ES2638065T3 - Método y aparato de caracterización y recuento de partículas, en particular de partículas biológicas - Google Patents

Abstract

Método para la detección de la presencia de partículas (BEADS) posiblemente presentes en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actúa sobre dichas partículas, que se genera mediante una serie de electrodos (EL) que comprende las etapas de: i. desactivar el campo (F) de fuerza; ii. medir, en al menos un intervalo de tiempo posterior a la desactivación y seleccionado en función de la dinámica de los movimientos de asentamiento y/o brownianos a los que se someten las partículas con un campo desactivado, el nivel de gris que se genera por los primeros sensores (PIXEL_IJ) que se asocian con puntos de equilibrio estable (PEQ) y por segundos sensores (PIXEL_REF) que se asocian con regiones espaciales que ciertamente no pueden ser ocupadas por partículas debido a la configuración actual de dicho campo (F) de fuerza ; iii. reactivar el campo (F) de fuerza; iv. repetir los pasos i) a iii) una cantidad de veces, sustancialmente comparable con la tasa de convergencia a su valor asintótico, de la varianza de los valores de nivel de gris medidos en dichos segundos sensores, que se asume como referencia (PIXEL_REF); v. clasificar un punto de equilibrio que es ocupado por partículas si, en la serie temporal considerada de mediciones, la desviación estándar de los valores de nivel de gris detectados en los primeros sensores, asociada con dicho punto de equilibrio (PEQ), resulta superior a un valor de umbral prefijo (THR).

Description

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DESCRIPCION

Metodo y aparato de caracterizacion y recuento de partlcuias, en particular de partlcuias biologicas.

Campo tecnico

La presente invencion se reiaciona con metodos para la caracterizacion y/o el recuento de partlcuias. La invencion encuentra principalmente su aplicacion en la implementacion de protocolos biologicos sobre celulas individuales.

Estado del arte

La solicitud de patente PCT/WO 00/69565 de G. Medoro describe un aparato y un metodo para la manipulation y la detection de partlculas a traves del uso de jaulas cerradas de potencial dielectroforetico. El metodo que se describe ensena como controlar la position de cada partlcula independientemente de todas las otras dentro de un espacio de dos dimensiones. La fuerza que se usa para atrapar las partlculas en suspension es de dielectroforesis negativa. El control individual sobre las operaciones de manipulacion se lleva a cabo a traves de la programacion de elementos de memoria y circuitos asociados a cada elemento de una serie de electrodos y sensores que se integran dentro del mismo sustrato. Sin embargo, el “ruido” espacial fijo ligado a la dispersion de las caracterlsticas de los sensores (que se conocen tecnicamente como “Ruido de Patron Fijo”) limita severamente la confiabilidad de los mismos sensores en las celulas de deteccion. La patente informa del uso de sensores opticos y/o de impedancia. Incluso al sustraer una imagen de referencia para la compensation de las variaciones en la ganancia de los sensores, el resultado no es completamente confiable debido a otros factores que no se compensan, tales como por ejemplo las variaciones espaciales de la iluminacion (para los sensores opticos) o de la conductividad del llquido (para los sensores de impedancia).

La patente US 6,294,063, de Becker et al., divulga un metodo y un aparato para la manipulacion de material biologico gaseoso llquido o solido a traves de una distribution de fuerzas programables. La patente menciona tambien el uso de sensores. Pero en este caso tambien, existe el problema del Ruido de Patron Fijo.

Otro metodo que se conoce para la manipulacion de partlculas llquidas (gotas) es la Electrohumectacion sobre Dielectrico (EWOD), que se describe T.B. Jones, Journal of Micromechanics and Microengineering, 15 (2005) 11841187. En este caso, un campo electrico ejercido por electrodos que se suministran a un sustrato permite la propulsion de una gota que se rodea mediante una fase gaseosa en una direction controlada por la secuencia de electrodos energizados. Se pueden hacer dispositivos con bases en este principio al incluir una tapa (la misma cubierta tambien con un dielectrico) como se enseno mediante la solicitud de la patente US 2004/0058450A1 de Pamula et al., o simplemente tambien un cable, llamado “cadena”, el cual establece el contacto electrico con las gotas encima del sustrato. J. Berthier et al., NSTI Nanotech 2005,
www.nsti.org, vol. 1, 2005.

Una fuerza adicional para la manipulacion de partlculas es la fuerza de friction viscosa que se genera a traves del flujo electrohidrodinamico (EHD) tales como los flujos electrotermicos (ETF) o la electroosmosis AC. En NG. Green, A. Ramos y H. Morgan, J. Phys. D: Appl. Phys. 33 (2000), se usan las FEH para las partlculas que se visualizan. Por ejemplo, PCT WO 2004/071668 A1 describe un aparato para la concentration de partlculas en algunos electrodos, al aprovechar los flujos electrohidrodinamicos mencionados.

En "Impedance Spectroscopy Flow Cytometry: On-Chip Label-Free Cell Differentiation", Cytometry Part A 65A: 124132 (2005), Cheung K, Gawad S, Renuad P, se usa un sensor diferencial de impedancia integrado en un microchip para diferenciacion de partlculas en un flujo.

En "Near-Field Optical Sensors for Particle Shape Measurements", IEEE Sensor Journal, vol. 3, No. 5, Oct. 2003, pp. 646-651, se describe un chip para la deteccion de la forma de la partlcula con base en una serie de sensores integrados (fotodiodos). Sin embargo, un llquido de flujo opera el movimiento de las partlculas, lo que requiere por ejemplo una bomba u otro mecanismo analogo y es imposible de este modo controlar exactamente la posicion de las partlculas que se van a analizar.

En la solicitud de patente italiana BO2005A000481 de Medoro et al., se informan algunos metodos para la manipulacion de partlculas con conjuntos de electrodo y algunos metodos y aparatos para su deteccion, los que, sin embargo, tienen limitaciones similares a la patente PCT/WO 00/69565 que ya se menciono, como la habilidad de diferenciar celulas diferentes.

Finalmente, en la solicitud de patente Internacional No. PCT/IT02/00524, se describe un metodo en donde se reconocen primeras entidades biologicas a traves de segundas entidades biologicas que tienen la capacidad de vincular la primera (o viceversa), donde las primeras entidades bilogicas se inmovilizan sobre una superficie que se define a traves de una matriz de primeros electrodos al menos activables y dirigibles de manera parcial y selectiva, que se disponen de cara a al menos un segundo electrodo y se encuentran en contacto con las segundas entidades biologicas que se desplazan a traves de jaulas de dielectroforesis; la interaction de adhesion, si la hubiera, se detecta entre al menos una parte de la primera y segunda entidades biologicas al excitar grupos fluoroforos enlazados a las segundas entidades biologicas con radiaciones a una primera frecuencia y al detectar la emision de fluorescencia a una segunda frecuencia a traves de sensores opticos integrados dentro de los electrodos por lo tanto

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se presenta nuevamente el problema de eliminar el ruido que se conecta a la deteccion optica (“Ruido de Patron Fijo”).

Resumen de la invencion

El objetivo de la presente invencion es el de proporcionar un metodo para la caracterizacion y/o el recuento de partlculas de cualquier tipo, el cual, esta libre de los inconvenientes que se describen y que permite, en particular, una manipulation precisa de las partlculas a obtener, lo cual es al mismo tiempo sustancialmente insensible al inconveniente del Ruido de Patron Fijo.

Es particularmente un objetivo de la presente invencion actuar sobre el control de la position de cada partlcula presente en la muestra, con el fin de desplazar dichas partlculas de una manera determinista o estadlstica, para detectar su presencia y/o caracterizar su tipo con sensores opticos integrados y/o medidores de impedancia.

Aqul y en lo sucesivo, se entienden por los terminos "partlculas" o "partlcula" entidades naturales o artificiales, micrometricas o nanometricas, tales como celulas, componentes subcelulares, virus, liposomas, niosomas, microbolas (microesferas) y nanobolas, o entidades mas pequenas, tales como, moleculas, protelnas, ADN, ARN, etc., as! como gotas de un fluido inmiscible en un medio de suspension, por ejemplo aceite en agua o agua en aceite, o tambien gotas de llquido en un gas (tal como agua en aire) o, todavla, burbujas de gas en un llquido (tal como aire en agua).

A veces, se usara el termino celula, pero si no se especifica de otro modo, se debe pensar como un ejemplo no limitante del uso para la deteccion y caracterizacion de partlculas en el sentido mas amplio descrito anteriormente.

Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para la deteccion de la presencia/caracterizacion y/o el recuento de partlculas, segun se ha especificado anteriormente, segun las reivindicaciones 1, 8 o 10.

En particular, se utilizan campos de fuerza no uniformes, variables en el tiempo y sensores opticos integrados. Los campos de fuerza pueden ser de dielectroforesis positiva o negativa, electroforesis o movimientos electrohidrodinamicos, caracterizados por una serie de puntos de equilibrio estable para las partlculas (solido, llquido o gaseoso); el mismo metodo se adapta a la manipulacion de gotas (partlculas llquidas) mediante el aprovechamiento de efectos conocidos por la comunidad cientlfica internacional con el nombre de Electrohumectacion sobre Dielectrico.

De este modo, las restricciones de la tecnica conocida son superadas por la presente invencion.

La implementation del metodo de acuerdo con la invencion es insensible a las variaciones espaciales de la iluminacion y al Ruido de Patron Fijo. Ademas, es posible caracterizar y clasificar con precision las partlculas manipuladas en el aparato sin necesidad de bombas o flujos de llquido generados de otro modo, lo que provoca un posicionamiento de las partlculas analizadas no bien determinado.

Finalmente, al contrario de las metodologlas que hacen uso de flujos para mover las partlculas, al usar un campo de fuerza controlado para mover las partlculas, con respecto al sensor, se obtiene una mayor cantidad de information, que consiste por ejemplo en la velocidad de movimiento de la partlcula en respuesta al campo de fuerza. Por lo tanto, se obtiene una fuente de informacion adicional sobre las caracterlsticas de la partlcula. Esta informacion se puede utilizar ventajosamente para diferenciar los diferentes tipos de partlculas.

Breve description de las figuras

La Fig. 1 muestra el principio de generation de los campos de fuerza a traves de conjuntos de electrodos

La Fig. 2 muestra las formas de onda que se relacionan con el metodo de deteccion y caracterizacion con base en un desplazamiento de jaula de las figuras 4 y 9.

La Fig. 3 muestra imagenes microscopicas de (a) una bola de poliestireno, (b) una celula K 562, (c) un globulo rojo.

La Fig. 4 muestra una secuencia de pasos para la deteccion/caracterizacion de partlculas con dimensiones inferiores al electrodo.

La Fig.5 muestra un diagrama de un curso temporal tlpico del valor de grises que se detectan en el paso de una celula o bolas con dimensiones del orden de 15-20 pm, y la indication de algunos posibles parametros discriminantes.

La Fig. 6 muestra la evolution temporal del valor de grises detectado en el paso de una celula K562 despues del desplazamiento de su jaula.

La figura 7 muestra un diagrama de un transcurso temporal tlpico del valor de grises detectado en el paso de una pequena celula o microbola, y la indicacion de algunos posibles parametros discriminantes.

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La Fig. 8 muestra la evolucion temporal del valor de gris detectado en el paso de una bola de poliestireno de 10 pm, 6 pm y 3 pm, respectivamente, tras el desplazamiento de su jaula.

La Fig. 9 muestra una secuencia de etapas utiles para la deteccion/caracterizacion de partlculas con dimensiones superiores a un electrodo, pero inferiores a dos electrodos.

La Fig. 10 muestra una secuencia elemental de etapas utiles para la deteccion simultanea de todas las partlculas a traves del movimiento de todas las jaulas.

La Fig. 11 muestra tres imagenes que se pueden adquirir a traves de la implementacion de la secuencia de pasos de la Fig. 10.

La Fig. 12 muestra una secuencia elemental de pasos que se muestran para la deteccion simultanea de todas las partlculas sin la necesidad de mover las jaulas.

La Fig. 13 muestra las formas de onda relacionadas con el metodo de deteccion y caracterizacion con base en la activacion y desactivacion de jaula de la Fig. 12.

La Fig. 14 muestra otra secuencia de pasos utiles para la deteccion/caracterizacion de partlculas en una jaula.

La Fig. 15 muestra la arquitectura de un aparato para la investigacion de alta resolucion de las caracterlsticas de las partlculas.

La Fig. 16 muestra la arquitectura de un aparato para la determinacion en tiempo real del desplazamiento de las partlculas tanto en la direccion vertical como horizontal.

La Fig. 17 muestra algunos modos diferentes de iluminacion y deteccion optica.

La Fig. 18 muestra la vista superior y la vista en seccion de un aparato especial para celulas fluorescentes, con un filtro de emision integrado en la superficie del chip.

La Fig. 19 muestra la vista superior y la vista en seccion de un aparato especial para celulas fluorescentes, con un filtro de emision integrado en las capas internas del chip.

La Fig. 20 muestra la vista superior y la vista en seccion de un aparato especial para celulas fluorescentes, con filtros de emision multiple integrados en la superficie del chip.

La Fig. 21 muestra una representacion geometrica del recuento de diferentes tipos de partlculas, particularmente de tres tipos diferentes.

Description detallada

El objetivo de la presente invention es el de proporcionar un metodo para llevar a cabo la manipulation y/o la deteccion de partlculas.

El metodo de la invencion se basa en el uso de un campo de fuerza no uniforme (F) a traves del cual se atraen partlculas individuales o grupos de partlculas (BEADS) hacia posiciones de equilibrio estable (CAGE) (figura 1). Tal campo puede ser, por ejemplo, un campo de dielectroforesis (DEP) negativo (NDEP) o positivo (PDEP), un campo de electroforesis (EF) o un campo de movimientos electrohidrodinamicos (EHD) o todavla electrohumectacion sobre dielectrico (EWD).

La deteccion se puede referir a uno de los siguientes aspectos, o combinaciones de los mismos:

1. el recuento de partlculas individuales o la cuantificacion;

2. la identification y/o caracterizacion;

3. La localization.

En este sentido, se aprovecha principalmente la medicion de la variation de impedancia y/o la medicion de la variation de intensidad luminosa que se transmite, difunde o emite en fluorescencia.

Generation de las fuerzas

Existen diferentes metodos para la generacion de fuerzas hacia partlculas en movimiento, de acuerdo con la tecnica conocida (figura 1), a traves de matrices de electrodos (EL), que se proporcionan sobre un sustrato. Tlpicamente, se utiliza una tapa (LID), que puede ser a su vez un electrodo, que delimita una microcamara dentro de la cual las partlculas (BEADS) se encuentran tlpicamente en una suspension llquida. En la Figura 1 se presentan algunos diagramas de las diferentes fuerzas. En el caso de la dielectroforesis (DEP), las tensiones aplicadas son en voltajes periodicos de fase (Vphip) que se muestran con el slmbolo de adicion (+) y las tensiones periodicas de contrafase

promover la deteccion de promover la deteccion de promover la deteccion de

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(Vphin) que se muestran con el slmbolo de sustraccion (-). Por voltajes de contrafase, se entienden voltajes fuera de fase de 180 grados. El campo genera una fuerza que actua sobre las partlculas, que se atraen hacia los puntos de equilibrio (CAGE). En caso de DEP negativo (NDEP), es posible generar jaulas de fuerza cerradas, de acuerdo con la tecnica conocida, si la tapa (LID) es un electrodo conductor; en este caso, se proporciona el punto de equilibrio (CAGE) en correspondencia con cada electrodo conectado con Vphin (-) si los electrodos adyacentes estan conectados con la fase opuesta Vphip (+) y si la tapa (LID) esta conectada con la fase Vphin (-). Este punto de equilibrio (CAGE) se separa normalmente en el llquido con respecto a los electrodos, por lo que las partlculas (BEAD) se encuentran, en estado estacionario, en levitacion. En el caso de DEP positivo (PDEP), el punto de equilibrio (CAGE) se encuentra normalmente en correspondencia con la superficie sobre la cual se proporcionan los electrodos, y las partlculas (BEADS) se encuentran, en estado estacionario, en contacto con el mismo. Para el PDEP, la presencia de otros electrodos en la cubierta no es necesaria, porque los puntos de equilibrio del PDEP corresponden a los maximos del campo electrico. Se puede utilizar una serie de electrodos para la electroforesis, con el fin de atraer partlculas cargadas hacia los electrodos con una polaridad opuesta. Para los movimientos electrohidrodinamicos (EHD), las configuraciones de los electrodos generan algunos flujos que impulsan a las partlculas hacia puntos de flujo mlnimo. Para el EWOD se utiliza generalmente una tapa (LID) que contiene un electrodo recubierto dielectricamente y la matriz de electrodos se energiza mediante senales de contrafase con respecto a la cubierta en los puntos en los que las partlculas (tlpicamente gotas llquidas en el aire) tienen que ser atraldas. Los electrodos sobre los que la partlcula no debe estar presente, por el contrario, se dejan flotantes. Para el EWOD, mediante la manipulation de gotas en el aire, por encima de la serie de electrodos, se puede usar una serie de alambres alternativamente a la cubierta.

A continuation, por razones de facilidad, el uso de jaula cerradas de dielectroforesis negativas como fuerza de ejecucion para la description de los metodos de la invention se considera meramente a modo de ejemplo no limitante para los propositos de la presente invencion (por esta razon, debe usarse una tapa que actua como electrodo). Para los expertos en la tecnica con capacidades ordinarias, es evidente como generalizar los metodos y el aparato descritos a continuacion para el uso de diferentes fuerzas de ejecucion y diferentes tipos de partlculas.

Sensores empleados

Siempre por simplicidad, en lo que sigue solo se hara referencia al caso de los sensores opticos, que permiten detectar la potencia optica incidente sobre un fotodiodo integrado con los electrodos. Para los expertos en la tecnica con capacidades ordinarias, es evidente como generalizar, en los diferentes casos, los metodos y aparatos descritos a continuacion tambien para el uso alternativo o combinado de sensores integrados de medidores de impedancia.

A continuacion, por simplicidad, el termino "nivel de gris" tambien se utilizara como sinonimo de "salida de la senal del sensor integrado". Esta senal, a su vez, podrla ser proporcional a la "potencia optica incidente" (en un sensor optico, tal como un fotodiodo) o a la impedancia medida (en el caso de sensores integrados del medidor de impedancia).

Metodos para el uso de sensores opticos

En el caso de los sensores opticos, generalmente se hara referencia al caso de la iluminacion de campo claro (o BF). En este caso, la iluminacion impacta el sensor. Tambien son posibles metodos de iluminacion de campo oscuro (o DF), o con base en fluorescencia y caen dentro del objeto de la presente invencion, pero por facilidad no se enumeraran para todos los metodos tratados a continuacion, sino que solo se discuten aqul.

En la figura 17, se muestran algunos metodos para el uso de los sensores opticos. La figura se refiere a la section de un aparato con sensores opticos (PIXEL) integrado en un sustrato (SUB). El dielectrico entre los sensores y las diferentes capas de metalizacion que proporcionan los electrodos (EL) puede consistir simplemente en una capa de oxido (OX) o tambien incluir una capa de filtro (DFL), por ejemplo que se realiza con la tecnologla de espejos dicroicos de pellcula delgada.

En el diagrama de detection de campo claro (Fig. 17-BF), la iluminacion (LIGHT) procede de la tapa (LID) y la potencia optica detectada por los sensores varla sustancialmente en funcion de la distorsion y absorcion causada por la partlcula (BEAD).

En el diagrama de deteccion de campo oscuro (Fig. 17-DF), la iluminacion (LIGHT) pasa a traves de la tapa (LID) con un angulo de incidencia tal que no llega directamente a los sensores (PIXEL) y la potencia optica detectada por los sensores varla sustancialmente en funcion de la radiation difusa (LEVE) de la partlcula (BEAD) alcanzada por la iluminacion de manera directa (LUZ), o, en caso tal, despues de una reflexion sobre los electrodos (RLIGHT).

En el diagrama de deteccion de fluorescencia de campo claro (Figura 17-BFF), la excitation (EXLIGHT) proviene de la tapa (LID) y la potencia optica detectada por los sensores varla sustancialmente en funcion de la fluorescencia emitida (EMLIGHT) por la partlcula (BEAD). En este caso, para que la senal de luz emitida (EMLIGHT) no sea superada por la potencia de excitacion (EXLIGHT), es aconsejable utilizar uno o mas de los siguientes trucos:

- usar una capa de filtro (DFL) para la longitud de onda de la radiacion emitida para la excitacion;

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- usar una frecuencia de excitacion para la cual el sensor optico (PIXEL) tiene un rendimiento cuantico bajo (es decir, es relativamente insensible a esa longitud de onda). Esto es posible, por ejemplo, utilizando juntas p-n a una profundidad relativamente alta, y una radiacion de excitacion con una longitud de onda preferiblemente en el UV, en particular mejor si es inferior a 380 nm.

En el diagrama de la deteccion de fluorescencia de campo oscuro (figura 17-DFF), la excitacion (EXLIGHT) proviene de la tapa (LID) con un angulo de incidencia tal que no llega directamente a los sensores (PIXEL) La potencia optica detectada por los sensores varla sustancialmente en funcion de la fluorescencia emitida por la partlcula (BEAD) impactada por la luz de forma directa (EXLIGHT), o, en caso, despues de una reflexion sobre los electrodos (RLIGHT). Con el fin de que la luz emitida (EMLIGHT) no sea degradada por la potencia de la luz difundida por la partlcula (SLIGHT), se desea, sin embargo usar uno o mas de los trucos mencionados anteriormente en el caso de fluorescencia de campo claro, con el objeto de mejorar la selectividad del sistema.

Metodo para la deteccion de jaulas completas mediante activacion y desactivacion de las jaulas

La figura 12 muestra una posible secuencia de etapas del metodo de acuerdo con la presente invencion, con el fin de detectar cuales jaulas estan llenas (al menos una partlcula esta encerrada) y cuales estan vaclas, sin la necesidad de desplazar las propias jaulas. Este metodo es particularmente adecuado cuando el patron aplicado a los electrodos es tan grueso como para no permitir el desplazamiento de las jaulas. Ademas, puede ser ventajoso que si el aparato no presenta circuitos para el desplazamiento de las jaulas.

El metodo se basa en la alternancia de fases de ejecucion, para el atrapamiento/liberacion de las partlculas (BEAD) en las jaulas (CAGE) y deteccion, durante el cual una o mas imagenes son adquiridas por los sensores integrados (PIXEL).

Las formas de onda se esquematizan en la Figura 13.

En la desactivacion de las jaulas, las partlculas comienzan a depositarse por asentamiento y/o desplazarse lateralmente (parte derecha de la figura 12 - t_sense) debido a los movimientos brownianos, partiendo de la posicion de equilibrio estable (PEQ) que asumen cuando estan enjaulados. Debido a estos desplazamientos, los niveles de grises detectados en jaulas completas varlan de una manera sustancialmente mas elevada con respecto a las variaciones de los niveles de grises asociados con el ruido termico del circuito de lectura y/o del sistema de luz que se producen en los sensores (pixel) en relacion con jaulas vaclas.

La clasificacion de jaula vacla o llena se lleva a cabo de la siguiente manera:

1. Se adquiere una serie de imagenes (deteccion) mediante la operacion alternada (activacion o desactivacion) de las jaulas (para tiempos en el orden de algunos segundos a algunas fracciones de segundo) y la deteccion de una o mas imagenes (para tiempos en la orden de una fraccion de segundo, por ejemplo 100 ms, a decenas de segundos).

2. Para una serie de imagenes NIMG, para cada sensor PIXEL_IJ asociado a un CAGE_IJ, se calcula la desviacion estandar no normalizada del nivel de gris (en este caso particular proporcional a la potencia optica incidente) en el sensor, definida como

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con

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NIMG).

(Valor medio del nivel de gris de PIXEL_IJ en la serie de imagenes

3. Se calculan la media de desviacion estandar no normalizada del nivel de gris en sensores de referenda vaclos (PIXEL_REF), y la desviacion estandar relativa de la desviacion estandar NREF ^ '“no normalizada

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4. Se define un umbral de clasificacion.

7HR=M

REF-N1MG

+ CX

&RW-S1MG + A

Los valores tlpicos son

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5. Las jaulas IJ se clasifican como llenas, con lo que por lo que

°ij-NIMG > THR

y las jaulas restantes se clasifican como vaclas,

Es interesante para u-nimg > THR tener en cuenta que dicho metodo es independiente del ruido de patron fijo (ruido espacial fijo ligado a la dispersion de las caracterlsticas de los fotodiodos), ya que considera la potencia de la senal con respecto al valor promedio por sensor, pero deja fuera el valor absoluto de dicho valor medio.

Normalmente es suficiente llevar a cabo una serie de mediciones (es decir, adquirir varias imagenes) NIMG = 50-100 para obtener una precision superior al 95%.

Se puede obtener una medicion dinamica del numero de imagenes NIMG que se tiene que adquirir, teniendo en cuenta el numero de imagenes necesarias para converger la desviacion estandar (normalizada) de los plxeles de referencia

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a su valor asintotico.

Este valor asintotico es constante si el ruido 1/f que se une a las variaciones de luz es despreciable (donde f es la frecuencia general en la que se considera el ruido).

Por lo tanto, en terminos mas generales, el metodo que se acaba de describir con una referencia especlfica al caso del uso de sensores opticos permite realizar la deteccion de la presencia de partlculas (BEADS), si existen, existentes en puntos de equilibrio estable (PEQ) de cualquier campo (F) de fuerza (por lo tanto no solo a un dielectroforetico) que actua sobre las partlculas (por ejemplo celulas) y que se genera por una matriz de electrodos (EL). Dicho metodo incluye las etapas de:

i. desactivacion del campo (F) de fuerza;

ii. medicion, en al menos un intervalo de tiempo posterior a la desactivacion y seleccionado en funcion de la dinamica de los movimientos de asentamiento y/o brownianos a los que se someten las partlculas con un campo desactivado, el nivel de gris que se genera por los primeros sensores (PIXEL_IJ) que se asocian con puntos de equilibrio estable (PEQ) y por segundos sensores (PIXEL_REF) que se asocian con regiones espaciales que ciertamente no se pueden ocupar por partlculas debido a la configuracion actual del campo (F) de fuerza ;

iii. reactivation del campo (F) de fuerza;

iv. repetition de los pasos i) a iii) una cantidad de veces, sustancialmente comparable con la tasa de convergencia a su valor asintotico, de la varianza de los valores de nivel de gris medidos en los segundos sensores, que se asume como referencia (PIXEL_REF);

v. clasificacion de un punto de equilibrio que se ocupa por partlculas si, en la serie temporal considerada de mediciones, la desviacion estandar de los valores de nivel de gris detectados en los primeros sensores, asociada con dicho punto de equilibrio (PEQ), resulta superior a un valor de umbral prefijo (THR).

Metodo para la deteccion de las jaulas completas por movimiento de jaulas y medicion de la diferencia del valor estatico de los niveles de grises.

La figura 10 muestra los pasos de una secuencia de operaciones de acuerdo con el presente metodo para detectar las jaulas completas a traves de un movimiento de las mismas y un analisis de los valores estaticos de los niveles de grises.

1. En un primer instante (t0) las jaulas (CAGE) colocan las partlculas (BEADS) sobre conjuntos respectivos de sensores opticos iniciales (PIXEL_STA). Se adquiere una imagen nueva con los niveles de gris correspondientes a esta configuracion.

2. Al tiempo siguiente (t1), una vez se agota el transiente que se une al movimiento de las jaulas, las partlculas se disponen en correspondencia con los sensores opticos finales (PIXEL_TGT). Se adquiere una imagen nueva con los niveles de gris correspondientes a esta configuracion.

3. Se determina la imagen de diferencia de los niveles de grises en relation con las imagenes de los puntos 1 y 2.

4. Se determina el valor absoluto de la imagen de diferencia.

5. Se determina el nivel de gris resultante para los pares de plxeles (PIXEL_STA, PIXEL_TGT) que se relacionan

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con las posiciones inicial y final de cada jaula.

6. Los pasos del 1 al 4 se repiten NDIFF veces y se acumulan los niveles de gris para cada jaula en relacion con la variacion absoluta determinada en el paso 5.

7. Analogamente a lo que se ha descrito anteriormente para la clasificacion con activacion/desactivacion de las jaulas, se determina un umbral de clasificacion THR, considerando, esta vez, el promedio y la desviacion estandar del valor absoluto de las diferencias correspondientes a los sensores ciertamente vaclos (plxeles) (tales como, por ejemplo, los plxeles entre hileras de jaula), para todas las imagenes NDIFF de diferencia que se adquieren.

En terminos mas generales, la detection de la presencia de partlculas (BEADS) existentes, en su caso, en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actua sobre las partlculas, generado por una serie de electrodos (EL), se lleva a cabo al

i) medir primero el nivel de gris generado por los primeros sensores (PIXEL_STA) asociados con puntos de equilibrio estables (PEQ), y por sensores de referencia (PlXEL_REF) asociados a zonas espaciales que ciertamente no se pueden ocupar por partlculas en esta primera configuration de corriente del campo (F) de fuerza;

ii) luego, modificar el campo (F) de fuerza para impartirle una segunda configuracion de corriente en la que los puntos de equilibrio estable se desplazan en correspondencia con segundos sensores (PIXEL_TGT), diferentes de los primeros sensores;

iii) luego, medir el nivel de gris generado por los segundos sensores (PIXEL_TGT) y sensores de referencia (PIXEL_REF) asociados con zonas espaciales que no se pueden ocupar por partlculas en la segunda configuracion de corriente del campo (F) de fuerza;

iv) determinar la diferencia (DIFF_IMG) entre los valores de nivel de gris detectados en los puntos precedentes;

v) repetir los pasos i) a iv);

vi) procesar valores de nivel de gris diferenciales para clasificar los puntos de equilibrio estable (PEQ) ocupados por partlculas y los no ocupados.

Dicho procesamiento incluye las etapas de vii) determinar el valor absoluto de las diferencias en los niveles de grises, y entonces

viii) clasificar como ocupados los puntos de equilibrio asociados con sensores para los cuales se detecta una variacion sustancialmente mayor que la variacion media del nivel de gris asociado con sensores de referencia que no se pueden ocupar por partlculas en la primera y segunda configuraciones del campo (F).

Este metodo, que se basa en el valor absoluto de las diferencias de imagen, es tambien inmune al ruido de patron fijo y, al igual que al metodo con activacion/desactivacion de las jaulas, es bastante insensible a la irregularidad en la iluminacion.

Con respecto al primer metodo, tiene la desventaja de requerir circuitos para el desplazamiento de las jaulas y una distancia entre las mismas que permite que un movimiento de las mismas determine de una manera unlvoca el desplazamiento de la celula enjaulada, si lo hay.

Una de las ventajas de este metodo es que se requieren tlpicamente unas pocas imagenes (y tiempos reducidos) para obtener una cierta calidad de clasificacion (bajas posibilidades de error) que, con el metodo de activacion/desactivacion de las jaulas, requiere mas imagenes y mas tiempo.

En la figura 11, se muestra el resultado que se puede obtener con una sola etapa (NDIFF = 1). En la figura 11 (a) se muestra la imagen detectable por el microscopio optico, en la figura 11 (b) se muestra el mapa de los valores de gris correspondientes (con una compensation del ruido de patron fijo) y por el contrario, en la figura 11 (c) se muestra la imagen normalizada del valor absoluto de la diferencia entre la imagen con valores de gris iniciales y despues de un desplazamiento hacia la derecha.

Metodo para la deteccion de jaulas completas a traves del movimiento de jaulas y medicion del valor dinamico de los niveles de grises.

La figura 2 muestra las formas de onda en las etapas de los metodos para la deteccion dinamica de la presencia de partlculas en las jaulas a traves del desplazamiento de las propias jaulas.

Al principio se realiza un desplazamiento de las jaulas sin esperar el asentamiento de las partlculas en su nueva position de equilibrio y se detectan las variaciones de senal de los sensores opticos por encima del cual se mueven las celulas que contienen las jaulas moviles.

5

10

15

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50

La Fig. 4 muestra una secuencia de pasos que implica el movimiento de la jaula en la posicion IJ y el desplazamiento del punto de equilibrio (PEQ) que determina el paso sobre la partlcula (BEAD) sobre el sensor optico (PIXEL_IJ).

Si las dimensiones de la partlcula (BEAD) son mayores que las del electrodo, el sensor medira una variacion pero no alcanzara el valor base relativo al pixel sin partlculas por encima de el. En este caso, se puede adoptar un diagrama ligeramente diferente, como en la figura 9. En este caso, al medir el valor de gris en el pixel (PIXEL_IJ) sobre el borde de una jaula con dimensiones mayores que un electrodo, se reproduce una situacion correspondiente a la de tener electrodos con dimensiones dobles que las dimensiones reales del electrodo.

Esta tecnica permite, en un sentido, explorar la celula al detectar los valores de gris que se asocian con la potencia incidente considerando la integral con respecto a las secciones horizontales de la misma (si el fotodiodo es tan grande como la celula y este se mueve verticalmente). Al cambiar el ciclo de trabajo de la ejecucion, se obtiene una velocidad de exploration diferente.

Estas operaciones permiten detectar la presencia de partlculas basadas en los ('■»< + C™)pjcos y valles de luminosidad que se producen cuando la jaula esta llena. Mediante el procesamiento de las senales de los sensores, un experto en la tecnica puede detectar facilmente una serie de parametros (por ejemplo, la amplitud del pico-pico del valor de gris) que permiten discriminar las jaulas completas de las jaulas vaclas.

Por lo tanto, de acuerdo con esta variante del metodo de la invention, la presencia de partlculas existentes (BEAD), si las hay, en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actua sobre las partlculas, generado por una serie de electrodos (EL) se detecta al llevar a cabo las siguientes etapas:

i. modificar el campo (F) de fuerza para mover los puntos de equilibrio estable (PEQ) al pasar por las partlculas (BEADS) en correspondencia con los respectivos sensores (PIXEL_IJ);

ii. medir el nivel de gris generado por los sensores (PIXEL IJ) que se asocia al paso de los diferentes puntos de equilibrio estable (PEQ) con una frecuencia sustancialmente mayor que el tiempo de asentamiento de las partlculas en la nueva posicion de equilibrio;

iii. clasificar la presencia o la ausencia de partlculas a traves de la medicion de parametros caracterlsticos de la evolution temporal de la medida del nivel de gris generado por los sensores, por ejemplo con bases en la potencia optica incidente en el caso de sensores opticos.

La medicion del nivel de gris generado por los sensores, es decir, la potencia optica que impacta sobre el mismo, puede llevarse a cabo obviamente alternando tambien las etapas de activation del campo que actua sobre la partlcula; y la desactivacion del mencionado campo, con el fin de medir, luego, la potencia optica incidente, es decir el nivel de gris que as! se obtiene; esto es ventajoso para evitar cualquier interferencia entre las tensiones de ejecucion con la lectura de los sensores, incluso si en principio no es necesario si hay una independencia sustancial de los sensores de la activacion de las tensiones de ejecucion.

Los parametros de la evolucion temporal de la medicion de la potencia optica incluyen preferiblemente la amplitud pico a pico del nivel de grises y preferiblemente la clasificacion tiene lugar a traves de la comparacion con un valor umbral determinado a partir de mediciones pico a pico de la potencia optica, es decir, el nivel de grises, en sensores de referencia que no se pueden ocupar por partlculas con la configuration del campo (F) de fuerza considerado, que se incrementa por un factor proporcional a la desviacion estandar de los valores pico a pico de los sensores de referencia.

De este modo, tambien se obtiene la compensation del ruido 1/f debido a la iluminacion ambiental existente en los sensores de referencia.

Metodo para el recuento de celulas con base en el numero de jaulas completas, con compensacion de error.

Mediante los metodos descritos anteriormente, se determina entonces el numero de jaulas completas. El objetivo de la presente invencion es tambien encontrar un metodo para el recuento de las celulas en las jaulas. A partir de esto, se conoce el volumen de la muestra considerada, tambien se obtiene la concentration de las celulas.

Como primera aproximacion, especialmente si el numero medio de celulas por jaula es sustancialmente inferior a aproximadamente 0,1, el numero de jaulas completas es aproximadamente similar al numero de celulas (en este caso hay una subvaluacion del numero de celulas de aproximadamente 5 %). Para un numero medio mas alto de celulas, de acuerdo con la presente invencion, se pueden compensar las estadlsticas de distribucion de las celulas por jaulas, para obtener un recuento que se aproxima con mayor precision al numero real de celulas en el chip.

Asumimos que se producen las siguientes suposiciones:

5

10

15

20

25

30

35

1. Las celulas se distribuyen uniformemente por unidad de volumen; esta hipotesis se verifica globalmente en los

casos en que la muestra se inyecta en la microcamara vacla. Si, por el contrario, la muestra se inyecta en la

microcamara previamente llena de regulador, la muestra podrla ser solo localmente uniforme, debido a las

variaciones de densidad de celulas unidas al perfil de flujo de la muestra.

2. Se pueden ignorar los enlaces que se conectan con el numero maximo de celulas por jaula.

Esta hipotesis se verifica cuando el volumen total de las celulas (volumen medio de una celula por numero medio de

celulas) es razonablemente menor que el volumen de una jaula (que se preve como el volumen de la cuenca de atraccion de cada jaula).

Bajo estas hipotesis, la distribucion estadlstica de las celulas se representa por la distribucion binomial. Definimos: NCAGES = numero de jaulas en el chip (o parte considerada) n = NCELLS = numero de celulas en el chip (o parte considerada)

En el que por "chip" se entiende la serie formada por la serie de electrodos EL, que se integra precisa y normalmente en un solo chip multicapa junto con los sensores PIXEL.

Entonces, la probabilidad de que una celula pertenezca a la cuenca de atraccion de cualquier jaula es:

p = 1/NCAGES

La probabilidad de tener celulas k por jaula resulta de la formula:

donde es

imagen6

el numero de combinaciones de n objetos tomados k a la vez (distribucion binomial). El valor medio de las celulas por jaula (Celulas Promedio Por Jaula - ACPC) es

ACPC =<P[k]>= pn =

NCELLS

NCAGES

Como en el chip tlpicamente hay muchas jaulas, la probabilidad de tener 1, 2, ... k celulas por jaula, multiplicado por el numero de jaulas, se aproxima bien al valor real de jaulas con 1, 2, ... k celulas. Teniendo en cuenta esto, y el numero total de jaulas vaclas y completas que se detectan, se puede estimar el valor medio de celulas por jaula (ACPC), calculando el valor que proporciona un numero esperado de jaulas llenas y vaclas correspondientes al valor detectado.

El valor esperado de las jaulas vaclas se calcula como

ECm - NCAGES-P[0] = NCAGES-pf = NCAGES

y al sustituir el valor de las jaulas vaclas realmente detectadas, se obtiene entonces el recuento de celulas, que se puede calcular con pasos simples tales como

imagen7

\og(NCAGES) - lo g(ECmttmn) log(AOGES) - \o%{NCAGES -1)

Se obtiene as! una mejor estimation del numero de celulas y la precision del recuento resulta tambien buena para valores ACPC superiores a uno, siempre que el numero de jaulas vaclas y llenas sea estadlsticamente significativo; de esta manera, de hecho, se mitiga el error ligado a la subevaluacion del numero de celulas que se asocia de otro

modo con el recuento de las jaulas completas. Obviamente, el numero que se detecta de jaulas vaclas (ECmedida) debe ser mayor de cero y resulta menor o igual al numero de jaulas NCAGES. La siguiente tabla muestra numericamente el caso de un ejemplo particular con 6400 jaulas, y diferentes concentraciones de celulas. Como puede observarse, el error de recuento se reduce drasticamente, especialmente para altas concentraciones medias 5 de celulas por jaula. En realidad, el valor que se reporta es simplemente el que se basa en la densidad de probabilidades, pero dado el gran numero de jaulas, la estimacion de probabilidad se aproxima bien a un posible valor medido.

TABLA 1

NCAG ES

5400 5400 6400

NCELLS

540 3200 6400 12800

ACPC

0,100 0,500 1,000 2,000

k

P[k] jaulas celulas P[k] jaulas celulas P[k] jaulas celulas P[k] jaulas celulas

0

90,48% 579 1 0 50,65% 3882 0 36,79% 2354 0 13,53% 866

0

1

9,05% 579 579 30,33% 1941 1941 36,79% 2355 2355 27,07% 1732 1732

2

0,45% 29 58 7,58% 485 970 18,40% 1177 2354 27,07% 1732 3464

3

0,02% 1 3 1,26% 81 243 6,13% 392 1176 18,05% 1155 3465

4

0,00% 0 0 0,16% 10 40 1,53% 98 392 9,02% 577 2308

5

0,00% 0 0 0,02% 1 5 0,31% 20 100 3,61% 231 1155

S

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,05% 3 18 1,20% 77 462

7

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,01% 0 0 0,34% 22 154

8

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,09% 5 40

9

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,02% 1

9

10

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0

11

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0

12

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0

13

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0

14

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0

15

0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0 0,00% 0 0

Recuento total

509 540 2518 3199 4045 6395 5532 12789

Error

-4,84% 0,00% -21,31% -0,03% -36,80% -0,08% -56,78% -0,09%

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En otras palabras, de acuerdo con este metodo, a partir del recuento de jaulas llenas y vaclas, que se realiza de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos hasta ahora, se puede derivar el recuento del numero total de partlculas (por ejemplo celulas) actualmente existentes en una muestra inyectada en una camara definida por la serie de electrodos El y la tapa (LID), si la hay; el paso de recuento de las partlculas individuales, cuya presencia general se ha detectado previamente, se lleva a cabo de acuerdo con este aspecto de la invencion de una manera estimada sobre bases estadlsticas, como sigue:

a) el numero (ECmedida) de puntos de equilibrio estable (PEQ) existentes en el campo (F) generado por la serie de electrodos (EL) - puntos de equilibrio estable, que tambien se muestran aqul como - jaulas- que no contienen ninguna partlcula (BEAD) se mide mediante los sensores.

b) el recuento (NCELLS) de las partlculas (BEAD) se determina como la relacion de la diferencia entre el logaritmo del numero (NCAGES) de puntos de equilibrio estable (PEQ) y el logaritmo del numero medido (ECmedida) de los puntos de equilibrio estable (PEQ) que no contiene ninguna partlcula y la diferencia entre el logaritmo del numero (NCAGES) de puntos de equilibrio estable (PEQ) y el logaritmo del numero (NCAGES-1) de los puntos de equilibrio estable) menos uno.

Metodo de caracterizacion de las celulas en las jaulas mediante el movimiento de las jaulas y medicion del valor dinamico de los niveles de grises.

Como se muestra en la figura 3, dado que una bola (por ejemplo, la figura 3 (a)), una celula de un tipo (por ejemplo, un K562, como en la figura 3 (b)), o una celula de otro tipo (ej., un globulo rojo como en la figura 3 (c)), tienen diferentes dimensiones, forma, perfil de absorbancia e Indice de refraccion, al pasar la jaula en un sensor es posible detectar no solo si esta lleno sino tambien, de acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion, para caracterizar el tipo de la partlcula existente, si la hay.

Una celula (y ciertos tipos de microbolas) muestran una distorsion de luz (una especie de efecto de lente) que provoca una variacion del nivel de gris con picos negativos (bordes oscuros en la celula) y picos positivos (centro mas brillante donde la celula concentra la luz) del nivel de grises.

Los parametros que se ligan a la evolucion dinamica del nivel de grises, tales como, mediante un ejemplo significativo, pero no limitante, que se informa en la figura 5, la medida de la amplitud de los picos negativos (Gnp) y positivos (Gpp) del gris, as! como, por ejemplo, el tiempo de retraso (td) entre el movimiento de la jaula y la deteccion de la primera variacion de gris, o tambien la longitud temporal de las variaciones que se pueden usar para obtener informacion adicional y clasificar el tipo de celula.

Formulas:

La velocidad de desplazamiento es, como una primera aproximacion, proporcional a la movilidad dielectroforetica, y resulta v a k R2. Por tanto, la longitud de la variacion de los niveles de grises, como primera aproximacion, resulta, a saber, inversamente proporcional al radio de la partlcula (disminuye cuando R aumenta). El tiempo de retraso td 2R 1

- —- oc —,

entre " kM1 R la ejecucion y el inicio de la variacion del nivel de gris resulta como una primera aproximacion (en el caso de la figura 4, con una celula en un solo electrodo) es igual a

(Tambien disminuye cuando R aumenta).

La figura 6 muestra el curso real que se mide para una celula K562.

La Fig. 7 muestra el curso tlpico que se espera para bolas no transparentes, o

" kR7

celulas pequenas para las cuales predomina el efecto de la absorbancia en comparacion con el efecto "lente" antes mencionado.

La figura 8 muestra la evolucion temporal del valor de gris que se detecta en el paso de bolas de poliestireno de 10 pm, 6 pm y 3 pm despues del desplazamiento de su jaula.

Al extraer parametros de discrimination oportunos, es posible, de manera aparente para los expertos en la tecnica, definir un criterio de clasificacion, similarmente a lo que se ha mencionado anteriormente para la clasificacion de jaulas vaclas y llenas.

En particular, el metodo de identification puede incluir la extraction de las caracterlsticas discriminantes de las partlculas, y el uso de algoritmos que se basan en redes neuronales, primeros acercamientos ks, algoritmos de umbrales y/o Analisis de Componentes Principales, o una combination de los mismos.

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La figura 14 muestra una tecnica alternativa que se basa en el mismo principio, a traves de la cual es posible escanear la celula en su seccion horizontal con una mayor resolucion, al desplazarla lateralmente por encima del sensor. De hecho, la "rebanada" de la celula considerada tiene dimensiones mas bajas. A partir de la derivada del valor de gris a medida que pasa la celula, se puede calcular el valor puntual del valor de gris a lo largo de una seccion horizontal de la celula, con una resolucion horizontal igual al numero de puntos durante la adquisicion y una resolucion vertical igual a la separacion (distancia) entre los electrodos.

Al basarse en lo que se ha descrito anteriormente, resulta por lo tanto evidente que la invencion tambien permite caracterizar partlculas (BEADS) (es decir, establecer su naturaleza flsica) presentes en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actuan sobre las partlculas y que se generan por una serie de electrodos (EL), a traves de la realizacion de las siguientes etapas:

a. modificar el campo (F) de fuerza para desplazar dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) al pasar dichas partlculas (BEADS) en correspondencia con los respectivos sensores (PIXEL_IJ);

b. medir el nivel de gris detectable por los sensores (PIXEL_IJ) que se asocia al transito de diferentes puntos de equilibrio estable (PEQ) que contienen partlculas, con una frecuencia sustancialmente mayor que el tiempo de asentamiento de las partlculas en la nueva posicion de equilibrio;

c. procesar parametros caracterlsticos de la evolucion temporal de la medicion del nivel de gris para estimar la naturaleza de las partlculas.

El todo siempre sin verse afectado por el "ruido" de fondo detectable por los sensores, es decir, el ruido de patron fijo.

En el ejemplo descrito, donde los sensores que se usan son sensores opticos y la medicion del nivel de grises es una medicion de la potencia optica que impacta sobre los sensores, dicha medicion se lleva a cabo preferiblemente alternando las etapas de:

i. activar el campo que actua sobre la partlcula;

ii. desactivar el campo y medir la potencia optica incidente;

o al usar el mismo sistema preferido descrito anteriormente para la deteccion dinamica de la presencia de partlculas en las jaulas. Los parametros de la evolucion temporal de la medicion de la potencia optica incluyen, con base en lo que se ha descrito anteriormente, al menos uno de los parametros seleccionados del grupo que consiste en:

i. el retraso (td) entre la variacion del campo (F) de fuerza y la primera variation de la potencia optica

ii. la longitud (tw) de la variacion transitoria de la potencia optica;

iii. la amplitud del pico positivo (Gpp) del valor de potencia optica;

iv. la amplitud del pico negativo (Gnp) del valor de potencia optica.

Metodo para el recuento de diferentes especies de celulas en una muestra heterogenea

Mediante la combination de las metodologlas para el recuento de celulas para una poblacion unica con la caracterizacion de las partlculas en las jaulas individuales, es posible, de acuerdo con la presente invencion, determinar la composition de una muestra con tipos heterogeneos de partlculas.

Generalmente, no es facil diferenciar la composicion de partlculas en jaula que contienen mas de una celula. Sin embargo, al procesar la dinamica del nivel de grises, que se registra como se ha descrito anteriormente para la caracterizacion del contenido de una jaula, es relativamente sencillo determinar si la jaula contiene una sola partlcula o una multiplicidad de partlculas (MC).

Puesto que se puede suponer que la distribution de diferentes tipos de partlculas es independiente (ortogonal) entre ellas, al combinar el numero de partlculas de cada tipo que se obtiene en las jaulas con una sola partlcula, y la information que se relaciona con el numero de jaulas vaclas (CE) y el numero total de jaulas, por lo tanto es posible determinar la estimation del numero de partlculas de las diferentes poblaciones, a traves de una ruta numerica. El problema es la minimization de una funcion con diferentes NPT (donde NPT = numero de tipos de partlculas). En la Fig. 21 se presenta una representation del problema en el caso de NPT = 3.

Para cada tipo de partlcula t = 1, ... NPT, una vez que se ha supuesto la presencia de un numero de partlculas (NCELLSt), el volumen del hipercubo del espacio a dimensiones NPT que representa el numero de partlculas del tipo t que existen en una sola jaula (al ignorar los otros tipos de partlculas), se mantiene, de hecho, fijo (Pt_1) Con

referencia a la Fig. 21 (a), para las partlculas de un primer tipo, se obtienen P1_1 partlculas en una sola jaula ,

partlculas P1_M en jaulas multiples y P1_0 jaulas sin partlculas del tipo P1 (las medidas de los volumenes mostrados). Se debe tener en cuenta el numero de partlculas tipo t que se detectan en una sola jaula, sin embargo,

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una o mas partlcuias de otros tipos pueden presentarse en las mismas jaulas. Por lo tanto, como se muestra en la figura 21 (d), el valor detectado de partlculas individuales (Pt_1_MEAS) de cada tipo t corresponde al volumen (Pt_1) del hipercubo de partlculas de tipo t menos el volumen de los hipercubos de intersection entre Pt_1 y Pq_h, con q <> t y h> 0 de hipercubos que contienen al menos una partlcula de un tipo diferente. Se conoce ademas el volumen del hipercubo de las jaulas vaclas (EC_MEAS).

El multiplo t de valores NCELLSt, t = 1, ..., NTP se calcula por via numerica, por lo que el valor esperado (estadlsticamente) corresponde mejor al numero (Pt_1) de jaulas que realmente se mide con una sola partlcula de cada tipo t y de jaulas vaclas (EC_MEAS).

Al basarse en lo que se acaba de describir, resulta por lo tanto evidente que la invention tambien permite contar el numero de partlculas (BEADS) de una multiplicidad de tipos (NTP) que existen en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo de fuerza F) que actuan sobre las partlculas y que se generan por una serie de electrodos (EL), a traves de la ejecucion de las siguientes etapas:

a. modificar el campo (F) de fuerza para desplazar dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) al pasar dichas partlculas (BEADS) en correspondencia con los respectivos sensores (PIXEL_IJ);

b. medir el nivel de gris detectable por los sensores (PIXEL_IJ) que se asocia con el paso de los diferentes puntos de equilibrio estable (PEQ) que contienen partlculas, con una frecuencia sustancialmente superior al tiempo de asentamiento de las partlculas en la nueva position de equilibrio;

c. procesar parametros caracterlsticos de la evolution temporal de la medida de nivel de gris que se asocia a cada punto de equilibrio estable (PEQ) para detectar si la jaula asociada esta vacla, si contiene una partlcula de un tipo o si contiene mas partlculas;

d. determinar de manera numerica la combination de recuentos de partlculas de cada tipo (NCELLSt) que mejor se aproxima al valor medido de jaulas con una sola partlcula de cada tipo (Pt_1_MEAS) y jaulas vaclas (EC_MEAS).

Aparato para la caracterizacion de alta resolution de las celulas en las jaulas a traves del movimiento de las jaulas y medicion del valor dinamico del nivel de grises.

Con el fin de aumentar la resolucion de los metodos de detection dinamica descritos hasta ahora, de acuerdo con la presente invencion es posible combinar (Figura 15) una serie de electrodos (EL) asociados con fotodiodos (PIXEL_V1, ... PIXEL_VN) caracterizados por una mayor resolucion espacial, para analizar secuencialmente diferentes secciones de la partlcula, moviendola secuencialmente sobre diferentes electrodos.

El llmite de resolucion esta as! determinado por la geometrla minima de la resolucion fotolitografica y no tiene la necesidad de colocar diferentes transistores para el direccionamiento de los electrodos (pixeles), lo que incremental el area requerida. Por ejemplo, algunas aberturas (SLITS) pueden llevarse a cabo sobre una metalizacion dispuesta sobre el fotodiodo, de manera que sea sensible solo en correspondencia con la misma abertura.

De esta manera, se puede implementar una etapa adicional en todos los metodos descritos hasta ahora, en los que dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) se desplazan de tal manera que dichas partlculas (BEADS) se pasen en correspondencia con una pluralidad de dichos respectivos sensores (PIXEL_IJ ); y en el que los sensores (PIXEL_IJ) son sensores opticos y estan blindados (a traves de la capa de metalizacion anteriormente mencionada equipada con aberturas SLITS de una amplitud prefijada y relativamente pequena), para detectar con los sensores la potencia optica incidente sobre una portion de espacio sustancialmente menores que las dimensiones de las partlculas y los propios sensores.

Metodo para la manipulation de celulas con un control automatico de la velocidad de desplazamiento de las jaulas.

Un metodo de manipulacion con un control automatico de la velocidad de desplazamiento de las jaulas se puede basar entonces en el uso de la deteccion de paso de las celulas, como se ha descrito anteriormente. Para las jaulas con celulas que se mueven sobre el chip (junto con la serie de electrodos) se puede monitorizar la evolucion de los niveles de grises y se puede detectar el final del asentamiento transiente el nuevo punto de equilibrio para iniciar inmediatamente el siguiente paso a lo largo de la trayectoria. Ademas de la optimization de los tiempos, al adaptarlos dinamicamente a la velocidad de las diferentes partlculas en los diferentes momentos, aproximacion que tambien permite verificar que cada celula no queda bloqueada.

Si a cada electrodo se le asocia un unico sensor optico, por ejemplo en la separation vertical (distancia) entre dos electrodos, como en la figura 4, metodo que se lleva a cabo utilizando jaulas con una anchura de 1 x 2 electrodos (1 en posicion horizontal x 2 en posicion vertical). En el desplazamiento horizontal, de hecho, la partlcula se situa a toda velocidad sobre el sensor entre los dos electrodos, y se puede seguir su movimiento a traves de la supervision del sensor en correspondencia con el punto inicial y/o final de equilibrio. Esto introduce un enlace en la forma de la jaula, que sin embargo se puede superar usando un aparato como se describe a continuation.

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Aparato para la manipulacion de celulas con control automatico de la velocidad de desplazamiento de las jaulas, sin ilmites en las dimensiones de las mismas.

En la figura 16, se muestra el diagrama de un aparato con sensores (plxeles) para la determinacion del movimiento tanto en direccion horizontal (PIXEL_H) como en direccion vertical (PIXEL_V). Dicho aparato es ventajoso para implementar una manipulacion de partlculas con un control de cadena estrecha, que se realiza de manera integrada con la de la velocidad de desplazamiento de las jaulas. Con este aparato se puede realizar el desplazamiento horizontal tambien con jaulas 1 x 1, ya que la celula/partlcula pasa en cualquier caso al sensor (PIXEL_H) que se coloca entre dos electrodos a lo largo del eje horizontal.

Con el metodo y aparato adicional que se describen ahora, se implementa una etapa aplicable a todos los metodos de detection y caracterizacion de partlculas mencionados previamente, que consiste en el control del curso de variation en el nivel de grises detectable por los sensores (PIXEL_IJ) que se asocian con el paso de los puntos de equilibrio estable (PEQ) que contienen partlculas, para determinar el final del asentamiento transiente de las partlculas en la nueva position de equilibrio y retroceder desde esta medida a la velocidad de desplazamiento de las partlculas (BEADS) hacia nuevos puntos de equilibrio estable (PEQ). Al final de dicho asentamiento transiente, se puede generar automaticamente una variacion en el campo (F) de fuerza que se produce por los propios electrodos (por ejemplo, a traves de un software apropiado que se implementa en una unidad de control CTRL, ademas de un tipo conocido, de la serie de electrodos EL (figura 15), con el fin de provocar un nuevo desplazamiento de los puntos de equilibrio estable (PEQ) a lo largo de la trayectoria prefijada que se desea (que se muestra en la figura 15 mediante la flecha).

Aparatos con filtros dicroicos que se integran para la deteccion y/o caracterizacion de las celulas en las jaulas por fluorescencia

Para la deteccion de fluorescencia y/o la caracterizacion de celulas, se describen algunas implementaciones preferidas de acuerdo con la presente invention. Estas implementaciones integran un elemento filtrante que permite el paso de la emision de fluorescencia pero mitiga la excitation. Estos elementos filtrantes se pueden integrar con pasos de proceso aguas abajo de la ejecucion del chip, tales como depositos de pellcula delgada de materiales con Indices de refraction oportunos para realizar filtros dicroicos. El efecto de filtro permite mitigar la parte de potencia optica en la banda de excitacion que se detecta mediante el sensor (PIXEL), reduciendo as! los requisitos vinculados al rango dinamico del propio sensor.

En la Figura 18, se muestra el diagrama de un aparato que se adecua particularmente para la deteccion y/o caracterizacion de celulas de fluorescencia. En el chip se deposita un filtro dicroico (DFL) que permite el paso de las frecuencias correspondientes a la emision, con tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. Despues de la deposition, opcionalmente, se desea mejorar el contacto electrico entre un electrodo (EL) y un llquido, se abren algunas ventanas sobre la capa dicroica, en correspondencia con los propios electrodos. De esta manera, es posible, por ejemplo, usar soluciones incluso de alta conductividad, en caso de electroforesis, sin caldas de tension que se conectan con la presencia de la capa dielectrica que se compone del filtro dicroico. Este esquema de ejecucion es compatible con el uso de una fabrication de placas CMOS estandar y solo implica un post-procesado de las placas. Alternativamente, el filtro dicroico se puede realizar por debajo de los electrodos, tal como se muestra en la figura 19. Esto puede ser util si se puede modificar el proceso CMOS. Ademas, sin la modification del proceso CMOS, este diagrama se puede llevar a cabo al realizar un post-procesado, aunque mas complejo, se representa por la aplicacion del filtro, la apertura de contactos en el metal superior CMOS y la metalizacion adicional para realizar los electrodos (EL). Puede ser ventajoso llevar a cabo, independientemente del hecho de estar por encima o por debajo de los electrodos (EL), una multiplicidad espaciada de filtros dicroicos con una banda de paso diferente (DFL1, DFLN), como se muestra en la figura 20. Esto puede ser util para dividir y detectar por separado la fluorescencia de celulas/partlculas a diferentes frecuencias de emision.

Evidentemente, al comprobar la posicion de las celulas, es posible analizarlas en secuencia, en diferentes sensores, para la presencia por ejemplo de fluoroforos diferentes. Tambien se describe un aparato para la deteccion y/o caracterizacion de partlculas como se ha descrito anteriormente, pero que ademas incluye medios de blindaje de los sensores y aberturas, en un numero de al menos uno para cada sensor, que se obtiene a traves de los medios de blindaje y que tiene dimensiones prefijas mas pequenas que las de las partlculas a detectar/caracterizar.

El aparato puede incluir ademas al menos un filtro dicroico con una banda de paso prefijada que se dispone de tal manera que proteja al menos parcialmente los sensores (PIXEL), si estos son sensores opticos, e incluye preferiblemente una pluralidad de filtros dicroicos, al tener cada uno una banda de paso diferente entre las otras, que se disponen superpuestas entre ellas y para proteger al menos parcialmente los sensores (PIXEL). Si al menos un filtro dicroico se dispone para cubrir los electrodos (EL), se equipa con aberturas de interruption que se colocan en correspondencia con al menos parte de cada electrodo.

Filtration de la excitacion

El aparato puede aprovechar, o no, el hecho de que (externamente) la fuente de excitacion se filtra y optimiza para cada fluoroforo que se va a analizar. Esto se puede llevar a cabo facilmente con filtros no integrados en el

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dispositivo. Ademas, o alternativamente, la tapa del chip puede integrar la parte de la filtracion de excitacion correspondiente con filtros dicroicos subyacentes, que varian o no, de pixel a pixel del chip.

Si el filtro de excitacion se integra en la tapa, es necesario llevar a cabo zonas mas amplias con un filtro dicroico homogeneo, para evitar la interferencia entre las excitaciones de los diferentes pixeles. En este caso, la celula sometida a prueba debe cubrir una mayor distancia para poderse analizar mediante diferentes fluoroforos. El aparato que se describe hasta ahora puede por lo tanto incluir al menos un filtro dicroico con una banda de paso prefijada que se dispone en correspondencia con la cubierta (LID) que define, junto con la serie de electrodos (EL), una camara o microcamara que se adecua para recibir y que contiene una muestra de fluido que contiene las particulas a detectar/caracterizar.

Metodo de compensacion del ruido de iluminacion

En todos los metodos que se mencionan anteriormente, cuando se usan sensores opticos, la senal para la detection o caracterizacion de las particulas depende de la potencia de iluminacion. Por lo tanto, las variaciones de este tipo pueden causar algunas variaciones del nivel de la potencia optica que se detecta, las cuales no se unen a la senal (presencia y/o position de la particula). Aunque normalmente esto no es un problema, se pueden mejorar los desempenos de los metodos (mayor precision, mayor velocidad), al compensar dichas variaciones al usar un valor normalizado a la deteccion media de los pixeles de referencia (pixeles que ciertamente corresponden con jaulas vacias, para las cuales, la potencia optica incidente solo se ve afectada por la potencia de iluminacion).

Esto es principalmente cierto para el ruido de iluminacion de baja frecuencia que, debido a la densidad espectral de la potencia de ruido (proporcional a 1/f), hace que su impacto sea mas influente.

Metodo de compensacion de ruido para sensores de impedancia.

En todos los metodos que se mencionan anteriormente, cuando se usan sensores del medidor de impedancia, la senal para la deteccion y caracterizacion de las particulas depende de la conductividad y la permisividad del medio de suspension de las particulas, que a su vez depende, por ejemplo, de la temperatura, concentration de sales u otras moleculas, etc. Por lo tanto, las variaciones de estos pueden causar algunas variaciones del nivel de la impedancia detectada que no se unen a la senal (presencia y/o posicion de la particula). Aunque normalmente esto no es un problema, se pueden mejorar los desempenos de los metodos (mayor precision, mayor velocidad), al compensar dichas variaciones usando un valor normalizado a la deteccion media de los pixeles de referencia (pixeles que ciertamente corresponden con jaulas vacias, para las cuales, la impedancia solo se ve afectada por la conductividad y la permisividad del medio de suspension).

En todos los metodos de deteccion y caracterizacion que se describen hasta ahora, se puede introducir una etapa adicional que consiste en una compensacion de los niveles de grises detectados por dichos sensores (PIXEL_IJ), al usar un valor normalizado para la deteccion media de sensores de referencia (PIXEL_REF) que se asocian con regiones espaciales que ciertamente no se pueden ocupar por particulas en la configuration actual del campo (F) de fuerza considerado.

Nota sobre las aplicaciones

Los metodos y el aparato que se describen hasta ahora son de uso general y encuentran multiples aplicaciones. A modo de ejemplo, pero no de limitation de la invention, se mencionan algunas de las aplicaciones mas importantes:

- Analisis de muestras de sangre; al introducir una muestra en el chip (que utiliza, por ejemplo, jaulas de dielectroforesis cerradas), se pueden contar los globulos rojos contando como primera aproximacion todas las jaulas ocupadas (de hecho las otras celulas que existen posiblemente tienen una concentracion tan baja que resulta insignificante para la precision que tipicamente se requiere).

- Hemograma: caracterizacion del numero y tipo de celulas en la sangre; en este caso, se emplea el metodo que se describe anteriormente para llevar a cabo una caracterizacion precisa de cada celula existente, clasificandola como eritrocito, plaqueta, linfocito, etcetera.

- Recuento de las bacterias que existen en una muestra; al inyectar en el chip (con jaulas cerradas de DEP) un volumen conocido de muestra, se detectan todas las bacterias existentes y, si es necesario, tambien el tipo, si se distinguen a traves de su firma caracteristica que se detecta con los sensores opticos.

- Separacion/recuento de las celulas marcadas con fluorescencia a partir de una poblacion mixta. Este tipo de problema esta difundido ampliamente tanto en la investigation como en el diagnostico.

Por ejemplo, se pueden detectar bacterias en muestras lacteas, tales como leche, yogur, preparaciones para helados, etc.

Como otro ejemplo, se pueden detectar bacterias para una fermentation del mosto de uva (por ejemplo para aplicaciones enologicas).

Como otro ejemplo, se pueden detectar bacterias que existen en un volumen de agua potable.

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   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para la deteccion de la presencia de partlculas (BEADS) posiblemente presentes en puntos de equilibrio estable (pEq) de un campo (F) de fuerza que actua sobre dichas partlculas, que se genera mediante una serie de electrodos (EL) que comprende las etapas de:

   1. desactivar el campo (F) de fuerza;

   ii. medir, en al menos un intervalo de tiempo posterior a la desactivacion y seleccionado en funcion de la dinamica de los movimientos de asentamiento y/o brownianos a los que se someten las partlculas con un campo desactivado, el nivel de gris que se genera por los primeros sensores (PIXEL_IJ) que se asocian con puntos de equilibrio estable (PEQ) y por segundos sensores (PlXEL_REF) que se asocian con regiones espaciales que ciertamente no pueden ser ocupadas por partlculas debido a la configuracion actual de dicho campo (F) de fuerza ;

   iii. reactivar el campo (F) de fuerza;

   iv. repetir los pasos i) a iii) una cantidad de veces, sustancialmente comparable con la tasa de convergencia a su valor asintotico, de la varianza de los valores de nivel de gris medidos en dichos segundos sensores, que se asume como referencia (PIXEL_REF);

   v. clasificar un punto de equilibrio que es ocupado por partlculas si, en la serie temporal considerada de mediciones, la desviacion estandar de los valores de nivel de gris detectados en los primeros sensores, asociada con dicho punto de equilibrio (PEQ), resulta superior a un valor de umbral prefijo (THR).
2. 2. Metodo para la deteccion de la presencia de partlculas (BEADS) que existen posiblemente en puntos de equilibrio estables (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actua sobre dichas partlculas, generadas mediante una serie de electrodos (EL), que comprende los pasos de:

   i) medir primero el nivel de gris generado por los primeros sensores (PIXEL_STA) asociados a dichos puntos de equilibrio estable (PEQ), y por sensores de referencia (PIXEL_REF) que se asocian a regiones espaciales que ciertamente no se pueden ocupar por partlculas en esta primera configuracion de corriente del campo (F) de fuerza mencionado;

   ii) modificar dicho campo (F) de fuerza para impartirle una segunda configuracion de corriente en la que dichos puntos de equilibrio estable se desplazan en correspondencia con segundos sensores (PIXEL_TGT), diferentes de los primeros sensores;

   iii) medir el nivel de gris generado por los segundos sensores (PIXEL_TGT) y sensores de referencia (PIXEL_REF) que se asocian con zonas espaciales que ciertamente no se pueden ocupar por partlculas en dicha segunda configuracion de corriente de dicho campo (F) de fuerza;

   iv) determinar la diferencia (DIFF_IMG) entre los valores de nivel de gris detectados en los puntos precedentes i) y iii);

   v) repetir los pasos i) a iv);

   vi) procesar valores de nivel de gris diferenciales para clasificar los puntos de equilibrio estable (PEQ) ocupados por partlculas y los no ocupados.
3. 3. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado porque dicho tratamiento incluye las etapas de determinar el valor absoluto de las diferencias de niveles de grises y clasificar como ocupados los puntos de equilibrio que se asocian a sensores para los que se detecta una variacion sustancialmente superior a la variacion media del nivel de gris que se asocia con dichos sensores de referencia que no se pueden ocupar por partlculas en dichas primera y segunda configuraciones del campo (F).
4. 4. Metodo para la deteccion de la presencia de partlculas (BEADS) que posiblemente existen en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actua sobre dichas partlculas, que se genera por una serie de electrodos (EL), que comprende las etapas de:

   i. modificar el campo (F) de fuerza para desplazar dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) para que dichas partlculas (BEADS) pasen en correspondencia con los respectivos sensores (PIXEL_IJ);

   ii. medir el nivel de gris generado por los sensores (PIXEL_IJ) asociado con el paso de dichos diferentes puntos de equilibrio estable (PEQ), con una frecuencia sustancialmente mayor que el tiempo de asentamiento de dichas partlculas en la nueva posicion de equilibrio;

   iii. clasificar la presencia o la ausencia de partlculas a traves de la medicion de al menos un parametro caracterlstico de la evolucion temporal del nivel de gris que se mide mediante dichos sensores (PIXEL_IJ).

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5. 5. Metodo de acuerdo con la reivindicacion anterior, caracterizado porque dicho parametro caracterlstico de la evolucion temporal de la medicion de los niveles de gris sobre dichos sensores (PIXEL_IJ) comprende la amplitud pico a pico.
6. 6. Metodo de acuerdo con la reivindicacion precedente, caracterizado porque la clasificacion tiene lugar a traves de la comparacion con un valor umbral determinado a partir de las mediciones de pico a pico de los niveles de grises en los sensores de referencia que se no pueden ocupar por partlculas con la configuracion del campo (F) de fuerza considerado, que se incrementa por un factor proporcional a la desviacion estandar de dichos valores de pico a pico de dichos sensores de referencia.
7. 7. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que incluye ademas una etapa de recuento del numero total de partlculas de las que se ha detectado la presencia, caracterizado porque dicha etapa de recuento tiene lugar de una manera estimada sobre bases estadlsticas, de la manera siguiente:

   i. el numero (ECmedido) de puntos de equilibrio estable (PEQ) existentes en el campo (F) generado por la serie de electrodos (EL) que no contienen ninguna partlcula (BEAD) se mide mediante los sensores.

   ii. el recuento (NCELLS) de las partlculas (BEAD) se determina como la relacion de la diferencia entre el logaritmo del numero (NCAGES) de puntos de equilibrio estable (PEQ) al logaritmo del numero medido (ECmedida) de los puntos de equilibrio estable (PEQ) que no contienen ninguna partlcula y la diferencia del logaritmo del numero (NCAGES) de puntos de equilibrio estable (PEQ) al logaritmo del numero (NCAGES-1) de los puntos de equilibrio estable) menos uno.
8. 8. Metodo para la caracterizacion de partlculas (BEADS) que existen en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actua sobre dichas partlculas, que se genera por una serie de electrodos (EL), que comprende las etapas de:

   i. modificar dicho campo (F) de fuerza para desplazar dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) al pasar dichas partlculas (BEADS) en correspondencia con los respectivos sensores (PIXEL_IJ);

   ii. medir el nivel de gris generado por los sensores (PIXEL_IJ) asociado con el paso de los diferentes puntos de equilibrio estable (PEQ) que contienen partlculas, con una frecuencia sustancialmente superior al tiempo de asentamiento de las partlculas en la nueva posicion de equilibrio;

   iii. procesar parametros caracterlsticos de la evolucion temporal de la medida de nivel de gris con el fin de estimar la naturaleza de las partlculas mencionadas.
9. 9. Metodo de acuerdo con la reivindicacion anterior, caracterizado porque dichos parametros de la evolucion temporal del nivel de grises incluyen al menos uno de los parametros seleccionados del grupo que consiste en:

   i. el retraso (td) entre la variacion del campo (F) de fuerza y la primera variacion del nivel de grises;

   ii. la longitud (tw) de la variacion transitoria del nivel de grises;

   iii. la amplitud del pico positivo (Gpp) del nivel de grises;

   iv. la amplitud del pico negativo (Gnp) del nivel de grises.
10. 10. Metodo para contar el numero de partlculas (BEADS) de una multiplicidad de tipos (NTP), que existen en puntos de equilibrio estable (PEQ) de un campo (F) de fuerza que actua sobre dichas partlculas y que se generan por una serie de electrodos (EL) mediante la ejecucion de los siguientes pasos:

    i. modificar el campo (F) de fuerza para desplazar dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) al pasar dichas partlculas (BEADS) en correspondencia con los respectivos sensores (PIXEL_IJ);
11. 11. medir el nivel de gris detectable por los sensores (PIXEL_IJ) que se asocia con el paso de los diferentes puntos de equilibrio estable (PEQ) que contienen partlculas, con una frecuencia sustancialmente superior al tiempo de asentamiento de las partlculas en la nueva posicion de equilibrio;

    iii. procesar parametros caracterlsticos de la evolucion temporal de la medida de nivel de gris que se asocia con cada punto de equilibrio estable (PEQ) para detectar si la jaula asociada esta vacla, si contiene una partlcula de un tipo o si contiene mas partlculas;

    iv. determinar de manera numerica la combinacion de recuentos de partlculas de cada tipo (NCELLSt) que mejor se aproxima al valor medido de jaulas con una sola partlcula de cada tipo (Pt_1_MEAS) y jaulas vaclas (EC_MEAS).
12. 11. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 4 u 8 o 10, caracterizado porque dichos puntos de equilibrio estable (PEQ) se desplazan de modo que dichas partlculas (BEADS) se pasen en correspondencia con una pluralidad de sensores respectivos (PIXEL_IJ); y porque dichos sensores (PIXEL_IJ) son sensores opticos y estan blindados para

    detectar la potencia optica incidente sobre una porcion de espacio sustancialmente inferior a las dimensiones de las partlculas.
13. 12. Metodo de acuerdo con las reivindicaciones 4, 8 u 11, caracterizado porque se controla el curso de la variacion del nivel de grises detectable por los sensores (PIXEL_IJ) que se asocia con el transito de dichos puntos de

    5 equilibrio estable (PEQ) que contienen partlculas para determinar el final del asentamiento transiente de dichas partlculas en la nueva posicion de equilibrio y retroceder desde esta medida hasta la velocidad de desplazamiento de dichos puntos de equilibrio estable (PEQ).
14. 13. Metodo de acuerdo con la reivindicacion anterior, caracterizado porque al final de dicho asentamiento transiente se produce una variacion en dicho campo (F) de fuerza para provocar un nuevo desplazamiento de dichos puntos de

    10 equilibrio estable (PEQ).
15. 14. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dichos sensores son sensores opticos y dicho nivel de grises corresponde con la potencia optica que impacta sobre los sensores.
16. 15. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dichos sensores son sensores de medicion de impedancia.

    15 16. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se realiza una

    compensation de los valores de los niveles de grises detectados por dichos sensores (PIXEL_IJ) al usar un valor normalizado a la detection media de los sensores de referencia (PIXEL_REF) que se asocian con zonas espaciales que no se pueden ocupar ciertamente a partir de partlculas en dicha configuration de corriente de dicho campo (F) de fuerza.

    20 17. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha medicion

    del nivel de grises tiene lugar al desactivar temporalmente dicho campo (F) de fuerza.