ES2639573T3 - Péptidos que tienen afinidad de unión por un anticuerpo que reconoce un epítopo en un bucle 2 de alfa 1 o bucle 1 de beta 2 de un receptor adrenérgico - Google Patents

Péptidos que tienen afinidad de unión por un anticuerpo que reconoce un epítopo en un bucle 2 de alfa 1 o bucle 1 de beta 2 de un receptor adrenérgico Download PDF

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Abstract

Péptido que tiene una DE50 de menos de 500 nM, en particular 10 nM contra un anticuerpo que reconoce un epítopo en un bucle 2 de a1 o bucle 1 de b2 extracelular de un receptor adrenérgico (AR) humano en el que la unión del anticuerpo al epítopo da como resultado un aumento de la actividad g-secretasa, una liberación aumentada de moléculas de b-amiloide, en el que el valor de DE50 se mide mediante un bioensayo; y en el que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 en la que a) X1 >= grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción, X2 >= A, G, a-Abu, F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, S, V, W, Y o deleción, X3 >= Hyp, P, Pip, S, T, Y o deleción, X4 >= Aad, Asu, D, E, Har, K, N, Orn, Q, R, X5 >= Aad, Asu, D, E, N, Q, X6 >= Aad, Asu, D, E, Har, K, N, Orn, Q, R, X7 >= F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y o deleción, X8 >= A, a-Abu, b-A, G, S, T, V, Y o deleción, X9 >= amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción, o b) X1 >= grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción, X2 >= F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y, X3 >= A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R, S, V, X4 >= Aad, Asu, D, E, Hyp, N, P, Pip, Q, X5 >= Aad, Asu, D, E, Hyp, N, P, Pip, Q, X6 >= A, a-Abu, G, Hyl, K, Orn, R, S, V X7 >= F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y, X8 >= g-Abu, Ahx, b-A, G o deleción, X9 >= amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción, o c) X1 >= grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción, X2 >= A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R o deleción, X3 >= A, C, F, Hph, M, Nal, S, W, Y, X4 >= F, S, T, W, Y, X5 >= F, S, T, W, Y, X6 >= A, C, F, Hph, M, Nal, S, W, Y, X7 >= A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R, X8 >= Abu, Ahx, b-A, G o deleción, X9 >= amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, 5 GKK, SGKK o deleción, o d) X1 >= grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción, X2 >= Aad, Asu, D, E, F, Hph, N, Nal, Q, W, Y, X3 >= A, C, G, Hcy, S, Sec, X4 >= D, E, F, N, Nal, Q, W, Y, X5 >= F, Hph, Nal, W, Y, X6 >= D, E, F, N, Nal, Q, W, Y, X7 >= A, C, G, Hcy, S, Sec, X8 >= Aad, Asu, D, E, F, Hph, N, Nal, Q, W, Y, X9 >= amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deleción en el que Aad es ácido a-aminoadípico; a-Abu es ácido a-aminobutírico; Ahx es ácido e-aminohexanoico; Asu es ácido a-aminosubérico; b-A es b-alanina; Dab es ácido a,g-diaminobutírico; g-Abu es ácido g-aminobutírico; Har es homoarginina; Hcy es homocisteína; Hph es homofenilalanina; Hyl es d-hidroxilisina; Hyp es hidroxiprolina; Nal es b- (1 ó 2-naftil)-alanina; Orn es ornitina; Pip es ácido pipecólico; Sec es selenocisteína y el código de una letra de aminoácidos representa los L-aminoácidos comunes según la nomenclatura de la IUPAC así como los D-aminoácidos correspondientes.

Description

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DESCRIPCION
Peptidos que tienen afinidad de union por un anticuerpo que reconoce un epltopo en un bucle 2 de ai o bucle 1 de P2 de un receptor adrenergico.
La invencion se refiere a un peptido que tiene afinidad de union a un anticuerpo que reconoce un epltopo en un bucle 2 de ai o bucle 1 de P2 de un receptor adrenergico, a fases solidas para cromatografla de afinidad o extraccion en fase solida que consisten en pollmeros organicos, inorganicos, sinteticos o en pollmeros mixtos. Tambien se dan a conocer una molecula de acido nucleico aislada, un vector que comprende una molecula de acido nucleico, una celula huesped que comprende el vector, un dispositivo para retirar inmunoglobulinas de llquidos que contienen inmunoglobulina sobre fases solidas, una composicion farmaceutica que comprende una molecula de acido nucleico, un peptido y/o una fase solida de la invencion junto con un portador farmaceuticamente tolerable, un kit que comprende una molecula de acido nucleico de la invencion, un vector de la invencion, una celula huesped de la invencion, as! como un aparato para cromatografla, que comprende peptidos de la invencion.
La enfermedad de Alzheimer (EA), que se llama as! por su descubridor Alois Alzheimer (1864-1915), es una enfermedad degenerativa progresiva. Se caracteriza por cambios en la estructura y funcion celular cerebral provocados por depositos de protelnas agregadas con amplias consecuencias para funciones cerebrales esenciales. Las siguientes caracterlsticas cllnicas y cognitivas son esenciales:
• trastornos de la memoria a corto plazo en un principio, y mas adelante de la memoria a largo plazo
• trastornos de la perception de patrones de reconocimiento sencillos
• perdida progresiva del habla y de la capacidad de articulation
• perdida progresiva del sentido del olfato, de la orientation espacial y reduction de la capacidad para realizar tareas rutinarias.
El diagnostico de “EA” se obtiene mediante diferentes metodos, por ejemplo, con metodos de obtencion de imagenes, tales como tomografla computarizada (TC) o tomografla por resonancia magnetica (TRM) y mediante la determination qulmica en el laboratorio de las concentraciones de las moleculas patologicas implicadas en el llquido cefalorraquldeo. Tambien puede recurrirse a la electroencefalografla (EEG). Las pruebas cognitivas, tales como el mini-examen cognoscitivo (MEC) estan recibiendo cada vez mas importancia.
Si no se trata, la enfermedad es una “calle de un unico sentido” que da inevitablemente como resultado un deterioro de la situation cllnica a lo largo de varios anos hasta terminar con la muerte. Cuanto mas avanzado es el estadio de la enfermedad, mas intensos se vuelven los cuidados y el coste del paciente. Esto tambien es cierto para otras formas de demencia (representando la EA aproximadamente dos tercios de todos los casos de demencia), las cuales sin embargo no se abordaran aqul.
La prevalencia de la enfermedad depende en gran medida de la edad. Entre las personas de 60 a 70 anos de edad, es de aproximadamente el 1%, y entre las de 70 a 80 anos de edad, es de hasta aproximadamente el 10%. Dado que la esperanza de vida de las personas en Alemania esta aumentando continuamente, debe esperarse otro aumento del numero de casos.
Actualmente, la incidencia anual para la EA en Alemania es de 130000 a 140000 casos (Hallauer, 2003), un numero que, sin embargo, requiere interpretation. Dado que la forma leve es poco evidente, la mayorla de los pacientes tendran probablemente una intensidad media de la enfermedad.
Hace algunos anos, la enfermedad todavla se consideraba un capricho del destino que no podia curarse. Se han tratado casos intensos con sedantes y neurolepticos para la sedation. Mientras tanto, estan disponibles farmacos de primera generation; se emplean principalmente en el estadio medio, moderado. Los ejemplos incluyen productos farmaceuticos aprobados, tales como Axura (principio activo: memantina) o Exelone (principio activo: rivastigmina). Segun el estado publicado del estudio, estos agentes tienen una buena eficacia para intensidades leve y media de la EA. Sin embargo, segun metanalisis se niega la eficacia cllnica de Exelone y otros inhibidores de colina esterasa. Aunque hay medicamentos aprobados disponibles en el mercado y pueden recetarse las preparaciones, no se trata a todos los pacientes ni mucho menos.
Parece que se ejerce cierto efecto profilactico sobre la EA mediante farmacos antiinflamatorios, tales como acido acetilsalicllico (aspirina), ibuprofeno, indometazina o inhibidores de COX2. Evidentemente, los mediadores de la inflamacion o inflamaciones locales y sistemicas desempenan un papel promotor de la enfermedad en el organismo/cerebro, probablemente debido a una aceleracion de la formation de neurofibrillas.
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Los agentes reductores del colesterol, tales como estatinas, tambien parecen tener una influencia favorable sobre el riesgo de desarrollar EA. Al menos, los pacientes que reciben agentes reductores del colesterol muestran una menor incidencia de EA. Sin embargo, no se dispone de datos cientlficos fiables para respaldar esto.
La situacion es similar con los agentes hipotensores, tales como los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA). Ademas de un efecto directo de estos principios activos, la reduccion de la tension arterial sistolica tambien esta asociada generalmente con los efectos preventivos observados.
Las inmunizaciones de pacientes con b-amiloide estan en la fase experimental de una terapia. En respuesta, el sistema inmunitario produce anticuerpos que despues destruyen las placas de amiloide mediante una reaccion inflamatoria local. Este enfoque parece ser prometedor, pero no es indiscutible, ya que implica altos riesgos. Probablemente, las respuestas inmunitarias inflamatorias individuales que se usan terapeuticamente no pueden dosificarse con tanta precision como se requerirla. Otros enfoques terapeuticos experimentales se basan en la compensacion de una deficiencia cerebral de iones de cobre, lo que evidentemente desempena un papel en la formation de placas.
Actualmente todavla no se ha encontrado respuesta a la cuestion de si los medicamentos solo pueden lograr basicamente una parada, o tambien una mejora cllnica del estado cognitivo de los pacientes. Los medios actualmente disponibles estabilizan la situacion cllnica en vez de mejorarla.
Todavla no se ha aclarado definitivamente la propia patogenesis de la EA. Se han reconocido varios factores de riesgo. Estos incluyen la edad, hipertension, altos niveles de colesterol, sobrepeso, apolipoprotelna E4, deficiencia en cobre, determinadas predisposiciones geneticas y posiblemente estres oxidativo. El desarrollo de la enfermedad es muy probablemente multifactorial.
Existe una gran cantidad de referencias sobre moleculas que desempenan o pueden desempenar un papel en el desarrollo y la progresion de la EA. En cuanto a una definition del termino, puede mencionarse en este caso que la mayorla de las denominadas moleculas patologicas son componentes de procesos y estructuras fisiologicas en el organismo sano. Se consideran patologicas si superan llmites de concentration, en el plasma o localmente en el tejido, a nivel intercelular o intracelular. Esto es cierto tanto para protelnas disueltas como para moleculas agregadas (por ejemplo, b-amiloide en forma de placa).
La agregacion o el deposito de dos moleculas de protelnas diferentes, en si mismas fisiologicas, en el cerebro en espacios intercelulares o intracelulares provoca trastornos fundamentales de la funcion neuronal en la transmision de senales y la interaction de neuronas. Estas protelnas son esencialmente el peptido b-amiloide neurotoxico (agregado como pollmero en forma de placa de amiloide) y la protelna Tau, un pollmero agregado como ovillos neurofibrilares.
Los denominados amiloides estan evidentemente implicados de manera causal en el desarrollo de la EA. Despues de eso, se produce un aumento de la formacion de amiloide-b40/42 mediante escision enzimatica de la molecula a partir de la membrana de las celulas nerviosas. Esto da como resultado una concentracion localmente aumentada de moleculas de b-amiloide individuales, oligomeros de b-amiloide y su agregacion para dar placas de amiloide. Estas placas alteran la transmision normal de estlmulos por los nervios y la comunicacion entre las celulas. La escision de b-amiloides que pueden agregarse a partir de las moleculas precursoras se realiza mediante la denominada g- secretasa. La actividad de esta enzima esta controlada por el receptor b2-adrenergico.
Las placas pueden dar como resultado a su vez la generation de ovillos neurofibrilares de la protelna Tau, que normalmente esta localizada fisiologicamente en los tramos axonicos de las celulas nerviosas. El deposito de estos agregados tiene lugar en una amplia variedad de zonas cerebrales. El proceso de formacion de placas avanza a lo largo de muchos anos desde el comienzo hasta la aparicion de la enfermedad.
Tanto las placas como los ovillos neurofibrilares pueden visualizarse bien mediante microscopla en secciones de cerebro de pacientes fallecidos con EA y son una parte importante del diagnostico.
Tambien se comenta en paralelo un papel patomecanlstico de otras moleculas, incluyendo el papel de la apolipoprotelna E4. Ademas, protelnas plasmaticas reologicamente relevantes parecen estar implicadas en el desarrollo de la situacion cllnica, al menos de manera indirecta. Estas incluyen un aumento o aumento moderado de niveles sistemicos y concentraciones locales de alfa-2-macroglobulina, fibrinogeno, pero tambien protelnas plasmaticas oxidadas a partir de reacciones de estres oxidativo, tales como lipoprotelna de baja densidad oxidada (oxLDL).
La suma de efectos de estas moleculas puede contribuir a una circulation en sangre reducida a traves de las zonas cerebrales y, por tanto, inducir el comienzo de la enfermedad y fomentar su desarrollo y mantenimiento. La tabla 1 proporciona un estudio de moleculas patologicas importantes.
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Tabla 1: Estudio de moleculas patologicas de la enfermedad de Alzheimer en el plasma sanguined
Moleculas patologicas en la EA
PM Comentario
fragmentos de b-amiloide oligomeros de b-amiloide
< 4.000 > 4.000 fragmentos de b-amiloide que tienen propiedades neurotoxicas
b-amiloide o fragmentos del mismo unidos a albumina
> 70.000 la albumina es la protelna plasmaticas mas importante para el aclaramiento fisiologico de sustancias nocivas
apolipoprotelna E, especialmente E4
aproximadamente 34.000 (monomero) predispuesta para EA, puede estar contenida en placas
citocinas proinflamatorias IL1 b, IL6, TNFa
16.000-50.000 (monomero y trlmero, respectivamente) niveles aumentados en el cerebro, neurotoxicas
protelna C reactiva (CRP)
120.000 implicada en la formacion de placas, potencia la degradacion celular en necrosis
fibrinogeno
340.000 reologicamente eficaz debido a su tamano, reduce la circulacion a traves de capilares
L-quinurenina
208 precursor neurotoxico de 3OH-K, interacciona con receptores de glutamato
homocistelna, no unida
268 inhibe la degradacion de ADMA y por tanto reduce la vasodilatacion
dimetilarginina asimetrica (ADMA)
202 inhibe la NO sintetasa y por tanto da como resultado hipoperfusion
estres oxidativo (productos de reaccion)
variable, tambien micropartlculas puede inducirse directamente por b- amiloide, pero tambien se forman mediante hipoperfusion
El grupo mas ampliamente estudiado de enfermedades asociadas con agAAB contra GPCR son las enfermedades cardiacas. En la miocarditis, miocardiopatla dilatada, miocardiopatla del periparto, enfermedad de Chagas y arritmias ventriculares, pueden detectarse agAAB contra el bi-AR en los sueros de pacientes con enfermedades con diagnostico cllnico.
DCM y miocarditis son trastornos cardiacos graves, y se ha planteado la hipotesis de que una miocarditis cronica puede evolucionar para dar DCM. En ambas enfermedades, una infeccion con un enterovirus u otros agentes puede ser el agente etiologico primario, pero la respuesta inflamatoria puede haber evolucionado para dar una enfermedad autoinmunitaria. En un estadio posterior, el agente infeccioso puede no ser detectable, e incluso puede haberse reducido la respuesta inflamatoria, sin embargo, se diagnostica una insuficiencia cardiaca progresiva cronica. La DCM se caracteriza por una insuficiencia cardiaca intensa. En un subconjunto de DCM, la DCM idiopatica, en la que pueden excluirse otros agentes etiologicos, la prevalencia del AAB bi-adrenergico de hasta el 80% es notable. La miocarditis y DCM se tratan preferiblemente mediante antagonistas del receptor bi-adrenergico y del sistema renina-angiotensina y reposo flsico.
El objetivo terapeutico es reducir la sobreestimulacion cardiaca y prevenir arritmias. El uso terapeutico de betabloqueantes en la reduccion de la sobreestimulacion adrenergica va acompanado por una reduccion significativa de la muerte por causa cardiaca y hospitalizacion en los pacientes sujetos del estudio. Las arritmias ventriculares son una causa principal de muerte subita en DCM dilatada y se ha mostrado que las taquicardias ventriculares estan fuertemente relacionadas con la deteccion de agAAB contra el bi-AR.
La progresion cronica de la insuficiencia cardiaca en DCM conduce a un estadio de la enfermedad en el que ya no es posible una medicacion satisfactoria. En este estadio, solo puede considerarse un trasplante de corazon como terapia sostenible durante algunos anos. La DCM es la causa de aproximadamente la mitad de los trasplantes de corazon. Una ampliacion de las opciones terapeuticas podrla muy probablemente prevenir un numero sustancial de muertes prematuras en el caso de insuficiencia cardiaca intensa.
De manera similar a la DCM, la miocardiopatla del periparto se caracteriza por una dilatacion del ventrlculo izquierdo y puede evolucionar para dar un trastorno potencialmente mortal. La incidencia es de aproximadamente 1: 1000 en mujeres sudafricanas, mientras que la enfermedad es rara entre las poblaciones de raza blanca en palses occidentales. La etiologla de la miocardiopatla del periparto se desconoce en gran medida. Por definicion, se diagnostica entre el ultimo mes antes del parto y el 4° mes despues del parto. Recientemente se mostro la presencia de agAAB contra el b1-AR en todos los sueros de una muestra de 10 pacientes que padeclan miocardiopatla del periparto.
La enfermedad de Chagas esta provocada por el parasito Trypanosoma cruzi y es muy comun en Sudamerica. Entre otros slntomas, los pacientes desarrollan con frecuencia una miocarditis como parte del slndrome disautonomo que
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afecta a todo el sistema colinergico. Hay muchas evidencias de que el slndrome disautonomo tambien esta provocado por AAB funcionales contra el receptor M2 muscarlnico de acetilcolina. La prevalencia de agAAB contra el receptor M2 oscila entre el 50-94%. En la enfermedad de Chagas, tambien pueden encontrarse AAB contra el bi-AR en aproximadamente el 53% de los casos. Esta situacion puede representar el mimetismo antigenico de originalmente el mismo antlgeno de T. cruzi, con un antagonismo funcional como epifenomeno.
Con respecto a la naturaleza patogenica de los agAAB descritos, en el siguiente parrafo solo se tendran en cuenta los acontecimientos de senalizacion con evidencias de relevancia cllnica. La activacion del b-AR conduce a un aumento de AMPc mediante la activacion de adenilato ciclasa a traves de la estimulacion de protelnas Gs en el trlmero de protelnas G. Por otro lado, la union de ligando agonista a receptores de acetilcolina muscarlnicos y nicotlnicos inhibe la adenilato ciclasa mediante la inhibicion de protelnas Gi. Sin embargo, este patron sencillo tiene que ampliarse para los receptores individuales.
Los autoanticuerpos de sueros de pacientes con miocarditis o DCM muestran un efecto cronotropico positivo en la misma medida que la isoprenalina agonista. La isoprenalina aumenta claramente la concentracion de AMPc en la celula y activa los canales de Ca2+ de tipo L. Se ha mostrado que AAB de pacientes con DCM activan los canales de Ca2+ de tipo L. Por otro lado, el efecto de AAB sobre la acumulacion de AMPc fue mas bien marginal. Sin embargo, se ha mostrado que la protelna cinasa A citosolica as! como la unida a la membrana en cardiomiocitos se activa tras la estimulacion con AAB. Un AB monoclonal anti-receptor bi que induce apoptosis en cardiomiocitos de rata tambien actua a traves de AMPc y protelna cinasa A, MAP-cinasas, especialmente cinasa p38 estan activadas aguas abajo de varios GPCR, pero tambien en la cascada de transduccion de senales de citocinas inflamatorias. Por tanto, puede sugerirse que la estimulacion del bi-AR mediante agAAB tambien puede tener un efecto proinflamatorio.
Tambien hay importantes rutas de senalizacion independientes de AMPc. Los canales de Ca2+ de tipo L no solo se activan a traves de la fosforilacion mediante protelna cinasa A, sino tambien directamente a traves de subunidades de protelnas G. Por tanto, la estimulacion del influjo de Ca2+ puede ser una ruta significativa para el papel patogenico de AAB en la miocarditis y DCM autoinmunitarias. El potencial de accion en cardiomiocitos de rata y humanos se prolonga mediante la administracion de agAAB contra el bi-AR y activa a su vez el intercambiador electrogenico de Na+/Ca2+, dando como resultado inestabilidad electrica del corazon. Tambien se sabe que la sobrecarga de calcio intracelular es un acontecimiento clave de remodelado, al igual que la estimulacion bi-adrenergica. En un modelo de rata transgenica, el bi-AR era crucial para la reorganizacion de actina mediada por transcripcion potenciada del factor natriuretico auricular.
Tomadas en conjunto, la sobreestimulacion b-adrenergica, la sobrecarga de calcio intracelular y la ausencia parcial de regulacion por disminucion del bi-AR pueden estar implicadas en la patogenesis de la miocarditis y DCM. Resultados de experimentos con animales respaldan los datos in vitro sobre la relevancia patogenica de agAAB obtenidos en experimentos de cultivo tisular. Jahns et al. pudieron inducir anticuerpos agonistas en ratas mediante inmunizacion con el segundo bucle extracelular del bi-AR. Los animales desarrollaron una miocardiopatla dilatada similar a la de la miocardiopatla dilatada humana. La transferencia del anticuerpos/inmunoglobulinas inducidos a animales sanos tambien conduce a una DCM.
Tambien se realizo la induccion de anticuerpos agonistas contra el bi-AR en conejos y dio como resultado la aparicion de agAAB as! como DCM. Una retirada de agAAB a partir del plasma sangulneo del animal mediante inmunoadsorcion especlfica usando una columna de peptido conduce a una mejora de la funcion del musculo cardiaco, medida como fraccion de eyeccion del ventrlculo izquierdo.
Mas de una docena de publicaciones notifican el beneficio cllnico de la aferesis terapeutica (inmunoadsorcion) en pacientes que padecen DCM. En un estadio cllnico de la enfermedad cardiaca en el que no es posible ninguna medicacion farmacologica cardiaca satisfactoria, la aferesis terapeutica conduce a una reduction de larga duration de los agAAB, una desaparicion de leucocitos inflamatorios activados del tejido de musculo cardiaco y un aumento de funciones cardiacas esenciales.
Otros ejemplos de enfermedades que estan asociadas con, o provocadas por, agAAB son la preeclampsia y rechazo de rinon necrotico vascular (agAAB contra el receptor de angiotensina-i) o el glaucoma de angulo abierto (agAAB contra el receptor b2-adrenergico).
El documento WO-A-02/093i74 da a conocer un metodo y un dispositivo para tratar la EA. El metodo implica la retirada de autoanticuerpos en circulation de un marcador bioqulmico de marcadores, especlficamente protelna acida fibrilar de la glia (GFAP) humana y gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), en llquido corporal, preferiblemente sangre o un hemoderivado. La invention incluye ademas un dispositivo o un procedimiento de modulation del sistema inmunitario eficaz para la retirada de autoanticuerpos.
D.M. Walsh et al. dan a conocer en Biochemical Society Transactions (2005) vol. 33, parte 5, pags. i087-i090, que
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los oligomeros solubles de Ap se encuentran entre los efectores mas tempranos de la enfermedad de Alzheimer. Notifican pruebas de compuestos dirigidos a tres dianas terapeuticas prominentes basadas en amiloide, la inhibicion de las secretasas responsables de la produccion de Ap, la inhibicion de la agregacion de Ap y la inmunizacion contra Ap. En cada caso, los compuestos que pueden reducir la produccion de oligomero o los anticuerpos que se unen con avidez a oligomeros de Ap tambien mejoran los efectos sinaptotoxicos de estos oligomeros naturales derivados de celulas. Norman R. Relkin et al. dan a conocer en Neurobiology of Aging (2008), 20 de febrero, publicacion electronica, que los anticuerpos que se producen de manera natural contra pA pueden reducir el nivel de pA en el organismo, y su aplicacion intravenosa puede mejorar la funcion cerebral en pacientes con EA leve.
Dennis J. Selkoe et al. notifican en Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003, 43:545-84 comentarios sobre el entendimiento molecular que predice productos terapeuticos basados en amiloide. Desde hace mucho tiempo las enfermedades degenerativas del cerebro se consideraron entre las enfermedades de seres humanos menos conocidas y mas resistentes al tratamiento. Sin embargo, recientes avances en el entendimiento de sus mecanismos han llevado al borde de agentes potenciales de modification de la enfermedad. Esta evolution se muestra quizas como ejemplo de la mejor manera mediante el caso de la enfermedad de Alzheimer. La aplicacion de genetica y patologla molecular ha llevado al reconocimiento de que los cuatro genes implicados hasta la fecha en la enfermedad de Alzheimer familiar elevan, todos ellos, de manera cronica los niveles cerebrales de la protelna p-amiloide (Ap). Por consiguiente, estan desarrollandose activamente inhibidores de molecula pequena de las p y g-secretasas, las proteasas que generan Ap a partir de su precursor, y algunos han mostrado eficacia in vivo en modelos de raton. Un enfoque alternativo, la inmunizacion activa o pasiva contra Ap, ha recibido una amplia validation precllnica en ratones, pero todavla se espera una preparation eficaz libre de efectos secundarios significativos en seres humanos. En este caso tambien se revisan varias otras posibles terapias. Si se demuestra en ultima instancia que uno o mas de estos diversos enfoques ralentizan o previenen la demencia, la enfermedad de Alzheimer pasara a ser un ejemplo destacado de la aplicacion satisfactoria de la biologla reduccionista al mas complejo de los organos, la corteza cerebral humana.
El documento EP-A-1832600 da a conocer una invention que se refiere a moleculas de acido nucleico que codifican para peptidos que interaccionan con autoanticuerpos asociados con glaucoma, a los propios peptidos, a una composition farmaceutica que comprende dichas moleculas de acido nucleico y peptidos, y al uso de dichos peptidos (especialmente en aferesis) para el tratamiento de glaucoma. Los peptidos representan un epltopo que es una parte del bucle 2 extracelular del receptor p2-adrenergico.
El documento WO-A-02/38592 da a conocer una invencion que se refiere a peptidos que tienen una alta afinidad por inmunoglobulinas.
Y. Magnusson et al. notifican en Clin. Exp. Immunol. (1989) 78, 42-48 un analisis antigenico del segundo bucle extracelular del receptor beta-1-adrenergico humano que es diferente del receptor beta-2-adrenergico.
Yanxiang Ni et al. notifican la activation de la actividad g-secretasa estimulante de receptor p2-adrenergico y la aceleracion de la formation de placas de amiloide. Notifican que la activacion de p2-AR puede estimular la actividad g-secretasa y la formacion de placas de amiloide y especulan que la activacion anomala de p2-AR puede contribuir a la acumulacion de Ap en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer.
Un objeto de la invencion era proporcionar un compuesto que pueda usarse en el tratamiento de la EA. Otro objeto era proporcionar un compuesto que pueda reducir la actividad g-secretasa mediada por el receptor p2-adrenergico en individuos que presentan mayores niveles de g-secretasa debido a autoanticuerpos contra receptor adrenergico.
La invencion se basa en el hallazgo de autoanticuerpos agonistas (agAAB) dirigidos contra los receptores acoplados a protelnas G (GPCR), receptor p2 y a1-adrenergico (AR), en el plasma sangulneo de pacientes que padecen enfermedades provocadas por un aumento de la actividad g-secretasa, una liberation aumentada de moleculas de p- amiloide y/o disfuncion celular de celulas de vasos sangulneos del cerebro, celulas de la glia o neuronas. En particular, la enfermedad es EA.
Se da a conocer que el objeto puede resolverse retirando inmunoglobulinas de pacientes que se sospecha que padecen, o que padecen, una enfermedad provocada por un aumento de la actividad g-secretasa, una liberacion aumentada de moleculas de p-amiloide y/o disfuncion celular de celulas de vasos sangulneos del cerebro, celulas de la glia o neuronas. La retirada de inmunoglobulinas puede realizarse mediante adsorcion de las inmunoglobulinas respectivas sobre un soporte solido. Estos metodos en si mismos se conocen bien en la tecnica.
Ademas, se da a conocer el uso de un dispositivo de inmunoadsorcion para fabricar un dispositivo para el tratamiento de una enfermedad provocada por un aumento de la actividad g-secretasa, una liberacion aumentada de moleculas de p-amiloide y/o disfuncion celular de celulas de vasos sangulneos del cerebro, celulas de la glia o neuronas mediante la retirada de inmunoglobulinas de pacientes.
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En una realization de la invention, el objeto se resuelve mediante un peptido que tiene una DE50 de menos de 500 nM, en particular 10 nM contra un anticuerpo que reconoce un epltopo en un bucle 2 de a y bucle 1 de P2 de un receptor adrenergico humano en el que la union del anticuerpo al epltopo da como resultado el aumento de la actividad g- secretasa y/o liberation de b-amiloide patologica aumentada y/o disfuncion celular de celulas de vasos sangulneos del cerebro, celulas de la glia o neuronas, en el que el valor de DE50 se mide mediante un bioensayo, en particular que se usa para identificar los agAAB, y en el que el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9
en la que
a)
X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deletion, X2 = A, G, a-Abu, F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, S, V, W, Y o deletion,
X3 = Hyp, P, Pip, S, T, Y o deletion,
X4 = Aad, Asu, D, E, Har, K, N, Orn, Q, R,
X5 = Aad, Asu, D, E, N, Q,
X6 = Aad, Asu, D, E, Har, K, N, Orn, Q, R,
X7 = F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y o delecion,
X8 = A, a-Abu, b-A, G, S, T, V, Y o deletion,
X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deletion, o
b)
X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deletion, X2 = F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y,
X3 = A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R, S, V,
X4 = Aad, Asu, D, E, Hyp, N, P, Pip, Q,
X5 = Aad, Asu, D, E, Hyp, N, P, Pip, Q,
X6 = A, a-Abu, G, Hyl, K, Orn, R, S, V X7 = F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y,
X8 = g-Abu, Ahx, b-A, G o deletion,
X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deletion, o
c)
X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o deletion, X2 = A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R o deletion,
X3 = A, C, F, Hph, M, Nal, S, W, Y,
X4 = F, S, T, W, Y,
X5 = F, S, T, W, Y,
X6 = A, C, F, Hph, M, Nal, S, W, Y,
X7 = A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R,
X8 = Abu, Ahx, b-A, G o delecion,
5 X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, o
d)
X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion,
X2 = Aad, Asu, D, E, F, Hph, N, Nal, Q, W, Y,
X3 = A, C, G, Hcy, S, Sec,
10 X4 = D, E, F, N, Nal, Q, W, Y, X5 = F, Hph, Nal, W, Y,
X6 = D, E, F, N, Nal, Q, W, Y, X7 = A, C, G, Hcy, S, Sec,
X8 = Aad, Asu, D, E, F, Hph, N, Nal, Q, W, Y,
15 X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion
en el que Aad es acido a-aminoadlpico; a-Abu es acido a-aminobutlrico; Ahx es acido e-aminohexanoico; Asu es acido o-aminosuberico; b-A es b-alanina; Dab es acido aj-diaminobutlrico; g-Abu es acido g-aminobutlrico; Har es homoarginina; Hcy es homocistelna; Hph es homofenilalanina; Hyl es 8-hidroxilisina; Hyp es hidroxiprolina; Nal es b- (1 o 2-naftil)-alanina; Orn es ornitina; Pip es acido pipecolico; Sec es selenocistelna y el codigo de una letra de 20 aminoacidos representa los L-aminoacidos comunes segun la nomenclatura de la IUPAC as! como los D-aminoacidos correspondientes.
En particular, el peptido de la invencion reconoce los epltopos de bucle de a1 humano de los subtipos de receptor a- adrenergico A, B o C o combinaciones de los mismos.
En una realizacion adicional de la invencion, el peptido segun la invencion se caracteriza porque el ligador y/o un 25 espaciador se seleccionan del grupo que consiste en acidos a-aminocarboxllicos as! como homo y heterooligomeros de los mismos, acidos a,m-aminocarboxllicos y oligomeros ramificados o heterooligomeros de los mismos, otros aminoacidos alifaticos y/o aromaticos as! como homo o heterooligomeros lineales y ramificados; amino- oligoalcoxialquilaminas; derivados de acido maleinimidocarboxllico; oligomeros de alquilaminas; derivados de 4- alquilfenilo; derivados de 4-oligoalcoxifenilo o 4-oligoalcoxifenoxilo; derivados de 4-oligoalquil-mercaptofenilo o 430 oligoalquilmercaptofenoxilo; derivados de 4-oligo-alquilaminofenilo o 4-oligoalquilaminofenoxilo; derivados de (oligoalquilbencil)-fenilo o 4-(oligoalquilbencil)fenoxilo, as! como derivados de 4-(oligo-alcoxibencil)fenilo o 4- (oligoalcoxi-bencil)fenoxilo; derivados de tritilo; derivados de benciloxiarilo o benciloxialquilo; derivados de xanten-3- iloxialquilo; derivados de acido (4-alquilfenil) o w-(4-alquilfenoxi)alcanoico; derivados de oligoalquilfenoxialquilo u oligoalcoxifenoxialquilo; derivados de carbamato; aminas; derivados de trialquilsililo o dialquilalcoxisililo; derivados de 35 alquilo o arilo y/o combinaciones de los mismos.
En aun otra realizacion, el peptido segun la invencion se caracteriza porque se selecciona del grupo que consiste en:
a) un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9
en la que X1 a X9 tienen el mismo significado que el mencionado anteriormente en el presente documento;
40 b) un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene homologla suficiente como para ser
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funcionalmente analogo a una secuencia de aminoacidos segun a).
Ademas, se da a conocer que el peptido se selecciona del grupo que consiste en a); b);
c) un peptido segun una secuencia de aminoacidos a) o b) que se modifica mediante deleciones, adiciones, sustituciones, translocaciones, inversiones y/o inserciones y funcionalmente analogo a una secuencia de aminoacidos segun a) o b);
d) un peptido segun una secuencia de aminoacidos a), b) o c) que se modifica mediante ramificacion o extension con el mismo o con otro peptido segun la secuencia de aminoacidos a), b) o c) para formar un peptido homooligomerico o heterooligomerico.
Ademas, se da a conocer un peptido caracterizado porque la secuencia de aminoacidos especificada en b) tiene una homologla de al menos el 40% con cualquiera de las secuencias de aminoacidos especificada en a). Ademas, el peptido de la invencion se caracteriza porque la secuencia de aminoacidos especificada en b) tiene una homologla de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, mas preferiblemente el 80%, de manera especialmente preferible el 90% con cualquiera de las secuencias de aminoacidos especificada en a).
En aun otra realizacion de la invencion el peptido de la invencion se caracteriza porque consiste en la secuencia de aminoacidos APEDET; WKEPAP; PPDERF; KMWTFG o FGNFWCE.
Se da a conocer que el peptido de la invencion puede usarse como principio activo medico. El peptido segun la invencion puede unirse a anticuerpos de pacientes que padecen enfermedad de Alzheimer.
El peptido de la invencion se caracteriza ademas porque puede inmovilizarse y/o fijarse a nanopartlculas magneticas, paramagneticas y/o no magneticas.
De manera todavla adicional, se da a conocer que el peptido segun la invencion puede unirse a una fase solida. El peptido de la invencion puede estar presente en una forma lineal y ramificada as! como clclica. El cierre del anillo peptldico se realiza, por ejemplo, mediante formacion de puentes disulfuro cuando hay dos cistelnas presentes, o mediante ciclacion de amida, que se realiza opcionalmente mediante cadenas laterales, mediante los extremos C- terminal con N-terminal o mediante una combinacion de estos ultimos.
El peptido segun la invencion puede caracterizarse ademas porque las inmunoglobulinas a las que se une son agAAB que interaccionan con el P2-AR y a-AR humanos.
El peptido segun una cualquiera de las realizaciones anteriores, caracterizado porque comprende adicionalmente grupos amino, amidas, hidrazidas, azidas, carbamatos, grupos acetilo, grupos biotina, marcadores, espaciadores y/o ligadores tambien es una realizacion de la invencion.
Ademas, tambien se da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende:
a) una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica para al menos un peptido seleccionado del grupo que consiste en peptidos segun la invencion;
b) una molecula de acido nucleico que es complementaria a una secuencia de nucleotidos segun a);
c) una molecula de acido nucleico que experimenta hibridacion con una secuencia de nucleotidos segun a) o b) en condiciones rigurosas;
d) una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene homologla suficiente como para ser funcionalmente analoga a una secuencia de nucleotidos segun a), b) o c);
e) una molecula de acido nucleico que, como consecuencia del codigo genetico, esta degenerada para dar una secuencia de nucleotidos segun a) a d); y
f) una molecula de acido nucleico segun una secuencia de nucleotidos de a) a e) que esta modificada mediante deleciones, adiciones, sustituciones, translocaciones, inversiones y/o inserciones y es funcionalmente analoga a una secuencia de nucleotidos segun a) a e).
Se da a conocer que la molecula de acido nucleico que tiene la secuencia de nucleotidos especificada en d) comprende una homologla de al menos el 40%, en particular al menos el 60%, preferiblemente el 70%, mas preferiblemente el 80%, de manera especialmente preferible el 90% con cualquiera de las secuencias de nucleotidos especificadas en
a) a c).
Se da a conocer que la molecula de acido nucleico es ADN genomico, ADNc y/o ARN.
Tambien se da a conocer un vector que comprende una molecula de acido nucleico segun la invencion.
Tambien se da a conocer una celula huesped que comprende el vector segun la invencion.
5 Tambien son objeto de la invencion fases solidas para cromatografla de afinidad o extraction en fase solida, que comprenden pollmeros organicos, inorganicos, sinteticos o pollmeros mixtos, preferiblemente agarosa reticulada, celulosa, gel de sllice, poliamida y poli(alcoholes vinllicos), que opcionalmente estan activados qulmicamente, con peptidos segun la invencion, inmovilizados sobre la superficie de la fase solida, por ejemplo, mediante union covalente o mediante adsorcion. En particular, los peptidos pueden unirse de manera covalente a la fase solida en la position 10 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 y/o X9. Puede resultar ventajoso que los peptidos esten separados de la superficie de
soporte mediante ligadores o espaciadores.
Tambien se da a conocer un dispositivo para retirar inmunoglobulinas de muestras que contienen inmunoglobulina sobre fases solidas, en el que el dispositivo contiene la fase solida de la invencion. Tambien pueden proporcionarse medios para la introduction de muestras que contienen inmunoglobulina.
15 Ademas, se da a conocer una composition farmaceutica que comprende la molecula de acido nucleico segun la invencion, el vector segun la invencion, la celula huesped segun la invencion, el peptido segun la invencion y/o la fase solida segun la invencion, opcionalmente junto con una sustancia portadora farmaceuticamente tolerable.
Ademas, se da a conocer un kit que comprende una molecula de acido nucleico tal como se da a conocer, un vector tal como se da a conocer, una celula huesped tal como se da a conocer, un peptido segun la invencion, una fase solida 20 segun la invencion y/o una composicion farmaceutica tal como se da a conocer, opcionalmente junto con instrucciones para combinar el contenido del kit y/o proporcionar una formulation.
Tambien se da a conocer un aparato para cromatografla, que comprende peptidos segun la invencion. En particular, el aparato se caracteriza porque los peptidos estan unidos a la fase solida de la invencion.
La invencion tambien se refiere al uso de la molecula de acido nucleico tal como se da a conocer, el vector tal como 25 se da a conocer, la celula huesped tal como se da a conocer, el peptido segun la invencion, la fase solida segun la invencion, la composicion farmaceutica tal como se da a conocer, el kit tal como se da a conocer, el aparato tal como se da a conocer en la profilaxis, el diagnostico, la terapia de EA as! como en la production o el examen de un farmaco para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como EA. La invencion tambien da a conocer un metodo de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer mediante union y/o retirada de autoanticuerpos por medio de 30 peptidos segun la invencion unidos a una fase solida. La invencion tambien se refiere al peptido o a la fase solida de la invencion para su uso en la profilaxis, el diagnostico, la terapia, el seguimiento y/o cuidado posterior de la enfermedad de Alzheimer, para su uso en la produccion o el examen de un farmaco para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como eA; y a un peptido de la invencion que puede unirse a autoanticuerpos agonistas (agAAB) dirigidos contra la actividad g-secretasa mediada por receptor P2 y ai-adrenergico en individuos 35 que presentan mayores niveles de g-secretasa, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de EA.
Ejemplos, materiales y metodos
Se realizaron el aislamiento y el cultivo de celulas cardiacas neonatales tal como se describio anteriormente (Wallukat, G. y Wollenberger, A. 1987. Effects of the serum gammaglobulin fraction of patients with allergic asthma and dilated myocardiopathy on chronotropic b-adrenoceptor function in cultured rat heart myocytes. Biomed. Biochim. Acta. 40 78:634-639).
Cultivo celular. En resumen, se disociaron celulas individuales a partir de los ventrlculos cortados de ratas Wistar (12 dlas de edad) con una disolucion al 0,25% de tripsina en bruto y se cultivaron como monocapas con una densidad de 800 celulas/mm2 en medio Halle SM 20-I equilibrado con aire humidificado. El medio contenla FCS inactivado por calor al 10% y fluorodesoxiuridina 2 mmol/l (Serva, Heidelberg, Alemania), esta ultima para prevenir la proliferation de 45 celulas no musculares.
En el tercer o cuarto dla, se incubaron las celulas durante 2 h en 2 ml de medio que contenla suero reciente. Se contaron durante 15 s de siete a 10 celulas seleccionadas o agrupaciones de celulas que se contralan de manera slncrona por matraz. El cambio en la frecuencia de pulsaciones se expreso como latidos por minuto. Se repitio este procedimiento dos veces en diferentes cultivos para proporcionar resultados que representaban un total de hasta 50 30 celulas para cada muestra. Se anadieron fracciones de inmunoglobulina, farmacos agonistas y antagonistas,
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peptidos, etc. de manera individual o acumulativa segun se indica. La frecuencia de contraccion basal de los cardiomiocitos que latian de manera espontanea era de 162 ± 4 min.
Preparacion de la fraccion de inmunoglobulina. Se aislo la fraccion de inmunoglobulina a partir de muestras de suero de 1 a 2 ml mediante precipitacion con sulfato de amonio a una saturation del 40%. Se lavaron los precipitados y se disolvieron en tampon de dialisis (NaCl 154 mmol/l, fosfato de sodio 10 mmol/l; pH 7,2). Se repitio dos veces el procedimiento de precipitacion, lavado y disolucion.
Finalmente, se llevaron las inmunoglobulinas a 1 ml de PBS (pH 7,2) y se sometieron a dialisis a 4°C durante 30 horas frente a 1 l de tampon de dialisis. Se cambio el tampon cinco veces durante la dialisis. Para la detection de autoanticuerpos, se anadieron las fracciones de inmunoglobulina a una dilution de 1:20 o 1:40 a los matraces.
Tras la dialisis, las fracciones de IgG presentaban una concentration de 10-15 mg/ml, un maximo de 10 mg/ml de las cuales son anticuerpos de receptor especificos. Se incuban previamente 50 ml de esta disolucion de IgG con los peptidos con la siguiente concentracion de peptidos: 5 ml de una disolucion tamponada de 100 mg/ml por 50 ml de disolucion de IgG. Se incuba previamente esta mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos y posteriormente se llena en los viales de cultivo celular, tras haberse retirado mediante pipeta la disolucion de nutrientes anterior. La cantidad del medio es de 2 ml. Por tanto, la concentracion final es de 0,5-0,75 mg/ml para la IgG y de 0,5 mg para los peptidos. Si se establece el peso molecular del peptido (10 meros) a 1 KD y se establece el de la IgG a 150 KD, hay un exceso de agAAB.
Para los experimentos de neutralization, se anadieron en exceso (0,5 mg en 50 ml) peptidos sinteticos correspondientes a la secuencia de los tres bucles extracelulares del P2-AR o a1A-AR humanos a 50 ml de la fraccion de inmunoglobulina. Se agitaron las mezclas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Despues se anadieron las muestras de 100 ml a celulas de musculo cardiaco de rata neonatal cultivadas en 2 ml de medio hasta una dilucion final de 1:40. Se conto la frecuencia de latido durante 15 s, aproximadamente 60 min tras la adicion de la mezcla de peptido/inmunoglobulina.
Para identificar los epitopos neutralizantes de autoanticuerpo, se anadieron peptidos solapantes sinteticos correspondientes a la secuencia del primer bucle extracelular del P2-AR humano o del segundo bucle extracelular de a1A-AR a las inmunoglobulinas. Tras 1 h de incubation a temperatura ambiente se usaron las muestras tal como se describio anteriormente.
Calculo de DE50. Para la estimation de la dosis eficaz al 50% de agAAB para estimular cardiomiocitos de rata neonatal, se administraron los anticuerpos purificados mediante cromatografia de afinidad que se unen a los epitopos en el bucle 1 del receptor b2-adrenergico humano o en el bucle 2 del receptor 01-adrenergico humano (subtipo A) al cultivo tisular que contenia cardiomiocitos de rata neonatal de manera secuencial con el aumento de la concentracion de anticuerpo hasta que se observo el maximo del aumento de la frecuencia de latido. Se calculo la DE50 mediante un programa informatico.
Pacientes. Se obtuvieron sueros de 14 pacientes con demencia de tipo Alzheimer a partir de la Clinica de Psiquiatria del Hospital de Luedenscheid. Los controles son la fraccion de inmunoglobulina de suero sanguineo de donantes sanos del Centro Max Delbruck de Medicina Molecular, Berlin.
Para la preparacion de inmunoglobulina, se centrifugaron las muestras a 4.000 g durante 30 min y se almacenaron a -20°C. Se adquirieron los reactivos de Sigma-Aldrich Chemie (Deisenhofen, Alemania). Todos los demas productos quimicos eran de calidad analitica.
Resultados
Las figuras muestran lo siguiente:
Figura 1: Los anticuerpos de pacientes (n = 11 - 14) con enfermedad de Alzheimer estimulan cardiomiocitos de rata mediante el receptor b2-adrenergico y el receptor 01-adrenergico. El antagonista b2-adrenergico, ICI 118.551, bloquea especificamente, pero de manera parcial, los efectos estimulantes de los anticuerpos agonistas. Se observa una inhibition mas eficaz de la actividad celular de contraccion si se administra adicionalmente el antagonista o- adrenergico, prazosina, al cultivo celular. 11 de 14 muestras de suero o inmunoglobulinas activan los miocitos cardiacos.
Figura 2: Los anticuerpos de pacientes (n=6) con enfermedad de Alzheimer se unen al primer bucle extracelular del receptor b2-adrenergico. Tras la incubacion conjunta de los peptidos de bucle extracelular 1, 2 o 3 con las inmunoglobulinas de los pacientes, solo el bucle 1 neutraliza el aumento mediado por anticuerpos de la frecuencia de latido celular.
Figura 3: Los anticuerpos de pacientes (n = 6) con enfermedad de Alzheimer se unen a un epltopo peptldico incorporado en el primer bucle extracelular del P2-AR. Tras la incubacion conjunta de las inmunoglobulinas con epltopos solapantes (2 aminoacidos) de los peptidos de bucle 1, se observo una neutralizacion del aumento mediado por anticuerpo de la frecuencia de latido con el epltopo FGNFWCE.
5 Figura 4: Los anticuerpos de pacientes (n = 6) con enfermedad de Alzheimer y dirigidos contra el receptor P2- adrenergico pertenecen a la subclase 1 de inmunoglobulina G. Tras la incubacion conjunta de las inmunoglobulinas con anticuerpos monoclonales especlficos para las subclases 1 - 4, la actividad mediada por anticuerpos solo desaparecio con el precipitado realizado con el anticuerpo monoclonal contra IgG1.
Figura 5: Los anticuerpos de pacientes (n=6) con enfermedad de Alzheimer se unen al segundo bucle extracelular del 10 receptor a1-adrenergico. T ras la incubacion conjunta de los bucles 1,2 o 3 con las inmunoglobulinas de los pacientes,
solo el bucle 2 neutraliza el aumento mediado por anticuerpo de la frecuencia de latido celular.
Figura 6: Los anticuerpos de pacientes (n = 5) con enfermedad de Alzheimer se neutralizan mediante un peptido incorporado en el segundo bucle extracelular del receptor a1A-adrenergico. Se incubaron conjuntamente peptidos solapantes (uno o dos aminoacidos) con las inmunoglobulinas. El peptido con la secuencia de aminoacidos APEDET 15 neutraliza la actividad celular de las inmunoglobulinas.
Figura 7: Los anticuerpos de pacientes (n = 5) con enfermedad de Alzheimer y dirigidos contra el receptor a1A- adrenergico pertenecen a la subclase 1 de inmunoglobulina G. Tras la incubacion conjunta de las inmunoglobulinas con anticuerpos monoclonales especlficos para las subclases 1 - 4, la actividad mediada por anticuerpos solo desaparecio con el precipitado realizado con el anticuerpo monoclonal contra IgG1.
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Claims (14)

  1. 5
    10
    15
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    REIVINDICACIONES
    1. Peptido que tiene una DE50 de menos de 500 nM, en particular 10 nM contra un anticuerpo que reconoce un epltopo en un bucle 2 de a o bucle 1 de P2 extracelular de un receptor adrenergico (AR) humano en el que la union del anticuerpo al epltopo da como resultado un aumento de la actividad g-secretasa, una liberacion aumentada de moleculas de b-amiloide, en el que el valor de DE50 se mide mediante un bioensayo; y en el que el peptido consiste en una secuencia de aminoacidos
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9
    en la que
    a)
    X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, X2 = A, G, a-Abu, F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, S, V, W, Y o delecion,
    X3 = Hyp, P, Pip, S, T, Y o delecion,
    X4 = Aad, Asu, D, E, Har, K, N, Orn, Q, R,
    X5 = Aad, Asu, D, E, N, Q,
    X6 = Aad, Asu, D, E, Har, K, N, Orn, Q, R,
    X7 = F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y o delecion,
    X8 = A, a-Abu, b-A, G, S, T, V, Y o delecion,
    X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, o
    b)
    X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, X2 = F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y,
    X3 = A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R, S, V,
    X4 = Aad, Asu, D, E, Hyp, N, P, Pip, Q,
    X5 = Aad, Asu, D, E, Hyp, N, P, Pip, Q,
    X6 = A, a-Abu, G, Hyl, K, Orn, R, S, V X7 = F, Hph, Hyp, Nal, P, Pip, W, Y,
    X8 = g-Abu, Ahx, b-A, G o delecion,
    X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, o
    c)
    X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, X2 = A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R o delecion,
    X3 = A, C, F, Hph, M, Nal, S, W, Y,
    X4 = F, S, T, W, Y,
    X5 = F, S, T, W, Y,
    X6 = A, C, F, Hph, M, Nal, S, W, Y,
    X7 = A, a-Abu, Dab, G, Hyl, K, Orn, R,
    X8 = Abu, Ahx, b-A, G o delecion,
    5 X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion, o
    d)
    X1 = grupo amino, amida, grupo acetilo, grupo biotina, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion,
    X2 = Aad, Asu, D, E, F, Hph, N, Nal, Q, W, Y,
    X3 = A, C, G, Hcy, S, Sec,
    10 X4 = D, E, F, N, Nal, Q, W, Y, X5 = F, Hph, Nal, W, Y,
    X6 = D, E, F, N, Nal, Q, W, Y, X7 = A, C, G, Hcy, S, Sec,
    X8 = Aad, Asu, D, E, F, Hph, N, Nal, Q, W, Y,
    15 X9 = amida, hidrazida, azida, carbamato, marcador, espaciador, ligador, C, GKK, SGKK o delecion
    en el que Aad es acido a-aminoadlpico; a-Abu es acido a-aminobutlrico; Ahx es acido e-aminohexanoico; Asu es acido a-aminosuberico; b-A es b-alanina; Dab es acido aj-diaminobutlrico; g-Abu es acido g-aminobutlrico; Har es homoarginina; Hcy es homocistelna; Hph es homofenilalanina; Hyl es 8-hidroxilisina; Hyp es hidroxiprolina; Nal es b- (1 o 2-naftil)-alanina; Orn es ornitina; Pip es acido pipecolico; Sec es selenocistelna y el codigo de una letra de 20 aminoacidos representa los L-aminoacidos comunes segun la nomenclatura de la IUPAC as! como los D-aminoacidos correspondientes.
  2. 2. Peptido segun la reivindicacion 1, en el que el peptido reconoce los epltopos de bucle 1 extracelular de a1 de los subtipos de a-AR humano A, B o C o combinaciones de los mismos, y el bucle 1 extracelular de un b2-AR, en el que las combinaciones son A y B; A y C; B y C; A y B y C.
    25 3. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ligador y/o un espaciador
    se seleccionan del grupo que comprende: acidos a-aminocarboxllicos as! como homo y heterooligomeros de los mismos, acidos a,m-aminocarboxllicos y oligomeros ramificados o heterooligomeros de los mismos, otros aminoacidos alifaticos y/o aromaticos as! como homo o heterooligomeros lineales y ramificados; amino-oligoalcoxialquilaminas; derivados de acido maleinimidocarboxllico; oligomeros de alquilaminas; derivados de 4-alquilfenilo; derivados de 430 oligoalcoxifenilo o 4-oligoalcoxifenoxilo; derivados de 4-oligoalquilmercaptofenilo o 4-oligoalquilmercaptofenoxilo; derivados de 4-oligo-alquilaminofenilo o 4-oligoalquilaminofenoxilo; derivados de (oligoalquilbencil)fenilo o 4- (oligoalquilbencil)fenoxilo, as! como derivados de 4-(oligo-alcoxibencil)fenilo o 4-(oligoalcoxi-bencil)fenoxilo; derivados de tritilo; derivados de benciloxiarilo o benciloxialquilo; derivados de xanten-3-iloxialquilo; derivados de acido (4- alquilfenil) o w-(4-alquilfenoxi)alcanoico; derivados de oligoalquilfenoxialquilo u oligoalcoxifenoxialquilo; derivados de 35 carbamato; aminas; derivados de trialquilsililo o dialquilalcoxisililo; derivados de alquilo o arilo y/o combinaciones de los mismos.
  3. 4. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en:
    a) un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos 40 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9
    segun la reivindicacion 1;
    5
    10
    15
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    25
    30
    b) un peptido que consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene una homologla suficiente como para ser funcionalmente analogo a una secuencia de aminoacidos segun a).
  4. 5. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoacidos APEDET; WKEPAP; PPDERF; KMWTFG o FGNFWCE.
  5. 6. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en una forma lineal y ramificada, as! como clclica, en el que el cierre del anillo peptldico se realiza mediante formacion de puentes disulfuro cuando hay dos cistelnas presentes, o mediante ciclacion de amida, que se realiza opcionalmente mediante cadenas laterales, mediante los extremos C-terminal con N-terminal o mediante una combinacion de estas dos ultimas posibilidades.
  6. 7. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las inmunoglobulinas, es decir los anticuerpos segun la reivindicacion 1, son autoanticuerpos agonistas que interaccionan con el receptor a- adrenergico.
  7. 8. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende adicionalmente grupos amino, amidas, hidrazidas, azidas, carbamatos, grupos acetilo, grupos biotina, marcadores, espaciadores y/o ligadores.
  8. 9. Fases solidas para cromatografla de afinidad o extraction en fase solida que consisten en pollmeros organicos, inorganicos, sinteticos o en pollmeros mixtos, preferiblemente agarosa reticulada, celulosa, gel de sllice, poliamida y poli(alcoholes vinllicos), que opcionalmente estan activados qulmicamente, con peptidos segun al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, inmovilizados sobre la superficie de la fase solida.
  9. 10. Fases solidas segun la reivindicacion 9, en las que los peptidos estan unidos a la fase de soporte solido de manera covalente o mediante adsorcion.
  10. 11. Fases solidas segun la reivindicacion 9 y/o 10, en las que los peptidos estan unidos de manera covalente a la fase solida en la position X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 y/o X9.
  11. 12. Fases solidas segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en las que los peptidos estan separados de la superficie de soporte mediante ligadores/espaciadores.
  12. 13. Peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fase solida segun las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la profilaxis, el diagnostico, la terapia, el seguimiento y/o cuidado posterior de la enfermedad de Alzheimer.
  13. 14. Peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fase solida segun las reivindicaciones 9 a 12, para su uso en la production o el examen de un farmaco para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como EA.
  14. 15. Peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que puede unirse a autoanticuerpos agonistas (agAAB) dirigidos contra la actividad g-secretasa mediada por receptor P2 y a1-adrenergico en individuos que presentan mayores niveles de g-secretasa, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de EA.
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