KR20020047177A

KR20020047177A - 확장성 심근질환을 유발하는 자동항체를 제거하기 위한펩티드

Info

Publication number: KR20020047177A
Application number: KR1020027003665A
Authority: KR
Inventors: 뢴스펙볼프강; 루돌프 쿤제; 게르트 발루카트; 마누엘라 디렌펠트
Original assignee: 아피나 이문테히닉 게엠베하
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2002-06-21
Also published as: JP2003514772A; EP1214350B1; ES2272325T3; ATE338772T1; US6994970B1; DE50013435D1; WO2001021660A1; AU7521800A; EP1214350A1

Abstract

본 발명은 확장성 심글질환(DCM)과 원인 병리적 관련이 있는 자동-항체를 결합시키는 펩티드에 관한다. 이들 펩티드는 예를들어 고체상에 결합될 수 있을 것이다. 자동-항체는 본 발명 펩티드로 DCM 환자의 혈액을 처리함으로써 제거할 수 있다.

Description

확장성 심근질환을 유발하는 자동항체를 제거하기 위한 펩티드{PEPTIDES FOR COMBATING THE AUTOANTIBODIES THAT ARE RESPONSIBLE FOR DILATATIVE CARDIOMYOPATHY(DCM)}

본 발명은 DCM을 유발하는 자동-항체에 대한 펩티드, 이러한 펩티드를 함유하는 약품, 펩티드의 용도, β₁-아드레날린성 활성 자동-항체에 돤련된 질병의 치료 방법 및 고체 상에 결합된 펩티드를 함유하는 면역흡수용 장치에 관한다.

면역 시스템은 모든 동물에 필수적인 시스템이다. 특히 포유동물에서, 이것은 미생물, 조직 재생 및 암세포의 파괴에 대한 방어 작용을 한다. 전형적인 면역작용에서, 세포 방어 및 사람 면역 방어간에는 차이가 있다. 이것은 면역 시스템을 궁극적으로 대표하는 두개의 구별되는 그러나 협조적인 시스템을 의미한다.

병리학적으로 자동-면역 질환으로 사료되어지는 질환은 다수가 있다. 이러한 질환에서, 환부의 면역 시스템은 기관, 조직, 세포 또는 단백질 및 기타 분자에 대한다. 주로 세포-매개된 자동-면역 질환은 복합 경화증 및 당뇨병을 포함한다(타입 1).

두번째 그룹은 주로 항체가 매개된 자동면역 질환이다. 이들은 예를들어 류마티스, 좀더 드물게 발생하는 위근무력증 또는 홍반성낭창 및 최근의 확장성 심근질환(DCM)과 같은 자동-면역 질환을 포함한다.

대부분의 자동-면역 질환의 병리는 공지되어 있지 않다. 자동-면역 질환의 발생을 설명하는 여러가지 가설 및 모델이 있다. 한 설명 모델은 항원/분자 모형이다. 이 모델에서는, 예를들어 바이러스 또는 기생충과 같은 미생물이 예를들어 숙주의 내인성 구조와 매우 유사하거나 이와 부분적으로 동일한 특정 분자를 스스로 제공하므로 숙주의 면역 시스템에 의하여 인식되지 않는다고 한다.

그러나, 이들이 외부 물질로 인식되어 이들에 대한 항체가 생성될 될 경우, 이러한 항체는 또한 유사한 내인성 구조를 인식하게 되어 면역 시스템 및 보체 시스템을 활성시키게 된다. 이것은 조직내 제자리 병리학적 반응, 예를들어 만성염을 포함하거나 자동-항체가 결합된 세포의 병리학적 오작용이 발생한다.

확장성 심근질환은 이의 지배적인 예로 간주할 수 있다. 이러한 자동-면역 질환에서, 유기체는 β₁-아드레날린성 수용체의 제한 영역에 결합하는 항체를 잘못 만들어낸다. 이들 영역은 β₁-아드레날린성 수용체의 총 3개의 세포외 루프의 제1 및 제2 루프 상에 있다.

이들 영역에 결합할 수 있는 이러한 자동-항체는 세포 배양(이들 세포는 표면상에 거의 동일한 β₁-아드레날린성 수용체를 가짐)된 쥐의 근세포로 생물학적 테스트시 맥박 증가를 야기한다. 이것을 아드레날린과 유사한 자동-항체의 약물-활성 효과라 한다. β₁-아드레날린성 수용체의 루프 1 및 2 상의 에피토프에 대한 자동-항체는 주로 DCM 환자에서 관찰된다. 때때로, 이러한 자동-항체는 부정맥및 심근염 환자에서도 관찰된다.

확장성 심근질환은 처치되지 않을 경우 심출력을 심각하게 손상시키는, 즉 병소에 의한 심근 조직의 동시 팽창으로 출력이 감소되어 심장 이식이 필요하거나 사망하게 되는 자동-면역 질환이다.

그러나, 혈액을 세척하여 환자의 혈액으로부터 항체를 제거할 경우, 1년내에 심근이 재생되고 심근 출력이 극적으로 개선되어 거의 정상인의 수준에 이른다.

DCM 환자에서, β₁-아드레날린성 수용체에 결합하는 특정 자동-항체를 함유하여 세포를 활성화시킬 수 있는 면역 글로불린 단편을 플라스마에서 분리시킬 수 있다. 자동-항체에 대한 결합 부위를 가지는 β₁-아드레날린성 수용체의 펩티드를 쥐 심장근육 세포 배양액에 가할 경우, 면역 글로불린 단편의 병리적 효과가 중화될 수 있다.

원래 서열에 해당하는 동일한 펩티드가 고체상에 커플링될 경우, 이들은 더이상 환자의 혈액 플라스마로부터의 상기 자동-항체를 결합 및 제거시킬 수 없게 된다. 이것은 β₁-아드레날린성 수용체의 원 서열에 해당하고 기술한 병리학적 자동-항체에 대한 결합 부위를 가지는 펩티드를 면역-흡수에 사용할 수 없음을 의미한다.

양성 항체 상태 또는 DCM을 가지고 있는 환자의 혈액 또는 플라스마내 관능 에피토프에 대한 병리학적 자동-항체를 인식, 결합 및 제거하는 펩티드를 제공하는 것이 본 발명의 목적인데, 상기에서 펩티드는 각기 항체 효과를 중화시키는 에피토프 외에, 병리학적 항체를 결합시킬 수 있는 아미노산 서열을 동시에 함유한다.

놀랍게도, 이러한 목적은 다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-X03-G-X04-XO5-X06-X07-X08-X09-W-X10-X11-X12

[식중, X01은 아미노 그룹, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹, 형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X02는 D, G, E, T, S 또는 결실;

X03는 W, Y, F, G, T;

X04는 T, S, A, G;

XO5는 L, F, Y, W;

X06는 V, I, W, F, Y;

X07은 S, A, C;

X08은 G, D, E, N, Q;

X09은 F, L, I, Y;

X10은 E, Q, T, S, L;

X11은 Y, F, T, S, W;

X12는 아미드, 유리산, GKK 또는 이격자임.

및 다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-W-X03-R-X04-XO5-X06-X07-X08-E-A-R-X09-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17

[식중, X01은 아미노 그룹, 아미노산, 펩티드, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹,형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X02는 H, E, Q;

X03는 H, F, Y, W;

X04는 A, V;

XO5는 G, T, E, S, D, N;

X06는 S, H, A;

X07는 D, N, Q, E;

X08은 G, A 또는 결실;

X09은 D, N, R;

X10은 S, T, C, M;

X11은 H, F, W, Y;

X12는 A, D, N, S;

X13은 D, N;

X14은 E, P;

X15은 R, K, T;

X16은 S, T, C, M 또는 결실;

X17은 아미드, 유리산, GKK, SGKK 또는 이격자임.

로 달성된다.

특히, 다음 아미노산 서열을 가지는 본 발명 펩티드

X01-X02-X03-G-X04-XO5-X06-X07-X08-X09-W-X10-X11-X12

X02는 D, E, T 또는 결실;

X03는 W, Y, T;

X04는 T, S;

XO5는 L, F;

X06는 V, F;

X07은 S;

X08은 G, D, E;

X09은 F, L;

X10은 E, Q, T, L;

X11은 Y, T, S;

X12는 아미드, 유리산, GKK 또는 이격자임.

및 다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-W-X03-R-X04-XO5-X06-X07-X08-E-A-R-X09-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17

[식중, X01은 아미노 그룹, 아미노산, 펩티드, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹, 형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X03는 Y, W;

XO5는 T, E;

X06는 S, H, A;

X08은 G 또는 결실;

X12는 A, N;

X15은 K, T;

X16은 S 또는 결실;

X17은 아미드, 유리산, GKK, SGKK 또는 이격자임.

를 사용한다.

하기 그룹에서 선택되는 펩티드:

-TGSFFSELWTSR²,

EYGSFFSELWTSR²,

TYGTLFSDFWLSR²,

DWGTLVSGFWERR²,

DWGTLFSDFWQTR²

[식중, R²는 아미노산, 유리산이거나 GKKR³³인데, 여기서 R³는 산 아미드 또는 유리산임.

(단, 서열내 아미노산 위치당 최대 하나의 비보존 아미노산 교환이 일어나는 것을 조건으로 하며, 상기에서 "비보존 교환"이란 하기 그룹 사이의 아미노산 교환을 의미함:

그룹 I: Leu, Ile, Val, Met, His, Trp, Tyr, Phe

그룹 II: Glu, Gln, Asp, Asn

그룹 III: Ser, Thr, Cys, Gly, Ala, Pro

그룹 IV: Lys, Arg.)

및

하기 그룹에서 선택되는 펩티드:

HWWRAESD-EARRSYNDPK-R²,

HWYRATSDGEARRSYADPTSR²

그룹 I: Leu, Ile, Val, Met, His, Trp, Tyr, Phe

그룹 II: Glu, Gln, Asp, Asn

그룹 III: Ser, Thr, Cys, Gly, Ala, Pro

그룹 IV: Lys, Arg.)

를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

다음 펩티드가 특히 바람직하다:

또한 N-말단이 아세틸화될 수 있는

TGSFF SELWT SGKK-아미드 또는 유리산(서열 제1번)

E YGSFF SELWT SGKK-아미드 또는 유리산(서열 제2번)

T YGTLF SDFWL SGKK-아미드 또는 유리산(서열 제3번)

His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-아미드 또는 유리산(서열 제4번)

Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-아미드 또는 유리산(서열 제5번)

D WGTLV SGFWE Y 아미드 또는 유리산(서열 제6번)

D WGTLF SDFWQ TGKK 아미드 또는 유리산(서열 제7번)

H WYRAT SDGEA PRSYA DPTSG KK-아미드 또는 유리산(서열 제8번)

HWWRAESDEARRSYNDPKC-아미드 또는 유리산(서열 제9번).

관능에 영향을 주지 않는 보존 방식으로 펩티드 또는 단백질내 아미노산 위치를 바꿀 수 있음은 당업자에 공지되어 있다. 본원에서, "보존적" 교환은 다음에 열거한 그룹내에서 교환됨을 의미한다:

그룹 I: Leu, Ile, Val, Met, His, Trp, Tyr, Phe

그룹 II: Glu, Gln, Asp, Asn

그룹 III: Ser, Thr, Cys, Gly, Ala, Pro

그룹 IV: Lys, Arg.

본 발명 펩티드는 특히 확장성 심근질환 환자의 항체에 결합된다.

본 발명 링커로서, 항체에 대한 펩티드의 결합 행동에 악영향을 주지 않는한 본 목적에 이용할 수 있는 모든 구조를 사용할 수 있을 것이다. 통상적으로, 링커는 보통 관능성이 없는 중합체 매트릭스 상에 하나 이상의 결합 부위(관능 그룹)를 제공하는 화합물이다.

결합 사이트는 리간드 또는 이격자를 커플링시키는 작용을 하며 리간드 또는 이격자의 화학적 특성을 맞춘다. 이러한 링크는 안정하며 링커 분자의 형태에 따라 절단가능한다.

리간드는 통상적으로 몇가지 특별한 특성을 가지는 화합물이다. 본 발명은 바람직하게는 심근의 β₁-아드레날린성 수용체에 향해 있고 아드레날린성 활성을 가지는 자동-항체를 특이적으로 결합시킬 수 있는 펩티드이다.

본 발명은 바람직하게는 다음 링커를 사용한다:

α-아미노카복실산 및 이의 호모- 및 헤테로올리고머, α,ω-아미노카복실산 및 이들의 분지된 호모- 또는 헤테로올리고머, 기타 아미노산 및 이의 선형 및 분지된 호모- 또는 헤테로올리고머(펩티드); 아미노-올리고알콕시-알킬아민; 말레인이미도카복실산 유도체; 알킬아민의 올리고머; 4-알킬페닐 유도체; 4-올리고알콕시페닐 또는 4-올리고알콕시 페녹시 유도체; 4-올리고알킬머캅토페닐 또는 4-올리고알킬머캅토페녹시 유도체; 4-올리고알킬아미노페닐 또는 4-올리고알킬아미노페녹시 유도체; (올리고알킬벤질)페닐 또는 (4-올리고알킬벤질)페녹시 유도체 및 (4-올리고알콕시벤질)페닐 또는 (4-올리고알콕시벤질)페녹시 유도체; 트리틸 유도체; 벤질옥시아릴 또는 벤질옥시알킬 유도체; 크산텐-3-일옥시알킬 유도체; (4-알킬페닐) 또는 ω-(4-알킬페녹시)알카노산 유도체; 올리고알킬페녹시알킬 또는 올리고알킬페녹시알킬 유도체; 카바메이트 유도체; 아민; 트리알킬실일 또는 디알킬알콕시실일 유도체; 알킬 또는 아릴 유도체 및 이의 조합물.

특히, 본 발명 펩티드는 이용시 고체상에 결합된다. 바람직하게는, 고체상에 펩티드의 결합은 이격자를 통해 이루어진다. 이격자로서는, 항체와 펩티드의 결합이 저해되거나 손상되는 정도로 결합 행동에 악영향을 미치지 않는한 이러한 작용에 적합한 실질적으로 모든 화합물 또는 그룹을 사용할 수 있을 것이다.

이격자는 통상적으로 필요하다면 링커 및 리간드 사이에 삽입되는 화합물로서, 자동-항체의 결합에 적절한 공간적 위치 및 거리로 리간드를 위치시키는 작용을 한다. 이격자는 둘 이상의 화학 활성 그룹(관능 그룹)을 가지는 분자인데, 이중 한 그룹은 링커 분자에 결합되고 하나 이상의 제2 관능 그룹은 리간드로의 결합을 매개한다. 이격자를 선택함으로써, 필요에 따라 표면상의 리간드 밀도를 증가시키고 리간드를 배향시킬 수 있을 뿐만 아니라 접근성을 개선시키고 유연성을 증가시킬 수 있다.

이격자는 예를들어 ω-아미노카르복실산 및 이들의 호모- 및 헤테로올리고머, α,ω-아미노카복실산 및 이들의 분지된 호모- 또는 헤테로올리고머, 기타 아미노카복실산 및 이들의 선형 및 분지된 호모- 또는 헤테로올리고머, 말레인이미도카복실산 유도체, 하이드록시카복실산 유도체, 디카복실산 유도체, 디아민 유도체 디하이드록시알킬 유도체 및 하이드록시알킬아민 유도체를 포함한다. β-알리닌 또는 ω-아미노헥사노산의 모노- 또는 디올리고머 및 리신 또는 오르니틴의 분지된 모노- 또는 디올리고머를 사용하는 것이 바람직하다. 펩티드를 고체상에 고정시킬 수 있는 기술이 특히 당업자에 공지되어 있다.

또다른 본 발명 구체예에서, 본 발명 펩티드는 약물로 사용된다.

이 개념에서, 펩티드는 특히 혈청 프로테아제에 의하여 분해될 수 없고 용액내에서 항체를 결합시키도록 (예를들어 순환시켜) 변형된다. 이러한 방식으로, 가공시킨 해당 펩티드를 정맥 주사함으로써 항체의 생체내 중화가 일어날 수 있다. 여기서 펩티드는 약물로 고려되어져야 한다. 이들의 개발은 칼럼 매트릭스에 고정되는 항체를 결합시키는 펩티드에서 직접 유도된다.

투여되는 펩티드의 양은 혈류 및 기타 부분에 도달될 수 있는 자동-항체의 농도 및 분자량(즉, 크기)에 따라 달라진다. 오늘날 알려진 바에 따르면, 자동-항체의 양은 ㎍ 및 ng 범위내이다. 존재하는 항체를 결합시키는데 1-5㎍의 펩티드가 충분할 것이며 이는 자연 정화 기전에 따라 면역 착물로서 제거된다. 따라서, 새로 생성된 항체만이 제거되어야 하므로 용량은 낮출 수 있다.

원칙적으로, 이 경우 다른 사용량도 적당할 수 있을 것이다. 해당 생약 방법을 사용할 경우, β₁-아드레날린성 항체를 결합시키는 펩티드의 장내 흡수가 이루어질 수 있어야 한다. 이 경우, 용량은 바람직하게는 약 10-20 인자 만큼 더 높아야 할 것이다.

본 발명 펩티드는 특히 확장성 심근질환, 고혈압 및크루즈트리파노소마에서 유도되는 일종의 심근질환과 같은 β₁-아드레날린성에 관련된 질병의 치료를 위한 약물의 제조에 사용할 수 있다. 확장성 심근질환 외에, 자동-면역 질환으로 분류될 수 있고 병리 기전이 유사한 다수의 질병이 존재한다. 또한 자간전증 및 혹종 형태의 악성 고혈압에 대하여도 자동 항체는 angiotensin 수용체 또는 α₁-수용체를 자극하여 세포를 과민하게 하고 임상 소견을 제한하는 원인이 되는 것으로 알려졌다. 확장성 심근질환과 유사하므로, 이들 특정 항체를 제거시키거나 자동-항체를 생체내에서 중화시키는데 펩티드를 사용하는 것을 고려할 수 있다.

본 발명은 고체상에 결합된 펩티드를 이용하여 자동-항체를 제거시킴으로써 β₁-아드레날린 작동 활성 자동-항체와 관련된 질병의 치료 방법을 청구한다. 이것은 고체상에 결합된 본 발명 펩티드를 함유하는 본 발명 크로마토그래피 장치로 수행하는 것이 유리할 수 있을 것이다.

펩티드는 통상 부피가 5-250ml인 밀폐된 살균 용기내 예를들어 세파로스와 같은 고체상에 고정시킨다. 이러한 살균 공간내에서, 미리 의공학 장치로 세포를 분리한 환자의 혈액 플라스마는 흡수 매트릭스, 즉 펩티드-피복된 세파로즈 표면 위를 또는 표면을 통하여 흐른다. 이로써 β₁-아드레날린성 수용체 영역을 시뮬레이트하는 펩티드와 병리학적 자동-항체의 결합이 이루어진다. 적당한 매트릭스를 사용할 경우, 세포를 미리 분리하는 단계를 생략할 수 있다.

필요한 모든 유용한 면역 글로불린을 포함하는 혈액 또는 혈액 플라스마의 나머지 성분은 이후 칼럼을 떠나 환자의 혈류 속으로 재순환된다. 면역 글루불린 또는 플라스마 단백질의 비특이적 제거에 관한한 이러한 외용 치료 장치가 현 기술 상태이다.

본 발명 장치는 적지만 병리학적으로 적절한 자동-항체 단편을 플라스마로부터 분리하기 위하여 β₁-아드레날린성 수용체에서 유도된 펩티드를 사용한다.

혹종량의 혈액 플라스마가 장치를 통해 흐른 후, 혈액 플라스마 스트림은 제1 칼럼과 기술적으로 동일한 제2 칼럼으로 전환될 수 있고, 이때 제1 칼럼은 재생된다. 이것은 로딩된 항체가 펩티드에서 분리되어, 상이한 헹굼용액 및 용출 용액, 바람직하게는 추가의 완충용액이 포함되거나 포함되지 않은 생리학적 식염수를 사용하여, 예를들어 포스페이트, 글리신 또는 시트레이트에 의하여 2-7.5의 pH에서 배출됨을 의미한다. 이어서, 이렇게 재생된 칼럼은 다시 환자의 혈액 플라스마로부터 병리학적 자동-항체를 결합 및 제거하는데 이용될 수 있다. 이러한 더블 칼럼 원칙은 유용한 것으로 밝혀져 칼럼의 재생이 필요할 경우 항상 이용된다.

병리학적 자동-항체의 제거를 위하여 펩티드를 사용하는 두번째의 변형은 일회용 칼럼을 사용하는 것을 포함한다. 이들 칼럼에서, 고체상 매트릭스는 수시간의 치료로 플라스마로부터 자동-항체의 대부분을 제거할 수 있기에 충분한 양의 펩티드를 함유한다. 시간-소모적이고 지루한 흡수 매트릭스의 재생 작업을 생략할 수 있다는 점에 이점이 있다.

혈액 플라스마로부터 병리학적 항체를 제거함으로써 DCM 환자를 치료하는 세번째 변형은 칼럼 디자인으로 인하여 플라스마 및 혈액 세포의 전 분리가 필요치 않는 칼럼을 사용하는 것을 포함한다.

칼럼의 사용은 상이한 유연 튜브, 모니터 스크린 및 기타 모니터 시스템을 사용하여 치료에 적당한 혈액 및 플라스마 유입 및 흐름을 확보하는 기술적 장치를 요한다.

1. 펩티드

다음 두 펩티드를 고체상으로서 가교결합된 아가로스 비드 세파로즈 4B 상에 고정시켰다.

펩티드 1: TGSFFCELWTSGKK

펩티드 2: HWWRAESDEARRSYNDPKC

세파로즈 CL4B는 충전 매트릭스로 작용하였다. 두 펩티드 매트릭스 및 충전 매트릭스로부터, 친화성 크로마토그래피 칼럼을 만들고 샘플로서 인간의 플라스마에 대하여 그 작용, 즉 인간 플라스마로부터의 DCM-관련 자동-항체의 제거를 테스트하였다.

2. 펩티드의 고정

고체상에 고정시키기 위하여, 펩티드를 2mg/ml의 농도까지 커플링 완충액(0.5M NaCl, 0.1M NaHCO3, pH 8.3)내 용해시키고, 세척하여 CNBr-전활성시킨 세파로즈 4B와 혼합하였다. 커플링 반응이 완료된 후, 펩티드 매트릭스를 커플링 완충액으로 세척하고 과량의 CNBr 그룹을 불활성시켰다.

커플링 전 사용된 펩티드의 질량 및 커플링 후 고정되지 않은 펩티드의 질량 차를 계산하여 매트릭스의 펩티드 로딩을 측광법적으로 측정하였다.

펩티드 1에서 매트릭스 로딩은 매트릭스 1ml당 펩티드 2.0mg이었다. 펩티드 2에서 매트릭스 로딩은 매트릭스 1ml당 펩티드 1.8mg이었다.

친화성 크로마토그래피 칼럼을 제작하기 위하여, 펩티드 매트릭스 1 및 펩티드 매트릭스 2를 1:1의 비율로 혼합하고 이 혼합물을 1:5의 비율로 충전 매트릭스와 혼합하였다. 친화성 크로마토그래피 칼럼에 대한 매트릭스의 총부피는 100ml였다.

3. 인간 플라스마로부터 DCM-관련 자동-항체의 분리

DCM-관련 자동-항체에 양성 반응을 보이는 DCM 환자 두 사람에 대하여 상기한 친화성 크로마토그래피 칼럼의 작용을 테스트하였다.

적용전, 상기 사람들에 헤파린, 히루딘 또는 시트레이트와 같은 항응집제 처치를 하였다.

따라서, 1500-3000 단위로 주어진 농도 범위에서 헤파린 정제 2000 단위를 선택하여 정맥주사하였다. 시간당 헤파린 250-750 단위로 주어진 농도 범위에서 시간당 헤파린 사용량 500 단위를 선택하여 정맥주사하였다.

혈액 플라스마로부터 혈액의 세포 성분이 분리되는 분리기에 혈액을 통과시켰다. DCM-관련 자동-항체에 양성 반응을 보이는 사람의 플라스마를 친화성 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시켰다. 친화성 크로마토그래피 칼럼 실행시 치환성 매트릭스 대 플라스마의 부피비는 1:6-1:10이었다. 모두에 대하여 이러한 정체 싸이클을 수행하였는데, 이때 테스트된 플라스마는 각 싸이클후 세포 혈액 성분과 더불어 환자에 재주입하였다. 정제 싸이클 총수 20은 총 투여일수 5일간 매 투여일 마다 4 정제 싸이클을 두어 나온 것이다.

4. DCM-관련 자동-항체의 정량분석

매 투여일마다 투여 전후 얻은 DCM 환자의 플라스마 샘플로부터, DCM-관련 자동-항체의 정량분석을 하였다. Wallukat, G., Wollenberger, A., Morwinski, R. 및 Pitschner, H.F.(1995); 확장성 심근질환 환자의 혈청에서 취한 변시성 활성의 항-β₁-부신 수용 항체: 제1 및 제2 세포외 루프내 에피토프 맵핑; J. Mol. Cell. Cardiol. 27, 397-406에 따라 DCM-관련 자동-항체(β₁-아드레날린성 수용체에 대한 항체)의 분석을 수행하였다.

5. 인간 플라스마로부터 DCM-관련 자동-항체의 제거 결과

바람직하게는 펩티드 1에 결합하는 자동-항체를 가지는 사람 1에 대하여, 전 체 투여를 마쳤을때 초기치의 12%까지 자동-항체가 감소되었다. 바람직하게는 펩티드 2에 결합하는 자동-항체를 가지는 사람 2에 대하여, 전 체 투여를 마쳤을때 초기치의 5%까지 자동-항체가 감소되었다.

전 투여에 대한 결과는 표1에 나타내었다.

두 사람 모두에서, 전체 단백질, 알부민 및 IgG와 같은 기타 플라스마 인자의 농도는 전 투여시 거의 영향을 받지 않았다.

표 1: 친화성 크로마토그래피 칼럼으로 처리 전후 및 처리시 환자 1 및 2의 인간 플라스마내 DCM-관련 자동-항체(β₁-아드레날린성 수용체에 대한 항체).

친화성 매트릭스에서 용출시킨후, 고체상에 결합된 펩티드 1 및 펩티드 2를통하여 펩티드 1 또는 펩티드 2에 대한 결합 선호도를 친화성 크로마토그래피 칼럼에 결합된 자동-항체에 대하여 테스트하였다. 자동-항체 타입 1은 펩티드 1의 결합을 선호하고 자동-항체 타입 2는 펩티드 2의 결합을 선호한다.

Claims

다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-X03-G-X04-XO5-X06-X07-X08-X09-W-X10-X11-X12

[식중, X01은 아미노 그룹, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹, 형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X02는 D, G, E, T, S 또는 결실;

X03는 W, Y, F, G, T;

X04는 T, S, A, G;

XO5는 L, F, Y, W;

X06는 V, I, W, F, Y;

X07은 S, A, C;

X08은 G, D, E, N, Q;

X09은 F, L, I, Y;

X10은 E, Q, T, S, L;

X11은 Y, F, T, S, W;

X12는 아미드, 유리산, GKK 또는 이격자임.]

및 다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-W-X03-R-X04-XO5-X06-X07-X08-E-A-R-X09-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17

[식중, X01은 아미노 그룹, 아미노산, 펩티드, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹, 형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X02는 H, E, Q;

X03는 H, F, Y, W;

X04는 A, V;

XO5는 G, T, E, S, D, N;

X06는 S, H, A;

X07는 D, N, Q, E;

X08은 G, A 또는 결실;

X09은 D, N, R;

X10은 S, T, C, M;

X11은 H, F, W, Y;

X12는 A, D, N, S;

X13은 D, N;

X14은 E, P;

X15은 R, K, T;

X16은 S, T, C, M 또는 결실;

X17은 아미드, 유리산, GKK, SGKK 또는 이격자임.]
제1항에 있어서, 다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-X03-G-X04-XO5-X06-X07-X08-X09-W-X10-X11-X12

[식중, X01은 아미노 그룹, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹, 형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X02는 D, E, T 또는 결실;

X03는 W, Y, T;

X04는 T, S;

XO5는 L, F;

X06는 V, F;

X07은 S;

X08은 G, D, E;

X09은 F, L;

X10은 E, Q, T, L;

X11은 Y, T, S;

X12는 아미드, 유리산, GKK 또는 이격자임.]

및 다음 아미노산 서열을 가지는 펩티드

X01-X02-W-X03-R-X04-XO5-X06-X07-X08-E-A-R-X09-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17

[식중, X01은 아미노 그룹, 아미노산, 펩티드, 아세틸 그룹, 비오틴 그룹, 형광 라벨, 이격자, 링커 또는 결실;

X03는 Y, W;

XO5는 T, E;

X08은 G 또는 결실;

X12는 A, N;

X15은 K, T;

X16은 S 또는 결실;

X17은 아미드, 유리산, GKK, SGKK 또는 이격자임.]
제1항 또는 제2항에 있어서, 다음으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 펩티드:

-TGSFFSELWTSR²,

EYGSFFSELWTSR²,

TYGTLFSDFWLSR²,

DWGTLVSGFWERR²,

DWGTLFSDFWQTR²

[식중, R²는 아미노산, 유리산이거나 GKKR³³인데, 여기서 R³는 산 아미드 또는 유리산임.

(단, 서열내 아미노산 위치당 최대 하나의 비보존 아미노산 교환이 일어나는것을 조건으로 하며, 상기에서 "비보존 교환"이란 하기 그룹 사이의 아미노산 교환을 의미함:

그룹 I: Leu, Ile, Val, Met, His, Trp, Tyr, Phe

그룹 II: Glu, Gln, Asp, Asn

그룹 III: Ser, Thr, Cys, Gly, Ala, Pro

그룹 IV: Lys, Arg.)

및 하기 그룹에서 선택되는 펩티드:

HWWRAESD-EARRSYNDPK-R²,

HWYRATSDGEARRSYADPTSR²

(단, 서열내 아미노산 위치당 최대 하나의 비보존 아미노산 교환이 일어나는 것을 조건으로 하며, 상기에서 "비보존 교환"이란 하기 그룹 사이의 아미노산 교환을 의미함:

그룹 I: Leu, Ile, Val, Met, His, Trp, Tyr, Phe

그룹 II: Glu, Gln, Asp, Asn

그룹 III: Ser, Thr, Cys, Gly, Ala, Pro

그룹 IV: Lys, Arg.)
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단이 아세틸화될 수 있는

TGSFF SELWT SGKK-아미드 또는 유리산,

E YGSFF SELWT SGKK-아미드 또는 유리산,

T YGTLF SDFWL SGKK-아미드 또는 유리산,

His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-아미드 또는 유리산,

Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-아미드 또는 유리산,

D WGTLV SGFWE Y 아미드 또는 유리산,

D WGTLF SDFWQ TGKK 아미드 또는 유리산,

H WYRAT SDGEA PRSYA DPTSG KK-아미드 또는 유리산,

HWWRAESDEARRSYNDPKC-아미드 또는 유리산.

인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 확장성 심근질환 환자의 항체에 결합되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 다음 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드:

- α-아미노카복실산 및 이의 호모- 및 헤테로올리고머;

- α,ω-아미노카복실산 및 이들의 분지된 호모- 또는 헤테로올리고머;

- 기타 아미노산 및 이의 선형 및 분지된 호모- 또는 헤테로올리고머(펩티드);

- 아미노-올리고알콕시-알킬아민;

- 말레인이미도카복실산 유도체;

- 알킬아민의 올리고머;

- 4-알킬페닐 유도체;

- 4-올리고알콕시페닐 또는 4-올리고알콕시페녹시 유도체;

- 4-올리고알킬머캅토페닐 또는 4-올리고알킬머캅토페녹시 유도체;

- 4-올리고알킬아미노페닐 또는 4-올리고알킬아미노페녹시 유도체;

- (올리고알킬벤질)페닐 또는 (4-올리고알킬벤질)페녹시 유도체 및 (4-올리고알콕시벤질)페닐 또는 (4-올리고알콕시벤질)페녹시 유도체; 트리틸 유도체; 벤질옥시아릴 또는 벤질옥시알킬 유도체; 크산텐-3-일옥시알킬 유도체;

- 트리틸 유도체;

- 벤질옥시아릴 또는 벤질옥시알킬 유도체;

- 크산텐-3-일옥시알킬 유도체;

- (4-알킬페닐) 또는 ω-(4-알킬페녹시)알카노산 유도체;

- 올리고알킬페녹시알킬 또는 올리고알킬페녹시알킬 유도체;

- 카바메이트 유도체;

- 아민;

- 트리알킬실일 또는 디알킬알콕시실일 유도체;

- 알킬 또는 아릴 유도체;

- 및 이의 조합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고체상에 결합되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이격자를 통하여 고체상에 결합되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 펩티드를 함유하는 약물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 펩티드를, β₁-아드레날린성 활성 자동-항체 관련 질병, 특히 확장성 심근질환의 치료약 제조에 사용하는 용도.
고체상에 결합된 제6항 또는 제7항의 펩티드를 이용하여 자동-항체를 제거함으로써 β₁-아드레날린성 활성 자동-항체 관련 질병을 치료하는 방법.
고체상에 결합된 제6항 또는 제7항의 펩티드를 함유하는 크로마토그래피 장치.