BR112014024608B1 - Processo de transfectar transientemente uma planta ou folhas em uma planta e cepa de agrobacterium - Google Patents

Abstract

agrobacterium para transfecção transiente de plantas inteiras. um processo de transfectar transientemente uma planta ou folhas em uma planta, compreendendo contatar referida planta ou referidas folhas com uma suspensão compreendendo células de agrobacterium de cepa cryx, ou uma cepa derivada de cepa cryx, no qual referida cepa derivada tem o antecedente cromossomal de cepa cryx, ou referida cepa derivada contém o plasmídeo vir de cepa cryx, ou um derivado de referido plasmídeo vir.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a um processo de transfectartransientemente uma planta ou folhas em uma planta. A invenção também se relaciona a um processo de expressar transientemente uma sequência de DNA de interesse em uma planta ou em folhas em uma planta. Ainda, a invenção se relaciona a uma cepa Agrobacterium.

Antecedentes da Invenção

[0002] Os processos de engenharia genética atuais para agriculturasão todos baseados na modificação genética de espécies de cultivo, demonstrados primeiro em 1983 (Fraley e outros 1983; Barton e outros 1983), e comercializados desde de 1996. Embora os processos de agricultura baseados em transformação genética estável de planta seja uma realidade hoje, e seja uma base de novas práticas bem-sucedidas, eles têm múltiplas limitações, a limitação principal sendo tempo muito longo e alto custo requeridos para desenvolvimento de cultivos transgênicos. O consenso geral entre as companhias envolvidas em biotecnologia de planta é que o processo R&D requer, dependendo da espécie de cultivo, entre 8 e 16 anos, e o custo de desenvolvimento médio total é estimado estar entre $100 e $150 milhões. Por causa destas limitações, após mais do que 25 anos, visto que a descoberta de um processo de transformação genética de planta, somente traços de grupo e poucas espécies de cultivo de GM foram comercializados até agora.

[0003] É conhecido que células de planta e plantas inteiras podemtambém serem reprogramadas transientemente (isto é, sem integração estável de novo material genético em um cromossomo de planta), e os processos transientes, tais como infecções virais, são rápidos. Tais processos transientes podem, em princípio, permitir uma modificação muito rápida de metabolismo de planta em favor de certos produtos que são de interesse ao usuário. Tais processos requerem um DNA ou vetor de RNA (um vírus ou uma bactéria), que foi projetado para efetivamente e seguramente transfectar a planta. Tentativas anteriores de usar vetores baseados em vírus de planta foram parcialmente bem- sucedidas em que elas permitem transfecção de plantas para produção de proteínas recombinantes de alto valor, tais como certos biofarmacêuticos (Gleba e outros 2007, 2008; Lico e outros 2008). O uso de vírus para manipulação de outros traços, tais como traços de entrada (por exemplo, resistência à herbicida, Shiboleth e outros 2001; Zhang and Ghabiral 2006) foi descrito na literatura, mas a transfecção de vírus introduz assim mudanças indesejadas no hospedeiro infectado que este tipo de processo transiente não é de acordo com quaisquer dos traços de entrada. Os processos transientes podem também serem construídos ao redor da capacidade das espécies Agrobacterium transferirem parte de seu plasmídeo Ti em eucarioto, em particular, células de planta. O uso de transfecção à base de Agrobacterium é uma base para manipulações genéticas, tais como protocolos de transformação genética e de ensaios de transfecção transientes de laboratório. As aplicações industriais de transfecção à base de Agrobacterium foram também limitadas a produção de proteína recombinante, porque as condições ótimas de aplicação, tal como infiltração a vácuo de plantas com suspensões bacterianas, não podem ser usadas em uma grande escala no campo, onde pulverização de partes aéreas ou rega de plantas com soluções bacterianas, resultam em uma proporção supostamente muito pequena de células de planta a serem transfectadas, e estudos prévios simplesmente não determinam esta questão específica.

[0004] Agrobacterium tumefaciens e A. rhizogenes são amplamenteusadas em laboratórios de pesquisa ao redor do mundo para transfecção transiente e transformação genética estável de plantas. Estas aplicações são baseadas na capacidade de Agrobacterium transferir informação genética a células eucarióticas. Muitas das plantas transgênicas cultivadas hoje, tais como sojas, canola e algodão, foram geradas através da transformação genérica mediada por Agrobacterium. A diferença essencial entre a transformação transiente e estável é que no processo de transformação estável, o DNA distribuído por Agrobacterium é eventualmente integrado em um cromossomo de planta, e é, em seguida, herdado pela progênie da planta. Tais eventos de integração são raros, mesmo em experimentos de laboratório designados para proporcionar contatos massivos entre células de planta e bactérias; desse modo, para a seleção de transformantes estáveis, métodos de classificação seletivos tem que serem utilizados, e explantes de planta específicos (ricos em tecidos meristemáticos) selecionados para transformação ótima e regeneração em plantas inteiras, são empregados. Subsequentemente, o conhecimento acumulado neste domínio de ciência é de valor limitado para aqueles interessados em processos transientes onde muitas células do corpo da planta devem ser afetadas sem seleção de células transfectadas.

[0005] A transfecção transiente, por outro lado, leva em contasomente etapas anteriores de distribuição de DNA acionada por Agrobacterium em um núcleo de uma célula de planta, junto com o fato que tais moléculas de DNA distribuídas podem ser transcritas em um núcleo, mesmo na ausência de integração de DNA em um cromossomo de planta, tal expressão resultando em uma reprogramação metabólica transiente de uma célula de planta. Tal reprogramação foi desenvolvida em uma ferramenta de laboratório para avaliação rápida de experimentos genéricos diferentes. Onde existe corpo considerável de conhecimento sobre transferência de DNA mediada por Agrobacterium às células de planta, aquela informação é invariavelmente limitada a experimentos de escala de laboratório, e, desse modo, até aqui, existem muito poucas tentativas de se desenvolver aplicações em escala industrial envolvendo Agrobacterium como um vetor de DNA.

[0006] Uma das limitações de aplicações de laboratório é o fato quea distribuição de DNA à base de Agrobacterium requer certos tratamentos que são difíceis ou impossíveis de aplicar em campo aberto, ou em uma grande escala. Em experimentos transientes típicos, as células de planta cultivadas, ou partes de planta (explantes), são tratados com um excesso de bactérias para proporcionar distribuição máxima. Em experimentos de pesquisa típicos, um está também interessado em níveis de expressão que não são economicamente viáveis se feito em uma escala industrial. Em geral, a pesquisa feita neste domínio tem conduzido os inventores à conclusão que os parâmetros que afetam seriamente a expressão transiente são aqueles que permitem o melhor acesso de interação de agrobactéria às células de planta dentro de um corpo de planta. Muitos tais estudos utilizam infiltração a vácuo, injeção em folha de planta, ou tratamento com tensoativo, ferimento de superfície da planta, por exemplo, com lâminas de barbear, ou combinação destes. De fato, o único grupo que está desenvolvendo um processo de transfecção à base de Agrobacterium para produção comercial de proteínas recombinantes que não envolvem amplificação adicional (à base de vírus) do DNA original, é o grupo de Medicago (D’Aoust e outros 2008, 2009; Vezina e outros, 2009). Seu processo ocorre completamente em infiltração a vácuo como um método de distribuição. Contudo, devido a ser baseado em grande excesso de razão de bactéria para célula de planta, os protocolos de laboratórios atuais usados para transfecção transiente de plantas não têm sério valor translacional, isto é, eles não podem ser diretamente replicados em um nível industrial. Exceto em poucos casos (por exemplo, Vaquero e outros, 1999, D’Aoust e outros, 2008, 2009), eles também não determinaram quantitativamente a questão de eficiência do processo de transfecção transiente. (Exemplos de tal pesquisa são múltiplos, é proporcionada uma citação para apenas uns exemplos poucos representativos: Li e outros, 1992; Liu e outros, 1992; Clough and Bent, 1998; De Buck e outros, 1998, 2000; Chung e outros, 2000; Yang e outros, 2000; Zambre e outros, 2003; Wroblewski e outros, 2005; Lee and Yang, 2006; Zhao e outros, 2006; Shang e outros, 2007; Jones e outros., 2009; Li e outros, 2009; De Felippes and Weigel, 2010).

[0007] Um dos processos industriais estando sob desenvolvimentohoje é "magnifection", um processo que é baseado em infiltração a vácuo de agrobactéria em folhas de planta. O processo de "magnifection" (comercialmente vendido por Icon Genetics GmbH como magnICON® e coberto por várias patentes/pedidos de patente), é um protocolo simples e indefinidamente escalável para expressão de proteína heteróloga em plantas, que é desprovido de transformação genética estável de uma planta, mas, ao invés, ocorre na amplificação transiente de vetores virais distribuídos à áreas múltiplas de um corpo de planta (distribuição sistêmica) por Agrobacterium como precursores de DNA. Tal processo é, na essência, uma infiltração de plantas maturas inteiras com uma suspensão diluída de T-DNAs que transportam agrobactérias que codificam replicons de RNA viral. Neste processo, a bactéria assume as funções (primeiramente viral) de infecção primária e movimento sistêmico, onde o vetor viral proporciona difusão de célula a célula (curta distância), amplificação e expressão de proteína de alto nível. A versão ampliada (industrial) é construída ao redor de vetores virais completamente montados (preferivelmente do que pró-vetores que requerem montagem in planta), e requerem aparelhos para distribuição de Agrobacterium de alta produção em plantas inteiras por infiltração a vácuo. O processo pode ser ampliado, mas ele requer submersão de partes aéreas de plantas em suspensão bacteriana sob vácuo (o processo envolve inversão de crescimento de plantas em potes ou em bandejas), um procedimento que impõe limitações nos volumes de biomassa que podem ser tratados desse modo, na produtividade do processo, nos modos em que as plantas podem ser cultivadas antes do tratamento, e ele também conduz a certos custos que limitam o uso do processo a altos custos de produtos, tais como biofarmacêuticos recombinantes somente. O processo de "magnifection" é eficiente, à medida que ele permite transfecção de quase todas as células de folha em plantas tratadas, ou aproximadamente 50% da biomassa de planta aérea total (o restante sendo caules e pecíolos de folha). O processo foi otimizado em muitos modos, ver, por exemplo, Marillonnet e outros, 2005. Contudo, o processo atual tem sido construído completamente ao redor de métodos de distribuição bacteriana, tais como injeção em uma folha de planta ou infiltração a vácuo (por exemplo, Simmons e outros, 2009), ferimento de folhas (Andrews and Curtis, 2005), ou derramamento de agrobactéria no solo (‘agrodrenching’, Ryu e outros, 2004; Yang e outros, 2008), mas estes métodos podem não serem aplicados para o tratamento de massa das plantas em um campo (revisto em Gleba e outros, 2004, 2007, 2008; Gleba & Giritch, 2010, 2011; Lico e outros, 2008; artigos originais de nosso grupo incluem Giritch e outros. 2006; Marillonnet e outros., 2004, 2005; Santi e outros, 2006; e artigos ideologicamente similares de outros grupos de pesquisa - Voinnet e outros, 2003; Sudarshana e outros, 2006; Gao e outros, 2006; Mett e outros, 2007; Lindbo, 2007a,b; Plesha e outros, 2007, 2009; Huang e outros, 2006; Regnard e outros 2009; Green e outros, 2009; Shoji e outros, 2009).

[0008] As tentativas de usar tratamento com Agrobacterium em plantas inteiras (in planta) sem infiltração a vácuo, resultaram em um número muito baixo de células inicialmente transfectadas, desse modo, limitando grandemente a aplicação prática do processo. Além disso, desde que nenhuma seleção para células de planta transfectadas é feita em sistemas transientes de transfecção, o processo transiente de transfecção completo é de eficiência muito baixa para aplicações de grande escala se infiltração a vácuo é para ser evitada. Adicionalmente, várias espécies de planta, tais como soja ou semente de colza, são difíceis de transfectar por Agrobacterium, a menos que tecido de planta específico seja usado, pelo que transfecção transiente in planta não foi alcançada a uma extensão significante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] Partindo-se da técnica anterior, é um objetivo da presenteinvenção proporcionar um processo eficiente de transfecção transiente in planta. É outro objetivo da invenção proporcionar um processo eficiente de expressar transientemente uma sequência de DNA de interesse in planta. Adicionalmente, é um objetivo da invenção proporcionar um processo eficiente que permite transfecção transiente de planta usando Agrobacterium em uma grande escala (industrial) (isto é, para muitas plantas em paralelo), sem a necessidade de aplicação de diferenças de pressão para introduzir Agrobacterium no espaço intercelular de plantas. É também um objetivo proporcionar uma célula e cepa de Agrobacterium adequadas para esta proposta.

[0010] Estes problemas são solucionados por um processo detransfectar transientemente uma planta ou folhas em uma planta, compreendendo contatar referida planta, ou referidas folhas, com uma suspensão compreendendo células de Agrobacterium da cepa CryX depositada sob No de acesso: DSM25686, ou uma cepa derivada da cepa CryX, no qual referida cepa derivada tem o antecedente cromossômico da cepa CryX, ou referida cepa derivada contém o plasmídeo vir da cepa CryX, ou um derivado de referido plasmídeo vir.

[0011] Adicionalmente proporcionado é um processo de expressartransientemente uma sequência de DNA de interesse em uma planta, compreendendo contatar referida planta, ou referidas folhas na referida planta com uma suspensão compreendendo células de Agrobacterium da cepa CryX depositadas sob número de acesso: DSM25686, ou uma cepa derivada da cepa CryX, no qual referida cepa derivada tem o antecedente cromossômico da cepa CryX, ou referida cepa derivada contém o plasmídeo vir da cepa CryX, ou um derivado de referido plasmídeo vir.

[0012] A invenção também proporciona um Agrobacterium cepaCryX tendo No de acesso no DSM: DSM25686, ou uma cepa derivada da cepa CryX, no qual referida cepa derivada tem o antecedente cromossômico da cepa CryX, ou referida cepa derivada contém o plasmídeo vir da cepa CryX, ou um derivado de referido plasmídeo vir; ou uma célula de Agrobacterium da cepa CryX, ou de referida cepa derivada.

[0013] A invenção também proporciona células de Agrobacteriumda cepa CryX tendo No de acesso no DSM: DSM25686, ou um derivado destas referidas células contendo um vetor binário contendo em T-DNA uma sequência de DNA de interesse a ser transfectada em células de uma planta, no qual o vetor binário pode codificar uma proteína virG da cepa CryX, ou uma proteína virG proximamente relacionada, conforme definido abaixo.

[0014] A invenção adicionalmente proporciona um kitcompreendendo:- uma célula de Agrobacterium de referida cepa ou referida cepa derivada, conforme definido acima, e- um vetor binário contendo em T-DNA uma sequência de DNA de interesse a ser transfectada em células de uma planta.

[0015] O vetor binário pode codificar uma proteína virG da cepaCryX, ou uma proteína virG proximamente relacionada, conforme definido abaixo.

[0016] A invenção também proporciona o plasmídeo vir da cepaCryX, e células de Agrobacterium tendo o cromossomo da cepa CryX.

[0017] A invenção adicionalmente proporciona uma suspensão decélula aquosa de Agrobacterium cepa CryX tendo No de acesso no DSM: DSM25686, ou uma cepa derivada da cepa CryX (conforme aqui definido), referida suspensão tendo uma concentração de célula de, no máximo, 1,1 x^106 cfu/mL da suspensão, preferivelmente, no máximo, 4,4 x^105 cfu/mL da suspensão, e, mais preferivelmente, de, no máximo, 1,1 x^105 cfu/mL da suspensão.

[0018] Os inventores da presente invenção verificaram um modo deaumentar fortemente a eficiência de transfecção transiente de plantas por Agrobacterium. Os inventores identificaram uma cepa Agrobacterium (Agrobacterium cepa CryX) que alcança eficiência particularmente alta em transfecção transiente in planta com uma ampla variedade de plantas. Notavelmente, a cepa CryX alcança eficiência de transfecção transiente muito mais alta in planta do que outras cepas Agrobacterium que são usadas como um padrão para transformação ou transfecção de planta, tal como cepa LBA4404 ou EHA105 (ver página 64 de Slater e outros., em: Plant Biotechnology, 2a edição, Oxford University Press, 2008). Os inventores verificaram ainda que cepa CryX alcança eficiência de transfecção transiente mais alta do que cepas relacionadas de Agrobacterium, tal como Chry5/KYRT1. Além disso, os inventores verificaram que uma eficiência de transfecção particularmente alta pode ser obtida quando um gene virG, notavelmente o gene virG da cepa Agrobacterium LBA4404, ou um gene virG que é proximamente relacionado àquele de LBA4404 é expresso em cepas Agrobacterium tumefaciens tipo crisopina ou succinamopina.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] A Fig. 1A e 1B mostram regiões de T-DNA com sequênciasde DNA de interesse de vetores usados nos exemplos. Pact2: promotor de gene Arabidopsis actin2; o: extremidade-5’ de TVCV (vírus de clareamento de veia de nabo); RdRp: Estrutura de leitura aberta de polimerase de RNA dependente de RNA (ORF) de cr-TMV (tobamovírus de infecção crucífera); MP: proteína de movimento proteína ORF de cr- TMV; N: região 3’-não transladada de cr-TMV; Tnos ou nos:terminador de sintase nopalina; segmentos brancos que interrompem segmentos cinzas nos RdRp e MP ORFs indicam íntrons inseridos nestes ORFs para aumentar a probabilidade de formação de replicon de RNA no citoplasma de células de planta, que é descrito em detalhe no WO2005049839; GUS: sequência de codificação de proteína GUS; GFP: sequência de codificação de proteína fluorescente verde; fs: capacidade de movimento de célula a célula de anulação de alteração de estrutura; P35S: promotor 35S; P19: supressor de silenciamento de gene de vírus do enfezamento vermelho do tomate (cf. Plant J. 33, 94956); Tocs: terminador ocs; LB: borda de T-DNA esquerda; RB: borda de T-DNA direita.

[0020] A Fig. 2 mostra uma comparação das cepas diferentes deAgrobacterium tumefaciens para sua eficiência de transfecção transiente. As fotografias mostram fluorescência de GFP 4 dpi (dias pós- infecção) sob luz UV devido à expressão de GFP à base de TMV após infiltração com seringa de folhas de Nicotiana benthamiana com culturas agrobacteriana diluídas conforme descrito no Exemplo 2. Os numerais 10-2, 10-3 e 10-4 mostram os fatores de concentração das culturasagrobacterianas durante a noite de OD = 1,3 a 600 nm, que corresponde a 102 vezes, 103 vezes, e 104 vezes de diluições, respectivamente. A composição do tampão para infiltração é 5 mM de MES, pH 5,5, e 10 mM de MgSO4. Cada infiltração foi realizada em triplicata usando três folhas independentes da mesma planta.

[0021] (A) Vetor à base de TMV capaz de movimento célula a célula:TMV(MP)-GFP (pNMD560).

[0022] (B) Vetor à base de TMV carecendo de capacidade demovimento célula a célula: TMV(fsMP)-GFP (pNMD570).

[0023] 1- Cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens;

[0024] 2- Cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens;

[0025] 3 - Cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens;

[0026] 4 - Cepa ICF320 de Agrobacterium tumefaciens;

[0027] 5 - Cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens;

[0028] 6 - Cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens;

[0029] 7 - Cepa LBA9402 de Agrobacterium tumefaciens.

[0030] A Fig. 3 demonstra a influência de sobre expressão de genevirG na eficiência de transfecção transiente para cepas AGL1, EHA105, ICF320 e GV3101. Sequências virG das cepas GV3101 e LBA4404 transportando a mutação N54D, bem como sequência nativa da cepa LBA4404, foram usadas para comparação. As fotografias mostram fluorescência de GFP 4 (Fig. 3A) e 6 (Fig. 3B) dpi sob luz uv devido à expressão de GFP à base de TMV após infiltração com seringa de folhas de Nicotiana benthamiana da mesma idade de 3 plantas independentes com culturas agrobacterianas diluídas, conforme descrito no Exemplo 3. Os numerais 10-2, 10-3 e 10-4 indicam os fatores pelos quais as concentrações de célula das culturas agrobacterianas durante a noite de OD = 1,3 a 600 nm, foram reduzidas. Desse modo, os fatores 10-2, 10-3 e 10-4 correspondem a 102-, 103- e 104 vezes de diluições, respectivamente. A composição do tampão para infiltração: 5 mM de MES, pH 5,3, e 10 mM de MgCl2. Em todos os casos, vetores à base de TMV capazes de movimento célula a célula foram usados.

[0031] 1 - pNMD560 (nenhum virG) em GV3101;

[0032] 2- pNMD064 (virGN54D/GV3101) em GV3101;

[0033] 3 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) em GV3101;

[0034] 4 - pNMD062 (virG/LBA4404) em GV3101;

[0035] 5 - pNMD560 (no virG) em ICF320;

[0036] 6 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) em ICF320;

[0037] 7 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) em ICF320;

[0038] 8 - pNMD062 (virG/LBA4404) em ICF320;

[0039] 9 - pNMD560 (nenhum virG) em EHA105;

[0040] 10 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) em EHA105;

[0041] 11 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) em EHA105;

[0042] 12 - pNMD062 (virG/LBA4404) em EHA105;

[0043] 13 - pNMD560 (nenhum virG) em AGL1;

[0044] 14 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) em AGL1;

[0045] 15 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) em AGL1;

[0046] 16 - pNMD062 (virG/LBA4404) em AGL1.

[0047] As Figs. 4A e 4B mostram a influência de sobre expressãode gene virG na eficiência de transfecção transiente das cepas GV3101 e CryX. As sequências de virG das cepas GV3101 e LBA4404 que transportam mutação de N54D, bem como sequência nativa da cepa LBA4404, foram usadas para comparação. As fotografias mostram fluorescência de GFP 3, 4 e 5 dpi sob luz uv devido à expressão de GFP à base de TMV após a infiltração com seringa de folhas de Nicotiana benthamiana da mesma idade de 3 plantas independentes com culturas agrobacterianas diluídas, conforme descrito no Exemplo 3. Os numerais 10-4 e 10-5 indicam os fatores de concentração das culturas agrobacterianas durante a noite de OD = 1,3 a 600 nm. A composição do tampão para infiltração: 5 mM de MES, pH 5,3, e 10 mM de MgCl2. Os vetores à base de TMV capazes de movimento célula a célula foram usados.

[0048] 1- pNMD560 (nenhum virG) na cepa GV3101;

[0049] 2- pNMD064 (virGN54D/GV3101) na cepa GV3101;

[0050] 3- pNMD063 (virGN54D/LBA4404) na cepa GV3101;

[0051] 4 - pNMD560 (nenhum virG) na cepa CryX;

[0052] 5 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) na cepa CryX;

[0053] 6 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) na cepa CryX.

[0054] A Fig. 5 mostra uma comparação de eficiências detransfecção transiente para cepas CryX e GV3101 em uma faixa de diluições de culturas agrobacterianas durante a noite de 10-3 a 10-7 usando infiltração com seringa de folhas de Nicotiana benthamiana. Os numerais 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 indicam os fatores de concentração das culturas agrobacterianas durante a noite de OD = 1,3 a 600 nm. Estes correspondem a 103, 104, 105, 106 e 107 vezes diluições,respectivamente. A composição do tampão para infiltração: 5 mM de MES, pH 5,3, e 10 mM de MgCl2 em água. As fotografias são tomadas a 4 dpi.

[0055] 1 - pNMD560 (nenhum virG) em cepa GV3101;

[0056] 2 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) em cepa GV3101;

[0057] 3 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) em cepa GV3101;

[0058] 4 - pNMD560 (nenhum virG) em cepa CryX;

[0059] 5 - pNMD064 (virGN54D/GV3101) em cepa CryX;

[0060] 6 - pNMD063 (virGN54D/LBA4404) em cepa CryX.

[0061] A Fig. 6 mostra os resultados de teste das cepas deAgrobacterium diferentes para transfecção transiente de soja usando pulverização com suspensão de células agrobacterianas. Construções de pNMD2190 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/LBA4404 no suporte de plasmídeo) foi usado com cepas AGL1, EHA105, CryX e LBA4404; construção de pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/GV3101 no suporte de plasmídeo) foi usado com cepas de GV3101 e ICF320. A marcação de folhas para a atividade de GUS foi realizado a 11 dps.

[0062] (A) Para pulverização, culturas líquidas de Agrobacterium deOD600 = 1,3 foram diluídas na razão 1:10 com tampão contendo 5 mM de MES, pH 5,3; 10 mM de MgCl2 e 0,05% (v/v) de Tween®20.

[0063] (B) Para pulverização, culturas líquidas de Agrobacterium deOD600 = 1,3 foram diluídas em razões 1:10, 1:100 e 1:1000 com tampão contendo (5 mM de MES, pH 5,3; 10 mM de MgCl2 e 0,05% (v/v) de Tween®20), suplementadas com partículas de carbeto de silício de tamanho 800 na concentração 0,3% (p/v).

[0064] A Fig. 7 mostra os resultados de teste das cepas CryX eEHA105 para transfecção transiente de algodão Gossipium hirsutum L. usando pulverização com suspensão de células agrobacterianas. Para pulverização, culturas líquidas de Agrobacterium de OD600 = 1,3 foram diluídas na razão 1:10 com tampão contendo 5 mM de MÊS, pH 5,3; 10 mM de MgCl2 e 0,25% (v/v) de Silwet L-77. Para teste, construções pNMD1971 (35S:GUS; 35S:p19), pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/GV3101 no suporte de plasmídeo) e pNMD2190 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/LBA4404 no suporte de plasmídeo), foram usados. O teste de atividade de GUS foi realizado a 6 dps.A Fig. 8 mostra uma comparação de dois acessos das cepas de Agrobacterium tumefaciens Chry5/KYRT1 recebidas de laboratórios diferentes usando um vetor à base de TMV capaz de movimento célula a célula (vetor TMV-GFP, pNMD560). As fotografias mostram a fluorescência de GFP 4 dpi (dias pós-infecção) sob luz uv devido à expressão de GFP à base de TMV após infiltração com seringa de folhas de Nicotiana benthamiana com culturas agrobacterianas diluídas durante a noite de OD = 1,3 a 600 nm, conforme descrito no Exemplo 8. A cepa obtida a partir do laboratório de Dr. G. Collins na Universidade de Kentucky (Lexington, USA) é infiltrada no lado direito de cada folha. O acesso a partir do Institute of Cell Biology and Genetics Engineering (ICBGE, Kiev, Ukraine), é infiltrado no lado direito de cada folha. Uma composição do tampão para infiltração é 5 mM de MES, pH 5,5, e 10 mM de MgSO4. Cada infiltração foi realizada em triplicata usando três folhas independentes da mesma planta.

[0068] 1- Acesso ao ICBGE, fator de concentração 10-1 (diluição 10vezes);

[0069] 2- Acesso ao ICBGE, fator de concentração 10-2;

[0070] 3 - Acesso ao ICBGE, fator de concentração 10-3;

[0071] 4 - Acesso à Universidade de Kentucky, fator deconcentração 10-1;

[0072] 5 - Acesso à Universidade de Kentucky, fator deconcentração 10-2;

[0073] 6 - Acesso à Universidade de Kentucky, fator deconcentração 10-3.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0074] Na presente invenção, uma classe particular das cepas deAgrobacterium tumefaciens é usada para transfecção transiente deplantas, tais como folhas em uma planta. Esta classe de Agrobacterium compreende A. tumefaciens cepa CryX e cepas derivadas desta, conforme definido abaixo. A cepa CryX foi depositada com DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha, em 23 defevereiro de 2012, sob o Tratado de Budapeste. O Número de acesso DSM 25686 foi designado para ela. A cepa CryX tem uma resistência à rifanpicina cromossomicamente integrada.

[0075] A cepa CryX é relacionada à Agrobacterium cepa Chry5derivada de Chrysanthemum morifolium que foi identificada por Busch & Puepke em 1991. Foi mostrado em seu artigo que a cepa é um biotipo I por testes de biotipo tradicionais, e que ela produz tumores em pelo menos 10 espécies de planta. Ela foi caracterizada como não usual de sua capacidade para formar tumores eficientemente grandes na soja (Glicina max) e, por esta razão, ela foi subsequentemente adicionalmente caracterizada em um número de artigos por vários grupos. O Chry5 é incapaz de utilizar octopina ou manopina como uma fonte de carbono; ao invés, ele é capaz de catabolizar um isômero único cada de nopalina e succinamopina, ao mesmo tempo, é insensível a agrocina 84 (Busch & Puepke, 1991). Em adição, os tumores induzidos por cepa Chry5 produzem uma família de opinas tipo Amadori que incluem deoxifructosil glutamina (Dfg) e sua lactona, crisopina (Chy) (Palanichelvam e outros., 2000). Os isolados de Chry5 foram mostrados conterem pelo menos dois plasmídeos, um com uma homologia com pTiB6. Torisky e outros. (1997) desarmaram parcialmente a cepa por remoção de aproximadamente 16,5-kb de segmento a partir de 285-kb de plasmídeo de Ti de Chry5, incluindo aproximadamente 4 kb do T- DNA oncogênico, através de recombinação homóloga. Este mutante de anulação, denominado KYRT1, foi mostrado ser um organismo de vetor eficiente, e este derivado parcialmente desarmado de Chry5 já foi usado por alguns pesquisadores. Mais recentemente, Palanichelvamet e outros. (2000) desenvolveram um derivado completamente desarmado.

[0065] Na pesquisa que conduziu à presente invenção, osinventores inicialmente testaram dois acessos de Chry5/KYRT1 recebidos de laboratórios diferentes. A cepa obtida a partir do laboratório de Dr. G. Collins (Torisky e outros., 1997) não mostrou qualquer superioridade sobre as cepas comparadoras padrões EHA105 e GV3101 em nossos estudos transientes, e foi excluída de estudos adicionais. Um acesso a partir do Institute of Cell Biology and Genetics Engineering (Kiev, Ukraine), por outro lado, foi verificado ser não usualmente ativo em sua transfecção transiente e eficiência de expressão, e foi usado na presente invenção. Este último acesso foi depositado sob o tratado de Budapeste no depositário oficial DSMZ- Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha, sob o nome CryX, para refletir o fato que não existe informação de proveniência clara no mesmo.

[0066] Os artigos originais e subsequentes caracterizaram a cepaChry5 em maiores detalhes. Estes estudos objetivados na caracterização padrão de biologia molecular e genéticas da cepa, bem como sua capacidade comparativa de induzir tumores, para causar transformação genética de espécies de planta diferentes, bem como sua capacidade de causar expressão transiente em explantes tratados com Agrobacterium. Os resultados destes estudos são brevemente resumidos abaixo.

[0067] Métodos de Comparação usados para caracterizarAgrobacterium tumefaciens Chry51. Dados em oncogenicidade

[0068] No artigo original de Bush & Puepke (1991), foi estabelecidoque a cepa Chry5 é capaz de causar tumores em 10 espécies de planta que representam 7 famílias de planta. O teste envolve avaliação semiquantitativa do número de plantas com tumores causados por esta cepa versus a cepa B6 de laboratório comum. Não existem diferenças significantes na tumorigenicidade entre as cepas em 6 de 9 espécies (beterrabas, kalanchoe, calêndula, girassol, tabaco e tomate). Na couve, o Chry5 foi aproximadamente duas vezes mais eficiente, e, na soja - aproximadamente três vezes mais eficiente, pelo que na ervilha, foi um tanto menos eficiente do que B6. Torisky e outros. (1997) proporcionaram dados adicionais na formação do tumor em caules de tabaco e tomate; neste estudo, a cepa Chry5 e seu KYRT1 derivado parcialmente desarmado, foram comparados com duas outras cepas de Agrobacterium frequentemente usadas em estudos de transformação, incluindo A281, a cepa do tipo succinamopina contendo plasmídeo de Bo542 Ti no antecedente cromossômico C58, e sua cepa de EHA105 derivada desarmada. Foi mostrado neste estudo que onde o Chry5 original e a outra cepa de succinamopina usada, A281, são ambos altamente tumorigênicas, os KYRT1 e EHA105 derivados parcialmente deficientes não foram ativos.2. Dados na eficiência de transformação usando cepas parcialmente deficientes e cepas totalmente deficientes

[0069] Torisky e outros. (1997) demonstraram que KYRT1 transferecom êxito o gene de beta-glucuronidase (GUS) em explantes de folha de tabaco, produzindo calo que expressa GUS que pode ser regenerado em plantas viáveis. Nestes experimentos, a eficiência de transformação da cepa KYRT1 foi aproximadamente o mesmo, conforme foi mostrado para EHA105. Grant e outros. (2003) verificaram que a cepa KYRT1 por estar na tripla função média, é mais eficiente do que AGL 1 para produção de plantas transgênicas de ervilha que usam avaliação de explantes de cotiledôneas de três genótipos de planta diferentes.

[0070] No trabalho de Palanichelvam e outros. (2000), foi mostradoque o derivado de KYRT1 é somente parcialmente desarmado, e contém todas das regiões direita-T oncogênica e o fragmento de regiões esquerda-T. Um derivado de Chry5 com plasmídeo de Ti completamente desarmado, pKPSF2 (Palanichelvam e outros., 2000), foi, contudo, menos eficiente para a transformação estável de soja, à medida que a cepa KYRT1 retém algum efeito hormonal nos explantes de planta, intensificando a embriogênese somática na soja (Ko e outros., 2004).3. Dados que caracterizam atividade transiente

[0071] Novamente, Torisky e outros. (1997) foram os primeiros aestudar expressão transiente de β-glucuronidase transgene causada pelo derivado Chry5 de KYRT1 pelo uso de um ensaio quantitativo de expressão de GUS em explantes de nodo de cotiledônea de soja. Estes dados indicam que o derivado de KYRT1 foi aproximadamente 2,5 vezes mais eficiente em causar expressão transiente quando comparado a EHA105 ou GV3850. KYRT1 foi, em média 2,8 vezes mais eficiente do que EHA105 e C58C1 para produção de expressão de gene transiente de β-glucuronidase (GUS) (gus) nos pecíolos de cotiledôneas de uma planta de legume recalcitrante, lentilha (Lens culinaris M.) (Akcay e outros., 2009). Akbulut e outros. (2008) mediram a atividade de GUS em explantes derivados de mudas feridas após tratamento com KYRT1 e dois outros vetores comuns, C58C1 e EHA105. A avaliação quantitativa de pontos de expressão de GUS mostrou que após 16 horas de embebimento, não existem diferenças estatisticamente significantes entre KYRT1 e C58C1, e após 40 horas, KYRT1 é melhor por ca. 50%, mas somente em um de dois pontos de medição.

[0072] A interpretação dos dados acima mencionados em suatotalidade é difícil porque autores diferentes usam espécies de planta diferentes, explantes de planta diferentes, cepas diferentes de Agrobacterium para comparação, e tiraram suas conclusões baseados em três métodos de atividade diferentes: atividade tumorigênica, eficiência de transformação genética, e eficiência de expressão transiente. O processo de interação de uma célula de planta e um Agrobacterium é muito complexo, e envolve transferência de complexo de proteína de T-DNA, transferência de proteínas, tal como VirE2 (via um sistema de secreção separado), expressão transiente de genes T- DNA em uma célula de planta, efeito hormonal de genes expressos, integração de algumas moléculas de T-DNA em um DNA cromossômico de planta, etc. Qualquer destes processos intermediários pode influenciar o resultado final; portanto, os dados na tumorigenicidade e na eficiência de transformação não dá informação com relação a eficiência de transferência de T-DNA e expressão transiente. Os dados apresentados na atividade transiente são, por outro lado, limitados, e as leves diferenças observadas são inconclusivas, ou não praticamente relevante.

[0073] Uma diferença maior nos processos e cepas aqui descritas e os métodos usados na técnica anterior acima descrita é a biologia diferente do material de planta usado para estudos de expressão transiente. Onde todos os autores anteriores usavam explantes cultivados ou excisado in vitro ricos em tecidos meristemáticos (o último objetivo sendo a capacidade de transformar uma célula de planta e regenerar uma planta inteira de referida célula transgênica), tal como embrião excisado, partes de mudas jovens, etc., a presente invenção se relaciona a transfecção transiente de intacto, plantas desenvolvidas que interagem com Agrobacterium diferentemente. Nas plantas inteiras, a agrobactéria entra na folha, via estômato (que é ausente em outros órgãos e em tecidos meristemáticos), e não via ferimentos em explantes de planta. Conforme mencionado antes, todos os autores, sem exceção, estavam usando altas densidades de bactéria quando tratando explantes de planta.

[0074] A cepa CryX da presente invenção contém um plasmídeo virque é pelo menos parcialmente desarmado. "Desarmado" significa que o plasmídeo vir e seu Agrobacterium hospedeiro não é oncogênico, isto é, ele não insere oncogenes ou genes para a produção de opinas em células de planta, ou porque ele não contém tais genes, ou ele não pode transferir tais genes. Um plasmídeo vir compreende os genes vir (genes de virulência) requeridos para transferência de T-DNA em células de planta. Os genes vir e suas funções na transferência de T-DNA são conhecidos na técnica e são, por exemplo, resumidos no livro de Slater e outros., Planta Biotechnology, 2a edição; Oxford University Press, 2008; ver também Hellens e outros., Trends in Planta Science 5 (2000) 446-451.

[0075] A cepa CryX da presente invenção é uma cepa binária, istoé, os genes vir requeridos para transferência de T-DNA em células de planta e o T-DNA estão em plasmídeos separados (ver, por exemplo, o livro de Slater e outros., e o artigo de Hellens e outros, que se relaciona a cepas de Agrobacterium binária e sistemas de vetor). No contexto de uma cepa de Agrobacterium binária, o plasmídeo contendo os genes vir é referido aqui como "plasmídeo vir", ou "plasmídeo auxiliador vir". O plasmídeo contendo o T-DNA a ser transfectado é referido como "vetor" ou "vetor binário". O termo "cepa" ou cepa "Agrobacterium" se relaciona a componentes do Agrobacterium outro do que o vetor binário. Desse modo, aqui, uma cepa de Agrobacterium binária não contendo um vetor binário e após introdução de um vetor binário, são referidos pelo mesmo nome da cepa. A cepa CryX depositada contém um plasmídeo vir, mas não contém um vetor binário.

[0076] A invenção também se relaciona a cepas derivadas da cepaCryX. Em uma modalidade (i), uma cepa derivada da cepa CryX tem o antecedente cromossômico da cepa CryX. Ela pode ter o mesmo cromossomo como CryX. Em outra modalidade (ii), uma cepa derivada da cepa CryX contém o plasmídeo vir da cepa CryX. Em uma outra modalidade (iii), uma cepa derivada da cepa CryX contém um derivado do plasmídeo vir da cepa CryX, e pode ter o cromossomo da cepa CryX. Na modalidade (ii), a cepa é uma cepa binária, e é usada nos processos da invenção após introdução de um vetor binário contendo um T-DNA de interesse. Nas modalidades (i) e (iii), as cepas podem ser cepa binárias. Se elas são cepas binárias, elas são usadas nos processos da invenção após introdução de um vetor binário contendo um T-DNA de interesse. Alternativamente, nas modalidades (i) e (iii), o T-DNA a ser transferido nas células de planta nos processos da invenção pode ser inserido no plasmídeo vir, tal que os genes vir e o T-DNA estão presentes em uma e a mesma molécula de plasmídeo. Contudo, é geralmente mais conveniente e, desse modo, preferido, usar cepas binárias.

[0077] O termo "antecedente cromossômico" é um termo padrão natécnica de transformação ou transfecção de Agrobacterium (cf. Hellens e outros., Trends in Plant Science 5 (2000) 446-451). Ele se relaciona a material genético de referida cepa Agrobacterium outra do que os plasmídeos Ti, plasmídeos auxiliadores vir, e vetores binários. Em uma modalidade, uma cepa derivada da cepa CryX tem o mesmo cromossomo como cepa CryX. Uma cepa derivada tendo o antecedente cromossômico da cepa CryX pode diferir de CryX, por exemplo, no plasmídeo vir, comparado ao plasmídeo vir de CryX. Desse modo, uma cepa derivada da cepa CryX pode conter um plasmídeo vir que é um derivado do plasmídeo vir da cepa CryX.

[0078] Se uma dada cepa Agrobacterium que tem um cromossomoé não idêntica àquela da cepa CryX que tem um antecedente cromossômico da cepa CryX pode ser testada experimentalmente por comparação da eficiência de transferência de T-DNA (ou eficiência de transfecção) de um vetor binário contendo T-DNA da cepa CryX com a cepa a ser testada que contém o plasmídeo vir de CryX e o mesmo vetor binário. A cepa a ser testada é considerada tendo o antecedente cromossômico de CryX se ela alcança pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80% da eficiência de transferência de T-DNA da cepa CryX. As eficiências de transfecção podem ser determinadas conforme descrito no Exemplo 2. Alternativamente, as eficiências de transfecção podem ser determinadas como no Exemplo 2, mas usando um vetor binário que codifica um replicon TMV-viral não capaz de movimento célula a célula, tal como pNMD570. A eficiência de transferência de T- DNA pode também ser determinada por contagem de protoplasto conforme descrito no WO 2005049839. Em uma modalidade, o cromossomo de uma cepa de Agrobacterium tendo o antecedente cromossômico da cepa CryX tem um cromossomo que é o mesmo na sequência base conforme aquele da cepa CryX.

[0079] Um derivado do plasmídeo vir da cepa CryX alcança, quandopresente em células de Agrobacterium tendo o mesmo cromossomo como cepa CryX, uma eficiência similar de transferência de T-DNA em células de planta de um vetor binário contendo T-DNA presente nestas células. Para esta proposta, o plasmídeo vir derivado tem uma região vir suficientemente similar àquela do plasmídeo vir da cepa CryX. O plasmídeo vir derivado pode codificar a proteína virG da cepa CryX, ou uma proteína virG proximamente relacionada. Preferivelmente, o plasmídeo vir derivado contém o gene virG da cepa CryX. Em uma modalidade, o plasmídeo vir derivado contém genes que codificam pelo menos duas das seguintes proteínas de virulência de CryX: VirA, VirG, VirB1-BirB11, VirC1, VirD1, VirD2, VirD4, VirE1, VirE2, VirF e VirJ. Em uma outra modalidade, um plasmídeo vir derivado contém pelo menos os genes que codificam as seguintes proteínas de virulência de CryX: VirA, VirG, VirD2 e VirE2. Em uma outra modalidade, um plasmídeo vir derivado contém a região vir completa, isto é, todos os genes vir do plasmídeo vir da cepa CryX. O plasmídeo vir derivado pode diferir no suporte de plasmídeo a partir do plasmídeo vir de CryX. Por exemplo, o plasmídeo vir derivado pode ter um gene marcador seletivo diferente ou adicional, ou pode ter porções de ácido nucléico adicionalmente anuladas do lado externo da região vir. Em uma modalidade, o plasmídeo vir derivado é pKYRT1 (US 5.929.306), notavelmente se a cepa derivada tem o mesmo cromossomo como CryX.

[0080] Se um dado plasmídeo vir é um plasmídeo vir derivado nosentido da presente invenção pode ser testado experimentalmente por comparação da eficiência de transferência de T-DNA de um vetor binário contendo T-DNA entre Agrobacterium da cepa CryX e Agrobacterium tendo o cromossomo da cepa CryX, mas o plasmídeo vir a ser testado sob, de outro modo, condições idênticas. Em uma modalidade, o Agrobacterium contendo um plasmídeo derivado de acordo com a invenção alcança pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% da eficiência de transferência de T-DNA da cepa CryX. As eficiências de transfecção podem ser determinadas conforme descrito no Exemplo 2, e conforme mencionado acima.

[0081] "Proteína virG proximamente relacionada" para a proteínavirG de CryX significa uma proteína virG que difere a partir da proteína virG de CryX em no máximo 3 substituições de aminoácido não conservativas, ou, em no máximo 6, preferivelmente, no máximo 3, substituições de aminoácido conservativas. As substituições de aminoácido não conservativas podem estar nas posições correspondentes às posições 6, 7 ou 106 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 que é uma proteína virG da cepa de Agrobacterium LBA4404, todos os outros resíduos de aminoácido sendo como na SEQ ID NO:1. Em adição, a proteína virG proximamente relacionada pode ter uma substituição de asparagina a aspartato na posição correspondente à posição 54 de SEQ ID NO: 1. As substituições de aminoácido conservativas podem estar em posições 6, 7 e/ou 106 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[0082] Aqui, substituições conservativas são substituições deresíduos de aminoácido dentro de cada um dos seguintes quatro grupos:

[0083] Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr

[0084] Val, Ile, Leu, Met

[0085] Lys, Arg, His

[0086] Phe, Tyr, Trp

[0087] Todas as outras substituições de resíduo de aminoácido sãoconsideradas não conservativas.

[0088] Aqui, um "T-DNA de interesse" é um DNA contendo, entresequências de borda esquerda e direita de T-DNA, uma sequência de DNA de interesse. Um T-DNA de interesse pode estar presente, ou pode ter sido incorporado por subclonagem em um plasmídeo vir, tal como o plasmídeo vir da cepa CryX. Nos processos da invenção, é preferido usar um sistema de vetor binário. Portanto, um T-DNA de interesse está preferivelmente presente, ou terá sido incorporado no vetor binário.

[0089] O vetor binário a ser usado na presente invenção é umamolécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA de interesse a ser transfectada em células de planta. A sequência de DNA tipicamente codifica uma proteína ou um RNA a serem expressos em células das plantas transfectadas. O vetor binário é geralmente produzido por inserção ou clonagem de uma construção de ácido nucléico contendo a sequência de DNA de interesse em um local de clonagem no interior do T-DNA de um vetor binário precursor, conforme geralmente feito em transfecção de planta mediada por Agrobacterium. Após inserção, a construção de ácido nucléico é flanqueado por sequências de borda esquerda e direita de T-DNA para permitir transfecção de referida planta com referido T-DNA. No T-DNA do vetor binário, a sequência de DNA de interesse está presente, tal como para ser expressável nas células de planta. Para esta proposta, a sequência de DNA de interesse está, por exemplo, na referida construção de ácido nucléico, tipicamente sob o controle de um promotor ativo nas células de planta. Exemplos da sequência de DNA de interesse são uma sequência de DNA que codifica um replicon de DNA viral, ou um replicon de RNA viral, ou um gene a ser expresso. O gene pode codificar um RNA de interesse, ou uma proteína de interesse a serem expressos em célula(s) da planta. Também, os replicons virais tipicamente codificam um RNA ou uma proteína de interesse a serem expressos nas plantas. A construção de DNA pode compreender, em adição à sequência de DNA de interesse, outras sequências, tais como sequências regulatórias para expressão da sequência de DNA de interesse. Os vetores binários utilizáveis na invenção são conhecidos aos técnicos no assunto, por exemplo, a partir das referências citadas na introdução, ou dos livros textos em plant biotechnology, tal como Slater, Scott and Fowler, Plant Biotechnology, segunda edição, Oxford University Press, 2008. O vetor binário tipicamente tem um gene de resistência a antibiótico para permitir seleção em bactéria, tal como E. coli.

[0090] Para aumentar a eficiência de transfecção, o vetor bináriopode compreender, fora do T-DNA, um gene virG expressável na referida cepa Agrobacterium. Alternativamente, um plasmídeo adicional pode ser inserido na referida cepa Agrobacterium, onde referido plasmídeo adicional contém um gene virG expressável na referida cepa Agrobacterium (Pazour e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 6941-6945). O gene virG preferivelmente codifica uma proteína virG da cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404, ou uma proteína virG proximamente relacionada. Adicionalmente, a proteína virG pode ter a mutação de N54D na posição correspondente a posição 54 de SEQ ID NO: 1, isto é, a proteína virG da cepa A. tumefaciens LBA4404. A mutação de N54D em uma proteína virG de outra cepa Agroabacterium foi descrita por Jung e outros., Current Microbiology 49 (2004) 334-340.

[0091] A proteína virG proximamente relacionada pode ser

[0092] (i) uma proteína compreendendo pelo menos 235,preferivelmente pelo menos 239 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou da sequência de aminoácido do mutante de N54D da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1; ou

[0093] (ii) uma proteína compreendendo uma sequência deaminoácido tendo não mais do que 3 substituições de aminoácido não conservativas, e não mais do que 10 substituições de aminoácido conservativas da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou o mutante de N54D destas; ou

[0094] (iii) uma proteína compreendendo uma sequência deaminoácido tendo não mais do que 20, preferivelmente não mais do que 10, substituições de aminoácido conservativas da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, ou o mutante de N54D destas.

[0095] Nos itens (ii) e (iii), referida proteína preferivelmente tem umresíduo de asparagina ou aspartato na posição correspondente à posição 54 de SEQ ID NO: 1

[0096] As posições possíveis para as substituições de aminoácidoconservativas nas modalidades acima mencionadas são posições 6, 7, 18, 35, 38, 42, 44, 66, 69, 73, 81, 86, 89, 97, 106, 107, 122, 124, 133, 135, 143, 147, 150, 165, 188, 208, 212, 213, 232, 235, e 238 de SEQ ID NO: 1, enquanto que os resíduos de aminoácido em outras posições são aqueles como em SEQ ID NO:1. As posições possíveis para substituições não conservativas são posições 6, 7 e 106 da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[0097] Nas modalidades no qual forte expressão de uma proteínaou RNA é desejada, ou no qual acúmulo de ácidos nucléicos virais a altas quantidades em células de referida planta e efeitos negativos possíveis na saúde da planta não é um interesse, a construção de ácido nucléico, ou sequência de DNA de interesse, podem codificar um vetor viral de replicação que pode replicar em células de planta. De modo a ser replicante, o vetor viral contém uma origem de replicação que pode ser reconhecida por uma polimerase de ácido nucléico presente em células de planta, tal como pela polimerase viral expressa a partir do replicon. No caso de vetores virais de RNA, os replicons virais podem ser formados por transcrição, sob o controle de um promotor de planta, a partir da construção de DNA após o último ter sido introduzido em núcleo de célula de planta. No caso de replicons virais de DNA, os replicons virais podem ser formados por recombinação entre dois locais de recombinação que flanqueiam a sequência que codifica o replicon viral na construção de DNA, por exemplo, conforme descrito no WO00/17365 e WO 99/22003. Se os replicons virais são codificados pela construção de DNA, os replicons virais de RNA são preferidos. O uso de replicons virais de DNA e RNA foi extensivamente descrito na literatura pelo menos sobre os últimos 15 anos. Alguns exemplos são as seguintes publicações de patente por Icon Genetics: WO2008028661, WO2007137788, WO 2006003018, WO2005071090, WO2005049839, WO02097080, WO02088369 e WO02068664. Um exemplo de vetores virais de DNA são aqueles baseados em geminivírus. Para a presente invenção, os vetores virais ou replicons baseados em vírus de RNA de planta, notavelmente baseados em vírus de RNA de trançado único de mais sentido, são preferidos. Exemplos de tais vetores virais são vírus de mosaico de tabaco (TMV) e potexvírus X (PVX) usados nos exemplos. Os vetores virais à base de potexvírus e sistemas de expressão são descritos em EP2061890. Muitos outros replicons virais de planta são descritos nas publicações de patente acima mencionadas.

[0098] Quando se realiza o processo da invenção, o vetor bináriocontendo no T-DNA a sequência de DNA de interesse pode ser introduzido na cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo vir, ou seu derivado, por métodos convencionais, tal como eletroporação. Uma cultura da cepa contendo o vetor binário é, em seguida, crescida em meio adequado, tipicamente na presença de um agente seletivo para seleção de células de Agrobacterium contendo o vetor binário, e, opcionalmente, subcultivada para produzir a quantidade desejada de uma suspensão aquosa compreendendo as células de Agrobacterium. A suspensão obtida pode ser diluída à concentração desejada com água, um tampão ou meio adequados, e ser usada para transfecção de uma planta ou folhas na planta. Alternativamente, se o T-DNA é parte do plasmídeo vir, o plasmídeo vir contendo T-DNA é introduzido no Agrobacterium por métodos convencionais, tal como eletroporação, e adicionalmente tratado conforme descrito para o sistema binário.

[0099] Nos processos da invenção, transfecção in planta é usada.In planta significa que os processos são realizados em plantas vivas inteiras após o estágio de muda, preferivelmente nas plantas completamente desenvolvidas, preferivelmente do que nos tecidos ou órgãos de planta excisados ou in vitro. Preferivelmente, o processo é aplicado a muitas plantas em paralelo, tal como plantas em crescimento em um campo.

[00100] Referidas plantas podem ser contatadas com a suspensãode células de Agrobacterium por infiltração, com ou sem aplicação de vácuo. Em uma modalidade, notavelmente quando aplicadas a plantas múltiplas em paralelo, as plantas podem ser contatas com a suspensão por pulverização. A suspensão aquosa usada nos processos da invenção pode ter uma concentração de células de Agrobacterium de, no máximo, 1,1-x 109 cfu/mL, que corresponde aproximadamente a uma cultura de Agrobacterium em meio LB de uma densidade ótica a 600 nm de 1. Devido à alta eficiência de transfecção alcançada na invenção, concentrações muito baixas podem, contudo, serem usadas, que permite tratamento de muitas plantas, tais como campos agrícolas completos sem a necessidade de fermentadores enormes para produção de Agrobacterium. Desse modo, a concentração é preferivelmente, no máximo, 2,2^x 107 cfu/mL, mais preferivelmente, no máximo, 1,1-x 107 cfu/mL, mais preferivelmente, no máximo, 4,4 x^106 cfu/mL. Em uma modalidade, a concentração é, no máximo, 1,1-x 106 cfu/mL da suspensão. Em uma outra modalidade, a concentração é, no máximo, 4,4 x^105 cfu/mL da suspensão, e, em uma outra modalidade, a concentração é, no máximo, 1,1-x 105 cfu/mL da suspensão.

[00101] Para evitar a determinação de concentrações de célula em termos de cfu/mL, concentrações de suspensões agrobacterianas são frequentemente avaliadas por medição da densidade ótica aparente a 600 nm usando um espectrofotômetro. Aqui, a concentração de 1,1-x 107 cfu/mL corresponde a uma densidade ótica calculada a 600 nm de 0,01, pelo que a densidade ótica calculada é definida por uma diluição de 100 vezes com água ou tampão de uma suspensão tendo uma densidade ótica de 1,0 a 600 nm. Similarmente, as concentrações de 4,4 /• 106 cfu/mL, 1,1 x^106 cfu/mL, 4,4 /• 105 cfu/mL e 1,1 x^105 cfu/mL da suspensão, corresponde a uma densidade ótica calculada a 600 nm de 0,004, 0,001, 0,0004, e 0,0001 respectivamente, pelo que asdensidades óticas calculadas são definidas por uma diluição de 250 vezes, 1000 vezes, 2500 vezes, ou 10000 vezes, respectivamente, com água ou tampão de uma suspensão tendo uma densidade ótica de 1,0 a 600 nm.

[00102] Desse modo, em uma modalidade particularmente preferida, a invenção proporciona um processo, e suspensão de célula de Agrobacterium deste, de expressar transientemente uma sequência de DNA de interesse em uma planta, compreendendo contatar referida planta, ou referidas folhas em referida planta, com uma suspensão compreendendo células de Agrobacterium da cepa CryX, ou uma cepa derivada da cepa CryX, no qual referida cepa derivada tem o antecedente cromossômico da cepa CryX, ou referida cepa derivada contém o plasmídeo vir da cepa CryX, ou um derivado de referido plasmídeo vir, no qual referida suspensão tem qualquer das concentrações máximas de Agrobacterium de célula mencionadas em qualquer um dos dois parágrafos precedentes. Nesta modalidade, a cepa de Agrobacterium é preferivelmente uma cepa binária contendo um vetor binário que compreende um gene virG expressável na referida cepa CryX, ou referida cepa derivada. Referido gene virG pode codificar uma proteína virG da cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 de SEQ ID NO: 1, ou é um mutante de N54D da proteína virG codificada pelo gene virG da cepa de A. tumefaciens LBA4404.

[00103] É possível incluir um abrasivo na suspensão para aumentar a eficiência de transfecção. O abrasivo é um material em partículas que é essencialmente insolúvel na suspensão aquosa de células de Agrobacterium. O abrasivo é acreditado enfraquecer, notavelmente se usado junto com um agente de umedecimento, a superfície de um tecido de planta, tal como folhas, e, desse modo, facilita a penetração de células de Agrobacterium no espaço intercelular do tecido de planta. Com relação ao possível abrasivo utilizável na presente invenção, tamanhos de partícula deste, concentrações e produtos comerciais possíveis, referência é feita ao pedido de patente Internacional publicado como WO 2012/019669 e descrição relacionada a abrasivos desta publicação é aqui incorporada.

[00104] A suspensão aquosa da invenção pode conter um adjuvante de pulverização agrícola. O adjuvante de pulverização pode ser um tensoativo ou agente de umedecimento. O tensoativo e agente de umedecimento têm vantagens múltiplas na presente invenção. Eles reduzem a tensão superficial da água da suspensão aquosa, e tornam a superfície cerosa das folhas de planta mais permeáveis para agrobactéria. Eles adicionalmente aperfeiçoam a estabilidade da suspensão e reduzem o assentamento do abrasivo na suspensão. Os tensoativos utilizáveis nos processos da presente invenção não são particularmente limitados, e são descritos no pedido de patente Internacional publicado como WO 2012/019669. Os tensoativos preferidos são tensoativos não iônicos de um valor HLB de 12 ou maior, preferivelmente pelo menos 13. Como tensoativos não iônicos, tensoativos de organossilicone, tal como polialquilenóxido heptametiltrisiloxano modificado, são mais preferidos na presente invenção. Um produto comercial é adjuvante de pulverização Silwet L77™ de GE Advanced Materials.

[00105] Os tensoativos, tais como aqueles descritos no WO2012/019669, podem ser usados unicamente, ou em combinação de dois ou mais tensoativos. Notavelmente, os tensoativos de organossilicone preferidos podem ser combinados com outros tensoativos. A concentração total de tensoativos na suspensão aquosa da invenção pode ser facilmente testada por condução de experimentos de pulverização comparativos, similarmente conforme feito nos exemplos. Contudo, em geral, a concentração total de tensoativos pode ser entre 0,005 e 2 volume-%, preferivelmente entre 0,01 e 0,5 volume- %, mais preferivelmente entre 0,025 e 0,2 volume-% de referida suspensão. Desde que a densidade dos tensoativos é geralmente próxima a 1,0 g/mL, a concentração total de tensoativos pode ser definida como sendo entre 0,05 e 20 g por litro de referida suspensão, preferivelmente entre 0,1 e 5,0 g, mais preferivelmente entre 0,25 e 2,0 g por litro de referida suspensão (incluindo abrasivo). Se os tensoativos de organossilicone acima, tal como polialquilenóxido heptametiltrisiloxano modificado, são usados, a concentração do tensoativo de organossilicone na suspensão agrobacteriana usada para pulverização pode ser entre 0,01 e 0,5 volume-%, preferivelmente entre 0,05 e 0,2 volume-%. Alternativamente, a concentração do tensoativo de organossilicone na suspensão agrobacteriana usada para pulverização pode ser definida como sendo entre 0,1 e 5,0 g, preferivelmente entre 0,5 e 2,0 g por litro de referida suspensão.

[00106] De modo a aperfeiçoar as propriedades físicas da suspensão aquosa, é possível adicionar ácido silícico de tamanho de submícron altamente disperso (sílica), ou polímeros porosos, tal como condensado de ureia/formaldeído (Pergopak™). Notavelmente, onde o tamanho de partícula médio do abrasivo é entre 0,1 e 30 μm, ou em uma das subfaixas preferidas dos acima, é possível adicionar uma sílica de tamanho de submícron altamente dispersa à suspensão. Aqui, uma sílica de tamanho de a submícron é sílica tendo um tamanho de partícula médio entre 0,01 e 0,5 μm, preferivelmente entre 0,02 e 0,5 μm, mais preferivelmente, entre 0,02 e 0,1 μm. O ácido silícico altamente disperso, tal como Hi-Sil™ 233 (PPG Industries), pode contribuir para as propriedades abrasivas da suspensão aquosa (ver Jensen e outros., Bull. Org. mond. Sante, Bull. Wld Hlth Org. 41 (1969) 937-940). Estes agentes podem ser incorporados em uma quantidade de a partir de 1 a 10 g por litro da suspensão da invenção.

[00107] Aditivos adicionais possíveis para a suspensão agrobacteriana são substâncias tampão para manter o pH da suspensão usada para pulverização a um pH desejado, tipicamente entre 4,5 e 6,5, preferivelmente entre 5,0 e 5,5. Adicionalmente, sais solúveis inorgânicos, tal como cloreto de sódio, podem ser adicionados para ajustar a resistência iônica da suspensão. Caldo de nutriente, tal como meio LB, pode também estar contido na suspensão.

[00108] A suspensão aquosa para contato com plantas pode ser produzida conforme segue. Em um método, a cepa de Agrobacterium, ou células contendo o vetor binário desejado a ser usado no processo da invenção, é inoculado no meio de cultura, e crescido a uma alta concentração de célula. Culturas maiores podem ser inoculadas com pequenos volumes de um meio de cultura altamente concentrado para obtenção de grandes quantidades do meio de cultura. As agrobactérias são geralmente crescidas até uma concentração de célula correspondente a um OD a 600 nm de pelo menos 1, tipicamente de cerca de 1,5. As suspensões agrobacterianas altamente concentradas são, em seguida, diluídas, para alcançar a concentração de célula desejada. Para diluição das suspensões agrobacterianas altamente concentradas, água é usada. A água pode conter um tampão. A água pode, adicionalmente, conter o tensoativo da invenção. Alternativamente, as suspensões agrobacterianas concentradas podem ser diluídas com água, e quaisquer aditivos, tais como tensoativo e a substância tampão opcional, são adicionados após ou durante o processo de diluição. O abrasivo pode ser adicionado antes, durante ou após diluição. É, contudo, preferido agitar a suspensão durante a adição do abrasivo para dispersar uniformemente o abrasivo na suspensão agrobacteriana. A etapa de diluição da suspensão agrobacteriana concentrada pode ser efetuada no tanque de pulverização do pulverizador usado para pulverização das suspensões diluídas.

[00109] Referidas plantas, notavelmente folhas na referida planta, são, em seguida, contatadas com a suspensão de células de Agrobacterium para efetuar a transfecção transiente de células da planta. Conforme explanado acima, o contato pode ser feito por pulverização. O pulverizador a ser usado no processo da invenção depende principalmente do número de plantas, ou da área a ser pulverizada. Para uma ou um pequeno número de plantas a serem pulverizadas, pulverizadores de bomba, conforme amplamente usados em residências e jardinagem, podem ser usados. Estes podem ter volumes do tanque de pulverização de entre 0,5 e 2 litros. Para aplicações em uma média escala, pulverizadores hidráulicos manualmente operados, tais como pulverizadores "knapsack" operados por alavanca, ou pulverizadores de compressão manualmente operados, podem ser usados. Contudo, a alta eficiência de transfecção alcançada na invenção tem seu potencial total na transfecção de muitas plantas, tal como plantas que crescem em campo agrícola ou em uma estufa. Para esta proposta, pulverizadores hidráulicos operados por energia, tais como pulverizadores hidráulicos montados em trator, equipados com barras de pulverização, podem ser usados. Técnicas de aplicação aérea usando helicópteros ou aeroplanos são também possíveis para grandes campos. Todos estes tipos de pulverizadores são conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, no livro "Pesticide Application Methods" por G.A. Matthews, terceira edição, Blackwell Science, 2000. De modo a assegurar uma suspensão homogênea nos tanques de pulverização dos pulverizadores, pulverizadores de tamanho pequeno ou médio podem ser oscilados em intervalos regulares, ou continuamente durante pulverização. Pulverizadores grandes, tais como pulverizadores montados em trator, devem ser equipados com um agitador no tanque de pulverização.

[00110] Considerando-se a presença de células de agrobacteriana e abrasivo nas suspensões a serem pulverizadas, os pulverizadores usados na invenção devem produzir pulverização de um tamanho de gotícula pelo menos de pulverização fina. Também, pulverização média ou pulverização grosseira na classificação de pulverizações usadas em "Pesticide Application Methods" por G.A. Matthews, terceira edição, Blackwell Science, 2000, página 74, pode ser usada. A proposta principal da pulverização na invenção é o umedecimento do tecido de planta com a suspensão. Desse modo, o tamanho de gotícula exato não é crítico. Contudo, a eficiência de transfecção pode ser adicionalmente aperfeiçoada pela provisão da pulverização nas superfícies da planta com pressão aumentada.

[00111] No processo da invenção, pelo menos partes de plantas são pulverizadas. Em uma modalidade importante, as plantas que crescem no solo em um campo são pulverizadas, isto é, as plantas que não crescem em potes ou recipientes móveis. Tais plantas não podem ser viradas de cabeça para baixo e imersas em suspensão agrobacteriana para infiltração a vácuo. Pelo menos partes de plantas são pulverizadas, tais como folhas. Preferivelmente, muitas folhas são pulverizadas, ou plantas inteiras.

[00112] A presente invenção é usada para transfecção transiente de plantas, ou para transiente com uma sequência de DNA de interesse que pode, em seguida, ser transientemente expressa. O termo "transiente" significa que nenhum método de seleção é usado para seleção de células ou plantas transfectadas com a sequência de DNA de interesse no antecedente de células não transfectadas ou plantas usando, por exemplo, agentes selecionáveis e genes marcadores selecionáveis capazes de detoxificação dos agentes selecionáveis. Como um resultado, a sequência de DNA de interesse transfectada é geralmente não estavelmente introduzida em DNA cromossômico da planta. Ao invés, métodos transientes fazem uso do efeito de transfecção nas plantas muito transfectadas.

[00113] A invenção é geralmente usada para transfecção de plantas multicelulares, notavelmente, plantas mais altas. Ambas planta monocotiledônea e planta dicotiledônea podem ser transfectadas, onde as plantas dicotiledôneas são preferidas. As plantas para o uso nesta invenção incluem qualquer espécie de planta com preferência dada a espécies de cultivo agronomicamente e horticulturalmente importantes. As plantas de cultivo comum para o uso na presente invenção incluem plantas de alfafa, cevada, feijões, canola, ervilhas, algodão, milho, trevo, lótus, lentilhas, tremoço, painço, aveias, ervilhas, amendoins, arroz, centeio, trevo doce, girassol, ervilha doce, soja, sorgo, triticale, inhames, feijões veludo, ervilhaca, trigo, glicínia e noz. As espécies de planta preferidas para prática desta invenção incluem, mas não são restritas a, representativas de Gramineae, Compositeae, Solanaceae e Rosaceae.

[00114] As espécies adicionalmente preferidas para uso nesta invenção são plantas a partir dos seguintes gêneros: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glicina, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, e o Olyreae, o Pharoideae, e outros.

[00115] Preferivelmente, os processos da invenção são aplicados à planta dicotiledônea, tal como Nicotiana benthamiana, tabaco, algodão, soja, colza, pimenta, batata ou tomate.

[00116] Em uma modalidade, o processo da invenção pode ser usado para produção de uma proteína de interesse em uma planta, ou em muitas plantas que crescem em um campo. Para esta proposta, as plantas podem ser pulverizadas com a suspensão compreendendo as células de Agrobacterium contendo o vetor binário desejado a um estado de crescimento desejado das plantas. Se o objetivo principal é alcançar os níveis de expressão mais altos possíveis, seguido por coleta de plantas para obtenção de material contendo altas quantidades da proteína, vetores virais podem ser usados, visto que eles geralmente dão os níveis de expressão mais altos.

[00117] Em outra modalidade, o processo da invenção é usado para gerar ou alterar um traço em uma planta, tal como um traço de entrada. Nesta modalidade, expressão excessiva de uma proteína, ou RNA de interesse, pode não ser desejada para evitar efeitos nocivos na saúde da planta. Para tais modalidades, vetores não replicantes (também referidos aqui como "vetores transcricionais"), isto é, vetores que carecem de uma origem funcional de replicação reconhecida por uma polimerase de ácido nucléico presente nas células de planta, são preferidos. Outra aplicação da invenção é expressão de RNA, por exemplo, para interferência de RNA, no qual o sinal de interferência pode se difundir na planta de células tendo expressas o sinal para outras células. Um exemplo é o alvo de DNA viral indesejado em plantas conforme descrito por Pooggin em Nat. Biotech. 21 (2003) 131. Um exemplo de silenciamento de oncogene que pode ser adaptado a um sistema transiente é descrito por Escobar e outros. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 13437-13442. Um exemplo adicional é o controle de pestes de inseto coleóptero através da interferência de RNA similar, conforme descrito por Baum e outros., Nat. Biotech. 25 (2007) 13221326, que pode ser adaptado ao processo transiente da invenção por plantas infestadas de peste transientemente transfectantes com uma sequência de DNA de interesse que codifica os dsRNA, tal que ela pode ser expressa. Métodos adicionais aplicáveis ao processo transiente da invenção são aqueles descritos por Huang e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 14302-14306; Chuang e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 4985-4990.

[00118] Adicionalmente, o processo da invenção permite alterar a um ponto desejado em tempo traços relacionados à regulação de tempo de florescimento ou formação de fruto, tal como tuberização em batata (Martinez-Garcia e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 1521115216), ou a regulação da trajetória de flavonoide usando um fator de transcrição (Deluc e outros., Plant Physiol. 147 (2008) 2041-2053). O florescimento pode ser induzido por expressão transientemente da proteína de florigen móvel FT (Zeevaart, Current Opinion in Plant Biology 11 (2008) 541-547; Corbesier e outros., Science 316 (2007) 1030-1033). Os frutos partenocárpicos em tomates podem ser produzidos em uma grande escala usando a invenção e o método descrito por Pandolfini e outros., BMC Biotechnology 2 (2002).Aplicações adicionais da invenção são, no contexto de alterar desenvolvimento de fibra de algodão por meio de fatores de transcrição de MYB, conforme descrito por Lee e outros., Annals of Botany 100 (2007) 1391-1401, ou ativação de genes defensivos de planta (Bergey e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 12053-12058.

[00119] A invenção também proporciona um processo de proteção de plantas de cultivo em um campo de uma peste. Em tal processo, a infestação de pelo menos uma das plantas de uma pluralidade de plantas que crescem em um lote ou campo agrícola, pode ser determinada. Devido à rapidez do processo da invenção, a expressão de uma proteína ou RNA prejudicial à peste necessita ser causada somente se infestação pela peste é determinada. Desse modo, expressão forte e constitutiva de toxinas de peste ou dsRNA para RNAi, mesmo na ausência de um risco de infestação, não é necessária. A expressão transiente de endotoxinas de Bacillus thuringiensis após a pulverização com culturas agrobacterianas diluídas que abrigam plantas Nicotiana benthamiana protegidas de vetores de expressão à base de PVX correspondentes de dano de alimentação por larvas do mandarovás de tabaco Manduca sexta (cf. Fig. 30 de WO 2012/019660).

EXEMPLOS

[00120] Exemplo de referência 1: Determinação de concentração de célula de Agrobacterium em cultura líquida em termos de unidades formadoras de colônias (cfu)

[00121] A concentração de células de Agrobacterium em suspensão líquida em termos de unidades formadoras de colônias por ml (cfu/mL) de suspensões líquidas pode ser determinada usando o seguinte protocolo. As células da cepa de Agrobacterium tumefaciens ICF 320 transformadas com construção pNMD620 foram crescidas em 7,5 ml de meio de LBS líquido contendo 25 mg/L de canamicina (AppliChem, A1493) e 50 mg/L de rifampicina (Carl Roth, 4163.2). A cultura bacteriana foi incubada a 28°C com oscilação contínua. A absorvência ou densidade ótica de cultura bacteriana expressa nas unidades de absorvência (AU), foi monitorada em alíquotas de 1 ml da cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm de comprimento de onda (OD600). A concentração de célula estimada como um número de unidades formadoras de colônias por mililitro de cultura líquida (cfu/mL), pode ser analisada em valores de OD600 1; 1,3; 1,5; 1,7 e 1,8. Para esta proposta, alíquotas de 250 μL de cultura líquida foram diluídas com meio de LBS para alcançar um volume final de 25 ml (diluição 1:100). 2,5 ml de tal diluição 1:100 foram misturados com 22,5 ml de LBS para alcançar a diluição 1:1000. As diluições de cultura líquida 1:100; 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000; 1:1.000.000; 1:10.000.000 e1:100.000.000, foram preparadas similarmente. As alíquotas das últimas três diluições foram difundidas em meio de LBS solidificado por ágar suplementado com 25 mg/L de canamicina e 50 mg/L de rifampicina (250 μL de cultura bacteriana por placa de 90 mm de diâmetro). A colocação de alíquotas para cada diluição foi realizada em triplicata. Após 2 dias de incubação a 28°C, as colônias bacterianas foram contadas para cada placa. A colocação de diluições 1: 1.000.000 e 1:10.000.000 resultou em poucas centenas e poucas dúzias de colônias por placa, respectivamente. Na medida em que diluição de 1:100,000,000 proporciona apenas poucas colônias por placa, esta diluição não foi usada para cálculo de concentração de célula. A concentração de célula foi estimada de acordo com a fórmula: cfu/mL = 4 x número de colônias por placa x fator de diluição.

[00122] Para transformação de concentrações de célula, conforme medida por medições de absorvência a 600 nm (em meio de LB) e, em termos de unidades de formação de célula, a seguinte relação é usada aqui: um OD600 de 1,0 corresponde a 1,1 x109 cfu/mL.

[00123] Meio de LBS (líquido)

[00124] 1% de peptona de soja (hidrolisato de papáica de carne desoja; Duchefa, S1330)

[00125] 0,5% de extrato de levedura (Duchefa, Y1333)

[00126] 1% de cloreto de sódio (Carl Roth, 9265.2) dissolvido em água, e o pH é ajustado a pH 7,5 com NaOH 1M (Carl Roth, 6771.2)

[00127] Para preparar o meio de LBS sólido, o meio de LBS líquido foi suplementado com 1,5% de ágar (Carl Roth, 2266.2). Os meios foram autoclavados a 121°C por 20 min.Exemplo 1: Vetores usados nos seguintes Exemplos

[00128] Neste estudo foram usados TMV- e vetores virais à base de PVX, bem como vetores transcricionais padrões baseados em promotor de 35S CaMV.

[00129] Os vetores à base de TMV com capacidade de movimento célula a célula pNMD560, pNMD062, pNMD063 e pNMD064 (Fig. 1A) foram criados na base de vetores descritos em Marillonnet e outros. (2006). Todos estes vetores são designados para a expressão de GFP como um gene repórter; eles contêm a inserção de uma sequência de codificação de sGFP que é proteína fluorescente verde modificada (GFP) de peixe em geleia Aequorea victoria (N° de acesso no Banco de Gene EF030489). A construção de pNMD560 contém, na ordem sequencial, um fragmento a partir do promotor de actina 2 de Arabidopsis (ACT2) (N° de acesso no Banco de Gene AB026654); a extremidade 5‘ de TVCV (N° de acesso no Banco de Gene BRU03387, pares bases 1-5455), e um fragmento de cr-TMV [N° de acesso no Banco de Gene Z29370, pares bases 5457-5677, ambos juntos contendo 16 inserções de íntron]; uma sequência de codificação sGFP; região não traduzida cr-TMV 3‘ (3‘ NTR; N° de acesso no Banco de Gene Z29370), e o terminador de sintase de nopalina (Nos). O fragmento inteiro foi clonado entre as bordas esquerda e direita de T-DNA de vetor binário.

[00130] O plasmídeo de pNMD062 foi criado na base de construção de pNMD560. Para esta proposta, um fragmento de DNA compreendendo a sequência de codificação e uma região genômica a montante 5’ de um gene virG de plasmídeo de Ti tipo octopina da cepa de LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (N° de acesso no Banco de Gene AF242881.1, pares bases 160603-161600) flanqueados pela sequência ctgtcgatc a partir do 5’-terminal e a sequência aagatcgacag (SEQ ID NO: 8) a partir do 3’ terminal, foi amplificada por PCR e inserida no suporte de plasmídeo usando local de restrição de AfeI.

[00131] A construção de pNMD063 foi idêntico ao pNMD062, exceto para a mutação de N54D.

[00132] Para criar a construção de pNMD064, um fragmento de DNA compreendendo a sequência de codificação contendo a mutação de N54D e região genômica a montante 5’ de gene virG de plasmídeo de Ti tipo nopalina da cepa de GV3101 de Agrobacterium tumefaciens (N° de acesso no Banco de Gene AE007871.2, pares bases 194307193333) foi amplificada por PCR, e inserida no suporte de plasmídeo de construção de pNMD560 usando o local de restrição de AfeI.

[00133] A construção de pNMD570 (vetores à base de TMV carecendo de capacidade de movimento célula a célula) foi idêntico ao pNMD560, exceto para uma mutação de ponto na sequência de codificação de MP que conduz a uma alteração de estrutura de leitura que distorce a translação de MP (Fig. 1A).

[00134] A construção de pNMD620, um vetor à base de PVX sem capacidades de movimento célula a célula e sistêmico para expressão de GFP, contém, na ordem sequencial, um promotor de 35S CaMV, sequências de codificação da polimerase de RNA dependente de RNA, módulos de bloco de gene triplo compreendendo 25kDa, 12 kDa e 8 kDa de proteínas, uma sequência de codificação de sGFP, e uma 3’-região não transladada. O fragmento completo foi clonado entre as bordas esquerda e direita de T-DNA de vetor binário (Fig. 1B).

[00135] Todos os vetores transcricionais foram criados na base de pICBV10, um vetor binário derivado de pBIN19 (Marillonnet e outros., 2004, 2006). Eles contêm dois cassetes de expressão inseridos dentro das bordas direita e esquerda da mesma região de T-DNA (Fig. 1B). No caso da construção de pNMD1971, um cassete de expressão adjacente à borda direita compreendido, na ordem sequencial, do promotor de Vírus de mosaico de couve-flor (CAMV) 35S, intensificador translacional ômega de Vírus de Mosaico de Tabaco, sequência de codificação de beta-glucuronidase de Escherichia coli (N° de acesso no Banco de Gene S69414) contendo o intron de gene Petunia hybrids PSK7 (N° de acesso no Banco de Gene AJ224165.1, pares bases 4411-4484), e o terminador a partir do gene sintase nopalina de Agrobacterium tumefaciens. O segundo cassete de expressão foi inserido entre a primeira uma e a borda esquerda de T-DNA. Ele contém, na ordem sequencial, o promotor de vírus de mosaico de couve-flor (CAMV) 35S, intensificador translacional ômega do Vírus de Mosaico de Tabaco, sequência de codificação de supressor de P19 de silenciamento de Virus de Enfezamento Vermelho do Tomate (TBSV) (N° de acesso no Banco de Gene CAB56483.1), e terminador de gene de sintase octopina de Agrobacterium tumefaciens.

[00136] A construção de pNMD2180 foi criado na base do vetor de pNMD1971. Para esta proposta, o fragmento de NotI/NdeI da construção de pNMD1971 foi substituido com o mesmo fragmento de construção de pNMD064 contendo gene virGN54D de plasmideo de Ti tipo nopalina da cepa de GV3101 de Agrobacterium tumefaciens flanqueado pela região genômica a montante 5’.

[00137] O pNMD2190 foi criado em um modo similar. O fragmento de NotI/NdeI de construção de pNMD1971 foi substituido com o mesmo fragmento de vetor de pNMD063 contendo gene virGN54D de plasmideo de Ti tipo octopina da cepa de LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens flanqueado por região genômica a montante 5’.Exemplo 2: Cepa CryX mostra transfecção transiente mais forte de Nicotiana benthamiana se comparada com cepas de Agrobacterium tumefaciens comumente usadas

[00138] Foi testado o número das cepas de Agrobacterium tumefaciens incluindo AGL1, EHA105, GV3101, ICF320, CryX,LBA4404 e LBA9402, para a transfecção transiente de plantas Nicotiana benthamiana. Para esta proposta, folhas de planta foram infiltradas usando uma seringa sem agulha com 10-3 e 10-4 de diluições de OD600 = 1,3 de agroculturas bacterianas das sete cepas acima mencionadas que abrigam um vetor à base de TMV de expressão de GFP capaz de movimento célula a célula (TMV-GFP, construção de pNMD560), conforme é mostrado na Fig. 2A. Em paralelo, as folhas foram infiltradas com diluições de 10-2 e 10-3 das culturas agrobacterianas durante a noite de mesmas cepas, conduzindo vetor à base de TMV que carece de capacidade de movimento célula a célula (TMV(fsMP)-GFP, construção de pNMD570), conforme é mostrado na Fig. 2B.

[00139] Baseado na densidade de pontos de fluorescência e na intensidade de fluorescência de GFP foi comprovada a transfecção transiente eficiente para várias cepas (por exemplo, AGL1, EHA105 e LBA9402); contudo, a eficiência de transfecção transiente da cepa CryX foi significantemente mais alta para ambas construções com todas as diluições testadas de agroculturas bacterianas se comparadas com qualquer outra cepa testada.

[00140] Para proporcionar uma avaliação quantitativa da eficiência de transfecção transiente para a cepa CryX, foi estimada a razão entre o número de células na suspensão bacteriana infiltradas nas folhas e o número de pontos fluorescentes de GFP produzidos, considerados como um evento de transfecção simples. Para esta proposta, folhas de 6 semanas de idade de plantas Nicotiana benthamiana foram infiltradas usando uma seringa sem agulha com 200 μL de agroculturas bacterianas de OD600 = 1,3 diluídas por fatores de diluição de 10-5, 106 e 10-7 com um tampão consistindo de 5 mM de MES, pH 5,3, e 10 mM de MgCl2. Células agrobacterianas de CryX, EHA105, GV3101 e ICF320 conduziram construções de pNMD560 (vetor de TMV-GFP). Para a classificação de células bacterianas, alíquotas de 100 μL de suspensões bacterianas usadas para infiltração de folha foram colocadas em triplicata em placas de LB-ágar contendo 50 μL/L de rifampicina e 50 μL/L de canamicina. As placas foram incubadas por 2 dias a 28°C e, após isto, o número de cfu (unidades formadoras de colônias) foi contado. De acordo com nossa estimativa, 100 μL de culturas bacterianas de CryX, EHA105, GV3101 e ICF320 contêm 7,38+/-1,72, 5,00+/-1,50, 2,53+/-0,87 e 6,17+/-1,37 cfu (Tabela 1). Em paralelo, a 4 dpi de folhas de Nicotiana benthamiana foi classificada para pontos fluorescentes de GFP. Em média, 7,38+/-1,72, 5,00+/-1,50, 2,53+/-0,87 e 6,17+/-1,37 de pontos fluorescentes foram produzidos por 100 μL de diluição de 10-7 de agrocultura bacteriana infiltrada para cepas CryX, EHA105, GV3101 e ICF320, respectivamente. Cada célula agrobacteriana produz 0,46 de local de transfecção para cepa CryX e 0,01 de local de transfecção para todas as outras cepas testadas, a cepa CryX sendo 46 vezes mais eficiente do que as cepas de EHA105, GV3101 e ICF320.

[00141] Tabela 1. Eficiência de transfecção da cepa CryX em comparação com outras cepas a fator de concentração 10-7 de agrocultura bacteriana (construção de pNMD560, 4 dpi).

Exemplo 3. Sobre expressão de gene virG da cepa de LBA4404 aumenta a eficiência de transfecção transiente da cepa CryX

[00142] Foi testada a influência de sobre expressão de genes virG na eficiência de transfecção transiente de várias cepas de Agrobacterium. Para esta proposta, foram criados vetores à base de TMV que conduzem a inserção de genes virG, ou da cepa de GV3101, ou da cepa de LBA4404 em seus suportes de plasmídeo (Fig. 1A). Primeiro, foram testadas cepas de AGL1, EHA105, ICF320 e GV3101 usando vetores que abrigam genes virGN54D das cepas de GV3101 e LBA404 (pNMD063 e pNMD064, respectivamente), bem como um vetor com sequência virG de gene nativo da cepa de LBA4404 (pNMD062). Folhas de Nicotiana benthamiana foram infiltradas usando seringa sem agulha com diluições de 102, 103 e 104 vezes de OD600 = 1,3 deagroculturas bacterianas. Fotografias mostrando fluorescência de GFP na luz uv foram tomadas a 4a (Fig. 3A) e 6a dpi (Fig. 3B). Baseado na avaliação visual, foi demonstrado o aumento específico da cepa da eficiência de transfecção transiente. Conforme é resumido na Tabela 2, a sobre expressão de virGN54D da cepa de GV3101 aumentou a eficiência de transfecção transiente para cepas de GV3101 e ICF320; virGN54D da cepa de LBA4404 aperfeiçoou a eficiência de transfecção transiente das cepas de AGL1, EHA105 e LBA4404.

[00143] A cepa CryX foi testada similarmente, conforme mostrado na Fig. 4. As folhas de Nicotiana benthamiana foram infiltradas usando seringa sem agulha com CryX líquido e agroculturas bacterianas de GV3101 de OD600 = 1,3 10-4 e 10-5 diluídas com tampão para infiltração. Os vetores à base de TMV de expressão de GFP contendo genes virGN54D das cepas de GV3101 e LBA404 no suporte de plasmídeo (pNMD063 e pNMD064, respectivamente) foram comparados com vetor de pNMD560 não contendo inserção de gene virG. A Fig. 4A representa a fluorescência de GFP para a diluição 10-4 a 3 e 4 dpi; A Fig. 4B mostra a fluorescência de GFP para a diluição 10-5 a 4 e 5 dpi. Foi demonstrado um aumento significante de eficiência de transfecção transiente para cepa CryX em combinação com gene virGN54D de LBA4404; em contraste, a sobre expressão de gene virGN54D da cepa de GV3101 tem um impacto negativo na transfecção transiente mediada por CryX.

[00144] Tabela 2. Efeito de sobre expressão de virG na eficiência de transferência de T-DNA

Exemplo 4. CryX em combinações com virGN54D/L BA4404 proporciona transfecção transiente eficiente de Nicotiana benthamiana em até 107 vezes de diluições usando infiltração de folha

[00145] Para encontrar as diluições efetivas máximas de culturas líquidas de CryX para transfecção transiente de plantas de Nicotiana benthamiana, foi realizada infiltração com seringa de folhas com CryX líquido e agroculturas bacterianas de GV3101 de OD600 = 1,3 diluídas a 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 com tampão para infiltração.

[00146] Em nossos experimentos, cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens, em combinação com virGN54D da cepa de LBA4404, proporcionou a transfecção mais eficiente de plantas de Nicotiana benthamiana que já foi observada, resultando no número razoável de pontos de fluorescência mesmo no fator de concentração 10-7 da cultura durante a noite (Fig. 5). Isto permite aumentar a diluição de agrocultura bacteriana usada para infiltração de planta aproximadamente 100 a 1000 vezes, comparada com diluição típica de 103 vezes tipicamente usada no sistema Magnicon®.

[00147] Para proporcionar uma avaliação quantitativa de eficiência de transfecção transiente para cepa CryX, foi estimada a razão entre o número de células na suspensão bacteriana infiltrada em folhas, e o número de pontos fluorescentes de GFP produzidos considerados como um evento de transfecção simples. Para esta proposta, folhas de 6 semanas de idade de plantas de Nicotiana benthamiana foram infiltradas usando seringa sem agulha com 200 μL de agroculturas bacterianas de OD600 = 1,3 diluídas 10-7 com um tampão aquoso contendo 5 mM de MES, pH 5,3, e 10 mM de MgCl2. As células agrobacterianas de CryX conduzem construções pNMD560 (vetor de TMV-GFP) e pNMD062 (vetor de TMV-GFP contendo virGN54D da cepa de LBA4404 no suporte de plasmídeo). Para classificação de células bacterianas, alíquotas de 100 μL de suspensões bacterianas usadas para infiltração de folha foram colocadas em triplicata nas placas de LB-ágar contendo 50μL/L de rifampicina e 50 μL/L de canamicina. As placas foram incubadas por 2 dias a 28°C e, após isto, o número de cfu (unidades formadoras de colônias) foi contado. De acordo com nossa estimativa, 100 μL de culturas bacterianas contêm 14,7+/-4,4 e 13,9+/3,4 cfu para construções de pNMD560 e pNMD062, respectivamente (Tabela 3). Em paralelo a 5 dpi, as folhas de Nicotiana benthamiana foram classificadas para pontos fluorescentes de GFP. Na média, pontos fluorescentes de 16,3+/-1,5 e 24,0+/-0,0 foram produzidos por 100 μL de agrocultura bacteriana infiltrada para construções de pNMD560 e pNMD062, respectivamente. Em outras palavras, cada célula agrobacteriana que abriga a construção de pNMD560 produz cerca de 1,1 locais de transfecção; para a construção de pNMD062, este valor foi mais alto, 1,7, mostrando um aumento da eficiência de transfecção devido á sobre expressão de gene virG.Exemplo 5. Cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens em combinação com virGN54D/L BA4404 mostra eficiência de transfecção de pulverização para soja

[00148] Foi testado o número das cepas de Agrobacterium tumefaciens incluindo AGL1, EHA105, GV3101, ICF320, CryX eLBA4404 para a transfecção transiente de soja Glicina max L. usando pulverização de plantas com suspensão de células agrobacterianas. Para esta proposta, culturas líquidas que abrigam vetores de expressão de GUS foram crescidas para OD600 = 1,3, e diluídas para pulverização com tampão contendo 5 mM de MÊS, pH 5,3; 10 mM de MgCl2 e 0,05% (v/v) de Tween®20 na razão 1:10. Para teste das cepas de AGL1, EHA105, CryX e LBA4404, foi usada construção de pNMD2190 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/LBA4404 no suporte de plasmídeo). As cepas de GV3101 e ICF320 foram testadas com vetor de pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/GV3101 no suporte de plasmídeo). A marcação de folhas para a atividade de GUS foi realizado nos 11 dias pós-pulverização. Comparado a outras cepas testadas que mostraram nenhuma ou pouca transfecção, o CryX proporcionou taxa de transfecção transiente significantemente mais alta, conforme descrito pela marcação de GUS (Fig. 6A).

[00149] Combinando tensoativo e tratamento com abrasivo, foi alcançada a transfecção transiente eficiente de soja com cepa CryX para até diluições de 10-2 de agroculturas bacterianas quando vetor transcricional de expressão de GUS pNMD2190 foi usado (Fig. 6B).Exemplo 6. Cepa CryX de Agrobacterium tumefaciens em combinação com virGN54D/L BA4404 mostra transfecção de pulverização transiente intensificada para algodão

[00150] Foi testada a transfecção transiente de algodão com cepas de EHA105, GV3101, ICF320, e CryX usando pulverização. Para esta proposta, culturas líquidas de Agrobacterium de OD600 = 1,3 foram diluídas na razão 1:10 com tampão contendo 5 mM de MES, pH 5,3; 10 mM de MgCl2 e 0,25% (v/v) de Silwet L-77. A construção de pNMD2180 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/GV3101 no suporte de plasmídeo) foi usado com cepas de GV3101 e ICF320, e pNMD2190 (35S:GUS; 35S:p19 e virGN54D/LBA4404 no suporte de plasmídeo) foi usado com cepas de EHA105 e CryX. A construção de pNMD1971 (35S:GUS; 35S:p19) foi aplicado como um controle com todas as cepas. O teste de marcação de GUS foi realizado nos 6 dias pós pulverização. Após a marcação, poucos pontos azuis foram encontrados para cepas de GV3101 e ICF320 (dados não mostrados). A eficiência de transfecção muito baixa foi mostrada também para cepas de EHA105 e CryX usadas com construção de pNMD1971. Comparado com todas as outras cepas testadas, o CryX em combinação com virGN54D da cepa de LBA4404 (pNMD2190), demonstrou eficiência de transfecção transiente aumentada (Fig. 7).

[00151] Tabela 3. Eficiência de transfecção de CryX em combinação com virGN54D/LBA4404 (construção de pNMD062)

Exemplo 7. Acesso de ICBGE da cepa de Agrobacterium tumefaciens Chry5/KYRT1 mostra transfecção transiente mais forte de Nicotiana benthamiana comparada a acesso da Universidade de Kentucky de mesma cepa

[00152] Foram testados dois acessos da cepa de Agrobacterium tumefaciens Chry5/KYRT1 recebidos de laboratórios diferentes, o laboratório de Dr. G. Collins na Universidade de Kentucky (Lexington, USA), e o acesso a partir do Institute of Cell Biology and Genetics Engineering (ICBGE, Kiev, Ukraine) para a transfecção transiente de plantas de Nicotiana benthamiana. Para esta proposta, as folhas de planta foram infiltradas usando seringa sem agulha com diluições usando fatores de concentração de 10-1, 10-2 e 10-3 de um OD600 = 1,3 de agroculturas bacterianas de ambos acessos da cepa que abrigam vetor à base de TMV de expressão de GFP capaz de movimento célula a célula (TMV-GFP, construção de pNMD560), conforme é mostrado na Fig. 8. Baseado na densidade de pontos de fluorescência e na intensidade de fluorescência de GFP, foi mostrada eficiência de transfecção transiente mais alta para acesso de ICBGE, se comparada com acesso da Universidade de Kentucky.

[00153] O conteúdo do pedido de patente Europeu No. 12 002 402.1, depositado em 3 de abril de 2012, é aqui incorporado por referência em sua totalidade, incluindo descrição, reivindicações, figuras, e listagem de sequência.

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N54 é mostrada em negrito.LKHVLLVDDDVAMRHLIIEYLTIHAFKVTAVADSTQFTRVLSSATVDWVVDLNLGREDGLEIVRNLAAKSDIPIIIISGDRLEETDKWALELGASDFIAKPFSIREFLARIRVALRVRPNWRSKDRRSFCFTDWTLNLRQRRLMSÊAGGEVKLTAGEFNLLLAFLEKPRDVLSREQLLIASRVRDEEVYDRSIDVLILRLRRKLEADPSSPQLIKTARGAGYFFDADVQVSHGGTMAASEQ ID NO: 2: Sequências de região de T-DNA de pNMD560,pNMD062, pNMD063, pNMD064cctgtggttggcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgattattctaataaacgctcttttctcttaggtttacccgc caatatatcctgtcaaacacfgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaatctgatctaagctagcttggaattggtaccacgcgtttcgacaaa atttagaacgaacttaattatgatctcaaatacattgatacatatctcatctagatctaggttatcattatgtaagaaagttttgacgaatatggcacgaca aaatggctagactcgatgtaattggtatctcaactcaacaKatacttataccaaacattagttagacaaaatttaaacaactattttttatgtatgcaaga gtcagcatatgtataattgattcagaatcgttttgacgagttcggatgtagtagtagccattatttaatgtacatactaatcgtgaatagtgaatatgatga aacattgtatcttattgtataaatatccataaacacatcatgaaagacactttctttcacggtctgaattaattatgalacaattctaatagaaaacgaatt 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Claims (5)

1. Processo de transfectar transientemente uma planta ou folhas em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida planta ou as referidas folhas com uma suspensão compreendendo células de Agrobacterium da cepa CryX tendo número de acesso no DSM: DSM25686.

2. Processo de expressar transientemente uma sequência de DNA de interesse em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende contatar a referida planta ou as referidas folhas na referida planta com uma suspensão compreendendo células de Agrobacterium da cepa CryX tendo número de acesso no DSM: DSM25686.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a referida planta ou as referidas folhas em uma planta são contatadas com a referida suspensão por pulverização ou por infiltração a vácuo da referida planta ou das referidas folhas em uma planta com a referida suspensão.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta dicotiledônea, tal como Nicotiana benthamiana, tabaco, algodão, soja, colza, pimenta, batata, tomate, ou uma planta monocotiledônea.

5. Cepa de Agrobacterium, caracterizada pelo fato de que é a cepa CryX tendo número de acesso no DSM: DSM25686.

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