ES2636895T3 - Procedimiento de extracción de beta-amilasas a partir de una fracción soluble de planta de almidón y en presencia de una proteasa - Google Patents

Procedimiento de extracción de beta-amilasas a partir de una fracción soluble de planta de almidón y en presencia de una proteasa Download PDF

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ES2636895T3 ES13756916.6T ES13756916T ES2636895T3 ES 2636895 T3 ES2636895 T3 ES 2636895T3 ES 13756916 T ES13756916 T ES 13756916T ES 2636895 T3 ES2636895 T3 ES 2636895T3
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Abstract

Procedimiento de extracción de β-amilasas a partir de una fracción soluble de planta de almidón que comprende: a) una etapa de microfiltración de una fracción soluble de planta de almidón, b) seguida de una etapa de ultrafiltración caracterizándose dicho procedimiento por que la etapa de microfiltración se realiza en presencia de al menos una proteasa.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de extraccion de beta-amilasas a partir de una fraccion soluble de planta de almidon y en presencia de una proteasa
La presente invencion se refiere a un procedimiento mejorado de extraccion de p-amilasa a partir de una fraccion soluble de planta de almidon, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de clarificacion por microfiltracion y una etapa de concentracion/purificacion por ultrafiltracion. Este procedimiento utiliza una proteasa durante la etapa de microfiltracion, lo que reduce muy sustancialmente el taponamiento de las membranas utilizadas: se aumenta asf el tiempo de produccion antes del lavado, y por lo tanto el rendimiento economico del procedimiento correspondiente. Paralelamente, la realizacion de tal proteasa conduce a permeados perfectamente lfmpidos, lo que facilita la etapa de ultrafiltracion, y permite mejorar la transmision en p-amilasa. Finalmente, la proteasa no tiene ningun efecto negativo sobre la actividad p-amilasica.
Las p-amilasas son unas exo-hidrolasas que liberan unas unidades maltosa a partir de los p-extremos no reductores de los polfmeros u oligomeros de glucosa enlazados en a 1^4, deteniendose la reaccion en el primer punto de ramificacion a 1^6 encontrado. Los componentes principales del “poder diastasico” (que corresponde a las actividades combinadas de las a-amilasas, p-amilasas, a-glucosidasas y enzimas desramificadoras) durante el malteado (germinacion artificial de las semillas de cereales), las actividades p-amilasicas aisladas de este coctel enzimatico son esenciales para la produccion de maltosa o de otros azucares fermentables generados a partir de almidon.
La actividad sacarificante de las unicas p-amilasas se explota por lo tanto en un buen numero de aplicaciones: en fabricacion del pan, en maltena, como aditivo alimenticio, incluso como agente digestivo, para la produccion de edulcorantes, en farmacia para la produccion de vacunas, y finalmente para la produccion de maltosa y de jarabes enriquecidos en maltosa (precursor de maltitol y jarabes de maltitol).
Los procedimientos de fabricacion de p-amilasas son numerosos. Se sabe asf que los granos de cebada, de centeno o de trigo no germinados son buenos materiales biologicos para la preparacion comercial, a gran escala, de p- amilasas. Por otro lado, se conoce por el experto en la materia que la mitad de las p-amilasas extrafbles de los granos no germinados de cebada, de trigo o de centeno puede obtenerse facilmente en forma de enzimas libres por extraccion con agua y soluciones salinas. La otra mitad se presenta en parte en forma “unida” que necesita la adicion de agentes reductores o de enzimas proteolfticas para su extraccion. Tambien se ha descrito otra fraccion de p-amilasas no directamente extrafble, denominada “latente”: se necesitan detergentes para extraerlo de los granos de cereales. Por otro lado, los procedimientos de extraccion de la p-amilasa descritos en el estado de la tecnica se adaptan en funcion de la aplicacion considerada.
Para ello, la solicitante ha desarrollado recientemente y protegido en la solicitud EP 2 414 379 un procedimiento original de produccion de p-amilasas, en el sentido que se basa en una materia prima de partida hasta ahora poco valorizada: las “fracciones solubles”, siendo estas ultimas antes utilizadas de manera exclusiva como fuente de
nitrogeno en fermentacion y como alimento nutritivo para el ganado una vez dichas fracciones enriquecidas en
fibras.
Estas fracciones solubles se producen durante la extraccion por via humeda de los componentes de plantas productoras de almidon, como el mafz, la patata, la batata, el trigo, el arroz, el guisante, el haba, la habichuela, la
mandioca, el sorgo, el konjac, el centeno, el alforfon y la cebada. Los componentes denominados “nobles”,
producidos durante la extraccion, son en particular los almidones, las protemas o tambien las fibras. Las “fracciones solubles” designan por oposicion unos constituyentes “no nobles”: se trata de los restos lfquidos procedentes de dicha extraccion, aunque tales restos pueden tambien contener, en forma de trazas, unas sustancias insolubles asf como partfculas y coloides diversos y variados.
El procedimiento objeto de la solicitud EP 2 414 379 se basa en la seleccion inicial de la fraccion soluble a tratar, despues sobre una etapa de clarificacion de esta realizada por microfiltracion. En esta ocasion, se ha demostrado que la p-amilasa obtenida era particularmente muy adecuada para la preparacion de jarabes de maltosa, al igual que una p-amilasa producida segun tecnicas anteriores, pero a partir de procedimientos mas complejos y mas costosos.
Siguiendo sus trabajos de desarrollo sobre esta tecnologfa, la solicitante se ha enfrontado a un nuevo problema tecnico: resulta en efecto que las sustancias insolubles residuales, las partfculas y los coloides contenidos en las “fracciones solubles” utilizadas, se comportan como “venenos” frente a membranas de microfiltracion obturando estas. El rendimiento del procedimiento disminuye entonces por las paradas obligatorias por subida de presion rapida: la limpieza resulta por lo tanto obligatoria. En otras palabras, el procedimiento objeto de la solicitud EP 2 414 379 necesita ser mejorado a fin de resolver el problema de taponamiento de las membranas de microfiltracion.
Trabajando en este sentido, la solicitante ha conseguido demostrar que la utilizacion de una proteasa, durante la etapa de clarificacion por microfiltracion, disminrna muy sustancialmente los problemas de taponamiento. De manera
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muy sorprendente, resulta que dicha proteasa no afecta en nada a las propiedades de la p-amilasa: como bien se conoce, cuando se utiliza una proteasa en un medio que contiene protemas, de las cuales una protema de interes, dicha proteasa es susceptible de degradar la protema de interes.
Se obtiene segun la invencion unos permeados extremadamente Kmpidos, y se mejora la transmision de la actividad p-amilasica. Por lo tanto, se ha conseguido dar al experto en la materia un procedimiento de fabricacion de p- amilasas perfectamente adaptadas a la smtesis de jarabes de maltosa a traves de un procedimiento simple a realizar, limitando al mismo tiempo fuertemente el problema de taponamiento de los dispositivos de microfiltracion.
Asimismo, un primer objeto de la presente invencion consiste en un procedimiento de extraccion de p-amilasas a partir de una fraccion soluble de planta de almidon que comprende:
a) una etapa de microfiltracion de una filtracion soluble de planta que produce almidon,
b) seguida de una etapa de ultrafiltracion
caracterizandose dicho procedimiento por que la etapa de microfiltracion se realiza en presencia de al menos una proteasa.
Las proteasas (o peptidasas o enzimas proteoltticas) son unas enzimas que rompen las uniones peptfdicas de las protemas. Se habla entonces de corte proteolftico o de proteolisis. Este proceso implica la utilizacion de una molecula de agua, lo que les clasifica entre las hidrolasas. Las funciones biologicas de las proteasas son variadas: intervienen en la maduracion de las protemas, en la digestion de los alimentos, en la coagulacion sangumea, en la remodelacion de los tejidos durante el desarrollo del organismo y en la cicatrizacion.
Existen 4 grandes familias de proteasas en funcion de la naturaleza del o de los aminoacidos del sitio activo implicado en la catalisis:
- las serinas proteasas: enzimas de digestion en los mairnferos (por ejemplo: alcalasa)
- las proteasas de tiol que posee una cistema en su sitio activo: papama (Lypaine™ 6500 L), catepsinas bromelina
- las aspartil proteasas: proteasas acidas que actuan a pH acido y que poseen un acido aspartico en su sitio activo (por ejemplo: pepsina)
- las metalo proteasas que poseen un cation metalico (Zn2+) que intervienen para activar una molecula de agua que escinde la cadena peptfdica (Neutrase, Brewlyve™ NP900).
Aguas arriba del procedimiento conforme a la invencion, conviene seleccionar la fraccion soluble de plantas de almidon a tratar. Esta seleccion se realiza en particular en el grupo constituido de las fracciones solubles del trigo, de la patata, del guisante, del haba, de la habichuela, del arroz, de la cebada, del centeno, del alforfon, de la batata y preferiblemente del trigo y de la cebada.
La primera etapa del procedimiento conforme a la invencion consiste en realizar una etapa de microfiltracion de dichas fracciones solubles en presencia de al menos una proteasa. La microfiltracion tiene en particular como objetivo eliminar las sustancias insolubles, los coloides y el material microbiologico para obtener una composicion lfmpida que contiene p-amilasa. Esta ultima composicion es por lo tanto el permeado de microfiltracion. Previamente a la microfiltracion, la proteasa se pone en contacto con la fraccion soluble de planta que produce almidon a tratar: el experto en la materia sabra adaptar el tiempo de contacto necesario para la accion de la enzima.
La proteasa utilizada en la presente invencion se selecciona entre las serinas proteasas, las proteasas a tiol, las aspartil proteasas y las metalo proteasas, y se selecciona mas particularmente entre las metalo proteasas. De manera nominativa, las proteasas preferidas en la presente invencion son los productos comercializados bajo las denominaciones: Sumizyme™ APL, Lypaine™ 6500 L, Neutrase™ 0,8L, Brewlyve™ NP 900, Brewers Clarex™. Se preferira utilizar una cantidad de proteasa comprendida entre el 0,01% y el 0,1% en volumen con respecto al volumen de la fraccion soluble de planta de almidon a tratar.
La etapa de microfiltracion del procedimiento conforme a la invencion se realiza preferiblemente por microfiltracion tangencial membranaria. Mas particularmente, la compafua solicitante recomienda realizar la microfiltracion tangencial con unas membranas de ceramica que presentan una porosidad de 0,1 |im a 1 |im.
De manera facultativa, la etapa de microfiltracion puede ser precedida de una etapa de floculacion de las partmulas insolubles contenidas en la fraccion soluble de plantas de almidon, mediante cualquier tecnica conocida por otro lado por el experto en la materia.
Para esta primera etapa de microfiltracion, la solicitante recomienda trabajar a un pH comprendido entre 4 y 5 y a una temperatura comprendida entre 40°C y 50°C.
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La etapa de microfiltracion se controla en particular por la subida de la presion transmembranaria (PTM) en el tiempo, a caudal de permeado fijado. La turbiedad del permeado se causa por unas partfculas coloidales que absorben, difunden y/o reflejan la luz, pero sobre todo por los complejos protemas-polifenoles. Se puede determinar mediante un turbidfmetro, pero puede tambien apreciarse visualmente. Con respecto la presion PTM, esta se determina clasicamente mediante sensores dispuestos en la entrada y en la salida del dispositivo de filtracion.
Se evalua tambien la actividad enzimatica de la solucion que contiene p-amilasa. La medicion de la actividad enzimatica se determina por la actividad diastasica. Esta ultima se expresa en grado de poder diastasico (°DP), definido como la cantidad de enzima contenida en 0,1 ml de una solucion al 5% de una muestra de preparacion de enzimas suficiente para reducir 5 ml de Fehling, cuando dicha muestra se coloca en 100 ml de sustrato durante 1 h a 20°C. El poder diastasico permite medir todas las actividades enzimaticas de tipo amilasica, por lo tanto la compama solicitante se ha asegurado mediante otros metodos enzimaticos mas espedficos (por ejemplo utilizando el kit de determinacion MEGAZYME espedfico a la a-amilasa comercializado por CERALPHA METHOD) que la preparacion de p-amilasas conforme a la invencion no contema otras actividades contaminantes.
Se determina despues la transmision como la relacion de actividad p-amilasica contenida en el permeado de microfiltracion sobre la actividad p-amilasica contenida en la alimentacion de la microfiltracion.
La segunda etapa del procedimiento segun la invencion es una etapa de ultrafiltracion, que tiene como objetivo, en primer lugar, concentrar el permeado de microfiltracion que contiene la p-amilasa, liberandose al mismo tiempo de eventuales sales residuales contaminantes, azucares y protemas. La ultrafiltracion se realiza asf sobre el permeado de la microfiltracion a fin de obtener un retenido de ultrafiltracion que contiene la p-amilasa. El retenido de ultrafiltracion se dializa entonces con el fin de disminuir la concentracion en impurezas en dicho retenido.
Mas particularmente, la compama solicitante recomienda realizar la ultrafiltracion con la ayuda de membranas que presentan un umbral de corte de 10000 Da a 50000 Da, preferentemente un umbral de 30000 Da. Las fracciones solubles se ultrafiltran sobre un modulo equipado de membranas polisulfonadas de un umbral de corte de 30000 Da en casetes a escala de laboratorio y membranas en espirales polisulfonadas de un umbral de corte de 30000 Da a escala piloto. La enzima se concentra entonces en el retenido a lo largo del tiempo.
Los ejemplos siguientes permiten comprender mejor la invencion, sin por ello limitar su alcance.
Ejemplos
En este ejemplo, se realiza en primer lugar la preparacion de p-amilasas segun el procedimiento descrito en la solicitud EP 2 414 379, es decir a partir de una etapa de microfiltracion de fraccion soluble sin utilizar proteasa: se trata del ensayo control. Se realiza despues la preparacion de p-amilasa segun el procedimiento objeto de la presente invencion, es decir por microfiltracion de fraccion soluble en presencia de una proteasa: estos ensayos ilustran la presente invencion.
En el almidon de trigo, se prefiere una fraccion soluble en la entrada del evaporador de los solubles, etapa clasicamente realizada para fabricar unos productos destinados a la alimentacion del ganado, una vez concentrados. Estos productos son comercializados por la compama solicitante bajo el nombre de CORAMI®. Estas fracciones solubles presentan un pH de 4 y una actividad p-amilasica del orden de 30 °DP.
Se realiza aqrn, en un equipo a escala piloto, la microfiltracion de fracciones solubles de trigo. La unidad de micofiltracion esta equipada de membranas de ceramica de oxido de titanio, cuyo umbral de corte es igual a 0,2 |im, el caudal de permeado se fija a 12 l/h m2. El factor de concentracion volumica es igual a 1,5. La temperatura y el pH del permeado son respectivamente iguales a 45°C y 4,5.
Se afade en la fraccion soluble la proteasa a ensayar, a una concentracion fijada al 0,1% en volumen con respecto al volumen total de dicha composicion. Se deja previamente actuar esta proteasa durante 1 hora.
Para cada uno de los ensayos, se sigue durante la etapa de microfiltracion la evolucion de la presion PTM, como ya se ha descrito anteriormente: la PTM aumenta en el tiempo a medida que la membrana se tapona. Para cada ensayo, se determina tambien en principio de ensayo (Alim °DP), despues de 1 hora (°DP 1 hora) y al final de procedimiento, despues de aproximadamente 8 horas (°DP 8 horas), el grado de poder diastasico (°dP); se puede calcular asf la transmision de la actividad p-amilasica despues de 1 hora (T 1 hora) y despues de 8 horas (T 8 horas). Finalmente, se determina al final de cada ensayo, y de manera visual, el caracter turbido o lfmpido del permeado.
La figura 1/1 ilustra la evolucion de la presion PTM en funcion del tiempo, para el ensayo control realizado sin proteasa, y para cada ensayo representativo de la invencion que utiliza una proteasa. Parece muy claramente que la utilizacion de una proteasa permite limitar el aumento de la presion PTM en el tiempo: por lo tanto, se ha conseguido ralentizar los fenomenos de taponamiento de la membrana. Se constata tambien que para algunas proteasas, entre ellas en particular el producto Brewlyne™ NP 900, la presion transmembranaria es perfectamente estable: en este caso, el fenomeno de taponamiento de la membrana esta practicamente ausente.
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Ademas, se senala para cada ensayo segun la invencion que el permeado obtenido es perfectamente Kmpido. Finalmente, como lo demuestra la tabla 1, la transmision se mejora en el caso de la invencion con respecto al ensayo control realizado sin proteasa.
Tabla 1
Proteasa utilizada
Alim °DP °DP 1 hora T 1 hora °DP 8 horas T 8 horas
Ninguna(control)
31 25 81 19 61
Sumizyne™ APL
31 28 90 22 71
Lypaine™ 6500 L
38 33 87 26 68
Brewlyne™ NP 900
36 32 89 27 75
Brewers Clarex™
37 35 95 25 68
Neutrase™ 0,8 L
32 27 84 24 75
La etapa de microfiltracion va seguida por una etapa de ultrafiltracion, realizada sobre el permeado de microfiltracion. Tiene como principal objetivo concentrar dicho permeado y liberarle de eventuales sales residuales contaminantes, azucares y protemas.
Se recuperan 40 litros de permeado de microfiltracion para cada uno de los ensayos a parte del ensayo control. Este se ultrafiltra sobre un modulo de laboratorio MILLIPORE con 0,18 m2 de membranas que presentan un umbral de corte de 30000 Da. Se recuperan 39,5 litros de permeado ultrafiltrado y un retenido de un factor 75, que presenta una actividad p-amilasica comprendida entre 1500 y 1600 °DP. Se dializa el retenido de ultrafiltracion a un volumen constante con 2,5 volumenes de agua en continuo a fin de disminuir la concentracion en impurezas de solubles de un factor de 10. La preparacion de p-amilasas asf obtenidas se almacena entonces a +4°C.
Ejemplo 2
Se procede de la misma manera que anteriormente, pero partiendo de las fracciones solubles que presentan un pH de 4 y una actividad p-amilasica del orden de 30 °DP.
Se anade en la fraccion soluble la enzima a ensayar:
- Neutrase 0,8 L (proteasa) a una concentracion fijada al 0,1% en volumen con respecto al volumen total de dicha composicion;
- Optilow (hemicelulasa) a una concentracion fijada al 1% en volumen con respecto al volumen total de dicha composicion;
- Rapidase (pectinasa) a una concentracion fijada al 1% en volumen con respecto al volumen total de dicha composicion;
- Finizyme (lisofosfolipasa) a una concentracion fijada al 1% en volumen con respecto al volumen total de dicha composicion.
Se deja previamente actuar cada enzima durante 1 hora.
Para cada ensayo, se determina tambien en principio de ensayo (Alim °DP), despues de 1 hora (° DP 1 hora), y un final de procedimiento despues de aproximadamente 8 horas (°DP 8 horas), el grado de poder diastasico (°DP); se puede tambien calcular la transmision de la actividad p-amilasica despues de 1 hora (T 1 hora) y despues de 8 horas (T 8 horas). Los resultados aparecen en la tabla 2.
Se constata que la proteasa segun la invencion permite mejorar de manera mucho mas significativa que las otras enzimas la transmision de la actividad p-amilasica. Ademas, al final de 8 horas, solo el permeado obtenido con la proteasa segun la invencion es lfmpido, presentando las otras un aspecto turbio muy marcado.
Tabla 2
Enzima utilizada
Alim °DP °DP 1 hora T 1 hora °DP 8 horas T 8 horas
Ninguna (control)
32 25 79 21 70
Neutrase™ 0,8 L
32 29 92 25 86
Optiflow™
31 20 65 9 30
Rapidase™
31 21 68 12 39
Finizyme™
31 26 84 23 74

Claims (9)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de extraccion de p-amilasas a partir de una fraccion soluble de planta de almidon que comprende:
    a) una etapa de microfiltracion de una fraccion soluble de planta de almidon,
    b) seguida de una etapa de ultrafiltracion
    caracterizandose dicho procedimiento por que la etapa de microfiltracion se realiza en presencia de al menos una proteasa.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la fraccion soluble de planta de almidon se selecciona del grupo constituido de las fracciones solubles del trigo, de la patata, del guisante, del haba, de la habichuela, del arroz, de la cebada, del centeno, del alforfon, de la batata y preferiblemente del trigo y de la cebada.
  3. 3. Procedimiento segun una u otra de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que la proteasa se selecciona entre las serina proteasas, las proteasas de tiol, las aspartil proteasas y las metalo proteasas, y mas particularmente entre las metalo proteasas.
  4. 4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la etapa de microfiltracion se realiza preferiblemente por microfiltracion tangencial membranaria.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, caracterizado por que la microfiltracion tangencial se realiza con unas membranas de ceramica que presentan una porosidad de 0,1 |im a 1 |im.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la etapa de microfiltracion se precede de una etapa de floculacion de las partfculas insolubles contenidas en la fraccion soluble de plantas de almidon.
  7. 7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la etapa de microfiltracion se realiza a un pH comprendido entre 4 y 5, y a una temperatura comprendida entre 40°C y 50°C.
  8. 8. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la ultrafiltracion se realiza con la ayuda de membranas que presentan un umbral de corte de 10000 Da a 50000 Da, preferentemente un umbral de 30000 Da.
  9. 9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, caracterizado por que la ultrafiltracion se realiza con la ayuda de membranas polisulfonadas de un umbral de corte de 30000 Da en casetes a escala de laboratorio y membranas en espirales polisulfonadas de un umbral de corte de 30000 Da a escala piloto.
ES13756916.6T 2012-08-07 2013-08-06 Procedimiento de extracción de beta-amilasas a partir de una fracción soluble de planta de almidón y en presencia de una proteasa Active ES2636895T3 (es)

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