EA019952B1 - Устойчивые к гербицидам, ингибирующим ahas, растения подсолнечника с двумя различными аллелями ahasl1 и способы их применения - Google Patents

Abstract

Описаны устойчивые к гербицидам растения подсолнечника, содержащие два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL1) подсолнечника. Раскрыты способы получения этих растений подсолнечника и способы контроля сорняков или другой нежелательной растительности, растущей вблизи этих растений подсолнечника. Такие методы включают использование гербицидов, ингибирующих ацетогидроксикислотную синтазу. Также описаны способы контроля паразитических сорняков, растущих на растениях подсолнечника.

Description

Настоящее изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к устойчивым к гербицидам растениям подсолнечника, которые содержат два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (АНАЗШ) подсолнечника.

Предшествующий уровень техники

Ацетогидроксикислотная синтаза (АНАЗ; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактатная синтаза или АЬЗ) является первым ферментом, который катализирует биохимический синтез разветвленных цепей аминокислот валина, лейцина и изолейцина (Зшдй (1999) Вюзуп!йез1з оГ уаЕпс. 1еисше апб 18о1еиеше, ίη Р1ап! Ашшо Лабз, Зшдй, В.К., еб., Магсе1 Эеккег 1пс. Иете Уогк, Иете Уогк, рр. 227-247). АНАЗ является местом приложения действия четырех структурно и химически различных семейств гербицидов, включающих сульфонилмочевины (Тап е! а1. (2005) Рез! Мапад. Зск 61:246-57; Ма11огу-3тйй апб КеРшдег (2003) \Уееб ТесЬпо1оду 17:620-626; ЬаКозза апб Еа1ео (1984) Тгепбз Вю!есЬпо1. 2:158-161), имидазолиноны (Зйапег е! а1. (1984) Р1ап! Рйузю1. 76:545-546), триазолпиримидины (8иЬгашашап апб ОегМск (1989) ИбпЬШоп оГ асеЮ1ас1а1е зуп!Ьазе Ьу !па7о1орупт1бшез, в Вюса!а1уз1з ш Адг1си11ига1 Вю!есйпо1оду, ХУйбакег ЕР. апб Зоппе!, Р.Е.. ебз., АС8 Зутрозшт Зепез, Атепсап Сйет1са1 8ос1е(у, ХУазйшд1оп, Э.С., рр. 277-288) и пиримидинилоксибензоаты (ЗиЬгаташап е! а1. (1990) Р1ап! РЬузюк 94: 239244). Имидазолиноновые и сульфонилмочевинные гербициды широко используются в современном сельском хозяйстве благодаря их эффективности при очень низкой дозе внесения и относительной нетоксичности для животных. Ингибируя активность АНАЗ, эти семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие восприимчивых растений, включая многие виды сорняков. Примерами коммерчески доступных имидазолиновых гербицидов являются РИКЗЫТ® (имазетапир), ЗСЕРТЕК® (имазахин) и ЛКЗЕИЛЬ® (имазапир). Примерами сульфонилмочевинных гербицидов являются хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметилсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон, флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон этил и галосульфурон.

Благодаря их высокой эффективности и низкой токсичности имидазолиноновые гербициды благоприятны для применения путем опрыскивания наземной части растений в широкий период вегетации. Возможность опрыскивания гербицидом наземной части растений в широкий период вегетации снижает расходы, связанные с приживаемостью и сохранением растений, и уменьшает необходимость предварительной подготовки перед использованием таких химикатов. Опрыскивание наземной части растений желаемых толерантных видов в результате также позволяет достичь максимального потенциального выхода желаемых видов растений вследствие отсутствия конкурентных видов. Однако возможность использования таких методик распыления зависит от наличия устойчивых к имидазолинону видов желаемых растений в области распыления.

Среди большого разнообразия сельскохозяйственных зерновых культур некоторые виды бобовых, такие как соя, являются природно устойчивыми к имидазолиноновым гербицидам, вследствие их способности к быстрому метаболизму гербицидных соединений (ЗЬапег апб ВоЬшзоп (1985) \Уееб Зск 33:469-471). Другие зерновые, такие как кукуруза (Ие^йоизе е! а1. (1992) Р1ап! РЬу8ю1. 100:882-886) и рис (Ваггей е! а1. (1989) Сгор ЗаГепегз Гог НегЫабез, Асабетю Ргезз, Иете Уогк, рр. 195-220) являются до некоторой степени чувствительными к имидазолиноновым гербицидам. Различная чувствительность к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы отдельного гербицида и различного метаболизма соединения из токсичной в нетоксичную форму в каждом растении (ЗЬапег е! а1. (1984) Р1ап! РЬузюк 76:545-546; Вго\уп е! а1., (1987) Резйс. Вюсйет. Рйузю1. 27:24-29). Другие физиологические различия растений, такие как поглощение и передвижение веществ в растении, также играют важную роль в чувствительности (ЗЬапег апб КоЬшзоп (1985) \Уееб Зсг 33:469-471).

Устойчивость растений к имдазолинонам, сульфонилмочевинам, триазолопиримидинам и пиримидинилоксибензоатам можно с успехом создать, используя мутагенез семян, микроспор, пыльцы и каллюса в 2еа шауз, АгаЬ1борз1з !Ьайапа, Вгаззюа париз (например, канола) О1усше тах, Мсойапа !аЬасит, сахарной свекле (Ве!а уи1дапз) и Огуха зайуа (ЗеЬазйап е! а1. (1989) Сгор Зсг 29:1403-1408; З\\цпзоп е! а1., 1989 Тйеог. Арр1. Оепе!. 78:525-530; Ие^йоизе е! а1. (1991) Тйеог. Арр1. Оепе!. 83:65-70; За+азгуап е! а1. (1991) Р1ап! Рйузю1 97:1044-1050; Моигапб е! а1. (1993) 1. Негебйу 84:91-96; \Упд111 апб Реппег (1998) Тйеог Арр1. Оепе!. 96:612-620; патент США № 5,545,822). Во всех случаях единственный частично доминантный ядерный ген обеспечивает устойчивость. Четыре устойчивых к имидазолинону растения пшеницы были предварительно выделены с последующим мутагенезом семян из Тпйсит аезйуит Ь. су. Είбе1 (№\\!юизе е! а1. (1992) Р1ап! РЬузюк 100:882-886). Исследование наследственности подтверждает, что единственный частично доминантный ген обеспечивает устойчивость. На основании изучения аллелей авторы делают вывод, что мутации в четырех идентифицированных линиях были расположены в одном и том же локусе. Один из резистентных генов культурного сорта растения Е1бе1 был обозначен Ε3-4 (№\\!юизе е! а1 (1992) Р1ап! РЬузюк 100:882-886).

Существующие в природе популяции растений, которые оказались устойчивыми к имидазолиноно

- 1 019952 вым и/или сульфонилмочевинным гербицидам, также были использованы для получения устойчивых к гербицидам селекционных линий подсолнечника. В частности, две линии подсолнечника, которые являются устойчивыми к сульфонилмочевинным гербицидам, были получены с использованием идиоплазмы, берущей начало из дикой популяции подсолнечника однолетнего (Нейапйшх апииик), в качестве источника свойств устойчивости к гербицидам (МШег апб А1-КйайЬ (2004) Сгор δα. 44:1037-1038). Ранее, А1Ше е( а1. ((2002) Аееб δα. 50:432-437) сообщали, что отдельные растения из дикой популяции подсолнечника однолетнего из Южной Дакоты, США, были перекрестно резистентны к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам. Анализ части кодирующей области генов большой субъединицы ацетогидроксикислотной синтазы (АНА8Ь) индивидуальных растений из этой популяции обнаружил точечные мутации, которые дают в результате аминокислотное замещение А1а-Уа1 в белке АНА8Ь подсолнечника, которое соответствует А1а₂₀₅ в белке АНА8Ь дикого типа АтаЫборкщ (НаНапа (А1Ше е( а1. (2003) Аееб δα. 51:845-853). Ранее, Аль-Хатиб и Миллер ((2000) Сгор 8с1. 40:869) сообщали о получении четырех устойчивых к имидазолинону селекционных линий подсолнечника.

Компьютерное моделирование трехмерных конформаций комплекса АНАδ-ингибитор предсказало различные аминокислоты в предполагаемых местах связывания ингибитора, как в местах, где индуцированные мутации будут вероятно обеспечивать селективную устойчивость к имидазолинонам (Ой е( а1. (1996) 1. Мо1. Вю1. 263:359-368). Растения табака, полученные с некоторыми из этих рационально обозначенных мутаций в предполагаемых местах связывания фермента АНАδ, фактически имели выраженную специфическую устойчивость к единственному классу гербицидов (Ой е( а1. (1996) 1. Мо1. Вю1. 263:359-368).

Растения, устойчивые к имидазолиноновым гербицидам, также описаны в ряде патентов США № 4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439, и 6,222,100, особенно описывается использование измененного гена АНАδ для вызывания устойчивости к гербицидам в растениях и особенно описываются некоторые устойчивые к имидазолинону линии кукурузы. В патенте США № 5,013,659 раскрыты растения, проявляющие устойчивость к гербицидам вследствие мутации по меньшей мере одной аминокислоты в одной или более консервативной области. Описанные мутации кодируют либо перекрестную устойчивость к имидазолинонам и сульфонилмочевинам или специфическую устойчивость к сульфонилмочевине, но специфическая устойчивость к имидазолинону не описана. В патенте США № 5,731,180 и патенте США № 5,767,361 обсуждается выделенный ген, имеющий единичное аминокислотное замещение в аминокислотной последовательности АНАδ односемядольного растения дикого типа, которое дает в результате специфическую устойчивость к имидазолинону. Кроме того, растения риса, устойчивые к гербицидам, которые препятствуют АНАδ, были получены путем воспроизведения мутации и также путем селекции устойчивых к гербицидам растений из пула растений риса, полученных с помощью другой культуры. См. патенты США № 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 и 6,274,796.

В растениях, как и во всех других исследованных организмах, фермент АНАδ содержит две субъединицы: большую субъединицу (каталитическая роль) и малую субъединицу (регуляторная роль) (Бидд1еЬу апб Рапд (2000) 1. Вюсйет. Мо1. Вю1. 33:1-36). Большая субъединица АНАδ (также обозначенная здесь как ΛΗΛδΡ) может быть кодирована с помощью единичного гена, как в случае АтаЫборкщ, и сахарной свеклы, или с помощью множества членов семейства генов, как в маисе, каноле и хлопке. Специфические единичные нуклеотидные замещения в большой субъединице обеспечивают ферменту степень чувствительности к одному или более классов гербицидов (СНапд апб Бидд1еЬу (1998) Вюсйет 1. 333:765-777).

Например, хлебная пшеница, Тпйсит аекйуит Ь., содержит три гомологичных гена большой субъединицы ацетогидроксикислотной синтазы. Каждый из генов проявляет значительную экспрессию, основанную на ответе гербицида и биохимических данных из мутантов в каждом из трех генов (Ахсеп/! е( а1. (2003) 1п1егпа1юпа1 δос^еίу о! Р1ап( Мо1еси1аг Вю1одщ18 Сопдгекк, Вагсе1опа, δρηιπ, Не!. Ыо. δ10-17). Кодирующие последовательности всех трех генов разделяют обширную гомологию на нуклеотидном уровне (АО 03/014357). Секвенированием генов АНΛδ^ из различных сортов Тгйюит аеШуит было найдено, что молекулярной основой толерантности к гербицидам в большинстве 1М1-толерантных (имидазолинонтолерантных) линий является мутация δ653(Λΐ)N, характеризующаяся замещением аспарагина на серин в положении, эквивалентном аминокислоте 653 в АтаЫборкщ 1Ьа1шпа (АО 03/01436; АО 03/014357). Эта мутация обусловлена единичным нуклеотидным полиморфизмом (δΝΡ) в последовательности ДНК, кодирующей белок ΛНΛδ^.

Также известно, что множество генов АНΛδ^ встречается в двудольных видах растений. Ранее Колкман с сотр. ((2004) ТНеог. Арр1. СепеР 109: 1147-1159) описали идентификацию, клонирование и секвенирование трех генов ΛНΛδ^ (ΛНΛδ^1. ΛНΛδ^2. и АНΛδ^3) из устойчивых к гербицидам и дикого типа генотипов подсолнечника (Нейап11ш5 аппит Ь.). Колкман с сотр. сообщали, что устойчивость к гербицидам была обусловлена либо Рго197Ьеи (использованы номенклатурные положения аминокислот ΛНΛδ^ АтаЫборкщ) замещением или А1а205Уа1 замещением в белке ΛНΛδ^1 и что каждое из этих замещений обеспечивает устойчивость и к имидазолиноновым, и к сульфонилмочевинным гербицидам.

Благодаря их высокой эффективности и низкой токсичности имидазолиноновые гербициды благоприятны для сельскохозяйственного использования. Однако возможность использования имидазолино

- 2 019952 новых гербицидов в определенных системах производства зерновых зависит от наличия устойчивых к имидазолинону сортов интересующих зерновых культур. Для получения таких устойчивых к имидазолинону сортов производителям растений необходимо разрабатывать селекционные линии, устойчивые к имидазолинону. Таким образом, необходимы дополнительные устойчивые к имидазолинону селекционные линии и сорта зерновых растений, а также способы и композиции для получения и использования устойчивых к имидазолинону селекционных линий и сортов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение представляет новые устойчивые к гербицидам растения подсолнечника, которые содержат два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (АНАЗЫ) подсолнечника. В частности, растения подсолнечника по изобретению имеют повышенную устойчивость к гербицидам, ингибирующим ацетогидроксикислотную синтазу (АНАЗ), по сравнению с растениями подсолнечника дикого типа. Устойчивые к гербицидам растения подсолнечника по изобретению содержат первый аллель АНАЗЫ и второй аллель АНАЗЫ, причем первый и второй аллели АНАЗЫ кодируют первый и второй устойчивый к гербициду белок подсолнечника АНАЗЫ соответственно. Первый аллель АНАЗЫ кодирует белок подсолнечника АНАЗЫ, содержащий А122Т аминокислотное замещение. Второй аллель АНАЗЫ кодирует белок подсолнечника АНАЗЫ, содержащий А205У аминокислотное замещение или Р197Б аминокислотное замещение. Также представлены части растений подсолнечника, ткани, клетки и семена, которые содержат первый и второй аллели АНАЗЫ.

Настоящее изобретение далее представляет способ получения гибридных растений подсолнечника, которые обладают устойчивостью по меньшей мере к одному ингибирующему АНАЗ гербициду. Способ включает перекрёстное опыление первого растения подсолнечника со вторым растением подсолнечника так, чтобы получить гибридные семена подсолнечника, которые можно будет высеять и затем вырастить гибридные растения подсолнечника, в частности Е1 гибрид растения подсолнечника. Первое растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию первого аллеля гена АНАЗЫ, и второе растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию второго аллеля гена АНАЗЫ. Предпочтительно, первое растение подсолнечника является гомозиготным для первого аллеля и второе растение подсолнечника является гомозиготным для второго аллеля. Первый аллель кодирует белок АНАЗЫ подсолнечника, содержащий А122Т аминокислотное замещение. Второй аллель кодирует белок АНАЗЫ подсолнечника, содержащий А205У аминокислотное замещение или Р197Б аминокислотное замещение.

Настоящее изобретение дополнительно представляет способы контроля сорняков или нежелательной растительности в окрестности растений подсолнечника по изобретению. Один способ включает нанесение эффективного количества ингибирующего АНАЗ гербицида, в частности имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида, на сорняки и растения подсолнечника. Другой способ включает контактирование семян подсолнечника по настоящему изобретению перед посевом и/или после проращивания с эффективным количеством ингибирующего АНАЗ гербицида, в частности имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида. Настоящее изобретение далее предлагает семена подсолнечника по настоящему изобретению, обработанные эффективным количеством ингибирующего АНАЗ гербицида. Растения подсолнечника и семена, используемые в этих способах, содержат в своем геноме первый аллель АНАЗЫ и второй аллель АНАЗЫ. Первый аллель АНАЗЫ кодирует белок АНАЗЫ подсолнечника, содержащий А122Т аминокислотное замещение. Второй аллель АНАЗЫ кодирует белок АНАЗЫ подсолнечника, содержащий А205У аминокислотное замещение или Р197Б аминокислотное замещение.

Настоящее изобретение далее представляет способы контроля паразитических сорняков ОтоЬаисйе ситапа и ОтоЬаисйе сетииа, также известных как заразиха, на пораженных растениях подсолнечника. Способ включает нанесение эффективного количества имидазолинонового гербицида на сорняки и устойчивые к гербицидам растения подсолнечника по настоящему изобретению, в частности растения подсолнечника, содержащие два А122Т аллеля, или растения подсолнечника, содержащие один АНАЗЫ А122Т аллель и один А205У АНАЗЫ аллель.

Настоящее изобретение представляет диагностические способы для идентификации аллелей гена АНАЗЫ в индивидуальном подсолнечнике. Такие диагностические способы включают амплификацию полимеразной цепной реакцией (ПЦР) специфических областей гена АНАЗЫ с использованием праймеров, предназначенных для отжига специфических сайтов в генах АНАЗЫ подсолнечника, таких как, например, сайты при или вблизи мутаций гена АНАЗЫ. Дополнительно представлены праймеры, используемые в этих способах, и наборы для осуществления способа.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено графическое изображение влияния листового нанесения имазапира на высоту растений в течение 14 дней после обработки для гомозиготных материалов с мутациями А122Т и А205У и гетерозиготных генотипов А205+А122Т. Средняя высота (% от необработанных участков) обозначается символами и границы погрешности представляют стандартное отклонение от средних значений.

- 3 019952

На фиг. 2 представлено графическое изображение влияния листового нанесения имазапира на показатель фитотоксичности (ΡΣ) в течение 14 дней после обработки для гомозиготных материалов с мутациями А122Т и А205У и гетерозиготных генотипов А205 + А122Т. Среднее значение ΡΙ обозначается символами и границы погрешности представляют стандартное отклонение от средних значений.

На фиг. 3 представлено графическое изображение влияния листового нанесения имазапира на накопление биомассы в течение 14 дней после обработки для гомозиготных материалов с мутациями А122Т и А205У и гетерозиготных генотипов А205 + А122Т. Среднее значение сухой биомассы (% от необработанных участков) обозначается символами и границы погрешности представляют стандартное отклонение от средних значений.

На фиг. 4 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификаций с использованием праймеров р-АНА818/рАНА8-19 и последующим электрофорезом в агарозном геле. Полоса 1 СМ40 (А122Т мутация), полоса 2 - Ь1 (А205У мутация), полосы 3 и 4 - Н3; полосы 5 и 6 - Н4; полосы 7 и 8 - Н1; полосы 9 и 10 - Ь2.

На фиг. 5 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ферментативного сбраживания продуктов ПЦР амплификаций с ВтдВ I и последующим электрофорезом в агарозном геле. Полоса М, молекулярный массовый маркер; полоса 1 - ВТК47 (дикий тип); полоса 2 - СМ40 (А122Т); полоса 3 - Р1 растение из перекрестного сткВТК47 х СМ40; и полоса 4 - еткСМ40 (А122Т).

На фиг. 6 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификаций, полученных с использованием р-АНАЗ ΝΙΟΕ/ΛΗΛ8 122 ТМи комбинации. Полоса 1 - молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 2 - молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер), полоса 3 - 122 индивидуальный гомозиготный, полоса 4 - 205 гомозиготный индивидуальный, полоса 5 - 197 гомозиготный индивидуальный, полоса 6 - \УТ (гаплотип 1), полоса 7 - 122/^УТ индивидуальный, полоса 8 - 122/205 индивидуальный, линия 9 - 122/197 индивидуальный, линия 10 - вода (негативный контроль), полоса 11 - молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 12 - молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер).

На фиг. 7 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификаций, полученных с использованием р-АНАЗ ΝΙΌΡ / АНАЗ 122 Т\УТ комбинации. Полоса 1 - молекулярный массовый маркер (25 п.о. маркер), полоса 2 - молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер), полоса 3 - 122 гомозиготный индивидуальный, полоса 4 - 205 гомозиготный индивидуальный, полоса 5 - 197 гомозиготный индивидуальный, полоса 6 - \УТ (гаплотип 1), полоса 7 - 122/^УТ индивидуальный, полоса 8 - 122/205 индивидуальный, линия 9 - 122/197 индивидуальный, линия 10 - вода (негативный контроль), полоса 11 - молекулярный массовый маркер (25п.о. маркер), полоса 12 - молекулярный массовый маркер (100 п.о. маркер).

На фиг. 8 представлено сравнение последовательности, показывающее различие в нуклеотидных последовательностях гаплотипов АНАЗЫ подсолнечника, где геномная ДНК подсолнечника каждого гаплотипа (Нар) амплифицирована с использованием пары праймеров р-АНАЗ №ПР/АНА8122Т^Т или пары праймеров р-АНАЗ ШПЕ/АНАЗ 122 ТМИ. Положение праймеров указано стрелками. Положения нуклеотидной последовательности, кодирующей (АСС)_П повтор (кодирует поли-Тйт область в предполагаемом транспортном пептиде) и ΙΝΏΕΕκ в нуклеотидной последовательности АНАЗЫ, выделены жирным шрифтом и цветом соответственно. (АСС)_П повтор и ΙΝΏΕΕ8 предполагаются в соответствующей части нуклеотидной последовательности АНАЗЫ, которая кодирует транспортный пептид АНАЗЫ. Положение единичного нуклеотидного полиморфизма А122Т (3ΝΡ) указано с помощью (▼). Числа в конце последовательностей показывают существующий размер фрагмента каждого гаплотипа, амплифицированного либо с парой праймеров р-АНАЗ МОЕ/АНАЗ^Т^Т (Нар1-5), либо с парой праймеров рАНАЗ ЧИЖА! 1АЗ 122 ТМи (Нар6).

На фиг. 9 представлена фотографическая иллюстрация продуктов ПЦР амплификаций, полученных с использованием экстрактов ДНК из тканей подсолнечника из растений, которые являются или гетерозиготными для аллеля АНАЗЫ А122Т (НЕТ), гомозиготными (МиТАЭТ) для аллеля АНАЗЫ А122Т или дикого типа при локусе АНАЗЫ (^Т). ПЦР амплификация выполнялась, как описано в примере 7, и продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% (масса/объем) агарозном геле.

На фиг. 10 представлено графическое изображение повреждений растений (средний % фитотоксичности) при дозе 200 г аи/га имазамокса, определяемое на 9-12 дни после обработки (левая половина) и на 25-30 дни после обработки (правая половина), расположенные в четырех местностях в 2007 для четырех разных типов гибридов. Четыре местности использовали: Велва, СД, США; Анжер, Фр; Сантэ, Фр; и Формоза, Арканзас. Четыре различных типа гибридов, представленные на фиг. 10, представляют собой А122Т гомозиготный (СЬНА-РШк гомо), А122Т/А205 (СЬНА-РЫк / 1М18иН гетеро), А122Т гетерозиготный (СЬНА-РЫк гетеро) и А205У гомозиготный (1М18иК гомо).

На фиг. 11 представлено графическое изображение повреждений растений различных типов гибридов подсолнечника, перенесших СЬНА-РШк мутацию, после нанесения имазамокса. Четыре различных типа гибридов, представленные на фиг. 11, представляют собой А122Т гомозиготный (СЬНА-РЫк гомо), А122Т/А205 (С^НΛ-Ρ1ик/IМIЗυN гетеро), А122Т гетерозиготный (СЬНА-РЫк/^Т гетеро) и А205У гомозиготный (1М18иХ гомо).

На фиг. 12 представлено графическое изображение повреждения растений различных типов гибридов подсолнечника, перенесших СЬНА-РЫк мутацию, после нанесения имазапира (СЬНА-РЫк гомози

- 4 019952 готный: Ь=0,20±0,06, Р<0,048 СЬНА-Р1и8 /ΙΜΙ8υΝ гетерозиготный: Ь: 0,26±0,07, Р<0.0019; СЬНА-Р1и8 ЖТ: Ь: 0,55±0,18, Р< 0.0109). Четыре различных типа гибридов, представленные на фиг. 12, представляют собой А122Т гомозиготный (СЬНА-Р1и8 гомо), А122Т/А205 (СЬНА-Р1и8 / ΙΜΙ8υΝ гетеро), А122Т гетерозиготный (СЬНА-Р1и8 / \УТ гетеро) и А205У гомозиготный (ΙΜΙ8υΝ гомо).

На фиг. 13 представлено графическое изображение активности фермента АНА8 (выраженной как процент от необработанного контроля) четырех линий подсолнечника в присутствии 100 мкМ имазамокса (левая половина) или 100 мкМ имазапира (правая половина).

На фиг. 14 представлено графическое изображение активности фермента АНА8 (выраженной как процент от необработанного контроля) пяти линий подсолнечника в присутствии повышенных уровней имазамокса.

Перечень последовательностей

Нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности, приведенные в указанном перечне последовательностей, показаны с использованием стандартных буквенных аббревиатур для нуклеотидных оснований и трехбуквенных кодов для аминокислот. Последовательности нуклеиновых кислот следуют стандартному условному обозначению начало при 5' конце последовательности и направлены вперед (например, справа налево в каждой линии) к 3' концу. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но понятно, что комплементарные цепи будут включаться с помощью любых ссылок в представленную цепь. Аминокислотные последовательности следуют стандартному условному обозначению: начало при амино-конце последовательности и направлены вперед (например, справа налево в каждой линии) к карбоксиконцу.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 представляет нуклеотидную последовательность р-АНА818.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 представляет нуклеотидную последовательность р-АНА819.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3 представляет нуклеотидную последовательность р-АНА8 ΝΙΌΡ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 представляет нуклеотидную последовательность АНА8 122 Т\УТ.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 представляет нуклеотидную последовательность АНА8 122 ТМи.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6 представляет нуклеотидную последовательность части АНА8Б1 гаплотипа 1 подсолнечника (Нар1), который показан на фиг. 8.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7 представляет нуклеотидную последовательность части АНА8Б1 гаплотипа 2 подсолнечника (Нар2), который показан на фиг. 8.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8 представляет нуклеотидную последовательность части АНА8Б1 гаплотипа 3 подсолнечника (Нар3), который показан на фиг. 8.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9 представляет нуклеотидную последовательность части АНА8Б1 гаплотипа 4 подсолнечника (Нар4), который показан на фиг. 8.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 10 представляет нуклеотидную последовательность части АНА8Б1 гаплотипа 5 подсолнечника (Нар5), который показан на фиг. 8.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11 представляет нуклеотидную последовательность части АНА8Б1 гаплотипа 6 подсолнечника (Нар6), который показан на фиг. 8.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12 представляет нуклеотидную последовательность, соответствующую положению праймера р-АНА8 ΝΙΌΕ внутри нуклеотидной последовательности АНА8Б1, показанной на фиг. 8 (см. верхнюю стрелку на фиг. 8). Праймер р-АНА8 ΝΙΌΡ отжигает нуклеотидную последовательность, которая является комплементом нуклеотидной последовательности, представленной в виде 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 13 представляет нуклеотидную последовательность места отжига праймера АНА8 122 Т\УТ внутри нуклеотидных последовательностей АНА8Б1 Нар1-Нар5 (8ЕО ΙΌ ΝΟ8: 6-10 соответственно), показанных на фиг. 8 (см. нижнюю стрелку на фиг. 8).

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14 представляет нуклеотидную последовательность места отжига праймера АНА8 122 ТМи внутри нуклеотидной последовательности АНА8Б1 Нар6 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11), показанной на фиг. 8 (см. нижнюю стрелку на фиг. 8).

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 15 представляет нуклеотидную последовательность НА122СР.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16 представляет нуклеотидную последовательность НА122\\1.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17 представляет нуклеотидную последовательность НА122ти1.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 18 представляет нуклеотидную последовательность НА122СК

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивый к гербицидам белок АНА8Б1, содержащий аминокислотное замещение А122Т, линий подсолнечника 84897 и 6М40, как описано в \¥Ο 2007005581. 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19 соответствует 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 из ΧΥΟ 2007005581.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20 представляет часть длины аминокислотной последовательности устойчивого к гербицидам белка АНА8Б1, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 19. 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20 соответствует 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 из ΑΟ 2007005581.

8ЕО ΙΌ ΝΟ: 21 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый устойчивый к гербицидам белок АНА8Б1, содержащий аминокислотное замещение Р197Б, линии подсолнечника МиТ28, как описанная в \¥Ο 2006024351. 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 21 соответствует 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5 из ΧΥΟ 2006024351.

- 5 019952

8ЕО Ш N0: 22 представляет аминокислотную последовательность зрелого устойчивого к гербицидам белка АНА8Ь1, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 Ш N0: 21. 8Е0 Ш N0: 21 соответствует 8Е0 Ш N0: 6 из \¥0 2006024351.

8Е0 Ш N0: 23 представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый устойчивый к гербицидам белок АНА8Ы, содержащий аминокислотное замещение А205У, гаплотипа 5 НейаиШик аппит, как описанная в Банке Генов под № АУ541455 и Колкманом с сотр. (2004) Тйеот. Арр1. Сеие1. 109: 1147-1159. 8Е0 Ш N0: 23 соответствует нуклеотидам 244-1959 нуклеотидной последовательности из Банка Генов № АУ541455.

8Е0 Ш N0: 24 представляет аминокислотную последовательность зрелого устойчивого к гербицидам белка АНА8Ь1, кодируемого нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 Ш N0: 23. 8Е0 Ш N0: 24 соответствует аминокислотам 82-652 аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью из Банка Генов № АУ541455.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к устойчивым к гербицидам растениям подсолнечника, содержащим в своем геноме два различных аллеля гена АНА8Ь1 подсолнечника. Каждый из двух различных аллелей кодирует белок АНА8Ь1 подсолнечника, который содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности АНА8Ь1 подсолнечника дикого типа одной или более аминокислотами. Каждый из аллелей АНА8Ы по настоящему изобретению придает растению подсолнечника повышенную устойчивость или толерантность к ингибирующим АНА8 гербицидам, в частности имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам. Настоящее изобретение далее относится к способам изготовления этих растений подсолнечника и способам контроля сорняков или нежелательной растительности, произрастающей вблизи растений подсолнечника по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение основано на открытии, что Г1 гибрид растения подсолнечника, который содержит единичную копию каждого из двух различных устойчивых к гербициду аллелей АНА8Ы подсолнечника, включает коммерчески допустимые уровни устойчивости к АНА8 гербицидам. Таким образом, настоящее изобретение находит применение для получения гибридных растений подсолнечника путем предоставления производителям растений поддержки, например, первой линии подсолнечника, которая является гомозиготной для первого устойчивого к гербицидам аллеля АНА8Ь1, и второй линии подсолнечника, которая является гомозиготной для второго устойчивого к гербицидам аллеля АНА8Ы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способы включают использование толерантных к гербицидам или устойчивых к гербицидам растений. Толерантное к гербицидам или устойчивое к гербицидам растение означает, что растение является толерантным или устойчивым по меньшей мере к одному гербициду при уровне, при котором обычно гибнут или задерживают рост обычные растения или растения дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения толерантные к гербицидам растения по изобретению содержат толерантный к гербицидам или устойчивый к гербицидам белок АНА8Ь. Термин толерантный к гербицидам белок АНА8Ь или устойчивый к гербицидам белок АНА8Ь означает, что такой белок АНА8Ь проявляет более высокую активность АНА8 по сравнению с активностью АНА8 белка АНА8Ь дикого типа в присутствии по меньшей мере одного гербицида, который мешает активности АНА8 и при концентрации или уровне гербицида, который ингибирует активность АНА8 белка АНА8Ь дикого типа. Более того, активность АНА8 такого толерантного к гербицидам или устойчивого к гербицидам белка АНА8Ь может быть обозначена как толерантная к гербицидам или устойчивая к гербицидам активность АНА8.

Для настоящего изобретения термины толерантный к гербицидам и устойчивый к гербицидам используются взаимозаменяемо и имеют эквивалентные значения и эквивалентный объем. Аналогично, термины толерантность к гербицидам и устойчивость к гербицидам используются взаимозаменяемо и имеют эквивалентные значения и эквивалентный объем. Аналогично, термины устойчивый к имидазолинону и устойчивость к имидазолинону используются взаимозаменяемо и имеют эквивалентные значения и эквивалентный объем с терминами толерантный к имидазолинону и толерантность к имидазолинону соответственно.

Изобретение представляет растения, ткани растений, клетки растений и клетки-хозяева с повышенной устойчивостью или толерантностью по меньшей мере к одному гербициду, в частности имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду. Предпочтительное количество или концентрация гербицида представляет собой эффективное количество или эффективную концентрацию. Под эффективным количеством или эффективной концентрацией понимают количество и концентрацию, соответственно которые достаточны для уничтожения или ингибирования роста похожих растений дикого типа, тканей растений, клеток растений или клеток-хозяев, но при этом указанное количество не уничтожает или не ингибирует сильно рост устойчивых к гербицидам растений, тканей растений, клеток растений или клеток-хозяев по настоящему изобретению. Обычно эффективным количеством или эффективной концентрацией гербицида является количество или концентрация, которые традиционно используются в сельскохозяйственных производственных системах для уничтожения интересующих сорняков. Такие количества известны или могут быть легко определены средним специалистом в данной области.

- 6 019952

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагаются растения подсолнечника, которые содержат коммерчески допустимые уровни устойчивости или толерантности к ингибирующему АНАБ гербициду. До тех пор пока другое не указано или другое не очевидно из контекста, растения подсолнечника, которые содержат такой уровень устойчивости или толерантности к ингибирующему АНАБ гербициду являются устойчивыми или толерантными к нанесению эффективного количества или эффективной концентрации по меньшей мере одного ингибирующего АНАБ гербицида. Как указано выше, эффективным количеством или концентрацией гербицида является количество или концентрация, которые традиционно используются в сельскохозяйственных производственных системах для уничтожения интересующих сорняка или сорняков, и такие количества известны или могут быть легко определены средним специалистом в данной области.

Под похожими растениями дикого типа, тканями растений, клетками растений или клеткамихозяевами понимаются растения, ткани растений, клетки растений или клетки-хозяева, соответственно которые не имеют свойств устойчивости к гербицидам и/или полинуклеотидов по изобретению, которые раскрыты здесь. Использование термина дикого типа не означает, что растения, ткани растений, клетки растений или клетки-хозяева не имеют рекомбинантную ДНК в их геноме и/или не имеют свойств устойчивости к гербицидам, которые различны с раскрытыми в настоящем описании.

До тех пор пока ясно не указано другое, термин растение означает растение на любой стадии развития, а также любую часть или части растения, которые могут быть прикреплены или отделены от целого неповрежденного растения. Такие части растения включают, но не ограничиваются ими, органы, ткани и клетки растения. Примеры частей растений включают стебель, лист, корень, соцветие, цветок, цветок компактного соцветия, фрукт, цветоножку, плодоножку, тычинку, пыльник, рыльце, столбик, завязь, лепесток, чашелистик, плодолистик, конец корня, корневой чехлик, корневой волосок, листовой волосок, семенной волосок, пыльцевое зерно, микроспору, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоэму, паренхиму, эндосперм, клетку-спутник, замыкающую клетку и любые другие известные органы, ткани и клетки растения. Кроме того, общепризнано, что семя является растением.

В одном из вариантов изобретение предлагает растения подсолнечника, содержащие в своем геноме по меньшей мере одну копию мутантного аллеля АНАБЫ А122Т и по меньшей мере одну копию мутантного аллеля АНАБЫ А205Т. Такое растение подсолнечника содержит коммерчески допустимый уровень толерантности по меньшей мере к одному ингибирующему АНАБ гербициду, в частности имидазолиноновому гербициду. Такие растения находят применение в сельском хозяйстве, особенно в методах контроля сорняков, включающих использование имидазолиноновых гербицидов, как описано здесь.

В другом варианте изобретение предлагает растения подсолнечника, содержащие в своем геноме по меньшей мере одну копию мутантного аллеля АНАБЫ А122Т и по меньшей мере одну копию мутантного аллеля АНАБЫ Р197Ь. Такое растение подсолнечника содержит коммерчески допустимый уровень толерантности по меньшей мере к одному ингибирующему АНАБ гербициду, в частности сульфонилмочевинному и/или имидазолиноновому гербициду. Такие растения находят применение в сельском хозяйстве, особенно в методах контроля сорняков, включающих использование имидазолиноновых и/или сульфонилмочевинных гербицидов, как описано здесь.

Настоящее изобретение включает использование растения подсолнечника, содержащего ген АНАБЫ, который содержит А122Т мутацию. Такой ген АНАБЫ кодирует белок АНАБЫ, содержащий А122Т аминокислотное замещение. Настоящее изобретение не зависит от использования редких сортов, линий подсолнечника или растений, содержащих ген АНАБЫ с А122Т мутацией. Любое растение подсолнечника, содержащее по меньшей мере один аллель гена АНАБЫ с А122Т мутацией, может быть использовано в описанных здесь способах. В одном из вариантов осуществления изобретения ген АНАБЫ с А122Т мутацией содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде БЕЦ ΙΌ N0: 19, или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в виде БЕЦ ΙΌ N0: 20.

Примером линии подсолнечника, содержащей по меньшей мере одну копию мутантного аллеля АНАБЫ А122Т является СМ40 (см. АО 2007005581 и предварительную патентную заявку США № 60/695,952; поданную 1 июля 2005; обе включены здесь с помощью ссылки). Хранение семян подсолнечника СМ40 было осуществлено в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур (АТСС), Манассас, УА 20110 США, 17 мая 2005, и присвоен АТСС патентный депозитарный номер РТА-6716. Срок хранения линии подсолнечника СМ40 был указан не менее 30 лет и не менее 5 лет после последнего требования предоставления образца депозита и является общепринятым в АТСС. Кроме того, заявители удовлетворили все требования 37 С.Р.К § 1.801-1.809, включающие предоставление критериев жизнеспособности образца.

Другим примером линии подсолнечника, содержащей по меньшей мере одну копию мутантного аллеля АНАБЫ А122Т, является СМ1606 (см. АО 2007005581). Хранение семян подсолнечника СМ1606 было осуществлено в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур (АТСС), Манассас, УА 20110 США, 19 мая 2006, и получен АТСС патентный депозитарный номер РТА-7606. Срок хранения линии подсолнечника СМ1606 был указан не менее 30 лет и не менее 5 лет после последнего требования предоставления образца депозита и является общепринятым в АТСС. Кроме того, заявители

- 7 019952 удовлетворили все требования 37 С.Е.К. §§ 1.801-1.809, включающие предоставление критериев жизнеспособности образца.

Настоящее изобретение включает использование растения подсолнечника, содержащего ген АНАЗЫ, который содержит А205У мутацию. Такой ген АНАЗЫ кодирует белок АНАЗЫ, содержащий А205У аминокислотное замещение. Настоящее изобретение не зависит от использования редких сортов, линий подсолнечника или растений, содержащих ген АНАЗЫ с А205У мутацией. Любое растение подсолнечника, содержащее по меньшей мере один аллель гена АНАЗЫ с А205У мутацией, может быть использовано в описанных здесь способах. В одном из вариантов осуществления изобретения ген АНАЗЫ с А205У мутацией содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕО Ш N0: 23 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в виде ЗЕО Ш N0: 24.

Растения подсолнечника, содержащие по меньшей мере один аллель гена АНАЗЫ с А205У мутацией, широко используются в коммерческом производстве подсолнечника и являются легкодоступными. Любой сорт такого коммерчески доступного растения подсолнечника может быть использован в описанных здесь способах. Такими сортами являются доступные от различных коммерческих компаний (например, Ыбета З.А., Буэнос-Айрес, Арентина; Эека1Ь Сепейсз Сотрогайои, Эска1Ь. Иллинойс, США; Мусодеп Зеебз, Индианаполис, Индиана, США; Зеебз 2000, Вгескеппбде, Миннесота, США; Ттштрй Зееб Сотрапу, Кшк, Техас, США,) источники и включают, но не ограничиваются ими, РагаБо 101СБ, Рагайо 102СБ, ИКР38,-80СЬ, 8Н429СБ, 8Н419СБ, 8Н386СЬ, 8Н358СБ, 629СЬ, 630,СЬ, 4682^/СЬ, 4880№/СЬ, Ватгасиба, Сйатдет, У1рег, 620СБ, 650СБ, и 660СБ. Кроме того, семена растений подсолнечника, содержащих по меньшей мере один аллель гена АНАЗЫ с А205У мутацией, сохраняются в Национальном центре сохранения генетических источников, Форт Коллинз, Колорадо, и могут быть получены по номерам Р1 633749 и Р1 633750.

Настоящее изобретение включает использование растения подсолнечника, содержащего ген АНАЗЫ, который содержит Р197Б мутацию. Такой ген АНАЗЫ кодирует белок АНАЗЫ, содержащий Р197Б аминокислотное замещение. Настоящее изобретение не зависит от использования редких сортов, линий подсолнечника или растений, содержащих ген АНАЗЫ с Р197Б мутацией. Любое растение подсолнечника, содержащее по меньшей мере один аллель гена АНАЗЫ с Р197Б мутацией, может быть использовано в описанных здесь способах. Растения подсолнечника, содержащие по меньшей мере один аллель гена АНАЗЫ с Р197Б, были раскрыты в \У0 2006024351 и патентной заявке США № 11/659,007, дата международной подачи 29 июля 2005; обе включены здесь с помощью ссылки. В одном из вариантов осуществления изобретения ген АНАЗЫ с Р197Б мутацией содержит полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕО Ш N0: 21 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в виде ЗЕО Ш N0: 22.

О трех линиях подсолнечника, содержащих по меньшей мере один аллель гена АНАЗЫ с Р197Б мутацией, сообщалось в публикации Департамента США Службы сельскохозяйственных исследований. Три линии представляют собой НА 469, КНА 470, и КНА 471. Семена каждой из трех линий могут быть получены у ЗеебзЮскз Рто.)ес1, Иерайтеи! оГ Р1аи1 Заепсез, Ьойздатб На11, №г111 Иако1а З1а1е Ишуегзйу, Батдо, N0 58105, ИЗ.

Настоящее изобретение включает растения подсолнечника с мутациями в гене АНАЗЫ подсолнечника. Эти мутации дают начало белкам АНАЗЫ подсолнечника, которые содержат специфические аминокислотные замещения в их аминокислотных последовательностях по сравнению с аминокислотными последовательностями белка АНАЗЫ подсолнечника дикого типа. Такие аминокислотные замещения включают, например, А122Т, А205У и Р197Б. Под А122Т понимают замещение треонина на аланин в положении белка АНАЗЫ подсолнечника, которое соответствует положению аминокислоты 122 в белке АНАЗЫ АаЫборзхз 1йа11аиа. Под А205У понимают замещение валина на аланин в положении белка АНАЗЫ подсолнечника, которое соответствует положению аминокислоты 205 в белке АНАЗЫ АтаЫбор§18 1йа11апа. Под Р197Б понимают замещение лейцина на пролин в положении белка АНАЗЫ подсолнечника, которое соответствует положению аминокислоты 197 в белке АНАЗЫ АаЫборзхз 1йайапа.

Если не указано другое или другое не очевидно из контекста, указанные здесь положения аминокислот в белке АНАЗЕ 1 подсолнечника являются соответствующими положениям в хорошо изученном белке АНАЗЫ АтаИборвхз 1йаБапа. Положения аминокислот в белке АНАЗЫ подсолнечника, которые соответствуют положениям аминокислот 122, 197 и 205 в АНАЗЫ АтаИборвхз Шайапа, являются 107, 182 и 190 соответственно. См. \У0 2007005581 (табл. 4) для дополнительной информации о положениях известных аминокислотных замещений, которые придают устойчивость к гербицидам белкам ЛНЛЗ^, и соответствующих им положениям в белках АНАЗЫ подсолнечника и АтаИборвхз 1йа11апа.

Настоящее изобретение представляет белки АНАЗЕ с аминокислотными замещениями в отдельных положениях аминокислот внутри консервативных областей описанных здесь белков АНАЗЫ подсолнечника. Кроме того, обычный специалист должен понимать, что такие положения аминокислот могут меняться в зависимости от того, добавляются ли аминокислоты или удаляются, например, из N терминального конца аминокислотной последовательности. Таким образом, изобретение охватывает аминокислотные замещения при перечисленных положениях или эквивалентных положениях. Под эк

- 8 019952 вивалентным положением понимают положение, которое находится внутри такой же консервативной области, как в приведенных примерах положения аминокислоты. Такие консервативные области известны из уровня техники (см. табл. 1 в АО 20070055581) или могут быть определены путем сравнения последовательностей или другими методами, известными из уровня техники.

Настоящее изобретение далее представляет способ получения гибридных растений подсолнечника, которые обладают устойчивостью по меньшей мере к одному ингибирующему ЛНЛ8 гербициду. Способ включает перекрёстное опыление первого растения подсолнечника со вторым растением подсолнечника так, чтобы получить гибридные семена подсолнечника, которые можно будет высеять и затем вырастить гибридные растения подсолнечника, в частности Т1 гибрид растения подсолнечника. Первое растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию первого аллеля гена АНА§Ь1, и второе растение подсолнечника содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию второго аллеля гена АНА8Ь1. Предпочтительно первое растение подсолнечника является гомозиготным для первого аллеля, и второе растение подсолнечника является гомозиготным для второго аллеля. Первый аллель кодирует белок АНА8Ь1 подсолнечника, содержащий А122Т аминокислотное замещение. Второй аллель кодирует белок АНА8Ь1 подсолнечника, содержащий А205У аминокислотное замещение или Р197Ь аминокислотное замещение.

Способ получения гибридного растения подсолнечника может далее включать сбор семян, с получением в результате указанного скрещивания или селекции по меньшей мере одного потомка растения подсолнечника из указанного скрещивания, который содержит в своем геноме указанный первый и указанный второй аллели. Такое потомство может быть отобрано с помощью любых известных из уровня техники методов, включая ПЦР амплификацию всего или части гена АНА8Ь1 для определения аллелей, которые присутствуют в растении. ДНК для использования в ПЦР амплификации может быть получена из части семени подсолнечника, полученных в результате скрещивания, или части растения, выращенного из такого семени. В примере 2, представленном ниже, приведен предпочтительный способ по изобретению отбора желаемого потомства растения, который включает ПЦР амплификацию. Альтернативно, потомство растения может быть отобрано путем оценки продуктивности потомства растения в тесте на устойчивость к гербицидам в тепличных или полевых условиях, как описано ниже.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридное растение подсолнечника по изобретению получали путем скрещивания первого растения подсолнечника, которое является гомозиготным для аллеля А205У АНА8Ь1, со вторым растением подсолнечника, которое гомозиготно для аллеля АНА8Ы А122Т. Все полученные в результате гибридные семена и растения, выращенные из таких семян, проверяли на содержание в их геноме одного аллеля А205У АНА8Ы и одного аллеля АНА8Ы А122Т. В этом предпочтительном варианте либо первый, либо второй подсолнечник может быть донором пыльцы для скрещивания.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения гибридное растение подсолнечника по изобретению получали путем скрещивания первого растения подсолнечника, которое является гомозиготным для аллеля Р197Ь АНА8Ы, со вторым растением подсолнечника, которое гомозиготно для аллеля АНА8Ь1 А122Т. Все полученные в результате гибридные семена и растения, выращенные из таких семян, проверяли на содержание в их геноме одного аллеля Р197Ь АНА8Ы и одного аллеля АНА8Ы А122Т. В этом предпочтительном варианте либо первый, либо второй подсолнечник может быть донором пыльцы для скрещивания.

Для целей настоящего изобретения, пока другое не указано или не следует из контекста, потомком растения является любое растение, которое происходит по меньшей мере из одного растения по изобретению и включает, но не ограничивается ими, первую, вторую, третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую и десятую генерацию потомков растения по изобретению. Предпочтительно такие потомки обладают повышенной устойчивостью по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа, и такие потомки содержат по меньшей мере один мутантный аллель АНА8Ы, выбранный из группы, состоящей из А122Т, А205У и Р197Ь аллелей. Еще более предпочтительно, такие потомки обладают повышенной устойчивостью по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду по сравнению с растением дикого типа, и такие потомки содержат по меньшей мере два различных мутантных аллеля АНА8Ы, выбранных из группы, состоящей из А122Т, А205У и Р197Ь аллелей.

В одном варианте осуществления изобретения растения подсолнечника по изобретению содержат аллель А122Т и продуцируют семена, содержащие экстрагируемое масло, которое содержит по меньшей мере 85% (мас./мас.) олеиновой кислоты или 850 г олеиновой кислоты /кг масла.

Предпочтительно,% содержания олеиновой кислоты в масле семян подсолнечника по настоящему изобретению определяли стандартными методами анализа растительных масел, такими как, например, способы, описанные в ОГПс1а1 МеШобк οί ΛηαΙνΑ οί А^оааОоп οί 111е ΟΓΠοίαΙ Апа1уНса1 СйеннУ/ (1990) А. НопгЦх. еб., 14111 еб ., Αοδίιίηφοη. Э.С. и/или АОС8 - Атепсап ОН СйетШ/ 8ос1е1у, ОГПаа1 аиб Теп1айуе МеШобк оГ 111е Атепсап Ой СйетШ5'8ос1е1у (1998) 5ΐΗ еб, СЫсадо, ШшоЦ

Настоящее изобретение предлагает способы усиления толерантности или устойчивости растений, тканей растений, клеток растений или клеток-хозяев по меньшей мере к одному гербициду, который ме

- 9 019952 шает активности фермента ЛНЛ8. Преимущественно таким гербицидом является имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид, триазолопиримидиновый гербицид, пиримидинилоксибензоатный гербицид, сульфониламино-карбонилтриазолиноновый гербицид или их смеси. Более предпочтительно, таким гербицидом является имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид или их смеси. Для настоящего изобретения, имидазолиноновые гербициды включают, но не ограничиваются ими, ρυκδυϊτ® (имазетапир), САЙКЕ® (имазапик), КАРТОЙ® (имазамокс), 8СЕРТЕК® (имазахин), А88ЕКТ® (имазетабенз), ΑΚ8ΕΝΑΕ® (имазапир), производные любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более вышеуказанных гербицидов, например имазапир/имазамокс (ΟΌΥ88ΕΥ®). Более специфично имидазолиноновый гербицид может быть выбран, но не ограничен ими, из 2-(4изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил)-4-метил-5-оксо-2имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой кислоты, 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин2-ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имдазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имдазолин-2-ил)-5-метилникотиновой кислоты, и смеси метил-6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил-2-(4-изопропил-4метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-р-толуата. Использование 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты и 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5(метоксиметил)никотиновой кислоты является предпочтительным. Еще более предпочтительно использование 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты.

Для настоящего изобретения сульфонилмочевинные гербициды включают, но не ограничиваются ими, хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфурон метил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон, флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон этил, галосульфурон, азимсулфурон, циклосульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон метил, форамсульфурон, иодосульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, производные любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более вышеуказанных гербицидов. Триазолопиримидиновые гербициды по изобретению включают, но не ограничиваются ими, хлорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пеноксулам. Пиримидинилоксибензоатные гербициды по изобретению включают, но не ограничиваются ими, биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пирибензоксим и пирифталид. Сульфониламино-карбонилтриазолиноновые гербициды включают, но не ограничиваются ими, флукарбазон и пропоксикарбазон.

Общепризнано, что пиримидинилоксибензоатные гербициды тесно связаны с пиримидинилтиобензоатными гербицидами и обобщены под заголовком последнего имени Американским научным обществом (\Усс4 8с1еисе δοοίοΙν οί Ашспеа). Следовательно, гербициды по настоящему изобретению включают пиримидинилтиобензоатные гербициды, включая, но не ограничиваясь ими, пиримидинилоксибензоатные гербициды, описанные выше.

Устойчивые к гербицидам растения подсолнечника по изобретению находят применение в способах контроля сорняков. Таким образом, настоящее изобретение далее представляет способ контроля сорняков в окрестности устойчивых к гербицидам растений подсолнечника по изобретению. Способ включает нанесение эффективного количества гербицида на сорняки и устойчивые к гербицидам растения подсолнечника, где растения имеют повышенную устойчивость по меньшей мере к одному гербициду, в частности имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду, по сравнению с растением подсолнечника дикого типа.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет способы контроля паразитических сорняков, известных как заразиха (ОтоЬапсйе крр.), на пораженных растениях подсолнечника. Такие ОтоЬапсйе крр. включают, например, ОтоЬапсйе ситапа и ОтоЬапсйе сегпиа. Способ включает нанесение эффективного количества имидазолинонового гербицида на сорняки и устойчивое к гербицидам растение подсолнечника по настоящему изобретению, в частности растение подсолнечника, содержащее две копии АНА8Б1 А122Т аллеля, или растение подсолнечника, содержащее одну копию АНА8Б1 А122Т аллеля и одну копию А205У АНА8Ь1 аллеля. В предпочтительном варианте имидазолиноновый гербицид является имазапиром. Предпочтительно, ингибирующий АНА8 гербицид наносят на последней стадии вегетации и/или на ранней репродуктивной стадии. Более предпочтительно гербицид наносят на ранней репродуктивной стадии. Наиболее предпочтительно гербицид наносят на стадии роста К1.

Если не указано другое, состояния роста подсолнечника, указываемые здесь, являются стадиями роста, как они определены в работе 8сйпейег апО М111ег (1981) Сгор 8ст 21:901-903.

Для предлагаемых растений подсолнечника, имеющих повышенную устойчивость к гербицидам, в частности имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, может применяться широкий ряд составов при защите растений от сорняков, чтобы усилить рост растений и ослабить конкуренцию за питательные вещества. Гербицид может использоваться сам по себе до появления, после появления сорняков, для предпосевного контроля сорняков и во время сева в областях, окружающих описанные здесь растения, или может быть использован имидазолиноновый гербицидный состав, содержащий другие до

- 10 019952 бавки. Гербицид также может быть использован при обработке семян. Добавки, вводимые в имидазолиноновые или сульфонилмочевинные гербицидные составы, включают другие гербициды, детергенты, адъюванты, рассеивающие агенты, агенты для прилипания, стабилизирующие агенты и т.п. Гербицидный состав может быть влажным или сухим препаратом и может включать, но не ограничивается ими, текучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Гербицид и гербицидные составы могут наноситься в соответствии с общепринятыми методами, например распылением, орошением, опылением или подобным образом.

Настоящее изобретение предлагает не трансгенные и трансгенные семена с повышенной толерантностью по меньшей мере к одному гербициду, в частности ингибирующему АНА8 гербициду, а точнее имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербицидам. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена подсолнечника, обладающие свойствами устойчивости к гербицидам, растения подсолнечника 84897, растения подсолнечника СМ40. растения подсолнечника СМ1606, растения подсолнечника с АТСС патентным депозитарным номером РТА-6716 или растения подсолнечника с АТСС патентным депозитарным номером РТА-7606 и трансгенные семена, содержащие молекулу полинуклеотида по изобретению, который кодирует устойчивый к гербицидам белок АНА8Ь.

Настоящее изобретение предлагает способы, которые включают использование по меньшей мере одного ингибирующего АНА8 гербицида, выбранного из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов, пиримидинилоксибензоатных гербицидов, сульфониламино-карбонилтриазолиноновых гербицидов или их смесей. В этих способах ингибирующий АНА8 гербицид может быть применен любым известным из уровня техники способом, включая, но не ограничиваясь ими, обработку семян, обработку почвы и лиственную обработку.

Перед применением ингибирующий АНА8 гербицид может быть превращен в привычные формы, например растворы, эмульсии, суспензии, дусты, порошки, пасты и гранулы. Выбор формы зависит от намеченной цели; в каждом случае должно гарантироваться высокое качество и распределение вещества по изобретению.

Формы получали известными способами (см., например, И8 3,060,084, ЕР-А-707445 (для жидких концентратов), Втогеишд, Адд1отега1юи, Сйетюа1 Епдшеегшд, Эсе. 4, 1967, 147-48, Реггу'з Сйетюа1 Епщпссг'5 НапбЬоок, 41Н Еб., МеСтаге-НШ, Ыеге Уогк, 1963, радез 8-57 апб е1 зес]. УО 91/13546, И8 4,172,714, И8 4,144,050, И8 3,920,442, И8 5,180,587, И8 5,232,701, И8 5,208,030, СВ 2,095,558, И8 3,299,566, КНпдтап, Уееб Соп1то1 аз а 8с1епсе, 1ойп \УПеу апб 8опз, 1пс., №\ν Уогк, 1961, Напсе е1 а1., Уееб Соп1го1 НапбЬоок, 8(П Еб., В1аскгее11 8с1еп(1Пс РиЫюабоиз, ОхЕотб, 1989 апб Мо11е1, Н., СтиЬешапп, А., Еотибабоп 1есйпо1оду, \УПеу УСН Уег1ад СтЬН, \Ует11еш1 (Сегтапу), 2001, 2. Ό. А. Киоге1е8, СНет181гу апб ТесНпо1оду оГ Адгосйетка1 ЕоттиШюпз, К1игеег Асабешю РиЬПзНегз, ПотбтесЫ, 1998 (Ι8ΒΝ 07514-0443-8), например путем разбавления активного вещества вспомогательными подходящими для состава агрохимикатами, такими как растворители и/или носители, если желательно, эмульгаторами, сурфактантами и диспергаторами, консервантами, антивспенивающими агентами, антизамерзающими агентами, для обработки семян составы также необязательно содержат красители и/или связывающие и/или гелеобразующие агенты.

Примерами подходящих растворителей являются вода, ароматические растворители (например, продукты 8о1уе8во, ксилол), парафины (например, фракции минерального масла), спирты (например, метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, циклогексанон, гаммабутиролактон), пирролидоны (ΝΜΡ, ΝΟΡ), ацетаты (гликоль диацетат), гликоли, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и эфиры жирных кислот. В принципе, также могут быть использованы смеси растворителей.

Примерами подходящих носителей являются земляные природные минералы (например, каолины, глины, тальк, мел) и земляные синтетические минералы (например, высокодисперсные кремнезем, силикаты).

Подходящими эмульгаторами являются неионные и анионные эмульгаторы (например, полиоксиэтиленовые эфиры жирного спирта, алкилсульфонаты и арилсульфонаты).

Примерами диспергаторов являются жидкие лигнин-сульфитные отходы и метилцеллюлоза.

Подходящими сурфактантами являются соль щелочного металла, соль щелочно-земельного металла и аммониевая соль лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнафталинсульфоновой кислоты, алкиларилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты жирных спиртов, жирные кислоты и сульфатированные гликолевые эфиры жирного спирта, кроме того, конденсаты сульфонированного нафталина и производного нафталина и формальдегида, конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленовый эфир октилфенола, этоксилированный изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, алкилфеноловый эфир полигликоля, трибутифениловый эфир полигликоля, тристеарилфениловый эфир полигликоля, алкиларильные полиэфирные спирты, конденсаты спирта и этиленоксида жирного спирта, этоксилированное касторовое масло, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, ацеталь полигликолевого эфира лаурилового спирта, эфиры сорбита, лигносульфитные жидкие отходы и

- 11 019952 метилцеллюлоза.

Веществами, пригодными для приготовления непосредственно распыляемых растворов, эмульсий, паст или масляных дисперсий, являются средне- или высококипящие фракции минеральных масел, такие как керосин или дизельное масло, кроме того, каменноугольные масла и растительные или животные масла, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например толуол, ксилол, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, изофорон, высокополярные растворители, например диметилсульфоксид, Ν-метилпирролидон или вода.

Антизамерзающие агенты, такие как глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль и бактерициды, также могут быть добавлены в составы.

Подходящими антивспенивающими агентами являются, например, антивспенивающие агенты на основе силикона или стеарата магния.

Подходящими консервантами являются, например, дихлорофен и энзилалкогольгеминформаль.

Составы для обработки семян могут дополнительно содержать связующее и необязательно красители.

Связующее может добавляться для улучшения адгезии активного материала к семени после обработки. Подходящими связующими являются блоксополимерные ЕО/РО сурфактанты, а также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакрилаты, полиметилакрилаты, полибутены, полиизобутены, полистиролы, полиэтиленамины, полиэтиленамиды, полиэтиленимины (Ьира8о1®, Ро1ушш®), полиэфиры, полиуретаны, поливинилацетат, тилос и сополимеры, полученные из этих полимеров.

При желании, в состав также могут быть включены красители. Подходящими красителями или красящими веществами для составов для обработки семян являются Родамин В, С.1. Пигмент красный 112, С.1. Сольвент красный 1, пигмент голубой 15:4, пигмент голубой 15:3, пигмент голубой 15:2, пигмент голубой 15:1, пигмент голубой 80, пигмент желтый 1, пигмент желтый 13, пигмент красный 112, пигмент красный 48:2, пигмент красный 48:1, пигмент красный 57:1, пигмент красный 53:1, пигмент оранжевый 43, пигмент оранжевый 34, пигмент оранжевый 5, пигмент зеленый 36, пигмент зеленый 7, пигмент белый 6, пигмент коричневый 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислый красный 51, кислый красный 52, кислый красный 14, кислый голубой 9, кислый желтый 23, основной красный 10, основной красный 108.

Примером подходящего гелеобразующего агента является караген (8аИаде1®).

Порошки, материалы для распыления и пылевидные продукты могут быть получены путем смешивания или совместного измельчения активных субстанций с твердым носителем.

Гранулы, например покрытые гранулы, пропитанные гранулы и гомогенные гранулы, могут быть получены путем связывания активных веществ с твердыми носителями. Примерами твердых носителей являются минеральные земли, такие как силикагели, силикаты, тальк, каолин, глины, известняк, известь, мел, бол, лесс, доломит, диатомовая земля, кальция сульфат, магния сульфат, магния оксид, земельные синтетические материалы, удобрения, такие как, например, аммония сульфат, аммония фосфат, аммония нитрат, мочевины и продукты из растительных источников, такие как зерновая мука, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители.

В основном, составы содержат от 0,01 до 95 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 90 мас.%, ингибирующего АНА8 гербицида. В этом случае ингибирующие АНА8 гербициды имеют чистоту от 90 до 100 мас.%, предпочтительно от 95 до 100 мас.% (согласно спектру ЯМР). Для целей обработки семян соответствующие составы могут быть разбавлены в 2-10 раз до концентраций в готовом к использованию препарате от 0,01 до 60 мас.% активного вещества, преимущественно от 0,1 до 40 мас.%.

Ингибирующие АНА8 гербициды могут использоваться как таковые в форме их составов или применяются формы, получаемые из них, например в форме непосредственно распыляемых растворов, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, пылевидных продуктов, материалов для орошения или гранул, путем обрызгивания, распыления, опыления, орошения или полива. Использование определенной формы зависит от назначенных целей; они предназначены в каждом случае гарантировать наилучшее возможное вложение ингибирующего АНА8 гербицида по изобретению.

Используемые водные формы могут быть приготовлены из эмульсионных концентратов, паст или влажных порошков (распыляемые порошки, масляные дисперсии) путем добавления воды. Для получения эмульсий, паст или масляных дисперсий субстанции, как таковые или растворенные в масле или растворителе, могут быть гомогенизированы в воде с помощью увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергатора или эмульгатора. Однако также возможно получение концентратов, состоящих из активного вещества, увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергатора или эмульгатора, и, если необходимо, растворителя или масла, и такие концентраты пригодны для разбавления водой.

Концентрация активного соединения в готовых к применению препаратах может варьироваться в относительно широких пределах. В основном, от 0,0001 до 10%, предпочтительно от 0,01 до 1 мас.%.

Ингибирующий АНА8 гербицид может также успешно использоваться в процессе сверхнизкого объема, что делает возможным применение составов, содержащих свыше 95 мас.% активного соедине

- 12 019952 ния, или даже нанесение активного соединения без добавок.

Далее приведены примеры составов:

1. Продукты для разбавления водой для лиственного нанесения. Для обработки семян такие продукты могут наноситься разбавленными или неразбавленными.

A) Водорастворимые концентраты (8Ь, Ь8) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида растворяли в 90 мас.ч. воды или водорастворимого растворителя. Как альтернатива, добавляли увлажнители или другие вспомогательные вещества. Ингибирующий АНА8 гербицид растворяли при разбавлении водой, при этом получали состав с 10% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

B) Дисперсионные концентраты (ИС) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида растворяли в 70 мас.ч. циклогексанона с добавлением 10 мас.ч. диспергатора, например поливинилпирролидона. Разбавление водой дает дисперсию, при этом получают состав с 20% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

C) Эмульсионные концентраты (ЕС) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида растворяли в 7 мас.ч. ксилола с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 мас.ч.). Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают состав с 15% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

И) Эмульсии (Ε\ν. ЕО, Е8) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида растворяли в 35 мас.ч. ксилола с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 мас.ч.). Эту смесь вводили в 30 мас.ч. воды с помощью эмульгирующего устройства (например, иНгаШггах) и переводили в гомогенную эмульсию. Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают состав с 25% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

Е) Суспензии (8С, ОИ, Е8)

В шаровой мельнице измельчали 20 мас.ч ингибирующего АНА8 гербицида с добавлением 10 мас.ч. диспергатора, увлажнителя и 70 мас.ч. воды или органического растворителя с получением хорошей суспензии ингибирующего АНА8 гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию ингибирующего АНА8 гербицида, при этом получают состав с 20% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

Е) Водо-диспергируемые гранулы и водорастворимые гранулы (νθ, 8С) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида смешивали с 50 мас.ч. диспергаторов и увлажнителей и получали вододиспергируемые гранулы или водорастворимые гранулы с помощью технических средств (например, экструдер, скруббер с разбрызгивающим устройством, псевдоожиженный слой). Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор ингибирующего АНА8 гербицида, при этом получают состав с 50% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

О) Вододиспергируемые порошки и водорастворимые порошки (νΡ, 8Р, 88, ν8) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида измельчали в роторно-статорной мельнице с добавлением 25 мас.ч. диспергаторов, увлажнителей и силикагеля. Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор ингибирующего АНА8 гербицида, при этом получают состав с 75% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

I) Гелевые составы (ОЕ)

В шаровой мельнице измельчали 20 мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида с добавлением 10 мас.ч. диспергатора, 1 мас.ч. гелеобазующего агента, увлажнителя и 70 мас.ч. воды или органического растворителя с получением суспензии ингибирующего АНА8 гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию ингибирующего АНА8 гербицида, при этом получают состав с 20% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида. Этот гелевый состав пригоден для обработки семян.

2. Продукты для нанесения неразбавленными при листовой обработке. Для обработки семян такие продукты могут наноситься разбавленными.

A) Пылевидные порошки (ИР, Ό8) мас.ч. ингибирующего АНА8 гербицида измельчали и тщательно смешивали с 95 мас.ч. размельченного каолина. Получали пылевидный продукт, содержащий 5% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида.

B) Гранулы (ОН, ЕО, ОС, МО)

Половину массовой части ингибирующего АНА8 гербицида измельчали и объединяли с 95,5 мас.ч. носителей, при этом получают состав с 0,5% (мас./мас.) ингибирующего АНА8 гербицида. Подходящими способами являются экструзия, сушка распылением и в псевдоожиженном слое. Получают гранулы для применения неразбавленными при листовом нанесении.

Обычные составы для обработки семян включают, например, текучие концентраты Е8, растворы Б8, порошки для сухой обработки Ό8, диспергируемые в воде порошки для суспензионной обработки ν8, водорастворимые порошки 88 и эмульсии Е8 и ЕС и гелевый состав ОЕ. Эти составы можно наносить на семена разбавленными или неразбавленными. Нанесение на семена выполняется перед посевом либо прямо на семена.

- 13 019952

В предпочтительном варианте осуществления для обработки семян используется состав Р8. Обычно, состав Р8 может содержать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л поверхностно-активного вещества, от 0 до 200 г/л антизамерзающего агента, от 0 до 400 г/л связующего, от 0 до 200 г/л пигмента и до 1 л растворителя, предпочтительно воды.

Для обработки семена устойчивых к гербицидам растений по изобретению обрабатывали гербицидами, предпочтительно гербицидами, выбранными из группы, состоящей из ингибирующих ЛНЛ8 гербицидов, таких как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфомурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, иодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, пирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак и их смеси, или составом, содержащим ингибирующий ЛНЛ8 гербицид.

Термин обработка семян содержит все известные из уровня техники подходящие методики обработки семян, такие как обмазка семян, покрытие семян, опыление семян, пропитка семян и дражирование семян.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения еще одним объектом изобретения является способ обработки почвы путем нанесения, в частности, с помощью рядовой сеялки либо гранулированного состава, содержащего ингибирующий ЛНЛ8 гербицид, как композиция/состав (например, гранулированный состав, необязательно с одним или более твердым или жидким сельскохозяйственно приемлемым носителем и/или необязательно с одним или более сельскохозяйственно приемлемым поверхностно-активным веществом. Этот способ преимущественно применим, например, в грядах зерновых, маиса, хлопка и подсолнечника.

Настоящее изобретение также включает семена с покрытием или семена, удерживающие состав, содержащий по меньшей мере один ингибирующий ЛНЛ8 гербицид, выбранный из группы, включающей амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфомурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, иодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, пирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид и пиритиобак.

Термин семя охватывает семена и отростки растений во всех случаях включая, но не ограничиваясь ими, сами семена, части семян, корневые побеги, клубнелуковицы, луковицы, фрукты, клубни, зерна, черенки, отрезанные побеги и т.п., и означает в предпочтительном варианте сами семена.

Термин с покрытием и/или удерживающие в основном означает, что активный ингредиент находится большей частью на поверхности продукта размножения во время нанесения, хотя большая или меньшая часть ингредиента может проникать в продукт размножения в зависимости от способа нанесения. Когда указанные продукты размножения вырастают в растения, они могут абсорбировать активный ингредиент. Обработка семян нанесением ингибирующего ЛНЛ8 гербицида или состава, содержащего ингибирующий ЛНЛ8 гербицид, выполняется путем разбрызгивания или опыления семян перед посадкой растения и перед всходами растений.

При обработке семян соответствующие составы применяются путем обработки семян эффективным количеством ингибирующего ЛНЛ8 гербицида или состава, содержащего ингибирующий ЛНЛ8 гербицид. Дозы нанесения в основном составляют от 0,1 г до 10 кг а.и. (активного ингредиента) (или смеси а.и. или состава) на 100 кг семян, предпочтительно от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности от 1 г до 2,5 кг на 100 кг семян. Для специфических сельскохозяйственных культур, таких как салат-латук, доза может быть выше.

Настоящее изобретение предлагает способ борьбы с нежелательной растительностью или контроля сорняков, включающий контактирование семян устойчивых растений по изобретению перед посадкой и/или после всходов с ингибирующим ЛНЛ8 гербицидом. Способ далее включает посадку семян, например, в почву на поле или в горшечную землю в теплице. Способ находит, в частности, применение при борьбе с нежелательной растительностью или контроле сорняков в непосредственной близости от семян.

Под контролем нежелательной растительности понимают уничтожение сорняков и/или другое препятствие или ингибирование нормального роста сорняков. Под сорняками, в широком смысле, понимают все те растения, которые растут в месте, где они нежелательны.

Сорняки по настоящему изобретению включают, например, двудольные и односемядольные сорняки. Двудольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки рода: 8тар18, Ьерйшт, Сайит.

- 14 019952

Б1е11апа. Ма1псапа. Ληΐΐιοιηίδ. Сайпкода. СНепоройшт. Игйса, Бепесю, АтагапФик, Ройи1аса, ХайЫит, Сопуо1уи1ик, 1ротоеа, Ро1удопит, БекЬаща, АтЬгоыа, Сагкшт. Сагйиик, БопсНик. Бо1агшт, Еопрра. Ро1а1а. Ыпйегша. Ьатщт, Уегошса, АЬиШои, Етех, Эа1ига. Ую1а, Са1еорк1к. Рарауег, СеШаигеа. Тп£о1шт, Яапипси1ик и Тагахасит. Односемядольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки рода: ЕсЫпосЫоа, Бе1апа. Ратсит, ЭщНапа. РЫеит, Роа, ЕекШса. Е1еикте, ВгасЫала, Ьо1шт, Вготик, Ауепа, Сурегик, БогдНит. Адгоругоп, Супойоп, МопосНопа. НтЬпкКкйк. БадШапа. Е1еос11апк. Бсйрик. Ракра1ит, ЕсНаетит. БрНепос1еа. Эас1у1ос1епц|т. Адгокйк, А^ресших, и Арега. Другие двудольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, паразитические растения, которые поражают подсолнечники, в частности ОгоЬапсНе крр. (Ьгоотгаре), такие как, например, ОгоЬапсНе ситапа и ОгоЬапсНе сегпиа.

Кроме того, сорняки по настоящему изобретению включают, например, сельскохозяйственные растения, которые произрастают в нежелательном месте. Например, самосевное растение маиса, находящееся в поле, на котором преобладающим является растение сои, может рассматриваться как сорняк, если растение маиса является нежелательным в поле с растениями сои.

Растения подсолнечника по изобретению могут быть трансформированы с одним или более интересующими генами. Интересующие гены по изобретению сильно зависят от желаемого результата. Например, могут быть интересны различные изменения в фенотипе, включая модификацию состава жирных кислот в растении, изменение содержания аминокислот в растении, изменение растительных насекомых и/или патогенных защитных механизмов и т.п. Эти результаты могут быть достигнуты путем обеспечения экспрессии гетерологичных продуктов или увеличенной экспрессии эндогенных продуктов в растении. Альтернативно, результаты могут быть достигнуты путем обеспечения восстановления экспрессии одного или более эндогенных продуктов, в частности ферментов или кофакторов в растении. Это изменение дают в результате изменение в генотипе трансформированного растения.

В одном из вариантов осуществления изобретения интересующие гены включают устойчивые к насекомым гены, такие как, например, гены белка токсина ВасШик 11шппд1епк1к (Патенты США № 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; и Ое1кег е1 а1. (1986) Оепе 48:109).

Настоящее изобретение предлагает диагностические способы для идентификации аллелей гена АНАБЫ в отдельном подсолнечнике. Такие диагностические способы, которые описаны ниже, находят применение в способах воспроизводства коммерческих культур подсолнечника с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. Используемые при описании этих способов термины определены ниже.

Праймер - одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий 5' конец и 3' конец, который способен к отжигу сайта отжига на целевой цепи ДНК, и праймер служит в качестве точки инициации синтеза ДНК с помощью ДНК полимеразы, в частности в полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификаций. Такой праймер может быть или не быть полностью комплементарным сайту отжига на целевой ДНК.

Сайт отжига на цепи целевой ДНК - это сайт, в котором праймер способен к отжигу в способах по настоящему изобретению.

В основном для амплификаций фрагмента гена с помощью ПЦР используется пара праймеров, которая отжигает обратные цепи двухцепочечной молекулы ДНК. Общепринято и используется здесь, пока другое не указано или не следует из контекста, что прямой праймер отжигает не кодирующую цепь гена и обратный праймер отжигает кодирующую цепь.

Далее определены термины мутантный аллель, мутантный аллель АНАБЫ или аллель мутантного гена АЛАБЫ. Пока другое не указано или не следует из контекста, эти термины относятся к полинуклеотиду, который кодирует толерантный к имидазолинону белок АНАБЫ, содержащий единичное аминокислотное замещение по сравнению с белком АНАБЫ дикого типа. Такое единичное аминокислотное замещение включает, например, А122Т, А205У и Р197Ь. Обычно такое единичное аминокислотное замещение является результатом единичного нуклеотидного замещения в последовательности, кодирующей АНАБЫ.

Наоборот, пока не указано другое, термины аллель дикого типа, аллель АНАБЫ дикого типа или аллель гена АНАБЫ дикого типа относятся к полинуклеотиду, который кодирует белок АНАБЫ.

Изобретение включает применение праймеров для ПЦР амплификаций. Эти праймеры подробно описаны ниже.

Прямой праймер АНАБЫ - это праймер, который может быть использован в способах по изобретению, включающих ПЦР амплификацию фрагмента аллеля АНАБЫ подсолнечника, где фрагмент распространяется в 5' направлении из места мутации, что дает начало А122Т аминокислотному замещению. Предпочтительно, комплемент места отжига прямого праймера АНАБЫ находится на 5' стороне (АСС)_п повтора, который показан на фиг. 8.

Обратный праймер АНАБЫ дикого типа представляет собой обратный праймер, который может быть использован в способах, включающих ПЦР амплификацию фрагмента аллеля АНАБЫ, который не содержит мутаций, что дает начало А122Т аминокислотному замещению. Место отжига обратного праймера показано на фиг. 8. 3' терминальный (или 3' концевой) нуклеотид обратного праймера АНАБЫ дикого типа отжигает О, который означает место БNР в Нар1-Нар5 на фиг. 8. 3' терминальный нуклеотид обратного праймера АНАБЫ является С.

- 15 019952

Обратный мутантный праймер АНА8Ь1 представляет собой обратный праймер, который может быть использован в способах, включающих ПЦР амплификацию фрагмента мутантного аллеля АНА8Ь1, содержащего мутацию, что дает начало А122Т аминокислотному замещению. Место отжига обратного праймера показано на фиг. 8. 3' терминальный (или 3' концевой) нуклеотид обратного мутантного праймера АНА8Ь1 отжигает А в Нар6, который означает место 8ΝΡ на фиг. 8. 3' терминальный нуклеотид обратного праймера АНА8Ь1 дикого типа является Т.

Настоящее изобретение представляет способы определения генотипа АНА8Ь1 подсолнечника. Способ включает выделение геномной ДНК из растения подсолнечника и использование геномной ДНК, или образца, или части ее в качестве матрицы для ПЦР амплификаций, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, прямой праймер АНА8Ь1 и обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа. Обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш N0: 13, где нуклеотид, который является 3' концевым нуклеотидом указанного обратного праймера АНА8Ь1 дикого типа, является комплементом нуклеотида, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 Ш N0: 13. Далее способ включает использование геномной ДНК, или образца, или части ее в качестве матрицы для второй ПЦР амплификации, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, указанный прямой праймер АНА8Ь1 и мутантный обратный праймер АНА8Ь1. Обратный мутантный праймер АНА8Ь1 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш N0: 14, где нуклеотид, который является 3' концевым нуклеотидом указанного обратного мутантного праймера АНА8Ь1, является комплементом нуклеотида, который находится в положении 1 нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 Ш N0: 14. Далее способ включает определение продуктов указанных первой и второй амплификаций.

Обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа и обратный мутантный праймер АНА8Ь1 по изобретению отжигают нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш N0: 13 и 14 соответственно, при условиях, подходящих для ПЦР амплификаций части генов АНА8Ь1 или подсолнечника, показанных на фиг. 8. Обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа и обратный мутантный праймер АНА8Ь1 дополнительно имеют 3' концевой нуклеотид, который состоит из нуклеотида, который находится в месте мутации, которая дает начало А122Т аминокислотному замещению. Каждый из обратных праймеров, может быть, но не обязательно, полностью комплементарным его сайту отжига и не должен превышать полную длину сайта отжига. Кроме того, обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа и обратный мутантный праймер АНА8Ь1 могут содержать дополнительные нуклеотиды на их 5' конце, удаленном от сайта отжига. Такие дополнительные нуклеотиды могут быть, но не обязательно, полностью или даже частично комплементарными части гена АНА8Ь1 подсолнечника. Дополнительный 5' нуклеотид может включать, например, последовательности узнавания фермента рестрикции. В одном из вариантов осуществления обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа и обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа содержат нуклеотидные последовательности, представленные в виде 8Е0 Ш N0: 4 и 8Е0 Ш N0: 5 соответственно.

Способы определения генотипа АНА8Н подсолнечника включают использование прямого праймера АНА8Ь1. В отличие от обратного праймера АНА8Ь1 дикого типа и обратного мутантного праймера АНА8Ь1, которые отжигают в месте мутации, которая дает начало А122Т аминокислотному замещению, сайт отжига нуклеотида прямого праймера АНА8Ь1 соответствует области гена АНА8Ь1 подсолнечника, которая представляет собой 5' область (АСС)_П, показанную на фиг. 8, так что гаплотипы 1-6 можно различать по длине (т.е. пар оснований п.о.) результирующих продуктов ПЦР. Последовательности этих гаплотипов вблизи мест А122Т мутации показаны на фиг. 8. В одном из вариантов осуществления изобретения прямой праймер АНА8Ь1 отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую комплемент нуклеотидной последовательности, представленной в виде 8Е0 Ш N0: 12. В предпочтительном варианте осуществления изобретения прямой праймер АНА8Ь1 содержит нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш N0: 3, и в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения прямой праймер АНА8Ь1 содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш N0: 3 с необязательными дополнительными нуклеотидами на 5' конце праймера. Такие дополнительные нуклеотиды могут быть, но не обязательно, полностью или даже частично комплементарными части гена АНА8Ь1 подсолнечника. Дополнительные 5' нуклеотиды могут включать, например, последовательности узнавания фермента рестрикции.

Настоящее изобретение далее представляет способ идентификации аллелей АНА8Ь1 в растении подсолнечника. Способ включает выделение геномной ДНК из растения подсолнечника и использование геномной ДНК, или образца, или части ее по меньшей мере в одной ПЦР амплификации. ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, первый прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш N0: 15, первый обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде

- 16 019952

ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 16, второй прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 17, и второй обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 18. Далее способ включает детектирование продуктов указанных первой и второй амплификаций.

Альтернативно, две или даже три раздельные ПЦР амплификации могут быть использованы в способах по изобретению. Когда используются две раздельные амплификации, первая ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для первой амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, первый прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 15, и первый обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 16. Вторая ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для второй амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, второй прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 17, и второй обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 18. Первая ПЦР амплификация может, необязательно, содержать третий праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 18, вторая ПЦР амплификация может, необязательно, содержать третий праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 15. Добавление такого необязательного праймера в одну или в обе, первую и вторую, ПЦР амплификации дает возможность получения продукта контроля связи, который амплифицируется с помощью пары праймеров, содержащей нуклеотидные последовательности, представленные в виде ЗЕр ΙΌ NΟЗ: 15 и 18. Далее способ включает детектирование продуктов указанных первой и второй ПЦР амплификаций.

Когда используются три отдельных ПЦР амплификации, первая и вторая ПЦР амплификации являются такими же, как описанные выше. Третья ПЦР амплификация включает использование геномной ДНК в качестве матрицы для третьей амплификации полимеразной цепной реакцией, содержащей геномную ДНК, полимеразу, деоксирибонуклеотида трифосфаты, первый прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 15, и второй обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в виде ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 18. Далее способ включает детектирование продуктов указанных первой, второй и третьей ПЦР амплификаций.

В одном из вариантов осуществления изобретения первый прямой праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую, по существу, из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 15, первый обратный праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую, по существу, из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 16, второй прямой имеет нуклеотидную последовательность, состоящую, по существу, из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 17, и/или второй обратный имеет нуклеотидную последовательность, состоящую, по существу, из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 18. Для настоящего изобретения праймер, состоящий, по существу, из указанной последовательности, означает, что праймер состоит из полной указанной последовательности, но может дополнительно включать нуклеотиды на 5' конце праймера. Такие дополнительные нуклеотиды могут быть, но не обязательно, полностью или частично комплементарными целевому гену для амплификаций. Поскольку синтез ДНК инициируется с 3' конца праймера, такие дополнительные нуклеотиды не заменяют стартовый сайт для синтеза ДНК, если сравнивать с праймером, который является идентичным, за исключением дополнительных нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения первый прямой праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 15, первый обратный праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 16, второй прямой праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 17, и/или второй обратный праймер имеет нуклеотидную последовательность, состоящую из ЗЕр ΙΌ ΝΟ: 18.

Пока не указано другое, полимераза относится к ДНК полимеразе, в частности ДНК полимеразе, которая пригодна для использования в одной или более ПЦР амплификации по настоящему изобретению.

В способах по изобретению, результаты ПЦР амплификаций могут быть детектированы, например, с помощью электрофореза в агарозном геле продуктов ПЦР, последующим этидиум-бромидным окрашиванием ДНК в геле и визуализацией в присутствии УФ-света.

Способы по изобретению включают использование ПЦР для амплификации ДНК. Могут быть разработаны олигонуклеотидные праймеры для применения в ПЦР реакциях, чтобы амплифицировать соответствующие последовательности ДНК из геномной ДНК или кДНК, экстрагированных из любых интересующих организмов. Способы разработки ПЦР праймеров хорошо известны из уровня техники и раскрыты в ЗатЬгоок с1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1оптд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1 (2й ей., Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Р1а1пу1ете, №\ν Уогк); включенных здесь в виде ссылки. См. также Ιπηίκ е1 а1., ейк. (1990) РСК Рго1осо1к: А Ршйе Ю МеПюйк апй АррИсаНопк (Асайетк Ргекк, №\ν Уогк); Ιηηίκ апй Се1Гапй, ейк. (1995) РСК З1га1ед1ек (Асайетк Ргекк, №\ν Уогк); !пп1к апй Се1Гапй, ейк. (1999) РСК Ме11юйк Мапиа1 (Асайетк Ргекк, №\ν Уогк); Ок1такг е1 а1., ейк. (2002) Кар1й Сус1е Кеа1 Т1те РСК - Ме11юйк апй АррИсайопк, (Зргшдег Уег1ад, №\ν Уогк); Тйеорййик апй КарЫеу, ейк. (2002) РСК Ми1айоп Эе1ес11оп Рго1осо1к (Нитапа

- 17 019952

Ргезз, Ыете Уогк); апб Ватбей апб 8бг11пд, ебб. (2003) РСК Рго1осо18 (Нитапа Ргезз, Ыете Уогк), все из которых включены здесь с помощью ссылки. Другие известные способы ПЦР, которые также могут быть использованы в способах по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, способы, использующие парные праймеры, вложенные праймеры, единичные специфические праймеры, дегенеративные праймеры, ген-специфические праймеры, смешанные ДНК/РНК праймеры, вектор-специфические праймеры, частично-несопряженные праймеры и т.п.

Использование термина праймер или ПЦР праймер не означает ограничение настоящего изобретения до праймеров, содержащих ДНК. Среднему специалисту в данной области должно быть понятно, что такие праймеры могут быть составлены, например, из деоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов, и их комбинаций. Такие деоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды включают встречающиеся в природе молекулы и синтетические аналоги.

Хотя изобретение не зависит от числа нуклеотидов в ПЦР праймерах, предполагается, что часть ПЦР праймера, который отжигает комплементарную ему цель на матрице ДНК, будет в основном составлять от 10 до 50 смежных нуклеотидов, предпочтительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более смежных нуклеотидов. Однако ПЦР праймер по изобретению может далее содержать на его 5' конце дополнительные нуклеотиды, которые не проводят отжига цели, такой как последовательность ДНК, содержащая один или более сайтов узнавания фермента рестрикции.

Способы по изобретению включают применение ДНК полимераз для ПЦР амплификаций ДНК. Любая ДНК полимераза, известная из уровня техники, которая способна к амплификаций целевой ДНК с помощью ПЦР, может быть использована в способах по изобретению. Способы по изобретению не зависят от частной ДНК полимеразы для ПЦР амплификаций ДНК, только от таких полимераз, которые способны к амплификаций одного или более генов АНАЗк растений или их фрагментов. Предпочтительно, ДНК полимеразы по изобретению являются термоустойчивыми ДНК полимеразами, включая, но не ограничиваясь ими: Тад полимеразы; Р£и полимеразы; термоустойчивые ДНК полимеразы из Тйеттососсиб догдопапоиб, которые также известны как Тдо ДНК полимеразы; термоустойчивые ДНК полимеразы из Тйеттососсиб 1йота118 такие как, например, которые также известны как Уеп1® ДНК полимеразы (Рег1ег, Р. е1 а1. (1992) Ргос. Ыа11. Асаб. Зск ИЗА 89, 5577), термоустойчивые ДНК полимеразы из Рутососсиз зрес1ев СВ-Ό такие как, например, которые также известны как Эеер Уеп1® ДНК полимеразы (Хи, М. е1 а1. (1993) Се11 75, 1371-1377); и модифицированные версии и их смеси.

Способы по настоящему изобретению включают амплификацию последовательности целевой ДНК с помощью ПЦР. В отдельных вариантах осуществления изобретения последовательность целевой ДНК амплифицируют прямо из образца, содержащего геномную ДНК, выделенную по меньшей мере из одного растения или его части, органа, ткани или клетки. Среднему специалисту в данной области техники должно быть ясно, что количество или концентрация геномной ДНК будет зависеть от разного числа факторов, включающих, но не ограничиваясь ими, условия ПЦР (например, температура отжига, температура денатурации, число циклов, концентрации праймеров, концентрации бЫТР и т.п.), термоустойчивая ДНК полимераза, последовательность праймеров и последовательность цели. Обычно в описанных здесь вариантах осуществления изобретения концентрация геномной ДНК составляет по меньшей мере от около 5 до около 100 нг/мкл.

В дополнение к ПЦР амплификации способы по изобретению могут включать различные методы молекулярной биологии, включая, например, выделение ДНК, в частности выделение геномной ДНК, разрушение ДНК или продуктов ПЦР путем рестрикции ферментами и нуклеазами, лигирование ДНК, секвенирование ДНК, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в полиакриламидном геле, гельэлектрофорез в любых других матрицах, пригодных для электрофоретического разделения ДНК, детектирование ДНК с помощью окрашивания бромистым этидием и т.п.. Такие методы хорошо известны из уровня техники и раскрыты, например, в ЗатЬгоок е1 а1. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаТоту Мапиа1 (2б еб., Со1б Зрг1пд НагЬог ЬаЬогаТоту Ргезз, Р1ашу1ете, Ыете Уогк).

Способы по изобретению включают использование геномной ДНК, выделенной из растения. Способы по изобретению не зависят от геномной ДНК, выделенной каким-либо частным способом. Любой известный из уровня техники способ выделения из растения или очистки геномной ДНК, которая может быть использована как источник матричной ДНК для ПЦР амплификации, описанной выше, может применяться в способах по изобретению. См., например, З1ет е1 а1. ((2001) Р1ап! Втеебшд, 12:354-356); С1агк, еб. ((1997) Р1ап! Мо1еси1аг В1о1оду - А ЬаЬогаТоту Мапиа1, Зрппдег-Уебад, Ыете Уогк, рр. 3-15); МШет е1 а1., ((1988) Ыис1е1с Аабз Кезеатсй, 16:1215); все из которых включены здесь с помощью ссылки. Предпочтительно, такие способы выделения растительной геномной ДНК пригодны или могут быть адаптированы средним специалистом в данной области для выделения геномной ДНК из относительно большого ряда образцов тканей растений.

В одном из вариантов осуществления изобретения геномную ДНК выделяли из растения подсолнечника с использованием ОЫеабу® набора в соответствии с инструкциями производителя (С|адеп 1пс., Уа1епс1а, СА, ИЗА). В другом варианте осуществления изобретения геномную ДНК выделяли из растения подсолнечника с использованием МадпеЗб® набора в соответствии с инструкциями производителя

- 18 019952 (Рготеда Согр., Майкоп, ЭД1, и8А).

Для способов по настоящему изобретению геномная ДНК может быть выделена из целого растения или любой его части, ткани или клетки. Например, геномная ДНК может быть выделена из сеянцев, листьев, стеблей, корней, соцветий, семян, зародышей, побегов, колеоптилей, пыльников, рылец, культивируемых клеток и т.п. Кроме того, изобретение не зависит от выделения геномной ДНК из растений или их частей, органов, тканей или клеток, которые находятся на любой стадии развития. Способы могут использовать геномную ДНК, которая выделена, например, из сеянца или зрелого растения или любой их части, органа, ткани или клетки. Кроме того, изобретение не зависит от растения, которое выращено при каких-либо особых условиях. Растения могут быть выращены, например, в полевых условиях, в теплице или ростовой камере, в культуре или даже на гидропонике в теплице или ростовой камере. Обычно растения выращивают при условиях, когда свет, температура, питательные вещества и влажность благоприятны для роста и развития растений.

Способы по изобретению включают детектирование продуктов ПЦР амплификации. Обычно ПЦР продукты детектируют путем первого разделения продуктов в субстрате по молекулярной массе и затем детектируют каждый из отделенных ПЦР продуктов в субстрате. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ПЦР продукты детектировали с помощью электрофореза в агарозном геле ПЦР продуктов с последующим окрашиванием бромистым этидием ДНК в геле и визуализацией в геле путем флуоресценции в присутствии УФ-света. Однако любые методы детектирования, пригодные для разделяемых полинуклеотидов, могут быть использованы для детектирования ПЦР продуктов по изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, гель-электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию, капиллярный электрофорез и т.п. Субстраты для таких методов включают, например, агарозу, полиакриламид, диэтиламиноэтилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозу, сефарозу, полиоксиэтилен и т.п. ПЦР амплификации по изобретению могут включать использование одного или более праймеров, которые помечены, например, радиоактивно или флуоресцентным красителем, люминесцентной меткой, парамагнитной меткой или любой другой меткой, пригодной для детектирования нуклеиновых кислот. Когда ПЦР амплификации включают использование одного или более таких меченых праймеров, этап детектирования может включать детектирование радиоактивной, флуоресцентной, люминесцентной, парамагнитной или другой метки любым известным из уровня техники способом, пригодным для обнаружения такой метки.

Настоящее изобретение также предлагает наборы для выполнения описанных выше способов определения генотипов АНА8Ь1 подсолнечника. Такие наборы включают праймеры по настоящему изобретению, в частности прямой праймер АНА8Ь1, обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа и обратный мутантный праймер АНА8Ь1, как описанные выше. Предпочтительно, прямой праймер АНА8Ь1 содержит нуклеотидную последовательность, которая соответствует области гена АНА8Ь1 подсолнечника, которая является 5' участка (АСС)_п, показанного на фиг. 8, обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 13, и обратный мутантный праймер АНА8Ь1 отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 14. Более предпочтительно, прямой праймер АНА8Ь1 содержит нуклеотидную последовательность, которая соответствует области гена АНА8Ь1 подсолнечника, которая является 5' участка (АСС)_п, показанного на фиг. 8, обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 13, и обратный мутантный праймер АНА8Ь1 отжигает нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 14. Более предпочтительно, прямой праймер АНА8Ь1, обратный праймер АНА8Ь1 дикого типа, и обратный мутантный праймер АНА8Ь1 содержат молекулы нуклеотида, имеющие нуклеотидные последовательности, представленные в виде 8Е0 Ш NΟ: 3, 8Е0 Ш NΟ: 4, и 8Е0 Ш NΟ: 5 соответственно. Наборы по изобретению необязательно могут содержать одну или более следующих составляющих: полимераза, деоксирибонуклеотида трифосфаты, и инструкции по выполнению способа.

Настоящее изобретение также предлагает наборы для выполнения способов идентификации аллелей АНА8Ь1 в растениях подсолнечника. Такие наборы содержат праймеры по настоящему изобретению, в частности первый прямой праймер, первый обратный праймер, второй прямой праймер и второй обратный праймер, как описанные выше. Первый прямой праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 15, первый обратный праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 16, второй прямой праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 17, и второй обратный праймер содержит нуклеотидную последовательность, представленную в виде 8Е0 Ш NΟ: 18. Наборы необязательно могут содержать одну или более следующих составляющих: полимераза, деоксирибонуклеотида трифосфаты, и инструкции по выполнению способа.

Кроме того, изобретение представляет праймеры, используемые в способах, включающих описанную выше ПЦР амплификацию. Такие праймеры содержат нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде 8Е0 Ш NΟ: 3,

- 19 019952

4, 5, 15, 16, 17 и 18.

Под используемым здесь словом содержит или вариациями, такими как содержат или содержащий, следует понимать заключает в себе добавления определенных элементов, целых чисел или этапов или группы элементов, целых чисел или этапов, но не исключение любого другого элемента, целого числа или этапа или группы элементов, целых чисел или этапов.

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, но не с целью ограничения.

Пример 1. Фенотипические взаимодействия устойчивых к имидазолинону мутаций в АНА8Ь1 подсолнечника.

СМ40 и СМ1606 представляют собой полученные мутацией линии подсолнечника, которые показывают высокие уровни толерантности к имидазолинонам вследствие точечной мутации в кодоне 122 (АгаЬИор818 Файапа номенклатура) АНА8Ь1 (\У0 2007005581 и предварительная патентная заявка США № 60/695,952; поданная 1 июля 2005). Было показано, что А122Т мутация и выведенные гомозиготные линии и гибриды с такими мутациями показывают лучшую толерантность к имазамоксу, чем уже известные, коммерчески применяемые, гомозиготные подсолнечники С1еагПе1й с А205У мутацией при АНА8Ь1 (\У0 2007005581). Оба мутанта показывают недостаточное доминирование над чувствительным аллелем дикого типа, чему имеется много других примеров в литературе. Настоящее изобретение основано на открытии, что А122Т придает почти полное преобладание по устойчивости к имидазолинонам над А205У при применении гербицида в интервале от 0,5х до 6х коммерческих доз. Настоящее изобретение предлагает гетерозиготные А122Т/А205У растения подсолнечника, которые проявляют такой же уровень толерантности и характер ответа на увеличенные дозы имидазолинонов, как и гомозиготные А122Т растения подсолнечника. Таким образом, более высокий уровень толерантности к имидазолинонам может быть получен путем аллельного замещения А205У на А122Т только в одной родительской линии подсолнечника С1еагПе1й. которая в свою очередь позволяет более быстрое развертывание этого нового аллеля в культуре подсолнечника.

Для определения фенотипических взаимодействий резистентного гена А122Т и гена 1тг1 (А205У), уже описанного в 1М1-В подсолнечниках (НА425), Е1, Е2 и ВС1Е1 популяции из гибрида СМ40 (А122Т)/НА425 (А205У) были оценены при двух дозах внесения гербицида (80 и 320 г а.и. га^-1 имазапира). Не чувствительные растения наблюдались в Е2 и ВС1Е1 популяциях, полученных из этого гибрида, когда потомство оценивалось при меньшей дозе гербицида, показывая, что резистентные гены в СМ40 и НА425 являются аллелями одного и того же локуса и что оба показывают одинаковый уровень устойчивости к имидазолинону при 1х дозе нанесения гербицида. Когда Е2 и ВС1Е1 популяции обсчитали при большей дозе гербицида (320 г а.и. га^-1), которая дискриминирует обоих родителей, наблюдалась сегрегация чувствительности. Были определены только два фенотипических класса, резистентный (устойчивый) класс с растениями без каких-либо повреждений или со слабыми симптомами и чувствительный фенотип, который был уничтожен подобно контрольной линии НА425. Наблюдаемые сегрегационные отношения свыше 450 исследованных Е2 растений несущественно отличались от сегрегационного соотношения 3:1. Для подтверждения этих результатов Е1 растения были подвергнуты возвратному скрещиванию с НА425 и полученные в результате ВС 1Е растения были исследованы при дозе имазапира 320 г а.и. га^-1. Наблюдаемые сегрегационные отношения дали хороший подбор 1:1 В:8 отношение, подтверждающее, что резистентный ген в СМ40 показывает полное доминирование над резистентным геном НА425 и что оба являются аллелями с одним и тем же локусом, АНА8Ь1.

Для дальнейшего подтверждения этих результатов был использован принцип молекулярных маркеров. Ген АНА8Ь1 присутствует в полиморфизме простого повтора последовательности (88В), который дискриминирует линии, переносящие 1тг1 аллель из любого другого генотипа подсолнечника (Ко1ктаи е1 а1. (2004) Тйеог. Арр1. Сепек 109: 1147-1159). ПЦР амплификация фрагмента гена АНА8Ь1, содержащего этот 88В, с использованием праймеров р-АНА818 и р-АНА819 дала продукт длиной 321 п.о. (пар оснований) для СМ40 и ВТК47 (исходная линия мутагенеза) и фрагмент длиной 312 п.о. для НА425. Полиморфизм такой длины, обнаруженный в СМ40 и НА425, использовали для исследования сегрегации в Е2 и ВС1Е1 популяциях, полученных скрещиванием обеих линий. Восемьдесят растений из Е2 популяции и 50 растений из ВС1Е1 популяции были отобраны путем случайной выборки для выделения ДНК, повреждены нанесением имазапира в дозе 320 г а.и. га^-1 и подвергнуты определению генотипа с использованием этого маркера. В Е2 популяции 22 растения были убиты гербицидом (8) и 58 не показали симптомов поражения или проявили слабое поражение (В). Наблюдаемое сегрегационное отношение для резистентности не существенно отличалось (Р<0,61) от установленного сегрегационного отношения для полностью доминантного фактора сегрегации в Е2 (3В:18). Наблюдаемая сегрегация для АНА8Ь1 88В маркера (19 А/А: 39 А/В: 22 В/В) соответствует ожидаемому сегрегационному отношению для кодоминантного маркера, отобранного в Е2 (1:2:1, Р<0.87). Все чувствительные растения, генотипированные для АНА8Ь1 88В были гомозиготными для НА425 гаплотипа (В/В), когда В-растения были либо гетерозиготными (А/В), либо гомозиготными для СМ40 гаплотипа (А/А) (табл. 4, фиг. 1). Далее была осуществлена косегрегация устойчивых к гербицидам фенотипов и гаплотипов АНА8Ь1 на 50 ВС1Е1 потомках, отобранных по устойчивости. Наблюдаемые сегрегационные отношения по устойчивости соответствовали отношению 1:1 (Р<0,78), ожидаемому для сегрегации в одном локусе ВС1. АНА8Ь1 88В гаплотипы

- 20 019952 полностью косегрегировали с фенотипами по реакции к гербициду, 23 А/В: 27 В/В. Чувствительные потомки были гомозиготными для НА425 гаплотипа (В/В), в то время как устойчивые потомки были гетерозиготными для НА425 и ОМ40 гаплотипов (А/В).

Эти результаты подтверждают, что резистентный ген в ОМ40 отличается от резистентного гена в НА425, что оба являются аллельными вариантами локуса АНА8Ь1 и, наконец, что ген, присутствующий в ОМ40, является полностью доминантным над 1тг1 аллелем.

Пример 2. Ответ гомозиготных А122Т/А122Т и А205У/А205У и гетерозиготного А122Т/А205У на имазапир на уровне целого растения.

Этот эксперимент был проведен, чтобы определить количественно и сравнить чувствительность к имазапиру гибридов подсолнечника, несущих А122Т и А205У мутации в гомозиготных (А122Т/А122Т или А205У/ А205У) и гетерозиготных (А122Т/А205У) состояниях в различных генетических средах и на уровне целого растения.

Материалы

В полевых условиях были получены семена различных видов подсолнечника (табл. 1).

Таблица 1. Используемые материалы подсолнечника, их генеалогия и тип мутации

Код	Генеалогия	Линия (Ь) или гибрид (Н)	Мутация(и)
Ы		Ь	А205У
Ь2		ь	А205У
Н1	Ы хЬ2	н	А205У
ЬЗ	СШ8СМ40	ь	А122Т
Ь4		ь	А122Т
Н2	ЬЗх Ь4	н	А122Т
Ь5	ВТК 47	ь	чувствительный
НЗ	ЬЗ х Г2	н	А205У + А122Т
Н4	Ы хЬ4	н	А205У + А122Т

Линии Ь1 и Ь2 являются линиями с мужской стерильностью и восстановленным размножением соответственно, которые несут А205У аллель в гомозиготных условиях. Ь5, ВТК 47, являются поддерживающими линиями, которые были использованы в качестве исходного материала для разработки линии ОМ40. ОМ40 является первоначальной линией, которая несет А122Т мутацию в гомозиготном состоянии (АТСС патентный депозитарный номер РТА-6716; см. νΟ 2007005581). Ь4 является реставрирующей линией ВС2Е4, полученной из скрещивания Н701*3/ОМ40, с использованием маркера, способствующего обратному скрещиванию, для отбора растений самых похожих с родительской формой, с которой гибрид скрещивается вновь, в каждой генерации обратного скрещивания. Н701 является подходящей реставрирующей линией с хорошей объединяющей способностью. После двух генераций обратного скрещивания были выделены наиболее похожие растения с Н701 и их потомство было отобрано по устойчивости к имазапиру. Гомозиготные А122Т растения были отобраны среди резистентного потомства с использованием молекулярной маркерной диагностики А122Т мутации, которая описана выше. СМ8 ОМ40 является мужской стерильной версией ОМ40, которую получили из ВС1Е1 генерации из скрещивания сткВТК47/*2 ОМ40, с использованием того же самого диагностического маркера для различения гомо- и гетерозиготных растений для А122Т аллеля.

Методы

Диагностический маркер для А122Т мутации

Аллельспецифический ПЦР анализ описан для высокопроизводительного определения генотипа растений подсолнечника, несущих А122Т мутацию в АНА8Ь1. Анализ позволяет: (1) определить индивидуумы, которые несут мутацию; (2) определить зиготность этих индивидуумов; (3) различить резистентные растения, которые несут эту мутацию, среди растений, которые содержат А205У мутацию.

ПЦР праймеры были взяты из предлагаемых Ко1ктап с1 а1. ((2004) Тйеот. Арр1. Оепе1. 109: 11471159) для амплификаций фрагмента последовательности АНА8Ь1 подсолнечника, которая включает А122Т мутацию и полиморфизм инсерция-делеция (ГНОЕЬ) и которая может быть использована для отличения последовательности А122Т мутации от последовательности уже известной мутации А205У.

Названия и последовательности этих праймеров следующие:

р-АНА818 5'-11сс1ссссс|гШс<гса11ас-3' (8Еф ГО N0:1) р-АНА819 5 '-сйсс£ссс1и1гсциас“3' (ЗЕГ) ГО N0:2)

Реакционная смесь имела следующий состав: 1 и Тад ДНК полимеразы, 70 нг геномной ДНК подсолнечника, 25 мкг В8А, и имела конечную концентрацию 100 мкМ каждого άΝΊΡ (дезоксинуклеозидтрифосфат), 0.25 мкМ каждого праймера, 90мМ Тп5-НС1 рН8, 20 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄ и 2.5мМ МдС1₂. ПЦР программа состоит из начального этапа денатурации при 94°С в течение 2 мин, последующих 40 циклов

- 21 019952 по 30 с при 94°С, 30 с при 56°С и 30 с при 72°С, с последующим удлинением конечной стадии при 72°С до 10 мин.

Предсказанный размер фрагмента ВТК47 (или СМ40), использующего вышеуказанные праймеры, составляет 321 п.о. и предсказанный размер фрагмента, основанного на СепВапк Ассеззюп №. АУ541455 для гаплотипа подсолнечника, который несет А205У мутацию, составляет 312 п.о. На фиг. 4 показано, что описанная ПЦР реакция позволяет дискриминировать оба мутанта А122Т и А205У на основании наличия ΙΝΏΕΕ полиморфизма между их последовательностями.

Амплифицированные продукты были подвергнуты рестрикции и полученные в результате фрагменты были растворены в агарозном геле. Реакция рестрикции осуществлялась с 10 мкл амплифицированного продукта, В8А 1Х (100мкг/мл), ΝΕΒιιΓίοΓ 3 1Х (100мМ №С1, 50мМ Τ1Ϊ5 НС1, 10мМ МдС12, 1мМ дитиотреитола рН 7,9) и 2,5И ВтдВ I. Эту смесь инкубировали при 37°С в течение 3 ч.

Предсказанный размер фрагмента после рестрикции для растений дикого типа и А122Т был следующим.

Дикий тип представил фрагменты 183+138 п.о. СМ40 (А122Т): представил фрагменты 183+76+62 п.о. Гетерозиготные индивидуумы представили фрагменты 183+138+76+62 п.о. На фиг. 5 показано, что с использованием этого метода были получены фрагменты предусмотренного размера и что этим методом возможно детектировать А122Т переносы из растений дикого типа, и также, что возможна дискриминация между гомо- и гетерозиготными индивидуумами для А122Т мутации.

Обработки гербицидом

Семена высевали в чашки Петри и после прорастания проростки переносили в горшки диаметром 10 см в горшечную среду, состоящую из равных частей вермикулита, почвы и песка. Растения выращивали в теплице в условиях естественного освещения, дополненного натрийгалоидными лампами 400 У для обеспечения длины дня 16 ч. Дневная и ночная температура были 25 и 20°С соответственно. На стадии У2-У4 (8сЬпейет & МШет (1981) Сгор 8с1. 21:901-903) 10 растений каждого генотипа случайной выборкой отбирали для каждой обработки, состоящей из восьми доз имазапира (0, 40, 80, 160, 240, 320, 400 и 480 г аи/га, соответствующих необработанным, 0,5х, 1х, 2х, 3х, 4х, 5х и 6х соответственно), и определяли начальную биомассу. Эксперимент проводили по схеме рандомизированных блоков с полной факториальной (линия подсолнечника х обработка) систематизацией и 10 репликациями.

В день нанесения гербицида десять растений каждого генотипа отрезали при семядольном узле и сушили при 60°С в течение 48 ч для определения начальной сухой массы.

Оставшиеся растения поддерживали 14 дней после обработки имазапиром (ЭЛТ) и определяли их высоту, показатель фитотоксичности (ΡΙ) и сухую биомассу наземной части. Высоту определяли как расстояние между семядольным узлом и высшей точкой каждого растения. Данные биомассы наземной части из каждой линии были преобразованы в биомассу, накопленную после нанесения гербицида путем вычитания средней начальной биомассы для каждого образца. Данные о сухой биомассе были преобразованы в процент от необработанных контрольных растений внутри каждой лини для обеспечения прямого сравнения между группами. ΡΙ имеет фенотипическую шкалу от 0 до 9, по которой оценивали каждое растение путем визуального обследования. Растения без каких-либо симптомов регистрировали как 0, с повышенными уровнями низкорослости и хлорозом по сравнению с необработанными контрольными растениями регистрировали как 1-4, с повышенными уровнями дефектов листьев и некрозом листьев регистрировали от 5 до 8 и погибшие растения с полным некрозом до верхней точки регистрировали как 9.

Результаты

Высота

Снижение высоты восприимчивой линии было 85% при низшей дозе нанесения имазапира (0,5х). От 1х до 6х снижение высоты снижение высоты этой линии было приблизительно 85% от необработанных контрольных растений. Высота линий подсолнечника и гибрида, несущих А205У мутацию в гомозиготном состоянии, не отличалась от необработанных контрольных при применяемой дозе имазапира 0.5х или 1х. От 2х до 6х эти линии показывали заметное снижение роста, которое составляло 69,6% +/- 3,9 от необработанного контроля (табл. 2 и фиг. 1). А линии подсолнечника, несущие А122Т мутацию в гомозиготном состоянии, показывали уменьшенное снижение высоты (от 0,1 до 18,8% от необработанного контроля для 0,5х и 6х доз имазапира соответственно). Обе группы линий показали заметные различия в их ответе на увеличение дозы гербицида от 2х до 6х (табл. 2 и фиг. 1).

Материалы с обоими мутантными аллелями при ЛНА8^1 (гетерозиготы А122Т/А205У) показали снижение роста от 0,6 до 38,2% +/- 2,7 от необработанного контроля для 0,5х и 6х доз нанесения гербицида. Это снижение высоты для гетерозиготных материалов не отличается от снижения, наблюдаемого для гомозигот А122Т/А122Т, но было меньше, чем зарегистрированное для гомозигот А205У/А205У (фиг. 1). Фактически среднее снижение роста в гетерозиготных материалах не отличалось от наблюдаемого для гомозиготных А122Т/А122Т растений при любых дозах нанесения гербицида, но статистически отличалось от наблюдаемого для гомозиготных А205У/А205У растений при дозах нанесения гербицида от 2х до 6х (табл. 2).

Показатель фитотоксичности

- 22 019952

Оба мутанта в гомозиготном состоянии показали большие различия в ответе на увеличение дозы гербицида от 0,5х до 6х (фиг. 2). Линии подсолнечника, несущие А122Т мутацию в гомозиготном состоянии, показали более слабое снижение размера листьев и яркости зеленого цвета, чем контрольные растения при повышении доз гербицида (табл. 3). А растения, несущие А205У мутацию, не показали каких-либо повреждений при дозе гербицида 0.5х или 1х, но уровень повреждений (хлороз, деформация листьев и некроз листьев) быстро увеличивался для доз от 2х до 6х (табл. 3). Два мутанта в гомозиготном состоянии существенно отличались друг от друга по показателю фитотоксичности от 2х до 6х (табл. 3). Гетерозиготные А122Т/А205У материалы показали такой же характер ответа, как гомозиготные А122Т/А122Т материалы. Фактически они показали только ярче зеленый цвет, чем контрольные растения при любой дозе нанесения гербицида, и меньший размер листьев, чем контрольные растения, при дозах 5х и 6х, для которых определяли Р1 равный 1 при высшей дозе (фиг. 2).

Сухая масса биомассы наземной части

Кривые доз - ответ для сухой массы мутантов А122Т и А205У показаны на фиг. 3. Вес биомассы экземпляра А122Т в гомозиготном состоянии снижался по сравнению с контрольными растениями при дозах 4х, 5х и 6х, и это снижение достигало 25% для высшей дозы. В тоже время, сухая масса экземпляра А205У снижалась по сравнению с контрольными растениями при дозах от 0,5х (40 г аи/га) до 6х. Оба мутанта показали заметные различия между ними в отношении их вариабельности от 0,5х до 6х доз (табл. 4). Гетерозиготные А122Т/А205У материалы показали совершенно такую же тенденцию, как гомозиготные А122Т материалы (фиг. 3, табл. 4). Они показали снижение веса биомассы от 0,3 до 33% для доз нанесения гербицида от 0,5х до 6х, которое не отличалось от данных, зарегистрированных для гомозиготных А122Т индивидуумов при любой дозе. Однако гетерозиготные материалы показали заметные различия по сравнению с гомозиготными А205У индивидуумами для накопления сухого вещества при дозах нанесения гербицидов от 3х до 6х (табл. 4).

Выводы

Гетерозиготные материалы, несущие оба мутантных аллеля при локусе ΛНΛδ^1. показали такой же уровень толерантности и характер ответа для высоты растений, показателя фитотоксичности и накопления сухого вещества при увеличении дозы нанесения имазапира, как и гомозиготные А122Т материалы, и этот уровень толерантности был лучше, чем проявляемый гомозиготными А205У материалами.

В табл. 2 показано влияние различных доз имазапира на высоту растений на 14 день после обработки для трех генотипов подсолнечника, несущих А205У мутацию, трех генотипов, несущих А122Т мутацию, двух генотипов, несущих А205У/А122Т мутацию, и одной чувствительной линии.

Таблица 2

	\ντ	Α205Υ	А122Т	Α122Τ/Α205Υ	Различие между Α2Ο5Υ ¥8 А205У/А122Т		Различие между А1222Т ν5 λ2Ο5ν/Α122 Т
Доза	Е5	Н1	ы	Ь2	Среднее значение	5В	Н2	ЕЗ	Ь4	Среднее значение	80	нз	Н4	Среднее значение	ευ	Р-значение	^значение
0	100.00	100	100	100	100	0.0	100	100	100	100	0	100.0	100.0	100.0	0.0	0.00	-	0.00
0.5	20.14	99.5	100.0	99.2	99.6	0.4	99.2	100.4	100.0	99.9	0.6	98.7	100.0	99.4	0.5	0.21	0.803	0.49	0.584
1	14.58	99.5	100.0	98.1	99.2	1.0	98.6	99.9	100.0	99.5	0.8	97.0	99.6	98.3	0.9	0.89	0.613	1.21	0.513
2	14.58	78.6	78.9	63.6	73.7**	8.8	100.3	92.0	101.8	98.0	5.3	96.7	100.0	98.3	1.2	•24.63	0.031	•0.32	0.933
3	14.58	48.4	50.0	51.9	50.1**	1.8	99.6	90.5	97.0	95.7*	4.7	93.8	100.0	96.9	2.2	-46.79	0.026	-1.22	0.790
4	14.58	28.9	38.1	27.5	31.5**	5.8	101.0	90.8	92.1	94.6**	5.6	92.0	95.0	93.5**	1.1	-62.01	0.001	1.15	0 770
5	14.58	25.3	31.8	26.0	27.7**	3.6	87.0	84.4	84.8	85.4**	1.4	65.4	87.2	76.3**	7.7	-48.59	0.130	9.12	0.556
6	14.58	27.1	34.7	29.3	30.4**	3.9	79.6	84.4	79.8	81.2··	2.7	58.0	65.5	61.8**	2.7	-31.39	0.027	19.49	0.082

*, ** Средние значения являются статистически отличными от необработанного контроля при 0,05 и 0,01 уровне значимости, соответственно.

В табл. 3 показано влияние различных доз имазапира на показатель фитотоксичности на 14 день после обработки для трех генотипов подсолнечника, несущих А205У мутацию, трех генотипов, несущих А122Т мутацию, двух генотипов, несущих А205У/А122Т мутацию, и одной чувствительной линии.

- 23 019952

Таблица 3

	χντ	А205У	А122Т	А122Т/А205У	Различие между А205У ν5 А205У/А122Т		Различие между ΑΙ222Τ ν$ А2О5У/А122Т
Доза	Ь5	Н1	Ы	Ь2	Среднее значение	30	Н2	ьз	Ь4	Среднее значение	3ϋ	нз	Н4	Среднее значение	50	Ршаченне	Р- 1начение
0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.00	-	0.00
0.5	9	0	0	0	0	0	0.5	0.4	0.0	0.3	0.3	0.5	0.0	0.5	0.0	-0,50	п$	-0.21	0.300
1	9	0	0	0	0	0	0.5	0.4	0.0	0.3	0.3	0.5	0.0	0.5	0.0	-0.50	П5	-0.21	0.286
2	9	1.8	1.6	3.1	2.2*	0.8	0.5	0.4	0.0	0.3	0.3	0.5	0.0	0.5	0.0	1.66	0.075	-0.20	0.311
3	9	64	5.1	3.9	5.1**	1.2	0.5	0.5	0.0	0.3	о.з	0.5	о.о	0.5	0.0	4.65	0.022	-0.17	0.423
4	9	8.0	8.4	5.9	7.4**	1.3	0.5	1.0	0.0	0.5	0.5	0.5	0.0	0.5	0.0	6.92	0.012	0.00	1.000
5	9	8.9	8.9	6.9	8.2**	ы	0.5	2.0	0.0	0.8	ΐ.Ο	0.6	0.2	0.6	0.2	7.59	0.006	0.21	0.764
6	9	9.0	8.9	6,7	8.2**	1.3	0.5	2.5	0.5	1.2	1,2	1.0	0.0	1.0	0.0	7,19	0.010	0.17	0.826

*, **: Средние значения являются статистически отличными от необработанного контроля при 0,05 и 0,01 уровне значимости соответственно.

В табл. 4 показано влияние различных доз имазапира на накопление биомассы на 14 день после обработки для трех генотипов подсолнечника, несущих А205У мутацию, трех генотипов, несущих А122Т мутацию, двух генотипов, несущих А205У/А122Т мутацию, и одной чувствительной линии.

Таблица 4

	ХУТ	А205 V	А122Т	Α122Τ/Α205Υ	Различие между А2О5У νδ А205У/А122Т		Различие между А1222Т νδ А205У/А122Т
Доза	Ь5	Н1	Ы	Ь2	Среднее значение	80	Н2	ЬЗ	Ь4	Среднее значение	50	НЗ	Н4	Среднее значение	8ϋ	Рзначение	Р-значение
0	100.0	100	100	100	100	0.0	100	100	100	100	0	100	100	100.0	0.0	0.00		0.00	-
0.5	18.3	95.0	91.7	99,2	95,3*	3.7	100	96.6	100.0	98.9	2.0	99.804	99.479	99,6	0.2	-4.33	0.271	-0.76	0.579
1	15.0	89.6	81.7	85.0	85.5**	4.0	97.2	93.9	99.1	96.7*	2.6	100.0	97.8	98.9	1.6	-13.45	0.241	-2.17	0.333
2	15.0	75.5	54.7	58.1	62.8**	11.2	97.9	81.6	97.0	92.2*·	9.2	94.3	92.2	93.2**	1.5	-30.47	0.063	-1.07	0.860
3	15.0	60.4	35.7	48,1	48,1*·	12.4	98.2	75.8	96.1	90.0**	12.4	90.8	88.2	89.5**	1.9	41.42	0.049	0.55	0.947
4	15.0	46.5	25.3	28.8	33.5**	11.3	97.8	75.0	84.3	85.7**	11.5	87.8	85.0	86.4**	2.0	-52.87	0.029	-0.73	0.923
5	15.0	38 9	19.8	27.4	28.7**	9.6	85.1	60.1	77.5	74.3**	12.8	72.1	78.7	75.4**	4.7	46.69	0.013	-1.14	0.898
6	15.0	33.9	19.5	24.9	26.1**	7.2	79.5	59.6	70.7	69.9**	10.0	63.2	71.8	67.5**	6.0	-41.41	0.012	2.41	0.759

*, **: Средние значения являются статистически отличными от необработанного контроля при 0.05 и 0.01 уровне значимости, соответственно.

Пример 3. Толерантность к гербициду гомозиготных линий и гетерозиготных А122Т и А205У по сравнению с гетерозиготными линиями обоих мутантов (Λ122Т/Λ205V) в полевых условиях.

Этот эксперимент был проведен, чтобы сравнить толерантность к гербициду гибридов подсолнечника и линий различных генотипов, несущих А122Т и А205У мутации в гомозиготном (А122Т/А122Т или А205У/ А205У), гетерозиготном (А122Т/- или А205У/-) и дважды сложенном гетерозиготном (Λ122Т/Λ205V) состояниях в полевых условиях.

Материалы

Были использованы материалы подсолнечника, приведенные в табл. 5.

Таблица 5. Перечень данных

Тип материала	Вид мутации	Зиготность	Продукт	Позиция описания	Номер записи
ХУТ х 1М1 реставратор	А205У	гетеро	гибрид	1-гибрид	1
ХУТ к ΙΜ1 реставратор	А205У	гетеро	гибрид	3- гибрид	2
ХУТ-СМЗ х ΙΜΙ реставратор	А205У	гетеро	гибрид	7-гибрид	3
[ΜΙ реставратор	Α205ν	гомо	реставратор	4-гибрид	4
ΙΜΙ СМ3 х 1ΜΙ реставратор	А205У	гомо	гибрид	гибрид	5
ХУТ X СМ40 реставратор	Α122Τ	гетеро	гибрид	8- гибрид	6
ХУТ X СМ40 реставратор	А122Τ	гетеро	гибрид	15-гибрид	7
ХУТ X 6М40 реставратор	А122Т	гетеро	гибрид	16-гибрид	8
СМ40 реставратор	А122Т	гомо	реставратор	9-линия	9
«ЗМ40СМЗ х СМ40 реставратор	ΑΙ22Τ	гомо	гибрид	13-гибрид	10
ΌΜ40 СМ5 х 6М40 реставратор	А122Т	гомо	гибр ид	14-гибрид	11
1М1 СМ3 х СМ40 реставратор	Α205ν/Α122Τ	гетеро /двойной	гибрид	10·гибрид	12
СМ40 СМ3 х ΙΜ1 реставратор	А205У/А122Т	гетеро / двойной	гибрид	11-гибрид	13
ΙΜΪ СМ3 х 6М40 реставратор	Α205ν/Α122Τ	гетеро / двойной	гибрид	12-гибрид	14
ХУТ			В линия	5-\νΤ	15

- 24 019952

Способы

Семена из каждой позиции табл. 5 получали при оптимальных условиях производства семян в Южной Америке в сезоне 2005-2006. Опытное поле было расположено в Северной Дакоте, США, 2006. Образцы были объединены по схеме полностью рандомизированных блоков с использованием метода расщеплённая делянка, состоящего из 3 повторов для каждой комбинации обработки. Фактор А (табл. 6) это обработка гербицидом, а фактор В - это образец подсолнечника. Размер делянки был 4 ряда х 12 фут и норма высева соответствовала местной агрономической практике.

Таблица 6. Фактор А - Перечень обработок гербицидом

№ обработки	Обработка
1	Без обработки
2	50 г аи/га изамокса + 0.25% (ν/ν) N18
3	100 г аи/га изамокса + 0.25% (ν/ν) N18
4	200 г аи/га изамокса + 0.25% (ν/ν) N18
5	160 г аи/га изамокса + 0.25% (ν/ν) N18

ΝΙ8 = не ионное поверхностно-активное вещество.

Распыляемый объем: 10 галлонов на акр (ОРА) (или 100 литров/га) для ранцевого распыления или 20 ОРА (или 200 л/га) для закреплениях на тракторе бонов.

Стадия роста при нанесении гербицида: 2-4 листа.

Позицию 15 (^Т линия сохранения) оставляли не опыленной при всех обработках блока.

Оценку фитотоксичности проводили на 7 и 21 дни после нанесения гербицида. Фитотоксичность регистрировалась как количество поврежденных растений (в процентах), причем показатель 0 указывает на отсутствие повреждений растений на делянке относительно необработанной делянки. Показатель 100 указывает на полный некроз (гибель) растений на делянке относительно необработанной делянки.

Данные подвергали АNΟVА анализу и средние значения из 3 повторений представлены в табл. 7 (фитотоксичность на 7 день после обработки) и табл. 8 (фитотоксичность на 21 день после обработки).

Результаты

При дозе имазапира 160 г аи/га не было значительных различий в фитотоксичности между дважды гетерозиготными образцами А205У/А122Т и гомозиготными образцами А205У и А122Т на 7 день и 21 день после обработки (ЭАТ). Фитотоксичность гетерозиготных образцов А205У была значительно выше, чем дважды гетерозиготных А205У/А122Т и гомозиготных образцов на 7 и 21 ОАТ (порядка 20-43% для гетерозиготных образцов А205У на 21 ЭАТ). Фитотоксичность гетерозиготных образцов также увеличивалась в промежуток времени оценки с 7 ОАТ по 21 ОАТ. Не было существенного увеличения фитотоксичности с 7 ОЛТ по 21 ОЛТ для А205У/А122Т, дважды гетерозиготных А122Т/А122Т и А205У/А205У гомозиготных образцов.

Три уровня имазамокса, 50 г аи, 100 г аи и 200 г/аи/га, тестировали на всех образцах (исключая образец 15). При 200 г аи/га имазамокса гетерозиготные А205У/А122Т линии (фитотоксичность 2-3% на 21 ОАТ) демонстрировали существенно меньшую фитотоксичность, чем гомозиготные А205У/А205У линии (фитотоксичность 15-22% на 21 ОАТ) и эквивалентную фитотоксичность с гомозиготными А122Т/А122Т линиями (фитотоксичность 3-5% на 21 ОАТ).

Обсуждение

Дважды гетерозиготные образцы А205У/А122Т проявляли толерантность к гербициду, эквивалентную с гомозиготными образцами А122Т/А122Т и значительно превосходящую толерантность к гербицидам гомозиготных образцов А205У/А205У, как показано при высшем уровне обработки имазомоксом (200 г аи/га).

Единичный уровень обработки имазапиром, 160 г аи/га, был недостаточно высоким, чтобы показать существенные различия в фитотоксичности между дважды гетерозиготными образцами А205У/А122Т и гомозиготными образцами, но он был достаточен, чтобы продемонстрировать более высокую толерантность, полученную при стекинге двух гетерозиготных мутаций А205У/А122Т вместе по сравнению с каждой гетерозиготной мутацией.

На основе данных обработки имазамоксом А122Т мутация, когда она скомплектована с А205У мутацией в гетерозиготном состоянии, приводит к более сильной толерантности к гербициду, чем А205У мутация в гомозиготном состоянии.

Описанный выше эксперимент раскрывает взаимодействие между двумя аллельными мутантами ЛНЛ8^1 в подсолнечнике. Мутация в кодоне 122 имеет существенно большую толерантность к гербициду, чем любые ранее описанные мутации АНА8 в подсолнечнике, причем мутация в кодоне 205 обеспечивает промежуточные уровни резистентности. Поскольку аллель 122 показывает доминирование над аллелем 205, гетерзиготные генотипы, несущие оба мутанта, имеют такой же уровень толерантности, как гомозиготные 122.

- 25 019952

Благодаря изучению повышенной толерантности к гербициду, настоящее изобретение представляет способы, которые позволяют разрабатывать новые и высокоэффективные гербицидные продукты для производства подсолнечника. Также настоящее изобретение предлагает растения подсолнечника с коммерческими уровнями толерантности к гербициду, произведенные с помощью выполнения единственного на настоящий день генного замещения в гибридах подсолнечника С1еагПе1б, которое представляет собой А205У/А205У, настоящее изобретение находит применение в повышенной эффективности размножения при производстве толерантных к гербициду гибридов подсолнечника и также предлагает развертывание А122Т мутации в коммерческих гибридах подсолнечника.

Таблица 7. Показатели фитотоксичности (% поражения культур), зарегистрированные на 7 день после обработки (ОАТ)

Тип материала	Вид мутации	Зиготность	Продукт	Описание образца	7 ϋΑΤ 50 г ΙΜΑΖΑΜΟΧ	7 ОАТ 100 г ΙΜΑΖΑΜΟΧ	7 ϋΑΤ 200 г ΙΜΑΖΑΜΟΧ	Ί ОАТ 160 г ΙΜΑΖΑΡΥΚ	7 ϋΑΤ υΝΤΚΕΑΤΕΟ
\УТ х ΙΜΙ реставратор	А205	гетеро	гибрид	1-гибрнд	8.3	35,0	48.3	16.7	0.0
\ντ х 1М1 реставратор	А205	гетеро	гибрид	3-гибрид	11.7	46.7	60.0	35.0	0.0
\УТ-СМ$ х ΙΜ1 реставратор	А205	гетеро	гибрид	7-гибрид	13.3	43.3	56.7	21.7	0.0
ΙΜ1 реставратор	А205	ГОМО	реставратор	4-линия	6,7	6.7	18.3	11.7	0.0
ΙΜΙ СМ$ х ΙΜΙ реставратор	А205	гомо	гибрид	6-гибрид	5,0	8.3	26.7	8.3	0.0
\УТ X 6М40 реставратор	А122	гетеро	гибрид	8-гибрид	13.3	13.3	25.0	13.3	0.0
\УТ X 6М40 реставратор	А122	гетеро	гибрид	ί 5-гибрид	10.0	11,7	16,7	8.3	0.0
\λ'Τ X (ЗМ40 реставратор	А122	гетеро	гибрид	16-гибрид	ю.о	15.0	23.3	10.0	0.0
СМ40 реставратор	А122	гомо	реставратор	9-линия	1.7	5.0	10.0	8.3	0.0
СМ40 СМ8 х ОМ40 реставратор	А122	гомо	гибрид	13-гибрид	3.3	5.0	10.0	5.0	0.0
СМ40 СМ8 х 6М40 реставратор	А122	гомо	гибрид	[4-гибрид	5.0	6.7	11.7	8.3	0.0
ΙΜΙ СМ8 х СМ40 реставратор	А205/А122	гетеро /дважды	гибрид	10- гибрид	3.3	3.3	10.0	3.3	0.0
6М40 СМ8 х ΙΜΙ реставратор	Α205/ΑΙ22	гетеро /дважды	гибрид	11-гибрид	0.0	3.3	11.7	3.3	0.0
ΙΜΙ СМ$ х СМ40 реставратор	А205/А122	гетеро /дважды	гибрид	12-гибрид	10.0	10.0	11.7	5.0	0.0
\νι		-	В линия	5-ШТ	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

Ь8Б=9,64 СУ=54,70

8ΐ Беу=6,03 Общее среднее= 11,02

Таблица 8. Показатели фитотоксичности (% поражения культур), зарегистрированные на 21 день после обработки (ОАТ)

Тип материала	Мутация	Зиготность	Продукт	Описание образца	21 ЭАТ 50 г ΙΜΑΖΑΜΟΧ	21 ϋΑΤ 100 г ΙΜΑΖΑΜΟΧ	21 ОАТ 200 г ΙΜΑΖΑΜΟΧ	21 ОАТ 160 г 1ΜΑΖΑΡΥΚ	21 ϋΑΤ υΝΤΚΕΑΤΕϋ
\ντ х ΙΜΙ реставратор	А205	гетеро	гибрид	1-гибрид	6.7	25.0	73.3	20.0	0.0
ν/Τ х ΙΜΙ реставратор	А205	гетеро	гибрид	3-гибрид	11.7	46.7	76.7	43.3	0.0
М/Т-СМ8 χ ΙΜΙ реставратор	А205	гетеро	гибрид	7-гибрид	3.3	40.0	78.3	36.7	0.0
ΙΜΙ Реставратор	А205	гомо	реставратор	4-линия	5.0	6.7	15.0	6.7	0.0
ΙΜΙ СМ8 χ ΙΜΙ реставратор	А2О5	гомо	гибрид	6-гибрид	0.0	3.3	21.7	3.3	0.0
ΆΤ X СМ40 реставратор	ΑΙ22	гетеро	гибрид	8-гибрид	6.7	11.7	28.3	11.7	0.0
ν/Τ X ΟΜ40 реставратор	А122	гетеро	гибрид	15-гибрид	6.7	11.7	30.0	21.7	0.0
ν, Τ X 6Μ40 реставратор	А122	гетеро	гибрид	16-гибрид	6.7	16.7	31,7	23.3	0,0
СМ40 реставратор	А122	гомо	реставратор	9-линия	0.0	0.0	3.3	5.0	0,0
6М40 СМ8 χ (ЗМ40 реставратор	ΑΙ22	гомо	гибрид	13-гибрид	0.0	1.7	3.3	1.7	0.0
СМ40 СМ8 х СМ40 реставратор	А122	гомо	гибрид	14-гибрид	0.0	3.3	5.0	3.3	0.0
ΙΜΙСМ8 х СМ40 реставратор	Α205/ΑΙ22	гетеро/дважды	гибрид	10-гибрид	0.0	0,0	1.7	0.0	0.0
ОМ40 СМ8 χ ΙΜΙ реставратор	А205/А122	гетеро/дважды	гибрид	11-гибрид	0.0	0.0	3.3	0.0	0.0
ΙΜΙ СМ8 х СМ40 реставратор	А205/А122	гетеро/дважды	гибрид	12-гибрид	3.3	3.3	3.3	1.7	0.0
\ντ			В линия	5-\ΥΤ	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0

Ь8Б=8,89 СУ=56,78

81Беу=5,55 Общее среднее=9,78

Пример 4. Толерантность к гербициду гомозиготных А122Т/А122Т или А205У/А205У и гетерозиготных образцов А122Т/А205У при листовом нанесении имазапира на поздней вегетативной или ранней репродуктивной стадиях развития растения для контроля заразихи.

0гоЬапс11е ситапа и 0гоЬапсйе сетиа (заразиха) представляют собой два паразитических растения, которые поражают подсолнечник во многих областях производства в мире. Оба вида инфицируют растения подсолнечника последовательно от У6 до стадии цветения (К5). Предлагалось использовать имида

- 26 019952 золиноновый гербицид, такой как имазетопир, для контроля заразихи путем нанесения гербицида на содержащие А205 растения подсолнечника на стадии развития от У10 до КГ (\УО 1999065312). Применение этого подхода для контроля ОгоЬапсНе было успешным и фитотоксичность была незначительной.

Здесь мы показываем, что толерантность А122Т/А122Т или Л122Т/Л205У гибридов лучше, чем толерантность Л205У гомозиготных растений, когда имидазолиноновый гербицид, такой как имазапир, применяют при 2х повторах во время ранних репродуктивных стадий развития (В1). В этом сообщении мы показываем применимость А122Т/А122Т и А122Т/А205У для контроля ОгоЬапсНе в подсолнечнике.

Материалы

Линии Н1, Н2 и Н3 такие, как описаны в табл. 9. Гибрид Н5 представляет Р1, созданный скрещиванием между Ь3 х В701, а гибрид Н6 представляет Р1, созданный скрещиванием между Ь1 х К.701.

Методы

Семена каждого вида были получены при оптимальных условиях производства семян в Лагуна Бланка (Формоза, Аргентина) в 2005г. Полевые испытания были проведены в Венадо Туерта (Санта Фе, Аргентина) в 2006г. Образцы были расположены по схеме полностью рандомизированных блоков, состоящей из 3 повторов для каждой комбинации обработки. Фактор А - онтогенетическая стадия развития подсолнечника (У8 и К1), и фактор В - тип подсолнечника. Размер делянки был 5 рядов х 6 метров, растения распределяли через 25 см внутри каждого ряда. На стадии У8 или К1 наносили 160 г аи/га имазапира + 0,25% (ν/ν) N18 путем распыления объема 100 л/га с использованием ранцевого распылителя.

Оценку фитотоксичности проводили на 7 и 21 дни после нанесения гербицида. Фитотоксичность регистрировалась как количество поврежденных растений (в процентах), причем показатель 0 указывает на отсутствие повреждений растений на делянке относительно необработанной делянки. Показатель от 1 до 15 указывает на повышенный уровень хлороза на делянке, причем 15 указывает на общее пожелтение делянки. Показатель от 20 до 49 указывает на повышенный уровень низкорослости, деформаций и некроза. Показатель 50 указывает на гибель (полный некроз) растений.

Данные подвергли АNОУА анализу. Средние значения каждого образца сравнивали с использованием Б8О теста при 0,01 уровне значимости.

Результаты

Средние значения показателя фитотоксичности (ΡΙ), подсчитанные на 14 и 21 дни после обработки (ΌΑΤ), представлены в табл. 9 и 10.

Почти все гибриды проявили слабые симптомы хлороза при обрызгивании на У8 стадии развития растения. Единственным исключением был гетерозиготный 122/^УТ гибрид, который продемонстрировал полное пожелтение на 14 ΌΑΤ (табл. 9). Это пожелтение исчезало на 21 ΌΑΤ (табл. 10). Также, на 21 ΌΑΤ не было различий между линиями в отношении ΡΙ (табл. 10).

С другой стороны, когда гибриды обрызгали на К1 стадии развития растения и оценили на 14 ΌΑΤ, обнаружили две хорошо различающиеся группы материалов. Одна группа проявляла только симптомы хлороза (ΡΙ менее чем 11,7), в то время как вторая группа проявляла симптомы хлороза наряду с низкорослостью и деформацией (ΡΙ больше чем 35). Первая группа состояла из линий, несущих по меньшей мере один аллель А122Т (т.е. гибриды А122Т/А122Т, Α122Τ/Α205У и Α122/\νΤ), а вторая группа состояла из гибридов, несущих Α205У мутацию в обоих гомозиготном и гетерозиготном состоянии (Α205У/Α205У, Α205У/VΤ). Различие в ΡΙ между обеими группами были хорошо заметны (р<0,01; табл. 9). На 21 ΌΑΤ, однако, для Α122/νΤ гибрида повысилась оценка ΡΙ (от 11.7 до 23.3), в то время как для А122Т/А122Т и Α122Τ/Α205У гибридов понизились их значения ΡΙ от 2,3-4,3 до 1,7-0,7. Различия между этими двумя последними гибридами и Α122Τ/νΤ были хорошо заметны на 21 ΌΑΤ (табл. 10). Линии, содержащие Α205/Α205У и Α205У/VΤ, также показали очень высокие значения ΡΙ, причем многие растения проявили признаки ожога верхушки и повреждения точек роста (табл. 10).

Вывод

Результаты показывают, что гибриды Α205У/Α205У или Α205У/VΤ нельзя обрызгивать имазапиром после У8, потому что они показали повышенную фитотоксичность и серьёзное повреждение после его нанесения. Гибриды А122Т/А122Т и Α122Τ/Α205У проявляли только симптомы хлороза после нанесения имазапира. Это подтверждает, что А122Т/А122Т и Α122Τ/Α205У растения подсолнечника демонстрируют лучший уровень толерантности к имидазолиноновым гербицидам, когда они наносятся на стадии К1, чем Α205У/Α205У или Α205У/VΤ материал. Таким образом, линии, содержащие А122Т/А122Т и Α122Τ/Α205У объединения, могут быть использованы для контроля ОгоЬапсНе с помощью имазапира путем нанесения гербицида на К1 (поздней вегетативной или ранней репродуктивной) стадии развития растения.

В табл. 9 показаны средние значения показателя фитотоксичности, оцененного на 14 день после обработки (ΌΑΤ) имазапиром (160 г аи/га), нанесенным в две разные стадии развития растения (У8 и К1), для мутаций А122Т и Α205У и гетерозиготных генотипов А122/А205, Α122/νΤ и Α205/νΤ. Различные буквы указывают на значительные различия при р<0.01.

- 27 019952

Таблица 9

Оценка на 14 РАТ
Генотип	АНА8Ы аллель/и	Без обработки	νβ		К1
Н2 (ЬЗ*Ь4)	122/122	0	5	аЬ	2.3	а
ΗΙ (Ш*Е2)	205/205	0	6	аЬ	35	ь
НЗ (ЪЗ*Ь2)	122/205	0	3	а	4.3	а
Н5 (ЬЗ х ХУТ)	122/дикий тип	0	15	ь	11.7	а
Н6(Ы * ΨΤ)	205/дикий тип	0	5	аЬ	40	Ь

Ь8Б-значение(р<0,01)=10,04

Остаточный средний квадрат=20,0

Средний квадрат генотипа=476,22 (р<2,2 е^-16)

В табл. 10 показаны средние значения показателя фитотоксичности, оцененного на 21 день после обработки (ОЛТ) имазапиром (160 г аи/га), нанесенным в две разные стадии развития растения (У8 и Р1), для мутаций А122Т и А205У и гетерозиготных генотипов А122/А205, А122/АТ и А205/АТ. Различные буквы указывают на значительные различия при р<0,01.

Таблица 10

Оценка на 21 ЙАТ
Генотип	АНА8Ы аллель/и	Без обработки	У8		К1
Н2(ЬЗ*Ь4)	122/122	0	1	а	1.7	а
Н1 (П*Е2)	205/205	0	3	а	37.7	Ьс
НЗ(ЬЗ‘Ь2)	122/205	0	0	а	0.7	а
Н5 (ЬЗ х \νΤ)	122/дикий тип	0	5	а	23.3	ь
Η6(ί1 * \УТ)	205/дикий тип	0	5	а	48.3	с

Ь8Б-значение (р<0,01)=16,39

Остаточный средний квадрат=53,3

Средний квадрат генотипа=806,33 (р<2,.2 е^-16)

Пример 5. Ответ гомозиготных А122Т/А122Т или Р197Ь/Р197Ь и гетерозиготных А122Т/Р197Ь образцов на сульфонилмочевинный гербицид на уровне целого растения.

Устойчивость подсолнечника к сульфонилмочевинам была обнаружена у дикой популяции из Канзаса (ИЗА, (АККЬяНЬ е! а1. (1998) \Уееб Зск 46:403-407). Ген резистентности (Аг-кап) был перенесен из дикой популяции в элитные инбредные линии с целью разработки и расширения устойчивых к гербицидам культиваров и гибридов (Ак-КИабЬ апб МШег (2000) Сгор Зск 40:869; МШег апб АГКИабЬ (2002) 42:988-989; МШег апб АГКИаНЬ (2004) Сгор Зск 44:1037-1038). Было показано, что АНАЗЫ из устойчивых к сульфонилмочевине генотипов накапливает С-!о-Т мутацию в кодоне 197, что приводит к замене

- 28 019952

Рго на Ьеи в этом положении (Ко1ктап е! а1. (2004) ТНеог. Арр1. Сепе! 109: 1147-1159).

Метсульфурон метил (метил-2-Е[С[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазифл-2-ил)аминокарбонил]аминосульфонил]бензоат) представляет собой сульфонилмочевинный гербицид, зарегистрированный для применения на пшенице и ячмене и непахотных угодьях, таких как полоса отчуждения (ЕРА РекНаОе Рас! 811ее1 Ме1ки1Гигоп те111у1 (1986) Со11ес11оп оГ рекНаОе сНетМгу. υδ Соуегптеп! Ргтйпд ОГПсе 461221/24041).

Целью этого исследования было определение количества и сравнение чувствительности к метсульфурону гибридов подсолнечника, несущих А122Т и Р197Ь мутации в гомозиготном (А122Т/А122Т или Р197Ь/ Р197Ь) и гетерозиготном (А122Т/Р197Ь) состояниях, на уровне целого растения в тепличных условиях.

Материалы

Использовались следующие материалы: В770, СМ1606, СМ40, Ь4, стк СМ40 х Ь4, стк СМ40 х ВТ8и-К1 и ВТ8и-К1. В770 представляет чувствительную линию подсолнечника, которая была использована как родительская для мутагенной линии СМ1606. СМ1606 представляет гомозиготную А122Т мутацию, а СМ1606 и В770 являются изолиниями, которые различаются только в АНА8Ь1 локусе. СМ40, Ь4 и сткСМ40 х Ь4 были описаны выше. ВТ8и-К! является линией-реставратором, разработанной в нашей лаборатории и полученной путем селекции родословной из составной популяции 8иКЕ8-2, которая была выделена МШег апО АРКНаНЬ (2004) Сгор 8ск 44:1037-1038.

Методы

Семена высевали в чашки Петри и после прорастания проростки переносили в горшки диаметром 10 см в горшечную среду, состоящую из равных частей вермикулита, почвы и песка. Растения выращивали в теплице в условиях естественного освещения, дополненного натрийгалоидными лампами 400 для обеспечения длины дня 16 ч. Дневная и ночная температура были 25 и 20°С соответственно. На стадии У2-У4 (8сйиейег & МШег (1981) 20 растений каждого генотипа случайной выборкой отбирали для каждой обработки, состоящей из трех доз метсульфурон метила (0 или нет обработки, 5 г аи/га или 1х доза и 10 г аи/га или 2х доза). Также было выполнено определение начальной биомассы. Эксперимент проводили по схеме рандомизированных блоков (КСВИ) с полной факториальной систематизацией обработок и 20 повторениями (линия подсолнечника х обработка).

Для определения начальной сухой массы десять растений каждого генотипа отрезали при семядольном узле в день нанесения гербицида и сушили при 60°С в течение 48 ч. Остаток растения поддерживали 14 дней после обработки гербицидом (ИАТ) и определяли их высоту, показатель фитотоксичности (Р1) и сухую биомассу наземной части. Высоту определяли как расстояние между семядольным узлом и высшей точкой каждого растения. Данные биомассы наземной части из каждой линии были преобразованы в биомассу, накопленную после нанесения гербицида, путем вычитания средней начальной биомассы для каждого образца. Данные о высоте и сухой биомассе были преобразованы в процент от необработанных контрольных растений внутри каждой линии для обеспечения прямого сравнения между группами. Р1 имеет фенотипическую шкалу от 0 до 9, по которой оценивали каждое растение путем визуального обследования. Растения, без каких-либо симптомов, регистрировали как 0. Повышенные уровни низкорослости и хлороза по сравнению с необработанными контрольными растениями регистрировали в интервале 1-4. Повышенные уровни дефектов листьев и некроза листьев регистрировали в интервале от 5 до 8. Погибшие растения с полным некрозом до верхней точки регистрировали как 9.

Данные подвергли ΑNΟVΑ анализу и средние значения сравнивали с помощью Ь8И теста.

Результаты

Высота, накопление сухого вещества и Р1 дикого типа и А122/А122Т гомозиготных растений свидетельствуют о высокой чувствительности обычного подсолнечника и мутанта А122Т к сульфонилмочевинам при обеих дозах нанесения (табл. 11). А мутация Р197Ь дает более высокий уровень толерантности, почти 80% от высоты необработанных контрольных растений при обеих дозах гербицида. Аналогично, накопление сухого вещества у этих образцов было 88 и 77% при 1х и 2х дозах метсульфурона соответственно.

Наконец, Р1 гомозиготной линии Р197Ь/Р197Ь был 0 и 0,1 при обеих дозах гербицида, что свидетельствует о том, что растение практически не имеет фитотоксических симптомов (табл. 11).

Составной гибрид А122Т/Р197Ь показал такой же характер толерантности, как и гомозиготная линия Р197, и предоставил лучшую продуктивность, чем все гомозиготные А122Т материалы для всех анализируемых вариантов (табл. 11). Для иллюстрации этого А122Т/Р197Ь линия, обработанная дозой 1х метсульфурона, показала такие же Р1 и снижение высоты, как гомозиготная резистентная Р197Ь. При дозе метсульфурона 2х А122Т/Р197Ь демонстрирует такое же накопление сухого вещества, как гомозиготная линия Р197Ь. Гетерозиготный гибрид Р197Ь/А122Т существенно отличался от резистентной линии Р197Ь по следующим параметрам: ЭМА при 1х (74,4 и 88,1 соответственно), РН (62 и 80,9%) и Р1 при 2х (1 и 0,1). Однако величина этих различий была очень низкой по сравнению с различиями, наблюдаемыми между А122Т/Р197Ь гетерозиготным материалом и всеми гомозиготными А122Т и дикого типа линиями.

- 29 019952

Вывод

На основании этих результатов, дважды гетерозиготный А122Т/Р197Б демонстрирует значительно большую устойчивость к метсульфурону, чем гомозиготный А122Т/А122Т и дикого типа материалы, и почти такой же уровень толерантности, как гомозиготная линия Р197Ь/Р197Ь.

В табл. 11 показано среднее снижение высоты (РН), накопление сухого вещества (ОМА) и показатель фитотоксичности φΙ) гомозиготныхА122Т/А122Т, Р197Ь/Р197Ь, гетерозиготных Р197Б/А122Т и дикого типа материалов после листового нанесения двух доз метсульфурона.

Таблица 11

		Дота метсульфурона
		IX (5г аи/га)	2Х (10 г аи/га)
Генетнческнй материал	АНА8 генотип	РН	ОМА	ΡΙ	РН	ОМА	ΡΙ
В770	ιντ	21.73 ’*	28.43 ь	8.50	18.20“	28.77ь	9.00“
СМ1606	ΑΙ22Τ/Α122Τ	21.55“	30.39ь	8.70“	21.70’	20.45’	9.00 е
СМ40	А122Т/А122Т	21.39*	25.73 вь	9.00“	21.17*	20.69 *	9.00 4
Ь4	А122Т/А122Т	19.47“	25.40 *	8.25 ь	18.73“	18.80’	8.5 е
ст®СМ40хЬ4	А122Т/А122Т	22.45 ’	19.90“	8.67“	20.56’	18.23’	8.82
стяСМ40хВТ8и-К1	А122Т/Р197Е	77.04	74.36 е	0.00’	61.99 ‘	72.66 е	1.00 ”
ВТ8и-К1	Р197Е/Р197Б	79.01 ”	88.10“	0.00’	80.85е	76.69 е	0.10’
ЕЗД-значенке (р<0.01)		4.87	8.29	0.33	5.45	6.97	0.38
Остаточный М8		20.00	58.00	0.09	25.00	41.00	0.12
Генотип М8		754.3 ***	257.90***	3908.9***	528.28***	339.05***	2680***

* Различные буквы обозначают существенные различия при р<0,01 уровне вероятности.

Пример 6. Диагностические ПЦР маркеры для устойчивых к гербицидам аллелей АНАЗЫ локуса в подсолнечнике.

Анализ единичного нуклеотидного полиморфизма (З№) проводился для высокопроизводительного определения генотипа растений подсолнечника, несущих АНАЗЫ мутации подсолнечника, описанных выше и в предварительно патентной заявке США № 60/695,952, поданной 1 июля 2005 г. Анализ позволяет (1) детектирование отдельных экземпляров, несущих А122Т мутацию, (2) определение зиготности А122Т мутации в этих отдельных экземплярах и (3) в случае гетерозиготных детектирование А122Т мутации наряду с другими скомпонованными резистентными аллелем(ями) АНАЗ (А205У или Р197Ь), которые присутствуют в растении.

1) ПЦР праймеры и условия амплификаций

ПЦР праймеры были разработаны на основе последовательностей ДНК, раскрытых здесь и в вышеупомянутой патентной заявке. Названия и последовательности этих праймеров следующие:

Прямой сохраняющий праймер

Ρ-ΑΗΑ8 МОГ 5 '-ТОТ ТСТ СТС СОА СТС ТАА А-3' (8Е<) ГО N0:3)

Обратный праймер дикого типа

АНА8 122 Т\¥Т 5'-ТОО ТОО АТС ТСС АТТ ОАО ТС-3 (ЗЕ<2 ГО N0:4)

Обратный мутантный праймер

АНА8 122 ТМи 5'-ТОО ТОО АТС ТСС АТТ ОАО ТТ-3' (КЕО ГО N0:5)

Реакционная смесь была следующей: 1 и Тад ДНК полимеразы (Вю)оо1к, 10,047), 70 нг геномной ДНК подсолнечника, 25 микрограмм ВЗА, и имела конечную концентрацию 100 мкМ каждого й№ГР (дезоксинуклеозидтрифосфат), 0,25 мкМ каждого праймера р-АНАЗ NI^Ε/ΛНΛЗ122Т\VТ или р-АНАЗ NI^Ε/ΛНΛЗ 122 ТМИ, 90 мМ Тпк-НС1, рН8, 20 мМ (NН₄)₂ЗΟ₄ и 2,5 мМ М§С1₂.

ПЦР программа состоит из исходного этапа денатурации при 94°С в течение 2 мин, последующих 45 циклов по 30 с при 94°С, 30 с при 55°С и 30 с при 72°С, с последующим удлинением завершающего этапа при 72°С до 10 мин.

2) Детектирование растений, несущих А122Т мутацию и их зиготности

Для обнаружения отдельных представителей, которые несут описанную мутацию, использовали комбинацию праймеров р-АНАЗ МОЕ/АНАЗ 122 ТМИ. Отдельные представители, имеющие по меньшей мере одну копию (т.е. гомо и гетерозиготные экземпляры) А122Т аллели, дают фрагмент 195 п.о. Представители дикого типа или экземпляры, имеющие любой другой гаплотип АНАЗЫ, не дают фрагмента с этой комбинацией праймеров (см. фиг. 6 и табл. 12). Вывод: эта комбинация праймеров является

- 30 019952 диагностической для А122Т мутации.

Комбинация праймеров р-АНА8 МЭЕ/АНА8 122 Т\УТ использовалась (а) для подтверждения специфичности предыдущих результатов, поскольку А122Т аллель не продуцирует продукты амплификаций с этой комбинацией праймеров, и (Ь) для определения, какой из других аллелей присутствует в каждом растении (если отличается от А122Т) (см. фиг. 7, и табл. 12).

Когда использовалась комбинация праймеров р-АНА8 МЭЕ/АНА8 122 Т\УТ, экземпляры дикого типа, А205У и Р197Ь мутанты давали специфический фрагмент (табл. 12); в то время как А122Т гомозиготы не давали продуктов амплификаций.

Амплифицированные продукты по п.1 растворили в 4% агарозном геле (МеШарйот Адагоке).

Ожидаемые размеры продуктов ПЦР из различных гаплотипов подсолнечника (Нар) при гене АНАНЫ приведены в табл. 12. Сравнение последовательностей Нар1-Нар6 представлено на фиг. 8 и включает места сайтов отжига праймеров р-АНА8 МЭЕ АНА8122Т\УТ, и АНА8 122 ТМИ, описанных выше, а также места А122Т мутации и (АСС)_П области, которая дает начало различию размеров ПЦР продуктов среди различных гаплотипов.

Таблица 12. Ожидаемые размеры продуктов амплификаций, полученные с парой праймеров р-АНА8 №ЭЕ/АНА8 122ТАТ и р-АНА8 №ЭЕ/АНА8 122 ТМИ.

		Полученные фрагменты	Полученные фрагменты
Галотип1*2		ρ·ΑΗΑ8ΝΠ>Γ/ ΑΗΑ8Ι22ΤΜ/Τ	Р-АНА5 ΝΙϋΓ / АНА8 122 тми
Гомозиготы

Нарб(А122Т)	СЬНаРШ	нуль	195П.О.
Нар 1	Культивируемые линии	195 п.о.	нуль
Нар 2	Культивируемые линии	192 п.о.	нуль
Нар 4	Культивируемые линии	186 п.о.	нуль
Нар 5 (А205У)	ΙΜΙδϋΝ производные линии	186 п.о.	нуль
НарЗ(Р197Ь)	производные линии	204 п.о.	нуль
Гетерозиготы
Нарб / Нар1		195 п.о.	195 п.о.
Нарб! Нар2		192 п.о.	195 п.о.
Нарб! Нар4		186 п о.	195 п.о.
Нарб / Нар 5		186 п.о.	195 п.о.
Нарб / Нар 3		204 п.о.	195 п.о.
НарЗ / Нар!		204/195 п.о.	нуль
НарЗ / Нар2		204 / 192 п.о.	нуль
НарЗ / Нар5		204/186 п.о.	нуль
НарЗ / Нар4		204/186 п.о.	нуль
Нар5 1 Нар1		186 /195 п.о.	нуль
Нар5! Нар2		186/192 п.о.	нуль
Нар5! Нар4		186/ 186 п.о.	нуль

'Гаплотипы (Нар) 1-5 соответствуют приведениям в Ко1ктап е1 а1. (2004) Тйеог. Арр1. Сгепе1. 109: 11471159).

²Тип АНА8Й1 мутации, если другое не указано в скобках.

Пример 7. Аллельспецифическая полимеразная цепная реакция для обнаружения А122Т аллеля АНА8Ь1 подсолнечника.

Для того чтобы способствовать разведению подсолнечника СЬЕАКНЕЬП, был разработан следующий 8№ анализ для детектирования А122Т аллеля АНА8Ь1 подсолнечника. Для разработки анализа использовали ΙΜΙ-толерантные варианты и оценка достоверности включала многочисленные обычные и толерантные к гербициду варианты. Этот анализ использует аллельспецифическую полимеразную цеп

- 31 019952 ную реакцию (ПЦР) для обнаружения и определения зиготности А122Т аллеля АЛАБЫ подсолнечника. Единственный цикл амплификаций с четырьмя праймерами представил продукты, необходимые для обнаружения трех возможных состояний зиготности: дикий тип, гетерозиготный и мутант (А122Т/А122Т). Поскольку локусы АНА8Ь1 и ЛНА8^2 идентичны в области, содержащей мутацию, был разработан ряд праймеров для специфической амплификаций локуса АНА8Б1 (см. ниже НА122СЕ и НА122СК). Кроме того, были созданы аллельспецифические праймеры для отжига/распространения специфически из единичного нуклеотида С в А, определяющие выбор соответствующего кодона от аланина до треонина. Специфический праймер аллеля дикого типа является обратным праймером. Таким образом, конечным основанием является С, как изображено ниже. Контрольная область794 пар оснований, сформированная с помощью НА122СЕ и НА122СЯ, получается независимо от оснований в месте мутации и служит в качестве позитивного контроля (фиг. 9).

Диагностическая область для состояния дикого типа, сформированная путем амплификаций праймерами НА122СЕ и НА122Ы, дала фрагмент из 258 пар оснований (фиг. 9). Этот праймер содержит преднамеренное ошибочное спаривание 4 оснований слева от фактической мутации, которое служит для придания повышенной специфичности для образцов дикого типа. Диагностическая область для мутантного состояния дала фрагмент из 576 пар оснований (фиг. 9). Продукт из 576 пар оснований сформирован при амплификаций с НА122ти1 и НА122СЯ и указывает на наличие мутантного аллеля. Специфический мутанту праймер содержит преднамеренное ошибочное спаривание 3 оснований слева от фактической мутации, которое служит для придания повышенной специфичности для мутантных образцов. Следовательно, образец, который является гетерозиготным для мутации, будет давать три полосы при визуализации с помощью электрофореза в агарозном геле, контрольную полосу и две диагностических полосы. А гомозиготный образец будет показывать две полосы. Гелевый образец зависит от сигнального основания в кодоне122. ПЦР праймеры приведены ниже.

Обычный прямой праймер (НА122СР):

5'СТТТСОСАТТАСССАТСАСТЗ¹ (8Еф ГО N0: 15)

Специфический праймер дикого типа (НА 122\νί):

5'ООТООАТСТССАТТААСОСЗ' (8Е() ГО N0:16)

Специфический мутантный праймер (НА122ти1):

5' ОССТАСССССОСТССАЗ' (8ЕЦ ГО ΝΟ: 17)

Обычный обратный праймер (НА122СК):

5’ СААААССООССТСТТСОСЗ’ (8ЕЦ ГО ΝΟ: 18)

Пример 8. Высокоолеиновые устойчивые к имидазолинону линии подсолнечника, экспрессирующие А122Т признак.

Были получены растения подсолнечника, которые экспрессируют ЛНА8^1 А122Т мутантный аллель (также известный как СЬНА-р1и8 признак), который придает высокие уровни устойчивости к имидазолиноновым гирбицидам растению подсолнечника и который продуцирует семена, содержащие экстрагируемое растительное масло, которое содержит по меньшей мере 85% олеиновой кислоты. Эти растения подсолнечника были получены с помощью обычных методик разведения через скрещивание 1М1устойчивой линии, полученной из СМ40, с высокоолеиновой (НО) линией (УВ141) и селекции по обоим признакам в Е2 и позднейших поколениях инбридинга с использованием молекулярных маркеров. СМ40 и другая линия подсолнечника, содержащая по меньшей мере одну копию ЛНА8^1 А122Т мутантного аллеля, СМ1606, описаны выше и в УО 2007005581. Семена СМ40 и СМ1606 были депонированы в АТСС и получили АТСС патентные депозитарные номера РТА-6716 и РТА-7606 соответственно.

Материалы

Линии ВТ1-ОБ-М1511, ВТ1-ОБ-М1709 и ВТ1-ОБ-2201 представляют собой три экспериментальные линии подсолнечника, отобранные по высокому содержанию олеиновой кислоты и их толерантности к имидазолинонам. УВ141, НА445 и ОВ712 представляют собой линии с высоким содержанием олеиновой кислоты, В770 и ВТК112 представляют собой две обычные линии и СМ40 представляет собой обычную А122Т линию.

Методы

Состав жирных кислот семян: все растения были выращены в полевых условиях в Лагуна Бланка (Формоза, Аргентина), следуя схеме полностью рандомизированных блоков с 3 повторами. 10 г семян каждого повтора использовали для анализа. Состав жирных кислот каждого образца определяли методом газовой хроматографии, следуя стандартным процедурам. Средние значения 3 повторов для каждого материала представлены в табл. 16.

Толерантность к имидазолинонам.

Семена девяти линий были высеяны в горшки в тепличных условиях. По меньшей мере 20 проростков из каждой линии были обрызганы на стадии У4 (8сйпейег & МШег, 1981) имазапиром в дозе 160 г/га. На четырнадцатый день после обработки каждое растение оценили фенотипически, используя показа

- 32 019952 тель фитотоксичности (ΡΙ). ΡΙ имеет фенотипическую шкалу от 0 до 9, по которой оценивали каждое растение путем визуального обследования. Растения без каких-либо симптомов регистрировали как 0, повышенные уровни низкорослости и пожелтения по сравнению с необработанными контрольными растениями регистрировали как 1-4, повышенные уровни дефектов листьев и некроза листьев регистрировали в интервале от 5 до 8, погибшие растения с полным некрозом до верхней точки регистрировали как 9.

Результаты

Высокоолеиновые линии показали содержание олеиновой кислоты в семенах в интервале от 85,79 до 88,97%, с другой стороны, обычные материалы показали значительно меньшее содержание (интервал: 18,62-24,2%). Линии ВТ1-ОЬ-М1511, ВТ1-ОЬ-М1709 и ВТ1-ОЬ-2201 показали концентрацию олеиновой кислоты в семенах от 89,58 до 90,83, аналогично полученному для НО линий (табл. 16).

Линии НА445, УВ141, ОВ712, В770 и ВТК112 были уничтожены при гербицидной обработке, в то время как линии ВТ1-ОЬ-М1511, ВТ1-ОЬ-М1709 и ВТ1-ОЬ-2201 показали уровень резистентности, аналогичный уровню, наблюдаемому для устойчивой линии ОМ40 (табл. 17).

Вывод: линии ВТ1-ОЬ-М1511, ВТ1-ОЬ-М1709 и ВТ1-ОЬ-2201 объединяют высокий уровень устойчивости к имидазолинонам и высокий уровень олеиновой кислоты в семенах.

Таблица 16. Состав жирных кислот семян 9 линий подсолнечника (каждое значение является средним из трех повторов).

	Линии
Состав масла	ВТ1-ОЬ-М1511	ВТ1-ОЬ-М1709	ВТ1-ОЬ-2201	УВ141	НА 445	ОВ712	6М40	В770	ВТК112
Миристиновая кислота (С 14:0)	0.018	0.023	0,02	0.014	0,01	0.02	0.09	0,08	0.1
Пальмитиновая кислота (С 16:0)	3.58	3.77	4.75	3.55	3.49	3.7	6.47	6.04	6.73
Стеариновая кислота (С 18:0)	1.13	1.68	0.18	1.82	3.2	1.85	4.71	4.71	4.48
Олеиновая кислота (€18:1)	90.83	89.58	89.81	88.97	85.79	87.58	21.24	24.2	18.62
Линолевая кислота (С 18:2)	2.86	3.07	3,65	3.91	5,63	5.15	65.85	63.41	68.25
Линоленовая кислота (С 18:3)	0.16	0.16	0,16	0.16	0.15	0.21	0.16	0.16	0 16
Арахидоновая кислота (С20:0)	0.09	0.14	0.09	0.2	0.21	0.17	0.21	0.26	0.23
Гадоленовая кислота (С20:1)	0.24	0.31	0,33	0.26	0.17	0.24	0.04	0.1	0.07
Бегеновая кислота(С22:0)	0.76	0.88	0,72	0.78	1.13	0.82	0,96	0.85	0.9
Лигноцериевая кислота (С24:0)	0.24	0.3	0.28	0.3	0.25	0.28	0.19	0.18	0.27
Сумма	99.9	99.9	100.0	100.0	100.0	100,0	99.9	100.0	99.8

Таблица 17. Средний показатель фитотоксичности 9 линий подсолнечника (каждое значение является средним из 20 репликаций).

	Линии
	ΒΤΙ-ΟΙ-Μ1511	ΒΤΙ-ΟΙ-ΜΙ709	ВТ1-ОЬ2201	УВ141	НА445	ОВ712	СМ40	В770	ВТК112
Показатель фитотоксичности
ΡΙ	0.5	0.2	0.2	8.5	8.8	9	0.2	8.7	9

Пример 9. Полевые испытания и оценка активности АНА8 для А122Т/А122Т, А205У/А205У и А122Т/А205У.

Полевые испытания были проведены в нескольких местах, чтобы определить сравнительные уровни толерантности к имидазолинону растений подсолнечника, которые представляют собой А122Т/А122Т, А122Т/А205У, или А205У/А205У для гена АНА8Ь1. Растения подсолнечника каждого различного генотипов были поражены различными дозами имазамокса и имазапира в условиях окружающей среды. Кроме того, определяли ίη νίΐτο активность АНА8 в присутствии возрастающих уровней гербицида для растений подсолнечника для каждого из трех генотипов подсолнечника.

Материалы и методы

Линия подсолнечника, ВТК47, специально отобранная по отсутствию Е-фактора (1тг1 1тг1/1тг2 1тг2) была подвергнута ЕМ8 мутагенезу семян. М₂₄ линия, которая выжила после полевой обработки имазапиром, была отобрана для последующего скрещивания и изучения ферментной активности. Эта линия была названа ОМ40.

Полевая оценка А122Т признака

122Т мутантный аллель был интрогрессирован в различные сохраняющие, реставрирующие и стерильные инбредные линии. Гомозиготная инбредная линия А122Т была скрещена с инбредной линией дикого типа (^Т) (не содержащей мутации толерантности к гербициду), гомозиготной инбредной линией А122Т или гомозиготной инбредной линией А205У для получения различных комбинаций зиготности мутантного аллеля Е1 (табл. 18). Эти образцы, наряду с различными регионально адаптированными СЕЕАКЕТЕЬП® А205У коммерческими образцами, были протестированы в полевых условиях на устойчивость к имидазолинону в ряде мест в Северной Америке, Юной Америке и Европе с 2005 по 2008 г. (табл. 19).

- 33 019952

Таблица 18. Перечень для полевой оценки толерантности к гербицидам (2007)

Позиция Описание линии Зиготность аллеля

АНАЗЫ

ОМ40 А122Т Гомозиготный οηΐδΟΜ40 χ Е733 А122Т Гомозиготный

СШ5ВТК47 χ К731 А122Т Гетерозиготный

ΙΑ9 χ К.733 ’ А22Т/А205У

ΙΑ9 χ КНА426 А205У Гомозиготный

Β7ίπιί (ΙΜΙδυΝΙ) А205У Гомозиготный стзВ7 χ КНА426 А205У Гетерозиготный

В7 ΨΤ

Таблица 19. Перечень мест полевой оценки толерантности к гербицидам (2005-2007)

Ближайший город,

Г од Страна штат или провинция

2005 США Велва, Северная Дакота

2005/2006 Аргентина (АК) Венадо Туэрто, Санта Фе

2006 США Велва, Северная Дакота

2006/2007 Аргентина Венадо Туэрто, Санта Фе

2006/2007 Аргентина Ва1сагсе, Буэнос-Айрес

2007 Аргентина Лагуна Бланка, Формоза

2007 США Велва, Северная Дакота

2007 США Хиксон, Северная Дакота

2007 Франция (РК) Анжер

2007 Франция 5а1п1ез

2007/2008 Аргентина Венадо Туэрто, Санта Фе

Сан Джеронимо, Санта

2007/2008 Аргентина

Фе

2007/2008 Аргентина Ва1сагсе, Буэнос-Айрес

Образцы в каждой местности в 2007 и 2007/2008гг. располагали по схеме рандомизированных двухфакторных разделенных делянок, состоящей из трех повторов (репликаций) для каждой комбинации обработки. Фактор А - гербицидная обработка (табл. 20), и фактор В - образец подсолнечника (табл. 18). Размер делянки составлял 2 ряда х 7 м, а норма высева соответствовала местной агрономической практике. Обработку гербицидом выполняли на стадии 2-4 листов с помощью закрепленных на тракторе бонов (20 галлонов/акр или 200 л/га). Обработку 2 проводили только в двух местностях во Франции.

Таблица 20. Список обработок имидазолиноном для полевых оценок толерантности к гербициду (2007)

Номер обработки	Обработка гербицидом	Форма гербицидного продукта
1	Без обработки
2	50 г аи/га имазамокса + 0.25% (об/об) N18*	Веуопб 120 г/л ЬС
3	100 г аи/га имазамокса + 0.25% (об/об) N18*	Веуопб 120 г/л ЬС
4	200 г аи/га имазамокса + 0.25% (об/об) N13*	Веуопб 120 г/л ЬС
5	160 г аи/га имазапира + 0.25% (об/об) N18*	Аг$епа1 240 г аи/л
6	320 г аи/га имазапира + 0.25% (об/об) N18*	Агвспа! 240 г аи/л

*ΝΙ8 = неионное поверхностно-активное вещество - 1пбисе 90ЗС (90%)

- 34 019952

Показатели повреждения растений (% фитотоксичности) оценивали на 6-10 дни после обработки и на 16-21 дни после обработки. Процент фитотоксичности записывали как среднее количество поврежденных растений на данной делянке, при этом показатель 0% указывал на отсутствие повреждений растений относительно необработанной делянки. Показатель от 10 до 40% указывал на повышенные уровни хлороза (причем 40% соответствовало полному пожелтению листьев). Показатель 50% или выше указывал, что растения продемонстрировали полное пожелтение, а также повышенные уровни некроза листьев. Показатель 100% указывал на полный некроз (гибель) растений.

Прорастание, дни начала цветения, дни окончания цветения и созревание также оценивались по каждой делянке в каждой местности (данные не указаны). Данные были подвергнуты ЛNΟУЛ анализу. Определение активности фермента АНА8

Двенадцать выращенных в теплице растений подсолнечника из каждой линии, указанной в табл. 21, собирали и подвергали анализу активности фермента ЛНЛ8 методом, описанным 81пдй е! а1. (1988) Апа1. Вюсйет. 171:173-179. Каждое определение активности повторяли дважды. Из-за большого числа образцов эксперимент разделили на 2 блока (табл. 21).

Таблица 21. Описания линий и соответствующих зиготностей аллелей мутации АНЛ8^1

Этап	Описание линии	Зиготность аллеля АН АЗЫ
1	СШ6ОМ40 х К733	А122Т гомозиготный
1	1А9 х К733	Α122Ί7Α205ν гетерозиготный
1	ΙΑ9 х КНА426	А205У гомозиготный
1	В7	\ντ
2	ОМ40	А122Т гомозиготный
2	стзВТК47 х К.731	А122Т гетерозиготный
2	Β7ίηύ (ΙΜΙδυΝΙ)	А205У гомозиготный
2	СШ5В7 х КНА426	А205У гетерозиготный
2	В7	χντ

Молодые, активно растущие листья из четырехнедельных проростков измельчали в ступке пестиком в жидком Ν₂, экстрагировали буфером, состоящим из 100 мМ соли пировиноградной кислоты, 200 мМ ΚΠ^Ο^ 20 мМ МдС1₂, 2 мМ тиамина пирофосфата и 20 мкМ флавин аденин динуклеотида. Растительные экстракты затем попускали через 10 мл 2еЬа ТМ опреснительную делительную колонку (Р1егсе #89893) в соответствии с рекомендациями производителя. Анализ ингибирования выполняли, как описано в 8тдй е! а1. (1988) Апа1. Вюсйет. 171:173-179. Анализы проводили в 96-луночном формате. 50 мкл ингибитора добавляли в каждую лунку, содержащую 50 мкл растворимого белкового экстракта, до получения конечных концентраций 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкМ имазамокса или 0.78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкМ имазапира. Нулевой гербицидный контроль также включен для каждой линии. Реакции проводились, как указано 8тдй е! а1. (1988) Апа1. Вюсйет. 171:173-179. Оптическую плотность измеряли при 530 нм. Активность АНА8, выраженная как среднее значение оптической плотности для каждой обработки, была представлена как процент от среднего значения контроля в отсутствие гербицида.

Результаты и обсуждение

В толерантных к гербициду культурах фенотип повреждения культуры можно отнести на счет взаимодействия генотипа с окружающей средой (ОхЕ). Компонент окружающей среды для толерантности к гербициду означает сумму абиотических (т.е. погода, почва) и биотических факторов (т.е. насекомые, болезни и сорняки), связанную с влиянием дозы гербицида. Пример этого влияния окружающей среды показан на фиг. 10, где продемонстрированы вариации фитотоксичности одного и того же генотипа, выращенного в четырех разных местностях (Уе1уа, ΝΌ, и8А; Апдегк, РВ; 8айИе5 РВ; Рогтока, АВ) при одной и той же дозе нанесения (200 г аи/га имазамокса). Генотипический фактор у толерантного к гербициду (НТ) растения означает сумму НТ гена(ов) плюс остаточная генетическая среда и взаимодействие между ними.

Для оценки НТ генов по их уровню относительной толерантности использовали два подхода. Первый подход измерял вред гербицида при условиях окружающей среды (местоположение и годы в комбинации с различными дозами гербицида), а второй подход тестировал целевой фермент (ίη νίΐτο) с возрастающими уровнями гербицида. Используя первый подход, мы количественно оценили фактор окружающей среды, связанный с этим признаком, путем расчета среднего показателя (ΤΙ) коммерческих, регионально адаптированных, А205У контрольных образцов на 6-10 дни после гербицидной обработки. Значения РI для различных гибридов, несущих А122Т мутацию, располагали против значений РI для А205У образцов, чтобы оценить относительный уровень устойчивости новой мутации к условиям окружающей среды (фиг. 11 и 12). Как видно по оси х фиг. 11 и 12, комбинация местоположения с дозами гербицида

- 35 019952 привела к различным условиям окружающей среды, которые колебались по средним значениям Р1 от 5.9 до 78 при обработках имазамоксом; и от 2 до 100 при обработках имазапиром. Линия у=х, представляющая среднее значение Р1 для А205У образцов, пересекает все компоненты окружающей среды.

Результаты, полученные после обработок имазамоксом, показаны на фиг. 11. А122Т гомозиготные гибриды показали возрастание Р1, когда компонент окружающей среды становился более суровым. Однако наклон линии регрессии (Ь= 0.149± 0.0667, Р<0.0375) показал, что уровень повреждения культуры как функция суровости окружающей среды возрастает при меньшей дозе, чем у образцов А205У. Гибриды, которые объединили А122Т мутацию с А205У аллелем в гетерозиготном состоянии, показали ответ на условия окружающей среды (Ь=0.39±0.05, Р<0.0001), схожий с А122Т гибридами в гомозиготном состоянии. С другой стороны гибриды, содержащие А122Т мутацию в гетерозиготном состоянии (А122Т/АТ), демонстрировали более высокие показатели поражения культуры, чем А205У образцы, при меньших уровнях строгости окружающей среды, как показывает больший отрезок, отсекаемый на оси у от начала координат, линии регрессии (а=15.3±2.67). Когда суровость компонента окружающей среды возросла, эти А122Т гетерозиготные гибриды показали лучшую продуктивность, чем А205У образцы, как показывает наклон его линейного уравнения (Ь=0.45±0.062, Р<0.0001). Одинаковое нанесение на фиг. 12, когда одинаковые типы в одинаковых условиях повреждались имазапиром.

Суровость условий окружающей среды при обработке имазапиром может быть суммирована путем суммирования регрессий для каждого генотипа на фиг. 12.

Чтобы обосновать эффект толерантности к гербициду, наблюдаемый в поле, комбинации генов с одинаковой толерантностью к гербициду были подвергнуты изучению ингибирования фермента АНАБ. Эти исследования были поведены на основе 12 отдельных экземпляров из каждой позиции табл. 18. Средние значения двух репликаций представлены на фиг. 13 для первого эксперимента (блок 1, табл. 21) и на фиг. 14 для второго эксперимента (блок 2, табл. 21). Необработанный контрольный образец был включен для обеспечения базового уровня 100% активности фермента АНАБ. Активность АНАБ в А122Т гомозиготном гибриде, обработанном 100 мкМ имазамокса, была 69% от необработанного контрольного образца, а для 100 мкМ имазапира она составляла 64% от необработанного контрольного образца (фиг. 13). Активность фермента АНАБ в А122Т/А205У гетерозиготном гибриде составляла 59 и 60% для экстрактов, обработанных 100 мкМ имазамокса и 100 мкМ имазапира соответственно (фиг. 13). Линия А205У гомозиготных гибридов, которая является действующим коммерческим А205У продуктом, продемонстрировала активность АНАБ 36% от необработанного контрольного образца и 42% от необработанного контрольного образца при 100 мкМ имазамокса и 100 мкМ имазапира соответственно (фиг. 13), меньшую, чем активность А122Т гомозиготного гибрида и А122Т/А205У гетерозиготного гибрида.

Во втором блоке данных А205У гомозиготные гибриды выступают почти идентично с А122Т гетерозиготными гибридами (фиг. 14). Оба типа гибридов продемонстрировали активности АНАБ 30% при 50 мкМ имазамокса, тогда как А205У гибрид имел активность 26% при 100 мкМ имазамокса и А122Т гетерозиготный гибрид имел активность 30% при 100 мкМ имазамокса. Наоборот, экстракт фермента АНАБ из А122Т гомозиготного гибрида демонстрировал меньшую величину ингибирования при увеличивающихся уровнях имазамокса, проявляя активности 63 и 60% относительно необработанного контрольного образца, при 50 мкМ и 100 мкМ имазамокса соответственно (фиг. 14). Линия АТ (В7) была генотипически идентична в обоих экспериментах и продемонстрировала дисперсию активности 6% при уровне имазамокса 100 мкМ между двумя экспериментами (17% активность АНАБ относительно необработанного контрольного образца в блоке 1 (фиг. 13) и 11% активность АНАБ относительно необработанного контрольного образца в блоке 2 (фиг. 14).

На основании полевых данных и данных активности фермента АНАБ было определено, что новая А122Т мутация придает значительно большую толерантность к гербициду ряда имидазолинонов в сравнении с известной А205У мутацией. Коммерческие уровни устойчивости к гербициду в А205У подсолнечниках требуют комбинации двух генетических факторов в гомозиготном состоянии из-за умеренного уровня устойчивости, обеспечиваемого 1тг1. Наоборот, при использовании единственной А122Т мутации 1тг2 энхансер (или ген для взаимодействия генотипов) оказывается не длиннее необходимого для достижения коммерческих уровней толерантности. Наиболее важно, что результаты показывают, что А122Т может быть использован как признак НТ гомозиготного единичного гена или как гетерозиготный набор вместе с признаком НТ А205У, обеспечивающий повышенные уровни толерантности, большую гибкость в контроле сорняков и облегчающий введение этой новой мутации в продукционную систему С^ЕΛΚΡIЕ^^ Ргойисйоп БуЧет.

Все публикации и патентные заявки, указанные в описании, показывают уровень техники, к которому это изобретение принадлежит. Все публикации и патентные заявки включены здесь с помощью ссылки в том же объеме, если каждая индивидуальная публикация или патентная заявка были специально и индивидуально указаны, как включенные с помощью ссылки.

Хотя вышеупомянутое изобретение было описано в некоторых подробностях с помощью иллюстраций и примеров с целью ясности понимания, должно быть очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть выполнены в объеме прилагаемой формулы изобретения.

- 36 019952

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Зала, Карлос

Булос, Мариано

Эхартэ, Мариель

Зинг, Виджай К.

Вестон, Брижит Дж.

Витт, Шери Р.

<120> УСТОЙЧИВЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ РАСТЕНИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА С МНОЖЕСТВЕННЫМИ УСТОЙЧИВЫМИ К ГЕРБИЦИДАМ АЛЛЕЛЯМИ АНА5Ы И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ <130> 038867/339058 <150> США 60/910,041 <151> 2007-04-04 <150> США 61/029,737 <151> 2008-02-19 <160> 24 <170> РазРЗЕО Рог Итпйоыз Уетздоп 4.0 <210> 1 <211> 22 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер <400> 1

РРссРссссс дсРссдсаРР ас <210> 2 <211> 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер <400> 2 сдссдсссбд СРсдСдас <210> 3 <211> 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер <400> 3

РдРРсРсРсс дасРсРаа <210> 4 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность

- 37 019952 <220>

<223> ГЩР праймер <400> 4

РддРддаЬсЕ ссаРЬдадРс <210> <211 > <212> <213>

ДНК

Синтетическая последовательность <220>

<223>

ПЦР праймер рддрддагсг ссаРРдадРР <4О0>

<210>

<211>

<212>

<213>

195

ДНК

Не11апРйиз аппипз <220>

<221>

<222>

<223>

тп1зс_£еасиге (1)...(195)

Нар1 <4 О 0 >

б

РдРСсРсбсс ддрдсадссЬ ддрддаадср ааЬддадаРс дасРссаааЬ ЬРРдРсРссс срддаасддд сасса ссассассас дррасдсдсс ааддрдрсас сассассасс адаРсаассд сдасдРсРРс ассасСсаас адааааддсд дссРассссд дассдССасс садасдРдРР дсддсдсдрс

120

180

195 <210> <211> <212> <213>

192

ДНК

Не11апС11и£ аппииз <220>

<221>

<222>

<223>

<4О0>

РдРРсРсРсс дсадссРРРЬ ддаадсРсРд ддадаРссас дасРссаааР дРсСсссддР даасдддаад са ссассассас асдсдссада дрдрсассда сассассасс Ьсаассдада сдРсРРсдсс асСсаассас аааддсдсад

Сассссддсд сдЕРасаддс асдрдррддр дсдсдСсааР

120

180

192 <210>

<211>

<212>

<21 3>

204

ДНК

Не11апРйи5 аппииз <220>

<221>

<222>

<223>

<400>

РдССсРсРсс ассдРРасад адасдРдРРд сддсдсдРса дасРссаааР дсдсадссРЬ дЪддаадсРс аРддадаРсс ссассассас ЫдОсСсссд Рддаасддда асса сассассасс

РСасдсдссР аддРдРсасс ассассасса дарсаассда дасдРсРРсд ссасЬсаасс дааааддсдс ссРассссдд

120

180

204

- 38 019952 <210> 9 <211> 186 <212> ДНК <213> Не11ап1:Ьиз аппииз

<210> 13 <211> 20 <212> ДНК <213> Не11апТНиз аппииз <220>

<221> аллель

- 39 019952 <222> (1)...(20) <223> аллель дикого типа <400> 13 дсд^сааСдд аданссасса 20 <210> 14 <211> 20 <212> ДНК <213> НеИапРЬид аппииз <220>

<221> аллель <222> (1)...(10) <223> мутантный аллель; позиция 1 сайта 5ΝΡ <400> 14 асдДсааЬдд адаЪссасса 20 <210> 15 <211 > 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер НА122СН <400> 15 дЕЬДсдсаРЕ асссабсасб 20 <210> 16 <211> 19 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер НА122ыД <400> 16 дддддаосбс са-Цаасдс 19 <210> 17 <211> 16 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер НА122ти6 <400> 17 дссбассссд дсгдса 16 <210> 18 <211> 18 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> ПЦР праймер НА122СК.

<400> 18 саааассддс сбсббсдс 18 <210> 19

- 40 019952 <211> 1178 <212> ДНК <213> Не11апкЬиз аппииз <220>

<221> СОЗ <222> (3) ... (1178) <400> 19 кс 21с дес кас ссс ддс ддс асд кса акд дад акс сас саа дек скс 47

РЬе А1а Туг Рго б1у С1у ТЬг Зег Мек К1и Не Ηϊε С1п А1а Ьеи

10 15

асд ТЬг

сдс Агд

кса Зег

аде Зег

аск ТЬг 20

акс Не

сдс Агд

аак Азп

дкд ν3ι

скс Ьеи 25

ссс Рго

едк Агд

сас

даа С1и

сад С1п 30

ддс С1у

95

ддс

дкд

ккс

дсс

дсс

даа

ддс

кас

дед

сдс

дсс

ксс

ддк

екк

ссс

ддс

143

31у

Уа1

РЬе

А1а

А1а

б1и

С1у

туг

А1а

Агд

А1а

Зег

б1у

Ьеи

Рго

С1у

35

40

45

дкд

кдк

акс

дсс

аск

кос

ддк

ссс

дда

дек

асд

аас

ска

дкк

адк

ддк

191

Уа1

Суз

Не

А1а

ТЬг

Зег

С1у

Рго

С1у

А1а

ТЬг

Азп

Ьеи

νθ1

Зег

С1у

50

55

60

скк

дек

дас

дед

скд

кка

дас

адк

дке

ссс

акд

дкд

дса

акс

асе

ддк

239

Ьеи

А1а

Азр

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

Уа1

Рго

Мек

Уа1

А1а

Не

ТЬг

С1у

65

70

75

саа

дкк

ссс

едд

ада

акд

акс

дда

асе

дак

дед

ккк

саа

даа

асе

сса

287

51п

Уа1

Рго

Агд

Агд

Мек

11е

С1у

ТЬг

Азр

А1а

РЬе

61п

С1и

ТЬг

Рго

80

85

90

95

ай

дЫ

дад

дка

аса

едк

кед

акс

аск

ааа

сак

аак

как

скк

дкд

ккд

335

11е

Уа1

С1и

Уа1

ТЬг

Агд

Зег

11е

ТЬг

Ьуз

Н13

Азп

Туг

Ьеи

Уа1

Ьеи

100

105

но

дак

дкк

дад

дак

акк

ссс

ада

акк

дкк

едк

дад

дек

ккк

как

скк

дед

383

Азр

Уа1

С1и

Азр

Не

Рго

Агд

Не

Уа1

Агд

С1и

А1а

РЬе

Туг

Ьеи

А1а

115

120

125

адк

кед

ддк

еда

ссс

ддс

ссд

дкк

ккд

ака

дак

дка

ссд

ааа

дак

ака

431

Зег

Зег

С1у

Агд

Рго

61у

Рго

Уа1

Ьеи

Не

Азр

νάΐ

Рго

Ьуз

Азр

Не

130

135

140

сад

саа

сад

кка

дкд

дкд

ссд

ааа

кдд

дак

даа

ссд

акд

адд

кка

ссд

479

С1п

С1п

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

61и

Рго

Мек

Агд

Ьеи

Рго

145

150

155

ддк

как

ккд

кек

ада

акд

ссд

аад

сек

саа

как

дак

ддд

сак

ккд

даа

527

С1у

Туг

Ьеи

Зег

Агд

Мек

Рго

Ьуз

Рго

С1п

Туг

Азр

С1у

ΗΪ3

Ьеи

С1и

160

165

170

175

сад

акк

дкк

адд

ккд

дкд

ддд

даа

дед

аад

адд

ссд

дкк

ккд

как

дкд

575

61п

Не

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

61у

31и

А1а

Ьуз

Агд

Рго

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

180

185

190

ддк

ддк

ддд

кдк

ккд

аак

кед

дак

дак

дад

ккд

адд

сдд

ккк

дкд

дад

623

С1у

С1у

51у

Суз

Ьеи

Азп

Зет

Азр

Азр

С1и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

νβΐ

С1и

195

200

205

скк

асд

ддд

акк

ссд

дкк

дед

адк

аск

ккд

акд

ддд

скс

дда

дед

кас

671

Ьеи

ТЬг

31у

11е

Рго

Уа1

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

Мек

61у

Ьеи

61у

А1а

Туг

210

215

220

- 41 019952

сер Рго

дсР А1а 225

есд Зег

аде Зег

дае Азр

еед Ьеи

есд Зег 230

сее Ьеи

сае Н1з

аРд Мер

сее Ьеи

ддд 61у 235

аРд Мер

саР Н13

ддр С1у

асд ТНг

719

дрр

ЬаР

дед

ааР

РаЬ

дед

дрр

дар

аад

адр

дар

РРд

РРд

сРЬ

дед

еее

7 67

Уа1

Туг

А1а

Азп

Туг

А1а

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

РНе

240

245

250

255

ддд

дед

едд

еер

дае

дае

еде

дед

асд

ддд

аад

СРР

дад

дед

РРТ

дсР

815

С1у

Уа1

Агд

РЬе

Азр

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

С1у

Ьуз

Ьеи

С1и

А1а

РНе

А1а

260

265

270

адР

адд

дед

аад

аее

дрр

сае

аее

дар

аРР

дар

ССР

дсР

даа

аРР

ддд

863

Зег

Агд

А1а

Ьуз

Не

Уа1

Н13

Не

Азр

Т1е

Азр

Рго

А1а

С1и

Пе

С1у

275

280

285

аад

ааР

аад

сад

ссР

саЬ

дед

Рсд

аее

РдР

ддр

дае

аСР

аад

дрс

дед

911

Ьуз

Азп

Ьуз

С1п

Рго

Н15

Уа1

Зег

Не

Суз

01 у

Азр

11е

Ьуз

Уа1

А1а

290

295

300

РРа

сад

ддЬ

еед

аас

аад

аее

РРд

дад

даа

аад

ааР

есд

дед

асе

ааР

959

Ьеи

С1п

С1у

Ьеи

Азп

Ьуз

Не

Ьеи

С1и

С1и

Ьуз

Азп

Зег

νβΐ

ТНг

Азп

305

310

315

сРР

дар

ьее

Род

асе

Одд

ада

аад

даа

РРд

дар

даа

саа

ά

ард

аад

1007

Ьеи

Азр

РНе

Зег

ТЬг

Тгр

Агд

Ьуз

С1и

Ьеи

Азр

С1и

С1п

Ьуз

Мер

Ьуз

320

325

330

335

рес

ссд

еед

аде

ее е

ааа

асд

ере

ддс

даа

дед

аРР

ссе

сса

сад

1аР

1055

РЬе

Рго

Ьеи

Зег

РЬе

Ьуз

ТЬг

РЬе

С1у

С1и

А1а

Пе

Рго

Рго

С1п

Туг

340

345

350

дсР

арр

саа

дее

сее

дар

дад

РРа

асд

ддс

ддд

ааР

дса

аРР

аРР

аде

1103

А1а

Не

С1п

Уа1

Ьеи

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

С1у

31у

Азп

А1а

Не

Не

Зег

355

360

365

асе

дде

дес

ддд

саа

саР

сад

аРд

Ьдд

дсР

дсР

сад

еее

Рас

ааа

Рас

1151

ТЬг

б1у

νβΐ

С1у

С1п

Н13

С1п

Мер

Тгр

А1а

А1а

С1п

РЬе

Туг

Ьуз

Туг

370

375

380

аас

ааа

ссе

ада

саа

едд

ерд

асд

есд

1178

Азп

Ьуз

Рго

Агд

С1п

Тгр

Ьеи

ТЬг

Зег

385 390 <210> 20 <211> 392 <212> РКТ <213> Не1д.апЬЬиз аппииз <400> 20

РЬе 1

А1а

Туг

Рго

С1у 5

61у

ТНг

Зег

Мер

С1и 10

Не

Н13

31п

А1а

Ьеи 15

ТНг

Агд

Зег

Зег

ТНг

11е

Агд

Азп

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

Н13

С1и

С1п

С1у

С1у

20

25

30

Уа1

РНе

А1а

А1а

01и

С1у

Туг

А1а

Агд

А1а

Зег

61у

Ьеи

Рго

С1у

Уа1

35

40

45

Суз

Не

А1а

ТИг

Зег

С1у

Рго

С1у

А1а

ТИг

Азп

Ьеи

Уа1

Зег

С1у

Ьеи

50

55

60

А1а

Азр

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

7а1

Рго

Мер

Уа1

А1а

11е

ТЬг

С1у

С1п

65

70

75

80

Уа1

Рго

Агд

Агд

Мер

Не

С1у

ТНг

Азр

А1а

РНе

С1п

С1и

ТЬг

Рго

11е

85

90

95

- 42 019952

Уа1

С1и

Уа1

ТИг 100

Агд

Зег

Не

ТНг

Ьуз 105

Н13

Азп

Туг

Ьеи

Уа1 110

Ьеи

Азр

Уа1

С1и

Азр

11е

Рго

Агд

Не

Уа1

Агд

С1и

А1а

РНе

Туг

Ьеи

А1а

Зег

115

120

125

Зег

С1у

Агд

Рго

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

11е

Азр

Уа1

Рго

Ьуз

Азр

Не

С1п

130

135

140

С1п

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

С1и

Рго

Мер

Агд

Ьеи

Рго

С1у

145

150

155

160

Туг

Ьеи

Зег

Агд

Мес

Рго

Ьуз

Рго

С1п

Туг

Азр

С1у

Низ

Ьеи

С1и

С1п

165

170

175

Не

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

С1у

С1 и

А1а

Ьуз

Агд

Рго

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

С1у

100

185

190

С1у

С1у

Суз

Ьеи

Азп

Зег

Азр

Азр

С1и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

7а1

С1и

Ьеи

195

200

205

ТНг

С1у

Не

Рго

Уа1

А1а

Зег

ТНг

Ьеи

Мер

СЬу

Ьеи

С1у

А1а

Туг

Рго

210

215

220

А1а

Зег

Зег

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Η1Ξ

МеС

Ьеи

С1у

Мес

Η1Ξ

С1у

ТНг

Уа1

225

230

235

240

Туг

А1а

Азп

Туг

А1а

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

С1у

245

250

255

Уа1

Агд

РЬе

Азр

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

С1у

Ьуз

Ьеи

С1и

А1а

РЬе

А1а

Зег

260

265

270

Агд

А1а

Ьуз

Не

Уа1

Н13

11е

Азр

Не

Азр

Рго

А1а

С1и

Не

С1у

Ьуз

275

200

285

Азп

Ьуз

С1п

Рго

Н13

Уа1

Зег

Не

Суз

С1у

Азр

11е

Ьуз

Уа1

А1а

Ьеи

290

295

300

С1п

С1у

Ьеи

Азп

Ьуз

Не

Ьеи

СЬи

С1и

Ьуз

Азп

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

Ьеи

305

310

315

320

Азр

РЬе

Зег

ТНг

Тгр

Агд

Ьуз

Й1и

Ьеи

Азр

31и

С1п

Ьуз

Меб

Ьуз

РНе

325

330

335

Рго

Ьеи

Зег

РНе

Ьуз

ТНг

РНе

СЬу

С1и

А1а

Не

Рго

Рго

С1п

Туг

А1а

34 0

345

350

11е

С1п

Уа1

Ьеи

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

С1у

С1у

Азп

А1а

Не

Не

Зег

ТИг

355

360

365

С1у

Уа1

С1у

61п

Н15

С1п

МеС

Тгр

А1а

А1а

С1п

РЬе

Туг

Ьуз

Туг

Азп

370

375

380

Ьуз

Рго

Агд

С1п

Тгр

Ьеи

ТНг

Зег

385 390 <210> 21 <211> 1716 <212> ДНК <213> Не11апЫ1из аппииз <220>

<221> СРЗ <222> (1)...(1716) <400> 21

дса А1а 1

дас Азр

дрд Уа1

ССд Ьеи

Уа1 5

даа С1и

дсС А1а

сСд Ьеи

даа С1и

едд Агд 10

даа 31и

ддЬ С1у

дЬс Уа1

асе ТЬг

дас Азр 15

дЬс Уа1

1:с

дсс

Нас

ОСС

ддс

ддс

дед

Ьса

аЬд

дад

абс

сас

саа

дек

сСс

асд

РНе

А1а

Туг

Рго

С1у

С1у

А1а

Зег

Мер

С1и

11е

Н1з

С1п

А1а

Ьеи

ТЬг

20

25

30

сдс

Ьса

аде

асе

асе

сдс

ааь

дед

сьс

ссс

Сд1:

сас

даа

сад

ддс

ддс

Агд

Зег

Зег

ТНг

Не

Агд

Азп

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

Η1Ξ

С1и

С1п

С1у

С1у

35

40

45

дрд

ЬЬс

дсс

дсс

даа

ддс

Рас

дед

сдс

дсс

Ссс

ддб

СП

ссс

ддс

дрд

Уа1

РЬе

А1а

А1а

61и

О1у

Туг

А1а

Агд

А1а

Зег

С1у

Ьеи

Рго

С1у

Уа1

- 43 019952

55 60

Сдб Суз 65

абс 11е

дсс А1а

асб ТЬг

Ссс Зег

ддб С1у 70

ссс Рго

дда С1у

дсб А1а

асд ТЬг

аас Азп 75

сба Ьеи

дбб Уа1

адб Зег

ддб С1у

ебб Ьеи 80

240

дсб

да с

дед

ебд

бба

дас

адб

дбе

ссс

абд

дбд

дса

абс

асе

ддб

саа

288

А1а

Авр

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

Уа1

Рго

Меб

Уа1

А1а

Не

ТЬг

С1у

С1п

85

90

95

дбб

сбс

едд

ада

аСд

аСс

дда

асе

даб

дед

ббб

саа

даа

асе

сса

абс

336

Уа1

Ьеи

Агд

Агд

Меб

11е

С1у

ТЬг

Азр

А1а

РЬе

С1п

С1и

ТЬг

Рго

11е

100

105

но

дбб

дад

дба

аса

сдС

бед

абс

асб

ааа

саб

ааб

Саб

ебб

дбд

Сбд

даб

384

Уа1

С1и

Уа1

ТЬг

Агд

Зег

11е

ТЬг

Ьуз

Н13

Азп

Туг

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азр

115

120

125

дбб

дад

даб

аб б

ссс

ада

абб

дбб

едб

дад

дсб

ббб

Саб

ебб

дед

адб

432

Уа1

С1и

Азр

11е

Рго

Агд

11е

Уа1

Агд

С1и

А1а

РЬе

Туг

Ьеи

А1а

Зег

130

135

140

бед

ддб

еда

ссс

ддс

ссд

дбб

Сбд

аба

даб

дба

ссд

ааа

даб

аса

сад

480

Зег

С1у

Агд

Рго

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

Т1е

Азр

Уа1

Рго

Ьуз

Азр

Т1е

С1п

145

150

155

160

саа

сад

ССа

дбд

дбд

ссд

ааа

бдд

даб

даа

ссд

абд

адд

бба

ссд

ддь

528

С1п

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

01и

Рго

Меб

Агд

Ьеи

Рго

С1у

165

170

175

Саб

«9

СсС

ада

абд

ссд

аад

ссб

саа

баб

даб

ддд

саб

Сбд

даа

сад

576

Туг

Ьеи

Зег

Агд

Меб

Рго

Ьуз

Рго

С1п

Туг

Азр

С1у

Н1з

Ьеи

С1и

Е1п

180

185

190

абб

деь

адд

ССд

дбд

ддд

даа

дед

аад

адд

ссд

дбб

ббд

Саб

дбд

ддб

624

Не

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

А1а

Ьуз

Агд

Рго

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

61у

195

200

205

ддб

ддд

бдб

ббд

ааб

бед

даб

даб

дад

ббд

адд

едд

ббб

дбд

дад

ебб

672

С1у

С1у

Суз

Ьеи

Азп

Зег

Азр

Азр

61и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

Уа1

(Ни

Ьеи

210

215

220

асд

ддд

аСС

сед

дСС

дед

адб

асб

ббд

абд

ддд

сбе

дда

дед

бас

ссб

720

ТЬг

Й1у

11е

Рго

Уа1

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

Меб

С1у

Ьеи

С1у

А1а

Туг

Рго

225

230

235

240

дсб

Ссд

адб

даб

ббд

бед

ебб

саб

абд

ебб

ддд

абд

саб

ддб

асд

дбб

768

А1а

Зег

Зег

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Ηίδ

Меб

Ьеи

С1у

Меб

Н1з

С1у

ТЬг

Уа1

245

250

255

бас

дед

ааб

баб

дед

дбб

даб

аад

адб

даб

ббд

ббд

ебб

дед

Сбб

ддд

816

Туг

А1а

Азп

Туг

А1а

Уа1

Азр

ьуз

Зег

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

Й1у

260

265

270

дед

едд

ССС

даб

даб

едб

дбд

асд

ддд

аад

ебб

дад

дед

ббб

дсб

адб

864

Уа1

Агд

РНе

Азр

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

С1у

Ьуз

Ьеи

С1и

А1а

РЬе

А1а

Зег

275

280

285

адд

дед

аад

аСС

дбб

саб

аб!

даб

абб

даб

ссб

дсб

даа

аи

ддд

аад

912

Агд

А1а

Ьуз

Пе

Уа1

Н1з

11е

Азр

Пе

Азр

Рго

А1а

61и

11е

С1у

Ьуз

290

295

300

ааб

аад

сад

ссб

саб

дбд

бед

абб

бдб

ддб

даб

абб

аад

дбе

дед

бба

960

Азп

Ьуз

С1п

Рго

ΗΪΒ

Уа1

Зег

11е

Суз

С1у

Азр

11е

Ьуз

Уа1

А1а

Ьеи

- 44 019952

305

ЗЬО

315

320

сад

ддр

ссд

аас

аад

асе

сед

дад

даа

аад

аас

Ссд

дед

асС

ааб

сСС

1008

С1п

СЬу

Ьеи

Азп

Ьуз

Не

Ьеи

СЬи

СЬи

Ьуз

Азп

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

Ьеи

325

330

335

даС

ссс

Сед

асе

Сдд

ада

аад

даа

сед

даС

даа

саа

ааа

аСд

аад

ббс

1056

Азр

РЬе

Зег

ТЬг

Тгр

Агд

Ьуз

СЬи

Ьеи

Азр

СЬи

СЬп

Ьуз

МеС

Ьуз

РЬе

340

345

350

ссд

еед

аде

ССС

ааа

асд

ССС

ддс

даа

дед

асе

ссб

сса

сад

Саб

дсС

1104

Рго

Ьеи

Зег

РЬе

Ьуз

ТЬг

РЬе

СЬу

СЬи

АЬа

11е

Рго

Рго

СЬп

Туг

АЬа

355

360

365

аСС

саа

дСС

сСС

даб

дад

Сба

асд

ддс

ддд

ааб

дса

абб

абб

аде

асе

1152

Не

СЬп

УаЬ

Ьеи

Азр

СЬи

Ьеи

ТЬг

СЬу

С1у

Азп

АЬа

11е

ЬЬе

5ег

ТЬг

370

375

380

ддр

дбе

ддд

саа

саб

сад

абд

Сдд

дсС

дсС

сад

ССС

Сас

ааа

бас

аас

1200

СЬу

УаЬ

СЬу

СЬп

Низ

СЬп

МеС

Тгр

АЬа

АЬа

СЬп

РЬе

Туг

Ьуз

Туг

Азп

385

390

395

400

ааа

ССР

ада

саа

сдд

сед

асд

Ссд

ддс

ддд

сба

ддд

дса

абд

ддб

ббс

1248

Ьуз

Рго

Агд

СЬп

Тгр

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬу

СЬу

Ьеи

СЬу

АЬа

МеС

СЬу

РЬе

405

410

415

ддс

ебд

ссс

дсС

дсС

аСс

ддд

дед

дсс

дСС

дса

ада

ссб

даб

дед

дса

1296

СЬу

Ьеи

Рго

АЬа

АЬа

11е

61у

АЬа

АЬа

УаЬ

АЬа

Агд

Рго

Азр

АЬа

Уа1

420

425

430

дСа

дСС

дас

аСс

дас

ддС

дас

дда

аде

ССС

аСд

аСд

ааС

дСб

саа

дад

1344

Уа1

УаЬ

Азр

ЬЬе

Азр

СЬу

Азр

СЬу

Зег

РЬе

МеС

МеС

Азп

УаЬ

СЬп

С1и

435

440

445

ССа

дсс

аса

аСс

сдС

дСС

даа

ааС

сСд

ссд

дСС

аад

аСС

Сба

Сба

ебб

1392

Ьеи

АЬа

ТНг

1Ье

Агд

УаЬ

СЬи

Азп

Ьеи

Рго

УаЬ

Ьуз

1Ье

Ьеи

Ьеи

Ьеи

450

455

460

аас

аас

сад

саС

ССд

ддб

аСд

дбд

дес

сад

Сдд

дад

даС

сдд

ббб

Сас

1440

Азп

Азп

СЬп

Н15

Ьеи

СЬу

МеС

УаЬ

УаЬ

СЬп

Тгр

СЬи

Азр

Агд

РЬе

Туг

4 65

470

475

480

аад

дед

ааб

сдд

дсб

саб

асе

Сас

ССа

дда

аас

ссд

Сса

ааа

дад

Ссд

1488

Ьуз

АЬа

Азп

Агд

АЬа

Н15

ТЬг

Туг

Ьеи

СЬу

Аэп

Рго

8ег

Ъуз

СЬи

Зег

485

490

495

даа

аба

ССс

ссС

аас

аСд

дед

аад

ССС

дсС

даа

дсс

еде

даб

абс

ссд

1536

СЬи

11е

РЬе

Рго

Азп

МеС

УаЬ

ьуз

РЬе

АЬа

СЬи

АЬа

Суз

Азр

11е

Рго

500

505

510

дсб

дсб

еда

дед

асе

саа

аад

дед

даС

сба

еда

дса

дсС

абб

сад

аад

1584

АЬа

АЬа

Агд

УаЬ

ТЬг

СЬп

Ьуз

АЬа

Азр

Ьеи

Агд

АЬа

АЬа

11е

С1п

Ьуз

515

520

525

абд

ССд

даб

аса

ссс

ддд

ссб

Сас

Сбд

сед

да С

дбд

абб

дбд

ссд

саб

1632

Мек

Ьеи

Азр

ТЬг

Рго

СЬу

Рго

Туг

Ьеи

Ьеи

Азр

УаЬ

I Ье

Уа1

Рго

Н1з

530

535

540

саа

даа

сас

дед

ссд

ссс

асд

абс

ссд

дсб

ддс

дда

ддс

ббс

Ссд

дас

1680

СЬп

СЬи

Н15

Уа1

Ьеи

Рго

МеС

Ь Ье

Рго

АЬа

СЬу

СЬу

СЬу

РЬе

Зег

Азр

545

550

555

560

дед

аСс

асе

дад

дд^

дас

ддс

ада

асд

ааа

СаС

бда

1716

УаЬ

11е

ТЬг

СЬи

СЬу

Азр

СЬу

Агд

ТЬг

Ьуз

Туг

*

- 45 019952

565 570 <210> 22 <211 > 571 <212> РРТ <213> Не11апЕИиз аппииз <400> 22

А1а 1

Азр

Уа1

Ъеи

Уа1 5

С1и

А1а

Теи

С1и

Агд 10

С1и

С1у

Уа1

ТНг

Азр 15

Уа1

РНе

А1а

Туг

Рго

С1у

С1у

А1а

Зег

МеЕ

61и

Не

Н13

С1п

А1а

Ьей

ТЬг

20

25

30

Агд

Зег

Зег

ТНг

Не

Агд

Азп

Уа1

Теи

Рго

Агд

Н13

С1и

С1п

С1у

С1у

35

40

45

Уа1

РНе

А1а

А1а

С1и

С1у

Туг

А1а

Агд

А1а

Зег

С1у

Ъеи

Рго

С1у

Уа1

50

55

60

Суз

Не

А1а

ТНг

Зег

С1у

Рго

61 у

А1а

ТНг

Азп

Ъеи

Уа1

Зег

С1у

Теи

65

70

75

80

А1а

Азр

А1а

Ьей

Ъеи

Азр

Зег

Уа1

Рго

МеЕ

Уа1

А1а

Не

ТНг

С1у

01п

85

90

95

Уа1

Ьей

Агд

Агд

Мер

Пе

С1у

ТНг

Азр

А1а

РНе

С1п

СНи

ТЬг

Рго

Не

100

105

но

Уа1

61и

Уа1

ТНг

Агд

Зег

Не

ТНг

Туз

Н1з

Азп

Туг

Теи

Уа1

Теи

Азр

115

120

125

Уа1

С1и

Азр

Не

Рго

Агд

Не

Уа1

Агд

С1и

А1а

РЬе

Туг

Теи

А1а

Зег

130

135

140

Зег-

С1у

Агд

Рго

С1у

Рго

Уа1

Теи

Не

Азр

Уа1

Рго

Туз

Азр

Не

С1п

145

150

155

160

С1п

С1п

Теи

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

С1и

Рго

МеЕ

Агд

Теи

Рго

С1у

165

170

175

Туг

Ьей

Зег

Агд

МеЕ

Рго

Ьуз

Рго

61 п

Туг

Азр

С1у

Н13

Теи

С1и

С1п

180

185

190

Не

Уа1

Агд

Ьей

Уа1

С1у

С1и

А1а

Туз

Агд

Рго

Уа1

Теи

Туг

Уа1

С1у

195

200

205

С1у

С1у

Суз

Ьей

Азп

Зег

Азр

Азр

С1и

Теи

Агд

Агд

РЬе

Уа1

С1и

Теи

210

215

220

ТНг

С1у

Не

Рго

Уа1

А1а

Зег

ТНг

Теи

МеЕ

С1у

Теи

С1у

А1а

Туг

Рго

225

230

235

240

А1а

Зег

Зег

Азр

Теи

Зег

Теи

Н13

МеЕ

Теи

С1у

МеЕ

Н13

61у

ТНг

Уа1

245

250

255

Туг

А1а

Азп

Туг

А1а

Уа1

Азр

Туз

Зег

Азр

Теи

Ъеи

Ьей

А1а

РЬе

С1у

260

265

270

Уа1

Агд

РНе

Азр

Азр

Агд

Уа1

ТНг

61у

Туз

Теи

С1и

А1а

РНе

А1а

Зег

275

280

285

Агд

А1а

Ьуз

Не

Уа1

Н13

Не

Азр

Не

Азр

Рго

А1а

СТи

Не

С1у

Туз

290

295

300

Азп

Туз

С1п

Рго

Н15

Уа1

Зег

Не

Суз

С1у

Азр

Не

Туз

Уа1

А1а

Теи

305

310

315

320

61п

С1у

Ьей

Азп

Ьуз

11е

Теи

С1и

С1и

Туз

Азп

Зег

Уа1

ТНг

АЗП

Теи

325

330

335

Азр

РЬе

Зег

ТНг

Тгр

Агд

Ьуз

С1и

Ьей

Азр

С1и

С1п

Ьуз

МеЕ

Ьуз

РНе

340

345

350

Рго

Ьей

Зег

РНе

Туз

ТНг

РЬе

С1у

С1и

А1а

11е

Рго

Рго

С1п

Туг

А1а

355

360

365

11е

С1п

Уа1

Ьей

Азр

61и

Ьей

ТНг

С1у

С1у

Азп

А1а

Не

Не

Зег

ТНг

370

375

380

С1у

Уа1

С1у

С1п

Н15

С1п

Мер

Тгр

А1а

А1а

61п

РНе

Туг

Туз

Туг

Азп

385

390

395

400

Ьуз

Рго

Агд

С1п

Тгр

Ьей

ТНг

Зег

С1у

С1у

Ьей

С1у

А1а

МеЕ

61у

РНе

405

410

415

С1у

Ьей

Рго

А1а

А1а

11е

С1у

А1а

А1а

Уа1

А1а

Агд

Рго

Азр

А1а

Уа1

420

425

430

Уа1

Уа1

Азр

Т1е

Азр

С1у

Азр

61у

Зег

РНе

МеЕ

МеЕ

Азп

Уа1

С1п

С1и

- 46 019952

435

440

445

Ьей

А1а

ТНг

Не

Агд

Уа1

0111

Азп

Ьей

Рго

Уа1

Ьуз

Не

Ьей

Ьей

Ьей

450

455

460

Азп

Азп

С1п

Н±з

Ьеи

С1у

Мер

Уа1

Уа1

С1п

Тгр

О1и

Азр

Агд

РЬе

Туг

465

470

475

480

Ьуз

А1а

Азп

Агд

А1а

Η1Ξ

ТЬг

Туг

Ьей

С1у

Азп

Рго

Зег

Ьуз

О1и

Зег

485

490

495

С1и

Не

РЬе

Рго

Азп

Мее

Уа1

Ьуз

РЬе

А1а

61и

А1а

Суз

Азр

11е

Рго

500

505

510

А1а

А1а

Агд

ν«ι

ТЬг

<31п

Ьуз

А1а

Азр

Ьей

Агд

А1а

А1а

Не

С1п

Ьуз

515

520

525

Мее

Ьей

Азр

ТЬг

Рго

С1у

Рго

Туг

Ьей

Ьей

Азр

Уа1

Не

Уа1

Рго

Н1в

530

535

540

С1п

(31и

Н13

Уа1

Ьей

Рго

Мее

Не

Рго

А1а

С1у

(31у

С1у

РЬе

Зег

Азр

545

550

555

560

Уа1

Не

ТЬг

С1и

С1у

Азр

<31у

Агд

ТЬг

Ьуз

Туг

565

570

<210> 23 <211> 1716 <212> ДНК <213> Не11апРЬиз аппииз <220>

<221> СЬЗ <222> (1)...(1716)

<400> 23

едд Агд 10

даа С1и

ддр 61у

дРс Уа1

асе ТЬг

дас Азр 15

дРс Уа1

48

дса А1а 1

да с Азр

дед Уа1

ерд Ьей

дрд Уа1 5

даа С1и

дсР А1а

сРа Ьей

даа (31и

еес

дсс

Рас

ссс

ддс

ддс

дед

Ьса

аРд

дад

абс

сас

саа

дер

сРс

асд

96

РЬе

А1а

Туг

Рго

(31у

С1у

А1а

Зег

Мер

(31и

Не

Н13

С1п

А1а

Ьей

ТЬг

20

25

30

сдс

Рса

аас

асе

аЬс

сдс

ааЬ

дРс

сРс

ссс

сдр

сас

даа

сад

ддс

ддс

144

Агд

Зег

Азп

ТЬг

11е

Агд

Азп

Уа1

Ьей

Рго

Агд

Н13

(31и

С1п

61у

С1у

35

40

45

дед

РЬе

дсс

дса

даа

ддс

Рас

дса

сдс

дсс

Рсс

ддр

сее

ссс

ддс

дрд

192

νπ

РЬе

А1а

А1а

(Пи

61у

Туг

А1а

Агд

А1а

Зег

(31у

Ьеп

Рго

С1у

Уа1

50

55

60

еде

аес

дсс

асе

Рсс

ддр

ссс

дда

дсР

асд

аас

сЬа

дер

адр

ддр

сее

240

Суз

11е

А1а

ТЬг

Зег

61у

Рго

О1у

А1а

ТЬг

Азп

Ьей

Уа1

Зег

О1у

Ьей

65

70

75

80

дсР

дас

дед

ррд

реа

дас

адр

дРс

ссс

аед

дрд

дса

аре

асе

ддр

саа

288

А1а

Азр

А1а

Ьей

Ьей

Азр

Зег

Уа1

Рго

Мер

Уа1

А1а

Не

ТЬг

О1у

С1п

85

90

95

9^7

ссс

едд

ада

аЬд

аРс

дда

асе

дар

дОд

ОРО

саа

даа

асе

сса

аРР

336

Уа1

Рго

Агд

Агд

Мер

11е

(31у

ТЬг

Азр

Уа1

РЬе

С1п

(31и

ТЬг

Рго

11е

100

105

110

дее

дад

дра

аса

еде

Ьсд

аее

асе

ааа

саР

ааР

РаР

сРР

дрд

ЬРд

дар

384

Уа1

61а

Уа1

ТЬг

Агд

Зег

Не

ТЬг

Ьуз

Н13

Азп

Туг

Ьей

Уа1

Ьей

Азр

115

120

125

дее

дад

дар

аРР

ссс

ада

аРР

дее

сдр

дад

дсР

РРР

РаР

сРР

дед

адр

432

Уа1

61и

Азр

Не

Рго

Агд

11е

Уа1

Агд

(31а

А1а

РЬе

Туг

Ьей

А1а

Зег

130

135

140

- 47 019952

Нед Зег 145

ддь С1у

еда Агд

ссс Рго

ддс С1у

ссд Рго 150

дЬЬ Уа1

ЬЬд Ьеи

аНа 11е

даН Азр

дПа Уа1 155

ссд Рго

ааа Ьуз

даН Азр

аНа Не

сад С1п 160

480

саа

сад

НПа

дЬд

дЬд

сса

ааа

Одд

даН

даа

ссд

аПд

адд

НПа

ссд

ддН

528

С1п

(31п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

С1и

Рго

МеН

Агд

Ьеи

Рго

С1у

165

170

175

НаП

ЬЬд

НсП

ада

аПд

сса

аад

ССП

саа

НаП

даН

ддс

саП

НПд

даа

сад

576

Туг

Ьеи

Зег

Агд

Мер

Рго

Ьуз

Рго

С1п

Туг

Азр

С1у

Низ

Ьеи

С1и

С1п

180

185

190

аПН

дЬЬ

адд

ППд

дЬд

ддд

да а

дед

ааа

адд

ссд

дни

ссд

Пан

дЬд

ддс

624

Не

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

А1а

Ьуз

Агд

Рго

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

СЬу

195

200

205

ддг

ддд

НдН

ННд

ааЬ

Нед

даН

даЬ

дад

ььд

адд

едд

ПИП

дрд

дад

сЬН

672

С1у

С1у

Суз

Ьеи

Азп

Зег

Азр

Азр

С1и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

Уа1

С1и

Ьеи

210

215

220

асд

ддд

аНН

ссд

дьь

дса

адЬ

асН

Нд

аНд

ддд

сП с

дда

дед

Нас

ссН

720

ТЬг

С1у

11е

Рго

Уа1

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

МеН

С1у

Ьеи

С1у

А1а

Туг

Рго

225

230

235

240

дсП

Нед

адЬ

даН

ЬЬд

Псд

сПП

саП

аПд

СНП

ддд

аПд

саП

ддд

асН

дПс

768

А1а

Зег

Зег

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

Н1з

МеН

Ьеи

С1у

МеН

Низ

С1у

ТЬг

Уа1

245

250

255

НаЬ

дед

ааН

НаП

дед

дНП

даН

аад

адН

даН

ЬЬд

оьд

сНП

дед

ИНН

ддд

816

Туг

А1а

Азп

Туг

А1а

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

С1у

260

265

270

дЬд

едд

СЕР

даН

дас

сдП

дЪд

асд

ддд

аад

енн

дад

дед

ннп

дсп

адн

864

νβΐ

Агд

РЬе

Азр

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

С1у

Ьуз

Ьеи

О1и

А1а

РЬе

А1а

Зег

275

280

285

адд

дед

аад

аНН

дПН

сан

аНН

дат

аНН

даН

ссд

дсп

даа

анн

ддд

аад

912

Агд

А1а

Ьуз

11е

Уа1

Н1з

11е

Азр

11е

Азр

Рго

А1а

С1и

Не

С1у

Ьуз

290

295

300

ааН

ааа

сад

ссд

саг.

дЬд

Псд

аНН

Одр

ддд

даН

аНН

аад

дне

дед

НПа

960

Азп

Ьуз

С1п

Рго

Н13

Уа1

Зег

Не

Суз

51у

Азр

Не

Ьуз

Уа1

А1а

Ьеи

305

310

315

320

сад

ддс

пнд

аас

аад

аНН

ннд

дад

даа

аад

ааН

Псд

дЬд

асН

ааН

сНН

1008

С1п

51у

Ьеи

Азп

Ьуз

11е

Ьеи

С1и

С1и

Ьуз

Азп

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

Ьеи

325

330

335

даН

НИС

Сед

аас

Ьдд

ада

аад

даа

ППд

даН

даа

саа

ааа

дЬд

аад

ИНН

1056

Аар

РЬе

Зег

Азп

Тгр

Агд

Ьуз

С1и

Ьеи

Азр

С1и

С1п

Ьуз

Уа1

Ьуз

РЬе

340

345

350

ссд

ЬЬд

аде

НИН

ааа

асд

НИН

ддс

даа

дед

аНН

ссН

сса

сад

саП

дсН

1104

Рго

Ьеи

Зег

РЬе

Ьуз

ТЬг

РЬе

С1у

61и

А1а

11е

Рго

Рго

С1п

Низ

А1а

355

360

365

аНН

саа

дЬЬ

сНП

даН

дад

НПа

асд

ддс

ддд

ааН

дса

аНН

аИ:

аде

асе

1152

11е

С1п

Уа1

Ьеи

Азр

С1и

Ьеи

ТЬг

С1у

С1у

Азп

А1а

11е

Не

Зег

ТЬг

370

375

380

ддд

дПс

ддд

саа

саб

сад

аПд

Одд

дсН

дсН

сад

ПНИ

бас

ааа

Нас

аас

1200

С1у

Уа1

С1у

С1п

Н13

С1п

Мер

Тгр

А1а

А1а

С1п

РЬе

Туг

Ьуз

Туг

Азп

385

390

395

400

- 48 019952

ааа Ьуз

сер Рго

ада Агд

саа СЬп

Рдд Тгр 405

сРд Ьеи

асд ТЬг

Рсд Зег

ддс СЬу

ддд СЬу 410

сРа Ьеи

ддд СЬу

дса АЬа

ард Мер

ддь СЬу 415

РРР РЬе

1248

ддд

срд

ссс

дсР

дсР

аРс

ддд

дед

дсс

дрр

дса

ада

сер

дар

дед

дра

1296

СЬу

Ьеи

Рго

АЬа

АЬа

Не

СЬу

АЬа

А1а

УаЬ

АЬа

Агд

Рго

Азр

АЬа

УаЬ

420

425

430

дра

дрр

дас

аРс

дас

ддр

дас

дда

аде

РРР

ард

аРд

ааР

дРР

саа

дад

1344

Уа1

УаЬ

Азр

11е

Азр

СЬу

Азр

СЬу

8ег

РЬе

МеР

Мер

Азп

УаЬ

С1п

СЬи

435

440

445

рра

дсс

аса

асе

сдр

дрр

даа

ааР

сед

ссд

дрр

аад

арр

рра

РРа

сРР

1392

Ьеи

А1а

ТЬг

Не

Агд

УаЬ

СЬи

Аэп

Ьеи

Рго

УаЬ

Ьуз

Не

Ьеи

Ьеи

Ьеи

450

455

4 60

ааР

ааР

сад

сар

РРд

ддр

ард

дрд

дРР

сад

рдд

дад

дар

едд

РРР

Рас

1440

Азп

Азп

СЬп

Н1з

Ьеи

СЬу

Мер

УаЬ

УаЬ

СЬп

Тгр

е1и

Азр

Агд

РЬе

Туг

465

470

475

480

аад

дед

ааР

адд

дсР

сар

асе

Рас

РРа

дда

аас

ссд

Рса

ааа

дад

Рсд

1488

Ьуз

АЬа

Азп

Агд

АЬа

Н13

ТЬг

Туг

Ьеи

СЬу

Азп

Рго

Зег

Ьуз

СЬи

Зег

485

490

495

даа

аРа

РРс

ссР

аас

ард

дрд

аад

РРР

дсР

даа

дсс

рдр

дар

аРс

ссд

1536

СЬи

Не

РЬе

Рго

Азп

Мер

7а1

Ьуз

РЬе

АЬа

СЬи

АЬа

Суз

Азр

Не

Рго

500

505

510

дсР

дсР

еда

дрд

асе

саа

аад

дед

дар

сРа

еда

дса

дер

аРР

сад

аад

1584

АЬа

АЬа

Агд

УаЬ

ТЬг

СЬп

Ьуз

АЬа

Азр

Ьеи

Агд

АЬа

АЬа

Не

СЬп

Ьуз

515

520

525

ард

РРд

дар

аса

ссс

ддд

ССР

Рас

РРд

РРд

дар

дрд

аРР

дрд

ссд

саР

1632

Мер

Ьеи

Азр

ТЬг

Рго

СЬу

Рго

Туг

Ьеи

Ьеи

Азр

УаЬ

11е

УаЬ

Рго

Н13

530

535

540

саа

даа

сас

д^д

РРд

ссс

ард

аРс

ссд

дсР

ддс

дда

ддр

ррс

Рсд

дар

1680

СЬп

СЬи

Ηΐδ

УаЬ

Ьеи

Рго

Мер

11е

Рго

АЬа

СЬу

СЬу

СЬу

РЬе

Зег

Азр

545

550

555

560

дЕд

аРс

асе

дад

ддр

дар

ддс

ада

асд

ааа

РаР

Рда

1716

7а1

11е

ТЬг

СЬи

СЬу

Азр

СЬу

Агд

ТЬг

Ьуз

Туг

+·

565 570 <210> 24 <211> 571 <212> РКТ <213> НеЬгапРЬиз аппииз <400> 24

АЬа

Азр

УаЬ

Ьеи

УаЬ

СЬи

АЬа

Ьеи

СЬи

Агд

СЬи

СЬу

УаЬ

ТЬг

Азр

УаЬ

1

5

10

15

РЬе

АЬа

Туг

Рго

СЬу

СЬу

АЬа

Зег

Мер

СЬи

Не

Нгз

СЬп

АЬа

Ьеи

ТЬг

20

25

30

Агд

Зег

Азп

ТИг

Ые

Агд

Азп

УаЬ

Ьеи

Рго

Агд

Н13

СЬи

СЬп

СЬу

СЬу

35

40

45

УаЬ

РЬе

АЬа

АЬа

СЬи

СЬу

Туг

АЬа

Агд

АЬа

Зег

СЬу

Ьеи

Рго

СЬу

УаЬ

50

55

60

Суз

Не

АЬа

ТИг

Зег

СЬу

Рго

СЬу

АЬа

ТЬг

Азп

Ьеи

УаЬ

Зег

СЬу

Ьеи

65

70

75

80

АЬа

Азр

АЬа

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

Уа1

Рго

Мер

УаЬ

А1а

Не

ТЬг

СЬу

СЬп

85

90

95

- 49 019952

Уа1

Рго

Агд

Агд 100

МеЬ

Не

С1у ТЬг

Азр 105

Уа1

РНе

С1п

(Ми

ТЬг 110

Рго

Не

Уа1

С1и

Уа1

ТЬг

Агд

Зег

Не

ТЬг

Ьуз

Н15

Азп

Туг

Ьеи

Уа1

Ьеи

Азр

115

120

125

Уа1

С1и

Азр

Не

Рго

Агд

Не

Уа1

Агд

С1и

А1а

РНе

Туг

Ьеи

А1а

Зег

130

135

140

Зег

С1у

Агд

Рго

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

Не

Азр

Уа1

Рго

Ьуз

Азр

Не

С1п

145

150

155

160

С1п

С1п

Ьеи

Уа1

Уа1

Рго

Ьуз

Тгр

Азр

С1и

Рго

Ме£

Агд

Ьеи

Рго

С1у

165

170

175

Туг

Ьеи

Зег

Агд

МеЬ

Рго

Ьуз

Рго

(Мп

Туг

Азр

С1у

НЬз

Ьеи

(Ни

С1п

180

185

190

Не

Уа1

Агд

Ьеи

Уа1

С1у

С1и

А1а

Ьуз

Агд

Рго

Уа1

Ьеи

Туг

Уа1

С1у

195

200

205

С1у

С1у

Суз

Ьеи

Азп

Зег

Азр

Азр

С1и

Ьеи

Агд

Агд

РЬе

Уа1

С1и

Ьеи

210

215

220

ТЬг

С1у

Не

Рго

Уа1

А1а

Зег

ТЬг

Ьеи

МеН

С1у

Ьеи

С1у

А1а

Тух

Рго

225

230

235

240

А1а

Зег

Зег

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

ΗΪ5

Меб

Ьеи

С1у

Ме1:

Н13

(Му

ТНг

Уа1

245

250

255

Туг

А1а

Азп

Туг

А1а

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

РЬе

(Му

260

265

270

Уа1

Агд

РЬе

Азр

Азр

Агд

Уа1

ТНг

С1у

Ьуз

Ьеи

(Ми

А1а

РНе

А1а

Зег

275

2Θ0

285

Агд

А1а

Ьуз

Не

Уа1

ΗΪ3

Не

Азр

Не

Азр

Рго

А1а

С1и

Не

Му

Ьуз

290

295

300

Азп

Ьуз

61п

Рго

Н13

Уа1

Зег

Не

Суз

(Му

Азр

Не

Ьуз

Уа1

А1а

Ьеи

305

310

315

320

С1п

С1у

Ьеи

Азп

Ьуз

Не

Ьеи

Ми

(Ии

Ьуз

Азп

Зег

Уа1

ТЬг

Азп

Ьеи

325

330

335

Азр

РЬе

Зег

Азп

Тгр

Агд

Ьуз

Ми

Ьеи

Азр

(Ми

(Мп

Ьуз

Уа1

Ьуз

РЬе

340

345

350

Рго

Ьеи

Зег

РЬе

Ьуз

ТЬг

РЬе

С1у

С1и

А1а

Не

Рго

Рго

<Мп

ΗΪ3

А1а

355

360

365

Не

С1П

Уа1

Ьеи

Азр

С1и

Ьеи

ТНг

С1у

С1у

Азп

А1а

Не

Не

5ег

ТЬг

370

375

380

С1у

Уа1

С1у

С1п

Н13

С1п

Ме£

Тгр

А1а

А1а

С1п

РНе

Туг

Ьуз

Туг

Азп

385

390

395

400

Ьуз

Рго

Агд

С1п

Тгр

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

С1у

Ьеи

С1у

А1а

Ме5

Му

РНе

405

4 10

415

С1у

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Не

С1у

А1а

А1а

Уа1

А1а

Агд

Рго

Азр

А1а

Уа1

420

425

430

Уа1

Уа1

Азр

Не

Азр

С1у

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ме£

МеЬ

Азп

Уа1

<Мп

(Ми

435

440

445

Ьеи

А1а

ТЬг

Не

Агд

Уа1

(Ми

Азп

Ьеи

Рго

Уа1

Ьуз

Не

Ьеи

Ьеи

Ьеи

4 50

455

460

Азп

Азп

С1п

Н1з

Ьеи

С1у

МеЪ

Уа1

Уа1

С1п

Тгр

С1и

Азр

Агд

РЬе

Туг

4 65

470

475

480

Ьуз

А1а

Азп

Агд

А1а

Ηίδ

ТЬг

Туг

Ьеи

С1у

Азп

Рго

8ег

Ьуз

(Ми

Зег

435

490

495

С1и

Не

РЬе

Рго

Азп

МеН

Уа1

Ьуз

РНе

А1а

(Ми

А1а

Суз

Азр

Не

Рго

500

505

510

А1а

А1а

Агд

Уа1

ТЬг

С1п

Ьуз

А1а

Азр

Ьеи

Агд

А1а

А1а

Не

С1п

Ьуз

515

520

525

Мер

Ьеи

Азр

ТЬг

Рго

С1у

Рго

Туг

Ьеи

Ьеи

Азр

Уа1

Не

Уа1

Рго

Н1з

530

535

540

С1п

С1и

Н13

Уа1

Ьеи

Рго

МеС

Не

Рго

А1а

61у

С1у

С1у

РНе

Зег

Азр

545

550

555

560

Уа1

Не

ТЬг

С1и

61у

Азр

С1у

Агд

ТЬг

Ьуз

Туг

565

570

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Устойчивое к гербициду растение подсолнечника, содержащее два различных устойчивых к гербицидам аллеля гена большой субъединицы 1 ацетогидроксикислотной синтазы (АНΛ8^1), содержащих первый аллель и второй аллель, где указанный первый аллель кодирует первый белок ЛНЛ8^1, содержащий замещение аланина на треонин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 7 в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 20, и указанный второй аллель кодирует второй белок ЛНЛ8^1, содержащий замещение аланина на валин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 90 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, или замещение пролина на лейцин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 82 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, причем указанное устойчивое к гербициду растение подсолнечника является устойчивым к ингибирующему АНА8 гербициду.
2. 2. Растение подсолнечника по п.1, где указанный ингибирующий ЛНЛ8 гербицид представляет собой имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид, триазолопиримидиновый гербицид, сульфониламино-карбонилтриазолиноновый гербицид или их смесь.
3. 3. Растение подсолнечника по п.1 или 2, где указанное растение подсолнечника продуцирует семена, содержащие экстрагируемое растительное масло, содержащее по меньшей мере 85% олеиновой кислоты.
4. 4. Семя растения подсолнечника по п.1 или 2, где указанное семя содержит указанные первый аллель гена ЛНЛ8^1 и второй аллель гена АНЛ8^1.
5. 5. Семя растения подсолнечника по п.4, обработанное ингибирующим АНА8 гербицидом.
6. 6. Семя по п.5, где указанный ингибирующий ЛНЛ8 гербицид представляет собой имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид, триазолопиримидиновый гербицид, сульфониламинокарбонилтриазолиноновый гербицид или их смесь.
7. 7. Способ получения гибридного растения подсолнечника, включающий скрещивание первого растения подсолнечника со вторым растением подсолнечника, где указанное первое растение содержит первый аллель гена ЛНЛ8^1, который кодирует первый белок АНЛ8^1, содержащий замещение аланина на треонин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 7 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, и указанное второе растение содержит второй аллель гена ЛНЛ8^1, который кодирует второй белок АНЛ8^1, содержащий замещение аланина на валин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 90 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, или замещение пролина на лейцин в положении аминокислоты, которое соответствует положению 82 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 20, причем указанное гибридное растение подсолнечника содержит указанные первый аллель гена АНЛ8^1 и второй аллель гена АНЛ8^1.
8. 8. Способ по п.7, дополнительно включающий сбор семян, полученных в результате указанного скрещивания.
9. 9. Способ по п.7, где указанное первое растение подсолнечника является гомозиготным для указанного первого аллеля и указанное второе растение подсолнечника является гомозиготным для указанного второго аллеля.
10. 10. Способ по п.7, дополнительно включающий отбор по меньшей мере одного потомка растения подсолнечника из указанного скрещивания, который содержит в геноме указанный первый и указанный второй аллели.
11. 11. Способ контроля сорняков вблизи растения подсолнечника, включающий нанесение эффективного количества ингибирующего ЛНЛ8 гербицида на сорняки и растение подсолнечника по п.1 или 2.
12. 12. Способ по п.11, где указанный ингибирующий АНЛ8 гербицид представляет собой имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид, триазолопиримидиновый гербицид, сульфониламино-карбонилтриазолиноновый гербицид или их смесь.
13. 13. Способ по п.12, где указанный имидазолиноновый гербицид представляет собой

    2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновую кислоту,

    2-(4-изопропил)-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновую кислоту,

    5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновую кислоту, смесь метил-6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил-2-(4-изопропил4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата или их смеси.
14. 14. Способ по п.12, где указанный сульфонилмочевинный гербицид представляет собой хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон этил, тифенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, никосульфурон, этаметилсульфурон метил, римсульфурон, трифлу

    - 51 019952 сульфурон метил, триасульфурон, примисульфурон метил, циносульфурон, амидосульфурон, флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфурон этил, галосульфурон или их смеси.
15. 15. Способ по п.11, где указанные сорняки включают заразиху.
16. 16. Способ по п.15, где указанная заразиха выбрана из группы, состоящей из ОгоЬапсНе ситапа и ОгоЬапсНе сетиа.
17. 17. Способ борьбы с нежелательной растительностью, включающий контактирование семени растения подсолнечника перед посевом и/или после проращивания с эффективным количеством ингибирующего АНА8 гербицида, где указанное семя растения подсолнечника представляет собой семя по любому из пп.4, 5 или 6.
18. 18. Способ по п.17, где указанный ингибирующий АНА8 гербицид представляет собой имидазолиноновый гербицид, сульфонилмочевинный гербицид, триазолопиримидиновый гербицид, сульфониламино-карбонилтриазолиноновый гербицид или их смесь.
19. 19. Применение семени растения подсолнечника по любому из пп.4, 5 или 6 для экстракции растительного масла из семян.
20. 20. Применение по п.19, где указанное растительное масло из семян содержит по меньшей мере 85% олеиновой кислоты.