CN104520427A - 用于从淀粉植物的可溶部分并且在蛋白酶存在下提取β-淀粉酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于从淀粉植物的可溶部分提取β-淀粉酶的改进方法，所述方法包括一个通过微滤的澄清步骤和一个通过超滤的浓缩和纯化步骤。本方法的特征在于在微滤步骤过程中其使用了一种蛋白酶，使得可以大大地减少所使用的膜的污染，该膜的污染增加了清洗前的生产时间。同时，获得了十分澄清的渗透物，这有助于后续超滤步骤，并且使得可以改进β-淀粉酶的穿透率。最后，该蛋白酶对β-淀粉酶活性没有负面影响。

Description

用于从淀粉植物的可溶部分并且在蛋白酶存在下提取β-淀粉酶的方法

技术领域

本发明涉及一种用于从淀粉植物的可溶部分提取β-淀粉酶的改进方法，所述方法包括一个通过微滤的澄清步骤和一个通过超滤的浓缩/纯化步骤。微滤步骤期间，该方法利用一种蛋白酶，该蛋白酶非常显著地减少所使用的膜的污染：清洗前的生产时间，并且因此该相应方法的经济效率由此增加。平行地，这样一种蛋白酶的使用产生了十分清澈的渗透物，这有助于超滤步骤，并且使得改进β-淀粉酶的穿透率成为可能。最后，该蛋白酶对β-淀粉酶活性没有负面影响。

技术背景

β-淀粉酶是从α-(1→4)-连接的葡萄糖聚合物或低聚物的非还原β端释放麦芽糖单元的外水解酶，该反应在遇到的第一个α-(1→6)分支点处停止。在发芽(谷类种子的人工萌发)期间，“糖化力”(对应于α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶和脱支酶的组合活性)的主要组分，从这种酶合剂(enzyme cocktail)中分离的β-淀粉酶活性对于生产麦芽糖或产生自淀粉的其他可发酵糖而言是必需的。

因此，单独的β-淀粉酶的糖化活性用于大量的应用中：在面包制作中，在麦芽工业中，作为一种食品添加剂，或甚至作为一种消化剂，用于生产增甜剂，在药学中用于生产疫苗，并且最后是用于生产麦芽糖和富含麦芽糖的糖浆(麦芽糖醇的前体和麦芽糖醇糖浆)。

存在许多用于生产β-淀粉酶的方法。因此，已知的是未萌发的大麦、黑麦或小麦种子都是用于大规模商业制备β-淀粉酶的生物材料的选择。此外，本领域的技术人员已知，可以从未萌发的大麦、小麦或黑麦种子中提取的一半的β-淀粉酶可以容易地通过用水和盐溶液提取以游离酶的形式获得。另一半部分处于“结合”形式，用于其提取需要添加还原剂或蛋白水解酶。不可以直接提取的另一种β-淀粉酶部分被称为“潜在的”部分，也已经被描述：为了从谷类种子中将它提取，洗涤剂是必需的。此外，根据预期的应用将描述于现有技术中的β-淀粉酶提取方法进行了调整。

在此方面，本申请人最近在申请EP 2 414 379中已经研发并保护了一种用于生产β-淀粉酶的原创方法，在这个意义上而言它是基于一种迄今为止利用不佳的起始原料：“可溶部分”。后者之前唯一被用作发酵中的氮源，并且被用作家畜的营养饲料，只要所述的部分富含纤维。

这些可溶部分是在湿法提取淀粉植物组分期间产生的，这些淀粉植物是诸如玉米、马铃薯、甘薯、小麦、水稻、豌豆、蚕豆、马蚕豆、木薯、高粱、魔芋、黑麦、荞麦以及大麦。在提取期间产生的”贵重的”组分具体是淀粉、蛋白质或其他纤维。相比之下，“可溶部分”表示“非贵重的”成分：它们是产自所述提取的液体残余物，尽管这些残余物仍可含有痕量的不可溶物质，并且还含有不同且多变的颗粒和胶体。

作为申请EP 2 414 379的主题的该方法是基于最初选择将要被处理的可溶部分，并且然后基于通过微滤对所述部分进行澄清的一个步骤。在这种情况下，证明了所获得的β-淀粉酶特别地适用于麦芽糖浆的制备，与根据先前技术生产β-淀粉酶同样的方法，但使用更复杂且更昂贵的方法。

随着在这项技术上继续其发展研究，本申请人已经面临一个新的技术问题：事实上，它证明了以下情况，包含在所使用的“可溶部分”中的残余的不可溶物质、颗粒以及胶体通过阻塞所述膜，其行为像针对微滤膜的“毒药”一样。然后，该方法的生产力被由快速增压而强制产生的中断而减少。换言之，作为申请EP 2 414 379的主题的该方法需要被改进以便解决微滤膜的污染问题。

致力于这种效果，本申请人已经成功证明在通过微滤的澄清步骤期间，一种蛋白酶的使用非常显著地减少了污染问题。完全出人意料地，它证明了以下情况，所述蛋白酶不以任何方式影响β-淀粉酶的特性：众所周知，当一种蛋白酶被用在含有蛋白质(包括一种感兴趣的蛋白质)的介质中时，所述蛋白酶能够降解该感兴趣的蛋白质。

根据本发明获得了极其清澈的渗透物，并且改进了β-淀粉酶活性的穿透率。因此，通过实施起来简单同时极大地限制了微滤装置的污染问题的方法，为本领域的技术人员成功地提供了一种用于生产完全适合于合成麦芽糖浆的β-淀粉酶的方法。

发明内容

本发明的一个第一主题由一种用于从淀粉植物的可溶部分提取β-淀粉酶的方法组成，该方法包括：

a)一个对淀粉植物的可溶部分进行微滤的步骤，

b)然后是一个超滤步骤

所述方法的特征在于该微滤步骤是在至少一种蛋白酶存在下进行的。

该蛋白酶(或肽酶或蛋白水解酶)是断裂蛋白质肽键的酶。然后，术语“蛋白水解裂解”或“蛋白水解”被使用。这个过程包括水分子的使用，其将它们在水解酶之间分类。蛋白酶具有多样的生物学功能：它们涉及蛋白质成熟、涉及食物消化、涉及血液凝固、涉及有机体发育期间的组织重构以及涉及愈合。

根据在催化作用中涉及的活性位点的一种或多种氨基酸的性质，存在四种主要的蛋白酶家族：

-丝氨酸蛋白酶：哺乳类体内的消化酶(例如：碱性蛋白酶)

-在其活性位点具有一个半胱氨酸的巯基蛋白酶：木瓜蛋白酶(Lypaine^TM6500L)、菠萝蛋白酶(bromolain)、组织蛋白酶

-天冬氨酰蛋白酶：在酸性pH下作用并且在其活性位点具有一个天冬氨酸(例如：胃蛋白酶)

-具有一种干预用以激活裂解肽链的水分子的金属阳离子(Zn2+)的金属蛋白酶(中性蛋白酶，Brewlyve^TMNP 900)。

根据本发明，应该在该方法的上游选择将被处理的植物淀粉的可溶部分。具体地，该选择是从下组做出，该组由以下各项的可溶部分组成：小麦、马铃薯、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦和甘薯，并且优选是小麦和大麦。

根据本发明，该方法的该第一步在于在至少一种蛋白酶存在下对所述可溶部分进行一个微滤步骤。具体地，微滤的目的是为了移除不溶的物质、胶体以及微生物材料，这是为了获得一种含有β-淀粉酶的澄清组合物的目的。因此，后一组合物是该微滤渗透物。在微滤之前，该蛋白酶与将要被处理的淀粉植物的可溶部分接触：本领域的技术人员将知道如何调节酶作用所需的接触时间。

本发明中使用的蛋白酶是选自丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和金属蛋白酶，并且更具体地是选自金属蛋白酶。按照名称，本发明中优选的蛋白酶是以下列名称销售的产品：Sumizyme^TMAPL、Lypaine^TM500L、Neutrase^TM0.8L、Brewlyve^TMNP 900以及Brewers Clarex^TM。将优选地使用一个相对于将被处理的淀粉植物的可溶部分的体积按体积计在0.01％和0.1％之间的量的蛋白酶。

根据本发明的方法的微滤步骤优选地按照切向膜微滤进行。更具体地，本申请公司推荐用具有0.1μm至1μm孔隙度的陶瓷膜进行切向微滤。

任选地，通过本领域的技术人员已知的任何技术，该微滤步骤之前可以是这些包含在淀粉植物的可溶部分中的不溶颗粒的一个絮凝步骤。

对于这第一微滤步骤，本申请人推荐在pH为4和5之间，并且温度在40℃和50℃之间操作。

具体地，该微滤步骤是以一个固定的渗透流量通过随时间的跨膜压力的增加来控制。渗透物的浊度是由吸收、散射和/或反射光的胶体颗粒引起的，但是尤其是由蛋白质-多元酚复合物引起。可以通过浊度计测定浊度，但也可以很好的目测评估。关于TMP压力，其可以通过放置在过滤装置的入口和出口的感应器常规地测定。

还可以评估含有β-淀粉酶的溶液的酶活性。酶活性度量通过糖化活性来测定。后者表示为糖化力的度数(°DP)，定义为当在20℃下将所述样品置于100ml的底物中持续1h时，足以还原5ml的费林液(Fehling’s solution)的包含在0.1ml 5％酶制剂的样品溶液中的酶的量。由于糖化力使得有可能测量所有淀粉酶类型的酶活性，本申请公司通过其他的更特异的酶法(例如使用对于α-淀粉酶特异的Megazyme测定试剂盒，由Ceralpha Method公司销售)证实根据本发明的β-淀粉酶制剂不含有其他污染活性。

然后，穿透率(transmission)被测定为包含在微滤渗透物中的β-淀粉酶活性与包含在微滤进料中的β-淀粉酶活性的比率。

根据本发明的方法的第二个步骤是一个超滤步骤，旨在首先浓缩含有β-淀粉酶的该微滤渗透物，而在同一时间从它移除任何污染的残余的盐、糖以及蛋白质。因此，超滤是以微滤渗透物进行的，以便获得含有β-淀粉酶的超滤渗余物。然后，透析该超滤渗余物以便减少在所述渗余物中的杂质的浓度。

更具体地，本申请公司推荐使用具有10 000Da至50 000Da截留阈值，优选地具有30 000Da阈值的膜进行超滤。在一个模块上超滤这些可溶部分，该模块配备有盒式(cassette)的实验室规模的具有30 000Da截留阈值的聚砜膜以及中试规模的具有30 000Da截留阈值的聚砜螺旋膜。然后，随着时间的推移，在该渗余物中的酶变得浓缩。

最后，本发明的一个第二主题由在从淀粉植物的可溶部分提取β-淀粉酶的方法中的蛋白酶的用途组成。

下列实例使得可以更清晰地理解本发明，但不以何种方式限制其范围。

附图说明

图1展示了作为时间的函数的TMP压力的变化。

具体实施方式

实施例1

在这个实例中，首先，根据在申请EP 2 414 379中描述的方法进行β-淀粉酶的制备，即在不使用蛋白酶的情况下，基于可溶部分的微滤步骤：它是对照试验。然后，根据作为本发明的主题的方法进行β-淀粉酶的制备，即，在一种蛋白酶存在的情况下，通过可溶部分的微滤：这些试验说明了本发明。

在从小麦生产淀粉中，在可溶物蒸发器的入口处收集可溶部分，一旦浓缩，常规地进行生产用于饲养家畜的产品的一个步骤。这些产品由本申请公司以名称销售。这些可溶部分具有的pH值为4并且具有的β-淀粉酶活性约为30°DP。

在此，在中式规模设备上进行小麦的可溶部分的微滤。微滤部件是配备有由二氧化钛制造的陶瓷膜，其截留阈值等于0.2μm。将渗透流率固定在12l/h m2。体积浓缩系数等于1.5。该渗透物的温度和pH分别等于45℃和4.5。

将该测试蛋白酶加入至该可溶部分，所述测试蛋白酶是以相对于所述组合物总体积按体积计固定在0.1％的浓度。使该蛋白酶事先作用1小时。

对于每个试验，监控TMP压力的变化，如已经在之前描述的，在微滤步骤期间：随着时间随着该膜变得污染，TMP压力增加。对于每个试验，还在该试验开始时(进料°DP)、1小时后(°DP 1小时)，并且在约8小时(°DP 8小时)后在该方法结束时测定糖化力的度数(°DP)；因此，计算1小时后(T 1小时)和8小时后(T 8小时)的β-淀粉酶活性的穿透率是可能的。最后，在每个试验结束时，目测该渗透物的浑浊或澄清性质。

图1展示了作为时间的函数的TMP压力的变化，针对没有蛋白酶情况下进行的对照试验，以及针对表示使用蛋白酶的本发明的每个试验。非常清晰地显现出来，蛋白酶的使用可以限制TMP压力随时间的增加：因此，的确成功地减缓了膜的污染现象。甚至指出，对于一些蛋白酶，具体地包括Brewlyne^TMNP 900产品，跨膜压力是十分稳定的：在这种情况下，膜污染现象是目测不到的。

此外，注意到对于根据本发明的每个试验，所获得的渗透物是十分澄清的。最后，如在表1中展示的，与没有蛋白酶的情况下进行的对照试验比较，本发明的情况下，穿透率被改进。

表1

该微滤步骤之后是以微滤渗透物进行超滤步骤。其主要目的是浓缩所述渗透物并且从它移除任何污染的残余的盐、糖以及蛋白质。

除对照试验外，每个试验回收了40升微滤渗透物。在一台具有30000Da的截留阈值的0.18m2膜的MILLIPORE实验室模块上超滤所述渗透物。回收39.5升的超滤渗透物以及在因子为75的情况下浓缩的渗余物，具有在1500和1600°DP之间的β-淀粉酶活性。用2.5体积的水以恒定的体积连续透析该超滤渗余物，使得在因子为10的情况下降低这些可溶物的杂质浓度。然后，在+4℃下储存如此获得的β-淀粉酶制剂。

实施例2

进行与之前一样的程序，但是从具有pH为4并且β-淀粉酶活性约为30°DP的可溶部分开始。

将该测试酶加入至该可溶部分：

-Neutrase 0.8L(蛋白酶)，浓度固定在相对于所述组合物的总体积按体积计0.1％；

-Optiflow(半纤维素酶)，浓度固定在相对于所述组合物的总体积按体积计1％；

-Rapidase(果胶酶)，浓度固定在相对于所述组合物的总体积按体积计1％；

-Finizyme(溶血磷脂酶)，浓度固定在相对于所述组合物的总体积按体积计1％。

使每种酶事先作用1小时。

对于每个试验，还在该试验开始时(进料°DP)、1小时后(°DP 1小时)，并且在约8小时(°DP 8小时)后在该方法结束时测定糖化力的度数(°DP)；因此，计算1小时后(T 1小时)和8小时后(T 8小时)的β-淀粉酶活性的穿透率是可能的。结果出现在表2中。

注意到根据本发明的蛋白酶使得可以比其他的酶更加显著地改进β-淀粉酶活性的穿透率。另外，8小时后，仅仅用根据本发明的蛋白酶所获得的渗透物是澄清的，其他的则具有非常明显的浑浊外观。

表2

Claims (10)

1.一种用于从淀粉植物的可溶部分提取β-淀粉酶的方法，该方法包括：

a)一个微滤淀粉植物的可溶部分的步骤，

b)然后是一个超滤步骤

所述方法的特征在于该微滤步骤是在至少一种蛋白酶存在下进行的。

2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于淀粉植物的该可溶部分是选自下组，该组由以下各项的可溶部分组成：小麦、马铃薯、豌豆、蚕豆、马蚕豆、水稻、大麦、黑麦、荞麦和甘薯，并且优选是小麦和大麦。

3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于该蛋白酶是选自丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和金属蛋白酶，并且更具体地是选自金属蛋白酶。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于该微滤步骤优选地是通过切向膜微滤进行。

5.如权利要求4中所述的方法，其特征在于用具有0.1μm至1μm孔隙度的陶瓷膜进行该切向微滤。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于该微滤步骤之前可以是这些包含在淀粉植物的该可溶部分中的不溶颗粒的一个絮凝步骤。

7.如权利要求1至6中的任一项所述的方法，其特征在于在pH为4和5之间，并且温度在40℃和50℃之间进行该微滤步骤。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于使用具有10000Da至50000Da截留阈值，优选地具有30000Da阈值的膜进行该超滤。

9.如权利要求8中所述的方法，其特征在于使用盒式的实验室规模的具有30000Da截留阈值的聚砜膜以及中试规模的具有30000Da截留阈值的聚砜螺旋膜进行该超滤。

10.蛋白酶在用于从淀粉植物的可溶部分提取β-淀粉酶的方法中的用途。