BRPI0918773B1 - Novas cepas de levedura para a produção de álcool - Google Patents

Novas cepas de levedura para a produção de álcool Download PDF

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Description

(54) Título: NOVAS CEPAS DE LEVEDURA PARA A PRODUÇÃO DE ÁLCOOL (51) lnt.CI.: C12N 1/18; C12R 1/865 (30) Prioridade Unionista: 16/09/2008 FR 08 05 056 (73) Titular(es): LESAFFRE ET COMPAGNIE (72) Inventor(es): DIDIER COLAVIZZA; RENAUD TOUSSAINT (85) Data do Início da Fase Nacional: 16/03/2011
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: NOVAS CEPAS DE LEVEDURA PARA A PRODUÇÃO DE ÁLCOOL .
Campo Técnico ' - - A presente invenção se refere a novas cepas de levedura e leveduras que se originam dessas novas cepas destinadas à produção de álcool, e também a um método para obter tais cepas.
Antecedentes da Invenção
Leveduras são freqüentemente submetidas a mutações durante sua multiplicação e durante seu uso em fermentação, em particular na escala industrial. Entretanto, essas leveduras retêm genericamente um fenótipo normal porque as mutações são freqüentemente mutações recessivas e as cepas industriais são normalmente aneuplóides ou poliplóides (The
Alcohol Textbook, Ed Jacques (2003)) .
A reciclagem de levedura é freqüentemente utilizada em fermentação alcoólica. A reciclagem de levedura consiste em vários usos sucessivos das leveduras, sem começar novamente a partir das leveduras iniciais ou cepa inicial. Desse modo, todas ou parte das leveduras que se originam de uma fermentação i são utilizadas para uma fermentação subsequente i+1; então todas ou parte das leveduras que se originam da fermentação i+1 são utilizadas para uma fermentação i+2, e assim por diante.
A reciclagem de leveduras, às vezes chamada de subcultura serial na literatura, é uma técnica que expõe a levedura .a um.grande número de tensões que podem levar a mutações em sua herança genética e derivações genéticas.
Em seu trabalho, Powell e Diacetis (2007, J. Inst.
Brew. 1131(1), 67-74) estudam o impacto da reciclagem de leveduras de cerveja sobre seu fenótipo. Ao término de cada fermentação, uma parte da biomassa de levedura é tirada para realizar a fermentação subseqüente. Powell e Diacetis não observaram modificação nas características de fermentação das leveduras durante subculturas sucessivas, em mais de aproximadamente 135 gerações.
Verma e outros (1983) estudaram, além disso, a vantagem de reciclagem de várias cepas Saccharomyces cerevisiae no contexto de produção de etanol. Após cada fermentação alcoólica, as leveduras são subcultivadas para fins de uma fermentação adicional, e a quantidade de álcool produzido ao término de cada fermentação é medida. Os autores demonstraram várias cepas de levedura capazes de serem submetidas a 6 a 10 subculturas sucessivas sem que sua produção de álcool seja substancialmente modificada.
Desse modo, na literatura, a estabilidade de levedura em termos de produção de álcool foi, portanto, estudada no contexto de reciclagem de levedura em fermentação alcoólica.
Quando multiplicado em um processo industrial convencional, a levedura mais eficaz, em termos de produção de álcool, conhecida da companhia requerente às vezes mostra, entretanto, diminuições consideráveis na quantidade de álcool produzido. Entretanto, multiplicação de levedura em escala industrial iniciando a partir de uma cepa de levedura deve resultar em uma cepa de qualidade segura. 0 termo qualidade segura pretende aqui sinalificar que a quantidade de álcool produzido pela levedura, em um esquema de fermentação de álcool dado, é relativamente constante.
Além disso, o mercado para levedura destinada à produção de álcool está sempre exigindo leveduras que sejam mais eficazes em termos de quantidade de álcool produzido.
Há, portanto, necessidade real em fornecer novas cepas de levedura que forneçam leveduras de qualidade segura e que sejam preferivelmente eficazes em termos de quantidade de álcool produzido.
Sumário da Invenção
Um primeiro assunto da invenção é fornecer novas cepas de levedura estáveis.
Um assunto da presente invenção é desse modo uma cepa de Saccharomyces cerevisiae estável escolhida a partir da cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4073, a cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4074 ou a cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4075.
Um segundo, assunto da invenção é fornecer um novo método para obter cepas de levedura estáveis, o método compreendendo as etapas de:
- cruzar uma cepa de Saccharomyces instável com ela própria ou com outra cepa de Saccharomyces, de modo a obter pelo menos um híbrido,
- cultivar pelo menos um híbrido, de modo a obter uma população de levedura RO,
- realizar n subculturas sucessivas da população de levedura RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6, de modo a obter uma população de levedura Rn,
- medir a produção de álcool da população RO e medir a produção de álcool da população Rn,
- selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 95% daquela da população RO, de modo a obter cepas de levedura estáveis.
Um assunto da presente invenção é particularmente um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, compreendendo uma etapa adicional de selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população RO é maior ou igual a 95% daquela de uma população RO da cepa depositada com o CNCM em 4 de setembro de 2008, de acordo com o número 1-4072.
Um assunto da presente invenção também é um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, compreendendo uma etapa adicional de selecionar pelo menos um híbrido que tem um rendimento de biomassa maior ou igual a 90% do rendimento de biomassa da cepa 1-4072.
Um assunto da presente invenção também é um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, caracterizado pelo fato de que a etapa de cruzar cepas de levedura compreende as seguintes etapas:
- esporular a referida cepa Saccharomyces instável e opcionalmente, a outra dita cepa Saccharomyces, de modo a obter segregantes,
- cultivar cada segregante, de modo a obter uma população RO para cada segregante, realizar m subculturas sucessivas de cada segregante, de modo a obter uma população Rm de cada segregante, m sendo um número inteiro maior ou igual a 6,
- medir a produção de álcool da população R0 e medir a produção de álcool da população Rm de cada segregante,
- selecionar os segregantes para os quais:
> a produção de álcool da população Rm seja maior ou igual a 70% daquela da população RO do segregante, e > a produção de álcool da população Rm seja maior ou igual a 85% daquela da população RO da cepa I4072, de modo a obter segregantes eficazes e ~ estáveis, e cruzar segregantes eficazes, estáveis que se originam da cepa instável com segregantes eficazes e estáveis de sinal oposto que se originam de cepa instável ou de outra cepa, de modo a obter pelo menos um híbrido.
Um assunto da presente invenção é particularmente um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, no qual a cepa de levedura instável é a cepa 1-4072.
assunto da presente invenção também é um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, em que a outra cepa é escolhida da cepa 1-4071, a cepa I4073, a cepa 1-4074 ou a cepa 1-4075.
Um terceiro assunto da invenção refere-se a uma cepa de levedura que pode ser obtida por intermédio do método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima.
Um quarto assunto da invenção é a provisão de uma cepa Saccharomyces cerevisiae derivada de uma cepa como definido acima, caracterizado pelo fato de que:
- a produção de álcool de uma população Rn da cepa derivada é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma população R0 da cepa derivada, e/ou
- a produção de álcool de uma população RO da cepa derivada é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma população-RO da cepa depositada como CNCM sob o número
1-4072,
A população Rn se originando de n subculturas sucessivas da população RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6.
Um quinto assunto da invenção é a provisão de um método novo para avaliar a estabilidade de uma cepa de levedura, compreendendo as etapas de:
- cultivar a cepa, de modo a obter uma população de levedura RO,
- realizar n subculturas sucessivas da população de levedura RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6, de modo a obter uma população de levedura Rn,
- medir a produção de álcool da população RO e medir a produção de álcool da população Rn,
- descrever a cepa como estável se a produção de álcool da população Rn for maior ou igual a 95% da produção de álcool da população RO.
Um sexto assunto da invenção refere-se a uma levedura obtida por cultivar uma cepa de levedura como definido acima.
Um assunto da presente invenção é particularmente uma levedura como definido acima, caracterizado pelo fato de que a produção de álcool da mesma é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma levedura que se origina da cepa
1-4072.
Um assunto da presente invenção também é uma levedura como definido acima, caracterizado pelo fato de que tem a forma de levedura em creme, levedura prensada, levedura seca ou levedura ultracongelada.
Um sétimo assunto da invenção refere-se ao uso de uma levedura como definido acima, para a produção de álcool.
Descrição Detalhada da Invenção
Um assunto da presente invenção é fornecer novas cepas de Saccharomyces cerevisiae e novas leveduras que se originam dessas cepas destinadas à produção de álcool, as leveduras sendo de qualidade segura e preferivelmente sendo eficazes em termos de quantidade de álcool produzido.
Para obter uma levedura de qualidade segura, é necessário ter uma cepa de levedura estável.
Uma cepa de levedura estável indica aqui uma cepa que fornece leveduras das quais a produção de álcool é relativamente estável sobre as gerações.
Para obter uma levedura que seja eficaz, em termos de quantidade de álcool produzido, é necessário ter uma cepa de levedura que seja eficaz em termos de quantidade de álcool produzido.
As expressões produção de álcool, produção de etanol., 2)quantidade de álcool produzido e quantidade de etanol produzido são sinônimos aqui.
Qualquer cepa que não corresponda à definição de uma cepa estável é descrita como uma cepa instável.
De forma surpreendente e inesperada, a companhia requerente demonstrou que, durante a multiplicação em escala industrial de leveduras, iniciando a partir da cepa
1-4072, variantes aparecem, cuja produção de álcool é baixa. Após certo número de gerações, a proporção crescente de variantes resulta em uma diminuição considerável na quantidade de álcool produzido.
Agora, esse problema de estabilidade em termos de 15 produção de álcool, que aparece durante a multiplicação de levedura nunca foi demonstrado na literatura.
Isso é porque os documentos do estado da técnica lidam com o problema de estabilidade de cepa somente no contexto de reciclagem de levedura entre várias fermentações alcoólicas.
Havia, portanto, necessidade de fornecer um método para distinguir cepas de levedura estáveis a partir de cepas de levedura instáveis.
Para ser capaz de verificar que uma cepa de levedura seja estável, em termos de produção de álcool, a companhia requerente desenvolveu um método novo para avaliar a natureza sólida de uma cepa.
Esse método original para avaliar a estabilidade de uma cepa de levedura se baseia em realizar várias subculturas sucessivas iniciando a partir da cepa a ser avaliada, para obter uma multiplicação das leveduras que simulam aquela obtida durante uma multiplicação em escala industrial.
O método para avaliar a estabilidade de uma cepa de levedura de acordo com a invenção compreende uma combinação original de duas etapas:
uma primeira etapa consistindo em várias subculturas sucessivas iniciando a partir da cepa inicial, e
uma segunda etapa de comparar a produção de álcool da população de levedura obtida ao término das subculturas sucessivas com aquela da cepa inicial a ser avaliada.
Desse modo, se a produção de álcool da população de levedura obtida ao término das subculturas não for substancialmente diminuída em comparação com a produção de álcool da cepa inicial a ser avaliada, a cepa é descrita como uma cepa estável.
A primeira etapa de subculturas sucessivas resulta preferivelmente em diversas gerações de levedura maior ou igual àquele obtido ao término de uma multiplicação “de~ levedura em escala industrial.
método para avaliar a estabilidade de uma cepa de acordo com a invenção tem muitas vantagens. É em particular um método rápido que fornece resultados seguros e que pode ser implementado no laboratório.
A implementação do método de acordo com a invenção provê uma vantagem considerável para um fabricante, igualmente em termos de tempo, custo e qualidade de seus produtos, por evitar em particular a realização de várias multiplicações industriais de uma cepa instável.
Um assunto da presente invenção é desse modo um método para avaliar a estabilidade de uma cepa de levedura, compreendendo as etapas de:
- cultivar a cepa, de modo a obter uma população de levedura RO,
- realizar n subculturas sucessivas da população de levedura RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6, de modo a obter uma população de levedura Rn,
- medir a produção de álcool da população RO e medir a produção de álcool da população Rn,
- descrever a cepa como estável se a produção de álcool da população Rn for maior ou igual a 95% da produção de álcool da população RO.
A expressão cepa de levedura indica uma população relativamente homogênea de células de levedura.
Uma cepa de levedura é obtida a partir do isolamento de um clone, um clone sendo uma população de células obtidas de uma única célula de levedura.
A cepa a ser avaliada é em particular uma cepa destinada à produção de leveduras utilizadas em destilação e/ou fabricação de vinho e/ou em fabrico de cerveja e/ou para a produção de bebidas fermentadas.
A cepa a ser avaliada é preferivelmente uma cepa
Saccharomyces, em particular uma cepa Saccharomyces cerevisiae.
O método de acordo com a invenção não é limitado a
avaliar a estabilidade de cepas de levedura. Pode ser
aplicado também a leveduras •
0 termo leveduras indica leveduras obtidas por
cultivar início de uma cepa de levedura.
0 cultivo da cepa de levedura a ser avaliada é
realizado em um meio de cultura apropriado para o crescimento da cepa de levedura.
Os técnicos versados no assunto são capazes de determinar a composição de um meio apropriado para uma dada cepa de levedura.
O cultivo da cepa de levedura pode ser realizado em um meio líquido ou em um meio Agar.
O cultivo da cepa de levedura é preferivelmente realizado em um meio Agar.
O cultivo da cepa de levedura é genericamente realizado em uma temperatura de 25°C a 35°C, preferivelmente de 28°C a 32°C.
O cultivo da cepa de levedura é genericamente realizado em uma temperatura de 30°C.
O cultivo da cepa de levedura a ser avaliada resulta em uma população de levedura denominada RO.
A seguir, n subculturas sucessivas são realizadas iniciando a partir da população RO. Isso sinalifica que toda ou parte da cultura que corresponde à população de levedura RO é inoculada para a cultura seguinte que resulta em uma população de levedura Gl; então toda ou parte da cultura correspondendo à população de levedura Gl é inoculada para a cultura seguinte que resulta em uma população de levedura G2, e assim por diante, até a cultura que resulte em uma população de levedura Rn.
As n subculturas sucessivas são preferivelmente realizadas em intervalos de tempo regulares.
Preferivelmente, as n subculturas sucessivas são *
subculturas diárias.
Em uma modalidade preferida, as n subculturas são realizadas no mesmo meio e/ou na mesma temperatura e/ou com a mesma quantidade de biomassa inoculada.
A biomassa é definida como a massa de uma população de levedura.
Por exemplo, durante cada subcultura, uma biomassa correspondendo a uma massa seca de 0,05 mg de leveduras é inoculada, preferivelmente na superfície de um meio de
Agar.
Se necessário, a biomassa colhida ao término de uma subcultura pode ser armazenada a 4°C por vários dias, por exemplo 1 a 2 dias, antes de ser inoculada para a subcultura seguinte.
As subculturas sucessivas podem ser realizadas como indicado no exemplo 1.
O método para avaliar a estabilidade de uma cepa compreende um número de subculturas maior ou igual a 6, preferivelmente maior ou igual a 10, mais preferivelmente maior ou igual 12, e ainda mais preferivelmente maior ou igual a 14.
Em uma modalidade preferida, o método de avaliação de acordo com a invenção compreende 12 subculturas sucessivas.
É possível determinar o número de gerações de levedura obtidas após n subculturas sucessivas por calcular o número de gerações obtidas entre cada das n subculturas (cf. Yeast -Physiology and Biotechnology, 1998, Graeme M.
Walker, publicado por Wiley, pág. 143).
O número de gerações ng entre duas subculturas sucessivas i e i + 1 é obtido por:
medir a biomassa (X±) inoculada para a ia subcultura e a biomassa (Χ±+ι) colhida ao término da ia subcultura, então
- aplicar a seguinte fórmula:
ng = 3,3 log (Xi+i/ X±)
A biomassa X pode ser expressa como número de células de levedura ou como peso de matéria seca.
número de células de levedura é determinado por métodos convencionais bem conhecidos por aqueles versados na técnica, como contagem sob um microscópio ou citometria de fluxo.
peso da matéria seca é determinado por métodos convencionais bem conhecidos por um técnico versado no assunto.
número total de gerações obtidas após n subculturas sucessivas corresponde à adição do número de gerações obtidas entre cada subcultura.
Como exemplo, o número de gerações obtidas durante 12 subculturas diárias sucessivas é da ordem de aproximadamente 60 gerações.
Um número de gerações, maior.ou igual àquele obtido ao término de uma multiplicação de levedura em escala industrial, que é genericamente da ordem de aproximadamente a aproximadamente 60 gerações, é desse modo obtido.
Esse método original para avaliar a estabilidade de uma cepa de levedura desse modo torna possível obter, na escala de laboratório, um número de gerações maior ou igual àquele obtido durante uma multiplicação industrial de leveduras.
Preferivelmente, as condições do método para avaliar a estabilidade de uma cepa tornam possível obter pelo menos 30 gerações, preferivelmente pelo menos 40 gerações, mais preferivelmente pelo menos 50 gerações, e ainda mais preferivelmente pelo menos 60 gerações.
A produção de álcool é medida por qualquer meio apropriado conhecido por um técnico versado no assunto. Pode ser uma medição direta do etanol produzido ou uma medição indireta através de um parâmetro correlacionado com a produção de álcool.
Por exemplo, a produção de álcool pode ser medida por cromatografia, em particular por HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência) , um kit enzimático (por exemplo, o kit Boehringer para ensaiar etanol) ou um ensaio com dicromato de potássio.
A produção.de Álcool· é preferivelmente medida em um teste de fermentação alcoólica como descrito no exemplo 1.
Em tal teste, a cepa de levedura é multiplicada em um meio líquido, preferivelmente em duas etapas: uma etapa de pré-cultura seguida por uma etapa de cultura. A fermentação alcoólica é então realizada, por exemplo, iniciando a partir de 1 g de levedura de matéria seca, a 35°C, sob condições anaeróbicas, preferivelmente sob agitação.
substrato para a fermentação alcoólica tem preferivelmente a forma de sacarose inicialmente presente no meio de cultura, por exemplo, em uma concentração de 240 g/L.
A medição de produção de álcool expressa como percentagem por volume.
A curva de fermentação alcoólica quantidade de álcool produzido como uma compreende genericamente três fases:
- uma fase lag, durante a qual não é genericamente representando a função de tempo há produção de etanol, uma fase exponencial, e uma fase platô, essa fase correspondendo à quantidade máxima de etanol produzido durante essa fermentação alcoólica.
A produção de álcool pode ser medida em um tempo (t) que está no final da fase exponencial ou durante a fase platô.
A produção de álcool pode ser medida em ti e/ou t2 como definido abaixo.
A medição em ti está no final da fase exponencial, em um tempo maior ou igual àquele que corresponde a 95% da quantidade máxima de álcool produzido.
Essa medição de ti torna possível em particular, avaliar a cinética de produção de álcool.
A medição em t2 é durante a fase platô, isto é, quando a fermentação alcoólica é finalizada.
final da fermentação alcoólica corresponde ao tempo no qual não há mais açúcar residual, no meio, que pode ser fermentado pela levedura.
Essa medição em t2 também torna possível avaliar o volume máximo de álcool produzido.
Como exemplo, sob as condições definidas nos exemplos, a produção de álcool pode ser medida a ti = 48 h e/ou em t2 = 72 h.
A última etapa no método para avaliar a estabilidade de uma cepa consiste em descrever como uma cepa estável, uma cepa da qual a produção de álcool de sua população Rn é maior ou igual a 95% da produção de álcool de sua população
RO.
A cepa é em particular descrita como uma cepa estável quando a produção de álcool da população Rn da cepa é maior ou igual a 97%, preferivelmente maior ou igual a 99% da produção de álcool de sua produção RO.
Uma cepa é descrita como uma cepa instável quando a produção de álcool da população Rn da cepa é menor do que
95% da produção de álcool de sua população RO.
A implementação do método para avaliar a estabilidade de uma cepa de acordo com a invenção torna possível confirmar que a cepa 1-4072 seja uma cepa instável: a produção de álcool de sua população R12 é iguala 49% em ti = 48 h e a 46,9% em t2 = 72 h, da produção de álcool de sua população RO (vide o exemplo 1).
Além disso, a companhia requerente também desenvolveu um método original novo para obter cepas de levedura estáveis.
A implementação desse método tornou em particular 20 possível obter as três novas cepas de Saccharomyces cerevisiae depositadas em 4 de setembro de 2008, de acordo com o Tratado de Budapeste, com o CNCM (Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes [Coleção nacional de culturas de microorganismo], Institut Pasteur, 25 rue Du
Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, França) sob os números 1-4073, 1-4074 e 1-4075.
Um assunto da -presente invenção é desse modo uma cepa de Saccharomyces cerevisiae escolhida da cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4 07 3, a cepa depositada com o
CNCM sob o número 1-4074 ou a cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4075.
Essas três cepas de leveduras são ambas estáveis e eficazes.
A estabilidade dessas cepas de levedura é refletida pela pequena diferença na quantidade de álcool produzido, após n subculturas sucessivas, comparadas com a cepa inicial.
A avaliação da estabilidade das cepas de acordo com a invenção pode ser realizada como descrito acima no método para avaliar a estabilidade de uma cepa.
A estabilidade das três cepas de acordo com a invenção é desse modo refletida por uma diminuição na produção de álcool menor do que 3% após n subculturas, ao passo que uma cepa instável como a cepa de referência I4072 mostra uma diminuição em produção de álcool maior do que 50% (vide o exemplo 1).
A eficácia das cepas de levedura de acordo com a invenção é refletida por uma produção de álcool das cepas similares àquela da cepa de referência 1-4072.
A eficácia das três cepas de leveduras de acordo com a invenção é, desse modo, refletida por uma produção de álcool das cepas maior ou igual a 95% daquela da cepa de referência.
A cepa Saccharomyces cerevisiae depositada em 4 de setembro de 2008 com o CNCM sob o número 1-4075 tem em particular as seguintes características:
- a produção de álcool da população R12 da cepa é maior ou igual a 97% da produção de álcool da população RO da cepa, a população R12 que se origina de 12 subculturas diárias sucessivas da população RO, e
- a produção de álcool da população RO da cepa é maior ou igual a 99% da produção de álcool da população RO da cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4072 (durante uma medição em 48 h).
A cepa Saccharomyces cerevisiae depositada em 4 de setembro de 2008 com o CNCM sob o número 1-4073 tem em particular as seguintes características:
- a produção de álcool da população R12 da cepa é maior ou igual a 98% da produção de álcool da população RO da cepa, a população R12 que se origina de 12 subculturas diárias sucessivas da população RO, e
- a produção de álcool da população RO da cepa é maior ou igual a 99% da produção de álcool da população RO da cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4072.
A cepa Sac-charomyces. cerevisiae depositada em 4 de setembro de 2008 com o CNCM sob o número 1-4074 tem em particular as seguintes características:
- a produção de álcool da população R12 da cepa é maior ou igual a 98% da produção de álcool da população RO da cepa, a população R12 que se origina de 12 subculturas diárias sucessivas da população RO, e
- a produção de álcool da população RO da cepa é maior ou igual a 99% da produção de álcool da população RO da cepa depositada com o CNCM sob o número 1-4072.
Um assunto da presente invenção é, portanto as três cepas descritas acima e todas as cepas que pertencem à mesma família, em particular todas as cepas derivadas que partilham as mesmas propriedades que essas três cepas.
Além disso, um assunto da presente invenção é um método original novo para obter cepas de levedura estáveis, com base na seleção de cepas novas que correspondem à descrição de cepa estável no método para avaliar a estabilidade de uma cepa como definido acima.
A seleção é realizada em novas cepas de levedura obtidas por técnicas convencionais.
Uma técnica convencional consiste em uma etapa de esporular leveduras para obter segregantes, seguida por uma etapa de cruzar os segregantes de modo a obter híbridos. Os híbridos constituem as cepas de levedura que são substancialmente selecionadas no critério de estabilidade.
Um assunto da presente invenção é desse modo um método para obter cepas de levedura estáveis, o método compreendendo as etapas de:
- cruzar uma cepa de Saccharomyces instável com ela própria ou com outra cepa de Saccharomyces, de modo a obter pelo menos um híbrido,
- cultivar pelo menos um. híbrido, de modo a obter uma população de levedura RO,
- realizar n subculturas sucessivas da população de levedura RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6, de modo a obter uma população de levedura Rn,
- medir a produção de álcool da população RO e medir a produção de álcool da população Rn,
- selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 95% daquela da população RO, de modo a obter cepas de levedura estáveis.
A etapa de cruzamento é realizada de acordo com técnicas convencionais, como aquelas ensinadas no capítulo
Sporulation and. Hybridization of Yeast de R.R. Fowell, do manual de referência The Yeasts, Volume 1, editado por
A.H. Rose e J. S. Harrison, 1969- Academic Press.
As etapas de cultivar pelo menos um híbrido, realizando n subculturas sucessivas e medindo a produção de álcool são similares àqueles do método para avaliar a estabilidade de uma cepa.
As condições para realizar essas etapas são, portanto iguais àquelas descritas acima no contexto do método para avaliar a estabilidade de uma cepa.
A última etapa no método para obter cepas de levedura estáveis consiste em selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 95% daquela da população RO, tal híbrido constituindo uma cepa de levedura estável.
Preferivelmente, a última etapa no método para obter cepas de levedura estáveis consiste em selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 97% daquela da população
RO.
Um assunto da presente invenção é particularmente um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, em que a última etapa de seleção compreende selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 97% daquela da população RO, preferivelmente maior ou igual a 99% daquela da população RO.
As cepas estáveis de acordo com a invenção, a cepa instável utilizada na etapa de cruzamento e a outra cepa
Saccharomyces utilizada na etapa de cruzamento podem ser cepas homotálicas ou heterotálicas.
Em uma modalidade preferencial da invenção, as cepas estáveis de acordo com a invenção, as cepas instáveis usada na etapa de cruzamento e a referida outra cepa de
Saccharomyces usada na etapa de cruzamento são cepas heterotálicas.
Um assunto da presente invenção também é um método para obter cepas de levedura que são tanto estáveis como eficazes em termos de produção de álcool.
Um assunto da presente invenção é desse modo um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, compreendendo uma etapa adicional de selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população RO é maior ou igual a 95% daquela da população RO da cepa 1-4072.
Essa etapa adicional de selecionar com base na eficácia em termos de produção de álcool é realizada antes ou após a etapa de selecionar os híbridos no critério de estabilidade.
Um assunto da presente invenção é particularmente um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, nos quais a etapa de seleção adicional compreende selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população RO é maior ou igual a 97%, preferivelmente maior ou igual a 99% daquela da população
RO da cepa 1-4072.
Um assunto da presente invenção também é um método para obter cepas de levedura que são tanto estáveis como eficazes em termos de produção de álcool e que têm bom rendimento de biomassa.
O termo rendimento ou rendimento de biomassa ou rendimento de produção de biomassa indica aqui a razão da massa de levedura produzida para a massa de açúcar utilizada durante a multiplicação das leveduras.
Um sujeito da presente invenção é desse modo um método para obter cepas de levedura estáveis como definido acima, compreendendo uma etapa adicional de selecionar pelo menos um híbrido que tem um rendimento de biomassa maior ou igual a 90% do rendimento de biomassa da cepa 1-4072, preferivelmente maior ou igual a 95% e mais preferivelmente maior ou igual a 98%.
Essa etapa adicional de selecionar com base no rendimento de biomassa é realizada antes ou após a etapa de selecionar os híbridos no critério de estabilidade e, se necessário, antes ou após a etapa de selecionar com base em eficácia em termos de produção de álcool.
Vantajosamente, o rendimento de biomassa das cepas de acordo com a invenção é maior ou igual a 90%, preferivelmente maior ou igual a 95%, mais preferivelmente maior ou igual a 98% do rendimento de biomassa obtido com a cepa 1-4072.
Em uma modalidade preferida, o método para obter cepas de levedura estáveis compreende uma pré-seleção no nível de segregante.
Os segregantes obtidos após esporulação das leveduras são então selecionados com base em estabilidade e eficácia.
Um assunto da presente invenção é desse modo um método para obter novas cepas de levedura estáveis como definido acima, caracterizado pelo fato de que a etapa de cruzar cepas de levedura compreende as seguintes etapas:
esporular a cepa de Saccharomyces instável e opcionalmente a outra cepa de Saccharomyces, de modo a obter segregantes;
cultivar cada segregante, de modo a obter uma
população RO para cada segregante,
realizar m subculturas sucessivas de cada
segregante, de modo a obter uma população Rm de cada segregante, m sendo um número inteiro maior ou igual a 6,
- medir a produção de álcool da população RO e medir a produçãode álcool da populaçãoRm de cada segregante,
- selecionar os segregantes para os quais:
> a produção de álcool da população Rm é maior ou igual a 70% daquela da população RO do segregante, e > a produção de álcool da população Rm é maior ou igual a 85% daquela de uma população RO da cepa I4072, de modo a obter segregantes estáveis, eficazes, e
cruzar segregantes estáveis eficazes que se originam da cepa instável com segregantes estáveis eficazes de sinal oposto que se originam da cepa instável ou de outras cepas, de modo a obter pelo menos um híbrido.
As etapas de cultivar cada segregante, de realizar m subculturas sucessivas e de medir a produção de álcool são similares àquelas do método para avaliar a estabilidade de uma cepa.
As condições para implementar essas etapas são, portanto, iguais àquelas descritas acima no contexto do método para avaliar a estabilidade de uma cepa.
A etapa de selecionar os segregantes com base em estabilidade e eficácia em termos de produção de álcool resulta na obtenção de segregantes estáveis, eficazes com base em critérios que são menos seletivo do que aqueles aplicados aos híbridos ou às cepas de levedura.
Em uma modalidade específica do método para obter cepas de levedura estáveis, a cepa de levedura instável é a cepa 1-4072.
Em uma modalidade específica do método para obter cepas de levedura estáveis, a outra cepa de levedura é escolhida entre cepa 1-4071, cepa 1-4073, cepa 1-4074 ou a cepa 1-4075.
A outra etapa de levedura é preferivelmente uma cepa
Saccharomyces cerevisiae.
Um assunto da presente invenção também é uma cepa de levedura que pode ser obtida por intermédio do método para obter cepas como definido acima.
Um assunto da presente invenção é em particular uma cepa de levedura obtida por intermédio do método para obter cepas como definido acima.
Um assunto da presente invenção também são todas as cepas derivadas das cepas de levedura estáveis de acordo 20 com a invenção que compartilham as mesmas propriedades.
A expressão cepa derivada indica uma cepa derivada por qualquer transformação, por exemplo, um ou mais cruzamentos e/ou uma ou mais mutações e/ou uma ou mais transformações genéticas.
Uma cepa derivada por cruzamento pode ser obtida por cruzamento de uma cepa de acordo com a invenção com a mesma cepa, ou outra cepa~ de acordo com a invenção ou qualquer outra cepa.
Uma cepa derivada por mutação pode ser uma cepa que foi submetida pelo menos a uma mutação espontânea em seu genoma ou pelo menos uma mutação induzida, por exemplo, induzida por mutagênese.
A(s) mutação(ões) da cepa derivada é(são) silenciosas ou não.
O termo mutagênese indica mutagênese tanto convencional obtida por radiação ou por agentes químicos mutagênicos como mutagênese de inserção por transposição ou por integração de um fragmento de DNA exógeno.
A mutagênese por radiação compreende o uso de radiação UV, X ou gama.
Os agentes químicos mutagênicos são, por exemplo, EMS (sulfonato de metano etila), EES (sulfonato de etano etila), nitrosoguanidina, ácido nitroso, aflatoxina Bl, hidroxil amina, 5-bromouracil, 2-aminopurina, proflavina e acridina laranja.
Uma cepa derivada por transformação genética é uma cepa na qual um DNA exógeno foi introduzido.
O referido DNA exógeno pode ser fornecido por um plasmideo.
O referido DNA exógeno é preferivelmente integrado no genoma da levedura.
Um assunto da presente invenção é desse modo uma cepa
Saccharomyces cerevisiae derivado de uma cepa de levedura estável como definido acima, caracterizado pelo fato de que:
- a produção de álcool de uma população Rn da cepa derivada é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma população RO da cepa derivada, e/ou
- á produção de álcool de uma população RO da cepa derivada é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma população RO da cepa depositada com o CNCM sob o número
1-4072,
- a população Rn que se origina de n subculturas sucessivas da população RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6.
número de subculturas é preferivelmente igual a 12 e são preferivelmente subculturas diárias.
Um assunto da presente invenção é partícularmente uma cepa Saccharomyces cerevisiae derivada de uma cepa como definido acima, caracterizado pelo fato de que:
- a produção de álcool de uma população Rn da cepa derivada é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma população RO da cepa derivada, preferivelmente maior ou igual a 97%, mais preferivelmente maior ou igual a 99% e
- a_ produção de. álcool de uma população RO da cepa derivada é maior ou igual a 95% da produção de álcool de uma população RO da cepa depositada com o CNCM sob o número
1-4072, preferivelmente maior ou igual a 97%, mais preferivelmente maior ou igual a 99%,
- a população Rn que se origina de n subculturas sucessivas da população RO, n sendo um número inteiro maior ou igual a 6.
Um assunto da invenção também é um método para transformar uma cepa de levedura estável, de modo a obter uma cepa derivada como definido acima, o método de transformação compreendendo uma etapa de transformar a cepa por intermédio de pelo menos um cruzamento e/ou pelo menos uma mutação e/ou pelo menos uma transformação genética.
Um assunto da presente invenção também é uma levedura obtida por cultivar uma cepa de levedura como definido acima.
As leveduras são produzidas começando a partir de cepas de levedura estáveis de acordo com a invenção em particular como descrito no manual de referência Yeast
Technology 2a edição, 1991, G. Reed e T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
A multiplicação em escala industrial de leveduras compreende, em geral, pelo menos as duas primeiras etapas e a última etapa do conjunto das seguintes erapas:
multiplicar uma cepa de levedura em vários estágios, primeiramente sob condições semi-anaerobicas, e então sob condições aeróbicas,
- separar a levedura desse modo produzida,a partir de seu meio de cultura, por centrifugação de modo a obter uma levedura de creme líquido contendo aproximadamente entre
12% e 25% de matéria seca, ou mesmo uma quantidade mais elevada de matéria seca se a levedura de creme for misturada com produtos de osmolite,
- filtrar a levedura de creme líquido resultante, em geral em um filtro giratório a vácuo, de modo a obter uma levedura fresca desidratada contendo de 26% a 35% de matéria seca,
- misturar a levedura fresca desidratada, de modo a obter uma massa homogênea,
- extrusar a levedura resultante, de modo a obter > uma levedura prensada na forma de massas de levedura fresca ou de levedura fresca esfarelada, contendo aproximadamente 30% de matéria seca, ou > uma levedura na forma de partículas, em geral de grânulos, se a levedura for destinada a ser seca,
- opcionalmente secar em um modo econômico, em um fluxo de ar quente, por exemplo por f luidificação, das partículas de levedura obtidas por extrusão, de modo a obter levedura seca,
- embalar.
A etapa de secagem é preferivelmente uma secagem rápida econômica na presença de um emulsificante.
Entre os emulsificantes que podem ser utilizados durante a etapa de secagem, monoestearato de sorbitano, utilizado, por exemplo, em uma concentração de aproximadamente 1,0% (em peso em relação ao peso de levedura seca), pode ser escolhido.
As leveduras de acordo coma invenção são leveduras que são de qualidade confiável e que são preferivelmente eficazes em termos de produção de álcool.
As leveduras de acordo com a invenção podem ser utilizadas em qualquer forma possível.
Por exemplo, um assunto da presente invenção é uma levedura como definido acima, caracterizada pelo fato de que tem a forma de levedura em creme, de levedura prensada, de levedura seca ou de levedura ultra congelada.
Leveduras frescas são caracterizadas por elevado teor de água em comparação com leveduras secas. Leveduras frescas abrangem leveduras em creme e leveduras prensadas.
Leveduras em creme, também chamadas leveduras líquidas, são suspensões aquosas de células de levedura tendo uma viscosidade do tipo creme.
O termo levedura em creme é entendido como sinalificando uma suspensão líquida, tipicamente uma suspensão aquosa, de células de levedura viva, a suspensão tendo um teor de matéria seca de pelo menos 12% em massa, genericamente compreendido de aproximadamente 12% a aproximadamente 50% em massa (definição ampla de levedura em creme).
Preferivelmente, a levedura em creme corresponde à definição no sentido estrito, isto é, tem um teor de matéria seca compreendido de aproximadamente 12% a aproximadamente 25% em massa, preferivelmente de aproximadamente 14% a aproximadamente 22% em massa.
Entre as leveduras prensadas, uma distinção é feita entre leveduras prensadas como um bloco compacto, também chamadas massas de levedura, que são caracterizadas por um teor de matéria seca compreendido de aproximadamente 26% a aproximadamente 35%, e leveduras prensadas como grânulos, que são caracterizados por um teor de água compreendido de aproximadamente 21% a aproximadamente 35%.
As leveduras secas são caracterizadas por um teor de matéria seca maior do que aproximadamente 92%.
As leveduras “ultra congeladas são caracterizadas por um teor de matéria seca compreendido de aproximadamente 74% a aproximadamente 80%.
A levedura de acordo com a invenção tem, portanto as características desejadas para uma levedura destinada à produção de álcool, a saber, uma qualidade confiável e uma produção eficaz de álcool.
Um assunto da presente invenção é desse modo também o uso de uma levedura como definido acima, para a produção de álcool.
As condições de fermentação alcoólica dependem em particular do tipo de aplicação desejada, por exemplo, de acordo com se é uma fermentação de fabricação de cerveja, fabricação de vinho ou destilação.
As condições de fermentação alcoólica podem ser prontamente determinadas por um técnico versado no assunto.
Como exemplo, pode-se fazer referência às condições de fermentação alcoólica descritas no manual de referência
Yeast Technology, 2a edição, 1991, G. Reed and T.W.
Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0442-31892-8.
As leveduras de acordo com a invenção são partícularmente vantajosas nas seguintes aplicações:
- álcool de beber, destinado à produção de bebidas alcoólicas, e/ou álcool industrial destinado, por exemplo, a biocombustíveis ou a indústrias químicas.
A presente invenção será ilustrada agora por intermédio dos seguintes exemplos que são dados como ilustração e, de modo algum, limitantes.
Os exemplos descrevem em particular um método para obter cepas de levedura estáveis de acordo com a invenção e as características das cepas de levedura estáveis, e também as características de leveduras obtidas a partir dessas cepas.
EXEMPLO 1: SELEÇÃO DE CEPAS DE LEVEDURA ESTÁVEIS E
CARACTERÍSTICAS DAS MESMAS
Materiais e métodos
1. Meios e produtos
A composição dos meios de cultura e a natureza das
enzimas utilizadas são indicadas abaixo.
Meio 1 Meio 2
Extrato de levedura 3 g Acetato de sódio 6,5 g
Extrato de malte 3 g Agar 15 g
Peptona 5 g pH: 6, 5-7
Glicose Agar PH: água qs IL esterilização: 121°C 10 g 20 g 6.2 +/- 0.2 água qs IL esterilização: 20 121°C minutos a
20 minutos a
Meio 3 Meio 4
melado de cana 5 g Sacarose 100 g
(NH4) 2hpo4 500 mg Extrato de levedura 20 g
Agar 30 g MgSO4 1 g
pH ajustado para 5,2-5,3 com KH2PO4 1 g
10% H2SO4 pH ajustado para 4. 7 com ácido
água qs IL láctico
esterilização: 40 minutos a água qs IL
121°C esterilização: 30 minutos a
121°C
Meio 5 Enzimas:
Sacarose 240 g Zimoliase 100 000 a 20 mg/mL
(ΝΗ4)2 ΗΡΟ4 4,7 g
KC1 0,8 g
Tween 80 0,5 ml
Tampão de citrato 0.2 M
Vitamina BI (tiamina) 4 mg
Vitamina B6(piridoxina) 4 mg Ácido nicotínico 40 mg
Biotina 0,01 mg pH: 4,2 águar qs 1L meio 1 é um meio de cultura de agar básico contendo os elementos necessários para o crescimento das cepas de
Saccharomyces cerevisiae de acordo com a invenção.
O meio 2 é um meio de agar apropriado para esporulação de levedura.
O meio 3 é um meio de cultura de agar apropriado para crescimento de levedura. O meio 3 contém melaço, que é o substrato genericamente utilizado para a multiplicação industrial de leveduras.
O meio 4 é um meio de cultura líquido padrão apropriado para multiplicação de levedura.
O meio 5 é um meio de cultura líquido apropriado para realizar uma fermentação alcoólica.
Zimolase é uma enzima utilizada após esporulação, para digerir parcialmente a parede do asei e facilitar sua dissecção.
. Isolamento dos segregantes
Etapa 1: crescimento da cepa no meio 1
Um orifício da cepa inicial (armazenada a -80°C) é inoculado na superfície do Agar de um prato Petri. A placa de Petri é então incubada por 24 horas a 30°C.
Etapa 2: Esporulação no meio 2
Um orifício da cultura anterior é inoculado na superfície do Agar de uma placa de Petri. A placa de Petri é incubada por 96 horas a 25°C. A biomassa obtida na superfície da placa é então colhida em 500 μΐ de água estéril. 25 μΐ de zimolase são adicionados a 100 μΐ dessa suspensão. A suspensão é incubada por 30 minutos a 30°C, antes de ser revestida sobre uma placa Agar do meio 1.
Preferivelmente, a dissecção das tétrades é realizada 20 minutos após.
Etapa 3: Dissecção das tétrades
As tétrades são dissecadas utilizando um micromanipulador Singer, e então a placa de Petri é incubado por 24 horas a 30°C.
Etapa 4: Armazenagem dos segregantes
Os segregantes são então armazenados a -80°C no meio contendo 20% de glicerol.
3. Subculturas sucessivas e número de gerações
Etapa 1: crescimento no meio 1
Um orifício da cepa de teste (armazenada a -80°C) é inoculada na superfície do Agar de uma placa de Petri contendo meio 1. A placa de Petri é então incubada por 24 horas a 30°C.
Etapa 2: Subculturasucessiva no meio 3 ---------------A cepa de teste é subcultivada na superfície de uma placa de Petri contendo meio 3 utilizando a ponta de um palito de dente. 0 prato Petri é então incubado por 20 a 24 horas a 30°C.
As seguintes etapas são então repetidas 11 vezes:
- subcultura da cepa de teste na superfície de uma placa de Petri contendo meio 3 utilizando a ponta de um palito de dente.
- incubação da placa de Petri por 20 a 24 horas a
30°C.
Variante da etapa 2
Alternativamente, as subculturas sucessivas no meio 3 podem ser realizadas de acordo com o seguinte protocolo.
A biomassa obtida na etapa 1 é recuperada e diluída em água destilada, para obter uma suspensão de leveduras a
0,5 mg/ml. Uma placa de Petri contendo meio 3 é então inoculada na superfície com 100 μΐ dessa suspensão.
A placa de Petri é incubada por 20 a 24 horas a 30°C.
As seguintes etapas são então repetidas 11 vezes:
- a biomassa obtida é colhida em 2 x 2,5 ml de água estéril;
- diluições são feitas para obter uma suspensão de leveduras a 0,5 mg/ml, —começando a partir dessa suspensão, uma placa de
Petri contendo meio 3 é novamente inoculada na superfície com 100 μΐ da suspensão, e
- a placa de Petri é incubada por 20-24 horas a 30°C.
Etapa 3: cálculo do número de gerações obtidas na etapa 2
Tomando ng como sendo o número de gerações e Xo como sendo a biomassa inoculada, a biomassa Xn obtida ao término de n subculturas é dada pela seguinte fórmula:
γ _çng γ Λη—Z Ao
O número de gerações é, portanto calculado por aplicar à seguinte fórmula:
ng = (log Xt - log Xo) /log 2, i.e. ng = 3,3 log (Xn/ Xo)
A biomassa pode ser expressa como número de células ou como peso de matéria seca.
Com relação ao número de células, as células de levedura amostradas na ponta de um palito de dente ou obtidas ao término da incubação na placa de Petri são suspensas em 1 ml de água. O número de células é então obtido por medição em um citômetro de fluxo.
Aproximadamente 5 gerações são obtidos entre cada subcultura, que corresponde em média a 60 gerações durante subculturas sucessivas.
Variante da etapa 3 número de gerações obtidas ao término do variante da etapa. 2 é determinado do.seguinte modo.
peso de matéria seca (Xo) da suspensão de levedura é medido, como é o peso de matéria seca (Xt) da suspensão de levedura colhida após 20 a 24 horas de crescimento.
O peso de matéria seca é medido após desidratação em um forno em aproximadamente 105°C.
número de gerações é calculado por aplicar a seguinte fórmula:
ng = 3,3 log (Xn/ Xo) a 4 gerações são obtidas entre cada subcultura, que corresponde a aproximadamente 36 a aproximadamente 48 gerações durante 12 subculturas sucessivas.
4. Teste para fermentação alcoólica para medir o etanol produzido
Etapa 1: Cultura no meio 1
Um orifício da cepa teste (armazenada a -80°C) é inoculada na superfície de uma placa de Petri contendo meio
1. A placa de Petri é incubada por 24 horas a 30°C.
Etapa 2: pré-cultura no meio líquido em um frasco de 50 ml
Um loop da cultura anterior é inoculada em um frasco de 50 mL contendo 20 mL do meio 4. O frasco é incubado por horas a 26°C.
Etapa 3: cultura no meio líquido em um frasco de 250 mL ml da cultura obtida na etapa anterior são inoculados em um frasco de 2-50 mL—contendo 150 mL do meio 4. O frasco é incubado por 20 horas a 26°C.
A cultura obtida é centrifugada a 4500 rpm por 3 minutos, o sobrenadante é removido e a pelota é suspensa novamente em 100 mL de água destilada estéril (lavagem). A suspensão é novamente centrifugada a 4500 rpm por 3 minutos e a pelota é suspensa novamente em 20 mL de água destilada estéril.
peso de matéria seca é medido.
Etapa 4: Fermentação alcoólica em um frasco de fundo redondo de 4000 mL.
g de levedura de matéria seca da suspensão obtida durante a etapa 3 é inoculada em um frasco de fundo redondo de 4000 mL contendo 1000 mL de meio 5.
O frasco de fundo redondo é incubado por 72 horas a
35°C com agitação a 80 rpm.
mL da fermentação devem ser removidos a t=0, t=7 horas, t=24 horas, t=48 horas e t=72 horas.
A fermentação deve ser removida é filtrada (filtro de
0,2 μ) e a solução de fermentação resultante é armazenada a
-20°C.
A concentração de açúcar, etanol e glicerol presentes na solução de fermentação é então medida por HPLC (coluna HPX87H).
Resultados
1. Seleção dos Segregantes
Segregantes foram isolados das cepas depositadas em 4 de setembro de 2008 no CNCM sob os números 1-4071 e 1-4072, como indicado na seção Materiais e métodos.
A etapa de esporulação resulta na formação de asei contendo 4 espórios de haplóide que são dissecados.
Cada espório de haplóide constitui um segregante.
Os segregantes que se originam das duas cepas 1-4071 e 1-4072 são avaliados em termos de quantidade de álcool produzido e de estabilidade.
Os resultados para 5 tétrades que se originam da cepa
1-4072 (numerados 1 a 5) são fornecidos nas tabelas l.a) a
e) .
Os resultados para 6 tétrades que se originam da cepa
1-4071 (numerados 6 a 11) são fornecidos nas tabelas 2.a) a
f) ·
Os valores fornecidos nas tabelas correspondem à média obtida durante pelo menos três testes independentes.
A linha (1) indica a produção de álcool da população
RO do segregante, expresso como % daquele da população RO da cepa 1-4072, e, portanto provê informações sobre a eficácia do segregante.
A linha (2) indica a produção de álcool da população
R12 do segregante, expresso como % daquele da população RO do segregante, e portanto provê informações sobre a estabilidade do segregante.
Tabela 1. a) Tabela 2. a)
Tétrade 1 la lb lc ld
Sinal a a α α
d) 77 97 64 101
(2) 103 88 108 77
Tabela 1. b)
Tétrade 6 6a 6b 6c 6d
sinal a a α α
(D 99 98 56 81
(2) 93 94 99 98
Tabela 2. b)
Tétrade 2 2a 2b 2c 2d
sinal a a α α
d) 100 65 73 100
(2) 68 96 101 80
Tabela 1. c)
Tétrade 7 7a 7b 7c 7d
sinal a a α α
d) 63 97 102 52
(2) 103 97 97 154
Tabela 2. c)
Tétrade 3a 3b 3c 3d
3
sinal a a α α
Tétrade 8a 8b 8c 8d
8
sinal a a α α
(1) 98 82 97 6 6
(2) 82 100 60 99
Tabela 1. d)
d) 53 98 58 100
(2) 109 99 100 76
-Tabela 2. d)
Tétrade 4 4a 4b 4c 4d
sinal a a a α
d) 75 94 98 71
(2) 98 100 88 100
Tabela 1. e)
Tétrade 9 9a 9b 9c 9d
sinal a a α α
d) 54 101 101 49
(2) 126 95 97 133
Tabela 2. e)
Tétrade 5 5a 5b 5c 5d Tétrade 10 10a 10b 10c lOd
sinal a a α α sinal a a α α
(D 99 97 65 68 d) 49 96 100 56
(2) 109 67 121 103 (2) 104 95 78 107
Tabela 2. f)
Tétrade 11 11a 11b 11c lld
sinal a a α α
d) 52 99 52 96
(2) 146 88 125 99
Os caracteres em negrito representam os tétrades que atendem os critérios de seleção aplicados aos segregantes:
produção de álcool maior ou igual a 90% para a linha (1) e maior ou igual a 75% para a linha (2).
2. Cruzamento e seleção de híbridos
Entre os segregantes selecionados, os segregantes de sinal-α são cruzados com os segregantes de sinal-a, de modo a obter híbridos.
Os híbridos são então selecionados com base nos seguintes critérios:
- estabilidade: a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 97% daquela da população RO, e
- eficácia: a produção de álcool da população RO é maior ou igual a 95% daquela da população RO da cepa I4072.
As tabelas 3.a) e 3.b) indicam os resultados obtidos com os híbridos correspondendo às cepas de acordo com a invenção:
Cepas 1-4073 e 1-4074: híbridos que se originam do cruzamento de segregante ld com segregante 7b, e
Cepa 1-4075: híbrido que se origina do cruzamento do segregante ld com segregante 5a. os resultados obtidos com a cepa 1-4072 são também indicados.
As tabelas 3. a) e 3.b) indicam os resultados obtidos no teste para fermentação alcoólica por medir o etanol produzido, respectivamente às 48h e 72 h.
A coluna (1) indica a produção de álcool da população
RO da cepa, expresso como percentagem daquela da população
RO da cepa 1-4072, e, portanto provê informações sobre a eficácia da cepa. A coluna (2) indica a produção de álcool da população
R12 da cepa, expresso como percentagem daquele da população
RO da cepa, e, portanto provê informações sobre a estabilidade da cepa.
Os valores fornecidos nas tabelas correspondem à média obtida durante pelo menos três testes.
Tabela 3.a) Tabela 3.b)
cepa (D (2)
1-4072 100,0 48,9
1-4073 99, 9 99,1
1-4074 100,7 98,5
1-4075 99, 8 97,8
cepa (D (2)
1-4072 100, 0 46, 9
1-4073 99,7 98,3
1-4074 99,1 99,2
1-4075 99,9 99,0
Os híbridos selecionados são muito eficazes em termos de produção de álcool, uma vez que a quantidade de álcool produzida é maior do que 99% daquele obtido com a cepa de referência 1-4072 (tabelas 3.a) e 3.b)).
Os híbridos mostram também uma estabilidade muito forte: a produção de álcool entre a população RO e a população R12 diminuiu em menos de 3% para os híbridos I4073, 1-4074 e 1-4075.
Em comparação, a produção de álcool da cepa 1-4072 caiu em mais de 50% (tabelas 3.a) e 3.b)).
Para resumir, os resultados para a população R12 correspondem a uma levedura tendo sido—-multiplicado em aproximadamente 60 gerações, que é maior ou igual ao número médio de gerações obtidas ao término de uma multiplicação de levedura industrial.
EXEMPLO 2: CARACTERÍSTICAS DAS LEVEDURAS DE ACORDO COM A
INVENÇÃO
Materiais e métodos
1. Produção em escala piloto
As cepas de levedura 1-4073, 1-4074 e 1-4075 são multiplicadas em fermentadores de 20 litros, no modo semicontínuo, como descrito no manual de referência Yeast
Technology, 2a edição, 1991, G. Reed and T.W.
Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0442-31892-8.
As leveduras obtidas a partir de cada cepa são então testadas em termos de estabilidade, eficácia e rendimento de biomassa.
A avaliação da estabilidade das leveduras é realizada de acordo com o teste de avaliação de estabilidade utilizado para as cepas de levedura, em 12 subculturas diárias sucessivas.
A eficácia é avaliada por medir a quantidade máxima de álcool produzido.
rendimento de biomassa é obtido por calcular a massa de levedura produzida sobre a massa de . açúcar utilizada durante a multiplicação de levedura.
2. Produção industrial
A cepa de levedura 1-4074 é multiplicada na escala industrial.
A avaliação da estabilidade das leveduras obtidas ao final das multiplicações em escala industrial é realizada de acordo com o teste de avaliação de estabilidade utilizado para as cepas de levedura, em 12 subculturas diárias sucessivas.
A eficácia é avaliada por medir a quantidade máxima de álcool produzido.
Resultados
Os resultados obtidos após multiplicações em escala piloto das cepas de levedura mostram que as leveduras que se originam de cada das três cepas de levedura 1-4073, I4074 e 1-4075 são estáveis, e, portanto, de qualidade segura, eficaz em termos de quantidade de álcool produzido e têm um bom rendimento de biomassa.
Além disso, após multiplicação industrial, as leveduras obtidas da cepa de levedura 1-4074 são estáveis e portanto de qualidade segura. Além disso, essas leveduras são também eficazes em termos de quantidade de álcool produzido e têm bom rendimento de biomassa.
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Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. método para a obtenção de cepas de leveduras estáveis caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as etapas de:
    - cruzar uma cepa instável de Saccharomyces com ela própria ou com outra cepa de Saccharomyces, de modo a obter pelo menos um híbrido,
    - cultivar pelo menos um híbrido, de modo a obter uma população de levedura RO,
    - realizar n subculturas sucessivas da população de levedura RO, sendo n um número inteiro maior ou igual a 6, de modo a obter uma população de fermento Rn,
    - medir a produção de álcool da referida população RO e medir a produção de álcool da referida população Rn, selecionar pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população Rn é maior ou igual a 95% da população RO, de modo a obter cepas de leveduras estáveis, em que a cepa de levedura estável é uma cepa de levedura que produz formas de leveduras a qual a produção de álcool é estável por gerações; e em que cepa de levedura instável sendo uma cepa de levedura que produz leveduras das quais a produção de álcool não é estável através de gerações.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional de seleção de pelo menos um híbrido para o qual a produção de álcool da população RO é maior que ou igual a 95% de uma população RO da cepa 1-4072.
    Petição 870170102216, de 27/12/2017, pág. 33/36
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  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional de selecionar pelo menos um híbrido que tenha um rendimento de biomassa superior ou igual a 90% do rendimento de biomassa da cepa 1-4072.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de cruzamento compreende as seguintes etapas:
    - esporular a referida cepa instável de Saccharomyces, de modo a obter segregantes,
    - cultivar o referido segregante, de modo a obter uma população RO para cada segregante,
    - realizar subculturas sucessivas de cada segregante, de modo a obter uma população Rm de cada segregante, sendo m um número inteiro maior ou igual a 6,
    - medir a produção de álcool da população RO e medir a produção de álcool da população Rm de cada segregante, selecionar os segregantes para os quais: a produção de álcool da população Rm seja maior ou igual a 70% da população RO do referido segregante, e a produção de álcool da população RO seja maior ou igual a 85% da população RO da cepa 1-4072, de modo a obter segregantes eficazes e estáveis, e
    - cruzar os segregantes eficazes e estáveis que se derivam da dita cepa instável com segregantes eficazes e estáveis de sinal oposto que se derivam da referida cepa instável, de modo a obter pelo menos um híbrido.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de cruzamento
    Petição 870170102216, de 27/12/2017, pág. 34/36
    3/4 compreende as seguintes etapas:
    - esporular a dita cepa instável de Saccharomyces e a dita outra cepa de Saccharomyces, de modo a obter segregantes,
    - cultivar o referido segregante, de modo a obter uma população RO para cada segregante,
    - realizar subculturas sucessivas de cada segregante, de modo a obter uma população Rm de cada segregante, sendo m um número inteiro maior ou igual a 6,
    - medir a produção de álcool da população RO e medindo a produção de álcool da população Rm de cada segregante, selecionar os segregantes para os quais: a produção de álcool da população Rm é maior ou igual a 70% da população RO do referido segregante, e a produção de álcool da população RO é maior ou igual a 85% da população RO da cepa 1-4072, de modo a obter segregants efetivos e estáveis, e cruzamento de segregantes efetivos e estáveis decorrentes da dita cepa instável com segregantes eficazes e estáveis de sinal oposto decorrentes da referida cepa instável ou da referida outra cepa, de modo a obter pelo menos um híbrido.
  6. 6. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida cepa de levedura instável é a cepa 1-4072.
  7. 7. Método, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida outra cepa é escolhida da cepa 1-4071, cepa 1-4073, cepa 1-4074 ou a cepa 1-4075.
    Petição 870170102216, de 27/12/2017, pág. 35/36
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  8. 8. Método para avaliar a estabilidade de uma cepa de levedura caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    cultivar a referida cepa, de modo a obter uma população de levedura RO,
    - realizar n subculturas sucessivas da população de levedura RO, sendo n um número inteiro maior ou igual a 6, de modo a obter uma população de levedura Rn,
    - medir a produção de álcool da referida população RO e medir a produção de álcool da referida população Rn, descrever a referida cepa como estável se a produção de álcool da população Rn for maior ou igual a 95% da produção de álcool da população RO.
  9. 9. Uso de uma levedura obtida por cultura de uma cepa de levedura obtida por meio do método conforme definido pelas reivindicações 1 a 6 caracterizado pelo fato de que para produzir álcool.
    Petição 870170102216, de 27/12/2017, pág. 36/36
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