadores del sabor y/o carbonatacion que por lo general se pueden anadir a cualquiera de tales formulaciones para
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variar el sabor, la sensacion en la boca, las caractensticas nutricionales, etc. En las realizaciones, el producto de bebida puede ser una bebida de cola que contiene agua, aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido V, un acidulante y aromatizante. En realizaciones, el producto de bebida puede ser una bebida de cola que contiene agua, aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido W, un acidulante y saborizante. En realizaciones, el producto de bebida puede ser una bebida de cola que contiene agua, aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido M, un acidulante y saborizante. Los aromas de ejemplo pueden ser, por ejemplo, aromatizantes de cola, aromatizantes de cftricos y aromatizantes de especias. En algunas realizaciones, la carbonatacion en forma de dioxido de carbono se puede anadir para la efervescencia. En otras realizaciones, se pueden anadir conservantes, dependiendo de los otros ingredientes, tecnica de produccion, vida util deseada, etc. En ciertas realizaciones, se puede anadir cafema. En algunas realizaciones, el producto de bebida puede ser una bebida carbonatada con sabor a cola, que contiene caractensticamente agua carbonatada, edulcorante, extracto de nuez de cola y/u otro saborizante, colorante de caramelo, uno o mas acidos, y opcionalmente otros ingredientes.
Las cantidades apropiadas de rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M o rebaudiosido G presentes en el producto de bebida pueden ser, por ejemplo, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm. En algunas realizaciones, bajas concentraciones de rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M o rebaudiosido G, por ejemplo, menos de 100 ppm, y tiene un dulzor equivalente a las soluciones de sacarosa que tienen concentraciones entre 10.000 ppm a 30.000 ppm. La concentracion final que vana desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 95 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 90 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 85 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 80 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 75 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 70 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 65 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 60 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 55 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 50 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 45 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 40 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 35 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 30 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 25 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 20 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 15 ppm, o desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 10 ppm. Alternativamente, el rebaudiosido V o el rebaudiosido W pueden estar presentes en productos de bebidas de la presente divulgacion a una concentracion final que vana desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 15 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 20 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 25 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 30 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 35 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 40 ppm a
aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 45 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 55 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 60 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 65 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 70 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 75 ppm a
aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 80 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 85 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 90 ppm a aproximadamente 100 ppm, o desde aproximadamente 95 ppm a aproximadamente 100 ppm.
En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un consumible que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido V. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un consumible que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido W. En otro aspecto, la presente divulgacion se dirige a un consumible que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido KA. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un consumible que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido G. En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un
consumible que comprende una cantidad edulcorante de rebaudiosido M. El consumible puede ser, por ejemplo, un
producto alimenticio, un nutraceutico, un producto farmaceutico, un suplemento dietetico, una composicion higienica dental, una composicion de gel comestible, un producto cosmetico y un saborizante de mesa.
Como se usa en este documento, "suplemento (s) dietetico (s)" se refiere a compuestos destinados a complementar la dieta y proporcionar nutrientes, tales como vitaminas, minerales, fibra, acidos grasos, aminoacidos, etc., que pueden faltar o no se consumen en cantidades suficientes en una dieta. Se puede usar cualquier suplemento dietetico apropiado conocido en la tecnica. Ejemplos de suplementos dieteticos apropiados pueden ser, por ejemplo, nutrientes, vitaminas, minerales, fibra, acidos grasos, hierbas, ingredientes botanicos, aminoacidos y metabolitos.
Como se usa en este documento, "nutraceutico (s)" se refiere a compuestos, que incluyen cualquier alimento o parte de un alimento que puede proporcionar beneficios medicinales o para la salud, incluida la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades o trastornos (por ejemplo, fatiga, insomnio, efectos del envejecimiento, perdida de memoria, trastornos del estado de animo, enfermedades cardiovasculares y niveles altos de colesterol en la sangre, diabetes, osteoporosis, inflamacion, trastornos autoinmunes, etc.). Se puede usar cualquier nutraceutico apropiado conocido en la tecnica. En algunas realizaciones, los nutraceuticos se pueden usar como suplementos para alimentos y bebidas y como formulaciones farmaceuticas para aplicaciones enterales o parenterales que pueden ser formulaciones solidas, tales como capsulas o comprimidos, o formulaciones lfquidas, tales como soluciones o suspensiones.
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En algunas realizaciones, los suplementos dieteticos y nutraceuticos pueden contener hidrocoloides protectores (tales como gomas, protemas, almidones modificados), aglutinantes, agentes formadores de pelfcula, agentes/materiales de encapsulacion, materiales de pared/cubierta, compuestos de matriz, recubrimientos, emulsionantes, agentes con actividad de superficie, agentes solubilizantes (aceites, grasas, ceras, lecitinas, etc.), adsorbentes, portadores, rellenos, cocompuestos, agentes dispersantes, agentes humectantes, auxiliares de procesamiento (solventes), agentes de flujo, agentes enmascaradores del sabor, agentes de ponderacion, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, antioxidantes y antimicrobianos.
Como se usa en este documento, un "gel" se refiere a un sistema coloidal en el que una red de partfculas abarca el volumen de un medio lfquido. Aunque los geles se componen principalmente de lfquidos y, de este modo, presentan densidades similares a los lfquidos, los geles tienen la coherencia estructural de los solidos debido a la red de partfculas que abarca el medio lfquido. Por esta razon, los geles generalmente parecen ser solidos, materiales como gelatina. Los geles se pueden usar un numero de aplicaciones. Por ejemplo, los geles se pueden usar en alimentos, pinturas y adhesivos. Los geles que se pueden comer se conocen como "composiciones de gel comestibles". Las composiciones de gel comestibles por lo general se consumen como bocadillos, como postres, como parte de los alimentos basicos, o junto con los alimentos basicos. Los ejemplos de composiciones de gel comestibles apropiadas pueden ser, por ejemplo, postres en gel, pudines, mermeladas, jaleas, pastas, bagatelas, aspics, malvaviscos, caramelos de goma y similares. En algunas realizaciones, las mezclas de gel comestibles generalmente son solidos en polvo o granulares a los que se puede anadir un fluido para formar una composicion de gel comestible. Los ejemplos de fluidos apropiados pueden ser, por ejemplo, agua, fluidos lacteos, fluidos analogos a lacteos, jugos, alcohol, bebidas alcoholicas y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de fluidos lacteos apropiados pueden ser, por ejemplo, leche, leche cultivada, nata, suero lfquido y mezclas de los mismos. Los ejemplos de fluidos analogos de productos lacteos apropiados pueden ser, por ejemplo, leche de soja y blanqueador de cafe no lacteo.
Como se usa en este documento, el termino "ingrediente gelificante" se refiere a cualquier material que puede formar un sistema coloidal dentro de un medio lfquido. Los ejemplos de ingredientes gelificantes apropiados pueden ser, por ejemplo, gelatina, alginato, carageenan, goma, pectina, konjac, agar, acido alimentario, cuajo, almidon, derivados de almidon y combinaciones de los mismos. Es bien conocido para los expertos en el arte que la cantidad de ingrediente gelificante usado en una mezcla de gel comestible o una composicion de gel comestible puede variar considerablemente dependiendo de un numero de factores tales como, por ejemplo, el ingrediente gelificante particular usado, la base del fluido particular usada, y las propiedades deseadas del gel.
Las mezclas de gel y las composiciones de gel de la presente divulgacion se pueden preparar por cualquier metodo apropiado conocido en la tecnica. En algunas realizaciones, las mezclas de gel comestibles y las composiciones de gel comestibles de la presente divulgacion se pueden preparar usando otros ingredientes ademas del agente gelificante. Los ejemplos de otros ingredientes apropiados pueden ser, por ejemplo, un acido alimentario, una sal de un acido alimentario, un sistema regulador, un agente de carga, un secuestrante, un agente de reticulacion, uno o mas sabores, uno o mas colores, y combinaciones de los mismos.
Se puede usar cualquier composicion farmaceutica apropiada conocida en la tecnica. En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede contener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido V, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede contener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido W, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede contener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido KA, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede contener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido G, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede contener desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido M, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion se pueden usar para formular farmacos farmaceuticos que contienen uno o mas agentes activos que ejercen un efecto biologico. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden contener uno o mas agentes activos que ejercen un efecto biologico. Los agentes activos apropiados son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, The Physician's Desk Reference). Tales composiciones se pueden preparar segun procedimientos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA.
El rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M o el rebaudiosido G se pueden usar con cualquier composicion de higiene oral y dental apropiada conocida en la tecnica. Los ejemplos de composiciones de higiene oral y dental apropiadas pueden ser, por ejemplo, pastas dentales, pulimentos dentales, hilo dental, colutorios, enjuagues bucales, dentffricos, aerosoles bucales, refrescos bucales, enjuagues de placa, analgesicos dentales y similares.
Las cantidades apropiadas de rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M o rebaudiosido G presentes en los consumibles pueden ser, por ejemplo, desde aproximadamente 5 partes por millon (ppm) a aproximadamente 100 partes por millon (ppm). En algunas realizaciones, bajas concentraciones de rebaudiosido V,
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rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M, o rebaudiosido G, por ejemplo, menos de 100 ppm, tiene un dulzor equivalente a las soluciones de sacarosa que tienen concentraciones entre 10.000 ppm a 30.000 ppm. La concentracion final que vana desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 95 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 90 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 85 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 80 ppm, desde
aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 75 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 70 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 65 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 60 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 55 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 50 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 45 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 40 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 35 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 30 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 25 ppm, desde
aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 20 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 15 ppm, o desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 10 ppm. Alternativamente, rebaudiosido V o rebaudiosido W puede estar presente en productos de consumo de la presente divulgacion a una concentracion final que vana desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 15 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 20 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 25 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 30 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 35 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 40 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 45 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 55 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 60 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 65 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 70 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 75 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 80 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 85 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 90 ppm a aproximadamente 100 ppm, o desde aproximadamente 95 ppm a aproximadamente 100 ppm.
En ciertas realizaciones, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm de rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M o rebaudiosido G esta presente en las composiciones de productos alimenticios. Como se usa en este documento, "composicion (es) de producto alimenticio" se refiere a cualquier material ingerible solido o lfquido que puede, pero no es necesario, tener un valor nutricional y estar destinado al consumo humano y animal.
Los ejemplos de composiciones de productos alimenticios apropiados pueden ser, por ejemplo, composiciones de confitena, tales como caramelos, mentas, gotas con sabor a frutas, productos de cacao, chocolates y similares; condimentos, tales como el ketchup, la mostaza, la mayonesa y similares; chicles; composiciones de cereales; productos horneados, tales como panes, pasteles, tartas, galletas y similares; productos lacteos, tales como leche, queso, crema, helado, crema agria, yogur, sorbete y similares; composiciones edulcorantes de mesa; sopas guisos comida de conveniencia; carnes, tales como jamon, tocino, salchichas, cecinas y similares; gelatinas y productos similares a la gelatina, tales como mermeladas, jaleas, conservas y similares; frutas; verduras; productos de huevo; glaseados; siropes incluyendo melaza; aperitivos; carnes de nueces y productos de nueces; y alimentacion animal.
Las composiciones de productos alimenticios tambien pueden ser hierbas, especias y condimentos, sabores naturales y sinteticos, y potenciadores del sabor, tales como glutamato monosodico. En algunas realizaciones, las composiciones de productos alimenticios pueden ser, por ejemplo, productos envasados preparados, tales como edulcorantes dieteticos, edulcorantes lfquidos, mezclas de sabores granulados, alimentos para mascotas, piensos para ganado, tabaco y materiales para aplicaciones de horneado, tales como mezclas para hornear en polvo para la preparacion de panes, galletas, pasteles, tortitas, rosquillas y similares. En otras realizaciones, las composiciones de productos alimenticios tambien pueden ser alimentos y bebidas dieteticas y bajas en calonas que contienen poca o ninguna sacarosa.
En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M o el rebaudiosido G es el unico edulcorante, y el producto tiene una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente el 1% a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, los productos de consumo y productos de bebidas pueden incluir ademas un edulcorante adicional, donde el producto tiene una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 10% (% p/v) de solucion de sacarosa. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, cada ingrediente edulcorante en el producto es un edulcorante de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, cada ingrediente edulcorante en el producto puede ser un edulcorante natural de alta intensidad. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el edulcorante adicional contiene uno o mas edulcorantes seleccionados de un extracto de stevia, un glicosido de esteviol, esteviosido, rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido D2, rebaudiosido F, dulcosido A, rubusosido, esteviolbiosido, sacarosa, jarabe de mafz alto en fructosa, fructosa, glucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa, eritritol, xilitol, manitol, sorbitol, inositol, AceK, aspartame, neotame, sucralosa, sacarina, naringina dihidrocalcona (NarDHC), neohesperidin dihidrocalcona (NDHC), rubusosido, mogrosido IV, siamenosido I, mogrosido V, monatina, taumatina, monelina, brazzeina, L-alanina, glicina, Lo Han Guo, hernandulcina, filodulcina,
trilobtain y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, los productos de consumo y productos de bebidas pueden incluir ademas uno o mas aditivos seleccionados de un carbohidrato, un poliol, un aminoacido o sal del mismo, un poliaminoacido o sal del mismo, un acido de azucar o sal del mismo, un nucleotido, un acido organico, un acido inorganico, una sal organica, una sal de 5 acido organico, una sal de base organica, una sal inorganica, un compuesto amargo, un saborizante, un ingrediente saborizante, un compuesto astringente, una protema, un hidrolizado de protemas, un surfactante, un emulsionante, un flavonoide, un alcohol, un polfmero y combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones precedentes, el rebaudiosido D2 tiene una pureza de aproximadamente 50% a aproximadamente 100% en peso antes de anadirse al producto.
10 Edulcorante
En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante que consiste en una estructura qmmica:
imagen12
En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante que consiste en una estructura qmmica:
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15 En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante que consiste en una estructura qmmica:
HO -Y„ <>
Azuc-a r 11 -
OH
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En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante que consiste en una estructura qmmica:
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En otro aspecto, la presente divulgacion esta dirigida a un edulcorante que consiste en una estructura qmmica:
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imagen16
En ciertas realizaciones, el edulcorante puede incluir ademas al menos uno de un relleno, un agente de carga y un agente antiaglomerante. Rellenos apropiados, agentes de carga y agentes antiaglomerantes son conocidos en la tecnica.
En ciertas realizaciones, el edulcorante rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M o 10 rebaudiosido G se pueden incluir y/o anadir a una concentracion final que sea suficiente para endulzar y/o aumentar el dulzor de los productos de consumo y productos de bebidas. La "concentracion final" de rebaudiosido V, rebaudiosido
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W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M, o rebaudiosido G se refiere a la concentracion de rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M, rebaudiosido G presente en los productos de consumo finales y productos de bebidas. (esto es, despues de que se hayan agregado todos los ingredientes y/o compuestos para producir los productos de consumo y los productos de bebidas). De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M, o rebaudiosido G se incluyen y/o se anaden a un compuesto o ingrediente usado para preparar los productos de consumo y productos de bebidas. El rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M o el rebaudiosido G pueden estar presentes en un solo compuesto o ingrediente, o en multiples compuestos e ingredientes. En otras realizaciones, el rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M, o rebaudiosido G se incluyen y/o se anaden a los productos de consumo y productos de bebidas. En ciertas realizaciones preferidas, el rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M o el rebaudiosido G se incluyen y/o se anaden a una concentracion final que vana desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 95 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 90 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 85 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 80 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 75 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 70 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 65 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 60 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 55 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 50 ppm, desde
aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 45 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 40 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 35 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 30 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 25 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 20 ppm, desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 15 ppm, o desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 10 ppm. Alternativamente, el rebaudiosido V o rebaudiosido W se incluye y/o adiciona a una concentracion final que vana desde aproximadamente 5 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 10 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 15 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde
aproximadamente 20 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 25 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 30 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 35 ppm a
aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 40 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 45 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 55 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 60 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 65 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 70 ppm a
aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 75 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 80 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 85 ppm a aproximadamente 100 ppm, desde aproximadamente 90 ppm a aproximadamente 100 ppm, o desde aproximadamente 95 ppm a aproximadamente 100 ppm. Por ejemplo, el rebaudiosido V o el rebaudiosido W se pueden incluir y/o anadir a una concentracion final de aproximadamente 5 ppm, aproximadamente 10 ppm, aproximadamente 15 ppm, aproximadamente 20 ppm,
aproximadamente 25 ppm, aproximadamente 30 ppm, aproximadamente 35 ppm, aproximadamente 40 ppm,
aproximadamente 45 ppm, aproximadamente 50 ppm, aproximadamente 55 ppm, aproximadamente 60 ppm,
aproximadamente 65 ppm, aproximadamente 70 ppm, aproximadamente 75 ppm, aproximadamente 80 ppm,
aproximadamente 85 ppm, aproximadamente 90 ppm, aproximadamente 95 ppm, o aproximadamente 100 ppm, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.
En ciertas realizaciones, el rebaudiosido V, el rebaudiosido W, el rebaudiosido KA, el rebaudiosido M o el rebaudiosido G es el unico edulcorante incluido y/o anadido a los productos de consumo y los productos de bebidas. En tales realizaciones, los productos de consumo y los productos de bebidas tienen una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa, aproximadamente 1% a aproximadamente 3% (% p/v) de solucion de sacarosa, o aproximadamente 1% a aproximadamente 2% (% p/v) de solucion de sacarosa. Alternativamente, los productos de consumo y los productos de bebida tienen una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1% a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa, aproximadamente 2% a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa, aproximadamente 3% a aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa, o aproximadamente 4%. Por ejemplo, los productos de consumo y los productos de bebida pueden tener una intensidad de dulzor equivalente a aproximadamente 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, o aproximadamente 4% (% p/v) de solucion de sacarosa, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores.
Los productos de consumo y productos de bebidas de la presente divulgacion pueden incluir una mezcla de rebaudiosido V, rebaudiosido W, rebaudiosido KA, rebaudiosido M o rebaudiosido G y uno o mas edulcorantes de la presente divulgacion en una proporcion suficiente para lograr una intensidad del dulzor, caractensticas nutricionales, perfil de sabor, sensacion en la boca u otro factor organoleptico.
La divulgacion se comprendera mas completamente despues de considerar los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1
En este ejemplo, se sintetizaron fragmentos de ADN de longitud completa de todos los genes UGT candidatos.
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Espedficamente, los ADNc fueron codones optimizados para la expresion de E. coli (Genscript, Piscataway, NJ). El ADN sintetizado se clono en un vector de expresion bacteriano pETite N-His SUMO Kan Vector (Lucigen). Para la secuencia de nucleotidos que codifica las enzimas de fusion UDp-glicosiltransferasa (UGT76G1-AtSUS1 y EUGT11- AtSUSl), se inserto un enlazante GSG (codificado por la secuencia de nucleotidos: ggttctggt) en un encuadre entre una secuencia de nucleotidos que codifica el dominio de uridina difosfo glicosiltransferasa y la secuencia de nucleotidos que codifica la sacarosa sintasa 1 de A. thaliana (AtSUSI). La tabla 2 resume los numeros de protema y de identificador de secuencia.
Tabla 2. Numeros de identificacion de secuencias.
Nombre
SEQ ID NO Descripcion
UGT76G1
SEQ ID NO: 1 Aminoacido
UGT76G1
SEQ ID NO: 2 Acido nucleico
EUGT11
SEQ ID NO: 3 Aminoacido
EUGT11
SEQ ID NO: 4 Acido nucleico
HV1
SEQ ID NO: 5 Aminoacido
HV1
SEQ ID NO: 6 Acido nucleico
AtSUS1
SEQ ID NO: 7 Aminoacido
AtSUS1
SEQ ID NO: 8 Acido nucleico
Enzima de fusion GS
SEQ ID NO: 9 Aminoacido
Enzima de fusion GS
SEQ ID NO: 10 Acido nucleico
Enzima de fusion EUS
SEQ ID NO: 11 Aminoacido
Enzima de fusion EUS
SEQ ID NO: 12 Acido nucleico
Cada construccion de expresion se transformo en E. coli BL21 (DE3), que posteriormente se hizo crecer en medios LB que conteman 50 pg/mL de kanamicina a 37 °C hasta alcanzar una OD600 de 0.8-1.0. La expresion de la protema se indujo mediante la adicion de isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) 1 mM y el cultivo se hizo crecer adicionalmente a 16 °C, durante 22 h. Las celulas se recogieron por centrifugacion (3,000 x g; 10 min; 4 °C). Las pellas celulares se recogieron y se usaron inmediatamente o se almacenaron a -80 °C.
Las pellas celulares se resuspendieron en solucion reguladora de lisis (solucion reguladora de fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, 25 pg/mL de lisozima, 5 pg/mL de DNasa I, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 10% y 0.4 % de TRITON X-100). Las celulas se rompieron por sonicacion a 4 °C, y los residuos celulares se clarificaron por centrifugacion (18,000 x g; 30 min). El sobrenadante se cargo en una columna de afinidad equilibrada (solucion reguladora de equilibrio: solucion reguladora de fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, imidazol 20 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 10%) Ni- NTA (Qiagen). Despues de cargar la muestra de protema, la columna se lavo con solucion reguladora de equilibrio para eliminar las protemas contaminantes no unidas. Los polipeptidos UGT recombinantes etiquetados con His se eluyeron mediante una solucion reguladora de equilibrio que contema imidazol 250 mM. Las protemas de fusion HV1 (61.4kD), UGT76G1 (65.4kD), AtSUS1 (106.3kD), EUGT11 (62kD), UGT76G1-SUS1 (GS) (157.25kD) y EUGT11-AtSUS1 (155kD) purificadas se mostraron en la figura 2.
Ejemplo 2
En este ejemplo, los polipeptidos recombinantes UGT candidatos se analizaron para determinar la actividad de la glicosiltransferasa usando glicosidos de esteviol probados como sustrato.
Por lo general, el polipeptido recombinante (10 pg) se probo en un sistema de reaccion in vitro de 200 pl. El sistema de reaccion contiene solucion reguladora de fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2, MgCh 3 mM, 1 mg/ml de sustrato de glicosido de esteviol, UDP-glucosa 1 mM. La reaccion se realizo a 30 °C y se termino anadiendo 200 pL de 1-butanol. Las muestras se extrajeron tres veces con 200 pL de 1-butanol. La fraccion combinada se seco y se disolvio en 70 pL de metanol al 80% para un analisis de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC). Se uso rubusosido (99%, Blue California, CA), Reb G purificado (98.8%), Reb KA (98.4%) y Reb V (80%) como sustrato en reacciones in vitro.
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La reaccion de glicosilacion catalizada por UGT se acoplo a una reaccion generadora de UDP-glucosa catalizada por una sacarosa sintasa (tal como AtSUSI). En este metodo, la UDP-glucosa se genero a partir de la sacarosa y UDP, de manera que se puede omitir la adicion de UDP-glucosa extra. En el ensayo, se anadio AtSUSI recombinante en el sistema de reaccion UGT y la UDP-glucosa se puede regenerar a partir de UDP. La secuencia AtSUSI (Bieniawska et al., Plant J. 2007, 49: 810-828) se sintetizo e inserto en un vector de expresion bacteriano. La protema AtSUSI recombinante se expreso y purifico por cromatograffa de afinidad.
El analisis de HPLC se realizo usando un sistema Dionex UPLC ultimate 3000 (Sunnyvale, CA), que incluye una bomba cuaternaria, un compartimento de columna de temperatura controlada, un muestreador automatico y un detector de absorbancia UV. Se usaron las columnas Phenomenex Luna NH2, Luna C18 o Synergi Hydro-RP con columna protectora para la caracterizacion de glicosidos de esteviol. Se uso acetonitrilo en agua o en solucion reguladora Na3PO4 para la elucion isocratica en el analisis de HPLC. La longitud de onda de deteccion fue de 210 nm.
Ejemplo 3
En este ejemplo, se analizaron los polipeptidos HV1 recombinantes para transferir una unidad estructural de azucar a rubusosido para producir el rebaudiosido KA ("Minor diterpene glycosides from the leaves of Stevia rebaudiana". Journal of Natural Products (2014), 77(5), 1231-1235) en todas las condiciones de reaccion con o sin AtSUSI.
Como se muestra en la figura 3, los polipeptidos HV1 recombinantes transfirieron una unidad estructural de azucar a rubusosido para producir Reb KA en todas las condiciones de reaccion con o sin AtSUS1. El rubusosido se convirtio completamente a Reb KA y Reb E por el HV1 recombinante en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (G, I). Sin embargo, solo el rubosido parcial se convirtio en Reb KA despues de 24 horas (H) por el polipeptido HV1 recombinante solo sin estar acoplado a AtSUS1, lo que indica que AtSUS1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS. En el sistema de reaccion de acoplamiento HV1-AtSUS1, el Reb KA producido se puede convertir continuamente a Reb E.
Ejemplo 4
En este ejemplo, la actividad de HV1 se analizo usando Reb E como un sustrato.
El sustrato Reb E (0.5 mg/ml) se incubo con el polipeptido HV1 recombinante (20 |ig) y AtSUS1 (20 |ig) en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (200 |iL) en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Como se muestra en la figura 4, Reb Z se produjo mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante y AtSUS1. Estos resultados indicaron que HV1 puede transferir una unidad estructural de glucosa a Reb E para formar RZ. La figura 4 muestra que el rebaudiosido Z ("Reb Z") se puede producir a partir del rebaudiosido E ("Reb E") catalizado por un polipeptido HV1 recombinante y un AtSUS1 recombinante en un sistema de reaccion de acoplamiento HV1-AtSUS1. HV1 puede transferir una glucosa a Reb E para producir Reb Z, mezcla de Reb Z1 y Reb Z2 en la proporcion entre 60:40 y 70:30 (solicitud provisional de EE. UU. No. 61/898,571, asignada a Conagen Inc.).
Ejemplo 5
En este ejemplo, para confirmar la conversion de Reb KA en Reb E, se incubo el sustrato Reb KA purificado con HV1 recombinante con o sin AtSUS1. Como se muestra en la figura 5, Reb E fue producido por el polipeptido HV1 recombinante en ambas condiciones de reaccion. Sin embargo, el polipeptido AtSUS1 en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS puede mejorar la eficiencia de la reaccion. Todo el sustrato Reb KA se puede convertir completamente a Reb E en el sistema de acoplamiento UGT-SUS (D).
Ejemplo 6
En este ejemplo, se analizo la actividad de EUGT11 usando rubusosido como sustrato.
Como se muestra en la figura 6, EUGT11 puede transferir una unidad estructural de azucar a rubusosido para producir Reb KA y esteviosido en todas las condiciones de reaccion con o sin AtSUS1. AtSUS1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS. En el sistema de reaccion de acoplamiento HV1-AtSUS1, Reb E puede ser convertido continuamente por EUGT11. La protema de fusion EUS presento una mayor actividad en las mismas condiciones de reaccion. Todos los Reb KA y el esteviosido producidos se convirtieron completamente en Reb E por EUS a las 48 horas. Reb E se puede convertir continuamente a Reb D2.
Ejemplo 7
En este ejemplo, la actividad de EUGT11 se analizo usando Reb KA como sustrato.
El EUGT11 es un UGT con una actividad de glicosilacion de 1,2-19-O-glucosa para producir el glicosido de esteviol relacionado (Solicitud publicada PCT WO2013/022989, asignada a Evolva SA). Por ejemplo, EUGT11 puede catalizar la reaccion para producir Reb E a partir de esteviosido. EUGT11 tambien tiene una actividad de glicosilacion de 1,6-13-0- glucosa que puede transferir una molecula de glucosa al rebaudiosido E para formar el rebaudiosido D2 (solicitud de patente de los Estados Unidos No. de serie 14/269,435, asignada a Conagen, Inc.). En los experimentos, encontramos
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que EUGT11 puede transferir un residuo de glucosa a Reb KA para formar Reb E. Como se muestra en la figura 7, EUGT11 puede transferir una unidad estructural de azucar a Reb KA para producir Reb E en todas las condiciones de reaccion con (E, H) o sin AtSUSI (D, G). AtSUSI mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS (E, H). En el sistema de reaccion de acoplamiento EUGT11-AtSUS1 (E, H) y el sistema de reaccion de fusion EUS (F, I), todo Reb KA se convirtio completamente y el Reb E producido se puede convertir continuamente a Reb D2.
Ejemplo 8
En este ejemplo, la actividad de UGT76G1 se analizo usando rubusosido como sustrato.
UGT76G1 tiene actividad de glicosilacion de 1,3-13-O-glucosa que puede transferir una molecula de glucosa a esteviosido para formar rebaudiosido Ay a Reb E para formar rebaudiosido D. En el ejemplo, encontramos que UGT76G1 puede transferir un residuo de glucosa a rubusosido para formar rebaudiosido G.
Como se muestra en la figura 8, UGT76G1 puede transferir una unidad estructural de azucar a rubusosido para producir Reb G en todas las condiciones de reaccion con (D, G) o sin AtSUSI (C, F). AtSUSI mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS. La protema de fusion GS mostro una mayor actividad en las mismas condiciones de reaccion (E, H). Todo el rubusosido se convirtio completamente a Reb G por GS a las 12 h (E).
Ejemplo 9
En este ejemplo, la actividad de UGT76G1 se analizo usando rebaudiosido KA como sustrato.
Para identificar adicionalmente la actividad enzimatica de UGT76G1, se realizo un ensayo in vitro usando rebaudiosido KA como sustrato. Sorprendentemente, un novedoso glicosido de esteviol (rebaudiosido V "Reb V") se produjo en un momento temprano del tiempo. En momentos posteriores, el Reb V producido en la reaccion se convirtio en otro nuevo glicosido de esteviol (rebaudiosido W "RebW").
Como se muestra en la figura 9, UGT76G1 puede transferir una unidad estructural de azucar a Reb KA para producir Reb V en todas las condiciones de reaccion con (F, I) o sin AtSUSI (E, H). AtSUSI mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS (F, I). En el sistema de reaccion de acoplamiento UGT76G1-AtSUS1 (I) y el sistema de reaccion de fusion GS (J), el Reb V producido se convirtio completamente en Reb W a las 12 h.
Ejemplo 10
En este ejemplo, la actividad de UGT76G1 se analizo usando Reb V como sustrato.
Se introdujo Reb V purificado como sustrato en el sistema de reaccion. Como se muestra en la figura 10C, sorprendentemente Reb V se convirtio completamente en Reb W mediante el polipeptido recombinante UGT76G1 en el sistema de acoplamiento UGT-SUS1 a las 6 h.
Ejemplo 11
En este ejemplo, la actividad de HV1 se analizo usando Reb G como un sustrato.
Como se muestra en la figura 11, los polipeptidos HV1 recombinantes transfirieron una unidad estructural de azucar al rebaudiosido G para producir Reb V en todas las condiciones de reaccion con o sin AtSUS1. Reb G se convirtio completamente a Reb V mediante el HV1 recombinante en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (E, G). Sin embargo, solo el Reb G parcial se convirtio en Reb V despues de 24 horas (F) por el polipeptido HV1 recombinante solo sin estar acoplado a AtSUS1, lo que indica que AtSUS1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS.
Ejemplo 12
En este ejemplo, la actividad de EUGT11 se analizo usando Reb G como sustrato.
Como se muestra en la figura 12, los polipeptidos EUGT11 recombinantes transfirieron una unidad estructural de azucar al rebaudiosido G para producir Reb V en todas las condiciones de reaccion con (F, I) o sin AtSUS1 (E, H). Se combino mas Reb G a Reb V mediante el EUGT11 recombinante en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (F, I). Sin embargo, solo el Reb G parcial se convirtio en Reb V por el polipeptido EUGT11 recombinante solo sin estar acoplado a AtSUS1 (E, H), lo que indica que AtSUS1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS. La protema de fusion EUS presento una mayor actividad en las mismas condiciones de reaccion (G, J). Todo el Reb G en el sistema de reaccion se convirtio completamente a Reb V por EUS a las 24 horas (J).
Ejemplo 13
En este ejemplo, se analizaron las actividades combinadas de HV1 con UGT76G1, usando rubusosido como sustrato.
El sustrato rubusosido se incubo con el polipeptido HV1 recombinante, UGT76G1 y AtSUSI en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 13, Reb V y Reb W se produjeron mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante, UGT76G1 y AtSUSI.
5 De este modo, el polipeptido HV1 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,2-19-O-glucosa y 1,2- 13-O-glucosa, se puede usar en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,3-13-O-glucosa y 1,3-19-O-glucosa) para la biosmtesis compleja, de multiples etapas de los glicosidos de esteviol. Si la protema recombinante HV1 se combino con la protema de fusion GS en el sistema de reaccion, Reb V y Reb W, tambien se produjeron Reb V y Reb W por estas enzimas UGT, lo que indica que se puede generar una 10 reaccion de acoplamiento uGT-SUS mediante la protema de fusion GS.
Ejemplo 14
En este ejemplo, se analizaron las actividades combinadas de EUGT11 con UGT76G1 usando rubusosido como sustrato.
El sustrato rebusosido se incubo con el polipeptido EUGT11 recombinante, UGT76G1 y AtSUSI en un sistema de 15 reaccion de acoplamiento UGT-SUS en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 14, Reb W se produjo mediante la combinacion del polipeptido EUGT11 recombinante, UGT76G1 y AtSUS1. De este modo, el polipeptido EUGT11 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1, 2-19-O-glucosa y 1, 2-13-O-glucosa, se puede usar en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,3-13-O-glucosa y 1,3-19-020 glucosa) para la biosmtesis compleja, de multiples etapas de los glicosidos de esteviol. Si la protema recombinante
EUGT11 se combino con la protema de fusion GS en el sistema de reaccion, tambien se produjo Reb W por estas
enzimas UGT, lo que indica que se puede generar una reaccion de acoplamiento UGT-SUS mediante la protema de fusion GS.
Ejemplo 15
25 En este ejemplo, se analizaron las actividades combinadas de HV1 con UGT76G1 usando Reb G como sustrato.
El sustrato Reb G se incubo con el polipeptido HV1 recombinante, UGT76G1 y AtSUS1 en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 15, Reb V y Reb W se produjeron mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante, UGT76G1 y AtSUS1. Despues de 12 horas, todo el sustrato rubusosido se convirtio en 30 Reb V, y despues de 36 horas, todo el Reb V producido se convirtio en Reb W. De este modo, el polipeptido HV1
recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,2-19-O-glucosa y 1,2-13-O-glucosa se puede usar en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1, que mostro una actividad de 1,3-13-O-glucosa y 1,3-19-O- glucosa) para la biosmtesis compleja, de multiples etapas de los glicosidos de esteviol. Si la protema recombinante HV1 se combino con la protema de fusion GS en el sistema de reaccion, tambien se produjeron Reb V y Reb W por estas 35 enzimas UGT, lo que indica que se puede generar una reaccion de acoplamiento UGT-SUS mediante la protema de fusion GS.
Ejemplo 16
En este ejemplo, se analizaron las actividades combinadas de EUGT11 con UGT76G1 usando Reb G como sustrato.
El sustrato Reb G se incubo con el polipeptido EUGT11 recombinante, UGT76G1 y AtSUS1 en un sistema de reaccion 40 de acoplamiento UGT-SUS en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 16, Reb W se produjo mediante la combinacion del polipeptido recombinante EUGT11, UGT76G1 y AtSUS1. De este modo, el polipeptido EUGT11 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1, 2-19-O-glucosa y 1, 2-13-O-glucosa, se puede usar en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1, que mostro una, actividad de glicosilacion de 1,3-13-0-glucosa y 1,3-19-O-glucosa) para la 45 biosmtesis compleja, de multiples etapas de los glicosidos de esteviol. Si la protema recombinante EUGT11 se combino con la protema de fusion GS en el sistema de reaccion, tambien se produjo Reb W por estas enzimas UGT, lo que indica que se puede generar una reaccion de acoplamiento UGT-SUS mediante la protema de fusion GS.
Ejemplo 17
En este ejemplo, se analizo la actividad de las enzimas de fusion UGT76G1 y GS usando Reb D como un sustrato.
50 El sustrato Reb D se incubo con el UGT76G1 recombinante en condiciones similares a las usadas en los ejemplos
anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 22, Reb M fue producido por el
UGT76G1 con (Figura 22D y G) o sin AtSUS1 (Figura 22C y F) en las reacciones. De este modo, el polipeptido UGT76G1 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1, 3-19-O-glucosa, se puede usar en la biosmtesis del rebaudiosido M. Reb D se convirtio completamente en Reb M por el UGT76G1 recombinante en un
55 sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS (figura 22g). Sin embargo, solo la Reb D parcial se convirtio en Reb M
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despues de 6 horas (F) por el polipeptido UGT76G1 recombinante solo sin estar acoplado a AtSUSI, lo que indica que AtSUSI mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS. La protema de fusion GS mostro una actividad similar a la reaccion de acoplamiento UGT76G1-AtSUS1 en las mismas condiciones de reaccion (E, H). Toda la Reb D se convirtio completamente en Reb M por GS a las 6 h (H), lo que indica que se puede generar la reaccion de acoplamiento UGT-SUS mediante la protema de fusion GS.
Ejemplo 18
En este ejemplo, se analizo la actividad de las enzimas de fusion UGT76G1 y GS usando Reb E como sustrato.
El sustrato Reb E se incubo con la enzima de fusion GS o UGT76G1 recombinante en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 23, Reb D fue producido por el UGT76G1 con (Figura 23E, H y K) o sin AtSUSI (Figura 22D, G y J) y enzima de fusion GS (Figura 23F, I y L) en las reacciones. Ademas, Reb M se formo a partir de Reb D producida en las reacciones. De este modo, el polipeptido UGT76G1 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,3-13-O-glucosa y 1,3-19-O-glucosa, se puede usar en la biosmtesis de rebaudiosido D y rebaudiosido M. Reb E se convirtio completamente a Reb M por el UGT76G1 recombinante en un sistema de reaccion de acoplamiento UGT-SUS despues de 24 horas (Figura 23K). Sin embargo, solo Reb D se convirtio completamente de Reb E despues de 24 horas (J) por el polipeptido UGT76G1 recombinante solo sin estar acoplado a AtSUSI, lo que indica que AtSUSI mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS a traves de la produccion continua de UDPG. La protema de fusion GS mostro una actividad similar a la reaccion de acoplamiento UGT76G1-AtSUS1 en las mismas condiciones de reaccion (Figura 23F, I y L), lo que indica que la reaccion de acoplamiento UGT-SUS se puede generar por la protema de fusion GS.
Ejemplo 19
En este ejemplo, se analizaron las actividades combinadas de HV1 con UGT76G1 usando esteviosido como sustrato.
El sustrato de esteviosido se incubo con el polipeptido HV1 recombinante y UGT76G1 o la enzima de fusion GS en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 24, la Reb A se produjo mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante y UGT76G1 en todas las reacciones. Adicionalmente, Reb D y Reb M se detectaron en las reacciones usando la combinacion del polipeptido HV1 recombinante, el polipeptido UGT76G1 y AtSUSI (Figura 24E, H y K) o la combinacion de la enzima de fusion GS recombinante y el polipeptido HV1 (Figura 24F, I y L). El polipeptido HV1 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1, 2-19-O-glucosa, se puede usar en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,3-13-O-glucosa y 1,3-19-O-glucosa) para la biosmtesis compleja, de multiples etapas de rebaudiosido D y rebaudiosido M. Los resultados tambien mostraron que AtSUS1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS a traves de la produccion continua de UDPG (Figura 24E, H y K). La protema de fusion GS mostro una actividad similar a la reaccion de acoplamiento UGT76G1-AtSUS1 en las mismas condiciones de reaccion (Figura 24F, I y L), lo que indica que la reaccion de acoplamiento UGT-SUS se puede generar por la protema de fusion GS.
Ejemplo 20
En este ejemplo, HV1 combinado con actividades de UGT76G1 se analizaron usando Reb A como sustrato.
El sustrato Reb A se incubo con el polipeptido HV1 recombinante y UGT76G1 o enzima de fusion GS en condiciones similares a las usadas en los ejemplos anteriores. Los productos fueron analizados por HPLC. Como se muestra en la figura 25, Reb D se produjo mediante la combinacion del polipeptido HV1 recombinante y UGT76G1 en todas las reacciones. Adicionalmente, se detecto Reb M en las reacciones usando la combinacion del polipeptido HV1 recombinante, polipeptido UGT76G1 y AtSUS1 (Figura 25D, G y J) o la combinacion de la enzima de fusion GS recombinante y el polipeptido HV1 (Figura 25E, H y K). El polipeptido HV1 recombinante, que mostro una actividad de glicosilacion de 1, 2-19-O-glucosa, se puede usar en combinacion con otras enzimas UGT (tal como UGT76G1, que mostro una actividad de glicosilacion de 1,3-19-O-glucosa) para la biosmtesis compleja, de multiples etapas del rebaudiosido D y del rebaudiosido M. Los resultados tambien mostraron que AtSUS1 mejoro la eficiencia de conversion en el sistema de acoplamiento UGT-SUS a traves de la produccion continua de UDPG (Figura 25D, G y J). La protema de fusion GS mostro una actividad similar a la reaccion de acoplamiento UGT76G1-AtSUS1 en las mismas condiciones de reaccion (Figura 25E, H y K), lo que indica que la reaccion de acoplamiento UGT-SUS puede ser generada por la protema de fusion GS.
Ejemplo 21
En este ejemplo, la estructura de Reb V se analizo por RMN.
El material usado para la caracterizacion de Reb V se produjo usando la conversion enzimatica de Reb G y se purifico por HPLC. Los datos HRMS se generaron con un instrumento LTQ Orbitrap Discovery HRMS, con su resolucion establecida en 30k. Los datos escaneados desde m/z 150 a 1500 en modo de electroaspersion de iones positivos. El voltaje de la aguja se ajusto a 4 kV; las otras condiciones de la fuente fueron gas de proteccion = 25, gas auxiliar = 0, gas de barrido = 5 (todos los flujos de gas en unidades arbitrarias), voltaje capilar = 30 V, temperatura capilar = 300 °C y
voltaje de la lente del tubo = 75. La muestra se diluyo con 2: 2: 1 acetonitrilo: metanol: agua (igual que el eluyente de infusion) e inyectado 50 microlitros. Los espectros de RMN se adquirieron en instrumented Bruker Avance DRX 500 MHz o Varian INOVA 600 MHz usando secuencias de pulsos estandar. Los espectros de RMN ID (1H y 13C) y 2D (TOCSY, HMQC y HMBC) se realizaron en C5D5N.
5 La formula molecular de Reb V se ha deducido como C44H70O23 en base a su espectro de masas de alta resolucion positiva (HR) que mostraba iones aductos correspondientes a [M+ Na]+ en m/z 989.4198; esta composicion fue apoyada por los datos de espectro 13C RMN. Los datos de espectro 1H RMN de Reb V mostraron la presencia de dos singletes de metilo a 8 0.97 y 1.40, dos protones olefrnicos como singletes a 8 5.06 y 5.71 de un doble enlace exoctelico, nueve protones sp3 metileno y dos protones sp3 metino entre 8 0.74-2.72, caractensticos de los diterpenoides ent-kaurane 10 aislados anteriormente del genero Stevia. El esqueleto basico de diterpenoides ent-kaurane fue apoyado por los estudios COSY y TOCSY que mostraron correlaciones clave: H-1/H-2; H-2/H-3; H-5/H-6; H-6/H-7; H-9/H-11; H-11/H-12. El espectro 1H RMN de Reb V tambien mostro la presencia de cuatro protones anomericos resona--8ntes a 8 5.08, 5.38, 5.57, y 6.23; sugiriendo cuatro unidades de azucar en su estructura. La hidrolisis acida de Reb V con H2SO4 al 5% produjo D-glucosa que se identifico por comparacion directa con una muestra autentica por TLC. La hidrolisis enzimatica 15 de Reb V proporciono una aglicona que se identifico como esteviol por comparacion de 1H RMN y TLC conjunta con compuesto estandar. Las constantes de acoplamiento grandes observadas para los cuatro protones anomericos de las unidades estructurales de glucosa a 8 5.08 (d, J=7.8 Hz), 5.38 (d, J=8.1 Hz), 5.57 (d, J=8.0 Hz), y 6.23 (d, J=7.8 Hz), sugirio su p-orientacion segun lo informado para los glicosidos de esteviol. Los valores de 1H y 13C RMN para Reb V se asignaron en base a los datos de TOCSY, HMQC y HMBC y se proporcionan en la tabla 3.
20 Tabla 3. Datos de espectros de 1H y 13C RMN (desplazamientos qmmicos y constantes de acoplamiento) para Reb V y
Reb Ga-c.
Posicion
Reb V Reb G
1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN
1
0.74 m, 1.66 m 41.1 0.78 m, 1.69 m 41.3
2
1.43 m, 2.18 m 20.4 1.44 m, 2.20 m 20.0
3
1.06 m, 2.72 d (12.8) 38.4 1.05 m, 2.70 d (11.6) 38.8
4
— 44.8 — 44.9
5
1.32 m 57.9 1.32 m 57.8
6
1.84 m, 2.20 m 22.7 1.87 m, 2.24 m 22.6
7
1.06 m, 1.70 m 42.2 1.07 m, 1.72 m 42.2
8
— 42.5 — 43.1
9
0.91 d (7.8) 54.5 0.92 d (7.6) 54.4
10
— 40.2 — 40.4
11
1.72 m 21.0 1.75 m 21.2
12
2.18 m, 2.38 m 38.3 2.26 m, 2.38 m 37.7
13
— 87.6 — 86.4
14
1.68 m, 2.43 m 44.8 1.78 m, 2.50 m 44.6
15
1.96 m, 2.24 m 48.9 2.06 m, 2.32 m 48.2
16
— 153.7 — 155.0
17
5.06 s, 5.71 s 105.7 5.00 s, 5.49 s 104.8
18
1.40 s 29.6 1.32 s 28.8
19
— 176.4 — 177.4
20
0.97 s 16.7 1.25 s 16.2
1'
6.23 d (7.8) 94.2 6.16 d (7.6) 96.4
2'
3.98 m 74.5 4.01 m 74.5
3'
4.14 m 79.3 4.09 m 79.3
4'
4.36 m 71.6 4.34 m 71.6
5'
4.24 m 79.9 4.22 m 79.9
6'
4.06 m, 4.48 m 62.6 4.04 m, 4.44 dd (3.2, 7.6) 62.6
1"
5.08 d (7.8) 99.6 5.06 d (7.4) 99.9
2"
3.94 m 74.7 3.92 m 74.5
3"
4.04 m 89.3 4.06 m 89.5
4"
4.28 m 71.2 4.23 m 71.0
5"
4.00 m 78.2 4.02 m 78.1
6"
4.24 m, 4.58 m 63.0 4.27 m, 4.56 dd (2.8, 8.4) 63.1
1'"
5.38 d (8.1) 106.4 5.27 d (8.4) 106.5
2'"
4.16 m 76.1 4.14 m 76.0
3'"
4.34 m 79.2 4.37 m 79.3
4'"
4.26 m 72.2 4.28 m 72.2
5'"
3.78 m 78.8 3.89 m 78.8
6'"
4.14 m, 4.44 m 63.2 4.18 m, 4.48 m 63.2
1""
5.57 d (8.0) 105.7
2""
3.96 m 76.5
3""
4.32 m 79.6
4""
4.20 m 72.5
5""
3.87 m 79.0
6""
4.12 m, 4.46 m 63.5
a asignaciones realizadas en base a las correlaciones TOCSY, HMQC y HMBC; b Los valores de desplazamiento qmmico estan en S (ppm); c Las constantes de acoplamiento estan en Hz.
En base a los resultados de los datos de espectros de RMN y los experimentos de hidrolisis de Reb V, se concluyo que existen cuatro unidades de p-D-glucosilo en su estructura conectadas a la aglicona esteviol. Una comparacion cercana de los valores de 1H y 13C RMN de Reb V con Reb G sugirio la presencia de una unidad estructural de aglicona esteviol 5 con una unidad 3-O-p-D-glucobiosilo en C-13 en forma de enlace eter y otra unidad p- D-glucosilo en la posicion C-19 en forma de un enlace ester, dejando la asignacion de la cuarta unidad estructural p-D-glucosilo (Figura 17). El desplazamiento de campo descendente para los desplazamientos qmmicos 1H y 13C en la posicion 2 del azucar I de la unidad estructural p-D-glucosilo apoyo la presencia de la unidad p-D-glucosilo en esta posicion. La estructura fue apoyada ademas por las correlaciones clave TOCSY y HMBC como se muestra en la figura 18. Sobre la base de los 10 resultados de la RMN y de los datos del espectro de masas, asf como de los estudios de hidrolisis, la estructura de Reb V producida por la conversion enzimatica de Reb G se dedujo como ester -(2-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosilo) del acido 13-[(3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico.
Hidrolisis acida de Reb V. A una solucion de Reb V (5 mg) en MeOH (10 ml) se anadieron 3 ml de H2SO4 al 5% y la mezcla se calento a reflujo durante 24 horas. La mezcla de reaccion se neutralizo luego con carbonato de sodio 15 saturado y se extrajo con acetato de etilo (EtOAc) (2 x 25 ml) para dar una fraccion acuosa que contema azucares y una
5
10
15
20
25
30
35
fraccion de EtOAc que conterna la parte de aglicona. La fase acuosa se concentre y se compare con los azucares estandar usando los sistemas TLC EtOAc/n-butanol/agua (2:7:1) y CH2Cl2/MeOH/agua (10:6:1); los azucares fueron identificados como D-glucosa.
Se disolvio hidrolisis enzimatica de Reb V. Reb V (1 mg) en 10 ml de solucion reguladora de acetato de sodio 0.1 M, pH 4.5 y se anadio pectinasa cruda de Aspergillus niger (50 uL, Sigma-Aldrich, P2736). La mezcla se agito a 50 °C, durante 96 h. El producto precipitado durante la reaccion a partir de la hidrolisis de 1 se identifico como esteviol por comparacion de su TLC conjunta con compuesto estandar y datos de espectro 1H RMN. Un compuesto llamado Reb V se confirmo como ester -(2-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosilo) del acido 13-[(3-O-p-D-glucopiranosil-p-D-glucopiranosil)oxi] ent-kaur-16-en-19-oico sobre la base de 1D y 2D RMN extensa, as^ como datos de espectros de masas de alta resolucion y estudios de hidrolisis.
Ejemplo 22
En este ejemplo, la estructura de Reb W se analizo mediante RMN.
El material usado para la caracterizacion de Reb W se produjo usando la conversion enzimatica de Reb V y se purifico por HPLC. Los datos HRMS se generaron con un instrumento LTQ Orbitrap Discovery HRMS, con su resolucion establecida en 30k. Los datos escaneados desde m/z 150 a 1500 en modo de electroaspersion de iones positivos. El voltaje de la aguja se ajusto a 4 kV; las otras condiciones de la fuente fueron gas de proteccion = 25, gas auxiliar = 0, gas de barrido = 5 (todos los flujos de gas en unidades arbitrarias), voltaje capilar = 30 V, temperatura capilar = 300 °C y voltaje de la lente del tubo = 75. La muestra se diluyo con 2:2:1 acetonitrilo:metanol:agua (igual que el eluyente de infusion) e se inyectaron 50 microlitros. Los espectros de RMN se adquirieron en instrumentos Bruker Avance DRX 500 MHz o Varian INOVA 600 MHz usando secuencias de pulsos estandar. Los espectros de RMN ID (1H y 13C) y 2D (TOCSY, HMQC y HMBC) se realizaron en C5D5N.
La formula molecular de Reb W se ha deducido como C50H80O28 en base a su espectro de masas de alta resolucion positiva (HR) que mostro iones aductos correspondientes a [M+ Na]+ en m/z 1151.4708; esta composicion fue apoyada por los datos de espectro 13C RMN. Los datos de espectro 1H RMN de Reb W mostraron la presencia de dos singletes de metilo a 8 0.92 y 1.39, dos protones olefrnicos como singletes a 8 5.10 y 5.73 de un doble enlace exodclico, nueve protones sp3 metileno y dos sp3 metino entre 8 0.72-2.72, caractensticos de los diterpenoides ent-kaurane aislados anteriormente del genero Stevia. El esqueleto basico de diterpenoides ent-kaurane fue apoyado por los estudios TOCSY que mostraron correlaciones clave: H-1/H-2; H-2/H-3; H-5/H-6; H-6/H-7; H-9/H-11; H-11/H-12. El espectro de 1H RMN de Reb W tambien mostro la presencia de cinco protones anomericos resonantes a 8 5.10, 5.34, 5.41, 5.81, y 6.14; sugiriendo cinco unidades de azucar en su estructura. La hidrolisis acida de Reb W con H2SO4 al 5% produjo D-glucosa que se identifico por comparacion directa con una muestra autentica por TLC. La hidrolisis enzimatica de Reb W proporciono una aglicona que se identifico como esteviol por comparacion de 1H RMN y TLC conjunta con compuesto estandar. Las grandes constantes de acoplamiento observadas para los cinco protones anomericos de las unidades estructurales de glucosa a 8 5.10 (d, J=7.4 Hz), 5.34 (d, J=7.9 Hz), 5.41 (d, J=7.9 Hz), 5.89 (d, J=7.9 Hz), y 6.14 (d, J=7.9 Hz), sugirieron su orientacion p segun lo informado para los glicosidos de esteviol [1-5, 9-13]. Los valores de 1H y 13C RMN para Reb W se asignaron en base a los datos de TOCSY, HMQC y HMBC y se proporcionan en la tabla 4.
Tabla 4. Datos de espectros de 1H y 13C RMN (cambios qmmicos y constantes de acoplamiento) para Reb W y Reb Va'b.
Posicion
Reb W Reb V
1H RMN 13C RMN 1H RMN 13C RMN
1
0.72 m, 1.67 m 41.0 0.78 m, 1.69 m 41.1
2
1.42 m, 2.18 m 20.4 1.44 m, 2.20 m 20.4
3
1.06 m, 2.72 d (13.4) 38.6 1.05 m, 2.70 d (11.6) 38.4
4
— 44.8 — 44.8
5
1.34 m 57.9 1.32 m 57.9
6
1.84 m, 2.18 m 22.8 1.87 m, 2.24 m 22.7
7
1.07 m, 1.69 m 42.3 1.07 m, 1.72 m 42.2
8
— 42.4 — 42.5
9
0.90 d (5.8) 54.5 0.92 d (7.6) 54.5
10
— 40.1 — 40.2

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    1. Un metodo de produccion de rebaudiosido KA y/o rebaudiosido E a partir de rubusosido, comprendiendo el metodo: proporcionar una mezcla de reaccion que comprende:
    (A)
    (i) rubusosido,
    (ii) uridina difosfato-glucosa (UDP-glucosa) como sustrato; y
    (iii) la glicosiltransferasa HVI que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ. ID. NO 5; o
    (B)
    (i) rubusosido,
    (ii) sacarosa, UDP y UDP-glucosa como sustratos y
    (ii) la glicosiltransferasa HVI que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ. ID. NO: 5 con una
    incubar la mezcla de reaccion para producir el rebaudiosido KA, en el que una glucosa se acopla de la glucosa 19-O de rubusosido para producir el rebaudiosido KA y/o rebaudiosido E, en el que la glucosa se acopla mas covalentemente por dicha glicosiltransferasa al C2' de la 13-O-glucosa del rebaudiosido KA; y obtener el rebaudiosido KA de la mezcla de reaccion para usar como edulcorante.
  2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el rebaudiosido KA se obtiene para usar como un unico edulcorante.
  3. 3. Un metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que se emplea una sacarosa sintasa seleccionada del grupo que consiste en una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis; una sacarosa sintasa 3 de Arabidopsis; y una sacarosa sintasa de Vigna radiata.
  4. 4. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que la sacarosa sintasa es una sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis thaliana.
  5. 5. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el rebaudiosido KA se proporciona en una composicion edulcorante que incluye al menos uno de un relleno, un agente de carga y un agente antiaglomerante.
  6. 6. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas incorporar el rebaudiosido KA como edulcorante en un producto de consumo por via oral, que es una bebida u otro producto de consumo por via oral.
    sacarosa sintasa covalentemente al C2'
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    Tiempo (min)
    FIG. 10
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    Tie-mpo {in in)
    FIG. 11
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    0
    OOI
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    imagen14
    azucar II
    azucar II
    azucar III
    azucar III
    azucar I
    azucarI
    azucar
    azucar
    azucar
    TOCSY
    HMBC
    azucarI
    FIG. 18
    azucar IV
    imagen15
    azucarI
    ai car
    azucar
    azucar
    azucar
    azucar V OH azucar I
    azucar IV OH
    azucar IV OH
    Ren W
    Reb V
    FIG. 19
    azucar
    azucar
    ► TOCSY
    HMRC
    azucarI
    azucarV
    OH FIG. 20
    azucar IV
    imagen16
    imagen17
    imagen18
    imagen19
    imagen20
    imagen21
    imagen22
    azucar I
    azucar
    azucar IV
    azucar
    azucar VI
    TOCSY
    HMBC
    azucarV
    FIG. 27
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