ES2674674T3 - Agrobacterium para la transfección transitoria de plantas completas - Google Patents

Abstract

Un proceso de transfección transitoria de una planta u hojas en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta o dichas hojas con una suspensión que comprende células de Agrobacterium de la cepa CryX depositada bajo el número de acceso DSM: DSM25686.

Description

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DESCRIPCION

Agrobacterium para la transfección transitoria de plantas completas Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso de transfección transitoria de una planta u hojas en una planta. La invención también se refiere a un proceso de expresión transitoria de una secuencia de aDn de interés en una planta o en hojas de una planta. Además, la invención se refiere a una cepa de Agrobacterium.

Antecedentes de la invención

Los procesos actuales de ingeniería genética para la agricultura se basan todos en la modificación genética estable de las especies de cultivos, demostrada primero en 1983 (Fraley et al 1983; Barton et al 1983) y comercializada desde 1996. Aunque los procesos agrícolas basados en la transformación genética estable de las plantas es una realidad hoy y es una base para nuevas prácticas de éxito, tiene múltiples limitaciones, siendo las principales el tiempo muy largo y el alto coste requerido para el desarrollo de cultivos transgénicos. El consenso general entre las empresas involucradas en la biotecnología vegetal es que el proceso de I + D requiere, dependiendo de la especie de cultivo, entre 8 y 16 años, y el coste promedio total del desarrollo se estima entre 100 y 150 millones de dólares americanos. Debido a estas limitaciones, después de más de 25 años desde el descubrimiento de un proceso de transformación genética de plantas, solo se han comercializado hasta ahora un puñado de rasgos y pocas especies de cultivos GM.

Se sabe que las células vegetales y las plantas completas también se pueden reprogramar de forma transitoria (es decir, sin una integración estable de material genético nuevo en un cromosoma vegetal), y los procesos transitorios, tales como las infecciones víricas, son rápidos. Dichos procesos transitorios podrían, en principio, permitir una modificación muy rápida del metabolismo de las plantas a favor de ciertos productos que son de interés para el usuario. Dichos procesos requieren un vector de ADN o ARN (un virus o una bacteria), que se ha diseñado para transfectar la planta de manera eficaz y segura. Los primeros intentos de usar vectores basados en virus de plantas han tenido un éxito parcial, ya que permiten la transfección de plantas para la fabricación de proteínas recombinantes de alto valor, tales como ciertos biofarmacéuticos (Gleba et al 2007, 2008; Lico et al 2008). En la literatura se ha descrito el uso de virus para la manipulación de otros rasgos, tales como rasgos introducidos (por ejemplo, resistencia a herbicidas, Shiboleth et al 2001; Zhang y Ghabiral 2006), pero la transfección de virus introduce tantos cambios indeseados en el huésped infectado que este tipo de proceso transitorio ya no se persigue para los rasgos introducidos. Los procesos transitorios también se pueden construir en torno a la capacidad de las especies de Agrobacterium para transferir parte de su plásmido Ti a células eucariotas, en particular, células vegetales. El uso de transfección con Agrobacterium es una base para manipulaciones genéticas, tales como protocolos de transformación genética y ensayos de transfección transitoria de laboratorio. Las aplicaciones industriales de transfección con Agrobacterium también se han limitado a la fabricación de proteínas recombinantes, porque las condiciones óptimas de aplicación, tales como la infiltración al vacío de plantas con suspensiones bacterianas no se pueden utilizar a gran escala en el campo, mientras que la pulverización de partes aéreas o plantas de riego con soluciones bacterianas da como resultado una proporción supuestamente muy pequeña de células vegetales a transfectar, y los estudios previos simplemente no abordaron esta cuestión específica.

Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes se usan ampliamente en laboratorios de investigación en todo el mundo para la transfección transitoria y la transformación genética estable de las plantas. Estas aplicaciones se basan en la capacidad de Agrobacterium para transferir información genética a células eucariotas. Muchas de las plantas transgénicas cultivadas en la actualidad, como la soja, la canola y el algodón, se han generado a través de transformación genética mediada por Agrobacterium. La diferencia esencial entre la transformación transitoria y estable es que en el proceso de transformación estable, el ADN liberado por Agrobacterium se integra, en última instancia, en un cromosoma vegetal y, después, es heredado por la progenie de la planta. Tales eventos de integración son raros incluso en experimentos de laboratorio diseñados específicamente para proporcionar contactos masivos entre células vegetales y bacterias; así, para la selección de transformantes estables, se deben utilizar métodos de detección selectiva específicos y se emplean explantes de plantas específicos (ricos en tejidos meristemáticos) seleccionados para una transformación óptima y regeneración en plantas completas. Posteriormente, el conocimiento acumulado en este dominio de la ciencia tiene un valor limitado para aquellos interesados en procesos transitorios donde muchas células del cuerpo de la planta deberían verse afectadas sin la selección de células transfectadas.

La transfección transitoria, por otra parte, tiene en cuenta solo las etapas tempranas de la liberación de ADN dirigida por Agrobacterium en un núcleo de una célula vegetal, junto con el hecho de que tales moléculas de ADN liberadas pueden transcribirse en un núcleo incluso en ausencia de integración de ADN en un cromosoma vegetal, dando como resultado dicha expresión una reprogramación metabólica transitoria de una célula vegetal. Dicha reprogramación se ha desarrollado como una herramienta de laboratorio para la evaluación rápida de diferentes experimentos genéticos. Aunque existe gran cantidad de información sobre transferencia de ADN mediada por Agrobacterium a células vegetales, dicha información se limita invariablemente a experimentos a escala de

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laboratorio y, hasta el momento, se han realizado intentos de desarrollar aplicaciones a escala industrial que impliquen a Agrobacterium como vector de ADN.

Una de las limitaciones de las aplicaciones de laboratorio es el hecho de que la liberación de ADN mediante Agrobacterium requiere ciertos tratamientos que son difíciles o imposibles de aplicar en campo abierto o a gran escala. En experimentos transitorios típicos, las células vegetales o partes de plantas (explantes) cultivadas se tratan con un exceso de bacterias para proporcionar una liberación máxima. En experimentos de investigación típicos, también es de interés los niveles de expresión que no son económicamente viables si se realizan a escala industrial. En general, la investigación realizada en este dominio ha llevado a los inventores a la conclusión de que los parámetros que afectan gravemente a la expresión transitoria son los que permiten el mejor acceso de interacción de las agrobacterias a las células vegetales dentro del cuerpo de una planta. La mayoría de tales estudios utilizan infiltración al vacío, inyección en la hoja de la planta o tratamiento con tensioactivos, roturas de la superficie de la planta, por ejemplo con hojas de afeitar o una combinación de los mismos. De hecho, el único grupo que está desarrollando un proceso de transfección por Agrobacterium para la producción comercial de proteínas recombinantes que no implica una mayor amplificación (basada en virus) del ADN original, es el grupo de Medicago (D'Aoust et al 2008, 2009; Vezina et al, 2009). Su proceso depende completamente de la infiltración al vacío como método de liberación. Sin embargo, debido a que se basan en un gran exceso de bacterias en la proporción de células vegetales, los protocolos de laboratorio actuales usados para la transfección transitoria de plantas no tienen un valor de traducción serio, es decir, no se pueden replicar directamente a nivel industrial. Salvo en algunos casos (por ejemplo, Vaquero et al, 1999, D'Aoust et al, 2008, 2009), tampoco han abordado cuantitativamente el problema de la eficacia del proceso de transfección transitoria. (Los ejemplos de tal investigación son múltiples, se proporciona una cita para unos pocos representativos: Li et al, 1992; Liu et al, 1992; Clough y Bent, 1998; De Buck et al, 1998, 2000; Chung et al, 2000; Yang et al., 2000; Zambre et al, 2003; Wroblewski et al, 2005; Lee y Yang, 2006; Zhao et al, 2006; Shang et al, 2007; Jones et al., 2009; Li et al, 2009; De Felippes y Weigel, 2010).

Uno de los procesos industriales en desarrollo en la actualidad es la magnificación, un proceso que se basa en la infiltración al vacío de agrobacterias en las hojas de las plantas. El proceso de magnificación (registrado por Icon Genetics GmbH como magnlCON® y cubierto por varias patentes/solicitudes de patente) es un protocolo simple e indefinidamente escalable para la expresión heteróloga de proteínas en plantas, que carece de transformación genética estable de una planta, pero en cambio depende de amplificación transitoria de vectores víricos liberados en múltiples áreas del cuerpo de una planta (liberación sistémica) por Agrobacterium como precursores de ADN. Tal proceso es, en esencia, una infiltración de plantas maduras completas con una suspensión diluida de agrobacterias que llevan ADN-T que codifican replicones de ARN vírico. En este proceso, las bacterias asumen las funciones (anteriormente víricas) de infección primaria y movimiento sistémico, mientras que el vector vírico proporciona la propagación de célula a célula (distancia corta), la amplificación y la expresión de proteínas de alto nivel. La versión escalable (industrial) se basa en vectores víricos completamente ensamblados (en lugar de provectores que requieren ensamblaje in planta) y requiere aparatos para la liberación de Agrobacterium de alto rendimiento a las plantas completas mediante infiltración al vacío. El proceso puede ampliarse pero requiere la inmersión de las partes aéreas de las plantas en suspensión bacteriana al vacío (el proceso implica invertir las plantas cultivadas en macetas o en bandejas), un procedimiento que impone limitaciones en los volúmenes de biomasa que pueden tratarse de esta manera, en el rendimiento del proceso, las formas en que las plantas se pueden cultivar antes del tratamiento y también conlleva ciertos costes que limitan el uso del proceso a productos de alto coste, tales como los productos biofarmacéuticos recombinantes solamente. El proceso de magnificación es eficiente, ya que permite la transfección de casi todas las células de la hoja en plantas tratadas, o aproximadamente el 50 % de la biomasa total de la planta aérea (el resto son tallos y pecíolos de las hojas). El proceso se ha optimizado de muchas maneras, véase, por ejemplo, Marillonnet et al, 2005. Sin embargo, el proceso actual se ha construido completamente en torno a métodos de administración bacteriana, tal como inyección en una hoja de planta o infiltración al vacío (por ejemplo, Simmons et al, 2009), heridas en las hojas (Andrews y Curtis, 2005) o verter agrobacterias en el suelo ("agroempapado", Ryu et al, 2004; Yang et al, 2008), pero estos métodos no pueden aplicarse para el tratamiento masivo de las plantas en un campo (revisado en Gleba et al, 2004, 2007, 2008; Gleba y Giritch, 2010, 2011; Lico et al, 2008; entre los artículos originales de nuestro grupo se incluyen Giritch et al. 2006; Marillonnet et al., 2004, 2005; Santi et al, 2006; y artículos ideológicamente similares de otros grupos de investigación - Voinnet et al, 2003; Sudarshana et al, 2006; Gao et al, 2006; Mett et al, 2007; Lindbo, 2007a,b; Plesha et al, 2007, 2009; Huang et al., 2006; Regnard et al 2009; Green et al, 2009; Shoji et al, 2009).

Los intentos de usar tratamiento con Agrobacterium en plantas completas (in planta) sin infiltración al vacío han dado como resultado un número muy bajo de células transfectadas inicialmente, lo que limita en gran medida la aplicación práctica del proceso. Además, dado que no se realiza ninguna selección de células vegetales transfectadas en los sistemas de transfección transitoria, la totalidad del proceso de transfección transitoria tiene una eficacia demasiado baja para aplicaciones a gran escala si se quiere evitar la infiltración al vacío. Además, varias especies de plantas, tales como la soja o la colza, son difíciles de transfectar con Agrobacterium, a menos que se use tejido vegetal específico, por lo que no se ha conseguido un grado significativo de transfección transitoria in planta.

Sumario de la invención

Partiendo de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso eficiente de

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transfección transitoria in planta. Es otro objeto de la invención proporcionar un proceso eficiente de expresión transitoria de una secuencia de ADN de interés en planta in planta. Además, es un objeto de la invención proporcionar un proceso eficiente que permita la transfección transitoria de plantas usando Agrobacterium a gran escala (industrial) (es decir, para muchas plantas en paralelo) sin la necesidad de aplicar diferencias de presión para introducir Agrobacterium en el espacio intercelular de las plantas. También es un objeto proporcionar una célula y cepa de Agrobacterium adecuadas para este fin.

Estos problemas se resuelven mediante un proceso de transfección transitoria de una planta u hojas en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta o dichas hojas con una suspensión que comprende células de Agrobacterium de la cepa CryX depositada bajo el número de acceso: DSM25686.

Se proporciona adicionalmente un proceso de expresión transitoria de una secuencia de ADN de interés en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta o dichas hojas en una planta con una suspensión que comprende células de Agrobacterium de la cepa CryX depositada bajo el número de acceso: DSM25686.

La invención también proporciona una cepa CryX de Agrobacterium que tiene el número de acceso DSM: DSM25686; o una célula de Agrobacterium de la cepa CryX.

La invención también proporciona células de Agrobacterium de la cepa CryX de que tiene el número de acceso DSM: DSM25686, contenendo dichas células un vector binario que contiene en el aDN-T una secuencia de ADN de interés para transfectar en células de una planta, donde el vector binario puede codificar una proteína VirG de la cepa CryX o una proteína VirG estrechamente relacionada como se define a continuación.

La invención proporciona además un kit que comprende:

- una célula de Agrobacterium de dicha cepa como se ha definido anteriormente y

- un vector binario que contiene en el ADN-T una secuencia de ADN de interés para transfectar en las células de una planta.

El vector binario puede codificar una proteína VirG de la cepa CryX o una proteína VirG estrechamente relacionada como se define a continuación.

La invención también proporciona el plásmido vir de la cepa CryX y células de Agrobacterium que tienen el cromosoma de la cepa CryX.

La invención proporciona además una suspensión de células acuosas de la cepa CryX de Agrobacterium que tiene el número de acceso DSM: DSM25686, teniendo dicha suspensión una concentración celular de, como máximo, 1,1 ■106 ufc/ml de la suspensión, preferentemente, como máximo, 4,4.105 ufc/ml de la suspensión y, más preferentemente, de, como máximo, 1,1 105 ufc/ml de la suspensión.

Los inventores de la presente invención han encontrado una manera de aumentar fuertemente la eficacia de transfección transitoria de las plantas mediante Agrobacterium. Los inventores han identificado una cepa de Agrobacterium (cepa CryX de Agrobacterium) que logra una eficacia particularmente alta en la transfección transitoria in planta con una gran variedad de plantas. De forma notable, la cepa CryX logra una transfección transitoria mucho más alta in planta que otras cepas de Agrobacterium que se utilizan como patrón para la transformación o transfección de plantas, tal como la cepa LBA4404 o EHA105 (véase la página 64 de Slater et al., en: Plant Biotechnology, 2a edición, Oxford University Press, 2008). Los inventores han descubierto además que la cepa CryX logra una mayor eficacia de transfección transitoria que cepas de Agrobacterium relacionadas, tales como Chry5/KYRT1. Además, los inventores han descubierto que puede obtenerse una eficacia de transfección particularmente alta cuando un gen virG, de forma notable, el gen virG de la cepa LBA4404 de Agrobacterium o un gen virG que está estrechamente relacionado con el de LBA4404 se expresa en cepas de Agrobacterium tumefaciens de tipo crisopina o succinamopina.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B muestran regiones de ADN-T con secuencias de ADN de interés de vectores usados en los ejemplos. Pact2: promotor del gen de la actina 2 de Arabidopsis; o: extremo 5' de TVCV (virus del aclaramiento de las venas del nabo); RdRp: marco de lectura abierto (ORF) de la ARN polimerasa dependiente de ARN de cr- TMV (tobamovirus que infecta crucíferas); MP: ORF de la proteína del movimiento del cr-TMV; N: región no traducida en 3' del cr-TMV; Tnos o nos: terminador de la nopalina sintasa; segmentos blancos que interrumpen los segmentos grises en los ORF de RdRp yMP indican intrones insertados en estos ORF para aumentar la probabilidad de formación de replicones de ARN en el citoplasma de las células vegetales, que se describe con detalle en el documento WO2005049839; GUS: secuencia de codificación de la proteína GUS; GFP: secuencia de codificación de la proteína verde fluorescente; fs: cambio de marco que elimina la capacidad de movimiento de célula a célula; P35S: promotor 35S; P19: supresor del silenciamiento génico del virus del enanismo ramificado del tomate (véase Plant J. 33, 949-56); Tocs: terminador de ocs; LB: límite izquierdo del ADN-T; RB:

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límite derecho del ADN-T.

La figura 2 muestra una comparación de diferentes cepas de Agrobacterium tumefaciens para su eficacia de transfección transitoria. Las fotografías muestran fluorescencia de GFP a los 4 dpi (días postinfección) bajo luz ultravioleta debido a la expresión de GFP basada en TMV después de la infiltración con jeringa de hojas de Nicotiana benthamiana con cultivos agrobacterianos diluidos como se describe en el Ejemplo 2. Los números 10" 2 10"1 2 3 y 10"4 indican los factores de concentración de los cultivos agrobacterianos durante la noche de DO= 1,3 a 600 nm que corresponden a LAS diluciones de 102, 103 y 104, respectivamente. La composición del tampón para infiltración es MES 5 mM, pH 5,5 y MgSO410 mM. Cada infiltración se realizó por triplicado usando tres hojas independientes de la misma planta.

(A) vector basado en TMV capaz del movimiento de célula a célula: TMV(MP)-GFP (pNMD560).

(B) Vector basado en TMV que carece de la capacidad de movimiento de célula a célula: TMV(fsMP)-GFP

(pNMD570).

1- cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens;

2- cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens;

3- cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens;

4- cepa ICF320 de Agrobacterium tumefaciens;

5- cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens;

6- cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens;

7- cepa LBA9402 de Agrobacterium tumefaciens.

La Fig. 3 demuestra la influencia de virG sobreexpresión génica en la eficacia de transfección transitoria para cepas AGL1, EHA105, ICF320 y GV3101. Para la comparación se usaron secuencias virG de las cepas GV3101 y LBA4404 portadoras de la mutación N54D, así como la secuencia nativa de la cepa LBA4404. Las fotografías muestran fluorescencia de GFP 4 (Fig.3A) y 6 (Fig. 3B) dpi bajo luz ultravioleta debido a la expresión de GFP basada en TMV después de la infiltración con jeringa de hojas de Nicotiana benthamiana de la misma edad de 3 plantas independientes con cultivos de agrobacterias diluidos como se describe en el Ejemplo 3. Los números 10-2, 10-3 y 10-4 indican los factores de concentración por los cuales se redujeron las concentraciones de los cultivos de agrobacterias de DO = 1,3 a 600 nm. Por tanto, los factores 10-2, 10-3 y 10-4 correspond en a las diluciones 102-, 103 y 104, respectivamente. La composición del tampón para infiltración: MES 5 mM, pH 5,3 y MgCl2 10 mM. En todos los casos se usaron vectores basados en TMV capaces de movimiento de célula a célula.

1 - pNMD560 (sin virG) en GV3101;

2 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) en GV3101;

3 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en GV3101;

4 - pNMD062 (virG/LBA4404) en GV3101;

5 - pNMD560 (sin virG) en ICF320;

6 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) en ICF320;

7 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en ICF320;

8 - pNMD062 (virG/LBA4404) en ICF320;

9 - pNMD560 (sin virG) en EHA105;

10 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) en EHA105;

11 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en EHA105;

12 - pNMD062 (virG/LBA4404) en EHA105;

13 - pNMD560 (sin virG) en AGL1;

14 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) en AGL1;

15 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en AGL1;

16 - pNMD062 (virG/LBA4404) en AGL1.

Las figuras 4A y 4B muestran la influencia de la sobreexpresión del gen virG sobre la eficacia de la transfección transitoria de las cepas GV3101 y CryX. Para la comparación se usaron secuencias virG de las cepas GV3101 y LBA4404 portadoras de la mutación N54D, así como la secuencia nativa de la cepa LBA4404. Las fotografías muestran fluorescencia de GFP 3, 4 y 5 dpi bajo luz ultravioleta debido a la expresión de GFP basada en TMV después de la infiltración con jeringa de hojas de Nicotiana benthamiana de la misma edad de 3 plantas independientes con cultivos de agrobacterias diluidos como se describe en el Ejemplo 3. Los números 10-4 y 10-5 indican los factores de concentración de los cultivos de agrobacterias durante la noche de DO = 1,3 a 600 nm. La composición del tampón para infiltración: MES 5 mM, pH 5,3 y MgCh 10 mM. Se usaron vectores basados en TMV con capacidad de movimiento de célula a célula.

1- pNMD560 (sinvirG) en la cepa GV3101;

2- pNMD064 (virGN54D/GV3101) en la cepa GV3101;

3- pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en la cepa GV3101;

4- pNMD560 (sin virG) en la cepa CryX;

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5- pNMD064 (virGN54D/GV3101) en la cepa CryX;

6- pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en la cepa CryX.

La Figura 5 muestra una comparación de las eficacias de transfección transitoria para las cepas CryX y GV3101 en un intervalo de diluciones de cultivos de agrobacterias durante la noche a partir de 10-3 a 10-7 utilizando infiltración con jeringa de hojas de Nicotiana benthamiana. Los números 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7 indican los factores de concentración de los cultivos de agrobacterias durante la noche de DO = 1,3 a 600 nm. Estos corresponden a las diluciones de 103, 104, 105, 106 y 107, respectivamente. La composición del tampón para infiltración: MES 5 mM, pH 5,3 y MgCh 10 mM en agua. Las fotografías se toman a 4 dpi.

1- pNMD560 (sin virG) en la cepa GV3101;

2 - NMD064 (virGN54D/GV3101) en la cepa GV3101;

3 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en la cepa GV3101;

4- pNMD560 (sin virG) en la cepa CryX;

5- pNMD064 (virGN54D/GV3101) en la cepa CryX;

6- pNMD063 (virGN54D/LBA4404) en la cepa CryX.

La figura 6 muestra los resultados de las pruebas de diferentes cepas de Agrobacterium para la transfección transitoria de soja usando pulverización con suspensión de células de agrobacterias. construcción pNMD2190 (35S: GUS; 35S:p19 y irGN54D/LBA4404 en la estructura del plásmido) se usó con las cepas AGl1, EHA105, CryX y LBA4404; construcción pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 y irGN54D/GV3101 en la estructura del plásmido) se usó con las cepas GV3101 y ICF320. La tinción de las hojas para la actividad GUS se realizó a los 11 dps.

(A) Para la pulverización, se diluyeron cultivos líquidos de Agrobacterium de DOa00=1,3 en una proporción

1:10 con tampón que contenía MES 5 mM, pH5.3; MgCh 10 mM y 0,05 % (v/v) de Tween®20.

(B) Para la pulverización, se diluyeron cultivos líquidos de Agrobacterium de DOa00=1,3 en las proporciones

1:10, 1:100 y 1:1.000 con tampón que contenía (MES 5 mM, pH 5,3; MgCh 10 mM y 0,05 % (v/v) de

Tween®20) suplementado con partículas de carburo de silicio de tamaño 800 en la concentración 0,3 % (p/v).

La figura 7 muestra los resultados de las pruebas de las cepas CryX y EHA105 para la transfección transitoria de algodón Gossipium hirsutum L. usando pulverización con suspensión de células de agrobacterias. Para la pulverización, se diluyeron cultivos líquidos de Agrobacterium de DOa00=1,3 en una proporción 1:10 con tampón que contenía MES 5 mM, a pH 5,3; MgCh 10 mM y 0,25 % (v/v) de Silwet L-77. Para el ensayo, se usaron las construcciones pNMD1971 (35S:GUS; 35S:p19), pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 yvirGN54D/GV3101 en la estructura principal del plásmido) y pNMD2190 (35S: GUS; 35s: p19 y virGN54D/ LBA4404 en laestructura principal del plásmido). La prueba de actividad GUS se realizó a los 6 dps.

La Figura 8 muestra una comparación de dos accesos de las cepas Chry5/KYRT1 de Agrobacterium tumefaciens recibidas de diferentes laboratorios utilizando un vector basado en TMV capaz de movimiento de célula a célula (TMV-GFP, vector pNMD560). Las fotografías muestran fluorescencia de GFP a los 4 dpi (días postinfección) bajo luz ultravioleta debido a la expresión de GFP basada en TMV después de la infiltración con jeringa de hojas de Nicotiana benthamiana con cultivos de agrobacterias durante la noche diluidos de DO= 1,3 a 600 nm, como se describe en el Ejemplo 8. La cepa obtenida del laboratorio del Dr. G. Collins de la Universidad de Kentucky (Lexington, EE.UU.) se infiltra en el lado derecho de cada hoja. El acceso del Institute of Cell Biology and Genetics Engineering (ICBGE, Kiev, Ucrania), se infiltra en el lado izquierdo de cada hoja. La composición del tampón para infiltración es MES 5 mM, pH 5,5 y MgSO4 10 mM. Cada infiltración se realizó por triplicado usando tres hojas independientes de la misma planta.

1- acceso ICBGE, factor de concentración 10-1 (dilución por 10);

2- acceso ICBGE, factor de concentration 10-2;

3- acceso ICBGE, factor de concentration 10-1;

4- acceso Kentucky University, factor de concentration 10-1;

5- acceso Kentucky University, factor de concentration 10-2;

6- acceso Kentucky University, factor de concentration 10-3.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención, se usa una clase particular de cepas de Agrobacterium tumefaciens para transfección transitoria de plantas, tales como hojas en una planta. Esta clase de Agrobacterium comprende la cepa CryX de A. tumefaciens. La cepa CryX se depositó en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrape 7B, 38124 Braunschweig, Alemania, el 23 de febrero de 2012 conforme al tratado de Budapest. Se le ha asignado el número de acceso DSM 25686. La cepa CryX tiene una resistencia a la rifampicina integrada en el cromosoma.

La cepa CryX está relacionada con la cepa Chry5 de Agrobacterium derivada de Chrysanthemum morifolium, que han identificado Busch & Puepke en 1991. En su artículo se ha demostrado que la cepa es un biotipo I según las

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pruebas de biotipo tradicionales y que produce tumores en al menos 10 especies de plantas. Se ha caracterizado como inusual debido a su capacidad para formar tumores grandes de manera eficiente en la soja (Glycine max) y por esta razón, varios grupos lo han caracterizado posteriormente en una serie de artículos. Chry5 no puede utilizar octopina ni mannopina como fuente de carbono; en su lugar, es capaz de catabolizar un solo isómero de cada uno de nopalina y succinamopina, al mismo tiempo que es no responde a agrocina 84, (Busch y Puepke, 1991). Además, los tumores inducidos por la cepa Chry5 producen una familia de opinas tipo Amadori que incluye desoxifructosil glutamina (Dfg) y su lactona, crisopina (Chy) (Palanichelvam et al., 2000). Se ha demostrado que los aislados de Chry5 contienen al menos dos plásmidos, uno con una homología con pTiB6. Torisky et al. (1997) han desarmado parcialmente la cepa eliminando un segmento de aproximadamente 16,5 kb del plásmido Ti de 285 kb de Chry5, que incluye aproximadamente 4 kb del ADN-T oncogénico, mediante recombinación homóloga. Se ha demostrado que este mutante de deleción, denominado KYRT1, es un organismo vector eficiente, y, desde entonces, algunos investigadores han usado este derivado de Chry5 parcialmente desarmado. Más recientemente, Palanichelvamet et al. (2000) han desarrollado un derivado totalmente desarmado.

En la investigación que condujo a la presente invención, los inventores han probado inicialmente dos accesos de Chry5/KYRT1 recibidas de diferentes laboratorios. La cepa obtenida del laboratorio del Dr. G. Collins (Torisky et al., 1997) no mostró ninguna superioridad sobre las cepas de comparación estándar EHA105 y GV3101 en los estudios transitorios de los inventores y se excluyó de los estudios posteriores. Por otro lado, se ha descubierto que un acceso del Cell Biology and Genetics Engineering (Kiev, Ucrania) es inusualmente activo en su transfección transitoria y eficacia de expresión y se ha usado en la presente invención. Este último acceso se depositó en virtud del tratado de Budapest en el depósito oficial DSMZ-Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania, con el nombre CryX, para reflejar el hecho de que no existe información clara sobre la procedencia.

Los artículos originales y posteriores han caracterizado la cepa Chry5 con más detalle. Estos estudios tuvieron como objetivo la caracterización estándar de la biología molecular y genética de la cepa, así como su capacidad comparativa para inducir tumores, para causar la transformación genética de diferentes especies de plantas, así como su capacidad para causar expresión transitoria en explantes tratados con Agrobacterium. Los resultados de estos estudios se resumen brevemente a continuación.

Métodos de comparación utilizados para caracterizar Chry5 de Agrobacterium tumefaciens

1. Datos sobre oncogenicidad

En el artículo original de Bush & Puepke (1991), se ha establecido que la cepa Chry5 puede causar tumores en 10 especies de plantas que representan 7 familias de plantas. La prueba involucró una evaluación semicuantitativa del número de plantas con tumores causados por esta cepa frente a la cepa de laboratorio común B6. No hubo diferencias significativas en la tumorigenicidad entre las cepas en 6 de 9 especies (remolacha, kalanchoe, caléndula, girasol, tabaco y tomate). En la berza, Chry5 ha sido aproximadamente dos veces más eficiente y, en soja, aproximadamente tres veces más eficiente, mientras que en el guisante, fue algo menos eficiente que B6. Torisky et al. (1997) proporcionaron datos adicionales sobre la formación de tumores en tallos de tabaco y tomate; en este estudio, la cepa Chry5 y su derivado parcialmente desarmado KYRT1 se han comparado con otras dos cepas de Agrobacterium frecuentemente usadas en estudios de transformación, incluyendo A281, una cepa de tipo succinamopina que contiene el plásmido Bo542 Ti en el fondo cromosómico C58 y su cepa EHA105 derivada desarmada. Se ha demostrado en ese estudio que mientras que Chry5 original y la otra cepa de succinamopina utilizada, A281, son altamente tumorigénicas, el derivado parcialmente incapacitado KYRT1 y EHA105 no estaban activos.

2. Datos sobre la eficiencia de la transformación utilizando cepas parcialmente inactivadas y totalmente inactivadas

Torisky et al. (1997) demostraron que KYRT1 transfiere con éxito el gen de la beta-glucuronidasa (GUS) a explantes de hoja de tabaco, produciendo callo que expresa GUS que podría regenerarse en plantas viables. En estos experimentos, la eficacia de transformación de la cepa KYRT1 fue aproximadamente la misma que la mostrada para EHA105. Grant et al. (2003) descubrieron que la cepa KYRT1 es, en promedio, tres veces más eficiente que aGl 1 para producir plantas transgénicas de guisantes usando para evaluar explantes de cotiledones de tres genotipos diferentes de plantas.

En el trabajo de (Palanichelvam et al. (2000)se ha demostrado que el derivado de KYRT1 únicamente está parcialmente desarmado y contiene todas las regiones de T a la derecha y el fragmento de T a la izquierda. Un derivado de Chry5 con plásmido Ti completamente desarmado, pKPSF2 (Palanichelvam et al., 2000), fue, sin embargo, menos eficiente para la transformación estable de la soja, ya que la cepa KYRT1 conserva algún efecto hormonal en explantes de plantas que potencian la embriogénesis somática en la soja (Ko et al., 2004).

3. Datos que caracterizan la actividad transitoria

De nuevo, Torisky et al. (1997) fueron los primeros en estudiar la expresión transitoria del transgén p-glucuronidasa

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causada por el derivado KYRT1 de Chry5 mediante el uso de un ensayo cuantitativo de la expresión de GUS en explantes de nudos cotiledonares de soja. Estos datos indicaron que el derivado KYRT1 era aproximadamente 2,5 veces más eficiente en causar expresión transitoria en comparación con EHA105 o GV3850. KYRT1 fue, en promedio, 2,8 veces más eficiente que EHA105 y C58C1 para producir la expresión transitoria del gen de la p- glucuronidasa (GUS) (gus) en los peciolos cotiledonares de una planta de leguminosa recalcitrante, lenteja (Lens culinaris M.) (Akcay et al., 2009). Akbulut et al. (2008) midieron la actividad de GUS en explantes derivados de plántulas dañadas después del tratamiento con KYRT1 y otros dos vectores comunes, C58C1 y EHA105. La evaluación cuantitativa de las manchas que expresan GUS ha demostrado que después de 16 horas de imbibición, no hay diferencias estadísticamente significativas entre KYRT1 y C58C1, y después de 40 horas, KYRT1 es mejor en aproximadamente un 50 %, pero solo en uno de los dos puntos de medición.

La interpretación de los datos mencionados anteriormente en su totalidad es difícil porque diferentes autores utilizaron diferentes especies de plantas, diferentes explantes de plantas, diferentes cepas de Agrobacterium para la comparación, y extrajeron sus conclusiones basadas en tres métodos de actividad diferentes: actividad tumorigénica, eficiencia de la transformación genética y eficacia de la expresión transitoria. El proceso de interacción de una célula vegetal y un Agrobacterium es muy complejo e implica la transferencia del complejo ADN-T-proteína, la transferencia de proteínas tales como VirE2 (a través de un sistema de secreción separado), la expresión transitoria de genes ADN-T en una célula vegetal, el efecto hormonal de genes expresados, la integración de algunas moléculas de ADN- T en el ADN cromosómico de una planta, etc. Cualquiera de estos procesos intermedios puede influir en el resultado final; por lo tanto, los datos sobre tumorigenicidad y sobre la eficacia de la transformación no proporcionan información con respecto a la eficacia de la transferencia de ADN-T y la expresión transitoria. Los datos presentados sobre la actividad transitoria son, por otra parte, limitados y las leves diferencias observadas no son concluyentes o no son relevantes en la práctica.

Una diferencia principal en los procesos y cepas descritos en el presente documento y los métodos usados en la técnica anterior descritos anteriormente es la diferente biología del material vegetal utilizado para los estudios de expresión transitoria. Aunque todos los autores anteriores utilizaron explantes de plantas cultivados o extirpados in vitro ricos en tejidos meristemáticos (el objetivo final es la capacidad de transformar una célula vegetal y regenerar una planta completa a partir de dicha célula transgénica), tales como embriones extirpados, partes de plántulas jóvenes, etc., la presente invención se refiere a la transfección transitoria de plantas intactas y desarrolladas que interaccionan con Agrobacterium de forma diferente. En plantas completas, las agrobacterias entran en la hoja a través de los estomas (que están ausentes en otros órganos y tejidos meristemáticos) y no a través de heridas en los explantes de plantas. Como se ha mencionado anteriormente, todos los autores sin excepción usaron altas densidades de bacterias en el tratamiento de los explantes de plantas.

La cepa CryX de la presente invención contiene un plásmido vir que está al menos parcialmente desarmado. "Desarmado" significa que el plásmido vir y su huésped Agrobacterium no es oncogénico, es decir, no inserta oncogenes o genes para la producción de opinas en células vegetales, ya sea porque no contiene tales genes o no puede transferir dichos genes. Un plásmido vir comprende los genes vir (genes de virulencia) necesarios para la transferencia de ADN-T a las células vegetales. Los genes vir y sus funciones en la transferencia de ADN-T son conocidos en la técnica y se resumen, por ejemplo, en el libro de Slater et al., Plant Biotechnology, 2a edición; Oxford University Press, 2008; véase también Hellens et al., Trends in Plant Science 5 (2000) 446-451.

La cepa CryX de la presente invención es una cepa binaria, es decir, los genes vir requeridos para la transferencia de aDN-T en células vegetales y el ADN-T están en plásmidos separados (véase, por ejemplo, el libro de Slater et al., y el artículo de Hellens et al., sobre las cepas de Agrobacterium binarias y los sistemas de vectores). En el contexto de una cepa de Agrobacterium binaria, el plásmido que contiene los genes vir se denomina en el presente documento "plásmido vir" o "plásmido colaborador vir". El plásmido que contiene el ADN-T a transfectar se denomina "vector" o "vector binario". El término "cepa" o "cepa de Agrobacterium" se refiere a los componentes del Agrobacterium que no sea el vector binario. Por tanto, en el presente documento, una cepa de Agrobacterium binaria que no contiene un vector binario y, después de la introducción de un vector binario, se denominan con el mismo nombre de cepa. La cepa depositada CryX contiene un plásmido vir, pero no contiene un vector binario.

La invención también se refiere a cepas derivadas de la cepa CryX. En una opción (i), una cepa derivada de la cepa CryX tiene el fondo cromosómico de la cepa CryX. Puede tener el mismo cromosoma que CryX. En otra opción (ii), una cepa derivada de la cepa CryX contiene el plásmido vir de la cepa CryX. En una opción adicional (iii), una cepa derivada de la cepa CryX contiene un derivado del plásmido vir de la cepa CryX y puede tener el cromosoma de la cepa CryX. En la opción (ii), la cepa es una cepa binaria y se usa en los procedimientos de la invención después de la introducción de un vector binario que contiene un ADN-T de interés. En las opciones (i) y (iii), las cepas pueden ser cepas binarias,. Si son cepas binarias, se usan en los procesos de la invención después de la introducción de un vector binario que contiene un ADN-T de interés. Como alternativa, en las opciones (i) y (iii), el ADN-T que se transferirá a las células vegetales en los procesos de la invención se puede insertar en el plásmido vir, de modo que los genes vir y el ADN-T están presentes en una y la misma molécula de plásmido. Sin embargo, generalmente es más conveniente y, por lo tanto, se prefiere usar cepas binarias.

El término "fondo cromosómico" es un término estándar en la técnica de transformación o transfección de

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Agrobacterium (véase Hellens et al., Trends in Plant Science 5 (2000) 446-451). Se refiere al material genético de dicha cepa de Agrobacterium distinta de los plásmidos Ti, los plásmidos colaboradores vir y los vectores binarios. En una realización, una cepa derivada de la cepa CryX tiene el mismo cromosoma que la cepa CryX. Una cepa derivada que tiene el fondo cromosómico de la cepa CryX puede diferir de CryX, por ejemplo, en el plásmido vir en comparación con el plásmido vir de CryX. Por tanto, una cepa derivada de la cepa CryX puede contener un plásmido vir que es un derivado del plásmido vir de la cepa CryX.

Si una cepa de Agrobacterium dada que tiene un cromosoma que no es idéntico al de la cepa CryX tiene un fondo cromosómico de la cepa CryX puede analizarse experimentalmente comparando la eficacia de transferencia del ADN-T (o la eficacia de la transfección) desde un vector binario de la cepa CryX que contiene ADN-T con la cepa que se va a analizar que contiene el plásmido vir de CryX y el mismo vector binario. La cepa a analizar se considera que tiene el fondo cromosómico de CryX si alcanza al menos el 70 %, preferentemente al menos el 80 % de la eficacia de la transferencia de ADN-T de la cepa CryX. Las eficacias de transfección pueden determinarse como se describe en el Ejemplo 2. Como alternativa, las eficacias de transfección pueden determinarse como en el Ejemplo 2 pero usando un vector binario que codifica un replicón vírico de TMV que no puede moverse de célula a célula, tal como pNMD570. La eficacia de la transferencia del ADN-T también puede determinarse mediante recuento de protoplastos como se describe en el documento WO 2005049839. En una realización, el cromosoma de una cepa de Agrobacterium que tiene el fondo cromosómico de la cepa CryX tiene un cromosoma que es el mismo en la secuencia de bases que el de la cepa CryX.

Un derivado del plásmido vir de la cepa CryX logra, cuando está presente en células de que tienen el mismo cromosoma que la cepa CryX, una eficacia similar de transferencia del ADN-T a células vegetales a partir de un vector binario que contiene ADN-T presente en estas células. Con este fin, el plásmido vir derivado tiene una región vir suficientemente similar a la del plásmido vir de la cepa CryX. El plásmido vir derivado puede codificar la proteína virG de la cepa CryX o una proteína virG estrechamente relacionada. Preferentemente, el plásmido vir derivado contiene el gen virG de la cepa CryX. En una realización, el plásmido vir derivado contiene genes que codifican al menos dos de las siguientes proteínas de virulencia de CryX: VirA, VirG, VirB1/BirB11, VirC1, VirD1, VirD2, VirD4, VirE1, VirE2, VirF y VirJ. En una realización adicional, un plásmido vir derivado contiene al menos los genes que codifican las siguientes proteínas de virulencia de CryX: VirA, VirG, VirD2 y VirE2. En una realización adicional, un plásmido vir derivado contiene la región vir completa, es decir, todos los genes vir del plásmido vir de la cepa CryXi. El plásmido vir derivado puede diferir en la cadena principal del plásmido del plásmido vir de CryX. Por ejemplo, el plásmido vir derivado puede tener un gen marcador selectivo diferente o adicional o puede haber eliminado porciones de ácido nucleico adicionales fuera de la región vir. En una realización, el plásmido vir derivado es pKYRT1 (US 5,929,306), especialmente si la cepa derivada tiene el mismo cromosoma que CryX.

Si un plásmido vir dado es un plásmido vir derivado en el sentido descrito anteriormente puede analizarse experimentalmente comparando la eficacia de la transferencia del ADN-T desde un vector binario que contiene ADN- T entre Agrobacterium de la cepa CryX y Agrobacterium que Tiene el cromosoma de la cepa CryX pero el plásmido vir que se va a analizar en condiciones por lo demás idénticas. El Agrobacterium que contiene un plásmido derivado puede alcanzar al menos 70 %, preferentemente de al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 % de la eficacia de transferencia de ADN-T de la cepa CryX. Las eficicacias de transfección se pueden determinar como se describe en el Ejemplo 2 y como se ha mencionado anteriormente.

"Proteína virG estrechamente relacionada" a la proteína virG de CryX significa una proteína virG que difiere de la proteína virG de CryX en, como máximo, 3 sustituciones de aminoácidos no conservadoras o en un máximo de 6, preferentemente, como máximo 3 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras pueden estar en las posiciones correspondientes a las posiciones 6, 7 o 106 de la secuencia de aminoácidos de sEq ID NO: 1 que es la proteína VirG de la cepa LBA4404 de Agrobacterium, siendo todos los demás restos de aMINOÁCIDOSs como en la SEQ ID NO:1. Además, la proteína VirG estrechamente relacionada puede tener una sustitución de asparagina por aspatato en la posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden estar en las posiciones 6, 7 y/o 106 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

En el presente documento, las sustituciones conservadoras son sustituciones de restos de aminoácidos dentro de cada uno de los cuatro grupos siguientes:

- Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr

- Val, Ile, Leu, Met

- Lys, Arg, His

- Phe, Tyr, Trp

Todas las demás sustituciones de restos de aminoácidos se consideran no conservadoras.

En el presente documento, un "ADN-T de interés" es un ADN que contiene, entre las secuencias límite de la izquierda y de la derecha de ADN-T, una secuencia de ADN de interés. Un ADN-T de interés puede estar presente o puede haberse incorporado por subclonación en un plásmido vir, tal como el plásmido vir de la cepa CryX. En los

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procesos de la invención, se prefiere usar un sistema de vector binario. Por lo tanto, un ADN-T de interés está presente, preferentemente, o se habrá incorporado en un vector binario.

El vector binario que se usará en la presente invención es una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN de interés para su transfección en células vegetales. La secuencia de ADN de interés típicamente codifica una proteína o un ARN para expresarse en células de las plantas transfectadas. El vector binario generalmente se produce insertando o clonando una construcción de ácido nucleico que contiene la secuencia de ADN de interés en un sitio de clonación dentro del ADN-T de un vector binario precursor, como generalmente se realiza en la transfección de plantas mediada por Agrobacterium. Después de dicha inserción, la construcción de ácido nucleico está flanqueada por secuencias del límite izquierda y derechao del T-aDN para permitir la transfección de dicha planta con dicho ADN-T. En el ADN-T del vector binario, la secuencia de ADN de interés está presente de forma tal que puede expresarse en células vegetales. Con este fin, la secuencia de ADN de interés está, por ejemplo, en dicha construcción de ácido nucleico, típicamente bajo el control de un promotor activo en células vegetales. Los ejemplos de la secuencia de ADN de interés son una secuencia de ADN que codifica un replicón vírico de ADN o un replicón vírico de ARN o un gen que se va a expresar. El gen puede codificar un ARN de interés o una proteína de interés para expresarse en células de la o las plantas. Además, los replicones víricos codifican típicamente un ARN o una proteína de interés para expresarse en las plantas. La construcción de ADN puede comprender, además de la secuencia de ADN de interés, otras secuencias tales como secuencias reguladoras para la expresión de la secuencia de ADN de interés. Los vectores binarios utilizables en la invención son conocidos por los expertos, por ejemplo, a partir de las referencias citadas en la introducción o de los libros de texto sobre biotecnología vegetal, tales como Slater, Scott y Fowler, Plant Biotechnology, segunda edición, Oxford University Press, 2008. El vector binario típicamente tiene un gen de resistencia a antibióticos para permitir la selección en bacterias tales como E. co/i.

Para aumentar la eficacia de la transfección, el vector binario puede comprender, fuera del ADN-T, un gen virG que se puede expresar en dicha cepa de Agrobacterium. Como alternativa, se puede insertar un plásmido adicional en dicha cepa de Agrobacterium, por lo que dicho plásmido adicional contiene un gen virG que se puede expresar en dicha cepa de Agrobacterium (Pazour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 6941-6945). El gen virG, codifica, preferentemente, una proteína VirG de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens o una proteína VirG estrechamente relacionada. Además, la proteína VirG puede tener la mutación N54D en la posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO: 1, es decir, la proteína VirG de la cepa LBA4404 de A. tumefaciens. La mutación N54D en una proteína VirG de otra cepa de Agroabacterium la describió Jung et al., Current Microbiology 49 (2004) 334-340.

La proteína VirG estrechamente relacionada puede ser

(i) una proteína que comprende al menos 235, preferentemente al menos 239 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o de la secuencia de aminoácidos del mutante N54D de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; o

(ii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene no más de 3 sustituciones de aminoácidos no conservadoras y no más de 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o el mutante N54D de la misma; o

(iii) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene no más de 20, preferentemente no más de 10, sustituciones conservadoras de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o el mutante N54D de la misma.

En los puntos (ii) y (iii), dicha proteína tiene, preferentemente, un resto de asparagina o aspartato en la posición correspondiente a la posición 54 de la SEQ ID NO: 1

Posibles posiciones para las sustituciones conservadoras de aminoácidos en las realizaciones mencionadas anteriormente son las posiciones 6, 7, 18, 35, 38, 42, 44, 66, 69, 73, 81, 86, 89, 97, 106, 107, 122, 124, 133, 135, 143, 147, 150, 165, 188, 208, 212, 213, 232, 235 y 238 de la SEQ ID NO: 1, mientras que los restos de aminoácidos en otras posiciones son aquellos como en la SEQ ID NO: 1. Posibles posiciones para las sustituciones no conservadoras son las posiciones 6, 7 y 106 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

En realizaciones donde se desea una fuerte expresión de una proteína o ARN o donde la acumulación de ácidos nucleicos víricos en cantidades altas en las células de dicha planta y los posibles efectos negativos sobre la salud de la planta no son motivo de preocupación, la construcción de ácido nucleico o la secuencia de ADN de interés puede codificar un vector vírico replicante que puede replicarse en las células vegetales. Para poder replicarse, el vector vírico contiene un origen de replicación que puede ser reconocido por una polimerasa de ácido nucleico presente en las células vegetales, tal como por la polimerasa vírica expresada a partir del replicón. En el caso de los vectores víricos de ARN, los replicones víricos se pueden formar por transcripción, bajo el control de un promotor vegetal, a partir de la construcción de ADN después de que este último se haya introducido en núcleos de células vegetales. En el caso de los replicones víricos de ADN, los replicones víricos pueden formarse mediante recombinación entre dos sitios de recombinación que flanquean la secuencia que codifica el replicón vírico en la construcción de ADN, por ejemplo, com se describe en los documentos WO00/17365 y WO 99/22003. Si los replicones víricos están

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codificados por la construcción de ADN, se prefieren los replicones víricos de ARN. El uso de replicones víricos de ADN y ARN se ha descrito extensamente en la literatura al menos durante los últimos 15 años. Algunos ejemplos son las siguientes publicaciones de patentes de Icon Genetics: WO2008028661, WO2007137788, WO 2006003018, WO2005071090, WO2005049839, WO02097080, WO02088369 y WO02068664. Un ejemplo de vectores víricos de ADN son los basados en geminivirus. Para la presente invención, se prefieren vectores o replicones víricos basados en virus de ARN vegetal, en particular se prefieren los basados en virus de ARN monocatenario con sentido positivo. Ejemplos de tales vectores víricos son el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el potexvirus X (PVX) utilizados en los ejemplos. Los vectores víricos y sistemas de expresión basados en Potexvirus se describen en el documento EP2061890. Se describen muchos otros replicones víricos vgetales en las publicaciones de patentes mencionadas anteriormente.

Al realizar el proceso de la invención, el vector binario que contiene en el ADN-T la secuencia de ADN de interés puede introducirse en la cepa de Agrobacterium que contiene el plásmido vir o su derivado por métodos convencionales, tales como electroporación. A continuación, se cultiva un cultivo de la cepa que contiene el vector binario en medios adecuados, típicamente en presencia de un agente selectivo para seleccionar células de Agrobacterium que contienen el vector binario, y, opcionalmente, se subcultivada para producir la cantidad deseada de una suspensión acuosa que comprende las células de Agrobacterium. La suspensión obtenida se puede diluir a la concentración deseada con agua, un tampón o medios adecuados y usarse para transfectar una planta u hojas de la planta. Como alternativa, si el ADN-T es parte del plásmido vir, el plásmido vir que contiene ADN-T se introduce en Agrobacterium por métodos convencionales, tales como electroporación, y se trata adicionalmente como se describe para el sistema binario.

En los procesos de la invención, se usa transfección in planta. In planta significa que los procesos se llevan a cabo en plantas vivas completas después de la etapa de plántula, preferentemente en plantas completamente desarrolladas, en lugar de en plantas extirpadas o tejidos u órganos vegetales cultivados in vitro. Preferentemente, el proceso se aplica a muchas plantas en paralelo, tales como plantas que crecen en un campo.

Dichas plantas pueden ponerse en contacto con la suspensión de células de Agrobacterium por infiltración con o sin aplicación de vacío. En una realización, especialmente cuando se aplica a múltiples plantas en paralelo, las plantas pueden ponerse en contacto con la suspensión mediante pulverización. La suspensión acuosa utilizada en los procedimientos de la invención puede tener una concentración de células de Agrobacterium de, como máximo, 1,1.109 ufc/ml, que corresponde aproximadamente a un cultivo de Agrobacterium en medio LB de densidad óptica a 600 nm de 1. Debido a la alta eficacia de transfección conseguida en la invención, pueden usarse concentraciones mucho más bajas, lo que permite el tratamiento de muchas plantas, tales como campos de cultivo enteros sin la necesidad de grandes fermentadores para la producción de Agrobacterium. Por tanto, la concentración es, preferentemente, como máximo 2,2 107 ufc/ml, más preferentemente, como máximo, 1,1-107 ufc/ml, más

preferentemente, como máximo, 4,4106 ufc/ml. En una realización, la concentración es, como máximo, 1,1 106 ufc/ml de la suspensión. En una realización adicional, la concentración es, como máximo, 4,4 105 ufc/ml de la suspensión y, en una realización adicional, la concentración es, como máximo, 1,1.105 ufc/ml de la suspensión

Para evitar la determinación de las concentraciones celular en términos de ufc/ml, las concentraciones de las suspensiones de agrobacterias se evalúan frecuentemente midiendo la densidad óptica aparente a 600 nm usando un espectrofotómetro. En el presente documento, la concentración de 1,1 107 ufc/ml corresponde a una densidad óptica calculada a 600 nm de 0,01, por lo que la densidad óptica calculada se define mediante una dilución de 100 veces con agua o tampón de una suspensión que tiene una densidad óptica de 1,0 a 600 nm. De manera similar, las concentraciones de 4,4106 ufc/ml, 1,1106 ufc/ml, 4,4105 ufc/ml y 1,1105 ufc/ml de la suspensión corresponden a una densidad óptica calculada a 600 nm de 0,004, 0,001, 0,0004 y 0,0001 respectivamente, por lo que las densidades ópticas calculadas se definen por una dilución de 250 veces, 1000 veces, 2500 veces o 10000 veces, respectivamente, con agua o tampón de una suspensión que tiene una densidad óptica de 1,0 a 600 nm.

Por tanto, en una realización particularmente preferente, tla invención proporciona un proceso y una suspensión celular de Agrobacterium para el mismo, de expresión transitoria de una secuencia de ADN de interés en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta o dichas hojas sonbre dicha planta con una suspensión que comprende células de Agrobacterium de la cepa CryX, donde dicha suspensión tiene cualquiera de las concentraciones celulares máximas de Agrobacterium mencionadas en uno cualquiera de los dos párrafos anteriores. En esta realización, la cepa de Agrobacterium es, preferentemente, una cepa binaria que contiene un vector binario comprende una gen virG que se puede expresar en dicha cepa CryX. Dicho gen virG puede codificar una proteína VirG de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens de la SEQ ID NO: 1 o es un mutante N54D de la proteína VirG codificada por el gen virG de la cepa LBA4404 de A. tumefaciens.

Es posible incluir un abrasivo en la suspensión para aumentar la eficacia de la transfección. El abrasivo es un material particulado que es esencialmente insoluble en la suspensión acuosa de las células de Agrobacterium. Se cree que el abrasivo se debilita, especialmente si se usa junto con un agente humectante, la superficie del tejido vegetal, tales como las hojas, y, de ese modo, facilita la penetración de las células en de Agrobacterium en el espacio intercelular del tejido vegetal. Con respecto a la posible utilización de abrasivo en la presente invención, los tamaños de partícula de los mismos, las concentraciones y los posibles productos comerciales, se hace referencia a

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la solicitud de patente internacional publicada como WO 2012/019669 y la divulgación con respecto a los abrasivos de esta publicación se incorpora en el presente documento.

La suspensión acuosa de la invención puede contener un adyuvante de pulverización agrícola. El adyuvante de pulverización puede ser un agente tensioactivo o humectante. El agente tensioactivo y humectante tienen múltiples ventajas en la presente invención. Reduce la tensión superficial del agua de la suspensión acuosa y hace que la superficie cerosa de las hojas de las plantas sea más permeable para las agrobacterias. Adicionalmente, mejora la estabilidad de la suspensión y reduce la sedimentación del abrasivo en la suspensión. Los tensioactivos utilizables en los procesos de la presente invención no están particularmente limitados y se desvelan en la solicitud de patente internacional publicada como WO 2012/019669. Los tensioactivos preferidos son tensioactivos no iónicos de un valor de HLB de 12 o más, preferentemente de al menos 13. Como tensioactivos no iniónicos, los tensioactivos de organo- silicona, tales como heptametiltrisiloxano modificado con poli(óxido de alquileno) son los más preferidos en la presente invención. Un producto comercial es el adyuvante de pulverización Silwet L77™ de GE Advanced Materials.

Tensioactivos tales como los desvelados en el documento WO 2012/019669 se pueden usar solo o en combinación de dos o más tensioactivos. De forma notable, los tensioactivos de organo-silicona preferidos se pueden combinar con otros tensioactivos. La concentración total de tensioactivos en la suspensión acuosa de la invención puede analizarse fácilmente llevando a cabo experimentos de pulverización comparativos, de forma similar a como se hace en los ejemplos. Sin embargo, en general, la concentración total de tensioactivos puede estar entre 0,005 y 2 % en volumen, preferentemente entre 0,01 y 0,5 % en volumen, más preferentemente entre 0,025 y 0,2 % en volumen de dicha suspensión. Dado que la densidad de los tensioactivos es generalmente cercana a 1,0 g/ml, la concentración total de tensioactivos se puede definir entre 0,05 y 20 g por litro de dicha suspensión, preferentemente entre 0,1 y 5,0 g, más preferentemente entre 0,25 y 2,0 g por litro de dicha suspensión (incluido el abrasivo). Si se usan los tensioactivos de organo-silicona anteriores, tales como heptametiltrisiloxano modificado con polialquilenóxido, la concentración del tensioactivo de organo-silicona en la suspensión de agrobacterias utilizada para pulverización puede estar entre 0,01 y 0,5 % en volumen, preferentemente entre 0,05 y 0,2 % en volumen. Como alternativa, la concentración del tensioactivo de organo-silicona en la suspensión de agrobacterias utilizada para pulverización se puede definir como que está entre 0,1 y 5,0 g, preferentemente entre 0,5 y 2,0 g por litro de dicha suspensión.

Con el fin de mejorar las propiedades físicas de la suspensión acuosa, es posible añadir ácido silícico (sílice) de tamaño submicrométrico altamente disperso o polímeros porosos, tales como condensado de urea/formaldehído (Pergopak™). De forma notable, cuando la mediana del tamaño de partícula del abrasivo está entre 0,1 y 30 pm, o en uno de los subintervalos preferidos de este intervalo dados anteriormente, es posible añadir a la suspensión un sílice de tamaño submicrométrico altamente disperso. En el presente documento, la sílice de tamaño submicrométrico que tiene una mediana del tamaño de partícula entre 0,01 y 0,5 pm, preferentemente entre 0,02 y 0,5 pm, más preferentemente entre 0,02 y 0,1 pm. El ácido silícico altamente disperso, tal como Hi-Sil ™ 233 (PPG Industries) puede contribuir a las propiedades abrasivas de la suspensión acuosa (véase Jensen et al., Bull. Org. mond. Sante, Bull. Wld Hlth Org. 41 (1969) 937-940). Estos agentes se pueden incorporar en una cantidad de 1 a 10 g por litro de la suspensión de la invención.

Otros posibles aditivos para la suspensión de agrobacterias son sustancias tampón para mantener el pH de la suspensión utilizada para la pulverización a un pH deseado, típicamente entre 4,5 y 6,5, preferentemente entre 5,0 y 5,5. Además, pueden añadirse sales solubles inorgánicas, tales como cloruro de sodio, para ajustar la fuerza iónica de la suspensión. El caldo nutriente, tal como el medio LB, también puede estar contenido en la suspensión.

La suspensión acuosa para poner en contacto con las plantas se puede producir de la siguiente manera. En un método, la cepa o células de Agrobacterium que contienen el vector binario deseado para usar en el proceso de la invención se inoculan en un medio de cultivo y se cultivan a una alta concentración de células. Se pueden inocular cultivos más granes con pequeños volúmenes de un medio de cultivo altamente concentrado para obtener grandes cantidades del medio de cultivo. Las agrobacterias generalmente crecen hasta una concentración celular correspondiente a una DO a 600 nm de al menos 1, típicamente de aproximadamente 1,5. Tales suspensiones de agrobacterias altamente concentradas se diluyen a continuación para alcanzar la concentración celular deseada. Para diluir las suspensiones de agrobacterias altamente concentradas se usa agua. El agua puede contener un tampón. El agua puede contener adicionalmente el tensioactivo de la invención. Como alternativa, las suspensiones de agrobacterias concentradas se pueden diluir con agua y cualquier aditivo, tal como el tensioactivo y las sustancias tampón opcionales, se añaden después o durante el proceso de dilución. El abrasivo puede añadirse antes, durante o después de la dilución. Sin embargo, se prefiere agitar la suspensión durante la adición del abrasivo para dispersar uniformemente el abrasivo en la suspensión de agrobacterias. La etapa de dilución de la suspensión de agrobacterias concentrada se puede llevar a cabo en el tanque de pulverización del pulverizador utilizado para pulverizar las suspensiones diluidas.

Dichas plantas, en particular las hojas de dicha planta, se ponen en contacto con la suspensión de las células de Agrobacterium para efectuar la transfección transitoria de las células de la planta. Como se ha explicado anteriormente, el contacto se puede realizar mediante pulverización. El pulverizador que se utilizará en el proceso de la invención depende principalmente del número de plantas o del área a pulverizar. Para pulverizar una o una

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pequeña cantidad de plantas, se pueden usar pulverizadores de bomba como los que se usan ampliamente en el hogar y en jardinería. Estos pueden tener volúmenes del tanque de pulverización de entre 0,5 y 2 litros. Para aplicaciones en una escala media, pueden usarse pulverizadores hidráulicos accionados manualmente, tales como pulverizadores de mochila accionados por palanca o pulverizadores de compresión accionados manualmente. Sin embargo, la alta eficacia de transfección lograda en la invención tiene todo su potencial en la transfección de muchas plantas, tales como las plantas que crecen en un campo agrícola o en un invernadero. Con este fin, se pueden usar pulverizadores hidráulicos accionados por motor, tales como pulverizadores hidráulicos montados en tractor equipados con brazos de pulverización. Las técnicas de aplicación aérea que utilizan helicópteros o aviones también son posibles para grandes campos. Todos estos tipos de pulverizadores son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el libro "Pesticide Application Methods" de G.A. Matthews, tercera edición, Blackwell Science, 2000. Para garantizar una suspensión homogénea en los tanques de pulverización de los pulverizadores, los pulverizadores de tamaño pequeño o mediao pueden agitarse a intervalos regulares o continuamente durante la pulverización. Los pulverizadores grandes, como los pulverizadores montados en el tractor, deben estar equipados con un agitador en el tanque de pulverización.

Teniendo en cuenta la presencia de células de agrobacterias y de abrasivo en las suspensiones a pulverizar, los pulverizadores utilizados en la invención deberían producir una pulverización con un tamaño de gota de al menos de pulverización fina. Asimismo, se pueden usar pulverización media o pulverización gruesa en la clasificación de pulverizaciones utilizada en "Pesticide Application Methods" de G.A. Matthews, tercera edición, Blackwell Science, 2000, página 74. El objetivo principal de la pulverización en la invención es humedecer el tejido vegetal con la suspensión. Por tanto, el tamaño exacto de la gota no es crítico. Sin embargo, la eficacia de la transfección puede mejorarse aún más proporcionando la pulverización a las superficies de la planta con una presión incrementada.

En el proceso de la invención, se pulverización al menos partes de las plantas. En una realización importante, se pulverizan plantas que crecen en el suelo en un campo, es decir, plantas que no crecen en macetas o recipientes móviles. No se puede dar la vuelta a tales plantas y sumergirlas en suspensión agrobacteriana para la infiltración al vacío. Se pulverización al menos partes de las plantas, tales como las hojas. Preferentemente, la mayoría de las hojas se pulverizan o plantas completas.

La presente invención se usa para la transfección transitoria de plantas o para transitoria con una secuencia de ADN de interés que luego puede expresarse transitoriamente. El término "transitorio" significa que se usan los métodos de no selección para seleccionar células o plantas transfectadas con la secuencia de ADN de interés en el fondo de células o plantas no transfectadas usando, por ejemplo, agentes seleccionables y genes marcadores seleccionables capaces de destoxificar los agentes seleccionables. Como resultado, la secuencia de ADN de interés transfectada generalmente no se introduce establemente en el ADN cromosómico de la planta. En cambio, los métodos transitorios hacen uso del efecto de la transfección en las mismas plantas transfectadas.

La invención se usa generalmente para transfectar plantas multicelulares, en particular, plantas superiores. Se pueden transfectar plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, aunque se prefieren las plantas dicotiledóneas. Las plantas para su uso en la presente invención incluyen cualquier especie de planta, dando preferencia a las especies de cultivo importantes desde el punto de vista agronómico y hortícola. Las plantas de cultivo comunes para el uso en la presente invención incluyen alfalfa, cebada, judías, canola, carillas, algodón, maíz, trébol, loto, lentejas, altramuz, mijo, avena, guisantes, cacahuetes, arroz, centeno, trébol dulce, girasol, arvejilla, soja, triticale sorgo, boniatos, granos de terciopelo, algarroba, trigo, glicinia y frutos secos. Las especies de plantas preferidas para practicar la presente invención incluyen, pero sin limitaciones, representantes de Gramineae, Compositeae, Solanaceae y Rosaceae.

Otras especies preferidas para su uso en la presente invención son plantas de los siguientes géneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea y los de Olyreae, Pharoideae y otros.

Preferentemente, los procesos de la invención se aplican a plantas de dicotiledóneas, tales como Nicotiana benthamiana, tabaco, algodón, soja, colza, pimiento, patata o tomate.

En una realización, el proceso de la invención se puede usar para producir una proteína de interés en una planta o en muchas plantas que crecen en un campo. Con este fin, las plantas pueden pulverizarse con la suspensión que comprende las células de Agrobacterium que contienen el vector binario deseado en un estado de crecimiento deseado de las plantas. Si el objetivo principal es lograr los niveles de expresión más altos posibles, seguido de la recolección de plantas para obtener material vegetal que contiene altas cantidades de la proteína, se pueden usar vectores víricos, ya que generalmente dan los niveles de expresión más altos.

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En otra realización, el proceso de la invención se usa para generar o alterar un rasgo en una planta, tal como un rasgo introducido. En esta realización, la expresión excesiva de una proteína o ARN de interés puede no ser deseada para evitar efectos perjudiciales sobre la salud de las plantas. Para dichas realizaciones, se prefieren vectores no replicantes (también denominados en el presente documento “vectores de expresión”), es decir, vectores que carecen de un origen de replicación funcional reconocido por una polimerasa de ácido nucleico presente en las células vegetales. Otra aplicación de la invención es la expresión de ARN, por ejemplo, ARN de interferencia, donde la señal de interferencia puede propagarse en la planta desde las células que han expresado la señal a otras células. Un ejemplo es el direccionamiento de ADN vírico no deseado en plantas según lo descrito por Pooggin en Nat. 21 (2003) 131. Un ejemplo de silenciamiento oncogénico que se puede adaptar a un sistema transitorio se describe en Escobar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 13437-13442. Un ejemplo adicional es el control de plagas de insectos coleópteros a través del ARN de interferencia similar al descrito por Baum et al., Nat. Biotech. 25 (2007) 1322-1326 que se puede adaptar al proceso transitorio de la invención transfectando transitoriamente plantas infestadas de plagas con una secuencia de ADN de interés que codifica el ARNds de forma que pueda expresarse. Otros métodos aplicables al proceso transitorio de la invención son los descritos por Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 14302-14306; Chuang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 4985-4990.

Además, el procedimiento de la invención permite alterar en un momento deseado los rasgos relacionados con la regulación del tiempo de floración o la formación del fruto, tal como la tuberización en la patata (Martinez-Garcia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 15211-15216) o la regulación de la vía de flavonoides usando un factor de transcripción (Deluc y col., Plant Physiol. 147 (2008) 2041-2053). La floración puede inducirse mediante la expresión transitoria de la proteína de florigen móvil FT (Zeevaart, Current Opinion in Plant Biology 11 (2008) 541-547; Corbesier et al., Science 316 (2007) 1030-1033). Las frutas partenocárpicas en los tomates pueden producirse a gran escala utilizando la invención y el método descrito por Pandolfini et al., BMC Biotechnology 2 (2002). Otras aplicaciones de la invención están en el contexto de alteración del desarrollo de la fibra de algodón por medio de factores de transcripción MYB como se describe en Lee et al., Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401 o activación de genes defensivos de plantas (Bergey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 12053-12058.

La invención también proporciona un proceso para proteger las plantas de cultivo en un campo de una plaga. En dicho proceso, puede determinarse la infestación de al menos una de las plantas de una pluralidad de plantas que crecen en un lote o campo agrícola. Debido a la rapidez del proceso de la invención, la expresión de una proteína o ARN perjudicial para la plaga debe producirse solo si se determina la infestación por la plaga. Por tanto, no es necesaria la expresión fuerte y constitutiva de toxinas de plagas o ARNds para aRní incluso en ausencia de un riesgo de infestación. La expresión transitoria de endotoxinas de Bacillus thuringiensis después de la pulverización con cultivos agrobacterianos diluidos que albergan vectores de expresión basados en PVX correspondientes protegió a plantas de Nicotiana benthamiana frente al daño por alimentación producidor por las larvas del gusano del tabaco Manduca sexta (véase la Fig. 30 del documento WO 2012/019660).

Ejemplos

Ejemplo de referencia 1: Determinación de la concentración celular de Agrobacterium en cultivo líquido en términos de unidades formadoras de colonias (ufc)

La concentración de células de Agrobacterium en suspensión líquida en términos de unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml) de suspensiones líquidas se puede determinar usando el siguiente protocolo. Se cultivaron células de la cepa ICF 320 de Agrobacterium tumefaciens transformada con la construcción pNMD620 en 7,5 ml de medio LBS líquido que contenía 25 mg/l de kanamicina (AppliChem, A1493) y 50 mg/l de rifampicina (Carl Roth, 4163.2). El cultivo bacteriano se incubó a 28 °C con agitación continua. La absorbancia o densidad óptica del cultivo bacteriano expresada en unidades de absorbancia (UA) se controló en alícuotas de 1 ml del cultivo usando un espectrofotómetro a 600 nm de longitud de onda (DO600). La concentración celular estimada como número de unidades formadoras de colonias por mililitro de cultivo líquido (ufc/ml) puede analizarse a valores de DO600 1; 1,3; 1,5; 1,7 y 1,8. Para este fin, se diluyeron alícuotas de 250 pl de cultivo líquido con medio LBS para alcanzar un volumen final de 25 ml (dilución 1:100). Se mezclaron 2,5 ml de dicha dilución 1:100 con 22,5 ml de LBS para lograr la dilución 1:1.000. Las diluciones de cultivo líquido 1:100; 1/1.000; 1:10.000; 1/100.000; 1/1.000.000; 1:10.000.000 y 1:100.000.000 se prepararon de forma similar. Se extendieron alícuotas de las últimas tres diluciones en medio LBS solidificado en agar suplementado con 25 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de rifampicina (250 pl de cultivo bacteriano por placa de 90 mm de diámetro). La siembra de alícuotas para cada dilución se realizó por triplicado. Después de una incubación de 2 días a 28 °C, se contaron las colonias bacterianas para cada placa. La siembra de las diluciones 1:1.000.000 y 1:10.000.000 dio como resultado unas pocas docenas y pocas colonias por placa, respectivamente. En la medida en que la dilución 1:100.000.000 proporcionó únicamente unas pocas colonias por placa, esta dilución no se usó para el cálculo de la concentración celular. La concentración celular se estimó de acuerdo con la fórmula: ufc/ml = 4 x número de colonias por placa x factor de dilución.

Para transformar las concentraciones celulares medidas por medidas de absorbancia a 600 nm (en medio LB) y en términos de unidades formadoras de células, se utiliza la siguiente relación: una DO600 de 1,0 corresponde a 1,1x109 ufc/ml.

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Medio LBS (líquido)

1 % de peptona de soja (hidrolizado papaico de harina de soja; Duchefa, S1330)

0,5 % de extracto de levadura (Duchefa, Y1333)

1 % de cloruro de sodio (Carl Roth, 9265.2)

se disolvió en agua y se ajustó a pH 7,5 con NaOH 1M (Carl Roth, 6771.2)

Para preparar el medio LBS sólido, el medio LBS líquido se suplemento con agar al 1,5 % (Carl Roth, 2266.2). Los medios se autoclavaron a 121 °C durante 20 minutos.

Ejemplo 1: Vectores usados en los siguientes ejemplos

En este estudio se utilizaron los vectores víricos basados en TMV y PVX, así como vectores transcripcionales estándar basados en el promotor 35S del CaMV.

Los vectores basado en TMV con capacidad de movimiento de célula a célula pNMD560, pNMD062, pNMD063 y pNMD064 (Figura 1A) se crearon en base a los vectores descritos en Marillonnet et al. (2006). Todos estos vectores están diseñados para la expresión de GFP como un gen indicador; contienen la inserción de una secuencia de codificación de sGFP que es proteína verde fluorescente modificada (GFP) de medusas Aequorea victoria (Número de acceso de GeneBank EF030489). La construcción pNMD560 contiene, en orden secuencial, un fragmento del promotor de actina 2 de Arabidopsis (ACT2) (n.° de acceso en GenBank AB026654); el extremo 5' del TVCV (n.° de acceso en GenBank BRU03387, pares de bases 1-5455) y un fragmento de cr-TMV [n.° de acceso en GenBank Z29370, pares de bases 5457-5677, conteniendo todos juntos 16 inserciones de intrón]; una secuencia de codificación de sGFP; la región no traducida en 3' de cr-TMv (3' NTR; n.° de acceso en GenBank Z29370), y el terminador de la nopalina sintasa (Nos). El fragmento completo se clonó entre los límites izquierdo y derecho de ADN-T del vector binario.

El plásmido pNMD062 se creó sobre la base de la construcción pNMD560. Con este fin, un fragmento de ADN que comprende la secuencia de codificación y una región genómica 5' aguas arriba de un gen virG del plásmido Ti de tipo octopina de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Número de acceso de GenBank AF242881.1, pares de bases 160603-161600) flanqueado por la secuencia ctgtcgatc del extremo 5' y la secuencia aagatcgacag (SEQ ID NO: 8) del extremo 3' se amplificó mediante PCR y se insertó en la estructura del plásmido usando el sitio de restricción Afel.

La construcción pNMD063 era idéntica a pNMD062 excepto por la mutación N54D.

Para crear la construcción pNMD064, un fragmento de ADN que comprende la secuencia de codificación que contiene la mutación N54D y la región genómica en 5' aguas arriba del gen virG del plásmido Ti de tipo nopalina de la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens (Número de acceso de GenBank AE007871.2, pares de bases 194307-193333) se amplificó por PCR y se insertó en la cadena principal del plásmido de la construcción pNMD560 utilizando el sitio de restricción Afel.

La construcción pNMD570 (vectores basados en TMV que carecen de capacidad de movimiento célula a célula) era idéntica a pNMD560 excepto por una mutación puntual en la secuencia de codificación de MP que conduce a un cambio de marco de lectura abierto que distorsiona la traducción de MP (figura 1A).

La construcción pNMD620, un vector basado en PVX sin capacidades de movimiento de célula a célula y sistémico para la expresión de GFP, contenía, en orden secuencial, un promotor 35S del CaMV, secuencias de codificación de la ARN polimerasa dependiente de ARN, módulos de bloque de genes triples que comprenden proteínas de 25 kDa, 12 kDa y 8 kDa, una secuencia de codificación de sGFP y una región no traducida en 3'. El fragmento completo se clonó entre los límites izquierdo y derecho de ADN-TA del vector binario (Fig. 1B).

Todos los vectores transcripcionales se crearon sobre la base de plCBV10, un vector binario derivado de pBIN19 (Marillonnet et al., 2004, 2006). Contenían dos casetes de expresión insertados dentro de los límites derecho e izquierdo de la misma región de ADN-T (figura 1B). En el caso de la construcción pNMD1971, un casete de expresión adyacente al limite derecho comprendía, en orden secuencial, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CAMV), potenciador omega de la traducción del virus del mosaico del tabaco, la secuencia de codificación de beta-glucuronidasa de Escherichia coli (Número de acceso de GenBank S69414) que contiene el intrón del g PSK7 de Petunia hybrids (número de acceso de GenBank AJ224165.1, pares de bases 4411-4484), y el terminador del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. El segundo casete de expresión se insertó entre el primero y el límite izquierdo del ADN-T. Contenía, en orden secuencial, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CAMV), potenciador omega de la traducción del virus del mosaico del tabaco, la secuencia de codificación del supresor P19 de la silenciación del virus del enanismo ramificado del tomate (TBSV) (número de acceso del GenBank CAB56483.1) y terminador del gen octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.

La construcción pNMD2180 se creó sobre la base del vector pNMD1971. Con este fin, el fragmento Notl/Ndel de la

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construcción pNMD1971 fue reemplazado por el mismo fragmento de la construcción pNMD064 que contenía el gen virGN54D del plásmido Ti de tipo nopalina de la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens flanqueado por la región genómica 5'-aguas arriba.

El pNMD2190 se creó de una manera similar. el fragmento Notl/Ndel de la construcción pNMD1971 fue reemplazado por el mismo fragmento del vector pNMD063 que contenía el gen virGN54D del plásmido Ti de tipo nopalina de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens flanqueado por la región genómica 5'-aguas arriba.

Ejemplo 2: La cepa CryX muestra transfección transitoria más fuerte de Nicotiana benthamiana si se compara con las cepas de uso habitual de Agrobacterium tumefaciens

Los inventores analizaron la cantidad de cepas de Agrobacterium tumefaciens que incluyen AGL1, EHA105, GV3101, ICF320, CryX, LBA4404 y LBA9402 para la transfección transitoria de plantas de Nicotiana benthamiana. Para este propósito, se infiltraron hojas de la planta usando una jeringa sin aguja con 10"3 y 10"4 diluciones de DO600= 1,3 de cultivos de agrobacterias de las siete cepas mencionadas anteriormente que albergan un vector basado en TMV de expresión de GFP capaz de movimiento de célula a célula (TMV-GFP, construcción pNMD560) como se muestra en la figura 2A. En paralelo, las hojas se infiltraron con diluciones 10"2 y 10"3 de los cultivos agrobacterianos durante la noche de las mismas cepas potadoras del vector basado en TMV que carece de la capacidad de movimiento de célula a célula (TMV (fsMP) -GFP, construcción pNMD570) como se muestra en la Figura 2B.

En base a la densidad de puntos fluorescentes y la intensidad de la fluorescencia de GFP, se demostró la transfección transitoria eficiente para varias cepas (por ejemplo, AGL1, EHA105 y LBA9402), sin embargo, la eficacia de la transfección transitoria de la cepa CryX fue significativamente mayor para ambas construcciones con todas las diluciones analizadas de cultivos agrobacterianos si se compara con cualquier otra cepa analizada.

Para proporcionar una evaluación cuantitativa de la eficacia de transfección transitoria para la cepa CryX, se estimó la relación entre el número de células en la suspensión bacteriana infiltrada en las hojas y el número de puntos fluorescentes de GFP producidos considerados como un único evento de transfección. Con este fin, hojas de plantas de Nicotiana benthamiana de 6 semanas de edad se infiltraron usando una jeringa sin aguja con 200 pl de cultivos agrobacterianos de DO600 = 1,3 diluidos por factores de dilución de 10"5, 10"6 y 10"7 con un tampón que consiste en MES 5 mM, pH 5,3 y MgCh 10 mM. Las célula de agrobacterias CryX, EHA105, GV3101 e ICF320 portaban las construcciones NMD560 (vector de TMV-GFP). Para la puntuación de las células bacterianas, se sembraron alícuotas de 100 pl de suspensiones bacterianas utilizadas para la infiltración en hojas or triplicado en placas de LB- agar que contenía 50 pl/l de rifampicina y 50 pl/l de kanamicina. Las placas se incubaron durante 2 días a 28 °C y, después de eso, se contó el número de ufc (unidades formadoras de colonias). De acuerdo con la estimación de los inventores, 100 pl dee cultivos bacterianos CryX, EHA105, GV3101 e ICF320 contenían 7,38+/-1,72, 5,00+/-1,50, 2,53+/-0,87 y 6,17+/-1,37 ufc (Tabla 1). En paralelo a 4 dpi, se puntuaron las hojas de Nicotiana benthamiana para detección de manchas fluorescentes de GFP. De media, se produjeron 7,38 +/- 1,72, 5,00 +/- 1,50, 2,53 +/- 0,87 y 6,17 +/- 1,37 manchas fluorescentes por cada 100 pl de la dilución 10-7 del cultivo agrobacteriano infiltrado para las cepas CryX, EHA105, GV3101 y ICF320, respectivamente. Cada célula agrobacteriana produjo 0,46 loci de transfección para la cepa CryX y 0.01 loci de transfección para todas las otras cepas evaluadas, ciendo la cepa CryX 46 veces más eficiente que las cepas EHA105, GV3101 y ICF320.

Tabla 1. Eficacia de la transfección de CryX en comparación con otras cepas en el factor de concentración 10-7 de

cultivo ag

robacteriano (construcción pNMD560, 4 dpi).

CryX EHA105 GV3101 ICF320

Puntos de GFP/100 pl de cultivo original

2,85+/-0,83 0,06+/-0,02 0,03+/-0,01 0,06+/-0,02

ufc/100 pl de cultivo original

7,38+/-1,72 5,00+/-1,50 2,53+/-0,87 6,17+/-1,37

Puntos de GFP/ufc del cultivo introducido

0,46 0,01 0,01 0,01

Ejemplo 3. Sobreexpresión del gen virG de la cepa LBA4404 aumenta la eficacia de la transfeccióntransfección transitoria de la cepa CryX

Se analizó la influencia de la sobreexpresión de los genes virG en la eficiencia de la transfección transitoria de varias cepas de Agrobacterium. Para este propósito, se crearon vectores basados en TMV portadores de la inserción de genes virG ya sea de cepas GV3101 o LBA4404 en sus estucturas principales plasmídicas (Fig 1A). En primer lugar, se analizaron las cepas AGL1, EHA105, ICF320 y GV3101 usando vectores que albergan los genes virGN54D de las cepas GV3101 y LBA404 (pNMD063 y pNMD064, respectivamente), así como un vector con la secuencia del gen virG nativo de la cepa LBA4404 (pNMD062). Se infiltraron las honas de Nicotiana benthamiana usando una jeringa sin aguja con diluciones 102, 103 y 104 de DO600=1,3 de cultivos de agrobacterias. Las fotografías que muestran la fluorescencia de GFP en la luz ultravioleta se tomaron al 4a (Fig. 3A) y 6° dpi (Fig. 3B). Sobre la base de la evaluación visual, se demostró el aumento específico de la cepa de la eficacia de transfección transitoria. Como se

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resume en la Tabla 2, la sobreexpresión de virGN54D de la cepa GV3101 aumentó la eficiencia de transfección transitoria para las cepas GV3101 e ICF320; virGN54D de la cepa LBA4404 mejoró la eficacia de la transfección transitoria de las cepas AGL1, EHA105 y LBA4404.

La cepa CryX se analizó de manera similar, como se muestra en la figura 4. Las hojas de Nicotiana benthamiana se infiltraron usando una jeringa sin aguja con cultivos agrobacterianos líquidos de CryX y GV3101 de DO600 = 1,3 diluido A 10-4 y 10-5 con tampóm para la infiltración. Expresión de GFP Los vectores basados en TMV que contienen los genes virGN54D de las cepas GV3101 y LBA404 en la cadena principal del plásmido (pNMD063 y pNMD064, respectivamente) se compararon con el vector pNMD560 que no contenía inserción de virG. La Figura 4A representa la fluorescencia de GFP para la dilución 10-4 a 3 y 4 dpi; la Figura 4B muestra la fluorescencia de GFP para la dilución 10-5 a 4 y 5 dpi. Los inventores demostraron un aumento significativo de la eficacia de la transfección transitoria para la cepa CryX en combinación con el gen virGN54D gen de LBA4404; por el contrario, la sobreexpresión del gen virGN54D de la cepa GV3101 tuvo un impacto negativo en la transfección transitoria mediada por CryX.

Tabla 2. Efecto de la sobreexpresión de virG en la eficiencia de la transferencia de ADN-T

Cepa de Agrobacterium

virGN54D/GV3101 virGN54D/LBA4404

AGL1

sin efecto incremento

GV3101

incremento sin efecto

ICF320

incremento sin efecto

EHA105

sin efecto incremento

LBA4404

sin efecto incremento

Ejemplo 4. CryX en combinaciones con virGN54D/ LBA4404 proporciona una transfección transitoria eficiente de Nicotiana benthamiana en diluciones de hasta 107 usando infiltración foliar

Para encontrar las diluciones efectivas máximas de los cultivos líquidos de CryX para la transfección transitoria de plantas de Nicotiana benthamiana, se realizó la infiltración con jeringa de las hojas con cultivos agrobacterianos líquidos CryX y GV3101 de DO600 = 1,3 diluidos a 10-3, 10-4, 10-1, 10-6y 10-7con tampón para infiltración.

En los experimentos de los inventores, la cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens en combinación con virGN54D de la cepa LBA4404 proporcionó la transfección más eficiente de las plantas de Nicotiana benthamiana jamás observada, lo que da como resultado el número razonable de puntos de fluorescencia, incluso en el 10-7 factor de concentración del cultivo nocturno (Fig. 5). Permite aumentar la dilución del cultivo agrobacteriano utilizado para la infiltración de plantas aproximadamente 100 a 1000 veces en comparación con la dilución 103doble típicamente utilizada en el sistema Magnicon®.

Para proporcionar una evaluación cuantitativa de la eficacia de transfección transitoria para la cepa CryX, se estimó la relación entre el número de células en la suspensión bacteriana infiltrada en las hojas y el número de puntos fluorescentes de GFP producidos considerados como un único evento de transfección. Con este fin, se infiltraron las hojas de plantas de Nicotiana benthamiana de 6 semanas de edad usando una jeringa sin aguja con 200 pl de cultivos agrobacterianos de DO600 = 1,3 diluidos a 10-7 con un tampón acuoso que contenía MES 5 mM, pH 5,3 y MgCl2 10 mM. Las células agrobacterianas CryX portaban las construcciones pNMD560 (vector TMV-GFP) y pNMD062 (vector TMV-GFP que contenía virGN54D de la cepa LBA4404 en la estructura principal del plásmido). Para la puntuación de las células bacterianas, se sembraron alícuotas de 100 pl de suspensiones bacterianas utilizadas para la infiltración en hojas or triplicado en placas de LB-agar que contenía 50 pl/l de rifampicina y 50 pl/l de kanamicina. Las placas se incubaron durante 2 días a 28 °C y, después de eso, se contó el número de ufc (unidades formadoras de colonias). De acuerdo con la estimación de los inventores, 100 pl de cultivos bacterianos contenían 14,7 +/- 4,4 y 13,9 +/- 3,4 ufc para las construcciones pNMD560 y pNMD062, respectivamente (Tabla 3). En paralelo a 5 dpi, se puntuaron las hojas de Nicotiana benthamiana para detección de manchas fluorescentes de GFP. De media, se produjeron 16,3 +/- 1,5 y 24,0 +/- 0,0 puntos fluorescentes por cada 100 pl de cultivo agrobacteriano infiltrado para las construcciones pNMD560 y pNMD062, respectivamente. En otras palabras, cada célula agrobacteriana que alberga la construcción pNMD560 produjo aproximadamente 1,1 loci de transfección; para la construcción pNMD062, este valor fue mayor, 1,7, de modo que muestra un aumento de la eficacia de transfección debido a la sobreexpresión del gen virG.

Ejemplo 5. Cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens en combinación con virGA/54D/ LBA4404 muestra una alta eficacia de transfección por pulverización para soja

Los inventores analizaron la cantidad de cepas de Agrobacterium tumefaciens que incluyen AGL1, EHA105, GV3101, ICF320, CryX y LBA4404 para la transfección transitoria de la soja Glycine max L. usando la pulverización de plantas con suspensión de células agrobacterianas. Con este fin, los cultivos líquidos que albergan vectores de expresión GUS se cultivaron a DO600 = 1,3 y se diluyeron para pulverizar con tampón que contiene MES 5 mM pH

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5,3; MgCl2 10 mM y 0,05 % (v/v) de Tween®20 a la proporción de 1:10. Para el análisis de las cepas AGL1, EHA105, CryX y LBA4404, los inventores usaron la construcción pNMD2190 (35S:GUS; 35S:p19 y irGN54D/LBA4404 en la estructura del plásmido). Las cepas GV3101 e ICF320 se analizaron con el vector pNMD2180 (35S: GUS; 35S:p19 y virGN54D/GV3101in en la estructura del plásmido). La tinción de las hojas para la actividad GUS se realizó a los 11 días después de la pulverización. En comparación con otras cepas analizadas que mostraron poca o ninguna transfección, CryX proporcionó una tasa de transfección transitoria significativamente más alta, como se revela mediante la tinción de gUs (figura 6A).

Combinando el tratamiento con tensioactivo y con abrasivo, los inventores lograron una transfección transitoria eficiente de la soja con la cepa CryX para diluciones de hasta 10-2 de cultivos agrobacterianos cuando se usó el vector de transcripción de expresión de GUS pNMD2190 (Fig. 6B).

Ejemplo 6. Cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens en combinación con virGM54D/ LBA4404 muestra transfección por pulverización transitoria mejorada para algodón

Los inventores analizaron la transfección transitoria del algodón con las cepas EHA105, GV3101, ICF320 y CryX mediante pulverización. Con este fin se diluyeron cultivos líquidos de Agrobacterium de DOa00=1,3 en una proporción 1:10 con tampón que contenía MES 5 mM, pH5.3; MgCh 10 mM y 0,25 % (v/v) de la construcción Silwet L-77. pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 y virGN54D/Gv3101in en la estructura del plásmido) se usó con las cepas GV3101 e ICF320, y pNMD2190 (35S:GUS; 35S:p19 y virGN54D/LBA4404 en la estructura del plásmido) se usó con las cepas EHA105 y CryX. La construcción pNMD1971 (35S:GUS; 35S:p19) se aplicó como control con todas las cepas. El análisis de tinción de GUS se realizó a los 6 días de la pulverización. Tras la tinción, se encontraron pocos puntos azules para las cepas GV3101 e ICF320 (datos no mostrados). También se mostró una eficacia de transfección muy baja para las cepas EHA105 y CryX utilizadas con la construcción pNMD1971. En comparación con todas las otras cepas analizadas, CryX en combinación con virGN54D de la cepa LBA4404 (pNMD2190) demostraron una eficacia de transfección transitoria incrementada (Fig. 7).

Tabla 3. Eficacia de la transfección de CryX en combinación con virGN54D/LBA4404 (construcción pNMD062)

pNMD560 (sin virG) pNMD062 (virGN54D/LBA4404)

Dilución del cultivo agrobacteriano original

10-7 10-7

ufc/100 |jl de cultivo original

14,7+/-4,4 13,9+/-3,4

Puntos de GFP/100 jl de cultivo original, 5 dpi

16,3+/-1,5 24,0+/-0,0

Puntos de GFP/ufc del cultivo introducido

1,1 1,7

Ejemplo 7. El acceso ICBGE de la cepa Chry5/KYRT1 de Agrobacterium tumefaciens muestra una transfección transitoria más fuerte de Nicotiana benthamiana en comparación con el acceso de la Universidad de Kentucky de la misma cepa

Los inventores analizaron dos accesos de la cepa Chry5/KYRT1 de Agrobacterium tumefaciens recibida de diferentes laboratorios, el laboratorio del Dr. G. Collins de la Universidad de Kentucky (Lexington, EE. UU.) y el acceso del Institute of Cell Biology and Genetics Engineering (ICBGE, Kiev, Ucrania) para la transfección transitoria de plantas de Nicotiana benthamiana. Con este fin, las hojas de la planta se infiltraron usando una jeringa sin aguja con diluciones usando los factores de concentración de 10-1, 10-2 y 10-3 de una DO600=1,3 de cultivos agrobacterianos de ambos accesos de cepas que albergan un vector basado en TMV de expresión de GFP capaz de moverse de célula a célula (TMV-GFP, construcción pNMD560) como se muestra en la Figura 8. En base a la densidad de puntos fluorescentes y la intensidad de la fluorescencia de GFP, los inventores demostraron una mayor eficacia de la transfección transitoria para el acceso ICBGE si se compara con el acceso de la Universidad de Kentucky.

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ANEXO

SEQ ID NO 1: Secuencia de aminoácidos de la proteína virG de la cepa LBA4404 de Agrobacterium. N54 se muestra en negrita.

LKHVLLVDDDVAMRHLIIEYLTIHAFKVTAVADSTQFTRVLSSATVDVW

VDLNLGREDGLEIVRNLAAKSDIPIIIISGDRLEETDKWALELGASDFI

AKPFSIREFLARIRVALRVRPNWRSKDRRSFCFTDWTLNLRQRRLMSEA

GGEVKLTAGEFNLLLAFLEKPRDVLSREQLLIASRVRDEEVYDRSIDVLI

LRLRRKLEADPSSPQLIKTARGAGYFFDADVQVSHGGTMAA

SEQ ID NO 2: Secuencias de la región de ADN-T de pNMD560, pNMD062, pNMD063, pNMD064

cctgtggttggcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgc

caatatatcctgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatctaagctagcttggaattggtaccacgcgtttcgacaaa

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Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un proceso de transfección transitoria de una planta u hojas en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta o dichas hojas con una suspensión que comprende células de Agrobacterium de la cepa CryX depositada bajo el número de acceso DSM: DSM25686.
2. 2. Un proceso de expresión transitoria de una secuencia de ADN de interés en una planta, que comprende poner en contacto dicha planta o dichas hojas en dicha planta con una suspensión que comprende células de Agrobacterium de la cepa CryX que tiene el número de acceso DSM: DSM25686.
3. 3. El proceso según la reivindicación 1 o 2, donde dicha cepa CryX contiene un vector binario que tiene ADN-T que comprende una secuencia de ADN de interés para transfectar en células de dicha planta u hojas.
4. 4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicho vector binario comprende un gen virG expresable en dicha cepa CryX.
5. 5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho gen virG codifica una proteína VirG de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens de la SEQ ID NO:1 o es un mutante N54D de la proteína VirG codificada por el gen virG de la cepa LBA4404 de A. tumefaciens.
6. 6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha planta o dichas hojas en una planta se ponen en contacto con dicha suspensión mediante pulverización o mediante infiltración al vacío de dicha planta o dichas hojas en una planta con dicha suspensión.
7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha planta es una planta dicotiledónea, tal como Nicotiana benthamiana, tabaco, algodón, soja, colza, pimiento, patata, tomate, o un plata monocotiledónea.
8. 8. Cepa CryX de a Agrobacterium que tiene el número de acceso DSM: DSM25686; o una célula de Agrobacterium de la cepa CryX.
9. 9. La célula de Agrobacterium de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicha célula comprende además un vector binario que comprende un ADN-T que comprende una secuencia de ADN de interés para ser transfectada en una planta.
10. 10. Un kit que comprende

    - una célula de Agrobacterium de dicha cepa como se define en la reivindicación 8 y

    - un vector que contiene en el ADN-T una secuencia de ADN de interés para transfectar en las células de una planta.

    PNMD560

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    LBA4404

    Fig, IB

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    imagen5

    Fig, 2B

    imagen6

    ve

    imagen7

    Fig, 3B

    imagen8

    I

    Fig, 4A

    imagen9

    imagen10

    Después de la tinción Antes de la tinción

    Sin tratar AGL1 EHA105 CryX LBA4404 GV3101 ICF320

    imagen11

    Fig. 6A

    Fig. 6B

    Después de la tinción Antes de la tinción

    imagen12

    Sintratar 1:10 1:50 1:100

    Fig.7

    Después de la tinción Antes de la tinción

    imagen13

    Un 3" < -1

    CD

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    imagen14

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    PNMD1971 PNMD2180 pNMD2190 pNMD1971

    hoja 1

    imagen16

    imagen17

    TMV(MP)-GFP (pNMD560)

    hoja 2 hoja 3

    3 dpi

    Fig. 8