ES2634315T3 - Derivados de 2.2-difluoropropionamida de bardoxolona metilo, formas polimórficas y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula:**Fórmula** o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Description

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DESCRIPCION

Derivados de 2.2-difluoropropionamida de bardoxolona metilo, formas polimorficas y metodos de uso de los mismos Antecedentes de la invencion

I. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general al compuesto:

W-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-ciano-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-dioxo-

I, 2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-octadecahidropicen-4a-il)-2,2-difluoropropanamida,

tambien referido en la presente como RTA 408, 63415, o PP415. La presente invencion tambien se refiere a formas polimorficas del mismo, metodos para la preparacion y uso del mismo, composiciones farmaceuticas del mismo, y kits y artfculos de fabricacion del mismo.

II. Descripcion de la tecnica relacionada

La actividad anti-inflamatoria y anti-proliferativa del triterpenoide, acido oleanolico, de origen natural, han sido mejoradas por modificaciones qmmicas. Por ejemplo, se han desarrollado acido 2-ciano-3,12-diooxooleana-1,9(11)- dien-28-oico (CDDO) y compuestos relacionados. Ver Honda et al., 1997; Honda et al., 1998; Honda et al., 1999; Honda et al., 2000a; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Suh et al., 1998; Suh et al., 1999; Place et al., 2003; Liby et al., 2005; y Patentes U.S. 8.129.429, 7.915.402, 8.124.799, y 7.943.778. El ester de metilo, bardoxolona metilo (CDDO-Me), se ha evaluado en ensayos clmicos fase II y III para el tratamiento y prevencion de la nefropatfa diabetica y enfermedad renal cronica. Ver Pergola et al., 2011.

Los analogos de triterpenoide sintetico de acido oleanolico tambien han mostrado ser inhibidores de procesos inflamatorios celulares, tales como la induccion por IFN-y de oxido mtrico sintasa inducible (iNOS) y de COX-2 en los macrofagos de raton. Ver Honda et al., (2000a), Honda et al. (2000b), Honda et al. (2002), y Patentes de Estados Unidos 8.129.429, 7.915.402, 8.124.799, y 7.943.778. Se ha mostrado que los compuestos derivados de acido oleanolico afectan la funcion de multiples dianas proteicas y por lo tanto modulan la actividad de varias vfas de senalizacion celular importantes relacionadas con el estres oxidativo, control del ciclo celular, y la inflamacion (por ejemplo, Dinkova-Kostova et al., 2005; Ahmad et al., 2006; Ahmad et al., 2008; Liby et al., 2007a, y Patentes U.S. 8.129.429, 7.915.402, 8.124.799, y 7.943.778).

Dado que los perfiles de actividad biologica de derivados de triterpenoide conocidos vanan, y a la vista de la amplia variedad de enfermedades que pueden ser tratadas o prevenidas con compuestos que tienen potentes efectos antioxidantes y anti-inflamatorios, y el alto grado de necesidad medica no satisfecha representada dentro de esta variedad de enfermedades, es deseable sintetizar nuevos compuestos con diferentes perfiles de actividad biologica para el tratamiento o prevencion de una o mas indicaciones.

Resumen de la invencion

En algunos aspectos de la presente invencion, se proporciona un compuesto de la formula (tambien referido en la presente como RTA 408, 63415, o PP415):

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o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, el compuesto esta en la forma de una sal farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el compuesto no esta en la forma de una sal.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan formas polimorficas del compuesto anterior. En algunas realizaciones, la forma polimorfica tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende un pico de halo a aproximadamente 14 °20. En algunas realizaciones, el patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) comprende ademas un pico de hombro a aproximadamente 8 °20. En algunas realizaciones, el patron de difraccion

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en polvo de rayos X (CuKa) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 59. En algunas realizaciones, la forma polimorfica tiene una Tg de aproximadamente 150°C a aproximadamente 155°C, incluyendo, por ejemplo, una Tg de aproximadamente 153°C o una Tg de aproximadamente 150°C. En algunas realizaciones, la forma polimorfica tiene una curva de calorimetna de barrido diferencial (DSC) que comprende una endoterma centrada desde aproximadamente 150°C a aproximadamente 155°C. En algunas realizaciones, la endoterma esta centrada a aproximadamente 153°C. En algunas realizaciones, la endoterma esta centrada a aproximadamente 150°C. En algunas realizaciones, la curva de calorimetna de barrido diferencial (DSC) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 62.

En algunas realizaciones, la forma polimorfica es un solvato que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 5,6, 7,0, 10,6, 12,7, y 14,6 °20. En algunas realizaciones, el patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 75, patron superior.

En algunas realizaciones, la forma polimorfica es un solvato que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (pico doble), 14,2, y 16,0 °20. En algunas realizaciones, el patron de difraccion de rayos X (CuKa) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 75, segundo patron desde la parte superior.

En algunas realizaciones, la forma polimorfica es un hemisolvato de acetonitrilo que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 7,5, 11,4, 15,6 y 16,6 °20. En algunas realizaciones, el patron de difraccion de rayos X (CuKa) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 75, segundo patron desde la parte inferior. En algunas realizaciones, la forma polimorfica tiene una Tg de aproximadamente 196°C. En algunas realizaciones, la forma polimorfica tiene una curva de calorimetna de barrido diferencial (DSC) que comprende una endoterma centrada a aproximadamente 196 C. En algunas realizaciones, la curva de calorimetna de barrido diferencial (DSC) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 116.

En algunas realizaciones, la forma polimorfica es un solvato que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6, y 15,6 °20. En algunas realizaciones, el patron de difraccion de rayos X (CuKa) es sustancialmente como se muestra en la FIG. 75, patron inferior.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden un ingrediente activo que consiste en el compuesto anterior o una forma polimorfica del mismo (tal como, por ejemplo, una cualquiera de las formas polimorficas descritas en la presente antes y a continuacion), y un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula para administracion: oral, intraadiposal, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradermica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostatica, intrarrectal, intratecal, intratraqueal, intratumoral, intraumbilical, intravaginal, intravenosa, intravesicular, intravftrea, liposomal, local, mucosal, parenteral, rectal, subconjuntival, subcutanea, sublingual, topica, transbucal, transdermica, vaginal, en cremas, en composiciones lipfdicas, via un cateter, via un lavado, via infusion continua, via infusion, via inhalacion, via inyeccion, via suministro local, o via perfusion localizada. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula para administracion oral, intraarterial, intravenosa, o topica. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula para administracion oral.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula como una capsula dura o blanda, un comprimido, un jarabe, una suspension, una emulsion, una disolucion, una dispersion solida, una oblea, o un elixir. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion comprende ademas un agente que potencia la solubilidad y dispersabilidad. (Por ejemplo, los agentes que potencian la solubilidad y dispersabilidad incluyen, pero no se limitan a, PEG, ciclodextranos, y derivados de celulosa). En algunas realizaciones, el compuesto o forma polimorfica se suspende en aceite de sesamo.

En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se formula para administracion topica. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se formula como una locion, una crema, un gel, un aceite, un unguento, un balsamo, una emulsion, una disolucion, o una suspension. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula como una locion, como una crema, o como un gel. En algunas realizaciones, la cantidad del ingrediente activo es desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% en peso, aproximadamente 0,01% a aproximadamente 3% en peso, o 0,01%, 0,1%, 1%, o 3% en peso.

En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan metodos para tratar o prevenir una afeccion asociada con la inflamacion o estres oxidativo en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica como se describe antes o a continuacion. La invencion se refiere igualmente al compuesto W-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-ciano-2,2,6a,6b,9,9,12a- heptametil-10,14-dioxo-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-octadecahidropicen-4a-il)-2,2- difluoropropanamida (o RTA 408) o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable, o una forma polimorfica de este compuesto (tal como, por ejemplo, una cualquiera de las formas polimorficas descritas en la presente antes o a continuacion), o una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de las entidades mencionadas antes y un vefnculo farmaceuticamente aceptable (incluyendo, por ejemplo, las composiciones farmaceuticas descritas anteriormente), para el uso en el tratamiento o prevencion de una afeccion asociada con la inflamacion o estres

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oxidativo. La invencion tambien se refiere al uso del compuesto mencionado anteriormente, forma polimorfica o composicion farmaceutica para la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de una afeccion asociada con la inflamacion o estres oxidativo. En algunas realizaciones, la afeccion esta asociada con la inflamacion. En otras realizaciones, la afeccion esta asociada con el estres oxidativo. En algunas realizaciones, la afeccion es una enfermedad o trastorno de la piel, sepsis, dermatitis, osteoartritis, cancer, inflamacion, una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, una complicacion de la exposicion localizada o total del cuerpo a radiacion ionizante, mucositis, insuficiencia organica aguda o cronica, enfermedad hepatica, pancreatitis, un trastorno ocular, una enfermedad pulmonar o diabetes.

La presente invencion se refiere ademas al compuesto W-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-ciano- 2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-dioxo-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-octadecahidropicen-4a-il)- 2,2-difluoropropanamida (o RTA 408) o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable, o una forma polimorfica de este compuesto (tal como, por ejemplo, una cualquiera de las formas polimorficas descritas en la presente antes o a continuacion), o una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de las entidades mencionadas anteriormente y un vehroulo farmaceuticamente aceptable (incluyendo, por ejemplo, las composiciones farmaceuticas descritas anteriormente), para el uso en el tratamiento o prevencion de una afeccion seleccionada de una enfermedad o trastorno de la piel, sepsis, dermatitis, osteoartritis, cancer, inflamacion, una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, una complicacion de la exposicion localizada o total del cuerpo a radiacion ionizante, mucositis, insuficiencia organica aguda o cronica, enfermedad hepatica, pancreatitis, un trastorno ocular, una enfermedad pulmonar o diabetes. Por consiguiente, la invencion se refiere al uso del compuesto mencionado anteriormente, forma polimorfica o composicion farmaceutica para la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de una afeccion seleccionada de una enfermedad o trastorno de la piel, sepsis, dermatitis, osteoartritis, cancer, inflamacion, una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, una complicacion de la exposicion localizada o total del cuerpo a radiacion ionizante, mucositis, insuficiencia organica aguda o cronica, enfermedad hepatica, pancreatitis, un trastorno ocular, una enfermedad pulmonar, o diabetes. La invencion tambien se refiere a un metodo para tratar o prevenir una afeccion seleccionada de una enfermedad o trastorno de la piel, sepsis, dermatitis, osteoartritis, cancer, inflamacion, una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, una complicacion de la exposicion localizada o total del cuerpo a radiacion ionizante, mucositis, insuficiencia organica aguda o cronica, enfermedad hepatica, pancreatitis, un trastorno ocular, una enfermedad pulmonar, o diabetes en un paciente en necesidad del mismo, comprendiendo el metodo administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva del compuesto mencionado anteriormente, forma polimorfica o composicion farmaceutica. En algunas realizaciones, la afeccion es una enfermedad o trastorno de la piel tal como dermatitis, una quemadura termica o qrnmica, una herida cronica, acne, alopecia, otros trastornos del folroulo piloso, epidermolisis bullosa, quemaduras de sol, complicaciones de quemaduras solares, trastornos de la pigmentacion de la piel, una afeccion de la piel relacionada con el envejecimiento; una herida post-quirurgica, una cicatriz de una lesion o quemadura de la piel, psoriasis, una manifestacion dermatologica de una enfermedad autoinmune o una enfermedad de injerto contra huesped, cancer de piel, o un trastorno que implica la hiperproliferacion de celulas de la piel. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno de la piel es dermatitis. En algunas realizaciones, la dermatitis es dermatitis alergica, dermatitis atopica, dermatitis debida a la exposicion qrnmica, o dermatitis inducida por radiacion. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno de la piel es una herida cronica. En algunas realizaciones, la herida cronica es una ulcera diabetica, una llaga por presion, o una ulcera venosa. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno de la piel es alopecia. En algunas realizaciones, la alopecia se selecciona de calvicie o alopecia inducida por farmacos. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno de la piel es un trastorno de la pigmentacion de la piel. En algunas realizaciones, el trastorno de la pigmentacion de la piel es vitiligo. En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno de la piel es un trastorno que implica la hiperproliferacion de celulas de la piel. En algunas realizaciones, el trastorno que implica la hiperproliferacion de celulas de la piel es hiperqueratosis.

En otras realizaciones, la afeccion es una enfermedad autoinmune, tales como artritis reumatoide, lupus, enfermedad de Crohn, o psoriasis. En otras realizaciones, la afeccion es una enfermedad hepatica, tal como la enfermedad de fugado graso o hepatitis.

En otras realizaciones, la afeccion es un trastorno ocular, tal como uveftis, degeneracion macular, glaucoma, edema macular diabetico, blefaritis, retinopatfa diabetica, una enfermedad o trastorno del endotelio corneal, inflamacion post-quirurgica, ojo seco, conjuntivitis alergica o una forma de conjuntivitis. En algunas realizaciones, el trastorno ocular es degeneracion macular. En algunas realizaciones, la degeneracion macular es la forma seca. En otras realizaciones, la degeneracion macular es la forma humeda. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno del endotelio corneal es distrofia corneal endotelial de Fuchs.

En otras realizaciones, la afeccion es una enfermedad pulmonar, tal como inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar, COPD, asma, fibrosis qrnstica, o fibrosis pulmonar idiopatica. En algunas realizaciones, la COPD es inducida por el humo del cigarrillo.

En otras realizaciones, la afeccion es sepsis. En otras realizaciones, la afeccion es mucositis resultante de la terapia de radiacion o quimioterapia. En algunas realizaciones, la mucositis se presenta por via oral. En otras realizaciones, la afeccion esta asociada con la exposicion a la radiacion. En algunas realizaciones, la exposicion a la radiacion conduce a dermatitis. En algunas realizaciones, la exposicion a la radiacion es aguda. En otras realizaciones, la

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exposicion a la radiacion se fracciona.

En otras realizaciones, la afeccion es cancer. En algunas realizaciones, el cancer es un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, melanoma, mesotelioma, mieloma multiple, o seminoma. En otras realizaciones, el cancer es de la vejiga, sangre, hueso, cerebro, mama, sistema nervioso central, cuello uterino, colon, endometrio, esofago, vesmula biliar, genitales, tracto genitourinario, cabeza, rinon, laringe, hngado, pulmon, tejido muscular, cuello, mucosa oral o nasal, ovario, pancreas, prostata, piel, bazo, intestino delgado, intestino grueso, estomago, testmulo, o tiroides.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra antes o inmediatamente despues de que un sujeto se trata con una terapia de radiacion o quimioterapia en donde la quimioterapia no comprende RTA 408 o sus formas polimorficas. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra tanto antes como despues de que el sujeto se trata con terapia de radiacion, quimioterapia o ambas. En algunas realizaciones, el tratamiento reduce un efecto secundario de la terapia de radiacion o la quimioterapia. En algunas realizaciones, el efecto secundario es mucositis y dermatitis. En algunas realizaciones, el tratamiento potencia la eficacia de la terapia de radiacion o la quimioterapia. En algunas realizaciones, la quimioterapia comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de 5-fluorouracilo o docetaxel.

La terapia de tratamiento de combinacion adicional tambien se contempla por la presente descripcion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los metodos de tratamiento de cancer en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion, los metodos pueden comprender ademas uno o mas tratamientos seleccionados del grupo que consiste en la administracion de una cantidad farmaceuticamente efectiva de un segundo farmaco, radioterapia, inmunoterapia, terapia genica, y cirugfa. En algunas realizaciones, los metodos pueden comprender ademas (1) poner en contacto una celula de tumor con el compuesto antes de poner en contacto la celula de tumor con el segundo farmaco, (2) poner en contacto una celula de tumor con el segundo farmaco antes de poner en contacto la celula de tumor con el compuesto, o (3) poner en contacto una celula de tumor con el compuesto y el segundo farmaco al mismo tiempo. El segundo farmaco puede, en ciertas realizaciones, ser un antibiotico, anti-inflamatorio, anti-neoplasico, anti-proliferativo, anti-viral, inmunomodulador, o inmunosupresor. En otras realizaciones, el segundo farmaco puede ser un agente alquilante, modulador del receptor de androgenos, disruptor de citoesqueleto, modulador del receptor de estrogeno, inhibidor de histona-desacetilasa, inhibidor de HMG-CoA reductasa, inhibidor de protema prenil transferasa, modulador del receptor de retinoide, inhibidor de topoisomerasa, o inhibidor de tirosina quinasa. En ciertas realizaciones, el segundo farmaco es 5-azacitidina, 5-fluorouracilo, acido 9-cis-retinoico, actinomicina D, alitretinoma, acido todo- trans-retinoico, anamicina, axitinib, belinostat, bevacizumab, bexaroteno, bosutinib, busulfan, capecitabina, carboplatino, carmustina, CD437, cediranib, cetuximab, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dasatinib, daunorrubicina, decitabina, docetaxel, dolastatina-10, doxifluridina, doxorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, erlotinib, etoposido, gefitinib, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, hexametilmelamina, idarrubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecan, isotretinoma, ixabepilona, lapatinib, LBH589, lomustina, mecloretamina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, MS-275, neratinib, nilotinib, nitrosourea, oxaliplatino, paclitaxel, plicamicina, procarbazina, semaxanib, semustina, butirato de sodio, fenilacetato de sodio, estreptozotocina, acido suberoilanilida hidroxamico, sunitinib, tamoxifeno, teniposido, tiopeta, tioguanina, topotecan, TRAIL, trastuzumab, tretinoma, tricostatina A, acido valproico, valrrubicina, vandetanib, vinblastina, vincristina, vindesina, o vinorrelbina.

Tambien se contemplan metodos para tratar o prevenir una enfermedad con un componente inflamatorio en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser, por ejemplo, lupus o artritis reumatoide. En otras realizaciones, la enfermedad puede ser una enfermedad inflamatoria del intestino, tal como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. En otras realizaciones, la enfermedad con un componente inflamatorio puede ser una enfermedad cardiovascular. En otras realizaciones, la enfermedad con un componente inflamatorio puede ser diabetes, tales como diabetes tipo 1 o tipo 2. En otras realizaciones, RTA 408, sus polimorfos, y composiciones farmaceuticas tambien se pueden utilizar para tratar complicaciones asociadas con la diabetes. Tales complicaciones son bien conocidas por una persona experta en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la obesidad, hipertension, aterosclerosis, enfermedad cardiaca coronaria, apoplejfa, enfermedad vascular periferica, hipertension, nefropatfa, neuropatfa, mionecrosis, retinopatfa y smdrome metabolico (smdrome X). En otras realizaciones, la enfermedad con un componente inflamatorio puede ser una enfermedad de la piel, tal como psoriasis, acne o dermatitis atopica. La administracion de RTA 408, sus polimorfos, y composiciones farmaceuticas en los metodos de tratamiento de tales enfermedades de la piel puede ser, pero no se limita a, por ejemplo, topica u oral.

En otras realizaciones, la enfermedad con un componente inflamatorio puede ser el smdrome metabolico (smdrome X). Un paciente que tiene este smdrome se caracteriza por tener tres o mas smtomas seleccionados del siguiente grupo de cinco smtomas: (1) obesidad abdominal; (2) hipertrigliceridemia; (3) bajo colesterol de lipoprotema de alta densidad (HDL); (4) alta presion arterial; y (5) glucosa en ayunas elevada, la cual puede estar en el intervalo caractenstico de la diabetes tipo 2 si el paciente tambien es diabetico. Cada uno de estos smtomas se define en el Tercer Informe del Panel de Expertos del Programa Nacional de Educacion del Colesterol sobre la Deteccion, Evaluacion y Tratamiento de Alto Colesterol en Sangre en Adultos (Panel de Tratamiento de Adultos III, o ATP III),

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Institutos Nacionales de Salud, 2001, NIH Publicacion No. 01-3670. Los pacientes con smdrome metabolico, ya tengan o desarrollen o no diabetes mellitus evidente, tienen un mayor riesgo de desarrollar las complicaciones macrovasculares y microvasculares que se enumeran anteriormente que ocurren con la diabetes tipo 2, tal como aterosclerosis y enfermedad cardiaca coronaria.

Otro metodo general de la presente descripcion implica un metodo para tratar o prevenir una enfermedad cardiovascular en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion. En algunas realizaciones, la enfermedad cardiovascular puede ser, pero no se limita a, por ejemplo, aterosclerosis, cardiomiopatfa, enfermedad cardfaca congenita, insuficiencia cardfaca congestiva, miocarditis, enfermedad cardiaca reumatica, enfermedad de la valvula, enfermedad de la arteria coronaria, endocarditis, o infarto de miocardio. La terapia de combinacion tambien se contempla para metodos para tratar o prevenir una enfermedad cardiovascular en un sujeto. Por ejemplo, tales metodos pueden comprender ademas administrar una cantidad farmaceuticamente efectiva de uno o mas farmacos cardiovasculares. El farmaco cardiovascular puede ser, pero no se limita a, por ejemplo, un farmaco para reducir el colesterol, un anti- hiperlipidemico, un bloqueador del canal de calcio, un anti-hipertensivo, o un inhibidor de de HMG-CoA reductasa. En algunas realizaciones, los ejemplos no limitantes de farmacos cardiovasculares incluyen amlodipina, aspirina, ezetimiba, felodipina, lacidipina, lercanidipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina, nisoldipina o nitrendipina. En otras realizaciones, otros ejemplos no limitantes de farmacos cardiovasculares incluyen atenolol, bucindolol, carvedilol, clonidina, doxazosina, indoramina, labetalol, metildopa, metoprolol, nadolol, oxprenolol, fenoxibenzamina, fentolamina, pindolol, prazosin, propranolol, terazosin, timolol o tolazolina. En otras realizaciones, el farmaco cardiovascular puede ser, por ejemplo, una estatina, tales como atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina o simvastatina.

Tambien se contemplan metodos para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis multiple (Em), enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrofica. En realizaciones particulares, la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer. En realizaciones particulares, la enfermedad neurodegenerativa es la EM, tal como EM progresiva primaria, progresiva secundaria con recidiva-remision o recidiva progresiva. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser, por ejemplo, un primate. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano.

En realizaciones particulares de los metodos para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion, el tratamiento suprime la desmielinizacion de las neuronas en el cerebro o medula espinal del sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento suprime la desmielinizacion inflamatoria. En ciertas realizaciones, el tratamiento suprime la transeccion de los axones de las neuronas en el cerebro o medula espinal del sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento suprime la transeccion de neuritas en el cerebro o medula espinal del sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento suprime la apoptosis neuronal en el cerebro o medula espinal del sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento estimula la remielinizacion de los axones de las neuronas en el cerebro o medula espinal del sujeto. En ciertas realizaciones, el tratamiento restaura la funcion perdida despues de un ataque de EM. En ciertas realizaciones, el tratamiento previene un nuevo ataque de EM. En ciertas realizaciones, el tratamiento previene una discapacidad como consecuencia de un ataque de EM.

Un aspecto general de la presente descripcion contempla un metodo para tratar o prevenir un trastorno caracterizado por la sobreexpresion de los genes de iNOS en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de RTA 408, formas polimorficas, o una composicion farmaceutica de la presente descripcion.

Otro aspecto general de la presente descripcion contempla un metodo para inhibir la produccion de oxido mtrico inducida por IFN-y en celulas de un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de RTA 408, formas polimorficas, o una composicion farmaceutica de la presente descripcion.

Todavfa otro metodo general de la presente descripcion contempla un metodo para tratar o prevenir un trastorno caracterizado por la sobreexpresion de los genes de COX-2 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de RTA 408, formas polimorficas, o una composicion farmaceutica de la presente descripcion.

Tambien se contemplan los metodos de tratamiento de enfermedad renal/del rinon (RKD) en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion. Vease la Patente U.S. 8.129.429. La RKD puede ser consecuencia de, por ejemplo, una agresion toxica. La agresion toxica puede ser consecuencia de, pero no se limita a, por ejemplo, un agente de imagenes o un farmaco. El farmaco puede ser un agente quimioterapeutico, por ejemplo. La RKD puede ser consecuencia de la lesion por isquemia/reperfusion, en ciertas realizaciones. En ciertas realizaciones, la RKD es consecuencia de la diabetes o hipertension. En algunas realizaciones, la RKD puede ser consecuencia de una enfermedad autoinmune. La RKD puede definirse adicionalmente como RKD cronica o RKD aguda.

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En ciertos metodos para tratar la enfermedad renal/del rinon (RKD) en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de un compuesto de la presente descripcion, el sujeto se ha sometido o se esta sometiendo a dialisis. En ciertas realizaciones, el sujeto se ha sometido o es un candidato para someterse a trasplante de rinon. El sujeto puede ser un primate. El primate puede ser un ser humano. El sujeto en este o cualquier otro metodo puede ser, por ejemplo, una vaca, caballo, perro, gato, cerdo, raton, rata o cobaya.

Tambien se contempla por la presente descripcion un metodo para mejorar la tasa de filtracion glomerular o aclaramiento de creatinina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad farmaceuticamente efectiva de RTA 408, formas polimorficas, o una composicion farmaceutica de la presente descripcion.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra en una dosis unica al dfa. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se administra en mas de una dosis al dfa. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra en una cantidad farmaceuticamente efectiva.

En algunas realizaciones, la dosis es desde aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 2.000 mg/kg. En otras realizaciones, la dosis es desde aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En otras realizaciones, la dosis es aproximadamente 3, 10, 30, o 100 mg/kg.

En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se administra por via topica. En algunas realizaciones, la administracion topica se administra en la piel. En otras realizaciones, la administracion topica se administra en el ojo.

En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se administra por via oral. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica se administra por via intraocular.

Otros objetos, caractensticas y ventajas de la presente descripcion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripcion detallada y los ejemplos espedficos, aunque indican realizaciones espedficas de la invencion, se dan a modo de ilustracion solamente, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del espmtu y alcance de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de esta descripcion detallada. Tengase en cuenta que simplemente porque un compuesto particular se atribuya a una formula generica particular, no quiere decir que no pueda tambien pertenecer a otra formula generica.

Breve descripcion de los dibujos

Los dibujos siguientes forman parte de la presente especificacion y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente descripcion. Una o mas palabras alemanas se pueden encontrar en los dibujos incluyendo “Masseanderung” y “temperatur”, las cuales significan “cambio en la masa” y “temperatura”, respectivamente. La invencion puede entenderse mejor por referencia a uno de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de realizaciones espedficas presentadas en la presente.

FIG. 1 - Efecto de RTA 408 en la produccion de oxido mtrico inducida por IFNy y la viabilidad celular en celulas RAW264.7.

FIGS. 2a y b - Efecto de RTA 408 en la activacion del elemento de respuesta antioxidante (ARE): (a) actividad de luciferasa NQO1-ARE; (b) actividad de luciferasa GSTA2-ARE.

FIGS. 3a-f - Veces de incremento relativo de Nrf2 GST ARE despues del tratamiento celular con (a) RTA 402; (b) 63415 (RTA 408); (c) 63170; (d) 63171; (e) 63179; y (f) 63189. Las graficas tambien muestran la viabilidad de las celulas como se ensaya utilizando el reactivo de proliferacion celular WST1 y midiendo la absorbancia despues de 1 hora. Todos los farmacos se administraron en dMsO y las celulas se cultivaron a 10.000 celulas/pocillo en placas de 384 pocillos en DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% FBS, 1% penicilina estreptomicina, y 0,8 mg/ml de geneticina.

FIGS. 4a-d - Efecto de RTA 408 en la expresion de gen diana de Nrf2 en fibroblastos de pulmon HFL1. (a) NQO1;

(b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.

FIGS. 5a-d - Efecto de RTA 408 en la expresion de gen diana de Nrf2 en celulas epiteliales bronquiales BEAS-2B. (a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.

FIGS. 6a y b - Efecto de RTA 408 en los niveles de protema diana Nrf2. (a) celulas SH-SY5Y; (b) celulas BV2.

FIG. 7 - Efecto de RTA 408 en la actividad enzimatica de NQO1 en celulas RAW264.7.

FIG. 8 - Efecto de RTA 408 en los niveles de glutation total en la lmea celular de hepatocitos AML-12.

FIG. 9 - Efecto de RTA 408 en la absorbancia de WST-1 como un marcador de NADPH.

FIGS. 10a-d - Efecto de RTA 408 en la expresion de genes implicados en la smtesis de NADPH. (a) H6PD; (b) PGD;

(c) TKT; (d) ME1.

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FIGS. 11a y b - (a) Efecto de RTA 408 en la activacion inducida por TNF-a de un informador de luciferasa NF-kB en la lmea celular de raton NIH3T3 con viabilidad de WST1 y viabilidad superpuesta de WST1/2. (b) activacion inducida por TNF-a de un informador de luciferasa NF-kB en la lmea celular de raton NIH3T3. La grafica muestra las veces de cambio relativo como una funcion de los cambios logantmicos en la concentracion de RTA 408.

FIG. 12 - Efecto de RTA 408 en la activacion inducida por TNF-a de una construccion informadora de luciferasa NF- kB.

FIGS. 13a y b - (a) Efecto de RTA 408 en la activacion inducida por TNF-a de un informador de luciferasa NF-kB en la lmea celular A549 humana con viabilidad de WST1 y viabilidad superpuesta de WST1/2. (b) Activacion inducida por TNF-a de un informador de luciferasa NF-kB en la lmea celular A549 humana. La grafica muestra las veces de cambio relativo como una funcion del cambio logantmico en la concentracion de RTA 408.

FIG. 14 - Efecto de RTA 408 en la fosforilacion inducida por TNF-a de kBa.

FIGS. 15a-d - Efecto de RTA 408 en la expresion de genes de transaminasa: (a) ALT1 (GPT1); (b) ALT2 (GPT2); (c) AST1 (GOT1); (d) AST1 (GOT2). Los asteriscos indican una diferencia estadfsticamente significativa del grupo de control (*P <0,05; **P <0,01).

FIG. 16 - Efecto de RTA 408 en los niveles de piruvato en las celulas musculares cultivadas (*P <0,05).

FIG. 17 - Efecto de 63415 en un modelo de inflamacion pulmonar mediada por LPS (% de cambio en las citoquinas pro-inflamatorias en relacion con el tratamiento de LPS). El compuesto 63415 se administro QD x 3 en el tiempo 0, 24, y 48 h seguido de LPS una h despues de la ultima dosis de 63415 en ratones BALB/c hembras. Los animales se sacrificaron 20 h despues de la administracion de LPS. BALF se examino para la expresion de citoquinas proinflamatorias. El compuesto 63415 redujo las citoquinas pro-inflamatorias de una manera dependiente de la dosis, con reducciones maximas que vanan desde 50%-80% en TNF-a, IL-6, e IL-12.

FIGS. 18a y b - Efecto de RTA 408 en la inflamacion pulmonar inducida por LPS en ratones. (a) citoquinas inflamatorias; (b) dianas de Nrf2. El RTA 408 se administro a ratones BALB/c hembras (n = 10) QDx6 en el tiempo 0, 24, 48, 72, 96, y 120 h seguido por LPS a 121 h con animales sacrificados a 141 h. La expresion de protema citoquina pro-inflamatoria se sometio a ensayo en BALF. Los biomarcadores de Nrf2 se sometieron a ensayo en el pulmon. Los asteriscos indican una diferencia estadfsticamente significativa del grupo de control de disolucion salina (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001).

FIGS. 19a y b - Efecto de 63415 en infiltrados de BALF en la inflamacion pulmonar inducida por bleomicina: (a) recuento de celulas de fluido de BAL; (b) peso corporal. El compuesto 63415 se administro QD*39 en los dfas -10 a 28 en ratones C57BL/6. La bleomicina se administro en el dfa 0. Se midieron los pesos diariamente. Los recuentos de celulas de BALF se obtuvieron en el sacrificio. Se observo una notable reduccion de infiltrado inflamatorio. No se observaron mejoras significativas en la puntuacion de la inflamacion cronica, fibrosis intersticial, o numero de focos fibroticos.

FIGS. 20a y b - Efecto de RTA 408 en la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratas: (a) PMN; (b) hidroxiprolina. Los asteriscos indican una diferencia estadfsticamente significativa del grupo de control de bleomicina (*P <0,05).

FIG. 21 - Efecto de RTA 408 en las enzimas diana de Nrf2 en los pulmones de ratas con fibrosis pulmonar inducida por bleomicina. Los asteriscos indican una diferencia estadfsticamente significativa del grupo de control de disolucion salina (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001).

FIGS. 22a-e - Efecto de RTA 408 en COPD inducida por humo de cigarrillo en ratones. (a) KC; (b) IL-6; (c) TNF-a;

(d) IFN-y; (e) RANTES. RTA 408 (63415) se ensayo a niveles de dosis de 3 mg/kg (bajo), 10 mg/kg (medio), y 30 mg/kg (alto). Un analogo de AIM (63355) se ensayo en el mismo estudio para comparacion. Los asteriscos indican una diferencia estadfsticamente significativa del grupo de control de CS.

FIG. 23 - Efecto de RTA 408 en las enzimas diana de Nrf2 en los pulmones de ratones con COPD inducida por humo de cigarrillo. Los asteriscos indican una diferencia estadfsticamente significativa del grupo de control de disolucion salina (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001). Las dagas representan una diferencia estadfsticamente significativa de la exposicion de ratones al humo de cigarrillo y vehmulo administrado (fP<0,05).

FIGS. 24a-d - Efectos de 63415 (RTA 408) en el peso corporal en un modelo de raton BALB/c de sepsis. Se administro LPS a todos los animales en el dfa 0. (a) Peso corporal: 63415 (RTA 408); (b) Peso corporal: RTA 405; (c) LPS sistemico: % de supervivencia: 63415 (rTA 408); (d) LPS sistemico: % de supervivencia: RTA 405. Tanto rTa 405 como 63415 (RTA 408) se administraron QD*5 en los dfas -2 a 2. El compuesto 63415 (RTA 408) mejoro la supervivencia. El peso corporal como una funcion del tiempo en ratones BALB/c tratados con 63415 sirve como un modelo para la sepsis.

FIG. 25 - Efecto de 63415 en un modelo de mucositis oral inducida por radiacion. RTA 405 o 63415 (RTA 408) se

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administro BID*20 en los D^as -5 a -1 y Dfas 1 a 15 a hamsteres dorados sirios machos. La radiacion ocurrio en el dfa 0. Las puntuaciones de mucositis vanan desde 0 a 5 con base en las manifestaciones clmicas (0: completamente sanos; 1-2: eritema ligero a severo; 3-5: diversos grados de ulceracion). 63415 mejoro la mucositis a 30 mg/kg y 100 mg/kg, con una reduccion de hasta 36% en la ulceracion.

FIG. 26 - Efecto de 63415 en la induccion de gen diana de Nrf2 en un estudio de toxicidad en ratones de 14 dfas en ratones C57BL/6. Los ARNm de genes diana de Nrf2 se evaluaron en los hugados de ratones tratados PO QD*14. Se observaron aumentos sustanciales en la expresion de los ARNm para multiples genes diana de Nrf2 y fueron consistentes con la exposicion del tejido.

FIGS. 27a y b - Efecto de 63415 en la induccion de gen diana de Nrf2 en hugados de ratas: (a) Genes diana; (b) Reguladores negativos. Los ARNm de los genes diana de Nrf2 se evaluaron en los hugados de ratas tratadas PO QD*14.

FIGS. 28a y b - Efecto de 63415 en los genes diana de Nrf2 en tejidos de monos: (a) Hfgado; (b) Pulmon. Los ARNm de genes diana de Nrf2 se evaluaron en monos tratados PO qD*14 utilizando tecnologfa Panomics QuantiGene® 2.0 Plex.

FIGS. 29a y b - Efecto de 63415 en la actividad enzimatica diana de Nrf2 en el hugado de raton: (a) Actividad de NQO1; (b) Actividad de GST. La actividad enzimatica diana de Nrf2 se evaluo en hfgados de ratones tratados PO QD*14. Las actividades enzimaticas de NQO1 y GST fueron inducidas de una manera dependiente de la dosis.

FIGS. 30a y b - Efecto de 63415 en la actividad enzimatica diana de Nrf2 en hugado de rata: (a) Actividad de NQO1; (b) Actividad de GST. La actividad enzimatica diana de Nrf2 se evaluo en hfgados de ratas tratadas PO QD*14. Las actividades enzimaticas de NQO1 y GST fueron inducidas de una manera dependiente de la dosis.

FIGS. 31a y b - Efectos de 63415 en la induccion de la actividad enzimatica diana de Nrf2 en diversos tejidos de monos cynomolgus: (a) Actividad de NQO1; (b) Actividad de GSR.

FIGS. 32a y b - Concentracion de RTA 408 en el hugado, pulmon y cerebro de raton, y actividad de NQO1 en hugado de raton despues de 14 dfas de administracion oral diaria. (a) Distribucion de tejido de RTA 408 en ratones despues de 14 dfas de administracion oral diaria. Los datos representan la media ± SD de concentraciones de RTA 408 en el tejido recogido 4 h despues de la dosis final del estudio. Los numeros encima de las barras de error son representativos de la media. (b) Correlacion de contenido de RTA 408 en hugado de raton con la actividad enzimatica de NQO1. El contenido de RTA 408 en hugado de raton individual se represento frente a la actividad enzimatica individual de este informe.

FIGS. 33a y b - Concentracion de RTA 408 en plasma, hugado, pulmon y cerebro de rata, y actividad de NQO1 en hugado de rata despues de 14 dfas de administracion oral diaria. (a) Distribucion de tejido de RTA 408 en ratas despues de 14 dfas de administracion oral diaria. Los datos representan la media ± SD de concentraciones de RTA 408 en el tejido recogido 4 h despues de la dosis final del estudio. Los numeros encima de las barras de error son representativos de la media. * Dos valores fueron excluidos del calculo de la media, debido a que son valores atfpicos, definidos como valores que causan que el conjunto de datos falle en el ensayo de normalidad de Shapiro- Wilk. (b) Correlacion de contenido de RTA 408 en hugado de rata con actividad enzimatica de NQO1. El contenido de RTA 408 en hugado de rata individual se represento frente a la actividad enzimatica individual de este informe. Los tejidos del grupo de dosis de 100 mg/kg de RTA 408 se recogieron en el dfa 6, y las toxicidades observadas en este grupo impidieron las evaluaciones de la actividad enzimatica de NQO1 en hugado.

FIGS. 34a y b - Efecto del tratamiento con 63415 en la activacion de Nrf2 en PBMC de monos: (a) NQO1 en PMBC frente a Concentracion en Plasma; (b) NQO1 en Pulmon frente a NQO1 en PMBC.

FIG. 35 - Resumen de estudio de toxicidad en monos de 14 dfas de 63415. Todas las dosis fueron bien toleradas sin signos clmicos adversos. Los datos de la qmmica clmica no sugieren toxicidad obvia.

FIG. 36 - Efecto del tiempo de dosificacion en la concentracion en plasma de RTA 408 despues de la administracion oral y ocular topica. La concentracion en plasma de RTA 408 tambien se midio despues de 5 dfas de la administracion ocular topica diaria de RTA 408 y se determino que permaneda relativamente consistente de las mediciones tomadas despues del primer dfa.

FIGS. 37a y b - Correlacion de la exposicion a RTA 408 en plasma de mono con expresion de ARNm de NQO1 y SRXN1 en PBMC: (a) NQO1; (b) SRXN1.

FIG. 38 - Concentracion de RTA 408 en varios tejidos o fluidos dentro del ojo como una funcion del tiempo despues de 5 dfas de dosificacion ocular topica. La concentracion de RTA 408 en plasma tambien se midio despues de la administracion ocular topica.

FIG. 39 - Efecto de RTA 408 en la incidencia de dermatitis grado 3 causada por exposicion a la radiacion aguda para diferentes concentraciones de RTA 408 administrado topicamente.

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FIG. 40 - Efecto de RTA 408 en la incidencia de dermatitis grado 2 causada por exposicion a la radiacion aguda durante un curso de tratamiento de 30 dfas para diferentes concentraciones de RTA 408 administrado topicamente.

FIG. 41 - Efecto de RTA 408 en la incidencia de dermatitis grado 2 causada por exposicion a la radiacion aguda durante un curso de tratamiento de 28 dfas para diferentes concentraciones de RTA 408 administrado oralmente.

FIGS. 42a y b - (a) Analisis del area bajo la curva de la puntuacion clmica de la dermatitis como una funcion del tiempo para cada uno de los diferentes grupos de control, incluyendo todos los animales utilizados en el ensayo. (b) Analisis del area bajo la curva de la puntuacion clmica de la dermatitis como una funcion de la duracion de esta puntuacion para cada uno de los diferentes grupos de control, incluyendo solo los animales que completaron los 30 dfas completos en el ensayo.

FIG. 43 - 1a puntuacion ciega promedio de la dermatitis por radiacion aguda como una funcion del tiempo para no tratado, no tratado sin exposicion a la radiacion, vehmulo solamente y tres cantidades orales de RTA 408 a 3, 10, y 30 mg/kg. La puntuacion de dermatitis se baso en una escala que 0 fue completamente sano, 1-2 exhibieron eritema leve a moderado con descamacion minima a ligera, 3-4 exhibieron descamacion y eritema moderado a severo, y 5 exhibieron una ulcera franca.

FIG. 44 -Puntuacion media de la dermatitis por radiacion aguda como una funcion del tiempo para no tratado, no tratado sin exposicion a la radiacion, vehmulo solamente y tres cantidades orales de RTA 408 a 3, 10 y 30 mg/kg medidos cada dos dfas desde el dfa 4 al dfa 30. La puntuacion de dermatitis se baso en una escala que 0 fue completamente sano, 1-2 exhibieron eritema leve a moderado con descamacion minima a ligera, 3-4 exhibieron descamacion y eritema moderado a severo, y 5 exhibieron una ulcera franca.

FIG. 45 - Puntuacion media de la dermatitis por radiacion aguda como una funcion del tiempo para no tratado, no tratado sin exposicion a la radiacion, vehmulo solamente y tres cantidades topicas de RTA 408 a 0,01%, 0,1% y 1% medidos cada dos dfas desde el dfa 4 al dfa 30. La puntuacion de dermatitis se baso en una escala que 0 fue completamente sano, 1-2 exhibieron eritema leve a moderado con descamacion minima a ligera, 3-4 exhibieron descamacion y eritema moderado a severo, y 5 exhibieron una ulcera franca.

FIG. 46 - Puntuaciones clmicas de dermatitis por radiacion fraccional representadas frente al tiempo y los cambios en la puntuacion de dermatitis para cada grupo de ensayo. La puntuacion de dermatitis se baso en una escala que 0 fue completamente sano, 1-2 exhibieron eritema leve a moderado con descamacion minima a ligera, 3-4 exhibieron descamacion y eritema moderado a severo, y 5 exhibieron una ulcera franca.

FIG. 47 - Grafica del analisis de AUC que muestra la puntuacion de dermatitis (severidad * dfas) para cada uno de los grupos de ensayo durante el penodo completo de observacion. Las puntuaciones de dermatitis se evaluaron cada dos dfas desde el dfa 4 al dfa 30 del estudio.

FIGS. 48a y b - (a) Grafica de la absorbancia a 595 nm para la lmea celular de cancer de prostata LNCaP tratada que muestra el efecto citotoxico relativo en las celulas tratadas con un agente quimioterapeutico y RTA 408 frente a RTA 408 solo. (b) Grafica de la absorbancia a 595 nm para la lmea celular de cancer de prostata DU-145 tratada que muestra el efecto citotoxico relativo en las celulas tratadas con un agente quimioterapeutico y RTA 408 frente a RTA 408 solo.

FIG. 49 - Versiones en blanco y negro de fotograffas a color de formacion de imagenes de ratones que muestran la actividad de luciferasa de los tumores de tres ratones: un animal de control sin tratamiento, un animal sometido solo a radiacion ionizante (una dosis unica, 18 Gy), y un animal al que se administro tanto radiacion ionizante (dosis unica, 18 Gy, dfa 0) como RTA 408 (17,5 mg/kg ip, una vez al dfa en los dfas -3 a -1, luego dosis unicas en los dfas 1, 3 y 5). Los colores indicados por las flechas son indicativos de la intensidad, representandose las intensidades por rojo, amarillo, verde, y azul en orden de intensidad mas alta a mas baja.

FIG. 50 - Reduccion de las concentraciones de protemas de humor acuoso para diferentes formulaciones de RTA 408 (barras oscuras) en comparacion con los valores de la bibliograffa para MaxiDex® (0,1% dexametasona) y mapracorat (barras claras) despues de la induccion de paracentesis.

FIG. 51 - Supresion dependiente de la dosis de NO in vivo por 63415. Ratones CD-I (n = 6) se dosificaron con DMSO o AIM por sonda oral. LPS (5 mg/kg) se administro 24 h mas tarde. Veinticuatro horas despues de la administracion de LPS, se recogio sangre completa para ensayo de NO. La inhibicion de NO se determino por reaccion de Griess de plasma desproteinado, reducido.

FIG. 52 - Distribucion extensa de 63415 (RTA 408) en tejidos de raton. Los ratones se dosificaron PO QD*3, ya sea con 25 mg/kg de 63415 (RTA 408) o 25 mg/kg de RTA 405. Sangre (plasma y sangre completa) y tejidos (cerebro, Imgado, pulmon y rinon) se recogieron 6 h despues de la ultima dosis. Se realizo un analisis semi-cuantitativo del contenido de farmaco. Se observaron niveles notables en el SNC.

FIG. 53 - Induccion de la actividad de NQO1 en el Imgado, pulmon y rinon de raton por 63415. Los ratones se dosificaron PO QD*3 con 25 mg/kg. Los tejidos se recogieron 6 h despues de la ultima dosis, y se realizo el analisis

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de la actividad de NQO1. Se observo activacion significativa de NQO1 en multiples tejidos.

FIG. 54 - Resumen del estudio de toxicidad en raton de 14 d^as de 63415. Ratones C57BL/6 fueron dosificados PO QD*14. Los puntos finales incluyeron la supervivencia, peso y qmmicas clmicas. Todos los animales sobrevivieron a los 14 dfas. No ocurrieron cambios de peso significativos en comparacion con el grupo de vehnculo, y no hubo evidencia de toxicidad a ninguna dosis sobre la base de las qmmicas clmicas.

FIG. 55 - Distribucion de tejido de 63415 del estudio de toxicidad en raton de 14 dfas en ratones C57BL/6. Se recogieron muestras de cerebro, pulmon e hngado 4 h despues de la dosis final y se cuantifico para el contenido de 63415 utilizando el metodo de LC/MS/MS sensible. Las exposiciones a 10 y 100 mg/kg en pulmon excedieron la CI50 in vitro para la induccion de NO por 55 y 1.138 veces, respectivamente. La exposicion a 10 y 100 mg/kg en el cerebro excedieron la CI50 in vitro para la induccion de NO por 29 y 541 veces, respectivamente.

FIG. 56 - Distribucion de tejido de 63415 en ratas Sprague Dawley. Los tejidos se recogieron cuatro horas despues de la dosificacion final en el dfa 14 o dfa 6 (100 mg/kg), se extrajeron, y se cuantificaron para contenido de 63415 utilizando un metodo de LC/MS/MS sensible. El compuesto 63415 se distribuye bien en los tejidos diana. Las exposiciones a 10 mg/kg en el pulmon y cerebro excedieron la CI50 in vitro para la inhibicion de NO por 294 y 240 veces, respectivamente.

FIG. 57 - Distribucion de tejido diana del compuesto 63415 en monos cynomolgus. Los tejidos se recogieron cuatro horas despues de la dosificacion final en el Dfa 14. El contenido de compuesto 63415 se extrajo y cuantifico utilizando un metodo de LC/MS/MS sensible.

FIG. 58 - Espectro de FT-Raman (3.400-50 cm-1) de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 59 - Patron de PXRD (1,5-55,5 °20) de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 60 - Termograma de TG-FTIR (25-350°C) de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 61 - Espectro de 1H-RMN en DMSO-d6 de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 62 - Termograma de DSC de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 63 - Isoterma de DVS de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 64 - El espectro de FT-Raman de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1), despues de la medicion de DVS (parte superior) esta inalterado en comparacion con el material antes de la medicion de DVS (parte inferior). Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 65 - El patron de PXRD de la muestra PP415-P1, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1), despues de la medicion de DVS (parte superior) esta inalterado en comparacion con el material antes de la medicion de DVS (parte inferior). Los patrones no se han escalado pero estan desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 66 - El patron de PXRD de la muestra PP415-P40 (parte superior) corresponde al patron de la forma de solvato (Clase 2) (parte inferior, muestra PP415-P19). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para proposito de comparacion.

FIG. 67 - Los patrones de PXRD de las muestras de estabilidad de PP415-P2a (parte superior), PP415-P3a (2° desde la parte superior), PP415-P4a (parte media), y PP415-P5a (2o desde la parte inferior), que corresponde a la forma amorfa (Clase 1), despues de una semana no muestran diferencias en comparacion con el material de partida en el punto de tiempo t0 (parte inferior, muestra PP415-P1). Los patrones no son escalados, pero estan desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 68 - Los patrones de PXRD de las muestras de estabilidad de PP415-P2b (parte superior), PP415-P3b (2o desde la parte superior), PP415-P4b (parte media), y PP415-P5b (2o desde la parte inferior), que corresponde a la forma amorfa (Clase 1), despues de dos semanas no muestran diferencias en comparacion con el material de partida en el punto de tiempo t0 (parte inferior, muestra PP415-P1). Los patrones no son escalados, pero estan desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 69 - Los patrones de PXRD de las muestras de estabilidad de PP415-P2c (parte superior), PP415-P3c (2o desde la parte superior), PP415-P4c (parte media), y PP415-P5C (2o desde la parte inferior), que corresponde a la forma amorfa (Clase 1), despues de cuatro semanas no muestran diferencias en comparacion con el material de partida en el punto de tiempo t0 (parte inferior, muestra PP415-P1). Los patrones no son escalados, pero estan desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 70 - Los espectros de FT-Raman (2.400-50 cm-1) de las muestras de la forma de solvato (Clase 2) (PP415-P7:

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parte superior; PP415-P8: 2° desde la parte superior; PP415-P9: 3° desde la parte superior; PP415-P10: 4° desde la parte superior; PP415-P11: parte media; PP415-P15: 4° desde la parte inferior; PP415-P17: 3° desde la parte inferior; PP415-P21: 2° desde la parte inferior; PP415-P24: parte inferior). Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 71 - El espectro de FT-Raman (1.750-1.000 cm-1) de la forma de solvato (Clase 2) (PP415-P7: parte superior) claramente difiere del espectro de la forma amorfa (Clase 1) (PP415-P1: parte inferior). Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 72 - Los espectros de FT-Raman (1.750-1.000 cm-1) de la clase 2 (muestra PP415-P19: parte superior), clase 3 (muestra PP415-P6: 2° desde la parte superior), clase 4 (muestra PP415-P13: 2° desde la parte inferior), y clase 5 (muestra PP415-P14: parte inferior) difieren significativamente entre sf. Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 73 - Los patrones de PXRD (2-32 °20) de las muestras de la forma de solvato (Clase 2) (PP415-P7: parte superior; PP415-P8: 2° desde la parte superior; PP415-P10: 3° desde la parte superior; PP415-P15: 4° desde la parte superior; PP415-P17: parte media; PP415-P18: 4° desde la parte inferior; PP415-P19: 3° desde la parte inferior; PP415-P21: 2° desde la parte inferior; PP415-P24: parte inferior). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 74 - Los patrones de PXRD (11-21 °20) de algunas muestras de la forma de solvato (Clase 2) (PP415-P7: parte superior; PP415-P8: 2° desde la parte superior; PP415-P10: parte media; PP415-P21: 2° desde la parte inferior; PP415-P24: parte inferior). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 75 - Los patrones de PXRD (2-32 °20) de la clase 2 (muestra PP415-P19: parte superior), clase 3 (muestra PP415-P6: 2° desde la parte superior), clase 4 (muestra PP415-P13: 2° desde la parte inferior), y clase 5 (muestra PP415-P14: parte inferior) son claramente diferentes. Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 76 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P7, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 77 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P21, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 78 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P24, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 79 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P29, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 80 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P47, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 81 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P48, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 82 - Los espectros de FT-Raman (1.800-700 cm-1) de la forma de solvato (Clase 2) (parte inferior, muestra PP415-P7) y de la forma seca de solvato (Clase 2) (parte superior, muestra PP415-P30) son similares y muestran solo pequenas diferencias que apenas se pueden distinguir dentro de la grafica. Los espectros son escalados para el proposito de comparacion.

FIG. 83 - El patron de PXRD de la forma seca de solvato (Clase 2), muestra PP415-P30 (parte superior) en comparacion con el patron de la forma de solvato (Clase 2), muestra PP415-P7 (parte inferior). Los patrones no son escalados, pero estan desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 84 - Termograma de TG-FTIR de la muestra seca PP415-P30, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 85 - El espectro de FT-Raman de la muestra seca PP415-P18 (gris claro) es identico al espectro de la muestra original PP415-P15 (gris oscuro) y muestra solo pequenas diferencias que diffcilmente se pueden distinguir dentro de la grafica. Los espectros se han escalado para el proposito de comparacion.

FIG. 86 - El patron de PXRD de la muestra seca PP415-P18 (parte superior) muestra pequenas diferencias del patron de la muestra original PP415-P15 (parte inferior), aunque ambas formas de solvato (Clase 2). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 87 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P18, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 88 - El espectro de FT-Raman de la muestra PP415-P17 (parte superior) es casi identico a los espectros de las muestras secas PP415-P19 (parte media) y PP415-P32 (parte inferior) y muestra solo pequenas diferencias que diffcilmente se pueden distinguir dentro de la grafica. Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

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FIG. 89 - El patron de PXRD de la muestra seca PP415-P19 (parte media) es diferente del patron de la muestra original PP415-P17 (parte superior) pero aun corresponde a la forma clase 2. El patron de la muestra adicionalmente seca PP415-P32 (parte inferior) muestra picos mas amplios con una menor relacion de S/N. El material es menos cristalino, pero aun corresponde a forma clase 2. Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 90 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P19, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 91 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P32A, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 92 - El espectro de FT-Raman de la muestra PP415-P21 (parte superior) es identico a los espectros de las muestras secas PP415-P28 (parte media) y PP415-P34 (parte inferior). Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 93 - Los patrones de PXRD de las muestras secas PP415-P28 (parte media) y PP415-P34 (parte inferior) muestran picos mas amplios con una relacion inferior de S/N, que indica una menor cristalinidad de las muestras en comparacion con el patron de la muestra original PP415-P21 (parte superior). Los patrones son algo diferentes, pero aun corresponden a la forma clase 2. Se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 94 - Termograma de TG-FTIR de la muestra seca PP415-P28, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 95 - Termograma de TG-FTIR de la muestra seca PP415-P34, que corresponde a una forma de solvato (Clase 2).

FIG. 96 - Los espectros de FT-Raman (2.400-50 cm-1) de las muestras de la forma de solvato (Clase 3) (PP415-P6: parte superior; PP415-P12: parte media; PP415-P20: parte inferior) Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 97 - Los espectros de FT-Raman (1.750-1.000 cm-1) de las muestras de la forma de solvato (Clase 3) (PP415- P6: parte superior; PP415-P12: 2° desde la parte superior; PP415-P20: 2° desde la parte inferior) son muy similares entre sf, con solo pequenas diferencias, por ejemplo, a ~1.690 cm-1, pero son claramente diferentes de la clase 1 (PP415-P1: parte inferior). Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 98 - Los patrones de PXRD (2-32 °20) de las muestras de la forma de solvato (Clase 3) (PP415-P6: parte superior; PP415-P12: parte media; PP415-P20: parte inferior). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 99 - Los patrones de PXRD (13,5-18,5 °20) de las muestras de forma de solvato (Clase 3) (PP415-P6: parte superior; PP415-P12: parte media; PP415-P20: parte inferior) muestran pequenas diferencias. Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 100 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P6, que corresponde a la forma de solvato (Clase 3).

FIG. 101 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P12, que corresponde a la forma de solvato (Clase 3).

FIG. 102 - Termograma de TG-FTIR de la forma seca de solvato (Clase 3), muestra PP415-P25.

FIG. 103 - Termograma de TG-FTIR de la forma adicionalmente seca de solvato (Clase 3), muestra PP415-P33.

FIG. 104 - Los espectros de FT-Raman (1.800-700 cm-1) de la forma de solvato (Clase 3) (parte superior, muestra PP415-P6), de la forma seca de solvato (Clase 3) (parte media, muestra PP415-P25), y de la forma adicionalmente seca de solvato (Clase 3) (parte inferior, muestra PP415- P33) son identicos. Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 105 - Los patrones de PXRD (4-24 °20) de la forma de solvato (Clase 3) (parte superior, muestra PP415-P6), de la forma seca de solvato (Clase 3) (parte media, muestra PP415-P25), y de la forma adicionalmente seca de solvato (Clase 3) (parte inferior, muestra PP415-P33). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 106 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P13, que corresponde a una forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4).

FIG. 107 - Los espectros de FT-Raman (1.800-700 cm-1) de la forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (gris oscuro, muestra PP415-P13) y del material seco de una forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (gris claro, muestra PP415-P26) son identicos y se superponen perfectamente. Los espectros se han escalado para propositos de comparacion.

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FIG. 108 - Patron de PXRD de la forma seca de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P26 (parte inferior), en comparacion con el patron de referencia de la forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P13 (parte superior). Los patrones no se han escalado pero se desplazaron en la direccion y para propositos de comparacion.

FIG. 109 - Termograma de TG-FTIR de la forma seca de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P26.

FIG. 110 - Los espectros de FT-Raman (1.800-700 cm-1) de la forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (parte superior, muestra PP415-P35), y de la forma seca de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (parte media, muestra Pp415- P36 y parte inferior, muestra PP415-P37) corresponden entre sf. Los espectros se han escalado y desplazado en la direccion y para propositos de comparacion.

FIG. 111 - Los patrones de PXRD (4-24 °20) de la forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (parte superior, muestra PP415-P35) y de la forma seca de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (parte media, muestra PP415-P36 y parte inferior, muestra PP415-P37) concuerdan entre sf Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 112 - Termograma de TG-FTIR de la forma seca de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P36.

FIG. 113 - Termograma de TG-FTIR de la forma seca de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P37.

FIG. 114 - Isoterma de DVS de la forma desolvatada de solvato de acetonitrilo (Clase 4) muestra PP415-P37).

FIG. 115 - El patron de PXRD de la muestra PP415-P37, una forma de solvato de acetonitrilo (Clase 4) despues de la medicion de DVS (parte inferior) esta inalterado en comparacion con el material antes de la medicion de DVS (parte superior). Los patrones no se han escalado sino que son desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 116 - Termograma de DSC de la forma desolvatada de solvato de acetonitrilo (Clase 4) (muestra PP415-P37).

FIG. 117 - Termograma de DSC de una mezcla ~ 1:1 de la forma amorfa (Clase 1), muestra PP415-P1, con la forma desolvatada de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P36.

FIG. 118 - Termograma de DSC de una mezcla ~ 1:1 de la forma amorfa (Clase 1), muestra PP415-P1, con la forma desolvatada de solvato de acetonitrilo (Clase 4), muestra PP415-P36 (numero de experimento: PP415-P39). El barrido de calentamiento (Etapa 1) se detuvo durante 30 min a 173°C (Etapa 2) y luego se reanudo (Etapa 3).

FIG. 119 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P14, que corresponde a una forma de solvato de THF (Clase 5).

FIG. 120 - Los espectros de FT-Raman (1.800-1.100 cm-1) de una forma de solvato de THF (Clase 5) (lmea discontinua, muestra PP415-P 14), material seco de una forma de solvato de THF (Clase 5) (lmea de puntos, muestra PP415-P27), y de la forma amorfa (Clase 1) (lmea continua, muestra PP415-P1). Los espectros se han escalado para el proposito de comparacion y muestran pequenos cambios de magnitud, pero poco cambio correspondiente de forma espectral.

FIG. 121 - Patron de PXRD de la forma de solvato de THF seca (Clase 5), muestra PP415-P27 (parte superior) en comparacion con el patron de la forma de solvato de THF (Clase 5), muestra PP415-P14 (parte inferior). Los patrones no se han escalado sino son desplazados en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 122 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P27, que corresponde a un solvato de THF seco (Clase 5).

FIG. 123 - El patron de PXRD de la muestra PP415-P41 (parte superior) corresponde al patron de la forma de solvato de THF (Clase 5) (parte media, muestra PP415-P14) y no al patron de la forma de solvato de heptano, (Clase 2) (parte inferior, muestra PP415-P19). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para propositos de comparacion.

FIG. 124 - El patron de PXRD de la muestra PP415-P45 (parte superior) corresponde al patron de la forma de solvato de THF (Clase 5) (parte media, muestra PP415-P14) y no al patron de la forma de solvato de heptano (Clase 2) (parte inferior, muestra PP415-P19). Los patrones se han escalado y desplazado en la direccion y para el proposito de comparacion.

FIG. 125 - El patron de PXRD de la muestra PP415-P41 (parte superior) corresponde a una forma de solvato de THF (Clase 5). Despues de secar la muestra PP415-P41 durante 1 dfa (2° desde la parte superior, muestra: PP415- P44), el material es principalmente amorfo. Permanecen algunos picos amplios con baja intensidad. Despues del secado adicional durante la noche (2o desde la parte inferior, muestra PP415-P44a) la intensidad de estos picos amplios se reduce adicionalmente. La forma amorfa (Clase 1) se muestra como una referencia (parte inferior, muestra: PP415-P42). Los patrones no se han escalado sino son desplazados en la direccion y para el proposito de

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comparacion.

FIG. 126 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P44a, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 127 - El patrOn de PXRD de la muestra PP415-P45 (parte superior) corresponde a una forma de solvato de THF (Clase 5). Despues de secar la muestra PP415-P45 durante 1 dfa (2° desde la parte superior, muestra PP415- P46), el material es principalmente amorfo. Permanecen algunos picos amplios con baja intensidad. Despues de un total de 4 dfas de secado (2o desde la parte inferior, muestra PP415-P46a), el patrOn permanece inalterado. La forma amorfa (Clase 1) se muestra como referencia (parte inferior, muestra PP415-P42). Los patrones no se han escalado sino son desplazados en la direcciOn y para el propOsito de comparaciOn.

FIG. 128 - Termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P46a, que corresponde a la forma amorfa (Clase 1).

FIG. 129 - El patrOn de PXRD de la muestra PP415-P42 (parte superior) corresponde al patrOn de la forma amorfa (Clase 1) (parte inferior, muestra PP415-P1). Los patrones se han escalado y desplazado en la direcciOn y para el propOsito de comparaciOn.

FIG. 130 - El patrOn de PXRD de la muestra PP415-P43 (parte superior) corresponde al patrOn de la forma de solvato isoestructural (Clase 2) (parte inferior, muestra PP415-P19) y no al patrOn de la forma de solvato de THF (Clase 5) (parte media, muestra PP415-P14). Los patrones se han escalado y desplazado en la direcciOn y para el propOsito de comparaciOn.

FIG. 131 - Los patrones de PXRD de las muestras PP415-P47 (parte superior) y PP415-P48 (parte media) corresponden esencialmente al patrOn de las formas de solvato isoestructurales (Clase 2) (parte inferior, muestra PP415-P19), aunque hay algunas diferencias. Los patrones se han escalado y desplazado en la direcciOn y para el propOsito de comparaciOn.

FIG. 132 - El patrOn de PXRD de la muestra PP415-P49 (parte superior) corresponde al patrOn de la forma amorfa (Clase 1) (parte inferior, muestra PP415-P1). Los patrones se han escalado y desplazado en la direcciOn y para el propOsito de comparaciOn.

Descripcion de realizaciones ilustrativas

La presente invenciOn proporciona en un aspecto el compuesto:

W-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-ciano-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptametil-10,14-dioxo-

1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-octadecahidropicen-4a-il)-2,2-difluoropropanamida,

que tambien es referido en la presente como RTA 408, 63415, o PP415. En otros aspectos no limitantes, la presente invenciOn tambien proporciona formas polimOrficas del mismo, incluyendo solvatos del mismo. En otros aspectos no limitantes, la invenciOn tambien proporciona sales farmaceuticamente aceptables del mismo. En otros aspectos no limitantes, tambien se proporcionan metodos para la preparaciOn, composiciones farmaceuticas y kits y artfculos de fabricaciOn de estos compuestos y formas polimOrficas de los mismos.

I. Definiciones

Cuando se utiliza en el contexto de un grupo qmmico: “hidrOgeno” significa -H; “hidroxi” significa -OH; “oxo” significa =O; “carbonilo” significa -C(=O)-; “carboxi” significa -C(=O)OH (tambien escrito como -COOH o -CO2H); “halo” significa independientemente -F, -Cl, Br o -I; “amino” significa -NH2; “hidroxiamino” significa -NHOH; “nitro” significa - NO2; imino significa = NH; “ciano” significa -CN; “isocianato” significa -N=C=O; “azido” significa -N3; en un contexto monovalente “fosfato” significa -OP(O)(OH)2 o una forma desprotonada del mismo; en un contexto divalente “fosfato” significa

-OP(O)(OH)O- o una forma desprotonada del mismo; “mercapto” significa -SH; y “tio” significa =S; “sulfonilo” significa -S(O)2-; y “sulfinilo” significa -S(O)-. Cualquier valencia no definida en un atomo de una estructura mostrada en esta solicitud representa implfcitamente un atomo de hidrOgeno unido al atomo.

En el contexto de esta descripciOn, las fOrmulas:

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representan las mismas estructuras. Cuando un punto se dibuja en un carbono, el punto indica que el atomo de hidrogeno unido a ese carbono esta saliendo del plano de la pagina.

El uso de la palabra “un” o “uno”, cuando se utiliza junto con el termino “que comprende” en las reivindicaciones y/o la especificacion puede significar “uno”, pero tambien es consistente con el significado de “uno o mas”, “al menos uno” y “uno o mas de uno”.

A lo largo de esta solicitud, el termino “aproximadamente” se utiliza para indicar que un valor incluye la variacion inherente de error para el dispositivo, el metodo que se emplea para determinar el valor, o la variacion que existe entre los sujetos de estudio. Cuando se utiliza en el contexto de la difraccion en polvo de rayos X, el termino “aproximadamente” se utiliza para indicar un valor de ± 0.2 °20 del valor reportado, preferiblemente un valor de ± 0,1 °20 del valor reportado. Cuando se utiliza en el contexto de las temperaturas de transicion vftrea o calorimetna de barrido diferencial, el termino “aproximadamente” se utiliza para indicar un valor de ± 10°C con respecto al maximo del pico, preferiblemente un valor de ± 2°C con respecto al maximo del pico. Cuando se utiliza en otros contextos, el termino “aproximadamente” se utiliza para indicar un valor de ± 10% del valor reportado, preferiblemente un valor de ± 5% del valor reportado. Debe entenderse que, siempre que se utilice el termino “aproximadamente”, tambien se incluye una referencia espedfica al valor numerico exacto indicado.

Los terminos “comprender”, “tener” e “incluir” son verbos copulativos ilimitados. Cualesquiera formas o tiempos de uno o mas de estos verbos, tales como “comprende”, “que comprende”, “tiene”, “que tiene”, “incluye” y “que incluye”, tambien son ilimitados. Por ejemplo, cualquier metodo que “comprende”, “tiene” o “incluye” una o mas etapas no se limita a solo aquellos que poseen una o mas etapas y tambien cubre otras etapas no listadas.

El termino “efectivo”, como ese termino se utiliza en la especificacion y/o reivindicaciones, significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado, o pretendido. “Cantidad efectiva”, “cantidad terapeuticamente efectiva” o “cantidad farmaceuticamente efectiva” cuando se utiliza en el contexto de tratamiento de un paciente o sujeto con un compuesto significa que la cantidad de compuesto que, cuando se administra a un sujeto o paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar tal tratamiento para la enfermedad.

El termino “pico de halo” en el contexto de la difraccion en polvo de rayos X significana un pico amplio, a menudo abarcando > 10 °20 en un difractograma de polvo de rayos X, tfpicamente caractenstico de un sistema o solido amorfo.

El termino “hidrato” cuando se utiliza como un modificador para un compuesto significa que el compuesto tiene menos de una (por ejemplo, hemihidrato), una (por ejemplo, monohidrato), o mas de una (por ejemplo, dihidrato) moleculas de agua asociadas con cada molecula de compuesto, como en formas solidas del compuesto.

Como se utiliza en la presente, el termino “CI50” se refiere a una dosis inhibidora que es 50% de la respuesta maxima obtenida. Esta medicion cuantitativa indica cuanto de un farmaco particular u otra sustancia (inhibidor) se necesita para inhibir a la mitad un proceso biologico, bioqmmico, o qrnmico dado (o componente de un proceso, es decir, una enzima, celula, receptor de celulas o microorganismo).

Un “isomero” de un primer compuesto es un compuesto separado en el cual cada molecula contiene los mismos atomos constituyentes que el primer compuesto, pero donde la configuracion de esos atomos en tres dimensiones difiere.

Como se utiliza en la presente, el termino “paciente” o “sujeto” se refiere a un organismo marnffero vivo, tal como un ser humano, mono, vaca, oveja, cabra, perro, gato, raton, rata, cobaya, o especie transgenica de los mismas. En ciertas realizaciones, el paciente o sujeto es un animal no humano. En ciertas realizaciones, el paciente o sujeto es un primate. En ciertas realizaciones, el paciente o sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de sujetos humanos son adultos, jovenes, lactantes y fetos.

Como se utiliza en la presente generalmente “farmaceuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificacion que son, dentro del alcance del juicio medico, adecuados para

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el uso en contacto con los tejidos, organos, y/o fluidos corporales de los seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica u otros problemas o complicaciones proporcionadas con una relacion razonable de beneficio/riesgo.

“Sales farmaceuticamente aceptables” significa sales de los compuestos de la presente invencion que son farmaceuticamente aceptables, como se define anteriormente, y que poseen la actividad farmacologica deseada. Tales sales incluyen sales de adicion de acido formadas con acidos inorganicos tales como acido clortudrico, acido bromtudrico, acido sulfurico, acido nftrico, acido fosforico, y similares; o con acidos organicos tales como acido 1,2- etanodisulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico, acido 2-naftalensulfonico, acido 3-fenilpropionico, 4,4'- metilenbis(acido 3-hidroxi-2-en-1-carbox^lico), acido 4-metilbiciclo[2.2.2]oct-2-en-1-carbox^lico, acido acetico, acidos mono-y dicarbox^licos alifaticos, acidos sulfuricos alifaticos, acidos sulfuricos aromaticos, acido bencensulfonico, acido benzoico, acido canforsulfonico, acido carbonico, acido cinamico, acido cftrico, acido ciclopentanopropionico, acido etanosulfonico, acido fumarico, acido glucoheptonico, acido gluconico, acido glutamico, acido glicolico, acido heptanoico, acido hexanoico, acido hidroxinaftoico, acido lactico, acido laurilsulfurico, acido maleico, acido malico, acido malonico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido muconico, acido o-(4-hidroxibenzoil)benzoico, acido oxalico, acido p-clorobencenosulfonico, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acido propionico, acido p- toluenosulfonico, acido piruvico, acido salidlico, acido estearico, acido succmico, acido tartarico, acido terciariobutilacetico, acido trimetilacetico, y similares. Las sales farmaceuticamente aceptables tambien incluyen sales de adicion de bases que se pueden formar cuando los protones acidos presentes son capaces de reaccionar con bases inorganicas u organicas. Las bases inorganicas aceptables incluyen hidroxido de sodio, carbonato de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de aluminio e hidroxido de calcio. Las bases organicas aceptables incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, A/-metilglucamina y similares. Debe reconocerse que el anion o cation particular que forma parte de cualquier sal de esta invencion no es cntico, siempre que la sal, como un todo, sea farmacologicamente aceptable. Los ejemplos adicionales de sales farmaceuticamente aceptables y sus metodos de preparacion y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

“Prevencion” o “prevenir” incluye: (1) inhibir el comienzo de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que todavfa no experimenta o muestra alguna o toda la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad, y/o (2) ralentizar el comienzo de la patologfa o sintomatologfa de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que todavfa no experimenta o muestra alguna o toda la patologfa o sintomatoiogfa de la enfermedad.

“Profarmaco” significa un compuesto que es convertible in vivo metabolicamente en un inhibidor de acuerdo con la presente invencion. El propio profarmaco puede o no puede tambien tener actividad con respecto a una protema diana dada. Por ejemplo, un compuesto que comprende un grupo hidroxi se puede administrar como un ester que se convierte por hidrolisis in vivo en el compuesto hidroxi. Los esteres adecuados que se pueden convertir in vivo en compuestos hidroxi incluyen acetatos, citratos, lactatos, fosfatos, tartratos, malonatos, oxalatos, salicilatos, propionatos, succinatos, fumaratos, maleatos, metilen-bis-p-hidroxinaftoato, gentisatos, isetionatos, di-p- toluoiltartratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos, ciclohexilsulfamatos, quinatos, esteres de aminoacidos, y similares. De manera similar, un compuesto que comprende un grupo amina se puede administrar como una amida que se convierte por hidrolisis in vivo en el compuesto amina.

Un “estereoisomero” o “isomero optico” es un isomero de un compuesto dado en el cual los mismos atomos estan unidos a los mismos otros atomos, pero donde la configuracion de esos atomos en tres dimensiones difiere. Los “enantiomeros” son estereoisomeros de un compuesto dado que son imagenes especulares entre sf, como las manos izquierda y derecha. Los “diastereomeros” son estereoisomeros de un compuesto dado que no son enantiomeros. Las moleculas quirales contienen un centro quiral, tambien referido como un estereocentro o centro estereogenico, que es cualquier punto, aunque no necesariamente un atomo, en una molecula que porta grupos de tal manera que un intercambio de cualquiera de los dos grupos conduce a un estereoisomero. En los compuestos organicos, el centro quiral es tfpicamente un atomo de carbono, fosforo o azufre, aunque tambien es posible que otros atomos sean estereocentros en los compuestos organicos e inorganicos. Una molecula puede tener multiples estereocentros, dandole muchos estereoisomeros. En los compuestos cuyo estereoisomerismo se debe a los centros estereogenicos tetraedricos (por ejemplo, carbono tetraedrico), el numero total de estereoisomeros hipoteticamente posibles no excedera 2n, donde n es el numero de estereocentros tetraedricos. Las moleculas con simetna con frecuencia tienen menos del numero maximo posible de estereoisomeros. Una mezcla 50:50 de enantiomeros se refiere como una mezcla racemica. Alternativamente, una mezcla de enantiomeros puede ser enantiomericamente enriquecida de modo que un enantiomero esta presente en una cantidad mayor de 50%. Tfpicamente, los enantiomeros y/o diastereomeros se pueden resolver o separar utilizando tecnicas conocidas en la tecnica. Se contempla que para cualquier estereocentro o eje de quiralidad para el cual no se ha definido la estereoqmmica, este estereocentro o eje de quiralidad puede estar presente en su forma R, forma S, o como una mezcla de las formas R y S, incluyendo mezclas racemicas y no racemicas. Como se utiliza en la presente, la frase “sustancialmente libre de otros estereoisomeros” significa que la composicion contiene < 15%, mas preferiblemente < 10%, incluso mas preferiblemente < 5%, o lo mas preferiblemente < 1% de otro(s) estereoisomero(s).

“Tratamiento” o “tratar” incluye (1) inhibir una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad (por ejemplo, deteniendo el desarrollo adicional de la patologfa y/o

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sintomatologfa), (2) mejorar una enfermedad en un sujeto o paciente que esta experimentando o mostrando la patolog^a o sintomatologfa de la enfermedad (por ejemplo, revertir la patolog^a y/o sintomatologfa), y/o (3) efectuar cualquier disminucion mensurable en una enfermedad en un sujeto o paciente que esta experimentando o mostrando la patologfa o sintomatologfa de la enfermedad.

Las definiciones anteriores sustituyen cualquier definicion en conflicto en cualquier referencia citada en la presente. El hecho de que ciertos terminos se definan, sin embargo, no debe ser considerado como indicativo de que cualquier termino que no se define es indefinido. Mas bien, todos los terminos utilizados se cree que describen la invencion en terminos tales que un experto puede apreciar el alcance y la practica de la presente invencion.

II. RTA 408 y Metodos Sinteticos

El RTA 408 se puede preparar de acuerdo con los metodos descritos en la seccion de Ejemplos a continuacion. Estos metodos se pueden modificar y optimizar adicionalmente utilizando los principios y tecnicas de la qrnmica organica como se aplica por una persona experta en la tecnica. Tales principios y tecnicas se ensenan, por ejemplo, en March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007).

Debe reconocerse que el anion o cation particular, que forma parte de cualquier sal de esta invencion no es crftico, siempre que la sal, como un todo, sea farmacologicamente aceptable. Los ejemplos adicionales de sales farmaceuticamente aceptables y sus metodos de preparacion y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002).

Ademas, se pretende que los atomos que integran el RTA 408 de la presente invencion incluyan todas las formas isotopicas de estos atomos. Los isotopos, como se utiliza en la presente, incluyen aquellos atomos que tienen el mismo numero atomico pero diferentes numeros de masa. A modo de ejemplo general y sin limitacion, los isotopos de hidrogeno incluyen tritio y deuterio, y los isotopos de carbono incluyen 13C y 14C. De manera similar, se contempla que uno o mas atomos de carbonos de un compuesto de la presente invencion se puedan remplazar por un atomo o atomos de silicio. Ademas, se contempla que uno o mas atomos de oxfgeno de RTA 408 se puedan remplazar por un atomo o atomos de azufre o selenio.

El RTA 408 y forma polimorfica del mismo tambien pueden tener la ventaja de que pueden ser mas eficaces que, ser menos toxicos que, ser de accion mas prolongada que, ser mas potentes que, producir menos efectos secundarios que, ser mas facilmente absorbidos que, y/o tener un mejor perfil farmacocinetico (por ejemplo, mayor biodisponibilidad oral y/o menor aclaramiento) que, y/o tener otras ventajas farmacologicas, ffsicas o qmmicas utiles sobre compuestos conocidos en la tecnica anterior para el uso en las indicaciones establecidas en la presente.

III. Formas Polimorficas de RTA 408

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona diferentes formas solidas de RTA 408, incluyendo solvatos del mismo. Se realizo un estudio de preformulacion y polimorfismo preliminar, y se encontro que el RTA 408 tiene una alta tendencia a la formacion de solvato. Las formas cristalinas de las clases 2, 3, 4 y 5 son consistentes con los solvatos. Para una descripcion de las clases, vease la Tabla 1 a continuacion. Los intentos de secar las clases 2 y 3 (dos grupos de solvatos isoestructurales) no fueron exitosos, lo cual es consistente con las moleculas de solvente fuertemente unidas. En algunas realizaciones, el secado de un solido de clase 4 (solvato de acetonitrilo) condujo a una forma desolvatada isoestructural. En algunas realizaciones, el secado de un solido de clase 5 (solvato de THF) resulto en la forma amorfa clase 1. Las formas no solvatadas de RTA 408 incluyen la forma amorfa (clase 1) y el solvato desolvatado cristalino de la clase 4 (isoestructural al solvato de acetonitrilo clase 4). En algunas realizaciones, la forma amorfa tiene una alta transicion vftrea con Tg “ 153°C (ACP = 0,72 J/g°C) y es solo ligeramente higroscopica (Am = +0.4% 50% ^ 85% de h.r.). En algunas realizaciones, la forma amorfa es estable durante al menos cuatro semanas bajo condiciones de temperatura y humedad elevadas (es decir, abierto a 40°C/75% de h.r. o cerrado a 80°C). En algunas realizaciones, la forma amorfa (clase 1) se preparo con exito a partir de material clase 2 en un proceso de dos etapas (transformacion en la clase 5 y posterior secado de la clase 5 para obtener la forma amorfa), asf como en un metodo de una etapa directa (precipitacion a partir de una disolucion de acetona en un bano de agua fna). El solvato cristalino desolvatado de la clase 4 (isoestructural al solvato clase 4) es ligeramente higroscopico (ganancia de masa de ~0,7% en peso de 50% de h.r. a 85% de h.r.) y tiene un posible punto de fusion a 196,1°C (AH = 29,31 J/g).

Una muestra de la forma amorfa de 63415, clase 1, se caracterizo por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, TG- FTIR, titulacion de Karl Fischer, 1H-RMN, DSC, y DVS (vease la seccion de Ejemplos para detalles adicionales). Se encontro que la muestra contiene ~0,9% en peso de EtOH con trazas de H2O (de acuerdo con la TG-FTIR). Un contenido de agua de 0,5% en peso se determino por titulacion de Karl Fischer. La DSC muestra una alta temperatura de transicion vftrea con Tg “ 153°C (ACP = 0,72 J/g°C). De acuerdo con DVS, el material es ligeramente higroscopico (Am = +0,4% 50% ^ 85% de h.r.). No se observo cristalizacion en los experimentos de DSC o DVS.

La estabilidad qrnmica de la forma amorfa se investigo en solventes organicos, incluyendo acetona, EtOAc, MeOH, y MeCN, asf como diferentes medios acuosos (por ejemplo, 1% Tween 80 ac., 1% SDS ac., 1% CTAB ac.) a una concentracion de 1 mg/mL en puntos de tiempo de 6 h, 24 h, 2 d, y 7 d. Se observo descomposicion > 1% solamente para disoluciones en MeCN despues de 7 dfas y para suspensiones en el medio de Tween 80 acuoso al 1% (en

todos los puntos de tiempo a 254 nm y despues de 24 h, 2 d, y 7 d a 242 nm).

Ademas, la estabilidad de la forma amorfa se investigo por el almacenamiento bajo condiciones de temperatura y humedad elevadas (abierto a 25°C/62% h.r. y 40°C/75% h.r. y cerrado a 60°C y 80°C). Despues de una semana, dos semanas, y cuatro semanas, las muestras almacenadas se analizaron por PXRD. Ninguna de las muestras 5 difirio del material de partida amorfo.

Se realizaron mas de 30 experimentos de cristalizacion y secado, incluyendo el equilibrio de suspension, enfriamiento lento, evaporacion, y precipitacion. Se obtuvieron cuatro nuevas formas cristalinas (clases 2, 3, 4 y 5), ademas de la forma amorfa (clase 1).

Las cuatro formas nuevas (clases 2, 3, 4 y 5) se caracterizaron por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. 10 Todas las formas corresponden a solvatos (Tabla 1). Los experimentos de secado bajo vacfo o flujo de N2 se realizaron con el objetivo de obtener una forma cristalina, no solvatada de 63415.

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Tabla 1. Resumen de las Clases Obtenidas

Clase

Caracteristicas Resultado de los Experimentos de Secado

Clase 1

forma amorfa --

Clase 2

solvatos isoestructurales (por ejemplo, heptano) secado no exitoso

Clase 3

solvatos isoestructurales (por ejemplo, etanol) secado no exitoso

Clase 4

solvato de MeCN y solvato desolvatado secado exitoso, estructura inalterada

Clase 5

solvato de THF el secado resulto en forma amorfa

Clase 2: La mayona de los experimentos de cristalizacion que se realizaron dieron como resultado el material solido de la clase 2 (vease la seccion de Ejemplos a continuacion). Sus miembros pueden corresponder a solvatos no estequiometricos isoestructurales (<0,5 eq.) (de heptano, ciclohexano, isopropil eter, 1-butanol, trietilamina, y posiblemente otros solventes, tales como hexano, otros eteres, etc) con moleculas de solvente fuertemente unidas. Los espectros de Raman y patrones de PXRD dentro de esta clase son muy similares entre sf, por lo tanto, las estructuras podnan ser esencialmente identicas con solo pequenas diferencias debido a los diferentes solventes que se incorporaron.

Los experimentos de secado en las muestras de la clase 2 no han resultado en una forma no solvatada cristalina. Incluso las temperaturas elevadas (80°C) y un alto vado (<1x10-3 mbares) no pudieron eliminar las moleculas de solvente fuertemente unidas por completo; siempre se mantuvo un contenido de solvente > 2% en peso. La cristalinidad de estas muestras parcialmente secas se redujo, pero no se observo ni la transformacion en una estructura diferente ni la amorfizacion sustancial.

Clase 3: El material solido de la clase 3 se puede obtener a partir de varias cristalizaciones (vease la seccion de Ejemplos a continuacion). Las muestras de la clase 3 son solvatos probablemente isoestructurales de 2PrOH, EtOH, y probablemente acetona con moleculas de solvente fuertemente unidas. Podnan corresponder ya sea a hemisolvatos estequiometricos o solvatos no estequiometricos con un contenido de solvente de ~0,5 eq. Como con la clase 2, los espectros de Raman y patrones de PXRD dentro de esta clase son muy similares entre sf, lo que indica estructuras similares que incorporan diferentes solventes.

Similar a la clase 2, los experimentos de secado no tuvieron exito. Las moleculas de solvente muy fuertemente unidas solo pudieron ser eliminadas parcialmente (es decir, ~5,4% en peso a ~4,8% en peso despues de hasta 3 d a 1x10-3 mbares y 80°C). Los patrones de PXRD se mantuvieron inalterados.

La Clase 4 se puede obtener a partir de un sistema de solventes de 7:3 MeCN/H2O (vease la seccion de Ejemplos a continuacion). Muy probablemente corresponde a un hemisolvato de acetonitrilo cristalino. Por secado (bajo vacfo o flujo de N2 a temperaturas elevadas) la mayona de las moleculas de solvente pidieron eliminarse sin cambiar o destruir la estructura cristalina (la PXRD se mantuvo inalterada). Asf, se obtuvo una forma no solvatada cristalina (o mas bien solvato desolvatado). Es ligeramente higroscopica (ganancia de masa del ~0,7% en peso de 50% de h.r. a 85% de h.r.) y tiene un posible punto de fusion a 196,1°C (AH = 29,31 J/g).

La Clase 5 se puede obtener a partir de un sistema de solventes de ~1:1 THF/H2O. La clase 5 contiene THF unido (y tal vez H2O). Como el contenido de los dos componentes no se puede cuantificar facilmente por separado, la naturaleza exacta de este solvato cristalino no se ha determinado.

El secado de la clase 5 resulto en desolvatacion y transformacion significativas en la direccion de la forma amorfa (clase 1). En algunas realizaciones, la forma amorfa de RTA 408 se puede preparar suspendiendo el solvato de heptano clase 2 en 1:1 THF/H2O para formar un solido clase 5, seguido de secado y amorfizacion.

Los experimentos con el objetivo de preparar la forma amorfa (clase 1) se realizaron utilizando el material de partida clase 2. El material principalmente amorfo (clase 1) se preparo partiendo del material de la clase 2 en un proceso de dos etapas a traves de la clase 5 en una escala de 100 mg y 3 g (secado a 100 mbares, 80°C, varios dfas). La preparacion de material totalmente amorfo (clase 1) se encontro que es posible en un proceso de una etapa evitando el solvente THF por precipitacion directa de la forma amorfa (clase 1) de una disolucion en acetona de material de la clase 2 en un bano de agua fna.

IV. Enfermedades Asociadas con la Inflamacion y/o Estres Oxidativo

La inflamacion es un proceso biologico que proporciona resistencia a organismos infecciosos o parasitarios y la reparacion de tejido danado. La inflamacion se caracteriza comunmente por vasodilatacion localizada, enrojecimiento, hinchazon, y dolor, el reclutamiento de leucocitos al sitio de la infeccion o lesion, la produccion de citoquinas inflamatorias, tal como TNF-a e IL-1, y la produccion de especies reactivas de oxfgeno o nitrogeno, tal

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como peroxido de hidrogeno, superoxido, y peroxinitrito. En los estadios posteriores de inflamacion, la remodelacion de tejido, angiogenesis y formacion de cicatrices (fibrosis) pueden presentarse como parte del proceso de cicatrizacion de la herida. Bajo circunstancias normales, la respuesta inflamatoria esta regulada, es temporal, y se resuelve de una manera orquestada una vez que la infeccion o lesion se ha tratado adecuadamente. Sin embargo, la inflamacion aguda puede llegar a ser excesiva y potencialmente mortal si fallan los mecanismos de regulacion. Alternativamente, la inflamacion puede llegar a ser cronica y causar dano de tejido acumulativo o complicaciones sistemicas. Sobre la base de al menos la evidencia presentada en la presente, el RTA 408 se puede utilizar en el tratamiento o prevencion de la inflamacion o enfermedades asociadas con la inflamacion.

Muchas enfermedades humanas graves e intratables implican la desrregulacion de los procesos inflamatorios, incluyendo enfermedades tales como el cancer, aterosclerosis y diabetes, que no se vieron tradicionalmente como afecciones inflamatorias. En el caso del cancer, los procesos inflamatorios estan asociados con los procesos que incluyen la formacion, progresion, metastasis y resistencia del tumor a la terapia. En algunas realizaciones, el RTA 408 se puede utilizar en el tratamiento o prevencion de canceres incluyendo un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, melanoma, mesotelioma, mieloma multiple, o seminoma, o cancer de la vejiga, sangre, huesos, cerebro, mama, sistema nervioso central, cuello uterino, colon, endometrio, esofago, vesfcula biliar, genitales, tracto genitourinario, cabeza, rinon, laringe, hngado, pulmon, tejido muscular, cuello, mucosa oral o nasal, ovario, pancreas, prostata, piel, bazo, intestino delgado, intestino grueso, estomago, testfculos, o tiroides. La aterosclerosis, vista desde hace tiempo como un trastorno del metabolismo de lfpidos, se entiende ahora que es principalmente una afeccion inflamatoria, con macrofagos activados que juegan un papel importante en la formacion y eventual ruptura de las placas ateroscleroticas. La activacion de vfas de senalizacion inflamatorias tambien se ha mostrado que desempena un papel en el desarrollo de la resistencia a la insulina, asf como en el dano de tejido periferico asociado con la hiperglucemia diabetica. La produccion excesiva de especies reactivas de oxfgeno y especies reactivas de nitrogeno, tales como superoxido, peroxido de hidrogeno, oxido mtrico y peroxinitrito, es un sello distintivo de las afecciones inflamatorias. La evidencia de la produccion de peroxinitrito desrregulada se ha reportado en una amplia variedad de enfermedades (Szabo et al., 2007; Schulz et al., 2008; Forstermann, 2006; Pall, 2007).

Las enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, lupus, psoriasis, y esclerosis multiple implican la activacion inapropiada y cronica de los procesos inflamatorios en los tejidos afectados, que surge de la disfuncion del reconocimiento de lo propio frente a lo no propio y los mecanismos de respuesta en el sistema inmune. En las enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedades de Alzheimer y Parkinson, el dano neuronal se correlaciona con la activacion de la microglia y los niveles elevados de protemas pro-inflamatorias, tales como la oxido mtrico sintasa inducible (iNOS). La insuficiencia organica cronica, tales como insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca, insuficiencia hepatica y enfermedad pulmonar obstructiva cronica, esta estrechamente asociada con la presencia de estres oxidativo cronico e inflamacion, conduciendo al desarrollo de fibrosis y perdida eventual de la funcion del organo. El estres oxidativo en las celulas endoteliales vasculares, que revisten los vasos sangumeos mayores y menores, puede conducir a la disfuncion endotelial y se cree que es un importante factor contribuyente en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular sistemica, complicaciones de la diabetes, enfermedad renal cronica y otras formas de insuficiencia organica, y un numero de otras enfermedades relacionadas con el envejecimiento, incluyendo enfermedades degenerativas del sistema nervioso central y la retina.

Muchos otros trastornos implican el estres oxidativo e inflamacion en los tejidos afectados, incluyendo la enfermedad inflamatoria del intestino; enfermedades inflamatorias de la piel; mucositis y dermatitis relacionada con la terapia de radiacion y quimioterapia; enfermedades oculares, tales como la uveftis, glaucoma, degeneracion macular, y diversas formas de retinopatfa; fallo y rechazo del trasplante; lesion por reperfusion isquemica; dolor cronico; afecciones degenerativas de los huesos y articulaciones, incluyendo la osteoartritis y osteoporosis; asma y fibrosis qrnstica; trastornos convulsivos; y afecciones neuropsiquiatricas, incluyendo la esquizofrenia, depresion, trastorno bipolar, trastorno de estres postraumatico, trastornos de deficit de atencion, trastornos del espectro autista, y trastornos de la alimentacion, tales como la anorexia nerviosa. Se cree que la desrregulacion de las vfas de senalizacion inflamatorias es un factor importante en la patologfa de las enfermedades de desgaste muscular, incluyendo la distrofia muscular y diversas formas de caquexia.

Una variedad de trastornos agudos potencialmente mortales tambien implica la senalizacion inflamatoria desrregulada, incluyendo insuficiencia organica aguda que involucra el pancreas, rinones, Imgado o pulmones, infarto de miocardio o smdrome coronario agudo, apoplejfa, choque septico, trauma, quemaduras graves, y anafilaxia.

Muchas complicaciones de enfermedades infecciosas tambien implican la desrregulacion de las respuestas inflamatorias. Aunque una respuesta inflamatoria puede matar a los patogenos invasores, una respuesta inflamatoria excesiva tambien puede ser muy destructiva y en algunos casos puede ser una fuente primaria de danos en los tejidos infectados. Ademas, una respuesta inflamatoria excesiva tambien puede conducir a complicaciones sistemicas debido a la sobreproduccion de citoquinas inflamatorias, tales como TNF-a e IL-1. Esto se cree que es un factor en la mortalidad derivada de la influenza severa, smdrome respiratorio agudo severo, y sepsis.

La expresion aberrante o excesiva ya sea de iNOS o ciclooxigenasa-2 (COX-2) ha sido implicada en la patogenesis de muchos procesos patologicos. Por ejemplo, esta claro que el NO es un mutageno potente (Tamir y Tannebaum, 1996), y que el oxido mtrico tambien puede activar la COX-2 (Salvemini et al., 1994). Ademas, hay un marcado

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aumento en la iNOS en los tumores de colon de rata inducidos por el carcinogeno, azoximetano (Takahashi et al., 1997). Se ha mostrado que una serie de analogos sinteticos de triterpenoide de acido oleanolico son potentes inhibidores de los procesos inflamatorios celulares, tales como la induccion por IFN-y de oxido nftrico sintasa inducible (iNOS) y de COX-2 en los macrofagos de raton. Vease Honda et al. (2000a), Honda et al. (2000b), y Honda et al. (2002), las cuales se incorporan en la presente por referencia.

En un aspecto, el RTA 408 descrito en la presente se caracteriza en parte por su capacidad para inhibir la produccion de oxido nftrico en celulas RAW 264.7 derivadas de macrofagos inducida por la exposicion a Y-interferon. El RTA 408 se caracteriza ademas por la capacidad para inducir la expresion de protemas antioxidantes, tal como NQO1, y reducir la expresion de protemas pro-inflamatorias, tales como COX-2 y oxido mtrico sintasa inducible (iNOS). Estas propiedades son relevantes para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y trastornos que implican el estres oxidativo y la desrregulacion de los procesos inflamatorios, incluyendo cancer, complicaciones de la exposicion localizada o total del cuerpo a radiacion ionizante, mucositis y dermatitis resultante de la terapia de radiacion o quimioterapia, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, incluyendo aterosclerosis, lesion por reperfusion isquemica, insuficiencia organica aguda y cronica, incluyendo insuficiencia renal e insuficiencia cardiaca, enfermedades respiratorias, diabetes y complicaciones de la diabetes, alergias severas, rechazo de trasplantes, enfermedad de injerto contra huesped, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades de los ojos y retina, dolor agudo y cronico, enfermedades oseas degenerativas, incluyendo la osteoartritis y osteoporosis, enfermedades inflamatorias del intestino, dermatitis y otras enfermedades de la piel, sepsis, quemaduras, trastornos convulsivos, y trastornos neuropsiquiatricos.

En otro aspecto, el RTA 408 se puede utilizar para tratar a un sujeto que tiene una afeccion tales como enfermedades de los ojos. Por ejemplo, uveftis, degeneracion macular (tanto la forma seca como forma humeda), glaucoma, edema macular diabetico, blefaritis, retinopatfa diabetica, enfermedades y trastornos del endotelio corneal tal como distrofia corneal endotelial de Fuchs, inflamacion post-quirurgica, ojo seco, conjuntivitis alergica y otras formas de conjuntivitis son ejemplos no limitantes de enfermedades de los ojos que podnan ser tratadas con RTA 408.

En otro aspecto, el RTA 408 se puede utilizar para tratar a un sujeto que tiene una afeccion tales como enfermedades o trastornos de la piel. Por ejemplo, dermatitis, incluyendo dermatitis alergica, dermatitis atopica, dermatitis debida a la exposicion qmmica, y dermatitis inducida por la radiacion; quemaduras termicas o qmmicas; heridas cronicas incluyendo ulceras diabeticas, llagas por presion y ulceras venosas; acne; alopecia incluyendo la calvicie y alopecia inducida por farmacos; otros trastornos del foftculo piloso; epidermolisis bullosa; quemaduras solares y sus complicaciones; trastornos de la pigmentacion de la piel incluyendo vitiligo; afecciones de la piel relacionadas con el envejecimiento; cicatrizacion de heridas post-quirurgicas; prevencion o reduccion de las cicatrices de las lesiones de la piel, cirugfa o quemaduras; psoriasis; manifestaciones dermatologicas de enfermedades autoinmunes o enfermedad de injerto contra huesped; prevencion o tratamiento de cancer de la piel; trastornos que implican la hiperproliferacion de celulas de la piel tales como hiperqueratosis es un ejemplo no limitante de enfermedades de la piel que podnan ser tratadas con RTA 408.

Sin estar ligado por la teona, se cree que la activacion de la via de Keap1/Nrf2/ARE antioxidante/anti-inflamatoria esta implicada en ambas propiedades antiinflamatorias y anti-cancengenas del compuesto descrito en la presente.

En otro aspecto, el RTA 408 se puede utilizar para tratar a un sujeto que tiene una afeccion causada por niveles elevados de estres oxidativo en uno o mas tejidos. El estres oxidativo resulta de los niveles anormalmente altos o prolongados de especies reactivas de oxfgeno, tales como superoxido, peroxido de hidrogeno, oxido nftrico y peroxinitrito (formado por la reaccion de oxido mtrico y superoxido). El estres oxidativo puede estar acompanado por inflamacion ya sea aguda o cronica. El estres oxidativo puede ser causado por la disfuncion mitocondrial, por la activacion de las celulas inmunes, tales como macrofagos y neutrofilos, por la exposicion aguda a un agente externo, tal como radiacion ionizante o un agente quimioterapeutico citotoxico (por ejemplo, doxorrubicina), por trauma u otra lesion aguda de los tejidos, por isquemia/reperfusion, por mala circulacion o anemia, por hipoxia o hiperoxia localizada o sistemica, por niveles elevados de citocinas inflamatorias y otras protemas relacionadas con la inflamacion, y/o por otros estados fisiologicos anormales, tales como hiperglucemia o hipoglucemia.

En modelos animales de muchas de estas afecciones, la estimulacion de la expresion de hemo oxigenasa inducible (HO-1), un gen diana de la via de Nrf2, se ha mostrado que tiene un efecto terapeutico significativo incluyendo en modelos de infarto de miocardio, insuficiencia renal, fallo y rechazo de trasplante, apoplejfa, enfermedad cardiovascular, y enfermedad autoinmune (por ejemplo, Sacerdoti et al., 2005; Abraham y Kappas, 2005; Bach, 2006; Araujo et al., 2003; Liu et al., 2006; Ishikawa et al., 2001; Kruger et al., 2006; Satoh et al., 2006; Zhou et al., 2005; Morse y Choi, 2005; Morse y Choi, 2002). Esta enzima descompone la hemo libre en hierro, monoxido de carbono (CO), y biliverdina (que posteriormente se convierte a la molecula antioxidante potente, bilirrubina).

En otro aspecto, el RTA 408 se puede utilizar para prevenir o tratar el dano de tejido o la insuficiencia organica, aguda y cronica, resultante del estres oxidativo exacerbado por la inflamacion. Los ejemplos de enfermedades que caen en esta categona incluyen la insuficiencia cardiaca, insuficiencia hepatica, fallo y rechazo de trasplante, insuficiencia renal, pancreatitis, enfermedades pulmonares fibroticas (fibrosis qrnstica, COPD, y fibrosis pulmonar idiopatica, entre otras), diabetes (incluyendo las complicaciones), aterosclerosis, lesion por reperfusion isquemica,

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glaucoma, apoplejfa, enfermedad autoimmune, autismo, degeneracion macular, y distrofia muscular. Por ejemplo, en el caso del autismo, los estudios sugieren que el aumento de estres oxidativo en el sistema nervioso central puede contribuir al desarrollo de la enfermedad (Chauhan y Chauhan, 2006).

La evidencia tambien vincula el estres oxidativo y la inflamacion con el desarrollo y patologfa de muchos otros trastornos del sistema nervioso central, incluyendo trastornos psiquiatricos, tales como la psicosis, depresion mayor y trastorno bipolar; trastornos convulsivos, tales como la epilepsia; dolor y smdromes sensoriales, tales como la migrana, dolor neuropatico, o tinnitus; y smdromes del comportamiento, tales como los trastornos de deficit de atencion. Vease, por ejemplo, Dickerson et al., 2007; Hanson et al., 2005; Kendall-Tackett, 2007; Lencz et al., 2007; Dudhgaonkar et al., 2006; Lee et al., 2007; Morris et al., 2002; Ruster et al., 2005; Mclver et al., 2005; Sarchielli et al., 2006; Kawakami et al., 2006; Ross et al., 2003. Por ejemplo, los niveles elevados de citoquinas inflamatorias, incluyendo TNF-a, interferon-Y, e IL-6, se asocian con enfermedades mentales graves (Dickerson et al., 2007). La activacion microglial tambien se ha vinculado con enfermedades mentales graves. Por lo tanto, la regulacion a la baja de las citoquinas inflamatorias y la inhibicion de la activacion excesiva de la microglia podnan ser beneficiosas en los pacientes con esquizofrenia, depresion mayor, trastorno bipolar, trastornos del espectro autista y otros trastornos neuropsiquiatricos.

Por consiguiente, en patologfas que implican el estres oxidativo solo o estres oxidativo exacerbado por la inflamacion, el tratamiento puede comprender administrar a un sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto de esta invencion, tales como las descritas anteriormente o en toda esta especificacion. El tratamiento se puede administrar de forma preventiva, antes de un estado predecible de estres oxidativo (por ejemplo, trasplante de organos o la administracion de terapia de radiacion a un paciente con cancer), o se puede administrar terapeuticamente en entornos que implican el estres oxidativo y la inflamacion establecidos. En algunas realizaciones, cuando se utiliza un compuesto de la presente invencion para tratar un paciente que recibe terapia de radiacion y/o quimioterapia, el compuesto de la invencion se puede administrar antes, al mismo tiempo, y/o despues de la radiacion o quimioterapia, o el compuesto se puede administrar en combinacion con las otras terapias. En algunas realizaciones, el compuesto de la invencion puede prevenir y/o reducir la severidad de los efectos secundarios asociados con la terapia de radiacion o quimioterapia (utilizando un agente diferente) sin reducir los efectos anticancengenos de la terapia de radiacion o quimioterapia. Debido a que tales efectos secundarios pueden ser limitantes de la dosis para la terapia de radiacion y/o quimioterapia, en algunas realizaciones, el compuesto de la presente invencion se puede utilizar para permitir una mayor y/o mas frecuente dosificacion de la terapia de radiacion y/o quimioterapia, por ejemplo, resultando en una mayor eficacia del tratamiento. En algunas realizaciones, el compuesto de la invencion cuando se administra en combinacion con la terapia de radiacion y/o quimioterapia puede mejorar la eficacia de una dosis dada de la radiacion y/o quimioterapia. En algunas realizaciones, el compuesto de la invencion cuando se administra en combinacion con la terapia de radiacion y/o quimioterapia puede mejorar la eficacia de una dosis dada de la radiacion y/o quimioterapia y reducir (o, como mmimo, no anadir) los efectos secundarios de la radiacion y/o quimioterapia. En algunas realizaciones, y sin estar limitados por la teona, esta eficacia combinatoria puede resultar de la inhibicion de la actividad del factor de transcripcion pro-inflamatorio NF-kB por el compuesto de la invencion. El NF-kB a menudo se activa cronicamente en las celulas cancerosas, y tal activacion se asocia con la resistencia a la terapia y la promocion de la progresion del tumor (por ejemplo, Karin, 2006; Aghajan et al., 2012). Otros factores de transcripcion que promueven la inflamacion y el cancer, tal como STAT3 (por ejemplo, He y Karin 2011; Grivennikov y Karin, 2010), tambien se pueden inhibir por el compuesto de la invencion en algunas realizaciones.

El RTA 408 se puede utilizar para tratar o prevenir afecciones inflamatorias, tales como sepsis, dermatitis, enfermedad autoinmune, y osteoartritis. El RTA 408 tambien se puede utilizar para tratar o prevenir el dolor inflamatorio y/o dolor neuropatico, por ejemplo, induciendo Nrf2 y/o inhibiendo NF-kB.

El RTA 408 tambien se puede utilizar para tratar o prevenir enfermedades, tales como el cancer, inflamacion, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis multiple, autismo, esclerosis lateral amiotrofica, enfermedad de Huntington, enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, lupus, enfermedad de Crohn, y psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, todas las otras enfermedades cuya patogenesis se cree que implica la produccion excesiva ya sea de oxido mtrico o prostaglandinas, y patologfas que implican el estres oxidativo solo o estres oxidativo exacerbado por la inflamacion. El RTA 408 se puede utilizar en el tratamiento o la prevencion de canceres incluyendo carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, melanoma, mesotelioma, mieloma multiple, o seminoma, o cancer de la vejiga, sangre, huesos, cerebro, mama, sistema nervioso central, cuello del utero, colon, endometrio, esofago, vesmula biliar, genitales, tracto genitourinario, cabeza, rinon, laringe, Imgado, pulmon, tejido muscular, cuello, mucosa oral o nasal, ovario, pancreas, prostata, piel, bazo, intestino delgado, intestino grueso, estomago, testmulos, o tiroides.

Otro aspecto de la inflamacion es la produccion de prostaglandinas inflamatorias, tal como la prostaglandina E. El RTA 408 se puede utilizar para promover la vasodilatacion, extravasacion de plasma, dolor localizado, temperatura elevada, y otros smtomas de la inflamacion. La forma inducible de la enzima COX-2 se asocia con su produccion, y los altos niveles de COX-2 se encuentran en los tejidos inflamados. En consecuencia, la inhibicion de la COX-2 puede aliviar muchos smtomas de la inflamacion y una serie de importantes farmacos anti-inflamatorios (por ejemplo, ibuprofeno y celecoxib) actuan inhibiendo la actividad de COX-2. Se ha demostrado que una clase de prostaglandinas de ciclopentenona (cyPG) (por ejemplo, 15-desoxi prostaglandina J2, tambien conocido como

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PGJ2) desempena un papel en la estimulacion de la resolucion orquestada de la inflamacion (por ejemplo, Rajakariar et al., 2007). La COX-2 tambien se asocia con la produccion de prostaglandinas de ciclopentenona. En consecuencia, la inhibicion de la COX-2 puede interferir con la resolucion completa de la inflamacion, promoviendo potencialmente la persistencia de las celulas inmunes activadas en los tejidos y conduciendo a la inflamacion “latente” cronica. Este efecto puede ser responsable de la incidencia aumentada de enfermedad cardiovascular en pacientes que utilizan inhibidores selectivos de la COX-2 durante largos penodos de tiempo.

En un aspecto, el RTA 408 se puede utilizar para controlar la produccion de citoquinas pro-inflamatorias dentro de la celula activando selectivamente los residuos de cistema reguladores (RCR) en las protemas que regulan la actividad de factores de transcripcion sensibles a redox. La activacion de RCR por cyPG se ha mostrado que inicia un programa de pro-resolucion en el cual la actividad del factor de transcripcion antioxidante y citoprotector Nrf2 se induce de forma potente y las actividades de los factores de transcripcion pro-oxidantes y pro-inflamatorios NF-kB y STAT se suprimen. En algunas realizaciones, el RTA 408 se puede utilizar para aumentar la produccion de moleculas antioxidantes y reductoras (NQO1, HO-1, SOD1, y-GCS) y disminuir el estres oxidativo y la produccion de moleculas pro-oxidantes y pro-inflamatorias (iNOS, COX-2, TNF-a). En algunas realizaciones, el RTA 408 se puede utilizar para causar que las celulas que albergan el evento inflamatorio reviertan a un un estado no inflamatorio promoviendo la resolucion de la inflamacion y limitando el dano de tejido excesivo al huesped.

A. Cancer

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de la presente descripcion se pueden utilizar para inducir la apoptosis en las celulas de tumor, inducir la diferenciacion celular, inhibir la proliferacion de celulas cancerosas, inhibir una respuesta inflamatoria, y/o funcionar en una capacidad quimiopreventiva. Por ejemplo, la invencion proporciona nuevas formas polimorficas que tienen una o mas de las siguientes propiedades: (1) una capacidad para inducir la apoptosis y diferenciar celulas tanto malignas como no malignas, (2) una actividad a niveles sub-micromolares o nanomolares como un inhibidor de proliferacion de muchas celulas malignas o premalignas, (3) una capacidad para suprimir la smtesis de novo de la enzima inflamatoria oxido mtrico sintasa inducible (iNOS), (4) una capacidad para inhibir la activacion de NF-kB, y (5) una capacidad para inducir la expresion de hemo oxigenasa-1 (HO-1).

Los niveles de iNOS y COX-2 estan elevados en ciertos canceres y han sido implicados en la carcinogenesis y se ha mostrado que los inhibidores de la COX-2 reducen la incidencia de adenomas de colon primarios en los seres humanos (Rostom et al., 2007; Brown y DuBois, 2005; Crowel et al., 2003). La iNOS se expresa en las celulas supresoras derivadas de mieloide (MDSC) (Angulo et al., 2000) y se ha mostrado que la actividad de COX-2 en celulas cancerosas resulta en la produccion de prostaglandina E2 (PGE2), que se ha mostrado que induce la expresion de la arginasa en MDSC (Sinha et al., 2007). La arginasa e iNOS son enzimas que utilizan L-arginina como sustrato y producen L-ornitina y urea, y L-citrulina y NO, respectivamente. El agotamiento de la arginina del microambiente del tumor por MDSC, combinado con la produccion de NO y peroxinitrito se ha mostrado que inhibe la proliferacion e induce la apoptosis de las celulas T (Bronte et al., 2003). La inhibicion de la COX-2 e iNOS se ha mostrado que reduce la acumulacion de MDSC, restaura la actividad citotoxica de celulas T asociadas a tumores, y retrasa el crecimiento del tumor (Sinha et al., 2007; Mazzoni et al., 2002; Zhou et al., 2007).

La inhibicion de las vfas de senalizacion de NF-kB y JAK/STAT se ha implicado como una estrategia para inhibir la proliferacion de celulas epiteliales cancerosas e inducir su apoptosis. La activacion de STAT3 y NF-kB se ha mostrado que resulta en la supresion de la apoptosis en las celulas cancerosas, y la promocion de la proliferacion, invasion y metastasis. Muchos de los genes diana implicados en estos procesos han mostrado estar transcripcionalmente regulados tanto por NF-kB como STAT3 (Yu et al., 2007).

Ademas de sus papeles directos en las celulas epiteliales cancerosas, NF-kB y STAT3 tambien tienen papeles importantes en otras celulas que se encuentran en el microambiente tumoral. Los experimentos en modelos animales han demostrado que NF-kB se requiere tanto en las celulas cancerosas como en las celulas hematopoyeticas para propagar los efectos de la inflamacion en la iniciacion y la progresion del cancer (Greten et al., 2004). La inhibicion de NF-kB en celulas cancerosas y mieloides reduce el numero y tamano, respectivamente, de los tumores resultantes. La activacion de STAT3 en celulas cancerosas resulta en la produccion de varias citoquinas (IL-6, IL-10), que suprimen la maduracion de las celulas dendnticas asociadas a tumores (DC). Ademas, STAT3 se activa por estas citoquinas en las propias celulas dendnticas. La inhibicion de STAT3 en modelos de raton de cancer restaura la maduracion de DC, promueve la inmunidad antitumoral, e inhibe el crecimiento tumoral (Kortylewski et al., 2005). En algunas realizaciones, el RTA 408 y sus formas polimorficas se pueden utilizar para tratar el cancer, incluyendo, por ejemplo, el cancer de prostata. En algunas realizaciones, el rTa 408 y sus formas polimorficas se pueden utilizar en una terapia de combinacion para tratar el cancer, incluyendo, por ejemplo, cancer de prostata. Vease, por ejemplo, el Ejemplo H a continuacion.

B. Esclerosis Multiple y Otras Afecciones Neurodegenerativas

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y los metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes para la esclerosis multiple (EM) u otras afecciones neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, o esclerosis lateral amiotrofica. La EM se sabe que es una

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afeccion inflamatoria del sistema nervioso central (Williams et al., 1994; Merrill y Benveniste, 1996; Genain y Nauser, 1997). Sobre la base de varias investigaciones, la evidencia sugiere que los mecanismos inflamatorios, oxidativos, y/o inmunes estan involucrados en la patogenesis de la enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Parkinson (PD), la esclerosis lateral amiotrofica (AlS), y EM (Bagasra et al., 1995; McGeer y McGeer, 1995; Simonian y Coyle, 1996; Kaltschmidt et al., 1997). Los datos epidemiologicos indican que el uso cronico de NSAID que bloquean la smtesis de prostaglandinas del araquidonato, disminuye notablemente el riesgo para el desarrollo de la AD (McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997). Por lo tanto, los agentes que bloquean la formacion de NO y prostaglandinas, se pueden utilizar en procedimientos para prevenir y tratar enfermedades neurodegenerativas. Los candidatos terapeuticos exitosos para el tratamiento de dicha enfermedad requieren tfpicamente una capacidad para penetrar la barrera hematoencefalica. Vease, por ejemplo, la Publicacion de Patente U.S. 2009/0060873.

C. Neuroinflamacion

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con neuroinflamacion. La neuroinflamacion encapsula la idea de que las respuestas y acciones microgliales y astrocfticas en el sistema nervioso central tienen un caracter de tipo fundamentalmente de inflamacion, y que estas respuestas son fundamentales para la patogenesis y la progresion de una amplia variedad de trastornos neurologicos. Estas ideas se han extendido de la enfermedad de Alzheimer a otras enfermedades neurodegenerativas (Eikelenboom et al., 2002; Ishizawa y Dickson, 2001), a las enfermedades isquemicas/toxicas (Gehrmann et al., 1995; Touzani et al., 1999), a la biologfa del tumor (Graeber et al., 2002) e incluso al desarrollo normal del cerebro. La neuroinflamacion incorpora un amplio espectro de respuestas celulares complejas que incluyen la activacion de la microglia y astrocitos y la induccion de citoquinas, quimioquinas, protemas del complemento, protemas de fase aguda, dano oxidativo y procesos moleculares relacionados, y los eventos pueden tener efectos perjudiciales sobre la funcion neuronal, conduciendo a la lesion neuronal, activacion glial adicional, y en ultima instancia la neurodegeneracion.

D. Enfermedades Renales

En algunas realizaciones, el RTA 408, asf como las formas polimorficas del mismo, se pueden utilizar para tratar pacientes con enfermedades y trastornos renales, incluyendo insuficiencia renal y enfermedad renal cronica (CKD), con base, por ejemplo, en los metodos ensenados por US 8.129.429. La insuficiencia renal, que resulta en el aclaramiento inadecuado de los productos de desecho metabolicos de la sangre y concentraciones de electrolitos anormales en la sangre, es un problema medico significativo en todo el mundo, especialmente en los pafses desarrollados. La diabetes y la hipertension estan entre las causas mas importantes de insuficiencia renal cronica, tambien conocida como enfermedad renal cronica (CKD), pero tambien se asocia con otras afecciones tal como lupus. La insuficiencia renal aguda puede surgir de la exposicion a ciertos farmacos (por ejemplo, acetaminofeno) o productos qmmicos toxicos, o de la lesion por reperfusion isquemica asociada con el choque o procedimientos quirurgicos como el trasplante, y puede resultar en insuficiencia renal cronica. En muchos pacientes, la insuficiencia renal avanza a una etapa en la que el paciente requiere dialisis regular o trasplante de rinon para seguir viviendo. Ambos procedimientos son altamente invasivos y asociados con efectos secundarios significativos y problemas en la calidad de vida. Aunque existen tratamientos efectivos para algunas complicaciones de la insuficiencia renal, tales como hiperparatiroidismo e hiperfosfatemia, ningun tratamiento disponible ha mostrado detener o revertir la progresion subyacente de la insuficiencia renal. Por lo tanto, los agentes que pueden mejorar la funcion renal alterada representanan un avance significativo en el tratamiento de la insuficiencia renal.

La inflamacion contribuye significativamente a la patologfa de la CKD. Tambien hay una fuerte relacion mecanicista entre el estres oxidativo y la disfuncion renal. La via de senalizacion de NF-kB juega un papel importante en la progresion de la CKD ya que NF-kB regula la transcripcion de MCP-1, una quimioquina que es responsable del reclutamiento de monocitos/macrofagos que resulta en una respuesta inflamatoria que en ultima instancia dana el rinon (Wardle, 2001). La via de Keap1/Nrf2/ARE controla la transcripcion de varios genes que codifican enzimas antioxidantes, incluyendo hemo oxigenasa-1 (HO-1). La ablacion del gen Nrf2 en ratones hembra resulta en el desarrollo de la nefritis glomerular similar al lupus (Yoh et al., 2001). Ademas, varios estudios han demostrado que la expresion de HO-1 es inducida en respuesta al dano renal y la inflamacion y que esta enzima y sus productos - bilirrubina y monoxido de carbono -juegan un papel protector en el rinon (Nath et al., 2006).

La lesion renal aguda (AKI) puede ocurrir despues de la reperfusion isquemica, el tratamiento con ciertos agentes farmacologicos, tales como cisplatino y rapamicina, y la inyeccion intravenosa de medios de contraste radiologicos utilizados en la formacion de imagenes medicas. Como en la CKD, la inflamacion y estres oxidativo contribuyen a la patologfa de la AKI. Los mecanismos moleculares que fundamentan la nefropatfa inducida por contraste radiologico (RCN) no se entienden bien; sin embargo, es probable que una combinacion de eventos, incluyendo la vasoconstriccion prolongada, autorregulacion del rinon alterada, y la toxicidad directa de los medios de contraste todos contribuyan a la insuficiencia renal (Tumlin et al., 2006). La vasoconstriccion resulta en el flujo sangumeo renal disminuido y causa reperfusion isquemica y la produccion de especies reactivas de oxfgeno. La HO-1 es fuertemente inducida en estas afecciones y se ha demostrado que previene la lesion por reperfusion isquemica en varios organos diferentes, incluyendo el rinon (Nath et al., 2006). Espedficamente, la induccion de HO-1 se ha mostrado que es protectora en un modelo de rata de RCN (Goodman et al., 2007). La reperfusion tambien induce una respuesta inflamatoria, en parte, a traves de la activacion de la senalizacion de NF-kB (Nichols, 2004). La toma

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como diana de NF-kB se ha propuesto como una estrategia terapeutica para prevenir el dano de organos (Zingarelli et al., 2003).

E. Enfermedad Cardiovascular

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con enfermedad cardiovascular. La etiologfa de la enfermedad CV es compleja, pero la mayona de las causas estan relacionadas con el suministro inadecuado o completamente interrumpido de sangre a un organo o tejido cntico. Frecuentemente, tal afeccion surge de la ruptura de uno o mas placas ateroscleroticas, lo que conduce a la formacion de un trombo que bloquea el flujo de sangre en un vaso cntico.

En algunas incidencias, la aterosclerosis puede ser tan extensa en los vasos sangumeos cnticos que se desarrolla estenosis (estrechamiento de las arterias) y el flujo sangumeo a organos cnticos (incluyendo el corazon) es cronicamente insuficiente. Tal isquemia cronica puede conducir a dano de organos de muchos tipos, incluyendo la hipertrofia cardiaca asociada con la insuficiencia cardfaca congestiva.

La aterosclerosis, el defecto subyacente que conduce a muchas formas de enfermedad cardiovascular, se produce cuando un defecto ffsico o lesion en el revestimiento (endotelio) de una arteria desencadena una respuesta inflamatoria que implica la proliferacion de celulas vasculares del musculo liso y la infiltracion de leucocitos en el area afectada. En ultima instancia, puede formarse una lesion complicada conocida como una placa aterosclerotica, compuesta por las celulas mencionadas anteriormente combinadas con los depositos de lipoprotemas que portan colesterol y otros materiales (por ejemplo, Hansson et al., 2006). A pesar de los beneficios significativos ofrecidos por los tratamientos terapeuticos actuales, la mortalidad por enfermedad cardiovascular sigue siendo alta y permanece una necesidad insatisfecha significativa en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares.

La induccion de HO-1 ha mostrado ser beneficiosa en una variedad de modelos de enfermedad cardiovascular, y bajos niveles de expresion de HO-1 se han correlacionado clmicamente con riesgo elevado de enfermedad CV. El RTA 408, las formas polimorficas y metodos de la invencion, por lo tanto, se pueden utilizar en el tratamiento o la prevencion de una variedad de trastornos cardiovasculares, incluyendo, pero no limitado a, la aterosclerosis, hipertension, infarto de miocardio, insuficiencia caroffaca cronica, apoplejfa, hemorragia subaracnoidea, y restenosis. En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas y metodos de la invencion se pueden utilizar como terapia de combinacion con otras terapias cardiovasculares conocidas, tales como, pero no limitado a anticoagulantes, tromboffticos, estreptoquinasa, activadores de plasminogeno de tejido, cirugfa, injerto de derivacion de arteria coronaria, angioplastia con balon, el uso de endoprotesis vascular, farmacos que inhiben la proliferacion celular, o farmacos que disminuyen los niveles de colesterol.

F. Diabetes

En algunas realizaciones, el RTA 408, asf como las formas polimorficas del mismo, se pueden utilizar para tratar pacientes con diabetes, con base, por ejemplo, en los metodos ensenados por US 8.129.429. La diabetes es una enfermedad compleja caracterizada por la insuficiencia del cuerpo para regular los niveles circulantes de glucosa. Esta insuficiencia puede ser el resultado de una ausencia de insulina, una hormona pepffdica que regula tanto la produccion como la absorcion de la glucosa en diversos tejidos. La insulina deficiente compromete la capacidad de los musculos, grasa y otros tejidos para absorber la glucosa adecuadamente, lo que conduce a la hiperglucemia (niveles anormalmente altos de glucosa en la sangre). Mas comunmente, tal deficiencia de insulina resulta de la produccion inadecuada de las celulas de islotes del pancreas. En la mayona de los casos esto surge de la destruccion autoinmune de estas celulas, una afeccion conocida como diabetes de inicio juvenil o tipo 1, pero tambien puede ser debido a un traumatismo ffsico o alguna otra causa.

La diabetes tambien puede surgir cuando las celulas de musculos y grasa se vuelven menos sensibles a la insulina y no absorben la glucosa adecuadamente, dando lugar a la hiperglucemia. Este fenomeno se conoce como resistencia a la insulina, y la afeccion resultante se conoce como diabetes tipo 2. La diabetes tipo 2, el tipo mas comun, esta muy asociada con la obesidad y la hipertension. La obesidad esta asociada con un estado inflamatorio del tejido adiposo que se cree que desempena un papel importante en el desarrollo de la resistencia a la insulina (por ejemplo, Hotamisligil, 2006; Guilherme et al., 2008).

La diabetes esta asociada con el dano a muchos tejidos, en gran parte porque la hiperglucemia (y la hipoglucemia, que puede resultar de dosis excesivas o mal sincronizadas de insulina) es una fuente importante de estres oxidativo. Debido a su capacidad para proteger contra el estres oxidativo, en particular por la induccion de la expresion de HO- 1, el RTA 408, las formas polimorficas, y los metodos de la presente invencion se pueden utilizar en tratamientos para muchas complicaciones de la diabetes. Como se senalo anteriormente (Cai et al., 2005), la inflamacion cronica y estres oxidativo en el fffgado son sospechosos de ser factores contribuyentes principales en el desarrollo de la diabetes tipo 2. Ademas, los agonistas de PPARy tales como tiazolidindionas son capaces de reducir la resistencia a la insulina y son conocidos por ser tratamientos efectivos para la diabetes tipo 2. En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y los metodos de la presente invencion se pueden utilizar como terapias de combinacion con agonistas de PPARy tales como tiazolidindionas.

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G. Artritis

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con una forma de artritis. En algunas realizaciones, las formas de artritis que podnan ser tratadas con RTA 408 y las formas polimorficas de esta invencion son la artritis reumatoide (RA), artritis psoriasica (PsA), espondiloartropatfas (SpAs), incluyendo espondilitis anquilosante (AS), artritis reactiva (ReA), y artritis enteropatica (EA), la artritis reumatoide juvenil (JRA), y artritis inflamatoria temprana.

Para la artritis reumatoide, los primeros signos aparecen tipicamente en la capa de revestimiento sinovial, con la proliferacion de los fibroblastos sinoviales y su union a la superficie articular en el margen de articulacion (Lipsky, 1998). Posteriormente, los macrofagos, celulas T y otras celulas inflamatorias son reclutadas en la articulacion, donde producen un numero de mediadores, incluyendo las citoquinas interleuquina-1 (IL-1), que contribuye a las secuelas cronicas que conducen a la destruccion del cartflago y huesos, y factor de necrosis tumoral (TNF-a), que desempena un papel en la inflamacion (Dinarello, 1998; Arend y Dayer, 1995; van den Berg, 2001). La concentracion de IL-1 en plasma es significativamente mayor en pacientes con RA que en individuos sanos y, en particular, los niveles de IL-1 en plasma se correlacionan con la actividad de la enfermedad RA (Eastgate et al., 1988). Por otra parte, los niveles de fluido sinovial de IL-1 se correlacionan con diferentes caractensticas radiograficas e histologicas de RA (Kahle et al., 1992; Rooney et al., 1990).

Otras formas de artritis incluyen la artritis psoriasica (PsA), que es una artropatfa inflamatoria cronica caracterizada por la asociacion de la artritis y psoriasis. Los estudios han revelado que la PsA comparte una serie de caractensticas geneticas, patogenicas y clrnicas con otras espondiloartropatfas (SpAs), un grupo de enfermedades que comprenden la espondilitis anquilosante, artritis reactiva y artritis enteropatica (Wright, 1979). La nocion de que la PsA pertenece al grupo de SpA ha ganado recientemente un mayor apoyo a partir de los estudios de formacion de imagenes que demuestran la entesitis generalizada en la PsA pero no rA (McGonagle et al., 1999; McGonagle et al., 1998). Mas espedficamente, la entesitis se ha postulado como uno de los primeros eventos que ocurren en las SpAs, conduciendo a la remodelacion osea y anquilosis de la columna vertebral, asf como a la sinovitis articular cuando las entesis inflamadas estan cerca de las articulaciones perifericas. Las cantidades incrementadas de TNF-a se han reportado tanto en la piel psoriasica (Ettehadi et al., 1994) como en el lfquido sinovial (Partsch et al., 1997). Los ensayos recientes han mostrado un beneficio positivo del tratamiento anti-TNF tanto en PsA (Mease et al., 2000) como en la espondilitis anquilosante (Brandt et al., 2000).

La artritis reumatoide juvenil (JRA), un termino para la forma mas frecuente de la artritis en los ninos, se aplica a una familia de enfermedades caracterizadas por inflamacion cronica y la hipertrofia de las membranas sinoviales. El termino se superpone, pero no es totalmente sinonimo, con la familia de enfermedades referidas como artritis juvenil cronica y/o artritis idiopatica juvenil en Europa.

La JRA poliarticular es un subtipo clmico distinto caracterizado por la inflamacion y la proliferacion sinovial en multiples articulaciones (cuatro o mas), incluyendo las articulaciones pequenas de las manos (Jarvis, 2002). Este subtipo de JRA puede ser grave, debido tanto a su implicacion en multiples articulaciones como a su capacidad para avanzar rapidamente con el tiempo. Aunque clmicamente distinta, la JRA poliarticular no es homogenea, y los pacientes vanan en las manifestaciones de la enfermedad, la edad de comienzo, pronostico y respuesta terapeutica. Estas diferencias muy probablemente reflejan un espectro de variacion en la naturaleza del ataque inmune e inflamatorio que puede ocurrir en esta enfermedad (Jarvis, 1998).

La espondilitis anquilosante (AS) es un subconjunto de la enfermedad dentro de una clasificacion mas amplia de la enfermedad de espondiloartropatfa. Los pacientes afectados con los distintos subconjuntos de espondiloartropatfa tienen etiologfas de enfermedades que son a menudo muy diferentes, que vanan de infecciones bacterianas a la herencia. Sin embargo, en todos los subgrupos, el resultado final del proceso de la enfermedad es la artritis axial.

La AS es un trastorno reumatico inflamatorio sistemico cronico del esqueleto axial con o sin manifestaciones extraesqueleticas. Las articulaciones sacroilfacas y la columna vertebral estan afectadas principalmente, pero las articulaciones de la cadera y hombro, y menos comunmente las articulaciones perifericas o ciertas estructuras extra- articulares tal como el ojo, vasculatura, sistema nervioso y aparato gastrointestinal tambien pueden estar implicadas. La etiologfa de la enfermedad aun no se entiende completamente (Wordsworth, 1995; Calin y Taurog, 1998). La etiologfa esta fuertemente asociada con el alelo HLA-B27 de histocompatibilidad mayor clase I (MHC I) (Calin y Taurog, 1998). La AS afecta a los individuos en la flor de su vida y se teme debido a su potencial para causar dolor cronico y dano irreversible de los tendones, ligamentos, articulaciones y huesos (Brewerton et al., 1973a; Brewerton et al., 1973b; Schlosstein et al., 1973).

H. Colitis Ulcerativa

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con colitis ulcerativa. La colitis ulcerativa es una enfermedad que causa inflamacion y llagas, llamadas ulceras, en el revestimiento del intestino grueso. La inflamacion ocurre normalmente en el recto y la parte inferior del colon, pero puede afectar a todo el colon. La colitis ulcerativa tambien se puede llamar colitis o proctitis. La inflamacion hace que el colon se vacfe con frecuencia, causando diarrea. Las ulceras se forman en lugares

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donde la inflamacion ha matado a las celulas que recubren el colon y las ulceras sangran y producen pus.

La colitis ulcerativa es una enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), el nombre general para enfermedades que causan inflamacion en el intestino delgado y el colon. La colitis ulcerativa puede ser diffcil de diagnosticar porque sus smtomas son similares a otros trastornos intestinales y a otro tipo de IBD, enfermedad de Crohn. La enfermedad de Crohn difiere de la colitis ulcerativa debido a que causa inflamacion mas profunda dentro de la pared intestinal. Ademas, la enfermedad de Crohn por lo general ocurre en el intestino delgado, aunque la enfermedad tambien puede ocurrir en la boca, esofago, estomago, duodeno, intestino grueso, apendice, y ano.

I. Enfermedad de Crohn

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con enfermedad de Crohn. Los smtomas de la enfermedad de Crohn incluyen inflamacion intestinal y el desarrollo de estenosis intestinal y fistulas; la neuropatfa a menudo acompana a estos smtomas. Los medicamentos anti-inflamatorios, tales como 5-aminosalicilatos (por ejemplo, mesalamina) o corticosteroides, generalmente se prescriben, pero no siempre son eficaces (revisado en Botoman et al., 1998). La inmunosupresion con ciclosporina a veces es beneficiosa para los pacientes resistentes o intolerantes a los corticosteroides (Brynskov et al., 1989).

En casos activos de la enfermedad de Crohn, se secretan concentraciones elevadas de TNF-a e IL-6 en la circulacion sangumea, y se producen TNF-a, IL-1, IL-6 e IL-8 en exceso localmente por las celulas de la mucosa (id.; Funakoshi et al., 1998). Estas citoquinas pueden tener efectos de largo alcance en los sistemas fisiologicos, incluyendo el desarrollo oseo, hematopoyesis, y funcion hepatica, de tiroides y neuropsiquiatrica. Ademas, un desequilibrio de la relacion de IL-1p/IL-1ra, a favor de IL-1 p pro-inflamatoria, se ha observado en pacientes con enfermedad de Crohn (Rogler y Andus, 1998; Saiki et al., 1998; Dionne et al., 1998, pero vease Kuboyama, 1998).

Los tratamientos que se han propuesto para la enfermedad de Crohn incluyen el uso de varios antagonistas de citoquinas (por ejemplo, IL-1 ra), inhibidores (por ejemplo, de la enzima conversora de IL-lp y antioxidantes) y anticuerpos anti-citoquinas (Rogler y Andus, 1998; van Hogezand y Verspaget, 1998; Reimund et al., 1998; Lugering et al., 1998; McAlindon et al., 1998). En particular, los anticuerpos monoclonales frente a TNF-a se han intentado con cierto exito en el tratamiento de la enfermedad de Crohn (Targan et al., 1997; Stack et al., 1997; van Dullemen et al., 1995). Estos compuestos se pueden utilizar en terapia de combinacion con RTA 408, las formas polimorficas, y los metodos de la presente descripcion.

J. Lupus Eritematoso Sistemico

En algunas realizaciones, El RTA 408, las formas polimorficas y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con SLE. El lupus eritematoso sistemico (SLE) es una enfermedad reumatica autoinmune caracterizada por la deposicion en tejidos de autoanticuerpos y complejos inmunes que conducen a la lesion de tejido (Kotzin, 1996). A diferencia de las enfermedades autoinmunes, tal como la EM y diabetes mellitus tipo 1, el sLe potencialmente involucra multiples sistemas de organos directamente, y sus manifestaciones clmicas son diversas y variables (revisado por Kotzin y O'Dell, 1995). Por ejemplo, algunos pacientes pueden demostrar principalmente erupciones en la piel y dolor en las articulaciones, mostrar remisiones espontaneas, y requerir poca medicacion. En el otro extremo del espectro estan los pacientes que demuestran involucramiento renal severo y progresivo que requiere terapia con altas dosis de esteroides y farmacos citotoxicos tal como ciclofosfamida (Kotzin, 1996).

Uno de los anticuerpos producidos por SLE, IgG anti-ADNds, desempena un papel importante en el desarrollo de glomerulonefritis lupica (GN) (Hahn y Tsao, 1993; Ohnishi et al., 1994). La glomerulonefritis es una afeccion seria en la cual las paredes de capilares de los glomerulos de purificacion de la sangre de los rinones se vuelven gruesas por acumulaciones en el lado epitelial de las membranas basales glomerulares. La enfermedad a menudo es cronica y progresiva y puede conducir a insuficiencia renal eventual.

K. Smdrome del Intestino Irritable

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con smdrome de intestino irritable (IBS). El IBS es un trastorno funcional caracterizado por dolor abdominal y habitos intestinales alterados. Este smdrome puede comenzar en la edad adulta joven y puede estar asociado con una discapacidad significativa. Este smdrome no es un trastorno homogeneo. Mas bien, los subtipos de IBS se han descrito sobre la base de smtomas predominantes - diarrea, estrenimiento, o dolor. En la ausencia de smtomas de “alarma”, tal como fiebre, perdida de peso y sangrado gastrointestinal, es necesario un estudio diagnostico limitado.

Cada vez mas, la evidencia de los ongenes de IBS sugiere una relacion entre la enteritis infecciosa y el desarrollo subsecuente de IBS. Las citoquinas inflamatorias pueden desempenar un papel. En una encuesta de pacientes con un historial de gastroenteritis bacteriana confirmada (Neal et al., 1997), el 25% reporto alteracion persistente de los habitos intestinales. La persistencia de los smtomas puede ser debido a estres psicologico en el momento de la infeccion aguda (Gwee et al., 1999).

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Los datos recientes sugieren que el sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado tambien puede tener un papel en los smtomas del IBS. En un estudio (Pimentel et al., 2000), 157 (78%) de 202 pacientes con IBS referidos para las pruebas de aliento de hidrogeno tuvieron hallazgos de las pruebas que fueron positivos para el sobrecrecimiento bacteriano. De los 47 sujetos que teman pruebas de seguimiento, 25 (53%) reportaron mejora de los smtomas (es decir, dolor abdominal y diarrea) con el tratamiento con antibioticos.

L. Smdrome de Sjogren

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con smdrome de Sjogren. El smdrome de Sjogren primario (SS) es una enfermedad autoinmune sistemica lentamente progresiva, cronica, que afecta predominantemente a las mujeres de mediana edad (relacion de mujer a hombre 9:1), aunque se puede ver en todas las edades incluyendo la infancia (Jonsson et al., 2002). La enfermedad se caracteriza por la infiltracion linfocftica y la destruccion de las glandulas exocrinas, que estan infiltradas con celulas mononucleares, incluyendo linfocitos linfocitos CD4+, CD8+ y celulas B (Jonsson et al., 2002). Ademas, las manifestaciones extraglandulares (sistemicas) se observan en un tercio de los pacientes (Jonsson et al., 2001).

En otras enfermedades autoinmunes sistemicas, tal como RA, se han identificado factores cnticos para centros germinales ectopicos (GC). Los tejidos sinoviales reumatoides con GC, se mostro que producen quimioquinas CXCL13, CCL21, y linfotoxina (LT)-p (detectadas en el centro folicular y celulas B de zona de manto). El analisis de regresion multivariada de estos analitos identifico CXCL13 y LT-p como las citoquinas solitarias que predicen GC en la sinovitis reumatoide (Weyand y Goronzy, 2003). Recientemente, se ha mostrado que CXCL13 y CXCR5 en las glandulas salivales juegan un papel esencial en el proceso inflamatorio reclutando celulas B y T, por lo tanto, contribuyendo a la neogenesis linfoide y la formacion Gc ectopica en SS (Salomonsson et al., 2002).

M. Psoriasis

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de esta invencion se pueden utilizar para tratar pacientes con psoriasis. La psoriasis es una enfermedad cronica de la piel de descamacion e inflamacion que afecta a 2 a 2,6 por ciento de la poblacion de Estados Unidos, o entre 5,8 y 7,5 millones de personas. La psoriasis ocurre cuando las celulas de la piel crecen rapidamente desde su origen por debajo de la superficie de la piel y se acumulan en la superficie antes de que tengan la oportunidad de madurar. Por lo general, este movimiento (tambien llamado recambio) tarda aproximadamente un mes, pero en la psoriasis el recambio puede ocurrir en solo unos pocos dfas. En su forma tfpica, la psoriasis resulta en parches de piel roja (inflamada) gruesa, cubiertos con escamas plateadas. Estos parches, que se refieren a veces como placas, generalmente pican o se sienten doloridas. Las placas ocurren con mayor frecuencia en los codos, rodillas, otras partes de las piernas, cuero cabelludo, espalda baja, cara, palmas, y plantas de los pies, pero pueden aparecer en la piel en cualquier parte del cuerpo. La enfermedad tambien puede afectar las unas de las manos, las unas de los pies, y los tejidos blandos de los genitales y dentro de la boca.

La psoriasis es un trastorno de la piel dirigido por el sistema inmune, que implica especialmente un tipo de globulo blanco llamado celula T. Normalmente, las celulas T ayudan a proteger al cuerpo frente a infeccion y enfermedad. En el caso de la psoriasis, las celulas T se ponen en accion por error y se vuelven tan activas que desencadenan otras respuestas inmunes, que conducen a la inflamacion y al recambio rapido de las celulas de la piel.

N. Enfermedades Infecciosas

En algunas realizaciones, el RTA 408, las formas polimorficas, y metodos de la presente descripcion pueden ser utiles en el tratamiento de enfermedades infecciosas, incluyendo infecciones virales y bacterianas. Como se senalo anteriormente, estas infecciones pueden estar asociadas con respuestas inflamatorias localizadas o sistemicas graves. Por ejemplo, la influenza puede causar inflamacion grave del pulmon y la infeccion bacteriana puede causar respuesta hiperinflamatoria sistemica, incluyendo la produccion excesiva de multiples citoquinas inflamatorias, que es el sello distintivo de la sepsis. Ademas, los compuestos de la invencion pueden ser utiles en la inhibicion directa de la replicacion de patogenos virales. Estudios anteriores han demostrado que los compuestos relacionados tal como CDDO pueden inhibir la replicacion del VIH en los macrofagos (Vazquez et al., 2005). Otros estudios han indicado que la inhibicion de la senalizacion de NF-kB puede inhibir la replicacion del virus de influenza, y que las prostaglandinas de ciclopentenona pueden inhibir la replicacion viral (por ejemplo, Mazur et al., 2007; Pica et al., 2000).

La presente invencion se refiere al tratamiento o prevencion de cada una de las enfermedades/trastornos/afecciones referidas anteriormente en la seccion IV utilizando el compuesto RTA 408 o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable, o una forma polimorfica de este compuesto (tal como, por ejemplo, una cualquiera de las formas polimorficas descritas en la presente antes o a continuacion), o una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de las entidades mencionadas anteriormente y un vehmulo farmaceuticamente aceptable (incluyendo, por ejemplo, las composiciones farmaceuticas descritas anteriormente).

V. Formulaciones Farmaceuticas y Rutas de Administracion

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El RTA 408 se puede administrar por una variedad de metodos, por ejemplo, por via oral o por inyeccion (por ejemplo, subcutanea, intravenosa, intraperitoneal, etc.). Dependiendo de la ruta de administracion, los compuestos activos se pueden revestir con un material para proteger el compuesto de la accion de acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. Tambien se pueden administrar por perfusion/infusion continua de una enfermedad o sitio de herida.

Para administrar el RTA 408 por una administracion diferente de la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivacion. Por ejemplo, el compuesto terapeutico se puede administrar a un paciente en un vetnculo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen disolucion salina y disoluciones tampones acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones de agua-en-aceite-en-agua CGF, asf como liposomas convencionales (Strejan et al., 1984).

El RTA 408 tambien se puede administrar por via parenteral, intraperitoneal, intraespinal, o intracerebral. Las dispersiones se pueden preparar en glicerol, polietilen glicoles lfquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las disoluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando RTA 408 en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto terapeutico en un vetnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado bajo vacfo y liofilizacion, que produce un polvo del ingrediente activo (es decir, el compuesto terapeutico) mas cualquier ingrediente deseado adicional de una disolucion previamente filtrada esteril del mismo.

El RTA 408 puede volverse totalmente amorfo utilizando un procedimiento de secado por pulverizacion directa. El RTA 408 se puede administrar por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehfculo comestible asimilable. El compuesto terapeutico y otros ingredientes tambien se pueden encerrar en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del paciente. Para la administracion terapeutica oral, el compuesto terapeutico se puede incorporar, por ejemplo, con excipientes y utilizarse en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, capsulas incluyendo capsulas duras o blandas, elfxires, emulsiones, dispersiones solidas, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. El porcentaje del compuesto terapeutico en las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse. La cantidad del compuesto terapeutico en tales composiciones terapeuticamente utiles es tal que se obtendra una dosificacion adecuada.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La forma unitaria de dosificacion como se utiliza en la presente se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los pacientes a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto terapeutico calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vetnculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas unitarias de dosificacion de la invencion esta dictada por y depende directamente de (a) las caractensticas unicas del compuesto terapeutico y el efecto terapeutico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de composicion de tal compuesto terapeutico para el tratamiento de una afeccion seleccionada en un paciente.

El RTA 408 tambien se puede administrar por via topica en la piel, ojos o mucosa. En algunas realizaciones, el compuesto se puede preparar en una locion, crema, gel, aceite, unguento, balsamo, disolucion, suspension, o emulsion. Alternativamente, si se desea el suministro local a los pulmones el compuesto terapeutico se puede administrar por inhalacion en una formulacion para aerosol o polvo seco.

El RTA 408 se administrara tfpicamente a una dosificacion terapeuticamente efectiva suficiente para tratar una afeccion asociada con un paciente dado. Por ejemplo, la eficacia de un compuesto puede ser evaluada en un sistema modelo animal que puede ser predictivo de la eficacia en el tratamiento de la enfermedad en los seres humanos, tales como los sistemas de modelos que se muestran en los ejemplos y figuras.

La cantidad de dosificacion real de RTA 408 o la composicion que comprende RTA 408 administrada a un paciente se puede determinar por factores ffsicos y fisiologicos, tales como la edad, sexo, peso corporal, severidad de la afeccion, tipo de enfermedad a tratar, intervenciones terapeuticas previas o simultaneas, idiopatfa del paciente, y la ruta de administracion. Estos factores se pueden determinar por un experto en la materia. El medico responsable de la administracion determinara tfpicamente la concentracion de ingrediente(s) activo(s) en una composicion y dosi(s) apropiada(s) para el paciente individual. La dosificacion se puede ajustar por el medico individual en el caso de cualquier complicacion.

Una cantidad efectiva variara tfpicamente desde aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 1.000 mg/kg,

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desde aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 750 mg/kg, desde aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, desde aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg, desde aproximadamente 10,0 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg en una o mas administraciones de dosis diarias, durante uno o varios dfas (dependiendo por supuesto del modo de administracion y los factores discutidos mas arriba). Otros intervalos de dosis adecuados incluyen 1 mg a 10.000 mg al dfa, 100 mg a 10.000 mg al dfa, 500 mg a 10.000 mg al dfa, y 500 mg a 1.000 mg al dfa. En algunas realizaciones particulares, la cantidad es menor de 10.000 mg al dfa con un intervalo de 750 mg a 9.000 mg al dfa.

La cantidad efectiva puede ser menos de 1 mg/kg/dfa, menos de 500 mg/kgMa, menos de 250 mg/kgMa, menos de 100 mg/kgMa, menos de 50 mg/kgMa, menos de 25 mg/kgMa, o menos de 10 mg/kgMa. Alternativamente, puede estar en el intervalo de 1 mg/kgMa a 200 mg/kgMa. En algunas realizaciones, la cantidad podna ser 10, 30, 100, o 150 mg/kg formulada como una suspension en aceite de sesamo como se describe a continuacion en el Ejemplo C1. En algunas realizaciones, la cantidad podna ser 3, 10, 30 o 100 mg/kg administrada diariamente a traves de una sonda oral como se describe a continuacion en los Ejemplos C2 y C3. En algunas realizaciones, la cantidad podna ser 10, 30, o 100 mg/kg administrada por via oral como se describe a continuacion en el Ejemplo C6. Por ejemplo, con respecto al tratamiento de pacientes diabeticos, la dosificacion unitaria puede ser una cantidad que reduce la glucosa en sangre al menos un 40% en comparacion con un paciente no tratado. En otra realizacion, la dosificacion unitaria es una cantidad que reduce la glucosa en sangre hasta un nivel que es de ± 10% del nivel de glucosa en la sangre de un paciente no diabetico.

En otros ejemplos no limitantes, una dosis tambien puede comprender desde aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal,

aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal peso, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal,

aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, hasta aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal o mas por administracion, y cualquier intervalo derivable de estos. En los ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los numeros listados en la presente, un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, etc., se puede administrar, con base en los numeros descritos anteriormente.

En ciertas realizaciones, una composicion farmaceutica de la presente descripcion puede comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,01% de RTA 408. En otras realizaciones, el RTA 408 puede comprender entre aproximadamente 0,01% a aproximadamente 75% del peso de la unidad, o entre aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable de estos. En algunas realizaciones, el RTA 408 se puede utilizar en una formulacion tal como una suspension en aceite de sesamo de 0,01%, 0,1%, o 1% como se describe a continuacion en los Ejemplos F y G. En algunas realizaciones, el RTA 408 se puede formular para la administracion topica en la piel u ojos, utilizando un vefuculo farmaceuticamente adecuado, o como una suspension, emulsion o disolucion en concentraciones que vanan desde aproximadamente 0,01% a 10%. En algunas realizaciones, la concentracion vana desde aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%. La concentracion optima puede variar dependiendo del organo diana, la preparacion espedfica, y la afeccion a tratar.

Se contemplan dosis unicas o multiples del agente que comprenden el RTA 408. Los intervalos de tiempo deseados para el suministro de multiples dosis se pueden determinar por un experto en la tecnica que emplea no mas que experimentacion de rutina. Como un ejemplo, se pueden administrar a los pacientes dos dosis diarias a intervalos de aproximadamente 12 horas. En algunas realizaciones, el agente se administra una vez al dfa. El o los agentes se pueden administrar en un programa de rutina. Como se utiliza en la presente, un programa de rutina se refiere a un penodo de tiempo designado predeterminado. El programa de rutina puede abarcar penodos de tiempo que son identicos o que difieren en longitud, siempre y cuando el programa sea predeterminado. Por ejemplo, el programa de rutina puede implicar la administracion dos veces al dfa, cada dfa, cada dos dfas, cada tres dfas, cada cuatro dfas, cada cinco dfas, cada seis dfas, semanalmente, mensualmente, o cualquier conjunto de numeros de dfas o semanas entre estos. Alternativamente, el programa de rutina predeterminado puede implicar la administracion sobre una base de dos veces al dfa durante la primera semana, seguida por una base diaria durante varios meses, etc. En otras realizaciones, la invencion provee que el o los agentes se pueden tomar por via oral y que la sincronizacion de estos depende o no de la ingesta de alimentos. Asf, por ejemplo, el agente se puede tomar cada manana y/o todas las noches, independientemente del momento en que el paciente haya comido o vaya a comer.

VI. Terapia de Combinacion

Ademas de ser utilizado como monoterapia, el RTA 408 y las formas polimorficas descritas en la presente invencion tambien pueden encontrar uso en terapias de combinacion. La terapia de combinacion efectiva se puede lograr con una composicion o formulacion farmacologica unica que incluye ambos agentes, o con dos composiciones o formulaciones distintas, administradas al mismo tiempo, en donde una composicion incluye RTA 408 o sus formas polimorficas, y la otra incluye el segundo o segundos agentes. La otra modalidad terapeutica se puede administrar antes de, simultaneamente con, o despues de la administracion de RTA 408 o sus formas polimorficas. La terapia

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utilizando RTA 408 o sus formas polimorficas puede preceder o seguir a la administracion del otro u otros agentes por intervalos que vanan de minutos a semanas. En realizaciones donde el otro agente y RTA 408 o sus formas polimorficas se administran por separado, uno en general asegurana que un penodo de tiempo significativo no expira entre el momento de cada suministro, de tal manera que cada agente todavfa sena capaz de ejercer un efecto ventajosamente combinado. En tales casos, se contempla que uno tfpicamente administrana el RTA 408 o las formas polimorficas y el otro agente terapeutico dentro de aproximadamente 12-24 horas uno del otro y, mas preferiblemente, dentro de aproximadamente 6-12 horas uno del otro, siendo el mas preferido un retraso de tiempo de solo aproximadamente 12 horas. En algunas situaciones, puede ser deseable extender el penodo de tiempo para el tratamiento significativamente, sin embargo, donde varios dfas (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) transcurren entre las administraciones respectivas.

Tambien es concebible que se deseara mas de una administracion de RTA 408 o sus formas polimorficas, o el otro agente. A este respecto, se pueden emplear varias combinaciones. A modo de ilustracion, donde el RTA 408 o sus formas polimorficas es “A” y el otro agente es “B”, las siguientes permutaciones basadas en 3 y 4 administraciones totales son ejemplares:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

Otras combinaciones se contemplan igualmente. Los ejemplos no limitantes de agentes farmacologicos que se pueden utilizar en la presente invencion incluyen cualquier agente farmacologico conocido por ser de beneficio en el tratamiento de un cancer. En algunas realizaciones, se contemplan combinaciones de RTA 408 o sus formas polimorficas con una inmunoterapia dirigida a un cancer, terapia genica, radioterapia, agente quimioterapeutico, o cirugfa. Tambien se contempla una combinacion de RTA 408 o sus formas polimorficas con mas de uno de los metodos mencionados anteriormente que incluyen mas de un tipo de una terapia espedfica. En algunas realizaciones, la inmunoterapia puede ser otros anticuerpos dirigidos al cancer tales como, pero no limitados a, trastuzumab (Herceptin®), alemtuzumab (Campath®), bevacizumab (Avastin®), cetuximab (Eribitux®), y panitumumab (Vectibix®) o anticuerpos conjugados tales como ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), tositumomab (Bexxar®), brentuximab vedotin (Adcetris®), ado-trastuzumab emtansina (Kadcyla™), o denileuquina dititox (ONTAK®). Ademas, en algunas realizaciones, el RTA 408 o sus formas polimorficas se contemplan para ser utilizados en terapias de combinacion con inmunoterapias basadas en celulas dendnticas, tal como Sipuleucel-T (Provenge®) o inmunoterapias de celulas T adoptivas.

Ademas, se contempla que el RTA 408 o sus formas polimorficas se utilicen en combinacion con un agente quimioterapeutico tal como, pero no limitado a, antraciclinas, taxanos, metotrexato, mitoxantrona, estramustina, doxorrubicina, etoposido, vinblastina, carboplatino, vinorrelbina, 5-fluorouracilo, cisplatino, topotecan, ifosfamida, ciclofosfamida, epirrubicina, gemcitabina, vinorrelbina, irinotecan, etoposido, vinblastina, pemetrexed, melfalan, capecitabina y oxaliplatino. En algunas realizaciones, el RTA 408 o sus formas polimorficas se utilizan en combinacion con terapia de radiacion incluyendo, pero no limitado a, el uso de radiacion ionizante. En algunas realizaciones, los efectos del agente terapeutico del cancer se potencian sinergicamente traves de la administracion con RTA 408 y sus formas polimorficas. En algunas realizaciones, las terapias de combinacion las cuales incluyen RTA 408 se utilizan para tratar el cancer, incluyendo, por ejemplo, cancer de prostata. Vease, por ejemplo, Ejemplo H a continuacion.

En algunas realizaciones, los metodos pueden comprender ademas (1) poner en contacto una celula de tumor con el compuesto antes de poner en contacto la celula de tumor con el segundo agente quimioterapeutico, (2) poner en contacto una celula de tumor con el segundo agente quimioterapeutico antes de poner en contacto la celula de tumor con el compuesto, o (3) poner en contacto una celula de tumor con el compuesto y el segundo agente quimioterapeutico al mismo tiempo. El segundo agente quimioterapeutico puede, en ciertas realizaciones, ser un antibiotico, antiinflamatorio, anti-neoplasico, anti-proliferativo, anti-viral, inmunomodulador o inmunosupresor. En otras realizaciones, el segundo agente quimioterapeutico puede ser un agente alquilante, modulador del receptor de androgenos, disruptor de citoesqueleto, modulador del receptor de estrogenos, inhibidor de histona-desacetilasa, inhibidor de HMG-CoA reductasa, inhibidor de protema prenil transferasa, modulador del receptor de retinoide, inhibidor de topoisomerasa, o inhibidor de tirosina quinasa. En ciertas realizaciones, el segundo agente quimioterapeutico es 5-azacitidina, 5-fluorouracilo, acido 9-cis-retinoico, actinomicina D, alitretinoma, acido todo- trans-retinoico, anamicina, axitinib, belinostat, bevacizumab, bexaroteno, bosutinib, busulfan, capecitabina, carboplatino, carmustina, CD437, cediranib, cetuximab, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dasatinib, daunorrubicina, decitabina, docetaxel, dolastatina-10, doxifluridina, doxorrubicina,

doxorrubicina, epirrubicina, erlotinib, etoposido, gefitinib, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina,

hexametilmelamina, idarrubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecan, isotretinoma, ixabepilona, lapatinib, LBH589, lomustina, mecloretamina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, MS-275, neratinib, nilotinib, nitrosourea, oxaliplatino, paclitaxel, plicamicina, procarbazina, semaxanib, semustina, butirato de sodio, fenilacetato de sodio, estreptozotocina, acido suberoilanilida hidroxamico, sunitinib, tamoxifeno, teniposido, tiopeta, tioguanina, topotecan, TRAIL, trastuzumab, tretinoma, tricostatina A, acido valproico, valrrubicina, vandetanib,

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vinblastina, vincristina, vindesina, o vinorrelbina.

Adicionalmente, se contemplan las terapias de combinacion para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular utilizando RTA 408, formas polimorficas, y composiciones farmaceuticas de la presente descripcion. Por ejemplo, tales metodos pueden comprender ademas administrar una cantidad farmaceuticamente efectiva de uno o mas farmacos cardiovasculares, ademas de RTA 408, formas polimorficas, y composiciones farmaceuticas de la presente descripcion. El farmaco cardiovascular puede ser, pero no se limita a, por ejemplo, un farmaco para reducir el colesterol, un anti-hiperlipidemico, un bloqueador del canal de calcio, un anti-hipertensivo, o un inhibidor de la HMG- CoA reductasa. En algunas realizaciones, los ejemplos no limitantes de farmacos cardiovasculares incluyen amlodipina, aspirina, ezetimiba, felodipina, lacidipina, lercanidipina, nicardipina, nifedipina, nimodipina, nisoldipina o nitrendipina. En otras realizaciones, otros ejemplos no limitantes de farmacos cardiovasculares incluyen atenolol, bucindolol, carvedilol, clonidina, doxazosina, indoramina, labetalol, metildopa, metoprolol, nadolol, oxprenolol, fenoxibenzamina, fentolamina, pindolol, prazosin, propranolol, terazosin, timolol o tolazolina. En otras realizaciones, el farmaco cardiovascular puede ser, por ejemplo, una estatina, tales como atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina o simvastatina.

VII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invencion. Se debe apreciar por los expertos en la tecnica que las tecnicas descritas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la practica de la invencion, y por lo tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica deben, a la luz de la presente descripcion, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se describen y todavfa obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espmtu y alcance de la invencion.

A. Smtesis de RTA 408 (63415)

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Reactivos y condiciones: (a) (PhO)2PON3 (DPPA), Et3N, tolueno, 0°C durante 5 min, luego t.a. durante la noche, ~94%; (b) benceno, 80°C durante 2 h; (c) HCl, CH3CN, t.a. durante 1 h; (d) CH3CF2CO2H, DCC, DMAP, CH2Cl2, t.a. durante la noche, 73% de RTA 401 (4 etapas).

Compuesto 1: A una disolucion de tolueno (400 mL), se anadio RTA 401 (que se puede preparar de acuerdo con los metodos ensenados, por ejemplo, por Honda, et al., 1998; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Yates et al., 2007, y Patentes U.S. 6.326.507 y 6.974.801) (20,0 g, 40,6 mmoles) y Et3N (17,0 ml, 122,0 mmoles) en un reactor y se enfrio hasta 0°C con agitacion. Se anadio difenilfosforilazida (DPPA) (13,2 ml, 61,0 mmoles) con agitacion a 0°C durante 5 min y la mezcla se agito continuamente a temperatura ambiente durante la noche (la verificacion de HPLC-MS no muestra RTA 401 remanente). La mezcla de reaccion se cargo directamente en una columna de gel de sflice y se purifico por cromatograffa en columna (gel de sflice, 0% a 5% de EtOAc en CH2Ch) para producir el compuesto 1 (19,7 g, ~94%, parcialmente convertido en el compuesto 2) como una espuma blanca.

Compuesto 2: El compuesto 1 (19,7 g, ~38,1 mmoles) y benceno (250 mL) se anadieron a un reactor y se calentaron hasta 80°C con agitacion durante 2 h (la verificacion de HPLC-MS no muestra compuesto 1 remanente). La mezcla de reaccion se concentro a presion reducida para proporcionar el compuesto crudo 2 como un residuo solido, que se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion.

Compuesto 3: El compuesto crudo 2 (<38,1 mmoles) y CH3CN (200 mL) se anadieron a un reactor y se enfriaron

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hasta 0°C con agitacion. Se anadio HCl (12 N, 90 mL) a 0°C durante 1 min y la mezcla se agito continuamente a temperatura ambiente durante 1 h (la verificacion de HPLC-MS no muestra compuesto 2 remanente). La mezcla de reaccion se enfrio hasta 0°C y se anadio 10% de NaOH (~500 mL) con agitacion. Luego, se anadio NaHCO3 saturado (1 L) con agitacion. La fase acuosa se extrajo por EtOAc (2x500 mL). La fase organica combinada se lavo con H2O (200 mL), NaCl saturado (200 mL), se seco sobre Na2SO4, y se concentro para proporcionar el compuesto crudo 3 (16,62 g) como una espuma de color amarillo claro, que se utilizo para la siguiente etapa sin purificacion.

RTA 408: La amina cruda 3 (16,62 g, 35,9 mmoles), CH3CF2CO2H (4,7388 g, 43,1 mmoles), y CH2O2 (360 mL) se anadieron a un reactor con agitacion a temperatura ambiente. Luego, se anadieron diciclohexilcarbodiimida (DCC) (11,129 g, 53,9 mmoles) y 4-(dimetilamino)-piridina (DMAP) (1,65 g, 13,64 mmoles) y la mezcla se agito continuamente a temperatura ambiente durante la noche (la verificacion de HPLC-MS no muestra compuesto 3 remanente). La mezcla de reaccion se filtro para remover los subproductos solidos y el filtrado se cargo directamente en una columna de gel de silice y se purifico por cromatograffa en columna (gel de silice, 0% a 20% de EtOAc en hexanos) dos veces para producir el compuesto RTA 408 (16,347 g, 73% de RTA 401 en 4 etapas) como una espuma blanca: 1H RMN (400 MHz, CDaCl) 8 8,04 (s, 1H), 6,00 (s, 1H), 5,94 (s, br, 1H), 3,01 (d, 1H, J = 4,8 Hz), 2,75-2,82 (m, 1H), 1,92-2,18 (m, 4H), 1,69-1,85 (m, 7H), 1,53-1,64 (m, 1H), 1,60 (s, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,42 (s, 3H), 1,11-1,38 (m, 3H), 1,27 (s, 3H), 1,18 (s, 3H), 1,06 (s, 3H), 1,04 (s, 3H), 0,92 (s, 3H); m/z 555 (M+1).

B. Farmacodinamica

Un resumen de los estudios in vitro e in vivo para evaluar los efectos farmacodinamicos primarios de RTA 408 se proporciona a continuacion.

1. Efectos de RTA 408 en Keap1-Nrf2 y NF-kB in Vitro

La inhibicion de la produccion de NO inducida por IFNy por AIM es dependiente de Nrf2 (Dinkova-Kostova, 2005). Macrofagos de raton RAW264.7 se plaquearon en placas de 96 pocillos a 30.000 celulas/pocillo por triplicado en RPMI 1640 suplementado con 0,5% de FBS y se incubaron a 37°C con 5% de CO2. Al dfa siguiente, las celulas se pre-trataron con DMSO (vehfculo) o RTA 408 durante 2 h, seguido por tratamiento con 20 ng/ml de IFNy de raton durante 24 h. Los niveles de nitrito (NO2") en los medios se midieron como un sustituto para el oxido mtrico utilizando el sistema de reactivo de Griess (cat # G2930, Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, ya que el nitrito es un producto de degradacion estable primario de NO. La viabilidad celular se evaluo utilizando Reactivo de Proliferacion de Celulas WST-1 (cat # 11644807001, Roche Applied Science) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de CI50 se determinaron con base en la supresion de la produccion de oxido nftrico inducida por IFNy normalizada a la viabilidad celular. El tratamiento con RTA 408 dio como resultado una supresion dependiente de la dosis de produccion de NO inducida por IFNy, con un valor de CI50 promedio de 3,8 ± 1,2 nM. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la FIG. 1. El valor de CI50 para RTA 408 se encontro que es 45% -65% menor que los valores de CI50 para los compuestos 63170 (8 ± 3 nM), 63171 (6,9 ± 0,6 nM), 63179 (11 ± 2 nm), y 63189 (7 ± 2 nM). 63170, 63171, 63179 y 63189 son compuestos de las formulas:

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2. Efecto de RTA 408 en Genes Diana Nrf2

El RTA 408 se ensayo en dos ensayos informadores de luciferasa diferentes para evaluar la activacion de ARE. El primer informador de luciferasa ensayado estuvo bajo el control de un ARE unico derivado del promotor del gen humano NQO1, que permite la evaluacion cuantitativa de la actividad endogena del factor de transcripcion Nrf2 en celulas de mairnfero cultivadas. La expresion de luciferasa de luciernaga de plasmido informador de luciferasa NQO1-ARE se controla por la union de Nrf2 a una secuencia potenciadora espedfica correspondiente al elemento de respuesta antioxidante (ARE) que se identifico en la region promotora del gen humano de NADPH:quinona oxidorreductasa 1 (NQO1) (Xie et al., 1995). El plasmido informador de luciferasa NQO1-ARE se construyo insertando el NQO1-ARE humano (5'-CAGTcAcAgTgACTCAGCAGAATCTG-3') en el vector pLuc-MCS utilizando sitios de clonacion HindIII/XhoI (GenScript Corp, Piscataway, NJ). La lmea celular de hepatoma humano Huh-7, mantenida en DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% FBS y 100 U/mL (cada una) de penicilina y estreptomicina, se transfecto transitoriamente utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) con el plasmido informador de luciferasa NQO1-ARE y el plasmido pRL-TK, que expresa constitutivamente la luciferasa de Renilla y se utilizo como un control interno para la normalizacion de los niveles de transfeccion. A las treinta horas desde la transfeccion, las celulas se trataron con RTA 408 durante 18 h. La actividad de luciferasa de luciernaga y de Renilla se ensayo por ensayo de luciferasa Dual-Glo (cat # E2920, Promega), y la senal de luminiscencia se midio en un luminometro L-Max II (Molecular Devices). La actividad de luciferasa de luciernaga se normalizo a la actividad de Renilla, y se calculo las veces de induccion sobre un control de vehmulo (DMSO) de la actividad de luciernaga normalizada. Fig. 2a muestra una induccion dependiente de la dosis de la actividad de luciferasa por RTA 408 en esta lmea celular. Los valores representan el promedio de tres experimentos independientes. Se requirio un veinte por ciento menos de RTA 408 (12 nM) que de 63189 (14,9 nM) para aumentar la transcripcion de NQO1 ARE en celulas HuH-7 2 veces. De manera similar, se requirio 2,1-2,4 veces menos de RTA 408 que de 63170 (25,2 nM) y 63179 (29,1 nM), respectivamente, para aumentar la transcripcion de NQO1 ARE en celulas HuH-7 2 veces.

El efecto de RTA 408 en la activacion de informador de luciferasa tambien se evaluo en la lmea celular de informador AREc32. Esta lmea celular deriva de celulas MCF-7 de carcinoma de mama humano y se transfecta de forma estable con un gen informador de luciferasa de luciernaga bajo el control transcripcional de ocho copias de la secuencia GSTA2 ARE de rata (Wang, et al., 2006). Despues del tratamiento con RTA 408 durante 18 h, se midio la actividad de luciferasa de luciernaga utilizando el sistema de ensayo de luciferasa ONE-Glo (Promega, Catalogo # E6110) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se observo una respuesta dependiente de la dosis en la lmea celular de informador AREc32 (FIG. 2b). Una induccion de ~ 2 veces de actividad de luciferasa fue evidente despues del tratamiento con 15,6 nM RTA 408, tanto en el sistema de informador NQO1-ARE como GSTA2-ARE. Cuando se observan los resultados del estudio de actividad de luciferasa de GSTA2-ARE (AREc32), los efectos de 63415 (RTA 408) en la induccion de GSTA2-ARE se pueden comparar directamente con los de RTA 402, 63170, 63171,63179, y 63189, junto con los estudios de viabilidad de WST1 (FIGS. 3a-f). En comparacion con los valores de RTA 402, el 63415 mostro la induccion mas rapida de la transcripcion mediada por GSTA2-ARE de los cinco compuestos de comparacion con una concentracion de 93 nM necesaria para lograr la induccion de 4 veces en el ensayo de informador de luciferasa. Todos los otros compuestos mostraron una induccion similar solamente con concentraciones mucho mas altas con 63170 necesitando una concentracion de 171 nM, 63171 necesitando una concentracion de 133 nM, 63179 necesitando una concentracion de 303 nM y 63189 necesitando una concentracion de 174 nM para lograr una induccion de 4 veces de la actividad de luciferasa. Estos valores corresponden a un

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aumento de 1,86 (63415), 3,40 (63170), 2,65 (63171), 6,05 (63179) y 3,47 (63189) veces en la cantidad del compuesto activo necesaria en comparacion con RTA 402 para conducir a la misma cantidad de actividad.

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Tambien se ha mostrado que RTA 408 aumenta los niveles de transcrito de genes diana conocidos de Nrf2 en los fibroblastos de pulmon fetal humano HFL1 y lmeas celulares epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B. Las celulas HFL1 se cultivaron en medio F-12K suplementado con 10% suero bovino fetal y 1% penicilina-estreptomicina. Las celulas BEAS-2B se cultivaron en medio DMEM/F-12 suplementado con 10% suero bovino fetal y 1% penicilina- estreptomicina. Las celulas se plaquearon en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 105 celulas/pocillo. Al dfa siguiente, las celulas se trataron con DMSO (vehmulo) o RTA 408 (7,8, 15,6, 31,3, 62,5, o 125 nM) durante 18 h. Cada pocillo recibio la misma cantidad de vehmulo. Despues del tratamiento, el medio se retiro y las celulas se recogieron utilizando tampon RLT (Qiagen). Los lisados se homogeneizaron utilizando columnas QIAshredder (Qiagen, Catalogo # 79654) y el aRn se aislo utilizando kits RNeasy Mini (Qiagen, Catalogo # 74104). Para la transcripcion inversa, el ARN (1 |jg) se combino con cebador Oligo(dT)12-18 y H2O en un volumen final de 23,25 pL. La mezcla se calento hasta 70°C durante 10 min y luego se coloco en hielo. Una mezcla maestra que contiene 8 pL 5X tampon de 1era cadena, 2 pL de 1 mg/ml de BSA, 2 pL de 20 mM DTT, 4 jL de mezcla de 5 mM dNTP, 0,25 pL de RNaseOUT™ y 0,5 pL de transcriptasa inversa Superscript® II se anadieron a la mezcla de ARN y se incubaron a 42°C durante 1 h. La reaccion se inactivo por calentamiento hasta 70°C durante 10 min. La mezcla de reaccion se diluyo 1:3 con H2O antes de su uso en la qPCR. Se combinaron 2,5 pL de la reaccion de transcripcion inversa diluida con un conjunto de cebadores de PCR (0,36 pM de concentracion final), 2X iQTM SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, catalogo # 170-8885) y H2O a un volumen final de 20 pL. Las secuencias para los cebadores de PCR son las siguientes: Glutamato-cistefna ligasa, subunidad modificadora (GCLM), cebador directo 5'-

GCTGTGGCTACTGCGGTATT-3' (SEC ID NO: 1), cebador inverso 5'-ATCTGCCTCAATGACACCAT-3' (SEC ID NO: 2); Hemo oxigenasa-1 (HMOX1) cebador directo 5'-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3' (SEC ID NO: 3), cebador inverso 5'-TAGGCTCCTTCCTCCTTTCC-3' (SEC ID NO: 4); NAD(P)H deshidrogenasa, quinona 1 (NQO1) cebador directo 5'-AAAACACTGCCCTCTTGTGG-3' (SEC ID NO: 5), cebador inverso 5'-GTGCCAGTCAGCATCTGGTA-3' (SEC ID NO: 6); Proteina ribosomal S9 (RPS9) cebador directo 5'-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3' (SEC ID NO: 7), cebador inverso 5'-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3' (SEC ID NO: 8); Tiorredoxina reductasa 1 (TXNRD1) cebador directo 5'-ATTGCCACTGGTGAAAGACC-3' (SEC ID NO: 9), cebador inverso 5'- ACCAATTTTGTTGGCCATGT-3' (SEC ID NO: 10). Todos los cebadores previamente se han validado para la especificidad y eficiencia de amplificacion. El ADNc se amplifico utilizando las siguientes condiciones de ciclo: (95°C durante 3 min, 44 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 15 segundos, 72°C durante 15 segundos, seguido por una curva de fusion de 55°C a 95°C en incrementos de 0,5°C). La abundancia relativa de cada gen diana de Nrf2 se determino utilizando el metodo comparativo Ct (AACt). Las reacciones de PCR se realizaron en pocillos por triplicado para cada muestra. Dos experimentos independientes se realizaron utilizando las condiciones descritas anteriormente. El tratamiento de fibroblastos de pulmon HFL1 con RTA 408 durante 18 h resulto en un aumento de la expresion de varios genes diana de Nrf2, incluyendo NQO1, HMOX1, GCLM, y TXNRD1, como se mide por PCR cuantitativa (FIGS. 4a- d). Para todos los genes ensayados, la induccion por RTA 408 fue dependiente de la dosis y evidente a concentraciones tan bajas como 15,6 nM. El tratamiento de celulas epiteliales bronquiales BEAS-2B con RTA 408 durante 18 h dio como resultado un aumento dependiente de la dosis similar de todos los genes diana de Nrf2 evaluados (FIGS. 5a-d). El RTA 408 tambien aumento la expresion de los genes diana de Nrf2 en las celulas mesangiales humanas normales (nHMC), la lmea celular microglial BV2 de raton, y la lmea celular de neuroblastoma SH-SY5Y humano a concentraciones similares.

Los niveles de proteina de las dianas de Nrf2, NQO1 y HMOX1 se midieron en celulas SH-5Y5Y y BV-2 por transferencia Western despues del tratamiento con RTA 408. Las celulas SH-SY5Y se plaquearon en placas de 6 pocillos a una densidad de 4 x 105 celulas por pocillo. Las celulas BV-2 se plaquearon en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,5 x 104 celulas por pocillo. Veinticuatro (BV-2) o 48 (SH-SY5Y) h despues del plaqueo, las celulas se trataron con RTA 408 durante 24 horas. Despues del tratamiento, las celulas se lavaron dos veces con PBS frio y se recogieron en tampon de lisis. Las celulas se sometieron sonicacion y los residuos se aclararon por centrifugacion (10 min a 18.000 rcf, Beckman Coulter, centnfuga microfuge 18). La proteina total en el sobrenadante se cuantifico utilizando el reactivo de protemas Bio-Rad con BSA como estandar. Cantidades iguales de proteina celular total se separaron en SDS-PAGE, y las protemas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 h en TBST (1 x TBS con 0,1% Tween-20) que contema 5% leche, se lavaron 3 veces con TBST, y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C. El anticuerpo NQO1 fue de Abcam (#

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AB2346); el anticuerpo HMOX1 (HO-1) fue de Santa Cruz (#sc-10789); el anticuerpo actina fue de Millipore (#MAB 1501). Despues del lavado con TBST, se anadieron anticuerpos secundarios en TBST + 5% leche durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios de IgG de anti-raton o anti-conejo de cabra AffiniPure fueron de Jackson ImmunoResearch (catalogo # 111-035-144 y # 115-035-146, respectivamente). Las membranas se lavaron en TBST, se desarrollaron utilizando ECL, y se expusieron a pelmula de rayos X. El tratamiento con RTA 408 tambien aumento los niveles de protema NQO1 en celulas SH-SY5Y en una forma dependiente de la dosis (FIG. 6a). La protema HMOX1 no se detecto en celulas SH-SY5Y no tratadas o tratadas con RTA 408. En las celulas BV2, el tratamiento con RTA 408 aumento los niveles de protema NQO1 y HMOX1 a concentraciones hasta 125 nM (FIG. 6b). El valor de CE50 para la induccion de expresion de protema Nrf2 en las celulas SK-N-SH por RTA 408 (56,4 nM) fue 45%-65% menor que los valores de CE50 para 63171 (122 nM), 63189 (102 nM), y 63179 (126 nM). Se requirio la misma cantidad de 63170 (54,6 nM).

La CE50 se midio utilizando un ensayo de NQO1 de analisis western en celulas donde las celulas se incubaron con el compuesto bajo evaluacion durante tres dfas. Despues de la incubacion con el compuesto de interes, las celulas se hicieron reaccionar con anticuerpo NQO1 de raton y luego al dfa siguiente, las celulas se hicieron reaccionar con anticuerpo de IgG IRDye-800CW-anti-raton. Las senales diana se visualizaron y luego se analizaron.

Consistente con la induccion de genes diana de Nrf2 y productos de protema correspondientes, el tratamiento de celulas de macrofagos de raton RAW264.7 durante 24 h aumento la actividad enzimatica de NQO1 de una manera dependiente de la dosis, con aumentos evidentes a 7,8 nM (FIG. 7). La actividad enzimatica de NQO1 se midio por un ensayo de Prochaska modificado (Prochaska y Santamaria, Anal Biochem 169:328-336, 1988).

Tomados en conjunto, estos datos de multiples lmeas celulares demuestran que el tratamiento con RTA 408 aumenta la actividad transcripcional controlada por elementos de respuesta antioxidante, aumenta la expresion de los genes diana de Nrf2, y aumenta la actividad de NQO1, un producto de gen diana de Nrf2.

3. Efecto de RTA 408 en Marcadores de la Capacidad Redox Celular

El glutation y NADPH son factores cnticos requeridos para el mantenimiento de la capacidad redox celular. Se ha mostrado que varios genes implicados en la smtesis de glutation (por ejemplo, GCLC y GLCM) y NADPH [por ejemplo, hexosa-6-fosfato deshidrogenasa (H6PD) y enzima malica 1 (ME1)] estan regulados por Nrf2 (Wu, 2011). El efecto del tratamiento con RTA 408 en los niveles de glutation totales se evaluo en la lmea celular de hepatocitos AML-12 de raton utilizando el kit de ensayo de glutation GSH-Glo™ (Promega, Catalogo # V6912) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tratamiento de celulas AML-12 durante 24 h con RTA 408 aumento los niveles de glutation celular totales de una manera dependiente de la dosis (FIG. 8). Los datos mostrados son representativos de dos experimentos independientes. Se observo un aumento > 2 veces en el glutation total a concentraciones de RTA 408 tan bajas como 15,6 nM. El valor de CE50 utilizando un modelo de raton RAW264.7 para la induccion de los niveles de glutation por RTA 408 (9,9 nM) fue 22%-57% menor que los valores de CE50 para 63170 (12,1 nM), 63171 (23,2 nM), y 63189 (16 nM).

El efecto del tratamiento con RTA 408 en los niveles de NADPH, como se mide por la absorbancia de un tinte sensible a redox, WST-1 (Roche Applied Science, Catalogo # 11644807001), se evaluo en celulas HCT-116. La absorbancia de WST-1 se utiliza comunmente para evaluar la viabilidad celular midiendo la produccion glicolftica de NAD(P)H por las celulas viables. Por lo tanto, en situaciones donde aumenta la produccion de NADPH en la ausencia de cualquier efecto en la viabilidad celular, la absorbancia de WST-1 tambien aumenta (Berridge et al., 1996). Varios genes clave implicados en la produccion de NADPH tambien se ha mostrado que estan regulados por Nrf2 (Thimmulappa et al., 2002; Wu, et al., 2011). El tratamiento con RTA 408 durante 24 h aumento la absorbancia de WST-1 de una manera dependiente de la dosis (FIG. 9), lo que sugiere que se aumentaron los niveles de NADPH.

El efecto de RTA 408 en la expresion de genes implicados en las vfas de smtesis de NADPH tambien fue evaluado en este estudio. Las celulas HCT-116 se trataron con RTA 408 durante 24 h, y los niveles de ARNm de H6PD, fosfogluconato deshidrogenasa (PGD), transcetolasa (TKT), y ME1 se midieron utilizando PCR cuantitativa. Las celulas HCT-116 se plaquearon en placas de 6 pocillos a una densidad de 3 x 105 celulas/pocillo. Al dfa siguiente, las celulas se trataron con DMSO (vehmulo), 10 nM RTA 408, o 50 nM RTA 408 durante 24 h. Cada pocillo recibio la misma cantidad de vehmulo. Despues del tratamiento, el medio se retiro y las celulas se recogieron utilizando tampon RLT (Qiagen). Los lisados se homogeneizaron utilizando columnas QIAshredder (Qiagen, Catalogo # 79654) y el ARN se aislo utilizando kits RNeasy Mini (Qiagen, Catalogo # 74104). Para la transcripcion inversa, el ARN (1 |jg) se combino con cebador Oligo(dT)12-18 y H2O en un volumen final de 23,25 |jL. La mezcla se calento hasta 70°C durante 10 min y luego se coloco en hielo. Una mezcla maestra que contiene 8 jL 5X tampon de 1era cadena, 2 jL de 1 mg/ml de BSA, 2 jL de 20 mM DTT, 4 jL de mezcla 5 mM dNTP, 0,25 jL de RNaseOUT™ y 0,5 jL de transcriptasa inversa Superscript® II se anadieron a la mezcla de ARN y se incubaron a 42°C durante 1 h. La reaccion se inactivo por calentamiento hasta 70°C durante 10 min. La mezcla de reaccion se diluyo 1:3 con H2O antes de su uso en la qPCR. Se combinaron 2,5 jl de la reaccion de transcripcion inversa diluida con un conjunto de cebadores de PCR (0,36 jM de concentracion final), 2X iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Catalogo # 1708885) y H2O a un volumen final de 20 jL. Las secuencias para los cebadores de PCR son como sigue: Protema ribosomal S9 (RPS9) cebador directo 5'-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3' (SEC ID NO: 7), cebador inverso

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5'-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3' (SEC ID NO: 8); Hexosa-6-fosfato deshidrogenasa (H6PD) cebador directo 5'-GAGGCCGTGTACACCAAGAT-3' (SEC ID NO: 11), cebador inverso 5'-AGCAGTGGGGTGAAAATACG-3' (SEC ID NO: 12), Fosfogluconato deshidrogenasa (PGD) cebador directo 5'-AAGGCACTCTACGCTTCCAA-3' (SEC ID NO: 13), cebador inverso 5'-AGGAGTCCTGGCAGTTTTCA-3' (SEC ID NO: 14), Transcetolasa (TKT) cebador directo 5'-CATCTCCGAGAGCAACATCA-3' (SEC ID NO: 15), cebador inverso 5'-TTGTATTGGCGGCTAGTTCC-3' (SEC ID NO: 16); Enzima malica 1 (ME1) cebador directo 5'-TATATCCTGGCCAAGGCAAC-3' (SEC ID NO: 17) cebador inverso 5'-GGATAAAGCCGACCCTCTTC-3' (SEC ID NO: 18). Todos los cebadores previamente se han validado para la especificidad y eficiencia de amplificacion. El ADNc se amplifico utilizando las siguientes condiciones de ciclo: (95°C durante 3 min, 44 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 15 segundos, 72°C durante 15 segundos, seguido por una curva de fusion de 55°C a 95°C en incrementos de 0,5°C). La abundancia relativa de cada gen diana se determino utilizando el metodo comparativo CT (AACT). Las reacciones de PCR se realizaron en pocillos por triplicado para cada muestra. Dos experimentos independientes se realizaron utilizando las condiciones descritas anteriormente. El tratamiento con RTA 408 resulto en un aumento dependiente de la dosis en la expresion de genes implicados en la smtesis de NADPH (FIGS. 10a-d).

En resumen, el tratamiento con RTA 408 aumento los niveles totales de glutation en hepatocitos AML-12 y aumento la absorbancia de WST-1, un marcador de la produccion de NADPH, en celulas HCT-116. Esta observacion se correlaciona con un aumento en la expresion de varios genes clave que codifican enzimas implicadas en la smtesis de NADPH.

4. Efecto de RTA 408 en la Senalizacion de NF-kB Inducida por TNFa

NF-kB es un factor de transcripcion que juega un papel central en la regulacion de muchas respuestas inmunes e inflamatorias. Se ha mostrado que rTa 402 y otros AIM inhiben la senalizacion de NF-kB pro-inflamatoria en una variedad de lmeas celulares (Shishodia, 2006; Ahmad, 2006; Yore, 2006). Utilizando la lmea celular NIH3T3/NF-KB- luc de raton (Panomics), se exploraron los efectos de RTA 408 y los compuestos 63171, 63179, 63170, y 63189 en el informador NF-KB-luc fueron explorados. La lmea celular NIH3T3/NF-KB-luc mantiene una integracion cromosomica de una construccion informadora de la luciferasa de luciernaga regulada por ocho copias del elemento de respuesta de NF-kB. Los efectos de estos compuestos se pueden cuantificar midiendo el valor de CI50 de NF-kB. El RTA 408 mostro una CI50 de 1,2 pM, que cuando se normalizo para la viabilidad mostro una CI50 de 1,4 pM. Los otros cuatro compuestos mostraron valores de CI50 de NIH3T3/NF-KB de 1,7, 0,2, 1,1, y 1,1 pM, que cuando se normalizo la viabilidad mostro valores de CI50 de 1,8, 0,6, 1,1, y 1,0 pM, respectivamente. El RTA 408 y sus efectos en NF-kB se representaron como una funcion de la dosificacion y las veces de cambio relativo, asf como WST1 y WST1/2 se muestran en las FIGS. 11a y b. El efecto de RTA 408 en la senalizacion de NF-kB inducida por TNFa se evaluo en celulas HeLa/NF-KB-luc, una lmea celular de adenocarcinoma de cuello uterino humano transfectada establemente con un construccion informadora de luciferasa bajo el control de multiples elementos de respuesta transcripcional de NF-kB. Las celulas HeLa/NF-KB-luc fueron pretratadas durante 1 h con RTA 408, seguido de tratamiento con TNF-a (10 ng/mL) durante 5 h adicionales. Despues del tratamiento, se midio la luminiscencia, y se determino el efecto del pre-tratamiento con RTA 408 en la actividad de luciferasa inducida por TNF-a. Los resultados promedio y las desviaciones estandar de tres experimentos independientes se muestran en la FIG. 12. El RTA 408 inhibio de manera dependiente de la dosis la activacion de NF-kB inducida por TNF-a con un valor de CI50 de 517 ± 83 nM. Se observaron resultados similares en otra lmea celular de informador de NF-kB (A549/NF-kB-Luc) donde el RTA 408 inhibio la activacion de NF-kB inducida por TNF-a con un valor de CI50 de 627 nm (intervalo de 614-649 nM). El RTA 408 fue 1,6-1,8 veces mas eficiente en la reduccion de la expresion del informador promotor de NF-kB en celulas HeLa/NF-KB-Luc que 63189 (854 nM) y 63170 (953 nM), respectivamente. La experimentacion adicional con la lmea celular A549 humana mostro una CI50 de RTA 408 como 1,7 pM y un valor que ha sido normalizado para la viabilidad a 1,7 pM. La CI50 de RTA 408 mostro una actividad similar a 63189, 63179, 63171, y 63170 que mostro valores de CI50 de 1,1, 1,4, 2,0 y 1,0, respectivamente. Cuando los valores fueron de variabilidad normalizada, el ensayo mostro CI50 de 1,2, 1,5, 2,1 y 1,1 pM, respectivamente. Las veces de cambio para NF-kB como una funcion de la concentracion de RTA 408 junto con curvas de WST1 y WST1/2, se representaron y se muestran en las FIGS. 13a y b.

El efecto de RTA 408 en la fosforilacion inducida por TNF-a de iKBa, una etapa clave en la activacion de la via de NF-kB, tambien se evaluo en celulas HeLa. Las celulas HeLa se pretrataron con RTA 408 durante 6 h, seguido de tratamiento con TNF-a (20 ng/mL) durante 5 min. Los niveles totales y fosforilados de IKBa se evaluaron por transferencia Western. Los anticuerpos IKBa primarios fueron de Santa-Cruz (sc-371), el anticuerpo plKBa fue de Cell Signaling (9246), el anticuerpo actina fue de Millipore (MAB 1501). Los anticuerpos secundarios anti-conejo de cabra de affini-pure conjugado con peroxidasa (IgG) e IgG anti-raton de cabra de affini-pure conjugado con peroxidasa se compraron de Jackson ImmunoResearch. Las transferencias de protemas se desarrollaron utilizando ECL, y se expusieron a pelmula de rayos X. Consistente con los resultados del ensayo de informador de luciferasa, el RTA 408 inhibio la fosforilacion de IKBa inducida por TNF-a de una manera dependiente de la dosis (FIG. 14).

Tambien se ha demostrado que el RTA 408 inhibe otras vfas de senalizacion pro-inflamatorias, tal como transductor de senal inducida por IL-6 y activador de la fosforilacion de transcripcion 3 (STAT3) y activador del receptor de osteoclastogenesis inducida por ligando de NF-kB (RANKL). En las celulas HeLa, el pretratamiento con 1 pM RTA 408 durante 6 h inhibio la fosforilacion de STAT3 inducida por IL-6. Los anticuerpos monoclonales STAT3 (124H6) y fosfo-STAT3 (Tyr705) fueron de Cell Signaling Technology. IgG anti-conejo de cabra Affini-pure conjugado con

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peroxidasa e IgG anti-raton de cabra Affini-pure conjugado con peroxidasa fueron de Jackson ImmunoResearch. La osteoclastogenesis es un proceso de diferenciacion de multiples etapas que resulta de la union de RANKL a su receptor, RANK, en las celulas de origen hematopoyetico. Esto resulta en la activacion de NF-kB y MAPK, que a su vez aumentan la transcripcion de genes diana espedficos de osteoclastos, incluyendo la fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP). El efecto de RTA 408 en la osteoclastogenesis inducida por RANKL se evaluo en la lmea celular de macrofagos de raton RAW264.7. Las celulas RAW 264.7 se plaquearon en placas de 24 pocillos a una densidad de 5.000 celulas/pocillo. Al dfa siguiente, las celulas se trataron con RTA 408 durante 2 horas y luego se trataron con 50 ng/mL de RANKL de raton recombinante (R&D systems). Las celulas tratadas se incubaron durante cuatro dfas para permitir la diferenciacion en osteoclastos. La diferenciacion en osteoclastos se evaluo por medicion de la actividad de TRAP. Brevemente, 90 |jL de medio de cultivo celular condicionado se retiraron de cada pocillo de ensayo y se alicuotaron en pocillos triplicados (30 jL/pocillo) de una placa de 96 pocillos. Se anadieron 170 |jL de tampon de ensayo TRAP (Kamiya Biomedical) a cada pocillo y la placa se incubo a 37°C durante 3 horas. Despues de la incubacion, la absorbancia a 540 nm se determino utilizando un espectrofotometro de lectura de placas Spectramax M2. El RTA 408 inhibio de manera dependiente de la dosis la actividad de TRAP inducida por RANKL y la formacion de osteoclastos, con una CI50 de ~5-10 nM.

5. Efecto de RTA 408 en la Expresion de Genes que Codifican Enzimas Transaminasas

Se observaron elevaciones de transaminasa en los estudios de toxicidad de 28 dfas con RTA 408 en ratas y, a un grado mucho menor, en monos. Hallazgos similares se han observado despues de administracion oral de un AIM relacionado (bardoxolona metilo) en los seres humanos (Pergola, 2011). Una hipotesis para este efecto es que los AIM directa o indirectamente aumentan la expresion de genes de transaminasa en la ausencia de toxicidad celular. Para evaluar si el tratamiento con RTA 408 afecta los niveles de ARNm de transaminasa, los hepatocitos AML-12 de raton se trataron con RTA 408 durante 18 h, y los niveles de ARNm de los genes que codifican las transaminasas se midieron utilizando PCR cuantitativa. Las celulas AML-12 se plaquearon en placas de cultivo de 6 pocillos a 3 x 105 celulas por pocillo utilizando 2 mL de medio por pocillo. Al siguiente dfa, las celulas se trataron con DMSO (vehfculo) o 250 nM y 500 nM RTA 408 durante 18 horas a 37°C. Cada pocillo recibio 0,1% DMSO. Se realizaron tres experimentos replicados independientes. Despues del tratamiento, el medio se retiro y las celulas se recogieron utilizando tampon RLT (Qiagen). Los lisados se homogeneizaron utilizando columnas QIAshredder (Qiagen, Catalogo # 79654) y el ARN se aislo utilizando kits RNeasy Mini (Qiagen, Catalogo # 74104). Para la transcripcion inversa, el ARN (1 jg) se combino con cebador Oligo(dT)12-18 y H2O en un volumen final de 23,25 jL. La mezcla se calento hasta 70°C durante 10 min y luego se coloco en hielo. Una mezcla maestra que contiene 8 jL 5X tampon de 1era cadena, 2 jL de 1 mg/mL de BSA, 2 jL de 20 mM DTT, 4 jL de mezcla de 5 mM dNTP, 0,25 jL de RNaseOUT™ y 0,5 jL de transcriptasa inversa Superscript® II se anadieron a la mezcla de ARN y se incubaron a 42°C durante 1 h. La reaccion se inactivo por calentamiento hasta 70°C durante 10 min. La mezcla de reaccion se diluyo 1:3 con H2O antes de su uso en la qPCR. Se combinaron 2,5 jL de la reaccion de transcripcion inversa diluida con un conjunto de cebadores de PCR (0,36 jM de concentracion final), 2X iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, catalogo # 170-8885) y H2O a un volumen final de 20 jL. Las secuencias para los cebadores de PCR son como sigue: Prote'rna ribosomal L19 (Rp119) cebador directo 5'-TCAGGCTACAGAAGAGGCTTGC-3' (SEC ID NO: 19), cebador inverso 5'-ACAGTCACAGGCTTGCGGATG-3' (SEC ID NO: 20); NAD(P)H deshidrogenasa, quinona 1 (Nqo1) cebador directo 5'-TCGGGCTAGTCCCAGtTaGA-3' (SEC ID NO: 21), cebador inverso 5'- AAAGAGCTGGAGAGCCAACC-3' (SEC ID NO: 22); Glutamico piruvico transaminasa 1 (Gpt1 o Alt1) cebador directo 5'-CACGGAGCAGGTCTTCAACG-3' (SEC ID NO: 23), cebador inverso 5'-AGAATGGTCATCCGGAAATG-3' (SEC ID NO: 24); Glutamico piruvico transaminasa 2 (GPT2 o Alt1) cebador directo 5'-

CGCGGTGCAGGTCAACTACT-3' (SEC ID NO: 25), cebador inverso 5'-CCTCATCAGCCAGGAGAAAA-3' (SEC ID NO: 26); Glutamato oxaloacetato transaminasa 1 (Got1 o Asti) cebador directo 5'-GGCTATTCGCTATTTTGTGT-3' (SEC ID NO: 27), cebador inverso 5'-GACCAGGTGATTCGTACAAT-3' (SEC ID NO: 28); Glutamato oxaloacetato transaminasa 2 (Got2 o Asti) cebador directo 5'-AGAGTCCTCTTCAGTCATTG-3' (SEC ID NO: 29), cebador inverso 5'-ATGATTAGAGCAGATGGTGG-3' (SEC ID NO: 30). Todos los cebadores previamente se han validado para la especificidad y eficiencia de amplificacion. El ADNc se amplifico utilizando las siguientes condiciones de ciclo: (95°C durante 3 min, 44 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 15 segundos, 72°C durante 15 segundos, seguido por una curva de fusion de 55°C a 95°C en incrementos de 0,5°C). La abundancia relativa de cada gen diana se determino utilizando el metodo comparativo CT (AACT). Las reacciones de PCR se realizaron en pocillos por triplicado para cada muestra. El tratamiento con RTA 408 aumento los niveles de ARNm de alanina transaminasa 1 (Alt1 o Gpt1) y aspartato transaminasa 1 (Ast1 o Got1) (FIGS. 15a,c). El RTA 408 no tuvo efecto en los niveles de ARNm de alanina transaminasa 2 (Alt2 o Gpt2) y redujo los niveles de ARNm de aspartato transaminasa 2 (Ast2 o Got2) (FIGS. 15b,d). Estos resultados demuestran que RTA 408, a las concentraciones ensayadas (250 nM o 500 nM), afecta la expresion de genes transaminasa in vitro.

6. Efecto de RTA 408 en los Niveles de Intermediarios Glucoliticos

Los estudios en ratones diabeticos han demostrado que bardoxolona metilo aumenta la captacion de glucosa estimulada por la insulina espedfica de los musculos (Saha, 2010). En los seres humanos, un mayor porcentaje de pacientes que reciben bardoxolona metilo reporto que experimentaron calambres musculares en comparacion con los pacientes que recibieron placebo (Pergola, 2011). Los espasmos musculares tambien se han reportado en pacientes diabeticos despues de la administracion de insulina, lo que sugiere una posible asociacion con el metabolismo de glucosa en el musculo. El efecto de RTA 408 en el metabolismo glucolttico se evaluo a traves de la

evaluacion de los niveles de lactato y piruvato en las celulas musculares C2C12 de roedores cultivadas. Para medir los niveles de lactato, los miotubos de C2C12 diferenciadas se trataron con 1 pM o 2 pM RTA 408 o insulina durante 3 horas a 37°C. El tampon se retiro y se guardo para la medicion de los niveles de lactato extracelulares. Los restos celulares se sedimentaron por centrifugacion (l0 min a 14.000 rpm) antes de la medicion de lactato. Para medir el 5 lactato intracelular, las celulas se suspendieron en 0,1% Triton X-100 en PBS y se lisaron por cizallamiento con una aguja de calibre 25. El lisado celular se centrifugo (10 min a 14.000 rpm, 4°C) y el lactato se midio en el sobrenadante. El lactato intracelular y extracelular se midio utilizando el kit de ensayo de lactato (BioVision, Catalogo # K607-100). Similar al tratamiento con insulina, el tratamiento de miotubos de C2C12 diferenciados con 1 pM o 2 pM RTA 408 durante 3 h aumento significativamente los niveles de lactato intracelular y extracelular de una manera 10 dependiente de la dosis.

Para medir los niveles de piruvato, los miotubos de C2C12 diferenciados se trataron con 250 o 500 nM RTA 408 o 100 nM insulina durante 18 h. Despues del tratamiento con farmacos, el medio se retiro y las celulas se lavaron con PBS. Las celulas se lisaron en tampon de ensayo de piruvato (Piruvate Assay Kit, BioVision, Catalogo # K609-100). Los lisados celulares se centrifugaron (10 min a 14.000 rpm, 4°C) y los niveles de piruvato se midieron en el 15 sobrenadante. El tratamiento de miotubos de C2C12 diferenciados con 250 nM o 500 nM RTA 408 durante 18 h tambien aumento significativamente (P < 0,0001, senalado con asteriscos) los niveles de piruvato intracelular en una forma dependiente de la dosis (FIG. 16). Conjuntamente, estos resultados demuestran que RTA 408, a las concentraciones ensayadas, puede afectar los intermediarios glicolfticos musculares in vitro; sin embargo, no esta claro como los resultados de este sistema in vitro a las concentraciones de RTA 408 ensayadas se relacionan con 20 los efectos potenciales en el metabolismo de la glucosa a niveles de dosis clmicamente relevantes en los seres humanos.

7. Evaluacion In Vitro del Eflujo de RTA 408 por MRP-1

Una caractenstica de un farmaco candidato es la relacion de eflujo del compuesto. La relacion de eflujo mide como de facilmente se transporta el compuesto traves de una membrana. La protema MRP-1, o la protema 1 de asistencia 25 a la resistencia de multiples farmacos, es una de una familia de protemas que ayudan a facilitar el transporte de aniones organicos y otras moleculas pequenas a traves de membranas celulares. Una relacion de eflujo mas grande normalmente significa que el farmaco candidato se transporta mas facilmente fuera de la membrana y esta menos disponible para modular los procesos intracelulares. Las protemas similares tambien regulan el transporte de compuestos a traves de la barrera hematoencefalica. La relacion de eflujo de MRP-1 para RTA 408 (1,3) se 30 determino experimentalmente que es aproximadamente diez veces menor que 63170 (10) y 63171 (11,2) y mas de 40 veces menor que 63179 (56,5) y 63189 (57,1). Sin estar ligado por la teona, el RTA 408 puede no ser un buen sustrato para MRP-1 y/o un candidato para el eflujo mediado por la p-glicoprotema en la barrera hematoencefalica. En algunas realizaciones, el RTA 408 se puede utilizar para tratar trastornos del sistema nervioso central (SNC).

C. Efectos Protectores de RTA 408 en Modelos Animales de la Enfermedad Pulmonar

35 El RTA 408 se ensayo en varios modelos animales de enfermedad pulmonar para evaluar su potencial eficacia en el pulmon. Para todos los estudios, el RTA 408 se administro por via oral diariamente en aceite de sesamo a niveles de dosis en el intervalo de 3 a 150 mg/kg. En la mayona de los casos, el RTA 408 se administro empezando varios dfas antes de la induccion de la respuesta de la lesion pulmonar.

1. Inflamacion Pulmonar inducida por LPS en Ratones

40 El RTA 408 se ensayo en dos estudios de inflamacion pulmonar inducida por LPS en ratones. En el primer estudio, propuesto para ser un buscador preliminar de intervalo de dosis, el RTA 408 (30, 100, o 150 mg/kg) se administro por via oral una vez al dfa durante tres dfas, seguido de la administracion de LPS 1 h despues de la dosis final. El fluido de lavado broncoalveolar (BALF) se recogio 20 h despues de la administracion de LPS (21 h despues de la dosis final de RTA 408) y se evaluo para los niveles de marcadores pro-inflamatorios (es decir, IL-6, IL-12p40, TNF- 45 a, y RANTES) utilizando tecnologfa Luminex™. El tratamiento con rTa 408 resulto en una reduccion significativa de IL-12p40 a todas las dosis y en TNF-a a las dosis de 100 y 150 mg/kg (FIG. 17). En el segundo estudio, el RTA 408 (10, 30, o 100 mg/kg) se administro diariamente durante seis dfas, seguido de la administracion de LPS 1 h despues de la dosis final. En este estudio, se observaron disminuciones significativas del peso corporal al nivel de dosis de 100 mg/kg empezando en el Dfa 3. Se observaron reducciones significativas de TNF-a a la dosis de 10 mg/kg, y se 50 observaron reducciones significativas de IL-12p40, TNF-a, y RANTES a la dosis de 30 mg/kg (FIG. 18a). La evaluacion adicional de los pulmones de ratones en este estudio revelo una participacion significativa de los genes de diana de Nrf2 relevantes, incluyendo la induccion significativa de la actividad enzimatica de NQO1 (por medicion de la tasa de reduccion de 2,6-diclorfenol-indofenol) y aumentos de GSH total (GSH-Glo™, Promega, Madison, WI) a 10 y 30 mg/kg (FIG. 18b).

55 2. Fibrosis Pulmonar Inducida por Bleomicina

El efecto de RTA 408 tambien se evaluo en modelos de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones y ratas. En el primer estudio preliminar, el RTA 408 (10, 30, o 100 mg/kg) se administro a ratones diariamente a traves de sonda oral durante 39 dfas, con pulso de bleomicina (intranasal) en el dfa 10. En el ultimo dfa de la dosificacion,

el tejido de pulmon se recogio y la histolog^a se realizo para evaluar el grado de inflamacion y fibrosis intersticial. En este modelo, no se observaron efectos estad^sticamente significativos a las dosis de RTA 408 ensayadas (FIGS. 19a y b). La evaluacion adicional se realizo utilizando un modelo de rata de fibrosis pulmonar que se ha caracterizado ampliamente en el Lovelace Respiratory Research Institute. En este estudio, las ratas se pulsaron con bleomicina o 5 disolucion salina por administracion intratraqueal en el dfa 0. Despues del pulso, los animales recibieron RTA 408 (3, 10, o 30 mg/kg) diariamente a traves de sonda oral durante 28 dfas. La administracion de la dosis de 30 mg/kg se detuvo en el dfa 14 debido a la deshidratacion excesiva y diarrea en los animales. Para los animales restantes, el fluido de lavado broncoalveolar se recogio en el dfa 28 para la evaluacion de los infiltrados proinflamatorios por citometna de flujo, y el tejido de pulmon se analizo para los niveles de hidroxiprolina por LC-MS e histopatologfa. El 10 pulso con sulfato de bleomicina indujo una liberacion sustancial de los neutrofilos y un aumento en el colageno soluble en el BALF, asf como un aumento de la hidroxiprolina en el pulmon. El tratamiento con 3 y 10 mg/kg de RTA 408 suprimio de forma significativa la infiltracion de celulas polimorfonucleares (PMN) en los pulmones y tambien produjo una reduccion significativa (~10%-20%) en la deposicion de hidroxiprolina (FIGS. 20a y b).

De manera importante, la evaluacion histopatologica revelo una disminucion significativa en la deposicion de 15 colageno, como se evalua por tincion tricromica, en ratas tratadas con RTA 408. Mientras que los animales control de bleomicina principalmente exhibieron tincion moderada, los animales tratados con 10 mg/kg de RTA 408 tuvieron tincion predominantemente minima a leve (Tabla 2).

Tabla 2: Efecto de RTA 408 en la deposicion de colageno en el pulmon de rata como se evalua por la intensidad de la tincion tricromica

Intensidad de Tinciona

Control de Bleomicina RTA 408 RTA 408

(3 mg/kg) (10 mg/kg)

Minima

0 0 3

Leve

1 0 4

Moderada

7 7 1

20 a Los valores representan la intensidad de la tincion en los animales con tincion tricromica intersticial en areas de alteraciones pulmonares inducidas por bleomicina.

La evaluacion adicional de los pulmones de las ratas en este estudio tambien revelo una participacion significativa de los genes diana de Nrf2 relevantes como se sometio a ensayo por el ensayo Quantigene Plex 2.0 Multiplex (Affymetrix, Santa Clara, CA) (FIG. 21). El RTA 408 de manera significativa y dependiente de la dosis aumento la 25 actividad enzimatica de NQO1, Txnrd, Gsr, y Gst en los pulmones de las ratas expuestas a la bleomicina, lo que demuestra la activacion de Nrf2 por RTA 408 en esta configuracion de la enfermedad. La actividad enzimatica de NQO1 se evaluo midiendo la tasa de reduccion de DCPIP. Las actividades enzimaticas de Txnrd, Gsr, y Gst se midieron utilizando kits disponibles comercialmente de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

3. COPD inducida por Humo de Cigarillo en Ratones

30 El RTA 408 tambien se ensayo en un modelo de raton de COPD inducida por humo de cigarrillo. Los ratones recibieron RTA 408 (3, 10, o 30 mg/kg) diariamente a traves de una sonda oral durante dos semanas y se expusieron a humo de cigarrillo cinco dfas por semana durante el penodo de dosificacion de RTA 408. Al final del estudio, el tejido de pulmon y BALF se recogieron para el analisis de infiltrados inflamatorios y citoquinas. En este experimento, la administracion de dosis multiples de RTA 408 a dosis tan bajas como 3 mg/kg de RTA 408 dio lugar 35 a una supresion significativa de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo KC (homologo funcional de raton de IL-8 humana) y TNF-a como se mide utilizando tecnologfa Luminex™. Un resumen de los resultados de este estudio se presenta en las FIGS. 22a-e. Un analogo de AIM (63355) se ensayo en el mismo estudio para comparacion. 63355 es un compuesto de la formula:

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40 La evaluacion adicional de los pulmones de los ratones en este estudio tambien revelo una participacion significativa

de genes diana de Nrf2 relevantes (FIG. 23). La actividad enzimatica de NQO1 en el pulmon, medida como la tasa de reduccion de DCPIP, se disminuyo significativamente por la exposicion a humo de cigarrillo; la administracion de RTA 408 rescato esta perdida. La actividad enzimatica de Txnrd tambien se indujo por la dosis de 30 mg/kg de RTA 408. En general, la actividad enzimatica de Gsr no se altero, y la actividad enzimatica de Gst se disminuyo con el 5 tratamiento - ambas fueron probablemente la consecuencia de una respuesta temporal para estas enzimas. Las actividades enzimaticas de Txnrd, Gsr, y Gst se midieron utilizando kits disponibles comercialmente de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

4. Asma inducido por Ovoalbumina en Ratones

La actividad potencial de RTA 408 tambien se evaluo en un estudio piloto en un modelo de raton de asma inducido 10 por ovoalbumina. Los ratones se sensibilizaron con una inyeccion IP de ovoalbumina e hidroxido de aluminio en el Dfa 0 y Dfa 14 y se pulsaron intranasalmente con ovoalbumina en disolucion salina en los dfas 14, 25, 26, y 27. Los ratones recibieron RTA 408 (3, 10, o 30 mg/kg) diariamente a traves de una sonda oral en los dfas 1-13 y 15-27. Despues de la sensibilizacion y el pulso con ovoalbumina, los ratones tratados con vefuculo tuvieron un aumento significativo en el numero total de leucocitos en comparacion con los ratones tratados con control positivo 15 (dexametasona). Un aumento en el numero de celulas T y celulas B tambien se observo en los ratones tratados con vefuculo. El tratamiento con RTA 408 a 30 mg/kg redujo significativamente el numero y porcentaje de celulas B dentro de las vfas respiratorias. El RTA 408 (3 y 30 mg/kg) tambien redujo significativamente el numero de macrofagos, pero no el porcentaje medio de macrofagos, detectados en las vfas respiratorias. Estas observaciones son indicativas de la eficacia potencial en este modelo.

20 5. Efectos de RTA 408 en Sepsis inducida por LPS en Ratones

La sepsis se indujo en el dfa 0 con una inyeccion IP de LPS (21 mg/kg), y la supervivencia fue seguida hasta el dfa 4. El RTA 408 (10, 30, o 100 mg/kg) se administro diariamente a traves de una sonda oral desde el dfa -2 al dfa 2. En el grupo de control de vefuculo, el 60% de los animales sobrevivio hasta el dfa 4 (mayor que la tasa de supervivencia de ~40% esperada en este modelo). En los grupos de tratamiento de RTA 408, el 80% de los 25 animales en el grupo de dosis de 10 mg/kg y el 90% de los animales en el grupo de dosis de 30 mg/kg sobrevivieron hasta el dfa 4 (FIGS. 24c y d). Para el grupo de dosis de 100 mg/kg, el 90% de los animales sobrevivio hasta el dfa 4, con una sola muerte ocurrida en el Dfa 4. Aunque estos efectos inducidos por RTA 408 son indicativos de la eficacia profunda en este modelo, la tasa de supervivencia relativamente alta en el grupo de control de vefuculo impide una diferencia estadfsticamente significativa entre los grupos de control y tratados con RTA 408. Los 30 resultados obtenidos utilizando el compuesto RTA 405 tambien se presentan (FIGS. 24a y b). El RTA 405 es un compuesto de la formula:

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6. Efectos de RTA 408 frente a la Mucositis Oral Inducida por Radiacion

La exposicion a la radiacion aguda dirigida a la bolsa de la mejilla bucal de hamsteres produce efectos similares a 35 los observados en la mucositis ulcerativa oral en seres humanos. Estos efectos incluyen mucositis moderada a grave caracterizada por un eritema grave y vasodilatacion, erosion de la mucosa superficial, y formacion de ulceras. Se realizo un estudio unico para evaluar los efectos de RTA 408 en este modelo. En el Dfa 0, se administro a cada hamster una dosis de radiacion aguda de 40 Gy dirigida a la bolsa de la mejilla bucal izquierda. El RTA 408 (10, 30, o 100 mg/kg) se administro por via oral dos veces al dfa desde el Dfa -5 al Dfa -1 y Dfa 1 al Dfa 15. Empezando en 40 el dfa 6 y continuando hasta el dfa 28 en dfas alternos, la mucositis oral se evaluo utilizando una escala de puntuacion estandar de 6 puntos. Las dosis tanto de 30 como 100 mg/kg de RTA 408 causaron una reduccion significativa en la duracion de la mucositis ulcerativa (FIG. 25). Ademas, tambien se observo una disminucion dependiente de la dosis en el porcentaje de animales con puntuaciones de mucositis > 3. Sin embargo, la administracion de RTA 408 a 30 o 100 mg/kg causo reducciones significativas dependientes de la dosis en la 45 ganancia de peso en hamsteres irradiados. Debido a la perdida de peso en exceso de 20%, dos de los ocho hamsteres en el grupo de dosis de 100 mg/kg se sacrificaron en el Dfa 2.

7. Efecto de RTA 408 en la Induccion de Biomarcadores de Nrf2 In Vivo

Como se describio anteriormente, una diana molecular clave de RTA 408 es Nrf2, un regulador transcripcional

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central de la proteccion celular antioxidante. La activacion de Nrf2 induce la regulacion al alza de una batena de genes citoprotectores, incluyendo NQO1, enzimas implicadas en la smtesis de GSH [es decir, subunidades modificadoras y cataltticas de glutamato-cistema ligasa (GclcC y Gclm)], enzimas implicadas en la desintoxicacion (es decir, glutation S-transferasas [Gsts]), y transportadores de eflujo [es decir, protemas asociadas a la resistencia a multiples farmacos (Mrps)]. La induccion de estos genes da como resultado un esfuerzo coordinado celular para proteccion contra el insulto oxidativo, resaltado por el aumento de la capacidad antioxidante, induccion de la smtesis de glutation, y conjugacion y exportacion de moleculas potencialmente daninas de la celula. Ademas de los puntos finales de eficacia y expresion de gen diana de Nrf2 evaluada en los diversos modelos animales descritos anteriormente, la capacidad de RTA 408 para inducir la expresion de genes diana de Nrf2 tambien se evaluo utilizando tejidos recogidos de ratones, ratas y monos sanos tratados con RTA 408.

Como parte de los estudios de toxicidad de 14 dfas sin GLP de RTA 408 en ratones, ratas y monos, los tejidos se recogieron para los propositos de medicion de ARNm y niveles de actividad enzimatica de genes diana de Nrf2 seleccionados. Para los ratones y ratas, se recogieron muestras de hngado 4 h despues de la dosis final en el Dfa 14. Para los monos, se recogieron sangre (para el aislamiento de PBMC), tejidos de tngado, pulmon, y cerebro 24 h despues de la dosis final en el Dfa 14. La actividad enzimatica de NQO1, Gst, y glutation reductasa (Gsr), como se describio anteriormente, se midieron en homogenados de tejido. Los niveles de ARNm se determinaron utilizando la tecnologfa QuantiGene Plex 2.0 de acuerdo con el protocolo del fabricante, lo que implica un ensayo basado en hibridacion utilizando perlas magneticas xMAP® Luminex® para la cuantificacion directa de ARNm diana. Ademas, se midieron las concentraciones de RTA 408 en plasma y tejidos por metodos de LC/MS/MS en un espectrometro de masas TQD (Waters, Milford, MA).

El RTA 408 generalmente aumento la expresion de varios genes diana de Nrf2 de una manera dependiente de la dosis a dosis de 10, 30, y 100 mg/kg (FIG. 26, FIG. 27a, FIGS. 28a y b). La regulacion al alza transcripcional de genes diana de Nrf2 por RTA 408 tambien resulto en aumentos funcionales en la respuesta antioxidante, como se manifiesta por los aumentos dependientes de la dosis en la actividad enzimatica de NQO1, Gst, y Gsr en el hngado de roedores, asf como del hngado y pulmon de monos (FIGS. 29a y b, FIGS. 30a y b, FIGS. 31a y b). Ademas, en roedores, la exposicion del hngado a RTA 408 se correlaciono con el nivel de actividad enzimatica de NQO1, el gen diana prototipo de Nrf2 (FIG. 32b, FIG. 33b). En los monos, el nivel de expresion de ARNm en PBMC tanto de NQO1 como sulfirredoxina 1 (SRXN1) se correlaciono con la exposicion de plasma a RTA 408 (FIGS. 37a y b). En general, el RTA 408 aumento los niveles de ARNm y la actividad de dianas de Nrf2, y tales aumentos generalmente se correlacionan con las exposiciones de tejido y plasma, lo que sugiere que las dianas de Nrf2 pueden servir como biomarcadores factibles para la activacion de Nrf2 (FIGS. 34a y b) y pueden ser utiles para evaluar la actividad farmacologica de RTA 408 en sujetos humanos sanos.

D. Farmacologia de Seguridad

Un programa de farmacologia de seguridad conforme a GLP se completo utilizando RTA 408. Este incluyo estudios (monos) in vitro e in vivo sobre el sistema cardiovascular, asf como estudios sobre el sistema respiratorio y sistema nervioso central en ratas.

1. Evaluacion de los Efectos de RTA 408 en Canales de hERG Clonados Expresados en celulas HEK293

Este estudio se realizo para evaluar los efectos de RTA 408 en la corriente de potasio rectificante hacia dentro de activacion rapida (kr) realizado por canales de hERG (gen humano relacionado con eter-a-go-go) expresados de forma estable en la lmea celular de rinon embrionario humano (HEK293). Los efectos de RTA 408 en la corriente de potasio relacionada con hERG se evaluaron utilizando metodos de electrofisiologfa de pinzamiento zonal de celulas completas. Se determino que el RTA 408 tiene un valor de CI50 de 12,4 pM en un ensayo QPatch_Kv11.1 de hERG. Este valor fue 2,5-3 veces mayor que los valores para 63170 (4,9 pM) y 63189 (3,8 pM), respectivamente. El valor de CI50 de RTA 408 fue similar al valor de 63171 (15,7 pM).

2. Evaluacion Cardiovascular de RTA 408 en el Mono Cynomolgus

Se realizo un estudio unico para evaluar los efectos cardiovasculares potenciales de RTA 408 en monos cynomolgus conscientes con movimiento libre. Se administro a los mismos cuatro monos cynomolgus macho y cuatro monos cynomolgus hembra el vehnculo (aceite de sesamo) y RTA 408 a niveles de dosis de 10, 30 y 100 mg/kg de acuerdo con un diseno cuadrado latino, con un animal/sexo/tratamiento dosificado cada semana seguido por un penodo de reposo farmacologico de 14 dfas entre las administraciones, hasta que cada animal recibio todos los tratamientos. El vehnculo y RTA 408 se administraron a todos los animales por sonda oral en un volumen de dosis de 5 mL/kg.

Los animales fueron equipados con transmisores de telemetna para la medicion de la temperatura corporal, presion arterial, frecuencia cardiaca, y evaluacion del electrocardiograma (ECG). La temperatura corporal, presion arterial sistolica, diastolica y media, frecuencia cardfaca, y parametros del ECG (duracion de QRS e intervalos de RR, PR y QT) se monitorizaron continuamente desde al menos 2 horas antes de la dosis hasta al menos 24 horas despues de la dosis. Los trazados ECG se imprimieron en los puntos de tiempo designados de los datos de monitorizacion cardiovascular y se evaluaron cualitativamente por un cardiologo veterinario certificado por el consejo. Antes de la primera administracion en el estudio, los animales no tratados se monitorizaron continuamente para los puntos

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finales cardiovasculares durante al menos 24 h, y estos datos se utilizaron en el calculo del intervalo de QT corregido a lo largo del estudio.

Las observaciones de la morbilidad, mortalidad, lesiones y disponibilidad de alimentos y agua se realizaron al menos dos veces al dfa para todos los animales. Las observaciones clmicas se realizaron antes de la dosis, aproximadamente 4 horas despues de la dosis, y despues de la finalizacion del penodo de monitorizacion cardiovascular. Los pesos corporales se midieron y registraron en el dfa antes de cada administracion del tratamiento.

El RTA 408 a niveles de dosis de 10, 30 y 100 mg/kg no produjo mortalidad, signos clmicos adversos, o resulto en cambios significativos en el peso corporal, temperatura corporal, presion arterial, o parametros de ECG cualitativos o cuantitativos (intervalos de Pr, RR, QRS, QT) (FIG. 35; Tabla 45). En el grupo de dosis de 100 mg/kg, se observo un aumento pequeno (1,6% en promedio) pero estadfsticamente significativo en el intervalo de QT corregido; sin embargo, los datos de animales individuales no mostraron aumentos consistentes de QTc que indicanan un efecto relacionado con el artmulo de ensayo. En consecuencia, debido a la pequena magnitud de cambio y la falta de una respuesta consistente en animales individuales, estos ligeros aumentos de QTc no fueron considerados relacionados con el tratamiento con RTA 408. Por lo tanto, la administracion oral de RTA 408 no produjo efectos en la funcion cardiovascular en monos cynomolgus a dosis de hasta e incluyendo 100 mg/kg.

3. Evaluacion Neuroconductual de RTA 408 en Ratas

La potencial toxicidad neuroconductual aguda de RTA 408 se evaluo en ratas. Tres grupos de tratamiento de ratas CD® [Crl:CD® (SD)] 10 machos y 10 hembras recibieron RTA 408 a niveles de dosis de 3, 10, o 30 mg/kg. Un grupo adicional de 10 animales/sexo sirvio como control y recibio vehnculo (aceite de sesamo). El vehnculo o RTA 408 se administro a todos los grupos a traves de sonda oral una vez en el dfa 1 a un volumen de dosis de 10 mL/kg.

Las observaciones de morbilidad, mortalidad, lesiones y disponibilidad de alimentos y agua se realizaron dos veces al dfa para todos los animales. Las observaciones de los signos clmicos se realizaron antes de la dosificacion en el dfa 1 y despues de cada evaluacion de batena observacional funcional (FOB). Las evaluaciones FOB se realizaron antes de la dosis (Dfa -1) y a aproximadamente 4 y 24 h despues de la dosis. Los pesos corporales se midieron y se registraron antes de la dosis en el dfa 1.

El RTA 408 a dosis de 3, 10 y 30 mg/kg no produjo mortalidad, observaciones clmicas adversas, o efectos en cualquiera de las medidas neuroconductuales ensayadas. Las ligeras disminuciones de la ganancia de peso corporal se observaron aproximadamente 24 h despues de la dosificacion en el grupo de 30 mg/kg que pueden estar potencialmente relacionadas con el artmulo de ensayo. Con respecto a los puntos finales neuroconductuales basicos evaluados en este estudio, el RTA 408 no produjo ningun efecto adverso en ratas a dosis de hasta e incluyendo 30 mg/kg.

4. Evaluacion Pulmonar de RTA 408 en Ratas

El efecto potencial de RTA 408 en la funcion pulmonar se evaluo en ratas. Tres grupos de tratamiento de ratas CD® [Crl:CD® (SD)] ocho machos y ocho hembras recibieron RTA 408 a niveles de dosis de 3, 10, o 30 mg/kg. Un grupo adicional de 8 animales/sexo sirvio como control y recibio vehnculo (aceite de sesamo). El vehnculo o RTA 408 se administro a todos los grupos a traves de una sonda oral una vez en el dfa 1 a un volumen de dosis de 10 mL/kg.

Las observaciones de mortalidad, morbilidad, lesiones y disponibilidad de alimentos y agua se realizaron dos veces al dfa para todos los animales. Las observaciones clmicas se realizaron antes de la dosificacion, aproximadamente 4 h despues de la dosis, y despues de la finalizacion del penodo de monitorizacion pulmonar de 8-h. Los pesos corporales se midieron y se registraron en el dfa de la administracion de RTA 408. La funcion pulmonar (tasa respiratoria, volumen tidal y volumen por minuto) se monitorizo durante al menos 1 h antes de la dosificacion para establecer un valor basal y durante al menos 8 h despues de la dosis.

El RTA 408 a dosis de 3, 10 y 30 mg/kg no produjo mortalidad, observaciones clmicas adversas, o efectos en cualquiera de los parametros pulmonares evaluados. Por lo tanto, con respecto a los puntos finales pulmonares basicos evaluados en este estudio, el RTA 408 no produjo ningun efecto adverso en ratas a dosis de hasta e incluyendo 30 mg/kg.

E. Descripcion General No Clinica

1. Farmacocinetica

El RTA 408 se ha investigado tanto in vitro como in vivo para evaluar sus propiedades PK y metabolismo. Se han realizado estudios in vitro para determinar la union a protemas plasmaticas de RTA 408 y la particion de sangre/plasma, inhibicion e induccion del citocromo P450 (CYP450), y para identificar los metabolitos formados por microsomas de hngado de ratones, ratas, monos y seres humanos. Los datos relativos a la absorcion y la distribucion in vivo despues de la administracion repetida de RTA 408 se han obtenido principalmente a traves de la monitorizacion de los niveles de farmaco en plasma y tejidos selectos de los estudios de toxicologfa. Los metodos

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bioanaltticos sensibles y selectivos basados en cromatograffa Uquida y espectrometna de masas (LC/MS/MS) se han utilizado para medir las concentraciones de RTA 408 en plasma, sangre y tejidos con exactitud y precision apropiadas. Las mediciones se realizaron en espectrometros de masas TQD y QTof (Waters).

a. Absorcion

La absorcion y el comportamiento farmacocinetico sistemico de RTA 408 se estudiaron en ratones, ratas y monos despues de la administracion oral unica y repetida (diariamente). Despues de la administracion oral de una formulacion de suspension a dosis de 10 a 100 mg/kg, las concentraciones maximas se observaron dentro de 1 a 2 h en ratones, y dentro de 1 a 24 h en ratas y monos. La exposicion sistemica a RTA 408 tendio a ser mas alta en ratas, con niveles inferiores observados en ratones y monos. Las estimaciones de la vida media terminal aparente de RTA 408 observada despues de la administracion oral estuvieron generalmente en el intervalo de 6 a 26 h, aunque la fase de absorcion prolongada aparente en algunos casos impidio el calculo de una estimacion de la vida media definitiva.

La exposicion sistemica a RTA 408 fue generalmente similar en machos y hembras. La exposicion a RTA 408 despues de la administracion oral diaria repetida tendio a ser ligeramente mayor (<2 veces) que la exposicion observada despues de una dosis unica. La administracion de RTA 408 en un intervalo de dosis de 3 a 100 mg/kg en una formulacion de suspension generalmente dio lugar a aumentos proporcionales a la dosis en la exposicion sistemica. Sin embargo, la administracion de dosis mayores (100 a 800 mg/kg en monos, 500 a 2.000 mg/kg en ratas) no dio lugar a aumentos similares en la exposicion, lo que sugiere la saturacion de la absorcion a dosis superiores a 100 mg/kg. Despues de la administracion oral de una formulacion de capsula (relleno suelto) no optimizada de RTA 408 (3 mg/kg) a monos, la exposicion sistemica normalizada por la dosis tendio a ser un poco menor que la observada con una formulacion de suspension.

La absorcion y el comportamiento farmacocinetico sistemico de RTA 408 se estudiaron en ratas utilizando la administracion topica unica y repetida. La administracion de RTA 408 en un intervalo de 0,01% a 3% mostro concentraciones en plasma menores en relacion con la dosificacion oral similar. La exposicion sistemica a RTA 408 generalmente aumento de una manera dependiente de la dosis. La administracion topica se formulo como una suspension en aceite de sesamo.

Utilizando conejos, se evaluo la absorcion ocular y el comportamiento farmacocinetico sistemico de RTA 408. El RTA 408 se administro topicamente al ojo una vez al dfa durante cinco dfas. La administracion ocular mostro concentracion en plasma menor de RTA 408 con relacion a cuando el RTA 408 se administro por via oral (FIG. 36). La cantidad de rTa 408 en el plasma incluso despues de cinco dfas consecutivos mostro solo un pequeno cambio en comparacion con la concentracion despues de la primera dosis con respecto a cuando el RTA 408 se administro por via oral, donde las concentraciones en plasma fueron casi 100 veces mayores (FIG. 36).

b. Distribucion

La union a protemas plasmaticas de RTA 408 se evaluo en plasma de raton, rata, conejo, perro, cerdo enano, mono, y humano a concentraciones de RTA 408 de 10-2.000 ng/mL utilizando la metodologfa de ultracentrifugacion. El RTA 408 se unio extensamente a las protemas plasmaticas. La union a protemas plasmaticas en la especie no clmica vario desde 93% (raton) a >99% (cerdo enano), con la union de 95% en la especie de toxicologfa (rata y mono) y 97% en seres humanos. No hubo evidencia de la union a protema dependiente de la concentracion en ninguna especie ensayada. Los resultados de los experimentos de particion de sangre a plasma indican que el RTA 408 tendio a distribuirse principalmente en la fraccion de plasma de la sangre de una manera lineal, con relaciones de sangre:plasma < 1,0 para todas las especies y todas las concentraciones ensayadas.

La distribucion de RTA 408 en los tejidos se ha investigado despues de la administracion oral a ratones, ratas y monos. En los estudios de toxicidad sin GLP de 14 dfas, tejidos selectos (hugado, pulmon y cerebro) se recogieron en un punto de tiempo unico (4 h para la rata y raton; 24 h para el mono) despues que la dosis final del estudio se administro y se analizaron para contenido de RTA 408 utilizando LC/MS/MS. El RTA 408 se distribuye facilmente en el pulmon, tugado y cerebro. En el pulmon, las concentraciones de RTA 408 a 4 h en ratones y ratas fueron similares o ligeramente mayores (<2 veces) que las concentraciones en plasma, mientras que, a 24 h en monos, las concentraciones de RTA 408 en el pulmon fueron 6 a 16 veces mayores que las concentraciones en plasma. Un patron similar se observo para el cerebro. En contraste, las concentraciones de RTA 408 en el tugado fueron 5 a 17 veces mayores que el plasma para ratones y ratas a 4 h, y 2 a 5 veces mayores que el plasma a 24 h en monos.

Los efectos farmacodinamicos de RTA 408 en los tejidos se evaluaron en ratones, ratas y monos, monitorizando la induccion de genes diana de Nrf2 en los mismos tejidos recogidos para la exposicion al farmaco de los estudios de toxicidad de 14 dfas. La induccion de genes diana de Nrf2 por RTA 408 dio lugar a aumentos en la respuesta antioxidante como se manifiesta por los aumentos dependientes de la dosis en la actividad enzimatica de NQO1, glutation S-transferasa (Gst) y glutation reductasa (Gsr) en los tejidos examinados. Se midieron las actividades enzimaticas como se describe anteriormente. Ademas, en roedores, el contenido de RTA 408 en el tugado se correlaciono con el nivel de la actividad enzimatica de NQO1, el gen diana prototfpico de Nrf2. En los monos, el nivel de la expresion de ARNm en las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) tanto para NQO1 como

sulfirredoxina 1 (SRXN1) se correlaciono con la exposicion plasmatica de RTA 408 (FIGS. 37a y b). En general, el RTA 408 indujo biomarcadores de Nrf2 en roedores y monos, y tales inducciones en general se correlacionaron bien con la exposicion de tejido y plasma a RTA 408.

Cuando el RTA 408 se administro a conejos via la administracion topica ocular, las concentraciones mas altas del 5 compuesto se encontraron en la cornea, retina o iris mientras que el humor vftreo, humor acuoso, y plasma mostraron concentraciones significativamente menores de RTA 408 (FIG. 38).

c. Metabolismo

El metabolismo de RTA 408 se ha investigado despues de la incubacion in vitro de RTA 408 durante 60 minutos con microsomas de tngado de ratones, ratas, monos y seres humanos en la presencia de un sistema de regeneracion de 10 nicotinamida adenina dinucleotido fosfato (NADPH) y una mezcla de reaccion de uridina difosfato glucuroniltransferasa (UGT). El recambio extenso de RTA 408 se observo con microsomas de primates, con <10% de la molecula parental permaneciendo al final de la incubacion de 60 min en microsomas tanto de monos como humanos. En contraste, el grado de metabolismo fue menor en los microsomas de roedores, con > 65% de la molecula parental permaneciendo al final de la incubacion. La falta de estandares autenticos disponibles para los 15 distintos metabolitos potenciales de RTA 408 impidio la evaluacion cuantitativa de los metabolitos observados. Desde una perspectiva cualitativa, se observo un patron similar de metabolitos de RTA 408 a traves de especies, y se incluyeron picos con masas consistentes con la reduccion e hidroxilacion de RTA 408, asf como la glucuronidacion de RTA 408, o de sus metabolitos de reduccion/hidroxilacion. No se observaron metabolitos humanos unicos, con todos los picos en las incubaciones de microsomas humanos tambien siendo observados en 20 una o mas de las especies preclmicas. En particular, con base en los datos de microsomas in vitro, todos los metabolitos humanos estuvieron presentes en la rata o mono, las especies de toxicidad de roedor y no roedor seleccionadas.

d. Interacciones de Farmaco Farmacocineticas

El potencial de RTA 408 para inhibir el metabolismo mediado por citocromo P450 (CYP450) se evaluo utilizando 25 microsomas hepaticos humanos combinados y sustratos estandares para las enzimas CYP450 espedficas. El RTA 408 directamente inhibio CYP2C8 y CYP3A4/5 con valores Ki de aproximadamente 0,5 pM para cada enzima. No se observo inhibicion significativa para las otras enzimas ensayadas (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, o CYP2D6), con inhibicion <50% a la concentracion mas alta ensayada (3 pM). Ademas, hubo poca o ninguna evidencia de inhibicion dependiente del metabolismo de cualquiera de las enzimas ensayadas. Los futuros estudios 30 que investigan el potencial de las interacciones de farmaco-farmaco mediadas por CYP3A4/5 se pueden garantizar con base en estos datos, y las concentraciones potencialmente altas que se pueden lograr localmente en el tracto gastrointestinal (GI) despues de la administracion oral.

El potencial de RTA 408 para inducir la expresion de la enzima CYP450 se evaluo utilizando hepatocitos humanos cultivados. Bajo condiciones donde los inductores prototfpicos causaron los aumentos esperados en la actividad de 35 CYP, el RTA 408 (hasta 3 pM) no fue un inductor de la actividad enzimatica de CYP1A2, CYP2B6 o CYP3A4 en hepatocitos humanos cultivados. La actividad enzimatica se midio monitorizando la conversion de sustrato de fenacetina, bupropion, y testosterona para CYP1A2, CYP2B6, y CYP3A4, respectivamente, en microsomas aislados.

F. Efectos de RTA 408 en la Dermatitis por Radiacion Aguda

Se han examinado los efectos de RTA 408 como un preventivo topico u oral para la dermatitis por radiacion aguda. 40 Utilizando ratones macho BALB/c, una dosis de radiacion de 30 Gy se administro en el dfa 0 (Tabla 3). El vehfculo aceite de sesamo o RTA 408 se administro a las ratas en el dfa -5 a -1 y dfas 1 a 30. El RTA 408 se administro tanto por via oral en 3, 10, y 30 mg/kg de aceite de sesamo como por via topica en el porcentaje de composicion de 0,01%, 0,1% y 1% en aceite de sesamo. La dermatitis se evaluo a ciegas cada dos dfas desde el dfa 4 al dfa 30. En el dfa 12, se observo el pico tfpico de dermatitis y 4 ratones se sacrificaron 4 horas despues de la administracion de 45 la dosis. Los ratones restantes se sacrificaron en el dfa 30 a 4 h despues de la dosis. El plasma se recogio en los dfas 12 y 30 asf como las muestras de piel irradiadas para examen de ARNm e histologico.

Tabla 3: Diseno del Estudio del Modelo de Dermatitis por Radiacion Aguda

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(aceite de sesamo)

4

14 machos 30 Gy RTA 408 -0,01% o 3 mg/kg Dfa -5 a -1 y Dfa 1 a 30

5

14 machos 30 Gy RTA 408 -0,1% o 10 mg/kg Dfa -5 a -1 y Dfa 1 a 30

6

14 machos 30 Gy RTA 408 - 1% o 30 mg/kg Dfa -5 a -1 y Dfa 1 a 30

En los grupos de ensayo donde los ratones se trataron con RTA 408, la incidencia de dermatitis parecio ser disminuida ligeramente en gravedad cuando el RTA 408 se dio ya sea en una administracion oral o topica (FIGS. 39-42). Ademas, las curvas que representan la puntuacion clmica de dermatitis media para los grupos 5 de ensayo como una funcion del tiempo muestran algun cambio con la administracion de RTA 408 ya sea en forma oral o topica de los grupos de ensayo no tratados (FIGS. 43-45) particularmente en el caso donde el RTA 408 se da a traves de una administracion oral. Ademas, como se puede ver en las Tablas 4 y 5 a continuacion, el porcentaje de ratones que sufren de dermatitis con una puntuacion clmica por encima de 3 fue significativamente menor para los ratones tratados con RTA 408 a traves de una administracion oral, mientras que el porcentaje de ratones que sufren 10 de dermatitis con una puntuacion clmica por encima de 2 fue ligeramente menor para los grupos de ensayo que recibieron una administracion topica de RTA 408.

Tabla 4: Porcentaje de ratones por grupo de prueba que puntuo por encima de 2 en su examen de dermatitis clinica y administrados con un tratamiento topico que contiene RTA 408

Dia 12 Dia 14 Dia 16 Dia 18 Dia 20 Dia 22 Dia 24 Dia 26 Dia 28 Dia 30 % animal- dias >=2 % animal- dias >=3

1

sin radiacion, notratado 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

2

irradiado, no tratado 0,0 50,0 83,3 83,3 83,3 100,0 66,7 50,0 50,0 50,0 35,6 0,0

3

irradiado, aceite de sesamo 21,4 45,0 60,0 50,0 40,0 40,0 0,0 0,0 0,0 0,0 16,6 0,0

4

irradiado, RTA 408-0,01% 0,0 0,0 20,0 50,0 10,0 40,0 40,0 40,0 20,0 10,0 14,4 0,0

5

irradiado, RTA 408-0,1 % 7,1 10,0 20,0 80,0 60,0 40,0 30,0 10,0 0,0 0,0 16,3 0,0

6

irradiado, RTA 408-1,0% 10,7 20,0 10,0 70,0 30,0 10,0 0,0 0,0 0,0 0,0 9,7 0,0

oo Tabla 5: Porcentaje de ratones por grupo de prueba que puntuo por encima de 3 en su examen de dermatitis clinica y administrados con un tratamiento oral que contiene RTA 408

Dia 16 Dia 18 Dia 20 Dia 22 Dia 24 Dia 26 Dia 28 % animal-dias >=2 % animal-dias >=3

1

sin radiacion, notratado 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0

2

irradiado, no tratado 20 40 20 20 20 20 20 39,0 8,8

3

irradiado, aceite de sesamo 35 50 40 30 20 0 0 45,6 10,9

4

irradiado, RTA 408-3 mg/kg 10 10 0 0 0 0 0 32,5 1,3

5

irradiado, RTA 408-10 mg/kg 10 25 30 0 0 0 0 33,8 4,1

6

irradiado, RTA 408-30 mg/kg 10 20 10 0 0 0 0 28,8 2,5

G. Efectos de RTA 408 en la Dermatitis por Radiacion Fraccionada

Utilizando RTA 408 a traves de la administracion topica, se midieron los efectos de RTA 408 hacia la mejora de los efectos de la dermatitis por radiacion fraccionada. Utilizando ratones Balb/c, el RTA 408 en una preparacion topica se administro a los ratones diariamente desde el dfa -5 al dfa 30 en tres dosis que vanan desde 0,0l% a 1%. Los 5 ratones fueron irradiados en los dfas 0-2 y 5-7 con seis dosis de 10 Gy al dfa. Las puntuaciones de dermatitis clmica para los ratones se evaluaron a ciegas cada dos dfas desde el dfa 4 hasta el final del estudio. En la FIG. 46, la grafica muestra el cambio en la puntuacion clmica promedio para cada grupo representado como una funcion del tiempo. La grafica muestra una mejora estadfsticamente significativa en las puntuaciones de los ratones tratados con 0,1% a 1% de formulaciones topicas de RTA 408. Los parametros del estudio y tratamiento se pueden encontrar en 10 la Tabla 6.

Tabla 6: Condiciones del Estudio para Dermatitis Inducida por Radiacion Fraccionada

Grupo

Numero de animales Radiacion (Dias 0-2, 5-7) Tratamiento Programa del tratamiento

1

9 machos — No tratado —

2

14 machos 6x 10 Gy No tratado —

3

18 machos 6x 10 Gy Control de vehmulo (aceite de sesamo) QD Dfas -5 a 30

4

18 machos 6x 10 Gy RTA 408 -0,01% QD Dfas -5 a 30

5

18 machos 6x 10 Gy RTA 408 -0,1% QD Dfas -5 a 30

6

18 machos 6x 10 Gy RTA 408 - 1% QD Dfas -5 a 30

Analizando las puntuaciones clmicas promedio que se muestran en la FIG. 46, se realizo un analisis de area bajo la curva (AUC), que produjo la severidad de la dermatitis con respecto a cuanto tiempo persistio la dermatitis. Este 15 analisis de AUC permitio la comparacion directa entre los diferentes grupos de ratones y el efecto de los diferentes porcentajes de composiciones de RTA 408 (FIG. 47 y Tabla 7). La administracion de formulaciones topicas de RTA 408 redujo las lesiones Grado 2 y Grado 3 de 60% y 33% cuando los ratones se expusieron solo al vehmulo a 21% y 6% con RTA 408 a concentracion de 1%, respectivamente. La otra composicion de RTA mostro alguna actividad, pero no fue tan significativa como la mostrada por la formulacion de 1%.

20 Tabla 7: Porcentaje de Puntuacion de Dermatitis para Cada Grupo de Tratamiento

Grupo

%Dias > 2 °/oDias > 3

Sin Rad., Sin Tx

0% 0%

Rad., Sin Tx

66% 31%

Rad., Aceite de sesamo

60% 33%

Rad., RTA 408 (0,01%)

54% 29%

Rad., RTA 408 (0,1%)

40% 13%

Rad., RTA 408 (1%)

21% 6%

H. Efectos Sinergicos de RTA 408 y Agentes Terapeuticos contra el Cancer en el Crecimiento de Tumor

Un estudio de los efectos de RTA 408 utilizado en combinacion con agentes quimioterapeuticos tradicionales se

49

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

realizo para determinar la eficacia del tratamiento potencial. Los estudios in vitro se realizaron para determinar los efectos de RTA 408 en dos diferentes lmeas celulares de cancer de prostata, LNCaP y DU-145. Como se puede ver en la FIG. 48a, el tratamiento de las lmeas celulares de cancer de prostata (LNCaP) in vitro con 5-fluorouracilo muestra un aumento estadfsticamente significativo en la citotoxicidad cuando se combino con RTA 408 a dosis que vanan desde 0,125 a 0,5 pM. Utilizando la lmea celular de prostata DU-145 y docetaxel, el RTA 408 amplifico la citotoxicidad del agente quimioterapeutico de una manera estadfsticamente significativa para la dosificacion de RTA 408 desde 0,125 a 0,75 pM como se muestra en la FIG. 48b. Esta evidencia apoya el concepto de que el RTA 408 podna actuar sinergicamente con agentes terapeuticos de cancer y se puede utilizar en algunas realizaciones para proporcionar una mayor eficacia en el tratamiento de pacientes con cancer.

Despues de los resultados exitosos del ensayo in vitro, se realizo un ensayo in vivo piloto utilizando cancer de prostata humano LNCaP/C4-2B y DU145 modificado geneticamente para expresar luciferasa de luciernaga (referido despues como C4-2B-Luc y DU145-Luc, respectivamente). Es de destacar que ambas lmeas celulares crecen de una manera independiente de androgenos. Las celulas se cultivaron en RPMi 1640 suplementado con 10% FBS. Las celulas se recogieron utilizando TrypLE Express (Invitrogen) y se lavaron en PBS y se contaron. Las celulas se reconstituyeron en PBS para llegar a una concentracion final de 3 x 106 celulas por 30 pL (a menos que se indique lo contrario) y se alicuoto en tubos separados. Se descongelo Matrigel reducido de factor de crecimiento (BD Bioscience) durante la noche a +4°C y se transfirio en los tubos en almuotas de 30 pL. Las disoluciones de celula/Matrigel se transfirieron al vivero y se mezclaron justo antes de la inyeccion a una relacion de 1:1. Cada raton (n = 1 por grupo para un total de tres animales) recibio una inyeccion subcutanea unica de las celulas de tumor. Los tumores se preestablecieron durante 4 semanas. Luego, un animal se trato con RTA 408 (17,5 mg/kg, i.p.) una vez al dfa durante 3 dfas (dfas -3 a -1). Al dfa siguiente (Dfa 0), los animales tratados con RTA 408 y otro animal se trataron con una dosis unica de IR 18 Gy, localizada en la region pelvica donde se implantaron los tumores. El raton que se trato previamente con RTA 408 recibio tres dosis adicionales de RTA 408 (17,5 mg/kg, i.p.), una vez cada dos dfas, durante la semana siguiente. El tercer animal no recibio tratamiento y sirvio como un control positivo. La progresion de tumor se monitorizo semanalmente a traves de formacion de imagenes en vivo. Para detectar celulas de tumor que expresan luciferasa, los ratones se inyectaron IP con D-luciferina 5 min antes de la formacion de imagenes de acuerdo con el protocolo del fabricante (Caliper LifeScience). Antes de la formacion de imagenes, los ratones se anestesiaron por inhalacion de isoflurano y se tomaron las imagenes en el sistema IVIS Lumina XR (Caliper LifeScience). Para la estandarizacion, el tiempo de exposicion mmimo necesario para tomar imagenes del tumor de control se determino y se tomaron imagenes de todos los animales bajo estas condiciones. En el Dfa 7, ninguna reduccion aparente del tamano del tumor fue visible en el animal tratado con IR en comparacion con el control, mientras que el animal que recibio tanto RTA 408 como IR mostro una imagen de tumor mas pequeno. En el Dfa 14 y Dfa 21, el animal de control mostro crecimiento y desarrollo de tumor continuo mientras que el animal tratado con radiacion ionizante mostro alguna mejora, muy notablemente en el Dfa 21. Por otro lado, el animal tratado con RTA 408 y radiacion ionizante no mostro progresion desde el dfa 7 al dfa 14 y no tuvo tumor visible en el Dfa 21. El progreso del tumor por semana se puede ver en la FIG. 49. Los datos tanto in vitro como in vivo muestran que el RTA 408 parece complementar la actividad de diferentes agentes terapeuticos contra el cancer aumentando asf la eficacia del agente.

I. Efectos de RTA 408 en un Modelo de Inflamacion Ocular

Un estudio de los efectos de RTA 408 en la inflamacion ocular se realizo utilizando conejos de la cepa albino de Nueva Zelanda. Los conejos se dividieron en 5 grupos de 12 conejos a los cuales se administraron tres concentraciones diferentes de RTA 408 (0,01%, 0,1% y 1%), Colirio Voltarene® a 0,1% y el vehmulo (aceite de sesamo). Se administraron a cada conejo tres instilaciones dentro de 60 minutos antes de la induccion de paracentesis y dos instilaciones dentro de 30 minutos despues de la induccion de paracentesis. Cada instilacion fue de 50 pL y se administraron en ambos ojos. El humor acuoso para 6 animales por punto de tiempo se recogio 30 min y de nuevo 2 h despues de la induccion de paracentesis. La cantidad de inflamacion se determino por la concentracion de protema en el humor acuoso. Como se muestra en la FIG. 50, el RTA 408 mostro una reduccion en la protema de humor acuoso similar a la de la concentracion mas alta de cualquiera de los otros compuestos de referencia (MaxiDex o mapracorat) a solo 0,01% RTA 408 en la formulacion. Los efectos de concentracion creciente de RTA 408 parecieron ser despreciables, ya que todas las concentraciones de RTA 408 parecieron mostrar efectos relativamente similares dentro del error en la reduccion de la concentracion de protema en humor acuoso.

J. Cribado de Polimorfo

Un estudio de pre-formulacion y polimorfismo se realizo para el compuesto 63415. Como parte de este estudio, un programa de polimorfismo preliminar se realizo con el objetivo de identificar la forma anhidra mas estable a temperatura ambiente e hidratos posibles con una probabilidad razonablemente alta. Se realizaron Un total de 30 experimentos de cristalizacion, incluyendo equilibrios de fase, experimentos de secado y otras tecnicas. Todos los solidos obtenidos se caracterizaron por espectroscopia de FT-Raman. Todas las nuevas formas se caracterizaron por PXRD y TG-FTIR, y opcionalmente por DSC y DVS.

Ademas, la forma amorfa se preparo y caracterizo. Varios experimentos utilizando diferentes tecnicas y procedimientos se realizaron para preparar la forma amorfa. La forma amorfa se caracterizo por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, TG-FTIR, DSC, DVS, y titulacion de Karl-Fischer. La estabilidad de la forma amorfa se ensayo en

condiciones de humedad y temperature elevadas durante el transcurso de cuatro semanas.

1. Material de Partida y Nomenclatura

Dos lotes de 63415 se utilizaron como materiales de partida (Tabla 8). El 63415 tambien es referido como PP415 en esta descripcion. Todas las muestras recibidas o generadas durante este proyecto recibieron un codigo de 5 identificacion unico de la forma PP415-Px, donde Px se refiere al numero de muestra/experimento (x = 1, 2, ..., n).

Tabla 8: Materiales de Partida

Muestra

Material Cantidad Recibido

PP415-P1

63415, lote #: 0141-66-1; PM = 554,7 g/mol, C33H44F2N2O3 5,0 g 25 de marzo, 2011

PP415-P40

63415, lote #: 2083-69-DC; PM = 554,7 g/mol, C33H44F2N2O3 5,0 g 27 de mayo, 2011

2. Compuesto 63415, lote #0414-66-1 (PP415-P1): La Forma Amorfa

El material de partida 63415, lote #0414-66-1, se caracterizo por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, TG-FTIR, 10 titulacion de Karl-Fischer, 1H-RMN, DSC, DVS, y mediciones de solubilidad aproximadas. Los resultados se resumen en la Tabla 9.

Tabla 9: Caracterizacion del material de partida 63415 (PP415-P1)

Metodo

Resultados

FT-Raman

se utilizara como la referencia

PXRD

sin patron de pico agudo, el material es amorfo

TG-FTIR

~0,9% en peso (~0,1 eq.) de EtOH con trazas de H2O desde 25°C a 200°C, descomposicion a T > 290°C

Karl-Fischer

0,5% en peso de H2O

'H-RMN

de acuerdo con la estructura, ~0,08 eq. de EtOH

DSC

1er barrido de calentamiento: transicion vftrea Tg = 152,7°C (ACp = 0,72 J/g°C); 2° barrido de calentamiento: transicion vftrea Tg = 149,7°C (ACp = 0,45 J/g°C)

DVS

ligeramente higroscopica; Am = +0,4% (50%^85% h.r.); FT-Raman y PXRD sin cambio

El espectro de FT-Raman (FIG. 58) se utilizara como el espectro de referencia para el material de partida. PXRD 15 (FIG. 59) no muestra patron de pico agudo. El halo amplio de ~10-20 °20 es caractenstico de los materiales amorfos.

El termograma de TG-FTIR (FIG. 60) muestra la perdida gradual ~0,9% en peso de EtOH (es decir, ~0,1 eq.) con trazas de H2O entre 25 y 200°C. La descomposicion se inicia a T > 290°C.

Un contenido de agua de 0,5% en peso se determino por titulacion de Karl-Fischer.

El espectro de 1H-RMN (FIG. 61) concuerda con la estructura y muestra ~0,08 eq. de EtOH, en concordancia con el 20 termograma de TG-FTIR.

El termograma de DSC (FIG. 62) muestra en un primer barrido de calentamiento una transicion vftrea del material amorfo a Tg = 152,7°C (ACp = 0,72 J/g°C). En un segundo barrido despues del enfriamiento rapido, la transicion vftrea ocurre a Tg = 149,7 °C (ACp = 0,45 J/g°C).

La isoterma de DVS (FIG. 63) muestra que una perdida de masa gradual de 1,0% en peso ocurrio al disminuir la 25 humedad relativa de 50% h.r. a 0% h.r.; el equilibrio se alcanzo a 0% h.r. Al aumentar la humedad relativa a 95% h.r. ocurrio una ganancia de masa gradual de 2,1% en peso (con respecto a la masa a 0% de h.r.); el equilibrio se alcanzo a 95% h.r. Al disminuir la humedad relativa desde 95% h.r. a 50% h.r., la masa final fue de 0,2% en peso por debajo de la masa de partida. El aumento de la masa de 0,4% en peso a 85% h.r. (con respecto a la masa de partida) clasifica la muestra como ligeramente higroscopica.

El espectro de FT-Raman (FIG. 64) y el patron de PXRD (FIG. 65) de la muestra despues de la medicion de DVS estan inalterados en comparacion con el espectro y patron de la muestra antes de la medicion.

La solubilidad aproximada del material de partida PP415-P1 se midio en doce solventes y cuatro mezclas de solventes a t.a. por dilucion manual combinada con la observacion visual (Tabla 10). Debido al error experimental 5 inherente en este metodo, los valores de solubilidad estan destinados a ser considerados como estimaciones aproximadas y estan para ser utilizados unicamente para el diseno de experimentos de cristalizacion. Todas las mezclas de solventes se enumeran como relaciones en volumen (v/v).

Tabla 10: Solubilidad aproximada del material de partida PP415-P1 (amorfo)

Solvente

Solubilidad S [mg/mL]

tolueno

S > 200

DCM

S > 200

EtOAc

S > 210

acetona

S > 230

MeCN

S > 230

DMF

S > 210

MeOH

S < 210

EtOHa

105 < S < 210

2PrOH

16 < S < 19

DEE

S > 1d

heptano

S < 1

H2O

S < 1

2PrOH / H2O (9:1)b

7,9 < S < 8,5

MeCN / H2O (2:3)c

S < 1

EtOAc / heptano (1:1)a

100 <S < 200

tolueno / DEE (1:1)a

S > 220

aprecipitacion observada despues de ~1d;

10 bactividad del agua a(H2O) ~0,7 a 25°C;

cactividad del agua a(H2O) > 0,9 a 50°C; ddisolucion incompleta al principio (S <1), pero el residuo solido se disolvio completamente durante la noche (S> 1).

3. Compuesto 63415, lote #2083-69-DC (PP415-P40): Clase 2

El 63415, lote #2083-69-DC, es un solvato de heptano. Este material (PP415-P40) se caracterizo por PXRD y se 15 encontro que corresponde a la clase 2 (FIG. 66).

La clase 2 probablemente corresponde a solvatos isoestructurales no estequiometricos (< 0,5 eq.) (de heptano, ciclohexano, isopropil eter, 1-butanol, trietilamina, y posiblemente otros solventes, tales como hexano y otros eteres) con solvente fuertemente unido.

Los pequenos picos visibles en el patron de PP415-P40 a 7,9 °20 y 13,8 °20 no corresponden a los picos de las 20 clases 3, 4, o 5. Su origen no esta claro en este punto.

4. Estabilidad Quimica de la Forma Amorfa

La estabilidad qmmica de la forma amorfa se investigo en diferentes solventes durante el transcurso de siete dfas.

Se prepararon disoluciones/suspensiones con una concentracion de 1 mg/mL en cuatro solventes organicos (acetona, MeOH, MeCN, EtOAc) y tres medios tensioactivos acuosos (1% SDS ac., 1% Tween 80 ac., 1% CTAB

52

ac.).

Se prepararon cuatro disoluciones/suspensiones separadas para cada solvente, se equilibraron durante 6 h, 24 h, 2 d, y 7 d y posteriormente se analizaron por HPLC.

El % de area relativa obtenido de los cromatogramas de HPLC se proporciona en la Tabla 11. El compuesto parece 5 ser algo inestable en el diluyente (0,1% acido formico en MeCN); durante el transcurso de la secuencia (es decir, dentro de ~24 horas) el % de area de una muestra de referencia (PP415-P1, corrida al inicio y al final de la secuencia) disminuyo desde 99,9% a 99,3% a 254 nm y desde 99,9% a 99,5% a 242 nm. Debido a este efecto, las muestras medidas hacia el final de la secuencia (establecidas en el siguiente orden: 7 d, 2 d, 24 h, 6 h), podnan estar afectadas y el % de area obtenido se podna subestimar.

10 Tabla 11: Experimentos de estabilidad quimica con la forma amorfa de 63415 (PP415-P1)a

a 254 nm a 242 nm

Solvente

7 d 2 d 24 h 6 h 7 d 2 d 24 h 6 h

acetona

99,6% 99,6% 99,6% 99,6% 99,7% 99,7% 99,6% 99,6%

EtOAc

99,8% 99,8% 99,8% 99,7% 99,8% 99,9% 99,8% 99,7%

MeOH

99,8% 99,8% 99,7% 99,8% 99,8% 99,9% 99,7% 99,8%

MeCN

97,7% 99,5% 99,3% 99,4% 97,4% 99,5% 99,3% 99,3%

Tween 1%b

97,7% 97,1% 95,1% 97,6% 98,7% 98,7% 96,2% 99,1%

SDS 1%c

99,7% 99,6% 99,7% 99,7% 99,8% 99,7% 99,7% 99,7%

CTAB 1%

99,3% 99,4% 99,4% 99,6% 99,3% 99,4% 99,4% 99,7%

a a la tercera longitud de onda (210 nm), la intensidad de la senal fue debil y la relacion de senal a ruido grande, por lo tanto, la integracion no se realizo

bsuspensiones, no todo el material se disolvio para todos los puntos de tiempo

csuspensiones, no todos los solidos se disolvieron para los puntos de tiempo de 24 h y 6 h

15 Se observo descomposicion > 1% para disoluciones en MeCN despues de siete dfas y para suspensiones en el medio Tween 80 acuoso al 1% (en todos los puntos de tiempo a 254 nm y despues de 24 h, 2 d, y 7 d a 242 nm).

5. Estabilidad en Almacenamiento de la Forma Amorfa

Para aprender mas acerca de sus propiedades fundamentales y estabilidad ffsica, la forma amorfa de 63415 se estreso por almacenamiento a temperaturas y humedades relativas elevadas.

20 Las muestras de la forma amorfa (el material de partida PP415-P1) se almacenaron abiertas a 25°C/~62% h.r. (en disolucion acuosa saturada de NH4NO3) y 40°C/~75% h.r. (en disolucion acuosa saturada de NaCl) y se cerraron a 60°C y 80°C (Tabla 12). En los puntos de tiempo 0 s, 1s, 2 s, y 4 s las muestras se examinaron por PXRD y se compararon con el material de partida, PP415-P1.

Tabla 12. Experimentos de estabilidad en almacenamiento con la forma amorfa de 63415 (PP415-P1)

Muestra

Condiciones Punto de tiempo Resultado de PXRD

PP415-P2a

abiertas, 25°C / ~62% h.r. 1 s amorfa

PP415-P2b

abiertas, 25°C / ~62% h.r. 2 s amorfa

PP415-P2c

abiertas, 25°C / ~62% h.r. 4 s amorfa

PP415-P3a

abiertas, 40°C / ~75% h.r. 1 s amorfa

PP415-P3b

abiertas, 40°C / ~75% h.r. 2 s amorfa

PP415-P3c

abiertas, 40°C / ~75% h.r. 4 s amorfa

5

10

15

20

25

Muestra

Condiciones Punto de tiempo Resultado de PXRD

PP415-P4a

cerradas, 60°C 1 s amorfa

PP415-P4b

cerradas, 60°C 2 s amorfa

PP415-P4c

cerradas, 60°C 4 s amorfa

PP415-P5a

cerradas, 80°C 1 s amorfa

PP415-P5b

cerradas, 80°C 2 s amorfa

PP415-P5c

cerradas, 80°C 4 s amorfa

Despues de una semana (punto de tiempo de 1 s, FIG. 67), dos semanas (punto de tiempo de 2 s, FIG. 68), y cuatro semanas (punto de tiempo 4 s, FIG. 69) todas las cuatro muestras eran todavfa amorfas, ya que los difractogramas de rayos X en polvo no muestran diferencias en comparacion con el material de partida en el punto de tiempo de 0 s.

6. Experimentos de Cristalizacion y Secado

a. Experimentos de Cristalizacion

Los experimentos de equilibrios de fase, cristalizaciones de disoluciones calientes, y evaporacion se realizaron partiendo de la forma amorfa para identificar con probabilidad razonablemente alta la forma anhidra mas estable a t.a. y posibles hidratos. Todos los materiales obtenidos se caracterizaron por espectroscopia de FT-Raman; las muestras seleccionadas tambien se caracterizaron por PXRD.

Los espectros de FT-Raman se agruparon en clases de acuerdo con la similitud de sus posiciones de picos. La muestra original (PP415-P1, vease la Tabla 8) se clasifico junto con los productos de cristalizacion. Los espectros dentro de una clase, sin embargo, no son estrictamente identicos, sino similares. Pueden existir pequenas diferencias y desplazamientos de pico. Considerando los espectros de FT-Raman solos, es diffcil determinar si los espectros de una clase pertenecen a la misma forma polimorfica.

Los picos en los patrones de PXRD se determinaron y los patrones luego se clasificaron en grupos utilizando el software PANalytical XPert (Highscore Plus). Estos grupos identifican patrones de una alta similitud. Sin embargo, existen diferencias pequenas pero significativas dentro de un grupo. Por lo tanto, los patrones dentro de un grupo no corresponden necesariamente a los mismos polimorfos, sino que representan diferentes formas con estructuras moleculares muy similares. Las clases de FT-Raman corresponden en todos los casos a los grupos de PXRD.

b. Experimentos de Equilibrio de Suspension

Los experimentos de equilibrio de suspension se realizaron en un solvente y once mezclas de solventes (Tabla 13). Las suspensiones de ~100 mg de PP415-P1 en 0,2-2,0 ml de los solventes seleccionados se prepararon y agitaron durante 4-15 dfas a 22-24°C. Los solidos se recuperaron y caracterizaron por espectroscopia de FT-Raman; la mayona se caracterizo tambien por PXRD.

Tabla 13. Experimentos de equilibrio de suspension partiendo de la forma amorfa (PP415-P1)

Muestra

Solvente/Mezcla Clase de FT-Raman Grupo de PXRD

PP415-P6

2PrOH 3 3

PP415-P7

1:2 EtOAc/heptano 2 2

PP415-P8

1:2 acetona/hexano 2 2

PP415-P9

1:3 tolueno/DEE 2d --

PP415-P10

1:3 MeOH/TBME 2 2

PP415-P11

1:2 MEK/ciclohexano 2d --

PP415-P12

9:1 EtOH/H2Oa 3 3

PP415-P13

7:3 MeCN/H2Ob 4d 4

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Muestra

Solvente/Mezcla Clase de FT-Raman Grupo de PXRD

PP415-P14

~1:1 THF/H2Oc 5d 5

PP415-P29

1:2 EtOAc/TEA 2 2

PP415-P31

9:1 PEG/H2O 1 1

PP415-P35

7:3 MeCN/H2Ob 4d 4

actividades acuosas': a a(H2O) ~0,5 a 50°C; b a(H2O) ~0,85 a 50°C; c a(H2O)> 0,99 a 64°C; d el espectro contiene senales de solvente

c. Cristalizaciones de Disoluciones Calientes

Las disoluciones calientes de PP415-P1 se prepararon en un solvente y cuatro mezclas de solventes (Tabla 14). Despues de enfriamiento lento a 5°C a una velocidad de ~0,2 K/min, se observo precipitacion en tres casos (-P20, - P21, -P24). En dos casos (-P22, -P23) no precipitaron solidos, incluso despues del almacenamiento a 4-5°C durante dos dfas. Aqm, el solvente se evaporo bajo flujo de N2 a t.a. Los solidos se recuperaron y caracterizaron por espectroscopia de FT-Raman y para aquellos con espectros diferentes del material de partida amorfo, clase 1 de FT- Raman, tambien por PXRD.

Tabla 14: Experimentos de enfriamiento lento partiendo de la forma amorfa (PP415-P1)

Muestra

Solvente/Mezcla Condiciones Clase de FT-Raman Grupo de PXRD

PP415-P20

~2:1 acetona/H2O 55°C^ 5°C 3b 3

PP415-P21

~1:5 EtOH/ciclohexano 75°C ^ 5°C 2 2

PP415-P22

~1:3 MeCN/tolueno 75°C ^ 5°Ca 1b --

PP415-P23

1:3 EtOAc/dioxano 75°C ^ 5°Ca 1b --

PP415-P24

1BuOH 75°C ^ 5°C 2b 2

asin precipitacion despues de enfriamiento lento y agitacion a 5°C durante 2 dfas; solvente evaporado bajo flujo de N2 a t.a.

bel espectro contiene senales de solvente

d. Experimentos de Evaporacion/Precipitacion

Se prepararon disoluciones claras de PP415-P1 en tres mezclas de solventes (Tabla 15). Los solventes luego se evaporaron lentamente a t.a. bajo condiciones ambientales. Sin embargo, en dos de los tres experimentos (-P15 y - P17) precipito un solido blanco antes que comenzara la evaporacion. Los solidos obtenidos se examinaron por espectroscopia de FT-Raman y PXRD.

Tabla 15. Experimentos de evaporacion lenta con la forma amorfa (PP415-P1)

Muestra

Solvente/Mezcla Clase de FT-Raman Grupo de PXRD

PP415-P15

1:2 DCM/IPE 2a 2

PP415-P16

1:2 MeOH/tolueno 1a --

PP415-P17

1:3 EtOAc/heptano 2a 2

a el espectro contiene senales de solvente e. Experimentos de Secado

Al menos una muestra de cada clase se seco bajo vacfo para desolvatar los solvatos y obtener formas cristalinas no solvatadas de 63415 (Tabla 16). Los materiales secos se caracterizaron adicionalmente por FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR.

Tabla 16. Experimentos de secado realizados en muestras obtenidas de los experimentos de cristalizacion

Muestra

Material de Partida (Clase) Condiciones Resultado

PP415-P18

PP415-P15 (2) t.a., 2-10 mbares, ~2 h 2

PP415-P19

PP415-P17 (2) t.a., 2-10 mbares, ~2 h 2

PP415-P25

PP415-P6 (3) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d 3

PP415-P26

PP415-P13 (4) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d 4

PP415-P27

PP415-P14 (5) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d 1a

PP415-P28

PP415-P21 (2) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d 2b

PP415-P30

PP415-P7 (2) 50-70°C, 1-10 mbares, 3 d 2

PP415-P32

PP415-P19 (2) 80°C, <1*10-3 mbares, 3 d 2b

PP415-P33

PP415-P25 (3) 80°C, <1*10-3 mbares, 3 d 3

PP415-P34

PP415-P28 (2) 80°C, <1*10-3 mbares, 3 d 2b

PP415-P36

PP415-P35 (4) 80°C, <1*10-3 mbares, 3 d 4c

PP415-P37

PP415-P35 (4) 80°C, flujo de N2, 3 d 4c

PP415-P44a

PP415-P41 (5) 80°C, 100 mbares, 2 d 1a

PP415-P46a

PP415-P45 (6) 80°C, 100 mbares, 4 d 1a

a desolvatacion exitosa, reduccion significativa de contenido de solvente, muestra principalmente amorfa; solo pocos picos amplios en PXRD

b muestra menos cristalina, como se indica por los picos mas amplios en PXRD

5 c desolvatacion exitosa, reduccion significativa de contenido de solvente, muestra todavfa cristalina; ningun cambio en la estructura

7. Caracterizacion de Nuevas Formas (Clases)

a. Resumen de Nuevas Clases

Ademas de la forma amorfa de 63415, cuatro nuevas formas cristalinas se obtuvieron en este estudio (Tabla 17).

10 Tabla 17. Resumen de las clases obtenidas

Clase

Caracteristicas Resultado de los experimentos de secado

Clase 1

forma amorfa --

Clase 2

solvatos isoestructurales (por ejemplo, heptano) secado no exitoso

Clase 3

solvatos isoestructurales (por ejemplo, etanol) secado no exitoso

Clase 4

Solvato de MeCN y solvato desolvatado secado exitoso, estructura sin cambio

Clase 5

Solvato de THF secado resulto en forma amorfa

Clase 2: La mayona de los experimentos de cristalizacion resultaron en material solido de la clase 2. Estas muestras probablemente corresponden a solvatos no estequiometricos isoestructurales (<0,5 eq) (de heptano, ciclohexano, isopropil eter, 1-butanol, trietilamina, y posiblemente hexano y otros eteres, etc.) con las moleculas de solvente 15 fuertemente unidas. Los espectros de Raman y patrones de PXRD dentro de esta clase son muy similares entre sf, por lo tanto, las estructuras podnan ser esencialmente identicas con solo pequenas diferencias debido a los diferentes solventes que se incorporaron.

Los experimentos de secado en muestras de la clase 2 no han resultado en una forma no solvatada cristalina. Incluso las temperaturas elevadas (80°C) y un alto vacfo (<1x10-3 mbares) no pudieron eliminar las moleculas de 20 solvente fuertemente unidas por completo; siempre permanecio un contenido de solvente > 2% en peso. La cristalinidad de estas muestras se redujo, pero no se observo transformacion en una estructura diferente ni

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amorfizacion sustancial.

Clase 3: El material solido de la clase 3 se obtuvo de varios experiments de cristalizacion. Las muestras de la clase 3 son probablemente solvatos isoestructurales de 2PrOH, EtOH, y probablemente acetona con moleculas de solvente fuertemente unidas. Podnan corresponder ya sea a hemisolvatos estequiometricos o solvatos no estequiometricos con un contenido de solvente de ~0,5 eq. Como con la clase 2, los espectros de Raman y patrones de PXRD dentro de esta clase son muy similares entre sf, lo que indica estructuras similares que incorporan diferentes solventes.

Similar a la clase 2, los experimentos de secado tampoco fueron exitosos. Las moleculas de solvente muy fuertemente unidas solo pudieron ser eliminadas parcialmente (~5,4% en peso a ~4,8% en peso, hasta 3 d a 1x10-3 mbares y 80°C). El patron de PXRD permanecio sin cambios.

Clase 4: El material de la clase 4 solo se obtuvo de un sistema de solventes 7:3 MeCN/H2O. Muy probablemente corresponde a un hemisolvato de acetonitrilo cristalino.

Por secado (bajo vado o flujo de N2 a temperaturas elevadas) la mayona del solvente se pudo eliminar sin cambiar o destruir la estructura cristalina (el PXRD permanecio sin cambios). Por lo tanto, se obtuvo una forma no solvatada cristalina (o mas bien solvato desolvatado). Es ligeramente higroscopica (ganancia de masa de ~0,7% en peso desde 50% h.r. a 85% h.r.) y tiene un posible punto de fusion a 196,1°C (AH = 29,31 J/g).

Clase 5: La clase 5 tambien se obtuvo de solo un sistema de solventes (~1:1 THF/H2O) y contiene THF unido (y tal vez H2O). Como el contenido de los dos componentes no se puede cuantificar por separado, la naturaleza exacta de este solvato cristalino no se puede determinar.

El secado de la clase 5 resulto en la desolvatacion completa y transformacion en la forma amorfa (clase 1). Un proceso posible para preparar la forma amorfa a partir de material de la clase 2 es una transformacion de la clase 2 a la clase 5, seguida por secado y amorfizacion.

b. Clase 1 - La Forma Amorfa

La Clase 1, la forma amorfa de 63415, se obtuvo de unos cuantos experimentos de cristalizacion (Tabla 18). La mayona de los experimentos de cristalizacion resultaron en material cristalino de las clases 2, 3, 4, o 5.

El material de partida, PP415-P1, es amorfo y pertenece a la clase 1. Se realizaron experimentos adicionales, dirigidos exclusivamente a la preparacion de la forma amorfa (clase 1).

Tabla 18. Experimentos de cristalizacion resultantes en material solido de la clase 1

Muestra

Metodo Solvente Caracterizacion Secado

PP415-P31

equil. de susp. 9:1 PEG/H2O Raman, PXRD --

PP415-P22

enfriamiento lentoa ~1:3 MeCN/tolueno obs. vis., Raman --

PP415-P23

enfriamiento lento 1:3 EtOAc/dioxano obs. vis., Raman --

PP415-P16

evap./precip. 1:2 MeOH/tolueno obs. vis., Raman --

a sin precipitacion despues del enfriamiento lento y agitacion a 5°C durante 2 dfas; solvente evaporado bajo flujo de N2a t.a.

c. Clase 2 - Solvatos Isoestructurales (por ejemplo, Heptano)

La mayona de los experimentos de cristalizacion resultaron en material solido de la clase 2 (Tabla 19). Ademas, un lote de un solvato de heptano clase 2, PP415-P40, se utilizo como material de partida (vease Tabla 8).

Los espectros de FT-Raman de la clase 2 son claramente similares entre sf (FIG. 70), pero muestran pequenas diferencias. Difieren significativamente del espectro del material de partida amorfo, clase 1 (FIG. 71) y de los espectros de las clases 3, 4 y 5 (FIG. 72).

Los patrones de PXRD de la clase 2 (FIG. 73) confirman la cristalinidad de los materiales. Los patrones de las muestras son muy similares entre sf, pero muestran pequenas diferencias (Fig. 74). Los patrones de la clase 2 difieren claramente de los patrones de las clases 3, 4 y 5 (FIG. 75).

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P7 (FIG. 76) muestra la perdida de ~7,5% en peso de EtOAc y heptano en dos etapas desde ~100°C a 290°C y descomposicion a temperaturas T > 290°C. Antes de los experimentos de TG-FTIR, las muestras se secaron brevemente (durante ~5 min) bajo vado (10-20 mbares) para remover el exceso de solvente no unido. La perdida tanto de EtOAc como heptano ocurre conjuntamente en el

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mismo intervalo de temperatura; ambos solventes parecen estrechamente unidos dentro de la estructura. El contenido teorico de EtOAc (p.e. = 76°C) de un hemisolvato es 7,4% en peso, el contenido teorico de heptano (p.e. = 98°C) de un hemisolvato es 8,3% en peso. Desafortunadamente, el contenido de los dos componentes no se puede cuantificar por separado.

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P21 (FIG. 77) muestra la perdida de ~5,8% en peso de ciclohexano en dos etapas desde ~140°C a ~250°C y descomposicion a temperaturas T > 250°C. Con el punto de ebullicion de ciclohexano a 81°C, el solvente parece fuertemente unido dentro de la estructura. El contenido teorico de ciclohexano de un hemisolvato es 7,1% en peso. Por lo tanto, la muestra PP415-P18 posiblemente corresponde a un solvato de ciclohexano no estequiometrico (con < 0,5 eq. de contenido de solvente).

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P24 (FIG. 78) muestra la perdida de ~16,6% en peso de IBuOH en una etapa desde ~50°C a ~160°C, perdida adicional de IBuOH (6,6% en peso) en una segunda etapa desde 160°C a 23o°C y descomposicion a temperaturas T > 230°C. Con el punto de ebullicion de IBuOH a 117°C, el solvente de al menos la segunda etapa parece fuertemente unido dentro de la estructura. El contenido teorico de IBuOH de un hemisolvato es 6,3% en peso.

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P29 (FIG. 79) muestra la perdida de ~5,1% en peso de EtOAc y TEA desde ~50°C a ~220°C, la mayona en una etapa desde 180°C a 210°C. La descomposicion ocurre a temperaturas T > 220°C. La perdida tanto de EtOAc como TEA ocurre conjuntamente en el mismo intervalo de temperatura; ambos solventes parecen fuertemente unidos dentro de la estructura (con el punto de ebullicion de EtOAc a 77°C y de TEA a 89°C).

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P47 (FIG. 80) muestra la perdida de masa de dos etapas tfpica para la clase 2 (total de ~7,9% en peso EtOAc) a temperaturas de hasta 240°C, lo que indica moleculas de solvente muy fuertemente unidas.

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P48 (FIG. 81) muestra la perdida de masa de ~3,5% en peso de formiato de etilo y agua, primero gradualmente y luego en una etapa clara entre 180°C y 200°C. Puede haber perdida adicional de formato de etilo concomitante con la descomposicion a T > 240°C.

Por lo tanto, las muestras de la clase 2 pueden corresponder todas a solvatos isoestructurales no estequiometricos (<0,5 eq.), con moleculas de solvente fuertemente unidas. Como los espectros Raman y patrones de PXRD dentro de esta clase son muy similares entre sf, las estructuras pueden ser esencialmente identicas entre sf con solo pequenas distorsiones de las dimensiones de celula unitaria o pequenos cambios de posiciones atomicas dentro de la celula unitaria, debido a los diferentes tamanos y formas de las moleculas de solvente incorporadas.

Tabla 19: Experimentos de cristalizacion resultantes en material solido de la clase 2

Muestra

Metodo Solvente Caracterizacion Secado

PP415-P7

equil. de susp. 1:2 EtOAc/heptano Raman, PXRD, TG-FTIR x

PP415-P8

equil. de susp. 1:2 acetona/hexano Raman, PXRD --

PP415-P9

equil. de susp. 1:3 tolueno/DEE Raman, PXRD --

PP415-P10

equil. de susp. 1:3 MeOH/TBME Raman, PXRD --

PP415-P11

equil. de susp. 1:2 MEK/ciclohexano Raman --

PP415-P29

equil. de susp. EtOAc/TEA Raman, PXRD, TG-FTIR --

PP415-P15

evap./precip. 1:2 DCM/IPE Raman, PXRD x

PP415-P17

evap./precip. 1:3 EtOAc/heptano Raman, PXRD x

PP415-P21

enfriamiento lento ~1:5 EtOH/ciclohexano Raman, PXRD, TG-FTIR x

PP415-P24

evap./precip. 1BuOH Raman, PXRD, TG-FTIR --

PP415-P43a

evaporacion (8:2) THF/hexano PXRD --

Muestra

Metodo Solvente Caracterizacion Secado

PP415-P473

evaporacion EtOAc PXRD, TG-FTIR --

PP415-P483

evaporacion formato de etilo PXRD, TG-FTIR --

amaterial de partida: PP415-P40, clase 2; en todos los otros experimentos se utilizo PP415-P1, clase 1, como material de partida.

d. Experimentos de Secado en Muestras de la Clase 2

Varias muestras de la clase 2 se secaron bajo vado (y algunas a temperatures elevadas) y en un intento de 5 desolvatarlas con el proposito de obtener una forma anhidra de 63415. Los detalles y caracterizaciones de las muestras secadas se proporcionan a continuacion en la Tabla 20.

Sin embargo, incluso el secado durante tres dfas a 80°C y un vado <1x10-3 mbares no pudo eliminar las moleculas de solvente fuertemente unidas por completo; se mantuvo un contenido de solvente > 2% en peso (ver muestras - P32 y -P34). Los patrones de PXRD muestran una cristalinidad reducida de estas muestras, pero no se observo 10 transformacion en una estructura diferente.

Tabla 20. Experimentos de secado en muestras clase 2

Material de Partida

Secado Material secado

Muestra

Contenido de solvente Condiciones Muestra Contenido de solvente Clase

PP415-P7

EtOAc/heptano (~7,5%) 50-70°C, 1-10 mbares, 3 d PP415-P30 heptano (~2,5%) 2

PP415-P15

IPE (desconocido) t.a., 2-10 mbares, ~2 h PP415-P18 IPE (~7,0%) 2

PP415-P17

EtOAc(?)/heptano (desconocido) t.a., 2-10 mbares, ~2 h PP415-P19 heptano (~7,6%) 2

PP415-P19

heptano (~7,6%) 80°C, <1x10'3 mbares, 3 d PP415-P32 heptano (~2,2%) 2a

PP415-P21

ciclohexano (~5,8%) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2x1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d PP415-P28 ciclohexano (~3,0%) 2a

PP415-P28a

ciclohexano (~3,0%) 80°C, <1x10'3 mbares, 3 d PP415-P34 ciclohexano (~2,3%) 2a

a de acuerdo con PXRD un poco menos cristalina

De este modo, los solvatos clase 2 parecen tener moleculas de solvente muy fuertemente unidas. Son diffciles de desolvatar o transformar/amorfizar.

15 e. PP415-P7 ^ PP415-P30

El material solido de la muestra PP415-P7, clase 2, obtenido de un experimento de equilibrio de suspension en 1:2 EtOAc/heptano se seco (como PP415-P30) bajo vado durante varios dfas (1-10 mbares, 50-70°C).

El espectro de FT-Raman del material secado de la clase 2 (PP415-P30) muestra pequenas diferencias del espectro original (muestra PP415-P7, FIG. 82), pero aun corresponde a la clase 2.

20 El patron de PXRD del material secado de la clase 2 (PP415-P30) muestra picos menos intensos ligeramente mas amplios (FIG. 83), pero aun corresponde a la clase 2.

El termograma de TG-FTIR de la muestra secada PP415-P30 (FIG. 84) muestra la perdida de ~2,5% en peso de heptano (y algo de EtOAc) en dos etapas desde ~50°C a ~250°C y descomposicion a temperaturas T > 250°C. En comparacion con el TG-FTIR de la muestra PP415-P7 (FIG. 76), las dos etapas de perdida de solvente se 25 conservan, pero la cantidad total de solvente en la muestra ha disminuido desde ~7,5% en peso de PP415-P7 a

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~2,5% en peso de PP415-P30.

Por lo tanto, el intento de desolvatar este solvato a temperatures elevadas (50-70°C) y un vado de 1-10 mbares) ha causado solo una perdida parcial de solvente.

f. PP415-P15 ^ PP415-P18

El material solido de la muestra PP415-P15, clase 2, obtenido de un experimento de precipitacion en 1:2 DCM/IPE se seco (como PP415-P18) bajo vado (~2-20 mbares) a t.a. durante ~2 h.

El espectro de FT-Raman de PP415-P18 es identico al espectro de la muestra PP415-P15 (FIG. 85), ambos corresponden a la clase 2.

El patron de PXRD de PP415-P18 muestra pequenas diferencias con el patron de PP415-P15 (FIG. 86). PP415-P18 aun corresponde a la clase 2.

El termograma de TG-FTIR (FIG. 87) muestra la perdida de ~7,0% en peso de IPE en dos etapas desde ~140°C a ~250°C y descomposicion a temperaturas T > 25o°C. Con el punto de ebullicion de IPE siendo 67°C, el solvente parece fuertemente unido dentro de la estructura. El contenido teorico de IPE de un hemisolvato es 8,4% en peso.

Desafortunadamente, no se registro el TG-FTIR del material antes de la etapa de secado. Sin embargo, como el solvente parece tan fuertemente unido dentro de la estructura y no se observaron cambios (o solo pequenos) en los espectros de FT-Raman y patrones de PXRD, se asume que el secado no ha tenido ningun efecto significativo en la estructura o contenido de solvente.

g. PP415-P17 ^ PP415-P19 ^ PP415-P32

El material solido de la muestra PP415-P17, clase 2, obtenido de un experimento de precipitacion en 1:3 EtOAc/heptano se seco (como PP415-P19) bajo vado (~2-20 mbares) a t.a. durante ~2 h.

El espectro de FT-Raman de PP415-P19 es identico al espectro de la muestra PP415-P17 (FIG. 88); no se pueden observar cambios, y ambos corresponden a la clase 2.

El patron de PXRD de PP415-P19 difiere ligeramente del patron de PP415-P17 (FIG. 89), pero aun corresponde a la clase 2.

El termograma de TG-FTIR (FIG. 90) muestra la perdida de ~7,6% en peso de heptano en dos etapas desde ~140°C a ~270°C y descomposicion a temperaturas T > 270°C. Con el punto de ebullicion de heptano siendo 98°C, el solvente parece fuertemente unido dentro de la estructura. El contenido teorico de heptano de un hemisolvato es 8,3% en peso.

Un experimento de secado adicional (80°C, <1x10-3 mbares, 3 dfas) se realizo en la misma muestra como PP415- P32.

El espectro de FT-Raman permanecio sin cambios (FIG. 88). El patron de PXRD aun correspondio a la clase 2 (FIG. 89), pero la muestra fue menos cristalina (ya que los picos fueron mas amplios y tuvieron una relacion de S/N menor).

El termograma de TG-FTIR (FIG. 90) muestra la perdida de ~2,2% en peso de heptano, la mayor parte en una etapa de 170°C a 200°C y descomposicion a temperaturas T > 250°C.

Por lo tanto, el contenido de heptano se redujo solo desde 7,6% en peso a 2,2% en peso, confirmando la union fuerte de las moleculas de solvente.

h. PP415-P21 ^ PP415-P28 ^ PP415-P34

El material solido de la muestra PP415-P21, clase 2, obtenido de un experimento de enfriamiento lento en ~1:5 EtOH/ciclohexano se seco (como PP415-P28) bajo vado durante varios dfas (2-20 mbares, t.a. a 60°C).

El espectro de FT-Raman del material secado de la clase 2 (PP415-P28) muestra pequenas diferencias con el espectro de la clase 2 (muestra PP415-P21, FIG. 92), pero aun corresponde a la clase 2.

El patron de PXRD del material secado de la clase 2 (PP415-P28) muestra picos menos intensos mas amplios en comparacion con el patron de PP415-P21 (FIG. 93), lo que indica que la muestra secada es menos cristalina. Sin embargo, el patron aun corresponde a la clase 2.

El termograma de TG-FTIR de la muestra secada PP415-P28 (FIG. 94) muestra la perdida de ~3,0% en peso de ciclohexano en dos etapas desde ~140°C a ~250°C y descomposicion a temperaturas T > 250°C. En comparacion con el TG-FTIR de la muestra PP415-P21 (FIG. 77), las dos etapas de la perdida de

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solvente se conservan, pero la cantidad total de solvente en la muestra ha disminuido desde ~5,8% en peso en PP415-P21 a ~3,0% en peso en PP415-P28.

Por lo tanto, la desolvatacion de este solvato parece haber causado solo una perdida parcial de solvente, paralelo a una perdida parcial de la cristalinidad.

El secado adicional de esta muestra (a 80°C, <1x10-3 mbares, 3 dfas) se realizo como PP415-P34.

El espectro de FT-Raman permanecio sin cambios (FIG. 92). El patron de PXRD aun correspondio a la clase 2 (FIG. 93), pero la muestra fue menos cristalina (ya que los picos fueron mas amplios y tuvieron una relacion de S/N menor).

El termograma de TG-FTIR (FIG. 95) muestra la perdida de ~2,3% en peso de ciclohexano, en dos etapas desdesde 25°C a 270°C y descomposicion a temperaturas T > 270°C.

Por lo tanto, el contenido de ciclohexano se redujo solo desde 3,0% en peso a 2,3% en peso confirmando la union fuerte de las moleculas de solvente.

i. Clase 3 - Solventes Isoestructurales (por ejemplo, Etanol)

Varios experimentos de cristalizacion resultaron en material solido de la clase 3 y se caracterizaron por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR (Tabla 21).

Los espectros de FT-Raman de la clase 3 son claramente similares entre sf (FIG. 96) pero muestran pequenas diferencias (Fig. 97). Los espectros de la clase 3 difieren significativamente del espectro del material de partida amorfo, clase 1 (FIG. 98), y de los espectros de las clases 2, 4, y 5 (FIG. 72).

Los patrones de PXRD de la clase 3 (FIG. 99) confirman la cristalinidad de los materiales. Los patrones de las tres muestras son similares entre sf, pero muestran diferencias pequenas pero significativas (Fig. 100). El patron de la clase 3 difiere claramente de los patrones cristalinos de las clases 2, 4, y 5 (FIG. 75).

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P6 (FIG. 100) muestra la perdida de ~5,4% en peso de 2PrOH desde 25°C a 250°C, la mayor parte en una etapa desde ~170°C a 190°C. La descomposicion comienza a temperaturas T > 250°C. Antes de los experimentos de TG-FTIR, las muestras se secaron brevemente (durante ~5 min) bajo vado (10-20 mbares) para eliminar el exceso de solvente no unido. El contenido teorico de 2PrOH (p.e. = 82°C) de un hemisolvato es 5,1% en peso.

El termograma de TG-FTIR de la muestra PP415-P12 (FIG. 101) muestra la perdida de ~4,9% en peso de EtOH (con trazas de agua) desde 25°C a 250°C, la mayor parte en una etapa desde ~160°C a 190°C. La descomposicion comienza a temperaturas T > 250°C. El contenido teorico de EtOH (p.e. = 78°C) de un hemisolvato es 4,0% en peso.

Por lo tanto, las muestras de la clase 3 parecen ser solvatos isoestructurales de 2PrOH, EtOH, y probablemente acetona con contenido de solvente fuertemente unido. Podnan corresponder a hemisolvatos estequiometricos. No se puede descartar, sin embargo, que estas formas sean solvatos no estequiometricos.

Como los espectros Raman y patrones de PXRD dentro de esta clase son muy similares entre sf, las estructuras pueden ser esencialmente identicas con solo pequenas distorsiones de las dimensiones de celula unitaria o pequenos cambios de posiciones atomicas dentro de la celula unitaria debido a la incorporacion de diferentes moleculas de solvente.

Tabla 21. Experimentos de cristalizacion resultantes en material solido de la clase 3

Muestra

Metodo Solvente / Mezcla Caracterizacion Secado

PP415-P6

equil. de suspension 2PrOH Raman, PXRD, TG-FTIR X

PP415-P12

equil. de suspension 9:1 EtOH/H2O Raman, PXRD, TG-FTIR --

PP415-P20

enfriamiento lento ~2:1 acetona/H2O Raman, PXRD --

j. Experimentos de Secado en Muestras de la Clase 3

Una de las muestras de la clase 3 (PP415-P6), obtenida de un experimento de equilibrio de suspension en 2PrOH, se seco (como PP415-P25) bajo vado durante varios dfas (2-20 mbares, t.a. a 60°C, Tabla 22).

El termograma de TG-FTIR de este material secado de la clase 3, la muestra PP415-P25 (FIG. 102), muestra la perdida de ~5,4% en peso de 2PrOH desde 50°C a 250°C, la mayor parte en una etapa desde 170°C a 190°C, otra

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perdida de ~1,0% en peso de 2PrOH desde 290°C a 320°C, y descomposicion a temperaturas T > 320°C. En comparacion con el TG-FTIR de la muestra PP415-P6 original clase 3 (Fig. 103), con un contenido de solvente de ~5,4% en peso de 2PrOH, el contenido de solvente no parece haber disminuido significativamente.

Este material se seco adicionalmente (como PP415-P33, Tabla 22) durante tres dfas bajo alto vado y temperaturas elevadas (<1x10-3 mbares, 80°C) con el objetivo de desolvatar el solvato y obtener una forma anhidra no solvatada de 63415.

El termograma de TG-FTIR de este material adicionalmente secado de la clase 3, muestra PP415-P33 (FIG. 103) muestra la perdida de ~4,2% en peso de 2PrOH desde 50°C a 210°C, la mayor parte en una etapa desde 160°C a 190°C, otra perdida de ~0,5% en peso de 2PrOH desde 210°C a 290°C, y descomposicion a temperaturas T > 290°C.

En comparacion con el contenido de solvente de las muestras PP415-P6 y PP415-P25, el contenido de solvente ha disminuido solo desde ~5,4% en peso a ~4.8% en peso.

Tabla 22. Experimentos de secado en muestras de la clase 3

Material de Partida

Secado Material secado

Muestra

Contenido de solvente Condiciones Muestra Contenido de solvente Clase

PP415-P6

2PrOH (~5,4%) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d PP415-P25 2PrOH (~5,4%) 3

PP415-P25

2PrOH (~5,4%) 80°C, <1*10'3 mbares, 3 d PP415-P33 2PrOH (~4,8%) 3

Los espectros de FT-Raman de la clase 3 (muestra PP415-P6), del material secado de la clase 3 (muestra PP415- P25), y del material adicionalmente secado de la clase 3 (muestra PP415-P33) son identicos y no muestran cambios (FIG. 104).

Los patrones de PXRD de la clase 3 (muestra PP415-P6) y del material adicionalmente secado de la clase 3 (muestra PP415-P33) no muestran diferencias significativas, mientras que hay pocos desplazamientos pequenos y diferencias con el patron del material inicialmente secado de la clase 3 (muestra PP415-P25, FIG. 105). Todos los patrones corresponden a la clase 3.

Ya que el secado no tuvo efecto principal en el contenido de solvente, no es sorprendente que los espectros de FT- Raman y patrones de PXRD de los materiales secados no muestren diferencias en comparacion con el material no secado.

Por lo tanto, la clase 3 es una clase de solvatos isoestructurales (2PrOH, EtOH, y probablemente acetona) con moleculas de solvente muy fuertemente unidas que se pudieron eliminar solo parcialmente (~5,4% en peso a ~4,8% en peso) por las condiciones de secado aplicadas aqrn (hasta 3 d a 1x10-3 mbares y 80°C).

k. Clase 4 - Solvato de Acetonitrilo

Se obtuvo la clase 4 solo de una mezcla de solventes 7:3 MeCN/H2O (Tabla 23). El experimento que resulta en la clase 4 (PP415-P 13) se repitio como PP415-P35 para preparar mas material para estudios de secado adicionales.

El espectro de FT-Raman (FIG. 72) y el patron de PXRD (FIG. 75) de la clase 4 (muestra PP415-P13) difieren significativamente de los espectros y patrones de las clases 2, 3 y 5.

El termograma de TG-FTIR de la clase 4 (muestra PP415-P13, FIG. 106) muestra la perdida de ~3,4% en peso de MeCN (con trazas de agua) desde 25°C a 270°C, la mayor parte en una etapa desde ~180°C a 210°C. La descomposicion comienza a temperaturas T > 270°C. Antes de los experimentos de TG-FTIR, las muestras se secaron brevemente (durante ~5 min) bajo vacfo (10-20 mbares) para eliminar el exceso de solvente no unido. El contenido teorico de MeCN (p.e. = 81°C) de un hemisolvato es 3,6% en peso.

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Muestra

Metodo Solvente Caracterizacion Secado

PP415-P13

equilibrio de suspension 7:3 MeCN/H2O Raman, PXRD, TG-FTIR X

PP415-P35

equilibrio de suspension 7:3 MeCN/H2O Raman, PXRD, TG-FTIR X

l. Experimentos de Secado en la Clase 4

Las muestras de la clase 4 obtenidas de los experimentos de equilibrio de suspension en ~7:3 MeCN/H2O se secaron bajo vado durante varios dfas o bajo flujo de N2 (Tabla 24).

Tabla 24. Experimentos de secado en las muestras de la clase 4

Material de Partida

Secado Material secado

Muestra

Contenido de solvente Condiciones Muestra Contenido de solvente Clase

PP415-P13

MeCN (~3,4%) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d PP415-P26 MeCN (~2,8%) 4

PP415-P35

MeCN (~2,9%) 80°C, <1*10'3 mbares, 3 d PP415-P36 MeCN/H2Oa (~0,6%) 4

PP415-P35

MeCN (~2,9%) 80°C, flujo de N2, 3 d PP415-P37 MeCN/H2Oa (~0,9%) 4

a contenido de solvente posiblemente MeCN y H2O, pero diffcil de determinar ya que las cantidades son pequenas

El espectro de FT-Raman del material secado de la clase 4 (PP415-P26) es identico al espectro de la clase 4 (PP415-P13, FIG. 107).

El patron de PXRD del material secado de la clase 4 (PP415-P26) muestra solo diferencias muy pequenas con el patron de la clase 4, muestra PP415-P13 (FIG. 108). Algunos picos parecen mejor resueltos, y las intensidades de pico se han desplazado. No se observo amorfizacion. El patron de PP415-P26 corresponde a la clase 4.

El termograma de TG-FTIR del material secado de la clase 4, muestra PP415-P26 (FIG. 109) muestra la perdida de ~2,8% en peso de MeCN desde 170°C a 250°C y descomposicion a temperaturas T > 300°C. En comparacion con el TG-FTIR de la muestra PP415-P13 (FIG. 106), el contenido de solvente de la muestra ha disminuido desde 3,4% en peso a 2,8% en peso.

Por lo tanto, la muestra parece ser un solvato parcialmente desolvatado. Ya que no permanecio suficiente material para un segundo experimento de secado con la subsecuente caracterizacion, el experimento de PP415-P13 se repitio (como PP415-P35). Mas material de la clase 4 se preparo y dos experimentos de secado se realizaron con este material recien preparado:

• PP415-P36: secado bajo vado (<1x10-3 mbares) a 80°C durante tres dfas

• PP415-P37: secado bajo flujo de N2 a 80°C durante tres dfas

Los espectros de FT-Raman de estas muestras secadas de clase 4 (PP415-P36 y -P37) corresponden con el espectro de la clase 4 (es decir, PP415-P35, FIG. 110).

Los patrones de PXRD (FIG. 111) del material de la clase 4 (muestra PP415-P35) y las muestras secadas de la clase 4 (muestras PP415-P36 y PP415-P37) son identicos. Las muestras secadas son cristalinas.

Los termogramas de TG-FTIR de estas muestras secadas de la clase 4 (FIG. 112 para PP415-P36 y FIG. 113 para PP415-P37) muestran solo un pequeno contenido de solvente (MeCN y/o H2O) de ~0,6% en peso y ~0,9% en peso para PP415-P36 y PP415-P37, respectivamente, en dos etapas desde 25°C a 280°C. El contenido de solvente es posiblemente MeCN y H2O, pero es diffcil de determinar ya que las cantidades son pequenas. La descomposicion comienza a temperaturas T > 280°C.

Por lo tanto, la mayoffa del solvente de este solvato se podffa eliminar sin destruir la estructura cristalina. Se obtuvo

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una forma no solvatada cristalina (o mas bien solvato desolvatado).

m. Caracterizacion Adicional de la Clase 4 Secada y Desolvatada

El secado de la clase 4 (solvato de MeCN) resulto en un solvato desolvatado con el contenido de solvente reducido a <1% en peso (TG-FTiR).

Ningun cambio en la estructura ocurrio en la desolvatacion (FT-Raman y PXRD). No se observo perdida significativa de la cristalinidad.

Por lo tanto, se obtuvo una forma no solvatada cristalina de 63415, la unica conocida hasta la fecha.

Este material desolvatado de clase 4 se caracterizo adicionalmente por DVS y DSC.

La isoterma de DVS (FIG. 114) muestra que durante el tiempo de equilibracion inicial a 50% h.r. ocurrio una ganancia de masa de ~0,4% en peso. Durante la medicion, una perdida de masa gradual reversible de ~1,3% en peso ocurrio al disminuir la humedad relativa desde 50% h.r. a 0% h.r. Se alcanzo el equilibrio. Al aumentar la humedad relativa a 95% h.r., se observo una ganancia de masa gradual de ~0,8% en peso (con respecto a la masa de equilibracion a 50% h.r.). Se alcanzo el equilibrio. Despues de disminuir la humedad relativa a 50% h.r., la masa final permanecio como 0,1% en peso por debajo de la masa de partida equilibrada. La ganancia de masa de ~0,7% en peso al aumentar la humedad relativa desde 50% h.r. a 85% h.r. clasifico la muestra como ligeramente higroscopica.

El patron de PXRD de la muestra despues de la medicion esta inalterado en comparacion con el patron antes de la medicion (FIG. 1 15).

El termograma de DSC de una muestra de material desolvatado de la clase 4 (FIG. 116) no muestra transicion vftrea atribuible a la forma amorfa, que se hubiera esperado a ~150°C, pero en su lugar, un pico endotermico agudo con un maximo a T = 196,1°C (AH = 29,31 J/g), probablemente correspondiente a la fusion, y no descomposicion hasta 270°C.

Ademas, un experimento de DSC se realizo con una mezcla ~1:1 del material amorfo, clase 1, con el material desolvatado de la clase 4 para investigar si el material amorfo se transformana y cristalizana en la clase 4 desolvatada, ocurrio un evento esperado (si es en absoluto) por encima de la temperatura de transicion vftrea de la forma amorfa (Tg “ 150°C) y por debajo de la de la fusion de la clase 4 desolvatada (T m “ 196°C).

El termograma de DSC de la mezcla (FIG. 117) muestra un evento endotermico con un pico a T = 156,7°C (AH = 1,47 J/g) y un segundo evento endotermico con un pico a 197,0°C (AH = 14,1 J/g). El primer evento podna ser atribuible al material amorfo (transicion vftrea a Tg “ 150°C). El segundo evento podna corresponder a la fusion de la clase 4 desolvatada a Tm “ 196°C. El calor de fusion (AH = 14,1 J/g) de la mezcla se correlaciona bien con la mitad del calor de fusion (AH = 29,3 J/g) de la clase 4 desolvatada pura.

No se pueden observar eventos exotermicos en el intervalo de temperatura entre la de transicion vftrea y la de fusion correspondiente a una posible cristalizacion del material amorfo. Por lo tanto, ninguna transformacion de la forma amorfa en la forma desolvatada de la clase 4 parecio haber ocurrido en este plazo de tiempo.

En todavfa otro experimento de DSC con una mezcla de ~1:1 del material amorfo, clase 1, con el material desolvatado de la clase 4, se detuvo el calentamiento a 173°C (entre la transicion vftrea y la fusion) para dar tiempo para una posible cristalizacion.

El termograma de DSC de la mezcla (FIG. 118) muestra un evento endotermico con un pico a T = 161,4°C (AH = 0,31 J/g) y un segundo evento endotermico con un pico a 201,4°C (AH = 11,4 J/g). Como en el primer experimento, el calor de fusion del segundo pico no aumento; no son visibles indicaciones de una transformacion de la forma amorfa en la forma desolvatada de la clase 4.

El valor basal curvado (-50°C a 150°C) es mas probablemente un artefacto (debido a una tapa doblada de soporte de muestra

n. Clase 5 - Solvato de THF

Se obtuvo la clase 5 solo de una mezcla de solventes 1:1 THF/H2O (Tabla 25).

El espectro de FT-Raman (FIG. 71) y patron de PXRD (FIG. 75) de la clase 5 difiere significativamente de los espectros y patrones de las clases 2, 3 y 4.

El termograma de TG-FTIR de la clase 5 (muestra PP415-P14, FIG. 119) muestra la perdida de ~36,1% en peso de THF y H2O desde 25 a 200°C, la mayor parte en una etapa desde ~100°C a 130°C. Antes de los experimentos de TG-FTIR, las muestras se secaron brevemente (durante ~5 min) bajo vacfo (10-20 mbares) para remover el exceso de solvente no unido. La perdida tanto de THF como H2O ocurre conjuntamente en el mismo intervalo de

temperatura. La descomposicion comienza a temperaturas T > 300°C. El contenido teorico de THF (p.e. = 66°C) de un trisolvato es 28., % en peso. Desafortunadamente, como el contenido de los dos componentes no se puede cuantificar por separado, el estado de solvatacion exacto no se puede determinar.

Se proporcionan detalles sobre los experimented y caracterizaciones de las muestras PP415-P41 y PP415-P45.

5 Tabla 25. Experimentos de cristalizacion resultantes en material solido de la clase 5

Muestra

Metodo Solvente Caracterizacion Secado

PP415-P14

equilibrio de suspension 1:1 THF/H2O Raman, PXRD, TG-FTIR X

PP415-P41b

equilibrio de suspension 1:1 THF/H2O PXRD X

PP415-P45b,c

equilibrio de suspension 1:1 THF/H2O PXRD X

b material de partida: PP415-P40, clase 2; en todos los otros experimentos en esta tabla PP415-P1, clase 1, se utilizo como el material de partida

c experimento de escala de 3 g en lugar de escala de 100 mg

o. Experimentos de Secado en Muestras de la Clase 5

10 La muestra de la clase 5 (PP415-P14), obtenida de un experimento de equilibrio de suspension en ~1:1 THF/H2O, se seco (como PP415-P27) bajo vacte durante varios dfas (2-20 mbares, t.a. a 60°C, Tabla 26).

Tabla 26. Experimentos de secado de muestras de la Clase 5

Material de Partida

Secado Material secoado

Muestra

Contenido de solvente Condiciones Muestra Contenido de solvente Clase

PP415-P14

THF y H2O (~36% en peso) t.a., ~3 mbares, ~5 d; 60°C, 5-10 mbares, 2*1 h; 40-50°C, 5-20 mbares, ~1 d PP415-P27 (~0,3 % en peso) 1 (+5)a

a principalmente amorfa, solo algunos picos amplios con relacion de S/N baja

El espectro de FT-Raman del material secado (PP415-P27) es diferente del espectro de la clase 5 (PP415-P14, FIG. 15 120) y, con sus picos ampliados, se asemeja mas al espectro de la clase 1, el material de partida amorfo, PP415-P1.

El patron de PXRD del material secado de la clase 5 (PP415-P27) solo muestra algunos picos amplios de baja intensidad con una relacion de S/N baja, que indica la baja cristalinidad de la muestra (FIG. 121). Algunos de los picos podnan corresponder a la clase 5, mientras que otros, es decir, a 7,35 °20, son nuevos o desplazados.

El termograma de TG-FTIR del material secado de clase 5 (FIG. 122) muestra una perdida de masa de ~0,3% en 20 peso desde 25°C a 290°C y descomposicion a temperaturas T > 290°C. La muestra es anhidra.

Por lo tanto, por secado bajo vacte, el material ha perdido su contenido de solvente y tambien mucha de su cristalinidad.

8. Experimentos para preparar la forma amorfa

Los experimentos con el proposito de preparar la forma amorfa, clase 1, se realizaron utilizando el material de clase 25 2 (PP415-P40, Tabla 8) como material de partida. Se intentaron varias estrategias y metodos:

• Transformacion de la clase 2 en la clase 5, seguida por secado de la clase 5 para obtener la forma amorfa, clase 1.

• Preparacion de la forma amorfa, clase 1, directamente de la clase 2, si es posible utilizando solventes de clase ICH.

Se preparo material principalmente amorfo partiendo del material de la clase 2 en un proceso de dos etapas a traves de la clase 5 en una escala de 100 mg y 3 g.

30 Se realizaron experimentos adicionales con el proposito de simplificar el procedimiento a un proceso de una etapa, para evitar el solvente de THF de ICH clase 2, y para obtener material completamente amorfo. Se encontro que el

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metodo mas prometedor es la precipitacion de una disolucion de acetona en un bano de agua fna. Este metodo directo da resultados mucho mejores que el metodo de dos etapas a traves de la clase 5.

a. Preparacion de la Forma Amorfa a traves de la Clase 5

Se realizaron experimented de cristalizacion utilizando la clase 2, PP415-P40, como el material de partida con el proposito de transformar este solvato de heptano en la clase 5 (probablemente solvato de THF), seguido por secado de la clase 5 para obtener el material amorfo (Tabla 27).

Se cree que la clase 5 es una buena etapa intermedia, ya que es mas facil de desolvatar y amorfizar que las clases 2 o3.

Tabla 27. Resumen de los experimentos encaminados a la preparacion de la forma amorfa, clase 1, a traves de material de la clase 5

Etapa

Muestra Metodo Condiciones Resultados

1

PP415-P41 equil. de suspension 1:1 THF/H2O, 24°C, 3 d clase 5

“

PP415-P45 equil. de suspension 1:1 THF/H2O, t.a. 1 d clase 5

2

PP415-P44a secado 100 mbares, 80°C, 2 d clase 1a; 0,9 % en peso THF

PP415-P46a secado 100 mbares, 80°C, 4 d clase 1a; 0,4 % en peso H2O

a principalmente amorfa, solo algunos picos amplios con relacion de S/N baja.

b. Etapa 1: Transformacion de la Clase 2 en la Clase 5

La transformacion del solvato de heptano, clase 2, en el solvato de THF, clase 5, se realizo con exito suspendiendo el material PP415-P40 (solvato de heptano) en una mezcla (1:1) THF/H2O y equilibrando la suspension a t.a. (PP415-P41, escala de 100 mg). El material solido resultante corresponde con el solvato de THF, clase 5 (FIG. 123).

Un primer experimento de escalamiento de la escala de mg a la escala de g (x30, es decir, escala de 3 g) se realizo analogo a PP415-P41: el material de partida de solvato de heptano de clase 2 (PP415-P40) se equilibro en THF/H2O (1:1) durante un dfa y se transformo con exito en la clase 5, el solvato de THF (PP415-P45, FIG. 124).

c. Etapa 2: Amorfizacion del Material de la Clase 5 por Secado

El material de la clase 5 (solvato de THF) se seco a temperatura elevada (80°C) bajo vacte (~100 mbares) teniendo en cuenta las condiciones que se pueden utilizar en el sitio de MFG del API.

Despues de secar el material del experimento de escala de 100 mg, el PP415-P41, durante un dfa a 80°C y 100 mbares se transformo en material principalmente amorfo (PP415-P44, FIG. 125). El patron de PXRD solo muestra algunos picos amplios con baja intensidad. Despues del secado adicional (80°C, 100 mbares) durante la noche, la intensidad de estos picos amplios se reduce adicionalmente (PP415-P44a). El TG-FTIR de este material muestra la perdida de ~0,9% en peso de THF (con trazas de agua) gradualmente desde 25°C a 280°C y descomposicion a temperaturas T > 300°C (FIG. 126).

El material del experimento de escala de 3 g, PP415-P45, tambien se seco a 80°C y 100 mbares (como PP415- P46). Se transformo durante la noche en material principalmente amorfo con solo algunos picos amplios con baja intensidad (FIG. 127). Despues de un total de cuatro dfas de secado (80°C, 100 mbares), estos picos amplios todavfa estan presentes (-P46a, FIG. 128). El TG-FTIR de este material no muestra contenido de THF, sino la perdida de ~0,4% en peso de agua gradualmente desde 25°C a 250°C y descomposicion a temperaturas T > 250°C (FIG. 129).

d. Obtencion de la Forma Amorfa Directamente

La preparacion de la forma amorfa partiendo del material de la clase 2 en el proceso de dos etapas a traves de la clase 5 fue en gran medida, pero no completamente, exitosa. Por lo tanto, se realizaron experimentos adicionales con el proposito de simplificar el procedimiento a un proceso de una etapa, para evitar el uso de solvente de THF de ICH clase 2, y obtener material completamente amorfo (Tabla 28).

La forma amorfa, clase 1, se preparo directamente del material de la clase 2 en un experimento de evaporacion de

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una disolucion de la clase 2 en THF bajo flujo de N2 (PP415-P42, FIG. 129).

En un intento de simular un solvato de heptano/hexano incompletamente seco con una cantidad significativa de solvente restante, se realizo una evaporacion de una disolucion de la clase 2 en una disolucion 8:2 THF/hexano (se utilizo hexano en lugar de heptano para tener puntos de ebullicion similares en la mezcla de solventes). Sin embargo, el solido resultante corresponde a la clase 2, la clase de los solvatos isoestructurales, no a la clase 5 (PP415-P43, FIG. 130).

Para evitar el solvente de THF de ICH clase 2, los experimentos de evaporacion se realizaron en solventes de ICH clase 3.

La evaporacion de una disolucion de clase 2 en EtOAc bajo flujo de N2 resulto en material cristalino con un patron de PXRD correspondiente a la clase 2 (PP415-P47, FIG. 130). El TG-FTIR (FIG. 80) muestra la perdida de masa en dos etapas tipica de la clase 2 (total de ~7,9% en peso de EtOAc) a temperaturas de hasta 240°C, lo que indica moleculas de solvente muy fuertemente unidas.

La evaporacion en formato de etilo tambien produjo material cristalino de clase 2 y no la forma amorfa (PP415-P48, FIG. 131). El TG-FTIR (FIG. 78) muestra la perdida de masa de ~3,5% en peso de formato de etilo, primero gradualmente y luego en una etapa clara entre 180°C y 200°C. Puede haber perdida adicional de formato de etilo concomitante con la descomposicion a T > 240°C.

Sin embargo, el material de clase 2 se transformo con exito en la forma amorfa, clase 1, anadiendo una disolucion de acetona a un bano de agua fria (5°C) (PP415-P49, FIG. 132).

Este metodo directo para la preparacion de la forma amorfa produce mejores resultados y es una ruta mas prometedora que el proceso de dos etapas.

Tabla 28. Resumen de experimentos encaminados a la obtencion de la forma amorfa directamente del material de partida de la clase 2

Muestra

Metodo Solvente Condition Result

PP415-P42

evaporacion THF flujo de N2, 1 d clase 1

PP415-P43

evaporacion 8:2 THF/hexano flujo de N2, 1 d clase 2

PP415-P47

evaporacion EtOAc flujo de N2, 1 d clase 2

PP415-P48

evaporacion formato de etilo flujo de N2, 1 d clase 2

PP415-P49

precipitacion acetona bano de H2O a 5°C clase 1

9. Instrumentos - Condiciones Tipicas de Medicion

Espectroscopia de FT-Raman: Bruker RFS100 con software OPUS 6.5; Nd: YAG de excitacion de 1.064 nm, detector Ge, intervalo de 3.500-100 cm-1; condiciones tipicas de medicion: potencia laser nominal de 100-300 mW, 64-128 barridos, resolucion de 2 cm-1.

PXRD: Stoe Stadi P; Detector Mythen1K, radiacion Cu-Ka; condiciones estandar de medicion: transmision; potencia de tubo de 40 kV y 40 mA; monocromador Ge curvado; tamano de etapa de 0,02 °20, tiempo de etapa de 12 s o 60 s, intervalo de barrido de 1,5-50,5 °20 o 1,0-55 °20; modo de detector: barrido por etapa; etapa de detector de 1 °20 o 6 °20; preparacion de la muestra estandar: 10 a 20 mg de la muestra se colocaron entre dos laminas de acetato; soporte de la muestra: soporte de muestra de transmision Stoe; la muestra se giro durante la medicion.

TG-FTIR: Microbalanza Termica Netzsch TG 209 con Espectrometro FT-IR Bruker Vector 22; crisol de aluminio (con microagujero), atmosfera de N2, velocidad de calentamiento de 10 K/min, intervalo de 25-250°C o 25-350°C.

DSC: Perkin Elmer DSC 7; crisoles de oro (cerrados o con microagujero), muestra rellenada en un ambiente de N2, velocidad de calentamiento de 10 K/min, intervalo de -50 a 250°C o 350°C, a tiempos de enfriamiento rapido (a -200 K/min) a -50°C entre barridos.

DVS: Projekt Messtechnik Sorptions Prufsystem SPS 11 - 100n o SIstemas de Medicion de Superficie DVS-1. La muestra se coloco en un soporte de aluminio o platino en la parte superior de una microbalanza y se dejo equilibrar durante 2 h a 50% h.r. antes de comenzar el programa de humedad predefinido:

5

10

15

20

25

(1) 50 ^ 0% h.r. (5%/h); 5 h a 0% h.r.

(2) 0 ^ 95% h.r. (5%/h); 5 h a 95% h.r.

(3) 95 ^ 50% h.r. (5%/h); 2 h a 50% h.r.

La higroscopicidad se clasifico con base en la ganancia de masa a 85% h.r. con respecto a la masa inicial como sigue: delicuescente (suficiente agua adsorbida para formar un Kquido), muy higroscopica (aumento de la masa > 15%), higroscopica (aumento de la masa < 15% pero > 2%), ligeramente higroscopica (aumento de la masa < 2% pero > 0,2%), o no higroscopica (aumento de la masa < 0,2%).

Solventes: Para todos los experimentos, se utilizaron solventes de grado analftico Fluka, Merck o ABCR.

Determinacion de Solubilidad Aproximada: Las solubilidades aproximadas se determinaron por una dilucion por etapas de una suspension de aproximadamente 10 mg de sustancia en 0,05 ml de solvente. Si la sustancia no se disolvio por adicion de un total de > 10 ml de solvente, la solubilidad se indica como < 1 mg/ml. Debido al error experimental inherente en este metodo, los valores de solubilidad estan destinados a ser considerados como estimaciones aproximadas y seran utilizados unicamente para el diseno de experimentos de cristalizacion.

Determinacion de la Estabilidad Quimica: Se prepararon cuatro muestras de 1,0 mg del material PP415-P1 en 1,0 mL del solvente respectivo. Las suspensiones/disoluciones resultantes se equilibraron en un agitador Eppendorf Thermomixer Comfort de temperatura controlada durante 7 d, 2 d, 24 h, y 6 h a 25°C a una velocidad de agitacion de 500 rpm. Si es necesario, la fase solida se separo por centrifugacion por filtro (membrana de PVDF de 0,5 pm). Los filtrados se diluyeron en el diluyente (0,1% acido formico en MeCN) a concentraciones < 0,2 mg/mL (desconocidas y probablemente inferiores para las suspensiones) y se examinaron utilizando el metodo de HPLC dado en la Tabla 29. Como referencia, el material PP415-P1 se diluyo en el diluyente a una concentracion de 0,25 mg/mL y se anadio al principio y al final de la secuencia de HPLC.

Resultados de la HPLC

Tabla 29. Metodo de HPLC utilizado para las determinaciones de estabilidad quimica

Columna

Zorbax Eclipse XDB-C18, 3*150 mm, 5 pm (CC19)

Eluyente A

H2O + 0,1% acido formico

Eluyente B

MeCN + 0,1% acido formico

0 min 50% A 50% B

10,0 min 10% A 90% B

Gradiente

15,0 min 0% A 100% B

15,1 min 50% A 50% B

20,0 min 50% A 50% B

Flujo

0,75 mL/min

Volumen de inyeccion

10 pL

Longitud de onda

254 nm, 242 nm, 210 nm

Tiempo de adquisicion

20 min

Tiempo de operacion

20 min

Temperatura de la columna

25°C

Tiempo de retencion

8,9-9,0 min

10. abreviaturas Metodos:

AUC analisis del area bajo la curva

5

10

15

20

25

30

35

DSC

calorimetna de barrido diferencial

DVS

sorcion dinamica de vapor

FT Raman

espectroscopia Raman por transformada de Fourier

1H-RMN

espectroscopia de resonancia magnetica nuclear de proton

HPLC

cromatograffa Kquida de alta resolucion

PXRD

difraccion de rayos X en polvo

TG-FTIR

termogravimetna acoplada a espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

Productos Quimicos

IBuOH

1-butanol

CTAB

bromuro de cetil trimetilamonio

DCM

diclorometano

DEE

dietil eter

DMF

W,W-dimetilformamida

EtOAc

acetato de etilo

EtOH

etanol

IPE

isopropil eter

MeCN

acetonitrilo

MEK

metil etil cetona

MeOH

metanol

PEG

propilenglicol

PTFE

politetrafluoroetileno, Teflon

2PrOH

2-propanol, isopropanol

SDS

dodecil sulfato de sodio

TBME

ferc-butil metil eter

TEA

trietilamina

THF

tetrahidrofurano

Tween 80

monooleato de polioxietilen(80)sorbitan o polisorbato 80

Genes, Protemas y Parametros Biologicos

AIM

modulador de inflamacion antioxidante

Akr1c1

miembro cl de la familia 1 de aldo-ceto reductasa

ALP

fosfatasa alcalina

ALT

alanina transaminasa

ARE

elemento de respuesta antioxidante

AST

aspartato transaminasa

AUC

area bajo la curva

BAL

lavado broncoalveolar

BALF

fluido de lavado broncoalveolar

Bil

bilirrubina

BUN

nitrogeno ureico en sangre

COPD

enfermedad pulmonar obstructiva cronica

5 COX-2

ciclooxigenasa-2

Cr

creatina

CYP450

citocromo P450

Eh-1

epoxido hidrolasa 1

G6PD

glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

10 Gclc

glutamato-cistema ligasa, subunidad catalttica

Gclm

glutamato-cistema ligasa, subunidad modificadora

Ggt1

gamma-glutamiltransferasa

Glrx

glutarredoxina-1

Glu

glucosa

15 GOT

glutamico-oxalacetica transaminasa

GPT1

glutamico-piruvato transaminasa

Gpx3

glutation peroxidasa 3

GSH

glutation

GSR

glutation reductasa

20 GSs

glutation sintetasa

GST

glutation S-transferasa

GSTa1

glutation S-transferasa alfa 1

GSTp1

glutation S-transferasa pi 1

Gy

Gray

25 H6PD

hexosa-6-fosfato deshidrogenasa

hERG

gen humano relacionado con eter a-go-go

HMOX1

hemo oxigenasa (desciclada) 1

HO-1

hemo oxigenasa

IFNy

interferon-gamma

30 IL

interleuquina

iNOS

oxido mtrico sintasa inducible

iKBa

factor nuclear de potenciador de gen de polipeptido ligero kappa en inhibidor de celulas B, alfa

KC

protema relacionada con IL-8 de raton

Keapl

protema-1 asociada con ECH tipo Kelch

35 LPS

lipopolisacarido

ME1

enzima malica 1

5

10

15

20

25

30

35

MPCE

eritrocitos policromaticos micronucleados

Mrp

protemas relacionadas con metG

Mrps

protemas relacionadas con la resistencia a multiples farmacos

NADPH

nicotinamida adenina dinucleotido fosfato, reducido

NFkB

factor nuclear de potenciador de cadena ligera kappa de celulas B activadas

NO

oxido nftrico

NQO1

NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1

Nrf2

semejante a factor nuclear (derivado de eritroides) 2

p-lKBa

iKBa fosforilado

PBMC

celulas mononucleares de sangre periferica

PCE

eritrocitos policromaticos

PGD

fosfogluconato deshidrogenasa

PMN

polimorfonuclear

RANTES

celulas T reguladas y normales expresadas y secretadas

SOD1

superoxido dismutasa 1

SRXN1

sulfirredoxina-1

TG

gliceridos totales

TKT

transcetolasa

TNFa

factor de necrosis tumoral alfa

Txn

tiorredoxina

TXNRD1

tiorredoxina reductasa 1

xCT Varios:

familia 7 de portador de soluto, miembro 11

API

ingrediente farmaceutico activo

ac.

acuoso

pe.

punto de ebullicion

crist.

cristalina

descomp.

descomposicion

d

dfa(s)

eq.

equivalente

equil.

equilibrio

evap.

evaporacion

h

hora(s)

mat.

material

min

minuto(s)

p.f.

punto de fusion

MS tamices moleculares

part. parcialmente

precip. precipitacion

h.r. humedad relativa

5

rpm revoluciones por minuto

t.a. temperature ambiente (~25°C)

S/N senal a ruido (relacion)

solv. solvente

susp. suspension

10

T temperatura

Tg temperatura de transicion vftrea

teo. teorico

obs. vis. observacion visual

s semana(s)

15

% en peso porcentaje en peso

Tabla 30: Lista de Muestras y Experimentos Realizados

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P1

se recibieron -5 g de 63415, lote # 0141-66-1, el 25 de marzo, 2011; PM — 554,7 g/mol, C33H44F2N2O3 FT-Raman: PP415P1.0 PP415P1.1 PXRD: 117a TG-FTIR: a4285 1H-RMN: Mar30-2011-ktr/30 DSC: d 9840 DVS: #0305_02 post-DVS Raman: PP415P1 aDVS post-DVS PXRD: 179a FT-Raman: utilizado como referenda para P1 PXRD: patron de pico no cristalino amorfo TG-FTIR: perdida de -0,9 % en peso (-0,1 eq.) de EtOH con trazas de H2O desde 25°C a 200°C, descomposicion a T > 290°C 1H-RMN: de acuerdo con la estructura, -0,08 eq. de EtOH DSC: 1er barrido: Tg = 152,7°C (ACp = 0,72 J/g°C); 2o barrido: Tg = 149,7°C (ACp = 0,45 J/g°C) DVS: ligeramente higroscopico; Am = +0,4% (50%—>85% h.r.); ganancia de masa total de 2,1% en peso desde 0% h.r. a 95% h.r. post-DVS Raman y PXRD: sin cambio

PP415-P2

se almaceno material de PP415-P1 a 25°C abierto sobre una disolucion saturada de NH4N03 (es decir, a -62% h.r.); las muestras se examinaron despues de 1 s (PP415-P2a), 2 s (PP415-P2b), y 4 s (PP415-P2c). PXRD: 132a (-P2a) 191a (-P2b) 262a (-P2c) PXRD: toda amorfa, corresponde a P1

PP415-P3

se almaceno material de PP415-P1 a 40°C abierto sobre una disolucion saturada de NaCI (es decir, a -75% h.r.); las muestras se examinaron despues de 1 s (PP415-P3a), 2 s (PP415-P3b), y 4 s (PP415-P3c). PXRD: 133a (-P3a) 192a (-P3b) 263a (-P3c) PXRD: toda amorfa, corresponde a P1

PP415-P4

se almaceno material de PP415-P1 a 60°C en un recipiente cerrado; las muestras se examinaron despues de 1 s (PP415-P4a), 2 s (PP415-P4b), y 4 s (PP415-P4c). PXRD: 134a (-P4a) 193a (-P4b) 264a (-P4c) PXRD: toda amorfa, corresponde a P1

PP415-P5

se almaceno material de PP415-P1 a 80°C en un recipiente cerrado; las muestras se examinaron despues de 1 s (PP415-P5a), 2 s (PP415-P5b), y 4 s (PP415-P5c). PXRD: 135a (-P5a) 194a (-P5b) 265a (-P5c) PXRD: toda amorfa, corresponde a P1

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P6

se suspendieron 97,7 mg de PP415-P1 en 0,4 mL de 2PrOH; se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; se anadio por etapas un total de 0,5 mL del solvente durante el siguiente par de dias; despues de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. FT-Raman: PP415P6.0 PXRD: 225a TG-FTIR: a4323 Raman: corresponde a clase 3 PXRD: corresponde a clase 3 TG-FTIR: perdida de —5,4 % en peso de 2PrOH desde 25°C a 250°C, la mayor parte en una etapa desde ~170°C a 190°C; la descomposicion comienza a T >250°C

PP415-P7

se suspendieron 104,3 mg de PP415-P1 en 0,6 mL de 1:2 EtOAc/heptano; se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; se anadio por etapas un total de 0,2 mL de la mezcla de solventes durante el siguiente par de dias; despues de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. FT-Raman: PP415P7.0 PXRD: 227a TG-FTIR: a4338 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a una clase 2 TG-FTIR: perdida de —7,5 % en peso de EtOAc y heptano en dos etapas desde ~100°C a 290°C; la descomposicion comienza a T > 290°C

PP415-P8

se suspendieron 102,0 mg de PP415-P1 en 0,4 mL de 1:2 acetona/hexano; se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; se anadio por etapas un total de 0,2 mL de la mezcla de solventes durante el siguiente par de dias; despues de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0.20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD. FT-Raman: PP415P8.0 PXRD: 228a Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2

PP415-P9

se suspendieron 102,6 mg de PP415-P1 en 0,4 mL de 1:3 tolueno/dietil eter; se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; se anadio por goteo un total de 0,2 mL de la mezcla de solventes durante el siguiente par de dias; despues de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0.20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT- Raman. FT-Raman: PP415P9.0 Raman: corresponde a clase 2, contiene senales de solvente

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P10

se suspendieron 102,5 mg de PP415-P1 en 0,2 mL de FT-Raman: Raman: corresponde a clase 2

1:3 MeOH/TBME; se obtuvo una solucion clara; la solucion se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; despues de 1 d se observo una suspension espesa; se anadieron 0,2 mL de la mezcla de solventes; se continuo el equilibrio de la suspension a 22°C agitando a 400 rpm; despues de un total de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0.20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD. PP415P10.0 PXRD: 229a PXRD: corresponde a clase 2

PP415-P11

se suspendieron 97,1 mg de PP415-P1 en 0,4 mL de 1:2 FT-Raman: Raman: corresponde a clase 2, contiene senales

MEK/ciclohexano; se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; despues de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman. PP415P11.0 de solvente

PP415-P12

se suspendieron 98,6 mg de PP415-P1 en 0,2 mL de 9:1 EtOH/FhO; se FT-Raman: Raman: corresponde a una clase 3

obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 22°C PP415P12.0 PXRD: corresponde a una clase 3

agitando a 400 rpm; se afiadio por etapas un total de 0,2 mL de la PXRD: 230a TG-FTIR: perdida de —4,9 % en peso de EtOH

mezcla de solventes durante el siguiente par de dias; despues de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT- Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. TG-FTIR: a4324 (con trazas de agua) desde 25°C a 250°C, la mayor parte en una etapa desde ~160°C a 190°C; la descomposicion comienza a T >250°C

PP415-P13

se suspendieron 95,9 mg de PP415-P1 en 0,2 mL de 7.3 MeCN/FhO; se FT-Raman: Raman: corresponde a clase 4, contiene senales

obtuvieron dos fases separadas claras; la solucion se equilibro a 22°C PP415P13.0 de solvente

agitando a 400 rpm; despues de 1 d se observo una suspension PXRD: 231a PXRD: corresponde a clase 4

espesa; se anadieron 0,2 mL de la mezcla de solventes; se continuo el equilibrio de la suspension a 22°C agitando a 400 rpm; despues de un total de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. TG-FTIR: a4321 TG-FTIR: perdida de —3,4 % en peso de MeCN (con trazas de agua) desde 25°C a 270°C, la mayor parte en una etapa desde ~180°C a 210°C; la descomposicion comienza a T >270°C

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P14

se suspendieron 95,8 mg de PP415-P1 en 0,2 mL de 9:1 THF/H2O; se obtuvieron dos fases separadas claras; la solucion se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; despues de 1 d se observo una fase clara; se anadieron 0,2 mL de H2O; se observo un precipitado bianco; la suspension se equilibro a 22°C agitando a 400 rpm; despues de un total de 15 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. FT-Raman: PP415P14.0 PXRD: 232a TG-FTIR: a4322 Raman: corresponde a clase 5, contiene senales de solvente PXRD: corresponde a clase 5 TG-FTIR: perdida de -36,1 % en peso de THF y H2O desde 25°C a 200°C, la mayor parte en una etapa desde ~100°C a 130°C; la descomposicion comienza a T > 300°C

PP415-P15

se disolvieron 100.6 mg de PP415-P1 en 0.2 mL de 1:2 DCM/IPE; se obtuvo una solucion clara; se observo la precipitacion de solido bianco en < 1 min; se anadieron 0.2 mL de mezcla de solventes; el vial se cubrio con tejido de capa unica y el solvente se dejo evaporar bajo condiciones ambientales; se obtuvo un material solido bianco humedo despues de varias horas; el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD. FT-Raman: PP415P15.0 PXRD: 137a Raman: corresponde a clase 2, contiene senales de solvente PXRD: corresponde a clase 2

PP415-P16

se disolvieron 100,3 mg de PP415-P1 en 0,2 mL de 1:2 MeOH/tolueno; se obtuvo una solucion clara; el vial se cubrio con tejido de capa unica y el solvente se dejo evaporar bajo condiciones ambientales; se obtuvo un material vitreo despues de varios dias; el material se examino por espectroscopia de FT-Raman. FT-Raman: PP415P16.0 FT-Raman: corresponde a clase 1, contiene picos de solvente de tolueno

PP415-P17

se disolvieron 101,0 mg de PP415-P1 en 0,3 mL de 1:3 EtOAc/heptano; se obtuvo una solucion clara; se observo la precipitacion de solido bianco en < 1 min; se anadieron 0,2 mL de mezcla de solventes; el vial se cubrio con tejido de capa unica y el solvente se dejo evaporar bajo condiciones ambientales; se obtuvo un material solido bianco humedo despues de varias horas; el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD. FT-Raman: PP415P17.0 PXRD: 138a Raman: corresponde a clase 2, contiene senales de solvente PXRD: corresponde a una clase 2

PP415-P18

se seco el material de PP415-P15 bajo vacio (2-20 mbares) a t.a. durante ~2 h; el solido bianco seco se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P18.0 PXRD: 149a TG-FTIR: a4301 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: perdida de -7,0 % en peso de IPE en dos etapas desde ~140°C a ~250°C; descomposicion a T > 250°C

PP415-P19

se seco el material de PP415-P17 bajo vacio (2-20 mbares) a t.a. durante ~2 h; el solido bianco seco se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P19.0 PXRD: 150a TG-FTIR: a4302 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: perdida de -7,6 % en peso de heptano en dos etapas desde ~140°C a ~270°C;

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

descomposicion a T > 270°C

PP415-P20

se suspendieron 98,8 mg de PP415-P1 en 2,0 mL de H2O; la suspension se calento a 50°C; lentamente y por etapas se anadieron 4,0 mL de acetona; se obtuvo una solucion clara; la solucion se calento a 55°C y se mantuvo a 55°C durante 30 min; se enfrio lentamente en 4 h 10 min a 5°C (a —0,2 K/min); el solido se recupero por filtracion en vacio (Tamano de poro P4); el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD. FT-Raman: PP415P20.0 PXRD: 226a Raman: corresponde a clase 3, contiene sehales de solvente PXRD: corresponde a clase 3

PP415-P21

se suspendieron 100,9 mg de PP415-P1 en 2,0 mL de ciclohexano; la suspension se calento a 70°C; lentamente y por etapas se anadieron 0,5 mL de ciclohexano y 0,5 mL de EtOH; la suspension delgada llego a ser mas espesa debido a una precipitacion adicional durante el transcurso de la adicion de solvente; la suspension se calento a 75°C y se mantuvo a 75°C durante 30 min; se enfrio lentamente en 5 h a 5°C (a -0,23 K/min); el solido se recupero por filtracion en vacio (Tamano de poro P4); el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. FT-Raman: PP415P21.0 PXRD: 218a TG-FTIR: a4326 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: perdida de -5,8 % en peso de ciclohexano en dos etapas desde ~140°C a ~250°C; descomposicion a T > 250°C

PP415-P22

se suspendieron 151,1 mg de PP415-P1 en 1,5 mL de tolueno; la suspension se calento a 70°C; se obtuvo una solucion clara; se anadieron 0,5 mL de MeCN; la solucion se calento a 75°C y se mantuvo a 75°C durante 30 min; se enfrio lentamente en 5 h a 5°C (a -0,23 K/min); se observo una solucion clara y sin precipitacion; la solucion clara se agito a 5°C durante 2 d; no se observo precipitacion; el solvente se evaporo bajo flujo de N2 a t.a.; se obtuvo una sustancia vitrea; se examino por espectroscopia de FT-Raman. FT-Raman: PP415P22.0 Raman: corresponde a clase 1, contiene sehales de solvente

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P23

se suspendieron 150,6 mg de PP415-P1 en 1,5 mL de dioxano; la suspension se calento a 70°C; se obtuvo una solucion clara; se anadieron 0,5 mL de EtOAc; la solucion se calento a 75°C y se mantuvo a 75°C durante 30 min; se enfrio lentamente en 5 h a 5°C (a -0,23 K/min); se observo una solucion clara y sin precipitacion; la solucion clara se agito a 5°C durante 2 d; no se observo precipitacion; el solvente se evaporo bajo flujo de N2 a t.a.; se obtuvo una sustancia vitrea; se examino por espectroscopia de FT-Raman. FT-Raman: PP415P23.0 Raman: corresponde a clase 1, contiene senales de solvente

PP415-P24

se suspendieron 99,4 mg de PP415-P1 en 0,3 mL de 1BuOH; la suspension se calento a 70°C; se obtuvo una solucion clara; se observo poco despues la precipitacion del solido bianco; se anadieron 0,5 mL de 1BuOH; siguio en suspension; la suspension se calento a 75°C y se mantuvo a 75°C durante 30 min; se enfrio lentamente en 5 h a 5°C (a -0,23 K/min); el solido se recupero por filtracion en vacio (Tamafio de poro P4); el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino porTG-FTIR. FT-Raman: PP415P24.0 PXRD: 219a TG-FTIR: a4325 Raman: corresponde a clase 2, contiene senales de solvente PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: perdida de -16,6 % en peso de 1BuOH en una etapa desde ~50°C a ~160°C, perdida adicional de 1BuOH (6,6 % en peso) en una segunda etapa desde 160°C a 230°C; descomposicion a T > 230°C

PP415-P25

se seco el material de PP415-P25 bajo vacio: a 60°C y -5 mbares durante -1 h; a t.a. y -3 mbares durante 4,5 d; a 60°C y -10 mbares durante 1 h; a 40-50°C y 5-20 mbares durante -20 h, el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P25.0 PXRD: 258a TG-FTIR: a4337 Raman: corresponde a clase 3 PXRD: corresponde a clase 3 TG-FTIR: perdida de -5,4 % en peso de 2PrOH desde 50°C a 250°C, la mayor parte en una etapa desde 170°C a 190°C, otra perdida de -1,0 % en peso de 2PrOH desde 290°C a 320°C; descomposicion a T > 320°C

PP415-P26

se seco el material de PP415-P13 bajo vacio: a 60°C y -5 mbares durante -1 h; a t.a. y -3 mbares durante 4,5 d; a 60°C y -10 mbares durante 1 h; a 40-50°C y 5-20 mbares durante -20 h, el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P26.0 PXRD: 259a TG-FTIR: a4335 Raman: corresponde a clase 4 PXRD: corresponde a clase 4 TG-FTIR: perdida de -2,8 % en peso de MeCN desde 170°C a 250°C; descomposicion a T > 300°C

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P27

se seco el material de PP415-P14 bajo vacio: a 60°C y ~5 mbares durante ~1 h; a t.a. y ~3 mbares durante 4,5 d; a 60°C y ~10 mbares durante 1 h; a 40-50°C y 5-20 mbares durante ~20 h, el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P27.0 PXRD: 260a TG-FTIR: a4336 Raman: parece que corresponde a una mezcla de clase 1 y clase 5 PXRD: la muestra solo es parcialmente cristalina; los pocos picos amplios corresponden a una clase 5; por lo tanto corresponde a una mezcla de la clase 1 y clase 5 amorfa TG-FTIR: perdida de —0,3 % en peso desde 25°C a 290°C; descomposicion a T > 290°C

PP415-P28

se seco el material de PP415-P21 bajo vacio: a 60°C y ~5 mbares durante ~1 h; a t.a. y ~3 mbares durante 4,5 d; a 60°C y ~10 mbares durante 1 h; a 40-50°C y 5-20 mbares durante ~20 h, el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P28.0 PXRD: 261a TG-FTIR: a4334 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2, muestra menos cristalina, como se indica por los picos mas amplios TG-FTIR: perdida de —3,0 % en peso de ciclohexano en dos etapas desde ~140°C a ~250°C; descomposicion a T > 250°C

PP415-P29

se suspendieron 132,2 mg de PP415-P1 en 0,8 mL de 1:2 EtOAc/TEA; se observo un cambio de apariencia de la fase solida; se agito y se sometio a sonicacion; la suspension se equilibro a 24°C agitando a 500 rpm; despues de 4 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman y PXRD; el material se seco durante 5 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino por TG-FTIR. FT-Raman: PP415P29.0 PXRD: 282a TG-FTIR: a4346 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: perdida de —5,1 % en peso de EtOAc y TEA desde ~50°C a ~220°C, la mayor parte en una etapa desde 180°C a 210°C; descomposicion a T > 220°C

PP415-P30

se seco el material de PP415-P7 bajo vacio a 50-70°C y 1-10 mbares durante 3 dias; el solido se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P30.0 PXRD: 290a TG-FTIR: a4347 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a una clase 2 TG-FTIR: perdida de —2,1 % en peso de heptano (y algo de EtOAc) en dos etapas desde ~50°C a ~250°C; descomposicion a T > 250°C

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P31

se suspendieron 137,6 mg de PP415-P1 en 2 mL de 9:1 H2O/PEG 400; se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 24°C agitando a 400 rpm; despues de 5 d el material solido se recupero por filtracion en vacio; el solido se lavo tres veces con una pequena cantidad de H2O; el material se examino por espectroscopia de FT- Raman y PXRD. FT-Raman: PP415P31.0 PXRD: 320a Raman: corresponde a clase 1 PXRD: amorfa, corresponde a clase 1

PP415-P32

se seco el material de PP415-P19 bajo vacio a 80°C y <1 x10'J mbares; despues de 1 d el material se examino por TG-FTIR (a4362); el secado se continuo; despues de un total de 3 d el material se examino por TG- FTIR (a4365), Espectroscopia de FT-Raman, y PXRD como P32A. FT-Raman: PP415P32.0 PXRD: 331a (P32A) TG-FTIR: a4362(P32) a4365(P32A) Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2, menos cristalina TG-FTIR P32: perdida de 2,8 % en peso de Heptano (25-250°C), la mayor parte en una etapa desde 170°C a 200°C; descomposicion a T > 250°C TG-FTIR P32A: perdida de 2,2 % en peso de Heptano (25-250°C), la mayor parte en una etapa desde 170°C a 200°C; descomposicion a T > 250°C

PP415-P33

se seco el material de PP415-P19 bajo vacio a 80°C y <1x10-3 mbares; despues de 3 d el material se examino por espectroscopia de FT- Raman, PXRD y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P33.0 PXRD: 332a TG-FTIR: a4366 Raman: corresponde a clase 3 PXRD: corresponde a clase 3 TG-FTIR: perdida de ~4,2 % en peso de 2PrOH (50-210°C), la mayor parte en una etapa desde 160°C a 190°C, otra perdida de —0,5 % en peso de 2PrOH (210°C a 290°C); descomposicion a T > 290°C

PP415-P34

se seco el material de PP415-P19 bajo vacio a 80°C y <1x10-3 mbares; despues de 3 d el material se examino por espectroscopia de FT- Raman, PXRD y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P34.0 PXRD: 333a TG-FTIR: a4367 Raman: corresponde a clase 2 PXRD: corresponde a clase 2, menos cristalina TG-FTIR: perdida de —2,3 % en peso de ciclohexano en dos etapas desde 25°C a 270°C; descomposicion a T > 270°C

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P35

se suspendieron 158,4 mg de PP415-P1 en 0,2 mL de MeCN/hhO; se obtuvieron dos fases separadas claras; la solucion se equilibro a 24°C agitando a 400 rpm; despues de 3 d se observo una suspension espesa; se anadieron 0,1 mL de la mezcla de solventes; se continuo el equilibrio de la suspension a 24°C agitando a 400 rpm; despues de un total de 5 d el material solido se recupero por centrifugacion en filtro (mebrana de PTFE de 0,20-pm); el material se examino por espectroscopia de FT-Raman; el material se seco durante 10 min bajo vacio (10-20 mbares); el material se examino por PXRD y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P35.0 PXRD: 326a TG-FTIR: a4363 Raman: corresponde a clase 4, contiene senales de solvente PXRD: corresponde a clase 4 TG-FTIR: perdida de 2,9 % en peso de MeCN desde 25°C a 250°C; descomposicion a T > 250°C

PP415-P36

se seco el material de PP415-P35 bajo vacio a 80°C y <1 x10'J mbares; despues de 3 d el material se examino por espectroscopia de FT- Raman, PXRD y TG-FTIR. FT-Raman: PP415P36.0 PXRD: 339a TG-FTIR: a4369 Raman: corresponde a clase 4 PXRD: corresponde a clase 4 TG-FTIR: perdida de —0,6 % en peso (probablemente H2O y/o MeCN) en dos etapas desde 25°C a 280°C; descomposicion a T > 280°C

PP415-P37

se seco el material de PP415-P35 flujo de N2 a 80°C; despues de 3 d el material se examino por espectroscopia de FT-Raman, PXRD, TG- FTIR, DSC, y DVS. FT-Raman: PP415P37.0 PXRD: 340a TG-FTIR: a4370 DSC: d 9907 DVS: dvs1176 post-DVS PXRD: 363a Raman: corresponde a clase 4 PXRD: corresponde a clase 4 TG-FTIR: perdida de —0,9 % en peso (probablemente H20 y/o MeCN) en dos etapas desde 25°C a 280°C; descomposicion a T > 280°C DSC: pico endotermico agudo a T = 196,1°C (AH = 29,31 J/g); sin descomposicion hasta 270°C DVS: ligeramente higroscopico; Am = +0,7% (50%—>85% h r.); ganancia de masa total de 2,1% en peso desde 0% h.r. a 95% h.r. post-DVS PXRD: corresponde a clase 4

PP415-P38

Experimento de DSC: se combinaron 1,275 mg de PP415-P1 y 1,344 mg de PP415-P36: se equilibraron durante 3 min bajo N2; la muestra se calento desde -50°C a 270°C a 10 K/min. DSC: d_9917 DSC

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P39

Experimento de DSC: se combinaron 2,17 mg de PP415-P1 y 2,20 mg de PP415-P36; los solidos se mezclaron utilizando una espatula; se equilibraron durante 3 min bajo N2; la muestra se calento desde -50°C a 173°C a 10K/min; se mantuvo a 173°C durante 30 min; se calento desde 173°C a 270°C a 10 K/min. DSC: d_9923 DSC

PP415-P40

recibido -5 g de 63415, lote #: 2083-69-DC el 27 de mayo, 2011; PM — 554,7 g/mol, C33H44F2N2O3 PXRD: 390a PXRD: corresponde a clase 2

PP415-P41

se suspendieron 101,3 mg de PP415-P40 en 0,20 mL de THF/H2O (1:1); se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a 24°C; despues de 3 dias el solido se recupero por centrifugacion en filtro (membrana de PTFE de 0,2 pm); el material solido se seco bajo vacio durante 5 min; el solido se examino por PXRD. PXRD: 400a PXRD: corresponde a clase 5

PP415-P42

se disolvieron 104,6 mg de PP415-P40 en 0,20 mL de THF; se obtuvo una solucion clara; el solvente se evaporo bajo flujo de N2 durante la noche; se obtuvo un solido bianco; el solido se examino por PXRD. PXRD: 405a PXRD: amorfa (clase 1)

PP415-P43

se disolvieron 101,8 mg de PP415-P40 en 0,20 mL de THF/hexano (8:2); se obtuvo una solucion clara; el solvente se evaporo bajo flujo de N2 durante la noche; se obtuvo un solido bianco; el solido se examino por PXRD. PXRD: 429a PXRD: corresponde a clase 2

PP415-P44

se seco el material de PP415-P41 bajo vacio (-100 mbares) a 80°C; el solido se examino despues de 1 dia por PXRD (474a); el secado se continuo durante la noche; el solido se examino de nuevo por PXRD (482a) y TG-FTIR. PXRD: 474a, 482a TG-FTIR: a4401 PXRD: ambas principalmente amorfas (clase 1), algunos picos amplios con baja intensidad TG-FTIR: -0,9 % en peso de THF 25-280°C, descomposicion a T > 300°C

PP415-P45

se suspendieron 3,03 g de PP415-P40 en 6,0 mL de THF/H20 (1:1); se obtuvo una suspension blanca; la suspension se equilibro a t.a.; despues de 1 dia se recupero una pequeha alicuota por centrifugacion en filtro y se examino por PXRD; se recupero el solido de la muestra completa por filtracion en vacio; la muestra se seco durante 10 min bajo vacio (-10 mbares). PXRD: 471a PXRD: corresponde a clase 5

Muestra

Descripcion Experimental Metodos de Prueba Resultado / Observaciones

PP415-P46

se seco el material de PP415-P45 bajo vacio (-100 mbares) a 80°C; el solido se examino despues del secado durante la noche por PXRD (481a); el secado se continuo; despues de 4 dias el solido se examino como PP415-P46a por PXRD (496a) y TG-FTIR. PXRD: 481a, 496a TG-FTIR: a4410 PXRD: ambas principalmente amorfas (clase 1), algunos picos amplios con baja intensidad TG-FTIR: -0,4 % en peso de H20 25-250°C, descomposicion a T > 250°C

PP415-P47

se disolvieron 101,8 mg de PP415-P40 en 0,4 mL de EtOAc; se obtuvo una solucion clara; el solvente se evaporo bajo flujo de N2 durante la noche; se obtuvo un solido bianco; el solido se examino por PXRD y TG-FTIR. PXRD: 492a TG-FTIR: a4412 PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: -6,2 % en peso de EtOAc 25-170°C, 1,7 % en peso de EtOAc 170-240°C, descomposicion a T > 240°C

PP415-P48

se disolvieron 101,1 mg de PP415-P40 en 0.4 mL de formato de etilo; se obtuvo una solucion clara; el solvente se evaporo bajo flujo de N2 durante la noche; se obtuvo un solido bianco; el solido se examino por PXRD y TG-FTIR. PXRD: 493a TG-FTIR: a4413 PXRD: corresponde a clase 2 TG-FTIR: —3,5 % en peso de formiato de etilo 25- 200°C, descomposicion a T > 200°C

PP415-P49

se disolvieron 205,3 mg de PP415-P40 en 0,3 mL de acetona; se obtuvo una solucion clara; se ahadieron por goteo unos 30,0 mL de H2O (pre-enfriado a 5°C); se obtuvo una suspension blanca ligera; la suspension ligera se agito a 5°C durante la noche; se obtuvo una suspension blanca mas espesa; el solido se recupero por filtracion en vacio (tarnaho de poro P4); se obtuvieron 188,3 mg de solido bianco; el solido se examino por PXRD. PXRD: 593a PXRD: amorfa (clase 1)

Compuesto

Niveles de NOx (% frente a Controles de LPS)

13 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg

RTA 405 *

44% 26% 18%

63415

30% 18% 16%

Tabla 32. 63415: ADMET Primario In Vivo - Ensayo de ADMET Primario Clave y Puntos Finales

Ensayo

Puntos Finales Claves

toxicidad en raton de 14 dias

Tolerabilidad, peso corporal, quimica clinica Distribucion de tejido Expresion de ARNm de gen diana de Nrf2 y activacion enzimatica en el higado

toxicidad en ratas de 14 dias

Tolerabilidad, peso corporal, quimica clinica, e histopatologia limitada Distribucion de tejido y TK de plasma Expresion de ARNm de gen diana de Nrf2 y activacion enzimatica en el higado

toxicidad en monos de 14 dias

Tolerabilidad, peso corporal, quimica clinica, e histopatologia limitada Distribucion de tejido y TK de plasma Expresion de ARNm de gen diana de Nrf2 y activacion enzimatica en tejidos multiples y PBMCs

Vehfculo 63415

Dosis (mg/kg)

0 10 30 100

ALT (U/L)

100 39 63 91

AST (U/L)

156 98 147 167

ALP (U/L)

120 131 110 98

Bil Tot (mg/dL)

<0,2 <0,2 <0,2 <0,2

BUN (mg/dL)

17 15 15 15

Cr (mg/dL)

<0,2 <0,2 <0,2 <0,2

Glu (mg/dL)

288 307 285 273

00

cn

Tratamiento (n=5/grupo)

PCE/Eritrocitos totales (Media +/-SD) Cambio del Control (%) Numero de MPCE/1000 PCE (Media +/-SD) Numero de MPCE/PCE Calificado

punto de tiempo de 24 h

Aceite de sesamo

0,588 ± 0,04 0,2 ± 0,27 2/10.000

125 mg/kg

0,543 ± 0,03 -8 0,3 ± 0,27 3/10.000

250 mg/kg

0,520 ± 0,06 -12 0,3 ± 0,27 3/10.000

500 mg/kg

0,426 ± 0,07 -28 0,0 ± 0,00 0/10.000

1.000 mg/kg

0,498 ± 0,05 -15 0,2 ± 0,27 2/10.000

1.500 mg/kg

0,499 ± 0,06 -15 0,4 ± 0,22 4/10.000

2.000 mg/kg

0,531 ± 0,05 -10 0,2 ± 0,27 2/10.000

punto de tiempo de 48 h

Aceite de sesamo

0,526 ± 0,05 0,3 ± 0,27 3/10.000

125 mg/kg

0,453 ± 0,03 -14 0,2 ± 0,27 2/10.000

250 mg/kg

0,391 ± 0,02 -26 0,2 ± 0,27 2/10.000

500 mg/kg

0,339 ± 0,05 -36 0,3 ± 0,45 3/10.000

1.000 mg/kg

0,344 ± 0,04 -35 0,1 ± 0,22 1/10.000

1.500 mg/kg

0,376 ± 0,05 -39 0,4 ± 0,42 4/10.000

2.000 mg/kg

0,360 ± 0,03 -32 0,1 ± 0,22 1/10.000

Tratamiento

Dfa ALT (U/L) AST (U/L) ALP (U/L) Bil Tot (mg/dL) BUN (mg/dL) Cr (mg/dL) Prot Tot (g/dL) Albumina (g/dL) Glucosa (mg/dL) Colesterol (mg/dL) TG (mg/dL)

Vehiculo

BL 30 29 320 0,15 23 0,63 7,2 4,1 87 124 52

Dfa 14

37 37 345 0,23 18 0,63 6,9 4,1 63 130 64

10 mg/kg

BL 46 32 351 0,18 35 0,78 7,4 4 74 146 51

Dfa 14

46 38 382 0,23 27 0,68 7,2 4 39 144 82

30 mg/kg

BL 32 32 409 0,18 23 0,7 7,3 4,2 85 125 47

Dfa 14

47 43 416 0,2 20 0,58 7,2 4 53 122 64

100 mg/kg

BL 32 35 381 0,15 24 0,7 6,9 4 96 137 37

Dfa 14

43 37 390 0,18 24 0,55 6 3,2 32 93 61

63415 63355

Cl50 de NO (nM), RAW264.7

4,0 ±1 0,63 ± 0,06

Cl50 deWST-1 (nM), RAW264.7

125 150

NQ01-ARE (veces a 62,5 nM en HuH7)

5,3 ± 1,0 6,5 ± 0,9

Tabla37. Parametros de la FIG. 52

Compuesto

Plasma Sangre Entera Cerebro Hfgado Pulmon Rinon

RTA 405 (nM)

130 1.165 93 1.143 1.631 2.357

63415 (nM)

51 679 1.081 985 533 1.604

oo

oo

Tabla 38. Parametros de la FIG. 53

Compuesto

Hfgado Pulmon Rinon

RTA 405

1,93 1,48 8,25

63415

10,9 1,75 10,9

Referencias

10

15

20

25

30

Las siguientes referencias se proporcionan en la medida en que proporcionen procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a los descritos en la presente.

Patente de Estados Unidos 6.326.507

Patente de Estados Unidos 6.974.801

Patente de Estados Unidos 7.915.402

Patente de Estados Unidos 7.943.778

Patente de Estados Unidos 8.124.799

Patente de Estados Unidos 8.129.429

Publicacion de Patente de Estados Unidos 2009/0060873

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Claims (26)

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1. Un compuesto de la formula:

imagen1

o una sal del mismo farmaceuticamente aceptable.

2. El compuesto segun la reivindicacion 1, que es un compuesto de la formula:

imagen2

3. Una forma polimorfica del compuesto segun la reivindicacion 1 o 2,

en el que la forma polimorfica tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende un pico de halo a aproximadamente 14 °20; o

en el que la forma polimorfica es un solvato que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 5,6, 7,0, 10,6, 12,7, y 14,6 °20; o

en el que la forma polimorfica es un solvato que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 7,0, 7,8, 8,6, 11,9, 13,9 (pico doble), 14,2, y 16,0 °20; o

en el que la forma polimorfica es un hemisolvato de acetonitrilo que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 7,5, 11,4, 15,6, y 16,6 °20; o

en el que la forma polimorfica es un solvato que tiene un patron de difraccion en polvo de rayos X (CuKa) que comprende picos a aproximadamente 6,8, 9,3, 9,5, 10,5, 13,6, y 15,6 °20.

4. El compuesto segun la reivindicacion 1 o 2 o la forma polimorfica segun la reivindicacion 3 para uso en un medicamento.

5. Una composicion farmaceutica que comprende:

un ingrediente activo que consiste en un compuesto segun la reivindicacion 1 o 2 o una forma polimorfica segun la reivindicacion 3, y

un vehuculo farmaceuticamente aceptable.

6. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5, en la que la composicion farmaceutica se formula para la administracion: via oral, intraadiposal, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradermica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapericardica, intraperitoneal, intrapleural, intraprcstatica, intrarrectal, intratecal, intratraqueal, intratumoral, intraumbilical, intravaginal, intravenosa, intravesicular, intravttrea, liposomal, local, mucosal, parenteral, rectal, subconjuntival, subcutanea, sublingual, topica, transbucal, transdermica, vaginal, en cremas, en composiciones de lfpidos, a traves de un cateter, a traves un lavado, a traves de infusion continua, a traves de infusion, a traves de inhalacion, a traves de inyeccion, a traves desuministro local, o a traves de perfusion localizada.

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7. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 6, en la que la composicion farmaceutica se formula como una capsula dura o blanda, un comprimido, un jarabe, una suspension, una emulsion, una disolucion, una dispersion solida, una oblea, o un eKxir.

8. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 5 o 6, en la que la composicion farmaceutica se formula para administracion topica, en una forma seleccionada de una locion, una crema, un gel, un aceite, un unguento, un balsamo, una emulsion, una disolucion, y una suspension.

9. La composicion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que la cantidad del ingrediente activo es desde 0,01% a 5% en peso.

10. El compuesto segun la reivindicacion 1 o 2 o la forma polimorfica segun la reivindicacion 3 o la composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 para uso en el tratamiento o prevencion de una afeccion asociada con la inflamacion o estres oxidativo.

11. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 10, en el que la afeccion es una enfermedad o trastorno de la piel, sepsis, dermatitis, osteoartritis, cancer, inflamacion, una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, una complicacion de la exposicion localizada o total del cuerpo a la radiacion ionizante, mucositis, insuficiencia organica aguda o cronica, enfermedad hepatica, pancreatitis, un trastorno ocular, una enfermedad pulmonar, o diabetes.

12. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es una enfermedad o trastorno de la piel seleccionado de dermatitis, una quemadura termica o qmmica, una herida cronica, acne, alopecia, otros trastornos del folfculo piloso, epidermolisis bullosa, quemaduras solares, complicaciones de las quemaduras solares, un trastorno de la pigmentacion de la piel, una afeccion de la piel relacionada con el envejecimiento, una herida post-quirurgica, una cicatriz de una lesion o quemadura de la piel, psoriasis, una manifestacion dermatologica de una enfermedad autoinmune o una enfermedad de injerto contra huesped, cancer de piel, y un trastorno que implica la hiperproliferacion de celulas de la piel.

13. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es dermatitis, que es dermatitis alergica, dermatitis atopica, dermatitis debida a la exposicion qmmica, o dermatitis inducida por radiacion.

14. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es una enfermedad autoinmune seleccionada de artritis reumatoide, lupus, enfermedad de Crohn, y psoriasis.

15. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es una enfermedad hepatica seleccionada de enfermedad del hngado graso y hepatitis.

16. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es un trastorno ocular seleccionado de uveitis, degeneracion macular, glaucoma, edema macular diabetico, blefaritis, retinopatfa diabetica, una enfermedad o trastorno del endotelio corneal, inflamacion post- quirurgica, ojo seco, conjuntivitis alergica, y una forma de conjuntivitis.

17. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es una enfermedad pulmonar seleccionada de inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar, COPD, asma, fibrosis qmstica, y fibrosis pulmonar idiopatica.

18. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es mucositis resultante de la terapia de radiacion o quimioterapia.

19. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es cancer seleccionado de un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, melanoma, mesotelioma, mieloma multiple, y seminoma.

20. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 19, en el que la afeccion es melanoma.

21. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 11, en el que la afeccion es cancer y el cancer es de la vejiga, sangre, hueso, cerebro, mama, centro sistema nervioso, cuello uterino, colon, endometrio, esofago, vesfcula biliar, genitales, tracto genitourinario, cabeza, rinon, laringe, fngado, pulmon, tejido muscular, cuello, mucosa oral o nasal, ovario, pancreas, prostata, piel, bazo, intestino delgado, intestino grueso, estomago, testfculos, o tiroides.

22. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 21, en el que la afeccion es cancer de pulmon.

23. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun una cualquiera de las

reivindicaciones 10 a 22, en el que el compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica se administra tanto antes como despues de que el sujeto se trata con la terapia de radiacion o quimioterapia.

24. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 23, en el que el tratamiento reduce un efecto secundario de la terapia de radiacion o la quimioterapia.

5 25. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 24, en el

que el efecto secundario es mucositis y dermatitis.

26. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica se administra en combinacion con una inmunoterapia.

27. El compuesto, la forma polimorfica, o la composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 26, en el que la inmunoterapia es un anticuerpo frente al cancer.

10 28. El compuesto segun la reivindicacion 1 6 2 o la forma polimorfica segun la reivindicacion 3 o la composicion

farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 para uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad neurodegenerativa.

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