ES2662123T3

ES2662123T3 - Derivados de esterol y uso de los mismos para tratar enfermedades que implican células astrocíticas transformadas o para el tratamiento de hemopatías malignas

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Publication number: ES2662123T3
Application number: ES13729470.8T
Authority: ES
Inventors: Ludovic Clarion; Marcel Mersel; Didier Petite
Original assignee: BETA INNOV
Current assignee: BETA INNOV
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2018-04-05
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: BR112014026948B1; RS54926B1; PT2847204T; RS57065B1; SMT201600215B; SI2847204T1; HUE037004T2; RU2627710C2; HK1191654A1; JP2015520146A; CA2871714C; CY1120395T1; US10800806B2; PT2662382T; CA2871714A1; TR201802700T4; PL2847204T3; CN104302655A; HRP20160624T1; KR20150013254A

Abstract

Compuesto de fórmula (I) que tiene una estructura básica de beta-hidroxicolesterol **Fórmula** caracterizado porque se selecciona de los siguientes compuestos: - 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a); - 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b); - 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a); - 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-12,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]-fenantren-3-ilo (molécula 2.b), para su uso en el tratamiento de hemopatías malignas.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de esterol y uso de los mismos para tratar enfermedades que implican células astrocíticas transformadas o para el tratamiento de hemopatías malignas 5

La invención se refiere a derivados de esterol novedosos para su uso en el tratamiento de hemopatías malignas, en particular que implican células mieloides transformadas, o para el tratamiento de linfomas.

La transformación celular corresponde a la transición de una célula eucariota normal a una célula inmortalizada y/o 10 una célula eucariota cancerosa. Las expresiones "célula transformada" o "célula cancerosa" se usarán como sinónimos en lo sucesivo en el presente documento.

El glioblastoma multiforme (GBM), también conocido como astrocitoma de grado IV, es un tumor cerebral caracterizado por la transformación de células astrocíticas en células cancerosas, en particular que pasa a través de 15 gliomas de grado I, grado II y grado III.

A pesar de los importantes avances científicos y terapéuticos en el área de oncología, el GBM es todavía un cáncer incurable. En el mejor de los casos, los investigadores y los médicos están satisfechos cuando la vida media de los pacientes puede prolongarse en algunos meses, como máximo quince meses.

20

Uno de los problemas encontrados en el tratamiento del GBM es la recaída causada por las células madre. De hecho, incluso cuando las terapias existentes tuvieron éxito en la erradicación de la mayor parte del tumor, las células madre a menudo causan el desarrollo de un nuevo tumor (1,2).

25 Las terapias actuales siempre consisten en la resección del tumor, si su ubicación lo permite, seguido de radioterapia y/o quimioterapia según el caso. En quimioterapia, uno de los principales tratamientos es la biterapia, que consiste en administrar Avastina (inhibición de la unión de VEGF a sus receptores) e irinotecán (inhibidor de la topoisomerasa I). La triterapia del tipo PCV, que es una combinación de procarbazina (agente de alquilación de ADN), lomustina (CCNU; agente de alquilación no específico) y vincristina (inhibición de la polimerización de 30 microtúbulos) es actualmente muy controvertida. La temozolomida, un agente de alquilación de guanina, junto con radioterapia, muestra un aumento de la supervivencia media, especialmente para pacientes con ADN hipermetilado. Están en curso ensayos clínicos (fase III), pruebas con cilengitida (inhibición de algunos receptores de integrina) y talampanel (bloqueo de canales de glutamato del tipo AMPA).

35 Los estudios de inmunoterapia y los ensayos clínicos son de dos tipos:

- inmunoterapia adaptativa, en la que las células activadas in vitro se inyectan en el paciente, tales como células asesinas activadas por linfoquina (LAK; ensayos clínicos de fase II) o linfocitos T citotóxicos (CTL; ensayos clínicos de fase I) inyectados por vía intracraneal. En la actualidad, las observaciones muestran una supervivencia de 20

40 meses, lo que es muy marginal.

- inmunoterapia activa, que consiste en el uso de vacunas (fase I) y células dendríticas (fase II). Esto no muestra una mejora significativa en la supervivencia del paciente. Estos ensayos se han interrumpido.

Las terapias genéticas, que consisten en el uso de adenovirus, retrovirus o virus del sarampión como vectores de 45 moléculas con potencial contra el cáncer, muestran una mejora de la supervivencia de sólo 6 a 11 meses. La terapia celular que propone el uso de células madre neuronales como transportadores de medicamentos en GBM todavía está en la fase de demostración en la investigación básica.

Un procedimiento que ha estado algo desatendido en las últimas décadas, y que se prevé de nuevo, consiste en la 50 acción a nivel de glucólisis y la fosforilación oxidativa. Las células cancerosas aumentan su consumo de glucosa ya que tienden a modificar su metabolismo hacia el metabolismo anaerobio, incluso si el suministro de oxígeno no es un factor limitante. Este fenómeno, observado por Warburg (3), se debe a la sobreexpresión de HIF (Factor inducido por hipoxia) y del pro-oncogen Myc. HIF aumenta la conversión de piruvato a lactato, de forma anaerobia, mediante la inactivación de piruvato deshidrogenasa, que es una enzima clave en la respiración aerobia. MYC estimula la 55 biosíntesis de glutamina, que está involucrada en la respiración anaerobia (4).

En este contexto, están en curso ensayos clínicos que actúan en el metabolismo energético. Se pueden mencionar, como ejemplos (4):

- metformina: inhibidor del complejo respiratorio mitocondrial I, que, a su vez, induce la AMPK, que ralentiza la proliferación celular;

- floretina: agente para la reducción de la importación de glucosa;

- acetato de fenilo: agente para reducir el nivel de glutamina;

5 - dicloroacetato: inhibidor de piruvato deshidrogenasa.

Todas estas moléculas, excepto dicloroacetato, están siendo ensayadas (ensayos clínicos en fase II) y las observaciones aún no se conocen en la actualidad.

10 Actualmente se ha descubierto que los derivados de esterol que se dirigen a un aspecto específico del metabolismo energético de los astrocitos, el tipo de célula en el origen del GBM, podrían usarse para el tratamiento del glioblastoma multiforme.

El aspecto original de la invención consiste en el uso del metabolismo energético particular de la célula astrocítica 15 (de origen glial), cuya transformación conduce en última instancia a la formación de GBM.

De hecho, la célula astrocítica usa al mismo tiempo el suministro de energía, en forma de ATP, a través de la fosforilación oxidativa (ciclo de Krebs acoplado al transporte de electrones en la mitocondria) y a través de la glucólisis: En esta última, el piruvato no entra en el ciclo de Krebs pero se reduce a lactato por la enzima lactato 20 deshidrogenasa (LDH) de tipo 5. Además del suministro de ATP, el astrocito usa la glucólisis, a través de la producción de lactato, para suministrar a la célula adyacente, la neurona, con un neurotransmisor (glutamato).

En la siguiente tabla, el metabolismo energético del astrocito, normal o canceroso, se compara esquemáticamente con el de otras células:

25

: Astrocitos Otras células

: Respiración mitocondrial Glucólisis Respiración mitocondrial Glucólisis

Células normales: 50 % 50 % 90 % 10 %

Células cancerosas: GBM 1 % GBM 99 % 1 % 99 %

El metabolismo energético del astrocito es especial: de hecho, la respiración mitocondrial y la glucólisis funcionan conjuntamente.

30 Es esta dualidad metabólica específica de la célula astrocítica normal, concretamente, por un lado la respiración mitocondrial y, por un lado, la glucólisis, la que constituye la base para la estrategia de preparación de los derivados de esterol de acuerdo con la invención.

De hecho, los inventores presentan la hipótesis de trabajo de acuerdo con la cual los derivados de esterol, de 35 acuerdo con la invención, pueden orientar el metabolismo energético de las células astrocíticas cancerosas de la glucólisis a la respiración mitocondrial, un proceso que conducirá a su muerte.

7p-Hidroxicolesterol (7P-OHCH), una molécula con alto potencial anticanceroso (5,6), muestra una citotoxicidad notable sobre líneas de astrocitos de rata inmortalizadas (transformadas espontáneamente) (7,8) y los GBM (línea 40 C6 de rata) "in vitro" (9). Los estudios demuestran que la esterificación de 7P-OHCH en C3-OH por los ácidos grasos intracelulares (formación de 7p-OHCH-C3-éster) estaba muy implicada en el efecto tóxico del precursor, 7P-OHCH (7, 8, 10).

Sin embargo, el mecanismo de acción de 7P-OHCH, esterificado o no en C3-OH, en los GBM "in vitro" estaba lejos 45 de elucidarse. Recientemente, los estudios realizados en las líneas C6 han demostrado que 7P-OHCH modula la arquitectura y la dinámica de las balsas, microdominios en la membrana plasmática, los sitios de inicio de ciertos mensajeros celulares, incluyendo los de la proteína cinasa Akt, una enzima clave en el metabolismo energético celular (11). De hecho, el oxisterol, mediante la interrupción de la arquitectura de las balsas, en consecuencia, afectará a la actividad de Akt, particularmente durante la transformación de las células normales en células 50 cancerosas: La Akt regula la captura de glucosa y la actividad de la glucólisis en estas células.

Sorprendentemente, se ha descubierto que los derivados de esterol, de acuerdo con la invención, que tienen una

estructura básica de 7beta-hidroxicolesterol que tiene sustituyentes en la posición 3 y grupos protectores en la posición 7, permitirán simultáneamente la inhibición de la glucólisis, esencial para el suministro de energía del astrocito canceroso de alto grado y, al mismo tiempo, restaurarán la respiración mitocondrial, que también es "mortal" para esta célula.

5

De hecho, esta acción dual conduce al "sobrecalentamiento" de la célula cancerosa, que conduce a su muerte.

Por otra parte, se ha demostrado que los derivados de esterol también tienen actividad con respecto a las células madre, permitiendo de este modo la destrucción total de las células de glioblastoma.

10

La actividad de los derivados de esterol de acuerdo con la invención con respecto al glioblastoma también significa que su uso puede considerarse en el tratamiento de hemopatías malignas del tipo mieloide, debido a la similitud del metabolismo celular de la célula mieloide con la del astrocito; en el tratamiento de neuroblastomas, teniendo las neuronas el mismo origen embrionario y celular que el astrocito; y en el tratamiento de los melanomas, ya que los 15 melanocitos tienen el mismo origen embrionario que los astrocitos, como se explicará más adelante.

Además, el hecho de que la línea mieloide y la línea linfoide tengan un origen común, concretamente, la célula madre hematopoyética pluripotente, significa que también es posible prever el uso de derivados de esterol de acuerdo con la invención para tratar linfomas.

20

Por lo tanto, la invención se refiere a compuestos de fórmula (I)

imagen1

25 seleccionado de los siguientes compuestos:

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((ferc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-

metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

30 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.b),

35

para su uso en el tratamiento de hemopatías malignas.

Los compuestos de fórmula (I) pueden obtenerse a partir de colesterol mediante un método que comprende las etapas de:

40

- protección de la función hidroxilo en la posición 3 del colesterol con un grupo protector, tal como, por ejemplo, un grupo aciloxi R9-C(O)- en el que el grupo R9 es un alquilo C1-C6 sustituido o sin sustituir, o un grupo arilo sustituido o sin sustituir, en particular, un grupo arilalcoxicarbonilo,

- introducción de una función cetona en la posición 7,

45 - reducción de la función cetona en una función hidroxilo,

- introducción de un grupo protector en la función hidroxilo en la posición 7, correspondiente al grupo B, tal como, por ejemplo, un grupo acilo o alcoxicarbonilo, o un grupo aciloxi Ri0-C(O) en el que Río es un alquilo Ci-C6 sustituido o sin sustituir, un arilo, sin sustituir sustituido con al menos un alquilo Ci-C6 lineal o ramificado, o un heteroarilo C5- C14, sin sustituir o sustituido con al menos un alquilo C1-C6 lineal o ramificado, o al menos un grupo seleccionado de

50 OR, NHR y SR, como se ha definido anteriormente,

- desprotección de la función hidroxilo en la posición 3.

Después de la desprotección de la función hidroxilo en la posición 3, dicha función hidroxilo puede sustituirse con el grupo A deseado.

5

La introducción de una función cetona en la posición 7 se puede realizar mediante métodos de oxidación habituales.

La reducción de la función cetona en una función hidroxilo, selectivamente en la posición p, se puede realizar, por ejemplo, mediante el método de Luche usando NaBH4 en presencia de cloruro de cerio heptahidrato (12).

10

Las composiciones farmacéuticas o medicamentos que comprenden al menos un compuesto de fórmula (I), y un vehículo farmacéuticamente aceptable, pueden consistir en una preparación liposomal que comprende al menos un compuesto de fórmula (I).

Los liposomas pueden producirse mediante diversas técnicas conocidas por un experto en la técnica. Pueden 15 usarse diversos lípidos que constituyen los liposomas [Medical Application of Liposomes (1986) editado por Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokio, Karger].

Como alternativa, dicho liposoma puede consistir en un liposoma denominado "mejorado" que tiene una distribución de tamaño predominantemente entre 40 y 80 nm y con una composición que es estable a lo largo del tiempo, o en 20 un liposoma denominado "concentrado" que tiene la misma distribución de tamaño pero que comprende una mayor concentración de molécula activa, en particular un 50% más alta que la del liposoma "mejorado".

El liposoma "mejorado" se puede obtener mediante un método de preparación que comprende las siguientes etapas:

25 - poner en contacto la molécula activa que se incluirá en el liposoma y el fosfolípido en un disolvente orgánico,

- evaporar el disolvente en una corriente de nitrógeno para obtener una película lipídica,

- disolver la película lipídica en un disolvente orgánico,

- evaporar dicho disolvente en una corriente de nitrógeno y tomar la película lipídica en un tampón acuoso

- sonicación en un baño ultrasónico,

30 - obtener las vesículas por extrusión.

Preferiblemente, la sonicación se realiza durante 10 pulsos de un minuto a una temperatura de aproximadamente 20°C. La extrusión puede realizarse en una membrana de tipo PVDF que tiene un tamaño de poro de 200 nm.

35 Los liposomas "concentrados" pueden obtenerse mediante un método de preparación que comprende las etapas de:

- poner en contacto la molécula activa que se incluirá en el liposoma y una cantidad de fosfolípido que es mayor que la utilizada en las técnicas habituales, notablemente el doble de la cantidad habitual, en un disolvente orgánico,

- evaporar el disolvente a presión reducida para obtener una película lipídica,

40 - disolver la película lipídica en un disolvente orgánico,

- evaporar dicho disolvente a presión reducida y recoger la película lipídica en un tampón acuoso,

- sonicación en un baño ultrasónico,

- obtener las vesículas por extrusión.

45 Preferiblemente, la sonicación se realiza durante 20 pulsos de un minuto a una temperatura de aproximadamente 20 °C. La extrusión puede realizarse en una membrana de tipo PVDF que tiene un tamaño de poro de 200 nm.

Preferiblemente, la evaporación se realiza a una presión por debajo de aproximadamente 3 kPa (30 mbar) y a una temperatura del baño de 25 °C. Se usa preferiblemente un evaporador rotatorio.

50

La cantidad de molécula activa con respecto al fosfolípido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente el 15%, expresada en % en peso.

Un medicamento preferido consiste en un liposoma cargado con al menos un compuesto de fórmula (I) como se ha 55 definido anteriormente.

Preferiblemente, el compuesto o compuestos de fórmula (I) como se han definido anteriormente constituyen el único principio o principios activos contenidos en la composición farmacéutica según la invención, en particular cuando dicha composición farmacéutica es un liposoma. Dicho liposoma, que comprende al menos un compuesto de

fórmula (I) como se ha definido anteriormente, se puede administrar, por ejemplo, por vía oral o por vía parenteral.

Como alternativa, el compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, puede usarse junto con otro principio activo, tal como, por ejemplo, un agente anticanceroso, en particular avastina, irinotecán, temozolomida o 5 derivados de taxol.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma adecuada para administración oral o para administración parenteral, en particular mediante inyección, infusión o inhalación, conocidas por un experto en la técnica.

10

En particular, dicha composición farmacéutica puede ser una solución farmacéuticamente aceptable, en particular una solución alcohólica, de al menos un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, en solitario o junto con otro principio activo, que puede administrarse a un paciente por transfusión o infusión.

15 Dicha composición farmacéutica puede ser adecuada, en particular, para la administración por vía oral o sublingual. Además de las formas farmacéuticas habituales, por ejemplo comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones, emulsiones, suspensiones orales, gotas, jarabes, etc., las composiciones farmacéuticas orales de acuerdo con la invención pueden comprender complejos de compuestos de fórmula (I) como se ha definido anteriormente con sales biliares, o, por ejemplo, combinaciones de compuestos de fórmula (I) como se ha definido anteriormente con 20 fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, en forma liposómica o no liposómica.

Los compuestos de fórmula (I) se pueden usar en el tratamiento de enfermedades que implican células astrocíticas transformadas, en particular en el tratamiento de glioblastoma multiforme o astrocitoma de grado IV (GBM). En particular, los compuestos de fórmula (I) se pueden inyectar directamente en la corteza cerebral, en el sitio de 25 tratamiento.

La invención se refiere al tratamiento de otros cánceres, concretamente, hemopatías malignas del tipo mieloide y linfomas, neuroblastomas y melanomas.

30 Los compuestos de fórmula (I) como se han definido anteriormente, para su uso en el tratamiento de hemopatías malignas del tipo mieloide, son un objeto de la invención.

La invención se refiere al tratamiento de hemopatías malignas del tipo mieloide, administrando una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente.

35

Las patologías malignas del tipo mieloide se desarrollan a partir de una célula mieloide normal. Ahora, este tipo de célula, en el estado normal, tiene un metabolismo energético bastante similar al del astrocito: produce su energía a partir de la respiración mitocondrial y de la glucólisis (ruta del lactato, LDH) (13). En el caso de cánceres de origen mieloide, las células cancerosas producen su energía a partir de la glucólisis. En cuanto a GBM, la actividad 40 anticancerosa de los compuestos de fórmula (I) se debería a la inhibición de la LDH (glucólisis) y, en consecuencia, al sobrecalentamiento de la célula causado por un alto estallido de la respiración mitocondrial.

Los compuestos de fórmula (I) seleccionados de los siguientes compuestos:

45 - 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetiM7-(6- metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,l2,13,14,15,l6,l7-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-acetoxi-l0,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-lH-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)- 50 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a);

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.b), para su uso en el tratamiento de linfomas, también son un objeto de la invención.

55 La invención también se refiere al tratamiento de linfomas, administrando una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente.

De hecho, dado que la línea mieloide y la línea linfoide tienen un origen común, que es la célula madre hematopoyética pluripotente, la actividad de los compuestos de fórmula (I), como se ha definido anteriormente en las

hemopatías malignas del tipo mieloide se refiere a que su uso también se puede contemplar para tratar linfomas.

Los compuestos de fórmula (I) seleccionados de los siguientes compuestos:

5 - 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6- metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)- 10 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a);

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.b), para su uso en el tratamiento de neuroblastomas, también son un objeto de la invención.

15 La invención también se refiere al tratamiento de neuroblastomas, administrando una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente.

Con respecto a los neuroblastomas, que afectan principalmente al sistema nervioso simpático extracraneal, los compuestos de fórmula (I) muestran una actividad antitumoral porque, como ocurre con los astrocitos, la neurona 20 tiene el mismo origen embrionario, por un lado, el ectodermo, y origen celular, por otro lado, es decir, las células neuroepiteliales (14). En resumen, el astrocito y la neurona son células nerviosas y son igualmente susceptibles a los compuestos de fórmula (I).

Los compuestos de fórmula (I) seleccionados de los siguientes compuestos:

25

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6- metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b);

30 - 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.b), para su uso en el tratamiento de melanomas, también son un objeto de la invención.

35

La invención también se refiere al tratamiento de melanomas, administrando una cantidad eficaz de al menos un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente.

De hecho, los melanocitos, que están en el origen de los melanomas, se derivan de la cresta neural, derivada 40 asimismo del ectodermo (14). Dado que los astrocitos y las neuronas también se derivan del ectodermo, y los compuestos de fórmula (I) muestran actividad anti-GBM y anti-neuroblastoma, también es probable que estos compuestos tengan propiedades anticancerosas con respecto a los melanomas.

De acuerdo con una alternativa, dicho tratamiento es un tratamiento secuencial que comprende al menos una etapa 45 de administración de un primer compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente y al menos una etapa de administración de un segundo compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, diferente del primero.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no la limitan.

50 La sección I se refiere a la síntesis química.

Los Ejemplos 1 y 2 se refieren a la preparación de intermedios de síntesis usados para la preparación de los compuestos de fórmula (I). Los Ejemplos 3 a 6 se refieren a la preparación de compuestos de fórmula (I).

55 La sección II se refiere a la actividad biológica de los compuestos de fórmula (I).

I/ Síntesis química

Ejemplo 1: Preparación de 7beta-acetilcolesterol (compuesto 1.4)

El diagrama de reacción se muestra en la figura 1.

1) Preparación del compuesto 1.1

imagen2

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

Benzoato de colesterilo: 490,78 100 mmol - 50 g

Clorito sódico: 90,44 300 mmol 3 equiv. 28 g

N-Hidroxiftalimida: 163,13 10 mmol 0,1 equiv. 1,7 g

Dioxano/Agua 3/1: 500 ml

10

El benzoato de colesterilo, la mezcla dioxano/agua, clorito sódico y N-hidroxiftalimida se ponen en ese orden en un matraz de 3 bocas de 1 litro equipado con un condensador. Esta mezcla se calienta a 50 °C durante 6 h. El avance de la reacción se controla por TLC en placa de gel de sílice (TLC gel de sílice 60 F254, Merck) en 8/2 de hexano/Et2O.

15

Cuando la tasa de formación alcanza un valor aceptable, la mezcla de reacción en bruto se vierte en una solución al 10 % de sulfito sódico (500 ml), y después se extrajo con éter. La fase orgánica obtenida se lava con una solución saturada de hidrogenocarbonato sódico, después con agua y finalmente con salmuera. Después, esta fase orgánica se seca sobre sulfato sódico, se filtra y después se evapora a presión reducida.

20

Después, el residuo oleoso con color obtenido se purifica por recristalización en etanol. Dado que el sólido de color blanco obtenido no es de pureza suficiente, se purifica de nuevo por cromatografía sobre gel de sílice (sílice SDS 60A, 35-70 pm). Se obtiene un depósito sólido recogiendo este aceite en diclorometano. La purificación se realiza en un eluyente que pasa de 98/2 de hexano/acetato de etilo a 90/10. El producto se obtiene en forma de un sólido de 25 color blanco.

Rendimiento: 23 %

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCh, BRUKER 400 MHz. Columna HPLC de fase normal CHIRALCEL O-DH (columna ODH0CE-CE026), eluyente 9/1 de Hexano/iProH, 20 min, longitud de onda 190 nm.

30 Tiempo de retención 6,682 min, pureza HPLC 99,2 %.

1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,71 (s, 3H, CH3), 0,89 (dd, 6H, 2CH3), 0,94 (d, 3H, CH3), 1,02-2,78 (m, 26H), 1,27 (s, 3H, CH3), 4,99 (m, 1H, CH), 5,76 (d, 1H, CH), 7,44-8,05 (m, 5H, CHAr).

2) Preparación del compuesto 1.2 35

imagen3

Se usaron los siguientes reactivos:

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

Benzoato de cetocolesterilo: 504,76 15,8 mmol - 8 g

NaBH4: 37,83 7,9 mmol 0,5 equiv. + 0,5 equiv. 0,3 g + 0,3 g

CeCla.7H2O: 372,60 14,2 mmol 0,9 equiv. 5,3 g

1:1 de THF/MeOH: 200 ml

El benzoato de cetocolesterilo, la mezcla de disolvente THF/MeOH y el cloruro de cerio hidratado se ponen en un matraz de 500 ml. Después, la mezcla de reacción en bruto se enfría a 0 °C con un baño de hielo, antes de añadir lentamente borohidruro sódico.Se observa desprendimiento de gas, el baño de hielo se mantiene durante 1 h, 5 después se agita a temperatura ambiente durante 18 h. El progreso se controla por TLC (TLC gel de sílice 60 F254, Merck) en eluyente 80/20 de Hexano/EtOAc. Si la tasa de formación es insuficiente, se añaden 0,5 equiv. de borohidruro sódico.

A la mezcla de reacción en bruto se le añaden 50 ml de agua y 200 ml de diclorometano. Después de la 10 transferencia a un embudo de separación, la fase orgánica se recupera. La fase acuosa se extrae de nuevo con DCM. Las fases orgánicas se combinan, se lavan con una solución 1 N de ácido clorhídrico y después con una solución saturada de NaCl.

Después, la fase orgánica se seca sobre sulfato sódico, se filtra y se evapora a presión reducida, dando un aceite 15 ligeramente coloreado, que cristaliza espontáneamente.

Se obtiene un depósito sólido recogiendo el residuo en DCM. Este producto en bruto se purifica sobre una columna de gel de sílice (sílice SDS 60A, 35-70 pm) en eluyente 9/1 de hexano/EtOAc. El producto se obtiene en forma de un sólido de color blanco.

20

Rendimiento: 89 %

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCl3, BRUKER 400 MHz. Columna HPLC de fase normal CHIRALCEL O-DH (columna ODH0CE-CE026), eluyente 9/1 de hexano/iProH, 20 min, longitud de onda 190 nm.

Tiempo de retención 7,076 min, pureza HPLC 98,8 %.

25 1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): 6 0,63 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,85 (d, 3H, CH3), 0,89-2,43 (m, 27H), 1,04 (s, 3H, CH3), 3,81 (d, 1H, CH), 4,81 (m, 1H, CH), 5,29 (d, 1H, CH), 7,34-7,99 (m, 5H, CHAr).

3) Preparación del compuesto 1.3

imagen4

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

Benzoato de 7-p-hidroxicolesterilo: 505,76 9,9 mmol - 5_g

Anhídrido acético: 20 ml

Piridina: 20 ml

35 El benzoato de 7-p-hidroxicolesterilo, piridina, y después el anhídrido acético se ponen en un matraz de 100 ml. Esta mezcla se agita a temperatura ambiente durante 16 h. El progreso se controla por TLC (TLC gel de sílice 60 F254, Merck) en eluyente 9/1 de hexano/EtOAc.

La mezcla de reacción en bruto se evapora a presión reducida. Se realizan dos co-evaporaciones con acetato de

etilo. El residuo obtenido se recoge en acetato de etilo. La fase orgánica obtenida de este modo se lava con ácido clorhídrico 1 N, se seca sobre sulfato sódico y después se evapora a presión reducida.

El sólido de color blanco obtenido se usa directamente en la siguiente etapa, sin purificación adicional.

5

Rendimiento: 100 %

Tiempo de retención 4,972 min, pureza HPLC 99,6 %.

10 1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,63 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,91-2,41 (m, 26H), 1,06 (s, 3H, CH3), 1,95 (s, 3H, CH3 acetilo), 4,78 (m, 1H, CH), 4,99 (d, 1H, CH), 5,21 (s, 1H, CH), 7,33-7,98 (m, 5H, CHAr).

4) Preparación del compuesto 1.4 15

imagen5

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

Benzoato de 7-p-acetilcolesterilo: 548,81 9,1 mmol - 5_g

NaOH al 1 % en metanol: 50 ml

20

El benzoato de 7-p-acetilcolesterilo y una solución de hidróxido de sodio al 1 % en metanol se ponen en un matraz de 100 ml. Esta mezcla se agita a temperatura ambiente hasta que se disuelve completamente. El progreso se controla por TLC (TLC gel de sílice 60 F254, Merck) en un eluyente 7/3 de hexano/EtOAc.

25 Para completar la reacción, la mezcla en bruto puede calentarse a 40 °C, en tal caso, el control por TLC se realiza cada 20 minutos.

Se añaden 200 ml de acetato de etilo y 50 ml de agua seguido de transferencia a un embudo de separación y la separación de las fases. La fase acuosa se mezcla de nuevo una vez con acetato de etilo. Las fases orgánicas se 30 combinan, se secan sobre sulfato sódico, se filtran y después se evaporan a presión reducida, dando un residuo oleoso.

El residuo se recoge en acetato de etilo para preparar el depósito sólido. La purificación se realiza sobre una columna de gel de sílice (sílice SDS 60A, 35-70 pm) en eluyente de hexano/EtOAc variando de 9/1 a 7/3. El 35 producto esperado se obtiene en forma de un aceite incoloro que cristaliza espontáneamente, dando un sólido de color blanco. La columna se lava con acetato de etilo al 100 % para recuperar el 7-p-hidroxicolesterol formado.

Rendimiento: 38 %

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCl3, BRUKER 400 MHz. Columna HPLC de fase normal CHIRALCEL O-DH 40 (columna ODH0CE-CE026), eluyente 9/1 de hexano/iProH, 20 min, longitud de onda 190 nm.

Tiempo de retención 6,186 min, pureza HPLC 91,7 %.

1H RMN (CDCl3, 400,13 MHz): ó 0,62 (s, 3H, CH3), 0,78 (dd, 6H, 2CH3), 0,85 (d, 3H, CH3), 0,86-2,28 (m, 27H), 1,03 (s, 3H, CH3), 1,96 (s, 3H, CH3 acetilo), 3,47 (m, 1H, CH), 4,94 (td, 1H, CH), 5,13 (t, 1H, CH).

45 Ejemplo 2: Preparación de 7beta-terc-but¡lox¡carbon¡lcolesterol (compuesto 1.6)

El diagrama de reacción se muestra en la figura 2.

El compuesto 1.6 a partir del compuesto 1.2 del Ejemplo 1.

1) Preparación del compuesto 1.5 5

imagen6

Se usaron los siguientes reactivos:

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

Benzoato de 7-p-hidroxicolesterilo: 505,76 1,29 mmol - 0,65 g

Boc2O: 218,25 2,8 mmol 2,2 equiv. 0,61 g

DMAP: 122,17 0,13 mmol 0,1 equiv. 0,016 g

5:2 de Hexano/THF: 42 ml

10

El benzoato de 7-p-hidroxicolesterilo, el disolvente, 2,6-dimetilaminopiridina y después el anhídrido de terc- butiloxicarbonilo se ponen en un matraz de una boca de 100 ml. Esta mezcla se agita a temperatura ambiente hasta que se disuelve completamente. El progreso se controla por TLC en un eluyente 8/2 de hexano/EtOAc.

15 Se añaden 50 ml de EtOAc y 10 ml de agua. La fase orgánica obtenida de este modo se seca sobre sulfato sódico, se filtra y después se evapora a presión reducida, dando un residuo oleoso.

El residuo se recoge en EtOAc para preparar el depósito sólido. La purificación se realiza sobre una columna de gel de sílice en eluyente 95/5 de hexano/EtOAc.

20

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCh.

1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,59 (s, 3H, CH3), 0,77 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,86-1,98 (m, 24H), 1,09 (s, 3H, CH3), 1,41 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 2,42 (m, 2H, CH2), 4,80 (m, 1H, CH), 4,91 (d, 1H, CH), 5,18 (s, 1H, CH), 7,34-7,97 (m, 5H, CHAr).

25

2) Preparación del compuesto 1.6

imagen7

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

Benzoato de 7-p-t-Butiloxicarbonil- colesterilo: 606,89 1,64 mmol - 1 g

NaOH al 1 % MeOH: 50 ml

El benzoato de 7-p-t-butiloxicarbonilcolesterilo y una solución de hidróxido de sodio al 1 % en metanol se ponen en un matraz de una boca de 50 ml. Esta mezcla se agita a temperatura ambiente hasta que se solubiliza 5 completamente. El progreso se controla por TLC en un eluyente 7/3 de hexano/EtOAc. Para completar la reacción, la mezcla en bruto puede calentarse a 40 °C.

Se añaden 100 ml de EtOAc y 20 ml de agua. La fase acuosa se extrae de nuevo con EtOAc. Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre sulfato sódico, se filtran y después se evaporan a presión reducida, dando un residuo 10 oleoso.

El residuo se recoge en EtOAc para preparar el depósito sólido. La purificación se realiza sobre una columna de gel de sílice en eluyente de hexano/EtOAc que varía de 9/1 a 7/3. La columna se lava con EtOAc al 100 % para recuperar el 7-p-hidroxicolesterol formado.

15

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCl3.

1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,60 (s, 3H, CH3), 0,78 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,91-2,29 (m, 27H), 0,97 (s, 3H, CH3), 1,41 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 3,47 (m, 1H, CHb), 4,77 (td, 1H, CHc), 5,17 (t, 1H, CHa).

20 Ejemplo 3: Preparación de 2-(2-(((benc¡lox¡)carbonil)am¡no)acetam¡do) propanoato de 7-((terc- butoxicarbonil)oxi)-10.13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17-tetradecahidro-1H- ciclopentaralfenantren-3-ilo (molécula 1.a)

Nombre simplificado: 3-benciloxicarbonil-glicinil-alanil-7-p-O-terc-butiloxicarbonil-colesterol 25

imagen8

30 Se usaron los siguientes reactivos:

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

7-p-t-Butiloxicarbonil-colesterol (compuesto 1.6): 502 0,16 mmol - 80 mg

Z-Gly-Ala-COOH: 280,28 0,24 mmol 1,5 equiv. 68 mg

DCC: 206,3 0,24 mmol 1,5 equiv. 50 mg

DMAP: 122,17 0,24 mmol 1,5 equiv. 30 mg

1:1 de THF/DCE: 6 ml

Se ponen 80 mg (0,16 mmol) de 7-p-t-butiloxicarbonilcolesterol, 68 mg (0,24 mmol, 1,5 equiv.) de dipéptido, 6 ml de mezcla de disolvente (1:1 de THF/DCE), 50 mg (0,24 mmol, 1,5 equiv.) de DCC, y 30 mg (0,24 mmol, 1,5 equiv.) de 35 DMAP en un frasco Wheaton de 10 ml. La mezcla de reacción en bruto se agita durante 24 h a temperatura ambiente. El progreso se controla por TLC en un eluyente 7/3 de hexano/acetato de etilo.

Al producto de reacción en bruto se le añaden 30 ml de acetato de etilo y 10 ml de agua. La fase orgánica se separa, se seca sobre sulfato sódico, se filtra y después se evapora a presión reducida. El residuo oleoso obtenido se recoge

en acetato de etilo para preparar el depósito sólido.

La purificación se realiza sobre una columna de gel de sílice en eluyente 7/3, después 6/4, de hexano/acetato de etilo.

5

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCl3.

1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,60 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,83 (d, 3H, CH3), 0,94-1,88 (m, 24H), 0,98 (s, 3H, CH3), 1,19 (s, 3H, CH3 Ala), 1,40 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 2,27 (m, 2H, CH2), 3,83 (m, 2H, CH2), 4,47 (td, 1H, CH Ala), 4,47 (m, 1H, CH), 4,78 (td, 1H, CH), 5,07 (s, 2H, CH2 Gly), 5,22 (t, 1H, CH), 5,23 (m, 1H, NH), 6,41 (sl, 1H, 10 NH), 7,29 (m, 5H, CHAr).

Ejemplo 4: Preparación de 2-(2-(((benc¡lox¡)carbonil)am¡no)-acetam¡do)propanoato de 7-acetoxi-10,13- dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3- ilo (molécula 1.b)

15

Nombre simplificado: 3-benciloxicarbonil-glicinil-alanil-7-p-O-acetil-colesterol

imagen9

20 La Molécula 1.b se prepara a partir del compuesto intermedio 1.4. Se usaron los siguientes reactivos:

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

7-p-Acetilcolesterol: 444 0,18 mmol - 80 mg

Z-Gly-Ala-COOH: 280,28 0,27 mmol 1,5 equiv. 76 mg

DCC: 206,3 0,27 mmol 1,5 equiv. 56 mg

DMAP: 122,17 0,27 mmol 1,5 equiv. 33 mg

1:1 de THF/DCE: 6 ml

25 Se ponen 60 mg (0,13 mmol) de 7-p-acetilcolesterol, 70 mg (0,19 mmol, 1,5 equiv.) de dipéptido, 6 ml de mezcla de disolvente (1:1 de THF/DCE), 42 mg (0,19 mmol, 1,5 equiv.) de DCC, y 25 mg (0,19 mmol, 1,5 equiv.) de DMAP se ponen en un frasco Wheaton de 10 ml. La mezcla de reacción en bruto se agita durante 24 h a temperatura ambiente.

30 El progreso se controla por TLC en un eluyente 7/3 de hexano/acetato de etilo.Al producto de reacción en bruto se le añaden 30 ml de acetato de etilo y 10 ml de agua. La fase orgánica se separa, se seca sobre sulfato sódico, se filtra y después se evapora a presión reducida. El residuo oleoso obtenido se recoge en acetato de etilo para preparar el depósito sólido.

35 La purificación se realiza sobre una columna de gel de sílice en un eluyente 7/3, después 6/4, de hexano/acetato de etilo.

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCl3.

1H RMN (CDCl3, 400,13 MHz): ó 0,62 (s, 3H, CH3), 0,78 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,91-1,83 (m, 25H), 1,01 40 (s, 3H, CH3), 1,17 (s, 3H, CH3 Ala), 1,94 (s, 3H, CH3 acetilo), 2,27 (m, 2H, CH2), 3,82 (m, 1H, CH), 4,47 (td, 1H, CH Ala), 4,56 (m, 1H, CH), 4,95 (td, 1H, CH), 5,06 (s, 2H, CH2 Gly), 5,17 (sl, 1H, CH), 5,37 (t, 1H, CH), 6,49 (dl, 1H, NH), 7,24 (m, 5H, CHAr).

Ejemplo 5: Preparación de 2,2-d¡met¡l-1,3-d¡oxolano-4-carbox¡lato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-

d¡met¡l-17-(6-met¡lheptan-2-¡l)-2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17-tetradecah¡dro-1H-c¡clopentara1fenantren-3- ilo (molécula 2.a)

Nombre simplificado: 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxil-7-p-O-terc-butiloxicarbonil-colesterol 5

1) Preparación del grupo 1,3-dioxolano-4-carboxilato de dimetilo

imagen10

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxol ano-4- carboxilato de (-)-metilo: 160,17 31,2 mmol - 5 g

UOH.H2O: 41,96 78 mmol 2,5 equiv. 3,3 g

Metanol: 25 ml

El acetal, metanol y después el hidróxido de litio se ponen en un matraz de 50 ml. Esta mezcla se agita a temperatura ambiente durante 16 h.

15

La mezcla de reacción en bruto se evapora a presión reducida. El residuo obtenido se recoge en 75 ml de agua. Después, esta fase se acidifica a 0 °C a pH 1 con ácido clorhídrico 1 N, después se extrae con 2 x 100 ml de acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre sulfato sódico, se filtran y después se evaporan a presión reducida, dando un residuo oleoso ligeramente coloreado.

20

El residuo se usa directamente en la etapa de acoplamiento sin purificación adicional.

Anál¡s¡s: Análisis por 1H RMN en DMSO, BRUKER 400 MHz.

1H RMN (CDCl3. 400.13 MHz): 6 1,32 (d, 3H, CH3), 1,42 (s, 3H, CH3), 4,14 (AB, 2H, CH2), 4,55 (dd, 1H, CH), 10,30 25 (sl, 1H, OH), 7,24 (m, 5H, CHAr).

Rend¡m¡ento: 94 %

2) Preparación de molécula 2.a

30

imagen11

La Molécula 2.a se prepara a partir del compuesto intermedio 1.4.

Se usaron los siguientes reactivos: 35

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

7-p-Acetilcolesterol: 444 3,4 mmol - 1,5 g

Ácido 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4- carboxílico: 146,17 10,1 mmol 3 equiv. 1,35 g

DCC: 206,3 10,1 mmol 3 equiv. 2,1 g

DMAP: 122,17 10,1 mmol 3 equiv. 1,24 mg

THF/DCE (1:1): 50 ml

Se ponen 50 mg (9,9 mmol) de 7-p-t-butiloxicarbonilcolesterol, 6 ml de mezcla de disolvente (1:1 de THF/DCE), y 16 mg (11,9 mmol, 1,2 equiv.) de ácido 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxílico se ponen en un frasco Wheaton de 5 10 ml.

Se añaden 24,5 mg (11,9 mmol, 1,2 equiv.) de DCC y 14,5 mg (11,9 mmol, 1,2 equiv.) de DMAP, antes de agitar la mezcla de reacción en bruto durante 24 h a temperatura ambiente. El progreso se controla por TLC en un eluyente 8/2 de hexano/acetato de etilo. Se calienta a 50 °C durante 2 h para finalizar la reacción.

10

Al producto de reacción en bruto se le añaden 30 ml de acetato de etilo y 10 ml de agua. La fase orgánica se separa, se seca sobre sulfato sódico, se filtra y después se evapora a presión reducida. El residuo oleoso obtenido se recoge en acetato de etilo para preparar el depósito sólido.

15 La purificación se realiza sobre una columna de gel de sílice en un eluyente 95/5, después 9/1 de hexano/acetato de etilo.

Análisis: Análisis por 1H RMN en CDCh.

1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,60 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,83 (d, 3H, CH3), 0,74-1,97 (m, 25H), 0,98 20 (s, 3H, CH3), 1,33 (s, 3H, CH3 Acetal), 1,40 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 1,42 (s, 3H, CH3 Acetal), 2,29 (m, 2H, CH2), 4,08 (AB, 2H, CH2 Acetal), 4,48 (ddd, 1H, CH Acetal), 4,63 (m, 1H, CH), 4,78 (td, 1H, CH), 5,22 (d, 1H, CH).

Ejemplo 6: Preparación de 2.2-d¡met¡l-1.3-dioxolano-4-carbox¡lato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6- met¡lheptan-2-¡l)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecah¡dro-1H-c¡clopenta[a]fenantren-3-¡lo (molécula 25 2b)

Nombre simplificado: 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-carboxil-7-p-O-acetil-colesterol

imagen12

Se usaron los siguientes reactivos:

: PM Nb mol. equiv. Masa o Volumen

7-p-Acetilcolesterol: 444 3,4 mmol - 1,5 g

DCC: 206,3 10,1 mmol 3 equiv. 2,1 g

DMAP: 122,17 10,1 mmol 3 equiv. 1,24 mg

THF/DCE (1:1)

50 ml

El colesterol, la mezcla de disolvente y el ácido se ponen en un matraz de 100 ml. Se añaden DCC y DMAP, antes de agitar el producto de reacción en bruto durante 24 h a temperatura ambiente. El progreso se controla por TLC (TLC gel de sílice 60 F254, Merck) en un eluyente 8/2 de hexano/EtOAc.

5

A la mezcla de reacción en bruto se le añaden 100 ml de acetato de etilo y 50 ml de agua. La fase orgánica se separa, se seca sobre sulfato sódico, se filtra y después se evapora a presión reducida.

El residuo oleoso obtenido se recoge en acetato de etilo para preparar el depósito sólido. Columna de gel de sílice 10 (sílice SDS 60A, 35-70 pm) en un eluyente 95/5, después 9/1, de hexano/EtoAc.

Rendimiento: 68 %

Análisis: Análisis por 1H y 13C RMN en CDCl3 BRUKER 400 MHz. Columna HPLC de fase normal CHIRALCEL O- DH (columna ODH0CE-CE026), eluyente 9/1 de hexano/iProH, 20 min, longitud de onda 190 nm.

15 Tiempo de retención 5,291 min, pureza HPLC 98,7 %.

1H RMN (CDCI3, 400,13 MHz): ó 0,62 (s, 3H, CH3), 0,79 (dd, 6H, 2CH3), 0,84 (d, 3H, CH3), 0,91-2,30 (m, 27H), 1,01 (s, 3H, CH3), 1,33 (s, 3H, CH3 Acetal), 1,42 (s, 3H, CH3 Acetal), 1,93 (s, 3H, CH3 acetilo), 4,09 (AB, 2H, CH2 Acetal), 4,48 (dd, 1H, CH Acetal), 4,62 (m, 1H, CH), 4,96 (td, 1H, CH), 5,18 (d, 1H, CH).

20 II/ Actividad biológica

A/ Protocolos

Se usaron los siguientes protocolos para todos los experimentos:

25

1) Cultivos celulares

Se usan placas de cultivo de 96 pocillos con el fondo plano de plástico (NUNC, Estados Unidos) para el cultivo celular (Sigma-Aldrich, ref. 114754); se siembran 1500 células por pocillo en 200 pl de medio de cultivo. En el 30 momento del tratamiento, se añaden por pocillo 100 pl de medio de cultivo puro, 100 pl de medio de cultivo que contiene etanol, o liposomas, o 100 pl de medio de cultivo que contiene los principios activos; el volumen final del medio de cultivo, después del tratamiento es, por lo tanto, de 300 pl para todos los pocillos.

Los cultivos se incuban en una incubadora Sanyo (Japón, modelo MCO-19AIC-UV) a 37 °C y en una atmósfera con 35 CO2 al 5 % y se saturaron en humedad. Las células se observan con un microscopio invertido (Nikon Eclipse TS100, Japón) y las fotografías se toman con una cámara (cámara DIGITAL con c-mount; LABOVER, Francia). La campana de cultivo es una campana de seguridad microbiológica MSC (thermo SCIENTIFIC, modelo HERA SAFE KS12, Francia).

40 El tiempo de duplicado celular se calcula usando las fórmulas:

Tiempo de duplicado = (tb - ta) log(2)/(log (b) - log (a))

donde (a) y (b) representan el número de células en los momentos ta y tb (tb>ta) (15).

45

La transición se realiza por disociación con tripsina (páncreas bovino tipo 3, Sigma, Francia). La disociación celular se realiza a temperatura ambiente, durante 30 minutos, con una solución al 0,04 % (p/v) en KCl de Tyrode que contiene tripsina al 0,05 % (p/v).

50 Después de la disociación, las células se suspenden en el medio de cultivo apropiado para las células y se cuentan usando un contador de células THOMA y se diluyeron en el mismo medio para obtener 1500 células por pocillo.

a) Líneas celulares

55 Se usaron las siguientes líneas de glioblastoma:

• Líneas C6.

La línea celular de tipo C6 se obtuvo por Benda y col. (16) a partir de tumores de cerebro de rata, inducidos por N- metilnitrosourea. Este tipo de célula se usa como modelo "in vitro" e "in vivo" para evaluar el potencial anti-GBM. Las líneas proceden del antiguo Strasbourg Neurochemistry Centre (U44 INSERM y UPR 416 CNRS).

5 El medio de cultivo está formado por medio esencial mínimo al 70 % (MEM; (Fischer Scientifique, ref. 61100) y una solución de Hanks al 30 % (SIGMA, ref. H 9269). Se añaden los siguientes al medio de cultivo: suero fetal de ternero (FCS; Fischer Scientifique, ref. 10108165) a una concentración final del 5 % (v/v), una solución antibiótica de clorhidrato de ciprofloxacina 5 pg/ml (EUROMEDEX, ref. UC5074) y una solución de fungizona 2,5 pg/ml (INVITROGEN, ref. 15290-026). El tiempo de duplicado de este tipo de células es de 17 h.

10

• Líneas de GBM de origen humano

Las líneas de glioblastoma humano (GBM, línea U-87 MG) y su medio de cultivo (medio esencial mínimo de Eagle o EMEM) se obtuvieron de la ATCC (Estados Unidos, ref. ATCC- HTB-14). El cultivo de las células se inicia y se 15 mantiene de acuerdo con las recomendaciones de la ATCC. Estas líneas se usan comúnmente "in vitro" e "in vivo" para probar el potencial anti-GBM. El tiempo de duplicado de estas líneas es de 16 h.

También se usaron los siguientes cultivos principales de células humanas:

20 • Células astrocíticas

Las células astrocíticas de origen humano usadas se obtuvieron de ScienCell, Estados Unidos (ref. 1800), así como su medio de cultivo, formado por un medio básico que contiene suero FCS al 2 % (v/v) (ref. 0010), proteínas de crecimiento astrocítico (AGS, ref. 1852) y una solución de penicilina/estreptomicina (ref. 0503). El tiempo de 25 duplicado de estos astrocitos humanos es de 96 h.

• Células hepáticas

De origen humano, se obtuvieron en ScienCell, Estados Unidos (ref. 50200), así como el medio de cultivo (ref. 30 5201), que contiene FCS al 10 % (v/v). El tiempo de duplicado de estas células es de 24 h.

• Células renales

Estas células, de origen humano, se obtuvieron en ScienCell, Estados Unidos (ref. 4120), así como el medio de 35 cultivo (ref. 4101), que contiene FCS al 10 % (v/v). El tiempo de duplicado es de 96 h.

• Células cardiacas

Estas células, de origen humano, se obtuvieron en ScienCell, Estados Unidos (ref. 6300), así como el medio de 40 cultivo, que contiene FCS al 10 % (v/v). El tiempo de duplicado es de 72 h.

• Células musculoesqueléticas

De origen humano, se obtuvieron en ScienCell, Estados Unidos (ref. 3500), así como el medio de cultivo (ref. 3501), 45 que contiene FCS al 10 % (v/v). El tiempo de duplicado para estas células es de 72 h.

También se usaron los siguientes cultivos de células cancerosas de origen humano:

• Células cancerosas hepáticas 50

Se obtuvieron en la ATCC (ref. ATCC-HB-8065). El medio de cultivo consiste en MEM (Gibco, Estados Unidos; ref. 51200) y FCS al 10 % (v/v). El tiempo de duplicado es de 60 h.

• Células cancerosas de próstata 55

Se obtuvieron en ATCC (ref. ATCC-HTB-81). El medio de cultivo es el mismo que el usado para las líneas de cáncer de hígado. El tiempo de duplicado es de 60 h.

• Células cancerosas de mama

Se obtuvieron en la ATCC (ref. ATCC-HTB-19). El medio de cultivo es el mismo que el usado para las líneas de cáncer de hígado. El tiempo de duplicado es de 20 h.

5 • Carcinoma de colon (línea HT29/219)

Se obtuvieron de la colección ECACC (Ref. ECACC-85061109). Las condiciones de cultivo se basan en las recomendaciones del folleto informativo de Sigma-Aldrich.

10 • Neuroblastoma (línea SH-SY5Y)

Se obtuvieron de la colección ATCC (Ref. ATCC-CRL-2266). Las condiciones de cultivo se basan en las recomendaciones del folleto informativo de la ATCC.

15 • Leucemia mielomonocítica crónica (CMML)

Las células purificadas de muestras de sangre de pacientes que padecen leucemia mielomonocítica crónica (CMML) se obtuvieron en el Clinical Haematology Centre and the Biotherapy Centre del Saint Eloi Hospital (CHU de Montpellier). El cultivo se realizó mediante la técnica de siembra en una capa de alimentación. Las células se 20 siembran en una capa de alimentación que no se ve afectada por los tratamientos destinados a las células de interés y que no altera en gran medida la fisiología de las células de interés. Las células de CMML se cultivaron en líneas celulares que se originaban en la médula espinal de embrión humano (17).

Para todos estos cultivos, el cultivo se inició y se mantuvo de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.

25

b) Tratamiento de los cultivos

Los principios activos se disuelven en etanol absoluto (AnalaR, NORMAPUR, VWR, Francia) o en forma de una solución liposomal, tal como 10 pl de las soluciones madre diluidas en 990 pl y después se añaden a los pocillos de 30 cultivo (200 pl de medio de cultivo), dando concentraciones de 30,0, 15,0, 7,5 y 3,3 pM (volumen final de medio de cultivo por pocillo BI-GBM: 300 pl).

Cuando los principios activos están en una solución etanólica, el medio de cultivo contiene etanol al 3,3 % (v/v).

35 2) Preparación de los liposomas

a) La metodología básica se describe por Werthle y col. (10).

En resumen, los compuestos a ensayar, concretamente los compuestos de acuerdo con la invención (principios activos) o 7p-OHCH-C3-éster (un derivado de 7beta-hidroxisterol esterificado en la posición 3 con un grupo oleato, la 40 síntesis de que se describe por Rakotoarivelo y col. (18) y que se usa como control), fosfatidilcolina de soja (Sigma), así como colesteril-3-sulfato (Sigma) se toman de soluciones madre preparadas a partir de dicloroetano en el caso de los principios activos y el 7p-OHCH-C3-éster, un cloroformo: mezcla de metanol (9:1, v/v) en el caso de fosfatidilcolina y cloroformo en el caso de colesteril-3-sulfato. Las relaciones molares son 1 M/0,1 M/0,25 M para fosfatidilcolina, colesteril-3-sulfato y el 7p-OHCH-C3-éster y los principios activos respectivamente.

45 Después de la evaporación, al compuesto seco se le añade una solución de solución salina en PBS, sin Ca2+ y Mg2+, pH 7,2 (BioRad). El volumen de tampón y la masa de los productos se ajustan de manera que 20 o 10 pl de liposomas añadidos a 90 pl de medio de cultivo den las concentraciones finales deseadas. Los liposomas se forman mediante la técnica de extrusión con Liposofast (Sodexim, SA Muizon, Francia). La solución se pasa 41 veces a través de membranas de filtración de policarbonato (100 nm). Los liposomas se esterilizan por filtración en 50 membranas Millipore de 22 pm.

Para los ensayos de actividades de las moléculas en otros tipos de células humanas "in vitro", la fabricación de los liposomas se optimizó de dos maneras diferentes, como se ha descrito anteriormente, es decir, con respecto a una distribución de tamaño homogénea, por un lado, y con respecto a la concentración de molécula activa, por otro lado.

b) Obtención de liposomas con distribución de tamaño idéntica y con una composición que es estable en el tiempo 55 ("liposomas mejorados").

Después de la evaporación de los disolventes, la película lipídica se disuelve de nuevo en dicloroetano:etanol (3,3: 1,5; v:v) y la solución se evapora de nuevo en una corriente de nitrógeno. Se añade 1 ml de PBS mientras se agita vigorosamente, el residuo lipídico se raspa para que se disuelva de nuevo seguido de una agitación vigorosa durante 5 minutos, y después se aplica una sonicación de 10 pulsos de 1 minuto a una temperatura que no exceda

los 20 °C (Elma, S 60H, Elmasonic). Las vesículas obtenidas se extruyen y se esterilizan como se ha descrito anteriormente, excepto que la solución solo se pasa a través de las membranas de filtración dos veces.

Estos liposomas tienen una distribución de tamaño de 40 a 80 nm y contienen 0,086 mg/ml de moléculas 2.b.

c) Obtención de liposomas con una mayor concentración de moléculas 2.b. ("liposomas concentrados").

5

Para la preparación de la película lipídica, la concentración de fosfatidilcolina se duplica; la concentración de los otros compuestos permanece idéntica a la descrita anteriormente para los liposomas mejorados.

El procedimiento para producir estos liposomas es idéntico al descrito para los liposomas mejorados, excepto que 10 (1) la sonicación es de 20 pulsos de 1 minuto y (2) los disolventes se evaporan a presión reducida (aproximadamente 3 kPa; 30 mbar) utilizando un evaporador rotatorio (Buchi, modelos V 850 y R 215).

Estos liposomas tienen una distribución de tamaño de 40 a 80 nm y contienen 0,133 mg/ml de molécula 2.b.

15 La caracterización de las moléculas que componen los liposomas, la investigación de la estabilidad y de la composición de los liposomas se realizan después de la extracción de los compuestos lipídicos de acuerdo con el método de Folch et al. (19), excepto que antes de la extracción, se incuban 500 pl de la solución de liposomas con 10 pl de Triton X-100 al 2% (v:v) (Sigma) a 40 °C durante 18 h.

20 El análisis de los ácidos grasos que constituyen la fosfatidilcolina, después de la metilación de acuerdo con las técnicas de rutina, se realiza mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS).

La caracterización del grupo colina de fosfatidilcolina se realiza de acuerdo con el método de Reineckate (20).

25 La molécula 2.b se cuantifica por HPLC como se ha descrito anteriormente (preparación de los compuestos) o por cromatografía de capa fina sobre sílice como se describe en el punto 5) a continuación.

La distribución del tamaño de los liposomas se mide en liposomas fluorescentes y el análisis morfométrico se realiza mediante el programa Sert después de obtener imágenes con el microscopio de epifluorescencia (Axivert, Zeiss).

30

Los liposomas fluorescentes se producen con la misma cantidad de fosfatidilcolina descrita para los liposomas mejorados o concentrados, excepto que la fosfatidilcolina utilizada contiene fosfatidilcolina fluorescente al 5,0% (NBD-PC-oleílo; Avanti; Excitación/Emisión = 460 nm/534 nm) en el caso de los liposomas mejorados y del 2,5% en el caso de los liposomas concentrados.

35

Los liposomas se sedimentan en portaobjetos de cultivo de vidrio recubiertos en primer lugar con poli-D-lisina (Sigma, 1% en agua, p:v) y después con laminina (Sigma, 0,6% en agua). Los liposomas se fijaron con glutaraldehído (Merck) (liposomas:glutaraldehído: PBS; 15:37,5:97,5, v:v:v) antes de obtener las imágenes.

40 3) Medición de la actividad y la toxicidad

Se usan los mismos métodos para ambos casos. Para la actividad, se usa el potencial anti-GBM de los compuestos de ensayo, y la toxicidad se ensaya en las células normales de origen humano mantenidas "in vitro".

45 Se usan los siguientes métodos de medición:

a) Recuento celular

Se usó un método de recuento celular en fotografías.

50

Por ejemplo, en el caso de los cultivos en placas de 96 pocillos y en función del aumento del microscopio usado (objetivos x 10 o x 20, oculares x 10), una fotografía tomada representa un campo de visión con un diámetro igual a 1/5 del diámetro de un pocillo. Por lo tanto, el número total de células en un pocillo es igual a 5 veces el número de células por fotografía. Esta técnica se compara con una técnica convencional (tripsinización de la capa celular, 55 centrifugación de las células, suspensión de las células en una solución salina fisiológica y recuento con un contador de células THOMA) en el caso de las células C6. Los resultados obtenidos son idénticos para ambos métodos.

b) Ensayo de proteínas

El medio de cultivo se extrae de cada pocilio y se añaden por pocilio 50 pl de tampón de Laemmli (0,1 ml de Tris, 0,8 mi de glicerol, 1,6 ml de SDS al 10 %, 8 ml c.s.f de agua ultrapura).

En los pocillos de control se añaden 10 pl de una solución de la gama de albúmina sérica bovina (BSA cristalizada, 5 Sigma); la gama es de 0 a 20 pg por pocillo. Después, los pocillos se complementan con 40 pl de tampón de Laemmli. Finalmente, se añaden 200 pl de una solución de reactivo de BCA (Pierce, Estados Unidos; kit de ensayo de proteínas BCA; Thermo Scientific, Francia).

Las placas de cultivo se incuban durante 30 min a 37 °C. La densidad óptica para cada pocillo se lee y se cuantifica 10 por un lector de placas (BioRad, Estados Unidos, lector de microplacas iMark 12222) a 570 nm.

c) Viabilidad celular (prueba MTT)

Este ensayo hace posible detectar la respiración celular, especialmente la respiración mitocondrial. La solución 15 madre de sal de tetrazolio MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio, Sigma-Aldrich, Estados Unidos, ref. M5655) se prepara con 10 mg de MTT/ml de tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato, SIGMA, ref. D 1408). Esta solución se añade directamente al medio de cultivo en cada pocillo; la concentración final de MTT es de 25 pg/ ml. Después, la placa se incuba a 37 °C durante al menos 1 h.

20 Después de la aparición de granos de formazán de color azul, producidos principalmente por el transporte de electrones mitocondriales, se tomaron fotografías con el fin de contar las células con una alta densidad de granos de formazán; esta técnica se usa en el caso de las líneas U87-MG. Después, para esta línea y los demás cultivos, los medios se retiran y se añaden 100 pl de dimetilsulfóxido (DMSO, SDS CARLO ERBA, Italia) para disolver los depósitos de formazán.

25

La densidad óptica se lee y se cuantifica usando el lector de placas (BioRad, lector de microplacas iMark) a 490 nm.

La viabilidad a veces también se ensaya por la técnica de exclusión azul de tripano.

30 4) Inmunomarcado de las células y obtención de imágenes

Los anticuerpos primarios anti-CD133 (poli, Abnova), anti-GFAP (poli, Sigma), anti-NFL (mono, Santa Cruz) y antifibroblastos (ERTR7, Santa Cruz) se diluyen hasta 1/100 en el caso de los primeros tres anticuerpos y hasta 1/50 en el caso del último.

35

Para detectar IDH-R132H (marcador de gliomas de bajo grado (21)) y CD31 (marcador de células endoteliales (22)), los anticuerpos primarios utilizados se obtuvieron en Clinisciences (ratón, dilución 1/20) y en Spring Bioscience (conejo, dilución 1/250), respectivamente.

40 Los anticuerpos secundarios correspondientes al reconocimiento de los anticuerpos primarios son anticuerpos anticonejo acoplados a peroxidasa (cabra, Sigma), anti-ratón acoplados a Dylight 488 (oveja, Sigma), anti-ratón acoplados a Dylight 488 (oveja, Sigma) y anti-rata acoplados a FITC (conejo, Sigma). Las diluciones son 1/4000, 1/1000, 1/4000 y 1/400 respectivamente.

45 IDH1-R132H y CD31 se detectan usando anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa. Se obtienen de Fischer Scientific (anti-ratón, dilución 1/1000) y de Sigma (anti-conejo, dilución 1/500) respectivamente.

Las células se permeabilizan durante 5 min con Triton X-100 al 0,1 % (Sigma) en PBS (Fisher Scientific). Los sitios no específicos se bloquean con BSA al 2 % (Sigma) en PBS. Las incubaciones se realizan respectivamente durante 50 1 h a temperatura ambiente, 48 h a 4 °C, 24 h a 4 °C y 1 h a temperatura ambiente durante los anticuerpos anti- CD133, anti-GFAP, anti-NFL y anti-Fibroblastos. La incubación con los anticuerpos secundarios se realiza durante 1 h a temperatura ambiente. Las células positivas CD133 se detectan por el sistema DAB/H2O2 (Sigma), y se observan con un microscopio óptico.

55 La detección colorimétrica de los marcadores IDH1-R132H y CD31 se realiza con el vector NOVARED de sustrato (Eurobio). Las células coloreadas también se detectan mediante microscopía óptica. La fluorescencia se detecta y las imágenes se obtienen utilizando un microscopio de epifluorescencia (Axiovert, Zeiss, Alemania). La fluorescencia se detecta y las imágenes se obtienen usando un microscopio de epifluorescencia (Axiovert, Zeiss, Alemania).

5) Extracción de los lípidos y la identificación de los oxiesteroles

Las células se lavan con NaCl al 0,9 %o, se recogen mecánicamente, se suspenden en tampón Tris-HCl (10 mM; pH 7,4) y se homogenizan con un Potter (1000 r.p.m. y 13 reciprocidades). La homogeneización se realiza en hielo. La 5 extracción se realiza a 4 °C después de añadir 19 volúmenes de cloroformo:metanol (2:1, v/v) durante 1 volumen de suspensión celular de acuerdo con Folch y col. (19). La fase orgánica y la fase acuosa se separan añadiendo 0,2 volúmenes de KCl al 0,74 % (p/v).

Después de la evaporación de la fase orgánica en un evaporador rotatorio (Buchi, R-215, Suiza), el residuo lipídico 10 se recoge en cloroformo. Las capas TLC se lavan previamente con cloroformo:metanol (1:1, v/v) y se activan a 100 °C durante 1 h. Los lípidos se eluyen con el siguiente sistema: éter de petróleo (punto de ebullición: 60-70 °C):éter:ácido acético (80:20:1,3, v/v/v). Los estándares depositados son colesterol, 7-ceto-colesterol, 7beta-OHCH, 7beta-OHCH-C3-éster y la molécula 2.b. Los lípidos y estándares se detectan con reactivo Maccala. Los valores Fr son respectivamente 0,21, 0,09, 0,08, 0,27 y 0,23 para colesterol, 7-ceto-colesterol, 7beta-OHCH, 7beta-OHCH-C3- 15 éster y molécula 2.b. Los rangos de calibración de 0,5 a 2 pg para cada estándar se realizan por separado. Las intensidades de los puntos de interés se calculan con respecto a los estándares después de explorar las capas finas de sílice desarrolladas.

Los disolventes usados son de grado AnalAR o HPLC.

20

6) Análisis de la actividad y la inhibición de la LDH (lactato deshidrogenasa, EC 1.1.1.27)

Las mediciones de la actividad de LDH y de su inhibición por un inhibidor de rutina, oxamato (23), se validaron mediante el método espectrométrico (24) usando la LDH purificada de Lactobacillus leichmannii (LL) (Sigma) como 25 patrón.

A continuación, las actividades de LDH y su inhibición se detectaron mediante la técnica de "ensayo en gel' (25). La fuente de actividad utilizada fue LDH LL y LDH, parcialmente purificada, de líneas GBM humanas U87-MG (LDH GBM). La detección de "ensayo en gel" se realizó después del enfoque isoeléctrico (IEF) en geles de electroforesis 30 de las muestras LDH LL y LDH GBM.

a) Purificación parcial de LDH GBM

Las células recogidas en tampón de fosfato (50 mM, Ph 7.2. Pi) experimentan varios ciclos de congelación (-20 35 °C)/descongelación y el material celular se homogeniza. Después de la centrifugación a 10.000 g durante 45 minutos a 4 °C, se recoge el sobrenadante y se congelan las alícuotas que contienen glicerol al 10% (v:v) a -80 °C. En el momento deseado, las alícuotas, después de la descongelación, se someten a cromatografía en una columna de filtración (Biogel P-60, BioRad) preparada en Pi. El volumen de gel es de 9 ml y el diámetro interior de la columna es de 0,4 cm. La elución se realiza a presión atmosférica. La primera fracción de 1,4 ml se elimina y la actividad de LDH 40 se recoge en los siguientes 2 ml. Los componentes proteicos de esta fracción (LDH GBM) se caracterizaron mediante la técnica SDS PAGE, seguida de tinción con nitrato de plata o mediante Western blot. Se encuentran los pesos moleculares característicos de la LDH (31 kDa, para la subunidad, o 62 kDa para su asociación en un dímero).

45 b) IEF

Los mini-geles de 7,5 (% de Ty de 2,6 (% de C) se vierten en Pi con Ampholines (BioRad), lo que permite formar un gradiente de pH en el intervalo de 7 a 5 después del pre-enfoque en una cámara fría. Los recipientes usados son del tipo mini-protean 3 (BioRad). El tampón del ánodo tiene un pH de 2,0 y el tampón del cátodo tiene un pH de 10,0. 50 Las muestras LDH LL y LDH GBM se depositan sin desnaturalización y el enfoque se realiza durante 210 minutos, aumentando la tensión de 100 V a 300 V en la cámara fría.

c) Actividad de LDH

55 La actividad de LDH se detecta mediante el sistema de lactato/NAD/MTT/metosulfato de fenazina (formación de un precipitado del tipo formazán en el gel IEF); este sistema se describe en la referencia (25).

La adición de oxamato (18 mM) o de la molécula 2.b, en forma etanólica (36 mM) permite medir el grado de inhibición de las actividades de LDH LL y LDH GBM.

B / Actividad anti-GBM "in vitro"

Los siguientes ejemplos 7 a 11 se presentan no como realizaciones de la invención, sino como ejemplos que son 5 útiles para comprender la invención.

B.1. El modelo animal

Se usaron cultivos de células C6 (rata) en las condiciones operativas que se han mencionado anteriormente (sección 10 II, A).

Ejemplo 7: Actividad anti-GBM "in vitro" en cultivos de células C6 (rata)

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1 a continuación, así como en la figura 3.

15

Tabla 1

Moléculas ensayadas (etanol al 3 %): 1.a (Ej. 3) 15 pm 2.a (Ej. 5) 15 pm 1.a después 2.a 15 pm + 7,5 pm

Células vivas residuales: 3 % 100 % 0 %

La figura 3 (aumento 20 x 10) muestra la aparición de los cultivos de células C6 en las condiciones operativas que se han mencionado anteriormente (sección II, A) en presencia de molécula 1.a (Ej. 3) o después del tratamiento 20 secuencial con la molécula 1.a y después la molécula 2.a (Ej. 5), en 19 días y en 35 días.

Los resultados (Tabla 1) muestran que la molécula 1.a, en forma etanólica, es citotóxica, después de 19 días de tratamiento. A 15 pM de 1.a y después de 14 días de tratamiento, el número de células, el nivel de proteínas y el ensayo MTT se reduce en un 30 % y alcanzar una reducción del 97 %, como mucho, en 19 días. A los 19 días de 25 tratamiento, también se observa dependencia de la dosis durante 7,5 y 3,3 pM de 1.a y a 15 pM se observa un aumento al 20 % de la relación MTT/célula con respecto a los cultivos de control.

Con el fin de eliminar las células residuales, se usó un tratamiento secuencial. En primer lugar, las células se tratan con 15 pM de molécula 1.a y el día 19° de tratamiento, se añade la molécula 2.a a una concentración de 7,5 pM.

30

No se observó ninguna célula viable; únicamente se adhieren los "cadáveres" celulares al sustrato sólido del cultivo celular (fondo del pocillo) como se muestra en la figura 3.

Para resumir, el tratamiento secuencial con la molécula 1.a, y después la molécula 2.a, muestra una eficacia 35 completa frente a este tipo celular. Las observaciones indican un aumento de la respiración total de las células antes de su destrucción.

B.2. El modelo humano: actividad anti-GBM "in vitro" en cultivos de células humanas (línea U-87 GM)

40 B.2.1. Definición del modelo "in vitro" y de la expresión de los resultados a) Caracterización de los diferentes tipos celulares

Las células U-87GM se cultivaron en las condiciones operativas que se han descrito anteriormente (sección II, A).

45

Los cultivos se forman por dos componentes celulares: una capa celular compuesta por células que se comportan como células normales (no cancerosas) y agregados celulares formados por células de tipo GBM.

La figura 4 muestra una imagen óptica (10 x 10) que es característica del cultivo. Puede observarse una capa celular 50 (CL), sobre la que los agregados celulares (CA) de forma hemisférica se fijan. La figura 5 (20 x 10) muestra, por inmunomarcado, que las células CD133+ (células madre), descritas en los GBM humanos, se sitúan en los agregados celulares y no en la CL. El marcado por inmunofluorescencia muestra la presencia de GFAP, un marcador de astrocitos normales (figuras 6 y 7; 20 x 10) (26) en la CL y CA (figuras 6 y 7; 20 x 10) y de neurofilamentos en CL y CA. Sin embargo, el marcado específico de fibroblastos, células con alto potencial de 55 multiplicación, únicamente se encuentra en el caso de CA. Se observan muy pocas células positivas a IDH1-R132H en CL y CA. Por el contrario, están presentes células positivas a CD31 en CL y CA.

La observación por microscopía fotónica muestra claramente que las células de los CA se dividen muy rápidamente (tiempo de duplicación de como mucho 16 h), mientras que las células que forman el CL tienen un tiempo de duplicado de 96 h.

Estas observaciones justifican el método de recuento celular (células marcadas o no con granos de formazán) que se ha desarrollado; de hecho, el recuento después de la tripsinización no puede distinguir entre las células de CL y CA. Las imágenes también muestran que únicamente los CA tienen un carácter de GBM (tiempo de duplicado corto, presencia de células madre y fibroblastos). Por lo tanto, los resultados obtenidos son los del efecto de las moléculas 10 ensayadas en CA.

b) Expresión de los resultados

Los resultados se expresan de acuerdo con los siguientes parámetros:

15

(i) Eficacia de las moléculas, de acuerdo con la invención

- Cuantificación de las células residuales, las células madre en particular.

- Eficacia de las moléculas de acuerdo con la invención con el tiempo

20

El medio de cultivo que contiene las moléculas de acuerdo con la invención se reemplaza con medio fresco y la multiplicación celular "de novo" se examina: ninguna multiplicación "de novo" significa una destrucción total de las células GBM, incluyendo las células madre.

25 (ii) Efecto de las moléculas en la respiración total de las células GBM.

(iii) Comparación de los resultados obtenidos con las moléculas de acuerdo con la invención con los obtenidos con 7p-OHCH-C3-éster (control).

30 B.2.2. Resultados

Se usaron cultivos de células U87-MG (humanas) en las condiciones operativas que se han mencionado anteriormente (sección II, A).

35 Se usó 7beta-OHCH-C3-éster como control.

Ejemplo 8: Estudio de la actividad anti-GBM "in vitro" de la molécula 2.a (Ej. 5) en forma liposomal

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 2 a continuación.

40

Tabla 2

: Molécula 2.a (15 pM) en forma liposomal 7p-OHCH-C3-éster (80 pM) en forma liposomal

Días de tratamiento: Proteínas MTT/célula Proteínas MTT/célula

6: 70 100 70 100

8: 25 140 20 100

13: 15 120 15 100

15: 0 0 15 100

Estos resultados son el valor medio de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Los resultados se expresan como un porcentaje con respecto a los controles.

45

Las observaciones muestran que 15 pM de la molécula 2.a, en forma liposomal, reducen la presencia de células GBM (CA) a cero después de 15 días de tratamiento.

Únicamente permanecen las células con baja división (CL). El efecto no es dependiente de la dosis. El 7p-OHCH-

C3-éster no actúa en forma etanólica en los GBM (CA) (véase también el Ejemplo 9), y únicamente actúa en forma liposomal, concretamente a 80 pM. Si eficacia no es mejor, o incluso disminuye, al aumentar la dosis de 7p-OHCH- C3-éster en forma liposomal.

5 Sin embargo, si el día 13° de tratamiento el medio de cultivo que contiene el 7p-OHCH-C3-éster se retira y se reemplaza con un medio de cultivo recién preparado que no contiene este fármaco, se observa multiplicación celular y, en paralelo, un aumento en el ensayo MTT después de dos días; este aumento es del 40 %. Este no es el caso para la molécula 2.a: en ausencia de esta molécula, no se observa ninguna multiplicación celular.

10 La Tabla 2 también muestra un gran aumento en MTT/célula (140 % con respecto a los controles) en el momento cuando la mayor parte de las células desaparecen (8 días de tratamiento). Este no es el caso para el 7p-OHCH-C3- éster liposomal: incluso a 80 pM, la relación MTT/celular no varía.

Esta observación muestra una acción diferente entre las dos moléculas: la respiración celular total aumenta antes de 15 la muerte masiva de las células. Este no es el caso para el 7p-OHCH-C3-éster.

Ejemplo 9: Estudio de actividad anti-GBM "in vitro" de molécula 2.b (Ej. 6) en forma etanólica

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3 a continuación.

20

Tabla 3

: Molécula 2.b (30 pM) en forma etanólica 7p-OHCH-C3-éster (30 pM) en forma etanólica

Días de tratamiento: Proteínas MTT/célula Proteínas MTT/célula

4: 100 100 100 100

6: 100 100 100 100

9: 90 160 100 100

15: 50 130 100 100

22: 0 0 100 100

Estos resultados son el valor medio de tres experimentos independientes realizados cada uno por triplicado. Los resultados se expresan como un porcentaje con respecto a los controles. Por encima de 30 pM, el 7p-OHCH-C3- 25 éster ya no es soluble en etanol.

Las observaciones muestran que la molécula 2.b es completamente eficaz a 30 pM en forma etanólica: no queda ninguna célula GBM, incluso después de eliminar el principio activo. Al igual que para la molécula 2.a, en forma liposomal, la respiración celular aumenta antes de la muerte celular. Este no es el caso para el 7p-OHCH-C3-éster 30 etanólico, no se observa actividad antitumoral.

Además, el reemplazo del medio de cultivo con medio fresco que no contiene el compuesto 2.b en 22 días no conduce a ninguna multiplicación celular.

35 Ejemplo 10: Inmunomarcado de las células madre CD133+ con el sistema A/B peroxidasa

El inmunomarcado se realiza como se ha descrito anteriormente (sección II, A).

Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4

Días de tratamiento: Células CD133+

Cultivos no tratados (Controles): Molécula 2.b (30 pM) en forma etanólica 7p-OHCH-C3-éster (80 pM) en forma liposomal

4: 100 100 100

22: 100 0 50

Estos resultados son el valor medio de dos experimentos independientes realizados cada un por triplicado. Los resultados se expresan como un porcentaje de células positivas CD133 con respecto a los controles. Estos 5 experimentos son independientes de los descritos en los Ejemplos 8 y 9.

Como en las observaciones descritas en las Tablas 2 y 3, 7p-OHCH-C3-éster en forma liposomal y la molécula 2.b en forma etanólica reducen el nivel de proteínas en un 85 % y en un 100 % con respecto a las células de control no tratadas.

10

Los resultados muestran que las células madre se destruyen completamente por la molécula 2.b. Este no es el caso para el 7p-OHCH-C3-éster, incluso cuando se administra en forma liposomal.

La figura 9 (inmunomarcado de las células CD133+) muestra claramente su desaparición después de 22 días de 15 tratamiento. Este no es el caso para el 7p-OHCH-C3-éster en forma liposomal (figura 10, inmunomarcado de las células CD133+); en este caso, aún está presente el 50 % de las células CD133+ entre las células residuales. El reemplazo del medio de cultivo con medio fresco que no contiene el compuesto 2.b en 22 días no conduce a la aparición de células madre CD133+.

20 Ejemplo 11: Estudio del destino de la molécula 2.b (Ej. 6) en forma etanólica "in vitro" en GBM de origen humano

La extracción y el análisis de los lípidos de GBM tratado con 30 pM de la molécula 2.b en forma etanólica no muestra la presencia de 7beta-OHCH-C3-éster después de 24 h o 10 días de tratamiento, siendo este último 25 momento cuando se activa la muerte celular. Sin embargo, se observa un 0,12 % y un 0,18 % de la molécula 2.b transformada en 7beta-OHCH después de 1 día y 10 días de tratamiento respectivamente. Los experimentos de control muestran que estos niveles tan bajos de 7beta-OHCH no inducen ninguna muerte de GBM.

Ejemplo 12: Estudio de toxicidad

30

La toxicidad se ensayó "in vitro" en diversos tipos de células normales de origen humano.

a) En astrocitos

35 Las células usadas son células de origen humano (ScienCell, Estados Unidos, ref. 1800), que se han mencionado anteriormente (sección II, A).

El tipo de astrocito se valida por la presencia de GFAP, el marcador estándar de astrocitos normales (figura 11; aumento x 200).

40

Las moléculas 2.a (forma liposomal) y 2.b (forma etanólica) no son tóxicas en cultivos primarios de astrocitos humanos normales (no cancerosos) a 30 pM, después de 30 días de tratamiento.

b) En otras células 45

Las células usadas son células hepáticas (ScienCell, Estados Unidos, ref. 50200), células renales (ScienCell, Estados Unidos, ref. 4120), células musculoesqueléticas (ScienCell, Estados Unidos, ref. 3500) y células cardiacas

(ScienCell, Estados Unidos, ref. 6300), de origen humano, que se han mencionado anteriormente (sección II, A).

Las moléculas 2.a (forma liposomal) y 2.b (forma etanólica) no son tóxicas a 30 |jM y después de al menos 30 días de tratamiento, en cultivos primarios de células hepáticas, células renales, células musculoesqueléticas y células 5 cardiacas de origen humano.

Ejemplo 13: Estudio de la actividad de la molécula 2.b (Ej. 6) "in vitro" en otros cánceres

Las células cancerosas usadas son de células cancerosas de hígado (ref. ATCC-HB-8065), próstata (ref. ATCC- 10 HTB-81), mama (ref. ATCC-HTB-19), y de células cancerosas de colon (ECACC-HT29/219) de origen humano, que se han mencionado anteriormente.

A 30 jM y en forma etanólica, la molécula 2.b no muestra ningún efecto sobre la división celular y la respiración de las células cancerosas de hígado, próstata o de mama de origen humano.

15

A 15 jM, la molécula 2.b en forma liposómica mejorada no es tóxica para las células de cáncer de colon.

Ejemplo 14. Estudio de la actividad de la molécula 2.b en forma liposómica mejorada "in vitro" en leucemia mielomonocítica crónica (CMML)

20

Los glóbulos blancos se aíslan de una muestra de sangre recogida de un paciente que padece CMML. Las células se tratan una vez con 10 |jM de la molécula 2.b en forma liposómica mejorada 24 horas después del cultivo mediante siembra en una capa de alimentación (17).

25 Los resultados se muestran en las fotografías de la Figura 12 (ampliación 20 x 10).

Los controles son células tratadas con liposomas vacíos: la fotografía de la izquierda superior marcada con la letra A se tomó después de 48 h de tratamiento y la fotografía de la izquierda inferior con la letra B después de 72 h de tratamiento.

30

Para las células tratadas con 2.b, la fotografía superior derecha marcada con la letra C se tomó después de 48 h de tratamiento y la fotografía inferior derecha con la letra D después de 72 h de tratamiento.

Los resultados muestran un efecto notable de la molécula 2.b después de 72 h de tratamiento. La multiplicación 35 celular se ralentiza considerablemente en relación con el control y se observan muchas células con aspecto necrótico.

Ejemplo 15. Estudio de la actividad de las moléculas 1.b y 2.b "in vitro" en neuroblastomas humanos (ATCC-CRL- 2266)

40

Los neuroblastomas se trataron con liposomas vacíos (controles) o con liposomas que contienen la molécula 1.b o

2.b, 24 horas después de comenzar el cultivo. Las células se tratan una vez con 22 jM de la molécula 1.b o 22 jM de molécula 2.b. La forma liposomal está concentrada.

45 Los resultados se muestran en las fotografías en la Figura 13 (aumento 10 x 10).

Para las células de control, se tomó la fotografía superior izquierda marcada con la letra A después de 7 días de tratamiento; la fotografía izquierda inferior marcada con la letra B se tomó después de 28 días de tratamiento.

50 Para las células tratadas con la molécula liposómica concentrada 1.b, la fotografía marcada con la letra C (en el centro, en la parte superior) se tomó después de 7 días de tratamiento y la fotografía se marcó con la letra D (en el centro, en la parte inferior) después de 28 días de tratamiento. Para las células tratadas con la molécula liposómica concentrada 2.b, se tomó la fotografía superior derecha marcada con la letra E después de 7 días de tratamiento.

55 Los resultados muestran una actividad notable de la molécula 2.b con respecto a la molécula 1.b. Después de 28 días de tratamiento, la molécula 1.b es tóxica para casi todas las células, en comparación con las células de control. Para la molécula 2.b, ya se observa un efecto tóxico radical después de 7 días de tratamiento; no se observa ninguna célula viable.

Ejemplo 16. Estudio de la inhibición de la actividad de LDH extraída de GBH humano "in vitro" (líneas U87-MG) por la molécula 2.b

Este ejemplo se presenta, no como una realización de la invención, sino como un ejemplo que es útil para 5 comprender la invención.

El objetivo de estos experimentos fue demostrar el potencial de inhibición de la actividad enzimática de LDH de las moléculas de la serie 2. El estudio se realizó con la molécula 2.b y su potencial inhibidor se ensayó en LDH de Lactobacillus leichmannii (LL) y LDH parcialmente purificado de líneas de GBM humano (U87-MG) como se ha 10 descrito anteriormente en la sección "A/PROTOCOlOs 6)".

La actividad de LDH se detecta mediante la técnica de "ensayo en gel" sobre geles de electroforesis IEF, que se describió en la sección "A/PROTOCOLOS 6)" (25); la precisión de esta técnica es de 0,2 unidades de pH. La actividad de LDH es detectada por un precipitado de color azul oscuro, del tipo formazán, el sitio donde se localiza la 15 actividad de LDH.

La Figura 14 (A) muestra la actividad de LDH para LDH LL a pHi 6,2 y para LDH GBM a pHi 6,4.

Los resultados muestran que la adición de oxamato, en forma acuosa (18 mM), o de la molécula 2.b, en forma 20 etanólica (36 mM), inhibe la actividad enzimática de LDH LL casi por completo y la de LDH GBM (B) parcialmente.

El potencial de inhibición de la actividad enzimática de LDH GBM por la molécula 2.b en combinación con el aumento en la tinción de MTT antes de la muerte celular de GBM (Tablas 2 y 3, Figuras 8 y 9) valida la hipótesis del mecanismo de acción de los compuestos de fórmula (I): las moléculas de la invención inhibirán la actividad de LDH 25 y, por consiguiente, causarán un estallido de respiración mitocondrial.

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26. Sensenbrenner M, Devilliers G, Bock E, Porte A. Differentiation, 1980, 17: 51-61.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto de fórmula (I) que tiene una estructura básica de beta-hidroxicolesterol

5

imagen1

caracterizado porque se selecciona de los siguientes compuestos:

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((ferc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-

10 metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a);

15 - 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]-fenantren-3-ilo (molécula 2.b),

para su uso en el tratamiento de hemopatías malignas.

20 2. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde las hemopatías malignas son del

tipo mieloide.
3. Compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde las hemopatías malignas son linfomas.

25
4. Compuesto de fórmula (I) que tiene una estructura básica de beta-hidroxicolesterol

imagen2

30 caracterizado porque se selecciona de los siguientes compuestos:

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((ferc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-

metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

35 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]-fenantren-3-ilo (molécula 2.b),

para su uso en el tratamiento de neuroblastomas.
5. Compuesto de fórmula (I) que tiene una estructura básica de beta-hidroxicolesterol

imagen3

5

caracterizado porque se selecciona de los siguientes compuestos:

- 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-((ferc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-

metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.a);

10 - 2-(2-(((benciloxi)carbonil)amino)-acetamido)propanoato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 1.b);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-((terc-butoxicarbonil)oxi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-
2.3.4.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17- tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo (molécula 2.a);

- 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-carboxilato de 7-acetoxi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-

15 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]-fenantren-3-ilo (molécula 2.b),

para su uso en el tratamiento de melanomas.
6. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en 20 forma de una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto como se define en las

reivindicaciones 1,4 y 5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en forma de una composición farmacéutica que consiste en un liposoma que comprende al menos un compuesto como

25 se define en las reivindicaciones 1, 4 y 5 en solitario o junto con otro principio activo.
8. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en forma de una composición farmacéutica que consiste en una solución alcohólica que comprende al menos un compuesto como se define en las reivindicaciones 1, 4 y 5 en solitario o junto con otro principio activo.

30
9. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en forma de una composición farmacéutica que es adecuada para la administración por vía oral.
10. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en 35 forma de una composición farmacéutica para administración por vía oral, seleccionada de comprimidos, cápsulas,

polvos, gránulos, soluciones, emulsiones, suspensiones orales, gotas, jarabes, complejos de compuestos según se define en las reivindicaciones 1, 4 y 5 con sales biliares y combinaciones de compuestos de fórmula (I) con fosfolípidos, en forma liposómica o no liposómica.

40 11. Compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en

forma de una composición farmacéutica en la que dicho compuesto, como se define en las reivindicaciones 1, 4 y 5, se usa como el único principio activo, o junto con un agente anticanceroso.