KR20070092197A

KR20070092197A - 안정화 제형

Info

Publication number: KR20070092197A
Application number: KR1020077003502A
Authority: KR
Inventors: 리 리; 안젤라 칸토르; 샤논 비 맥밀란
Original assignee: 와이어쓰
Priority date: 2004-08-13
Filing date: 2005-08-12
Publication date: 2007-09-12
Also published as: US20060115472A1; JP4948407B2; US8871201B2; IL181265A0; CN101022831A; BRPI0514340A; ECSP077246A; AU2005272603A1; CA2575870A1; CR8904A; MX2007001599A; NO20070930L; JP2008515775A; ES2637854T3; TW200621282A; WO2006020935A2; AR051009A1; EP1784219A4; RU2007109062A; EP1784219B1

Abstract

본 발명은 단백질 농도, pH 및 완충액 종류가 비교적 광범위한 조건 하에서, 항체와 같은 단백질 보관에 적합한 제형에 관한 것이다. 또한, 특정 단백질의 보관에 적합한 제형을 동정하는 방법 및 단백질을 보관하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명의 제형은 계면활성제가 적거나 전혀 함유하지 않고, 염 농도가 전혀 없거나 비교적 낮으며, 비교적 낮은 완충액 농도를 필요로 한다.

단백질 보관용 제형, 항체 보관용 제형

Description

안정화 제형{Stabilizing formulations}

본 발명은 단백질 제형 분야, 더 상세하게는 항체 제형에 관한 것이다.

관련 출원에 대한 참조 설명

본 출원은 전문이 참고 인용되고 있는 2004년 8월 13일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 제60/601311호의 우선권을 주장한다.

항체와 같은 단백질은 종종 생산된 다음, 이후에 사용하기 위해 보관된다. 이러한 단백질은 온도 및 단백질 농도를 비롯한 다양한 조건 하에서 단백질의 안정성을 보존하는 조건 하에서 보관되어야 하는 것이 중요하다. 즉, 단백질 보관에 사용되는 제형은 일반적으로 다양한 안정화 물질을 함유한다. 하지만, 이러한 물질은 하위 공정의 효율을 저하시키거나 또는 하나 이상의 안정화 물질을 반드시 제거한 다음에야 단백질을 하위 공정에 사용할 수 있어, 보관된 단백질의 하위 용도에 악영향을 미칠 수 있다.

이에, 단백질을 사용하는 하위 공정을 방해할 수 있는 물질을 함유하지 않고 다양한 온도 상에서 안정한, 항체와 같은 단백질 제형이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 단백질(예, 항체 및 이의 단편)과 같은 폴리펩타이드의 보관에 사용되어 비교적 안정하고 단순한 제조물을 형성할 수 있는 특정 제형의 발견에 관한 것이다. 이러한 제형은 단백질의 하위 공정이나 활성이 제형의 성분에 악영향을 미칠 수 있는 가능성을 감소시키고, 단기 또는 장기 보관용 단백질 시료의 제조를 간편하게 한다.

따라서, 본 발명은 분리된 단백질과 pH 4.0 내지 8.0인 수용액을 함유하고, 동결보호제 또는 계면활성제를 함유하지 않으며, 상기 단백질이 -80℃ 내지 8℃ 범위에서 적어도 3주 동안 안정한 제형을 포함한다. 일부 경우에, 제형은 150mM 미만의 염, 예컨대 75mM 염을 함유한다. 단백질은 항체(폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체)일 수 있다. 예를 들어, 단백질은 항CD22 항체, 항루이스 Y 항체 또는 항5T4 항체일 수 있다. 단백질은 재조합 단백질(예, 사람화된 모노클로날 항체)일 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 치료학적 단백질이다.

제형의 수용액은 물(예컨대, 여과되거나 멸균된 물)이거나 또는 아세테이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 포스페이트 완충액 또는 시트레이트 완충액과 같은 완충액을 함유할 수 있다. 일반적으로, 완충액 농도는 약 0mM 내지 약 150mM 범위, 예컨대 약 50mM, 약 100mM 또는 약 1mM 내지 약 50mM 범위이다.

제형의 단백질 성분은 일반적으로 5℃에서 적어도 1년 동안 안정하고, 예를 들어 단백질은 5℃에서 적어도 3년 동안 안정하다. 일부 양태에 따르면, 단백질은 약 1mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 20mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 20mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 10mg/ml 내지 약 30mg/ml, 25mg/ml 내지 약 30mg/ml, 약 10mg/ml 내지 약 50mg/ml 또는 약 20mg/ml 내지 약 50mg/ml 범위의 농도로 존재한다. 상기 단백질은 pI가 적어도 6.0, 예컨대 적어도 7.0 또는 적어도 8.0일 수 있다. 단백질은 예컨대 적어도 90% 또는 적어도 95%까지 정제될 수 있다.

일부 경우에, 제형은 약 0℃ 내지 약 8℃ 또는 약 0℃ 내지 약 5℃에서 보관된다. 제형의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0 범위일 수 있고, 일부 경우에는 제형의 pH가 약 5.0 내지 약 6.0 범위이고, 제형이 약 -80℃ 내지 약 5℃ 범위에서 보관된다. 일반적으로 제형은 멸균된 것이다.

본 발명의 제1 예에 따르면, 제형의 단백질은 예컨대 사람화된 항CD22 항체일 수 있고, 수용액은 약 20mM 숙시네이트, pH 6.0일 수 있다. 본 발명의 제2 예에 따르면, 단백질은 항루이스 Y 항체이고, 수용액은 약 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 및 약 75mM NaCl이다. 본 발명의 제3 예에 따르면, 단백질은 항5T4 항체이고, 수용액은 약 10mM 나트륨 아세테이트 pH 약 5.5이다.

제형의 안정성은 예컨대 대조군과 비교하여, 고분자량 종의 백분율, 저분자량 종의 백분율 또는 산성 종의 백분율 중 적어도 하나를 분석하여 측정할 수 있다.

다른 관점으로서, 본 발명은 단백질을 보관하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 전술한 제형을 제공하는 단계, 이 제형을 선택된 온도 하에 방치하는 단계, 및 상기 제형을 그 온도(예, 동결 온도)에서 유지시키는 단계를 포함하고, 상기 제형 중의 단백질은 적어도 1주 동안, 예컨대 적어도 1개월, 3개월, 1년, 5년, 7년 또는 10년 동안 안정하다. 일부 경우에, 단백질은 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 안정하게 보관된다. 특정 양태에 따르면, 단백질은 약 -80℃의 온도에서 보관되고, 단백질은 적어도 5년, 7년 또는 10년 동안 안정하다. 단백질이 동결되면, 이 방법은 단백질을 급속 해동하는 단계를 포함할 수 있다. 단백질이 동결되어야 하면(예, 보관을 위해), 단백질은 급속 동결을 이용하여 동결할 수 있다. 일부 경우에는 저속 동결이 사용되기도 한다. 단백질은 항체(모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체)일 수 있다. 일 예에 따르면, 단백질은 사람화된 항CD22 항체, 항루이스 Y 항체 또는 항5T4 항체이다. 특정 양태에 따르면, 항체는 중간 물질이다. 일반적으로, 단백질은 적어도 1mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/ml, 적어도 20mg/ml 또는 적어도 30mg/ml 농도로 존재한다. 보관 상태에서 회수 시, 단백질의 활성은 예컨대 참조물질 활성의 적어도 70%일 수 있다. 일부 경우에 따르면, 보관 상태에서 회수 시, 제형은 대조군에 비해 고분자량 산물을 5% 이하로 함유하거나, 또는 보관 상태에서 회수 시, 예컨대 대조군에 비해 10% 이하의 고분자량 산물 및 응집물을 함유한다. 일부 양태에 따르면, 제형은 10% 이하의 고분자량 산물, 예컨대 5% 이하의 고분자량 산물을 함유한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 선택된 분리 단백질을 보관하기에 바람직한 제형을 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 선택된 분리 단백질을 제공하는 단계, 상기 선택된 분리 단백질을 약 pH 4.0 내지 약 pH 8.0의 수용액과 약 0mM 내지 약 150mM의 완충액을 함유하는 일련의 제형에 보관하는 단계, 안정성에 관한 적어도 하나의 매개변수를 측정하는 단계 및 단백질이 안정한 제형을 동정하는 단계를 포함하고, 이러한 단백질이 안정한 제형이 상기 선택된 분리 단백질의 보관에 바람직한 제형이다. 본 방법의 일부 양태에 따르면, 안정성의 감소는 예컨대 대조군에 비해 시료에 존재하는 고분자량 단백질 함량의 증가, 예컨대 대조군에 비해 시료에 존재하는 저분자량 종 함량의 증가, 또는 대조군에 비해 산성 종%의 증가 중 적어도 하나에 의해 나타난다. 일부 경우에는, 단백질의 0.5%이하, 0.2% 이하 또는 0.1% 이하가 고분자량 종인 조건이 선택되기도 한다. 안정성의 매개변수는 효소 결합 면역분석법(ELISA)에 의해 분석된 활성일 수 있고, 안정한 제형에서 그 활성은 대조군의 적어도 50% 또는 대조군의 적어도 80%이다. 본 방법의 일 예에 따르면, 안정성의 매개변수는 고분자량 종의 존재이고, 안정한 제형이 5% 이하의 고분자량 종을 함유하는 것이다. 다른 예에 따르면, 안정성의 매개변수는 고분자량 종과 단백질 응집물의 존재이고, 안정한 제형이 10% 이하의 고분자량 종과 단백질 응집물을 함유하거나 또는 15% 이하의 고분자량 종과 단백질 응집물의 배합물을 함유하는 것이다. 일부 경우에 따르면, 고분자량 종의 백분율은 대조군 시료(예컨대, 보관 전의 시료)에 존재하는 함량과 비교된다. 본 방법의 또 다른 양태에 따르면, 안정성의 매개변수는 산성 단백질과 염기성 단백질의 비이며, 안정한 제형에서 이러한 비는 대조군과 15% 이하의 차이인 것이다.

또한, 본 발명은 pH 4.0 내지 pH 8.0인 수용액을 함유하는 제형에 폴리펩타이드를 보관하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드(단백질 또는 펩 타이드)에 관한 것으로, 이때 제형이 동결보호제 또는 계면활성제를 함유하지 않아도 되고 단백질은 -80℃ 내지 8℃에서 적어도 3주 동안 안정하다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 항체 또는 이의 단편(예컨대, 항CD22, 항루이스 Y, 또는 항5T4)이다. 이러한 항체 또는 이의 단편은 한 분자에 접합될 수 있거나 한 분자에 대한 접합, 예컨대 리신(ricin)이나 칼리케아미신(calicheamicin)과 같은 독소에 대한 접합용으로 사용될 수 있다.

일부 양태로서, 본 발명은 변형 단백질의 제조에 사용하기 위한 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드)에 관한 것으로서, 이 폴리펩타이드는 pH 4.0 내지 pH 8.0인 수용액을 함유하는 제형에 보관되어 있고, 이 제형은 동결보호제 또는 계면활성제를 함유하지 않으며, 상기 단백질은 -80℃ 내지 8℃에서 적어도 3주 동안 안정하다. 일부 경우에, 폴리펩타이드는 항체, 예컨대 항CD22, 항루이스 Y 또는 항5T4이다. 이러한 폴리펩타이드는 접합 단백질의 제조용, 예컨대 리신이나 칼리케아미신과 같은 독소에 접합시키기 위한 용도에 사용될 수 있다. 이러한 접합 단백질도 역시 본 명세서에 기술된 제형에 보관될 수 있다.

특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련된 자(이하, 당업자라 한다)가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 수행이나 검사에 사용될 수 있지만, 적합한 방법과 재료는 이하에 기재하였다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 그 전문이 참고 인용되었다. 또한, 재료, 방법 및 실시예들은 오로지 예시를 위한 것인 바, 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 이하 상세한 설명, 도면의 간단한 설명 및 청구의 범위를 통해 명백히 알 수 있을 것이다.

도 1A는 다양한 pH와 다양한 온도에서 1mg/ml 항루이스 Y의 크기배제크로마토그래피-고성능액체크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 고분자량(HMW) 종%를 나타낸다.

도 1B는 다양한 pH와 다양한 온도에서 1mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 저분자량(LMW) 종%를 나타낸다.

도 2는 다양한 pH와 다양한 온도에서 1mg/ml 항루이스 Y의 CEX-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 산성 종%를 나타낸다.

도 3은 다양한 pH에서 4주 동안 40℃에서 보관된 항루이스 Y 시료의 SDS-PAGE 결과를 도시한 것이다. 왼쪽 도면은 비환원 조건 하에서 진행된 겔의 이미지이고 우측 도면은 환원 조건 하에서 진행된 겔의 이미지이다.

도 4는 도 3에 기술된 바와 같은 시료의 등전집중(IEF) 겔을 도시한 것이다.

도 5는 다양한 pH와 다양한 온도에서 2주 동안 항온처리된 0.5mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 HMW 종%를 나타낸다.

도 6은 75mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 다양한 pH, 다양한 온도에서 2주 동안 항온처리된 25mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 7A는 75mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 다양한 완충액 중에서 다양한 pH와 40℃에서 4주 동안 항온처리된 1mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 HMW 종 %로서 나타낸다.

도 7B는 75mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 다양한 완충액 중에서 다양한 pH와 40℃에서 4주 동안 항온처리된 1mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 LMW 종 %로서 나타낸다.

도 8은 75mM NaCl의 존재 또는 부재 하에서 다양한 완충액 중에서 다양한 pH와 40℃에서 4주 동안 항온처리된 1mg/ml 항루이스 Y의 CEX-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 산성 종%로서 나타낸다.

도 9A는 다양한 NaCl 농도와 다양한 온도에서 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중에서 4주 동안 항온처리된 30mg/ml 항루이스 Y의 CEX-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 산성 종%로서 나타낸다.

도 9B는 도 9A에 설명된 시료의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 9C는 도 9A에 설명된 시료의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 LMW 종%로서 나타낸다.

도 10은 다양한 염 농도에서 진탕 처리된 1mg/ml 또는 30mg/ml의 항루이스 Y의 SEC-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수%로서 나타낸다.

도 11A는 도 11B에 나타낸 바와 같은 10회의 동결-해동 사이클 후 150mM NaCl 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5에서의 1mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수%를 나타낸다.

도 11B는 제시된 바와 같이 동결 해동 사이클 후 150mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5에서 30mg/ml의 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 나타낸 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수 %로서 나타낸다.

도 12는 75mM NaCl 존재 또는 부재 하에 다양한 온도에서 1개월 동안 항온처리된 50mM 숙시네이트 pH 6.0 중의 25mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 나타낸 막대 그래프이다.

도 13은 20mM 숙시네이트 pH 6.0, 숙시네이트 + 75mM NaCl, 숙시네이트 + 0.01% 폴리소르베이트 80 또는 숙시네이트 + 75mM NaCl 및 폴리소르베이트 80(Tween) 중에서 15mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 시료는 분석하기 전에 24시간 동안 진탕 처리했다. 숙시네이트 완충액 중의 단백질을 진탕처리하지 않은 대조군도 포함되어 있다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 14A는 75mM NaCl 존재 또는 부재 하에 40℃에서 4주 동안 항온처리된 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중의 1mg/ml 또는 30mg/ml의 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 HMW 종%의 변화로서 나타낸다.

도 14B는 75mM NaCl 존재 또는 부재 하에 40℃에서 4주 동안 항온처리된 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중의 1mg/ml 또는 30mg/ml의 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 LMW 종%의 변화를 나타낸다.

도 14C는 75mM NaCl 존재 또는 부재 하에 40℃에서 4주 동안 항온처리된 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중의 1mg/ml 또는 30mg/ml의 항루이스 Y의 CEX- HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 산성 종%의 변화로서 나타낸다.

도 15A는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 항온처리된 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중의 30mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 15B는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 항온처리된 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중의 30mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 LMW 종%로서 나타낸다.

도 15C는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 항온처리된 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중의 30mg/ml 항루이스 Y의 CEX-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 산성 종%로서 나타낸다.

도 16A는 다양한 사이클의 다양한 동결-해동 섭생 하에 처리된 20mM 숙시네이트 pH 6.0 중의 1mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, FT는 급속 해동, SF는 저속 동결 및 ST는 저속 해동이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 16B는 다양한 사이클의 다양한 동결-해동 섭생 하에 처리된 20mM 숙시네이트 pH 6.0 중의 25mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, FT는 급속 해동, SF는 저속 동결, ST는 저속 해동이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 16C는 다양한 사이클의 다양한 동결-해동 섭생 하에 처리된 폴리소르베이트 80 함유 20mM 숙시네이트 pH 6.0 중의 1mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, FT는 급속 해동, SF는 저속 동결, ST는 저속 해동이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 16D는 다양한 사이클의 다양한 동결-해동 섭생 하에 처리된 폴리소르베이트 80을 함유하는 20mM 숙시네이트 pH 6.0 중의 25mg/ml 항CD22의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, FT는 급속 해동, SF는 저속 동결, ST는 저속 해동이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 17A는 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중에서 1mg/ml 또는 30mg/ml 항루이스 Y를 실온에서 24시간 동안 360rpm 하에 진탕처리하고 SEC-HPLC를 사용하여 분석한 진탕처리 연구 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수%를 나타낸다.

도 17B는 다양한 농도의 폴리소르베이트 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중에서 30mg/ml 항루이스 Y를 실온에서 24시간 동안 360rpm 하에 진탕처리하고 SEC-HPLC를 사용하여 분석한 진탕처리 연구 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수%로서 나타낸다.

도 18A는 도 18B에 제시된 바와 같이 10회 동결 해동 사이클 후 0.01% 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중에서 1mg/ml 항루이스 Y를 SEC-HPLC 분석한 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수%로서 나타낸다.

도 18B는 제시된 바와 같이 10회 동결 해동 사이클 후 0.01% 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중에서 30mg/ml 항루이 스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 단량체 회수%로서 나타낸다.

도 19A는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 항온처리한 후 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중에서 30mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 19B는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 항온처리한 후 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중에서 30mg/ml 항루이스 Y의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 LMW 종%로서 나타낸다.

도 19C는 다양한 온도에서 다양한 시간 동안 항온처리한 후 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트, 75mM NaCl, pH 5.5 중에서 30mg/ml 항루이스 Y의 CEX-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 산성 종%로서 나타낸다.

도 20A는 6개월 동안 항CD22의 보관 안정성을 SEC-HPLC로 분석한 결과를 도시한 막대 그래프이다. 용액은 20mM 숙시네이트 pH 6.0(S); 20mM 숙시네이트, 10mM 메티오닌, pH 6.0(SM); 20mM 숙시네이트, 0.01 폴리소르베이트 80, pH 6.0(ST); 또는 20mM 숙시네이트, 10mM 메티오닌, 0.01 폴리소르베이트 80, pH 6.0(SMT)을 함유한다. 결과는 HMW 종%로서 나타낸다.

도 20B는 6개월 동안 항CD22의 보관 안정성을 SEC-HPLC로 분석한 결과를 도 시한 막대 그래프이다. 용액은 20mM 숙시네이트 pH 6.0(S); 20mM 숙시네이트, 10mM 메티오닌, pH 6.0(SM); 20mM 숙시네이트, 0.01 폴리소르베이트 80, pH 6.0(ST); 또는 20mM 숙시네이트, 10mM 메티오닌, 0.01 폴리소르베이트 80, pH 6.0(SMT)을 함유한다. 결과는 총 피크 면적%로서 나타낸다.

도 20C는 항CD22의 보관 안정성에 대한 CEX-HPLC 분석 결과를 도시한 막대 그래프이다. 조건은 도 20A 및 도 20B에 설명한 바와 같다. 결과는 완전 활성 종%(피크 5 %)로서 나타낸다.

도 21은 다양한 pH와 온도에서 2주 동안 보관된 항5T4의 고분자량 산물(HMW)을 SEC-HPLC 분석한 결과를 도시한 막대 그래프이다. 결과는 평균 고분자량 산물%로서 나타낸다.

도 22는 염(NaCl)의 존재 또는 부재 하에 다양한 pH의 아세테이트 완충액(Ace), 시트레이트 완충액(Cit), 포스페이트 완충액(Phos) 또는 숙시네이트 완충액(Suc)에서 처음 또는 40℃에서 4주 후에 항5T4 시료의 고분자량 산물(HMW) 또는 저분자량 산물(LMW)의 백분율을 SEC-HPLC 분석한 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 23A는 시트레이트 완충액(pH 5.5)에서 항5T4의 시차주사열량계(DSC) 결과를 도시한 온도기록도이다.

도 23B는 숙시네이트 완충액(pH 6.0)에서 항5T4의 시차주사열량계(DSC) 결과를 도시한 온도기록도이다.

도 24A는 NaCl 없이 다양한 pH의 다양한 제형에서 항5T4의 DSC 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 24B는 150mM NaCl을 함유하는 다양한 pH의 다양한 제형에서 항5T4의 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 25는 150mM NaCl 존재 또는 부재 하에 다양한 pH의 다양한 완충액을 함유하는 제형에서 40℃ 하에 4주 후에 항5T4의 CEX-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 26A는 다양한 pH의 다양한 완충액에서 -80℃ 또는 40℃ 하에 6주 후에 항5T4(2mg/ml)의 SEC-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 26B는 pH 6의 시트레이트 또는 숙시네이트 완충액에서 -80℃ 또는 40℃ 하에 6주 후에 항5T4(30mg/ml)의 SEC-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 27A는 다양한 pH의 다양한 완충액 제제에서 40℃ 하에 6주 후에 항5T4(2mg/ml)의 CEX-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 27B는 pH 6의 시트레이트 또는 숙시네이트 완충액에서 40℃ 하에 6주 후에 항5T4(30mg/ml)의 CEX-HPLC 결과를 도시한 막대 그래프이다.

도 28은 다양한 pH의 다양한 완충액 제제에서 40℃ 하에 6주 후에 항5T4의 SDS 겔 모세관 전기영동 결과를 도시한 중첩 전기영동도 세트 복사도이다.

도 29A는 여러 동결 및 해동 섭생 하에 슈크로스 존재 또는 부재 및 폴리소르베이트 80 존재 또는 부재와 함께 다양한 완충액(pH 5.5)을 함유하는 제형에서 1mg/ml 항5T4의 A₄₀₀을 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, SF는 저속 동결, FT는 급속 해동, ST는 저속 해동이다.

도 29B는 여러 동결 및 해동 섭생 하에 슈크로스 존재 또는 부재 및 폴리소 르베이트 80(P80) 존재 또는 부재와 함께 다양한 완충액(pH 5.5)을 함유하는 제형에서 1mg/ml 항5T4의 고분자량(HMW) 종의 백분율을 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, SF는 저속 동결, FT는 급속 해동, ST는 저속 해동이다.

도 30A는 여러 동결 및 해동 섭생 하에 슈크로스 존재 또는 부재 및 폴리소르베이트 80(P80) 존재 또는 부재와 함께 다양한 완충액(pH 5.5)을 함유하는 제형에서 25mg/ml 항5T4의 A₄₀₀을 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, SF는 저속 동결, FT는 급속 해동, ST는 저속 해동이다.

도 30B는 상이한 동결 및 해동 섭생 하에 슈크로스 존재 또는 부재 및 폴리소르베이트 80(P80) 존재 또는 부재와 함께 다양한 완충액(pH 5.5)을 함유하는 제형에서 25mg/ml 항5T4의 고분자량(HMW) 종의 백분율을 도시한 막대 그래프이다. FF는 급속 동결, SF는 저속 동결, FT는 급속 해동, ST는 저속 해동이다.

도 31A는 폴리소르베이트 80(P80) 및 슈크로스의 존재 또는 부재 하의 다양한 제형에서 1mg/ml 또는 25mg/ml 항5T4의 A₄₀₀을 도시한 막대 그래프이다. 시료는 진탕 처리하거나 처리하지 않았다. "*"는 혼탁도가 기구의 상한선을 초과한 것을 나타낸다.

도 31B는 폴리소르베이트 80(P80) 및 슈크로스의 존재 또는 부재 하의 다양한 제형에서 1mg/ml 또는 25mg/ml 항5T4의 고분자량(HMW) 백분율을 도시한 막대 그래프이다. 시료는 진탕 처리하거나 처리하지 않았다.

본 발명은 모노클로날 항체, 모노클로날 항체 함유 약물 또는 항체 함유 약물 등의 단백질 산물의 생산에 사용되는 중간 물질과 같은 단백질을 보관하기 위한 비교적 간단한 제형을 제공한다. 이 제형은 일반적으로 계면활성제를 소량 함유하거나 전혀 함유하지 않고, 염이 없거나 염의 농도가 비교적 낮으며, 비교적 낮은 완충액 농도를 필요로 한다. 본 제형은 항체와 같은 특정 단백질을 비교적 광범위한 단백질 농도, pH 및 완충액 종류 하에서 안정하게 보관하는데 효과적이다. 이러한 제형은 후속 가공에 상당한 이용용이성이 있어서, 예를 들어 단백질이 바람직한 pH, 첨가제 첨가, 화학적 변형 또는 동결건조에 대해 쉽게 조정가능하게 한다. 이러한 제형은 또한 펩타이드 및 가공된 단백질, 예컨대 다른 펩타이드 또는 비펩타이드 부분에 접합된 항체와 같은 단백질의 보관에도 사용될 수 있다.

구체적인 비제한적 예로서, 본 발명은 항체를 세포독소와 같은 화합물에 접합시켜 만든 약물을 제조하기 위한 중간 물질 등으로서 사용될 수 있는, 3가지 다른 항체, 항CD22, 항루이스 Y 및 항5T4의 보관에 바람직한 제형을 동정하는 예시적인 방법을 제공한다. 중간 물질은 약물과 같은 화합물의 제조에 사용되는 물질, 일반적으로 단백질(예,항체)이다.

제형

본 명세서에 기술된 제형은 일반적으로 약 pH 3.0-9.0, 예컨대 약 pH 4.0-8.0, 약 pH 5.0-6.5 또는 약 pH 5.5-6.0의 수용액에 분리된 단백질을 함유한다. 이러한 제형은 동결보호제 또는 계면활성제를 함유하지 않는다. 일반적으로, 제형은 방부제를 함유하지 않는다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 제형은 동결보호제를 함유하지 않는다. 동결보호제는 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예에는 단당류(예, 글루코스, 프럭토스, 말토스, 리보스, 만노스 및 자일로스); 이당류(예, 트레할로스, 슈크로스, 셀로비오스 및 락토스); 삼당류(예, 라피노스); 당알콜(예, 만니톨, 소르비톨, 미오이노시톨, 인산화된 이노시톨 및 글리세롤); 다당류(예, 하이드록시에틸 전분(HES), 덱스트란, 인산화된 덱스트란, 헤파린, 헤파린 설페이트, 히알루론산, 더마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 아가로스); 카복실산(예, 피루베이트 및 2,3-디포스포글리세레이트); 및 보호 효과를 위해 사용되는 단백질 또는 단백질 혼합물(예, 혈액, 동물 혈청, 혈장, 사람 알루민, 소 알부민, 소 젤라틴 및 어류 젤라틴)이 포함된다.

본 발명의 신규 제제는 계면활성제(매우 저농도로 사용되었을 때 물의 표면장력을 저하시킬 수 있는 시약)를 함유하지 않는다. 계면활성제는 당업계에 공지되어 있고, 그 예에는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 및 Pluronic® 계면활성제가 있다.

일반적으로, 신규 제형은 방부제를 함유하지 않는다. 방부제는 당업자에게 공지되어 있고, 그 예에는 항균제 및 항진균제, 예컨대 아지드화나트륨, 수은 함유 화합물, 예컨대 티메로살, 자일레놀, 항생제, 이소티아졸론 및 암포테리신 등이 있다.

완충액

제형은 용액의 pH를 허용 범위로 유지시키는 제제를 의미하는 완충액에 존재할 수 있다. 완충액에는 예컨대 시트레이트, 아세테이트, 히스티딘, 글루코네이트, 숙시네이트, 포스페이트, Tris(트리스(하이드록시메틸아미노메탄)), 디에탄올아민, HEPES 또는 다른 유기산 완충액이 포함될 수 있다. 단백질과 함께 사용하기에 적합한 다른 완충액은 당업자에게 공지되어 있다. 특정 제형은 아민 완충액의 사용을 배제한다. 완충액을 함유하는 제형에서, 완충액의 농도는 일반적으로 0mM 초과 내지 150mM 범위이다. 일부 경우에 완충액 농도는 약 50mM 내지 약 100mM 범위, 또는 약 1mM 내지 약 50mM 범위이다. 예를 들어, 완충액 농도는 약 10mM 내지 20mM 범위일 수 있다. 일부 경우에, 완충액 혼합물, 예컨대 HEPES와 Tris 완충액이 함께 사용될 수 있다.

완충액을 선택할 때에는 다른 조건을 고려해야 하기도 한다. 예를 들어, Tris 또는 히스티딘 완충액과 같은 아민 완충액은 특정 접합 절차에는 적합하지 않아서, 그러한 접합 절차에 사용될 단백질을 함유하는 제형에는 적합하지 않다.

일반적으로, 제형에 사용된 염의 농도는 첨가된 염으로 나타내는데, 예컨대 완충액 제조에 사용된 나트륨 또는 제형에 희석되기 전의 단백질 시료에 존재하는 염은 무시한다.

제형은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 단백질을 함유하는 제형에 원하는 pH의 완충액 및 경우에 따라 염을 첨가하기 위하여 투석을 사용할 수 있다. 일반적으로, 먼저 목적하는 분리된 단백질을 함유하는 초기 시료를 제조한다. 일부 경우, 예컨대 초기 시료가 제형에 희석되기 전에 고농도 단백질인 경우에는, 초기 시료의 pH 또는 염의 양을 고려할 필요가 없다. 하지만, 염 농도가 매우 높거나 완충액 농도가 높은 초기 시료를 사용하여 제형을 제조할 때에는, 초기 시료의 비단백질 성분을 제거하거나 감소시키는 단백질 제조 방법(예컨대, 투석)을 일반적으로 사용한다.

안정성

본 명세서에 기술된 제형의 한가지 특징은 제형의 단백질(예, 항체) 성분이 -80℃ 내지 8℃에서 제형이 보관될 때 3주 이상인 적어도 특정 기간 동안 안정하다는 점이다. 일반적으로, 제형의 단백질 성분은 5℃에서 적어도 1년 동안 안정하다. 안정성은 일반적으로 단백질의 형태적 안정성 및/또는 활성의 안정성을 의미한다. 제형 측면에서, 단백질은 본 명세서에 제시된 적어도 하나의 안정성 매개변수를 충족한다면 안정한 것이다. 일반적으로, 단백질의 보관 동안 축적되는 고분자량 종의 형성이 최소화되는 것이 바람직하다. 즉, 안정성의 1가지 매개변수는 보관 처리된 제형에 존재하는 고분자량 종의 함량 증가(존재하는 경우)가 대조군보다 미만인 것이다. 예를 들어, 제형 보관 후 시료의 고분자량 종의 백분율은 대조군에 비해 크게 증가하지 않아야 한다. 일반적으로, 대조군은 실험 조건(예컨대, -80℃ 내지 8℃에서 3주 동안) 하에 보관 처리되지 않은 제형의 복제물이다. 일부 경우에는, 보관 후 고분자량 종으로서 제형에 존재하는 단백질 성분의 백분율이 총 단백질의 10% 이하, 총 단백질의 5% 이하, 총 단백질의 3% 이하 또는 총 단백질의 2% 이하이다. 고분자량 종을 분석하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 그 예에는 SEC-HPLC, SDS-PAGE, 모세관 전기영동 및 크기배제크로마토그래피가 있다.

분석될 수 있는 다른 매개변수는 보관 처리된 제형에 존재하는 경우의 저분자량 종의 함량 증가이다. 일반적으로, 보관 중에 저분자량 종의 축적은 최소화되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제형에서 보관 후 시료의 저분자량 종의 백분율은 대조군에 비해 크게 증가하지 않아야 한다. 일부 경우에는, 보관 후 저분자량 종으로서 제형에 존재하는 단백질 성분의 백분율이 총 단백질의 10% 이하, 총 단백질의 5% 이하, 총 단백질의 3% 이하 또는 총 단백질의 2% 이하이다. 저분자량 종은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 SEC-HPLC를 사용하여 분석할 수 있다.

다양한 조건 하에서 보관한 다음 제형에 존재하는 산성 종과 염기성 종의 비도 대조군에서의 비와 비교될 수 있다. 일반적으로, 탈아미드화를 나타내는 산성 종의 백분율이 측정된다. 산성 종 백분율의 증가는 안정성 감소를 나타낸다. 예를 들어, 안정한 제형은 일반적으로 선택된 조건 하에서 대조군에 비해 산성 종 백분율의 증가가 10% 이하이다. 시료에 존재하는 산성 종 백분율의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 그 예는 CEX-HPLC이다. 일부 경우에는 염기성 종의 존재가 당업계에 공지된 방법에 따라 분석되기도 한다. 제형에 보관된 단백질에 존재하는 염기성 종의 백분율 또는 종류의 변화는 제형에 존재하는 단백질 종의 안정성 정도를 나타낸다.

안정성의 또 다른 매개변수는 대조군에 존재하는 응집물과 고분자량(HMW) 종 함량에 비해, 존재하는 경우의 응집물 및 HMW 종 함량의 10% 이하의 증가일 수 있다. 응집물은 일반적으로 제형의 단백질 성분을 분리하는데 사용될 수 있는 겔, 컬럼 또는 다른 분리 매체로 유입되지 않는 시료의 물질이다. 제형에 존재하는 고분자량 종 + 응집물을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 그 예에는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 크기배제크로마토그래피, 모세관전기영동 및 광산란법이 있다.

단백질의 효능 또는 활성을 측정하여, 제형의 안정성을 설정하는 매개변수로서 사용할 수 있다. 항체인 경우에는 면역분석법(예, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA))이 사용될 수 있다. 면역분석법 또는 다른 활성 분석법이 사용될 때, 제형에 존재하는 항체는 면역분석법에서의 활성이 대조군의 활성에 비해 적어도 50%를 유지한다면 안정한 것이다. 일부 경우, 제형은 단백질이 그 활성의 적어도 20%를 유지한다면 안정한 경우도 있다.

또 다른 안정성 매개변수도 측정하여 제형을 평가하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 교반(진탕) 후 제형에 존재하는 단백질의 안정성을 분석할 수도 있다. 이것은 시료가 수송 중에 안정성을 유지하는 것이 필요하기 때문에 중요한 매개변수일 수 있다. 진탕 측면에서의 제형의 안정성은 일반적으로 시료를 일정 시간(예, 12시간, 24시간, 48시간 또는 그 이상) 동안 진탕(예, 360rpm) 처리한 후, 불안정성을 나타내는 산물이 대조군에 비해 증가했는지의 여부를 측정하여 분석한다.

제형에 존재하는 단백질의 안정성을 평가하는 방법으로서, 당업계에 공지된 여타 방법들도 사용할 수 있다. 이러한 방법의 예에는 2차 및 3차 구조 정보를 제공하는 원편광 이색성 분광분석, 형광분광분석(예, 언폴딩(unfolding)의 지표로서 소수성 영역에 결합하는 Bis-ANS의 존재), 시차주사열량계(전체 열적 언폴딩을 모니터하는 DSC) 및 한외여과/정용여과(diafiltration)가 있다.

단백질의 안정성은 하나 이상의 매개변수를 사용하여 평가할 수 있다.

온도

본 명세서에 기술된 특정 제형의 장점은 단백질이 시간이 경과함에 따라 일정 범위의 온도 상에서 상당히 분해되거나 응집되지 않는 최소 용액에서 단백질을 보관하는 방법을 제공한다는 것이다. 일반적으로, 제형 중의 단백질 또는 펩타이드는 약 -80℃에서 약 40℃까지의 온도 또는 약 -80℃에서 약 8℃까지(예컨대, 약 5℃까지)의 온도 범위에서 적어도 3일(예컨대, 2주 또는 4주) 동안 안정하다. 일부 경우에, 제형은 장기간, 예컨대 적어도 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 3년, 5년, 7년 또는 10년 동안 안정해야 하는 것이 필요하다.

또한, 제형에 함유된 단백질은 반복적인 동결 해동 사이클 동안에도 유의적인 안정성을 나타낼 수 있고, 그러한 처리 이후 해동된 다음에도 안정성을 유지할 수 있다. 일반적으로, 동결되어야 하는 제형은 급속 동결, 예컨대 액체 질소에서 동결된다. 해동은 예컨대 저속 해동인 약 0℃ 내지 약 25℃ 범위에서; 또는 급속 해동인 약 26℃ 내지 40℃ 범위에서 실시될 수 있다. 급속 해동의 일 예는 37℃ 수조에서 제형을 해동하는 것이다. 제형 중의 단백질은 적어도 1회의 동결-해동 사이클, 적어도 5회의 동결-해동 사이클 또는 적어도 10회의 동결-해동 사이클 동안에 안정성일 수 있다.

안정성 보존을 위해 제형을 동결-해동하는 최적 섭생을 결정하는 것이 필요하거나 또는 특정 동결-해동 사이클로 처리될 단백질에 최대 안정성을 제공하는 제형을 동정할 필요가 있을 수 있다. 따라서, 일부 양태에서는 이러한 매개변수가 평가된다. 예를 들어, 최소의 분해 산물을 생산하는(예컨대, 안정성이 최대인) 절차를 결정하기 위하여, 다양한 조합의 급속 동결, 저속 동결, 급속 해동, 저속 해동과 같은 다양한 동결-해동 조건 하에서의 안정성에 대해 분석할 수 있다.

폴리펩타이드

본 명세서에 기술된 제형에 사용되는 폴리펩타이드는 일반적으로 분리된 단백질이다. "분리된" 단백질은 이 단백질이 유래되는 세포 또는 조직원 유래의 세포 물질이나 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학 합성 시에 화학 전구체 또는 다른 화학재료가 실질적으로 없는 것이다. "실질적으로 없는"이란 표현은 다른 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"로 언급되기도 한다) 또는 화학 전구체가 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(무수 중량 기준) 미만인 분리된 단백질 제조물을 의미한다. 분리된 단백질이 재조합 생산된 경우에는, 일반적으로 배양 배지가 실질적으로 없는, 즉 배양 배지가 단백질 제조물 용적의 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 것이다.

일부 경우에는 단백질의 조합이 제형에 사용되기도 한다. 예를 들어, 약제로서 제조되어야 하는 2종의 다른 항체가 동일한 제형에 함께 보관될 수 있다. 또한, 항체는 다른 종류의 단백질 또는 펩타이드, 예컨대 독성 펩타이드가 배합된 제형에 사용될 수도 있다. 펩타이드 또는 단백질 단편은 당해 제형에 사용될 수 있는데, 예컨대 Fab 단편과 같은 항체 단편이 사용될 수 있다.

일반적으로, "단백질"은 전장 단백질이나 이의 단편을 의미한다. 단백질은 천연의 단백질 또는 이의 단편, 또는 돌연변이유발이나 재조합 기술로부터 수득되는 유전자 조작된 단백질 또는 이의 단편에 해당할 수 있다. 단백질은 일부 경우에는 비단백질성 부분, 예컨대 검출가능한 분자(예, 형광 분자 또는 방사능동위원소), 독소, 약물 또는 소분자를 포함할 수도 있다. 단백질은, 예컨대 천연 아미노산을 함유할 수도 있다. 단백질은 하이브리드 단백질일 수 있다. 단백질은 항체(예, 중쇄와 경쇄를 모두 함유하는) 또는 성숙 인슐린 단백질에서와 같이 1종류보다 많은 다른 단백질을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 단백질 단편의 일 예에는 Fab 단편 또는 Fc 단편이 포함된다. 일부 경우에는 펩타이드가 제형로 사용되거나 또는 전술한 바와 같이 적어도 하나의 단백질과 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질 단편의 조합으로 사용된다. 또한, 단백질성 독소도, 예컨대 단독물로, 다른 단백질 또는 펩타이드에 접합되어, 또는 다른 단백질 또는 펩타이드와 별도의 실체로서 제형에 보관될 수 있다. 일반적으로, 본원에 제공된 제형은 단백질에 대해 본원에 기술된 바와 같은 모든 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드)에 유용하다.

펩타이드는 2개 이상의 아미노산(예컨대, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개 또는 50개 아미노산)이 공유결합되어 있는 화합물이다. 일반적으로, 단백질은 아미노산 길이가 적어도 50개인 폴리펩타이드 또는 복수의 폴리펩타이드(예컨대, 중쇄와 경쇄를 함유하는 항체 분자 또는 이의 일부)이다.

본 제형은 펩타이드 또는 비펩타이드 부분에 접합되어 있는 폴리펩타이드의 보관에도 사용될 수 있다. 이러한 부분의 예에는 형광 분자(예컨대, 플루오레세인, 로다민, 녹색형광단백질(GFP), 적색형광단백질(RFP), Cy3, Cy3.5, Cy5 또는 Cy5.5), 원소 부분(예컨대, 금 입자), 약물 또는 독소가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 분자를 폴리펩타이드에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 분자의 예에는 리신(Mansfield et al., 1997, Blood 90: 2020-2026; Ghetie et al., 1991, Cancer Res.51: 5876; Conry et al., 1995, J.Immunother. Emphgas, Tumor Immunol. 18:231-241), 슈도모나스 외독소 A(PE)(Smith, 2001, Seattle Genetics Curr.Opin.Investig. Drugs 2(9): 1314-1319; Mansfield et al., 1996, Bioconjug. Chem. 7:557), 탁산(예, 파클리탁셀)(Guillemard et al., 2001, Cancer Res. 61: 694-699), 독소루비신(Shouval et al., 1988, Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 85: 8276-8280; Takahashi et al., 1996, Anticancer Drugs 7(6): 687-696; Shih et al., 1991, Cancer Res. 51(16):4192-4198; Shih et al., 1994, Cancer Immunol. Immunother. 38(2): 92-98; Alexandru et al., 1999, Cancer Res. 59: 115-121; Trail et al., 1993, Science 261:212-215), 안트라센(Dias et al., 2005, Bioconjugate Chem. 16:949-958), 메이탄시노이드(maytansinoid) (Tassone et al., 2004, Cancer Res. 64:4629-4636; Tolcher et al., 2003, J. Clin. Oncol. 21 (2):211-222), 아드리아마이신(Hurwitz et al., 1983, Ann. N. Y. Acad. Sci. 417:125-36; Takahashi et al., 1988, Gan No Rinsho 34:847-50; Deguchi et al., 1987, J. Urol. 137(2):353-358), 방사성동위원소(Karube et al., 1996, Nuclear Med. Biol. 23:753-759; Mishra et al., 2004, J. Drug Target. 12(9-10):559-567; Lee et al., 2001, Cancer Res. 61:4474-4482), 메토트렉세이트(Ryser et al., 1988 J. Cell Physiol. 135(2):277-284; Mandel et al., 1991, J. Cell Physiol. 149(l):60-65), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(DOTA), 예컨대, 90-이트륨과 같은 다른 부분에 접합된 것(Lu et al., 2005, J. Pharm. Sci. 94(4):788-797), 스트렙타비딘(Ngai et al., 1995, Nucl. Med. Biol. 22(1), 77-86), 방사성동위원소 접합 산물(예컨대, 문헌 Biopharmaceutical Products in the U.S. Market, 4th Edition, Rader, ed., Biotechnology Information Institute, Rockville, MD, 2005에 기재된 것), 예컨대 테크네튬(Tc) 99m, 이트륨 및 In111 방사성접합체가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

일반적으로, 제형의 단백질 성분은 pI가 비교적 높은, 예컨대 pI가 적어도 6.0, 7.0, 8.0 또는 8.5인 단백질이다. 이러한 단백질은 항체에서와 같이 1 이상의 펩타이드 쇄를 보유할 수 있다. 제형의 단백질 성분이 항체인 경우에, 이 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이거나, 또는 이의 단편(예컨대, Fab 단편)일 수 있다. 단백질은 약 1mg/ml 내지 약 300mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml, 약 1mg/ml 내지 약 50mg/ml, 약 10mg/ml 내지 약 300mg/ml, 약 10mg/ml 내지 약 200mg/ml, 약 10mg/ml 내지 약 50mg/ml, 약 10mg/ml 내지 약 30mg/ml 또는 약 20mg/ml 내지 약 50mg/ml 범위의 농도로 제형에 존재할 수 있다. 본 명세서에 기술된 제형에 사용된 구체적인 항체에는 사람화된 모노클로날 항CD22 항체, 모노클로날 항루이스 Y 항체 및 항5T4 항체가 있다.

제형에 사용된 분리된 단백질은 일반적으로 치료제로서 효능이 있거나 치료제의 일부로서 효능이 있는 단백질이다. 이러한 단백질은 본원에서 치료학적 단백질이라고 언급하기도 하며, 항체가 포함된다.

본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있는 구체적인 단백질의 예에는 항CD22(US20040082764A1 및 US20040192900A1), 항루이스 Y(WO 05/019271A1) 및 항5T4(US 일련번호 60/608494)와 같은 항체가 포함된다.

pH

제형에 바람직한 pH 조건은 약 pH 4.0 내지 pH 8.0이다. 일반적으로, pH는 약 5.5 내지 6.0이다. 약 5.5 내지 6.0의 pH에서 모노클로날 항체를 함유하는 제형은 0℃ 내지 약 8℃(일반적으로 약 1℃ 내지 약 5℃)에서 적어도 3개월, 예컨대 6개월, 1년 또는 2년 동안, 그리고 예컨대 -80℃에서 장기간(적어도 3년, 5년, 7년 또는 10년) 동안 보관되고, 안정성을 유지할 수 있다.

바람직한 제형의 동정

본 명세서에 기술된 일부 방법에서, 바람직한 제형은 당해 목적하는 특정 단백질로서 동정된다. 이러한 방법에서, 본원에 기술된 바와 같은 제형에 보관되어야 하는 분리된 단백질, 예컨대 항체와 같은 치료학적 단백질이 동정된다. 이러한 단백질은 치료제로서 사용하기 위해 세포독소(예, 칼리케아미신)에 접합시킨 항체의 제조와 같이, 하위 공정에 사용될 수 있을 때까지 보관되어야 하는 항체일 수 있다. 다른 예로는 플루오레세인, 로다민과 같은 검출가능한 표지에 접합되거나 폴리에틸렌 글리콜에 접합시킨 다음, 항체의 장기 보관을 위해 동결건조되는 항체의 보관이 있다.

분리된 단백질의 보관에 바람직한 제형을 동정하기 위해서, 단백질은 일반적으로 pH 약 4.0 내지 8.0(예컨대, pH 5.0-6.0)이고 염 농도가 약 0mM 내지 150mM 인 일련의 검사 용액에 현탁시킨다. 이러한 검사 용액을 그 다음 특정 시간 동안 또는 여러 다른 시간(예컨대, 3일, 2주 또는 4주 동안 다양한 온도에서 보관한다. 그 후, 시료를 고분자량 종, 저분자량 종, 산성 종 백분율의 변화 또는 응집물과 고분자량 종의 함량 변화와 같은 적어도 하나의 안정성 매개변수에 대해 평가한다. 그 다음, 제형의 단백질 성분이 안정한 시료를 그 종의 보관에 바람직한 제형로서 선택한다. 추가 평가로서 동결 해동 사이클 후의 안정성 또는 교반(진탕) 후의 안정성과 같은 다른 안정성 매개변수의 평가를 수행할 수도 있다. 이상 제시한 예들은 특정 분리된 단백질의 보관에 바람직한 제형을 동정하는 방법의 부가적 지침을 제공한다.

단백질 보관 방법

본 발명은 단백질 또는 펩타이드(예, 항체, 항체 단편, 또는 펩타이드 또는 비펩타이드 부분에 접합된 단백질)의 보관 방법을 제공한다. 이러한 방법은 추가 제조에 필요할 때까지, 예컨대 세포독소에 접합된 약물 제조에 또는 검출가능하게 표지된 시약 제조에 필요할 때까지 단백질을 보관하거나 또는 예컨대 펩타이드 또는 비펩타이드 부분에 접합을 통한 변형 등으로 변형된 단백질을 보관하는데 특히 유용하다.

본 발명에 따른 제형의 일부로서 단백질(예, 항체)의 보관은 안정화제 및/또는 동결보호제를 함유하는 제형에 비해 하위 공정에 이용용이성을 증가시킨다.

제형은 또한 예컨대 안정한 모노클로날 항체 약물을 제공하거나 또는 강력한 항암제와의 접합, 동결건조 또는 비경구 투여용 액제 제조와 같은 추가 공정의 약물 중간제형을 제공하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 약물 보관 방법은 계면활성제, 동결보호제를 함유하지 않고 완충액 농도가 비교적 낮은(예컨대, 약 10mM 내지 약 20mM) 수용액의 일부로서, 선택된 분리 단백질을 보관하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이 제형의 염 농도는 비교적 낮으며, 일반적으로 약 100mM 미만, 예컨대 약 0mM 내지 약 50mM, 약 1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 10mM 또는 약 5mM 내지 약 10mM 범위이다.

앞에서 기술하고 청구의 범위로부터 분명히 알 수 있는 장점 외에도, 본 명세서에 기술된 바와 같이 보관된 단백질은 시료(예컨대, 분액된 단일 제제로부터의 단백질 시료들 및 본 명세서에 기술된 제형을 사용하여 보관된 분액들) 간의 재현성이 양호하다. 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같이 보관된 단백질은 보관 후 일반적으로 효과적으로 가공되는데, 예컨대 동결보호제 및/또는 계면활성제와 함께 보관된 단백질보다 더욱 효율적으로 접합된다.

본 발명은 다음 실시예를 통해 더욱 상세히 설명될 것이다. 이러한 실시예는 오로지 예시하기 위한 것이다. 따라서, 실시예가 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

실시예 1: pH

항루이스 Y

항체가 안정한 pH 범위를 조사하기 위하여, 1mg/ml 항루이스 Y 시료를 pH 4 내지 8 범위, 구체적으로, pH 4.0, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 8.0로 제조했다. 본 실시예 및 이하에 기술되는 실시예에서, 시료는 일반적으로 5ml Teflon^® PFA 바이엘(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL)에 넣어, 예컨대 시료 총 부피가 2ml가 되게 제조했다. 단백질 농도는 Costar^® 96웰 UV 평판(Corning, Corning, NY)의 시료를 분석하는 Spectra Max^® PLUS 분광광도계(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)로 280nm에서 UV 흡광도를 사용하여 측정했다. 단백질 농도의 계산은 비흡광도계수 1.36(mg/ml)^-1cm^-1를 사용하여 실시했다. 시료는 선택된 pH의 10m 인산칼륨 완충액을 함유하는 pH 완충액에서 투석하여 제조했다. 각 시료에는 추가로 75mM NaCl을 첨가했다. 제조한 시료를 멸균 여과하고 -80℃ 동결기에 넣거나 또는 5℃ 또는 40℃로 유지되는 안정성 챔버에 넣었다. 4주 후, 시료를 SEC-HPLC(크기배제크로마토그래피-고성능액체크로마토그래피)를 이용하여 고분자량 종 및 저분자량 종의 존재에 대해 분석했다. SEC-HPLC 분석은 분리 컬럼으로서 TosoHaas(PA, Montgomeryville) BIOSEP G3000SW_XL을 이용하여 당업계에 공지된 방법으로 수행했다.

동결 시료는 분석하기 전에 37℃ 수조에 넣어 해동시켰다.

고분자량 종의 발생은 pH에 따라 증가했지만, 고분자량 종이 pH 함수로서의 주요 분해 산물은 아니었다(도 1A). 40℃에서 보관된 시료의 저분자량 종에 대한 pH 프로필은 V형이었고, pH 5.5에서 저분자량 종이 최소였다(도 1B). 따라서, 항루이스 Y 항체는 -80℃ 내지 5℃의 온도 범위와 pH 4.0 내지 8.0 범위에서 안정했다.

CEX-HPLC(양이온교환크로마토그래피-HPLC)는 시료의 안정성을 추가로 평가하는데 사용했다. 이 분석은 Dionex(Ca, Sunnyvale) ProPac WCX-10 컬럼을 이용하여 실시했다. 분석 결과, 40℃에서 보관 시료 중에서 pH가 높을수록 산성 종의 농도가 증가하는 것으로 확인되었다(도 2). 하지만, 5℃와 -80℃에서 보관된 시료에서 항루이스 Y는 pH 전 범위에서 안정했고, 이는 상기 SEC-HPLC 데이터의 결론을 확인시켜주었다.

안정성을 평가하는 또 다른 방법으로서, 환원 또는 비환원 조건 하에서 진행되는 4 내지 20% 겔을 사용하는 SDS-PAGE로 40℃에서 보관된 시료를 추가 분석했다. 이 실험에서는 분자량의 최소 변화량, 즉 최대 안정성이 pH 5.0 내지 6.0 범위의 시료에서 확인되었다(도 3). 즉, 40℃에서 보관되어야 하는 시료(예, 항체)는 pH 약 5.0 내지 6.0 사이에서 가장 잘 유지된다.

또한, 등전집중(IEF) 전기영동을 사용하여 40℃에서 보관된 시료를 추가로 평가했다. IEF 전기영동은 단백질 분해의 결과로서 산성 종이 생산됨에 따른 항체 시료의 pI 변화를 모니터하는데 사용했다.

항체 시료의 SDS-PAGE 분석 결과와 마찬가지로, pH 5.0 내지 5.5 범위의 시료가 총 단백질 전하의 최소 변화량을 나타냈다(도 4).

보관의 1가지 중요한 관점은 시간이 경과함에 따른 제형 pH의 안정성이다. 따라서, 시료의 pH를 실험 개시 시, 2주 후, 그리고 4주 후에 3가지 모든 실험 온도에서 분석했다. 모든 시료의 초기 pH에는 큰 편차가 없었다(표 1).

동시에, 앞에 제시된 데이터는 항루이스 Y가 -80℃ 내지 5℃ 범위의 온도와 pH 4 내지 8 범위에서 안정하다는 것을 증명한다. 일반적으로, 이 항체의 보관에 바람직한 pH는 약 5.5이다. 또한, 상기 데이터는 40℃에서의 항체의 보관에 비교적 바람직한 조건을 제공한다.

일반적으로, pH는 2 이상의 온도 범위에서, 예컨대 시료가 0℃ 이하에서 보관될 때, 시료가 약 0℃ 내지 15℃에서 보관될 때, 시료가 약 15℃ 내지 40℃에서 보관될 때, 안정성을 나타내는 단백질 보관인 경우에 선택한다. 다른 비제한적 예로서, 시료가 약 -80℃, 5℃ 및 40℃에서 보관될 때 안정성을 나타내는 단백질 보관인 경우에 선택한다.

항CD22

정상 및 악성 성숙 B세포의 표면에서 발현되는 CD22를 표적으로 하는 사람화된 IgG4 항체인, 제2 항체(항CD22)의 보관에 미치는 pH 효과도 검사했다. 항CD22의 이론적 pI는 약 8.5이다. 가수분해는 pH 5.0 이하에서 일어날 가능성이 있는 반면, 탈아미드화는 7.5가 넘는 pH에서 일어날 가능성이 있다. 따라서, 단백질의 안정성에 미치는 pH 효과를 검사하고, 분석 절차의 안정성 표시능을 평가하며, 단백질 보관 제형에 적당한 pH의 선택에 이론적 근거를 제공하기 위하여 pH 4에서 8에 이르는 실험을 설계했다.

항CD22를 함유하는 시료는 검사되는 pH의 다양한 완충액에 0.5mg/ml 항CD22를 첨가하여 제조했다. 시료는 pH 4.0(10mM 숙시네이트), 5.0(10mM 시트레이트), 5.5(10mM 숙시네이트), 6.0(10mM 히스티딘), 6.5(10mM 히스티딘), 7.0(10mM 포스페이트) 또는 8.0(10mM Tris)에서 5℃, 25℃ 또는 40℃ 하에 2주 동안 보관했다. SEC-HPLC를 이용하여 시료에 존재하는 고분자량 종의 백분율을 분석했다. 이러한 시료들(각각 0.5mg/ml 항CD22를 함유한다)에서는 2주 후에 초기 조건 하에 존재하는 고분자량 종의 함량에 비해, pH 5.0 내지 8.0 범위의 시료에 존재하는 고분자량 종의 백분율이 크게 증가하지 않았다(도 5).

항CD22와 같은 항체가 추가(하위) 공정에 사용되어야 할 때에는 추가 공정에 적당한 완충액중에 중간 물질이 제공되어야만 한다. 예를 들어, 항CD22에 칼리케아미신의 접합은 pH 7 내지 8.5에서 1차 아민을 함유하지 않는 완충액에서 수행될 수 있다. 하지만, 중간 물질이 접합 완충액에 반드시 제공되어야할 필요는 없다. 하지만, 본 실시예에서는 완충액 성분에 있는 1차 아민이 접합 절차를 방해할 것이므로, 중간물 제형이 억제될 수 있을 것이다. 1차 아민을 함유하지 않는 용액에서의 단백질 보관을 조사하기 위하여, 항CD22를 25mg/ml로 농축시키고 50mM HEPES(pH 7.6), 50mM 숙시네이트(pH 6.0) 또는 50mM 숙시네이트 + 50mM HEPES(pH 7.0)로 정용여과하거나 투석하여 실험했다. 각 시료를 최대 2주 동안 안정성에 대해 검사했다. 시료는 75mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 제조하고 -80℃, 4℃ 또는 40℃에 보관했다. 시료의 분석은 보관 0 시간째, 1주 및 2주째 A₂₈₀/A₃₂₀, SEC-HPLC, SDS-PAGE 및 IEF(2주 째)로 실시했다.

이 실험의 데이터는 pH 6.0(숙시네이트 완충액)이 pH 7.0(HEPES) 또는 배합물의 pH 7.6(HEPES와 숙시네이트)보다 더 우수한 안정성을 제공한다는 것을 보여주었다(도 6).

또한, SEC-HPLC는 75mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 -80℃, 5℃ 또는 40℃에서 2주 동안 보관된, 숙시네이트, HEPES 또는 배합물(앞에서 기술한 바와 같다)의 pH 6.0, 7.0 또는 7.6에서 25mg/ml 항CD22를 함유하는 시료에 존재하는 고분자량 종의 백분율을 평가하는 데에도 사용했다. 실험 데이터는 염(NaCl)이 상기 시료에서 고분자량 종이 형성되는데 어떠한 유의적 영향도 미치지 않는다는 것을 보여주었다(도 6). 즉, 염의 존재는 항체의 보관에 중요한 조건이 아니었다.

실시예 2: pH/완충액

다른 완충액이 다른 pH에서 유리한 보관 조건을 제공하는지 여부를 측정하기 위하여, 보관된 시료로서 항루이스 Y 항체를 이용하여 임시 "최적" pH보다 pH 0.5 유닛 이상과 이하에서 완충액을 검사했다. 이 실험에서는 4가지 다른 완충액 시스템을 pH 5.0 내지 6.0 범위에서 검사했다. 또한, 다양한 이온 강도가 안정성에 미치는 효과도 평가했다. 이 실험에 사용된 완충액은 10mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0, 5.5 및 6.0; 10mM 나트륨 아세테이트, 75mM NaCl, pH 5.0, 5,5 및 6.0; 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.0, 5.5 및 6.0; 10mM 나트륨 시트레이트, 75mM NaCl, pH 5.0, 5.5 및 6.0; 10mM 나트륨 숙시네이트 pH 5.0, 5.5 및 6.0; 10mM 나트륨 숙시네이트, 75mM NaCl, pH 5.0, 5.5 및 6.0이다. 본 실험에서, 항루이스 Y는 상기 완충액들에서 투석하고 최종 농도 1mg/ml로 희석했다. 그 다음, 시료를 -80℃ 또는 40℃에서 최대 4주 동안 보관한 후, SEC-HPLC를 이용하여 고분자량 종의 백분율 및 저분자량 종의 백분율을 분석했다. 본 실험에서, 고분자량 종은 주요 분해물이 아니며, 다른 제형 간에 고분자량 종의 수준 차이는 무시할 정도인 것으로 확인되었다(도 7A). pH 5.5에서, 나트륨 시트레이트 시료는 검사된 모든 완충액(NaCl의 존재 또는 부재 하에) 중에서 저분자량 종이 가장 낮은 것으로 확인되었다(도 7B).

또한, 시료를 CEX-HPLC로 추가 분석했다. 이 분석 데이터는 검사된 4가지 완충액마다 모두, pH가 더 높은 시료들에 존재하는 산성 종의 백분율이 증가한다는 점에서, 상기 SEC-HPLC 데이터의 종합 결과를 확인시켜 주었다(도 8). 즉, pH 5.0 내지 6.0 범위에서는 모든 완충액마다 산성 종이 증가하는 경향이 있다.

이러한 데이터는 종합적으로, 항루이스 Y의 안정성이 pH 5.0 내지 6.0 범위에서는 검사된 4가지 완충액(나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 인산나트륨 및 나트륨 숙시네이트) 모두에서 유사했음을 입증해준다. 더욱이, 가속 안정성 연구(40℃에서의 안정성 검사; 도 7B)에서는 나트륨 시트레이트 완충액을 함유하는 시료에서의 저분자량 종 형성이 가장 낮았다. 따라서, 항루이스 Y에 유리한 완충액은 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5이다. 따라서, 상기 데이터는 항체와 같은 단백질의 보관에 유리한 제형을 동정하는 방법을 확인시켜준다.

실시예 3: 염 농도 및 단백질 농도

보관 제형에서 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 매개변수로서, 염 농도를 조사했다. 또한, 저단백질 농도에서의 보관 안정성을 실시예 2에 기술된 가속 분해 프로토콜에 따라 평가했다. 이 실험에서는 단백질 농도 1mg/ml일 때 NaCl의 첨가가 저분자량 종의 형성을 약간 촉진시키지만(도 7B), 검사된 모든 완충액에서의 산성 종 형성은 억제(도 8)한다는 것을 보여주었다.

여러 몰농도의 NaCl을 함유하는 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5에서 항루이스 Y의 안정성을 평가하기 위하여 CEX-HPLC 및 SEC-HPLC를 이용했다. 이 데이터는 항루이스 Y가 0 내지 150mM NaCl을 함유하는 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5에서 5℃ 및 -80℃에서 안정하다는 것을 보여주었다(도 9A). 가속 분해는 단백질 농도가 30mg/ml인 경우에, NaCl이 산성 종의 발생을 억제하지만(도 9A), 저분자량 종의 형성은 상승시키고(도 9C), 고분자량 종의 형성은 다른 조건마다 비교적 안정하다는 것(도 9B)을 보여주어, 1mg/ml 단백질을 함유하는 시료의 연구 결과(도 7 및 8)를 확인시켜 주었다. 즉, 75mM NaCl의 염 농도는 종합적인 분해를 최소화하는데 가장 바람직한 것으로 확인되었다.

진탕 하에서의 안정성

단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 조건은 시료에서 진행되는 진탕의 정도이다. 즉, 보관 제형은 시료가 진탕될 때 일정한 정도의 안정성을 보존하는 것이 바람직하다. 다양한 조건 하의 제형에서 진탕 하에 항온처리했을 때 항루이스 Y의 안정성을 검사하기 위해 실험을 실시했다. 본 실험에서는, 150mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5에 1mg/ml 또는 30mg/ml 항루이스 Y를 첨가한 제형을 실온에서 24시간 동안 360rpm으로 진탕시켜 검사하고, 단량체 회수율을 SEC-HPLC로 분석했다.

본 실험은 항체가 30mg/ml 농도로 존재할 때 진탕 처리되어도 안정하다는 것을 보여주었다(도 10). 또한, 1mg/ml 농도에서 NaCl은 단량체 회수율을 약간 저하시키는 것으로 관찰되었다.

따라서, 본 발명의 간단한 보관 제형은 진탕에 의해 유도된 스트레스로부터 시료를 충분히 보호할 수 있다.

동결/해동 하에서의 안정성

다양한 제조 방법에 사용되는 단백질은 반드시 동결-해동 사이클로 처리되어야 하고, 때로는 다회 동결-해동 사이클로 처리되어야 한다. 따라서, 동결-해동 사이클로 인한 분해를 최소화하는 조건을 제공하는 것이 보관 제형에 유리하다. 또한, 단백질을 최적 보존할 수 있는 동결 및 해동 조건을 측정하는 것도 유용하다. 이러한 매개변수를 검사하기 위하여, 150mM NaCl의 존재 또는 부재 하에 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 중에 1mg/ml 또는 30mg/ml 항루이스 Y를 함유하는 시료를 제조했다. 이 시료들을 그 다음 급속 동결/급속 해동, 급속 동결/저속 해동, 저속 동결/급속 해동 또는 저속 동결/저속 해동 조건 하에 10회의 동결-해동 사이클로 처리했다. 급속 동결은 시료를 액체 질소 중에서 동결시켜 수행했고, 저속 동결은 시료를 -80℃에 방치하여 수행했다. 급속 해동은 시료를 37℃ 수조에 넣어 해동시켜 수행했고, 저속 해동은 시료를 실온에서 방치하여 수행했다. 그 다음, 각 시료에 존재하는 단량체 함량은 SEC-HPLC로 평가했다.

실험 결과, 항루이스 Y는 동결/해동 조건이나 NaCl 농도에 관계없이 높은 단백질 농도(30mg/ml)에서 안정한 것으로 확인되었다(도 11A 및 도 11B). 항루이스 Y는 단백질 농도, 해동 조건 또는 NaCl 농도에 관계없이 저속 동결 조건 하에서 안정했다. 하지만, 1mg/ml 농도에서 제형 중의 NaCl은 급속 동결 조건 하에 회수율을 약간 저하시켰다.

이러한 결과에 비추어 볼 때, 항루이스 Y는 0mM 내지 150mM 범위의 NaCl 농도에서 -80℃ 및 5℃에서 안정한 것으로 결론지을 수 있다. 또한, 가속 안정성 연구(40℃에서 제형의 연구)는 NaCl이 산성 종 형성을 약간 감소시키는 한편 저분자량 종의 발생을 촉진시키는 것을 보여주었다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, 75mM NaCl이 항루이스 Y의 종합적인 분해를 최소화하는데 최적인 것으로 확인되었다.

또한, 본 실험은 본 명세서에 기술된 제형에서 보관되는 특정 단백질에 바람직한 조건을 동정하는 방법을 확인해준다.

항CD22

여러 단백질 간에 보관 조건의 다양성을 조사하고, 추가로 특정 단백질의 보관 제형을 동정하는 방법을 확인하기 위해, 항CD22의 보관 안정성을 조사했다. 본 실험에서는 25mg/ml(도 6) 항CD22를 함유하는 제형을 원하는 pH를 얻기 위하여 각종 완충액, 즉 pH 6.0(50mM 숙시네이트), pH 7.0(50mM 숙시네이트과 50mM HEPES), pH 7.6(50mM HEPES)으로 제조하고, 1개월 동안 -80℃, 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 보관한 뒤, 고분자량 종의 백분율을 평가했다.

검사된 어떠한 온도에서도, 높은 단백질 농도(도 6 및 도 12)의 항CD22 보관 안정성에 NaCl이 미치는 효과는 없는 것으로 확인되었다.

진탕 스트레스 하에서의 안정성

진탕 연구는 NaCl 및 폴리소르베이트 80의 존재 하에 항CD22에 미치는 표면/공기 상호작용 효과를 측정하기 위해 수행했다. 본 연구는 또한 운송 및 제조 중에 액체로서의 항CD22의 안정성을 평가하기 위해 수행했다. 본 실험에서, 시료는 75mM NaCl, 0.1% 폴리소르베이트 80 첨가 또는 75mM NaCl+0.1% 폴리소르베이트 80(Tween) 첨가 하에 20mM 숙시네이트 완충액 pH 6.0 중에 항CD22 15mg/ml를 첨가하여 제조했다. 시료는 300rpm에서 24시간 동안 진탕시켰다. 또한, 숙시네이트 완충액에 항CD22만을 함유하는 대조군도 제조했다. 그 다음, 고분자량 종의 백분율을 분석했다. 분석 데이터는 NaCl 또는 폴리소르베이트 80이 진탕 중에 항CD22의 안정성에 이롭지 않음을 보여주었다(도 13).

종합해 보면, 앞에 제시한 보관 제형 중의 항CD22에 대한 데이터는 NaCl이 항CD22 종합적인 안정성에 어떠한 실질적인 영향을 미치지 않는다는 것을 입증해준다. 따라서, NaCl은 항CD22 제형에 전혀 필요하지 않다.

실시예 4: 항체 농도

제형에서의 보관 안정성에 단백질 농도가 미치는 효과를 조사했다. 바람직한 단백질 농도의 측정은 특정 단백질에 대한 보관 제형을 동정할 때, 뿐만 아니라 제형에서 이 매개변수의 중요성에 관한 일반적인 이론을 밝혀낼 때에도 필요하다.

본 실험에서는 항루이스 Y를 1mg/ml 또는 30mg/ml 농도로 10mM 시트레이트 pH 5.5에 첨가하고, NaCl 무첨가 또는 75mM NaCl 첨가 하에 시료를 제조했다. 시료는 40℃에서 4주 동안 보관한 다음, 고분자량 종의 백분율 변화(도 14A), 저분자량 종의 백분율 변화(도 14B), 및 산성 종의 백분율 변화(도 14C)에 대해 분석했다.

본 실험 결과, 1mg/ml 및 30mg/ml를 함유하는 제형의 안정성이 유사한 것으로 나타났고, 낮은 농도(1mg/ml)가 NaCl의 존재에 단지 약간 더 민감한 것으로 나타났다.

지속적인 안정성은 보관 제형에 특히 필요한 것이다. 따라서, 항루이스 Y 30mg/ml를 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중에 함유하는 30mg/ml 항루이스 Y 제형의 다양한 온도, 즉 -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 및 40℃에서의 안정성을 측정하는 연구를 실시했다. 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 및 9개월 째, 시료의 고분자량 종의 백분율(도 15A), 저분자량 종의 백분율(도 15B) 및 산성 종의 백분율(도 15C)에 대해 검사했다. 이 분석 데이터는 항루이스 Y가 10mM 나트륨 시트레이트, 75mM NaCl, pH 5.5 제형에서 -80℃ 내지 5℃ 범위의 온도 하에 9개월 동안 보관된 후에도 단백질 안정성이 양호하다는 것을 보여주었다.

동결/해동 및 진탕 안정성

앞에서 확인된 바와 같이(도 10 및 도 11), 항루이스 Y는 30mg/ml 농도에서 진탕 및 동결/해동 스트레스에 민감하지 않은 것으로 나타났다. 또한, 항루이스 Y는 해동 속도에 관계없이 1mg/ml 농도일 때 저속 동결에 민감하지 않았으나, 급속 동결 조건 하에 두었을 때 및 교반 하에서는 1mg/ml 항루이스 Y 농도일 때 단백질 손실이 관찰되었다.

항CD22/동결/해동

동결-해동 사이클의 효과를 추가로 조사하기 위하여, 1mg/ml 또는 25mg/ml 농도의 항CD22를 20mM 숙시네이트 pH 6.0과 경우에 따라 폴리소르베이트 80(0.001%) 함유 제형에 첨가하여, 0회, 1회, 5회 또는 10회 실시되는 다양한 동결-해동 섭생으로 처리했다. 이 섭생은 급속 동결/급속 해동(FF/FT), 급속 동결/저속 해동(FF/ST), 저속 동결/급속 해동(SF/FT) 및 저속 동결/저속 해동(SF/ST)이다. 그 다음, HMV 종의 백분율을 분석했다.

이 분석 데이터는 25mg/ml 항CD22가 폴리소르베이트 80의 존재에 관계없이 동결/해동 스트레스에 민감하지 않음을 보여주었다(도 16B 및 도 16D). 하지만, 1mg/ml 농도에서는 항CD22는 급속 동결에 민감했다(도 16A 및 도 16C). 즉, 이 항체의 경우에는 시료가 동결-해동 사이클로 처리되어야 한다면, 계면활성제를 반드시 필요로 하지는 않지만 높은 농도로 보관되어야 하는 조건이 선택되어야 한다.

보관 안정성

도 5와 6은 항CD22가 0.5mg/ml 및 30mg/ml 농도에서 -80℃ 내지 5℃에서 안정함을 증명하는 실험 결과를 보여준다. 40℃에서, 2주 보관 후 단백질 농도가 높은 시료에서는 고분자량 종의 백분율이 증가했다(도 6). 이에 반해, 단백질 농도가 낮은 시료에서는 고분자량 종의 백분율에 어떠한 변화도 없었다(도 5).

실시예 5: 계면활성제 효과

단백질 시료의 보관에 관한 많은 프로토콜들은 계면활성제의 첨가를 요구한다. 따라서, 보관 제형에 계면활성제의 첨가 필요성을 조사했다. 본 실험에서는 경우에 따라 폴리소르베이트 80 0%, 0.001%, 0.005% 또는 0.01%를 함유하는 10mM 나트륨 시트레이트 완충액에 항루이스 Y를 1mg/ml 또는 30mg/ml 농도로 첨가하여 실온에서 24시간 동안 360rpm 진탕하에 항온처리했다. 그 다음, 단량체 회수율을 SEC-HPLC로 분석했다.

분석 데이터는 제형 중의 상기 단백질이 비교적 고농도 30mg/ml로 존재할 때에는 폴리소르베이트 80이 필요하지 않은 것으로 나타났다. 1mg/ml 농도에서는 폴리소르베이트 80이 진탕 스트레스에 대해 항루이스 Y를 약간 보호하는 작용을 하는 것으로 나타났다(도 17A 및 도 17B).

동결/해동 안정성

다양한 동결/해동 조건 하에서 항루이스 Y 안정성에 미치는 폴리소르베이트 80의 효과를 조사했다. 본 실험에서, 시료는 폴리소르베이트 80 무첨가 또는 0.01% 폴리소르베이트 80 함유의 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5에 항루이스 Y 항체 1mg/ml 또는 30mg/ml를 첨가한 시료를 제조했다. 그 다음, 시료를 앞에서 기술한 바와 같은 동결/해동으로 10회 처리했다.

30mg/ml 농도에서, 항루이스 Y는 계면활성제의 존재와 관계없이 동결/해동 스트레스에 민감하지 않았다(도 18B). 또한, 항루이스 Y는 단백질 농도 또는 해동 조건에 관계없이 저속 동결 조건 하에서 안정했다(도 18A 및 도 18B). 단백질 농도가 30mg/ml이거나 저속 동결이 사용되면 폴리소르베이트 80은 결과에 영향을 미치지 않았다. 항체 1mg/ml를 함유하는 시료에서, 폴리소르베이트 80은 급속 동결 조건 하에서 항루이스 Y를 보호했다(도 18A).

보관 안정성

항루이스 Y의 보관 안정성에 미치는 계면활성제의 효과를 조사했다. 본 실험에서, 시료는 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5와 75mM NaCl 중에 항루이스 30mg/ml를 첨가하여 제조했다. 또한, 시료에는 0.001% 폴리소르베이트 80을 첨가하거나 첨가하지 않았다. 시료는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 9개월 동안 -80℃, -20℃, 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 항온처리했고, 각 시료의 고분자량 종의 백분율, 저분자량 종의 백분율 및 산성 종의 백분율을 본 명세서에 기술된 바와 같이 분석했다.

일반적으로, 본 실험은 폴리소르베이트 80이 전 온도 범위, 즉 -80℃ 내지 40℃에 걸친 검사 조건 하에서 항루이스 Y의 안정성에 어떠한 유의적인 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다(도 19A, 도 19B 및 도 19C).

종합해보면, 항루이스 Y를 이용한 실험 결과는 30mg/ml 농도에서 항루이스 Y가 진탕 및 동결/해동 스트레스 조건 하에서 안정하다는 것을 증명해준다. 이러한 안정성에 계면활성제는 필요하지 않았다. 1mg/ml 농도에서는 저속 동결 조건일 때 항루이스 Y가 안정했다. 계면활성제는 이러한 조건에 영향을 미치는 데 있어서 아무런 효과가 없었다. 더욱이, 1mg/ml 항체 농도에서 폴리소르베이트 80은 교반 및 급속 동결 유도 변성에 대하여 항루이스 Y를 보호하지만, 일반적으로 계면활성제는 보관 중인 단백질의 안정성에 어떠한 유의적인 효과가 없었다.

항루이스 Y의 결과와 달리, 폴리소르베이트 80은 진탕 스트레스에 대하여 항CD22를 전적으로 보호하는 것은 아니었다(도 13). 하지만, 도 16의 데이터에 나타난 바와 같이, 25mg/ml 항CD22는 동결/해동 스트레스 하에 안정했고, 어떠한 계면활성제도 필요하지 않았다. 1mg/ml에서 항CD22는 저속 동결 조건 하에 안정했고, 계면활성제를 전혀 필요로 하지 않았다. 계면활성제는 급속 동결 조건 하에서만 항CD22에 부가적인 보호 역할을 했다.

항CD22에 미치는 계면활성제의 효과를 추가 조사하기 위하여, 6개월간 항CD22 안정성 연구를 수행했다. 본 실험에서는 25mg/ml 농도의 항CD22를 20mM 숙시네이트 pH 6.0(S); 20mM 숙시네이트, 10mM 메티오닌 pH 6.0(SM); 20mM 숙시네이트, 0.01% 폴리소르베이트 80 pH 6.0(ST); 또는 20mM 숙시네이트, 10mM 메티오닌, 0.01% 폴리소르베이트 80 pH 6.0(SMT)중에 첨가하여, -80℃, 2-8℃, 25℃ 또는 40℃에서 6개월 동안 항온처리했다. 그 다음, 시료를 고분자량 종의 백분율, 총 피크 면적 백분율(회수 지표이다) 및 총 활성 종의 백분율에 대해 분석했다. 특히, 피크 5는 완전 활성 종이었다.

일반적으로, 항CD22의 안정성에 어떠한 유의적인 영향을 미치는 매개변수는 없었다(도 20A, 도 20B 및 도 20C).

종합적으로, 다른 두 항체(항루이스 Y 및 항CD22)의 단기 보관 데이터 및 장기 보관 데이터는 보관 제형에서 항체의 안정성에 계면활성제(폴리소르베이트 80)가 필요하지 않다는 것을 입증해준다.

실시예 6: 항5T4 보관용 제형

단백질 보관용 제형을 결정하는 또 다른 예로서, 5T4에 대한 항체 보관을 위한 매개변수, 염 농도, pH, 단백질 농도 및 완충액 종류와 농도를 평가했다.

pH

항5T4 항체 보관용 제형에 사용하기에 유리한 pH를 동정하기 위하여 1mg/ml 항5T4를 함유하는 시료를 pH 4.0 내지 pH 8.0 범위에서 검사했다. 시료는 각 pH 완충액으로 투석하여 제조했다. 본 실험에 사용한 모든 제형은 150mM NaCl 존재 또는 부재 하에 10mM 인산나트륨 완충액을 이용했다. 제형의 단백질을 멸균 여과하고, -80℃ 동결기에 넣거나, 또는 5℃, 25℃ 또는 40℃로 유지되는 안정성 챔버에 방치했다. 그 다음, 고분자량 종(HMW)의 존재에 대해 시료를 분석했다(도 21).

항5T4는 10mM 인산나트륨 완충액에 첨가했을 때 pH 전범위에서 5℃, 25℃ 및 40℃일 때 NaCl의 부재 하에서 고분자량 종의 함량이 가장 낮은 것으로 관찰되었다. 완충액으로서 인산나트륨 pH 8과 NaCl을 함유하는 제형에서는 항체가 pH 7에서의 동결/해동 사이클에 안정적이지 않았다. 또한, 40℃, 150mM NaCl 존재 하에 pH 4에서는 단백질이 불안정한 것으로 관찰되었다.

다양한 pH로 제조되어 보관되고(앞에 기술한 바와 같이), 2주 동안 40℃에서 보관된 시료에 대해 등전집중(IEF)을 실시했다. pH 4(NaCl 없이)에서, pH 5과 pH 6(NaCl 존재 또는 부재)에서 제형에 보관된 시료는 전 단백질 전하에서 가장 적은 변화량을 나타내는 것으로 관찰되었다.

또한, 2주 동안 40℃에서 보관된 항5T4 pH 스크린 시료를 가지고 SDS-PAGE 분석도 실시했다. pH 5.0 내지 pH 7.0 범위의 시료는 비환원 겔에서 가장 적은 고분자량 종 함량을 나타냈고, 환원 겔에서 출발 물질에 비해 단백질 분자량의 가장 적은 변화량을 나타냈다.

이러한 데이터는 항5T4가 NaCl 존재 또는 부재 하에, -80℃, 5℃ 및 25℃에서 pH 4.0 내지 pH 7.0의 pH 전 범위의 10mM 인산나트륨에서 안정하다는 것을 입증해주었다. pH 스크린의 가속 실험 결과(즉, 높은 온도에서 수득된 결과)에 따르면, pH 5 내지 pH 6이 항5T4 안정성의 유리한 pH 범위로서 선택된다.

완충액

4가지 다른 완충액 시스템을 이용하여 5.0 내지 7.0의 pH 범위에서 제형에 존재하는 항5T4의 보관 안정성을 검사했다. 또한, 안정성에 미치는 이온 강도의 효과도 평가했다. 사용된 완충액 시스템은 다음과 같다: 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0; 10 mM 나트륨 아세테이트 5.5; 10 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.0; 10 mM 나트륨 아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.5; 10 mM 나트륨 시트레이트, pH 5.0; 10 mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5, 10 mM 나트륨 시트레이트, pH 6.0; 10 mM 나트륨 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 5.0; 10 mM 나트륨 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 5.5; 10 mM 나트륨 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 6.0; 10 mM 인산나트륨, pH 6.0; 10 mM 인산나트륨, pH 6.5; 10 mM 인산나트륨, pH 7.0; 10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 6.0; 10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 6.5; 10 mM 인산나트륨, 150 mM NaCl, pH 7.0; 10 mM 나트륨 숙시네이트, pH 5.0; 10 mM 나트륨 숙시네이트, 5.5; 10 mM 나트륨 숙시네이트, pH 6.0; 10 mM 나트륨 숙시네이트, pH 6.5; 10 mM 나트륨 숙시네이트, 150 mM NaCl, pH 5.0; 10 mM 나트륨 숙시네이트, 150 mM NaCl, pH 5.5; 10 mM 나트륨 숙시네이트, 150 mM NaCl, pH 6.0; 및 10 mM 나트륨 숙시네이트, 150 mM NaCl, pH 6.5.

항5T4는 상기 완충액으로 투석하고 최종 농도가 2mg/ml이 되게 희석했다. 시료는 최대 4주 동안 -80℃와 40℃에서 보관한 다음, SEC-HPLC를 사용하여 초기 시료(보관 전) 및 4주간 보관 후 시료를 분석했다. 분석 데이터(도 22)에 따르면, 고분자량 종은 주요 분해 산물이 아니며, 보관 4주 후 각 제형의 고분자량 종의 백분율이 초기 시료에 존재하는 고분자량 종의 백분율과 유사하거나 보다 적은 것으로 관찰되었다. 저분자량 종은 NaCl 함유 제형 대부분에서 상승되었다.

단백질(항5T4)의 열 안정성에 미치는 다양한 제형의 보관 효과를 평가하기 위하여 열 융해(T_m)를 수행했다. 시차주사열량계(DSC)를 이용하여 온도기록도를 수득했다. 이러한 온도기록도의 예는 도 23A에 도시했다. 시차주사열량계 결과는 도 23B에 도시했다.

pH가 5.0인 제형의 단백질은 이 제형이 완충액으로서 시트레이트 또는 숙시네이트를 사용할 때 열안정성이 가장 낮았다. NaCl은 각 pH/완충액 조건에서 대응하는 NaCl 부재 제형에 비해 T_m 값을 저하시키는 바, 열적 불안정화 요인인 것으로 관찰되었다. 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 및 포스페이트 완충액에서 pH 5.5 내지 7.0 범위의 다른 모든 제형은 최고의 T_m을 나타냈고, 따라서 열 안정성이 가장 높았다.

또한, 항5T4의 안정성을 분석하기 위하여 CEX-HPLC를 사용했다. 본 연구에서는 40℃에서 4주 동안 보관한 시료를 가지고 CEX-HPLC를 수행했다. 그 결과는 도 25에 도시했는데, 검사된 4가지 완충액 모두에서 pH가 높을수록 산성 종 백분율의 증가 및 염기성 종 백분율의 감소를 보여주었다. 또한, NaCl을 함유하는 일부 제형도 대응하는 NaCl 부재 제형보다 산성 종의 수준은 더 높고 염기성 종의 수준은 더 낮았다.

다양한 제형의 안정성을 추가 분석하기 위하여, 40℃에서 4주 보관한 시료의 환원 SDS-PAGE를 수행했다. 이 시료의 분석 결과, pH 5.5 및 pH 6.0의 제형에 보관된 시료가 환원 겔에서 초기 시료에 비해 단백질 분자량의 가장 적은 변화량을 유지하는 것으로 확인되었다.

일반적으로, 이러한 데이터들은 본 실험에 사용된 항5T4 단백질이 pH 5.5-6.5의 pH에서 보관되었을 때 검사된 4가지 완충액(나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 인산나트륨 및 나트륨 숙시네이트) 모두에서 유사한 안정성을 나타낸다는 것을 보여주었다. 가속 안정성 연구에서는 저분자량 종의 가장 적은 양이 NaCl을 함유하지 않는 제형에서 형성되었음을 보여주었다.

염(NaCl)의 효과

전술한 바와 같이, 항5T4는 150mM NaCl 존재 하에 pH 5-6의 10mM 인산나트륨 제형 중에서 -80℃, 5℃ 및 25℃ 하에 안정하다. 하지만, NaCl은 안정성을 개선시키지 않는 바, 어떠한 안정성 잇점을 제공하지 않는다(도 21).

40℃에서 가속 안정성 연구 결과, NaCl은 고분자량 및 저분자량 형성을 촉진하고 항체의 열안정성을 저하시키는 것으로 확인되었다(도 22, 도 24A, 도 24B 및 도 25).

항체 농도

저장 안정성에 미치는 항체(단백질) 농도의 효과를 조사했다. 본 실험에서는 좁은 pH 범위, 즉 5.5에서 6.5 범위에서 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 및 나트륨 숙시네이트 완충액 시스템을 다시 검사했다. 항5T4를 상기 완충액들로 투석하고 최종 농도가 2mg/ml이 되게 희석했다. 또 다른 시료 세트는 30mg/ml 농도를 시트레이트 또는 숙시네이트에 첨가하여 제조했다. 시료를 최대 6주 동안 -80℃와 40℃에서 보관한 뒤, 분석했다. 도 26A 및 도 26B는 이 시료들의 SEC-HPLC 분석 결과를 도시한 것이다. 일반적으로, 이 데이터들은 40℃에서 6주 후에 단백질 농도가 높은 시료에서 고분자량 종이 약간 더 많이 축적되기는 했지만 2mg/ml 제형과 30mg/ml 제형에서 유사한 안정성이 관찰된다는 것을 보여주었다.

또한, 40℃에서 6주 보관 후에 상기 시료들의 CEX-HPLC 분석을 실시했다. 40℃에서 6주 보관 후 2mg/ml의 pH 5.5 시료가 산성 종의 백분율이 약간 낮았지만, 2mg/ml 또는 30mg/ml를 함유하는 pH 5.5 제형에서의 안정성은 유사한 것으로 관찰되었다(도 27A 및 도 27B).

또한, 40℃에서 6주 동안 보관한 2mg/ml 시료를 분석하기 위하여, 모세관 전기영동 SDS(ceSDS; SDS-PAGE 등가 방법)를 수행했다. 본 실험에서, 2mg/ml 시료는 거의 유사한 안정성을 보였으나, pH 5.5 시료가 단백질 분자량의 변화가 약간 더 적은 것으로 나타났다. pH 5.5의 2mg/ml 시료는 모세관 전기영동 SDS 방법(SDS-PAGE 등가 방법)에서 단백질 MW의 변화가 약간 더 적은 바, 유사한 안정성이 관찰되었다(도 28).

동결/해동 및 진탕 안정성

0.005% 식물 유래 폴리소르베이트 80 및 3% 슈크로스 존재 또는 부재 하에 pH 5.5에서 동결/해동 및 진탕 연구 조건에서의 단백질 안정성 연구를 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 및 나트륨 숙시네이트 완충액 시스템에서 검사했다. 본 실험에서는 항5T4를 상기 완충액들로 투석하고 최종 농도가 25mg/ml 및 1mg/ml가 되게 희석했다. 시료를 액체 질소(약 -196℃) 또는 -80℃에서 동결시킨 다음, 37℃ 또는 상온에서 해동시켰다. 별도의 시료 세트를 20℃에서 24시간 동안 200rpm으로 진탕시켰다.

동결/해동 사이클 후, A₄₀₀에서의 흡광도를 측정하여 혼탁도를 분석하고, 1mg/ml 시료에 대해 고분자량 종의 백분율을 측정했다. 1회 동결/해동 사이클 후, 1mg/ml에서 항5T4는 저속 동결(SF) 조건에 약간 민감하고 급속 동결(FF) 조건(액체 질소)에 매우 민감했다. 폴리소르베이트 80은 혼탁도를 최소화했고, 1mg/ml 시료에서 고분자량 종의 백분율이 증가했다. 슈크로스는 혼탁도를 개선(최소화)했고, 휴크로스 존재 하에, 오로지 급속 동결 조건하에서만 고분자량 종의 백분율이 증가했다(도 29A 및 도 29B).

또한, 단백질(항5T4) 농도가 25mg/ml인 시료를 가지고 다회(10회) 동결/해동 사이클 후 혼탁도 및 고분자량 종의 백분율도 분석했다(도 30A 및 도 30B). 이러한 데이터는 항5T4가 25mg/ml 농도에서 동결/해동 스트레스에 민감하지 않음을 입증해주었다. 10회 동결/해동 사이클 후에는 폴리소르베이트 80 및/또는 슈크로스 첨가 시 혼탁도 및 고분자량 종의 백분율이 겨우 약간 감소했다. 또한, 혼탁도 결과는 슈크로스를 제형에 첨가할 때 항5T4 안정성에 아무런 잇점도 없으며, 일부 경우에는 유해하다는 것을 보여주었다. 제형에 아세테이트 완충액의 사용은 대부분의 동결/해동 조건 하에서 고분자량 종의 백분율 저하 및 혼탁도의 약간의 저하를 초래했다.

진탕 조건하에서의 안정성은 25mg/ml 항5T4를 함유하는 제형을 가지고 혼탁도(A₄₀₀) 및 고분자량 종의 백분율을 측정하여 분석했다. 도 31A 및 도 31B는 다양한 제형에 존재하는 시료의 혼탁도 측정 결과를 도시한 것이다. 이 데이터들은 항5T4가 시트레이트 완충액을 함유하는 제형에 존재할 때 진탕 스트레스에 매우 민감하다는 것을 보여주었다. 1mg/ml 및 25mg/ml 시료와 폴리소르베이트 80이 첨가된 일부 제형에서는 혼탁도 및 고분자량 종의 백분율이 감소했지만, 제형에 슈크로스를 첨가한 경우에는 아무런 잇점도 없었다. 아세테이트 완충액 제형은 일반적으로 혼탁도가 가장 낮았다.

계면활성제 및 동결보호제

전술한 일부 실험(예, 도 29A, 도 29B, 도 30A, 도 30B, 도 31A 및 도 31B에 예시된 실험)은 계면활성제(폴리소르베이트 80) 및/또는 동결보호제(슈크로스)를 함유하는 제형의 실험 데이터를 포함한다. 동결 후 안정성에 대해, 25mg/ml 항5T4를 함유하는 시료는 동결/해동 스트레스에 민감하지 않았다. 항5T4는 단백질 농도 또는 해동 조건에 상관없이 저속 동결 조건일 때 안정했다. 폴리소르베이트 80은 급속 해동 프로토콜이 적용된 경우 25mg/ml 농도의 단백질 시료의 안정성을 향상시키는데 필요하지 않았다.

제형에 슈크로스의 첨가는 25mg/ml 항5T4를 함유하는 시료의 안정성을 향상시키지 않았다. 1mg/ml 함유 시료에서, 폴리소르베이트 80 및 슈크로스는 특히 급속 동결 조건 하에서, 동결/해동 동안 항5T4를 보호했다(도 29A 및 도 29B, 도30A 및 도 30B).

또한, 진탕 조건 하에서 다양한 제형 중의 항5T4의 안정성을 조사했다. 단백질을 가장 높은 rpm으로 진탕시켰을 때 폴리소르베이트 80은 25mg/ml 단백질 농도의 항5T4 제형의 혼탁도 최소화 및 고분자량 종 백분율의 최소화에 기여했다. 1mg/ml 항5T4를 함유하는 제형에서, 폴리소르베이트 80은 교반 스트레스에 대하여 단백질을 보호했다(도 31A 및 도 31B).

이러한 데이터는 높은 단백질 농도(예, 25mg/ml)에서는 항5T4가 동결/해동 스트레스 하에 안정하다는 것을 보여주었다. 대부분의 동결/해동 조건 하에서 제형, 특히 아세테이트 완충액을 함유하는 제형에 계면활성제를 첨가하는 것은 거의 또는 전혀 잇점이 없었다. 또한, 상기 제형에는 동결보호제(예, 슈크로스)를 사용할 필요가 없었다. 폴리소르베이트 80은 고속 진탕 조건 하에서 항5T4를 안정화하는데 유용했다.

또한, 단백질 농도가 낮은(예, 1mg/ml 항5T4) 시료는 저속 동결 조건 하에서 안정한 것으로 관찰되었다. 이러한 저농도 단백질 시료에서는, 폴리소르베이트 80과 슈크로스가 동결/해동 유도 변성에 대하여 단백질(항5T4)을 보호했다. 또한, 저농도 단백질 시료에서는 폴리소르베이트 80이 진탕 유도 변성에 대하여 단백질을 보호했다.

기타 사항

이상의 상세한 설명을 통해 본 발명을 설명하지만, 앞의 상세한 설명은 예시하는 것뿐이며, 이하 청구의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 충분히 이해하고 있어야 한다. 따라서, 다른 관점, 장점 및 변형들이 이하 청구의 범위에 포함되어 있다.

Claims

(a) 분리된 단백질; 및

(b) pH 4.0 내지 pH 8.0 범위 수용액을 포함하고, 동결보호제 또는 계면활성제를 포함하지 않으며, 상기 단백질이 -80℃ 내지 8℃ 범위에서 3주 이상 동안 안정한 제형.
제1항에 있어서, 150mM 미만의 염을 포함하는 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 항체인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 폴리클로날 항체인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 모노클로날 항체인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 항CD22 항체, 항루이스 Y 항체 또는 항5T4 항체인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 재조합 단백질인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 치료학적 단백질인 제형.
제1항에 있어서, 수용액이 멸균수인 제형.
제1항에 있어서, 수용액이 완충액을 추가로 포함하는 제형.
제10항에 있어서, 완충액이 아세테이트 완충액, 숙시네이트 완충액, 포스페이트 완충액 또는 시트레이트 완충액인 제형.
제10항에 있어서, 완충액 농도가 약 0mM 내지 150mM 범위인 제형.
제10항에 있어서, 완충액 농도가 약 50mM 내지 100mM 범위인 제형.
제10항에 있어서, 완충액 농도가 약 1mM 내지 50mM 범위인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 5℃에서 1년 이상 동안 안정하거나 5℃에서 3년 이상 동안 안정한 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 약 1mg/ml 내지 약 200mg/ml 범위, 약 1mg/ml 내지 약 100mg/ml 범위, 약 20mg/ml 내지 약 200mg/ml 범위 또는 약 20mg/ml 내지 약 100mg/ml 범위의 농도로 존재하는 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 약 10mg/ml 내지 약 30mg/ml 범위, 25mg/ml 내지 약 30mg/ml 범위, 약 10mg/ml 내지 약 50mg/ml 범위 또는 약 20mg/ml 내지 약 50mg/ml 범위의 농도로 존재하는 제형.
제1항에 있어서, 단백질의 pI가 6.0, 7.0 또는 8.0 이상인 제형.
제1항에 있어서, 약 0℃ 내지 약 8℃ 또는 약 0℃ 내지 약 5℃에서 보관되는 제형.
제1항에 있어서, 제형의 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0 범위인 제형.
제1항에 있어서, 제형의 pH가 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.0 범위이고, 약 -80℃ 내지 약 5℃ 범위에서 보관되는 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 사람화된 항CD22 항체이고, 수용액이 약 20mM 숙시네이트, pH 6.0인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 항루이스 Y 항체이고, 수용액이 약 10mM 나트륨 시트레이트 pH 5.5 및 약 75mM NaCl인 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 항5T4 항체이고, 수용액이 약 10mM 나트륨 아세테이트 pH 5.5인 제형.
제1항에 있어서, 안정성은 대조군과 비교하여 고분자량 종의 백분율, 저분자량 종의 백분율 또는 산성 종의 백분율 중 하나 이상을 분석하여 측정하는 제형.
제1항에 있어서, 단백질이 95% 이상으로 정제된 제형.
제1항에 있어서, 멸균된 제형.
(a) 제1항에 따른 제형을 제공하는 단계;

(b) 상기 제형을 선택된 온도 하에 방치하는 단계; 및

(c) 상기 제형을 선택된 온도에서 유지시키는 단계를 포함하여, 이때 상기 제형 중의 단백질이 1주 이상 동안 안정한, 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 단백질이 1개월, 3개월, 1년, 5년, 7년 또는 10년 이상 동안 안정한 단백질 보관 방법.
제29항에 있어서, 단백질이 약 -80℃ 또는 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 안정한 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 단백질이 약 -80℃ 온도에서 보관되고, 5년, 7년 또는 10년 이상 동안 안정한 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 제형이 선택된 온도에서 동결되고, 단계 (c) 이후에 단백질이 급속 해동되는 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 제형이 (b)에서 동결되고, 동결이 급속 동결인 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 단백질이 항체인 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 단백질이 모노클로날 항체인 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 단백질이 항CD22 항체, 항루이스 Y 항체 또는 항5T4 항체인 단백질 보관 방법.
제34항에 있어서, 항체가 중간 물질인 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 단백질 농도가 15mg/ml 이상, 20mg/ml 이상 또는 30mg/ml 이상인 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 보관 상태에서 회수 시, 단백질이 참조물질 활성의 70% 이상인 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 보관 상태에서 회수 시, 제형이 참조물질에 비해 고분자량 산물을 5% 이하로 포함하는 단백질 보관 방법.
제28항에 있어서, 보관 상태에서 회수 시, 제형이 참조물질에 비해 고분자량 산물과 응집물을 10% 이하로 포함하는 단백질 보관 방법.
(a) 선택된 분리 단백질을 제공하는 단계;

(b) 상기 선택된 분리 단백질을 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.0의 수용액과 약 0mM 내지 150mM의 완충액을 포함하는 일련의 제형에 보관하는 단계;

(c) 안정성에 관한 하나 이상의 매개변수를 측정하는 단계; 및

(d) 단백질이 안정한 제형을 동정하는 단계

를 포함하고, 이때 이러한 단백질이 안정한 제형이 상기 선택된 분리 단백질의 보관에 유리한 제형이 되는, 선택된 분리 단백질의 보관에 유리한 제형을 결정 하는 방법.
제42항에 있어서, 안정성의 감소가 대조군에 비해 시료에 존재하는 고분자량 단백질 함량의 증가로 나타나는 방법.
제43항에 있어서, 단백질의 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 이하가 고분자량 종인 조건이 선택되는 방법.
제42항에 있어서, 안정성의 매개변수가 효소 결합 면역분석법으로 분석되는 활성이고, 이 활성이 대조군의 50% 이상이거나 안정한 제형에서 대조군의 80% 이상인 방법.
제42항에 있어서, 안정성의 매개변수가 고분자량 종의 존재이고, 안정한 제형이 대조군에 비해 5% 이하의 고분자량 종을 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 안정성의 매개변수가 고분자량 종 및 단백질 응집물의 존재이고, 안정한 제형이 대조군에 비해 고분자량 종과 단백질 응집물을 10%이하로 또는 고분자량 종과 단백질 응집물의 배합물을 15% 이하로 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 안정성의 매개변수가 산성 및 염기성 단백질의 비율이고, 안정한 제형에서 상기 비율이 대조군과 15% 이하의 차이를 나타내는 방법.
제1항에 따른 제형에 보관하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 폴리펩타이드.
제49항에 있어서, 폴리펩타이드가 단백질인 방법.
제49항에 있어서, 단백질이 항체인 방법.
제1항에 따른 제형에 보관되고, 변형 단백질의 제조에 유용한 폴리펩타이드.
제52항에 있어서, 항체인 폴리펩타이드.
제52항에 있어서, 접합 단백질의 제조에 사용되는 폴리펩타이드.
제54항에 있어서, 단백질이 독소에 접합된 폴리펩타이드.