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Das
vorliegende Patent betrifft ein verbessertes Verfahren zur Verflüssigung
und Verzuckerung von stärkehaltigen Substraten mittels
Enzymen und insbesondere ein Verfahren zur Rückführung und
Wiederverwendung der Enzyme.
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Die
Umwandlung pflanzlicher Stärke in Zucker und insbesondere
in Glucose ist ein wichtiger Zweig der Biotechnologie. Die hierfür
eingesetzte Stärke kann aus unterschiedlicher Pflanzen
stammen, z. B. aus Getreide wie Weizen, Roggen, Gerste, Mais, Triticale,
Sorghum, Reis, oder aus Knollenfrüchten wie Kartoffeln
oder Maniok (Cassava), dem Fachmann sind weiter einsetzbare Stärkequellen
bekannt. Vor der weiteren Verarbeitung müssen die stärkehaltigen
Ausgangsstoffe zerkleinert und die Stärke aus dem Rohstoff
freigesetzt werden. Dies geschieht durch Mahlverfahren, die grob
in Trocken- und Nassmahlverfahren unterteilt werden. Durch die Mahlverfahren
erfolgt gleichzeitig eine mehr oder weniger intensive Reinigung
der Stärke und eine Abtrennung der nicht-stärkehaltigen
Begleitkomponenten der Rohstoffe, wie Cellulose, Eiweiße,
Fasern oder Hemicellulosen. Für das Verfahren nach der vorliegenden
Erfindung ist es vorteilhaft, vorgereinigte Stärke einzusetzen,
besonders bevorzugt ist Stärke, die direkt nach der Vermahlung
von den nicht-stärkehaltigen Begleitstoffen befreit wurde
(
WO 02/277252 ;
JP 2001-072701 ;
JP 56-169594 ;
CN 1218111 ). Besonders bevorzugt
ist eine Zerkleinerung des stärkehaltigen Rohstoffes durch
eine Luftstrahlmühle oder Luftwirbelmühle („air
Jet mill”, „air turbulence mill”) mit
einer teilweise integrierten, teilweise nach geschalteten Abtrennung
der nicht-stärkehaltigen Komponenten. Durch diese Art der
Zerkleinerung wird ein Stärkemehl mit geringer und einheitlicher
Korngröße erhalten, das weitgehend rein und frei
von nicht verzuckerbaren Begeleitkomponenten ist.
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Das
so erhaltene Stärkemehl wird mit Frischwasser oder zurück
geführtem Prozeßwasser zu einer Stärkemilch
angeteigt und durch den Zusatz von einer α-Amylase (EC:
3.2.1.1, CAS: 9000-90-2) oder von einem Gemisch von α-Amylasen
verflüssigt. Die α-Amylasen können unterschiedlicher
Herkunft sein und sowohl aus Bakterien als auch aus Schimmelpilzen
oder Hefen gewonnen werden. Die Verflüssigung wird oberhalb
oder unterhalb der Gelatinierungstemperatur durchgeführt.
Im Allgemeinen erfolgt die Verflüssigung zumindest zeitweise
oberhalb der Gelierungstemperatur der eingesetzten Stärke.
In der Regel wird nach dem Stand der Technik bei Temperaturen im
Bereich zwischen 60 und 165°C, gearbeitet, die gewählte
Temperatur hängt von der Natur und der Aktivität
des verwendeten Enzyms oder Enzymgemisches ab. Dem Fachmann ist
bekannt, dass bei der Erwärmung der Stärkmilch
die Viskosität mit steigender Temperatur stark ansteigt
und ein Maximum durchläuft und erst nach Überschreiten
der Gelierungstemperatur wieder abfällt. Durch dieses Verhalten
entstehen Probleme bei der Förderung und Erwärmung
bzw. Abkühlung der Stärkemilch.
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Für
eine optimale Wirkung der α-Amylase wird, in Abhängigkeit
von dem eingesetzten Enzymen oder Enzymgemisch, zumindest zeitweise
ein pH-Wert im schwach sauren Bereich, etwa zwischen 4,0 und 7,0,
eingestellt, wobei üblicherweise vor oder zu Beginn der
Verflüssigung die Einstellung des pH-Wertes durch Zugabe
von Säuren und Basen vorgenommen wird. Dieser pH-Wert wird
während der Verflüssigung kontrolliert und gegebenenfalls
nachgestellt. Die Einstellung des pH-Werts erfolgt meist mit verdünnten
Mineralsäuren wie H2SO4 oder
H3PO4 bzw. mit verdünnten
Alkalilaugen wie NaOH oder KOH. Die Einstellung und Überwachung
des pH-Wertes erfordert einen zusätzlichen apparativen Aufwand,
ihre Nichtbeachtung ergibt eine Fehlerquelle für den Betrieb,
erfolgt die Verflüssigung und anschließende Verzuckerung
der Stärke bei niedrigen pH-Werten, so muss vor der Vergärung
neutralisiert werden, mit den damit verbundenen höheren Kosten
und der Erhöhung des Salzgehaltes während der
Fermentation.
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Je
nach Zerkleinerungsgrad und Größenverteilung der
Stärkekörner kann der Gehalt an Trockensubstanz
in der Stärkemilch in weiten Bereichen schwanken. Benutzt
werden Gehalte an Trockensubstanz zwischen 20 und 65% Trockensubstanz
(TS), im Allgemeinen wird aber bei niedrigeren Gehalten, im Bereich
zwischen 25 und 40% TS gearbeitet. Eine Obergrenze ist durch die
Viskosität der Stärkemilch und die bei erhöhter
Temperatur auftretende Gelatinierung (Verkleisterung) der Stärke
gegeben. Die Verflüssigung erfolgt absatzweise oder kontinuierlich (Behälterkaskade,
Rohrreaktor) erfolgen, die Beheizung für die Temperaturänderung
indirekt oder durch Einblasen von Heizdampf.
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In
der Verflüssigung werden die Stärkemoleküle
zu Oligosaccharide abgebaut, die weitere Verzuckerung zu Glucose
erfolgt durch die Zugabe des Enzyms bzw. Enzymsystems Glucoamylase
(EC: 3.2.1.3, CAS: 9032-08-0). Die Verzuckerung erfordert in den
Verfahren nach dem Stand der Technik die Einstellung eines sauren
pH-Wertes, wobei pH-Werte im bereich von pH 4 nicht unüblich
sind. Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass die Geschwindigkeit
der Verzuckerung der Oligosaccharide zu Glucose von einer Reihe
von weiteren Faktoren abhängt, unter denen die Konzentration
des Enzyms eine herausragende Rolle spielt, da die Verzuckerungszeit
in erster Näherung exponentiell von der Enzymkonzentration
abhängt. Bei niedrigen Enzymgehalten sind Verzuckerungszeiten
im Bereich von 40 und mehr Stunden erforderlich, daher wird häufig
die nur teilweise verzuckerte Stärke bereits in die Fermentation überführ,
so dass Verzuckerung und Fermentation zumindest teilweise zeitgleich
im selben Fermenter erfolgen. Dadurch wird nicht nur die Fermentation
unnötig verlängert, die Verzuckerungsenzyme können
die Fermentation inhibieren und die Gefahr durch Kontamination steigt
an.
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Durch
hohe Enzymkonzentrationen kann die vollständige Verzuckerung
in weniger als 5 Stunden erreicht werden. Hierdurch werden nicht
nur die Investitionskosten durch das kleinere Behältervolumen für
die Verzuckerung vermindert, die Gefahr von Kontaminationen und
die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten wird durch
die kurze Verzuckerungszeit deutlich reduziert und eine Inhibierung
der Fermentation wird vermieden. Anderseits ist mit hohen Enzymkonzentrationen
ein hoher Verbrauch der Enzyme verbunden, wodurch die Betriebskosten steigen.
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Es
ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung die vorgenannten
Nachteile der Verfahren des Standes der Technik zu vermeiden.
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Gelöst
wird diese Aufgabe dadurch, dass Verflüssigung und Verzuckerung
der Stärke in zwei getrennten Schritten erfolgt, bei dem
sich natürlich einstellenden pH-Wert der Stärkemilch.
Die verwendete α-Amylasen erlauben eine Verflüssigung
bei vergleichsweise moderaten Temperaturen, ohne dass ein unerwünscht
starkes Ansteigen oder ein ausgeprägtes Maximum der Viskosität
auftritt. Somit eignet sich das Verfahren besonders für
eine kontinuierliche Arbeitsweise in den Schritten der Verflüssigung,
Verzuckerung und der Fermentation der verzuckerten Stärke.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer Lösung von Glucose aus Stärke, welches dadurch
gekennzeichnet ist, dass die mit Wasser zu einer Stärkemilch
angeteigte Stärke bei dem sich natürlich einstellenden pH-Wert,
ohne Zusatz von Säure, in einem Verflüssigungsbehälter
mit einem ersten Enzym oder Enzymsystem aus der Gruppe der α-Amylasen
versetzt wird, zunächst eine erste Zeit bei einer ersten
Temperatur gehalten, dann über eine zweite Zeit bei einer zweiten,
höheren Temperatur im Verflüssigungsbehälter
gehalten wird, von dieser zweiten auf eine dritte, niedrigere Temperatur
abgekühlt und die so verflüssigte Stärke
in einen Verzuckerungsbehälter gebracht, mit einem zweiten
Enzym oder einer Enzymmischung aus der Gruppe der Glucoamylasen
versetzt wird, die sich bildende Glucoselösung in einer Ultrafiltration
in einen ersten Strom, ein steriles, Glucose enthaltendes und praktisch
enzymfreies Permeat und in einen zweiten Strom, ein noch nicht umgesetzte
Stärke und Enzym enthaltendes Retentat aufgetrennt wird,
wobei das Retentat in den Verzuckerungsbehälter zurück
geführt und in diesem die Konzentration an Enzym auf einem
hohen. stationären Niveau gehalten wird.
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Die
erste Temperatur im Verflüssigungsbehälter liegt
bevorzugt zwischen 55 und 75°C, die zweite Temperatur im
Verflüssigungsbehälter bevorzugt zwischen 85 und
105°C.
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Die
erste Zeit im Verflüssigungsbehälter beträgt
vorzugsweise zwischen 0,5 bis 2 h, die zweite Zeit im Verflüssigungsbehälter
vorzugsweise zwischen 0,5 bis 2 h.
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Die
Verflüssigung erfolgt vorzugsweise in einem kontinuierlich
durchströmten und beheizbaren Rohrreaktor, die Temperatur
im Verzuckerungsbehälter beträgt vorzugsweise
zwischen 55 und 65°C.
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Die
sich an die Verflüssigung der Stärkemilch anschließende
Verzuckerung erfolgt bei einer hohen stationären Konzentration
der eingesetzten Glucoamylase. Diese wird dadurch erreicht, dass
die eingesetzte Glucoamylase durch das Verfahren der Ultrafiltration
mit angepassten Membranen aus der verzuckerten Lösung zurück
gewonnen und in die Verzuckerung zurückgeführt
wird. Dadurch kann die Verzuckerung bei einer gleichmäßig
hohen stationären Enzymkonzentration erfolgen, ohne dass
mehr Enzym zugesetzt und verbraucht wird als dies nach den Verfahren
des Standes der Technik der Fall ist. Die verflüssigte
Stärkemilch kann somit bei der hohen stationären
Enzymkonzentration innerhalb weniger Stunden vollständig
verzuckert werden. Die eingesetzten Membranen der Ultrafiltration
halten nicht nur die Glucoamylase zurück, sondern auch
Mikroorganismen und Verunreinigungen, die durch die eingesetzte
Stärke eingebracht worden sind. Das Permeat der Ultrafiltration
liefert somit eine sterile Lösung von Glucose mit einem
Gehalt von Glucose, bezogen auf die gesamte Trockenmasse, im Bereich
von vorzugsweise 85 bis 98%. Die Verwendung und weitere Verarbeitung
einer solchen sterilen Glucoselösung, etwa in Fermentationsverfahren,
kann schneller erfolgen und liefert reinere Endprodukte als die
Verfahren nach dem Stand der Technik.
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Die
Verzuckerung der verflüssigten Stärke beansprucht üblicherweise
einen Zeitraum von 1 bis 10 Stunden. Ein Teilstrom des Retentats
der Ultrafiltration kann aus dem Prozess ausgeschleust und gesondert
behandelt werden, wobei der aus dem Retentat der Ultrafiltration
ausgeschleuste Teilstrom 0,5 bis 10% des Retentatstromes betragen
kann.
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Das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird somit kontinuierlich
durchgeführt, das durch die Ultrafiltration abgeführte
Permeat wird durch kontinuierliche Zugabe von verflüssigter
Stärkemilch in den Verzuckerungsbehälter ersetzt.
In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens nach der
vorliegenden Erfindung können mehrere Verzuckerungsbehälter
hintereinander geschaltet sein. Durch eine Zugabe von frischem Enzym
in die Verzuckerung wird inaktiv gewordenes Enzym ersetzt und der
Gehalt an aktivem Enzym auf einem konstanten Wert gehalten. Um inaktives
Enzym und Verunreinigungen, die mit der Stärke eingebracht
und die durch die Enzyme nicht umgesetzt werden, aus dem System
zu entfernen, muss ein Teilstrom des Retentates der Ultrafiltration
abgeschlämmt und gesondert aufbereitet werden. Die Rate
der Abschlämmung wird so gewählt, dass sich einerseits
keine unerwünscht hohe Konzentratration an Verunreinigungen
aufbaut, andererseits der Verbrauch an kontinuierlich zugesetztem
frischen Enzym nicht höher ist als bei konventionellen
Verfahren.
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Die
folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der vorliegenden
Erfindung.
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Beispiel 1
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In
einem beheizbaren Rührbehälter wurden 100 l Wasser
eingefüllt, unter intensivem Rühren wurden 30
kg Stärkepulver zugesetzt. Das Stärkepulver war
durch Vermahlen von Weizen in einer Prallmühle erhalten
worden, es war von Kleie und Eiweiß befreit, enthielt aber
neben A-Stärke noch Anteile an B- und C-Stärke
sowie Fasern. Die so erhaltene Stärkemilch zeigte einen
natürlichen pH-Wert von 5,5, die Viskosität bei
40°C betrug 72 mPas (gemessen mit Haake Rotovisko bei 200
sec–1). Ohne weitere Einstellung
des pH-Wertes wurden 30 ml einer α-Amylase (EnerZyme® Alpha MHT der Fa. Erbslöh
Geisenheim AG, Geisenheim) zugegeben, die Stärkemilch wurde
auf eine Temperatur von 50°C aufgeheizt und für
30 min bei dieser Temperatur gehalten. Die Viskosität bei
40°C sank auf Werte zwischen 60 und 55 mPas, ohne dass
ein Ansteigen der Viskosität über den Anfangswert
auftrat. Anschließend wurde weiter bis auf 90°C
aufgeheizt und diese Temperatur für 60 min. gehalten. Die
Viskosität bei 80°C betrug 32 mPas, nach Abkühlen
auf 40°C lag sie bei 52 mPas, Zugabe einer Jod-Kaliumjodidlösung
ergab keine Blaufärbung mehr.
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l der verflüssigten Stärkemilch wurden in den
Vorratsbehälter einer Ultrafiltrations- Anlage überführt
und auf 60°C abgekühlt. Nach Erreichen dieser
Temperatur wurden 187 g einer Glucoamylase (EnerZyme® Gamma
der Fa Erbslöh Geisenheim AG, Geisenheim), aufgeschlämmt
in. 1 l Wasser, zugesetzt und die verflüssigte Stärkemilch
unter Konstanthaltung der Temperatur 1 h lang gerührt.
Am Ende dieser Zeit wurde der Gehalt an Trockensubstanz (TS) zu
30% bestimmt, der Gehalt an Glucose betrug 255 g/l Glucose (Messung
mit Erbsloeh-EasyLab). bei konstant gehaltener Temperatur von 60°C
wurde die Ultrafiltration gestartet (UF Keramikmembran der Fa. Inocerm,
2 19-Kanalrohre in Reihe, nominale Porenweite der Membran 5 nm,
Eingangsdruck 5 bar, Druckverlust bei einer Überströmungsgeschwindigkeit
von 4 m/sec 1,5 bar über beide Rohre, Permeatfluss 20 bis
22 l/m2h).
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Nach
der Abtrennung von jeweils 5 l Permeat wurde die entsprechende Menge
an verflüssigter Stärke in den Vorratsbehälter
der UF-Anlage nachgefüllt. Das Permeat wurde in Portionen
von jeweils 5 l gesammelt und auf den Gehalt an Trockensubstanz, Glucose
und Glucoamylase analysiert. In den ersten zwei Stunden stieg der
Gehalt an Trockensubstanz im Permeat von zunächst 30% TS
auf 31 bis 32% TS, der Gehalt an Glukose nahm parallel von zunächst 255
g/l auf 320 g/l zu. Alle Permeatproben waren klar und ohne Trübung
und schwach gelblich gefärbt.
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Über
die Abspaltung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenol-α-D-Glucopyranosid
durch die Glucosidase und die photometrische Bestimmung des frei gesetzten
p-Nitrophenols wurde der Gehalt an Glucoamylase in den Permeatproben überprüft.
Während der gesamten Versuchsdauer konnte in den Permeatproben
keine Glucoamylase nachgewiesen werden. Der Gehalt an Enzym in dem
Verzuckerungsbehälter blieb innerhalb der Fehlergrenzen
der Bestimmung während der Versuchszeit konstant.
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Beispiel 2
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Entsprechend
dem Vorgehen nach Beispiel 1 wurde im gleichen Rührbehälter
eine Stärkemilch einer höheren Konzentration angesetzt,
mit 35 kg Stärke auf 100 1 Wasser. Die Viskosität
dieser Stärkemilch war mit 83 mPas bei 40°C höher
als in Beispiel 1. Es wurden die gleiche Menge an α-Amylase (EnerZyme® Alpha MHT der Fa. Erbslöh
Geisenheim AG, Geisenheim) zugesetzt, die Lösung wurde
für 75 min auf 65°C erwärmt, anschließend
für weitere 75 min auf 95°C erwärmt.
Der Test mit Jod-Kaliumjodid Lösung ergab keine Blaufärbung
mehr, die Viskosität bei 40°C war auf 47 mPas
gesunken. Wie in Beispiel 1 wurde die Lösung rasch auf
60°C abgekühlt und ein Teilstrom von 55 l in den
Verzuckerungsbehälter überführt. Zu diesem
Teilstrom wurden 150 ml einer Glucoamylase – Lösung
(Enerzyme® Gamma Plus der Firma
Erbslöh Geisenheim AG, Geisenheim), die Lösung
wurde anschließend 90 min bei konstanter Temperatur von
60°C gerührt, dann wurde. Anschließend
wurde die Ultrafiltration, wie in Beispiel 1, gestartet. Die Viskosität
der Lösung, sowohl im Verzuckerungsbehälter als
auch in Permeat wurde bei 40°C bestimmt sie lag bei Werten
zwischen 45 und 53 mPas, die Permeat waren klar und nur schwach gelblich
gefärbt. Wie in Beispiel 1 wurden nach dem Abzug von jeweils
5 l Permeat diese Menge aus dem Verflüssigungsbehälter
in den Verzuckerungsbehälter überführt.
Die Viskosität im Verzuckerungsbehälter war vor
dem Nachfüllen auf einen Wert von 65 mPas (bei 40°C)
gestiegen. Der Gehalt an Trockensubstanz lag in beiden Lösungen
bei 33%, im Permeat stieg der Gehalt an Glucose in den ersten zwei Stunden
von 220 g/l auf 325 g/l und blieb danach etwa konstant. In keiner
der Permeatproben ließ sich mit der im Beispiel 1 angegebenen
Methode Glucoamylase nachweisen, die Konzentration des Enzyms im
Verzuckerungsbehälter blieb, innerhalb der Fehlergrenzen
der Bestimmungsmethode über einen Versuchszeitraum von
8 Stunden konstant.
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Nach
der Beschreibung und den Beispielen ist für den Fachmann
offensichtlich, dass das beanspruchte Verfahren auch auf die Hydrolyse
anderer polymerer Substrate, aus denen durch Enzyme Monosaccharide
gebildet werden können, wie Inulin, Pentosane, Hemicellulose,
gelöste Cellulose, in analoger Weise angewendet werden
kann.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 02/277252 [0002]
- - JP 2001-072701 [0002]
- - JP 56-169594 [0002]
- - CN 1218111 [0002]