ES2640899T3 - Nuevas cepas de levaduras para la producción de alcohol - Google Patents

Nuevas cepas de levaduras para la producción de alcohol Download PDF

Info

Publication number
ES2640899T3
ES2640899T3 ES09740346.3T ES09740346T ES2640899T3 ES 2640899 T3 ES2640899 T3 ES 2640899T3 ES 09740346 T ES09740346 T ES 09740346T ES 2640899 T3 ES2640899 T3 ES 2640899T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
strain
population
yeast
alcohol production
equal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09740346.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Didier Colavizza
Renaud Toussaint
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lesaffre et Cie SA
Original Assignee
Lesaffre et Cie SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre et Cie SA filed Critical Lesaffre et Cie SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2640899T3 publication Critical patent/ES2640899T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Cepa de Saccharomyces cerevisiae estable seleccionada entre la cepa depositada en la CNCM con el número I- 4073, la cepa depositada en la CNCM con el número I-4074 o la cepa depositada en la CNCM con el número I-4075.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Nuevas cepas de levaduras para la produccion de alcohol Campo tecnico
La presente invencion se refiere a nuevas cepas de levaduras y a levaduras procedentes de estas nuevas cepas destinadas a la produccion de alcohol, asf como a un procedimiento de obtencion de dichas cepas.
Antecedentes tecnologicos
Las levaduras sufren con frecuencia mutaciones durante su multiplicacion y durante su uso en la fermentacion, en particular a escala industrial. Sin embargo, estas levaduras en general conservan un fenotipo normal, porque con frecuencia se trata de mutaciones recesivas y porque las cepas industriales habitualmente son aneuploides o poliploides (TheAlcohol Textbook, Ed Jacques (2o03)).
El reciclaje de levaduras se usa con frecuencia en la fermentacion alcoholica. El reciclaje de levaduras consiste en varios usos sucesivos de las levaduras, sin volver a partir de las levaduras o la cepa de partida. Asf, todas o una parte de las levaduras procedentes de una fermentacion i son usadas para una fermentacion posterior i+1; despues todas o partes de las levaduras procedentes de la fermentacion i+1 son usadas para una fermentacion i+2, y asf sucesivamente.
El reciclaje de levaduras, llamado a veces “subcultivo en serie” en la bibliograffa, es una tecnica que expone a la levadura a una gran cantidad de tensiones que pueden conllevar a mutaciones de su patrimonio genetico y a derivados geneticos.
En sus trabajos, Powell y Diacetis (2007, J. Inst. Brew. 1131(1), 67-74) estudian el impacto del reciclaje de levaduras de cerveza en su fenotipo. Al final de cada fermentacion, se extrae una parte de la biomasa de levaduras para realizar la siguiente fermentacion. Powell y Diacetis no han observado ninguna alteracion en las caracteffsticas de la fermentacion de levaduras en el transcurso de los sucesivos subcultivos, en alrededor de 135 generaciones.
Verma et al. (1983) por otro lado, han estudiado el interes del reciclaje de diferentes levaduras de Saccharomyces cerevisiae en el marco de la produccion de etanol. Despues de cada fermentacion alcoholica, las levaduras son subcultivadas en vista de una nueva fermentacion, y se mide la cantidad de alcohol producida al final de cada fermentacion. Los autores han destacado varias cepas de levaduras capaces de experimentar de 6 a 10 subcultivos sucesivos sin que su produccion de alcohol se altere sensiblemente.
Asf pues, en la bibliograffa se ha estudiado la estabilidad de las levaduras en terminos de la produccion de alcohol en el marco del reciclaje de levaduras en la fermentacion alcoholica.
Cuando se multiplica en un procedimiento industrial clasico, la levadura mas eficaz, en terminos de produccion de alcohol, que conoce la empresa solicitante, muestra a veces, no obstante, disminuciones considerables de la cantidad de alcohol producida. Sin embargo, la multiplicacion de las levaduras a escala industrial a partir de una cepa de levadura debe conducir a una levadura de calidad fiable. Por “calidad fiable” se entiende aqu que la cantidad de alcohol producido por la levadura, en un esquema de fermentacion alcoholica dada, es relativamente constante.
Por otro lado, el mercado de la levadura dirigido a la produccion de alcohol esta continuamente demandando levaduras mas eficaces en terminos de cantidad de alcohol producido.
Por lo tanto, hay una necesidad real de proporcionar nuevas cepas de levaduras que den levaduras de calidad fiable, y preferiblemente eficaces en terminos de cantidad de alcohol producido.
Resumen de la invencion
Un primer objeto de la invencion es proporcionar nuevas cepas de levaduras estables.
La presente invencion tiene por lo tanto como objeto una cepa de Saccharomyces cerevisiae estable seleccionada entre la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4073, la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4074 o la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4075.
Un segundo objeto de la invencion es proporcionar un nuevo procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- cruce de una cepa de Saccharomyces inestable con ella misma o con otra cepa de Saccharomyces, para obtener al menos un hffbrido,
- cultivo de al menos un hffbrido, para obtener una poblacion de levaduras R0,
- realizacion de n subcultivos sucesivos de la poblacion de levaduras R0, siendo n un numero entero superior o igual
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
a 6, para obtener una poblacion de levaduras Rn,
- medicion de la produccion de alcohol de dicha poblacion R0 y de la produccion de alcohol de dicha poblacion Rn,
- seleccion de al menos un hnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95% la de la poblacion R0, para obtener cepas de levaduras estables.
La presente invencion tiene en particular por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se han definido anteriormente, que comprende una etapa complementaria de seleccion de al menos un hnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion R0 es superior o igual a 95% la de una poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM el 4 de septiembre de 2008, con el numero I-4072.
La presente invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se ha definido anteriormente, que comprende una etapa complementaria de seleccion de al menos un tnbrido que tenga un rendimiento de biomasa superior o igual a 90% el rendimiento de la biomasa de la cepa I-4072.
La presente invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se ha definido anteriormente, caracterizado por que la etapa de cruzamiento de las cepas de levaduras comprende las siguientes etapas:
- esporulacion de dicha cepa de Saccharomyces inestable y opcionalmente de dicha otra cepa de Saccharomyces, para obtener segregantes,
- cultivo de cada segregante, para obtener una poblacion R0 para cada segregante,
- realizacion de m subcultivos sucesivos de cada segregante, para obtener una poblacion Rm de cada segregante, siendo m un numero entero superior o igual a 6,
- medicion de la produccion de alcohol de la poblacion R0 y la de la produccion de alcohol de la poblacion Rm de cada segregante,
- seleccion de los segregantes para los que:
- la produccion de alcohol de la poblacion Rm es superior o igual a 70% de la de la poblacion R0 de dicho segregante y
- la produccion de alcohol de la poblacion Rm es igual o superior a 85% la de la una poblacion R0 de la cepa I-4072,
para obtener segregantes estables y eficaces, y
- cruce de segregantes estables y eficaces procedentes de dicha cepa inestable con segregantes estables y eficaces de signo opuesto procedentes de dicha cepa inestable o de dicha otra cepa, para obtener al menos un hnbrido.
La presente invencion tiene por objeto en particular un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se ha definido anteriormente, en el que dicha cepa de levadura inestables es la cepa I-4072.
La presente invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se ha definido anteriormente, en el que dicha otra cepa se selecciona de entre la cepa I-4071, la cepa I-4073, la cepa I-4074 o la cepa I-4075.
Un tercer objeto de la invencion se refiere a una cepa de levadura que se puede obtener por el procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se ha definido anteriormente.
Un cuarto objeto de la invencion es proporcionar una cepa de Saccharomyces cerevisiae derivada de una cepa como la definida anteriormente, caracterizada por que:
- la produccion de alcohol de una poblacion Rn de dicha cepa derivada es superior o igual a de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada, y/o
- la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada es superior o igual a de alcohol de una poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072,
procediendo la poblacion Rn de n subcultivos sucesivos de la poblacion R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6.
Un quinto objeto de la invencion es proporcionar un nuevo procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa de levadura, que comprende las etapas de:
- cultivo de dicha cepa, para obtener una poblacion de levaduras R0,
95% de la produccion 95% de la produccion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
- realizacion de n subcultivos sucesivos de la poblacion de levaduras R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6, para obtener una poblacion de levaduras Rn,
- medicion de la produccion de alcohol de dicha poblacion R0 y de la de la produccion de alcohol de dicha poblacion Rn,
- calificacion de dicha cepa de “estable” si la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0.
Un sexto objeto de la invencion se refiere a una levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura como la definida anteriormente.
La presente invencion tiene en particular por objeto una levadura como la definida anteriormente, caracterizada por que su produccion de alcohol es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una levadura procedente de la cepa I-4072.
La presente invencion tiene tambien por objeto una levadura como la definida anteriormente, caracterizada por que esta en forma de crema de levadura, levadura prensada, levadura seca o levadura congelada.
Un septimo objeto de la invencion se refiere al uso de una levadura como se ha definido anteriormente para producir alcohol.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion tiene por objeto proporcionar nuevas cepas de Saccharomyces cerevisiae y nuevas levaduras procedentes de estas cepas destinadas a la produccion de alcohol, siendo dichas levaduras de calidad fiable y, preferiblemente, eficaces en terminos de cantidad de alcohol producido.
Para obtener una levadura de calidad fiable, hay que disponer de una cepa de levadura estable.
Una cepa de levadura estable indica aqrn una cepa que da levaduras cuya produccion de alcohol es relativamente estable a lo largo de las generaciones.
Para obtener una levadura eficaz, en terminos de cantidad de alcohol producido, hay que disponer de una cepa de levadura eficaz en terminos de cantidad de alcohol producido.
Las expresiones “produccion de alcohol”, “produccion de etanol”, “cantidad de alcohol producido” y “cantidad de etanol producido” son sinonimas aqrn.
Cualquier cepa que no responda a la definicion de una cepa estable se califica de cepa inestable.
De forma sorprendente e inesperada, la empresa solicitante ha demostrado que en el transcurso de las multiplicaciones de levaduras a escala industrial, a partir de la cepa I-4072, aparecen variantes cuya produccion de alcohol es fiable. Al cabo de un determinado numero de generaciones, la proporcion creciente de variantes se traduce en una disminucion considerable de la cantidad de alcohol producido.
Sin embargo, este problema de estabilidad en terminos de produccion de alcohol, que aparece en el transcurso de la multiplicacion de levaduras, no se ha puesto nunca de manifiesto en la bibliograffa.
En efecto, los documentos de la tecnica anterior abordan el problema de la estabilidad de las cepas solamente en el marco del reciclaje de levaduras entre varias fermentaciones alcoholicas.
Por lo tanto existe la necesidad de proporcionar un procedimiento que permita distinguir las cepas de levaduras estables de las cepas de levaduras inestables.
Con el fin de poder verificar que una cepa de levadura es estable, en terminos de produccion de alcohol, la empresa solicitante ha elaborado un nuevo procedimiento que permite evaluar el caracter estable de una cepa.
Este procedimiento original de evaluacion de la estabilidad de una cepa de levadura se basa en la realizacion de varios subcultivos sucesivos a partir de la cepa que se va a evaluar, con el fin de obtener una multiplicacion de las levaduras que imita la obtenida durante una multiplicacion a escala industrial.
El procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa de levadura segun la invencion, implica una combinacion original de dos etapas:
- una primera etapa que consiste en varios subcultivos sucesivos a partir de la cepa de partida, y
- una segunda etapa de comparacion de la produccion de alcohol de las levaduras obtenidas despues de los subcultivos sucesivos con la de la cepa de partida que se va a evaluar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Asf pues, si la produccion de alcohol de la poblacion de levaduras obtenida despues de los subcultivos no ha disminuido sensiblemente en relacion con la produccion de alcohol de la cepa de partida que se va a evaluar, la cepa se califica como cepa estable.
La primera etapa de subcultivos sucesivos conduce, preferiblemente, a un numero de generaciones de levaduras superior o igual al obtenido despues de una multiplicacion de las levaduras a escala industrial.
El procedimiento de evaluacion de la estabilidad de la cepa segun la invencion presenta numerosas ventajas. Se trata en particular de un procedimiento rapido, que da resultados fiables, y que se puede llevar a cabo en el laboratorio.
La aplicacion del procedimiento segun la invencion proporciona una ventaja considerable para un empresario, a la vez en terminos de tiempo, coste y calidad de sus productos, evitando en particular realizar varias multiplicaciones industriales de una cepa inestable.
La presente invencion tiene, por lo tanto, por objeto un procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa de levadura, que comprende las etapas de:
- cultivo de dicha cepa, para obtener una poblacion de levaduras R0,
- realizacion de n subcultivos sucesivos de la poblacion de levaduras R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6, para obtener una poblacion de levaduras Rn,
- medicion de la produccion de alcohol de dicha poblacion R0 y de la produccion de alcohol de dicha poblacion Rn,
- calificacion de dicha cepa de “estable” si la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0.
La expresion “cepa de levadura” indica una poblacion relativamente homogenea de celulas de levadura.
Una cepa de levadura se obtiene a partir del aislamiento de un clon, siendo un clon una poblacion de celulas obtenida a partir de una sola celula de levadura.
La cepa a evaluar es en particular una cepa destinada a la produccion de levaduras usadas en destilena y/o vinificacion y/o fabricacion de cerveza y/o para la produccion de bebidas fermentadas.
La cepa a evaluar preferiblemente es una cepa de Saccharomyces, en particular una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
El procedimiento segun la invencion no esta limitado a la evaluacion de la estabilidad de cepas de levadura. Se puede aplicar tambien a levaduras.
El termino “levaduras” indica las levaduras obtenidas por cultivo a partir de una cepa de levadura.
El cultivo de la cepa de levadura a evaluar se realiza en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de la cepa de levadura.
El experto en la tecnica puede determinar cual es la composicion de un medio adecuado para una cepa de levadura dada.
El cultivo de la cepa de levadura se puede llevar a cabo en medio lfquido o en un medio de agar.
El cultivo de la cepa de levadura se lleva a cabo, preferiblemente, en un medio de agar.
El cultivo de la cepa de levadura se lleva a cabo en general a una temperatura comprendida entre 25°C y 35°C, preferiblemente de 28°C a 32°C.
El cultivo de la cepa de levadura se lleva a cabo en general a una temperatura de 30°C.
El cultivo de la cepa de levadura a evaluar conduce a una poblacion de levaduras llamada R0.
Despues, se llevan a cabo n subcultivos sucesivos a partir de la poblacion R0. Esto significa que todo o una parte del cultivo que corresponde a la poblacion de levaduras R0 se siembra para el cultivo siguiente que conduce a una poblacion de levaduras G1; despues todo o una parte del cultivo correspondiente a la poblacion de levaduras G1 se siembra para el siguiente cultivo que conduce a una poblacion de levaduras G2, y asf sucesivamente hasta el cultivo que conduce a una poblacion de levaduras Rn.
Los n subcultivos sucesivos se llevan a cabo, preferiblemente a intervalos de tiempo regulares.
Preferiblemente, los n subcultivos sucesivos son subcultivos diarios.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
En un modo de realizacion preferido, los n subcultivos se llevan a cabo en el mismo medio y/o a la misma temperatura y/o con la misma cantidad de biomasa sembrada.
La biomasa se define como la masa de una poblacion de levaduras.
Por ejemplo, despues de cada subcultivo, una biomasa que corresponde a una masa seca de 0,05 mg de levaduras se siembra, preferiblemente en la superficie de un medio de agar.
Si es necesario, la biomasa recogida despues de un subcultivo se puede conservar a 4°C durante varios dfas, por ejemplo, de 1 a 2 dfas, antes de sembrarla para el siguiente subcultivo.
Los subcultivos sucesivos se pueden llevar a cabo como se indica en el ejemplo 1.
El procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa conlleva un numero de subcultivos superior o igual a 6, preferiblemente superior o igual a 10, mas preferiblemente superior o igual a 12, todavfa mas preferiblemente superior o igual a 14.
En un modo de realizacion preferido, el procedimiento de evaluacion segun la invencion implica 12 subcultivos sucesivos.
Se puede determinar el numero de generaciones de levaduras obtenido despues de n subcultivos sucesivos, calculando el numero de generaciones obtenidas entre cada uno de los n subcultivos (vease, “Yeast Physiology and Biotechnology”, 1998, Graeme M. Walker, publicado porWiley, pag. 143).
El numero de generaciones ng entre dos subcultivos sucesivos i e i+1 se obtiene:
- midiendo la biomasa (Xi) sembrada para el 1er subcultivo y la biomasa (Xi+1) recogida al final del 1er subcultivo, despues
- aplicando la siguiente formula:
ng = 3,3 log (Xi+1/Xi)
La biomasa X se puede expresar en numero de celulas de levadura o en peso de materia seca.
El numero de celulas de levadura se determina por metodos clasicos bien conocidos para el experto en la tecnica, tales como recuento con microscopio o la citometna de flujo.
El peso de materia seca se determina por metodos clasicos bien conocidos para el experto en la tecnica.
El numero total de generaciones obtenidas despues de n subcultivos sucesivos corresponde a la suma del numero de generaciones obtenidas entre cada subcultivo.
A modo de ejemplo, el numero de generaciones obtenidas en 12 subcultivos sucesivos diarios es del orden de aproximadamente 60 generaciones.
Se obtiene asf un numero de generaciones superior o igual al obtenido despues de una multiplicacion de levaduras a escala industrial, que en general es del orden de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 generaciones.
Este procedimiento original de la evaluacion de la estabilidad de una cepa de levadura permite obtener asf, a escala de laboratorio, un numero de generaciones superior o igual al obtenido en una multiplicacion industrial de levaduras.
Preferiblemente, las condiciones del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa permiten obtener al menos 30 generaciones, preferiblemente al menos 40 generaciones, mas preferiblemente al menos 50 generaciones, mas preferiblemente todavfa al menos 60 generaciones.
La medicion de la produccion de alcohol se lleva a cabo por cualquier medio adecuado conocido para el experto en la tecnica. Se puede tratar de una medicion directa del etanol producido o una medicion indirecta por un parametro correlacionado con la produccion de alcohol.
Por ejemplo, la produccion de alcohol se puede medir por cromatograffa, en concreto por HPLC (Cromatograffa ffquida de alto rendimiento), un kit enzimatico (por ejemplo, el kit de determinacion de etanol de Boehringer), o una determinacion mediante dicromato potasico.
La produccion de alcohol se mide preferiblemente en un ensayo de fermentacion alcoholica como se describe en el ejemplo 1.
En dicho ensayo, la cepa de levadura se multiplica en medio ffquido, preferiblemente en dos tiempos: una etapa de precultivo seguido de una etapa de cultivo. A continuacion se lleva a cabo la fermentacion alcoholica, por ejemplo, a partir de 1 g de materia seca de levadura, a 35°C, en condiciones anaerobias, preferiblemente con agitacion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El sustrato para la fermentacion alcoholica preferiblemente esta en forma de sacarosa presente inicialmente en el medio de cultivo, por ejemplo, en una concentracion de 240 g/l.
La medicion de la produccion de alcohol en general se expresa en porcentaje en volumen.
La curva de la fermentacion alcoholica que representa la cantidad de alcohol producido en funcion del tiempo incluye
en general tres fases:
- una fase de latencia, en el transcurso de la cual no hay produccion de etanol,
- una fase exponencial, y
- una fase de meseta, correspondiendo esta fase a la cantidad maxima de fermentacion alcoholica.
La produccion de alcohol se puede medir en un tiempo (t) que se situa al final de fase de meseta.
La medicion de la produccion de alcohol se puede hacer a ti y/o t2, como se definen mas adelante.
La medicion de ti se situa al final de la fase exponencial, en un tiempo superior o igual al que corresponde a 95% de
la cantidad maxima de alcohol producido.
Esta medicion en ti permite, en particular, evaluar la cinetica de la produccion de alcohol.
La medicion en t2 se situa durante la fase de meseta, es decir cuando la fermentacion alcoholica ha terminado.
El final de la fermentacion alcoholica corresponde al momento en el que ya no hay azucar residual en el medio que pueda ser fermentado por la levadura.
Esta medicion en t2 permite tambien evaluar el volumen maximo de alcohol producido.
A modo de ejemplo, en las condiciones definidas en los ejemplos, la produccion de alcohol se puede medir en ti = 48 h y/o en t2 = 72 h.
La ultima etapa del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa consiste en calificar de cepa estable a una cepa cuya produccion de alcohol de su poblacion Rn es superior o igual al 95% de la produccion de alcohol de su poblacion R0.
La cepa se califica en concreto de cepa estable cuando la produccion de alcohol de la poblacion Rn de dicha cepa es superior o igual a 97%, preferiblemente superior o igual a 99% de la produccion de alcohol de su poblacion R0.
Una cepa se califica de cepa inestable cuando la produccion de alcohol de la poblacion Rn de dicha cepa es inferior a 95% de la produccion de alcohol de su poblacion R0.
La aplicacion del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa segun la invencion permite confirmar que la cepa I-4072 es una cepa inestable: la produccion de alcohol de su poblacion R12 es igual a 49% en ti = 48 h y46,9% en t2 = 72 h de la produccion de alcohol de su poblacion R0 (vease el ejemplo i).
Por otra parte, la empresa solicitante tambien ha puesto a punto un procedimiento nuevo original de obtencion de cepas de levaduras estables.
La aplicacion de este procedimiento ha permitido en particular obtener las tres nuevas cepas de Saccharomyces cerevisiae depositadas el 4 de septiembre de 2008 en virtud del tratado de Budapest ante la CNCM (Coleccion Nacional de Cultivos de Microorganismos, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex i5, Francia) con los numeros I-4073, I- 4074 y I-4075.
Por lo tanto, la presente invencion tiene por objeto una cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4073, la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4074 o la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4075.
Estas tres cepas de levaduras son a la vez estables y eficaces.
La estabilidad de estas cepas de levaduras se traduce por la pequena desviacion en la cantidad de alcohol producido, despues de n subcultivos sucesivos, con respecto a la cepa de partida.
La evaluacion de la estabilidad de las cepas segun la invencion se puede realizar como se ha descrito antes en el procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa.
La estabilidad de las tres cepas segun la invencion se traduce, por lo tanto, en una disminucion de la produccion de
etanol producido durante esta la fase exponencial o durante la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
alcohol inferior a 3% despues de n subcultivos, mientras que una cepa inestable como la cepa de referencia I-4072 presenta una disminucion de la produccion de alcohol superior a 50% (vease el ejemplo 1).
La eficacia de las cepas de levaduras segun la invencion se traduce en una produccion de alcohol de dichas cepas cercana a la de la cepa de referencia I-4072.
La eficacia de las tres cepas de levadura segun la invencion se traduce asf en una produccion de alcohol de dichas cepas superior o igual a 95% la de la cepa de referencia.
La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada el 4 de septiembre de 2008 ante la CNCM con el numero I-4075 presenta en concreto las siguientes caractensticas:
- la produccion de alcohol de la poblacion R12 de dicha cepa es superior o igual a 97% de la produccion de alcohol de la poblacion R0 de dicha cepa, procediendo la poblacion R12 de 12 subcultivos sucesivos diarios de la poblacion R0, y
- la produccion de alcohol de la poblacion R0 de dicha cepa es superior o igual a 99% de la produccion de alcohol de la poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072 (tras una medicion a las 48 h).
La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada el 4 de septiembre de 2008 ante la CNCM con el numero I-4073 presenta en concreto las siguientes caractensticas:
- la produccion de alcohol de la poblacion R12 de dicha cepa es superior o igual a 98% de la produccion de alcohol de la poblacion R0 de dicha cepa, procediendo la poblacion R12 de 12 subcultivos sucesivos diarios de la poblacion R0, y
- la produccion de alcohol de la poblacion R0 de dicha cepa es superior o igual a 99% de la produccion de alcohol de la poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072.
La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada el 4 de septiembre de 2008 ante la CNCM con el numero I-4074 presenta en concreto las siguientes caractensticas:
- la produccion de alcohol de la poblacion R12 de dicha cepa es superior o igual a 98% de la produccion de alcohol de la poblacion R0 de dicha cepa, procediendo la poblacion R12 de 12 subcultivos sucesivos diarios de la poblacion R0, y
- la produccion de alcohol de la poblacion R0 de dicha cepa es superior o igual a 99% de la produccion de alcohol de la poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072.
La presente invencion tiene por lo tanto por objeto las tres cepas descritas antes y el conjunto de cepas que pertenecen a la misma familia, en particular todas las cepas derivadas que comparten las mismas propiedades que estas tres cepas.
Por otra parte, la presente invencion tiene por objeto un nuevo procedimiento original de obtencion de cepas de levaduras estables, basado en la seleccion de nuevas cepas que responden a la calificacion de cepa estable en el procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa como se ha definido anteriormente.
Dicha seleccion se lleva a cabo en las nuevas cepas de levaduras obtenidas por tecnicas clasicas.
Una tecnica clasica consiste en una etapa de esporulacion de levaduras para obtener segregantes, seguido de una etapa de cruce de los segregantes para obtener hubridos.
Los hubridos constituyen las cepas de levaduras que posteriormente son seleccionadas segun el criterio de estabilidad.
La presente invencion tiene, por lo tanto, por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- cruce de una cepa de Saccharomyces inestable con ella misma o con otra cepa de Saccharomyces, para obtener al menos un hubrido,
- cultivo de al menos un hubrido, para obtener una poblacion de levaduras R0,
- realizacion de n subcultivos sucesivos de la poblacion de levaduras R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6, para obtener una poblacion de levaduras Rn,
- medicion de la produccion de alcohol de dicha poblacion R0 y la de la produccion de alcohol de dicha poblacion Rn,
- seleccion de al menos un hubrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95%
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
la de la poblacion R0, para obtener cepas de levaduras estables.
La etapa de cruce se lleva a cabo segun tecnicas clasicas, como las ensenadas en el capttulo 7 de “Sporulation and Hydridization of Yeast” de R.R. Fowell, de la obra de referencia “The Yeasts”, Volumen 1, editado por A.H. Rose y J. S. Harrison, 1969-Academic Press.
Las etapas de cultivo de al menos un hnbrido, realizacion de n subcultivos sucesivos y medicion de la produccion de alcohol son similares a las del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa.
Las condiciones para llevar a cabo estas etapas son, por lo tanto, las mismas que las descritas anteriormente en el marco del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa.
La ultima etapa del procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables consiste en seleccionar al menos un hnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95% de la de la poblacion R0, constituyendo dicho hnbrido una cepa de levadura estable.
Preferiblemente, la ultima etapa del procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables consiste en seleccionar al menos un hnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 97% de la de la poblacion R0.
La presente invencion tiene en particular por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables como se han definido anteriormente, en el que la ultima etapa de la seleccion comprende la seleccion de al menos un hnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 97% de la de la poblacion R0, preferiblemente superior o igual a 99% de la de la poblacion R0.
Las cepas estables segun la invencion, la cepa inestable usada en la etapa de cruce y dicha otra cepa de Saccharomyces usada en la etapa de cruce pueden ser cepas homotalicas o heterotalicas.
En un modo de realizacion preferido de la invencion, las cepas estables segun la invencion, la cepa inestable usada en la etapa de cruce y dicha otra cepa de Saccharomyces usada en la etapa de cruce son cepas heterotalicas.
La presente invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras a la vez estables y eficaces en terminos de produccion de alcohol.
La presente invencion tiene, por lo tanto, por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables tal como se han definido anteriormente, que comprende una etapa complementaria de seleccion de al menos un hnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion R0 es superior o igual a 95% la de la poblacion R0 de la cepa I-4072.
Esta etapa complementaria de seleccion basada en el rendimiento en terminos de produccion de alcohol se lleva a cabo antes o despues de la etapa de seleccion de hnbridos segun el criterio de estabilidad.
La presente invencion tiene en particular por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables tal como se han definido anteriormente, en el que la etapa complementaria de seleccion comprende la seleccion de al menos un tnbrido para el que la produccion de alcohol de la poblacion R0 es superior o igual a 97%, preferiblemente superior o igual a 99% la de la poblacion R0 de la cepa I-4072.
La presente invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras a la vez estables y eficaces en terminos de produccion de alcohol y que tienen un buen rendimiento de biomasa.
Por “rendimiento” o “rendimiento de biomasa” o “rendimiento de la produccion de biomasa” se indica aqrn la relacion de la masa de levadura producida respecto a la masa de azucar usada durante la multiplicacion de las levaduras.
La presente invencion tiene, por lo tanto, por objeto un procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables tal como se han definido anteriormente, que comprende una etapa complementaria de seleccion de al menos un hnbrido que tiene un rendimiento de biomasa superior o igual a 90% del rendimiento de biomasa de la cepa I-4072, preferiblemente superior o igual a 95%, mas preferiblemente superior o igual a 98%.
Esta etapa complementaria de seleccion basada en el rendimiento de biomasa se lleva a cabo antes o despues de la etapa de seleccion de los hnbridos por el criterio de estabilidad y, llegado el caso, antes o despues de la etapa de seleccion basado en la eficacia en terminos de produccion de alcohol.
De forma ventajosa, el rendimiento de biomasa de las cepas segun la invencion es superior o igual a 90%, preferiblemente superior o igual a 95%, mas preferiblemente superior o igual a 98% del rendimiento de biomasa obtenido con la cepa I-4072.
En un modo de realizacion preferido, el procedimiento de obtencion de cepas de levaduras estables comprende una preseleccion a nivel de los segregantes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Los segregantes obtenidos despues de esporulacion de las levaduras se seleccionan entonces basandose en la estabilidad y la eficacia.
La presente invencion tiene, por lo tanto, por objeto un procedimiento de obtencion de nuevas cepas de levaduras estables tal como se han definido anteriormente, caracterizadas por que la etapa de cruce de las cepas de levaduras comprende las siguientes etapas:
- esporulacion de dicha cepa de Saccharomyces inestable y opcionalmente de dicha otra cepa de Saccharomyces, para obtener segregantes,
- cultivo de cada segregante, para obtener una poblacion R0 para cada segregante,
- realizacion de m subcultivos sucesivos de cada segregante, para obtener una poblacion Rm de cada segregante, siendo m un numero entero superior o igual a 6,
- medicion de la produccion de alcohol de la poblacion R0 y la de la produccion de alcohol de la poblacion Rm de cada segregante,
- seleccion de los segregantes para los que:
- la produccion de alcohol de la poblacion Rm es superior o igual a 70% de la de la poblacion R0 de dicho segregante y
- la produccion de alcohol de la poblacion Rm es igual o superior a 85% de la de la una poblacion R0 de la cepa I-4072,
para obtener segregantes estables y eficaces, y
- cruce de segregantes estables y eficaces procedentes de dicha cepa inestable con segregantes estables y eficaces de signo opuesto procedentes de dicha cepa inestable o de dicha otra cepa, para obtener al menos un tubrido.
Las etapas de cultivo de cada segregante, de realizacion de m subcultivos sucesivos y de medicion de la produccion de alcohol son similares a las del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa.
Las condiciones para llevar a cabo estas etapas son, por lo tanto, las mismas que las descritas anteriormente en el marco del procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa.
La etapa de seleccion de segregantes basada en la estabilidad y la eficacia en terminos de produccion de alcohol conduce a la obtencion de segregantes estables y eficaces, segun criterios menos selectivos que los aplicados a los hfbridos o a las cepas de levaduras.
En un modo de realizacion particular del procedimiento de obtencion de las cepas de levaduras estables, dicha cepa de levadura inestables es la cepa I-4072.
En un modo de realizacion particular del procedimiento de obtencion de las cepas de levaduras estables, dicha otra cepa de levadura se selecciona entre la cepa I-4071, la cepa I-4073, la cepa I-4074 o la cepa I-4075.
Dicha otra cepa de levadura preferiblemente es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
La presente invencion tiene tambien por objeto una cepa de levadura que se puede obtener por el procedimiento de obtencion de las cepas como se ha definido anteriormente.
La presente invencion tiene en concreto por objeto una cepa de levadura obtenida por el procedimiento de obtencion de cepas tal como se ha definido anteriormente.
La presente invencion tiene tambien por objeto todas las cepas derivadas de cepas de levaduras estables segun la invencion que compartan las mismas propiedades.
Por la expresion “cepa derivada”, se indica una cepa derivada por cualquier transformacion cualquiera que sea, como por ejemplo uno o varios cruces y/o una o varias mutaciones y/o una o varias transformaciones geneticas.
Una cepa derivada por cruce se puede obtener por cruce de una cepa segun la invencion con la misma cepa, u otra cepa segun la invencion, u otra cepa cualquiera.
Una cepa derivada por mutacion puede ser una cepa que sufre al menos una mutacion espontanea en su genoma o al menos una mutacion inducida, por ejemplo, por mutagenesis.
La o las mutaciones de la cepa derivada son silenciosas o no.
Por el termino “mutagenesis”, se indica a la vez la mutagenesis clasica obtenida por radiaciones o por agentes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
qmmicos mutagenos y la mutagenesis de insercion por transposicion o por integracion de un fragmento de ADN exogeno.
La mutagenesis por radiaciones comprende el uso de rayos UV, X o gamma.
Los agentes qmmicos mutagenos son, por ejemplo, el EMS (sulfonato de etilo-metilo), EES (sulfonato de etilo-etilo), nitrosoguanidina, acido nitroso, aflatoxina B1, hidroxilamina, 5-bromourecilo, 2-aminopurina, proflavina, acridina naranja.
Una cepa derivada por transformacion genetica es una cepa en la que se ha introducido un ADN exogeno.
Dicho ADN exogeno puede ser aportado por un plasmido.
Dicho ADN exogeno preferiblemente se integra en el genoma de la levadura.
La presente invencion tiene, por lo tanto, por objeto una cepa de Saccharomyces cerevisiae derivada de una cepa de levadura estable tal como se ha definido anteriormente, caracterizada por que:
- la produccion de alcohol de una poblacion Rn de dicha cepa derivada es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada, y/o
- la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072,
procediendo la poblacion Rn de n subcultivos sucesivos de la poblacion R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6.
El numero de subcultivos es, preferiblemente, igual a 12, y se trata, preferiblemente, de subcultivos diarios.
La presente invencion tiene en particular por objeto una cepa de Saccharomyces cerevisiae derivada de una cepa de levadura estable tal como se ha definido anteriormente, caracterizada por que:
- la produccion de alcohol de una poblacion Rn de dicha cepa derivada es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada, preferiblemente superior o igual a 97%, mas preferiblemente superior o igual a 99%, y
- la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072, preferiblemente superior o igual a 97%, mas preferiblemente superior o igual a 99%,
procediendo la poblacion Rn de n subcultivos sucesivos de la poblacion R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6.
La invencion tiene tambien por objeto un procedimiento de transformacion de una cepa de levadura estable, para obtener una cepa derivada como se ha definido anteriormente, comprendiendo dicho procedimiento de transformacion una etapa de transformacion de dicha cepa por al menos un cruce y/o al menos una mutacion y/o al menos una transformacion genetica.
La presente invencion tiene tambien por objeto una levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura tal como se ha definido anteriormente.
Las levaduras son producidas a partir de cepas de levadura estables segun la invencion, en concreto como se describe en el libro de referencia “Yeast Technology”, 2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
La multiplicacion de las levaduras, a escala industrial, comprende en general al menos las dos primeras etapas y la ultima etapa del siguiente conjunto de etapas:
- multiplicacion de una cepa de levadura en varias fases, primero semianaerobia, y despues aerobia,
- separacion por centrifugacion de la levadura asf producida de su medio de cultivo, para obtener una crema de levadura lfquida que contiene aproximadamente entre 12 y 25% de materia seca, incluso una cantidad mas elevada de materia seca si la crema de levaduras se mezcla con productos osmolitos,
- filtracion de la crema de levaduras lfquida asf obtenida, en general sobre un filtro rotatorio con vacfo, para obtener una levadura fresca deshidratada que contiene de 26% a 35% de materia seca,
- amasado de dicha levadura fresca deshidratada, para obtener una masa homogenea,
- extrusion de la levadura asf obtenida, para obtener
5
10
15
20
25
30
35
40
45
- una levadura prensada en forma de panes de levadura fresca o de levadura fresca desmenuzada, que contiene aproximadamente 30% de materia seca, o
- una levadura en forma de partfculas, en general de granulos, si la levadura esta destinada a ser secada,
- opcionalmente, secado de forma controlada, en una corriente de aire caliente, por ejemplo, por fluidizacion, de las partfculas de levaduras obtenidas por extrusion para obtener la levadura seca,
- envasado.
La etapa de secado preferiblemente es un secado rapido realizado en presencia de un emulsionante.
Entre los emulsionantes que se pueden usar durante la etapa de secado, se puede seleccionar el monoestearato de sorbitan, usado, por ejemplo, en una concentracion de aproximadamente 1,0% (en peso, respecto al peso de la levadura seca).
Las levaduras segun la invencion son levaduras de calidad fiable, y, preferiblemente eficaces en terminos de produccion de alcohol.
Las levaduras segun la invencion se pueden usar en cualquier forma posible.
Por ejemplo, la presente invencion tiene por objeto una levadura como se ha definido anteriormente, caracterizada por que esta en forma de crema de levadura, levadura prensada, levadura seca o levadura congelada.
Las levaduras frescas se caracterizan por un contenido elevado de agua en comparacion con las levaduras secas. Las levaduras frescas abarcan las cremas de levaduras o las levaduras prensadas.
Las cremas de levaduras, llamadas tambien “levaduras lfquidas” son suspensiones acuosas de celulas de levadura que presentan una viscosidad de tipo crema.
Por crema de levadura se entiende una suspension lfquida, tipicamente una suspension acuosa, de celulas vivas de levadura, teniendo dicha suspension un contenido en materia seca de al menos 12% en masa, en general comprendido de aproximadamente 12 a aproximadamente 50% en masa (definicion entendida de crema de levadura).
Preferiblemente, la crema de levadura responde a la definicion en sentido estricto, es decir, presenta un contenido de materia seca comprendido de aproximadamente 12 a aproximadamente 25% en masa, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 22% en masa.
Entre las levaduras prensadas, se distinguen las levaduras prensadas en bloque compacto, llamadas tambien “panes de levadura” que se caracterizan por un contenido en materia seca comprendido de aproximadamente 26% a aproximadamente 35%, y las levaduras prensadas en granulos que se caracterizan por un contenido en agua comprendido de aproximadamente 21% a aproximadamente 35%.
Las levaduras secas se caracterizan por un contenido en materia seca superior a aproximadamente 92%.
Las levaduras congeladas se caracterizan por un contenido en materia seca comprendido de aproximadamente 74% a aproximadamente 80%.
La levadura segun la invencion presenta, por lo tanto, caractensticas buscadas para una levadura destinada a la produccion de alcohol, es decir, una calidad fiable y una produccion de alcohol eficaz.
La presente invencion tiene tambien por objeto una levadura tal como se ha definido anteriormente para producir alcohol.
Las condiciones de la fermentacion alcoholica dependen en particular del tipo de aplicacion buscada, por ejemplo, segun se trate de una fermentacion de tipo cervecera, vinificacion o destilena.
Las condiciones de fermentacion alcoholica las puede determinar facilmente el experto en la tecnica.
A modo de ejemplo, se puede hacer referencia a las condiciones de fermentacion alcoholica descritas en el libro de referencia “Yeast Technology”, 2a edicion, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Las levaduras segun la invencion son particularmente interesantes en las siguientes aplicaciones:
- el alcohol llamado “de beber”, destinado a la fabricacion de bebidas alcoholicas, y/o
- el alcohol industrial, destinado, por ejemplo, a los biocarburantes o a la industrias qmmicas.
La presente invencion se va a ilustrar ahora con ayuda de los siguientes ejemplos que se dan a modo de ilustracion y no son en modo alguno limitantes.
Los ejemplos describen en particular un procedimiento de obtencion de cepas de levadura estables segun la invencion y sus caractensticas, asf como las caractensticas de las levaduras obtenidas a partir de estas cepas.
5 Ejemplo 1: Seleccion de cepas de levadura estables y sus caractensticas
Material y metodos
1. Medios y productos
La composicion de los medios de cultivo y la naturaleza de las enzimas usadas se indican a continuacion.
Medio 1 Extracto de levadura Extracto de malta Peptona Glucosa Agar pH: 6,2 +/- 0,2 Agua csp 1 litro Esterilizacion: 20 minutos a 121°C
3 g 3 g 5 g 10 g 20 g Medio 2 Acetato sodico agar pH: 6,5-7 Agua csp 1 litro Esterilizacion: 20 minutos a 121°C 6,5g 15 g
Medio 3
Medio 4
Melaza de cana
5g Sacarosa 100 g
(NH4)2HPO4
500 mg Extracto de levadura 20 g
Agar
30 g MgSO4 1 g
pH ajustado 5,2-5,3 con H2SO4 al 10%
KH2PO4 1 g
Agua csp 1 litro
pH ajustado a 4,7 con acido lactico
Esterilizacion: 40 minutos a 121°C
Agua csp 1 litro
Esterilizacion: 30 minutos a 121°C
Medio 5
Enzimas:
Sacarosa
240 g Zimoliasa 100000 a 20 mg/ml
(NH4)2HP04
4,7 g
KCI
0,8 g
Tween 80
0,5 ml
Tampon de citrato
0,2 M
Vitamina B1 (Tiamina)
4 mg
Vitamina B6 (Piridoxina)
4 mg
Acido nicotmico
40 mg
Biotina 0,01mg
pH: 4,2
Agua csp 1 litro
10 El medio 1 es un medio de cultivo basico de agar que contiene los elementos necesarios para el crecimiento de las cepas de Saccharomyces cerevisiae segun la invencion.
El medio 2 es un medio de agar adecuado para la esporulacion de levaduras.
El medio 3 es un medio de cultivo de agar adecuado para el crecimiento de levaduras. El medio 3 contiene melaza, el sustrato usado en general para la multiplicacion industrial de levaduras.
15 El medio 4 es un medio de cultivo lfquido de referencia adecuado para la multiplicacion de levaduras.
El medio 5 es un medio de cultivo lfquido adecuado para llevar a cabo una fermentacion alcoholica.
5
10
15
20
25
30
35
40
La zimoliasa es una enzima usada despues de la esporulacion, con el fin de digerir parcialmente la pared de los ascomicetos para facilitar su diseccion.
2. Aislamiento de los segregantes
Etapa 1: Crecimiento de la cepa en el medio 1
Se siembra un inoculo de la cepa de partida (conservada a -80°C) en la superficie del agar en una placa de Petri. La placa de Petri despues se incuba durante 24 horas a 30°C.
Etapa 2: Esporulacion en el medio 2
Se siembra un inoculo del cultivo precedente en la superficie de agar de una placa de Petri.
La placa de Petri se incuba durante 96 horas a 25°C. La biomasa obtenida en la superficie de la placa a continuacion se recoge en 500 pl de agua esteril. A 100 pl de esta suspension se le anaden 25 pl de zimoliasa. La suspension se incuba durante 30 minutos a 30°C, antes de extenderla sobre placa de agar de medio 1. Preferiblemente, la diseccion de las tetradas se lleva a cabo 20 minutos mas tarde.
Etapa 3: Diseccion de las tetradas
Las tetradas son diseccionadas en el micromanipulador SINGER, y despues la placa de Petri se incuba durante 24 horas a 30°C.
Etapa 4: Conservacion de los segregantes
Los segregantes a continuacion se conservan a -80°C en medio 1 que contiene 20% de glicerol.
3. Subcultivos sucesivos y numero de generaciones Etapa 1: Crecimiento en medio 1
Se siembra un inoculo de la cepa a ensayar (conservada a -80°C) en superficie de agar en una placa de Petri que contiene medio 1. A continuacion la placa de Petri se incuba durante 24 horas a 30°C.
Etapa 2: subcultivos sucesivos en medio 3
La cepa a ensayar se subcultiva en la superficie de una placa de Petri que contiene medio 3 con ayuda de una punta de palillo. A continuacion la placa de Petri se incuba durante 20 a 24 horas a 30°C.
Se repiten entonces las siguientes etapas 11 veces:
- subcultivo de la cepa a ensayar en la superficie de una placa de Petri que contiene medio 3 con ayuda de una punta de palillo,
- incubacion de la placa de Petri durante 20 a 24 horas a 30°C.
Variante de la etapa 2
De forma alternativa, los subcultivos sucesivos en el medio 3 se pueden llevar a cabo segun el siguiente protocolo.
La biomasa obtenida en la etapa 1 se recupera y se diluye en agua destilada, con el fin de obtener una suspension de levaduras de 0,5 mg/ml. Se siembra entonces una placa de Petri que contiene medio 3 en la superficie con 100 pl de esta suspension.
La placa de Petri se incuba durante 20 a 24 horas a 30°C.
Se repiten entonces las siguientes etapas 11 veces:
- la biomasa obtenida se recoge en 2 x 2,5 ml de agua destilada,
- se realizan diluciones con el fin de obtener una suspension de levaduras de 0,5 mg/ml,
- a partir de esta suspension, se siembra de nuevo una placa de Petri que contiene medio 3 en la superficie con 100 pl de dicha suspension, y
- la placa de Petri se incuba durante 20 a 24 horas a 30°C.
Etapa 3: Calculo del numero de generaciones obtenidas en la etapa 2
Sea ng el numero de generaciones y Xq la biomasa sembrada, la biomasa Xn obtenida despues de n subcultivos
5
10
15
20
25
30
35
40
viene dada por la siguiente formula:
Xn = 2ngXo
El numero de generaciones se calcula, por lo tanto, aplicando la siguiente formula:
ng = (log Xt - log Xo) / log 2, siendo ng = 3,3 log (Xn/Xo)
La biomasa se puede expresar en numero de celulas o en peso de materia seca.
Con respecto al numero de celulas, las celulas de levadura extrafdas con una punta de palillo u obtenidas despues de incubacion en la placa de Petri, se ponen en suspension en 1 ml de agua. A continuacion se obtiene el numero de celulas por medicion en el citometro de flujo.
Se obtienen aproximadamente 5 generaciones entre cada subcultivo, lo que corresponde en media a 60 generaciones en 12 subcultivos sucesivos.
Variante de la etapa 3
El numero de generaciones obtenidas despues de la variante de la etapa 2 se determina de la siguiente forma.
Se mide el peso de materia seca (Xo) de dicha suspension de levaduras, asf como el peso de materia seca (Xt) de la suspension de levaduras recogida despues de 20 a 24 horas de crecimiento. El peso de materia seca se mide despues de deshidratacion en una estufa a aproximadamente 105°C.
El numero de generaciones se calcula aplicando la siguiente formula:
ng = 3,3 log (Xn/Xo)
se obtienen de 3 a 4 generaciones entre cada subcultivo, lo que corresponde de aproximadamente 36 a aproximadamente 48 generaciones en 12 subcultivos sucesivos.
4. Ensayo de fermentacion alcoholica por medicion del etanol producido
Etapa 1: Cultivo en el medio 1
Se siembra un inoculo de la cepa a ensayar (conservada a -8o°C) en la superficie de una placa de Petri que contiene el medio 1. La placa de Petri se incuba durante 24 horas a 3o°C.
Etapa 2: Precultivo en medio lfquido en matraz de 5o ml
Se siembra un inoculo del cultivo precedente en el matraz de 5o ml que contiene 2o ml de medio 4. El matraz se incuba durante 24 horas a 26°C.
Etapa 3: Cultivo en medio lfquido en matraz de 25o ml
Se siembran 6 ml de cultivo obtenido en la etapa precedente en un matraz de 25o ml que contiene 15o ml de medio 4. El matraz se incuba durante 2o horas a 26°C.
El cultivo obtenido se centrifuga a 45oo rpm durante 3 minutos, el lfquido sobrenadante se elimina y el sedimento se vuelve a suspender en 1oo ml de agua destilada esteril (lavado). La suspension se centrifuga de nuevo a 45oo rpm durante 3 minutos y el sedimento se vuelve a poner en suspension en 2o ml de agua destilada esteril.
Se mide el peso de materia seca.
Etapa 4: Fermentacion alcoholica en matraz de fondo redondo de 4ooo ml
Se siembra 1 g de materia seca de levadura de la suspension obtenida en la etapa 3 en un matraz de fondo redondo de 4ooo ml que contiene 1ooo ml de medio 5.
El matraz de fondo redondo se incuba durante 72 horas a 35°C con agitacion a 8o rpm.
Se extraen 1o ml de mosto de fermentacion en t = o, t = 7 horas, t = 24 horas, t = 48 horas y t = 72 horas.
El mosto de fermentacion extrafdo se filtra (filtro de o,2 pm) y la solucion de fermentacion asf obtenida se conserva a -2o°C.
A continuacion se miden la concentracion de azucar, etanol y glicerol presentes en la solucion de fermentacion por HPLC (columna HPX87H).
Resultados
1. Seleccion de los segregantes
Se aislaron segregantes de las cepas depositadas el 4 de septiembre de 2008 en la CNCM con los numeros I-4071 y I-4072, como se indica en la seccion "Material y metodos".
La etapa de esporulacion conduce a la formacion de ascomicetos que contienen 4 esporas haploides que son 5 diseccionadas.
Cada espora haploide constituye un segregante.
Los segregantes procedentes de las dos cepas I-4071 y I-4072 se evaluan en terminos de cantidad de alcohol producido y de la estabilidad.
Los resultados de 5 tetradas procedentes de la cepa I-4072 (numeradas de 1 a 5) se presentan en las tablas 1. a) a 10 e).
Los resultados de 6 tetradas procedentes de la cepa I-4071 (numeradas de 6 a 11) se presentan en las tablas 2. a) a
f).
Los valores dados en las tablas corresponden a la media obtenida de al menos tres ensayos independientes.
La fila (1) indica la produccion de alcohol de la poblacion R0 del segregante, expresada en % de la de la poblacion 15 R0 de la cepa I-4072 y por lo tanto indica el rendimiento del segregante.
La fila (2) indica la produccion de alcohol de la poblacion R12 del segregante, expresada en % de la de la poblacion R0 de dicho segregante y por lo tanto indica la estabilidad del segregante.
Tabla 1. a)
tetrada 1
1a 1b 1c 1d
signo
a a a a
(1)
77 97 64 101
(2)
103 88 108 77
Tabla 1. b)
tetrada 2
2a 2b 2c 2d
signo
a a a a
(1)
100 65 73 100
___(2)___
68 96 101 80
20 Tabla 1. c)
tetrada 3
3a 3b 3c 3d
signo
a a a a
(1)
98 82 97 66
___(2)___
82 100 60 99
Tabla 1. d)
tetrada 4
4a 4b 4c 4d
signo
a a a a
(1)
75 94 98 71
(2)
98 100 88 100
Tabla 1. e)
tetrada 5
5a 5b 5c 5d
signo
a a a a
(1)
99 97 65 68
___(2)___
109 67 121 103
Tabla 2. a)
tetrada 6
6a 6b 6c 6d
signo
a a a a
(i)
99 98 56 81
___(2)___
93 94 99 98
Tabla 2. b)
tetrada 7
7a 7b 7c 7d
signo
a a a a
(1)
63 97 102 52
___(2)___
103 97 97 154
Tabla 2. c)
tetrada 8
8a 8b 8c 8d
signo
a a a a
(1)
53 98 58 100
___(2)___
109 99 100 76
Tabla 2. d)
tetrada 9
9a 9b 9c 9d
signo
a a a a
(1)
54 101 101 49
(2)
126 95 97 133
Tabla 2. e)
tetrada 10
10a 10b 10c 10d
signo
a a a a
(1)
49 96 100 56
___(2)___
104 95 78 107
5 Tabla 2. f)
tetrada 11
11a 11b 11c 11d
signo
a a a a
(1)
52 99 52 96
____(2)____
146 88 125 99
En negrilla figuran las tetradas que corresponden a los criterios de seleccion aplicados a los segregantes: produccion de alcohol superior o igual a 90% para la fila (1) y superior o igual a 75% para la fila (2).
2. Crecimiento y seleccion de hforidos
10 Entre los segregantes seleccionados, los segregantes de signo a se cruzan con los de signo a, para obtener los hforidos.
Los hforidos a continuacion son seleccionados basandose en los siguientes criterios:
- estabilidad: la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 97% la de la poblacion R0, y
- rendimiento: la produccion de alcohol de la poblacion R0 es superior o igual a 95% la de la poblacion R0 de la cepa
15 I-4072.
Las tablas 3 y 4 indican los resultados obtenidos con los hforidos correspondientes a las cepas segun la invencion.
- cepas I-4073 y I-4074: hfbridos procedentes del cruce del segregante 1d con el segregante 7b, y
- cepa I-4075: hforido procedente del cruce del segregante 1d con el segregante 5a.
5
10
15
20
25
30
35
Los resultados obtenidos con la cepa I-4072 tambien estan indicados.
Las tablas 3. a) y 3. b) indican los resultados obtenidos en el ensayo de fermentacion alcoholica por medicion del etanol producido, respectivamente a las 48 h y 72 h.
La fila (1) indica la produccion de alcohol de la poblacion R0 de la cepa expresada en porcentaje de la de la poblacion R0 de la cepa I-4072, e indica por lo tanto el rendimiento de la cepa.
La fila (2) indica la produccion de alcohol de la poblacion R12 de la cepa, expresada en porcentaje de la de la poblacion R0 de dicha cepa y por lo tanto indica la estabilidad de la cepa.
Los valores dados en las tablas corresponden a la media obtenida en al menos tres ensayos.
Tabla 3. a)
Cepa
(1) (2)
I-4072
100,0 48,9
I-4073
99,9 99,1
I-4074
100,7 98,5
I-4075
99,8 97,8
Tabla 3. b)
Cepa
(1) (2)
I-4072
100,0 46,9
I-4073
99,7 98,3
I-4074
99,1 99,2
I-4075
99,9 99,0
Los hforidos seleccionados son muy eficaces en terminos de produccion de alcohol puesto que la cantidad de alcohol producido es superior a 99% del obtenido con la cepa de referencia I-4072 (tabla 3. a) y 3. b)).
Los hfbridos muestran tambien una estabilidad muy fuerte: la produccion de alcohol entre la poblacion R0 y R12 ha disminuido menos de 3% para los hfbridos I-4073, I-4074 y I-4075.
En comparacion, la produccion de alcohol de la cepa I-4072 ha disminuido en mas de 50% (tabla 3. a) y 3. b)).
Como recordatorio, los resultados de la poblacion R12 corresponden a una levadura que se ha multiplicado aproximadamente 60 generaciones, lo que es superior o igual al numero de generaciones medio obtenido despues de una multiplicacion industrial de levaduras.
Ejemplo 2: Caracteristicas de las levaduras segun la invencion
Material y metodos
1. Produccion a escala piloto
Las cepas de levaduras I-4073, I-4074 y I-4075 se multiplican en fermentadores de 20 litros, en modo semicontinuo, como se describe en el libro de referencia "Yeast Technology", 2a edicion, 1991, G. Reed y TW Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
A continuacion se ensayan las levaduras obtenidas a partir de cada cepa en terminos de estabilidad, rendimiento y rendimiento de biomasa.
La evaluacion de la estabilidad de las levaduras se lleva a cabo segun el ensayo de evaluacion de estabilidad usado para las cepas de levaduras, de 12 subcultivos sucesivos diarios.
El rendimiento se evalua midiendo la cantidad maxima de alcohol producido.
El rendimiento de biomasa se obtiene calculando la masa de levadura producida respecto a la masa de azucar usada durante la multiplicacion de las levaduras.
2. Produccion industrial
La cepa de levadura I-4074 se multiplica a escala industrial.
La evaluacion de la estabilidad de las levaduras obtenidas despues de las multiplicaciones a escala industrial se
lleva a cabo segun el ensayo de evaluacion de estabilidad usado para las cepas de levaduras, de 12 subcultivos sucesivos diarios.
El rendimiento se evalua midiendo la cantidad maxima de alcohol producido.
Resultados
5 Los resultados obtenidos despues de las multiplicaciones de las cepas de levaduras a escala piloto muestran que las levaduras procedentes de cada una de las tres cepas de levaduras I-4073, I-4074 y I-4075 son estables, por lo tanto, de calidad fiable, eficaces en terminos de cantidad de alcohol producido, y tienen un buen rendimiento de biomasa.
Ademas, despues de la multiplicacion industrial, las levaduras obtenidas a partir de la cepa de levadura I-4074 son 10 estables, por lo tanto de calidad fiable. Ademas, estas levaduras son tambien eficaces en terminos de cantidad de alcohol producido y tienen un buen rendimiento de biomasa.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Cepa de Saccharomyces cerevisiae estable seleccionada entre la cepa depositada en la CNCM con el numero I- 4073, la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4074 o la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4075.
  2. 2. Procedimiento que comprende las etapas de:
    - cruce de una cepa de Saccharomyces inestable con ella misma o con otra cepa de Saccharomyces, para obtener al menos un hforido,
    - cultivo de al menos un hforido, para obtener una poblacion de levaduras R0,
    - realizacion de n subcultivos sucesivos de la poblacion de levaduras R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6, para obtener una poblacion de levaduras Rn,
    - medicion de la produccion de alcohol de dicha poblacion R0 y la de la produccion de alcohol de dicha poblacion Rn,
    - seleccion de al menos un hforido para el que la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95% la de la poblacion R0, para obtener cepas de levaduras estables, o
    - La cepa de levadura estable es una cepa de levadura que da levaduras cuya produccion de alcohol es estable a lo largo de generaciones; y
    - la cepa de levadura inestable es una cepa de levadura que da levaduras cuya produccion de alcohol no es estable a lo largo de generaciones.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, que comprende una etapa complementaria de seleccion de al menos un hforido para el que la produccion de alcohol de la poblacion R0 es superior o igual a 95% la de una poblacion R0 de la cepa I-4072.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 2 o 3, que comprende una etapa complementaria de seleccion de al menos un hfbrido que tiene un rendimiento de biomasa superior o igual a 90% del rendimiento de la biomasa de la cepa I-4072.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 2, en el que la etapa de cruce comprende las siguientes etapas:
    - esporulacion de dicha cepa de Saccharomyces inestable y opcionalmente de dicha otra cepa de Saccharomyces, para obtener segregantes,
    - cultivo de cada segregante, para obtener una poblacion R0 para cada segregante,
    - realizacion de m subcultivos sucesivos de cada segregante, para obtener una poblacion Rm de cada segregante, siendo m un numero entero superior o igual a 6,
    - medicion de la produccion de alcohol de la poblacion R0 y la de la produccion de alcohol de la poblacion Rm de cada segregante,
    - seleccion de los segregantes para los que:
    - la produccion de alcohol de la poblacion Rm es superior o igual a 70% de la de la poblacion R0 de dicho segregante y
    - la produccion de alcohol de la poblacion R0 es igual o superior a 85% la de la una poblacion R0 de la cepa I-4072,
    para obtener segregantes estables y eficaces, y
    - cruce de segregantes estables y eficaces procedentes de dicha cepa inestable con segregantes estables y eficaces de signo opuesto procedentes de dicha cepa inestable o de dicha otra cepa, para obtener al menos un hforido.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicha cepa de levadura inestable es la cepa I- 4072.
  7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicha otra cepa se selecciona de entre la cepa I-4071, la cepa I-4073, la cepa I-4074 o la cepa I-4075.
    10
    15
    20
  8. 8. Cepa de Saccharomyces cerevisiae derivada de una cepa segun la reivindicacion 1, caracterizada por que:
    - la produccion de alcohol de una poblacion Rn de dicha cepa derivada es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada, y/o
    - la produccion de alcohol de una poblacion R0 de dicha cepa derivada es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0 de la cepa depositada en la CNCM con el numero I-4072,
    procediendo la poblacion Rn de n subcultivos sucesivos de la poblacion R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6.
  9. 9. Procedimiento de evaluacion de la estabilidad de una cepa de levadura, que comprende las etapas de:
    - cultivo de dicha cepa, para obtener una poblacion de levaduras R0,
    - realizacion de n subcultivos sucesivos de la poblacion de levaduras R0, siendo n un numero entero superior o igual a 6, para obtener una poblacion de levaduras Rn,
    - medicion de la produccion de alcohol de dicha poblacion R0 y de la produccion de alcohol de dicha poblacion Rn,
    - calificacion de dicha cepa de “estable” si la produccion de alcohol de la poblacion Rn es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una poblacion R0.
  10. 10. Levadura obtenida por cultivo de una cepa de levadura segun la reivindicacion 1.
  11. 11. Levadura segun la reivindicacion 10, caracterizada por que su produccion de alcohol es superior o igual a 95% de la produccion de alcohol de una levadura procedente de la cepa I-4072.
  12. 12. Levadura segun la reivindicacion 10 u 11, caracterizada por que esta en forma de crema de levadura, levadura prensada, levadura seca o levadura congelada.
  13. 13. Uso de una levadura segun una de las reivindicaciones 10 a 12, para producir alcohol.
ES09740346.3T 2008-09-16 2009-09-10 Nuevas cepas de levaduras para la producción de alcohol Active ES2640899T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0805056A FR2935985B1 (fr) 2008-09-16 2008-09-16 Nouvelles souches de levure pour la production d'alcool.
FR0805056 2008-09-16
PCT/FR2009/001080 WO2010031916A1 (fr) 2008-09-16 2009-09-10 Nouvelles souches de levure pour la production d'alcool

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2640899T3 true ES2640899T3 (es) 2017-11-07

Family

ID=40513399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09740346.3T Active ES2640899T3 (es) 2008-09-16 2009-09-10 Nuevas cepas de levaduras para la producción de alcohol

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9175257B2 (es)
EP (1) EP2329008B1 (es)
BR (1) BRPI0918773B1 (es)
ES (1) ES2640899T3 (es)
FR (1) FR2935985B1 (es)
HU (1) HUE033467T2 (es)
PL (1) PL2329008T3 (es)
WO (1) WO2010031916A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2953857B1 (fr) * 2009-12-15 2012-10-12 Lesaffre & Cie Nouvelles souches de levure pour la production d'alcool
US11311032B2 (en) 2010-04-27 2022-04-26 Chr. Hansen A/S Method for inoculating yeast into fruit juice
FR3015985B1 (fr) * 2013-12-30 2017-06-16 Lesaffre & Cie Souches de levures pour la production d'ethanol de premiere generation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1306949A1 (ru) * 1985-12-19 1987-04-30 Всесоюзный научно-исследовательский институт новых видов пищевых продуктов и добавок Гибридный штамм дрожжей @ @ ЦМПМ У-563,используемый дл сбраживани мелассного сусла повышенной концентрации в двухпродуктовом производстве спирта и хлебопекарных дрожжей
JPH0636734B2 (ja) * 1992-02-27 1994-05-18 通商産業省基礎産業局長 新規凝集性アルコ−ル発酵酵母
US5693526A (en) * 1996-03-29 1997-12-02 Council Of Scientific & Industrial Research Strains of yeast of saccharomyces cerevisiae and a process for the preparation of such strains of yeast
US6140108A (en) * 1997-01-16 2000-10-31 The Regents Of The University Of California Wine yeast cultures
RU2340666C1 (ru) * 2007-04-12 2008-12-10 Открытое акционерное общество "Пивоваренная компания "Балтика" ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПИВОВАРЕННОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0918773A2 (pt) 2015-08-11
EP2329008A1 (fr) 2011-06-08
WO2010031916A1 (fr) 2010-03-25
EP2329008B1 (fr) 2017-06-28
US20110165612A1 (en) 2011-07-07
FR2935985B1 (fr) 2014-11-07
BRPI0918773B1 (pt) 2018-08-14
PL2329008T3 (pl) 2017-12-29
FR2935985A1 (fr) 2010-03-19
HUE033467T2 (en) 2017-12-28
US9175257B2 (en) 2015-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2373397T3 (es) Cepas de saccharomyces no recombinantes que crecen en xilosa.
ES2640899T3 (es) Nuevas cepas de levaduras para la producción de alcohol
Coloretti et al. Characterization of flocculent Saccharomyces interspecific hybrids for the production of sparkling wines
CN112680370A (zh) 一株高核酸酿酒酵母及其应用
CA2783949C (fr) Nouvelles souches de levure pour la production d'alcool
FR2675815A1 (fr) Nouvelles souches de levure de panification et leur procede d'obtention, nouvelles levures fraiche et seche correspondantes.
FR2744729A1 (fr) Nouvelles levures de panification sensibles au froid
US7288370B1 (en) Baker's yeasts and strains for their preparation
CN102181372A (zh) 一种酿酒酵母菌及其应用
JP3057557B2 (ja) 新規酵母とその用途
Ivannikova et al. Viral dsRNA in the wine yeast Saccharomyces bayanus var. uvarum
EP0008554B1 (fr) Levure sèche active de panification; procédé et souche permettant de l'obtenir, application à la fermentation
JP2009171912A (ja) エタノール発酵性ヘテロタリズム酵母
TWI748420B (zh) 一種生產2,3-丁二醇的重組克雷白氏菌屬以及製造2,3-丁二醇的方法
CN108384809A (zh) 一种多倍体工业啤酒酵母菌株ura3基因缺陷型的回复方法
WO2012085386A1 (fr) Nouvelles souches de levure de panification
Palacio‐Bielsa et al. First report of bacterial soft rot on onion caused by Dickeya sp.(ex Pectobacterium chrysanthemi) in Spain
JP2006288267A (ja) Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母のプロトプラスト製造方法
JP5807896B2 (ja) 有機酸組成の優れた自然変異株清酒酵母分離法
Ito-Kuwa et al. Further characterization of respiratory mutants of Candida albicans
Drygaś et al. Yeast metabolic adaptation to environment
Usatii et al. Innovative Solutions for Cultivation of Ss-Glucans Producing Yeast
JPH0614766A (ja) 酵母融合株
JP2018183119A (ja) パン酵母、パンの製造方法、パン生地及びパン
JPS61108376A (ja) 凝集性と発酵能を備えた酵母の製造法