ES2659991T3 - Plantas de girasol resistentes a herbicidas con múltiples alelos resistentes a herbicidas de AHASL1 y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Planta de girasol resistente a herbicidas que comprende dos alelos resistentes a herbicidas diferentes de un gen de la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa 1 (AHASL1) de girasol en la que un primer alelo codifica una primera proteína AHASL1 resistente a herbicidas que comprende una sustitución de alanina por treonina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 7 de SEQ ID NO: 20 y un segundo alelo codifica una segunda proteína AHASL1 resistente a herbicidas que comprende una sustitución de alanina por valina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 90 de SEQ ID NO: 20 o una sustitución de prolina por leucina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 82 de SEQ ID NO: 20; en la que dicha planta de girasol resistente a herbicidas es resistente a al menos un herbicida inhibidor de AHAS.

Description

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particularmente un herbicida de sulfonilurea y/o de imidazolinona. Tales plantas encuentran uso en agricultura, particularmente en métodos para controlar malas hierbas que implican el uso de herbicidas de imidazolinona y/o de sulfonilurea tal como se describe en el presente documento.

La presente divulgación implica el uso de una planta de girasol que comprende un gen AHASL1 que comprende la mutación A122T. Un gen AHASL1 de este tipo codifica una proteína AHASL1 que comprende la sustitución de aminoácido A122T. La presente divulgación no depende del uso de una variedad, línea o planta de girasol particular que comprenda un gen AHASL1 con la mutación A122T. Cualquier planta de girasol que comprenda al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación A122T puede usarse en los métodos divulgados en el presente documento. En un caso, el gen AHASL1 con la mutación A122T comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 19 o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 20.

Un ejemplo de una línea de girasol que comprende al menos una copia del alelo mutante A122T de AHASL1 es GM40 (véanse el documento WO 2007005581 y la solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 60/695.952; presentada el 1 de julio de 2005; ambos de los cuales se incorporan en el presente documento como referencia). Se realizó un depósito de semillas del girasol GM40 en el depósito de patentes de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, VA 20110 EE. UU. el 17 de mayo de 2005, y se le asignó el número de depósito de patentes de ATCC PTA-6716. El depósito de la línea de girasol GM40 se realizó para un plazo de al menos 30 años y al menos 5 años tras recibirse en la ATCC la petición más reciente de proporcionar una muestra del depósito. Adicionalmente, los solicitantes han cumplido todos los requisitos del 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, incluyendo proporcionar una indicación de la viabilidad de la muestra.

Otro ejemplo de una línea de girasol que comprende al menos una copia del alelo mutante A122T de AHASL1 es GM1606 (véase el documento WO 2007005581). Se realizó un depósito de semillas del girasol GM1606 en el depósito de patentes de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, VA 20110 EE. UU. el 19 de mayo de 2006, y se le asignó el número de depósito de patentes de ATCC PTA-7606. El depósito de girasol GM1606 se realizó para un plazo de al menos 30 años y al menos 5 años tras recibirse en la ATCC la petición más reciente de proporcionar una muestra del depósito. Adicionalmente, los solicitantes han cumplido todos los requisitos del 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, incluyendo proporcionar una indicación de la viabilidad de la muestra.

La presente divulgación implica el uso de una planta de girasol que comprende un gen AHASL1 que comprende la mutación A205V. Un gen AHASL1 de este tipo codifica una proteína AHASL1 que comprende la sustitución de aminoácido A205V. La presente divulgación no depende del uso de una variedad, línea o planta de girasol particular que comprenda un gen AHASL1 con la mutación A205V. Cualquier planta de girasol que comprenda al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación A205V puede usarse en los métodos divulgados en el presente documento. En un caso, el gen AHASL1 con la mutación A205V comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 23 o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24.

Plantas de girasol que comprenden al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación A205V se usan ampliamente en la producción comercial de girasoles y están fácilmente disponibles. Cualquiera de tales variedades de plantas de girasol comercialmente disponibles puede usarse en los métodos divulgados en el presente documento. Tales variedades están disponibles de diversas fuentes de empresas de semillas comerciales (por ejemplo, Nidera S.A., Buenos Aires, Argentina; Dekalb Genetics Corporation, Dekalb, IL, EE. UU.; Mycogen Seeds, Indianápolis, IN, EE. UU.; Seeds 2000, Breckenridge, MN, EE. UU.; Triumph Seed Company, Ralls, TX, EE. UU.) e incluyen, pero no se limitan a, Paraiso 101CL, Paraiso 102CL, DKF38,-80CL, 8H429CL, 8H419CL, 8H386CL, 8H358CL, 629CL, 630,CL, 4682NS/CL, 4880NS/CL, Barracuda, Charger, Viper, 620CL, 650CL, y 660CL. Además, se mantienen semillas de plantas de girasol que comprenden al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación A205V en el National Center for Genetic Resources Preservation, Fort Collins, Colorado, y pueden obtenerse con los números de registro PI 633749 y PI 633750.

La presente divulgación implica el uso de una planta de girasol que comprende un gen AHASL1 que comprende la mutación P197L. Un gen AHASL1 de este tipo codifica una proteína AHASL1 que comprende la sustitución de aminoácido P197L. La presente divulgación no depende del uso de una variedad, línea o planta de girasol particular que comprenda un gen AHASL1 con la mutación P197L. Cualquier planta de girasol que comprenda al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación P197L puede usarse en los métodos divulgados en el presente documento. Se han divulgado plantas de girasol que comprenden al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación P197L en el documento WO 2006024351 y la solicitud de patente en fase nacional estadounidense con n.º de serie 11/659.007, con fecha de presentación internacional del 29 de julio de 2005; ambos de los cuales se incorporan en el presente documento como referencia. En un caso, el gen AHASL1 con la mutación P197L comprende un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 21 o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22.

El servicio de investigación del departamento de agricultura de los Estados Unidos ha liberado al público tres líneas de girasol que comprenden al menos un alelo de un gen AHASL1 con la mutación P197L. Las tres líneas son HA

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469, RHA 470 y RHA 471. Pueden obtenerse semillas de cada una de las tres líneas de Seedstocks Project, Department of Plant Sciences, Loftsgard Hall, North Dakota State University, Fargo, ND 58105, EE. UU.

La presente divulgación implica plantas de girasol con mutaciones en el gen AHASL1 de girasol. Estas mutaciones dan lugar a proteínas AHASL1 de girasol que comprenden sustituciones de aminoácido específicas en sus secuencias de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de una proteína AHASL1 de girasol de tipo natural. Tales sustituciones de aminoácido incluyen, por ejemplo, A122T, A205V y P197L. Por “A122T” quiere decirse la sustitución por treonina de la alanina en la posición de la proteína AHASL1 de girasol que corresponde a la posición de aminoácido 122 en la proteína AHASL1 de Arabidopsis thaliana. Por “A205V” quiere decirse la sustitución por valina de la alanina en la posición de la proteína AHASL1 de girasol que corresponde a la posición de aminoácido 205 en la proteína AHASL1 de Arabidopsis thaliana. Por “P197L” quiere decirse la sustitución por leucina de la prolina en la posición de la proteína AHASL1 de girasol que corresponde a la posición de aminoácido 197 en la proteína AHASL1 de Arabidopsis thaliana.

A menos que se indique lo contrario o resulte obvio a partir del contexto, las posiciones de aminoácido en la proteína AHASL1 de girasol a las que se hace referencia en el presente documento son las posiciones correspondientes en la proteína AHASL1 bien estudiada de Arabidopsis thaliana. Las posiciones de aminoácido en la proteína AHASL1 de girasol que corresponden a posiciones de aminoácido de AHASL1 de Arabidopsis thaliana 122, 197 y 205 son 107, 182 y 190, respectivamente. Véase el documento WO 2007005581 (tabla 4 en el mismo) para información adicional sobre las posiciones de sustituciones de aminoácido conocidas que confieren resistencia a herbicidas a proteínas AHASL y sus posiciones correspondientes en las proteínas AHASL1 de girasol y de Arabidopsis thaliana.

La presente divulgación se refiere a proteínas AHASL con sustituciones de aminoácido en posiciones de aminoácido particulares dentro de regiones conservadas de las proteínas AHASL 1 de girasol divulgadas en el presente documento. Además, los expertos habituales reconocerán que tales posiciones de aminoácido pueden variar dependiendo de si se añaden o se eliminan aminoácidos, por ejemplo, del extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos. Por tanto, la divulgación abarca las sustituciones de aminoácido en la posición mencionada o posición equivalente. Por “posición equivalente” quiere decirse una posición que está dentro de la misma región conservada que la posición de aminoácido mostrada a modo de ejemplo. Tales regiones conservadas se conocen en la técnica (véase la tabla 4 en el documento WO 20070055581) o pueden determinarse mediante múltiples alineaciones de secuencias o mediante otros métodos conocidos en la técnica.

La presente divulgación se refiere además a un método para producir una planta de girasol híbrida que comprende resistencia a al menos un herbicida inhibidor de AHAS. El método implica la polinización cruzada de una primera planta de girasol con una segunda planta de girasol para producir semillas de girasol híbridas que pueden sembrarse y dejarse crecer para dar una planta de girasol híbrida, particularmente una planta de girasol híbrida F1. La primera planta de girasol comprende en su genoma al menos una copia de un primer alelo de un gen AHASL1, y la segunda planta de girasol comprende en su genoma al menos una copia de un segundo alelo de un gen AHASL1. Preferiblemente, la primera planta de girasol es homocigótica para el primer alelo, y la segunda planta de girasol es homocigótica para el segundo alelo. El primer alelo codifica una proteína AHASL1 de girasol que comprende la sustitución de aminoácido A122T. El segundo alelo codifica una proteína AHASL1 de girasol que comprende la sustitución de aminoácido A205V o la sustitución de aminoácido P197L.

El método para producir una planta de girasol híbrida puede implicar además cosechar una semilla resultante de dicho cruce y seleccionar al menos una planta de girasol de progenie a partir de dicho cruce que comprende en su genoma dichos alelos primero y segundo. Una progenie de este tipo puede seleccionarse mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo amplificación por PCR de la totalidad o parte del gen AHASL1 para determinar los alelos que están presentes en la planta. Puede obtenerse ADN para su uso en una amplificación por PCR de este tipo a partir de una parte de semilla de girasol resultante del cruce o una parte de una planta que se hace crecer a partir de una semilla de este tipo. En el ejemplo 2 a continuación, se proporciona un método preferido de la invención para seleccionar la planta de progenie deseada que implica la amplificación por PCR. Alternativamente, la planta de progenie puede seleccionarse evaluando el rendimiento de la planta de progenie en una prueba de resistencia a herbicidas en condiciones de invernadero o en campo tal como se describe a continuación en el presente documento.

Puede producirse una planta de girasol híbrida cruzando una primera planta de girasol que es homocigótica para el alelo A205V de AHASL1 con una segunda planta de girasol que es homocigótica para el alelo A122T de AHASL1. Se espera que todas las semillas híbridas resultantes y plantas híbridas que crecen a partir de tal semilla comprendan en sus genomas un alelo A205V de AHASL1 y un alelo A122T de AHASL1. O bien el primer o bien el segundo girasol pueden ser el donante de polen para el cruce.

En otro caso, una planta de girasol híbrida de la invención se produce cruzando una primera planta de girasol que es homocigótica para el alelo P197L de AHASL1 con una segunda planta de girasol que es homocigótica para el alelo A122T de AHASL1. Se espera que todas las semillas híbridas y plantas híbridas que crecen a partir de tal semilla comprendan en sus genomas un alelo P197L de AHASL1 y un alelo A122T de AHASL1. También en este caso, o bien el primer o bien el segundo girasol pueden ser el donante para el cruce.

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La presente divulgación proporciona métodos para controlar las malas hierbas parasitarias conocidas como orobanca (Orobanche spp.) en plantas de girasol infectadas. Tales Orobanche spp. incluyen, por ejemplo, Orobanche cumana y Orobanche cernua. El método comprende aplicar una cantidad eficaz de un herbicida de imidazolinona a las malas hierbas y a la planta de girasol resistente a herbicidas de la presente invención, particularmente una planta de girasol que comprende dos copias del alelo A122T de AHASL1 o una planta de girasol que comprende una copia del alelo A122T de AHASL1 y una copia del alelo A205V de AHASL1. En una realización preferida, el herbicida de imidazolinona es imazapir. Preferiblemente, el herbicida inhibidor de AHAS se aplica en una fase vegetativa tardía y/o fase reproductiva temprana. Más preferiblemente, el herbicida se aplica en una fase reproductiva temprana. Lo más preferiblemente, el herbicida se aplica en la fase de crecimiento R1.

A menos que se indique lo contrario, los estados de crecimiento de girasol mencionados en el presente documento son las fases de crecimiento definidas en Schneiter y Miller (1981) Crop Sci. 21:901-903.

Al proporcionar plantas de girasol que tienen resistencia aumentada a herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona y de sulfonilurea, puede emplearse una amplia variedad de formulaciones para proteger plantas frente a malas hierbas, para potenciar el crecimiento de plantas y reducir la competición por nutrientes. Puede usarse un herbicida por sí solo para el control antes de la emergencia, tras la emergencia, antes de la plantación y en la plantación de malas hierbas en zonas que rodean a las plantas descritas en el presente documento o puede usarse una formulación de herbicida de imidazolinona que contiene otros aditivos. El herbicida también puede usarse como tratamiento para semillas. Los aditivos encontrados en una formulación de herbicida de imidazolinona o de sulfonilurea incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes de propagación, agentes de pegajosidad, agentes estabilizantes o similares. La formulación de herbicida puede ser una preparación húmeda o seca y puede incluir, pero no se limita a, polvos que pueden fluir, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. El herbicida y las formulaciones de herbicida pueden aplicarse según métodos convencionales, por ejemplo, mediante pulverización, irrigación, espolvoreo o similares.

La presente divulgación se refiere a semillas transgénicas y no transgénicas con tolerancia aumentada a al menos un herbicida, particularmente un herbicida inhibidor de AHAS, más particularmente herbicidas de imidazolinona y de sulfonilurea. Tales semillas incluyen, por ejemplo, semillas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con número de depósito de patentes de ATCC PTA-6716, o la planta de girasol con número de depósito de patentes de ATCC PTA-7606, y semillas transgénicas que comprenden una molécula de polinucleótido de la invención que codifica una proteína AHASL resistente a herbicidas.

La presente divulgación se refiere a métodos que implican el uso de al menos un herbicida inhibidor de AHAS seleccionado del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona y mezclas de los mismos. En estos métodos, el herbicida inhibidor de AHAS puede aplicarse mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, tratamiento de semillas, tratamiento de la tierra y tratamiento foliar.

Antes de la aplicación, el herbicida inhibidor de AHAS puede convertirse en formulaciones convencionales, por ejemplo disoluciones, emulsiones, suspensiones, polvos para espolvorear, polvos, pastas y gránulos. La forma de uso depende del propósito previsto particular; en cada caso, debe garantizarse una distribución fina y uniforme del compuesto.

Las formulaciones se preparan de una manera conocida (véanse por ejemplo para una revisión los documentos US 3 060 084, EP-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, “Agglomeration”, Chemical Engineering, 4 de diciembre de 1967, 147-48, Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4.ª Ed., McGraw-Hill, Nueva York, 1963, páginas 8-57 y siguientes, los documentos WO 91/13546, US 4 172 714, US 4 144 050, US 3 920 442, US 5 180 587, US 5 232 701, US 5 208 030, GB 2 095 558, US 3 299 566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1961, Hance et al, Weed Control Handbook, 8.ª Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 y Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemania), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por ejemplo diluyendo el compuesto activo con agentes auxiliares adecuados para la formulación de productos químicos para la agricultura, tales como disolventes y/o portadores, si se desea emulsionantes, tensioactivos y dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelantes, para la formulación de tratamiento de semillas también opcionalmente colorantes y/o aglutinantes y/o agentes gelificantes.

Ejemplos de disolventes adecuados son agua, disolventes aromáticos (por ejemplo productos de Solvesso, xilenos), parafinas (por ejemplo fracciones de aceite mineral), alcoholes (por ejemplo metanol, butanol, pentanol, alcohol bencílico), cetonas (por ejemplo ciclohexanona, gamma-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (diacetato de glicol), glicoles, dimetilamidas de ácido graso, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos. En principio, también pueden usarse mezclas de disolventes.

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Ejemplos de portadores adecuados son minerales naturales triturados (por ejemplo caolines, arcillas, talco, yeso) y materiales sintéticos triturados (por ejemplo sílice altamente dispersa, silicatos).

Emulsionantes adecuados son emulsionantes aniónicos y no iónicos (por ejemplo éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, alquilsulfonatos y arilsulfonatos).

Ejemplos de dispersantes son lejías residuales de sulfito-lignina y metilcelulosa.

Tensioactivos adecuados usados son sales de metales alcalinos, de metales alcalinotérreos y de amonio de ácido lignosulfónico, ácido naftalenosulfónico, ácido fenolsulfónico, ácido dibutilnaftalenosulfónico, alquilarilsulfonatos, alquilsulfatos, alquilsulfonatos, sulfatos de alcoholes grasos, ácidos grasos y éteres de glicol de alcoholes grasos sulfatados, además condensados de naftaleno sulfonado y derivados de naftaleno con formaldehído, condensados de naftaleno o de ácido naftalenosulfónico con fenol y formaldehído, éter de octilfenol de polioxietileno, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, éteres de poliglicol de alquilfenol, tributilfenil éter de poliglicol, triestearilfenil éter de poliglicol, poliéter alcoholes de alquilarilo, condensados de óxido de etileno de alcohol graso y alcohol, aceite de ricino etoxilado, alquil éteres de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, acetal de éter de poliglicol de alcohol laurílico, ésteres de sorbitol, lejías residuales de lignosulfito y metilcelulosa.

Sustancias que son adecuadas para la preparación de disoluciones directamente pulverizables, emulsiones, pastas

o dispersiones en aceite son fracciones de aceite mineral de medio a alto punto de ebullición, tales como queroseno

o aceite diésel, además aceites de alquitrán de hulla y aceites de origen vegetal o animal, hidrocarburos alifáticos, cíclicos y aromáticos, por ejemplo tolueno, xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados o sus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol, ciclohexanona, isoforona, disolventes altamente polares, por ejemplo dimetilsulfóxido, N-metilpirrolidona o agua.

También agentes anticongelantes tales como glicerina, etilenglicol, propilenglicol y bactericidas tales como pueden añadirse a la formulación.

Agentes antiespumantes adecuados son por ejemplo agentes antiespumantes basados en estearato de magnesio o silicio.

Conservantes adecuados son por ejemplo diclorofeno y hemiformal de alcohol bencílico.

Formulaciones para el tratamiento de semillas pueden comprender adicionalmente aglutinantes y opcionalmente colorantes.

Pueden añadirse aglutinantes para mejorar la adhesión de los materiales activos sobre las semillas tras el tratamiento. Aglutinantes adecuados son tensioactivos de copolímeros en bloque EO/PO pero también poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenaminas, polietilenamidas, polietileniminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, poli(acetato de vinilo), tilosa y copolímeros derivados de estos polímeros.

Opcionalmente, también pueden incluirse colorantes en la formulación. Colorantes o tintes adecuados para las formulaciones de tratamiento de semillas son rodamina B, pigmento rojo 112 C.I., disolvente rojo 1 C.I., pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarillo 1, pigmento amarillo 13, pigmento rojo 112, pigmento rojo 48:2, pigmento rojo 48:1, pigmento rojo 57:1, pigmento rojo 53:1, pigmento naranja 43, pigmento naranja 34, pigmento naranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento blanco 6, pigmento marrón 25, violeta básico 10, violeta básico 49, rojo ácido 51, rojo ácido 52, rojo ácido 14, azul ácido 9, amarillo ácido 23, rojo básico 10, rojo básico 108.

Un ejemplo de agente gelificante adecuado es carragenano (Satiagel®).

Pueden prepararse polvos, materiales para propagar y productos para espolvorear mezclando o triturando de manera concomitante las sustancias activas con un portador sólido.

Pueden prepararse gránulos, por ejemplo gránulos recubiertos, gránulos impregnados y gránulos homogéneos, uniendo los compuestos activos a portadores sólidos. Ejemplos de portadores sólidos son tierras minerales tales como geles de sílice, silicatos, talcos, caolines, Attaclay, caliza, cal, yeso, bol, loess, arcilla, dolmomita, tierra de diatomeas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticos triturados, fertilizantes, tales como, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas, y productos de origen vegetal, tales como harina de cereal, harina de corteza de árbol, harina de madera y harina de cáscara de nuez, polvos de celulosa y otros portadores sólidos.

En general, las formulaciones comprenden desde el 0,01 hasta el 95 % en peso, preferiblemente desde el 0,1 hasta el 90 % en peso, del herbicida inhibidor de AHAS. En este caso, los herbicidas inhibidores de AHAS se emplean en una pureza de desde el 90 % hasta el 100 % en peso, preferiblemente del 95 % al 100 % en peso (según el espectro

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planta, alterando los mecanismos de defensa contra patógenos y/o insectos de una planta, y similares. Estos resultados pueden conseguirse proporcionando la expresión de productos heterólogos o el aumento de la expresión de productos endógenos en plantas. Alternativamente, los resultados pueden conseguirse proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Los genes de interés incluyen genes de resistencia a insectos tales como, por ejemplo, genes de la proteína de toxina de Bacillus thuringiensis (patentes estadounidenses n.os 5 366 892; 5 747 450; 5 736 514; 5 723 756; 5 593 881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109).

La presente divulgación incluye métodos de diagnóstico para identificar los alelos del gen AHASL1 en girasoles individuales. Tales métodos de diagnóstico, que se describen a continuación, encuentran uso en métodos para el cultivo de variedades de girasol comerciales con resistencia aumentada a herbicidas de imidazolinona. A continuación se describen los siguientes términos usados en el presente documento en la descripción de estos métodos.

Un “cebador” es un oligonucleótido de cadena sencilla, que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’, que es capaz de hibridarse a un sitio de hibridación en una cadena de ADN diana, y el cebador sirve como un punto de inicio para la síntesis de ADN mediante una ADN polimerasa, particularmente en una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tal cebador puede ser o no ser totalmente complementario a su sitio de hibridación en el ADN diana.

Un sitio de “hibridación” en una cadena de ADN diana es el sitio al cual es capaz de hibridarse un cebador en los métodos de la presente invención.

Generalmente para la amplificación de un fragmento de un gen por PCR, se emplean un par de cebadores que se hibridan con cadenas opuestas de una molécula de ADN de doble cadena. Por convenio convencional y usado en el presente documento a menos que se indique lo contrario o resulte evidente a partir del contexto, el “cebador directo” se hibrida con la cadena no codificante y el “cebador inverso” se hibrida con la cadena codificante.

A lo largo de la memoria descriptiva, los términos “alelo mutante”, “alelo de AHASL1 mutante” o “gen AHASL1 mutante”, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o resulte evidente a partir del contexto, estos términos se refieren a un polinucleótido que codifica una proteína AHSAL1 tolerante a imidazolinona que comprende una única sustitución de aminoácido en comparación con una proteína AHASL1 de tipo natural. Tal sustitución de aminoácido única incluye, por ejemplo, A122T, A205V y P197L. Normalmente, tal sustitución de aminoácido es el resultado de una única sustitución de nucleótido en la secuencia codificante de AHASL1.

En cambio, a menos que se indique lo contrario, los términos “alelo de tipo natural”, “alelo de AHASL1 de tipo natural” o alelo de “gen AHASL1 de tipo natural” se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína AHASL1.

La divulgación incluye el uso de varios cebadores para amplificación por PCR. Estos cebadores se describen en detalle a continuación.

Un “cebador de AHASL1 directo” es un cebador que puede usarse en los métodos divulgados en el presente documento que implican la amplificación por PCR de un fragmento de un alelo de AHASL1 de girasol, en el que el fragmento se extiende en un sentido 5’ desde el sitio de la mutación que da lugar a la sustitución de aminoácido A122T. Preferiblemente, el complemento del sitio de hibridación del “cebador de AHASL1 directo” está en el lado 5’ de la repetición (ACC)n que se muestra en la figura 8.

Un “cebador de AHASL1 de tipo natural inverso” es un cebador inverso puede usarse en los métodos que implican la amplificación por PCR de un fragmento de un alelo de AHASL1 que no comprende la mutación que da lugar a la sustitución de aminoácido A122T. El sitio de hibridación del cebador inverso se muestra en la figura 8. El nucleótido 3’-terminal (o de extremo 3’) del cebador de AHASL1 de tipo natural inverso se hibrida con la G que está en el sitio del SNP en Hap1-Hap5 en la figura 8. El nucleótido 3’-terminal del cebador de AHASL1 de tipo natural inverso es una C.

Un “cebador de AHASL1 mutante inverso” es un cebador inverso que puede usarse en los métodos que implican la amplificación por PCR de un fragmento de un alelo de AHASL1 mutante que comprende la mutación que da lugar a la sustitución de aminoácido A122T. En la figura 8 se muestra el sitio de hibridación del cebador inverso. El nucleótido 3’-terminal (o de extremo 3’) del cebador de AHASL1 mutante inverso se hibrida con la A en Hap6 que está en el sitio del SNP en la figura 8. El nucleótido 3’-terminal del cebador de AHASL1 de tipo natural inverso es una T.

La presente divulgación incluye métodos para genotipar AHASL1 de girasol. El método implica obtener ADN genómico de una planta de girasol y usar el ADN genómico o muestra o parte del mismo como molde para una primera amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende el ADN genómico, polimerasa,

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trifosfatos de desoxirribonucleótidos, un cebador de AHASL1 directo y un cebador de AHASL1 de tipo natural inverso. El cebador de AHASL1 de tipo natural inverso comprende un molécula de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 13, en la que el nucleótido que está en el nucleótido de extremo 3’ de dicho cebador de AHASL1 de tipo natural inverso es el complemento del nucleótido que está en la posición 1 de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 13. El método comprende además usar el ADN genómico o muestra o parte del mismo como molde para una segunda amplificación por PCR que comprende dicho ADN, polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleótidos, dicho cebador de AHASL1 directo y un cebador de AHASL1 inverso mutante. El cebador de AHASL1 mutante inverso comprende una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 14, en la que el nucleótido que está en el nucleótido de extremo 3’ de dicho cebador de AHASL1 mutante inverso es el complemento del nucleótido que está en la posición 1 de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 14. El método comprende además detectar los productos de dichas amplificaciones por PCR primera y segunda.

Los cebadores de AHASL1 de tipo natural inverso y de AHASL1 mutante inverso se hibridan con una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente, en condiciones adecuadas para la amplificación por PCR de las partes de los genes AHASL1 o girasol mostradas en la figura 8. Los cebadores de AHASL1 de tipo natural inverso y de AHASL1 mutante inverso tienen adicionalmente un nucleótido de extremo 3’ que consiste en un nucleótido que está en el sitio de la mutación que da lugar a la sustitución de aminoácido A122T. Cada uno de los cebadores inversos puede ser, pero no se requiere que sea, totalmente complementario a su sitio de hibridación y no necesita extenderse por toda la longitud del sitio de hibridación. Además, los cebadores de AHASL1 de tipo natural y mutante inversos pueden comprender nucleótidos adicionales en sus extremos 5’ más allá de sus sitios de hibridación. Tales nucleótidos adicionales pueden ser, pero no se requiere que sean, total o incluso parcialmente complementarios a una parte del gen AHASL1 de girasol. Los nucleótidos en 5’ adicionales pueden incluir, por ejemplo, secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. En un caso, los cebadores de AHASL1 de tipo natural inverso y de AHASL1 mutante inverso comprenden las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente.

Los métodos para genotipar AHASL1 de girasol implican el uso de un cebador de AHASL1 directo. A diferencia de los cebadores de AHASL1 de tipo natural inverso y de AHASL1 mutante inverso que se hibridan en el sitio de la mutación que da lugar a la sustitución de aminoácido A122T, el sitio de hibridación del nucleótido de cebador de AHASL1 directo corresponde a una región del gen AHASL1 de girasol que está en sentido 5’ de la región (ACC)n mostrada en la figura 8 de forma que pueden distinguirse los haplotipos 1-6 por diferencias en la longitud (es decir, pb) de los productos de PCR resultantes. Las secuencias de estos haplotipos en las proximidades del sitio de la mutación A122T se muestran en la figura 8. En un caso, el cebador de AHASL1 directo se hibrida con una secuencia de nucleótidos que comprende el complemento de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 12. En algunos casos de la invención, el cebador de AHASL1 directo comprende una molécula de nucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3, y en una realización incluso más preferida, el cebador de AHASL1 directo tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3 opcionalmente con nucleótidos adicionales en el extremo 5’ del cebador. Tales nucleótidos adicionales pueden ser, pero no se requiere que sean, total o incluso parcialmente complementarios a una parte del gen AHASL1 de girasol. Los nucleótidos en 5’ adicionales pueden incluir, por ejemplo, secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción.

La presente divulgación se refiere además a un método para identificar alelos de AHASL1 en una planta de girasol. El método implica obtener ADN genómico de una planta de girasol y usar el ADN genómico o muestra o parte del mismo en al menos una amplificación por PCR. La amplificación por PCR implica usar el ADN genómico como molde para una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa que comprende el ADN genómico, polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleótidos, un primer cebador directo que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15, un primer cebador inverso que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16, un segundo cebador directo que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 17, y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 18. El método implica además detectar los productos de amplificación por PCR.

Alternativamente, pueden usarse dos o incluso tres amplificaciones por PCR separadas en los métodos divulgados en el presente documento. Cuando se usan dos amplificaciones por PCR separadas, la primera amplificación por PCR implica usar el ADN genómico como molde para una primera amplificación por reacción en cadena de la polimerasa que comprende el ADN genómico, polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleótidos, un primer cebador directo que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15, y un primer cebador inverso que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 16. La segunda amplificación por PCR implica usar el ADN genómico como molde para una segunda amplificación por reacción en cadena de la polimerasa que comprende el ADN genómico, polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleótidos, un segundo cebador directo que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 17, y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 18. La primera amplificación por PCR puede comprender opcionalmente un tercer cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 18, y la segunda amplificación por PCR puede comprender opcionalmente un tercer cebador que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 15. La adición de tal cebador opcional a una cualquiera o a ambas de las

18

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EJEMPLO 3: Tolerancia a herbicida de líneas homocigóticas y heterocigóticas para A122T y A205V frente a líneas heterocigóticas para ambas mutaciones (A122T/A205V) en condiciones de campo

Se llevó a cabo este experimento para comparar la tolerancia a herbicida de híbridos y líneas de girasol en

5 diferentes genotipos que portaban las mutaciones A122T y A205V en estados homocigótico (A122T/A122T o A205V/A205V), heterocigótico (A122T/-o A205V/-) y heterocigótico doble apilado (A122T/A205V) en condiciones de campo.

Materiales

10 Los materiales de girasol que se usaron se indican en la tabla 5.

Tabla 5: Lista de entrada

Tipo de material

Acontecimiento de mut. Cigosidad Producto Descripción de entrada Número de entrada

Restaurador WT x IMI

A205V hetero híbrido híbrido-1 1

Restaurador WT x IMI

A205V hetero híbrido híbrido-3 2

Restaurador WT-CMS x IMI

A205V hetero híbrido híbrido-7 3

Restaurador IMI

A205V homo restaurador línea-4 4

Restaurador IMI CMS x IMI

A205V homo híbrido híbrido-6 5

Restaurador WT X GM40

A122T hetero híbrido híbrido-8 6

Restaurador WT X GM40

A122T hetero híbrido híbrido-15 7

Restaurador WT X GM40

A122T hetero híbrido híbrido-16 8

Restaurador GM40

A122T homo restaurador línea-9 9

Restaurador GM40 CMS x GM40

A122T homo híbrido híbrido-13 10

Restaurador GM40 CMS x GM40

A122T homo híbrido híbrido-14 11

Restaurador IMI CMS x GM40

A205V/A122T hetero/doble híbrido híbrido-10 12

Restaurador GM40 CMS x IMI

A205V/A122T hetero/doble híbrido híbrido-11 13

Restaurador IMI CMS x GM40

A205V/A122T hetero/doble híbrido híbrido-12 14

WT

- - línea B WT-5 15

15 Métodos

Se produjeron semillas de cada entrada en la tabla 5 en condiciones de producción de semillas óptimas en Sudamérica durante el periodo de crecimiento 2005-2006. La prueba en campo se llevó a cabo en una ubicación en

20 Dakota del Norte, EE. UU. en 2006. Las entradas se organizaron en un bloque completo aleatorizado usando un diseño de parcelas divididas que consistía en 3 repeticiones para cada combinación de tratamiento. El factor A (tabla 6) era el tratamiento con herbicida y el factor B era la entrada de girasol. El tamaño de parcela era de 4 filas x 12 pies y la tasa de siembra fue compatible con las prácticas agrícolas locales.

25 Tabla 6: Factor A -Lista de tratamiento con herbicida

N.º de tratamiento

Tratamiento

1

Sin tratar

2

imazamox 50 g de pa/ha + NIS al 0,25 % (v/v)

3

imazamox 100 g de pa/ha + NIS al 0,25 % (v/v)

4

imazamox 200 g de pa/ha + NIS al 0,25 % (v/v)

5

imazapir 160 g de pa/ha + NIS al 0,25 % (v/v)

29

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Tipo de material

Acontecimiento de mut. Cigosidad Producto Descripción de entrada 7 DAT 50 g de imazamox 7 DAT 100 g de imazamox 7 DAT 200 g de imazamox 7 DAT 160 g de imazapir 7 DAT sin tratar

Restaurador

A205 hetero híbrido híbrido-1 8,3 35,0 48,3 16,7 0,0

WT x IMI

Restaurador

A205 hetero híbrido híbrido-3 11,7 46,7 60,0 35,0 0,0

WT x IMI

Restaurador

A205 hetero híbrido híbrido-7 13,3 43,3 56,7 21,7 0,0

WT-CMS x

IMI

Restaurador

A205 homo restaurador línea-4 6,7 6,7 18,3 11,7 0,0

IMI

Restaurador

A205 homo híbrido híbrido-6 5,0 8,3 26,7 8,3 0,0

IMI CMS x

IMI

Restaurador

A122 hetero híbrido híbrido-8 13,3 13,3 25,0 13,3 0,0

WT X GM40

Restaurador

A122 hetero híbrido híbrido-15 10,0 11,7 16,7 8,3 0,0

WT X GM40

Restaurador

A122 hetero híbrido híbrido-16 10,0 15,0 23,3 10,0 0,0

WT X GM40

Restaurador

A122 homo restaurador línea-9 1,7 5,0 10,0 8,3 0,0

GM40

Restaurador

A122 homo híbrido híbrido-13 3,3 5,0 10,0 5,0 0,0

GM40 CMS

x GM40

Restaurador

A122 homo híbrido híbrido-14 5,0 6,7 11,7 8,3 0,0

GM40 CMS

x GM40

Restaurador IMI CMS x GM40 Restaurador GM40 CMS x IMI Restaurador IMI CMS x GM40

A205/ A122 A205/ A122 A205/ A122 hetero / doble hetero / doble hetero / doble híbrido híbrido híbrido híbrido-10 híbrido-11 híbrido-12 3,3 0,0 10,0 3,3 3,3 10,0 10,0 11,7 11,7 3,3 3,3 5,0 0,0 0,0 0,0

WT

- - Línea B WT-5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

LSD = 9,64 CV = 54,70 Des. Est. = 6,03 Media global = 11,02

Tabla 8. Clasificaciones de fitotoxicidad (% de daño de cosecha) registradas 21 días tras el tratamiento (DAT)

Tipo de material

Acontecimiento de mut. Cigosidad Producto Descripción de entrada 21 DAT 50 g de imazamox 21 DAT 100 g de imazamox 21 DAT 200 g de imazamox 21 DAT 160 g de imazapir 21 DAT sin tratar

Restaurador

A205 hetero híbrido híbrido-1 6,7 25,0 73,3 20,0 0,0

WT IMI

Restaurador

A205 hetero híbrido híbrido-3 11,7 46,7 76,7 43,3 0,0

WT x IMI

Restaurador

A205 hetero híbrido híbrido-7 3,3 40,0 78,3 36,7 0,0

WT-CMS x

IMI

Restaurador

A205 homo restaurador línea-4 5,0 6,7 15,0 6,7 0,0

IMI

Restaurador

A205 homo híbrido híbrido-6 0,0 3,3 21,7 3,3 0,0

IMI CMS x

IMI

Restaurador

A122 hetero híbrido híbrido-8 6,7 11,7 28,3 11,7 0,0

WT X GM40

Restaurador

A122 hetero híbrido híbrido-15 6,7 11,7 30,0 21,7 0,0

WT X GM40

31

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5

10

15

20

25

30

35

40

AHAS122TWT

122 TMU

Homocigotos

Hap 6 (A122T)

CLHaPlus ninguno 195 pb

Hap1

Líneas cultivadas 195 pb Ninguno

Hap 2

Líneas cultivadas 192 pb Ninguno

Hap 4

Líneas cultivadas 186 pb Ninguno

Hap 5 (A205V)

Líneas derivadas de IMISUN 186 pb Ninguno

Hap 3 (P197L)

Líneas derivadas de SURES 204 pb Ninguno

Heterocigotos

Hap6 / Hap1

195 pb 195 pb

Hap6 / Hap2

192 pb 195 pb

Hap6 / Hap4

186 pb 195 pb

Hap6 / Hap 5

186 pb 195 pb

Hap6 / Hap 3

204 pb 195 pb

Hap3 / Hap1

204 / 195 pb Ninguno

Hap3 / Hap2

204 / 192 pb Ninguno

Hap3 / Hap5

204 / 186 pb Ninguno

Hap3 / Hap4

204 / 186 pb Ninguno

Hap5 / Hap1

186 / 195 pb Ninguno

Hap5 / Hap2

186 / 192 pb Ninguno

Hap5 / Hap4

186 / 186 pb Ninguno

1 Los haplotipos (Hap) 1 a 5 corresponden a los proporcionados en Kolkman et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159).

2 Tipo de mutación de AHASL1, si la hay, indicada entre paréntesis..

EJEMPLO 7: Reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo para la detección del alelo A122T de AHASL1 de girasol

Con el fin de facilitar el cultivo de girasol Clearfield, se desarrolló el siguiente ensayo de SNP para la detección del alelo A122T de AHASL1 de girasol. Las variedades tolerantes a IMI usadas para el desarrollo y la validación del ensayo incluyen numerosas variedades convencionales y tolerantes a herbicida. Este ensayo usa la reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo (PCR) para detectar y determinar la cigosidad del alelo A122T de AHASL1 de girasol. Una única ronda de amplificación con cuatro cebadores proporciona los productos necesarios para detectar los tres posibles estados de cigosidad: tipo natural, heterocigótico y mutante (A122T/A122T). Dado que los loci de AHASL1 y AHASL2 son idénticos en la región que contiene la mutación, se diseñó un conjunto de cebadores para amplificar específicamente el locus de AHASL1 (véase a continuación HA122CF y HA122CR). Además, se diseñaron cebadores específicos de alelo para hibridarse con/extender específicamente del nucleótido único “G” a “A” responsable del cambio de codón respectivo de alanina a treonina. El cebador específico de alelo de tipo natural es un cebador inverso. Por tanto, la base terminal es “C” tal como se representa a continuación. Se produce una banda de control de 794 pares de bases formada por HA122CF y HA122CR, independientemente de la(s) base(s) en el sitio de mutación y sirve como control positivo (figura 9).

La banda de diagnóstico para la condición de tipo natural, formada por la amplificación de cebadores HA122CF y HA122wt, produce un fragmento de 258 pares de bases (figura 9). Este cebador contiene un apareamiento erróneo deliberado 4 bases en el sentido de 5’ de la mutación real que sirve para generar especificidad aumentada para las muestras de tipo natural. La banda de diagnóstico para la condición mutante produce un fragmento de 576 pares de bases (figura 9). Se forma un producto de 576 pares de bases a partir de la amplificación de HA122mut y HA122CR e indica la presencia del alelo mutante. El cebador específico de mutante contiene un apareamiento erróneo deliberado 3 bases en el sentido de 5’ de la mutación actual que sirve para generar especificad aumentada para las muestras mutantes. Por tanto, una muestra que es heterocigótica para la mutación producirá tres bandas con la visualización por electroforesis en gel de agarosa, la banda de control y ambas bandas de diagnóstico. Una muestra homocigótica mostrará dos bandas. El patrón en gel depende de la asignación de nucleótido en el codón 122. A continuación se proporcionan los cebadores de PCR.

Cebador directo común (HA122CF):

5’GTTTCGCATTACCCATCACT3’ (SEQ ID NO: 15)

Cebador específico de tipo natural (HA122wt):

37

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Líneas

Perfil de aceite

BTI-OL-M1511 BTI-OL-M1709 BTI-OL2201 VB141 HA445 OB712 GM40 B770 BTK112

Ácido mirístico (C14:0)

0,018 0,023 0,02 0,014 0,01 0,02 0,09 0,08 0,1

Ácido palmítico (C16:0)

3,58 3,77 4,75 3,55 3,49 3,7 6,47 6,04 6,73

Ácido esteárico (C18:0)

1,13 1,68 0,18 1,82 3,2 1,85 4,71 4,71 4,48

Ácido oleico (C18:1)

90,83 89,58 89,81 88,97 85,79 87,58 21,24 24,2 18,62

Ácido linoleico (C18:2)

2,86 3,07 3,65 3,91 5,63 5,15 65,85 63,41 68,25

Ácido linolénico (C18:3)

0,16 0,16 0,16 0,16 0,15 0,21 0,16 0,16 0,16

Ácido araquídico (C20:0)

0,09 0,14 0,09 0,2 0,21 0,17 0,21 0,26 0,23

Ácido gadoleico (C20:1)

0,24 0,31 0,33 0,26 0,17 0,24 0,04 0,1 0,07

Ácido behénico (C22:0)

0,76 0,88 0,72 0,78 1,13 0,82 0,96 0,85 0,9

Ácido lignocérico (C24:0)

0,24 0,3 0,28 0,3 0,25 0,28 0,19 0,18 0,27

Suma

99,9 99,9 100,0 100,0 100,0 100,0 99,9 100,0 99,8

Tabla 17. Índice de fitotoxicidad medio de 9 líneas de girasol (cada valor es la media de 20 repeticiones).

Líneas

BTI-OL

BTI-OL

BTI-OL- VB141 HA445 OB712 GM40 B770 BTK112

M1511

M1709 2201

Índice de fitotoxicidad

PI

0,5 0,2 0,2 8,5 8,8 9 0,2 8,7 9

5 EJEMPLO 9: Evaluaciones en campo y evaluaciones de actividad AHAS para los acontecimientos A122T/A122T, A205V/A205V y A122T/A205V

Se llevaron a cabo evaluaciones en campo a través de varias ubicaciones para determinar los niveles de tolerancia a

10 imidazolinona relativos de plantas de girasol que son A122T/A122T, A122T/A205V o A205V/A205V para el gen AHASL1. Se expusieron plantas de girasol de cada uno de los diferentes genotipos a diferentes dosis de imazamox e imazapir en un intervalo de condiciones medioambientales. Además, se determinó la actividad AHAS in vitro en presencia de niveles crecientes de herbicidas para plantas de girasol de cada de los tres genotipos de girasol.

15 Materiales y métodos

Se sometió una línea de girasol, BTK47, seleccionada específicamente por la ausencia de un factor E (imr1 imr1 / imr2 imr2) a mutagénesis de semilla EMS. Se seleccionó una línea M2:4 que sobrevivió a la selección en campo de imazapir, para un posterior cruce y estudios de actividad enzimática. Esta línea se denominó GM40.

20

Evaluación en campo del rasgo A122T

Se introgresionó el alelo mutante A122T en diferentes líneas mantenedoras, restauradoras y endogámicas estériles. Se cruzaron líneas endógamicas homocigóticas A122T con líneas endógamicas de tipo natural (WT) (no contenían

25 mutación de tolerancia a herbicida), líneas endogámicas homocigóticas A122T o líneas endogámicas homocigóticas A205V para producir diferentes combinaciones de cigosidad de alelo mutante de F1 (tabla 18). Se sometieron a prueba en campo estas entradas, junto con varios controles de variedad comercial A205V CLEARFIELD® adaptados regionalmente, para determinar la tolerancia a imidazolinona en numerosas ubicaciones en Norteamérica, Sudamérica y Europa desde 2005 hasta 2008 (tabla 19).

30 Tabla 18. Lista de entrada para evaluaciones en campo de tolerancia a herbicida (2007)

Entrada

Descripción de línea Cigosidad del alelo de AHASL1

1

GM40 homocigótica A122T

2

cmsGM40 x R733 homocigótica A122T

39

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Claims (1)

1. imagen1

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