ES2637854T3

ES2637854T3 - Formulaciones estabilizadoras

Info

Publication number: ES2637854T3
Application number: ES05803522.1T
Authority: ES
Inventors: Li Li; Angela Kantor; Shannon B Macmillan
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2004-08-13
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2017-10-17
Anticipated expiration: 2025-08-12
Also published as: US20060115472A1; JP4948407B2; US8871201B2; IL181265A0; CN101022831A; BRPI0514340A; ECSP077246A; AU2005272603A1; CA2575870A1; CR8904A; MX2007001599A; KR20070092197A; NO20070930L; JP2008515775A; TW200621282A; WO2006020935A2; AR051009A1; EP1784219A4; RU2007109062A; EP1784219B1

Abstract

Una formulación que comprende (a) un anticuerpo anti-CD22 monoclonal humanizado que comprende: - una región variable de la cadena ligera gL1 que consiste en la secuencia de aminoácidos: **(Ver secuencia)** - una región constante de la cadena ligera de la cadena ligera kappa humana; - una región variable de la cadena pesada gH7 que consiste en la secuencia de aminoácidos **(Ver secuencia)** y, - una región constante de la cadena pesada de la cadena pesada gamma-4 humana; en la que el anticuerpo está presente a una concentración de 1 mg/ml a 50 mg/ml; y (b) una solución acuosa que comprende un tampón succinato y que tiene un pH 4,0 a pH 6,5, en la que la concentración del tampón es de 1 mM a 100 mM;

Description

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DESCRIPCION

Formulaciones estabilizadoras Campo tecnico

La presente solicitud se refiere al campo de la formulacion de protemas, y mas particularmente, a la formulacion de anticuerpos.

Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos numero de serie 60/601311, depositada el 13 de agosto de 2004.

Antecedentes

Las protemas, tales como anticuerpos, se suelen generar y almacenar para su uso posterior. Es importante que tales protemas puedan almacenarse en condiciones que conserven la estabilidad de la protema en diversas condiciones, incluyendo la temperatura y la concentration proteica. De este modo, las formulaciones utilizadas para el almacenamiento de protemas contienen en general una variedad de sustancias estabilizadoras. No obstante, tales sustancias pueden afectar negativamente a los usos corriente abajo de la protema almacenada, ya sea mediante la reduction del rendimiento de un procedimiento corriente abajo o porque necesita la elimination de una o mas sustancias estabilizadoras antes de que la protema pueda utilizarse en un procedimiento corriente abajo.

Existe una necesidad de formulaciones de protemas, tales como anticuerpos, que sean estables en una variedad de temperaturas y no contengan sustancias que puedan interferir con los procedimientos corriente abajo que utiliza las protemas.

Resumen

La invention se refiere al hallazgo de que ciertas formulaciones se pueden utilizar para el almacenamiento de polipeptidos, tales como protemas (p. ej., anticuerpos y fragmentos de los mismos) para formar una preparation que es relativamente estable y simple. Tales formulaciones reducen la probabilidad de que el procesamiento corriente abajo, o la actividad de la protema, se vea afectado negativamente por un componente de la formulacion y simplifican la preparacion de muestras proteicas en un almacenamiento a corto o a largo plazo.

La invencion se refiere a una formulacion que comprende

(a) un anticuerpo anti-CD22 monoclonal humanizado que comprende:

- una region variable de la cadena ligera gL1 que consiste en la secuencia de aminoacidos:

1 DVQVTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLA NSYGNTFLSW YLHKPGKAPQ LLIYGISNRF 61 SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQGTHQP YTFGQGTKVE IKR

- una region constante de la cadena ligera de la cadena ligera kappa humana;

- una region variable de la cadena pesada gH7 que consiste en la secuencia de aminoacidos

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYRFT NYWIHWVRQA PGQGLEWIGG INPGNNYATY 61 RRKFQGRVTM TADTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCTREG YGNYGAWFAY WGQGTLVTVS 121 S;

y,

- una region constante de la cadena pesada de la cadena pesada gamma-4 humana;

en la que el anticuerpo esta presente a una concentracion de 1 mg/ml a 50 mg/ml; y

(b) una solution acuosa que comprende un tampon succinato y que tiene un pH 4,0 a pH 6,5, en la que la concentracion del tampon es de 1 mM a 100 mM;

en la que la formulacion no contiene crioprotector o tensioactivo, y el anticuerpo es estable durante al menos 3 semanas entre -80 °C a 8 °C,

en la que la estabilidad se determina examinando al menos uno entre el porcentaje de especies de alto peso molecular, el porcentaje de especies de bajo peso molecular, o el porcentaje de especies acidas en comparacion con un control;

en la que el control es una replica de la formulacion que no se ha sometido a almacenamiento; en la que el porcentaje del componente proteico de la formulacion en especies de alto peso molecular despues del almacenamiento es de 10 % o menos de la protema total;

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en la que el porcentaje del componente proteico de la formulacion en especies de bajo peso molecular despues del almacenamiento es de 10 % o menos de la protema total, y,

en la que la formulacion no muestra un aumento superior al 10 % en el porcentaje de especies acidas despues del almacenamiento.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende - una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos:

1 MKLPVRLLVL LLFWIPASRG DVQVTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLA NSYGNTFLSW 61 YLHKPGKAPQ LLIYGISNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQGTHQP 121 YTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ 181 SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC;

y una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos:

1 MDFGFSLVFL ALILKGVQCE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYRFTN YWIHWVRQAP 61 GQGLEWIGGI NPGNNYATYR RKFQGRVTMT ADTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCTREGY

121 GNYGAWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 181 WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES 241 KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 301 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK 361 GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 421 DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK.

Por consiguiente, la divulgacion incluye una formulacion que contiene una protema aislada y una solution acuosa que tiene un pH 4,0-8,0, de manera tal que la formulacion no contiene ningun crioprotector o tensioactivo, y la protema es estable durante al menos 3 semanas a -80 ° a 8 °C. En algunos casos, la formulacion contiene menos de sal 150 mM, p. ej., sal 75 mM. La protema puede ser un anticuerpo (un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal). Por ejemplo, la protema puede ser un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-Lewis Y o un anticuerpo anti-5T4. La protema puede ser una protema recombinante (p. ej., un anticuerpo monoclonal humanizado). En algunos casos, la protema es una protema terapeutica.

La solucion acuosa de la formulacion puede ser agua (p. ej., filtrada o esteril) o puede incluir un tampon, tal como un tampon acetato, tampon succinato, tampon fosfato o tampon citrato. En general, la concentration del tampon es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 150 mM, p. ej., aproximadamente 50 mM, aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM.

El componente proteico de la formulacion es generalmente estable durante al menos 1 ano a 5 °C, p. ej., la protema es estable durante al menos 3 anos a 5 °C. En algunas realizaciones, la protema esta presente a una concentracion de desde aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, 25 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, o aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. La protema puede tener un pl de al menos 6,0, p. ej., al menos 7,0, o al menos 8,0. La protema se puede purificar, p. ej., a al menos el 90 % o a al menos el 95 %.

En algunos casos, la formulacion se almacena a aproximadamente 0°C a aproximadamente 8 °C o de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 5 °C. El pH de la formulacion puede ser de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, y en algunos casos, el pH de la formulacion es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 y la formulacion se almacena a aproximadamente -80 °C a aproximadamente 5 °C. Generalmente, la formulacion es esteril.

En un ejemplo de la divulgacion, la protema de la formulacion tambien puede ser, p. ej., un anticuerpo anti-CD22 humanizado y una solucion acuosa con aproximadamente succinato 20 mM, pH 6,0. En otro ejemplo de la divulgacion, la protema es un anticuerpo anti-Lewis Y y la solucion acuosa es de aproximadamente citrato Na 10 mM, pH 5,5 y aproximadamente NaCl 75 mM. En un tercer ejemplo de la divulgacion, la protema es un anticuerpo anti-5T4 y la solucion acuosa es de aproximadamente acetato Na 10 mM, pH aproximadamente 5,5.

La estabilidad de la formulacion puede determinarse, p. ej., examinando al menos uno entre el porcentaje de especies de alto peso molecular, el porcentaje de especies de bajo peso molecular, o el porcentaje de especies

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acidas, p. ej., en comparacion con un control.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un procedimiento de almacenamiento de una protema. El procedimiento incluye proporcionar una formulacion como se ha descrito supra, colocar la formulacion a una temperatura seleccionada, y mantener la formulacion a la temperatura (p. ej., congelada), de manera tal que la protema en la formulacion es estable durante al menos una semana, p. ej., durante al menos un mes, tres meses, un ano, cinco anos, siete anos, o diez anos. En algunos casos, la protema se almacena y es estable a una temperatura de aproximadamente 2 °C a 8 °C. En ciertas realizaciones, la protema se almacena a una temperatura de aproximadamente -80 °C y la protema es estable durante al menos cinco anos, siete anos, o diez anos. Cuando se congela la protema, el procedimiento puede incluir una etapa en la que la protema se descongela rapidamente. Cuando la protema se va a congelar, p. ej., para su almacenamiento, la protema se puede congelar utilizando congelacion rapida. En algunos casos, se utiliza la congelacion lenta. La protema puede ser un anticuerpo (un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal). En un ejemplo, la protema es un anticuerpo anti-CD22 humanizado, un anticuerpo anti-Lewis Y, o un anticuerpo anti-5T4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es una sustancia intermedia. En general, la protema esta presente en una concentracion de al menos 1 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml, o al menos 30 mg/ml. Despues de la recuperacion del almacenamiento, la protema puede tener, p. ej., al menos el 70% de la actividad de una referencia. En algunos casos, despues de la recuperacion del almacenamiento, la formulacion contiene menos o igual al 5 % de productos de alto peso molecular en comparacion con un control o despues de la recuperacion del almacenamiento, la formulacion contiene menos o igual al 10 % de productos de alto peso molecular y agregados, p. ej., en comparacion con un control. En algunas realizaciones, la formulacion contiene menos o igual al 10 % de productos de alto peso molecular, p. ej., menos o igual al 5 % de productos de alto peso molecular.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un procedimiento de determinacion de una formulacion favorable para el almacenamiento de una protema aislada seleccionada. El procedimiento incluye proporcionar una protema aislada seleccionada, almacenar la protema aislada seleccionada en una serie de formulaciones que comprenden una solucion acuosa comprendida entre pH 4,0 y pH 8,0 y que comprende entre aproximadamente 0 mM a aproximadamente 150 mM de tampon, determinar al menos un parametro de estabilidad, e identificar una formulacion en la que la protema es estable, de manera tal que una formulacion en la que la protema es estable es una formulacion favorable para el almacenamiento de la protema aislada seleccionada. En algunas realizaciones del procedimiento, una disminucion en la estabilidad esta indicada por al menos uno entre un aumento en la cantidad de protema de alto peso molecular en la muestra, p. ej., en comparacion con un control, un aumento en la cantidad de especies de bajo peso molecular en la muestra, p. ej., en comparacion con un control, o un aumento en el porcentaje de especies acidas en comparacion con un control. En algunos casos, se selecciono una condicion en la que no mas del 0,5 %, 0,2 %, o 0,1 % de la protema es una especie de alto peso molecular. El parametro de estabilidad puede ser la actividad examinada por el ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) y en una formulacion estable, la actividad es al menos el 50 % de un control o es al menos el 80 % de un control. En un ejemplo del procedimiento, el parametro de estabilidad es la presencia de especies de alto peso molecular y una formulacion estable contiene no mas del 5 % de especies de alto peso molecular. En otro ejemplo, el parametro de la estabilidad es la presencia de especies de alto peso molecular y agregados proteicos, y una formulacion estable incluye no mas del 10 % de especies de alto peso molecular y agregados proteicos o no mas del 15 % de especies de alto peso molecular y agregados proteicos combinados. En algunos casos, el porcentaje de especies de alto peso molecular se compara con la cantidad presente en una muestra de control (p. ej., una muestra antes del almacenamiento). En otra realizacion del procedimiento, el parametro de estabilidad es la relacion de protemas acidas y basicas, y la relacion en una formulacion estable es no mas del 15 % diferente de un control.

La divulgacion tambien se refiere a un polipeptido (una protema o un peptido) producido por un procedimiento que incluye el almacenamiento del polipeptido en una formulacion que incluye una solucion acuosa que tiene un pH de 4,0 a pH 8,0, de manera tal que la formulacion no contiene crioprotector del tensioactivo, y la protema es estable durante al menos tres semanas a -80 °C a 8 °C. En algunas realizaciones, el polipeptido es un anticuerpo o un fragmento del mismo (p. ej., un anti-CD22, anti-Lewis Y, o un anti-5T4). El anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con una molecula o puede utilizarse para la conjugacion con una molecula, por ejemplo, conjugacion con una toxina, tal como ricina o caliqueamicina.

En algunas realizaciones, la divulgacion se refiere a un polipeptido (una protema o un peptido) para su uso en la fabricacion de una protema modificada, de manera tal que el polipeptido se almacena en una formulacion que incluye una solucion acuosa que tiene un pH de 4,0 a pH 8,0, la formulacion no contiene crioprotector del surfactante, y la protema es estable durante al menos tres semanas a -80 °C a 8 °C. En algunos casos, el polipeptido es un anticuerpo, p. ej., un anti-CD22, un anti-Lewis y, o un anti-5T4. El polipeptido puede utilizarse para fabricar una protema conjugada, p. ej., para la conjugacion con una toxina, tal como ricina o caliqueamicina. Tales protemas conjugadas tambien se pueden almacenar en una formulacion descrita en la presente memoria.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comunmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden utilizarse en la practica o ensayo de la presente invencion, se describen a continuacion procedimientos y materiales adecuados.

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Otras caractensticas y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la descripcion detallada, los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

La Fig. 1A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por cromatograffa de exclusion por tamanos-cromatograffa Kquida de alto rendimiento (CET-HPLC) de 1 mg/ml de anti-Lewis Y a diversas temperaturas y diversos pHs. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de alto peso molecular (APM).

La Fig. 1B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 1 mg/ml de antiLewis Y a diversas temperaturas y diversos pHs. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de bajo peso molecular (BpM).

La Fig. 2 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CIC-HPLC de 1 mg/ml de antiLewis Y a diversas temperaturas y diversos pHs. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies acidas.

La Fig. 3 es una representacion de un SDS-PAGE de muestras de anti-Lewis Y almacenadas a 40 °C durante cuatro semanas a varios pH. La imagen de la izquierda es de un analisis en gel en condiciones no reductoras y la imagen de la derecha es de un analisis en gel en condiciones reductoras.

La Fig. 4 es una representacion de un isoelectroenfoque (IEE) en gel de muestras como se describe para la Fig. 3.

La Fig. 5 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 0,5 mg/ml de anti- CD22 incubados durante dos semanas a diversas temperaturas y diversos pHs. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 6 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 25 mg/ml de anti- CD22 incubados durante dos semanas a diversas temperaturas y diversos pHs, en presencia o ausencia de NaCl 75 mM. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 7A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 1 mg/ml de antiLewis Y incubados durante cuatro semanas a diversos pHs a 40 °C, en varios tampones, y en presencia o ausencia de NaCl 75 mM. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 7B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 1 mg/ml de antiLewis Y incubados durante cuatro semanas a diversos pHs a 40 °C, en varios tampones, y en presencia o ausencia de NaCl 75 mM. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de BPM.

La Fig. 8 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CIC-HPLC de 1 mg/ml de antiLewis Y incubados durante cuatro semanas a diversos pHs a 40 °C, en varios tampones, y en presencia o ausencia de NaCl 75 mM. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies acidas.

La Fig. 9A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CIC-HPLC de 30 mg/ml de antiLewis Y incubados durante cuatro semanas en citrato Na 10 mM, pH 5,5 a varias temperaturas y varias concentraciones de NaCI. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies acidas.

La Fig. 9B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de las muestras descritas para 9A. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 9C es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de las muestras descritas para 9A. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de BPM.

La Fig. 10 es un grafico de barras que representa los resultados de CET-HPLC de anti-Lewis Y a 1 mg/ml o 30 mg/ml en diferentes concentraciones de sal y se someten a sacudida. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 11A es un grafico de barras que representa los resultados de CET-HPLC de anti-Lewis Y a 1 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de NaCl 150 mM siguiendo diez ciclos de congelacion- descongelacion como se indica en la Fig. 11B. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 11B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-Lewis Y a 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de NaCl 150 mM siguiendo diez ciclos de congelacion-descongelacion como se ha indicado. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 12 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 25 mg/ml de anti- CD22 en succinato 50 mM, pH 6,0, incubados durante un mes a varias temperaturas en presencia o ausencia de NaCl 75 mM.

La Fig. 13 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 15 mg/ml de anti- CD22 en succinato 20 mM, pH 6,0, succinato mas NaCl 75 mM, succinato mas polisorbato 80 al 0,01 %, o succinato mas NaCl 75 mM y polisorbato 80 (Tween). Las muestras se agitaron durante 24 horas antes del analisis. Se incluye un control sin sacudir de la protema en tampon succinato. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 14A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-Lewis Y a 1 mg/ml o 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 incubados en presencia o ausencia de NaCl 75 mM durante cuatro semanas a 40 °C. Los resultados se expresan como un cambio en el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 14B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-Lewis Y a 1 mg/ml o 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 incubados en presencia o ausencia de NaCl 75 mM durante

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cuatro semanas a 40 °C. Los resultados se expresan como un cambio en el porcentaje de especies de BPM.

La Fig. 14C es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CIC-HPLC de anti-Lewis Y a 1 mg/ml o 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 incubados en presencia o ausencia de NaCl 75 mM durante cuatro semanas a 40 °C. Los resultados se expresan como un cambio en el porcentaje de especies acidas.

La Fig. 15A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLc de anti-Lewis Y a 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM incubados a varias temperaturas durante varios momentos. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 15B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-Lewis Y a 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM incubados a varias temperaturas durante varios momentos. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de BPM.

La Fig. 15C es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CIC-HPLC de anti-Lewis Y a

30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM incubados a varias temperaturas durante varios momentos.

Los resultados se expresan como el porcentaje de especies acidas.

La Fig. 16A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-CD22 a 1 mg/ml en succinato 20 mM, pH 6,0 y se tratan en varios regfmenes de congelacion-descongelacion para varios ciclos. CR es congelacion rapida, DR es descongelacion rapida, CL es congelacion lenta, y DL es

descongelacion lenta. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 16B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-CD22 a 25 mg/ml en succinato 20 mM, pH 6,0 y se tratan en varios regfmenes de congelacion-descongelacion para varios ciclos. CR es congelacion rapida, DR es descongelacion rapida, CL es congelacion lenta, y DL es

La Fig. 16C es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-CD22 a 1 mg/ml en succinato 20 mM, pH 6,0 que contiene polisorbato 80 y se tratan en varios regfmenes de congelacion- descongelacion para varios ciclos. CR es congelacion rapida, DR es descongelacion rapida, CL es congelacion lenta, y DL es descongelacion lenta. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 16D es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-CD22 a 25 mg/ml en succinato 20 mM, pH 6,0 que contiene polisorbato 80 y se tratan en varios regfmenes de congelacion- descongelacion para varios ciclos. CR es congelacion rapida, DR es descongelacion rapida, CL es congelacion lenta, y DL es descongelacion lenta. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 17A es un grafico de barras que representa los resultados de estudios de sacudida, analizados utilizando CET-HPLC, en el que se agitaron 1 mg/ml o 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de polisorbato 80 a 360 rpm durante 24 horas a temperatura ambiente. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 17B es un grafico de barras que representa los resultados de estudios de sacudida, analizados utilizando CET-HPLC, en el que se agitaron 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en varias concentraciones de polisorbato 80 a 360 rpm durante 24 horas a temperatura ambiente. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 18A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-Lewis Y a 1 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de polisorbato 80 al 0,01 % siguiendo diez ciclos de congelacion-descongelacion como se indica en la Fig. 18B. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 18B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de anti-Lewis Y a 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de polisorbato 80 al 0,01 % siguiendo diez ciclos de congelacion-descongelacion como se ha indicado. Los resultados se expresan como el porcentaje de recuperacion de monomeros.

La Fig. 19A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM en presencia o ausencia de polisorbato 80 despues de la incubacion a diversas temperaturas y durante diversos momentos. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 19B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM en presencia o ausencia de polisorbato 80 despues de la incubacion a diversas temperaturas y durante diversos momentos. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de BPM.

La Fig. 19C es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, NaCl 75 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de polisorbato 80 despues de la incubacion a diversas temperaturas y durante diversos momentos. Los resultados se expresan como el porcentaje de especies acidas.

La Fig. 20A es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de la estabilidad de almacenamiento de anti-CD22 durante seis meses. Las soluciones contienen succinato 20 mM, pH 6,0 (S); succinato 20 mM, metionina 10 mM, pH 6,0 (SM); succinato 20 mM, polisorbato 80 al 0,01, pH 6,0 (St); o succinato 20 mM, metionina 10 mM, polisorbato 80 al 0,01, pH 6,0 (SMT). Los resultados se expresan como el porcentaje de especies de APM.

La Fig. 20B es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de la estabilidad de almacenamiento de anti-CD22 durante seis meses. Las soluciones contienen succinato 20 mM, pH 6,0 (S); succinato 20 mM, metionina 10 mM, pH 6,0 (SM); succinato 20 mM, polisorbato 80 al 0,01, pH 6,0 (St); o succinato 20 mM, metionina 10 mM, polisorbato 80 al 0,01, pH 6,0 (SMT). Los resultados se expresan como el

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porcentaje del area del pico total.

La Fig. 20C es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CIC-HPLC de estabilidad de almacenamiento de anti-CD22. Las condiciones son como se describen en la Fig. 20A y 20B. Los resultados se expresan como el porcentaje de las especies completamente activas (% de pico 5).

La Fig. 21 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC de los productos de alto peso molecular (APM) de anti-5T4 almacenados a diferentes pHs y temperaturas durante dos semanas. Los resultados se expresan como el porcentaje medio de los productos de alto peso molecular.

La Fig. 22 es un grafico de barras que representa los resultados del analisis por CET-HPLC del porcentaje de productos de alto peso molecular (APM) o productos de bajo peso molecular (BPM) en muestras de anti-5T4 inicialmente o despues de cuatro semanas a 40 °C en tampon acetato (Ace), tampon citrato (Cit), tampon fosfato (Fos), o tampon succinato (Suc), con o sin sal (NaCl), a varios pHs.

La Fig. 23A es un termograma que muestra los resultados de calorimetna diferencial de barrido (CDB) de anti- 5T4 en tampon citrato (pH 5,5).

La Fig. 23B es un termograma que muestra los resultados de calorimetna diferencial de barrido (CDB) de anti- 5T4 en tampon succinato (pH 6,0).

La Fig. 24A es un grafico de barras que representa los resultados de CDB de anti-5T4 en diversas formulaciones, sin NaCl, y a diversos pHs.

La Fig. 24B es un grafico de barras que representa los resultados de CDB de anti-5T4 en diversas formulaciones que contienen NaCl 150 mM a diversos pH.

La Fig. 25 es un grafico de barras que representa los resultados de CIC-HPLC de anti-5T4 en formulaciones que contienen diversos tampones, con o sin NaCl 150 mM, a diversos pHs despues de cuatro semanas a 40 °C.

La Fig. 26A es un grafico de barras que representa los resultados de CET-HPLC de anti-5T4 (2 mg/ml) en diversos tampones a diversos pHs despues de seis semanas a -80 °C o 40 °C.

La Fig. 26B es un grafico de barras que representa los resultados de CET-HPLC de anti-5T4 (30 mg/ml) en tampon citrato o succinato a pH 6 despues de seis semanas a -80 °C o 40 °C.

La Fig. 27A es un grafico de barras que representa los resultados de CIC-HPLC de anti-5T4 (2 mg/ml) en diversas formulaciones de tampones a diversos pHs despues de seis semanas a 40 °C.

La Fig. 27B es un grafico de barras que representa los resultados de CIC-HPLC de anti-5T4 (30 mg/ml) en un tampon succinato o citrato a pH 6 despues de seis semanas a 40 °C.

La Fig. 28 es una reproduccion de un conjunto de electroferogramas superpuestos que representan los resultados de la electroforesis capilar en geles de SDS de anti-5T4 en diversas formulaciones de tampon a diversos pHs despues de seis semanas a 40 °C.

La Fig. 29A es un grafico de barras que representa el valor A400 de anti-5T4 a 1 mg/ml en formulaciones que contienen diversos tampones (pH 5,5) y con o sin polisorbato 80 (P80), y con o sin sacarosa en diferentes regfmenes de congelacion y descongelacion. CR es congelacion rapida, CL es congelacion lenta, DR es descongelacion rapida, y DL es descongelacion lenta.

La Fig. 29B es un grafico de barras que representa el porcentaje de especies de alto peso molecular (APM) de anti-5T4 a 1 mg/ml en formulaciones que contienen diversos tampones (pH 5,5) y con o sin polisorbato 80 (P80), y con o sin sacarosa en diferentes regfmenes de congelacion y descongelacion. Cr es congelacion rapida, CL es congelacion lenta, DR es descongelacion rapida, y DL es descongelacion lenta.

La Fig. 30A es un grafico de barras que representa el valor A400 de anti-5T4 a 25 mg/ml en formulaciones que contienen diversos tampones (pH 5,5) y con o sin polisorbato 80 (P80), y con o sin sacarosa en diferentes regfmenes de congelacion y descongelacion. CR es congelacion rapida, CL es congelacion lenta, DR es descongelacion rapida, y DL es descongelacion lenta.

La Fig. 30B es un grafico de barras que representa el porcentaje de especies de alto peso molecular (APM) de anti-5T4 a 25 mg/ml en formulaciones que contienen diversos tampones (pH 5,5) y con o sin polisorbato 80 (P80), y con o sin sacarosa en diferentes regfmenes de congelacion y descongelacion. CR es congelacion rapida, CL es congelacion lenta, DR es descongelacion rapida, y DL es descongelacion lenta.

La Fig. 31A es un grafico de barras que representa el valor A400 de anti-5T4 a 1 mg/ml o 25 mg/ml en varias formulaciones con o sin polisorbato 80 (P80), y con o sin sacarosa. Las muestras se sacudieron o no se sacudieron. "*" indica que la turbidez excede el lfmite superior del instrumento.

La Fig. 31B es un grafico de barras que representa el porcentaje de especies de alto peso molecular (APM) de anti-5T4 a 1 mg/ml o 25 mg/ml en varias formulaciones con o sin polisorbato (P80) y con o sin sacarosa. Las muestras se sacudieron o no se sacudieron.

Descripcion detallada

Se proporciona una formulacion relativamente simple para el almacenamiento de una protema, tal como un anticuerpo monoclonal, un farmaco que contiene un anticuerpo monoclonal, o una sustancia intermedia en la produccion de un producto proteico, tal como un farmaco que contiene un anticuerpo. La formulacion contiene generalmente concentraciones con una cantidad escasa a nula de tensioactivo, concentraciones con una cantidad nula o relativamente baja en sal, y requiere una concentracion de tampon relativamente baja. La formulacion es eficaz para el almacenamiento estable de ciertas protemas, tales como anticuerpos, a traves de un intervalo relativamente amplio de concentraciones proteicas, pH, y tipos de tampon. Dichas formulaciones proporcionan una gran flexibilidad para su posterior procesamiento, p. ej., haciendo que la protema se ajuste con facilidad a un pH deseado, adicion excipiente, modificacion qmmica, o liofilizacion. Las formulaciones tambien se pueden utilizar para

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el almacenamiento de peptidos y protemas procesadas, p. ej., protemas, tales como anticuerpos que se conjugan con otro peptido o fragmentos no peptidicos.

Tambien se proporcionan ejemplos espedficos no limitativos que ilustran procedimientos de identificacion de una formulacion favorable para el almacenamiento de tres anticuerpos diferentes, un anti-CD22, un anti-Lewis Y, y un anti-5T4, que se pueden utilizar, p. ej., como sustancias intermedias para la fabricacion de farmacos elaborados por la conjugacion de los anticuerpos con un compuesto, tal como una citotoxina. Una sustancia intermedia es una sustancia, generalmente una protema (p. ej., un anticuerpo) que se utiliza en la fabricacion de un compuesto, tal como un farmaco.

Formulaciones

Las formulaciones descritas en la presente memoria incluyen generalmente una protema aislada en una solucion acuosa de un pH aproximadamente 3,0 a 9,0, p. ej., un pH de aproximadamente 4,0-8,0, un pH de aproximadamente 5,0-6,5, o un pH de aproximadamente 5,5-6,0. Las formulaciones no contienen crioprotectores o tensioactivos. En general, las formulaciones no contienen conservantes.

Una formulacion que se describe en la presente memoria no contiene crioprotector alguno. Los crioprotectores se conocen por los expertos en la materia, e incluyen, por ejemplo, monosacaridos (p. ej., glucosa, fructosa, maltosa, ribosa, manosa, y xilosa); disacaridos (p. ej., trehalosa, sacarosa, celobiosa y lactosa); trisacaridos (p. ej., rafinosa); alcoholes de azucar (p. ej., manitol, sorbitol, mio-inositol, inositoles fosforilados, y glicerol); polisacaridos (p. ej., almidon de hidroxietilo (AHE), dextrano, dextrano fosforilado, heparina, sulfato de heparina, acido hialuronico, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, y agarosa); acidos carboxflicos (p. ej., piruvato y 2,3,-difosfoglicerato); y protemas o mezclas de protemas utilizadas para un efecto protector (p. ej., sangre, suero animal, plasma, albumina humana, albumina bovina, gelatina bovina y gelatina de pescado).

Las nuevas formulaciones no contienen tensioactivo (un reactivo que puede reducir la tension superficial del agua cuando se utiliza en concentraciones muy bajas). Los surfactantes se conocen en la materia e incluyen, p. ej., polisorbato 80, polisorbato 20, y tensioactivos Pluronic®.

En general, las nuevas formulaciones no contienen conservantes. Los conservantes se conocen por los expertos en la materia e incluyen agentes antibacterianos y antifungicos, tales como, por ejemplo, azida de sodio, compuestos que contienen mercurio, tales como timerosal, xilenoles, antibioticos, isotiazolonas, y anfotericina.

Tampones

Las formulaciones pueden estar en un tampon, lo que significa un agente que mantiene el pH de una solucion en un intervalo aceptable. Un tampon puede incluir, por ejemplo, citrato, acetato, histidina, gluconato, succinato, fosfato, Tris (tris (hidroximetilaminometano)), dietanolamina, HEPES u otros tampones acidos organicos. Otros tampones adecuados para su uso con una protema se conocen por los expertos en la materia. Ciertas formulaciones excluyen el uso de tampones amina. En formulaciones que contienen un tampon, el tampon esta presente generalmente en una concentracion que oscila desde mas de 0 mM a 150 mM. En algunos casos, la concentracion del tampon es de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. Por ejemplo, la concentracion de tampon puede ser de aproximadamente 10 mM a 20 mM. En algunos casos, puede utilizarse una combinacion de tampones, por ejemplo, tampones HEPES y Tris pueden utilizarse en combinacion.

Otras consideraciones pueden aplicarse a la seleccion de un tampon. Por ejemplo, tampones amina, tales como tampones Tris o histidina no son adecuados para ciertos procedimientos de conjugacion y por lo tanto no son adecuados para una formulacion que contiene una protema que se va a utilizar en un procedimiento de conjugacion de este tipo.

En general, la concentracion de sal utilizada en una formulacion se expresa como sal anadida y no tienen en cuenta, p. ej., sodio aportado por tampon o sal que estaba presente en la muestra proteica antes de su dilucion en la formulacion.

Las formulaciones pueden prepararse utilizando procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, la dialisis puede utilizarse para introducir un tampon de pH deseado y, opcionalmente, una sal a una formulacion que contiene la protema de interes. Generalmente, se proporciona una muestra inicial que contiene una protema de interes aislada. En algunos casos, tales como cuando la muestra inicial esta a una concentracion alta de protemas antes de su dilucion en la formulacion, no es necesario tener en cuenta el pH o la cantidad de sal de la muestra inicial. Al preparar una formulacion utilizando una muestra inicial que contiene concentraciones muy altas de sal o altas concentraciones de tampon, se utiliza un procedimiento para preparar la protema generalmente para eliminar o reducir los componentes no proteicos de la muestra inicial (p. ej., dialisis).

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Estabilidad

Es una caracteffstica de las formulaciones descritas en la presente memoria que el componente proteico (p. ej., anticuerpo) de la formulacion sea estable durante al menos un periodo de tiempo especificado que no sea menos de tres semanas cuando la formulacion se almacene a una temperatura de -80 °C a 8 °C. En general, un componente proteico en una formulacion es estable durante al menos un ano a 5 °C. La estabilidad se refiere generalmente a la estabilidad conformacional de una protema y/o la estabilidad de la actividad. Con respecto a una formulacion, una protema es estable si cumple con al menos uno de los parametros para la estabilidad que se proporcionan en la presente memoria. En general, es deseable minimizar la formacion de especies de alto peso molecular que se acumulan durante el almacenamiento de una protema. De este modo, un parametro para la estabilidad es que el aumento, si lo hubiere, en la cantidad de especies de alto peso molecular en una formulacion sometida a almacenamiento es menor que en un control. Por ejemplo, el porcentaje de especies de alto peso molecular en una muestra despues de un almacenamiento en una formulacion no aumenta significativamente en comparacion con un control. En general, un control es una replica de la formulacion que no se ha sometido a almacenamiento en las condiciones experimentales (p. ej., durante tres semanas a -80° a 8 °C). En algunos casos, el porcentaje del componente proteico de una formulacion en especies de alto peso molecular despues del almacenamiento es de 10 % o menos de la protema total, 5 % o menos de la protema total, es 3 % o menos de la protema total, o es 2 % o menos de la protema total. Los procedimientos de analisis de especies de alto peso molecular se conocen en la tecnica e incluyen SEC-HPLC, SDS-PAGE, electroforesis capilar, y cromatograffa de exclusion por tamanos.

Otro parametro que puede analizarse es el aumento, si lo hubiere, en la cantidad de especies de bajo peso molecular en una formulacion sometida a almacenamiento. En general, es deseable minimizar la acumulacion de especies de bajo peso molecular durante el almacenamiento. Por ejemplo, el porcentaje de especies de bajo peso molecular en una muestra despues de un almacenamiento de una formulacion no aumenta significativamente en comparacion con un control. En algunos casos, el porcentaje del componente proteico de una formulacion en especies de alto peso molecular despues del almacenamiento es de 10 % o menos de la protema total, 5 % o menos de la protema total, es 3 % o menos de la protema total, o es 2 % o menos de la protema total. Las especies de bajo peso molecular se pueden analizar utilizando procedimientos conocidos en la materia, p. ej., SEC-HPLC.

La relacion de especies acidas y basicas en una formulacion despues del almacenamiento en diversas condiciones puede compararse a la relacion en un control. En general, se determina el porcentaje de especies acidas, indicativo de desamidacion. Un aumento en el porcentaje de especies acidas es indicativo de estabilidad disminuida. Por ejemplo, una formulacion estable no muestra generalmente un aumento superior al 10% en el porcentaje de especies acidas en comparacion con un control en una condicion seleccionada. Los procedimientos para determinar el porcentaje de especies acidas en una muestra se conocen en la materia, p. ej., CIC-HPLC. En algunos casos, la presencia de especies basicas se analiza utilizando procedimientos conocidos en la materia. Un cambio en el porcentaje o tipo de especies basicas presentes en una protema almacenada en una formulacion es indicativo del grado de estabilidad de las especies proteicas en la formulacion.

Otro parametro para la estabilidad puede ser un aumento de los agregados y las especies de APM, si los hubiere, que es menor o igual al 10 % de la cantidad de agregados y especies de alto peso molecular en un control. Los agregados son generalmente aquellos materiales en una muestra que no entran en un gel, columna, u otro medio de separacion que puede utilizarse para separar los componentes proteicos de una formulacion. Los procedimientos para determinar las especies de alto peso molecular ademas de los agregados en una formulacion se conocen en la materia e incluyen electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatograffa de exclusion por tamanos, electroforesis capilar, y dispersion de luz.

La potencia o actividad de una protema puede determinarse y utilizarse como un parametro para establecer la estabilidad de una formulacion. En el caso de un anticuerpo, puede utilizarse un inmunoensayo (p. ej., un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA)). Cuando se utiliza un inmunoensayo u otro ensayo de actividad, un anticuerpo en una formulacion es estable si retiene al menos el 50 % de su actividad en el inmunoensayo en comparacion con la actividad de un control. En algunos casos, la formulacion es estable si la protema retiene al menos el 20 % de su actividad.

Otros parametros de estabilidad tambien pueden medirse y utilizarse para evaluar una formulacion. Por ejemplo, se puede analizar la estabilidad de una protema en una formulacion despues de la agitacion (sacudida). Esto puede ser un parametro importante ya que es deseable que las muestras se mantengan estables durante el transporte. La estabilidad de una formulacion con respecto a la agitacion se analiza sometiendo generalmente la muestra a sacudidas (p. ej., 360 rpm) durante un periodo de tiempo (p. ej., 12 horas, 24 horas, 48 horas, o mas), determinando entonces si se produce un aumento en los productos indicativos de inestabilidad (p. ej., especies de alto peso molecular, especies de bajo peso molecular, o especies acidas) con relacion a un control.

Otros procedimientos conocidos en la materia pueden utilizarse para evaluar la estabilidad de una protema en una formulacion. Ejemplos de tales procedimientos incluyen dicrofsmo circular, que proporciona tanto informacion estructural secundaria como terciaria, espectroscopia de fluorescencia (p. ej., en presencia de Bis-ANS, que se une a parches hidrofobos como una indicacion de despliegue), calorimetffa diferencial de barrido (CDB, que supervisa el despliegue termico general), y ultrafiltracion/diafiltracion.

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Se puede utilizar mas de un parametro para evaluar la estabilidad de una protema.

Temperatura

Es una ventaja de ciertas formulaciones descritas en la presente memoria que proporcionen un procedimiento de almacenamiento de una protema en una solucion minima, tal que la protema no muestra degradacion o agregacion significativa en el tiempo y en un intervalo de temperaturas. En general, una protema o peptido en la formulacion es estable durante al menos tres dfas (p. ej., dos semanas o cuatro semanas) a temperaturas que oscilan desde aproximadamente -80 °C a aproximadamente 40°°C o desde aproximadamente -80 °C a aproximadamente 8 °C (p. ej., a aproximadamente 5 °C). En algunos casos, es deseable que una formulacion sea estable durante largos periodos de tiempo, p. ej., durante al menos 2 meses, tres meses, seis meses, nueve meses, un ano, tres anos, cinco anos, siete anos, o diez anos.

Ademas, una protema incluida en una formulacion puede mostrar estabilidad significativa sobre ciclos de congelacion-descongelacion repetidos, y despues de tal tratamiento puede permanecer estable despues de ser descongelada. En general, una formulacion a congelar es congelada rapidamente, por ejemplo, congelada en nitrogeno lfquido. La descongelacion puede encontrarse en un intervalo de temperaturas, p. ej., de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 25 °C, que es una descongelacion lenta; o de aproximadamente 26 °C a 40 °C, que es una descongelacion rapida. Un ejemplo de descongelacion rapida es descongelar la formulacion en un bano de agua a 37 °C. Una protema en una formulacion puede ser estable durante al menos un ciclo de congelacion-descongelacion, al menos cinco ciclos de congelacion-descongelacion, o al menos diez ciclos de congelacion-descongelacion.

Puede ser deseable determinar un regimen optimo para congelar-descongelar una formulacion para conservar la estabilidad, o puede ser deseable identificar una formulacion que proporciona la mayor estabilidad para una protema que se sometera a un ciclo de congelacion-descongelacion particular. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se evalua este parametro. Por ejemplo, una formulacion de ensayo puede analizarse para la estabilidad en una variedad de condiciones de congelacion-descongelacion, tales como congelacion rapida, congelacion lenta, descongelacion rapida, descongelacion lenta en diversas combinaciones para determinar el procedimiento que produce los productos de menor degradacion (p. ej., que tiene la mayor estabilidad).

Polipeptidos

Los polipeptidos utilizados en las formulaciones descritas en la presente memoria son protemas generalmente aisladas. Una protema "aislada" esta esencialmente libre de material celular u otras protemas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que deriva la protema, o esencialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos cuando se sintetiza qmmicamente. La expresion "esencialmente libre" significa una preparacion de protema aislada que tiene menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % o 5 % (en peso seco), de otras protemas (tambien denominada en la presente memoria como una "protema contaminante"), o de precursores qmmicos. Cuando la protema aislada se produce por recombinacion, tambien es generalmente esencialmente libre de medio de cultivo, es decir, un medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 10 %, o menos de aproximadamente 5 % del volumen de la preparacion proteica.

En algunos casos, las combinaciones de protemas se utilizan en una formulacion. Por ejemplo, dos anticuerpos diferentes que se van a preparar como un medicamento pueden almacenarse juntos en la misma formulacion. Un anticuerpo tambien se puede utilizar con una formulacion en combinacion con otros tipos o protemas o peptidos, incluyendo peptidos toxicos. Los peptidos o fragmentos proteicos pueden utilizarse con las formulaciones, p. ej., se puede utilizar un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fab.

En general, "protema" se refiere a una protema de longitud completa o un fragmento de la misma. Una protema puede corresponder a una protema de origen natural o fragmento de la misma, o una protema modificada por ingeniena genetica procedente de, p. ej., mutagenesis o tecnicas recombinantes, o un fragmento de la misma. Una protema puede, en algunos casos incluir un resto no protemico, tal como una molecula detectable (p. ej., una molecula fluorescente o un radioisotopo), una toxina, un farmaco, o una molecula pequena. Las protemas pueden contener, p. ej., aminoacidos de origen no natural. La protema puede ser una protema tubrida. La protema puede incluir mas de un tipo de protema distinta como en un anticuerpo (p. ej., que contiene cadenas tanto pesadas como ligeras) o una protema de la insulina madura. Un ejemplo de un fragmento proteico que puede utilizarse incluye un fragmento Fab o un fragmento Fc. En algunos casos, un peptido se utiliza con una formulacion, o, como se ha descrito anteriormente, una combinacion de al menos una protema y al menos un fragmento peptfdico o proteico. Las toxinas protemicas tambien se pueden almacenar en las formulaciones, p. ej., solas, conjugadas con otra protema o peptido, o como una entidad distinta con otra protema o peptido. En general, las formulaciones proporcionadas en la presente memoria son utiles para cualquier polipeptido (protema o peptido) como se describe en la presente memoria para las protemas.

Un peptido es un compuesto que tiene dos o mas aminoacidos unidos covalentemente (p. ej., 5, 10, 15, 20, 30, o 50 aminoacidos). En general, una protema es un polipeptido o multiples polipeptidos (p. ej., una molecula de anticuerpo que contiene cadenas pesadas y ligeras, o porciones de los mismos) que son al menos 50 aminoacidos de longitud.

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Las formulaciones tambien se pueden utilizar para almacenar polipeptidos que se conjugan con un resto peptidico o no peptfdico. Ejemplos de tales restos incluyen, sin limitacion, una molecula fluorescente (por ejemplo, fluorescema, rodamina, protema verde fluorescente (PVF), protema roja fluorescente (PRF), Cy3, Cy3.5, Cy5, o Cy5.5), un resto elemental (p. ej., partmulas de oro), un farmaco, o una toxina. Los procedimientos de conjugacion de dichas moleculas con un polipeptido se conocen en la materia. Los ejemplos de moleculas incluyen, sin limitacion, ricina (Mansfield y col., 1997, Blood 90: 2020-2026; Ghetie y col., 1991, Cancer Res. 51:5876; Conry y col., 1995, J. Immunother. Emphas. Tumor Immunol. 18:231-241), exotoxina A Pseudomonas (EP) (Smith, 2001, Seattle Genetics Curr. Opin. Investig. Drugs 2(9):1314-1319; Mansfield y col, 1996, Bioconjug. Chem. 7:557), taxano (es decir, paclitaxel) (Guillemard y col., 2001, Cancer Res. 61: 694-699), doxorrubicina (Shouval y col., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. EE. UU. 85:8276-8280; Takahashi y col., 1996, Anticancer Drugs 7(6):687-696; shih y col., 1991, Cancer Res. 51(16):4192-4198; Shih y col., 1994, Cancer Immunol. Immunother. 38(2):92-98; Alexandru y col., 1999, Cancer Res. 59:115-121; Trail y col., 1993, Science 261:212-215), antracenos (Dias y col., 2005, Bioconjugate Chem. 16:949-958), maitansinoide (Tassone y col., 2004, Cancer Res. 64:4629-4636; Tolcher y col., 2003, J. Clin. Oncol. 21(2):211-222), adriamicina (Hurwitz y col., 1983, Ann. N.Y. Acad. Sci. 417:125-36; Takahashi y col., 1988, Gan No Rinsho 34:847-50; Deguchi y col., 1987, J. Urol. 137(2):353-358), radioisotopos (Karube y col., 1996, Nuclear Med. Biol. 23:753-759; Mishra y col., 2004, J. Drug Target. 12(9-10):559-567; Lee y col., 2001, Cancer Res. 61:44744482), metotrexato (Ryser y col., 1988 J. Cell Physiol. 135(2):277-284; Mandel y col., 1991, J. Cell Physiol. 149(1):60-65), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N'N"N,"-tetraacetico (DOTA), p. ej., conjugado con otro resto, tal como itrio 90 (Lu y col., 2005, J. Pharm. Sci. 94(4):788-797), estreptavidina (Ngai y col., 1995, Nucl. Med. Biol. 22(1), 77-86), productos conjugados con radioisotopos (p. ej., los que figuran en Biopharmaceutical Products in the U.S. market, 4a edicion, Rader, ed., Biotechnology Information Institute, Rockville, MD, 2005), incluyendo tecnecio (Tc) 99m, itrio, y radioconjugados In111.

En general, el componente proteico de una formulacion es una protema que tiene un pl relativamente alto, por ejemplo, un pl de al menos 6,0, 7,0, 8,0, u 8,5. La protema puede tener mas de una cadena peptfdica al igual que en un anticuerpo. Cuando el componente proteico de una formulacion es un anticuerpo, el anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, o un fragmento del mismo (p. ej., un fragmento Fab). Una protema puede estar presente en una formulacion a una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, o aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. Los anticuerpos espedficos utilizados en las formulaciones descritas en la presente memoria son un anticuerpo anti-CD22 monoclonal humanizado, un anticuerpo anti-Lewis Y monoclonal, y un anticuerpo anti-5T4.

Una protema aislada utilizada en una formulacion es generalmente una protema que tiene potencial como agente terapeutico o potencial para formar parte de un agente terapeutico. Tales protemas se denominan en la presente memoria como una protema terapeutica e incluyen anticuerpos.

Los ejemplos de protemas espedficas que se pueden utilizar como se describe en la presente memoria incluyen anticuerpos, tales como anti-CD-22 (vease los documentos US20040082764A1 y US20040192900A1), anti-Lewis Y (documento WO 05/019271A1), y anti-5T4 (vease el documento US n.° de serie 60/608494).

PH

Condiciones de pH favorables para una formulacion se comprenden entre aproximadamente un pH 4,0 a pH 8,0. En general, el pH es de aproximadamente 5,5-6,0. A un pH de aproximadamente 5,5-6,0, una formulacion que contiene un anticuerpo monoclonal puede almacenarse y retener la estabilidad durante al menos tres meses, p. ej., seis meses, un ano, o dos anos a 0 °C a aproximadamente 8 °C (generalmente a aproximadamente 1 °C a aproximadamente 5 °C), y para el almacenamiento a largo plazo (durante al menos tres anos, cinco anos, siete anos, o diez anos), p. ej., a -80 °C.

Identificacion de las formulaciones favorables

En algunos procedimientos descritos en la presente memoria, se identifica una formulacion favorable para una protema de interes espedfica. En estos procedimientos, una protema aislada, p. ej., una protema terapeutica, tal como un anticuerpo, se identifica para almacenarse en una formulacion, tal como la descrita en la presente memoria. La protema puede ser un anticuerpo que se va a almacenar hasta que se pueda utilizar para el procesamiento corriente abajo, tal como para la fabricacion de un anticuerpo conjugado con una citotoxina (p. ej., caliqueamicina) para su uso como agente terapeutico. Otros ejemplos incluyen el almacenamiento de un anticuerpo que se va a conjugar con un marcador detectable, tal como fluorescema, rodamina, o la conjugacion con polietilenglicol seguido por liofilizacion para un almacenamiento mayor del anticuerpo.

Para identificar una formulacion favorable para el almacenamiento de la protema aislada, la protema se suspende en general en una serie de soluciones de ensayo a un pH que oscila de aproximadamente 4,0-8,0 (p. ej., pH 5,0-6,0) y concentraciones de sal que oscilan de aproximadamente 0 mM-150 mM. Estas soluciones de ensayo se almacenan

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a diversas temperaturas durante un periodo de tiempo especificado o por varios momentos diferentes (p. ej., tres d^as, dos semanas o cuatro semanas). Las muestras se evaluan a continuacion para al menos un parametro de estabilidad, tal como especies de alto peso molecular, especies de bajo peso molecular, un cambio en el porcentaje de especies acidas, o un cambio en la cantidad de agregados y especies de alto peso molecular. Las muestras en las que el componente proteico de la formulacion es estable se seleccionan entonces como formulaciones favorables para el almacenamiento de las especies. Evaluaciones adicionales pueden llevarse a cabo para evaluar otros parametros de estabilidad, tales como la estabilidad despues de ciclos de congelacion-descongelacion o despues de la agitacion (sacudida). Los ejemplos proporcionados supra proporcionan una grna adicional para procedimientos de identificacion de una formulacion favorable para el almacenamiento de una protema aislada espedfica.

Procedimientos de almacenamiento de una protema

Los procedimientos de almacenamiento de protemas o peptidos (p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, o protemas conjugadas con un peptido o resto no peptfdico) se proporcionan en la presente memoria. Los procedimientos son particularmente utiles para el almacenamiento de una protema, tal como un anticuerpo hasta que sean necesarios para la fabricacion adicional, p. ej., para la fabricacion de un farmaco conjugado con una citotoxina o para la fabricacion de un reactivo marcado de forma detectable, o para el almacenamiento de una protema que se ha modificado, por ejemplo, por conjugacion con un peptido o resto no peptfdico.

El almacenamiento de una protema (p. ej., anticuerpo) como parte de una formulacion reivindicada proporciona una mayor flexibilidad para el procesamiento corriente abajo en comparacion con formulaciones que contienen agentes estabilizadores y/o crioprotectores.

Una formulacion tambien puede utilizarse para proporcionar, p. ej., una sustancia de farmaco de anticuerpo monoclonal estable, o formulacion intermedia de sustancia de farmaco para un procesamiento adicional, tal como por conjugacion con potentes agentes anti-cancer, liofilizacion, o formulacion lfquida para administracion parental. En general, el procedimiento incluye el almacenamiento de una protema aislada seleccionada como parte de una solucion acuosa que no incluye un tensioactivo, no incluye un crioconservante, y tiene una concentracion de tampon relativamente baja (p. ej., aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM). En general, la concentracion de sal de la formulacion es relativamente baja, generalmente menos de aproximadamente 100 mM, p. ej., aproximadamente 0 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 5 mM a aproximadamente 10 mM.

Ademas de las ventajas descritas supra y aquellas que resultan de las reivindicaciones, las protemas almacenadas que se describen en la presente memoria tienen una buena reproducibilidad entre las muestras (p. ej., muestras proteicas a partir de una sola preparacion que se alicuota y las almuotas se almacenaron utilizando una formulacion descrita en la presente memoria). Ademas, las protemas almacenadas como se describe en la presente memoria son generalmente procesadas posteriormente de manera eficiente al almacenamiento, por ejemplo se conjugan mas eficientemente que las protemas almacenadas con crioprotectores y/o tensioactivos.

Ejemplos

La divulgacion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos. No deben interpretarse como limitantes del ambito o contenido de la invencion de modo alguno.

Ejemplo 1: pH

Anti-Lewis Y (ejemplo de referencia)

Para investigar el intervalo de pH en el que un anticuerpo es estable, las muestras de 1 mg/ml de anti-Lewis Y se prepararon en un intervalo de pH de 4 a 8, espedficamente a pH 4,0, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, y 8,0. En este Ejemplo y los descritos a continuacion, las muestras se preparan generalmente en viales PFA de 5 ml de Teflon® (Cole- Parmer, Vernon Hills, IL), p. ej., con un volumen total de muestra de 2 ml. Las concentraciones proteicas se determinaron utilizando absorbancia UV a 280 nm medida con un espectrofotometro Spectra Max® PLUS (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) para analizar las muestras en placas de UV de 96 pocillos Costar® (Corning, Corning, NY). La concentracion proteica se calculo utilizando el coeficiente de absorbancia espedfica de 1,36 (mg/ml)-1 cm-1. Las muestras se prepararon por dialisis en tampones pH que contienen tampon fosfato de potasio 10 mM del pH seleccionado. Cada muestra tambien contema NaCl 75 mM. Las muestras preparadas se filtraron de forma esteril y se colocaron en un congelador a -80 °C o en una camara de estabilidad mantenida a 5 °C o 40 °C. Despues de cuatro semanas, las muestras se analizaron para la presencia de especies de alto peso molecular y especies de bajo peso molecular utilizando CET-HPLC (cromatograffa de exclusion por tamanos-cromatograffa lfquida de alta resolucion). El analisis por CET-HPLC se realizo utilizando TosoHaas (Montgomeryville, PA) BIOSEP G3000SWxl como la columna de separacion utilizando procedimientos conocidos en la materia.

Las muestras congeladas se descongelaron en un bano de agua a 37 °C antes de analisis.

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El surgimiento de especies de alto peso molecular aumenta con el pH, pero las especies de alto peso molecular no fueron un producto principal de degradacion como funcion del pH (Fig. 1A). El perfil de pH de las especies de bajo peso molecular para las muestras almacenadas a 40 °C tema forma de V, con el mmimo de especies de bajo peso molecular a pH 5,5 (Fig. 1B). Por lo tanto, el anticuerpo anti-Lewis Y era estable a un intervalo de temperatura de - 80 °C a 5 °C y durante un intervalo de pH de aproximadamente pH 4,0 a 8,0.

CIC-HPLC (cromatograffa de intercambio cationico-HPLC) se utilizo para evaluar aun mas la estabilidad de las muestras. Estos analisis se realizaron empleando una columna Dionex ProPac WCX-10 (Sunnyvale, CA). Se descubrio que la concentracion de especies acidas aumento a un pH alto en las muestras almacenadas a 40 °C. (Fig. 2). No obstante, para las muestras almacenadas a 5 °C y -80 °C, el anti-Lewis Y era estable en todo el intervalo de pH, lo que confirma las conclusiones extrafdas de los datos de CIC-HPLC.

Como otro procedimiento para evaluar la estabilidad, se utilizo SDS-PAGE para analizar mas a fondo las muestras almacenadas a 40 °C utilizando geles al 4-20 % ejecutados en condiciones reducidas o no reducidas. En estos experimentos, se demostro que la menor cantidad de cambio en el peso molecular, y por lo tanto la mayor parte de la estabilidad, era de esas muestras en el intervalo de pH de 5,0-6,0 (Fig. 3). Por lo tanto, las muestras (p. ej., anticuerpos) que se van a almacenar a 40 °C se mantienen mejor a un pH comprendido entre aproximadamente 5,0

y 6,0.

La electroforesis por isoelectroenfoque (IEE) se utilizo para evaluar aun mas las muestras almacenadas a 40 °C. La electroforesis por IEE se utilizo para supervisar los cambios en pi de las muestras de anticuerpos debido a la produccion de especies acidas como resultado de la degradacion de protemas.

Acorde con los resultados del analisis por SDS-PAGE de las muestras de anticuerpo, esas muestras en el intervalo de pH de 5,0-5,5 mostraron la menor cantidad de cambio en la carga general de protemas (Fig. 4).

Un aspecto importante de almacenamiento es la estabilidad del pH de una formulacion con el tiempo. Por lo tanto, el pH de las muestras se analizo al inicio del experimento, despues de dos semanas, y despues de cuatro semanas de almacenamiento en tres temperaturas. No habfa desviacion alguna significativa del pH de partida en ninguna de las muestras (Tabla 1).

Tabla 1: medicion del pH de las muestras de estabilidad por deteccion del pH de anti-Lewis Y

pH diana: pH medido

Tiempo 0: 2 semanas 4 semanas

-80 °C: 5 °C 40 °C -80 °C 5 °C 40 °C

4,00: 4,01 4,01 4,02 4,02 4,05 4,07 4,03

5,00: 5,01 5,02 5,01 5,02 5,07 5,06 5,02

5,50: 5,51 5,52 5,52 5,52 5,55 5,57 5,54

6,00
6,00: 5,99 5,99 6,00 6,04 6,06 6,02

6,50: 6,51 6,51 6,51 6,50 6,55 6,56 6,53

7,00: 7,03 7,03 7,00 6,99 7,04 7,05 7,01

8,00: 8,01 7,97 7,96 7,92 7,97 7,97 7,91

Juntos, los datos presentados supra demuestran que el anti-Lewis Y es estable en un intervalo de temperatura de - 80 °C a 5 °C y en un intervalo de pH de 4-8. En general, un pH favorable para el almacenamiento de este anticuerpo es de aproximadamente 5,5. Esto tambien proporciona condiciones relativamente favorables para el almacenamiento del anticuerpo a 40 °C.

En general, se selecciona un pH para el almacenamiento de protemas que resulta en la estabilidad en un intervalo de dos o mas temperaturas, por ejemplo, cuando la muestra se almacena por debajo de 0 °C, cuando la muestra se almacena entre aproximadamente 0 °C y 15 °C, y cuando la muestra se almacena entre aproximadamente 15 °C y 40 °C. En otro ejemplo no limitativo, cuando la muestra se almacena a aproximadamente -80 °C, 5 °C, y 40 °C.

Anti-CD22

Los efectos del pH sobre el almacenamiento de un segundo anticuerpo (anti-CD22), un anticuerpo IgG4 humanizado que se orienta selectivamente a CD22, que se expresa en la superficie de linfocitos B maduros normales y malignos, se ensayaron tambien. El pi teorico del anti-CD22 es de aproximadamente 8,5. Considerando que es probable que la hidrolisis se produzca a pH 5,0 y por debajo, la desamidacion es probable a un pH superior a 7,5. Por lo tanto, se disenaron experimentos para abarcar un intervalo de pH de 4 a 8 para ensayar el efecto del pH sobre la estabilidad de la protema, para evaluar la capacidad de indicador de la estabilidad de los procedimientos analfticos, y para proporcionar un fundamento para la seleccion del pH apropiado para una formulacion de almacenamiento proteico.

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Las muestras que contienen anti-CD22 se prepararon con un contenido de 0,5 mg/ml de anti-CD22 en diversos tampones a los valores de pH a ensayar. Las muestras se almacenaron durante dos semanas a 5 °C, 25 °C, o 40 °C, a un pH de 4,0 (succinato 10 mM), 5,0 (citrato 10 mM), 5,5 (succinato 10 mM), 6,0 (histidina 10 mM), 6,5 (histidina 10 mM), 7,0 (fosfato 10 mM), u 8,0 (Tris 10 mM). Las muestras se analizaron para el porcentaje de especies de alto peso molecular presentes utilizando CET-HPLC. En estas muestras (que contienen cada una 0,5 mg/ml de anti- CD22), no hubo aumento significativo en el porcentaje de especies de alto peso molecular en las muestras en el intervalo de pH de 5,0 a 8,0 en comparacion con la cantidad presente en las condiciones iniciales despues de dos semanas (Fig. 5).

Cuando un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-CD22 se utiliza para un procesamiento adicional (corriente abajo), se ha de prestar atencion a la presentacion de la sustancia intermedia en un tampon apropiado para el procesamiento adicional. Por ejemplo, la conjugacion de caliqueamicina con un anticuerpo anti-CD22 puede realizarse en un tampon que no contiene amina primaria a un pH 7 a 8,5. Sin embargo, puede que no sea necesario para la sustancia intermedia que se proporciona en el tampon de conjugacion. En este ejemplo, la formulacion de la sustancia intermedia se vera limitada en que las aminas primarias en los componentes del tampon podnan interferir con el procedimiento de conjugacion. Para investigar el almacenamiento de protemas en una solucion que no contiene aminas primarias, se llevaron a cabo experimentos en los que anti-CD22 se concentro a 25 mg/ml y se diafiltro o dializo en cualquiera de HEPES 50 mM (pH 7,6), succinato 50 mM (pH 6,0), o succinato 50 mM + HEPES 50 mM (pH 7,0). Cada muestra se ensayo durante hasta dos semanas para la estabilidad. Las muestras se prepararon con o sin NaCl 75 mM y se almacenaron a -80 °C, 4 °C, o 40 °C. Las muestras se analizaron en el tiempo = 0, una semana, y dos semanas por A280/A320, CET-HPLC, SDS-PAGE, e IEE (en dos semanas).

Los datos de estos experimentos demostraron que el pH 6,0 (tampon succinato) proporciona una mayor estabilidad que pH 7,0 (HEPES) o una combinacion a pH 7,6 (HEPES y succinato) (Fig. 6).

CET-HPLC tambien se utilizo para evaluar el porcentaje de especies de alto peso molecular en muestras que conteman 25 mg/ml de anti-CD22 a pH 6,0, 7,0, o 7,6 en succinato, HEPES, o una combinacion (como se ha descrito supra) que se almaceno durante dos semanas a -80 °C, 5 °C, o 40 °C, en presencia o ausencia de NaCl 75 mM. Estos datos demostraron que la sal (NaCl) no tuvo ningun efecto significativo sobre la formacion de especies de alto peso molecular en estas muestras (Fig. 6). Por lo tanto, la presencia de sal no es una condicion esencial para el almacenamiento de anticuerpos.

Ejemplo 2: pH/tampones (ejemplo de referencia)

Para determinar si diferentes tampones proporcionan condiciones de almacenamiento favorables a diferentes pH, tampones se ensayaron a un pH de 0,5 unidades por encima y por debajo del pH "optimo" tentativo utilizando el anticuerpo anti-Lewis Y como la muestra almacenada. En estos experimentos, cuatro sistemas tampon diferentes se ensayaron en el intervalo de pH de 5,0 a 6,0. Tambien se evaluo el efecto de varias fuerzas ionicas sobre la estabilidad. Los tampones utilizados en estos experimentos fueron acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, 5,5, y 6,0; 10 mM de acetato de sodio, NaCl 75 mM, pH 5,0, 5,5 y 6,0; citrato de sodio 10 mM, pH 5,0, 5,5, y 6,0; citrato de sodio 10 mM, NaCl 75 mM, pH 5,0, 5,5 y 6,0; fosfato de sodio 10 mM, pH 5,0, 5,5, y 6,0; fosfato de sodio 10 mM, NaCl 75 mM, pH 5,0, 5,5, y 6,0; succinato de sodio 10 mM, pH 5,0, 5,5, y 6,0; y succinato de sodio 10 mM, NaCl 75 mM, pH 5,0, 5,5, y 6,0. En estos experimentos, anti-Lewis Y se dializo en los tampones anteriores y se diluyo a una concentracion final de 1 mg/ml. Las muestras se almacenaron a -80 °C o 40 °C durante hasta 4 semanas, y luego se analizaron para el porcentaje de especies de alto peso molecular y el porcentaje de especies de bajo peso molecular utilizando CET-HPLC. En estos experimentos, se descubrio que las especies de alto peso molecular no eran el principal producto de degradacion, y la diferencia en el nivel de especies de alto peso molecular entre las diferentes formulaciones fue insignificante (Fig. 7A). A un pH 5,5, la muestra de citrato de sodio demostro el nivel mas bajo de las especies de bajo peso molecular entre todos los tampones (con o sin adicion de NaCl) (Fig. 7B).

Las muestras se analizaron adicionalmente utilizando CIC-HPLC. Estos datos confirmaron las observaciones generales de los datos de CET-HPLC en que no hubo un aumento del porcentaje de especies acidas presentes en el de las muestras de pH mayores en los cuatro tampones ensayados (Fig. 8), Es decir, hay una tendencia al alza de especies acidas para todos los tampones en el intervalo de pH de 5,0 a 6,0.

Estos datos demuestran que, en general, la estabilidad de anti-Lewis Y fue similar en los cuatro tampones ensayados (acetato, citrato, fosfato y succinato Na) en un intervalo de pH de 5,0 a 6,0. Ademas, en el estudio de estabilidad acelerada (examen de la estabilidad a 40 °C; Fig. 7B), la cantidad inferior de formacion de especies de bajo peso molecular estaba en la muestra que contema tampon citrato Na. Por lo tanto, un tampon favorable para el anti-Lewis Y es citrato Na 10 mM, pH 5,5. Estos datos tambien demuestran un procedimiento de identificacion de una formulacion favorable para el almacenamiento de una protema, tal como un anticuerpo.

Ejemplo 3 Concentracion de sal y concentracion de protemas (ejemplo de referencia)

La concentracion de sal se examino como un parametro que puede tener un efecto sobre la estabilidad de una protema en una formulacion de almacenamiento. La estabilidad de almacenamiento a una baja concentracion de protemas se evaluo tambien en el protocolo de degradacion acelerada descrito en el Ejemplo 2. En estos

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experimented, se descubrio que a una concentracion de protemas de 1 mg/ml, la adicion de NaCI promovio ligeramente la formacion de especies de bajo peso molecular (Fig. 7B) mientras se suprime la formacion de especies acidas (Fig. 8) en todos los buferes sometidos a ensayo.

CIC-HPLC y CET-HPLC se utilizaron para evaluar la estabilidad de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 que contema diferentes molaridades de NaCl. Estos datos demostraron que el anti-Lewis Y era estable a 5 °C y -80 °C en citrato Na 10 mM, pH 5,5 que contema NaCl 0-150 mM (Fig. 9A). La degradacion acelerada muestra a 30 mg/ml la concentracion de protemas, NaCl suprime la aparicion de especies acidas (Fig. 9A) pero la formacion elevada de especies de bajo peso molecular (Fig. 9C) y la formacion de especies de alto peso molecular eran relativamente estables en las diferentes condiciones (Fig. 9B), lo que confirma la observacion de las muestras que contienen 1 mg/ml de protemas (Figs. 7 y 8). De este modo, se descubrio que una concentracion de sal de NaCl 75 mM era la mas favorable para minimizar la degradacion general.

Estabilidad con sacudida (ejemplo de referencia)

Otra condicion que puede afectar a la estabilidad de una protema es la cantidad de agitacion experimentada por la muestra. Por lo tanto, es deseable que una formulacion de almacenamiento conserve una cierta cantidad de estabilidad cuando se agite la muestra. Se realizaron experimentos para ensayar la estabilidad de anti-Lewis Y en una formulacion en diversas condiciones y se incubo con agitacion. En estos experimentos, las formulaciones que conteman o bien 1 mg/ml o bien 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 en presencia o ausencia de NaCl 150 mM se ensayaron mediante sacudidas a 360 rpm durante 24 horas a temperatura ambiente y el porcentaje de recuperacion de monomeros se ensayo utilizando CET-HPLC.

Estos experimentos demostraron que el anticuerpo era estable cuando esta presente a una concentracion de 30 mg/ml cuando se somete a sacudida (Fig. 10). Se descubrio tambien que a 1 mg/ml, NaCl redujo ligeramente la recuperacion de monomeros.

Por consiguiente, la formulacion de almacenamiento simple puede proporcionar una proteccion suficiente del esfuerzo a la muestra inducida por sacudida.

Estabilidad bajo congelamiento/descongelamiento (ejemplo de referencia)

Las protemas que se utilizan para diversos procedimientos de fabricacion pueden someterse necesariamente a ciclos de congelacion-descongelacion, de hecho, a veces a multiples ciclos de congelacion-descongelacion. Resulta, por lo tanto, ventajoso para una formulacion de almacenamiento proporcionar condiciones en las que hay una minima degradacion causada por los ciclos de congelacion-descongelacion. Ademas, es util para determinar que condiciones de congelacion y descongelacion proporcionan una conservacion optima de la protema. Para ensayar estos parametros, se prepararon muestras que conteman anti-Lewis Y a 1 mg/ml o 30 mg/ml en citrato Na 10 mM, pH 5,5, en presencia o ausencia de NaCl 150 mM. Estas muestras se sometieron despues a diez ciclos de congelacion-descongelacion con condiciones de congelacion rapida/descongelacion rapida, congelacion rapida/descongelacion lenta, congelacion lenta/descongelacion rapida, o congelacion lenta/descongelacion lenta. La congelacion rapida se realizo por congelacion de la muestra en nitrogeno lfquido y la congelacion lenta se realizo colocando la muestra a -80 °C. La descongelacion rapida se realizo descongelando la muestra en un bano de agua a 37 °C y la descongelacion lenta se realizo colocando la muestra a temperatura ambiente. Se evaluo entonces la cantidad de monomeros en cada muestra utilizando CET-HPLC.

Los resultados de estos experimentos mostraron que el anti-Lewis Y era estable en una alta concentracion de protemas (30 mg/ml) independientemente de las condiciones de congelacion/descongelacion o la concentracion de NaCl (Fig. 11A y Fig. 11B). El anti-Lewis Y era estable en condiciones de congelacion lenta, independientemente de la concentracion de protemas, las condiciones de descongelacion, o la concentracion de NaCl. No obstante, a 1 mg/ml, NaCl en la formulacion reduce ligeramente la recuperacion en condiciones de congelacion rapida.

En vista de lo anterior, se puede concluir que el anti-Lewis Y es estable a -80 °C y 5 °C en una concentracion de NaCl que oscila de 0 mM-150 mM. Ademas, un estudio de estabilidad acelerada (un estudio de formulaciones a 40 °C) mostro que NaCl redujo ligeramente la formacion de especies acidas, mientras que promovio una aparicion de especies de bajo peso molecular. En vista de estos resultados, se descubrio que NaCl 75 mM era optimo para minimizar la degradacion general del anti-Lewis Y.

Estos experimentos demuestran tambien procedimientos para identificar condiciones favorables para una protema espedfica que se almacena en una formulacion descrita en la presente memoria.

Anti-CD22

Para examinar la variabilidad de las condiciones de almacenamiento entre diferentes protemas y validar aun mas los procedimientos de identificacion de formulaciones de almacenamiento para una protema espedfica, se investigo la estabilidad de almacenamiento de un anti-CD22. En estos experimentos, las formulaciones que contienen 25 mg/ml de anti-CD22 (Fig. 6) se prepararon en diversos tampones para conseguir el pH deseado; pH 6,0 (succinato 50 mM); pH 7,0 (succinato 50 mM y HEPES 50 mM); pH 7,6 (HEPES 50 mM), y se almacenaron durante un mes a -80 °C,

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5 °C, 25 °C, o 40 °C, despues se evaluaron para el porcentaje de especies de alto peso molecular.

Se descubrio que NaCl no tuvo efecto alguno sobre la estabilidad de almacenamiento de anti-CD22 en altas concentraciones de protemas (Fig. 6 y Fig. 12) en cualquiera de las temperatures ensayadas.

Estabilidad baio tension por sacudida

Un estudio de sacudida se realizo para determinar los efectos de interaccion de superficie/aire en anti-CD22 en presencia de NaCl y polisorbato 80. Este estudio tambien se realizo para evaluar la estabilidad de anti-CD22 como un lfquido durante el envfo y la fabricacion. En estos experimentos, se prepararon muestras que conteman 15 mg/ml de anti-CD22 en tampon succinato 20 mM, pH 6,0, una adicion de NaCl 75 mM, polisorbato 80 al 0,1 %, o NaCl 75 mM mas polisorbato 80 al 0,1 %. (Tween) Las muestras se sacudieron a 300 rpm durante 24 horas. Asimismo se preparo un control que conterna solo el anti-CD22 en tampon succinato. A continuacion, se analizo el porcentaje de especies de alto peso molecular. Estos datos demuestran que ni NaCl ni polisorbato 80 son beneficiosos para la estabilidad de anti-CD22 durante la sacudida (Fig. 13).

En general, los datos presentados anteriormente para anti-CD22 en una formulacion de almacenamiento demuestran que NaCl no tiene efecto alguno sustancial sobre la estabilidad general de anti-CD22. Por lo tanto, NaCl no es necesario en la formulacion con anti-CD22.

Ejemplo 4: Concentracion de anticuerpos (ejemplo de referencia)

Se examinaron los efectos de la concentracion de protemas en la estabilidad de almacenamiento de una formulacion. La determinacion de una concentracion de protemas favorable es deseable cuando se identifica una formulacion de almacenamiento para una protema espedfica, asf como el descubrimiento de los principios generales relativos a la importancia de este parametro en una formulacion.

En estos experimentos, se prepararon muestras que conteman anti-Lewis Y en citrato 10 mM, pH 5,5 a una concentracion de 1 mg/ml o 30 mg/ml y que conterna o bien muestras sin NaCl o NaCl 75 mM. Las muestras se almacenaron durante cuatro semanas a 40 °C, despues se analizaron para el cambio en el porcentaje de especies de alto peso molecular (Fig. 14A), para el cambio en el porcentaje de especies de bajo peso molecular (Fig. 14B), y para el cambio en el porcentaje de especies acidas (Fig. 14C).

Los resultados de estos experimentos revelaron estabilidad comparable para formulaciones que conteman 1 mg/ml y 30 mg/ml, con la concentracion mas baja (1 mg/ml) solo ligeramente mas sensible a la presencia de NaCl.

La estabilidad sostenida es particularmente deseable en una formulacion de almacenamiento. Por consiguiente, se llevo a cabo un estudio para determinar la estabilidad de formulaciones de 30 mg/ml de anti-Lewis Y que conteman 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM a diversas temperaturas: -80 °C, -20 °C, 5 °C, 25 °C, y 40 °C. Las muestras se ensayaron en un mes, dos meses, tres meses, seis meses, y nueve meses para el porcentaje de especies de alto peso molecular (Fig. 15A), el porcentaje de especies de bajo peso molecular (Fig. 15B), y el porcentaje de especies acidas (Fig. 15C). El analisis de estos datos demostraron que habfa una buena estabilidad de protemas de anti-Lewis Y despues de 9 meses de almacenamiento a un intervalo de temperatura de - 80 °C a 5 °C en la formulacion de citrato Na 10 mM, NaCl 75 mM, pH 5,5.

Congelacion/descongelacion y estabilidad a las sacudidas (ejemplo de referencia)

Como se ha mostrado anteriormente, (Fig. 10 y Fig. 11), pareda que anti-Lewis Y no era sensible a la tension por sacudidas y por congelacion/descongelacion a una concentracion de 30 mg/ml. Ademas, el anti-Lewis Y no fue sensible en la reduccion de la congelacion lenta a una concentracion de 1 mg/ml independientemente de la velocidad de descongelacion, pero la perdida de la protema se descubrio a una concentracion de 1 mg/ml de antiLewis Y con agitacion asf como cuando se coloca en condiciones de congelacion rapida.

Anti-CD22/congelaci6n/descongelaci6n

Para investigar mas los efectos de los ciclos de congelacion-descongelacion, anti-CD22 a una concentracion de 1 mg/ml o 25 mg/ml en succinato 20 mM, pH 6,0 y, opcionalmente, que contiene polisorbato 80 (0,001 %), se sometio a varios regfmenes de congelacion-descongelacion y cero, uno, cinco, o 10 ciclos del regimen. Los regfmenes eran congelacion rapida/descongelacion rapida (CR/DR), congelacion rapida/descongelacion lenta (CR/DL), congelacion lenta/descongelacion rapida (CL/DR), y congelacion lenta/descongelacion lenta (CL/DL). A continuacion, se analizo el porcentaje de especies de APM.

Estos datos demuestran que a 25 mg/ml, anti-CD22 no es sensible a tension por congelacion/descongelacion, independientemente de la presencia de polisorbato 80 (Fig. 16B y Fig. 16D). No obstante, a una concentracion de 1 mg/ml, anti-CD22 es sensible a una congelacion rapida (Fig. 16A y Fig. 16C). De este modo, para este anticuerpo, si la muestra se somete a ciclos de congelacion-descongelacion, una concentracion de almacenamiento superior ha de seleccionarse aunque no es necesario incluir un tensioactivo.

Estabilidad de almacenamiento

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Las Figs. 5 y 6, muestran los resultados de experimentos que demuestran que anti-CD22 es estable a -80 °C a 5 °C a 0,5 mg/ml y a 30 mg/ml. A 40 °C, el porcentaje de especies de alto peso molecular aumento en la muestra que contiene la concentracion de protema mas alta despues de dos semanas de almacenamiento (Fig. 6), mientras que no se detecto cambio alguno en el porcentaje de especies de alto peso molecular en muestras que contienen concentraciones bajas de protema (Fig. 5).

Ejemplo 5: Efectos del tensioactivo (ejemplo de referencia)

Muchos protocolos para el almacenamiento de muestras de protemas requieren la inclusion de un tensioactivo. Por lo tanto, se investigo la necesidad de incluir tensioactivo en una formulacion de almacenamiento. En estos experimentos, el anticuerpo anti-Lewis Y a una concentracion de 1 mg/ml o 30 mg/ml en un tampon de citrato Na 10 mM y, opcionalmente, que contiene polisorbato 80 al 0 %, 0,001 %, 0,005 % o 0,01 %, se incubo con sacudida a 360 rpm a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuacion, el porcentaje de recuperacion de monomeros se analizo utilizando CET-HPLC.

Los datos demostraron que no se requiere polisorbato 80 cuando esta presente en la protema de la formulacion a una concentracion relativamente alta de 30 mg/ml de la protema. A 1 mg/ml, polisorbato 80 proporciono una cierta proteccion de anti-Lewis Y contra la tension por agitacion (Fig. 17A y Fig. 17B).

Estabilidad por congelacion/descongelacidn (ejemplo de referencia)

Se examino el efecto de polisorbato 80 en la estabilidad de anti-Lewis Y durante las diversas condiciones de congelacion/descongelacion. En estos experimentos, se prepararon muestras que contienen o bien 1 mg/ml o bien 30 mg/ml de anticuerpo anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5, y que no contiene polisorbato 80 o polisorbato 80 al 0,01 %. Las muestras se sometieron a continuacion a 10 ciclos de congelacion/descongelacion como se ha descrito anteriormente.

A 30 mg/ml, anti-Lewis Y no fue sensible a tension por congelacion/descongelacion independientemente de la presencia de tensioactivo (Fig. 18B). Anti-Lewis Y tambien era estable en condiciones de congelacion lenta, independientemente de la concentracion de protema o condiciones de descongelacion (Fig. 18A y Fig. 18B). Polisorbato 80 no afecto a los resultados a 30 mg/ml de concentracion proteica o si se utilizo congelacion lenta. En las muestras que contienen 1 mg/ml de anticuerpo, polisorbato 80 protegio anti-Lewis Y en condiciones de congelacion rapida (Fig. 18A).

Estabilidad de almacenamiento (ejemplo de referencia)

Se investigo el efecto del surfactante sobre la estabilidad de almacenamiento de anti-Lewis Y. En estos experimentos, se prepararon muestras que conteman 30 mg/ml de anti-Lewis Y en citrato Na 10 mM, pH 5,5 y NaCl 75 mM. Ademas, las muestras o bien teman polisorbato 80 al 0,001 % o no teman polisorbato 80. Las muestras se incubaron a -80 °C, -20 °C, 5 °C, 25 °C, o 40 °C durante un mes, dos meses, tres meses, seis meses, o nueve meses y se analizo el porcentaje de especies de alto peso molecular, el porcentaje de especies de bajo peso molecular, y el porcentaje de especies acidas como se describe en la presente memoria.

En general, estos experimentos demostraron que el polisorbato 80 no tuvo ningun efecto significativo sobre la estabilidad de anti-Lewis Y en condiciones de ensayo sobre el intervalo completo de temperaturas, -80 °C a 40 °C. (Figs. 19A, 19B, y 19C).

En general, los resultados de experimentos con anti-Lewis Y demuestran que a una concentracion de 30 mg/ml, antiLewis Y es estable en condiciones de agitacion y condiciones de tension por congelacion/descongelacion. El surfactante no es necesario para efectuar esta estabilidad. A una concentracion de 1 mg/ml, anti-Lewis es estable en condiciones de congelacion lenta. El surfactante no es necesario para efectuar esta condicion. Ademas, en una concentracion de anticuerpo de 1 mg/ml, polisorbato 80 protege al anti-Lewis Y contra la agitacion y la congelacion rapida inducida por la desnaturalizacion y, en general, el tensioactivo no tiene ningun efecto significativo sobre la estabilidad de la protema durante el almacenamiento.

Estabilidad de almacenamiento, CD22

En contraste con los resultados con anti-Lewis Y, polisorbato 80 no es totalmente protector con respecto a anti-CD22 contra la tension por sacudida (Fig. 13). No obstante, como se indica en los datos de la Fig. 16, a 25 mg/ml, anti- CD22 es estable en tension por congelacion/descongelacion y no se necesita tensioactivo. A 1 mg/ml, anti-CD22 es estable en condiciones de congelacion lenta y no se necesita tensioactivo. El tensioactivo proporciono proteccion adicional a anti-CD22 solo en condiciones de congelacion rapida.

Para investigar mas a fondo los efectos del surfactante sobre anti-CD22, se desarrollo un estudio de seis meses para la estabilidad de anti-CD22. En estos experimentos, se preparo anti-CD22 a una concentracion de 25 mg/ml de succinato 20 mM, pH 6,0 (S); succinato 20 mM, metionina 10 mM, pH 6,0 (SM); succinato 20 mM, polisorbato 80 al 0,01 %, pH 6,0 (ST); o succinato 20 mM, metionina 10 mM, polisorbato 80 al 0,01 %, pH 6,0 (sMt); y se incubo durante seis meses a -80 °C, 2-8 °C, 25 °C, o 40 °C. Las muestras se analizaron entonces para el porcentaje de

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especies de alto peso molecular, porcentaje del area del pico total (que es una indicacion de recuperacion), y el porcentaje de especies completamente activas. Tenga en cuenta que el pico 5 es la especie totalmente activa.

En general, ninguno de los parametros mostro efecto significativo sobre la estabilidad de anti-CD22 (Fig. 20A, Fig. 20B y Fig. 20C).

En general, tanto los datos de almacenamiento a largo plazo de dos anticuerpos diferentes (un anti-Lewis Y y un anti-CD22) demuestran que el tensioactivo (polisorbato 80) no es necesario para la estabilizacion de anticuerpos en una formulacion de almacenamiento.

Ejemplo 6: Formulacion para el almacenamiento de anti-5T4 (ejemplo de referencia)

Como otro ejemplo de la determinacion de una formulacion para el almacenamiento de una protema, se evaluaron los parametros de la concentracion de sal, pH, concentracion de protemas y tipo de tampon y la concentracion para el almacenamiento de un anticuerpo dirigido contra 5T4.

pH

Para identificar un pH ventajoso que se va a utilizar en una formulacion para el almacenamiento de un anticuerpo anti-5T4, las muestras que contienen 1 mg/ml de anti-5T4 se ensayaron a un intervalo de pH desde pH 4,0 a pH 8,0. Las muestras se prepararon por dialisis en cada tampon de pH. Todas las formulaciones utilizadas en estos experimentos emplearon tampon fosfato de sodio 10 mM con o sin NaCl 150 mM. La protema en una formulacion se esterilizo por filtracion y se coloco en un congelador a -80 °C o en una camara de estabilidad mantenida a 5 °C, 25 °C, o 40 °C. Las muestras se analizaron para la presencia de especies de alto peso molecular (APM) (Fig. 21).

Se descubrio que anti-5T4 tema la menor cantidad de especies de alto peso molecular en ausencia de NaCl a 5 °C, 25 °C, y 40 °C durante todo el intervalo de pH en tampon fosfato de sodio 10 mM. El anticuerpo no era estable a un ciclo de congelacion/descongelacion a pH 7 en una formulacion que contiene NaCl y a un pH 8 con fosfato de sodio como tampon. Tambien se observo que la protema era inestable a pH 4 con NaCl 150 mM a 40 °C.

El isoelectroenfoque (IEE) se realizo en muestras preparadas y almacenadas a varios pHs (como se ha descrito anteriormente) y almacenadas a 40 °C durante dos semanas. Se descubrio que las muestras almacenadas en una formulacion a pH 4 (sin NaCl) y a pH 5 y pH 6 (con o sin NaCl) mostraron la menor cantidad de cambio en la carga general de la protema.

Tambien se realizo un analisis por SDS-PAGE de muestras de deteccion de pH de anti-5T4 almacenadas a 40 °C durante dos semanas. Las muestras en el intervalo de pH del pH 5,0 a pH 7,0 muestran menor cantidad de especies de alto peso molecular en el gel no reducido y la menor cantidad de cambio en el peso molecular de protemas en comparacion con el material de partida en un gel reducido.

Estos datos demuestran que el anti-5T4 es estable en fosfato de sodio 10 mM en presencia o ausencia de NaCl a - 80 °C, 5 °C, y 25 °C en el intervalo de pH de pH 4,0 a pH 7,0. En base a los resultados acelerados (es decir, los resultados obtenidos a temperaturas mas altas) de la deteccion de pH, pH 5 a pH 6 se selecciona como el intervalo de pH ventajoso para la estabilidad de anti-5T4.

Tampones

Cuatro sistemas tampon diferentes se ensayaron para el almacenamiento estable de anti-5T4 en formulaciones en el intervalo de pH de 5,0 a 7,0. Tambien se evaluo el efecto de la fuerza ionica sobre la estabilidad. Estos sistemas tampon utilizados fueron acetato de sodio 10 mM, pH 5,0; acetato de sodio 10 mM 5,5; acetato de sodio 10 mM , NaCl 150 mM, pH 5,0; acetato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5; citrato de sodio 10 mM, pH 5,0; citrato de sodio 10 mM, pH 5,5, citrato de sodio 10 mM, pH 6,0; citrato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,0; citrato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5; citrato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0; fosfato de sodio 10 mM, pH 6,0; fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5; fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0; fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0; fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5; fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0; succinato de sodio 10 mM, pH 5,0; succinato de sodio 10 mM, 5,5; succinato de sodio 10 mM, pH 6,0; succinato de sodio 10 mM, pH 6,5; succinato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,0; succinato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5; succinato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0; y succinato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5.

Anti-5T4 se dializo en los tampones anteriores y se diluyo a una concentracion final de 2 mg/ml. Las muestras se almacenaron a -80 °C y 40 °C durante hasta cuatro semanas, y luego se analizaron utilizando CET-HPLC de muestras iniciales (antes del almacenamiento) y despues del almacenamiento durante cuatro semanas. En estos datos (Fig. 22), se descubrio que las especies de alto peso molecular no eran los principales productos de degradacion y el porcentaje de especies de alto peso molecular en cada formulacion despues de cuatro semanas de almacenamiento era comparable, o menor que, el porcentaje de especies de alto peso molecular presentes en las muestras iniciales. Las especies de bajo peso molecular se elevaron en la mayona de las formulaciones que conteman NaCl.

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Las masas fundidas termicas (Mts) se realizaron para evaluar el efecto del almacenamiento en diversas formulaciones sobre la estabilidad termica de una protema (anti-5T4). La calorimetna diferencial de barrido (CDB) se utilizo para generar termogramas. Ejemplos de tales termogramas se muestran en la Fig. 23A. Los resultados de calorimetna diferencial de barrido se ilustran en la Fig. 23B.

La protema en formulaciones que tienen un pH de 5,0 fueron las menos estables termicamente cuando la formulacion utilizo citrato o succinato como tampon. Se descubrio que NaCl era termicamente desestabilizadora puesto que los valores Mt fueron inferiores en cada condicion de pH/tampon en comparacion con sus correspondientes formulaciones libres de NaCl. Las otras formulaciones en el intervalo de pH de 5,5 a 7,0 en tampones acetato, citrato, succinato, y fosfato exhibieron los valores mas altos de Mts y, por lo tanto, la mayor estabilidad termica.

CIC-HPLC tambien se utilizo para analizar la estabilidad de anti-5T4. En estos estudios, CIC-HPLC se realizo sobre muestras despues de un almacenamiento durante cuatro semanas a 40 °C. Estos resultados se ilustran en la Fig. 25 y demuestran un aumento en el porcentaje de especies acidas y una disminucion en el porcentaje de especies basicas a un pH superior para los cuatro tampones ensayados. Algunas de las formulaciones que contienen NaCl tambien teman niveles mas altos de especies acidas y niveles mas bajos de especies basicas que las formulaciones correspondientes libres de NaCl.

Para analizar adicionalmente la estabilidad de las diversas formulaciones, la reduccion por SDS-PAGE se realizo sobre las muestras despues de un almacenamiento durante cuatro semanas a 40 °C. El analisis de estas muestras demostro que las muestras almacenadas en las formulaciones de pH 5,5 y pH 6,0 retuvieron la menor cantidad de cambio en el peso molecular de protemas en comparacion con el material de partida en el gel reductor.

En general, estos datos demuestran que la protema de anti-5T4 utilizada en estos experimentos tema una estabilidad similar en los cuatro tampones ensayados (acetato, citrato, fosfato y succinato de sodio) cuando se almacenan a un pH de pH 5,5 a 6,5. Un estudio de estabilidad acelerada mostro que la menor cantidad de especies de bajo peso molecular formo las formulaciones que no conteman NaCl.

Efecto de la sal (NaCl)

Como se ha ilustrado anteriormente, anti-5T4 es estable en fosfato de sodio 10 mM en formulaciones a pH 5-6 a - 80 °C, 5 °C, y 25 °C en NaCl 150 mM. No obstante, NaCl no mejoro la estabilidad y, por lo tanto, no proporciono ningun beneficio de estabilidad (Fig. 21).

Los resultados de un estudio de estabilidad acelerada a 40 °C demostraron que NaCl promueve la formacion de alto peso molecular y de bajo peso molecular y reduce la estabilidad termica del anticuerpo (Fig. 22, Fig. 24A, Fig. 24B y Fig. 25).

Concentracion de anticuerpos

Se examinaron los efectos de la concentracion de anticuerpos (protemas) sobre la estabilidad de almacenamiento. En estos experimentos, sistemas de tampon acetato de sodio, citrato de sodio, y succinato de sodio, se ensayaron de nuevo con un estrecho intervalo de pH; a partir 5,5 a 6,5. Anti-5T4 se dializo en los tampones y se diluyo a una concentracion final de 2 mg/ml. Un conjunto adicional de las muestras se preparo con una concentracion de 30 mg/ml en citrato o succinato. Las muestras se almacenaron a -80 °C y 40 °C durante hasta seis semanas, y luego se analizaron. La Fig. 26A y Fig. 26B ilustran los resultados del analisis por CET-HPLC de estas muestras. En general, estos datos demuestran que se observa una estabilidad comparable para las formulaciones de 2 mg/ml y 30 mg/ml, aunque la concentracion de protema mas alta acumulo una cantidad ligeramente mayor de especies de alto peso molecular despues de seis semanas a 40 °C.

CIC-HPLC tambien se realizo en estas muestras despues de 6 semanas de almacenamiento a 40 °C. La estabilidad comparable fue observada para formulaciones de pH 5,5 que contienen 2 mg/ml o 30 mg/ml, aunque las muestras de pH 5,5 a 2 mg/ml tuvieron un porcentaje ligeramente menor de especies acidas despues del almacenamiento durante seis semanas a 40 °C. (Fig. 27A y 27B).

Tambien se utilizo electroforesis capilar-SDS (ec-SDS; un procedimiento equivalente a SDS-PAGE) para analizar las muestras de 2 mg/ml que se almacenaron durante seis semanas a 40 °C. En estos experimentos, se observo una estabilidad casi comparable para las muestras de 2 mg/ml, con las muestras con un pH 5,5 que muestran un cambio ligeramente inferior en el peso molecular de la protema. La estabilidad comparable se observa para las muestras de 2 mg/ml con las muestras con un pH 5,5 que muestran un cambio ligeramente inferior en el PM de la protema por el procedimiento de electroforesis capilar-SDS (procedimiento equivalente a SDS-PAGE) (Fig. 28).

Congelacion/descongelacion y estabilidad a las sacudidas

Los sistemas de tampon acetato de sodio, citrato de sodio, y succinato de sodio se ensayaron en un estudio de la estabilidad de la protema en condiciones de congelacion/descongelacion y estudio de sacudidas a pH 5,5 en presencia o ausencia de polisorbato 80 derivado de vegetales al 0,005 % y sacarosa al 3 %. En estos experimentos,

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anti-5T4 se dializo en los tampones y se diluyo a concentraciones finales de 25 mg/ml y 1 mg/ml. Las muestras se congelaron en nitrogeno Kquido (aproximadamente -196 °C o a -80 °C y despues se descongelaron a 37 °C o a temperature ambiente. Un conjunto distinto de muestras se sacudio a 200 rpm durante 24 horas, a 20 °C.

La turbidez se ensayo despues de un ciclo de congelacion/descongelacion midiendo la absorbancia a A400, y se determino el porcentaje de especies de alto peso molecular para las muestras de 1 mg/ml. Despues de un ciclo de congelacion/descongelacion, anti-5T4 fue ligeramente sensible a condiciones de congelacion lenta (CL) (-80) a 1 mg/ml y muy sensible a condiciones de congelacion mas rapida (CR) (nitrogeno lfquido). Polisorbato 80 minimizo la turbidez y el porcentaje de especies de alto peso molecular se incremento en muestras de 1 mg/ml. La sacarosa mejoro (minimizo) la turbidez y en presencia de sacarosa, el porcentaje de especies de alto peso molecular aumento solo en condiciones de congelacion rapida (Fig. 29A y Fig. 29B).

La turbidez y el porcentaje de especies de alto peso molecular tambien se analizaron despues de multiples ciclos (diez) de congelacion/descongelacion utilizando muestras con una concentracion de protema (anti-5T4) de 25 mg/ml. (Fig. 30A y Fig. 30B). Estos datos demostraron que el anti-ST4 no es sensible a tension por congelacion/descongelacion a una concentracion de 25 mg/ml. Solo hubo una ligera disminucion en la turbidez y el porcentaje de especies de alto peso molecular con la adicion de polisorbato 80 y/o sacarosa despues de diez ciclos de congelacion/descongelacion. Los resultados de turbidez tambien demuestran que no hubo beneficio, y en algunos casos fue perjudicial a la estabilidad de anti-5T4 cuando se anadio sacarosa a una formulacion. El uso de tampon acetato en una formulacion resulto en una turbidez ligeramente inferior y un menor porcentaje de especies de alto peso molecular en la mayona de las condiciones de congelacion/descongelacion.

La estabilidad en condiciones de sacudida se analizo mediante la medicion de la turbidez (A400) y el porcentaje de especies de alto peso molecular utilizando las formulaciones que contienen 25 mg/ml de anti-5T4. La Fig. 31A y Fig. 31B ilustran los resultados de las mediciones de turbidez de las muestras en varias formulaciones. Estos datos demuestran que el anti-5T4 es muy sensible a la tension por sacudidas cuando una formulacion contiene tampon citrato. Hubo una disminucion de la turbidez y el porcentaje de algunas formulaciones de especies de alto peso molecular con la adicion de polisorbato 80 con muestras de 1 mg/ml y 25 mg/ml, pero no se produce beneficio alguno con la adicion de sacarosa a las formulaciones. Las formulaciones de tampon acetato exhibieron generalmente la turbidez mas baja.

Tensioactivo y crioprotector

Algunos de los experimentos descritos supra (p. ej., los ilustrados en las Fig. 29A, Fig. 29B, Fig. 30A, Fig. 30B, Fig. 31A y Fig. 31B) incluyen datos en los que la formulacion incluye un tensioactivo (polisorbato 80) y/o un crioprotector (sacarosa). Con respecto a la estabilidad despues de la congelacion, las muestras que contienen 25 mg/ml de anti- 5T4 no fueron sensibles a tension por congelacion/descongelacion. Anti-5T4 era estable en condiciones de congelacion lenta, independientemente de la concentracion de protemas o condicion de descongelacion. Polisorbato 80 no era necesario para mejorar la estabilidad de las muestras de concentracion de protemas de 25 mg/ml cuando se aplico un protocolo de descongelacion rapida.

La adicion de sacarosa a una formulacion no mejoro la estabilidad para las muestras que contienen 25 mg/ml de anti-5T4. Para las muestras que contienen 1 mg/ml, polisorbato 80 y sacarosa protegieron el anti-5T4 durante la congelacion/descongelacion, particularmente en condiciones de congelacion rapida (Fig. 29A y Fig. 29B y Fig. 30A y Fig. 30B).

Tambien se examino la estabilidad de anti-5T4 en diversas formulaciones en condiciones de sacudida. Polisorbato 80 contribuyo a la minimizacion de la turbidez y a la minimizacion del porcentaje de especies de alto peso molecular de las formulaciones anti-5T4 a una concentracion de protemas de 25 mg/ml cuando la protema se sacudio a rpm extremadamente altas. En formulaciones que contienen 1 mg/ml de anti-5T4, polisorbato 80 protegfa a la protema contra la tension por agitacion (Fig. 31A y Fig. 31B).

Estos datos demuestran que para las concentraciones de protema mas altas (p. ej., 25 mg/ml), anti-5T4 es estable en tension por congelacion/descongelacion. Hubo un beneficio escaso o nulo con la adicion de tensioactivo a una formulacion en la mayona de las condiciones de congelacion/descongelacion, en particular, en formulaciones que contienen tampon acetato. Ademas, no hay necesidad de utilizar un crioprotector (p. ej., sacarosa) en las formulaciones. Polisorbato 80 fue util para la estabilizacion de anti-5T4 en condiciones de agitacion severa.

Ademas, se descubrio que las muestras que contienen bajas concentraciones de protema (p. ej., 1 mg/ml de anti- 5T4) eran estables en condiciones de congelacion lenta. En tales muestras de protemas con una concentracion baja, polisorbato 80 y sacarosa protegieron la protema (anti-5T4) contra la desnaturalizacion inducida por congelacion/descongelacion. Tambien, en las muestras con una baja concentracion de protemas, el polisorbato 80 protegio a la protema frente a la desnaturalizacion inducida por agitacion.

Otras realizaciones

Queda entendido que si bien la invencion se ha descrito junto con la descripcion detallada de la misma, la descripcion anterior tiene por objeto ilustrar y no limitar el ambito de la invencion, que se define por el ambito de las

reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones estan dentro del ambito de las siguientes reivindicaciones.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Una formulacion que comprende

(a) un anticuerpo anti-CD22 monoclonal humanizado que comprende:

- una region variable de la cadena ligera gL1 que consiste en la secuencia de aminoacidos:

1 DVQVTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLA NSYGNTFLSW YLHKPGKAPQ LLIYGISNRF 61 SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQGTHQP YTFGQGTKVE IKR

- una region constante de la cadena ligera de la cadena ligera kappa humana;

- una region variable de la cadena pesada gH7 que consiste en la secuencia de aminoacidos

1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYRFT NYWIHWVRQA PGQGLEWIGG INPGNNYATY 61 RRKFQGRVTM TADTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCTREG YGNYGAWFAY WGQGTLVTVS 121 S;

y,

- una region constante de la cadena pesada de la cadena pesada gamma-4 humana;

en la que el anticuerpo esta presente a una concentration de 1 mg/ml a 50 mg/ml; y

(b) una solution acuosa que comprende un tampon succinato y que tiene un pH 4,0 a pH 6,5, en la que la concentracion del tampon es de 1 mM a 100 mM;

en la que la formulacion no contiene crioprotector o tensioactivo, y el anticuerpo es estable durante al menos 3 semanas entre -80 °C a 8 °C,

en la que la estabilidad se determina examinando al menos uno entre el porcentaje de especies de alto peso molecular, el porcentaje de especies de bajo peso molecular, o el porcentaje de especies acidas en comparacion con un control;

en la que el control es una replica de la formulacion que no se ha sometido a almacenamiento; en la que el porcentaje del componente proteico de la formulacion en especies de alto peso molecular despues del almacenamiento es de 10 % o menos de la protema total;

en la que el porcentaje del componente proteico de la formulacion en especies de bajo peso molecular despues del almacenamiento es de 10 % o menos de la protema total, y,

en la que la formulacion no muestra un aumento superior al 10 % en el porcentaje de especies acidas despues del almacenamiento.
2. Una formulacion segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende

- una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos:

1 MKLPVRLLVL LLFWIPASRG DVQVTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLA NSYGNTFLSW 61 YLHKPGKAPQ LLIYGISNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCLQGTHQP 121 YTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ 181 SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC;

y una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos:

1 MDFGFSLVFL ALILKGVQCE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYRFTN YWIHWVRQAP 61 GQGLEWIGGI NPGNNYATYR RKFQGRVTMT ADTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCTREGY 121 GNYGAWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS 181 WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES 241 KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 301 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK 361 GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 421 DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK.
3. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que la formulacion comprende menos de sal 150 mM.

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4. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que la concentracion de tampon es de 50 mM a 100 mM.
5. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que la concentracion de tampon es de 1 mM a 50 mM.
6. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo es estable durante al menos 1 ano a 5 °C o el anticuerpo es estable durante al menos 3 anos a 5 °C.
7. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo esta presente a una concentracion de 10 mg/ml a 30 mg/ml, 25 mg/ml a 30 mg/ml, 10 mg/ml a 50 mg/ml o 20 mg/ml a 50 mg/ml.
8. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo tiene un pl de al menos 6,0, 7,0 u 8,0.
9. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el pH de la formulacion es de 5,0 a 6,0.
10. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que la solucion acuosa es succinato 20 mM, pH 6,0.
11. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo esta purificado al menos en el 95 %.
12. La formulacion de la reivindicacion 1, en la que la formulacion es esteril.