ES2273349T3

ES2273349T3 - Metodo para licuar almidon.

Info

Publication number: ES2273349T3
Application number: ES96916844T
Authority: ES
Inventors: Colin Genencor International Inc. MITCHINSON; Leif P. Genencor International Inc. SOLHEIM
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-30
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2016-05-30
Also published as: US6184002B1; EP0856063B1; AU5958596A; JPH11506008A; CA2222571A1; US5652127A; ATE341643T1; DE69636601D1; EP0856063A1; CA2222571C; WO1996038578A1; DE69636601T2

Abstract

SEGUN LA INVENCION SE PROPONE UN METODO PARA LICUAR ALMIDON QUE INCLUYE LOS PASOS DE AÑADIR UNA COMPOSICION DE SODIO AL ALMIDON DE FORMA PREVIA O SIMULTANEA A LA LICUACION DEL ALMIDON; AÑADIR AL - AMILASA AL ALMIDON TRATADO; Y HACER REACCIONAR EL ALMIDON TRATADO DURANTE UN TIEMPO Y A UNA TEMPERATURA EFECTIVOS PARA LICUAR EL ALMIDON TRATADO. ENTRE LAS COMPOSICIONES DE SODIO PREFERIDAS SE INCLUYEN CLORURO SODICO, BICARBONATO SODICO, BENZOATO SODICO, SULFATO SODICO, BISULFITO SODICO, ASCORBATO SODICO, ACETATO SODICO, NITRATO SODICO, TARTRATO SODICO, TETRABORATO SODICO, PROPIONATO SODICO, CITRATO SODICO, SUCCINATO SODICO, GLUTAMATO MONOSODICO, CITRATO TRISODICO, FOSFATO SODICO O UNA MEZCLA DE ELLOS.

Description

Método para licuar almidón.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la modificación del uso de una \alpha-amilasa en la conversión del almidón del grano a productos de degradación, tales como dextrosa, fructosa y alcohol. En particular, la presente invención se refiere a la adición de iones sodio a una mezcla de almidón antes o durante la licuefacción para aumentar la eficacia de la licuefacción a pH bajo, es decir, entre pH 4,5 y 5,5.

Los granos, como el maíz, se han utilizado durante mucho tiempo como fuente de almidón. Uno de los métodos muy conocidos para separar y purificar el almidón para su utilización en procesos industriales es el proceso de molienda en húmedo. Este método se ha desarrollado en un sistema integrado y muy específico diseñado para separar los componentes principales del núcleo de un grano lo más completamente posible (véase Stanley A. Watson, Starch: Chemistry & Technology, vol. II, Industrial Aspects, Academic Press, Nueva York, 1967, pp. 30-51).

En un proceso de molienda en húmedo habitual, los granos secos utilizados para la producción de productos de almidón se someten, en primer lugar, a un proceso de empapado denominado maceración. Durante la maceración, los granos se someten a una corriente de agua a contracorriente que separa muchos compuestos solubles, incluyendo fitato y ácido fítico, azúcares, sales y proteínas, de los gránulos del grano. Los granos macerados se separan del agua de empapado (agua de maceración) y se someten a procedimientos de ruptura y molienda mecánicos. Entonces se utilizan técnicas de flotación y centrifugación para separar el germen del almidón, fibra y proteínas. La suspensión resultante de esdospermo (almidón), fibra y proteínas entonces se vuelve a moler y se tamiza para separar la fibra. Por último, las proteínas y los componentes relacionados con el endospermo se separan basándose en la densidad mediante un enjuagado a contracorriente y una centrifugación para separar el almidón de la corriente de proteínas/gluten. La corriente de almidón aislada entonces se enjuaga a fondo para eliminar cualquier compuesto soluble relacionado con el almidón que no sea granular, incluyendo compuestos solubles como sales inorgánicas, y compuestos como fitato y sales del ácido fítico. El producto resultante es una suspensión muy purificada de almidón granular insoluble que actúa como producto de partida para la conversión a fructosa.

En general, el procesamiento del almidón a fructosa consiste en cuatro etapas: licuefacción del almidón granular, sacarificación del almidón licuado para producir dextrosa, purificación, e isomerización para producir fructosa. El objeto de un proceso de licuefacción del almidón es convetir una suspensión concentrada de gránulos de polímeros de almidón en una disolución de dextrinas de cadena más corta solubles de baja viscosidad. Esta etapa es esencial para una manipulación conveniente con equipo convencional y para la conversión eficaz en glucosa u otros azúcares. Para licuar el almidón granular es necesario gelatinizar los gránulos aumentado la temperatura del almidón granular por encima de aproximadamente 72ºC. El proceso de calentamiento rompe instantáneamente los gránulos de almidón insolubles para producir una disolución de almidón soluble en agua. La disolución de almidón solubilizado entonces se licua mediante una \alpha-amilasa (EC 3.2.1.1.).

Un proceso de licuefacción enzimática habitual implica ajustar el pH de una suspensión de almidón granular entre 6,0 y 6,5, el pH óptimo de una \alpha-amilasa derivada de Bacillus licheniformis, con la adición de hidróxido de calcio, hidróxido de sodio o carbonato de sodio. La adición de hidróxido de calcio tiene la ventaja de proporcionar también iones calcio, que se sabe que estabilizan a la \alpha-amilasa frente a la inactivación. Después de la adición de \alpha-amilasa, la suspensión se bombea a través de una corriente en chorro para aumentar la temperatura de manera instantánea hasta 80º-115ºC. El almidón inmediatamente se gelatiniza y, debido a la presencia de \alpha-amilasa, es despolimerizado mediante la hidrólisis aleatoria de los enlaces \alpha(1-4)glicosídicos por la \alpha-amilasa para formar una masa fluida que puede bombearse con facilidad.

En una segunda variación del proceso de licuefacción, se añade \alpha-amilasa a la suspensión de almidón, la suspensión se mantiene a una temperatura de 80-100ºC para hidrolizar parcialmente los gránulos de almidón, y la suspensión de almidón parcialmente hidrolizado se bombea a través de un chorro a una temperatura en exceso de aproximadamente 105ºC para gelatinizar completamente cualquier estructura granular remanente. Después de enfriar el almidón gelatinizado puede realizarse una segunda adición de \alpha-amilasa para hidrolizar aún más el almidón.

Una tercera variación de este proceso se denomina proceso de molienda en seco. En la molienda en seco, el grano completo se muele y se combina con agua. El germen se separa opcionalmente mediante separación por flotación o técnicas equivalentes. La mezcla resultante, que contiene almidón, fibra, proteínas y otros componentes del grano, se licua utilizando \alpha-amilasa. La práctica general de la técnica consiste en realizar la licuefacción enzimática a una temperatura menor cuando se utiliza el proceso de molienda en seco. En general, se cree que una licuefacción a baja temperatura es menos eficaz que una licuefacción a alta temperatura para convertir el almidón en dextrinas solubles.

De forma típica, después de la gelatinización, la disolución de almidón se mantiene a una temperatura elevada en presencia de \alpha-amilasa hasta que se logra un ED de 10-20, normalmente durante un periodo de 1-3 horas. El equivalente de dextrosa (ED) es el patrón industrial para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculados como D-glucosa sobre una base de peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un ED de prácticamente cero, mientras que el ED de la D-glucosa se define como 100.

La temperatura máxima en la que puede mantenerse la disolución de almidón que contiene \alpha-amilasa depende de la fuente microbiana de la cual se ha obtenido la enzima y la estructura molecular de la molécula de \alpha-amilasa. Las \alpha-amilasas producidas por cepas de tipo salvaje de B. subtilis o B. amyloliquefaciens se utilizan, de forma típica, a unas temperatura no mayores que aproximadamente 90ºC debido a su inactivación térmica excesivamente rápida por encima de esta temperatura, mientras que las \alpha-amilasas producidas por cepas de tipo salvaje de B. licheniformis pueden utilizarse a temperaturas de hasta aproximadamente 110ºC.

Se sabe que la presencia de almidón e iones calcio estabiliza la \alpha-amilasa frente a la inactivación. No obstante, las \alpha-amilasas se utilizan a valores de pH por encima de 6 para obtener protección frente a la inactivación rápida. A bajas temperaturas se sabe que la \alpha-amilasa de B. licheniformis muestra una excelente actividad hidrolizante sobre un sustrato de almidón a valores de pH tan bajos como 5. Sin embargo, cuando la enzima se utiliza para la hidrólisis del almidón a temperaturas de chorro habituales, por ejemplo, entre 102ºC y 109ºC, el pH debe mantenerse al menos por encima de pH 5,7 para evitar una inactivación excesivamente rápida. El requerimiento de pH proporciona, por desgracia, una estrecha ventana de oportunidades de procesamiento porque unos valores de pH por encima de 6,0 producen subproductos indeseables, por ejemplo, maltulosa. Por tanto, en realidad, el pH de licuefacción debe mantenerse entre 5,9 y 6,0 para lograr un rendimiento satisfactorio del almidón hidrolizado.

Otro problema relacionado con el pH de licuefacción es la necesidad de aumentar el pH de la suspensión de almidón desde aproximadamente 4, el pH de una suspensión de almidón de maíz tal como viene de la etapa de molienda en húmedo, hasta 5,9-6,0. Este ajuste de pH requiere la adición costosa de productos químicos neutralizantes de ácidos, y también requiere un refinamiento de intercambio iónico adicional del producto final de la conversión del almidón para retirar el producto químico. Además, la siguiente etapa del proceso después de la licuefacción, de forma típica la sacarificación del almidón licuado para producir glucosa, requiere un pH de 4-4,5; por tanto, el pH debe ajustarse hacia abajo, desde 5,9-6,0 a 4-4,5, lo cual requiere etapas adicionales de adición de productos químicos y refina-
miento.

En la patente de EEUU nº 5.322.778, se logró una licuefacción entre pH 4,0 y 6,0 añadiendo un antioxidante, tal como bisulfito o su sal, ácido ascórbico o su sal, ácido eritórbico, o antioxidantes fenólicos, tales como hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, o \alpha-tocoferol, a la suspensión de licuefacción. Según las reivindicaciones de esta patente, el antioxidante debe añadirse a una concentración mayor que 5 mM.

En la patente de EEUU nº 5.180.669, se logró una licuefacción entre un pH de 5,0 a 6,0 mediante la adición de ion carbonato en exceso de la cantidad necesaria para tamponar la disolución, a la suspensión de almidón molido. Debido a un efecto de aumento de pH que se produce por la adición del ion carbonato, la suspensión en general se neutraliza mediante la adición de una fuente de ion hidrógeno, por ejemplo, un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.

En la publicación PCT nº WO 94/02597, se describe una \alpha-amilasa mutante que tiene mejor estabilidad oxidativa, en la que una o más metioninas están sustituidas por cualquier aminoácido, excepto cisteína o metionina.

En Patents Abstracts of Japan, vol. 4 (C-12) [555], 1980, el almidón se incorporó con 0,1-2% en p/p de una enzima de licuefacción purificada que es una amilasa termorresistente producida en una bacteria, tal como Bacillus subtilis, y exenta de enzimas proteasas y descomponedoras de grasas, y 0,05-5% en p/p de un estabilizador enzimático, tal como carbonato de calcio o cloruro de sodio.

En Chemical Abstracts, vol. 75, nº 89, 1971, se observó la termoestabilidad de la amilasa bacteriana a un pH de 5,5 o mayor, preferiblemente 6,2. El efecto protector del almidón se observó en concentraciones mayores que 25%. Los iones sodio y calcio también eran protectores eficaces de la amilasa.

En el documento FR-A-1556626 se describe un procedimiento para la licuefacción del almidón, que incluye la adición de sales de calcio y sodio a la mezcla de almidón, y la adición de \alpha-amilasa. Se sugiere un intervalo de pH de 5,7-7,5, con un pH preferido de 6,2.

El documento EP-A-0189838 describe un método para potenciar la estabilidad térmica de una \alpha-amilasa microbiana. El método implica añadir una cantidad estabilizante de un compuesto anfifílico a la enzima en su disolución acuosa.

El documento EP-A-0180952 se refiere a un proceso para licuar el almidón utilizando una \alpha-amilasa termoestable que tiene un intervalo de pH de actuación óptimo en una región ácida y un bajo requerimiento de calcio.

En la publicación PCT nº 94/18314 se describe una amilasa mutante que tiene mejor estabilidad oxidativa, en la que uno o más de los restos metionina, triptófano, cisteína, histidina o tirosina está sustituido por un aminoácido no oxidable.

En la publicación PCT nº WO 91/00353, los problemas asociados con la licuefacción se abordan mediante una \alpha-amilasa genéticamente modificada para que incluya características que incluyen mejor estabilidad térmica, a ácidos y a álcalis.

En la patente de EEUU nº 4.914.029 se añade fitasa al agua de macerado de maíz para reducir la cantidad de ácido fítico en el agua de macerado de maíz y, por tanto, utilizar de modo más eficaz el agua de macerado de maíz para piensos animales.

A pesar de los avances realizados en la técnica anterior, existe aún la necesidad de un medio eficaz para la licuefacción del almidón a bajos niveles de pH utilizando \alpha-amilasa disponible en el mercado.

Sumario de la invención

Un objeto de esta invención es proporcionar una licuefacción de mayor eficacia a pH bajo del almidón utilizando enzimas \alpha-amilasa de tipo salvaje o mutantes que pueden adquirirse con facilidad.

Otro objeto de esta invención es proporcionar un método según la reivindicación 1 para licuar el almidón sin la adición de antioxidantes costosos.

Según la presente invención, un método para licuar una disolución de almidón comprende las etapas de: (a) añadir una composición de sodio a la disolución de almidón, en el que la concentración final de sodio de la disolución de almidón es mayor que 20 ppm; (b) añadir \alpha-amilasa a la disolución de almidón; y (c) incubar la disolución de almidón que comprende la composición de sodio y la \alpha-amilasa durante un tiempo y bajo unas condiciones adecuados para licuar la disolución de almidón para formar una disolución de almidón licuada; en el que la etapa (c) se realiza bajo unas condiciones tales que un antioxidante está presente en la disolución de almidón en una concentración final menor que 2,5 mM. Según una realización preferida de la invención, la composición de sodio está presente en una concentración final de aproximadamente 20 ppm o mayor, preferiblemente de aproximadamente 20 ppm a aproximadamente 10.000 ppm, más preferiblemente de aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 1000 ppm, y lo más preferible de aproximadamente 100-500 ppm. La etapa (c) se realiza a un pH entre 4,5 y 5,5.

Como se indica con más detalle a continuación, la práctica de la presente invención confiere ventajas importantes a los procesos de licuefacción del almidón comerciales. Aunque no desean estar limitados por ninguna teoría, los inventores creen que la adición de una composición de sodio contrarresta los problemas asociados con la licuefacción a bajo pH del almidón con \alpha-amilasa, debido al aumento de la estabilidad de la enzima en sí misma, o por la reacción del sodio con una composición o composiciones en la disolución de almidón que desestabiliza el almidón. El sorprendente descubrimiento de los inventores de que la adición de sodio confiere mayor actividad a pH bajo a la \alpha-amilasa permite una licuefacción eficaz del almidón granular a valores de pH por debajo de aproximadamente 5,9 con \alpha-amilasas disponibles en el mercado.

La invención en sí misma, junto con otros objetos y ventajas relacionadas, se entenderá mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada junto con los dibujos adjuntos.

Descripción detallada de la invención

"Licuefacción" o "licuar" significa un proceso mediante el cual el almidón se convierte en dextrinas de cadenas más cortas y menos viscosas. En general, este proceso implica la gelatinización del almidón simultáneamente o seguido de la adición de \alpha-amilasa. En procesos comerciales, se prefiere que el almidón granular se derive de una fuente que comprende maíz, trigo, milo, sorgo, centeno o bulgur. Sin embargo, la presente invención se aplica a cualquier fuente de almidón de granos que sea útil en la licuefacción, por ejemplo, cualquier otra fuente de granos o vegetal conocida por producir almidón adecuado para la licuefacción.

"Agua de maceración" significa un líquido que se extrae de núcleos de granos macerados durante el proceso de macerado. El agua de maceración contiene una porción significativa de los componentes solubles del grano.

"Almidón granular" o "gránulos de almidón" significa un componente insoluble en agua de granos comestibles que permanece tras la retirada de la cáscara, fibra, proteínas, grasas, germen y compuestos solubles mediante las etapas de macerado, ruptura mecánica, separaciones, tamizado, enjuagado a contracorriente y centrifugación típicas del proceso de molienda en húmedo del grano. El almidón granular comprende gránulos de almidón intactos que contienen, casi exclusivamente, moléculas de almidón compactadas (es decir, amilopectina y amilosa). En el maíz, el componente de almidón granular comprende aproximadamente 99% de almidón; el 1% restante está compuesto de proteínas, grasas, ceniza, fibra y componentes traza muy asociados a los gránulos. La estructura compacta del almidón granular retrasa gravemente la capacidad de la \alpha-amilasa para hidrolizar el almidón. Se utiliza la gelatinización del almidón para romper los gránulos para formar una disolución de almidón soluble y facilitar la hidrólisis enzimáti-
ca.

"Disolución de almidón" significa el almidón gelatinizado soluble en agua que se produce como resultado de calentar el almidón granular. Tras calentar los gránulos por encima de aproximadamente 72ºC, el almidón granular se disocia para formar una mezcla acuosa de moléculas de almidón sueltas. Esta mezcla que comprende, por ejemplo, aproximadamente 75% de amilopectina y 25% de amilosa en maíz dentado amarillo, forma una disolución viscosa en agua. En procesos comerciales para formar glucosa o fructosa, es la disolución de almidón lo que se licua para formar una disolución de dextrina soluble.

"\alpha-amilasa" significa una actividad enzimática que rompe o hidroliza el enlace \alpha(1-4)glicosídico, por ejemplo, el presente en polímeros de almidón, amilopectina o amilosa. Las \alpha-amilasas adecuadas con las \alpha-amilasas que aparecen en la naturaleza, así como las amilasas recombinantes o mutantes que son útiles en la licuefacción del almidón. Las amilasas preferidas en la presente invención son \alpha-amilasas derivadas de Bacillus, y en particular Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus stearothermophilus.

"Composición de sodio" o "sodio" significa una composición o mezcla que contiene sodio que, cuando se disuelve en una disolución acuosa, da como resultado la presencia de iones sodio libres. Las composiciones de sodio pueden ser iones sodio libres, sodio metálico, sales que contienen sodio o cualquier otro método conocido en la técnica para introducir iones sodio libres en una disolución acuosa. Las sales de sodio adecuadas incluyen cloruro de sodio, benzoato de sodio, sulfato de sodio, bisulfito de sodio, ascorbato de sodio, nitrato de sodio, tartrato de sodio, tetraborato de sodio, propionato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, glutamato de monosodio, citrato de trisodio o sus mezclas.

La concentración final de la composición de sodio en la disolución de almidón debe ser, en general, una concentración que es suficiente para permitir la licuefacción eficaz del almidón según la presente invención. En general, la concentración final de la composición que contiene sodio añadida al almidón es 20 ppm o mayor; preferiblemente de aproximadamente 20 ppm a aproximadamente 10.000 ppm; más preferiblemente de aproximadamente 50 ppm a aproximadamente 1000 ppm; y lo más preferible de aproximadamente 100-500 ppm.

La licuefacción del almidón según la presente invención permite que se produzca la reacción de licuefacción, es decir, la hidrólisis enzimática del almidón, amilopectina o amilosa, de forma eficaz a un pH entre 4,5 y 5,5.

El intervalo de temperatura de la licuefacción es, en general, cualquier temperatura de licuefacción que se sabe que es eficaz para licuar el almidón. Preferiblemente, la temperatura del almidón es de aproximadamente 80ºC a aproximadamente 115ºC, más preferiblemente de aproximadamente 100ºC a aproximadamente 110ºC, y lo más preferible de aproximadamente 105ºC a aproximadamente 108ºC.

En una realización preferida de la invención, se añade un compuesto que contiene sodio a un almidón granular o una disolución de almidón antes o simultáneamente a la adición de \alpha-amilasa y la licuefacción del almidón. La suspensión entonces se incuba durante un tiempo apropiado a un pH apropiado y a una temperatura apropiada, según técnicas muy conocidas, para licuar el almidón. Según la presente invención, la capacidad para licuar el almidón de forma eficaz mejora sustancialmente mediante la adición de la composición de sodio a la disolución de almidón antes de la licuefacción, es decir, antes de la adición de la \alpha-amilasa.

Los siguientes ejemplos son representativos, y no limitantes, de las ventajas conferidas mediante el uso de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica serán capaces de sustituir condiciones, granos, temperaturas, enzimas y similares según la anterior descripción.

Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo para la determinación de la actividad \alpha-amilasa

Se determinó la actividad \alpha-amilasa mediante un ensayo que depende de la capacidad del almidón para formar un complejo de color azul con yodo, y la desaparición de este color cuando el almidón se hidroliza para formar moléculas de dextrina más cortas. La actividad \alpha-amilasa se define en términos de tiempo de digestión requerido para producir un cambio de color, lo cual indica un estado definido de dextrinación del almidón.

Los reactivos utilizados fueron los siguientes: Tampón fosfato - Se disolvieron dihidrógenofosfato de potasio (340 g) e hidróxido de sodio (25,3 g) en agua y se diluyó hasta 2 litros. El tampón se enfrió hasta la temperatura ambiente, y el pH se ajustó a 6,2 \pm 0,1. El tampón se diluyó hasta 2 litros en un matraz aforado. Sustrato de almidón - Se suspendieron 10 gramos (sustancia seca) de almidón Lintner soluble en 50 ml de agua y se lavaron en aproximadamente 300 ml de agua hirviendo. La suspensión se volvió a hervir y se hirvió durante 5 minutos con agitación constante. La disolución de almidón se enfrió con agitación constante hasta la temperatura ambiente y se añadieron 125 ml de tampón fosfato. La disolución se diluyó hasta 500 ml con agua. Disolución patrón de yodo - Se disolvieron cristales de yodo (5,5 g) y yoduro de potasio (11,0 g) en agua y se diluyeron volumétricamente hasta 250 ml. La disolución se ocultó de la luz. Disolución de yodo diluida - Se disolvieron yoduro de potasio (20 g) y 2 ml de la disolución patrón de yodo en agua, y se diluyó volumétricamente hasta 500 ml. Disolución de dilución enzimática - Se disolvió cloruro de calcio (11,1 g) en 4 litros de agua. El agua utilizada para todos los reactivos era destilada o desionizada.

La muestra de \alpha-amilasa para la cual debe determinarse la actividad se diluyó hasta 10-15 LU/ml (como se define a continuación) con disolución de dilución enzimática. Para muchas preparaciones comerciales de \alpha-amilasa se descubrió que una dilución adecuada era 2000 veces. Se dispensaron partes alícuotas de 5 mililitros de disolución de yodo diluida a tubos de ensayo de 13 x 100 mm, y se colocaron 10 ml de sustrato de almidón en un tubo de ensayo de 23 x 200 mm. Todos los tubos se colocaron en el baño de agua a 30ºC. Se utilizó un comparador Hellige equipado con un disco de color de \alpha-amilasa especial (nº de catálogo 620-s5) para realizar las lecturas. Se mezclaron 5 mililitros de enzima diluida (también a 30ºC) con el sustrato de almidón y se comenzó el cronometraje. En intervalos de tiempo apropiados, por ejemplo intervalos de 1 minuto al comienzo de la reacción e intervalos de 15 segundos más adelante en la reacción, se trasladaron partes alícuotas de 1 ml de la mezcla de enzima-sustrato a un tubo que contiene la disolución de yodo diluida atemperada. La disolución de yodo y almidón se mezcló y se trasladó a un tubo cuadrado de precisión de 13 mm, y el color se comparó con el disco de color de \alpha-amilasa patrón en el comparador Hellige. Cuando se aproximó el momento de la finalización se tomaron muestras en intervalos de 0,25 minutos.

Se registró el tiempo requerido para que los colores de las muestras y el disco de color se correspondieran, y se calculó la actividad (en licuefón por gramo o ml) según la fórmula:

LU/g o LU/ml = \left\{\frac{570}{V \ x \ t}\right\} \ x \ D

en la que

LU = unidad de licuefón

t = tiempo de dextrinización (minutos)

D = factor de dilución: volumen de dilución dividido entre los mililitros o gramos de la enzima diluida.

Ejemplo 2 Condiciones de licuefacción del almidón - determinación del ED (equivalente de dextrosa) del almidón licuado

La licuefacción del almidón se realizó utilizando un reactor compuesto de un tubo de acero inoxidable de 15,2 m con diámetro de 0,61 cm doblado en una bobina de aproximadamente 25,4 cm de diámetro y aproximadamente 14 cm de altura. La bobina estaba equipada con un mezclador estático en línea de 29,2 cm (Cole-Parmer nº G-04669-60) montado a aproximadamente 1,22 m del extremo anterior. El extremo posterior de la bobina estaba equipado con un valor de liberación de presión ajustable en línea Swagelok (nº SS-4CA-3) ajustado a una presión de ruptura de aproximadamente 138 kPa. La suspensión de almidón se introdujo en la bobina a una velocidad de aproximadamente 70 ml/minuto con una bomba dosificadora de pistón. La bobina se calentó mediante inmersión en un baño de glicerol-agua calentado hasta 105,5ºC. La temperatura en el baño se mantuvo utilizando un controlador de temperatura/calentador circulante (Fisher Scientific modelo 7305).

El almidón granular se obtuvo de un molino de maíz en húmedo y se utilizó en los dos días siguientes. Como otra fuente de almidón se obtuvo LO-DEX^{TM} 10 (una dextrina purificada soluble en agua producida por la hidrólisis limitada de almidón de maíz) de American Maize-Products Company, Hammond, Indiana. El LO-DEX^{TM} 10 utilizado en la presente tenía un ED inicial de aproximadamente 9,5.

El almidón o maltodextrina se diluyó hasta un nivel de sólidos deseado de aproximadamente 30-35% de sólidos secos con agua desionizada, y el pH se ajustó con NaOH al 2,5% o HCl al 6%, según fuera necesario. El calcio se añadió en forma de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O. Las condiciones de licuefacción típicas eran:

Almidón o LO-DEX^{TM} 10: 32%-35% de sólidos

Calcio: 40-60 ppm (30 ppm añadidos)

pH: 5,0-6,0

\alpha-amilasa: 12-14 LU/g de carbohidratos (sobre una base seca)

El almidón o LO-DEX^{TM} 10 que contiene la enzima y el calcio en forma de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O se introdujo en el reactor a aproximadamente 70 ml/min. La temperatura del reactor se mantuvo a 105,5ºC mediante la inmersión del reactor en un baño de glicerol-agua. Las muestras de almidón se trasladaron del reactor a un baño de licuefacción de segunda etapa a 95ºC y se mantuvieron durante 90 minutos. El grado de licuefacción del almidón se midió inmediatamente después de la licuefacción de segunda etapa determinando el equivalente de dextrosa (ED) de la muestra según el método descrito en Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Inc., 6ª ed., Analytical Procedure Committee (1980).

Como alternativa, el almidón se licuó utilizando un hidrocalentador M 103-M de corriente en chorro (Hydro-Thermal Corp., Milwaukee, WI) equipado con una bobina de retraso de 2,5 litros detrás de la cámara de mezclado y una válvula de retropresión terminal. El almidón se introdujo en la corriente a aproximadamente 360 ml/min mediante una bomba Moyno, y se suministró vapor mediante una tubería de vapor a 1030 kPa reducida a 621-689 kPa y se controló para producir una temperatura de la suspensión de aproximadamente 105,5ºC medida en la sonda de temperatura posterior. Las sondas de temperatura se instalaron aproximadamente 10 cm después del chorro del hidrocalentador y aproximadamente 5 cm antes de la válvula de retropresión.

Ejemplo 3 Efecto de los cationes sobre la licuefacción del almidón de maíz a pH bajo por \alpha-amilasa

Almidón de maíz secado (almidón de maíz Clinton marca 106-B Pearl, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) se suspendió con agua desionizada (aproximadamente 23 kg en aproximadamente 50 litros) y se dejó hidratándose durante 16 horas. El almidón se lavó dos veces mediante filtración y resuspensión en agua desionizada para eliminar los materiales solubles y después se diluyó hasta 35% de sólidos con agua desionizada. Se añadió calcio (50 ppm añadidos como CaCl_{2}\cdot2H_{2}O) al almidón y el pH se ajustó a aproximadamente 5,5 con NaOH al 2,5%. Se añadió aproximadamente 5 mM del catión que se va a evaluar a la suspensión de almidón y se añadió \alpha-amilasa (SPEZYME AA20, producida por una cepa de B. licheniformis y disponible en el mercado en Genencor International, Inc.) a una velocidad de 12 LU/g de carbohidratos, y el pH de la disolución se ajustó a pH 5,5 mediante la adición de NaOH al 2,5% o HCl al 6%, según fuera necesario. La disolución se hidrolizó utilizando el sistema de reactor y el procedimiento según se describe en el ejemplo 2. El grado de hidrólisis de la suspensión de almidón se midió determinando el equivalente de dextrosa (ED) inmediatamente después de la contención secundaria.

La siguiente tabla demuestra que se evita la inactivación de la \alpha-amilasa durante la licuefacción del almidón de maíz a pH 5,5 mediante la adición de sales de sodio, pero no por otros cationes.

TABLA 1 Efecto de los cationes sobre la licuefacción del almidón de maíz a pH 5,5

Compuesto químico evaluado	ED
ninguno	4,9
NaCl	9,7
LiCl	3,0
KCl	6,5
NH_{4}Cl	5,3
(NH_{4})_{2}SO_{4}	5,4
CaCl_{2}	5,1

Los inventores verificaron que los pequeños efectos observados con ciertos cationes (es decir, K^{+} y NH_{4}^{+}) son coherentes con pequeñas variaciones en la cantidad de NaOH añadido para el ajuste del pH. No obstante, los inventores creen que el ion potasio también proporciona un pequeño efecto, por ejemplo, aproximadamente 10-25% del provocado por una composición de sodio.

Ejemplo 4

(Referencia)

Efecto de variar el contraión sobre la estabilización de sodio de la \alpha-amilasa

Almidón de maíz secado (almidón de maíz Clinton marca 106-B Pearl, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) se suspendió con agua desionizada (aproximadamente 23 kg en aproximadamente 50 litros) y se dejó hidratándose durante 16 horas. El almidón se lavó dos veces mediante filtración y resuspensión en agua desionizada para eliminar los materiales solubles y después se diluyó hasta 35% de sólidos con agua desionizada. Se añadió calcio (50 ppm añadidos como CaCl_{2}\cdot2H_{2}O) al almidón y el pH se ajustó a aproximadamente 5,5 con KOH al 5%. Se añadieron diversas sales de sodio a la suspensión de almidón para producir concentraciones finales de sodio de 5 mM. Se añadió \alpha-amilasa (SPEZYME AA20, producida por una cepa de B. licheniformis y disponible en el mercado en Genencor International, Inc.) a una velocidad de 12 LU/g de carbohidratos, y el pH de la disolución se ajustó a pH 5,5 mediante la adición de KOH al 5% o HCl al 6%, según fuera necesario. La disolución se hidrolizó utilizando el sistema de reactor y el procedimiento según se describe en el ejemplo 2. El grado de hidrólisis de la suspensión de almidón se midió determinando el equivalente de dextrosa (ED) inmediatamente después de la contención secundaria.

Como se muestra en la tabla 2, se evita la inactivación de la \alpha-amilasa durante la licuefacción del almidón de maíz a pH 5,5 mediante la adición del ion sodio procedente de una diversidad de fuentes. Aunque el bromato de sodio aparentemente es ineficaz, esto se atribuye al fuerte efecto de oxidación que se sabe que se produce entre el bromato y las proteínas.

TABLA 2 Efecto del ion sodio sobre la estabilidad de la \alpha-amilasa durante la licuefacción a pH 5,5

Sal de sodio evaluada	ED
ninguna	2,3
NaH_{2}PO_{4}	8,9
benzoato de sodio	11,7
Na_{2}SO_{4}	10,7
NaNO_{3}	10,8
tartrato de potasio y sodio	9,8
tetraborato de sodio	10,7
propionato de sodio	11,2
citrato de sodio	6,6
succinato de sodio	10,4
glutamato de monosodio	10,6
bromato de sodio	aproximadamente 0

Ejemplo 5 Efecto del ion sodio y la concentración de \alpha-amilasa sobre la licuefacción del almidón de maíz

Una suspensión de almidón de maíz de una planta de molienda en húmedo de maíz se diluyó hasta 35% de sólidos con agua desionizada y se añadieron 300 ppm de calcio como Ca(OH)_{2}. Se añadieron diversas concentraciones de ion sodio a la suspensión de almidón para producir la concentración de iones sodio deseada. Se evaluaron al menos dos concentraciones de iones sodio en cada concentración de \alpha-amilasa. La concentración de ion sodio en la suspensión de almidón se midió mediante un electrodo de ion sodio (Corning nº 476138). La suspensión de almidón de sólidos conocidos se filtró a través de un papel de filtro Whatman nº 3 y se midió la concentración de sodio del filtrado como se describe en el manual del electrodo de sodio. Las concentraciones de ion sodio se indican como partes por millón de la suspensión completa de almidón.

El pH de la suspensión de almidón se ajustó a aproximadamente el pH deseado (entre 5,5 y 5,9) con KOH al 5% o HCl al 6%, según fuera necesario. Se añadió \alpha-amilasa (SPEZYME AA20, producida por una cepa de B. licheniformis y disponible en el mercado en Genencor International, Inc.) a una velocidad de 12, 15 ó 18 LU/g de sólidos secos de carbohidratos, y el pH de la disolución se ajustó al pH deseado mediante la adición de KOH al 5% o HCl al 6%, según fuera necesario. La disolución se hidrolizó utilizando la corriente en chorro y el procedimiento según se describe en el ejemplo 2. El grado de hidrólisis de la suspensión de almidón se midió determinando el equivalente de dextrosa (ED) inmediatamente después de la contención secundaria.

Las concentraciones de iones sodio utilizadas en la licuefacción se ajustaron de forma que se obtuvieron ED por encima y por debajo de 10 en cada dosificación de \alpha-amilasa evaluada. Entonces se determinó la concentración de ion sodio requerida para producir un almidón licuado de ED 10 en cada dosificación de enzima, construyendo una gráfica de valores de ED frente a las concentraciones de ion sodio e interpolando los puntos de datos.

Como se muestra en la tabla 3, a medida que disminuye el pH de las gotas de licuefacción o la concentración de \alpha-amilasa, se necesita más ion sodio para producir un almidón licuado de ED 10.

TABLA 3 Concentración de sodio requerida para producir un licuefacto de ED 10

pH	Concentración de sodio (ppm)
	12 LU/g	15 LU/g	18 LU/g
5,9	100	28	5
5,7	155	95	22
5,5	322	200	63

Por supuesto, debe entenderse que puede realizarse una amplia gama de cambios y modificaciones en la realización preferida descrita anteriormente. Por tanto, se pretende que la anterior descripción detallada se entienda que se encuentre en las siguientes reivindicaciones, incluyendo todos los equivalentes, que pretenden definir el alcance de esta invención.

Claims

1. Un método para licuar una disolución de almidón que es una suspensión, que comprende las etapas de:

(a) añadir una composición de sodio a dicha disolución de almidón, en el que la concentración final de sodio de dicha disolución de almidón es mayor que 20 ppm, en el que dicha composición de sodio comprende cloruro de sodio, benzoato de sodio, sulfato de sodio, bisulfito de sodio, ascorbato de sodio, nitrato de sodio, tartrato de sodio, tetraborato de sodio, propionato de sodio, citrato de sodio, succinato de sodio, glutamato de monosodio, citrato de trisodio o sus mezclas;

(b) añadir \alpha-amilasa a dicha disolución de almidón; y

(c) incubar dicha disolución de almidón que comprende dicha composición de sodio y dicha \alpha-amilasa a un pH entre 4,5 y 5,5, a una temperatura entre 80ºC y 115ºC, y durante un tiempo adecuado para licuar dicha disolución de almidón para formar una disolución de almidón licuada;

en el que dicha etapa (c) se realiza bajo unas condiciones tales que un antioxidante está presente en dicha disolución de almidón en una concentración final que comprende menos de 2,5 mM de un antioxidante.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha composición de sodio está presente en una concentración final de 20 ppm a 10.000 ppm.

3. El método según la reivindicación 1, en el que dicha composición de sodio está presente en una concentración final de 50 ppm a 1000 ppm.

4. El método según la reivindicación 1, en el que dicha composición de sodio está presente en una concentración final de 100 ppm a 500 ppm.

5. El método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa (a) es anterior a dicha etapa (b).

6. El método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa (a) es simultánea con dicha etapa (b).