CN117586389A - 一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用。本申请的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体包括重链可变区与轻链可变区，重链可变区包括基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2～3其中之一所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～5其中之一所示的HCDR3；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6～7其中之一所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.9～10其中之一所示的LCDR3。本申请的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体可用于制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物。

Description

一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，特别涉及一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
植物、真菌、某些原生生物和大多数细菌从GTP和分支酸开始从头制备叶酸(维生素B9)，但高等动物缺乏合成途径的关键酶，并且因此需要饮食叶酸。叶酸对于健康是至关重要的，并且抗叶酸药物广泛用于癌症化疗和抗微生物剂中。在细胞代谢过程中，叶酸提供了嘌呤、胸苷酸和甲硫氨酸合成所需要的单碳单位。哺乳动物细胞不能从头合成叶酸，需要从环境中摄取的叶酸跨膜转运到胞内。质子偶联叶酸转运蛋白(the proton-coupledfolate transporter,PCFT)，也称溶质转运蛋白SLC46A1(Solute Carrier Family46Member 1,SLC4A1)，利用细胞内外的质子梯度差，同向转运质子与叶酸分子至胞内。
PCFT高表达于正常人体的肠道刷状缘膜和脉络丛，也在实体瘤中高表达。不同于已知的还原型叶酸转运蛋白(reduced folate carrier,RFC)和叶酸受体蛋白(Folatereceptors,FRs)在中性pH下最高的叶酸转运活性，PCFT在微酸的pH 5.5下转运活性最高。因此，PCFT被认为是肿瘤细胞利用其周边微酸的pH环境摄取叶酸的主要转运蛋白之一。
根据叶酸分子的结构，临床上开发了一系列叶酸结构类似的分子，干扰叶酸代谢实现其药理作用，它们被称为抗叶酸药物。传统抗叶酸药物都是通过RFC进行转运，而导致毒副作用。PCFT在肿瘤中高表达，并且能够利用肿瘤微酸外环境所提供的质子梯度转运抗叶酸药物。因此开发靶向癌细胞的特异性抗叶酸剂是精准治疗的方向。但迄今为止，未见抗PCFT单克隆抗体及其应用。
发明内容
本申请为了克服现有技术中的缺陷，提供一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用。
本申请的第一方面，提供了一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2～3其中之一所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～5其中之一所示的HCDR3；所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6～7其中之一所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.9～10其中之一所示的LCDR3。
本申请的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，编码上述抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体。
本申请的第三方面，提供一种表达载体，含有上述分离的多核苷酸。
本申请的第四方面，提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含上述的表达载体或基因组中整合有外源的如上述的多核苷酸。
本申请的第五方面，提供上述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养上述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。
本申请的第六方面，提供一种产品，为检测试剂盒或药物组合物，所述检测试剂盒包括本申请的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，所述药物组合物包括本申请的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及药学上可接受的载体。
本申请的第七方面，提供前述抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体、多核苷酸、表达载体，表达系统或产品在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选的，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、食管癌中的一种或多种的组合。
本申请公开的一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及其应用，带来的有益效果包括但不限于：(1)提供一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体或其抗原结合片段及其制备方法。(2)本申请制备的抗体可以直接抑制PCFT的叶酸转运活性，从而能够抑制癌细胞对于叶酸的摄取。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的重组质粒pEGBacMam-hPCFT的图谱；
图2为根据本申请一些实施例所示的hPCFT蛋白的SDS-PAGE示意图；
图3为根据本申请一些实施例所示的检测杂交瘤细胞抗体表达情况的曲线图；
图4为根据本申请一些实施例所示的hPCFT介导叶酸/质子同向转运偶联实验的示意图；
图5为根据本申请一些实施例所示的验证抗体体外活性的荧光强度变化示意图。
具体实施方式
以下是对本申请中一些术语的定义。
术语“特异性结合”意指此结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学上可接受的载体”是指药物组合物或制剂中的成分，而不是活性成分，其对个体是无毒的。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。所述药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
术语“抗原”是抗体可选择性结合的预定抗原。靶标抗原可为多肽、蛋白、核酸、细胞、脂质、半抗原或其它天然存在或合成化合物。
本申请首先提供一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，其中，重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2～3其中之一所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～5其中之一所示的HCDR3；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6～7其中之一所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.9～10其中之一所示的LCDR3。
自然产生的抗体结构单元通常包含四聚体。每个这样的四聚体都可由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条全长“轻”链(如：约25000道尔顿分子量(25kDa))和一条全长“重”链(如：约50000～70000道尔顿分子量(50～70kDa))。每条链的氨基末端部分通常包含大约100～110个或更多氨基酸的可变区，其通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常限定可能负责效应子功能的恒定区。人轻链通常被归类为K和λ轻链。重链通常被归类为μ，δ，γ，α或ε，并分别限定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM有亚类，包括但不限于：IgM1和IgM2。相似地，IgA细分为亚类，包括但不限于：IgA1和IgA2。在轻链和重链内，可变区和恒定区可通过约12个或更多氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个或更多氨基酸的“D”区。每条轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常显示相同的基本结构，由三个超变区(也称为互补决定区或CDR)连接相对保守的框架区(FR)。通常，来自每一对的两条链的CDRs由框架区对齐，其能结合特异性表位。从氨基端到羧基端，轻链和重链的可变区通常都包含FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。
本文所述的单克隆抗体由基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能的天然存在的突变外，它们通常以极少量存在。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原位点。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在可以合成它们而不受其它抗体的污染。修饰语“单克隆”指示抗体由基本上同质的抗体群获得的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。
本文中的“序列”一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述氨基酸序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
在一些实施例中，重链可变区可以包括氨基酸序列如下任一所示的HCDR1～HCDR3：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的HCDR3；(2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的HCDR3；
在一些实施例中，轻链可变区可以包括氨基酸序列如下任一所示的LCDR1～LCDR3:
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的LCDR3；(4)氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的LCDR3。
在一些实施例中，单克隆抗体还可以包括如下技术特征中的至少一项：a)所述重链可变区HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；b)所述重链可变区HFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16中任一所示；c)所述重链可变区HFR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.19或SEQ ID NO.20所示；d)所述重链可变区HFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；e)所述轻链可变区的LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示；f)所述轻链可变区的LFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示；g)所述轻链可变区的LFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22所示；h)所述轻链可变区的LFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25所示。
在一些实施例中，重链可变区可以包括：c1)SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28或SEQID NO.30所示的氨基酸序列，或者c2)与c1)所示的氨基酸序列其中之一具有80％以上序列相同性且具有c1)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列；和/或，所述轻链可变区包括：c3)SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列，或者c4)与c3)所示的氨基酸序列其中之一具有80％以上序列相同性且具有c1)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
在一些实施例中，抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体可以包括：d1)氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示的重链可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示的轻链可变区；或者，d2)氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示的重链可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示的轻链可变区；或者，d3)氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示的重链可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示的轻链可变区。
表1
本申请还提供一种分离的多核苷酸，编码上述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体。多核苷酸是指通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，且取决于上下文，其指DNA以及RNA。本申请中的多核苷酸并不包含任一大小限制，并且也包括包含修饰，特别是包含修饰的核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。在本发明一具体实施方式中，分离的多核苷酸的核酸序列如SEQ ID NO:26-30其中之一所示。
本申请还提供一种表达载体，含有本申请前述分离的多核苷酸。本文中的“载体”是指能携带至少一个多核苷酸片段的多核苷酸。载体可以将核酸的片段、各个多核苷酸递送到宿主细胞中。它可以包含至少一种包含调节序列的表达盒，用于正确地表达掺入其中的多核苷酸。待引入到细胞中的多核苷酸(例如编码目的产物或选择标记的多核苷酸)可以插入到载体的表达盒中以从其表达。根据本申请的载体可以以环状或线性(线性化)形式存在，并且也包括载体片段。术语“载体”也包含允许转移外源核酸片段的人工染色体或类似的各个多核苷酸。
获得高表达宿主细胞(也称为高生产者)的最常见方法以产生用于表达目的产物的合适表达载体作为第一步。该表达载体驱动编码目的产物的多核苷酸在宿主细胞中表达，并提供至少一种用于产生重组细胞系的选择标记。哺乳动物表达载体的主要元件通常包括能增强转录活性的组成型或诱导型启动子；通常包括Kozak序列的优化的mRNA加工和翻译信号、翻译终止密码子、mRNA切割和多腺苷酸化信号、转录终止予以及用于制备稳定细胞系和用于基因扩增的选择标记；此外，表达载体还可以提供用于细菌中的载体增殖的原核复制起点和选择标记。
用于表达目的产物的载体通常含有适用于驱动转录的转录控制元件例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录中止或终止信号作为表达盒的元件。如果想要的产物是蛋白质，那么优选地将合适的翻译控制元件包括在载体中，例如产生适用于募集核糖体的5帽结构的5’非翻译区和终止密码子以终止翻译过程。特别地，用作为选择标记基因的多核苷酸以及编码目的产物的多核苷酸可以在存在合适启动子的转录元件的控制下转录。得到的选择标记基因的转录物和目的产物的转录物具有有助于相当高水平的蛋白质表达(即翻译)和正确翻译终止的功能性翻译元件。
因此，根据本申请的表达载体可以包含至少一个启动子和/或启动子/增强子元件作为表达盒的元件。尽管这两个控制元件之间的物理界限并非总是清楚的，但是术语“启动子”通常指核酸分子上与RNA聚合酶和/或任一相关的因子结合并起始转录的位点。增强子在时间上和空间上加强启动子洁性。许多启动子在多种细胞类型中都是转录活跃的。可以将启动子分为两类，组成型发挥作用的启动子和受到诱导或去抑制调节的启动子。二者都适用于与本发明的教导结合。用于在哺乳动物细胞中高水平生产蛋白质的启动子在多种细胞类型中应当是强的并优选地是活跃的。
本申请还提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含上述的表达载体或基因组中整合有外源的如上述的多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞、丝状真菌细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。将构建体导入宿主细胞的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等方法。表达系统的选择取决于多种因素，包括细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、目的蛋白质的翻译后修饰和生物学洁性，以及在生产治疗性蛋白质中的监管问题和经济考虑。
本申请还提供上述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养上述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。在一些实施例中，抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的许多方法产生。在一些实施例中，抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体可以通过杂交瘤方法使用小鼠骨髓瘤细胞系制备。在一些实施例中，抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体可以通过基因工程的方法制备。
本申请还提供一种产品，为检测试剂盒或药物组合物，所述检测试剂盒包括本申请前述抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，所述药物组合物包括本申请前述抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及药学上可接受的载体。所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
所述药物组合物包括上述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体；优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体，可以是常用的药物载体，例如可以是聚(乙二醇)，包括分子量在约200到约5,000Da范围内的聚(乙二醇)(例如PEG200、PEG300、PEG 400或PEG 600)，乙二醇，丙二醇，甘油，非离子表面活性剂，泰洛沙泊，聚山梨酯80，聚乙二醇-15-羟基，硬脂酸酯，磷脂，卵磷脂，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，环糊精，α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，羟乙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精，羟乙基-γ-环糊精，羟丙基-γ-环糊精，二羟丙基-β-环糊精，磺丁醚-β-环糊精，磺丁醚-γ-环糊精，葡糖基-α-环糊精，葡糖基-β-环糊精，二葡萄糖基-β-环糊精，麦芽糖基-α-环糊精，麦芽糖基-β-环糊精，麦芽糖基-γ-环糊精，麦芽三糖基-β-环糊精，麦芽三糖基-γ-环糊精，二麦芽糖基-β-环糊精，甲基-β-环糊精，羧基烷基硫醚，羟丙基甲基纤维素，羟丙基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮、月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠或其任何组合。本领域的技术人员通常可基于剂型要求确定药物组合物的配方。
在一些实施例中，本申请的药物组合物可以在单一疗法中施用(例如，没有伴随施用任何另外的治疗剂，或没有伴随施用任何另外的治疗剂对抗要用本申请的药物组合物治疗或预防的相同疾病)。在一些实施例中，本申请的药物组合物也可与一种或多种其它治疗剂联合施用或同时施用。
本申请还提供本申请前述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体、多核苷酸、表达载体，表达系统或产品在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选的，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、食管癌中的一种或多种的组合。
本申请中的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体可用于诊断、治疗或预防的肿瘤可以包括所有表达质子偶联叶酸转运蛋白的癌症和肿瘤实体，具体可以是包括但不限于结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌和食管癌等，这些癌症可以为早期、中期或晚期，例如转移癌。
术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本申请的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
由于PCFT在小肠上皮细胞大量分布，抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体也有潜力成为鉴别肠道组织相关PCFT表达高低的显影剂。
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1-构建pEG BacMam-hPCFT质粒
由安徽通用生物科技有限公司合成hPCFT的基因片段,序列如SEQ ID NO.31所示，
>hPCFT-DNA
ATGGAGGGGAGCGCGAGCCCCCCGGAAAAGCCCCGCGCCCGCCCTGCGGCTGCCGTGCTGTGCCGGGGCCCGGTAGAGCCGCTGGTCTTCCTGGCCAACTTTGCCTTGGTCCTGCAGGGCCCGCTCACCACGCAGTATCTGTGGCACCGCTTCAGCGCCGACCTCGGCTACAATGGCACCCGCCAAAGGGGGGGCTGCAGCAACCGCAGCGCGGACCCCACCATGCAGGAAGTGGAGACCCTTACCTCCCACTGGACCCTCTACATGAACGTGGGCGGCTTCCTGGTGGGGCTCTTCTCGTCCACCCTGCTGGGAGCTTGGAGCGACAGTGTGGGCCGCCGCCCGCTGCTAGTGCTGGCCTCGCTGGGCCTGCTGCTCCAGGCCCTAGTGTCCGTTTTTGTGGTGCAGCTGCAGCTCCACGTCGGCTACTTCGTGCTGGGTCGCATCCTTTGTGCCCTCCTCGGCGACTTCGGTGGCCTTCTGGCTGCTAGCTTTGCGTCCGTGGCAGATGTCAGCTCCAGTCGCAGCCGCACCTTCCGGATGGCCCTGCTGGAAGCCAGCATCGGGGTGGCTGGGATGCTGGCAAGCCTCCTCGGGGGCCACTGGCTCCGGGCCCAGGGTTATGCCAACCCCTTCTGGCTGGCCTTGGCCTTGCTGATAGCCATGACTCTCTATGCAGCTTTCTGCTTTGGTGAGACCTTAAAGGAGCCAAAGTCCACCCGGCTCTTCACGTTCCGTCACCACCGATCCATTGTCCAGCTCTATGTGGCTCCCGCCCCAGAGAAGTCCAGGAAACATTTAGCCCTCTACTCACTGGCCATCTTCGTGGTGATCACTGTGCACTTTGGGGCCCAGGACATCTTAACCCTTTATGAACTAAGCACACCCCTCTGCTGGGACTCCAAACTAATCGGCTATGGTTCTGCAGCTCAGCATCTCCCCTACCTCACCAGCCTGCTGGCCCTGAAGCTCCTGCAGTACTGCCTGGCCGATGCCTGGGTAGCTGAGATCGGCCTGGCCTTCAACATCCTGGGGATGGTGGTCTTTGCCTTTGCCACTATCACGCCTCTCATGTTCACAGGATATGGGTTGCTTTTCCTGTCATTAGTCATCACACCTGTCATCCGGGCTAAACTCTCCAAGCTGGTGAGAGAGACAGAGCAGGGTGCTCTCTTTTCTGCTGTGGCCTGTGTGAATAGCCTGGCCATGCTGACGGCCTCCGGCATCTTCAACTCACTCTACCCAGCCACTCTGAACTTTATGAAGGGGTTCCCCTTCCTCCTGGGAGCTGGCCTCCTGCTCATCCCGGCTGTTCTGATTGGGATGCTGGAAAAGGCTGATCCTCACCTCGAGTTCCAGCAGTTTCCCCAGAGCCCCCTGGAGGTGCTCTTCCAGGGTCCCGACTACAAGGACGATGACGATAAGCACCATCATCACCATCATCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO.31)将hPCFT基因构建到载体pEGBacMam上，得到重组质粒pEGBacMam-hPCFT，重组质粒pEGBacMam-hPCFT图谱如图1所示。此外，在hPCFT的C端添加flag tag和10×His tag以便于后期的纯化。hPCFT的5’端是Kozak序列GCCACC；hPCFT的3’端接着HRV3C酶识别序列-Flag tag-10xHis。
其中SEQ ID NO.32：CTGGAGGTGCTCTTCCAGGGTCCC编码HRV3C酶识别序列SEQ IDNO.33：LEVLFQGP，SEQ ID NO.34：GACTACAAGGACGATGACGATAAG编码Flag标签SEQ ID NO.35：DYKDDDDK，SEQ ID NO.36：CACCATCATCACCATCATCACCACCACCACTAA编码10xHis加终止密码子TAA。上述重组质粒pEGBacMam-hPCFT的一级全序列如SEQ ID NO.37所示。
>pEGBacMam-hPCFT-DNA
CTGGAGGTGCTCTTCCAGGGTCCCGACTACAAGGACGATGACGATAAGCACCATCATCACCATCATCACCACCACCACTAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGACAAGCTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGATCACTGCTTGAGCCTAGGAGATCCGAACCAGATAAGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATTTTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAACTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCGGGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTTTAATCAAACATCCTGCCAACTCCATGTGACAAACCGTCATCTTCGGCTACTTTTTCTCTGTCACAGAATGAAAATTTTTCTGTCATCTCTTCGTTATTAATGTTTGTAATTGACTGAATATCAACGCTTATTTGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGCCAAGGGCATGGTAAAGACTATATTCGCGGCGTTGTGACAATTTACCGAACAACTCCGCGGCCGGGAAGCCGATCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACTTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCTCCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGC GTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTTGCTTCAGGAGATCGGTAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGGACTCTAGCTATAGTTCTAGTGGTTGGCTACAGCTTTGTTTAAACAAAGCTGGCTATGGCAGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGTCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGTACCGCATGCTATGCATCAGCTGCTAGCACCATGGCTCGAGATCCCGGGTGATCAAGTC TTCGTCGAGTGATTGTAAATAAAATGTAATTTACAGTATAGTATTTTAATTAATATACAAATGATTTGATAATAATTCTTATTTAACTATAATATATTGTGTTGGGTTGAATTAAAGGTCCGTATACTAGTATCGATTCGCGACCTACTCCGGAATATTAATAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGGATCCCGGTCCGAAGCGCGCGGAATTCGCCACCATGGAGGGGAGCGCGAGCCCCCCGGAAAAGCCCCGCGCCCGCCCTGCGGCTGCCGTGCTGTGCCGGGGCCCGGTAGAGCCGCTGGTCTTCCTGGCCAACTTTGCCTTGGTCCTGCAGGGCCCGCTCACCACGCAGTATCTGTGGCACCGCTTCAGCGCCGACCTCGGCTACAATGGCACCCGCCAAAGGGGGGGCTGCAGCAACCGCAGCGCGGACCCCACCATGCAGGAAGTGGAGACCCTTACCTCCCACTGGACCCTCTACATGAACGTGGGCGGCTTCCTGGTGGGGCTCTTCTCGTCCACCCTGCTGGGAGCTTGGAGCGACAGTGTGGGCCGCCGCCCGCTGCTAGTGCTGGCCTCGCTGGGCCTGCTGCTCCAGGCCCTAGTGTCCGTTTTTGTGGTGCAGCTGCAGCTCCACGTCGGCTACTTCGTGCTGGGTCGCATCCTTTGTGCCCTCCTCGGCGACTTCGGTGGCCTTCTGGCTGCTAGCTTTGCGTCCGTGGCAGATGTCAGCTCCAGTCGCAGCCGCACCTTCCGGATGGCCCTGCTGGAAGCCAGCATCGGGGTGGCTGGGATGCTGGCAAGCCTCCTCGGGGGCCACTGGCTCCGGGCCCAGGGTTATGCCAACCCCTTCTGGCTGGCCTTGGCCTTGCTGATAGCCATGACTCTCTATGCAGCTTTCTGCTTTGGTGAGACCTTAAAGGAGCCAAAGTCCACCCGGCTCTTCACGTTCCGTCACCACCGATCCATTGTCCAGCTCTATGTGGCTCCCGCCCCAGAGAAGTCCAGGAAACATTTAGCCCTCTACTCACTGGCCATCTTCGTGGTGATCACTGTGCACTTTGGGGCCCAGGACATCTTAACCCTTTATGAACTAAGCACACCCCTCTGCTGGGACTCCAAACTAATCGGCTATGGTTCTGCAGCTCAGCATCTCCCCTACCTCACCAGCCTGCTGGCCCTGAAGCTCCTGCAGTACTGCCTGGCCGATGCCTGGGTAGCTGAGATCGGCCTGGCCTTCAACATCCTGGGGATGGTGGTCTTTGCCTTTGCCACTATCACGCCTCTCATGTTCACAGGATATGGGTTGCTTTTCCTGTCATTAGTCATCACACCTGTCATCCGGGCTAAACTCTCCAAGCTGGTGAGAGAGACAGAGCAGGGTGCTCTCTTTTCTGCTGTGGCCTGTGTGAATAGCCTGGCCATGCTGACGGCCTCCGGCATCTTCAACTCACTCTACCCAGCCACTCTGAACTTTATGAAGGGGTTCCCCTTCCTCCTGGGAGCTGGCCTCCTGCTCATCCCGGCTGTTCTGATTGGGATGCTGGAAAAGGCTGATCCTCACCTCGAGTTCCAGCAGTTTCCCCAGAGCCCCGGCGGC(SEQ ID NO.37)
实施例2-制备杆状病毒、表达和纯化hPCFT蛋白
杆粒pEGBacMam-hPCFT的制备：
将感受态细胞后放冰上融化，取1μL pEGBacMam-hPCFT质粒加入到50μL的DH10Bac感受态细胞。冰上孵育30分钟，42℃水浴锅热激45s后，放置冰上2分钟。在感受态细胞加入500μL SOC培养基，37℃，225rpm，复苏4个小时。取10μL菌液在含有抗生素卡那霉素，四环素，庆大霉素的LB平板涂板。37℃培养48小时。挑取白斑单克隆到5mL液体LB培养基(含有卡那霉素，庆大霉素，四环素)，37℃，225rpm，培养16-24h。提取pEGBacMam-hPCFT质粒，测浓度。取上述提取出的杆粒做PCR验证，PCR产物条带在1450bp左右即为阳性，其余条带则丢弃。
制备重组杆状病毒：
取三份PCR验证正确的杆粒10μg加入到200μL grace补充昆虫培养基。加入10μL脂质体转染试剂X-tremeGENE 7Transfection Reagent到补充昆虫培养基中,混匀，室温放置15分钟，得到转染复合物。将转染复合物逐滴滴入3～4mL浓度为1×106个/mL SF9 insectcell中，密封，27℃摇床培养120小时。测量SF9 insect cell GP64信号，舍弃阳性信号比例小于50％的样品，保留样品中阳性率最高的样品记为P0。将P0按照体积比1％～4％的比例加入至30mL浓度为2×106个/mL SF9 insect cell中，27℃摇床培养120小时。测量SF9insect cell GP64信号，并记为P1。按照同样的操作获得P2。
重组杆状病毒感染细胞：
上述得到的P2按照2％、3％、4％、5％、6％、8％的体积比例加入至3.0×106个/mLHEK293SGNTI细胞上清中。37℃培养10小时后，加入10mM丁酸钠，继续培养48～72小时。用流式和western的方法检测目标蛋白表达量，选用最优的P2体积比例进行大量培养。
蛋白纯化：
取表达良好的细胞一升，冰上加入pH7.5 50mM HEPES 50mL,150mM NaCl溶液。加入Aprotinin、Leupeptin和PepstatinA三种蛋白酶抑制剂，使其终浓度分别为2μM、20μM和15μM，混匀。4℃条件下，用高压破碎机破裂细胞。取高压破碎后的样品10000rpm，4℃离心25min，弃沉淀，向上清液中加入5mL 10％DDM 1％CHS溶液，同时补加蛋白酶抑制剂。4℃溶膜2.5小时后，15000rpm离心40分钟，弃沉淀。向上清液中加入干体积2mL Ni-NTAbeads，并加入终浓度为10mM咪唑，4℃孵育2小时后过重力柱收集Ni-NTA beads。用含有12CV20mMHEPES pH7.5,150mM NaCl,0.03％DDM,0.003％CHS,35mM Imidazole的缓冲液洗杂。用含有6CV 20mM HEPES pH7.5,150mM NaCl,0.03％DDM,0.003％CHS,250mM Imidazole的缓冲液洗脱，收集洗脱液。
向收集的洗脱液中加入5mL anti-DYKDDDDK G1 Affinity Resin，4℃孵育2小时后过重力柱收集resin，用10CV分子筛缓冲液洗杂，随后加入0.5CV含0.2mg/mL DYKDDDDK小肽的分子筛缓冲液，待流动相完全流出后关闭重力柱，加入1.5CV上述含小肽缓冲液，室温放置半小时并多次用移液枪吹打基质，收集并浓缩洗脱液，选用Superdex200 increase10/300分子排阻色谱层析柱进行分离纯化蛋白。如图2所示，hPCFT在Superdex200Increase 10/300GL分子排阻色谱层析(右，峰高洗脱体积11.9mL)以及样品的SDS-PAGE结果(左)。hPCFT经过SDS-PAGE后，通过考马斯亮蓝染色显示分子量寡聚的条带。所以在SDS-PAGE上显示单体，二体，三体和四体的条带。通过镍柱亲和层析和凝胶排阻获得纯度达90％以上的hPCFT蛋白。
实施例3-抗hPCFT抗体的制备
Balb/c小鼠免疫：
将纯化的hPCFT蛋白通过尾静脉注射的方式免疫C57BL/6小鼠。每隔2～3周进行加强免疫，共3次。免疫小鼠的血清效价在3次免疫之后均达到105以上，在最后一次免疫后4天，分离免疫小鼠脾脏进行后续实验。
杂交瘤细胞的培养：
将5.35×107个免疫小鼠脾细胞与2.675×107个SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合的细胞重悬150mL含胸腺核苷嘧啶、次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM+10％FBS培养基中，并用移液器以100μL/孔的体积移至15个96孔板中。将96孔板中细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养。培养7天后，使用下文所述的ELISA结合来检测hPCFT抗体的表达情况。
ELISA结合检测方法：
用PBST稀释抗原至5μg/mL，每孔100μL包被Immuno透明标准板(thermo 468667)四度过夜，3个复孔。
弃板中溶液，PBST洗一次。每孔加入200μL 2％BSA封闭液，室温封闭2小时后，弃封闭液，用PBST洗3次。每列孔按照十倍稀释比例由高到低依次加入一抗稀释液100μL，其中最高浓度为0.01mg/mL，室温孵育2小时。弃板中溶液，PBST洗3次，每孔加入100μL稀释的二抗，室温孵育1小时。弃板中溶液，PBST洗3次，加入100μL TMB，室温反应20分钟，加入100μL 1M盐酸溶液终止显色，于酶标仪测量450nm波长吸收值。所有ELISA数据由Graph Prism8处理，结果如图3所示。从该图可以看到抗体M1916,C0368,M1917与hPCFT结合所需浓度远低于其余抗体结合所需浓度。并且抗原抗体的酶联荧光强度高，所以选用表达这三株抗体的杂交瘤细胞通过亚克隆获得单克隆株。
实施例4-单克隆抗体的纯化
将收集的杂交瘤细胞上清8000rpm离心40分钟，去掉沉淀。取20μL澄清透明的上清进行western blotting实验，预估收集的上清中的总抗体量。按照每5mg抗体加入1mL干体积的protein A beads(1mL protein A beads理论上能结合10mg抗体)，并加入上清等体积的20mM Na2PO4 pH7.0，150mM NaCl溶液，4度孵育24小时。
收集孵育后的protein A beads于重力柱中，待上清自然流出后。低速冲洗20个柱体积的20mM Na2PO4 pH7.0，150mM NaCl溶液，然后分次加入总体积5个柱体积的0.1MGlycine pH3.0溶液进行洗脱。加入洗脱液时应吹打均匀，洗脱液流出立刻加入1/10体积的1M Tris pH 8.5混合均匀。
将收集的洗脱液冰上静置过夜。过夜后8000rpm离心20分钟除去沉淀。通过SDSPAGE(loading buffer不含β-巯基乙醇等还原剂)检验抗体的纯度。一般情况SDS-PAGE上为单一条带。浓缩已获得的抗体溶液置换于PBS缓冲液中。
实施例5-V区测序和抗体表达：
使用快速ELISA小鼠抗体亚型鉴定试剂盒(Clonotyping System-HRP，SouthernBiotech)对单克隆抗体进行亚型鉴定后，使用TRIzol(Life Technology，15596-026)从1×106～5×106个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物(PrimeScriptTM 1stStrand cDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过RACEPCR(GenScript)扩增免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段亚克隆至pMD18-T载体系统(Takara)中，并使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获取了分别对C0369,M1916和M1917的独特V-区域蛋白氨基酸序列。参考表1，C0369的重链可变区为VH1，轻链可变区为VL1；M1916的重链可变区为VH2，轻链可变区为VL2,M1917的重链可变区为VH3，轻链可变区为VL2。重链VH1全长氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，轻链VL1全长氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，重链VH1全长基因序列如SEQ ID NO.40所示，轻链VL1全长基因序列如SEQ ID NO.41所示。
>重链VH1全长-AA
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYIEWVRQTPGKRLEWIAGSRNRENDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCVRDAGDYDGAWFGHWGQGTLVTVSAEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDFYIEWVRQTPGKRLEWIAGSRNRENDYTTEYSASVKGRFIVSRDTSQSILYLQMNALRAEDTAIYYCVRDAGDYDGAWFGHWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.38)
>轻链VL1全长-AA
DIVMSQSPSSLAVSFGEKVTMSCKSSQTLLYRNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYHCQQYYRYPWTFGGGTKLAIKDIVMSQSPSSLAVSFGEKVTMSCKSSQTLLYRNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYHCQQYYRYPWTFGGGTKLAIK(SEQ ID NO.39)
>重链VH1全长-DNA
GAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACATAGAGTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGAGACTGGAGTGGATTGCTGGTAGTAGAAATAGAGAAAATGATTATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGATTCATCGTCTCCAGAGACACTTCCCAAAGCATCCTCTACCTTCAGATGAACGCCCTGAGAGCTGAGGACACTGCCATTTATTATTGTGTAAGAGATGCAGGGGATTACGACGGGGCCTGGTTTGGTCACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGAGGTGAAGCTGGTGGAATCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTTCTACATAGAGTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGAGACTGGAGTGGATTGCTGGTAGTAGAAATAGAGAAAATGATTATACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGATTCATCGTCTCCAGAGACACTTCCCAAAGCATCCTCTACCTTCAGATGAACGCCCTGAGAGCTGAGGACACTGCCATTTATTATTGTGTAAGAGATGCAGGGGATTACGACGGGGCCTGGTTTGGTCACTGGGGCCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO.40)
>轻链VL1全长-DNA
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCATTTGGAGAGAAGGTAACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGACCCTTTTATATAGAAACAATCAAAAGAATTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTATTGGGCATCCACGAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATCACTGTCAGCAATATTATAGGTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGCAATCAAAGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCATTTGGAGAGAAGGTAACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGACCCTTTTATATAGAAACAATCAAAAGAATTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTATTGGGCATCCACGAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATCACTGTCAGCAATATTATAGGTATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGCAATCAAA(SEQ ID NO.41)
PCR扩增抗体轻链可变区VL1、重链可变区VH1，通过同源重组方法，分别构建至经过改造的含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒pcDNA3.3-TOPO(Invitrogen)上，组成完整的抗体轻、重链全长基因，质粒经测序符合预期。
将构建好的含抗体轻重链全长基因的载体分别转化到大肠杆菌SS320中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取，得到无内毒素的抗体轻重链质粒。将得到的抗体轻重链质粒转染CHO细胞，通过ExpiCHO瞬转表达系统(Thermo Fisher，A29133)表达单抗，收集表达有目的单抗的细胞培养上清，纯化获得抗体1。
替换可变区序列，采用同样方法构建表达载体，转染CHO细胞后培养、收集、纯化获得抗体2和抗体3,参考表1，抗体2的重链可变区为VH2，轻链可变区为VL2,抗体3的重链可变区为VH3，轻链可变区为VL2。
实施例6-抗体体外活性的验证
本申请用脂质体包埋的hPCFT介导的叶酸/质子同向转运偶联实验引起的荧光淬灭实验来表征hPCFT的转运活性。8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonate(HPTS)是一种荧光指示剂。将hPCFT重组在脂质体脂双层上，脂质体内部pH 5.5，脂质体外部pH6.5。脂质体内部存在叶酸。HTPS加在脂质体外侧溶液中，游离的HTPS的激发光波长为452nm，发射光波长为512nm。脂质体上的hPCFT是质子/叶酸同向转运蛋白，受到脂双层两侧的质子梯度差驱动，叶酸和质子从脂质体中释放到脂质体外部溶液。此时HTPS与质子结合，发生荧光淬灭，原理如图4所示。因此，当hPCFT的转运活性受到小分子抑制剂或者抗体抑制时，该荧光淬灭速率降低。通过这个方法，就可以研究抗体的抑制效率。
混合脂的配制：
将脂磷脂DOPE：磷脂DOPG：胆固醇＝15:5:1按质量比例混匀并使用旋转蒸发仪去除试剂中的氯仿。去除大部分氯仿后，将其放入冻干机过夜，去掉残留的氯仿。使用缓冲液(20mM Na2HPO4 pH5.5，150mM NaCl，0.03％(w/v)DDM和0.003％(w/v)CHS)溶解脂质，脂的终浓度在10mg/mL。使用液氮速冻，然后放置超声仪中超声溶解。反复冻融，超声，让脂完全溶解在缓冲液中，将其200μL一支分装并冻存于-80℃。
人工脂质体的制备：
将hPCFT与200μL脂质按1：80的质量比混匀，并加入500μL的叶酸，剩下使用缓冲液(20mM Na2HPO4 pH5.5，150mM NaCl，0.03％(w/v)DDM和0.003％(w/v)CHS)补齐至总体积1mL。对照组空脂质体不加入hPCFT蛋白。将蛋白脂质混合液放入超声仪中，4℃，超声10min使之混匀。然后放置4℃低速混匀4小时。4小时后向混合液中后每管加入0.2g的Bio-BeadsSM-2用于去除去垢剂DDM和CHS，4℃孵育过夜。短暂离心，吸取混合液上清。使用Avanti脂质体制备器制备脂质体，所用滤膜为200nm多孔滤膜。用不透气注射器将混合液反复穿过滤膜，最终制得大小均一的脂质体。
在外液缓冲液(20mM Na2HPO4 pH6.5，150mM NaCl)中加入适量的HPTS指示剂。HPTS是一种水溶性，不透膜的pH指示剂。外液与脂质体按9:1的比例混合以建立质子梯度，然后立即使用酶标仪测量。记录HTPS指示剂在511nm的发射波长信号(450nm激发波长)。每组三个重复，每10秒测量一次，测量15min。每次测量值归一化处理Fnormalized＝(F-Fend)/(Fwt_star-Fwt_end)。
抗体对于hPCFT体外活性的转运抑制实验：
按照hPCFT：antibody＝1:1.2的摩尔比共孵育2小时后，将抗体加入到脂质体的外液。对照组为空的脂质体和非特异性抗体抗CD147抗体。按上述方法测量荧光强度变化，结果如图5所示。Control是不含hPCFT的对照脂质体，该脂质体无法转运质子和叶酸，因此不能导致HTPS发生荧光淬灭。WT-PCFT是含有hPCFT的脂质体，脂质体溶液中没有抗体。Non-specific antibody无法抑制hPCFT的转运活性，因此加入non-specific antibody后，荧光淬灭的速率与WT-PCFT基本一致。三个抗hPCFT抗体都对转运有一定的抑制作用，抗体2对转运的抑制效果最强，抗体3次之。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (10)

1.一种抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2～3其中之一所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～5其中之一所示的HCDR3；
所述轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6～7其中之一所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.9～10其中之一所示的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，所述重链可变区包括氨基酸序列如下任一所示的HCDR1～HCDR3：
(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的HCDR3；
(2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的HCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的HCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的HCDR3；
所述轻链可变区包括氨基酸序列如下任一所示的LCDR1～LCDR3:
(3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的LCDR3；
(4)氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的LCDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的LCDR2，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的LCDR3。
3.如权利要求1所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括如下技术特征中的至少一项：
a)所述重链可变区HFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
b)所述重链可变区HFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16中任一所示；
c)所述重链可变区HFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示；
d)所述重链可变区HFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
e)所述轻链可变区的LFR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示；
f)所述轻链可变区的LFR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示；
g)所述轻链可变区的LFR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22所示；
h)所述轻链可变区的LFR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25所示。
4.如权利要求1所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，其特征在于，
所述重链可变区包括：
c1)SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列，或者
c2)与c1)所示的氨基酸序列其中之一具有80％以上序列相同性且具有c1)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列；
和/或，所述轻链可变区包括：
c3)SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列，或者
c4)与c3)所示的氨基酸序列其中之一具有80％以上序列相同性且具有c1)所限定的氨基酸序列的功能的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体包括：
d1)氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示的重链可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示的轻链可变区；或者，
d2)氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示的重链可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示的轻链可变区；或者，
d3)氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示的重链可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示的轻链可变区。
6.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～5任一权利要求所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体。
7.一种表达载体，含有如权利要求6所述的分离的多核苷酸。
8.一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如权利要求7所述的表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种产品，为检测试剂盒或药物组合物，所述检测试剂盒包括如权利要求1～5任一权利要求所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体，所述药物组合物包括如权利要求1～5任一权利要求所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体及药学上可接受的载体。
10.如权利要求1～5任一权利要求所述的抗质子偶联叶酸转运蛋白单克隆抗体、如权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的表达载体，权利要求8所述的表达系统或如权利要求9所述的产品在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选的，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、食管癌中的一种或多种的组合。
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