KR20150003875A - 바독솔론 메틸의 2,2-다이플루오로프로피온아미드 유도체, 그의 다형태 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 화합물: N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-시아노-2,2,6a,6b,9,9,12a-헵타메틸-10,14-다이옥소-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-옥타데카하이드로피센-4a-일)-2,2-다이플루오로프로판아미드, 그의 다형태, 그의 제조 및 사용 방법, 그의 약학 조성물, 및 그의 키트 및 제조품에 관한 것이다.

Description

바독솔론 메틸의 2,2-다이플루오로프로피온아미드 유도체, 그의 다형태 및 사용 방법{2,2-DIFLUOROPROPIONAMIDE DERIVATIVES OF BARDOXOLONE METHYL, POLYMORPHIC FORMS AND METHODS OF USE THEREOF}

I. 발명의 분야

본 발명은 일반적으로 화합물: N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-시아노-2,2,6a,6b,9,9,12a-헵타메틸-10,14-다이옥소-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-옥타데카하이드로피센-4a-일)-2,2-다이플루오로프로판아미드(또한 본 발명에서 RTA 408, 63415, 또는 PP415라 지칭된다)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그의 다형태, 그의 제조 및 사용 방법, 그의 약학 조성물, 및 그의 키트 및 제조품에 관한 것이다.

본 출원은 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/780,444 호, 2013년 3월 8일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/775,288 호, 및 2012년 4월 27일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/687,669 호에 대한 우선권의 이점을 주장하며; 이들 각각의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.

조항 37 C.F.R. 1.821(c)에 따라, ASCII에 따르는 텍스트 화일로서 2013년 4월 24일에 작성되어 약 6 킬로바이트의 크기를 가지는 화일 "REATP0073WO_ST25"로서 서열목록을 여기에 함께 제출합니다. 상기 언급된 화일의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 삽입됩니다.

II. 관련 분야의 설명

천연 트라이터페노이드, 올레아놀산의 소염 및 증식억제 활성은 화학적 변형에 의해 개선되었다. 예를 들어, 2-시아노-3,12-다이옥소올레아나-1,9(11)-다이엔-28-오산(CDDO) 및 관련 화합물들이 개발되었다. 하기 문헌들을 참조하시오: Honda et al., 1997; Honda et al., 1998; Honda et al., 1999; Honda et al., 2000a; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Suh et al., 1998; Suh et al., 1999; Place et al., 2003; Liby et al., 2005; 및 미국 특허 제 8,129,429 호, 제 7,915,402 호, 제 8,124,799 호, 및 제 7,943,778 호(이들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다). 메틸 에스터, 바독솔론 메틸(CDDO-Me)은 당뇨성 망막병증 및 만성 신장병의 치료 및 예방에 대해 II 및 III기 임상 시험에서 평가되었다. 문헌[Pergola et al., 2011](본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.

올레아놀산의 합성 트라이터페노이드 유사체도 또한, 마우스 대식세포에서 COX-2의 그리고 유도성 산화 질소 신타제(iNOS)의 IFN-γ에 의한 유도와 같은, 세포 염증 과정의 억제제로서 입증되었다. 문헌들 [Honda et al, (2000a)], [Honda et al. (2000b)], [Honda et al. (2002)], 및 미국 특허 제 8,129,429 호, 제 7,915,402 호, 제 8,124,799 호, 및 제 7,943,778 호(이들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 올레아놀산으로부터 유도된 화합물은 다수의 단백질 표적들의 기능에 영향을 미치고 이에 의해 산화 스트레스, 세포 주기 조절 및 염증과 관련된 다수의 중요한 세포 신호전달 경로의 활성을 조절하는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌들 [Dinkova-Kostova et al., 2005]; [Ahmad et al., 2006]; [Ahmad et al., 2008]; [Liby et al., 2007a], 및 미국 특허 제 8,129,429 호, 제 7,915,402 호, 제 8,124,799 호, 및 제 7,943,778 호).

공지된 트라이터페노이드 유도체의 생물 활성 프로파일을 고려하여, 효능있는 산화방지 및 소염 효과를 갖는 화합물로 치료되거나 예방될 수 있는 광범위하게 다양한 질병, 및 상기 광범위한 질병 내에서 나타나는 충족되지 못한 의학적 요구 정도에 비추어, 하나 이상의 적응증의 치료 또는 예방을 위한 상이한 생물 활성 프로파일을 갖는 신규 화합물을 합성하는 것이 바람직하다.

발명의 요약

본 발명의 일부 태양에서, 하기 화학식의 화합물(또한 본 발명에서 RTA 408, 63415, 또는 PP415로서 지칭된다):

또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

일부 실시태양에서, 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태이다. 일부 실시태양에서, 상기 화합물은 염의 형태가 아니다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 화합물의 다형태를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 14 °2θ에서 할로 피크를 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)은 약 8 °2θ에서 숄더 피크를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)은 실질적으로 도 59에 도시된 바와 같다. 일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 150 ℃ 내지 약 155 ℃의 T_g, 예를 들어 약 153 ℃의 T_g 또는 약 150 ℃의 T_g를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 150 ℃ 내지 약 155 ℃에 집중된 흡열(endotherm)을 포함하는 시차 주사 열량측정(differential scanning calorimetry: DSC) 곡선을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 흡열은 약 153 ℃에 집중된다. 일부 실시태양에서, 상기 흡열은 약 150 ℃에 집중된다. 일부 실시태양에서, 상기 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선은 실질적으로 도 62에 도시된 바와 같다.

일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 5.6, 7.0, 10.6, 12.7 및 14.6 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 용매화물이다. 일부 실시태양에서, 상기 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)은 실질적으로 도 75, 맨위 패턴에 도시된 바와 같다.

일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 7.0, 7.8, 8.6, 11.9, 13.9(이중 피크), 14.2 및 16.0 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 용매화물이다. 일부 실시태양에서, 상기 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)은 실질적으로 도 75, 맨위에서부터 두 번째 패턴에 도시된 바와 같다.

일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 7.5, 11.4, 15.6 및 16.6 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 아세토나이트릴 반용매화물이다. 일부 실시태양에서, 상기 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)은 실질적으로 도 75, 아래에서부터 두 번째 패턴에 도시된 바와 같다. 일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 196 ℃의 T_g를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 196 ℃에 집중된 흡열을 포함하는 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선은 실질적으로 도 116에 도시된 바와 같다.

일부 실시태양에서, 상기 다형태는 약 6.8, 9.3, 9.5, 10.5, 13.6 및 15.6 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 용매화물이다. 일부 실시태양에서, 상기 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)은 실질적으로 도 75, 맨아래 패턴에 도시된 바와 같다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 화합물 또는 그의 다형태(예를 들어 본 발명에서 상기 및 하기에 개시되는 다형태들 중 임의의 하나)로 이루어지는 활성 성분, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 경구, 지방내, 동맥내, 관절내, 두개내, 피내, 병변내, 근육내, 비내, 안내, 심막내, 복강내, 늑막내, 전립선내, 직장내, 척추강내, 기관내, 종양내, 탯줄내, 질내, 정맥내, 소낭내, 유리체내, 리포솜으로, 국소로, 점막으로, 비경구로, 직장으로, 결막하로, 피하로, 설하로, 국소로, 볼통과로, 경피로, 질로, 크림 중에서, 액체 조성물 중에서, 카테터를 통해서, 세척을 통해서, 연속 주입을 통해서, 주입을 통해서, 흡입을 통해서, 주사를 통해서, 국소 전달을 통해서, 또는 국소화된 관류를 통해서 투여하기 위해 제형화한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 경구, 동맥내, 정맥내, 또는 국소 투여를 위해서 제형화한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 경구 투여를 위해서 제형화한다.

일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 경질 또는 연질 캡슐, 정제, 시럽, 현탁액, 유화액, 용액, 고체 분산액, 웨이퍼, 또는 엘릭서로서 제형화한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 용해성 및 분산성을 증대시키는 작용제를 추가로 포함한다. (예를 들어, 용해성 및 분산성을 증대시키는 작용제는 비제한적으로 PEG, 사이클로덱스트란 및 셀룰로스 유도체를 포함한다). 일부 실시태양에서, 상기 화합물 또는 다형태를 참깨 오일 중에 현탁시킨다.

다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 국소 투여를 위해 제형화한다. 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 로션, 크림, 젤, 오일, 연고, 고약, 유화액, 용액 또는 현탁액으로서 제형화한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 로션으로서, 크림으로서, 또는 젤로서 제형화한다. 일부 실시태양에서, 상기 활성 성분의 양은 약 0.01 내지 약 5 중량%, 약 0.01 내지 약 3 중량% 또는 0.01 중량%, 0.1 중량%, 1 중량% 또는 3 중량%이다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 상태의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 치료 유효량의 상기 또는 하기에 개시된 바와 같은 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 상기 상태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 본 발명은 마찬가지로 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-시아노-2,2,6a,6b,9,9,12a-헵타메틸-10,14-다이옥소-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-옥타데카하이드로피센-4a-일)-2,2-다이플루오로프로판아미드(또는 RTA 408) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 상기 화합물의 다형태(예를 들어 본 발명에서 상기 또는 하기에 개시된 다형태들 중 임의의 하나), 또는 상기 언급한 존재들 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물(예를 들어 상술한 약학 조성물 포함)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 상태는 염증과 관련된다. 다른 실시태양에서, 상기 상태는 산화 스트레스와 관련된다. 일부 실시태양에서, 상기 상태는 피부병 또는 피부 질환, 패혈증, 피부염, 골관절염, 암, 염증, 자가면역 질병, 염증성 장 질병, 이온화 방사선에의 국소화된 또는 전신 노출로부터의 합병증, 점막염, 급성 또는 만성 기관 부전, 간 질환, 췌장염, 눈 질환, 폐 질환 또는 당뇨병이다.

본 발명은 더욱 또한 피부병 또는 피부 질환, 패혈증, 피부염, 골관절염, 암, 염증, 자가면역 질병, 염증성 장 질병, 이온화 방사선에의 국소화된 또는 전신 노출로부터의 합병증, 점막염, 급성 또는 만성 기관 부전, 간 질환, 췌장염, 눈 질환, 폐 질환 및 당뇨병 중에서 선택된 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-시아노-2,2,6a,6b,9,9,12a-헵타메틸-10,14-다이옥소-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-옥타데카하이드로피센-4a-일)-2,2-다이플루오로프로판아미드(또는 RTA 408) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 상기 화합물의 다형태(예를 들어 본 발명에서 상기 또는 하기에 개시된 다형태들 중 임의의 하나), 또는 상기 언급한 존재들 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물(예를 들어 상술한 약학 조성물 포함)에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 피부병 또는 피부 질환, 패혈증, 피부염, 골관절염, 암, 염증, 자가면역 질병, 염증성 장 질병, 이온화 방사선에의 국소화된 또는 전신 노출로부터의 합병증, 점막염, 급성 또는 만성 기관 부전, 간 질환, 췌장염, 눈 질환, 폐 질환 및 당뇨병 중에서 선택된 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 피부병 또는 피부 질환, 패혈증, 피부염, 골관절염, 암, 염증, 자가면역 질병, 염증성 장 질병, 이온화 방사선에의 국소화된 또는 전신 노출로부터의 합병증, 점막염, 급성 또는 만성 기관 부전, 간 질환, 췌장염, 눈 질환, 폐 질환 및 당뇨병 중에서 선택된 상태의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 치료 유효량의 상기 언급한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에게서 상기 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 상태는 피부병 또는 피부 질환, 예를 들어 피부염, 열적 또는 화학적 화상, 만성 상처, 여드름, 탈모증, 모낭의 다른 질환, 수포성 표피박리증, 일광화상, 일광화상의 합병증, 피부 착색 질환, 노화-관련된 피부 상태; 수술후 상처, 피부 손상 또는 화상으로부터의 흉터, 건선, 자가면역 질병 또는 이식편대 숙주병의 피부학적 발현, 피부암, 또는 피부세포의 과잉증식을 수반하는 질환이다. 일부 실시태양에서, 상기 피부병 또는 피부질환은 피부염이다. 일부 실시태양에서, 상기 피부염은 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 화학물질 노출로 인한 피부염, 또는 방사선-유발된 피부염이다. 다른 실시태양에서, 상기 피부병 또는 피부질환은 만성 상처이다. 일부 실시태양에서, 상기 만성 상처는 당뇨성 궤양, 욕창, 또는 정맥궤양이다. 다른 실시태양에서, 상기 피부병 또는 피부질환은 탈모증이다. 일부 실시태양에서, 상기 탈모증은 대머리 및 약물-유발된 탈모증 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 상기 피부병 또는 피부질환은 피부 착색 질환이다. 일부 실시태양에서, 상기 피부 착색 질환은 백반증이다. 다른 실시태양에서, 상기 피부병 또는 피부질환은 피부세포의 과잉증식을 수반하는 질환이다. 일부 실시태양에서, 상기 피부세포의 과잉증식을 수반하는 질환은 과각화증이다.

다른 실시태양에서, 상기 상태는 자가면역 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 루푸스, 크론병, 또는 건선이다. 다른 실시태양에서, 상기 상태는 간 질환, 예를 들어 지방간 질환 또는 간염이다.

다른 실시태양에서, 상기 상태는 눈 질환, 예를 들어 포도막염, 황반 변성, 녹내장, 당뇨성 황반 부종, 안검염, 당뇨성 망막병증, 각막 내피의 질병 또는 질환, 수술후 염증, 안구 건조증, 알러지성 결막염 또는 결막염의 한 형태이다. 일부 실시태양에서, 상기 눈 질환은 황반 변성이다. 일부 실시태양에서, 상기 황반 변성은 건성 형태이다. 다른 실시태양에서, 상기 황반 변성은 습성 형태이다. 일부 실시태양에서, 상기 각막 내피의 질병 또는 질환은 푹스 내피 각막 이영양증이다.

다른 실시태양에서, 상기 상태는 폐 질환, 예를 들어 폐 염증, 폐 섬유증, COPD, 천식, 낭성 섬유증, 또는 특발성 폐 섬유증이다. 일부 실시태양에서, 상기 COPD는 담배 연기에 의해 유발된다.

다른 실시태양에서, 상기 상태는 패혈증이다. 다른 실시태양에서, 상기 상태는 방사선 요법 또는 화학요법으로부터 발생하는 점막염이다. 일부 실시태양에서, 상기 점막염은 구강에 존재한다. 다른 실시태양에서, 상기 상태는 방사선에의 노출과 관련된다. 일부 실시태양에서, 상기 방사선 노출은 피부염을 야기한다. 일부 실시태양에서, 상기 방사선 노출은 급성이다. 다른 실시태양에서, 상기 방사선 노출은 분할된다.

다른 실시태양에서, 상기 상태는 암이다. 일부 실시태양에서, 상기 암은 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 또는 정상피종이다. 다른 실시태양에서, 상기 암은 방광, 혈액, 뼈, 뇌, 유방, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 방광, 생식기, 비뇨생식관, 두부, 신장, 후두, 간, 폐, 근육 조직, 경부, 구강 또는 코 점막, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 비장, 소장, 대장, 위, 고환 또는 갑상선의 암이다.

일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을, 환자를 방사선 요법 또는 화학요법으로 치료하기 전 또는 치료한 직후에 투여하며, 여기에서 상기 화학요법은 RTA 408 또는 그의 다형태를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을, 상기 환자를 방사선 요법, 화학요법, 또는 이 둘 모두로 치료하기 전후 모두 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 치료는 상기 방사선 요법 또는 화학요법의 부작용을 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 부작용은 점막염 및 피부염이다. 일부 실시태양에서, 상기 치료는 상기 방사선 요법 또는 화학요법의 효능을 증대시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 화학요법은 상기 환자에게 치료 유효량의 5-플루오로유라실 또는 도세탁셀을 투여함을 포함한다.

추가적인 복합 치료 요법이 또한 본 명세에 의해 고려된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 암을 치료하는 방법은, 약학적으로 유효한 양의 제 2 약물, 방사선 요법, 면역요법, 유전자 요법, 및 수술을 시행함으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 치료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (1) 종양 세포를 상기 화합물과 접촉시킨 후에 상기 종양 세포를 제 2 약물과 접촉시키거나, (2) 종양 세포를 상기 제 2 약물과 접촉시킨 후에 상기 종양 세포를 상기 화합물과 접촉시키거나, 또는 (3) 종양 세포를 상기 화합물 및 상기 제 2 약물과 동시에 접촉시킴을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제 2 약물은 몇몇 실시태양에서, 항생제, 소염제, 신생물 억제제, 증식 억제제, 항바이러스제, 면역조절제, 또는 면역억제제일 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 제 2 약물은 알킬화제, 안드로젠 수용체 조절제, 세포골격 붕괴제, 에스트로젠 수용체 조절제, 히스톤-데아세틸라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 레티노이드 수용체 조절제, 국소이성화 효소 억제제, 또는 타이로신 키나제 억제제일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제 2 약물은 5-아자시티딘, 5-플루오로유라실, 9-시스-레티노산, 액티노마이신 D, 알리트레티노인, 모든-트랜스-레티노산, 안나마이신, 악시티니브, 벨리노스태트, 베바시주맵, 벡사로텐, 보수티니브, 부설판, 카페시타빈, 카보플라틴, 카머스틴, CD437, 세디라니브, 세툭시맵, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 다사티니브, 다우노루비신, 데시타빈, 도세탁셀, 돌라스타틴-10, 독시플루리딘, 독소루비신, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티니브, 에토포시드, 제피티니브, 젬시타빈, 젬투주맵 오조가미신, 헥사메틸멜라민, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브, 이리노테칸, 아이소트레티노인, 익사베필론, 라파티니브, LBH589, 로머스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, MS-275, 네라티니브, 닐로티니브, 니트로소유레아, 옥살리플라틴, 패클리탁셀, 플리카마이신, 프로카바진, 세막사니브, 세머스틴, 나트륨 부티레이트, 나트륨 페닐아세테이트, 스트렙토조토신, 수베로일아닐리드 하이드록삼산, 수니티니브, 타목시펜, 테니포시드, 티오페타, 티오구아닌, 토포테칸, TRAIL, 트라스투주맵, 트레티노인, 트리코스타틴 A, 발프로산, 발루비신, 반데타니브, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 또는 비노렐빈이다.

환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 염증 성분을 갖는 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 또한 고려된다. 일부 실시태양에서, 상기 질병은 예를 들어 루푸스 또는 류마티스성 관절염일 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 질병은 염증성 장 질병, 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염일 수 있다. 다른 실시태양에서, 염증 성분을 갖는 질병은 심혈관 질병일 수 있다. 다른 실시태양에서, 염증 성분을 갖는 질병은 당뇨병, 예를 들어 1형 또는 2형 당뇨병일 수 있다. 다른 실시태양에서, RTA 408, 그의 다형태 및 약학 조성물을 또한 당뇨병과 관련된 합병증의 치료에 사용할 수 있다. 상기와 같은 합병증은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로, 예를 들어 비만증, 고혈압, 죽상동맥경화증, 관상동맥 심장병, 뇌졸중, 말초 혈관 질병, 고혈압, 신장병증, 신경병증, 근육괴사, 망막병증 및 대사 증후군(증후군 X)을 포함한다. 다른 실시태양에서, 염증 성분을 갖는 질병은 피부병, 예를 들어 건선, 여드름 또는 아토피성 피부염일 수 있다. 상기와 같은 피부병의 치료 방법에서 RTA 408, 그의 다형태 및 약학 조성물의 투여는 예를 들어 국소 또는 경구일 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.

다른 실시태양에서, 염증 성분을 갖는 질병은 대사 증후군(증후군 X)일 수 있다. 상기 증후군을 갖는 환자는 하기 5 개의 증상 그룹 중에서 선택된 3 개 이상의 증상을 가짐을 특징으로 한다: (1) 복부 비만; (2) 고트라이글리세라이드혈증; (3) 낮은 고밀도 지단백질 콜레스테롤(HDL); (4) 높은 혈압; 및 (5) 상승된 공복 혈당(이는 상기 환자가 또한 당뇨병인 경우 2형 당뇨병의 특징적인 범위 중에 있을 수 있다). 이러한 증상들은 각각 성인의 높은 혈중 콜레스테롤의 검출, 평가 및 치료에 대한 국립 콜레스테롤 교육 프로그램 전문가 패널(성인 치료 패널 III, 또는 ATP III)의 세 번째 보고서(국립 보건원, 2001, NIH 공보 제 01-3670)(본 발명에 참고로 인용된다)에 정의되어 있다. 대사 증후군이 있는 환자는 명백한 당뇨병이 있거나 발병하거나 혹은 그렇지 않거나에 상관 없이, 2형 당뇨병과 함께 발생하는 상기에 나열된 대혈관 및 소혈관 합병증, 예를 들어 죽상동맥경화증 및 관상동맥 심장병의 발병 위험이 높다.

본 명세의 또 다른 일반적인 방법은 환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 심혈관 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 수반한다. 일부 실시태양에서, 상기 심혈관 질병은 비제한적으로, 예를 들어 죽상동맥경화증, 심근병증, 선천성 심장병, 울혈성 심부전, 심근증, 류마티스성 심장병, 판막병, 관상동맥 질병, 심내막염, 또는 심근경색일 수 있다. 복합 요법이 또한 환자에서 심혈관 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로 고려된다. 예를 들어, 상기와 같은 방법은 약학적으로 유효한 양의 하나 이상의 심혈관 약물을 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 심혈관 약물은 비제한적으로, 예를 들어 콜레스테롤 강하 약물, 고지질혈증 치료제, 칼슘 채널 차단제, 고혈압 치료제, 또는 HMG-CoA 리덕타제 억제제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 심혈관 약물의 비제한적인 예는 암로디핀, 아스피린, 에제티미베, 펠로디핀, 라시디핀, 레르카니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 니모디핀, 니솔디핀 또는 니트렌디핀을 포함한다. 다른 실시태양에서, 심혈관 약물의 다른 비제한적인 예는 아테놀롤, 부신돌롤, 카르베딜롤, 클로니딘, 독사조신, 인도라민, 라베탈롤, 메틸도파, 메토프롤롤, 나돌롤, 옥스프레놀롤, 페녹시벤자민, 펜톨아민, 핀돌롤, 프라조신, 프로프라놀롤, 테라조신, 티몰롤 또는 톨라졸린을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 심혈관 약물은 예를 들어 스타틴, 예를 들어 아토바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 또는 심바스타틴일 수 있다.

환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 신경퇴행성 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 또한 고려된다. 일부 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질병은 예를 들어 파킨슨병, 알쯔하이머병, 다발성 경화증(MS), 헌팅톤병 및 근위축성 측삭 경화증으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질병은 알쯔하이머병이다. 특정한 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질병은 MS, 예를 들어 1차 진행성, 재발 이장성 2차 진행성 또는 진행성 재발 MS이다. 일부 실시태양에서, 상기 환자는 예를 들어 영장류일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 환자는 인간일 수 있다.

환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 신경퇴행성 질병을 치료 또는 예방하는 방법의 특정한 실시태양에서, 상기 치료는 상기 환자의 뇌 또는 척수에서 뉴런의 탈수초를 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 염증성 탈수초를 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 상기 환자의 뇌 또는 척수에서 뉴런 축색의 횡절단을 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 상기 환자의 뇌 또는 척수에서 신경돌기의 횡절단을 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 상기 환자의 뇌 또는 척수에서 뉴런 세포사멸을 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 상기 환자의 뇌 또는 척수에서 뉴런 축색의 재수초화를 자극한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 MS 발병 후 상실된 기능을 복원시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 새로운 MS 발병을 예방한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료는 MS 발병으로부터 발생하는 불구를 예방한다.

본 명세의 하나의 일반적인 태양은 환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 RTA 408, 다형태 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 iNOS 유전자의 과잉발현을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 고려한다.

본 명세의 또 다른 일반적인 태양은 환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 RTA 408, 다형태 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자의 세포에서 IFN-γ-유도된 산화 질소 생산의 억제 방법을 고려한다.

본 명세의 더욱 또 다른 일반적인 태양은 환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 RTA 408, 다형태 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 COX-2 유전자의 과잉발현을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 고려한다.

환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자의 신장 질병(RKD)의 치료 방법이 또한 고려된다. 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 8,129,429 호를 참조하시오. 상기 RKD는 예를 들어 독성 손상으로부터 발생할 수도 있다. 상기 독성 손상은 비제한적으로, 예를 들어 영상화제 또는 약물로부터 발생할 수도 있다. 상기 약물은 예를 들어 화학요법제일 수 있다. 상기 RKD는 몇몇 실시태양에서 허혈/재관류 손상으로부터 발생할 수 있다. 몇몇 실시태양에서 상기 RKD는 당뇨병 또는 고혈압으로부터 발생한다. 일부 실시태양에서, 상기 RKD는 자가면역 질병으로부터 발생할 수 있다. 상기 RKD는 만성 RKD 또는 급성 RKD로서 추가로 한정될 수도 있다.

환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 화합물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 신장 질병(RKD)을 치료하는 몇몇 방법에서, 상기 환자는 투석을 경험했거나 경험 중에 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 환자는 신장 이식을 경험했거나 경험할 후보이다. 상기 환자는 영장류일 수 있다. 상기 영장류는 인간일 수 있다. 상기 또는 임의의 다른 방법에서 상기 환자는 예를 들어 소, 말, 개, 고양이, 돼지, 마우스, 랫트 또는 기니 피그일 수 있다.

환자에게 약학적으로 유효한 양의 본 명세의 RTA 408, 다형태 또는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 사구체 여과율 또는 크레아티닌 제거를 개선시키는 방법이 본 명세에 의해 또한 고려된다.

일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 하루에 단일 용량으로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 하루에 1 회 초과 용량으로 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

일부 실시태양에서, 상기 용량은 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 2000 ㎎/㎏이다. 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 3 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏이다. 다른 실시태양에서, 상기 용량은 약 3, 10, 30 또는 100 ㎎/㎏이다.

다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 국소로 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 국소 투여는 피부에 실행된다. 다른 실시태양에서, 상기 국소 투여는 눈에 실행된다.

다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 경구로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 안내로 투여한다.

본 명세의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상기 상세한 설명 및 특정한 실시예들은 본 발명의 특정한 실시태양들을 가리키지만, 본 발명의 진의 및 범위내에서의 다양한 변화 및 변형들이 상기 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이기 때문에, 이는 단지 예시로 제공될 뿐임을 알아야 한다. 단순히 특정한 화합물은 하나의 특정한 일반식에 기인하는 것이므로, 상기 화합물이 또 다른 일반식에 또한 속할 수 없음을 의미하는 것은 아님을 유의한다.

하기의 도면들은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 명세의 몇몇 태양들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. "Masseanderung" 및 "temperatur"(이들은 각각 "질량 변화" 및 "온도"를 의미한다)를 포함한 하나 이상의 독일어가 도면에서 발견될 수 있다. 본 발명은 본 발명에 나타낸 특정한 실시태양들의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나를 참고로 더 잘 이해될 수 있다.
도 1 - RAW264.7 세포에서 IFNγ-유도된 산화 질소 생산 및 세포 생육성에 대한 RTA 408의 효과.
도 2a & b - 산화방지성 반응 요소(ARE) 활성화에 대한 RTA 408의 효과: (a) NQO1-ARE 루시페라제 활성; (b) GSTA2-ARE 루시페라제 활성.
도 3a-f - (a) RTA 402; (b) 63415 (RTA 408); (c) 63170; (d) 63171; (e) 63179; 및 (f) 63189에 의한 세포 처리 후 상대적인 Nrf2 GST ARE 증가 배수 (fold increase). 그래프들은 또한 WST1 세포 증식 시약을 사용하고 1 시간 후 흡광도를 측정하여 분석된 바와 같은 세포의 생육성을 도시한다. 모든 약물은 DMSO 중에서 투여되었으며 세포는 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 0.8 ㎎/㎖ 제네티신이 보충된 DMEM 저 글루코스 중에서 384-웰 플레이트에서 10,000 세포/웰로 생육되었다.
도 4a-d - HFL1 폐 섬유아세포에서 Nrf2 표적 유전자 발현에 대한 RTA 408의 효과. (a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.
도 5a-d - BEAS-2B 기관지 상피 세포에서 Nrf2 표적 유전자 발현에 대한 RTA 408의 효과. (a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.
도 6a & b - Nrf2 표적 단백질 수준에 대한 RTA 408의 효과. (a) SH-SY5Y 세포; (b) BV2 세포.
도 7 - RAW264.7 세포에서 NQO1 효소 활성에 대한 RTA 408의 효과.
도 8 - AML-12 간세포 세포주에서 전체 글루타치온 수준에 대한 RTA 408의 효과.
도 9 - NADPH의 마커로서 WST-1 흡광도에 대한 RTA 408의 효과.
도 10a-d - NADPH 합성에 관여하는 유전자들의 발현에 대한 RTA 408의 효과. (a) H6PD; (b) PGD; (c) TKT; (d) ME1.
도 11a & b - (a) WST1 생육성 및 WST1/2 생육성이 더해진 마우스 NIH3T3 세포주에서 NF-κB 루시페라제 리포터의 TNF-α-유도된 활성화에 대한 RTA 408의 효과. (b) 마우스 NIH3T3 세포주에서 NF-κB 루시페라제 리포터의 TNF-α-유도된 활성화. 그래프는 RTA 408 농도에서 로그 변화의 함수로서 상대적인 변화 배수를 도시한다.
도 12 - NF-κB 루시페라제 리포터 구조물의 TNF-α-유도된 활성화에 대한 RTA 408의 효과.
도 13a & b - (a) WST1 생육성 및 WST1/2 생육성이 더해진 인간 A549 세포주에서 NF-κB 루시페라제 리포터의 TNF-α-유도된 활성화에 대한 RTA 408의 효과. (b) 인간 A549 세포주에서 NF-κB 루시페라제 리포터의 TNF-α-유도된 활성화. 그래프는 RTA 408 농도에서 로그 변화의 함수로서 상대적인 변화 배수를 도시한다.
도 14 - IκBα의 TNF-α-유도된 인산화에 대한 RTA 408의 효과.
도 15a-d - 트랜스아미나제 유전자 발현에 대한 RTA 408의 효과: (a) ALT1 (GPT1); (b) ALT2 (GPT2); (c) AST1 (GOT1); (d) AST1 (GOT2). 별표는 대조군으로부터의 통계학적 유의수준 차이를 가리킨다(*P<0.05; **P<0.01).
도 16 - 배양된 근육 세포에서 피루베이트 수준에 대한 RTA 408의 효과(*P<0.05).
도 17 - 폐 LPS-매개된 염증의 모델에서 63415의 효과(LPS 처리에 대한 염증전 사이토킨의 변화%). 암컷 BALB/c 마우스에서 화합물 63415를 0, 24 및 48 시간째에 QDx3 투여한 다음 63415의 최종 투여 후 1 시간째에 LPS를 투여하였다. 동물들을 LPS 투여 후 20 시간째에 죽였다. BALF를 염증전 사이토킨 발현에 대해 검사하였다. 화합물 63415는 용량-의존적인 방식으로 염증전 사이토킨을 감소시켰으며, 이때 TNF-α, IL-6 및 IL-12에서 50% 내지 80% 범위의 피크 감소가 있었다.
도 18a & b - 마우스에서 LPS-유발된 폐 염증에 대한 RTA 408의 효과. (a) 염증성 사이토킨; (b) Nrf2 표적. RTA 408을 암컷 BALB/c 마우스(n=10)에게 0, 24, 48, 72, 96 및 120 시간째에 QDx6 투여한 다음 LPS를 121 시간째에 투여하고, 동물을 141 시간째에 죽였다. 염증전 사이토킨 단백질 발현을 BALF에서 분석하였다. Nrf2 생물마커를 폐에서 분석하였다. 별표는 염수 대조군으로부터의 통계학적 유의수준 차이를 가리킨다(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).
도 19a & b - 블레오마이신-유발된 폐 염증에서 BALF 침윤물에 대한 63415의 효과: (a) BAL 유동 세포 카운트; (b) 체중. 화합물 63415를 C57BL/6 마우스에서 -10 내지 28일에 QDx39 투여하였다. 블레오마이신을 0일에 제공하였다. 매일 중량을 측정하였다. 죽였을 때의 BALF 세포 카운트를 획득하였다. 현저한 염증 침윤물의 감소가 관찰되었다. 만성 염증 점수, 간질성 섬유증, 또는 섬유성 병소의 수에서 현저한 변화는 관찰되지 않았다.
도 20a & b - 랫트에서 블레오마이신-유발된 폐 섬유증에 대한 RTA 408의 효과: (a) PMN; (b) 하이드록시프롤린. 별표는 블레오마이신 대조군으로부터의 통계학적 유의수준 차이를 가리킨다(*P<0.05).
도 21 - 블레오마이신-유발된 폐 섬유증이 있는 랫트로부터의 폐에서 Nrf2 표적 효소에 대한 RTA 408의 효과. 별표는 염수 대조군으로부터의 통계학적 유의수준 차이를 가리킨다(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).
도 22a-e - 마우스에서 담배 연기-유발된 COPD에 대한 RTA 408의 효과. (a) KC; (b) IL-6; (c) TNF-α; (d) IFN-γ; (e) RANTES. RTA 408(63415)을 3 ㎎/㎏(낮은), 10 ㎎/㎏(중간), 및 30 ㎎/㎏(높은)의 용량 수준으로 시험하였다. AIM 유사체(63355)를 비교를 위해 같은 연구에서 시험하였다. 별표는 CS 대조군으로부터의 통계학적 유의수준 차이를 가리킨다.
도 23 - 담배 연기-유발된 COPD가 있는 마우스로부터의 폐에서 Nrf2 표적 효소에 대한 RTA 408의 효과. 별표는 염수 대조군으로부터의 통계학적 유의수준 차이를 가리킨다(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). 칼표는 담배 연기 노출 및 비히클 투여된 마우스로부터의 통계학적 유의수준 타이를 나타낸다(†P<0.05).
도 24a-d - 패혈증의 BALB/c 마우스 모델에서 체중에 대한 63415(RTA 408)의 효과. LPS를 모든 동물들에게 0일에 투여하였다. (a) 체중: 63415(RTA 408); (b) 체중: RTA 405; (c) 전신 LPS: 생존%: 63415(RTA 408); (d) 전신 LPS: 생존%: RTA 405. RTA 405 및 63415(RTA 408)를 모두 -2 내지 2일에 QDx5 투여하였다. 화합물 63415(RTA 408)는 생존을 개선시켰다. 63415-처리된 BALB/c 마우스에서 시간의 함수로서 체중은 패혈증에 대한 모델로서 작용한다.
도 25 - 방사선-유발된 구강 점막염의 모델에서 63415의 효과. RTA 405 또는 63415(RTA 408)를 -5 내지 -1일 및 1 내지 15일에 수컷 시리안 골든 햄스터에게 BIDx20 투여하였다. 방사선은 0일에 제공하였다. 점막염 점수는 임상적 발현(0: 완전히 건강함; 1-2: 약간 내지 심한 홍반; 3-5: 다양한 정도의 궤양)을 기준으로 0 내지 5의 범위이다. 63415는 30 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏에서 궤양발생의 36%까지 감소시키면서 점막염을 개선시켰다.
도 26 - C58BL/6 마우스에서 14-일 마우스 독성 연구에서 Nrf2 표적 유전자 유도에 대한 63415의 효과. Nrf2 표적 유전자의 mRNA를 PO QDx14 처리된 마우스의 간에서 평가하였다. 다수의 Nrf2 표적 유전자에 대한 mRNA 발현에서 상당한 증가가 관찰되었으며 이는 조직 노출과 일치하였다.
도 27a & b - 랫트 간에서 Nrf2 표적 유전자 유도에 대한 63415의 효과: (a) 표적 유전자; (b) 음의 조절인자. Nrf2 표적 유전자의 mRNA를 PO QDx14 처리된 랫트의 간에서 평가하였다.
도 28a & b - 원숭이 조직에서 Nrf2 표적 유전자에 대한 63415의 효과: (a) 간; (b) 폐. Nrf2 표적 유전자의 mRNA를 파노믹스 콴티젠(Panomics QuantiGene)(등록상표) 2.0 플렉스(Plex) 기술을 사용하여 PO QDx14 처리된 원숭이에서 평가하였다.
도 29a & b - 마우스 간에서 Nrf2 표적 효소 활성에 대한 63415의 효과: (a) NQO1 활성; (b) GST 활성. Nrf2 표적 효소 활성을 PO QDx14 처리된 마우스의 간에서 평가하였다. NOQ1 및 GST 효소 활성은 용량-의존적인 방식으로 유도되었다.
도 30a & b - 랫트 간에서 Nrf2 표적 효소 활성에 대한 63415의 효과: (a) NQO1 활성; (b) GST 활성. Nrf2 표적 효소 활성을 PO QDx14 처리된 랫트의 간에서 평가하였다. NOQ1 및 GST 효소 활성은 용량-의존적인 방식으로 유도되었다.
도 31a & b - 키노몰구스 원숭이의 다양한 조직에서 Nrf2 표적 효소 활성 유도에 대한 63415의 효과: (a) NQO1 활성; (b) GSR 활성.
도 32a & b - 14일의 매일 경구 투여 후 마우스 간, 폐 및 뇌 중 RTA 408 농도, 및 마우스 간 중 NQO1 활성. (a) 14일의 매일 경구 투여 후 마우스에서 RTA 408의 조직 분포. 데이터는 연구의 최종 투여 후 4 시간째에 수거된 조직 중 RTA 408 농도의 평균±SD를 나타낸다. 오차 막대 위의 숫자들은 평균을 나타낸다. (b) NQO1 효소 활성과 마우스 간 RTA 408 함량과의 상관성. 개별적인 마우스 간 RTA 408 간 함량을 본 보고서로부터의 개별적인 효소 활성에 대해 플롯팅하였다.
도 33a & b - 14일의 매일 경구 투여 후 랫트 혈장, 간, 폐 및 뇌 중 RTA 408 농도, 및 랫트 간 중 NQO1 활성. (a) 14일의 매일 경구 투여 후 랫트에서 RTA 408의 조직 분포. 데이터는 연구의 최종 투여 후 4 시간째에 수거된 조직 중 RTA 408 농도의 평균±SD를 나타낸다. 오차 막대 위의 숫자들은 평균을 나타낸다. ^*2 개의 값을, 데이터 세트가 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 정규성 시험의 실패를 야기하는 값으로서 한정한 이상점인 것으로 인해, 평균 계산에서 제외시켰다. (b) NQO1 효소 활성과 랫트 간 RTA 408 함량과의 상관성. 개별적인 랫트 간 RTA 408 함량을 본 보고서로부터의 개별적인 효소 활성에 대해 플롯팅하였다. 상기 100 ㎎/㎏ RTA 408 용량 그룹으로부터의 조직을 6일에 수거하였으며, 상기 그룹에서 관찰된 독성은 간 NQO1 효소 활성 평가를 배제시켰다.
도 34a & b - 원숭이 PBMC에서 Nrf2 활성화에 대한 63415 처리의 효과: (a) PBMC NQO1 대 혈장 농도; (b) 폐 NQO1 대 PBMC NQO1.
도 35 - 63415 14-일 원숭이 독성 연구의 요약. 모든 용량은 불리한 임상 징후 없이 잘-허용되었다. 임상 화학 데이터는 명백한 독성이 없음을 암시하였다.
도 36 - 국소적인 눈 및 경구 투여 후 RTA 408의 혈장 농도에 대한 투여 시간의 효과. RTA 408의 혈장 농도를 또한 5일의 RTA 408의 매일 국소 눈 투여 후에 측정하였으며 이는 첫째날 후에 취한 측정치와 비교적 일관되게 유지된 것으로 측정되었다.
도 37a & b - PBMC에서 NQO1 및 SRXN1 mRNA 발현과 원숭이 혈장에서 RTA 408에의 노출과의 상관성: (a) NQO1; (b) SRXN1.
도 38 - 5일의 국소 눈 투여 후 시간의 함수로서 눈 내 다양한 조직 또는 체액 중 RTA 408의 농도. 혈장 중 RTA 408 농도를 또한 국소 눈 투여 후에 측정하였다.
도 39 - 상이한 농도의 국소적으로 투여된 RTA 408에 대한 급성 방사선 노출에 의해 유발된 3 등급 피부염의 발병률에 대한 RTA 408의 효과.
도 40 - 상이한 농도의 국소적으로 투여된 RTA 408에 대한 30일 처리 과정에 걸친 급성 방사선 노출에 의해 유발된 2 등급 피부염의 발병률에 대한 RTA 408의 효과.
도 41 - 상이한 농도의 경구 투여된 RTA 408에 대한 28일 치료 과정에 걸친 급성 방사선 노출에 의해 유발된 2 등급 피부염의 발병률에 대한 RTA 408의 효과.
도 42a & b - (a) 시험에 사용된 모든 동물들을 포함하는 상이한 대조군들 각각에 대한 시간의 함수로서 피부염의 임상 점수의 곡선 아래 면적 분석. (b) 시험에서 전체 30일을 완료한 동물들만을 포함하는 상이한 대조군들 각각에 대한 상기 점수의 지속 기간의 함수로서 피부염의 임상 점수의 곡선 아래 면적 분석.
도 43 - 처리되지 않은, 방사선 노출 없이 처리되지 않은, 비히클만, 및 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 3 개의 경구량의 RTA 408에 대한, 시간의 함수로서 급성 방사선 피부염의 평균 1차 맹검 점수. 상기 피부염 점수는, 0이 완전히 건강하고, 1-2가 최소 내지 약간의 박리와 함께 순함 내지 보통의 홍반을 나타내고, 3-4가 보통 내지 심한 홍반 및 박리를 나타내고, 5가 명백한 궤양을 나타내는 점수를 기준으로 하였다.
도 44 - 4일 내지 30일 동안 이틀마다 측정된, 처리되지 않은, 방사선 노출 없이 처리되지 않은, 비히클만, 및 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 3 개의 경구량의 RTA 408에 대한, 시간의 함수로서 급성 방사선 피부염의 평균 점수. 상기 피부염 점수는, 0이 완전히 건강하고, 1-2가 최소 내지 약간의 박리와 함께 순함 내지 보통의 홍반을 나타내고, 3-4가 보통 내지 심한 홍반 및 박리를 나타내고, 5가 명백한 궤양을 나타내는 점수를 기준으로 하였다.
도 45 - 4일 내지 30일 동안 이틀마다 측정된, 처리되지 않은, 방사선 노출 없이 처리되지 않은, 비히클만, 및 0.01%, 0.1% 및 1%의 3 개의 국소량의 RTA 408에 대한, 시간의 함수로서 급성 방사선 피부염의 평균 점수. 상기 피부염 점수는, 0이 완전히 건강하고, 1-2가 최소 내지 약간의 박리와 함께 순함 내지 보통의 홍반을 나타내고, 3-4가 보통 내지 심한 홍반 및 박리를 나타내고, 5가 명백한 궤양을 나타내는 점수를 기준으로 하였다.
도 46 - 각각의 시험 그룹에 대한 시간 및 피부염 점수 변화에 대해 플롯팅된 분할 방사선 피부염의 임상 점수. 상기 피부염 점수는, 0이 완전히 건강하고, 1-2가 최소 내지 약간의 박리와 함께 순함 내지 보통의 홍반을 나타내고, 3-4가 보통 내지 심한 홍반 및 박리를 나타내고, 5가 명백한 궤양을 나타내는 점수를 기준으로 하였다.
도 47 - 전체 관찰 기간에 걸쳐 시험 그룹들 각각에 대한 피부염 점수(중증도 x 일수)를 나타내는 AUC 분석의 그래프. 피부염 점수를 4일 내지 30일의 연구일 동안 이틀마다 평가하였다.
도 48a & b - (a) 화학요법제 및 RTA 408 대 RTA 408 단독으로 처리된 세포에 대한 상대적인 세포독성 효과를 나타내는, 처리된 전립선 암세포주 LNCaP에 대한 595 ㎚에서의 흡광도의 그래프. (b) 화학요법제 및 RTA 408 대 RTA 408 단독으로 처리된 세포에 대한 상대적인 세포독성 효과를 나타내는, 처리된 전립선 암세포주 DU-145에 대한 595 ㎚에서의 흡광도의 그래프.
도 49 - 3 마리의 마우스: 처리 없는 대조군 동물, 단지 이온화 방사선(단일 용량, 18 Gy)만이 가해진 동물, 및 이온화 방사선(단일 용량, 18 Gy, 0일)과 RTA 408(17.5 ㎎/㎏ i.p., -3 내지 -1일에 매일 1 회, 이어서 1, 3 및 5일에 단일 용량)이 모두 제공된 동물에 대한 종양의 루시페라제 활성을 나타내는 영상화된 마우스의 컬러 사진의 흑백 버전. 화살표가 가리키는 색상은 최고 강도에서부터 최저 강도 순으로 적색, 황색, 녹색 및 청색으로 나타내는 강도를 가리킨다.
도 50 - 복부천자 (paracentesis)의 유발 후 맥시덱스(MaxiDex)(등록상표)(0.1% 덱사메타손) 및 마프라코라트(밝은색 막대)에 대한 문헌 값들과 비교된, RTA 408(어두운색 막대)의 상이한 제형들에 대한 수성 체액 단백질 농도의 감소.
도 51 - 63415에 의한 생체내 NO의 용량-의존적인 억제. CD-1 마우스(n=6)에게 DMSO 또는 AIM을 경구 위관영양에 의해 투여하였다. LPS(5 ㎎/㎏)를 24 시간 후에 투여하였다. LPS 투여 후 24 시간째에, 전혈을 NO 분석을 위해 채혈하였다. NO 억제를, 환원된, 단백질 제거된 혈장으로부터의 그리스(Griess) 반응에 의해 측정하였다.
도 52 - 마우스 조직내로의 63415(RTA 408)의 광범위한 분포. 마우스에게 63415(RTA 408) 25 ㎎/㎏ 또는 RTA 405 25 ㎎/㎏을 PO QDx3 투여하였다. 혈액(혈장 및 전혈) 및 조직(뇌, 간, 폐 및 신장)을 최종 투여 후 6 시간째에 수거하였다. 약물 함량의 반-정량적인 분석을 수행하였다. CNS에서 현저한 수준이 관찰되었다.
도 53 - 63415에 의한 마우스 간, 폐 및 신장에서 NQO1 활성 유도. 마우스에게 25 ㎎/㎏을 PO QDx3 투여하였다. 조직을 최종 투여 후 6 시간째에 수거하고, NQO1 활성의 분석을 수행하였다. NQO1의 의미있는 활성화가 다수의 조직들에서 관찰되었다.
도 54 - 63415 14-일 마우스 독성 연구의 요약. C57BL/6 마우스에게 PO QDx14 투여하였다. 종점은 생존, 중량, 및 임상 화학을 포함하였다. 모든 동물들이 14일까지 생존하였다. 비히클 그룹에 비해 현저한 중량 변화는 발생하지 않았으며, 임상 화학을 근거로 어떠한 용량에서도 독성 증거는 존재하지 않았다.
도 55 - C57BL/6 마우스에서 14-일 마우스 독성 연구로부터의 63415의 조직 분포. 뇌, 폐 및 간 샘플을 최종 투여 후 4 시간째에 수거하고 민감한 LC/MS/MS 방법을 사용하여 63415 함량에 대해 정량분석하였다. 폐에서 10 및 100 ㎎/㎏의 노출은 NO 유도에 대한 시험관내 IC₅₀을 각각 55- 및 1138-배까지 초과하였다. 뇌에서 10 및 100 ㎎/㎏의 노출은 NO 유도에 대한 시험관내 IC₅₀을 각각 29- 및 541-배까지 초과하였다.
도 56 - 스프래그 다우리 랫트에서 63415의 조직 분포. 조직들을 14일 또는 6일에 최종 투여(100 ㎎/㎏) 후 4 시간째에 수거하고, 추출하고, 민감한 LC/MS/MS 방법을 사용하여 63415 함량에 대해 정량분석하였다. 화합물 63415는 표적 조직내에 잘 분포한다. 폐 및 뇌에서 10 ㎎/㎏의 노출은 NO 유도에 대한 시험관내 IC₅₀을 각각 294- 및 240-배까지 초과한다.
도 57 - 키노몰구스 원숭이에서 화합물 63415의 표적 조직 분포. 조직을 14일에 최종 투여 후 4 시간째에 수거하였다. 화합물 63415 함량을 추출하고 민감한 LC/MS/MS 방법을 사용하여 정량분석하였다.
도 58 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 FT-라만 스펙트럼(3400-50 ㎝^-1).
도 59 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 PXRD(1.5-55.5 °2θ) 패턴.
도 60 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 TG-FTIR 써모그램(25-350 ℃).
도 61 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 DMSO-d₆ 중의 ¹H-NMR 스펙트럼.
도 62 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 DSC 써모그램.
도 63 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 DVS 등온선.
도 64 - DVS 측정후, 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 FT-라만 스펙트럼(맨위)은 상기 DVS 측정 전 물질(맨아래)에 비해 변하지 않는다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 65 - DVS 측정후, 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P1의 PXRD 패턴(맨위)은 상기 DVS 측정 전 물질(맨아래)에 비해 변하지 않는다. 상기 패턴을 비율화 (scaled)하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 66 - 샘플 PP415-P40의 PXRD 패턴(맨위)은 용매화물 형태(부류 2)의 패턴(맨아래, 샘플 PP415-P19)에 상응한다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 67 - 1 주일 후, 비결정 형태(부류 1)에 상응하는 안정성 샘플 PP415-P2a(맨위), PP415 P3a(맨위로부터 두 번째), PP415-P4a(중간), 및 PP415-P5a(맨아래로부터 두 번째)의 PXRD 패턴은 시점 t₀에서 출발 물질(맨아래, 샘플 PP415-P1)에 비해 차이를 나타내지 않는다. 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 68 - 2 주일 후, 비결정 형태(부류 1)에 상응하는 안정성 샘플 PP415-P2b(맨위), PP415 P3b(맨위로부터 두 번째), PP415-P4b(중간), 및 PP415-P5b(맨아래로부터 두 번째)의 PXRD 패턴은 시점 t₀에서 출발 물질(맨아래, 샘플 PP415-P1)에 비해 차이를 나타내지 않는다. 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 69 - 4 주일 후, 비결정 형태(부류 1)에 상응하는 안정성 샘플 PP415-P2c(맨위), PP415 P3c(맨위로부터 두 번째), PP415-P4c(중간), 및 PP415-P5c(맨아래로부터 두 번째)의 PXRD 패턴은 시점 t₀에서 출발 물질(맨아래, 샘플 PP415-P1)에 비해 차이를 나타내지 않는다. 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 70 - 용매화물 형태(부류 2)의 샘플들의 FT-라만 스펙트럼(2400-50 ㎝^-1)(PP415-P7: 맨위; PP415-P8: 맨위로부터 두 번째; PP415-P9: 맨위로부터 세 번째; PP415 P10: 맨위로부터 네 번째; PP415 P11: 중간; PP415-P15: 맨아래로부터 네 번째; PP415-P17: 맨아래로부터 세 번째; PP415-P21: 맨아래로부터 두 번째; PP415-P24: 맨아래). 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 71 - 용매화물 형태(부류 2)의 FT-라만 스펙트럼(1750-1000 ㎝^-1)(PP415-P7: 맨위)은 비결정성 형태(부류 1)의 스펙트럼(PP415-P1: 맨아래)과 명백히 상이하다. 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 72 - 부류 2(샘플 PP415-P19: 맨위), 부류 3(샘플 PP415-P6: 맨위로부터 두 번째), 부류 4(샘플 PP415-P13: 맨아래로부터 두 번째), 및 부류 5(샘플 PP415-P14: 맨아래)의 FT-라만 스펙트럼(1750-1000 ㎝^-1)은 서로 현저하게 상이하다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 73 - 용매화물 형태(부류 2)의 샘플들의 PXRD 패턴(2-32 °2θ)(PP415-P7: 맨위; PP415-P8: 맨위로부터 두 번째; PP415-P10: 맨위로부터 세 번째; PP415 P15: 맨위로부터 네 번째; PP415-P17: 중간; PP415-P18: 맨아래로부터 네 번째; PP415-P19: 맨아래로부터 세 번째; PP415-P21: 맨아래로부터 두 번째; PP415-P24: 맨아래). 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 74 - 용매화물 형태(부류 2)의 샘플들의 PXRD 패턴(11-21 °2θ)(PP415-P7: 맨위; PP415-P8: 맨위로부터 두 번째; PP415-P10: 중간; PP415-P21: 맨아래로부터 두 번째; PP415-P24: 맨아래). 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 75 - 부류 2(PP415-P19: 맨위), 부류 3(샘플 PP415-P6: 맨위로부터 두 번째), 부류 4(샘플 PP415-P13: 맨아래로부터 두 번째), 및 부류 5(샘플 PP415-P14: 맨아래)의 PXRD 패턴(2-32 °2θ)은 명백하게 상이하다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 76 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P7의 TG-FTIR 써모그램.
도 77 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P21의 TG-FTIR 써모그램.
도 78 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P24의 TG-FTIR 써모그램.
도 79 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P29의 TG-FTIR 써모그램.
도 80 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P47의 TG-FTIR 써모그램.
도 81 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P48의 TG-FTIR 써모그램.
도 82 - 용매화물 형태(부류 2)(맨아래, 샘플 PP415-P7) 및 건조된 용매화물 형태(부류 2)(맨위, 샘플 PP415-P30)의 FT-라만 스펙트럼(1800-700 ㎝^-1)은 유사하며, 그래프 내에서 거의 구분될 수 없는 단지 작은 차이만을 나타낸다. 상기 스펙트럼을 비교를 맨위해서 비율화한다.
도 83 - 용매화물 형태(부류 2), 샘플 PP415-P7(맨아래)의 패턴과 비교된, 건조된 용매화물 형태(부류 2), 샘플 PP415-P30(맨위)의 PXRD 패턴. 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 84 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 건조된 샘플 PP415-P30의 TG-FTIR 써모그램.
도 85 - 건조된 샘플 PP415-P18(밝은 회색)의 FT-라만 스펙트럼은 원래 샘플 PP415-P15(어두운 회색)의 스펙트럼과 동일하고 유사하며 그래프 내에서 거의 구분될 수 없는 단지 작은 차이만을 나타낸다. 상기 스펙트럼을 비교를 위해서 비율화하였다.
도 86 - 건조된 샘플 PP415-P18의 PXRD 패턴(맨위)은 원래 샘플 PP415-P15의 패턴(맨아래)과 작은 차이를 나타내지만, 둘 다 용매화물 형태(부류 2)이다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 87 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P18의 TG-FTIR 써모그램.
도 88 - 샘플 PP415-P17의 FT-라만 스펙트럼(맨위)은 건조된 샘플 PP415-P19(중간) 및 PP415-P32(맨아래)의 스펙트럼들과 거의 동일하며 그래프 내에서 거의 구분될 수 없는 단지 작은 차이만을 나타낸다. 상기 스펙트럼을 비교를 위해서 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 89 - 건조된 샘플 PP415-P19의 PXRD 패턴(중간)은 원래 샘플 PP415-P17의 패턴(맨위)과 상이하지만 여전히 부류 2 형태에 상응한다. 추가의 건조된 샘플 PP415-P32의 패턴(맨아래)은 보다 낮은 S/N 비를 갖는 보다 넓은 피크를 나타낸다. 상기 물질은 덜 결정성이나, 여전히 부류 2 형태에 상응한다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 90 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P19의 TG-FTIR 써모그램.
도 91 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 샘플 PP415-P32A의 TG-FTIR 써모그램.
도 92 - 샘플 PP415-P21의 FT-라만 스펙트럼(맨위)은 건조된 샘플 PP415-P28(중간) 및 PP415-P34(맨아래)의 스펙트럼들과 동일하다. 상기 스펙트럼을 비교를 위해서 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 93 - 건조된 샘플 PP415-P28(중간) 및 PP415-P34(맨아래)의 PXRD 패턴은 보다 낮은 S/N 비를 갖는 보다 넓은 피크들을 보이며, 이는 원래 샘플 PP415-P21의 패턴(맨위)에 비해 상기 샘플들의 보다 낮은 결정성을 가리킨다. 상기 패턴들은 다소 상이하지만 여전히 부류 2 형태에 상응한다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 94 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 건조된 샘플 PP415-P28의 TG-FTIR 써모그램.
도 95 - 용매화물 형태(부류 2)에 상응하는, 건조된 샘플 PP415-P34의 TG-FTIR 써모그램.
도 96 - 용매화물 형태(부류 3)의 샘플들(PP415 P6: 맨위; PP415-P12: 중간; PP415-P20: 맨아래)의 FT-라만 스펙트럼(2400-50 ㎝^-1). 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 97 - 용매화물 형태(부류 3)의 샘플들(PP415 P6: 맨위; PP415-P12: 맨위로부터 두 번째; PP415-P20: 맨아래로부터 두 번째)의 FT-라만 스펙트럼(1750-1000 ㎝^-1)은, 예를 들어 ∼1690 ㎝^-1에서 단지 약간의 차이로 서로 매우 유사하지만, 부류 1(PP415-P1: 맨아래)과는 명백히 상이하다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 98 - 용매화물 형태(부류 3)의 샘플들(PP415 P6: 맨위; PP415-P12: 중간; PP415-P20: 맨아래)의 PXRD 패턴(2-32 °2θ). 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 99 - 용매화물 형태(부류 3)의 샘플들(PP415 P6: 맨위; PP415-P12: 중간; PP415-P20: 맨아래)의 PXRD 패턴(13.5-18.5 °2θ)은 작은 차이를 나타낸다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 100 - 용매화물 형태(부류 3)에 상응하는, 샘플 PP415-P6의 TG-FTIR 써모그램.
도 101 - 용매화물 형태(부류 3)에 상응하는, 샘플 PP415-P12의 TG-FTIR 써모그램.
도 102 - 건조된 용매화물 형태(부류 3), 샘플 PP415-P25의 TG-FTIR 써모그램.
도 103 - 추가로 건조된 용매화물 형태(부류 3), 샘플 PP415-P33의 TG-FTIR 써모그램.
도 104 - 용매화물 형태(부류 3)(맨위, 샘플 PP415-P6), 건조된 용매화물 형태(부류 3)(중간, 샘플 PP415-P25), 및 추가로 건조된 용매화물 형태(부류 3)(맨아래, 샘플 PP415-P33)의 FT-라만 스펙트럼(1800-700 ㎝^-1)은 동일하다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 105 - 용매화물 형태(부류 3)(맨위, 샘플 PP415-P6), 건조된 용매화물 형태(부류 3)(중간, 샘플 PP415-P25), 및 추가로 건조된 용매화물 형태(부류 3)(맨아래, 샘플 PP415-P33)의 PXRD 패턴(4-24 °2θ). 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 106 - 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)에 상응하는, 샘플 PP415-P13의 TG-FTIR 써모그램.
도 107 - 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)(어두운 회색, 샘플 PP415-P13) 및 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)의 건조된 물질(밝은 회색, 샘플 PP415-P26)의 FT-라만 스펙트럼(1800-700 ㎝^-1)은 동일하며 완벽하게 겹친다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하였다.
도 108 - 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P13의 기준(reference) 패턴(맨위)과 비교된, 건조된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P26의 PXRD 패턴(맨아래). 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 109 - 건조된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P26의 TG-FTIR 써모그램.
도 110 - 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)(맨위, 샘플 PP415-P35), 및 건조된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)(중간, 샘플 PP415-P36 및 맨아래, 샘플 PP415-P37)의 FT-라만 스펙트럼(1800-700 ㎝^-1)은 서로 상응한다. 상기 스펙트럼을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 111 - 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)(맨위, 샘플 PP415-P35), 및 건조된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)(중간, 샘플 PP415-P36 및 맨아래, 샘플 PP415-P37)의 PXRD 패턴(4-24 °2θ)은 서로 일치한다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 112 - 건조된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P36의 TG-FTIR 써모그램.
도 113 - 건조된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P37의 TG-FTIR 써모그램.
도 114 - 탈용매화된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P37의 DVS 등온선.
도 115 - DVS 측정후, 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P37의 PXRD 패턴(맨아래)은 상기 DVS 측정 전 물질(맨위)에 비해 변하지 않는다. 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 116 - 탈용매화된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4)(샘플 PP415-P37)의 DSC 써모그램.
도 117 - 비결정성 형태(부류 1), 샘플 PP415-P1과 탈용매화된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P36과의 ∼1:1 혼합물의 DSC 써모그램.
도 118 - 비결정성 형태(부류 1), 샘플 PP415-P1과 탈용매화된 아세토나이트릴 용매화물 형태(부류 4), 샘플 PP415-P36(실험 번호: PP415-P39)과의 ∼1:1 혼합물의 DSC 써모그램. 가열 단계(단계 1)를 173 ℃에서 30 분간 정지시키고(단계 2) 이어서 재개하였다(단계 3).
도 119 - THF 용매화물 형태(부류 5)에 상응하는, 샘플 PP415-P14의 TG-FTIR 써모그램.
도 120 - THF 용매화물 형태(부류 5)(파선, 샘플 PP415-P14), THF 용매화물 형태(부류 5)의 건조된 물질(점선, 샘플 PP415-P27), 및 비결정성 형태(부류 1)(실선, 샘플 PP415-P1)의 FT-라만 스펙트럼(1800-1100 ㎝^-1). 상기 스펙트럼을 비교를 위해서 비율화하였으며, 상기 스펙트럼은 작은 크기 변화를 보이나 스펙트럼 모양의 상응하는 변화는 거의 보이지 않는다.
도 121 - THF 용매화물 형태(부류 5), 샘플 PP415-P14(맨아래)의 패턴과 비교된, 건조된 THF 용매화물 형태(부류 5), 샘플 PP415-P27(맨위)의 PXRD 패턴. 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 122 - 건조된 THF 용매화물(부류 5)에 상응하는, 샘플 PP415-P27의 TG-FTIR 써모그램.
도 123 - 샘플 PP415-P41의 PXRD 패턴(맨위)은 THF 용매화물 형태(부류 5)의 패턴(중간, 샘플 PP415-P14)에 상응하나 헵탄 용매화물 형태(부류 2)의 패턴(맨아래, 샘플 PP415-P19)에는 상응하지 않는다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 124 - 샘플 PP415-P45의 PXRD 패턴(맨위)은 THF 용매화물 형태(부류 5)의 패턴(중간, 샘플 PP415-P14)에 상응하나 헵탄 용매화물 형태(부류 2)의 패턴(맨아래, 샘플 PP415-P19)에는 상응하지 않는다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 125 - 샘플 PP415-P41의 PXRD 패턴(맨위)은 THF 용매화물 형태(부류 5)에 상응한다. 샘플 PP415-P41을 1일 동안 건조시킨 후에(맨위로부터 두 번째, 샘플: PP415-P44), 상기 물질은 주로 비결정성이다. 낮은 강도를 갖는 일부 넓은 피크들이 남아있는다. 밤새 추가로 건조시킨 후에(맨아래로부터 두 번째, 샘플 PP415-P44a), 이들 넓은 피크의 강도는 추가로 감소된다. 비결정성 형태(부류 1)를 기준으로서 나타낸다(맨아래, 샘플: PP415-P42). 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 126 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P44a의 TG-FTIR 써모그램.
도 127 - 샘플 PP415-P45의 PXRD 패턴(맨위)은 THF 용매화물 형태(부류 5)에 상응한다. 샘플 PP415-P45를 1일 동안 건조시킨 후에(맨위로부터 두 번째, 샘플: PP415-P46), 상기 물질은 주로 비결정성이다. 낮은 강도를 갖는 일부 넓은 피크들이 남아있는다. 총 4일을 건조시킨 후에(맨아래로부터 두 번째, 샘플 PP415-P46a), 상기 패턴은 변하지 않고 남아있는다. 비결정성 형태(부류 1)를 기준으로서 나타낸다(맨아래, 샘플: PP415-P42). 상기 패턴을 비율화하지 않았으나 비교를 목적으로 y-방향으로 오프셋하였다.
도 128 - 비결정성 형태(부류 1)에 상응하는, 샘플 PP415-P46a의 TG-FTIR 써모그램.
도 129 - 샘플 PP415-P42의 PXRD 패턴(맨위)은 비결정성 형태(부류 1)의 패턴(맨아래, 샘플 PP415-P1)에 상응한다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 130 - 샘플 PP415-P43의 PXRD 패턴(맨위)은 등구조(isostructural) 용매화물 형태(부류 2)의 패턴(맨아래, 샘플 PP415-P19)에 상응하나 THF 용매화물 형태(부류 5)의 패턴(중간, 샘플 PP415-P14)에는 상응하지 않는다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 131 - 샘플 PP415-P47(맨위) 및 PP415-P48(중간)의 PXRD 패턴은 등구조 용매화물 형태(부류 2)(맨아래, 샘플 PP415-P19)의 패턴에 본질적으로 상응하지만, 약간의 차이가 존재한다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.
도 132 - 샘플 PP415-P49의 PXRD 패턴(맨위)은 비결정성 형태(부류 1)의 패턴(맨아래, 샘플 PP415-P1)에 상응한다. 상기 패턴을 비교를 목적으로 비율화하고 y-방향으로 오프셋하였다.

본 발명은 화합물: N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-시아노-2,2,6a,6b,9,9,12a-헵타메틸-10,14-다이옥소-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-옥타데카하이드로피센-4a-일)-2,2-다이플루오로프로판아미드(또한 본 발명에서 RTA 408, 63415, 또는 PP415라 지칭된다)을 제공한다. 다른 비제한적인 태양에서, 본 발명은 또한 그의 용매화물을 포함한 다형태를 제공한다. 다른 비제한적인 태양에서, 본 발명은 또한 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다. 다른 비제한적인 태양에서, 상기 화합물 및 그의 다형태의 제조 방법, 약학 조성물, 및 키트 및 제조품을 또한 제공한다.

I. 정의

화학적 그룹과 관련하여 사용될 때: "수소"는 -H를 의미하고; "하이드록시"는 -OH를 의미하고; "옥소"는 =O를 의미하고; "카보닐"은 -C(=O)-를 의미하고; "카복시"는 -C(=O)OH(또한 -COOH 또는 -CO₂H라고도 쓴다)를 의미하고; "할로"는 독립적으로 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 의미하고; "아미노"는 -NH₂를 의미하고; "하이드록시아미노"는 -NHOH를 의미하고; "나이트로"는 -NO₂를 의미하고; 이미노는 =NH를 의미하고; "시아노"는 -CN을 의미하고; "아이소시아네이트"는 -N=C=O를 의미하고; "아지도"는 -N₃를 의미하고; 1가 상황에서 "포스페이트"는 -OP(O)(OH)₂ 또는 그의 탈양자화된 형태를 의미하고; 2가 상황에서 "포스페이트"는 -OP(O)(OH)O- 또는 그의 탈양자화된 형태를 의미하고; "머캅토"는 -SH를 의미하고; "티오"는 =S를 의미하고; "설포닐"은 -S(O)₂-를 의미하고; "설피닐"은 -S(O)-를 의미한다. 본 출원에 도시된 구조의 원자상의 임의의 한정되지 않은 원자가는 암묵적으로 상기 원자에 결합된 수소 원자를 나타낸다.

본 명세와 관련하여, 화학식:

및

은 동일한 구조를 나타낸다. 탄소상에 점이 그려지면, 상기 점은 상기 탄소에 결합된 수소 원자가 해당 지면 밖으로 나옴을 가리킨다.

"하나의"라는 단어의 사용은 특허청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 관련하여 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있으나, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와 일치한다.

본 출원 전체를 통해서, "약"이란 용어는 하나의 값이 고안물의 고유한 오차 변동, 상기 값의 측정에 사용되는 방법, 또는 연구 대상 중에 존재하는 변동을 포함함을 가리키는데 사용된다. X-선 분말 회절과 관련하여 사용될 때, "약"이란 용어는 보고된 값으로부터 ±0.2 °2θ의 값, 바람직하게는 보고된 값으로부터 ±0.1 °2θ의 값을 가리키는데 사용된다. 시차 주사 열량측정 또는 유리 전이 온도와 관련하여 사용될 때, "약"이란 용어는 피크의 최대에 대해 ±10 ℃의 값, 바람직하게는 피크의 최대에 대해 ±2 ℃의 값을 가리키는데 사용된다. 다른 상황들에서 사용될 때, "약"이란 용어는 보고된 값의 ±10%의 값, 바람직하게는 보고된 값의 ±5%의 값을 가리키는데 사용된다. "약"이란 용어가 사용될 때마다, 지시되는 정확한 수치에 대한 특별한 언급이 또한 포함됨을 알아야 한다.

"포함하다", "갖다" 및 "함유하다"란 용어들은 오픈-엔드 결합 동사이다. 상기 동사들의 하나 이상의 임의의 형태 또는 시제, 예를 들어 "포함하다", "포함하는", "갖다", "갖는", "함유하다" 및 "함유하는"도 또한 오픈-엔드이다. 예를 들어, 하나 이상의 단계를 "포함하는", "갖는" 또는 "함유하는" 임의의 방법은 단지 상기 하나 이상의 단계들만을 갖는 것으로 제한되지 않으며 또한 다른 나열되지 않은 단계들도 포함한다.

"유효한"이란 용어는 명세서 및/또는 특허청구범위에 사용될 때 목적하는, 예상되는, 또는 의도하는 결과를 성취하기에 적합함을 의미한다. "유효량", "치료 유효량" 또는 "약학적으로 유효한 양"은 화합물로 환자 또는 피실험자를 치료함과 관련하여 사용될 때, 질병을 치료하기 위해 환자 또는 피실험자에게 투여시 상기 질병에 대해 상기와 같은 치료를 수행하기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.

"할로 피크"란 용어는 X-선 분말 회절과 관련하여 전형적으로 비결정성 고체 또는 시스템의 특징인, X-선 분말 회절그림에서 종종 >10 °2θ에 걸쳐있는 넓은 피크를 의미할 것이다.

"수화물"이란 용어는 화합물에 대한 변경인자로서 사용될 때, 예를 들어 상기 화합물의 고체 형태에서, 상기 화합물이 각각의 화합물 분자와 회합된 하나 미만(예를 들어 반수화물), 하나(예를 들어 일수화물), 또는 하나 초과(예를 들어 이수화물)의 물 분자를 가짐을 의미한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "IC₅₀"이란 용어는 획득되는 최대 반응의 50%인 억제 용량을 지칭한다. 이러한 정량적인 크기는 특정 약물 또는 다른 물질(억제제)이 주어진 생물학적, 생화학적, 또는 화학적 과정(또는 과정의 성분, 즉 효소, 세포, 세포 수용체 또는 미생물)을 절반까지 억제하는데 얼마나 많이 필요한가를 가리킨다.

제 1 화합물의 "이성질체"는 각각의 분자가 상기 제 1 화합물과 동일한 구성성분 원자를 함유하지만 이들 원자의 3차원 형태는 상이한 별개의 화합물이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "환자" 또는 "피실험자"란 용어는 살아있는 포유동물 유기체, 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 기니 피그 또는 이들의 트랜스제닉 종들을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 환자 또는 피실험자는 비인간 동물이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 환자 또는 피실험자는 영장류이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 환자 또는 피실험자는 인간이다. 인간 환자의 비제한적인 예는 성인, 아동, 유아 및 태아이다.

본 발명에 일반적으로 사용되는 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 합당한 이익/위험비와 상응하는 다른 문제 또는 합병증 없이 접촉시켜 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 지칭한다.

"약학적으로 허용 가능한 염"은 상기 정의된 바와 같이 약학적으로 허용 가능하고 목적하는 약물 활성을 갖는 본 발명의 화합물의 염을 의미한다. 상기와 같은 염은 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등; 또는 유기산, 예를 들어 1,2-에탄다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 3-페닐프로피온산, 4,4'-메틸렌비스(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 4-메틸바이사이클로[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포르설폰산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클로펜탄프로피온산, 에탄설폰산, 퓨마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 헵탄산, 헥산산, 하이드록시나프토산, 락트산, 라우릴황산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤콘산, o-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠설폰산, 페닐-치환된 알칸산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 타타르산, 3급부틸아세트산, 트라이메틸아세트산 등과 형성되는 산 부가염을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있을 때 형성될 수 있는 염기 부가염을 포함한다. 허용 가능한 무기 염기는 수산화 나트륨, 탄산 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 알루미늄 및 수산화 칼슘을 포함한다. 허용 가능한 유기 염기는 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 본 발명의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정한 음이온 또는 양이온은, 상기 염이 전체로서 약물학적으로 허용 가능한 한은, 중요하지 않음을 알아야 한다. 약학적으로 허용 가능한 염 및 그의 제조 방법 및 용도에 대한 추가의 예들이 문헌[Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)]에 제공되어 있다.

"예방" 또는 "예방하는"은 (1) 질병의 위험이 있고/있거나 상기 질병에 대한 소인이 있을 수 있지만, 아직 상기 질병의 병리학 또는 증후학 중 어느 하나 또는 전부를 경험하거나 나타내지 않은 환자 또는 피실험자에서 상기 질병의 개시를 억제함, 및/또는 (2) 질병의 위험이 있고/있거나 상기 질병에 대한 소인이 있을 수 있지만, 아직 상기 질병의 병리학 또는 증후학 중 어느 하나 또는 전부를 경험하거나 나타내지 않은 환자 또는 피실험자에서 상기 질병의 병리학 또는 증후학의 개시를 늦춤을 포함한다.

"전구약물"은 생체내에서 대사에 의해 본 발명에 따른 억제제로 전환될 수 있는 화합물을 의미한다. 상기 전구약물 자체는 주어진 표적 단백질에 대한 활성을 가질 수도 또는 갖지 않을 수도 있다. 예를 들어, 하이드록시기를 포함하는 화합물을 생체내에서 가수분해에 의해 하이드록시 화합물로 전환되는 에스터로서 투여할 수도 있다. 생체내에서 하이드록시 화합물로 전환될 수 있는 적합한 에스터는 아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 포스페이트, 타르트레이트, 말로네이트, 옥살레이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 퓨마레이트, 말리에이트, 메틸렌-비스-β-하이드록시나프토에이트, 젠티세이트, 이세티오네이트, 다이-p-톨루오일타르트레이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 사이클로헥실설파메이트, 퀴네이트, 아미노산의 에스터 등을 포함한다. 유사하게, 아민기를 포함하는 화합물을 생체내에서 가수분해에 의해 아민 화합물로 전환되는 아미드로서 투여할 수도 있다.

"입체이성질체" 또는 "광학 이성질체"는 동일한 원자가 동일한 다른 원자들에 결합되지만, 상기 원자들의 3차원 형태가 상이한 주어진 화합물의 이성질체이다. "거울상이성질체"는 왼손과 오른손처럼, 서로 거울상인 주어진 화합물의 입체이성질체이다. "부분입체이성질체"는 거울상이성질체가 아닌 주어진 화합물의 입체이성질체이다. 키랄 분자는, 임의의 2 개의 기의 교환이 입체이성질체를 도출하도록 분자 함유기 중의 임의의 지점(반드시 원자는 아니지만)인 키랄 중심(또한 입체 중심 또는 입체발생 중심으로도 지칭된다)을 함유한다. 유기 화합물에서, 상기 키랄 중심은 전형적으로는 탄소, 인 또는 황 원자이지만, 유기 및 무기 화합물에서 다른 원자들도 또한 입체중심이 될 수 있다. 분자는 다수의 입체중심을 가질 수 있으며, 이는 다수의 입체이성질체를 제공한다. 입체이성체화가 4면체 입체중심(예를 들어 사면체 탄소)에 기인한 화합물에서, 가정에 의해 가능한 입체이성질체의 총 수는 2n을 초과하지 않을 것이며, 이때 n은 사면체 입체중심 (stereocenter)의 수이다. 대칭을 갖는 분자들은 흔히 최대로 가능한 수보다 적은 입체이성질체를 갖는다. 거울상이성질체의 50:50 혼합물을 라세미 혼합물이라 칭한다. 한편으로, 입체이성질체들의 혼합물은 하나의 거울상이성질체가 50%를 초과하는 양으로 존재하도록 거울상이성질체적으로 풍부할 수 있다. 전형적으로, 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체를 당해 분야에 공지된 기법을 사용하여 분할(resolve) 또는 분리시킬 수 있다. 입체 화학이 한정되지 않은 것에 대한 임의의 입체중심 또는 키랄성의 축에 대해서, 상기 입체중심 또는 키랄성의 축이 그의 R 형태, S 형태, 또는 라세미 및 비-라세미 혼합물을 포함하여 R 형태와 S 형태의 혼합물로서 존재할 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "다른 입체이성질체가 실질적으로 없는"이란 어구는 조성물이 ≤15%, 보다 바람직하게는 ≤10%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤5%, 또는 가장 바람직하게는 ≤1%의 또 다른 입체이성질체(들)를 함유함을 의미한다.

"치료" 또는 "치료하는"은 (1) 질병의 병리 또는 증후를 겪고 있거나 나타내는 환자 또는 피실험자에서 상기 질병을 억제함(예를 들어 상기 병리 및/또는 증후의 추가적인 발생을 저지함), (2) 질병의 병리 또는 증후를 겪고 있거나 나타내는 환자 또는 피실험자에서 상기 질병을 개선시킴(예를 들어 상기 병리 및/또는 증후를 역전시킴), 및/또는 (3) 질병의 병리 또는 증후를 겪고 있거나 나타내는 환자 또는 피실험자에서 상기 질병의 임의의 측정 가능한 감소를 수행함을 포함한다.

상기 정의들은 본 발명에 참고로 인용된 참고문헌 중 임의의 문헌에서 임의의 대립되는 정의들에 대신한다. 그러나, 몇몇 용어들을 한정한다는 사실을, 한정되지 않은 임의의 용어가 불명확함을 나타내는 것으로서 간주해서는 안 된다. 오히려, 사용되는 모든 용어들은 통상적인 숙련가가 범위를 이해하여 본 발명을 실시할 수 있도록 하는 용어들로 본 발명을 개시하는 것으로 여겨진다.

II . RTA 408 및 합성 방법

RTA 408을 하기 실시예 섹션에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 이들 방법을 당해 분야의 숙련가에 의해 적용되는 바와 같은 유기화학의 원리 및 기법을 사용하여 추가로 변형시키고 최적화할 수 있다. 상기와 같은 원리 및 기법들은 예를 들어 문헌[March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007)](본 발명에 참고로 인용된다)에 교시되어 있다.

본 발명의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정한 음이온 또는 양이온은, 상기 염이 전체로서 약물학적으로 허용 가능한 한은, 중요하지 않음을 알아야 한다. 약학적으로 허용 가능한 염 및 그의 제조 방법 및 용도에 대한 추가적인 예가 문헌[Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002)](본 발명에 참고로 인용된다)에 제공되어 있다.

RTA 408은 또한 전구약물 형태로 존재할 수도 있다. 전구약물은 약제의 다수의 바람직한 성질들, 예를 들어 용해도, 생체이용율, 제조 등을 향상시키는 것으로 공지되어 있으므로, 본 발명의 일부 방법들에 사용된 화합물을 경우에 따라 전구약물 형태로 전달할 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 전구약물뿐만 아니라 전구약물의 전달 방법을 고려한다. 본 발명에 사용되는 화합물의 전구약물은 그 화합물 중에 존재하는 작용기들을 변형시킴으로써 제조할 수 있는데, 통상적인 조작으로 또는 생체내에서 그 변형이 분리되어 모 화합물이 될 수 있도록 변형시키는 것이다. 따라서 예를 들면, 전구약물은 하이드록시, 아미노 또는 카복시기가 임의의 기에 결합되어 있다가, 상기 전구약물이 환자에게 투여될 때 분리되어 각각 하이드록시, 아미노 또는 카복실산을 형성하는, 본 발명에 개시된 화합물들을 포함한다.

RTA 408은 하나 이상의 비대칭적으로 치환된 탄소 또는 질소 원자를 함유할 수 있으며, 이들을 광학적으로 활성이거나 라세미 형태로 단리시킬 수 있다. 따라서, 구조의 모든 키랄, 부분입체이성질체, 라세미 형태, 에피머 형태, 및 모든 기하 이성질체 형태들이, 달리 특정한 입체화학 또는 이성질체 형태가 구체적으로 지시되지 않는 한, 고려된다. RTA 408은 라세메이트 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 개별적인 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서, 단일 부분입체이성질체를 수득한다. 본 발명에 따른 RTA 408의 키랄 중심은 S 또는 R 형태를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 RTA 408을 구성하는 원자들은 상기와 같은 원자들의 모든 동위원소 형태들을 포함하고자 한다. 동위원소는 본 발명에 사용된 바와 같이, 동일한 원자번호를 갖지만 상이한 질량수를 갖는 원자들을 포함한다. 일반적인 예로서, 비제한적으로, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함하며, 탄소의 동위원소는 ¹³C 및 ¹⁴C를 포함한다. 유사하게, 본 발명의 화합물의 하나 이상의 탄소 원자(들)를 규소 원자(들)로 치환시킬 수 있음이 고려된다. 더욱 또한, RTA 408의 하나 이상의 산소 원자(들)를 황 또는 셀레늄 원자(들)로 치환시킬 수 있음이 고려된다.

RTA 408 및 그의 다형태는 또한 본 발명에서 서술된 적응증들에 사용하기 위해 종래 기술에서 공지된 화합물들에 비해, 더 유효하고, 덜 독성이며, 더 오래 작용하고, 더 효능있으며, 더 적은 부작용을 생성시키고, 더 용이하게 흡수되고/되거나 더 양호한 약동학 프로파일(예를 들어 보다 높은 경구 생체이용율 및/또는 보다 낮은 제거율(clearance))을 가질 수 있다는 이점을 갖고/갖거나, 다른 유용한 약물학적, 물리적 또는 화학적 이점을 가질 수 있다.

III . RTA 408의 다형태

일부 실시태양에서, 본 발명은 RTA 408의 용매화물을 포함하여, 그의 상이한 고체 형태를 제공한다. 예비제형화 및 예비 다형성 연구를 수행하였으며, RTA 408은 높은 용매화물 형성 성향을 갖는 것으로 밝혀졌다. 부류 2, 3, 4 및 5의 결정성 형태들은 용매화물과 일치한다. 상기 부류들의 설명에 대해서, 하기 표 1을 참조하시오. 부류 2 및 3(등구조 용매화물의 2 개 그룹)을 건조시키려는 시도는 성공적이지 못했으며, 이는 단단히 결합된 용매 분자와 일치한다. 일부 실시태양에서, 부류 4 고체(아세토나이트릴 용매화물)의 건조는 등구조 탈용매화된 형태를 도출하였다. 일부 실시태양에서, 부류 5 고체(THF 용매화물)의 건조는 비결정성 형태 부류 1을 생성시켰다. RTA 408의 비-용매화된 형태는 비결정성 형태(부류 1) 및 부류 4의 결정성 탈용매화된 용매화물(부류 4 아세토나이트릴 용매화물과 등구조)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 비결정성 형태는 T_g

153 ℃(ΔCp = 0.72 J/g℃)의 높은 유리 전이를 가지며 단지 약간 흡습성이다(Δm = +0.4% 50%→85% r.h.). 일부 실시태양에서, 상기 비결정성 형태는 상승된 온도 및 습도 조건 하에서(즉 40 ℃/∼75% r.h.에서 개방 또는 80 ℃에서 폐쇄) 4 주 이상 안정하다. 일부 실시태양에서, 상기 비결정성 형태(부류 1)는 부류 2 물질로부터 2-단계 과정(부류 5로의 변환 및 부류 5의 후속 건조로 비결정성 형태를 수득함)뿐만 아니라 직접적인 1-단계 방법(냉수욕에서 아세톤 용액으로부터 침전)으로 성공적으로 제조되었다. 상기 부류 4의 결정성 탈용매화된 용매화물(부류 4 용매화물과 등구조)은 약간 흡습성이고(50% r.h. 내지 85% r.h.에서 ∼0.7 중량%의 질량 증가) 196.1 ℃(ΔH = 29.31 J/g)에서 가능한 융점을 갖는다.

63415, 부류 1의 비결정성 형태의 샘플은 FT-라만 분광학, PXRD, TG-FTIR, 칼 피셔 적정, ¹H-NMR, DSC 및 DVS에 의해 특성화되었다(추가적인 세부내용에 대해서 실시예 섹션을 참조하시오). 상기 샘플은 ∼0.9 중량%의 EtOH와 미량의 H₂O를 함유하는 것으로 밝혀졌다(TG-FTIR에 따라). 0.5 중량%의 수 함량이 칼 피셔 적정에 의해 측정되었다. DSC는 T_g

153 ℃(ΔCp = 0.72 J/g℃)의 높은 유리 전이 온도를 나타낸다. DVS에 따르면, 상기 물질은 약간 흡습성이다(Δm = +0.4% 50%→85% r.h.). 상기 DSC 또는 DVS 실험에서 결정화는 관찰되지 않았다.

상기 비결정성 형태의 화학적 안정성을 1 ㎎/㎖의 농도에서 상이한 수성 매질(예를 들어 1% 수성 트윈 80, 1% 수성 SDS, 1% 수성 CTAB)뿐만 아니라 아세톤, EtOAc, MeOH 및 MeCN을 포함하는 유기 용매 중에서 6 시간, 24 시간, 2 일 및 7 일의 시점들에서 조사하였다. ≥1% 분해는 오직 7일 후 MeCN 중의 용액의 경우, 및 1% 수성 트윈 80 매질 중의 현탁액의 경우에만 관찰되었다(254 ㎚에서 모든 시점, 및 242 ㎚에서 24 시간, 2 일 및 7 일 후).

또한, 상기 비결정성 형태의 안정성을 상승된 온도 및 습도 조건 하에서(즉 25 ℃/62% r.h. 및 40 ℃/75% r.h.에서 개방 및 60 ℃ 및 80 ℃에서 폐쇄)의 보관에 의해 조사하였다. 1 주일, 2 주일 및 4 주일 후에, 상기 보관된 샘플들을 PXRD에 의해 분석하였다. 상기 샘플들 중 어느 것도 상기 비결정성 출발 물질과 다르지 않았다.

현탁액 평형화, 느린 냉각, 증발, 및 침전을 포함하여 30 회가 넘는 결정화 및 건조 실험을 수행하였다. 4 개의 새로운 결정성 형태들(부류 2, 3, 4 및 5)이 상기 비결정성 형태(부류 1) 외에 수득되었다.

상기 4 개의 새로운 형태(부류 2, 3, 4 및 5)를 RT-라만 분광학, PXRD 및 TG-FTIR에 의해 특성화하였다. 모든 형태는 용매화물에 상응한다(표 1). 63415의 결정성, 비-용매화된 형태를 수득할 목적으로 진공 또는 N₂ 흐름 하에서 건조 실험을 수행하였다.

수득된 부류들의 요약

부류	특징	건조 실험의 결과
부류 1	비결정성 형태	--
부류 2	등구조 용매화물(예를 들어 헵탄)	건조가 성공적이지 않음
부류 3	등구조 용매화물(예를 들어 에탄올)	건조가 성공적이지 않음
부류 4	MeCN 용매화물 & 탈용매화된 용매화물	건조가 성공적이고, 구조가 불변함
부류 5	THF 용매화물	건조가 비결정성 형태를 생성시킴

부류 2: 수행된 대부분의 결정화 실험들은 부류 2의 고체 물질을 생성시켰다(하기 실시예 섹션을 참조하시오). 그의 구성원들은 단단히 결합된 용매 분자와 함께 등구조의 비-화학량론적(<0.5 당량) 용매화물(헵탄, 사이클로헥산, 아이소프로필 에테르, 1-부탄올, 트라이에틸아민, 및 가능하게는 다른 용매, 예를 들어 헥산, 다른 에테르 등의)에 상응할 수 있다. 상기 부류 내의 라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴은 서로 매우 유사하며, 따라서 상기 구조들은, 혼입된 상이한 용매들로 인한 단지 작은 차이와 함께, 본질적으로 동일하다고 해도 좋다.

부류 2 샘플에 대한 건조 실험은 결정성의 비-용매화된 형태를 생성시키지 않았다. 상승된 온도(80 ℃) 및 고 진공(<1 x 10^-3 mbar) 조차 상기 단단히 결합된 용매 분자를 완전하게 제거할 수 없었으며; >2 중량%의 용매 함량이 항상 남아있었다. 이들 부분적으로 건조된 샘플의 결정도는 감소하지만, 상이한 구조로의 변환도 실질적인 비결정화도 관찰되지 않았다.

부류 3: 부류 3의 고체 물질을 몇몇의 결정화로부터 수득할 수 있다(하기 실시예 섹션을 참조하시오). 부류 3의 샘플은 단단히 결합된 용매 분자를 갖는 2PrOH, EtOH 및 추정상 아세톤의 등구조 용매화물인 듯하다. 이들은 ∼0.5 당량의 용매 함량을 갖는 화학량론적 반용매화물 또는 비-화학량론적 용매화물에 상응할 수 있었다. 부류 2의 경우와 같이, 상기 부류 내의 라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴은 서로 매우 유사하며, 이는 상이한 용매들을 포함하는 유사한 구조들을 가리킨다.

부류 2와 유사하게, 건조 실험은 성공적이지 못했다. 매우 단단히 결합된 용매 분자는 단지 부분적으로 제거될 수 있었다(즉 1 x 10^-3 mbar 및 80 ℃에서 3 일까지 ∼5.4 중량% 내지 ∼4.8 중량%). PXRD 패턴은 불변인 채로 있었다.

부류 4를 7:3 MeCN/H₂O 용매 시스템으로부터 수득할 수 있다(하기 실시예 섹션을 참조하시오). 상기는 아마도 결정성 아세토나이트릴 반용매화물에 상응하는 듯하다. 건조(승온에서 진공 또는 N₂ 흐름 하에서)에 의해 상기 용매 분자의 대부분을, 상기 결정 구조의 변화 또는 파괴없이 제거할 수 있었다(RXRD는 불변인 채로 있었다). 따라서, 결정성, 비-용매화된 형태(또는 다소 탈용매화된 용매화물)가 수득되었다. 상기는 약간 흡습성이고(50% r.h. 내지 85% r.h.에서 ∼0.7 중량%의 질량 증가) 196.1 ℃(ΔH = 29.31 J/g)에서 가능한 융점을 갖는다.

부류 5를 ∼1:1 THF/H₂O 용매 시스템으로부터 수득할 수 있다. 부류 5는 결합된 THF(및 아마도 H₂O)를 함유한다. 상기 두 성분의 함량을 별도로 쉽게 정량화할 수 없기 때문에, 상기 결정성 용매화물의 정확한 성질은 측정되지 않았다.

부류 5의 건조는 현저한 탈용매화 및 상기 비결정성 형태(부류 1) 방향으로의 변환을 생성시켰다. 일부 실시태양에서, 상기 RTA 408의 비결정성 형태를, 부류 2 헵탄 용매화물을 1:1 THF/H₂O에 현탁시켜 부류 5 고체를 형성시킨 다음 건조 및 비결정화시켜 제조할 수 있다.

상기 비결정성 형태(부류 1)를 제조할 목적으로 부류 2 출발 물질을 사용하여 실험을 수행하였다. 주로 비결정성 물질(부류 1)이 100-㎎ 및 3-g 규모로 부류 5를 통해 2-단계 과정(100 mbar, 80 ℃에서, 수일 건조)으로 부류 2 물질로부터 출발하여 제조되었다. 완전히 비결정성인 물질(부류 1)의 제조는 냉수욕에서 부류 2 물질의 아세톤 용액으로부터 상기 비결정성 형태(부류 1)의 직접적인 침전에 의해 용매 THF 없이 1-단계 과정으로 가능한 것으로 밝혀졌다.

IV . 염증 및/또는 산화 스트레스와 관련된 질병

염증은 감염성 또는 기생성 유기체에 대한 내성 및 손상된 조직의 수복을 제공하는 생물학적 과정이다. 염증은 통상적으로 국소화된 혈관확장, 적열 상태, 팽창, 및 통증, 감염 또는 손상 부위로의 백혈구의 보충, 염증성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α 및 IL-1의 생산, 및 반응성 산소 또는 질소 종, 예를 들어 과산화 수소, 초과산화물 (superoxide), 및 퍼옥시나이트라이트의 생성을 특징으로 한다. 염증의 말기 단계에서, 조직 재형성, 혈관형성 및 흉터 형성(섬유증)이 상처 치유 과정의 부분으로서 발생할 수도 있다. 정상적인 환경 하에서, 상기 염증 반응은 조절되고, 일시적이며, 일단 상기 감염 또는 손상이 적절하게 다루어졌으면 조직화된 방식으로 해결된다. 그러나, 급성 염증은 조절 기전을 실패한 경우 과도하고 생명 위협성으로 될 수 있다. 한편으로, 염증은 만성적으로 될 수 있으며 축적되는 조직 손상 또는 전신 합병증을 야기할 수 있다. 적어도 본 발명에 제공된 증거들을 근거로, RTA 408을 염증 또는 염증과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

다수의 심한 난치성 인간 질병은, 전통적으로 염증 상태로서 바라보지 않았던 암, 죽상동맥경화증 및 당뇨병과 같은 질병을 포함한 염증 과정의 조절 장애를 수반한다. 암의 경우에, 상기 염증 과정은 종양 형성, 진행, 전이, 및 치료내성을 포함하는 과정들과 관련된다. 일부 실시태양에서, RTA 408을 암종, 육종, 림프종, 백혈구, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 또는 정상피종을 포함한 암, 또는 방광, 혈액, 뼈, 뇌, 유방, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 방광, 생식기, 비뇨생식관, 두부, 신장, 후두, 간, 폐, 근육 조직, 경부, 구강 또는 코 점막, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 비장, 소장, 대장, 위, 고환 또는 갑상선의 암의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 오랫 동안 지질 대사의 질환으로서 보아왔던 죽상동맥경화증은 현재 주로 염증 상태인 것으로 이해되며, 이때 활성화된 대식세포가 죽상동맥경화반의 형성 및 최종적인 파열에 중요한 역할을 한다. 염증 신호전달 경로의 활성화가 또한 인슐린 내성의 발생뿐만 아니라 당뇨성 고혈당증과 관련된 말초 조직 손상에 한 역할을 하는 것으로 나타났다. 반응성 산소 종 및 반응성 질소 종, 예를 들어 초과산화물, 과산화 수소, 산화 질소, 및 퍼옥시나이트라이트의 과잉 생성은 염증 상태의 특징이다. 조절장애된 퍼옥시나이트라이트 생성의 증거가 광범위하게 다양한 질병에서 보고되었다(문헌들 [Szabo et al., 2007]; [Schulz et al., 2008]; [Forstermann, 2006]; [Pall, 2007]).

자가면역 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 루푸스, 건선 및 다발성 경화증은 병든 조직에서 부적합하고 만성적인 염증 과정의 활성화를 수반하며, 이는 면역계에서 자기 대 비-자기 인식 및 반응 기전의 기능장애로부터 발생한다. 신경퇴행성 질병, 예를 들어 알쯔하이머병 및 파킨슨병에서, 신경 손상은 미세아교세포의 활성화 및 염증전 단백질, 예를 들어 유도성 산화 질소 신타제(iNOS)의 상승된 수준과 상관된다. 만성적인 기관 부전, 예를 들어 신부전, 심부전, 간부전, 및 만성 폐쇄성 폐 질병은 만성적인 산화 스트레스 및 염증의 존재와 밀접하게 관련되며, 이는 섬유증 및 결국 기관기능의 상실을 야기한다. 대혈관 및 소혈관의 내층을 이루는 혈관 내피 세포에서 산화 스트레스는 내피 기능장애을 야기할 수 있으며, 전신 심혈관 질병, 당뇨병 합병증, 만성 신장병 및 다른 형태의 기관 부전, 및 다수의 다른 노화-관련된 질병, 예를 들어 중추신경계 및 망막의 퇴행성 질병의 발병에 중요한 기여 인자인 것으로 여겨진다.

다수의 다른 질병들은 염증성 장 질병; 염증성 피부병; 방사선 요법 및 화학요법과 관련된 점막염 및 피부염; 눈병, 예를 들어 포도막염, 녹내장, 황반 변성, 및 다양한 형태의 망막병증; 이식 결함 및 거부; 허혈-재관류 손상; 만성 통증; 뼈 및 관절의 퇴행성 상태, 예를 들어 골관절염 및 골다공증; 천식 및 낭성 섬유증; 발작 장애; 및 신경정신병 상태, 예를 들어 정신분열증, 우울증, 양극 장애, 외상후 스트레스 장애, 주의력 결핍 장애, 자폐-스펙트럼 장애, 및 식사 장애, 예를 들어 거식증을 포함하여, 감염된 조직에서 산화 스트레스 및 염증을 수반한다. 염증성 신호전달 경로의 조절장애는 근이영양증 및 다양한 형태의 악액질을 포함하는, 근육 소모 질병의 병리학에 주요 인자인 것으로 여겨진다.

다양한 생명 위협성 급성 질환은 또한 조절장애된 염증성 신호전달, 예를 들어 췌장, 신장, 간 또는 폐를 포함한 급성 기관 부전, 심근 경색 또는 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 패혈성 쇼크, 외상, 중증 화상 및 아나필락시스를 포함한다.

감염성 질병의 다수의 합병증들이 또한 염증 반응의 조절장애를 수반한다. 염증 반응은 침입하는 병원균을 죽일 수 있지만, 과도한 염증 반응은 또한 매우 파괴적일 수 있으며 일부의 경우 감염된 조직의 주요 손상 원인일 수 있다. 더욱 또한, 과도한 염증 반응은 염증성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α 및 IL-1의 과잉생산으로 인해 전신 합병증을 야기할 수도 있다. 이는 중증 인플루엔자, 중증 급성 호흡기 증후군, 및 패혈증으로부터 발생하는 사망률의 한 인자인 것으로 여겨진다.

iNOS 또는 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 이상 또는 과잉 발현이 다수의 질병 과정들의 병인에 연루되었다. 예를 들어, NO는 강력한 돌연변이유발 물질이고(문헌[Tamir and Tannebaum, 1996]), 산화 질소는 또한 COX-2를 활성화시킬 수 있음(문헌[Salvemini et al., 1994])이 명백하다. 더욱 또한, 발암물질, 아족시메탄에 의해 유발된 랫트 결장 종양에서 iNOS의 현저한 증가가 존재한다(문헌[Takahashi et al., 1997]). 올레아놀산의 일련의 합성 트라이터페노이드 유사체들이 세포 염증 과정, 예를 들어 마우스 대식세포에서 유도성 산화 질소 신타제(iNOS) 및 COX-2의 IFN-γ에 의한 유도의 강력한 억제제인 것으로 나타났다. 문헌들 [Honda et al. (2000a)], [Honda et al. (2000b)], 및 [Honda et al. (2002)](모두 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.

하나의 태양에서, 본 발명에 개시된 RTA 408은 부분적으로, γ-인터페론에의 노출에 의해 유도된 대식세포-유래된 RAW 264.7 세포에서의 산화 질소의 생성을 억제하는 그의 능력을 특징으로 한다. RTA 408은 산화방지성 단백질, 예를 들어 NQO1의 발현을 유도하고, 염증전(pro-inflammatory) 단백질, 예를 들어 COX-2 및 유도성 산화 질소 신타제(iNOS)의 발현을 감소시키는 능력을 추가의 특징으로 한다. 이러한 성질들은 산화 스트레스 및 염증 과정의 조절장애를 수반하는 광범위한 질병 및 질환들, 예를 들어 암, 이온화 방사선에의 국소 또는 전신 노출로부터의 합병증, 방사선 요법 또는 화학요법으로부터 생성되는 점막염 및 피부염, 자가면역 질병, 심혈관 질병, 예를 들어 죽상동맥경화증, 허혈-재관류 손상, 급성 및 만성 기관 부전, 예를 들어 신부전 및 심부전, 호흡기 질병, 당뇨병 및 당뇨 합병증, 중증 알러지, 이식편 거부, 이식편대 숙주병, 신경퇴행성 질병, 눈 및 망막의 질병, 급성 및 만성 통증, 퇴행성 골 질병, 예를 들어 골관절염 및 골다공증, 염증성 장 질병, 피부염 및 다른 피부병, 패혈증, 화상, 발작 장애, 및 신경정신성 질환의 치료에 적합하다.

또 다른 태양에서, RTA 408을 눈병과 같은 상태를 갖는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어, 포도막염, 황반 변성(건성 형태 및 습성 형태 모두), 녹내장, 당뇨성 황반 부종, 안검염, 당뇨성 망막병증, 각막 내피의 질병 및 질환, 예를 들어 푹스 내피 각막 이영양증, 수술후 염증, 안구 건조증, 알러지성 결막염 및 다른 형태의 결막염이 RTA 408에 의해 치료될 수 있었던 눈병의 비제한적인 예이다.

또 다른 태양에서, RTA 408을 피부병 또는 피부질환과 같은 상태를 갖는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 화학물질 노출로 인한 피부염, 및 방사선-유발된 피부염; 열적 또는 화학적 손상; 만성 상처, 예를 들어 당뇨성 궤양, 욕창 및 정맥 궤양; 여드름; 탈모증, 예를 들어 대머리 및 약물-유발된 탈모증; 모낭의 다른 질환; 수포성 표피박리증; 일광화상 및 그의 합병증; 백반증을 포함한 피부 착색 질환; 노화-관련된 피부 상태; 수술후 상처 치유; 피부 손상, 수술 또는 화상으로부터의 흉터 예방 또는 감소; 건선; 자가면역 질병 또는 이식편대 숙주병의 피부학적 발현; 피부암의 예방 또는 치료; 피부세포의 과증식을 수반하는 질환, 예를 들어 과각화증이 RTA 408에 의해 치료될 수 있었던 피부병의 비제한적인 예이다.

이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 산화방지/소염성 Keap1/Nrf2/ARE 경로의 활성화가 본 발명에 개시된 화합물의 소염 및 항암 성질 모두에 관련되는 것으로 여겨진다.

또 다른 태양에서, RTA 408을 하나 이상의 조직 중의 상승된 수준의 산화 스트레스에 의해 야기된 상태를 갖는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 산화 스트레스는 반응성 산소종, 예를 들어 초과산화물, 과산화 수소, 산화 질소, 및 퍼옥시나이트라이트(산화 질소와 초과산화물과의 반응에 의해 형성됨)의 비정상적으로 높거나 연장된 수준으로부터 발생한다. 상기 산화 스트레스는 급성 또는 만성 염증에 의해 동반될 수 있다. 상기 산화 스트레스는 미토콘드리아 기능장애에 의해, 면역 세포, 예를 들어 대식세포 및 호중구의 활성화에 의해, 외부 작용제, 예를 들어 이온화 방사선 또는 세포독성 화학요법제(예를 들어 독소루비신)에의 급성 노출에 의해, 외상 또는 다른 급성 조직 손상에 의해, 허혈/재관류에 의해, 불량한 순환 또는 빈혈에 의해, 국소화된 또는 전신 저산소증 또는 과잉산소증에 의해, 상승된 수준의 염증성 사이토킨 및 다른 염증-관련된 단백질에 의해, 및/또는 다른 비정상적인 생리학적 상태, 예를 들어 고혈당증 또는 저혈당증에 의해 야기될 수 있다.

다수의 상기와 같은 상태의 동물 모델에서, Nrf2 경로의 표적 유전자, 유도성 헴 옥시게나제(HO-1)의 발현을 자극하는 것이, 예를 들어 심근 경색, 신부전, 이식 결함 및 거부, 뇌졸중, 심혈관 질병 및 자가면역 질병의 모델에서 현저한 치료 효과를 갖는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌들 [Sacerdoti et al., 2005]; [Abraham & Kappas, 2005]; [Bach, 2006]; [Araujo et al., 2003]; [Liu et al., 2006]; [Ishikawa et al., 2001]; [Kruger et al., 2006]; [Satoh et al., 2006]; [Zhou et al., 2005]; [Morse and Choi, 2005]; [Morse and Choi, 2002]). 상기 효소는 자유 헴을 철, 일산화 탄소(CO) 및 빌리베르딘(이는 후속으로 효능있는 산화방지제 분자인 빌리루빈으로 전환된다)으로 분해한다.

또 다른 태양에서, RTA 408을 염증에 의해 악화된 산화 스트레스로부터 발생되는, 급성 및 만성 조직 손상 또는 기관 부전의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 본 범주에 있는 질병의 예는 심부전, 간부전, 이식 결함 및 거부, 신부전, 췌장염, 섬유성 폐 질병(특히 낭성 섬유증, CODP, 및 특발성 폐 섬유증), 당뇨병(합병증 포함), 죽상동맥경화증, 허혈-재관류 손상, 녹내장, 뇌졸중, 자가면역 질병, 자폐증, 황반 변성, 및 근이영양증을 포함한다. 예를 들어, 자폐증의 경우에, 연구들은 중추신경계에서 증가된 산화 스트레스가 상기 질병의 발병에 기여할 수 있음을 암시한다(문헌[Chauhan and Chauhan, 2006]).

증거가 또한 산화 스트레스 및 염증을 중추신경계의 다수의 다른 질환들, 예를 들어 정신 질환, 예를 들어 정신병, 주요 우울증, 및 양극 장애; 발작 장애, 예를 들어 간질; 통증 및 감각 증후군, 예를 들어 편두통, 신경병성 통증, 또는 이명; 및 행동 증후군, 예를 들어 주의력 결핍 질환의 발병 및 병리와 연계시킨다. 예를 들어 문헌들 [Dickerson et al., 2007]; [Hanson et al., 2005]; [Kendall-Tackett, 2007]; [Lencz et al., 2007]; [Dudhgaonkar et al., 2006]; [Lee et al., 2007]; [Morris et al., 2002]; [Ruster et al., 2005]; [McIver et al., 2005]; [Sarchielli et al., 2006]; [Kawakami et al., 2006]; [Ross et al., 2003](이들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 예를 들어, 상승된 수준의 염증성 사이토킨, 예를 들어 TNF-α, 인터페론-γ, 및 IL-6이 주요 정신 질환들과 관련된다(문헌[Dickerson et al., 2007]). 미세아교세포 활성화가 또한 주요 정신 질환과 관련되었다. 따라서, 염증성 사이토킨의 하향 조절 및 미세아교세포의 과잉 활성화 억제가 정신분열증, 주요 우울증, 양극 장애, 자폐-스펙트럼 장애, 및 다른 신경정신성 질환이 있는 환자에게 이로울 수 있다.

따라서, 산화 스트레스 단독 또는 염증에 의해 악화된 산화 스트레스를 수반하는 병리에서, 치료는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 화합물, 예를 들어 상기에 또는 본 명세서 전체를 통해 개시된 것들을 투여함을 포함할 수 있다. 치료를 예방적으로, 산화 스트레스의 예측가능한 상태(예를 들어 기관 이식 또는 암 환자에의 방사선 요법의 투여)에 앞서 실행하거나, 또는 확립된 산화 스트레스 및 염증을 수반하는 상황에서 치료학적으로 실행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 방사선 요법 및/또는 화학요법을 제공받는 환자의 치료에 사용하는 경우, 본 발명의 화합물을 상기 방사선 요법 또는 화학요법 전에, 상기 요법들과 동시에, 및/또는 상기 요법들 후에 투여하거나, 또는 상기 화합물을 다른 요법들과 함께 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 상기 방사선 요법 또는 화학요법의 항암 효과를 감소시키지 않으면서 상기 상기 방사선 요법 또는 화학요법(상이한 작용제 사용)과 관련된 부작용을 예방하고/하거나 부작용의 중증도를 감소시킬 수 있다. 상기와 같은 부작용들은 상기 방사선 요법 및/또는 화학요법에 대해 용량-제한적일 수 있기 때문에, 일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 상기 방사선 요법 및/또는 화학요법의 보다 많고/많거나 보다 빈번한 투여를 허용하여, 예를 들어 보다 큰 치료 효능을 생성시키도록 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 상기 방사선 요법 및/또는 화학요법과 함께 투여하는 경우에, 상기 화합물은 주어진 용량의 방사선 요법 및/또는 화학요법의 효능을 증대시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 상기 방사선 요법 및/또는 화학요법과 함께 투여될 때 주어진 용량의 방사선 요법 및/또는 화학요법의 효능을 증대시키고 상기 방사선 요법 및/또는 화학요법의 부작용을 감소시킬 수(또는 최소한 가중시키지 않을 수) 있다. 일부 실시태양에서, 이론에 얽매이고자 하는 것이 아니라, 이러한 복합 효능은 본 발명의 화합물에 의한 염증전 전사 인자 NF-κB의 활성화의 억제로부터 생성될 수 있다. NF-κB는 종종 암세포에서 만성적으로 활성화되며, 상기와 같은 활성화는 치료에 대한 내성 및 종양 진행의 촉진과 관련된다(예를 들어 문헌들 [Karin, 2006]; [Aghajan et al., 2012]). 염증 및 암을 촉진하는 다른 전사 인자들, 예를 들어 STAT3(예를 들어 문헌들 [He and Karin 2011]; [Grivennikov and Karin, 2010])이 또한 일부 실시태양에서 본 발명의 화합물에 의해 억제될 수 있다.

RTA 408을 패혈증, 피부염, 자가면역 질병, 및 골관절염과 같은 염증 상태의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. RTA 408을 또한, 예를 들어 Nrf2를 유도하고/하거나 NF-κB를 억제함으로써 염증성 통증 및/또는 신경병성 통증의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

RAT 408을 또한 암, 염증, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 자폐증, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅톤병, 자가면역 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 루푸스, 크론병 및 건선, 염증성 장 질병, 병인이 산화 질소 또는 프로스타글란딘의 과잉 생성을 수반하는 것으로 여겨지는 모든 다른 질병들, 및 산화 스트레스 단독 또는 염증에 의해 악화된 산화 스트레스를 수반하는 병리와 같은 질병의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. RTA 408을 암종, 육종, 림프종, 백혈구, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 또는 정상피종을 포함한 암, 또는 방광, 혈액, 뼈, 뇌, 유방, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 방광, 생식기, 비뇨생식관, 두부, 신장, 후두, 간, 폐, 근육 조직, 경부, 구강 또는 코 점막, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 비장, 소장, 대장, 위, 고환 또는 갑상선의 암의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다.

염증의 또 다른 태양은 염증성 프로스타글란딘, 예를 들어 프로스타글란딘 E의 생산이다. RTA 408을 혈관확장, 혈장 누출, 국소 통증, 상승된 체온, 및 다른 염증 증상을 촉진하는데 사용할 수 있다. 효소 COX-2의 유도성 형태가 그의 생산과 관련되며, 높은 수준의 COX-2가 염증이 발생한 조직에서 발견된다. 결과적으로, COX-2의 억제는 많은 염증 증상들을 완화시킬 수 있으며 다수의 중요한 소염 약물(예를 들어 이부프로펜 및 셀레콕시브)은 COX-2 활성을 억제시킴으로써 작용한다. 한 부류의 사이클로펜테논 프로스타글란딘(cyPG)(예를 들어 15-데옥시 프로스타글란딘 J2, a.k.a. PGJ2)이 염증의 조직화된 해결을 자극하는데 한 역할을 함이 입증되었다(예를 들어 문헌[Rajakariar et al., 2007]). COX-2가 또한 사이클로펜테논 프로스타글란딘의 생산과 관련된다. 결과적으로, COX-2의 억제는 염증의 완전한 해결을 방해할 수 있으며, 이는 잠재적으로 조직 중 활성화된 면역 세포의 지속을 촉진하여 만성적인, "연기나는 (smoldering)" 염증을 야기한다. 이러한 효과는 장시간 동안 선택적인 COX-2 억제제를 사용하는 환자들에서 심혈관 질병의 증가된 발병률에 원인이 될 수 있다.

하나의 태양에서, RTA 408을 산화환원-민감성 전사 인자들의 활성을 조절하는 단백질상의 조절성 시스테인 잔기(RCR)를 선택적으로 활성화시킴으로써 세포내 염증전 사이토킨의 생산을 조절하는데 사용할 수 있다. cyPG에 의한 RCR의 활성화는, 상기 산화방지성 및 세포보호성 전사 인자 Nrf2의 활성을 효능있게 유도하고 산화전 및 염증전 전사 인자 NF-κB 및 STAT의 활성을 억제하는 사전-해결 프로그램을 개시시키는 것으로 나타났다. 일부 실시태양에서, RTA 408을 산화방지성 및 환원성 분자(NQO1, HO-1, SOD1, γ-GCS)의 생산을 증가시키고 산화 스트레스 및 산화전 및 염증전 분자(iNOS, COX-2, TNF-α)의 생산을 감소시키는데 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, RTA 408을 염증 사건의 주인인 세포가, 염증의 해결을 촉진하고 상기 주인에 대한 과도한 조직 손상을 제한함으로써 비-염증성 상태로 복귀되게 하는데 사용할 수 있다.

A. 암

일부 실시태양에서, 본 명세의 RTA 408, 다형태 및 방법을 종양 세포에서 세포사멸을 유도하고, 세포 분화를 유도하고, 암세포 증식을 억제하고, 염증 반응을 억제하고/하거나 화학예방 능력으로 작용하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하기의 성질들 중 하나 이상을 갖는 신규의 다형태들을 제공한다: (1) 악성 및 비-악성 세포 모두의 세포사멸을 유도하고 분화시키는 능력, (2) 마이크로몰 이하 또는 나노몰 수준에서 다수의 악성 또는 전암성 세포의 증식의 억제제로서의 활성, (3) 염증 효소 유도성 산화 질소 신타제(iNOS)의 드노보 (de novo) 합성을 억제하는 능력, (4) NF-κB 활성화를 억제하는 능력, 및 (5) 헴 옥시게나제-1(HO-1)의 발현을 유도하는 능력.

몇몇 암에서 iNOS 및 COX-2의 수준이 상승하고 이는 암발생과 관련되었으며, COX-2 억제제는 인간에서 원발성 결장 선암종의 발병률을 감소시키는 것으로 나타났다(문헌들 [Rostom et al., 2007]; [Brown and DuBois, 2005]; [Crowel et al., 2003]). iNOS는 골수-유래된 억제인자 세포(MDSC)에서 발현되고(문헌[Angulo et al., 2000]), 암세포에서 COX-2 활성은 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)를 생성시키는 것으로 나타났으며, 이는 MDSC에서 아르기나제의 발현을 유도하는 것으로 입증되었다(문헌[Sinha et al., 2007]). 아르기닌 및 iNOS는, 기질로서 L-아르기닌을 이용하고 각각 L-오르니틴 및 유레아, 및 L-시트룰린 및 NO를 생산하는 효소이다. MDSC에 의한 종양 미세환경으로부터의 아르기닌의 고갈은 NO 및 퍼옥시나이트라이트의 생산과 결합하여, T 세포의 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 것으로 입증되었다(문헌[Bronte et al., 2003]). COX-2 및 iNOS의 억제는 MDSC의 축적을 감소시키고, 종양-관련된 T 세포의 세포독성 활성을 복원시키며, 종양 성장을 지연시키는 것으로 입증되었다(문헌들 [Sinha et al., 2007]; [Mazzoni et al., 2002]; [Zhou et al., 2007]).

NF-κB 및 JAK/STAT 신호전달 경로의 억제는 암 상피 세포의 증식을 억제하고 이들의 세포사멸을 유도하는 전략과 관련되었다. STAT3 및 NF-κB의 활성화는 암세포에서 세포사멸을 억제시키고, 증식, 침습 및 전이의 촉진을 생성시키는 것으로 입증되었다. 이러한 과정들에 관련된 표적 유전자들 중 다수가 NF-κB 및 STAT3에 의해 전사적으로 조절되는 것으로 입증되었다(문헌[Yu et al., 2007]).

암 상피 세포에서의 직접적인 역할들 외에, NF-κB 및 STAT3은 또한 종양 미세환경내에서 발견되는 다른 세포들에서 중요한 역할을 한다. 동물 모델 실험은 NF-κB가 암 개시 및 진행에 대한 염증의 효과를 전파하기 위해서 암세포 및 조혈세포 모두에 필요함이 입증되었다(문헌[Greten et al., 2004]). 암 및 골수 세포에서 NF-κB 억제는 각각 생성 종양의 수 및 크기를 감소시킨다. 암세포에서 STAT3의 활성화는 종양-관련된 수지상 세포(DC)의 성숙을 억제하는 몇몇 사이토킨(IL-6, IL-10)을 생성시킨다. 더욱 또한, STAT3은 상기 수지상 세포 자체에서 상기 사이토킨에 의해 활성화된다. 마우스 암 모델에서 STAT3의 억제는 DC 성숙을 복원시키고, 항종양 면역성을 촉진하며, 종양 성장을 억제한다(문헌[Kortylewski et al., 2005). 일부 실시태양에서, RTA 408 및 그의 다형태를 예를 들어 전립선암을 포함한 암의 치료에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, RTA 및 그의 다형태를 예를 들어 전립선암을 포함한 암의 치료를 위한 복합 요법에 사용할 수 있다. 예를 들면 하기의 실시예 H를 참조하시오.

B. 다발성 경화증 및 다른 신경퇴행성 상태

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 다발성 경화증(MS) 또는 다른 신경퇴행성 상태, 예를 들어 알쯔하이머병, 파킨슨병 또는 근위축성 측삭 경화증에 대해서 환자를 치료하기 위해 사용할 수 있다. MS는 중추신경계의 염증 상태인 것으로 공지되어 있다(문헌들 [Williams et al., 1994]; [Merrill and Benvenist, 1996]; [Genain and Nauser, 1997]). 여러 연구들을 근거로, 증거는 염증, 산화 및/또는 면역 기전이 알쯔하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 및 MS의 병인에 관련됨을 암시한다(문헌들 [Bagasra et al., 1995]; [McGeer and McGeer, 1995]; [Simonian and Coyle, 1996]; [Kaltschmidt et al., 1997]). 역학 데이터는 아라키도네이트로부터의 프로스타글란딘의 합성을 차단하는 NSAID의 만성적인 사용이 AD의 발병 위험성을 현저하게 낮춤을 가리킨다(문헌들 [McGeer et al., 1996]; [Stewart et al., 1997]). 따라서, NO 및 프로스타글란딘의 형성을 차단하는 작용제들을 신경퇴행성 질병의 예방 및 치료를 위한 접근법에 사용할 수 있다. 상기와 같은 질병의 치료에 성공적인 치료제 후보는 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능력을 필요로 한다. 예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 공보 2009/0060873을 참조하시오.

C. 신경염증

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 신경염증이 있는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 신경염증은 중추신경계에서 미세아교세포 및 성상세포 반응 및 작용이 근본적으로 염증-유사 특징을 가지며, 이러한 반응들이 광범위하게 다양한 신경학적 질환의 병인 및 진행에 중심이라는 생각을 포함한다. 이러한 생각은 알쯔하이머병에서부터 다른 신경퇴행성 질병(문헌들 [Eikelenboom et al., 2002]; [Ishizawa and Dickson, 2001]), 허혈/독성 질병(문헌들 [Gehrmann et al., 1995]; [Touzani et al., 1999]), 종양 생물학(문헌[Graeber et al., 2002]) 및 심지어 정상적인 뇌 발달에까지 연장되었다. 신경염증은 미세아교세포 및 성상세포의 활성화 및 사이토킨, 케모킨, 보체 단백질, 급성기 단백질, 산화적 손상, 및 관련된 분자 과정을 포함하는 광범위한 복잡한 세포 반응들을 포함하며, 상기 사건들은 신경 기능에 유해한 영향을 미쳐, 신경 손상, 추가적인 아교세포 활성화, 및 최종적으로 신경퇴행을 야기할 수도 있다.

D. 신장병

일부 실시태양에서, RTA 408뿐만 아니라 그의 다형태를, 신장병 및 신장 질환, 예를 들어 신부전 및 만성 신장병(CKD)이 있는 환자들을, 예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 8,129,429 호에 교시된 방법들에 근거하여 치료하는데 사용할 수 있다. 혈액으로부터의 대사성 폐기물의 부적합한 제거 및 혈중 전해질의 이상 농도를 생성시키는 신부전은 전세계적으로, 특히 선진국에서 중대한 의료 문제이다. 당뇨병 및 고혈압이 만성 신부전(또한 만성 신장병(CDK)으로도 공지되어 있다)의 가장 중요한 원인들 가운데 있으나, 이는 또한 다른 상태들, 예를 들어 루푸스와도 관련된다. 급성 신부전은 몇몇 약물(예를 들어 아세트아미노펜) 또는 독성 화학물질에의 노출로부터, 또는 쇼크 또는 외과적 시술, 예를 들어 이식과 관련된 허혈-재관류 손상으로부터 발생할 수 있으며 만성 신부전을 생성시킬 수 있다. 다수의 환자들에서, 신부전은, 환자들이 삶을 계속하기 위해서 규칙적인 투석 또는 신장 이식을 필요로 하는 단계로 진행한다. 이러한 시술들은 모두 침습적이며 상당한 부작용 및 삶의 질의 문제와 관련된다. 신부전의 일부 합병증, 예를 들어 부갑상선 기능항진증 및 고인산혈증에 대한 유효 치료제들이 존재하지만, 신부전의 근원적인 진행을 멈추거나 역전시키는 것으로 입증된 이용 가능한 치료제는 없다. 따라서, 손상된 신장 기능을 개선시킬 수 있는 작용제들은 신부전의 치료에 현저한 진보를 나타낼 것이다.

염증은 CKD의 병리에 현저하게 기여한다. 또한 산화 스트레스와 신장 기능장애 간에 강한 역학적인 관련이 존재한다. NF-κB 신호전달 경로는, NF-κB가 궁극적으로 신장을 손상시키는 염증 반응을 생성시키는 단핵세포/대식세포의 보충을 맡고 있는 케모킨인 MCP-1의 전사를 조절하기 때문에, CKD의 진행에 중요한 역할을 한다(문헌[Wardle, 2001]). Keap1/Nrf2/ARE 경로는 헴 옥시게나제-1(HO-1)을 포함한, 산화방지 효소를 암호화하는 다수 유전자들의 전사를 조절한다. 암컷 마우스에서 Nrf2 유전자의 제거는 루푸스-유사 사구체 신염을 발병시킨다(문헌[Yoh et al., 2001]). 더욱 또한, 몇몇의 연구들은 HO-1 발현이 신장 손상 및 염증에 반응하여 유도되고 상기 효소 및 그의 산물, 빌리루빈 및 일산화 탄소가 상기 신장에서 보호 역할을 함을 입증하였다(문헌[Nath et al., 2006]).

급성 신장 손상(AKI)은 허혈-재관류, 몇몇 약제, 예를 들어 시스플라틴 및 라파마이신에 의한 치료, 및 의료 영상화에 사용되는 방사선콘트라스트 매질의 정맥내 주사에 따라 발생한다. CKD에서와 같이, 염증 및 산화 스트레스는 AKI의 병리에 기여한다. 방사선콘트라스트-유발된 신장병증(RCN)에 근원하는 분자 기전은 잘 이해되어 있지 않으나; 연장된 혈관수축, 손상된 신장 자가조절, 및 상기 콘트라스트 매질의 직접적인 독성을 포함한 사건들의 조합이 모두 신부전에 기여하는 듯하다(문헌[Tumlin et al., 2006]). 혈관수축은 신장 혈류를 감소시키고 허혈-재관류 및 반응성 산소종의 생성을 야기한다. HO-1은 이러한 조건 하에서 강하게 유도되며 신장을 포함한 다수의 상이한 기관들에서 허혈-재관류 손상을 방지하는 것으로 입증되었다(문헌[Nath et al., 2006]). 구체적으로, HO-1의 유도는 RCN 랫트 모델에서 보호성인 것으로 나타났다(문헌[Goodman et al., 2007]). 재관류가 또한, 부분적으로 NF-κB 신호전달의 활성화를 통해서 염증 반응을 유도한다(문헌[Nichols, 2004]). NF-κB 표적화가 기관 손상의 예방을 위한 치료학적 전략으로서 제안되었다(문헌[Zingarelli et al., 2003]).

E. 심혈관 질병

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 심혈관 질병이 있는 환자의 치료에 사용할 수 있다. CV 질병의 병인은 복잡하지만, 원인 중 대부분은 중요 기관 또는 조직으로의 부적합하거나 완전히 붕괴된 혈액 공급과 관련된다. 흔히 상기와 같은 상태는 하나 이상의 죽상동맥경화반의 붕괴로부터 발생하며, 이는 중요한 혈관 중 혈류를 차단하는 혈전의 형성을 야기한다.

일부 경우에, 죽상동맥경화증은, 협착증(동맥이 좁아짐)이 발생하여 중요한 기관(심장 포함)으로의 혈류가 만성적으로 불충분한 중요 혈관에서 매우 많을 수 있다. 상기와 같은 만성적인 허혈은 울혈성 심부전과 관련된 심장 비대를 포함하여, 많은 종류의 종말 기관 손상을 야기할 수 있다.

많은 형태의 심혈관 질병을 야기하는 근원적인 결함인 죽상동맥경화증은, 동맥의 내층(내피)에 대한 물리적인 결함 또는 손상이 혈관 평활근세포의 증식 및 병든 영역으로의 백혈구의 침윤을 수반하는 염증 반응을 촉발할 때 발생한다. 최종적으로, 콜레스테롤-함유 지단백질 및 다른 물질들의 침착물과 결합된 상기 언급된 세포들로 구성된, 죽상동맥경화반으로서 공지된 복합 병변이 형성될 수 있다(예를 들어 문헌[Hansson et al., 2006]). 현행 치료학적 치료에 의해 제공된 상당한 이점에도 불구하고, 심혈관 질병으로부터의 사망률은 여전히 높으며 심혈관 질병의 치료에 있어서 충족되지 못한 상당한 요구들이 남아있다.

HO-1의 유도는 다양한 심혈관 질병 모델에서 이로운 것으로 나타났으며, 낮은 수준의 HO-1 발현은 상승된 CV 질병의 위험성과 임상적으로 상관되었다. 따라서 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 다양한 심혈관 질환, 예를 들어 비제한적으로 죽상동맥경화증, 고혈압, 심근경색, 만성 심부전, 뇌졸중, 지주막하 출혈, 및 재협착증의 치료 또는 예방에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 다른 공지된 심혈관 요법, 예를 들어 비제한적으로 응고방지제, 혈전용해제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 관상동맥 우회 이식술, 풍선 혈관성형술, 스텐트의 사용, 세포 증식을 억제하는 약물, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추는 약물과의 복합 요법으로서 사용할 수 있다.

F. 당뇨병

일부 실시태양에서, RTA 408뿐만 아니라 그의 다형태를, 예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 8,129,429 호에 교시된 방법들을 근거로, 당뇨병이 있는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 당뇨병은 신체가 순환하는 글루코스의 수준을 조절하지 못함을 특징으로 하는 복합적인 질병이다. 상기 실패는 다양한 조직에서 글루코스의 생산 및 흡수 모두를 조절하는 펩타이드 호르몬인 인슐린의 결여로부터 발생할 수 있다. 결핍 인슐린은 근육, 지방 및 다른 조직이 글루코스를 적합하게 흡수하는 능력을 손상시켜, 고혈당증(비정상적으로 높은 수준의 혈중 글루코스)을 야기한다. 가장 통상적으로, 상기와 같은 인슐린 결핍은 췌장의 섬세포에서의 부적합한 생산으로부터 발생한다. 사례들의 대부분에서 상기는 1형 또는 소아-발병 당뇨병으로서 공지된 상태인 상기 세포의 자가면역 파괴로부터 발생하지만, 또한 물리적 외상 또는 일부 다른 원인에 기인할 수도 있다.

당뇨병은 또한 근육 및 지방 세포가 인슐린에 덜 반응성으로 되고 글루코스를 적합하게 흡수하지 않아 고혈당증을 생성시킬 때 발생할 수 있다. 이러한 현상은 인슐린 내성으로서 공지되며, 생성되는 상태는 2형 당뇨병으로서 공지된다. 가장 흔한 형태인 2형 당뇨병은 비만 및 고혈압과 고도로 관련된다. 비만은 인슐린 내성의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 지방 조직의 염증성 상태와 관련된다(문헌들 [Hotamisligil, 2006]; [Guilherme et al., 2008]).

당뇨병은, 주로 고혈당증(및 저혈당증, 이들은 인슐린의 과도한 또는 불충분한 타이밍의 투여로부터 발생할 수 있다)이 산화 스트레스의 중요한 원인이므로, 다수의 조직들에 대한 손상과 관련있다. 특히 HO-1 발현의 유도에 의한 산화 스트레스에 대해 보호하는 능력으로 인해, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 당뇨병의 다수의 합병증의 치료에 사용할 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이(문헌[Cai et al., 2005]), 간에서 만성 염증 및 산화 스트레스는 2형 당뇨병의 발병에 1차적인 기여 인자인 것으로 의심된다. 더욱 또한, 티아졸리딘디온과 같은 PPAR_γ 작용물질은 인슐린 내성을 감소시킬 수 있으며 2형 당뇨병에 대한 유효 치료제인 것으로 공지되어 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 티아졸리딘디온과 같은 PPAR_γ 작용물질과의 복합 요법으로서 사용할 수 있다.

G. 관절염

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 관절염의 한 형태를 갖는 환자의 치료에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408 및 다형태로 치료될 수 있는 관절염의 형태들은 류마티스성 관절염(RA), 건선성 관절염(PsA), 강직성 척추염(AS)을 포함한 척추관절증(SpA), 반응성 관절염(ReA), 및 장병성 관절염(EA), 소아 류마티스성 관절염(JRA), 및 초기 염증성 관절염이다.

류마티스성 관절염의 경우, 첫 번째 징후는 전형적으로, 활액 섬유아세포의 증식 및 관절 주변의 관절 표면에의 그의 부착과 함께 활액 내층에서 나타난다(문헌[Lipsky, 1998]). 후속으로, 대식세포, T 세포 및 다른 염증 세포들이 상기 관절로 모이고, 여기에서 이들은 뼈 및 연골 파괴를 야기하는 만성적인 후유증에 기여하는 사이토킨 인터류킨-1(IL-1), 및 염증에서 한 역할을 하는 종양 괴사 인자(TNF-α)를 포함한 다수의 매개체들을 생산한다(문헌들 [Dinarello, 1998]; [Arend and Dayer, 1995]; [van den Berg, 2001]). 혈장 중 IL-1의 농도는 건강한 개인에서보다 RA 환자에서 현저하게 더 높으며, 현저하게, 혈장 IL-1 수준은 RA 질병 활성과 상관있다(문헌[Eastgate et al., 1988]). 더욱이, IL-1의 활액 수준은 RA의 다양한 방사선 사진 및 조직학적 특징들과 상관있다(문헌들 [Kahle et al., 1992; Rooney et al., 1990]).

다른 형태의 관절염은 관절염과 건선의 결합을 특징으로 하는 만성 염증성 관절병증인 건선성 관절염(PsA)이다. 연구들은 PsA가 강직성 척추염, 반응성 관절염 및 장병성 관절염을 포함하는 질병 그룹인 다른 척추관절증(SpA)과 다수의 유전적, 병원성 및 임상적 특징을 공유함을 밝혀냈다(문헌[Wright, 1979]). PsA가 상기 SpA 그룹에 속한다는 생각은 최근에, PsA에는 착부염이 만연하지만 RA에는 아님을 입증하는 영상화 연구로부터 추가적인 지지를 획득하였다(문헌들 [McGonagle et al., 1999]; [McGonagle et al., 1998]). 보다 구체적으로, 착부염은 상기 SpA에서 발생하는 가장 이른 사건들 중 하나로, 골 재형성 및 척주 중 교착뿐만 아니라, 염증이 발생한 착부가 말초 관절에 가까울 때는 관절 활막염을 야기하는 것으로 가정되었다. TNF-α의 증가된 양은 건선성 피부(문헌[Ettehadi et al., 1994]) 및 활액(문헌[Partsch et al., 1997])모두에서 보고되었다. 최근의 시험은 PsA(문헌[Mease et al., 2000]) 및 강직성 척추염(문헌[Brandt et al., 2000]) 모두에서 항-TNF 치료의 긍정적인 이점을 입증하였다.

아동에서 가장 만연한 형태의 관절염에 대한 용어인 소아 류마티스성 관절염(JRA)은 만성 염증 및 활액막의 비대를 특징으로 하는 질병군에 적용된다. 상기 용어는 유럽에서 소아 만성 관절염 및/또는 소아 특발성 관절염으로 지칭되는 질병군과 중복되지만, 완벽하게 동의어는 아니다.

다관절 JRA는 손의 작은 관절을 포함하여, 다수 관절(4 개 이상)의 염증 및 활액 증식을 특징으로 하는 별개의 임상적 하위유형이다(문헌[Jarvis, 2002]). 상기 JRA의 하위유형은 그의 다수의 관절 관련 및 시간에 따라 급속히 진행하는 그의 능력 모두로 인해, 중증일 수 있다. 임상적으로 별개이지만, 다관절 JRA는 동종이 아니고, 환자들은 질병 발현, 발병 연령, 예후, 및 치료 반응이 다양하다. 이러한 차이는 상기 질병에서 발생할 수 있는 면역 및 염증 발병의 성질에 있어서의 변동 범위를 매우 반영하는 듯하다(문헌[Jarvis, 1998]).

강직성 척추염(AS)은 척추관절증의 보다 넓은 질병 분류내에 있는 질병 부분집합이다. 척추관절증의 다양한 부분집합들에 걸린 환자들은 종종, 세균성 감염에서부터 유전성에 이르는 범위의 매우 상이한 질병 원인을 갖는다. 그러나, 모든 하위그룹들에서, 상기 질병 과정의 최종 결과는 축 관절염이다.

AS는 골격외 발현이 있거나 없는 축 골격의 만성적인 전신 염증성 류마티스성 질환이다. 천장관절 및 척주가 주로 병들지만, 고관절 및 어깨 관절, 및 덜 통상적으로는 말초 관절 또는 몇몇 관절외 구조, 예를 들어 눈, 맥관구조, 신경계, 및 위장계가 또한 연루될 수도 있다. 상기 질병의 원인은 아직 충분히 이해되고 있지 않다(문헌들 [Wordsworth, 1995]; [Calin and Taurog, 1998]). 상기 원인은 주 조직적합성 부류 I(MHC I) HLA-B27 대립유전자와 강한 관련이 있다(문헌[Calin and Taurog, 1998]). AS는 삶의 전성기에서 개인을 침범하며, 만성적인 통증과 힘줄, 인대, 관절 및 뼈의 비가역적인 손상을 일으킬 가능성으로 인해 공포의 대상이다(문헌들 [Brewerton et al., 1973a]; [Brewerton et al., 1973b]; [Schlosstein et al., 1973]).

H. 궤양성 대장염

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 궤양성 대장염 환자의 치료에 사용할 수 있다. 궤양성 대장염은 대장의 내층에서, 염증 및 궤양이라 칭하는 종기를 유발하는 질병이다. 상기 염증은 대개 직장 및 결장의 하부에서 발생하지만, 전체 결장을 침범할 수도 있다. 궤양성 대장염을 또한 결장염 또는 직장염이라 칭할 수도 있다. 상기 염증은 상기 결장을 빈번히 비워, 설사를 유발한다. 상기 염증이 결장 내층의 세포를 죽인 장소에 궤양이 형성되며 상기 궤양은 출혈하고 고름을 생성시킨다.

궤양성 대장염은, 소장 및 결장에서 염증을 유발시키는 질병에 대한 일반명인 염증성 장 질병(IBD)이다. 궤양성 대장염은 그의 증상이 다른 장 질환 및 또 다른 유형의 IBD, 크론병과 유사하기 때문에 진단이 어려울 수 있다. 크론병은 내장벽 내의 보다 심부에서 염증을 유발시키기 때문에 궤양성 대장염과 다르다. 또한, 크론병은 대개 소장에서 발생하지만, 상기 질병은 또한 구강, 식도, 위, 십이지장, 대장, 맹장 및 항문에서도 발생할 수 있다.

I. 크론병

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 크론병 환자의 치료에 사용할 수 있다. 크론병 증상은 장 염증 및 장 협착 및 누공의 발생을 포함하며; 신경병증이 종종 이러한 증상들을 동반한다. 소염 약물, 예를 들어 5-아미노살리실레이트(예를 들어 메살라민) 또는 코르티코스테로이드가 전형적으로 처방되지만, 이들이 항상 유효한 것은 아니다(문헌[Botoman et al., 1998]에 재고찰되어 있다). 사이클로스포린에 의한 면역억제가 때때로 코르티코스테로이드에 내성이거나 불관용인 환자에게 이롭다(문헌[Brynskov et al., 1989]).

활성 크론병의 사례에서, 상승된 농도의 TNF-α 및 IL-6가 혈액 순환내로 분비되고, TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-8이 점막 세포에 의해 국소적으로 과잉 생산된다(id.; Funakoshi et al., 1998). 이들 사이토킨은 골 발육, 조혈, 및 간, 갑상선 및 신경정신 작용을 포함한 생리학적 시스템들에 대해 광범위한 효과를 미칠 수 있다. 또한, 염증전 IL-1β에 치우친, IL-1β/IL-1ra 비의 불균형이 크론병 환자에서 관찰되었다(문헌들 [Rogler and Andus, 1998]; [Saiki et al., 1998]; [Dionne et al., 1998]; [Kuboyama, 1998]을 참조하시오).

크론병에 제안된 치료는 다양한 사이토킨 길항물질(예를 들어 IL-1ra), 억제제(예를 들어 효소 및 산화방지제를 전환시키는 IL-1β의) 및 항-사이토킨 항체(문헌들 [Rogler and Andus, 1998]; [van Hogezand and Verspaget, 1998]; [Reimund et al., 1998]; [Lugering et al., 1998]; [McAlindon et al., 1998])의 사용을 포함한다. 특히, TNF-α에 대한 단클론 항체가 크론병의 치료에 약간의 성공과 함께 시도되었다(문헌들 [Targan et al., 1997]; [Stack et al., 1997]; [van Dullemen et al., 1995]). 이들 화합물을 본 명세의 RTA 408, 다형태 및 방법과의 복합 요법에 사용할 수 있다.

J. 전신 홍반성 루푸스

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 SLE 환자의 치료에 사용할 수 있다. 전신 홍반성 루푸스(SLE)는 조직 손상에 이르는 자가항체 및 면역 복합체의 조직중 침착을 특징으로 하는 자가면역 류마티스성 질병이다(문헌[Kotzin, 1996]). 자가면역 질병, 예를 들어 MS 및 1형 당뇨병과 대조적으로, SLE는 다수의 기관계를 잠재적으로 직접 포함하며, 그의 임상적 발현은 다양하고 가변적이다(문헌[Kotzin and O'Dell, 1995]에 재고찰되어 있다). 예를 들어, 일부 환자는 주로 피부 발진 및 관절통을 나타낼 수 있으며, 자발적인 완화를 보이고, 약물치료를 거의 필요로 하지 않는다. 상기 스펙트럼의 다른 끝에는 고용량의 스테로이드 및 세포독성 약물, 예를 들어 사이클로포스파미드에 의한 치료를 필요로 하는 중증의 진행성 신장 연루를 나타내는 환자들이 있다(문헌[Kotzin, 1996]).

SLE에 의해 생산된 항체들 중 하나인, IgG 항-dsDNA는 루푸스 사구체신염(GN)의 발병에 중요한 역할을 한다(문헌들 [Hahn and Tsao, 1993]; [Ohnishi et al., 1994]). 사구체신염은 신장의 혈액 정제 사구체의 모세관벽이 사구체 기저막의 상피면상에서 유착에 의해 두껍게되는 중증 상태이다. 상기 질병은 종종 만성적이고 진행성이며 결국에는 신부전을 야기할 수도 있다.

K. 과민성 장 증후군

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 과민성 장 증후군(IBS) 환자의 치료에 사용할 수 있다. IBS는 복부 통증 및 변경된 장 체질을 특징으로 하는 기능성 질환이다. 상기 증후군은 청년기에서 시작될 수 있으며 현저한 장애와 관련될 수 있다. 상기 증후군은 동종 질환이 아니다. 오히려, IBS의 하위유형들이 우세한 증상--설사, 변비 또는 통증을 기준으로 개시되었다. "경고" 증상, 예를 들어 발열, 체중 감소, 및 위장 출혈의 부재 하에서, 제한된 정밀검사가 필요하다.

점점 더, IBS의 기원에 대한 증거는 감염성 장염과 후속 IBS의 발병간의 관계를 암시하고 있다. 염증성 사이토킨이 한 역할을 할 수 있다. 확인된 세균성 위장염의 병력을 갖는 환자의 표본 조사(문헌[Neal et al., 1997])에서, 25%가 장 체질의 지속적인 변경을 보고하였다. 증상의 지속은 급성 감염시의 정신적인 스트레스에 기인할 수도 있다(문헌[Gwee et al., 1999]).

최근의 데이터는 소장에서의 세균 이상증식이 또한 IBS 증상에 한 역할을 가질 수 있음을 암시한다. 하나의 연구(문헌[Pimentel et al., 2000])에서, 수소 호기 시험이 의뢰된 202명 환자 중 157 명(78%)이 세균 이상증식에 대해 양성인 시험 결과를 가졌다. 추적 시험된 47 명의 피실험자 중, 25 명(53%)이 항생제 치료와 함께 증상(즉 복부 통증 및 설사)의 개선을 보고하였다.

L. 쇼그렌 증후군

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 쇼그렌 증후군 환자의 치료에 사용할 수 있다. 원발성 쇼그렌 증후군(SS)은 만성적이고, 느리게 진행하는 전신 자가면역 질병이며, 우세하게는 중년 여성들(여성 대 남성 비 9:1)이 걸리지만, 아동을 포함한 전 연령에서 볼 수 있다(문헌[Jonsson et al., 2002]). 상기 질병은 림프구 침윤 및 외분비선의 파괴를 특징으로 하며, CD4+, CD8+ 림프구, 및 B-세포를 포함한 단핵 세포에 의해 침윤된다(문헌[Jonsson et al., 2002]). 또한, 선외(전신) 발현이 환자의 1/3에서 나타난다(문헌[Jonsson et al., 2001]).

다른 전신 자가면역 질병, 예를 들어 RA에서, 이소성 배 중심(GC)에 중요한 인자가 확인되었다. GC를 갖는 류마티스성 활액 조직은 CXCL13, CCL21 및 림프독소(LT)-β(소낭 중심 및 맨틀 대역 B 세포상에서 검출됨)를 생산하는 것으로 나타났다. 이들 분석물의 다변량 회귀 분석은 CXCL13 및 LT-β를 류마티스성 활막염에서 GC를 예견하는 고립 사이토킨으로서 동정하였다(문헌[Weyand and Goronzy, 2003]). 최근에 침샘 중 CXCL13 및 CXCR5가 B 및 T 세포를 모집함으로써 염증 과정에 필수적인 역할을 하고, 따라서 SS에서 림프구 신생 및 이소성 GC 형성에 기여하는 것으로 나타났다(문헌[Salomonsson et al., 2002]).

M. 건선

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법을 건선 환자의 치료에 사용할 수 있다. 건선은 미국 인구의 2 내지 2.6% 또는 580만 내지 750만명이 걸리는 스케일링 및 염증의 만성적인 피부병이다. 건선은 피부세포가 그의 기원으로부터 상기 피부의 표면 아래에서 급속하게 성장하여 성숙할 기회를 갖기 전에 상기 표면 상에 쌓일 때 발생한다. 대개 이러한 생장(또한 턴오버라 칭한다)은 대략 1 개월이 걸리지만, 건선에서 턴오버는 단지 수일안에 발생할 수 있다. 건선은 전형적인 형태에서, 은비늘로 덮인 두껍고, 붉은(염증이 발생한) 피부의 패치들을 생성시킨다. 이러한 패치(때때로 반이라 지칭된다)는 대개 가렵거나 따갑게 느껴진다. 상기 반은 대부분 종종 팔꿈치, 무릎, 다리의 다른 부분, 두피, 등허리, 얼굴, 손바닥 및 발바닥에서 발생하지만, 신체상의 어느 피부에서나 발생할 수 있다. 상기 질병은 또한 손톱, 발톱 및 생식기의 연조직 및 구강 안쪽을 침범할 수도 있다.

건선은, 특히 T 세포라 칭하는 한 유형의 백혈구 세포를 수반하는 면역계에 의해 구동되는 피부 질환이다. 통상적으로, T 세포는 신체를 감염 및 질병에 대해 보호하는데 일조한다. 건선의 경우에, T 세포는 잘못 행동하여 너무 활성적으로 되어 다른 면역 반응들을 촉발하며, 이는 염증 및 피부세포의 급속한 턴오버를 야기한다.

N. 감염성 질병

일부 실시태양에서, 본 발명의 RTA 408, 다형태 및 방법은 바이러스 및 세균 감염을 포함한 감염성 질병의 치료에 유용할 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 감염은 중증의 국소 또는 전신 염증 반응과 관련될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자는 폐의 중증 염증을 야기할 수 있으며 세균성 감염은 다수의 염증성 사이토킨의 과잉 생산(패혈증의 특징이다)을 포함한, 전신 고염증 반응을 야기할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 바이러스성 병원체의 복제를 직접 억제하는데 유용할 수 있다. 선행의 연구들은 관련 화합물, 예를 들어 CDDO가 대식세포에서 HIV의 복제를 억제할 수 있음을 입증하였다(문헌[Vazquez et al., 2005]). 다른 연구들은 NF-κB 신호전달의 억제가 인플루엔자 바이러스 복제를 억제할 수 있고, 사이클로펜테논 프로스타글란딘이 바이러스 복제를 억제할 수 있음을 지적하였다(예를 들어 문헌들 [Mazur et al., 2007]; [Pica et al., 2000]).

본 발명은 화합물 RTA 408 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 상기 화합물의 다형태(예를 들어 상기 또는 하기에서 본 발명에 개시된 다형태들 중 어느 하나), 또는 상기 언급한 존재들 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물(예를 들어 상술한 약학 조성물 포함)을 사용하는, 상기 섹션 IV에 언급된 질병/질환/상태들 각각의 치료 또는 예방에 관한 것이다.

V. 약학 제형 및 투여 경로

RTA 408을 다양한 방법들에 의해서, 예를 들어 경구로 또는 주사(예를 들어 피하, 정맥내, 복강내 등)에 의해서 투여할 수 있다. 투여 경로에 따라, 상기 활성 화합물을, 상기 화합물을 불활성화할 수도 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다. 상기 화합물을 또한 질병 또는 상처 부위의 연속적인 관류/주입에 의해 투여할 수 있다.

비경구 투여외의 투여에 의해 RTA 408을 투여하기 위해서, 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 또는 상기 물질과 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 상기 치료 화합물을 적합한 담체, 예를 들어 리포솜 또는 희석제 중에서 환자에게 투여할 수도 있다. 약학적으로 허용 가능한 희석제는 염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 리포솜은 수중-유중-수적형 CGF 유화액뿐만 아니라 통상적인 리포솜을 포함한다(문헌[Strejan et al., 1984]).

RTA 408을 또한 비경구로, 복강내로, 척수내로, 또는 대뇌내로 투여할 수 있다. 분산액을 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 생육을 방지하기 위해서 보존제를 함유할 수도 있다.

멸균 주사성 용액을, RTA 408을 적합한 용매 중에, 필요시, 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 상기 성분들의 조합과 함께 필요한 양으로 혼입시킨 다음 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액을, 상기 치료 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 나열된 것들 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 담체에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사성 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 상기는 활성 성분(즉 치료 화합물)에 더하여 그의 앞서 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공한다.

RTA 408을 직접 분무 건조 과정을 사용하여 완전히 비결정성으로 만들 수 있다. RTA 408을, 예를 들어 불활성 희석제 또는 융합성 식용 담체와 함께 경구 투여할 수 있다. 상기 치료 화합물 및 다른 성분들을 또한 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐로 둘러싸거나, 정제로 압착시키거나, 또는 환자의 식사에 직접 혼입시킬 수도 있다. 경구 치료제 투여를 위해서, 상기 치료 화합물을, 예를 들어 부형제와 함께 혼입하고 삼킬 수 있는 정제, 구강정, 트로키제, 경질 또는 연질 캡슐을 포함하는 캡슐, 엘릭서, 유화액, 고체 분산액, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용할 수 있다. 상기 조성물 및 제제 중의 상기 치료 화합물의 백분율은 물론 다양할 수 있다. 상기와 같은 치료학적으로 유용한 조성물 중의 상기 치료 화합물의 양은 적합한 투여량이 획득되도록 하는 양이다.

비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 발명에 사용된 바와 같은 단위 투여형은 치료하려는 환자에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 소정량의 치료 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여형의 명세서는 (a) 상기 치료 화합물의 독특한 특성 및 성취하려는 특정 치료 효과, 및 (b) 환자에서 선택된 상태의 치료를 위한 상기와 같은 치료 화합물의 배합 분야에 고유한 제한에 의해 지시되고 직접적으로 이에 의존한다.

RTA 408을 또한 피부, 눈 또는 점막에 국소적으로 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 화합물을 로션, 크림, 젤, 오일, 연고, 고약, 용액, 현탁액 또는 유화액으로 제조할 수 있다. 한편으로, 폐로의 국소 전달을 원하는 경우, 상기 치료 화합물을 건조-분말 또는 에어로졸 제형 중에서 흡입에 의해 투여할 수도 있다.

RTA 408을 전형적으로는 주어진 환자와 관련된 상태의 치료에 충분한 치료 유효 투여량으로 투여할 것이다. 예를 들어, 화합물의 효능을, 인간에서 질병의 치료에 대한 효능을 예측할 수 있는 동물 모델 시스템, 예를 들어 실시예 및 도면에 나타낸 모델 시스템에서 평가할 수 있다.

환자에게 투여되는 RTA 408 또는 RTA 408을 포함하는 조성물의 실제 투여량을 물리적 및 생리학적 인자, 예를 들어 연령, 성별, 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질병의 유형, 선행 또는 동반되는 치료학적 중재, 환자의 특발증, 및 투여 경로에 의해 결정할 수 있다. 이들 인자는 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 투여를 맡고 있는 의사는 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 개별적인 환자에 적합한 용량(들)을 전형적으로 결정할 것이다. 상기 투여량은 임의의 합병증의 경우에 주치의에 의해 조절될 수도 있다.

유효량은 전형적으로 하루 또는 수일 동안(상기 논의된 투여 방식의 과정 및 인자들에 따라), 매일 하나 이상의 용량 투여에서 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 1000 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 750 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 500 ㎎/㎏, 약 1.0 ㎎/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏, 약 10.0 ㎎/㎏ 내지 약 150 ㎎/㎏로 다양할 것이다. 다른 적합한 용량 범위는 하루에 1 ㎎ 내지 10000 ㎎, 하루에 100 ㎎ 내지 10000 ㎎, 하루에 500 ㎎ 내지 10000 ㎎, 및 하루에 500 ㎎ 내지 1000 ㎎을 포함한다. 일부 특정한 실시태양에서, 상기 량은 하루에 750 ㎎ 내지 9000 ㎎의 범위로 하루에 10,000 ㎎ 미만이다.

상기 유효량은 1 ㎎/㎏/일 미만, 500 ㎎/㎏/일 미만, 250 ㎎/㎏/일 미만, 100 ㎎/㎏/일 미만, 50 ㎎/㎏/일 미만, 25 ㎎/㎏/일 미만, 또는 10 ㎎/㎏/일 미만일 수 있다. 한편으로, 상기는 1 ㎎/㎏/일 내지 200 ㎎/㎏/일의 범위에 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 량은 하기 실시예 C1에 개시된 바와 같이 참깨 오일 중 현탁액으로서 제형화된 10, 30, 100 또는 150 ㎎/㎏일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 량은 하기 실시예 C2 및 C3에 개시된 바와 같이 경구 위관영양을 통해서 매일 3, 10, 30 또는 100 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 량은 하기 실시예 C6에 개시된 바와 같이 경구에 의해 10, 30 또는 100 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병 환자의 치료에 관하여, 상기 단위 투여량은 치료되지 않은 환자에 비해 혈당을 40% 이상까지 감소시키는 양일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 단위 투여량은 혈당을 비-당뇨병 환자의 혈당 수준의 ±10%인 수준으로 감소시키는 양이다.

다른 비제한적인 실시예에서, 하나의 용량은 또한 투여당 약 1 ㎍/㎏ 체중, 약 5 ㎍/㎏ 체중, 약 10 ㎍/㎏ 체중, 약 50 ㎍/㎏ 체중, 약 100 ㎍/㎏ 체중, 약 200 ㎍/㎏ 체중, 약 350 ㎍/㎏ 체중, 약 500 ㎍/㎏ 체중, 약 1 ㎎/㎏ 체중, 약 5 ㎎/㎏ 체중, 약 10 ㎎/㎏ 체중, 약 50 ㎎/㎏ 체중, 약 100 ㎎/㎏ 체중, 약 200 ㎎/㎏ 체중, 약 350 ㎎/㎏ 체중, 약 500 ㎎/㎏ 체중, 내지 약 1000 ㎎/㎏ 체중 이상, 및 이중에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본 발명에 나열된 숫자들로부터 유도될 수 있는 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 ㎎/㎏ 체중 내지 약 100 ㎎/㎏ 체중, 약 5 ㎍/㎏ 체중 내지 약 500 ㎎/㎏ 체중 등의 범위를 상술한 숫자들을 기준으로 투여할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 명세의 약학 조성물은 예를 들어 약 0.01% 이상의 RTA 408을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, RTA 408은 상기 단위의 중량의 약 0.01% 내지 약 75%, 또는 예를 들어 약 0.01% 내지 약 5%, 및 이 중에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, RTA 408은 참깨 오일 중의 현탁액과 같은 제형 중에 하기 실시예 F 및 G에 개시된 바와 같이 0.01%, 0.1% 또는 1%로 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, RTA 408을 약 0.01% 내지 10% 범위의 농도로, 약학적으로 적합한 담체를 사용하여 또는 현탁액, 유화액 또는 용액으로서 피부 또는 눈에 국소 투여하기 위해서 제형화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 농도 범위는 약 0.1% 내지 약 5%이다. 최적 농도는 표적 기관, 특정 제제, 및 치료하려는 상태에 따라 변할 수 있다.

RTA 408을 포함하는 작용제의 단일 또는 수회 용량이 고려된다. 수회 용량의 전달에 바람직한 시간 간격은 단지 통상적인 실험을 사용하여 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 일례로서, 환자들에게 대략 12 시간 간격으로 매일 2 회 용량을 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 작용제를 하루에 한 번 투여한다. 상기 작용제(들)를 통상적인 스케줄로 투여할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 통상적인 스케줄은 소정의 지정된 시간 기간을 지칭한다. 상기 통상적인 스케줄은, 상기 스케줄이 미리정해지는 한, 길이가 동일하거나 상이한 시간의 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 통상적인 스케줄은 하루에 2 회, 매일, 이틀마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 매달, 또는 이들 사이의 임의의 일수 또는 주수의 조합으로 투여함을 포함할 수 있다. 한편으로, 상기 예정된 통상적인 스케줄은 첫주 동안 매일 2 회, 이어서 수 개월 동안 매일 등으로 투여함을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 작용제(들)를 경구로 복용할 수 있으며 그의 타이밍은 음식물 섭취에 의존하거나 의존하지 않음을 제공한다. 따라서, 예를 들어 상기 작용제를, 환자가 식사를 한 때나 할 때에 관계 없이, 매일 아침 및/또는 매일 저녁에 복용할 수 있다.

VI . 복합 요법

단독요법으로 사용되는 것 외에, 본 발명에 개시된 RTA 408 및 다형태를 또한 복합 요법에 사용할 수 있다. 유효 복합 요법은 상기 두 작용제 모두를 포함하는 단일 조성물 또는 약물학적 제형, 또는 동시에 투여되는 2 개의 별도의 조성물 또는 제형(여기에서 하나의 조성물은 RTA 408 또는 그의 다형태를 포함하고, 다른 것은 제 2 작용제(들)를 포함한다)으로 성취될 수 있다. 다른 치료학적 양상은 RTA 408 또는 그의 다형태의 투여 전, 투여와 동시 또는 투여에 이어서 투여될 수 있다. RTA 408 또는 그의 다형태를 사용하는 요법은 수분 내지 수주 범위의 간격에 의해 다른 작용제(들)의 투여에 선행하거나 투여 후에 수행될 수 있다. 상기 다른 작용제 및 RTA 408 또는 그의 다형태를 별도로 투여하는 실시태양에서, 각각의 작용제가 여전히 유리하게 결합된 효과를 발휘할 수 있도록, 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 상당한 시간의 기간이 소멸되지 않게 할 것이다. 상기와 같은 경우에, 전형적으로는 RTA 408 또는 다형태 및 다른 치료제를 서로 약 12 내지 14 시간 이내에, 및 보다 바람직하게는 서로 약 6 내지 12 시간 이내에 투여할 것이 고려되며, 이때 단지 약 12 시간의 지연 시간이 가장 바람직하다. 그러나, 일부 상황에서, 상기 치료를 위한 시간 간격을 현저하게, 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과하도록 연장시키는 것이 바람직할 수도 있다.

또한, RTA 408 또는 그의 다형태, 또는 다른 작용제의 1 회 초과 투여가 바람직할 것으로 생각할 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 조합들을 사용할 수 있다. 예시로서, RTA 408 또는 그의 다형태가 "A"이고 다른 작용제가 "B"인 경우, 3 및 4 회의 총 투여를 기준으로 하기의 순열들이 예시된다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

다른 조합들도 마찬가지로 고려된다. 본 발명에 사용될 수 있는 약제들의 비제한적인 예는 암의 치료에 이로운 것으로 공지된 임의의 약제를 포함한다. 일부 실시태양에서, RTA 408 또는 그의 다형태와, 암 표적화 면역요법, 유전자 요법, 방사선 요법, 화학요법제, 또는 수술과의 조합이 고려된다. 또한 RTA 408 또는 그의 다형태와 하나 보다 많은 특수 요법을 포함한 상기 언급한 방법들 중 하나보다 많은 방법과의 조합이 고려된다. 일부 실시태양에서, 상기 면역요법은 다른 암 표적화 항체, 예를 들어 비제한적으로 트라스투주맵(허셉틴(Herceptin)(등록상표)), 알렘투주맵(캄패쓰(Campath)(등록상표)), 베바시주맵(아바스틴(Avastin)(등록상표)), 세툭시맵(에리비툭스(Eribitux)(등록상표)), 및 파니투뮤맵(벡티빅스(Vectibix)(등록상표)) 또는 접합(conjugated) 항체, 예를 들어 이브리투모맵 티욱세탄(제발린(Zevalin)(등록상표)), 토시투모맵(벡사(Bexxar)(등록상표)), 브렌툭시맵 베도틴(애드세트리스(Adcetris)(등록상표)), 아도-트라스투주맵 엠탄신(카드실라(Kadcyla)(상표)), 또는 데닐류킨 디티톡스(온탁(Ontak)(등록상표))일 수 있다. 더욱 또한, 일부 실시태양에서, RTA 408 또는 그의 다형태는 수지상 세포-기재 면역요법, 예를 들어 시풀류셀-T(프로벤지(Provenge)(등록상표)) 또는 양자 T-세포 면역요법과의 복합 요법에 사용이 고려된다.

더욱 또한, RTA 408 또는 그의 다형태를 화학요법제, 예를 들어 비제한적으로 안트라사이클린, 탁산, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 에스트라머스틴, 독소루비신, 에토포시드, 빈블라스틴, 카보플라틴, 비노렐빈, 5-플루오로유라실, 시스플라틴, 토포테칸, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 에피루비신, 젬시타빈, 비노렐빈, 이리노테칸, 에토포시드, 빈블라스틴, 페메트렉시드, 멜팔란, 카페시타빈, 및 옥살리플라틴과 함께 사용하는 것이 고려된다. 일부 실시태양에서, RTA 408 또는 그의 다형태를 방사선 요법, 예를 들어 비제한적으로 이온화 방사선의 사용과 함께 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 암 치료제의 효과는 RTA 408 및 그의 다형태와의 투여를 통해서 상승적으로 증대된다. 일부 실시태양에서, RTA 408을 포함하는 복합 요법을 사용하여, 예를 들어 전립선암을 포함한 암을 치료한다. 예를 들어 하기 실시예 H를 참조하시오.

일부 실시태양에서, 상기 방법은 (1) 종양 세포를 상기 화합물과 접촉시킨 후에 상기 종양 세포를 제 2 화학요법제와 접촉시키거나, (2) 종양 세포를 상기 제 2 화학요법제와 접촉시킨 후에 상기 종양 세포를 상기 화합물과 접촉시키거나, 또는 (3) 종양 세포를 상기 화합물 및 상기 제 2 화학요법제와 동시에 접촉시킴을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제 2 화학요법제는 몇몇 실시태양에서, 항생제, 소염제, 신생물 억제제, 증식 억제제, 항바이러스제, 면역조절제, 또는 면역억제제일 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 제 2 화학요법제는 알킬화제, 안드로젠 수용체 조절제, 세포골격 붕괴제, 에스트로젠 수용체 조절제, 히스톤-데아세틸라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 레티노이드 수용체 조절제, 국소이성화 효소 억제제, 또는 타이로신 키나제 억제제일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제 2 약물은 5-아자시티딘, 5-플루오로유라실, 9-시스-레티노산, 액티노마이신 D, 알리트레티노인, 모든-트랜스-레티노산, 안나마이신, 악시티니브, 벨리노스태트, 베바시주맵, 벡사로텐, 보수티니브, 부설판, 카페시타빈, 카보플라틴, 카머스틴, CD437, 세디라니브, 세툭시맵, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카바진, 다사티니브, 다우노루비신, 데시타빈, 도세탁셀, 돌라스타틴-10, 독시플루리딘, 독소루비신, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티니브, 에토포시드, 제피티니브, 젬시타빈, 젬투주맵 오조가미신, 헥사메틸멜라민, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브, 이리노테칸, 아이소트레티노인, 익사베필론, 라파티니브, LBH589, 로머스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, MS-275, 네라티니브, 닐로티니브, 니트로소유레아, 옥살리플라틴, 패클리탁셀, 플리카마이신, 프로카바진, 세막사니브, 세머스틴, 나트륨 부티레이트, 나트륨 페닐아세테이트, 스트렙토조토신, 수베로일아닐리드 하이드록삼산, 수니티니브, 타목시펜, 테니포시드, 티오페타, 티오구아닌, 토포테칸, TRAIL, 트라스투주맵, 트레티노인, 트리코스타틴 A, 발프로산, 발루비신, 반데타니브, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 또는 비노렐빈이다.

추가로, 본 명세의 RTA 408, 다형태 및 약학 조성물을 사용하는 심혈관 질병의 치료를 위한 복합 요법이 고려된다. 예를 들어, 상기와 같은 방법은 본 명세의 RTA 408, 다형태 및 약학 조성물 외에, 약학적으로 유효한 양의 하나 이상의 심혈관 약물을 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 심혈관 약물은 비제한적으로, 예를 들어 콜레스테롤 강하 약물, 고지질혈증 치료제, 칼슘 채널 차단제, 고혈압 치료제, 또는 HMG-CoA 리덕타제 억제제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 심혈관 약물의 비제한적인 예는 암로디핀, 아스피린, 에제티미베, 펠로디핀, 라시디핀, 레르카니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 니모디핀, 니솔디핀 또는 니트렌디핀을 포함한다. 다른 실시태양에서, 심혈관 약물의 다른 비제한적인 예는 아테놀롤, 부신돌롤, 카르베딜롤, 클로니딘, 독사조신, 인도라민, 라베탈롤, 메틸도파, 메토프롤롤, 나돌롤, 옥스프레놀롤, 페녹시벤자민, 펜톨아민, 핀돌롤, 프라조신, 프로프라놀롤, 테라조신, 티몰롤 또는 톨라졸린을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 심혈관 약물은 예를 들어 스타틴, 예를 들어 아토바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴 또는 심바스타틴일 수 있다.

VII . 실시예

하기의 실시예들을 본 발명의 바람직한 실시태양을 설명하기 위해 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은, 하기 실시예들에 개시된 기법들이 본 발명자에 의해 본 발명의 실시에서 잘 작용하는 것으로 발견된 기법들을 나타내며, 따라서 그의 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알아야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본 명세에 비추어, 다수의 변화들을 개시된 특정 실시태양에서 수행할 수 있고 이들이 여전히 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 같거나 유사한 결과가 획득될 수 있음을 알아야 한다.

A. RTA 408(63415)의 합성

시약 및 조건: (a) (PhO)₂PON₃(DPPA), Et₃N, 톨루엔, 0 ℃ 5 분, 이어서 실온에서 밤새, ~94%; (b) 벤젠, 80 ℃ 2 시간; (c) HCl, CH₃CN, 실온에서 1 시간; (d) CH₃CF₂CO₂H, DCC, DMAP, CH₂Cl₂, 실온에서 밤새, RTA 401로부터 73%(4 단계).

화합물 1: 톨루엔(400 ㎖)의 용액에, RTA 401(예를 들어 문헌들 [Honda, et al., 1998]; [Honda et al., 2000b]; [Honda et al., 2002]; [Yates et al., 2007]; 및 미국 특허 제 6,326,507 호 및 제 6,974,801 호(이들은 본 발명에 참고로 인용된다)에 교시된 방법들에 따라 제조될 수 있다)(20.0 g, 40.6 mmol) 및 Et₃N(17.0 ㎖, 122.0 mmol)을 반응기에서 가하고, 교반하면서 0 ℃로 냉각시켰다. 다이페닐 포스포릴 아지드(DPPA)(13.2 ㎖, 61.0 mmol)를 0 ℃에서 5 분에 걸쳐 교반하면서 가하고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 계속 교반하였다(HPLC-MS 검사는 RTA 401이 남아있지 않음을 보인다). 상기 반응 혼합물을 실리카젤 컬럼상에 직접 로딩하고 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜(실리카젤, CH₂Cl₂ 중의 0%에서 5% EtOAc) 백색 폼으로서 화합물 1(19.7 g, ∼94%, 화합물 2로 부분적으로 전환됨)을 제공하였다.

화합물 2: 화합물 1(19.7 g, ∼38.1 mmol) 및 벤젠(250 ㎖)을 반응기에 가하고 2 시간 동안 교반하면서 80 ℃로 가열하였다(HPLC-MS 검사는 화합물 1이 남아있지 않음을 보인다). 상기 반응 혼합물을 감압에서 농축시켜 고체 잔사로서 조 화합물 2를 제공하고, 이를 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

화합물 3: 조 화합물 2(≤38.1 mmol) 및 CH₃CN(200 ㎖)을 반응기에 가하고 교반하면서 0 ℃로 냉각시켰다. HCl(12 N, 90 ㎖)을 0 ℃에서 1 분에 걸쳐 가하고 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 연속적으로 교반하였다(HPLC-MS 검사는 화합물 2가 남아있지 않음을 보인다). 상기 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고 10% NaOH(∼500 ㎖)를 교반하면서 가하였다. 이어서, 포화된 NaHCO₃(1 L)를 교반하면서 가하였다. 상기 수성상을 EtOAc(2 x 500 ㎖)에 의해 추출하였다. 합한 유기상을 H₂O(200 ㎖), 포화된 NaCl(200 ㎖)에 의해 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 밝은 황색 폼으로서 조 화합물 3(16.62 g)을 제공하고, 이를 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

RTA 408: 조 아민 3(16.62 g, 35.9 mmol), CH₃CF₂CO₂H(4.7388 g, 43.1 mmol), 및 CH₂Cl₂(360 ㎖)를 실온에서 교반하면서 반응기에 가하였다. 이어서, 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC)(11.129 g, 53.9 mmol) 및 4-(다이메틸아미노)-피리딘(DMAP)(1.65 g, 13.64 mmol)을 가하고 상기 혼합물을 실온에서 밤새 계속해서 교반하였다(HPLC-MS 검사는 화합물 3이 남아있지 않음을 보인다). 상기 반응 혼합물을 여과하여 고체 부산물을 제거하고 여액을 실리카젤 컬럼상에 직접 로딩하고 컬럼 크로마토그래피(실리카젤, 헥산 중 0%에서 20% EtOAc)에 의해 2 회 정제시켜 화합물 RTA 408(16.347 g, RTA 401로부터 4 단계에 걸쳐 73%)을 백색 폼으로서 제공하였다: ¹H NMR (400 MHz, CD3Cl) δ 8.04 (s, 1H), 6.00 (s, 1H), 5.94 (s, br, 1H), 3.01 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 2.75-2.82 (m, 1H), 1.92-2.18 (m, 4H), 1.69-1.85 (m, 7H), 1.53-1.64 (m, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.50 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.11-1.38 (m, 3H), 1.27 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 0.92 (s, 3H); m/z 555 (M+1).

B. 약역학

RTA 408의 주요 약역학 효과를 평가하기 위한 시험관내 및 생체내 연구의 요약을 하기에 제공한다.

1. 시험관내에서 Keap1 - Nrf2 및 NF -κB에 대한 RTA 408의 효과

AIM에 의한 IFNγ-유도된 NO 생산의 억제는 Nrf2-의존적이다(문헌[Dinkova Kostova, 2005]). RAW264.7 마우스 대식세포를, 0.5% FBS가 보충된 RPMI 1640에서 30,000 세포/웰로 3 회 중복하여 96-웰 플레이트에 도말하고 37 ℃에서 5% CO₂와 함께 배양하였다. 다음날, 세포를 DMSO(비히클) 또는 RTA 408로 2 시간 동안 전처리한 다음, 20 ng/㎖의 마우스 IFNγ로 24 시간 동안 처리하였다. 배지 중 나이트라이트(NO₂ ^-) 수준을, 나이트라이트가 NO의 1차적인 안정한 분해 산물이므로, 제조사의 설명에 따라 그리스(Griess) 시약 시스템(카탈로그 #G2930, 프로메가(Promega))을 사용하여 산화 질소에 대한 대용물로서 측정하였다. 세포 생육성을 제조사의 설명에 따라 WST-1 세포 증식 시약(카탈로그 #11644807001, 롯슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))을 사용하여 평가하였다. IC₅₀ 값을 세포 생육성에 대해 표준화된 IFNγ-유도된 산화 질소 생산의 억제를 근거로 측정하였다. RTA 408에 의한 처리는 IFNγ-유도된 NO 생산을 용량-의존적으로 억제시켰으며, 이때 평균 IC₅₀ 값은 3.8 ± 1.2 nM이었다. 전형적인 실험으로부터의 결과를 도 1에 나타낸다. RTA 408에 대한 IC₅₀ 값은 화합물 63170(8 ± 3 nM), 63171(6.9 ± 0.6 nM), 63179(11 ± 2 nm), 및 63189(7 ± 2 nM)에 대한 IC₅₀ 값들보다 45% 내지 65% 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 63170, 63171, 63179 및 63189는 하기 화학식들의 화합물들이다:

2. Nrf2 표적 유전자에 대한 RTA 408의 효과

RTA 408을 ARE의 활성화를 평가하기 위해서 2 개의 상이한 루시페라제 리포터 분석에서 시험하였다. 시험된 첫 번째 루시페라제 리포터는 인간 NQO1 유전자의 프로모터로부터 유도된 단일 ARE의 조절 하에 있었으며, 이는 배양된 포유동물 세포에서 Nrf2 전사 인자의 내생 활성의 정량적인 평가를 허용한다. NQO1-ARE 루시페라제 리포터 플라스미드로부터의 개똥벌레 루시페라제의 발현을, 인간 NADPH:퀴논 옥시도리덕타제 1(NQO1) 유전자의 프로모터 영역에서 동정된 산화방지 반응 요소(ARE)에 상응하는 특이적인 인헨서 서열에 Nrf2를 결합시킴으로써 조절한다(문헌[Xie et al., 1995]). 상기 NQO1-ARE-루시페라제 리포터 플라스미드를, 인간 NQO1-ARE(5'-CAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCTG-3')를 HindIII/XhoI 클로닝 부위(진스크립트 코포레이션(GenScript Corp.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 pLuc-MCS 벡터에 삽입함으로써 제작하였다. 10% FBS 및 100 U/㎖(각각)의 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM(인비트로젠(Invitrogen)) 중에서 유지된, HuH-7 인간 간종양 세포주를 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 상기 NQO1-ARE 루시페라제 리포터 플라스미드 및 pRL-TK 플라스미드(레닐라 루시페라제를 구성적으로 발현하고 형질감염 수준의 표준화를 위한 내부 대조군으로서 사용된다)로 일시적으로 형질감염시켰다. 30 시간의 형질감염, 세포를 RTA 408로 18 시간 동안 처리하였다. 개똥벌레 및 레닐라 루시페라제 활성을 듀얼-글로(Dual-Glo) 루시페라제 분석(카탈로그 #E2920, 프로메가)에 의해 분석하고, 발광 신호를 L-맥스(Max) II 광도계(몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))상에서 측정하였다. 개똥벌레 루시페라제 활성을 레닐라 활성에 대해 표준화하고, 표준화된 개똥벌레 활성의 비히클 대조군(DMSO)에 대한 유도 배수를 계산하였다. 도 2a는 상기 세포주에서 RTA 408에 의한 루시페라제 활성의 용량-의존적인 유도를 도시한다. 값들은 3 개의 독립적인 실험들의 평균을 나타낸다. 63189(14.9 nM)보다 20% 적은 RTA 408(12 nM)이, HuH-7 세포에서 NQO1 ARE로부터 전사를 2배까지 증가시키는데 필요하였다. 마찬가지로, 각각 63170(25.2 nM) 및 63179(29.1 nM)보다 2.1 내지 2.4 배 적은 RTA 408이, HuH-7 세포에서 NQO1 ARE로부터 전사를 2배까지 증가시키는데 필요하였다.

루시페라제 리포터 활성화에 대한 RTA 408의 효과를 또한 AREc32 리포터 세포주에서 평가하였다. 상기 세포주는 인간 유방암 MCF-7 세포로부터 유래되며, 상기 세포주를 랫트 GSTA2 ARE 서열의 8 개 사본의 전사 조절 하에서 개똥벌레 루시페라제 리포터 유전자로 안정하게 형질감염시킨다(문헌[Wang et al., 2006](본 발명에 참고로 인용된다)). RTA 408로 18 시간 동안 처리한 다음에, 개똥벌레 루시페라제 활성을 제조사의 설명에 따라 원-글로(ONE-Glo) 루시페라제 분석 시스템(프로메가, 카탈로그 #E6110)을 사용하여 측정하였다. 용량-의존적인 반응이 상기 AREc32 리포터 세포주에서 관찰되었다(도 2b). 루시페라제 활성의 ∼2배 유도가, NQO1-ARE 및 GSTA2-ARE 리포터 분석 시스템 모두에서 15.6 nM RTA 408에 의한 처리에 따라 분명하였다. 상기 GSTA2-ARE(AREc32) 루시페라제 활성 연구로부터의 결과를 검토하면, GSTA2-ARE 유도에 대한 63415(RTA 408)의 효과를 WST1 생육성(viability) 연구와 함께 RTA 402, 63170, 63171, 63179, 및 63189의 경우와 직접 비교할 수 있다(도 3a-f). RTA 402의 값들에 비해, 63415는 상기 루시페라제 리포터 분석에서 4-배 유도에 도달하는데 필요한 93 nM의 농도를 갖는 5 개의 비교 화합물들 중 가장 빠른 GSTA2-ARE-매개된 전사의 유도를 나타내었다. 다른 모든 화합물들은 단지 훨씬 더 높은 농도를 가질때만 유사한 유도를 보였으며, 이때 루시페라제 활성의 4 배 유도를 성취하기 위해서 63170은 171 nM의 농도를 필요로 하고, 63171은 133 nM의 농도를 필요로 하고, 63179는 303 nM의 농도를 필요로 하고, 63189는 174 nM의 농도를 필요로 하였다. 이들 값은 동일한 양의 활성에 이르기 위해서 RTA 402에 비해 필요한 활성 화합물의 양의 1.86(63415), 3.40(63170), 2.65(63171), 6.05(63179) 및3.47(63189) 배 증가에 상응한다.

RTA 408은 또한 HFL1 인간 태아 폐 섬유아세포 및 BEAS-2B 인간 기관지 상피 세포주에서 공지된 Nrf2 표적 유전자의 전사 수준을 증가시키는 것으로 나타났다. HFL1 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 F-12K 배지에서 배양하였다. BEAS-2B 세포를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다. 세포를 6-웰 디쉬에서 2.5 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 다음날, 세포를 DMSO(비히클) 또는 RTA 408(7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 또는 125 nM)로 18 시간 동안 처리하였다. 각각의 웰에 동일한 양의 비히클을 제공하였다. 처리에 이어서, 배지를 제거하고 세포를 RLT 완충제(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 수확하였다. 용해물을 QIA슈레더(Shredder) 컬럼(퀴아겐, 카탈로그 #79654)을 사용하여 균질화하고 RNA를 RNeasy 미니 키트(퀴아겐, 카탈로그 #74104)를 사용하여 단리하였다. 역 전사를 위해서, RNA(1 ㎍)를 23.25 ㎕의 최종 부피로 올리고(dT)_12-18 프라이머 및 H₂O와 합하였다. 상기 혼합물을 70 ℃로 10분간 가열하고 이어서 얼음상에 놓았다. 8 ㎕ 5X 첫 번째 스트랜드 완충제, 2 ㎕ 1 ㎎/㎖ BSA, 2 ㎕ 20 mM DTT, 4 ㎕ 5 mM dNTP 혼합물, 0.25 ㎕ RNaseOUT(상표) 및 0.5 ㎕ 슈퍼스크립트(Superscript)(등록상표) II 역전사효소를 함유하는 마스터 혼합물을 상기 RNA 혼합물에 가하고 42 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 반응을 70 ℃로 10 분간 가열하여 불활성화시켰다. 상기 반응 혼합물을 qPCR에 사용하기 전에 H₂O로 1:3 희석하였다. 2.5 ㎕의 상기 희석된 역전사 반응물을 한 세트의 PCR 프라이머(0.36 μM 최종 농도), 2X iQ(상표) SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(바이오-래드(Bio-Rad), 카탈로그 #170-8885) 및 H₂O와 20 ㎕의 최종 부피로 합하였다. PCR 프라이머들에 대한 서열은 하기와 같다: 글루타메이트-시스테인 리가제, 변경물질 서브유닛(GCLM), 순방향 프라이머 5'-GCTGTGGCTACTGCGGTATT-3' (서열번호 1) 역방향 프라이머 5'-ATCTGCCTCAATGACACCAT-3' (서열번호 2); 헴 옥시게나제-1 (HMOX1) 순방향 프라이머 5'-TCCGATGGGTCCTTACACTC-3' (서열번호 3), 역방향 프라이머 5'-TAGGCTCCTTCCTCCTTTCC-3' (서열번호 4); NAD(P)H 데하이드로게나제, 퀴논 1 (NQO1) 순방향 프라이머 5'-AAAACACTGCCCTCTTGTGG-3' (서열번호 5), 역방향 프라이머 5'-GTGCCAGTCAGCATCTGGTA-3' (서열번호 6); 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 순방향 프라이머 5'-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3' (서열번호 7), 역방향 프라이머 5'-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3' (서열번호 8); 티오레독신 리덕타제 1 (TXNRD1) 순방향 프라이머 5'-ATTGCCACTGGTGAAAGACC-3' (서열번호 9), 역방향 프라이머 5'-ACCAATTTTGTTGGCCATGT-3' (서열번호 10). 모든 프라이머들은 앞서 특이성 및 증폭 효율에 대해 확인되었다. cDNA를 하기의 주기 조건들을 사용하여 증폭시켰다: (95 ℃ 3분, 44 주기의 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 15 초, 72 ℃ 15 초, 이어서 0.5 ℃의 증분으로 55 ℃에서 95 ℃까의 용융 곡선). 각 Nrf2 표적 유전자의 상대 빈도를 비교 C_T 방법(ΔΔC_T)을 사용하여 측정하였다. PCR 반응을 각각의 샘플에 대해 3 중 웰에서 실행하였다. 2 개의 독립적인 실험을 상술한 조건들을 사용하여 수행하였다. HFL1 폐 섬유아세포를 RTA 408로 18 시간 동안 처리한 결과, 정량적인 PCR에 의해 측정된 바와 같이, NQO1, HMOX1, GCLM, 및 TXNRD1을 포함하여 다수의 Nrf2 표적 유전자의 발현이 증가되었다(도 4a-d). 시험된 모든 유전자들에 대해서, RTA 408에 의한 유도는 용량-의존적이었으며 15.6 nM 정도로 낮은 농도에서 뚜렷하였다. BEAS-2B 기관지 상피 세포를 RTA 408에 의해 18 시간 동안 처리한 결과, 평가된 모든 Nrf2 표적 유전자의 유사한 용량-의존적인 증가가 발생하였다(도 5a-d). RTA 408은 또한 유사한 농도로 정상적인 인간 혈관사이세포(nHMC), 마우스 BV2 미세아교세포주, 및 인간 SH-SY5Y 신경모세포종 세포주에서 Nrf2 표적 유전자의 발현을 증가시켰다.

Nrf2 표적 NQO1 및 HMOX1의 단백질 수준을 RTA 408에 의한 처리에 이어서 웨스턴 블럿에 의해 SH-5Y5Y 및 BV-2 세포에서 측정하였다. SH-SY5Y 세포를 6-웰 플레이트에서 웰당 4 x 10⁵ 세포의 밀도로 도말하였다. BV-2 세포를 6-웰 플레이트에서 웰당 2.5 x 10⁴ 세포의 밀도로 도말하였다. 도말 후 24 시간(BV-2) 또는 48 시간(SH-SY5Y)째에, 세포들을 RTA 408로 24 시간 동안 처리하였다. 처리에 이어서, 세포를 저온 PBS로 2 회 세척하고 용해 완충제 중에서 수확하였다. 세포를 초음파 처리하고 찌꺼기를 원심분리(10 분 @ 18,000 rcf, 벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 미세원심분리기 18 원심분리기)에 의해 제거하였다. 상등액 중의 총 단백질을 표준으로서 BSA와 함께 바이오-래드 단백질 시약을 사용하여 정량화하였다. 동량의 전체 세포 단백질이 SDS-PAGE 상에서 분리되었으며, 단백질을 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 1 시간 동안 5% 우유를 함유하는 TBST(0.1% 트윈 20을 갖는 1 x TBS) 중에서 차단시키고, TBST로 3 회 세척하고, 4 ℃에서 밤새 1차 항체와 배양하였다. NQO1 항체는 아브캠(Abcam)(#AB2346)으로부터의 것이고; HMOX1(HO-1) 항체는 산타 크루즈(Santa Cruz)(#sc-10789)로부터의 것이며; 액틴 항체는 밀리포어(Millipore)(#MAB 1501)로부터의 것이었다. TBST로 세척 후에, 2차 항체를 실온에서 1 시간 동안 TBST + 5% 우유 중에 가하였다. 애피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-토끼 또는 항-마우스 IgG 2차 항체는 잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch)(각각 카탈로그 #111-035-144 및 #115-035-146)로부터의 것이었다. 멤브레인들을 TBST로 세척하고, ECL을 사용하여 전개시키고, X-선 필름에 노출시켰다. RTA 408에 의한 처리는 SH-SY5Y 중의 NQO1 단백질 수준을 용량-의존적인 방식으로 또한 증가시켰다(도 6a). HMOX1 단백질은 처리되지 않거나 또는 RTA 408-처리된 SH-SY5Y 세포 중에서 검출되지 않았다. BV2 세포에서, RTA 408에 의한 처리는 125 nM까지의 농도에서 NQO1 및 HMOX1 단백질 수준을 증가시켰다(도 6b). RTA 408(56.4 nM)에 의한 SK-N-SH 세포에서의 Nrf2 단백질 발현의 유도에 대한 EC₅₀ 값은 63171(122 nM), 63189(102 nM), 및 63179(126 nM)에 대한 EC₅₀ 값보다 45% 내지 65% 더 낮았다. 같은 양의 63170(54.6 nM)이 필요하였다.

상기 EC₅₀을, 세포를 3 일 동안 평가 하의 화합물과 함께 배양하는 세포내 웨스턴 NQO1 분석을 사용하여 측정하였다. 관심 화합물과의 배양 후에, 상기 세포를 마우스 NQO1 항체와 반응시키고 이어서 다음날 상기 세포를 IRDye-800CW-항-마우스 IgG 항체와 반응시켰다. 표적 신호들을 가시화하였으며 이어서 분석하였다.

Nrf2 표적 유전자 및 상응하는 단백질 생성물의 유도와 일치하게, RAW264.7 마우스 대식세포의 24 시간 처리는 7.8 nM에서 분명한 증가와 함께, NQO1 효소 활성을 용량-의존적인 방식으로 증가시켰다(도 7). NQO1 효소 활성을 변형된 프로차스카(Prochaska) 분석에 의해 측정하였다(문헌[Prochaska and Santamaria, Anal Biochem. 169:328-336, 1988](본 발명에 참고로 인용된다)).

합쳐서 생각하면, 이들 다수의 세포주들로부터의 데이터는 RTA 408에 의한 처리가 산화방지 반응 요소들에 의해 조절된 전사 활성을 증가시키고, Nrf2 표적 유전자의 발현을 증가시키며, Nrf2 표적 유전자 산물인 NQO1의 활성을 증가시킴을 입증한다.

3. 세포 산화환원 능력의 마커들에 대한 RTA 408의 효과

글루타치온 및 NADPH는 세포 산화환원 능력의 유지에 필요한 중요한 인자들이다. 글루타치온(예를 들어 GCLC 및 GLCM) 및 NADPH[예를 들어 헥소스-6-포스페이트 데하이드로게나제(H6PD) 및 말산 효소(ME1)]의 합성에 관여하는 다수의 유전자들이 Nrf2에 의해 조절됨이 입증되었다(문헌[Wu, 2011]). 총 글루타치온 수준에 대한 RTA 408의 효과를 제조자의 설명에 따라 GSH-글로(상표) 글루타치온 분석 키트(프로메가, 카탈로그 #V6912)를 사용하여 마우스 AML-12 간세포 세포주에서 평가하였다. AML-12 세포의 RTA 408에 의한 24 시간 처리는 전체 세포 글루타치온 수준을 용량-의존적인 방식으로 증가시켰다(도 8). 나타낸 데이터는 2 개의 독립적인 실험을 나타낸다. 전체 글루타치온의 >2배 증가가 15.6 nM 정도로 낮은 RTA 408 농도에서 관찰되었다. RTA 408(9.9 nM)에 의한 글루타치온 수준의 유도를 위해 RAW264.7 마우스 모델을 사용하는 EC₅₀ 값은 63170 (12.1 nM), 63171 (23.2 nM), 및 63189 (16 nM)에 대한 EC₅₀ 값보다 22% 내지 57% 더 낮았다.

산화환원-민감성 염료인 WST-1(롯슈 어플라이드 사이언스, 카탈로그 #11644807001)의 흡광도에 의해 측정된 바와 같이, NADPH의 수준에 대한 RTA 408 처리의 효과를 HCT-116 세포에서 평가하였다. WST-1 흡광도는 통상적으로 생육 가능한 세포에 의한 NAD(P)H의 해당 생산을 측정함으로써 세포 생육성을 평가하는데 사용된다. 따라서, NADPH 생산이 세포 생육성에 대한 임의의 효과의 부재 하에서 증가하는 상황에서, WST-1 흡광도가 또한 증가한다(문헌[Berridge et al., 1996](본 발명에 참고로 인용된다)). NADPH 생산에 관여하는 다수의 핵심 유전자들이 또한 Nrf2에 의해 조절되는 것으로 나타났다(문헌들 [Thimmulappa et al., 2002]; [Wu, et al., 2011](본 발명에 참고로 인용된다)). 24 시간 동안의 RTA 408 처리는 WST-1 흡광도를 용량-의존적인 방식으로 증가시켰으며(도 9), 이는 NADPH 수준이 증가했음을 암시한다.

NADPH 합성 경로에 관여하는 유전자의 발현에 대한 RTA 408의 효과를 또한 본 연구에서 평가하였다. HCT-116 세포를 24 시간 동안 RTA 408로 처리하고, H6PD, 포스포글루코네이트 데하이드로게나제(PGD), 트랜스케톨라제(TKT), 및 ME1의 mRNA 수준을 정량적인 PCR을 사용하여 측정하였다. HCT-116 세포를 6-웰 디쉬에 3 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 다음날, 세포를 DMSO(비히클), 10 nM RTA 408, 또는 50 nM RTA 408로 24 시간 동안 처리하였다. 각 웰에 동량의 비히클을 제공하였다. 처리에 이어서, 배지를 제거하고 세포를 RLT 완충제(퀴아겐)를 사용하여 수확하였다. 용해물을 QIA슈레더 컬럼(퀴아겐, 카탈로그 #79654)을 사용하여 균질화하고 RNA를 RNeasy 미니 키트(퀴아겐, 카탈로그 #74104)를 사용하여 단리하였다. 역 전사를 위해서, RNA(1 ㎍)를 23.25 ㎕의 최종 부피로 올리고(dT)12-18 프라이머 및 H₂O와 합하였다. 상기 혼합물을 70 ℃로 10분간 가열하고 이어서 얼음상에 놓았다. 8 ㎕ 5X 첫 번째 스트랜드 완충제, 2 ㎕ 1 ㎎/㎖ BSA, 2 ㎕ 20 mM DTT, 4 ㎕ 5 mM dNTP 혼합물, 0.25 ㎕ RNaseOUT(상표) 및 0.5 ㎕ 슈퍼스크립트(등록상표) II 역전사효소를 함유하는 마스터 혼합물을 상기 RNA 혼합물에 가하고 42 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 반응을 70 ℃로 10 분간 가열하여 불활성화시켰다. 상기 반응 혼합물을 qPCR에 사용하기 전에 H₂O로 1:3 희석하였다. 2.5 ㎕의 상기 희석된 역전사 반응물을 한 세트의 PCR 프라이머(0.36 μM 최종 농도), 2X iQ(상표) SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(바이오-래드, 카탈로그 #170-8885) 및 H₂O와 20 ㎕의 최종 부피로 합하였다. PCR 프라이머들에 대한 서열은 하기와 같다: 리보솜 단백질 S9(RPS9) 순방향 프라이머 5'-GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3'(서열번호 7), 역방향 프라이머 5'-GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3'(서열번호 8); 헥소스-6-포스페이트 데하이드로게나제(H6PD) 순방향 프라이머 5'-GAGGCCGTGTACACCAAGAT-3'(서열번호 11), 역방향 프라이머 5'-AGCAGTGGGGTGAAAATACG-3'(서열번호 12), 포스포글루코네이트 데하이드로게나제(PGD) 순방향 프라이머 5'-AAGGCACTCTACGCTTCCAA-3'(서열번호 13), 역방향 프라이머 5'-AGGAGTCCTGGCAGTTTTCA-3'(서열번호 14), 트랜스케톨라제(TKT) 순방향 프라이머 5'-CATCTCCGAGAGCAACATCA-3'(서열번호 15), 역방향 프라이머 5'-TTGTATTGGCGGCTAGTTCC-3'(서열번호 16); 말산 효소 1 (ME1) 순방향 프라이머 5'-TATATCCTGGCCAAGGCAAC-3'(서열번호 17) 역방향 프라이머 5'-GGATAAAGCCGACCCTCTTC-3'(서열번호 18). 모든 프라이머들은 앞서 특이성 및 증폭 효율에 대해 확인되었다. cDNA를 하기의 주기 조건들을 사용하여 증폭시켰다: (95 ℃ 3분, 44 주기의 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 15 초, 72 ℃ 15 초, 이어서 0.5 ℃의 증분으로 55 ℃에서 95 ℃까의 용융 곡선). 각 표적 유전자의 상대 빈도 (relative abundance)를 비교 CT 방법(ΔΔCT)을 사용하여 측정하였다. PCR 반응을 각각의 샘플에 대해 3 중 웰에서 실행하였다. 2 개의 독립적인 실험을 상술한 조건들을 사용하여 수행하였다. RTA 408로 처리한 결과 NADPH 합성과 관련된 유전자의 발현이 용량-의존적으로 증가하였다(도 10a-d).

요약하면, RTA 408에 의한 처리는 HCT-116 세포에서 AML-12 간세포의 전체 글루타치온 수준을 증가시켰고, NADPH 생산의 마커인 WST-1 흡광도를 증가시켰다. 이러한 관찰은 NADPH 합성에 관련된 효소들을 암호화하는 다수의 핵심 유전자들의 발현 증가와 상관있었다.

4. TNF α-유도된 NF -κB 신호전달에 대한 RTA 408의 효과

NF-κB는 다수의 면역 및 염증 반응의 조절에서 중심 역할을 하는 전사 인자이다. RTA 402 및 다른 AIM은 다양한 세포주들에서 염증전 NF-κB 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다(문헌들 [Shishodia, 2006]; [Ahmad, 2006]; [Yore, 2006]). 마우스 NIH3T3/NF-κB-luc 세포주(파노믹스(Panomics))를 사용하여, 상기 NF-κB-Luc 리포터에 대한 RTA 408 및 화합물 63171, 63179, 63170 및 63189의 효과를 조사하였다. 상기 NIH3T3/NF-κB-luc 세포주는 상기 NF-κB 반응 요소의 8 개 사본에 의해 조절되는 개똥벌레 루시페라제 리포터 구조물의 염색체 통합을 유지한다. 이들 화합물의 효과를 상기 NF-κB IC₅₀의 값을 측정하여 정량화할 수 있다. RTA 408은 1.2 μM IC₅₀을 나타냈으며, 이는 생육성에 대해 표준화시 1.4 μM의 IC₅₀을 나타내었다. 다른 4 개의 화합물은 1.7, 0.2, 1.1 및 1.1 μM의 NIH3T3/NF-κB IC₅₀ 값을 나타냈으며, 이들은 생육성에 대해 표준화시 각각 1.8, 0.6, 1.1 및 1.0 μM의 IC₅₀ 값을 나타내었다. RTA 408 및 NF-κB에 대한 그의 효과를 용량의 함수로서 플롯팅하고 WST1 및 WST1/2뿐만 아니라 상대 변화 배수도 도 11a & b에 나타낸다. TNFα-유도된 NF-κB 신호전달에 대한 RTA 408의 효과를, 다수의 NF-κB 전사 반응 요소의 조절 하에서 루시페라제 리포터 구조물로 안정하게 형질감염된 인간 자궁경부 선암종 세포주인 HeLa/NF-κB-Luc 세포에서 평가하였다. HeLa/NF-κB-Luc 세포를 1 시간 동안 RTA 408로 전처리한 다음 추가로 5 시간 동안 TNF-α(10 ng/㎖)로 처리하였다. 처리 후에, 발광을 측정하고, TNF-α-유도된 루시페라제 활성에 대한 RTA 408 전처리의 효과를 측정하였다. 3 개의 독립적인 실험들로부터의 평균 결과 및 표준 편차를 도 12에 나타낸다. RTA 408은 TNF-α-유도된 NF-κB 활성화를 517 ± 83 nM의 IC₅₀ 값으로 용량-의존적으로 억제하였다. 유사한 결과가 또 다른 NF-κB 리포터 세포주(A549/NF-κB-Luc)에서 관찰되었으며, 여기에서 RTA 408은 TNF-α-유도된 NF-κB 활성화를 627 nM(범위 614 - 649 nM)의 IC₅₀ 값으로 억제하였다. RTA 408은 HeLa/NF-κB-Luc 세포에서 상기 NF-κB 프로모터 리포터로부터의 발현을 감소시킴에 있어서 각각 63189(854 nM) 및 63170(953 nM)보다 1.6 내지 1.8 배 더 효율적이었다. 인간 A549 세포주에 의한 추가의 실험은 1.7 μM로서 RTA 408에 대한 IC₅₀ 및 1.7 μM로 생육성 표준화된 값을 나타내었다. RTA 408의 IC₅₀은 63189, 63179, 63171 및 63170(이들은 각각 1.1, 1.4, 2.0 및 1.0의 IC₅₀ 값을 나타내었다)과 유사한 활성을 나타내었다. 상기 값들을 생육성 표준화했을 때, 상기 분석은 각각 1.2, 1.5, 2.1 및 1.1 μM IC₅₀를 나타내었다. WST1 및 WST1/2 곡선과 함께 RTA 408 농도의 함수로서 NF-κB에 대한 변화 배수를 플롯팅하고 도 13a & b에 나타낸다.

상기 NF-κB 경로의 활성화에서 핵심 단계인, IκBα의 TNF-α-유도된 인산화에 대한 RTA 408의 효과를 또한 HeLa 세포에서 평가하였다. HeLa 세포를 RTA 408로 6 시간 동안 전처리한 다음 TNF-α(20 ng/㎖)로 5 분간 처리하였다. IκBα의 전체 및 인산화된 수준을 웨스턴 블럿에 의해 평가하였다. 1차 IκBα 항체는 산타-크루즈(Santa-Cruz)(sc-371)로부터의 것이었고, pIκBα 항체는 셀 시그널링(Cell Signaling)(9246)으로부터의 것이었으며, 액틴 항체는 밀리포어(Millipore)(MAB 1501)로부터의 것이었다. 퍼옥시다제-접합된 친화성-순수한(affini-pure) 염소 항-토끼(IgG) 및 퍼옥시다제-접합된 친화성-순수한 염소 항-마우스 IgG 2차 항체를 잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch)로부터 구입하였다. 단백질 블럿을 ECL을 사용하여 전개시키고, X-선 필름에 노출시켰다. 상기 루시페라제 리포터 분석으로부터의 결과와 일관되게, RTA 408은 IκBα의 TNF-α-유도된 인산화를 용량-의존적인 방식으로 억제하였다(도 14).

RTA 408은 또한 다른 염증전 신호전달 경로, 예를 들어 전사 3의 IL-6 유도된 신호 변환인자 및 활성인자(STAT3) 인산화 및 NF-κB 리간드의 수용체 활성인자(RANKL)-유도된 파골세포형성을 억제하는 것으로 입증되었다. HeLa 세포에서, 1 μM RTA 408에 의한 6 시간 동안의 전처리는 IL-6에 의해 유도된 STAT3의 인산화를 억제하였다. STAT3(124H6) 및 포스포-STAT3(Tyr705) 단클론 항체는 셀 시그널링 테크놀로지로부터의 것이었다. 퍼옥시다제-접합된 친화성-순수한 염소 항-토끼 IgG 및 퍼옥시다제-접합된 친화성-순수한 염소 항-마우스 IgG는 잭슨 임뮤노리써치로부터의 것이었다. 파골세포형성은 조혈 기원 세포상에서, RANKL이 그의 수용체인 RANK에의 결합으로부터 생성되는 다단계 분화 과정이다. 상기는 NF-κB 및 MAPK를 활성화시키고, 이는 차례로 타르트레이트-내성 산 포스파타제(TRAP)를 포함한, 파골세포-특이성 표적 유전자의 전사를 증가시킨다. RANKL-유도된 파골세포형성에 대한 RTA 408의 효과를 마우스 대식세포주 RAW264.7에서 평가하였다. RAW 264.7 세포를 24-웰 플레이트에 5,000 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 다음날, 세포를 RTA 408로 2 시간 동안 처리하고 이어서 50 ng/㎖ 재조합 마우스 RANKL(R&D 시스템스)로 처리하였다. 상기 처리된 세포를 4일 동안 배양시켜 파골세포로 분화되게 하였다. 파골세포로의 분화를 TRAP 활성의 측정에 의해 평가하였다. 간단히, 90 ㎕의 처리된 세포 배양 배지를 각각의 시험 웰로부터 제거하고 96-웰 플레이트의 3 중 웰(30 ㎕/웰)에 분액하였다. 이어서 170 ㎕의 TRAP 분석 완충제(카미야 바이오메디컬(Kamiya Biomedical))를 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 상기 배양에 이어서, 540 ㎚에서의 흡광도를 스펙트라맥스(Spectramax) M2 플레이트 판독 분광광도계를 사용하여 측정하였다. RTA 408은 RANKL-유도된 TRAP 활성 및 파골세포의 형성을 ∼5 내지 10 nM의 IC₅₀으로 용량-의존적으로 억제하였다.

5. 트랜스아미나제 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 대한 RTA 408의 효과

트랜스아미나제 상승이 랫트에서, 및 훨씬 더 낮은 정도로 원숭이에서 RTA 408을 사용한 28-일 독성 연구에서 관찰되었다. 인간에서 관련된 AIM(바독솔론 메틸)의 경구 투여에 이어서 유사한 발견이 관찰되었다(문헌[Pergola, 2011]). 상기 효과에 대한 한 가지 가설은 AIM이 세포독성의 부재 하에서 트랜스아미나제 유전자 발현을 직접 또는 간접적으로 증가시킨다는 것이다. RTA 408에 의한 처리가 트랜스아미나제 mRNA 수준에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해서, 마우스 AML-12 간세포를 RTA 408로 18 시간 동안 처리하고, 트랜스아미나제를 암호화하는 유전자의 mRNA 수준을 정량적인 PCR을 사용하여 측정하였다. AML-12 세포를 6-웰 배양 디쉬에서 웰당 2 ㎖의 배지를 사용하여 웰당 3 x 10⁵ 세포로 도말하였다. 다음날 세포를 37 ℃에서 18 시간 동안 DMSO(비히클) 또는 250 nM 및 500 nM RTA 408로 처리하였다. 각 웰에 0.1% DMSO를 제공하였다. 3 개의 독립적인 반복 실험을 수행하였다. 처리에 이어서, 배지를 제거하고 세포를 RLT 완충제(퀴아겐)를 사용하여 수확하였다. 용해물을 QIA슈레더 컬럼(퀴아겐, 카탈로그 #79654)을 사용하여 균질화하고 RNA를 RNeasy 미니 키트(퀴아겐, 카탈로그 #74104)를 사용하여 단리하였다. 역 전사를 위해서, RNA(1 ㎍)를 23.25 ㎕의 최종 부피로 올리고(dT)12-18 프라이머 및 H₂O와 합하였다. 상기 혼합물을 70 ℃로 10분간 가열하고 이어서 얼음상에 놓았다. 8 ㎕ 5X 첫 번째 스트랜드 완충제, 2 ㎕ 1 ㎎/㎖ BSA, 2 ㎕ 20 mM DTT, 4 ㎕ 5 mM dNTP 혼합물, 0.25 ㎕ RNaseOUT(상표) 및 0.5 ㎕ 슈퍼스크립트(등록상표) II 역전사효소를 함유하는 마스터 혼합물을 상기 RNA 혼합물에 가하고 42 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 반응을 70 ℃로 10 분간 가열하여 불활성화시켰다. 상기 반응 혼합물을 qPCR에 사용하기 전에 H₂O로 1:3 희석하였다. 2.5 ㎕의 상기 희석된 역전사 반응물을 한 세트의 PCR 프라이머(0.36 μM 최종 농도), 2X iQ(상표) SYBR(등록상표) 그린 슈퍼믹스(바이오-래드, 카탈로그 #170-8885) 및 H₂O와 20 ㎕의 최종 부피로 합하였다. PCR 프라이머들에 대한 서열은 하기와 같다: 리보솜 단백질 L19(Rpl19) 순방향 프라이머 5'-TCAGGCTACAGAAGAGGCTTGC-3' (서열번호 19), 역방향 프라이머 5'-ACAGTCACAGGCTTGCGGATG-3' (서열번호 20); NAD(P)H 데하이드로게나제, 퀴논 1 (Nqo1) 순방향 프라이머 5'-TCGGGCTAGTCCCAGTTAGA-3' (서열번호 21), 역방향 프라이머 5'-AAAGAGCTGGAGAGCCAACC-3' (서열번호 22); 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제 1 (Gpt1 또는 Alt1) 순방향 프라이머 5'-CACGGAGCAGGTCTTCAACG-3' (서열번호 23), 역방향 프라이머 5'-AGAATGGTCATCCGGAAATG-3' (서열번호 24); 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제 2 (Gpt2 또는 Alt2) 순방향 프라이머 5'-CGCGGTGCAGGTCAACTACT-3' (서열번호 25), 역방향 프라이머 5'-CCTCATCAGCCAGGAGAAAA-3' (서열번호 26); 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나제 1 (Got1 또는 Ast1) 순방향 프라이머 5'-GGCTATTCGCTATTTTGTGT-3' (서열번호 27), 역방향 프라이머 5'-GACCAGGTGATTCGTACAAT-3' (서열번호 28); 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나제 2 (Got2 또는 Ast2) 순방향 프라이머 5'-AGAGTCCTCTTCAGTCATTG-3' (서열번호 29), 역방향 프라이머 5'-ATGATTAGAGCAGATGGTGG-3' (서열번호 30). 모든 프라이머들은 앞서 특이성 및 증폭 효율에 대해 확인되었다. cDNA를 하기의 주기 조건들을 사용하여 증폭시켰다: (95 ℃ 3분, 44 주기의 95 ℃ 30 초, 60 ℃ 15 초, 72 ℃ 15 초, 이어서 0.5 ℃의 증분으로 55 ℃에서 95 ℃까의 용융 곡선). 각 표적 유전자의 상대 빈도를 비교 CT 방법(ΔΔCT)을 사용하여 측정하였다. PCR 반응을 각각의 샘플에 대해 3 중 웰에서 실행하였다. RTA 408에 의한 처리는 알라닌 트랜스아미나제 1(Alt1 또는 Gpt1) 및 아스파테이트 트랜스아미나제 1(Ast1 또는 Got1)의 mRNA 수준을 증가시켰다(도 15a,c). RTA 408은 알라닌 트랜스아미나제 2(Alt2 또는 Gpt2) mRNA 수준에 대해 효과가 없었으며 아스파테이트 트랜스아미나제 2(Ast2 또는 Got2)의 mRNA 수준을 감소시켰다(도 15b,d). 이들 결과는 RTA 408이 시험 농도(250 nM 또는 500 nM)에서 시험관내 트랜스아미나제 유전자 발현에 영향을 미침을 입증한다.

6. 해당 중간체의 수준에 대한 RTA 408의 효과

당뇨병 마우스에서의 연구는 바독솔론 메틸이 근육-특이적 인슐린-자극된 글루코스 흡수를 증가시킴을 입증하였다(문헌[Saha, 2010]). 인간에서, 바독솔론 메틸을 제공받은 환자의 보다 높은 백분율이 위약을 받은 환자에 비해 근육 경련을 경험함을 보고하였다(문헌[Pergola, 2011]). 근육 경련이 또한 인슐린 투여에 이은 당뇨병 환자에게서 보고되었으며, 이는 근육 글루코스 대사와의 가능한 연관성을 암시한다. 해당(glycolytic) 대사에 대한 RTA 408의 효과를, 배양된 설치류 C2C12 근육 세포 중 락테이트 및 피루베이트 수준의 평가를 통해 평가하였다. 락테이트 수준을 측정하기 위해서, 분화된 C2C12 근관세포를 37 ℃에서 3 시간 동안 1 μM 또는 2 μM RTA 408 또는 인슐린으로 처리하였다. 완충제를 제거하고 세포외 락테이트 수준의 측정을 위해 남겨두었다. 세포 찌꺼기를 락테이트의 측정 전에 원심분리(14,000 rpm에서 10 분)에 의해 펠릿화하였다. 세포내 락테이트를 측정하기 위해서, 세포를 PBS 중의 0.1% 트리톤 X-100에 현탁하고 25 게이지 바늘로 전단하여 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리시키고(14,000 rpm, 4 ℃에서 10 분), 락테이트를 상등액 중에서 측정하였다. 세포내 및 세포외 락테이트를 락테이트 분석 키트(바이오비젼(BioVision), 카탈로그 # K607-100)를 사용하여 측정하였다. 인슐린 처리와 유사하게, 1 μM 또는 2 μM RTA 408로 3 시간 동안, 분화된 C2C12 근관세포의 처리는 세포내 및 세포외 락테이트 수준을 용량-의존적인 방식으로 현저하게 증가시켰다.

피루베이트 수준을 측정하기 위해서, 분화된 C2C12 근관세포를 250 또는 500 nM RTA 408 또는 100 nM 인슐린으로 18 시간 동안 처리하였다. 약물 처리에 이어서, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다. 세포를 피루베이트 분석 완충제(피루베이트 분석 키트, 바이오비젼, 카탈로그 # K609-100)에 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리시키고(14,000 rpm, 4 ℃에서 10 분) 피루베이트 수준을 상등액 중에서 측정하였다. 250 nM 또는 500 nM RTA 408로 18 시간 동안, C2C12 분화된 근관세포의 처리는 또한 세포내 피루베이트 수준을 용량-의존적인 방식으로 현저하게 증가시켰다(P<0.0001, 별표로 나타냄)(도 16). 함께, 이들 결과는 RTA 408이 시험 농도에서 시험관내에서 근육 해당 중간체에 영향을 미칠 수 있음을 입증하지만; 상기 시험된 RTA 408 농도에서 상기 시험관내 시스템으로부터의 결과가 인간에서 임상적으로 관련된 용량 수준에서 글루코스 대사에 대한 잠재적인 효과와 어떻게 관련되는지는 명확하지가 않다.

7. MRP -1에 의한 RTA 408 유출의 시험관내 평가

약물 후보의 특징 중 하나는 화합물의 유출비(efflux ratio)이다. 상기 유출비는 얼마나 쉽게 화합물이 막을 통과하여 운반되는지의 크기이다. MRP-1 단백질, 또는 다중약물 내성-지원 단백질 1은 세포막을 통한 유기 음이온 및 다른 작은 분자의 운반을 촉진하는데 일조하는 단백질군의 하나이다. 보다 큰 유출비는 전형적으로 상기 약물 후보가 상기 막 밖으로 보다 쉽게 운반되고 세포내 과정을 조절하는데 덜 이용될 수 있음을 의미한다. 유사한 단백질들이 또한 혈액-뇌 장벽을 통한 화합물의 운반을 조절한다. RTA 408에 대한 MRP-1 유출비(1.3)가 63170(10) 및 63171(11.2)보다 대략 10 배 더 낮고 63179(56.5) 및 63189(57.1)보다 40 배 더 낮은 것으로 실험적으로 측정되었다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, RTA 408은 혈액-뇌 장벽에서 MRP-1에 대한 양호한 기질 및/또는 p-당단백질 매개된 유출에 대한 후보일 수 없다. 일부 실시태양에서, RTA 408을 중추신경계(CNS)의 질환을 치료하기 위해 사용할 수 있다.

C. 폐 질환의 동물 모델에서 RTA 408의 보호 효과

RTA 408을 폐에서 그의 잠재적인 효능을 평가하기 위해서 다수의 폐 질환 동물 모델에서 시험하였다. 모든 연구에 대해서, RTA 408을 참깨 오일 중에서 3 내지 150 ㎎/㎏ 범위의 용량 수준으로 매일 경구 투여하였다. 대부분의 경우에, RTA 408을 폐 손상 반응 유도의 수일 전에 투여하기 시작하였다.

1. 마우스에서 LPS -유발된 폐 염증

RTA 408을 마우스에서 LPS-유발된 폐 염증에 대한 2 개의 연구에서 시험하였다. 첫 번째 연구에서, 예비 용량-범위 탐지자가 되도록, RTA 408(30, 100 또는 150 ㎎/㎏)을 3일 동안 매일 1 회 경구 투여한 다음, LPS를 최종 투여 후 1 시간째에 투여하였다. 기관지폐포 세척액(BALF)을 LPS 투여 후 20 시간째(RTA 408의 최종 투여 후 21 시간째)에 수거하고 루미넥스(Luminex)(상표) 기술을 사용하여 염증전 마커(즉 IL-6, IL-12p40, TNF-α, 및 RANTES)의 수준에 대해서 평가하였다. RTA 408 처리는 모든 용량에서 IL-12p40, 및 100 및 150 ㎎/㎏ 용량에서 TNF-α를 현저하게 감소시켰다(도 17). 두 번째 연구에서, RTA 408(10, 30 또는 100 ㎎/㎏)을 6일 동안 매일 투여한 다음, LPS를 최종 투여 후 1 시간째에 투여하였다. 이 연구에서, 3 일째에 시작하여 100 ㎎/㎏ 용량 수준에서 체중의 현저한 감소가 관찰되었다. TNF-α의 현저한 감소는 10 ㎎/㎏ 용량에서 관찰되었고, IL-12p40, TNF-α 및 RANTES의 현저한 감소는 30 ㎎/㎏ 용량에서 관찰되었다(도 18a). 이 연구에서 마우스로부터의 폐에 대한 추가의 평가는 10 및 30 ㎎/㎏에서 NQO1 효소 활성의 현저한 유도(2,6-다이클로로페놀-인돌페놀의 감소율의 측정에 의해) 및 총 GSH의 증가(GSH-Glo(상표), 프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 포함하여, 관련 Nrf2 표적 유전자의 의미있는 연대를 밝혀내었다.

2. 블레오마이신 -유발된 폐 섬유증

RTA 408의 효과를 또한 마우스 및 랫트에서 블레오마이신-유발된 폐 섬유증의 모델에서 평가하였다. 첫 번째 예비 연구에서, RTA 408(10, 30 또는 100 ㎎/㎏)을, 10일째 블레오마이신 투여(비내)와 함께, 39일 동안 경구 위관영양을 통해 매일 마우스에게 투여하였다. 마지막 투여일에, 폐 조직을 수거하고 조직학(histology)을 수행하여 염증 정도 및 간질성 섬유증을 평가하였다. 상기 모델에서, 시험된 RTA 408 용량에서 통계학적 유의수준 효과는 관찰되지 않았다(도 19a & b). 추가적인 평가를, 러브레이스(Lovelace) 호흡 연구소에서 광범위하게 특성화된 폐 섬유증의 랫트 모델을 사용하여 수행하였다. 이 연구에서, 랫트에게 블레오마이신 또는 염수를 기관내 투여에 의해 0일째에 투여하였다. 상기 투여에 이어서, 동물들에게 RTA 408(3, 10 또는 30 ㎎/㎏)을 매일 28일 동안 경구 위관영양에 의해 제공하였다. 상기 30-㎎/㎏ 용량의 투여를 상기 동물들에서의 과도한 탈수 및 설사로 인해 14일째에 중지하였다. 나머지 동물들에 대해서, 기관지폐포 세척액을 유식 세포측정에 의해서 염증전 침윤물의 평가를 위해 28일째에 수거하고, 폐 조직을 LC-MS 및 조직병리학에 의해 하이드록시프롤린 수준에 대해서 분석하였다. 블레오마이신 설페이트 투여는 BALF 중 호중구의 상당한 방출 및 용해성 콜라겐의 증가뿐만 아니라 폐에서 하이드록시프롤린의 증가를 유도하였다. 3 및 10 ㎎/㎏ RTA 408의 처리는 다형핵(PMN) 세포의 폐로의 침윤을 현저하게 억제하고 또한 하이드록시프롤린 침착을 의미있게 감소시켰다(∼10% 내지 20%)(도 20a & b).

중요하게, 조직병리학적 평가는 RTA 408로 처리된 랫트에서, 트라이크롬 염색에 의해 평가시, 콜라겐 침착의 현저한 감소를 밝혀내었다. 블레오마이신 대조군 동물은 주로 보통의 염색을 나타낸 반면, 10 ㎎/㎏ RTA 408로 처리된 동물들은 우세하게는 최소 내지 순한 염색을 가졌다(표 2).

트라이크롬 염색의 강도에 의해 평가된 바와 같은, 랫트 폐에서 콜라겐 침착에 대한 RTA 408의 효과

염색 강도a	블레오마이신 대조군	RTA 408(3 ㎎/㎏)	RTA 408(10 ㎎/㎏)
최소	0	0	3
순함	1	0	4
보통	7	7	1

^a값들은 블레오마이신-유발된 폐 변질 영역에서 간질성(intestitial) 트라이크롬 염색에 의한 동물 중 염색 강도를 나타낸다.

상기 연구에서 랫트로부터의 폐에 대한 추가의 평가는 콴티젠 플렉스(Quantigene Plex) 2.0 멀티플렉스 분석(애피매트릭스(Affymetrix), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 의해 분석된 바와 같은 관련된 Nrf2 표적 유전자의 의미있는 연대성을 밝혀냈다(도 21). RTA 408은 블레오마이신에 노출된 랫트의 폐에서 NQO1, Txnrd, Gsr, 및 Gst 효소 활성을 현저하고 용량-의존적으로 증가시켰으며, 이는 상기 질병 상황에서 RTA 408에 의한 Nrf2 활성화를 입증한다. NQO1 효소 활성을 DCPIP의 감소율을 측정함으로써 평가하였다. Txnrd, Gst 및 Gst 효소 활성을 캐이만 케미칼(Cayman Chemical)(미국 미시건주 앤 아버 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 키트를 사용하여 측정하였다.

3. 마우스에서 담배 연기-유발된 COPD

RTA 408을 또한 담배 연기-유발된 COPD의 마우스 모델에서 시험하였다. 마우스에게 RTA 408(3, 10 또는 30 ㎎/㎏)을 매일 2 주 동안 경구 위관영양을 통해 제공하고 RTA 408 투여 기간 동안 주당 5일 담배 연기에 노출시켰다. 상기 연구의 끝에서, 폐 조직 및 BALF를 염증성 침윤물 및 사이토킨의 분석을 위해 수거하였다. 이 실험에서, 3 ㎎/㎏ RTA 408 정도로 낮은 용량의 RTA 408의 수회 용량 투여는 루미넥스(Luminex)(상표) 기술을 사용하여 측정된 바와 같이 KC(인간 IL-8의 작용성 마우스 동족체) 및 TNF-α를 포함한 염증전 사이토킨을 현저하게 억제하였다. 상기 연구로부터의 결과에 대한 요약을 도 22a-e에 제공한다. AIM 유사체(63355)를 비교를 위해 동일한 연구에서 시험하였다. 63355는 하기 화학식의 화합물이다:

상기 연구에서 마우스로부터의 폐에 대한 추가의 평가는 또한 관련된 Nrf2 표적 유전자의 의미있는 연대를 밝혀내었다(도 23). DCPIP의 감소율로서 측정된, 폐에서의 NQO1 효소 활성이 담배 연기 노출에 의해 현저하게 감소하였으며; RTA 408의 투여는 이러한 상실을 구제하였다. Txnrd 효소 활성을 또한 30 ㎎/㎏ 용량의 RTA 408에 의해 유도하였다. 일반적으로 Gsr 효소 활성은 변경되지 않았으며, Gst 효소 활성은 처리에 의해 감소하였고, 이러한 결과는 모두 상기 효소들에 대한 일시적인 반응의 결과인 듯하였다. Txnrd, Gst, 및 Gst 효소 활성을 캐이만 케미칼(미국 미시건주 앤 아버 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 키트를 사용하여 측정하였다.

4. 마우스에서 오브알부민 -유발된 천식

RTA 408의 잠재적인 활성을 또한 오브알부민-유발된 천식의 마우스 모델에서 파일럿 연구로 평가하였다. 마우스를 0일 및 14일에 오브알부민 및 수산화 알루미늄의 IP 주사로 감작시키고 염수중 오브알부민을 14, 25, 26 및 27일에 비내 투여하였다. 마우스에게 RTA 408(3, 10 또는 30 ㎎/㎏)을 1 내지 13일 및 15 내지 27일에 경구 위관영양(gavage)을 통해 매일 제공하였다. 오브알부민에 의한 감작화 및 투여에 따라, 비히클-처리된 마우스는 양성 대조군 (덱사메타손)-처리된 마우스에 비해 총 백혈구수가 현저하게 증가하였다. T 세포 및 B 세포 수의 증가가 또한 상기 비히클-처리된 마우스에서 관찰되었다. 30 ㎎/㎏의 RTA 408의 처리는 기도 내 B 세포의 수 및 백분율을 현저하게 감소시켰다. RTA 408(3 및 30 ㎎/㎏)은 또한 대식세포의 수를 현저하게 감소시켰으나, 대식세포의 평균 백분율은 상기 기도에서 검출되지 않았다. 이러한 관찰은 상기 모델에서 잠재적인 효능을 암시한다.

5. 마우스에서 LPS -유발된 패혈증에 대한 RTA 408의 효과

패혈증을 LPS(21 ㎎/㎏)의 IP 주사에 의해 0일째에 유발시켰으며, 4일까지 생존하였다. RTA 408(10, 30 또는 100 ㎎/㎏)을 -2일에서 2일까지 경구 위관영양에 의해 매일 투여하였다. 비히클 대조군에서 상기 동물의 60%가 4일까지 생존하였다(상기 모델에서 예상된 ∼40% 생존률보다 더 높다). 상기 RTA 408 처리 그룹에서, 10 ㎎/㎏ 용량 그룹 동물의 80% 및 30 ㎎/㎏ 용량 그룹 동물의 90%가 4일까지 생존하였다(도 24c & d). 100 ㎎/㎏ 용량 그룹의 경우, 동물의 90%가 4일까지 생존하였으며, 4일째에 단지 하나의 사망이 발생하였다. 상기 RTA 408-유도된 효과가 상기 모델에서 충분한 효능을 가리키지만, 상기 비히클 대조군에서의 비교적 높은 생존률은 상기 대조군과 RTA 408-처리된 그룹들 간의 통계학적 유의수준 차이를 방해하였다. 화합물 RTA 405를 사용하여 획득한 결과를 또한 제공하였다(도 24a & b). RTA 405는 하기 화학식의 화합물이다:

6. 방사선-유발된 구강 점막염에 대한 RTA 408의 효과

햄스터의 볼 주머니(buccal check pouch)를 향한 급성 방사선 노출은 인간의 구강 궤양성 점막염에서 관찰되는 것과 유사한 효과를 생성시킨다. 상기 효과는 중증 홍반 및 혈관확장, 표피 점막의 미란, 및 궤양의 형성을 특징으로 하는 보통 내지 중증 점막염을 포함한다. 단일 연구를 수행하여 상기 모델에서 RTA 408의 효과를 평가하였다. 0일째에, 각각의 햄스터에게 왼쪽 볼 주머니를 향해 40 Gy의 급성 방사선 용량을 제공하였다. RTA 408(10, 30 또는 100 ㎎/㎏)을 -5일에서 -1일, 및 1일에서 15일까지 매일 2 회 경구 투여하였다. 6일에 시작하여 28일까지 계속 격일로, 구강 점막염을 표준 6-점 득점 등급을 사용하여 평가하였다. RTA 408의 30 및 100 ㎎/㎏ 용량 모두 궤양성 점막염의 지속기간을 현저하게 감소시켰다(도 25). 더욱 또한, 점막염 점수 ≥3를 갖는 동물의 백분율의 용량-의존적인 감소가 또한 관찰되었다. 그러나, 30 또는 100 ㎎/㎏의 RTA 408의 투여는 조사된 햄스터에서 현저한 용량-의존적인 중량 증가의 감소를 야기하였다. 20% 초과의 중량 손실로 인해, 상기 100 ㎎/㎏ 용량 그룹에서 8 마리의 햄스터 중 2 마리를 2일째에 안락사시켰다.

7. 생체내에서 Nrf2 생물마커의 유도에 대한 RTA 408의 효과

상술한 바와같이, RTA 408의 핵심 분자 표적은 산화방지성 세포 보호의 중심 전사 조절인자인 Nrf2이다. Nrf2의 활성화는 NQO1, GSH 합성에 관련된 효소[즉 글루타메이트-시스테인 촉매 및 변형인자 서브유닛(Gclc 및 Gclm)], 해독에 관련된 효소(즉 글루타치온 S-트랜스퍼라제[Gst]), 및 유출 운반자[즉 다중약물 내성-관련된 단백질(Mrp)]을 포함한 일련의 세포보호 유전자의 상향조절을 유도한다. 이들 유전자의 유도는, 증가된 산화방지 능력, 글루타치온 합성의 유도, 및 세포로부터 잠재적으로 유해한 분자의 접합 및 송출을 특징으로 하는, 산화 손상에 대해 보호하기 위한 조화된 세포 작용을 발생시킨다. 상술한 다양한 동물 모델들에서 평가된 효능 종점 및 Nrf2 표적 유전자 발현 외에, Nrf2 표적 유전자의 발현을 유도하기 위한 RTA 408의 능력을 또한 건강한 RTA 408-처리된 마우스, 랫트 및 원숭이로부터 수거된 조직을 사용하여 평가하였다.

마우스, 랫트 및 원숭이에서 RTA 408의 비-GLP 14-일 독성 연구의 부분으로서, 조직들을 선택된 Nrf2 표적 유전자의 mRNA 및 효소 활성 수준을 측정하기 위해서 수거하였다. 마우스 및 랫트의 경우에, 간 샘플을 14일에 최종 투여 후 4 시간째에 수거하였다. 원숭이의 경우, 혈액(PBMC 단리를 위해서), 간, 폐 및 뇌 조직을 14일에 최종 투여 후 24 시간째에 수거하였다. 상술한 바와 같이, NQO1, Gst 및 글루타치온 리덕타제(Gsr)에 대한 효소 활성을 조직 균질물에서 측정하였다. mRNA의 수준을 제조사의 프로토콜(mRNA 표적의 직접적인 정량화를 위한 xMAP(등록상표) 루미넥스(등록상표) 자기 비드를 사용하는 하이브리드화-기재 분석을 포함한다)에 따라 콴티젠 플렉스 2.0 기술을 사용하여 측정하였다. 또한, RTA 408 농도를 TQD 질량 분광계(워터스(Waters), 미국 매사추세츠주 밀포드 소재) 상에서 LC/MS/MS 방법에 의해 혈장 및 조직 중에서 측정하였다.

RTA 408은 일반적으로 10, 30 및 100 ㎎/㎏의 용량에서 용량-의존적인 방식으로 다양한 Nrf2 표적 유전자의 발현을 증가시켰다(도 26, 27a, 도 28a & b). RTA 408에 의한 Nrf2 표적 유전자의 전사적 상향조절은 또한 설치류 간뿐만 아니라 원숭이 간 및 폐에서 NQO1, Gst 및 Gsr 효소 활성의 용량-의존적인 증가에 의해 나타나는 바와 같이, 산화방지 반응의 작용성 증가를 생성시켰다(도 29a & b, 도 30a & b, 도 31a & b). 더욱 또한, 설치류에서, RTA 408의 간 노출은 Nrf2에 대한 원형 표적 유전자인 NQO1의 효소 활성 수준과 상관되었다(도 32b, 도 33b). 원숭이에서, NQO1 및 설피레독신 1(SRXN1) 모두의 PBMC에서의 mRNA 발현의 수준은 RTA 408에 대한 혈장 노출과 상관되었다(도 37a & b). 종합적으로, RTA 408은 Nrf2 표적의 mRNA 수준 및 활성을 증가시켰으며, 상기와 같은 증가는 일반적으로 조직 및 혈장 노출과 상관되었고, 이는 Nrf2 표적이 Nrf2 활성화에 적합한 생물마커로서 작용할 수 있고(도 34a & b) 건강한 인간 피실험자에서 RTA 408의 약물학적 활성 평가에 유용할 수 있음을 암시한다.

D. 안전성 약물학

GLP-순응성 안전성 약물학 프로그램을 RTA 408을 사용하여 완료하였다. 상기는 심혈관계에 대한 시험관내 및 생체내(원숭이) 연구뿐만 아니라 랫트에서 호흡계 및 중추신경계에 대한 연구를 포함하였다.

1. HEK293 세포에서 발현된 클로닝된 hERG 채널에 대한 RTA 408의 효과의 평가

상기 연구를 수행하여 인간 태아 신장(HEK293) 세포주에서 안정하게 발현된 hERG(인간 에테르-a-go-go-관련된 유전자) 채널에 의해 수행된 내측 정류 칼륨 흐름(

)의 신속한 활성화에 대한 RTA 408의 효과를 평가하였다. 상기 hERG-관련된 칼륨 흐름에 대한 RTA 408의 효과를 완전-세포 패치 클램프 전기생리학 방법을 사용하여 평가하였다. RTA 408은 hERG QPatch_Kv11.1 분석에서 12.4 μM의 IC₅₀ 값을 갖는 것으로 측정되었다. 상기 값은 각각 63170(4.9 μM) 및 63189(3.8 μM)에 대한 값보다 2.5 내지 3 배 더 높았다. 상기 RTA 408 IC₅₀ 값은 상기 63171 값(15.7 μM)과 유사하였다.

2. 키노몰구스 원숭이에서 RTA 408의 심혈관 평가

의식을 갖고 자유롭게 움직이는 키노몰구스 원숭이에서 RTA 408의 잠재적인 심혈관 효과를 평가하기 위해서 단일 연구를 수행하였다. 동일한 4 마리의 수컷 및 4 마리의 암컷 키노몰구스 원숭이에게 비히클(참깨 오일) 및 RTA 408(10, 30 및 100 ㎎/㎏의 용량 수준)을 라틴 정방 설계에 따라, 하나의 동물/성별/매주 투여된 처리에 이어서 투여 사이에 14-일 세척 기간으로, 각각의 동물이 모든 처리를 제공받을 때까지 투여하였다. 비히클 및 RTA 408을 5 ㎖/㎏의 용량 부피로 경구 위관영양을 통해 모든 동물에게 투여하였다.

동물들에게 체온, 혈압, 심박수의 측정, 및 심전도(ECG) 평가를 위해서 원격측정 전송기를 장치하였다. 체온, 수축기압, 확장기압, 및 평균 동맥 혈압, 심박수, 및 ECG 매개변수(QRS 지속기간 및 RR, PR 및 QT 구간)를 투여-전 2 시간 이상에서부터 투여-후 24 시간 이상까지 계속해서 모니터하였다. ECG 자취를 상기 심혈관 모니터링 데이터로부터 지정된 시점에서 인쇄하고 면허가 있는 수의과 심장전문의에 의해 정량적으로 평가하였다. 연구시 첫 번째 투여 전에, 처리되지 않은 동물을 24 시간 이상 심혈관 종점에 대해 계속해서 모니터하고, 상기 데이터를 상기 연구 전체를 통해 보정된 QT 구간의 계산에 사용하였다.

이환률(morbidity), 사망률, 손상, 및 먹이 및 물의 이용도에 대한 관찰을 모든 동물들에 대해서 매일 2 회 이상 수행하였다. 임상적 관찰을 투여-전, 투여-후 대략 4 시간째, 및 상기 심혈관 모니터링 기간의 종료에 이어서 수행하였다. 각각의 처리 투여 전날 체중을 측정하고 기록하였다.

10, 30 및 100 ㎎/㎏의 용량 수준의 RTA 408은 사망률, 불리한 임상 징후를 생성시키지 않거나, 체중, 체온, 혈압, 또는 정성적인 또는 정량적인(PR, RR, QRS, QT 구간) ECG 매개변수들의 의미있는 변화를 생성시켰다(도 35; 표 45). 상기 100 ㎎/㎏ 용량 그룹에서, 상기 보정된 QT 구간의 작지만(평균 1.6%) 통계학적 유의수준의 증가가 관찰되었으나; 개별적인 동물 데이터는 시험 항목 관련된 효과를 가리키는 QTc의 일관된 증가를 보이지 않았다. 결과적으로, 개별적인 동물에서 작은 변화 크기 및 일관된 반응의 결여로 인해, QTc에서의 이러한 근소한 증가는 RTA 408 처리와 관련되는 것으로 간주되지 않았다. 따라서, RTA 408의 경구 투여는 100 ㎎/㎏ 이하의 용량에서 키노몰구스 원숭이에서 심혈관 기능에 영향을 미치지 않았다.

3. 랫트에서 RTA 408의 신경행동 평가

RTA 408의 잠재적인 급성 신경행동 독성을 랫트에서 평가하였다. 10 마리의 수컷 및 10 마리의 암컷 CD(등록상표)[Crl:CD(등록상표)(SD)] 랫트의 3 개의 처리 그룹에게 RTA 408을 3, 10, 또는 30 ㎎/㎏의 용량 수준으로 제공하였다. 10 마리 동물/성별의 하나의 추가적인 그룹은 대조군으로서 작용하였으며 비히클(참깨 오일)을 제공하였다. 비히클 또는 RTA 408을 10 ㎎/㎏의 용량 부피로 1일에 1 회 경구 위관영양을 통해 모든 그룹에게 투여하였다.

이환률, 사망률, 손상, 및 먹이 및 물의 이용도에 대한 관찰을 모든 동물들에 대해서 매일 2 회 수행하였다. 임상적 징후에 대한 관찰을 투여-전 1일, 및 각각의 기능적 관찰 배터리(FOB) 평가에 이어서 수행하였다. FOB 평가를 투여-전(-1 일) 및 투여-후 대략 4 및 24 시간째에 수행하였다. 투여-전 1일에 체중을 측정하고 기록하였다.

3, 10 및 30 ㎎/㎏의 용량의 RTA 408은 사망률, 불리한 임상적 관찰, 또는 상기 시험된 신경행동 크기 중 어느 하나에 대한 효과를 생성시키지 않았다. 체중 증가의 근소한 감소가, 잠재적으로 시험 항목-관련될 수도 있는 상기 30 ㎎/㎏ 그룹에서 투여 후 대략 24 시간째에 관찰되었다. 상기 연구에서 평가된 기본적인 신경행동 종점들에 관하여, RTA 408은 30 ㎎/㎏ 이하의 용량에서 랫트에서 어떠한 부작용도 생성시키지 않았다.

4. 랫트에서 RTA 408의 폐 평가

폐 기능에 대한 RTA 408의 잠재적인 효과를 랫트에서 평가하였다. 8 마리의 수컷 및 8 마리의 암컷 CD(등록상표)[Crl:CD(등록상표)(SD)] 랫트의 3 개의 처리 그룹에게 RTA 408을 3, 10, 또는 30 ㎎/㎏의 용량 수준으로 제공하였다. 8 마리 동물/성별의 하나의 추가적인 그룹은 대조군으로서 작용하였으며 비히클(참깨 오일)을 제공하였다. 비히클 또는 RTA 408을 10 ㎎/㎏의 용량 부피로 1일에 1 회 경구 위관영양을 통해 모든 그룹에게 투여하였다.

이환률, 사망률, 손상, 및 먹이 및 물의 이용도에 대한 관찰을 모든 동물들에 대해서 매일 2 회 수행하였다. 임상적 관찰을 투여 전, 투여-후 대략 4 시간째, 및 8-시간 폐 모니터링 기간의 종료에 이어서 수행하였다. RTA 408 투여일에 체중을 측정하고 기록하였다. 폐 기능(호흡률, 호흡량, 및 일분 호흡 용적)을 기준선 확립을 위해 투여 전 1 시간 이상 및 투여-후 8 시간 이상 동안 모니터링하였다.

3, 10 및 30 ㎎/㎏의 용량의 RTA 408은 사망률, 불리한 임상적 관찰, 또는 평가된 폐 매개변수들 중 임의의 것에 대한 효과를 생성시키지 않았다. 따라서, 상기 연구에서 평가된 기본적인 폐 종점들에 관하여, RTA 408은 30 ㎎/㎏ 이하의 용량에서 랫트에서 어떠한 부작용도 생성시키지 않았다.

E. 비임상적 개관

1. 약동학

RTA 408을 그의 PK 및 대사 성질을 평가하기 위해서 시험관내 및 생체내 모두에서 조사하였다. 시험관내 연구를 수행하여 RTA 408 혈장 단백질 결합 및 혈액/혈장 분할, 시토크롬 P450(CYP450) 억제 및 유도를 측정하고, 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간의 간 마이크로솜에 의해 형성된 대사산물들을 확인하였다. 상기 RTA 408의 반복된 투여에 따른 생체내 흡수 및 분포에 속하는 데이터를 주로 독성학 연구로부터의 혈장 및 선택조직 중 약물 수준의 모니터링을 통해 획득하였다. 민감성 및 선택성 액체 크로마토그래피-질량 분광분석-기재 생물분석 방법(LC/MS/MS)을 사용하여 적합한 정밀도 및 정확성으로 혈장, 혈액 및 조직 중 RTA 408의 농도를 측정하였다. 측정을 TQD 및 QToF 질량 분광계(워터스)상에서 수행하였다.

a. 흡수

RTA 408의 흡수 및 전신 약동학 양상을 단일 및 반복된(매일) 경구 투여에 따라 마우스, 랫트 및 원숭이에서 연구하였다. 10 내지 100 ㎎/㎏ 용량의 현탁액 제형의 경구 투여에 이어서, 마우스에서 1 내지 2 시간 이내에 최대 농도가 관찰되었고, 랫트 및 원숭이에서는 1 내지 24 시간 이내에 관찰되었다. RTA 408의 전신 노출은 랫트에서 최고인 경향이 있었으며, 마우스 및 원숭이에서 보다 낮은 수준이 관찰되었다. 경구 투여 후 관찰된 RTA 408의 겉보기(apparent) 종말 반감기의 평가는, 일부 예에서 겉보기 연장된 흡수 단계가 명확한 반감기 평가의 계산을 방해하지만, 일반적으로 6- 내지 24-시간 범위 중에서 있었다.

RTA 408에 대한 전신 노출은 수컷 및 암컷에서 일반적으로 유사하였다. 반복된 매일 경구 투여에 따른 RTA 408에의 노출은 단일 투여 후 관찰된 노출보다 약간 더 높은(≤2-배) 경향이 있다. 현탁액 제형 중의 3 내지 100 ㎎/㎏ 범위의 용량에 걸쳐 RTA 408의 투여는 전신 노출에서 일반적으로 용량-비례하는 증가를 생성시켰다. 그러나, 보다 높은 용량(원숭이에서 100 내지 800 ㎎/㎏; 랫트에서 500 내지 2000 ㎎/㎏)의 투여는 노출시 유사한 증가를 생성시키지 못했으며, 이는 100 ㎎/㎏ 이상의 용량에서 흡수의 포화를 암시한다. 원숭이에게 RTA 408(3 ㎎/㎏)의 최적화되지 못한(느슨하게 충전된) 캡슐 제형의 경구 투여에 이어서, 용량-표준화된 전신 노출은 현탁액 제형에 대해 관찰된 경우보다 다소 더 낮은 경향이 있었다.

RTA 408의 흡수 및 전신 약동학 양상을 단일 및 반복된 국소 투여를 사용하여 랫트에서 연구하였다. 0.01% 내지 3%의 범위에 걸친 RTA 408의 투여는 유사한 경구 투여에 대해 보다 낮은 혈장 농도를 보였다. RTA 408에의 전신 노출은 일반적으로 용량 의존적인 방식으로 증가하였다. 국소 투여는 참깨 오일 중 현탁액으로서 제형화되었다.

토끼를 사용하여, RTA 408의 눈 흡수 및 전신 약동학 양상을 평가하였다. RTA 408을 5일 동안 하루에 1 회 눈에 국소 투여하였다. 눈 투여는 RTA 408을 경구로 투여한 경우에 비해 RTA 408의 보다 낮은 혈장 농도를 나타내었다(도 36). 5일 연속 투여 후에조차 혈장 중 RTA 408의 양은 RTA 408을 경구로 투여한 경우(이때 혈장 농도는 거의 100 배 더 높았다)에 비해 최초 투여 후 농도와 비교시 단지 작은 변화만을 나타내었다(도 36).

b. 분포

RTA 408의 혈장 단백질 결합을 한외원심분리 방법을 사용하여 10 내지 2000 ng/㎖의 RTA 408 농도에서 마우스, 랫트, 토끼, 개, 미니피그, 원숭이 및 인간 혈장 중에서 평가하였다. RTA 408은 혈장 단백질에 광범위하게 결합하였다. 비임상 종들에서 혈장 단백질 결합은 93%(마우스) 내지 >99%(미니피그)의 범위였으며, 독성학 종(랫트 및 원숭이)에서 95% 및 인간에서 97%의 결합을 가졌다. 시험된 어떤 종에서도 농도-의존적인 단백질 결합의 증거는 없었다. 혈액 대 혈장 분할 실험으로부터의 결과는 RTA 408이 선형 방식으로 주로 혈액의 혈장 분획 중에 분포되는 경향이 있음을 가리키며, 이때 시험된 모든 종 및 모든 농도에 대해서 혈액:혈장 비는 <1.0이었다.

RTA 408의 조직내로의 분포를 마우스, 랫트 및 원숭이에게 경구 투여 후 조사하였다. 14-일 비-GLP 독성 연구에서, 선택 조직(간, 폐 및 뇌)을 상기 연구의 최종 용량 투여 후 단일 시점(랫트 및 마우스의 경우 4 시간; 원숭이의 경우 24 시간)에서 수거하고 LC/MS/MS를 사용하여 RTA 408 함량에 대해 분석하였다. RTA 408은 폐, 간 및 뇌에 쉽게 분포한다. 폐에서, 마우스 및 랫트에서 4 시간째에 RTA 408 농도는 혈장 중 농도와 유사하거나 이보다 약간 더 높은(<2 배) 반면, 원숭이에서 24 시간째에, 폐 중 RTA 408 농도는 혈장 농도보다 6- 내지 16-배 더 높았다. 유사한 패턴이 뇌에 대해서 관찰되었다. 대조적으로, 간에서 RTA 408 농도는 마우스 및 랫트의 경우 4 시간째에 혈장보다 5- 내지 17-배 더 높았고, 원숭이에서 24 시간째에 2- 내지 5-배 더 높았다.

조직 중 RTA 408의 약역학적 효과를, 14-일 독성 연구로부터 약물 노출에 대해 수거된 동일 조직 중 Nrf2 표적 유전자의 유도를 모니터링함으로써, 마우스, 랫트 및 원숭이에서 평가하였다. RTA 408에 의한 Nrf2 표적 유전자의 유도는 검사된 조직 중 NQO1, 글루타치온 S-트랜스퍼라제(Gst), 및 글루타치온 리덕타제(Gsr) 효소 활성의 용량 의존적인 증가에 의해 나타나는 바와 같이 산화방지 반응의 증가를 생성시켰다. 효소 활성을 상술한 바와 같이 측정하였다. 더욱 또한, 설치류에서, RTA 408 간 함량은 Nrf2에 대한 원형 표적 유전자인 NQO1에 대한 효소 활성 수준과 상관되었다. 원숭이에서, NQO1 및 설피레독신 1(SRXN1) 모두에 대한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서의 mRNA 발현 수준은 RTA 408의 혈장 노출과 상관되었다(도 37a & b). 종합하면, RTA 408은 설치류 및 원숭이에서 Nrf2의 생물마커를 유도하였고, 상기와 같은 유도는 일반적으로 RTA 408에의 조직 및 혈장 노출과 매우 상관있었다.

RTA 408을 눈 국소 투여를 통해 토끼에게 투여시, 상기 화합물의 최고 농도는 각막, 망막 또는 홍채에서 발견된 반면, 유리액, 수성 체액 및 혈장은 현저하게 더 낮은 농도의 RTA 408을 나타내었다(도 38).

c. 대사

RTA 408의 대사를 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트(NADPH)-재생 시스템 및 유리딘 다이포스페이트 글루쿠로노실트랜스퍼라제(UGT) 반응 혼합물의 존재 하에서 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간으로부터의 간 마이크로솜과 60 분 동안 RTA 408을 시험관내 배양 후에 조사하였다. RTA 408의 광범위한 턴오버가 영장류 마이크로솜에서 관찰되었으며, 이때 모 분자의 <10%는 원숭이 및 인간 마이크로솜 중에 60-분 배양의 끝에서 남아있었다. 대조적으로, 대사의 정도는 설치류 마이크로솜에서 더 낮았으며, 이때 모 분자의 >65%는 배양의 끝에서 남아있었다. RTA 408의 다양한 잠재적인 대사산물들에 대해 이용 가능한 확실한 표준의 결여는 관찰된 대사산물의 정량적인 평가를 방해하였다. 정성적인 시각으로부터, RTA 408 대사산물의 유사한 패턴이 종들간에 관찰되었으며, 상기 패턴은 RTA 408의 환원 및 하이드록실화뿐만 아니라 RTA 408 또는 그의 환원/하이드록실화 대사산물의 글루쿠론산화와 일치하는 질량을 갖는 피크들을 포함하였다. 독특한 인간 대사산물은 관찰되지 않았으며, 이때 인간 마이크로솜 배양에서 모든 피크들은 또한 전임상 종들 중 하나 이상에서 관찰되었다. 특히, 시험관내 마이크로솜 데이터를 근거로, 모든 인간 대사산물들은 랫트 또는 원숭이, 선택된 설치류 및 비-설치류 독성 종들 중에 존재하였다.

d. 약동학 약물 상호작용

시토크롬 P450(CYP450)-매개된 대사를 억제하는 RTA 408의 잠재성을, 모아놓은 인간 간 마이크로솜 및 특정한 CYP450 효소에 대한 표준 기질을 사용하여 평가하였다. RTA 408은 CYP2C8 및 CYP3A4/5를 각각의 효소에 대해서 대략 0.5 μM의 K_i 값으로 직접 억제하였다. 시험된 다른 효소들(CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, 또는 CYP2D6)에 대해서 의미있는 억제는 관찰되지 않았으며, 이때 시험된 최고 농도(3 μM)에서 <50% 억제를 가졌다. 또한, 시험된 효소들 중 임의의 효소의 대사-의존적인 억제의 증거는 거의 없거나 전혀 없었다. CYP3A4/5-매개된 약물-약물 상호 작용에 대한 잠재성을 조사하는 차후의 연구들은 이러한 데이터, 및 경구 투여 후 위장(GI) 관에서 국소적으로 성취될 수 있는 잠재적으로 높은 농도를 근거로 보장될 수 있다.

CYP450 효소 발현을 유도하는 RTA 408의 잠재성을 배양된 인간 간세포를 사용하여 평가하였다. 원형의 유도인자가 CYP 활성의 예상된 증가를 야기하는 조건 하에서, RTA 408(3 μM 이하)은 배양된 인간 간세포에서 CYP1A2, CYP2B6, 또는 CYP3A4 효소 활성의 유도인자가 아니었다. 효소 활성을 단리된 마이크로솜에서 CYP1A2, CYP2B6, 또는 CYP3A4 각각에 대한 펜아세틴, 부프로피온, 및 테스토스테론의 기질 전환을 모니터링함으로써 측정하였다.

F. 급성 방사선 피부염에 대한 RTA 408의 효과

급성 방사선 피부염에 대한 국소 또는 경구 예방제로서 RTA 408의 효과를 조사하였다. 수컷 BALB/c 마우스를 사용하여, 30 Gy 용량의 방사선을 0일째에 투여하였다(표 3). 참깨 오일 비히클 또는 RTA 408을 상기 랫트에게 -5 내지 -1일 및 1일 내지 30일에 투여하였다. RTA 408을 참깨 오일 중 3, 10, 및 30 ㎎/㎏으로 경구로, 및 참깨 오일 중 0.01%, 0.1% 및 1%의 조성물 백분율로 국소로 투여하였다. 상기 피부염을 4일 내지 30일에 이틀마다 맹검 평가하였다. 12일째에, 피부염의 전형적인 피크가 관찰되었으며 4 마리의 마우스를 상기 용량의 투여 후 4 시간째에 죽였다. 나머지 마우스를 30일에 투여-후 4 시간째에 죽였다. mRNA 및 조직 검사를 위해 조사된 피부 샘플뿐만 아니라 혈장을 12 및 30일에 수거하였다.

급성 방사선 피부염 모델에 대한 연구 설계

그룹	동물의 수	방사선(0일)	처리	처리 스케줄
1	수컷 9	--	비처리	--
2	수컷 10	30 Gy	비처리	--
3	수컷 14	30 Gy	비히클 대조군(참깨 오일)	-5에서 -1일 및 1에서 30일
4	수컷 14	30 Gy	RTA 408 - 0.01% 또는 3 ㎎/㎏	-5에서 -1일 및 1에서 30일
5	수컷 14	30 Gy	RTA 408 - 0.1% 또는 10 ㎎/㎏	-5에서 -1일 및 1에서 30일
6	수컷 14	30 Gy	RTA 408 - 1% 또는 30 ㎎/㎏	-5에서 -1일 및 1에서 30일

마우스를 RTA 408로 처리한 시험 그룹들에서, 피부염의 발병률은 RTA 408을 경구 또는 국소 투여로 제공한 경우 중증도가 약간 감소하는 것으로 나타났다(도 39-42). 더욱 또한, 시간의 함수로서 상기 시험 그룹들에 대한 평균 피부염 임상 점수를 플롯팅하는 곡선은, 특히 RTA 408을 경구 투여를 통해 제공한 경우에, 비처리된 시험 그룹으로부터 경구 또는 국소 형태의 RTA 408의 투여에 대해 약간의 변화를 보인다(도 43-45). 더욱 또한, 하기 표 4 및 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 3 이상의 임상 점수를 갖는 피부염을 앓고 있는 마우스의 백분율은 경구 투여를 통해 RTA 408로 처리된 마우스의 경우 현저하게 더 낮은 반면, 2 이상의 임상 등급을 갖는 피부염을 앓고 있는 마우스의 백분율은 RTA 408의 국소 투여가 제공된 시험 그룹의 경우 약간 더 낮았다.

G. 분할 방사선 피부염에 대한 RTA 408의 효과

국소 투여를 통한 RTA 408을 사용하여, 분할 방사선 피부염의 효과를 개선시킴에 대한 RTA 408의 효과를 측정하였다. Balb/c 마우스를 사용하여, 국소 제제 중의 RTA 408을 상기 마우스에게 0.01% 내지 1% 범위의 3 회 용량으로 -5일에서 30일까지 매일 투여하였다. 상기 마우스를 0-2일 및 5-7일에 하루에 6 회의 10-Gy 용량을 조사하였다. 상기 마우스에 대한 임상 피부염 점수를 4일부터 상기 연구가 끝날때까지 이틀마다 맹검 평가하였다. 도 46에서, 그래프는 시간의 함수로서 플롯팅된 각 그룹에 대한 평균 임상 점수의 변화를 도시한다. 상기 그래프는 RTA 408의 0.1% 내지 1% 국소 제형으로 처리된 마우스에 대한 통계학적 유의수준의 점수의 개선을 도시한다. 연구 및 치료 매개변수를 표 6에서 찾을 수 있다.

분할 방사선-유발된 피부염에 대한 연구 조건

그룹	동물의 수	방사선(0-2, 5-7일)	처리	처리 스케줄
1	수컷 9	--	비처리	--
2	수컷 14	6 x 10 Gy	비처리	--
3	수컷 18	6 x 10 Gy	비히클 대조군(참깨 오일)	QD -5에서 30일
4	수컷 18	6 x 10 Gy	RTA 408 - 0.01%	QD -5에서 30일
5	수컷 18	6 x 10 Gy	RTA 408 - 0.1%	QD -5에서 30일
6	수컷 18	6 x 10 Gy	RTA 408 - 1%	QD -5에서 30일

도 46에 나타낸 평균 임상 점수를 분석함으로써, 곡선 아래 면적(AUC) 분석을 수행하여, 피부염이 얼마나 오래 지속되는가에 대한 상기 피부염의 중증도를 제공하였다. 상기 AUC 분석은 마우스의 상이한 그룹들과 RTA 408의 상이한 백분율 조성물의 효과 간의 직접적인 비교를 허용하였다(도 47 및 표 7). 국소적인 RTA 408 제형의 투여는 2 등급 및 3 등급 병변을, 상기 마우스를 단지 비히클에 노출시켰을 때의 60% 및 33%에서부터, 1% 농도의 RTA 408에 의해 각각 21% 및 6%로 감소시켰다. 다른 RTA 조성물은 약간의 활성을 보였으나 상기 1% 제형에 의해 나타난 경우만큼 현저하지 않았다.

각각의 처리 그룹에 대한 피부염 점수의 백분율

그룹	%일수 ≥ 2	%일수 ≥3
방사선 없음, 처리 없음	0 %	0 %
방사선, 처리 없음	66%	31%
방사선, 참깨 오일	60%	33%
방사선, RTA 408 (0.01%)	54%	29%
방사선, RTA 408 (0.1%)	40%	13%
방사선, RTA 408 (1%)	21%	6%

H. 종양 성장에 대한 RTA 408 및 암 치료제의 상승 효과

전통적인 화학요법제와 함께 사용된 RTA 408의 효과에 대한 연구를 수행하여 잠재적인 치료 효능을 측정하였다. 시험관내 연구를 수행하여 2 개의 상이한 전립선암 세포주, LNCaP 및 DU-145에 대한 RTA 408의 효과를 측정하였다. 도 48a에서 볼 수 있는 바와 같이, 5-플루오로유라실에 의한 시험관내 전립선암 세포주(LNCaP)의 치료는 0.125 내지 0.5 μM 범위 용량의 RTA 408과 병행시 세포독성의 통계학적 유의수준의 증가를 보인다. 전립선암 세포주 DU-145 및 도세탁셀을 사용하는 경우, RTA 408은 상기 화학요법제의 세포독성을, 도 48b에 도시된 바와 같이 0.125 내지 0.75 μM의 RTA 408의 투여에 대해서 통계학적 유의수준 방식으로 증폭시켰다. 상기 증거는 RTA 408이 암 치료제와 상승적으로 작용할 수 있었으며 일부 실시태양에서 암 환자의 치료에 보다 큰 효능을 제공하는데 사용될 수 있다는 개념을 지지한다.

상기 시험관내 분석의 성공적인 결과 후에, 파일럿 생체내 분석을, 개똥벌레 루시페라제를 발현하도록 조작된 LNCaP/C4-2B 및 DU145 인간 전립선암(이후부터 각각 C4-2B-Luc 및 DU145-Luc라 칭한다)을 사용하여 수행하였다. 중요하게, 이들 세포주는 둘 다 안드로젠-독립적인 방식으로 성장한다. 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 세포를 TrypLE 익스프레스(Express)(인비트로젠)를 사용하여 수확하고 PBS에서 세척하고 카운트하였다. 세포를 PBS로 재조성하여 30 ㎕당 3 x 10⁶ 세포의 최종 농도(달리 서술되지 않는 한)에 도달시키고 별도의 튜브들에 분액하였다. 성장 인자-감소된 매트리젤(BD 바이오사이언스)을 +4 ℃에서 밤새 해동시키고 상기 30 ㎕ 분액의 튜브로 옮겼다. 상기 세포/매트리젤 용액을 비바리움으로 옮기고 주사 직전에 1:1 비로 혼합하였다. 각각의 마우스(총 3 마리의 동물에 대해서 그룹당 n=1)에게 상기 종양 세포의 단일 피하 주사를 제공하였다. 종양을 4 주 동안 사전-확립시켰다. 이어서, 한 마리의 동물을 3일 동안(-3에서 -1일) 하루에 한 번 RTA 408(17.5 ㎎/㎏, i.p.)로 처리하였다. 그 다음날(0일), 상기 RTA 408 처리된 동물 및 하나의 다른 동물을 단일 용량의 18 Gy IR로, 상기 종양이 이식된 골반 영역에 국소적으로 처리하였다. RTA 408로 전-처리된 마우스에게 그 다음 주 동안 이틀마다 한번 3 회 추가 용량의 RTA 408(17.5 ㎎/㎏, i.p.)을 제공하였다. 세 번째 동물에게는 처리를 제공하지 않았으며 상기 동물은 양성 대조군으로서 제공되었다. 종양 진행을 라이브 영상화를 통해 매주 모니터하였다. 루시페라제-발현 종양 세포를 검출하기 위해서, 마우스를 제조사의 프로토콜(캘리퍼 라이프사이언스(Caliper LifeScience)에 따라 영상화 5 분 전에 D-루시페린으로 IP 주사하였다. 영상화 전에 마우스를 아이소플루란 흡입에 의해 마취시키고 IVIS 루미나 XR 시스템(캘리퍼 라이프사이언스)상에서 영상화하였다. 표준화를 위해서, 대조군 종양의 영상화에 필요한 최소 노출 시간을 측정하고 모든 동물들을 상기 조건 하에서 영상화하였다. 7일째에, 종양 크기의 겉보기 감소는 대조군에 비해 상기 IR 처리된 동물에서 볼 수 없었던 반면, RTA 408 및 IR을 모두 제공받은 동물은 보다 작은 종양 상을 보였다. 14일 및 21일째에, 상기 대조군 동물은 계속된 종양 발생 및 성장을 보인 반면, 이온화 방사선으로 처리된 동물은 약간의 발생을 보였고, 21일째에 가장 현저하였다. 다른 한편으로 RTA 408 및 이온화 방사선으로 처리된 동물은 7일 내지 14일에 진행을 보이지 않았으며 21일째에는 종양을 볼 수 없었다. 주당 상기 종양의 진행을 도 49에서 볼 수 있다. 상기 시험관내 및 생체내 데이터는 모두 RTA 408이 상이한 암 치료제들의 활성을 보완하는 듯하며, 따라서 상기 작용제의 효능을 증가시키는 듯함을 나타낸다.

I. 눈 염증 모델에 대한 RAT 408의 효과

눈 염증에 대한 RTA 408의 효과에 대한 연구를 뉴질랜드 알비노 계통의 토끼를 사용하여 수행하였다. 상기 토끼를 12 마리 토끼의 5 개 그룹으로 나누고, 3 개의 상이한 농도의 RTA 408(0.01%, 0.1% 및 1%), 0.1% 볼타렌(Voltarene)(상표) 안약 및 비히클(참깨 오일)을 제공하였다. 각각의 토끼에게 복부천자의 유도 전 60 분 이내에 3 회 점안 및 복부천자의 유도 후 30 분 이내에 2 회의 점안을 제공하였다. 각각의 점안은 50 ㎕였으며 양쪽 눈에 제공되었다. 시점당 6 마리의 동물에 대해 수성 체액을, 복부천자 유도 후 30 분째 및 다시 2 시간째에 수거하였다. 염증의 양을 상기 수성 체액 중의 단백질 농도에 의해 측정하였다. 도 50에 도시된 바와 같이, RTA 408은 제형 중 단지 0.01% RTA 408에서 다른 기준 화합물들(맥시덱스 또는 마프라코라트) 중 어느 하나의 최고 농도의 경우와 유사한 수성 체액 단백질 감소를 나타내었다. RTA 408의 증가하는 농도의 효과는, 모든 농도의 RTA 408이 수성 체액 단백질 농도의 감소에 있어서 오차 내에서 비교적 유사한 효과들을 나타내는 듯하므로, 무시할만한 것으로 나타났다.

J. 다형체 선별

예비제형 및 다형성 연구를 화합물 63415에 대해서 수행하였다. 상기 연구의 부분으로서, 예비 다형성 프로그램을, 실온에서 가장 안정한 형태 및 합당하게 높은 확률로 가능한 수화물을 확인할 목적으로 수행하였다. 상 평형, 건조 실험 및 다른 기법들을 포함하여, 총 30 회의 결정화 실험을 수행하였다. 모든 수득된 고체가 FT-라만 분광학에 의해 특성화되었다. 모든 새로운 형태들이 PXRD 및 TG-FTIR, 및 임의로 DSC 및 DVS에 의해 특성화되었다.

또한, 비결정성 형태를 제조하고 특성화하였다. 상이한 기법 및 접근법을 사용하는 다수의 실험들을 수행하여 비결정성 형태를 제조하였다. 상기 비결정성 형태는 FT-라만 분광학, PXRD, TG-FTIR, DSC, DVS, 및 칼-피셔 적정에 의해 특성화되었다. 상기 비결정성 형태의 안정성을 4 주의 기간에 걸쳐 상승된 습도 및 온도 조건에서 시험하였다.

1. 출발 물질 및 명명법

63415의 2 개의 배치를 출발 물질로서 사용하였다(표 8). 63415를 또한 본 명세에서 PP415라 칭한다. 본 프로젝트 동안 제공받거나 생성된 모든 샘플들에게 형태 PP415-Px(여기에서 x는 샘플/실험 번호(x = 1, 2, ... n)를 지칭한다)의 독특한 식별 코드를 제공하였다.

출발 물질

샘플	물질	양	제공받은 날
PP415-P1	63415, 배치 #: 0141-66-1; MW = 554.7 g/mol, C33H44F2N2O3	5.0 g	2011년 3월 25일
PP415-P40	63415, 배치 #: 2083-69-DC; MW = 554.7 g/mol, C33H44F2N2O3	5.0 g	2011년 5월 27일

2. 화합물 63415, 배치 #0414-66-1(PP415-P1): 비결정성 형태

상기 63415, 배치 #0414-66-1, 출발 물질은 FT-라만 분광학, PXRD, TG-FTIR, 칼-피셔 적정, ¹H-NMR, DSC, DVS 및 대략적인 용해도 측정에 의해 특성화되었다. 결과를 표 9에 요약한다.

63415 출발 물질(PP415-P1)의 특성화

방법	결과
FT-라만	기준으로서 사용될 것이다
PXRD	예리한 피크 패턴 없음, 물질은 비결정성이다
TG-FTIR	~0.9 중량-% (~0.1 당량) EtOH, 미량의 H2O, 25℃ 내지 200℃, T > 290℃에서 분해
칼-피셔	0.5 중량-% H2O
1H-NMR	구조와 일치함, ~0.08 당량 EtOH
DSC	첫 번째 가열 스캔: 유리 전이Tg = 152.7℃ (DCp = 0.72 J/g℃); 두 번째 가열 스캔: 유리 전이 Tg = 149.7℃ (DCp = 0.45 J/g℃)
DVS	약간 흡습성; Dm = +0.4% (50%→85% r.h.); FT-라만 및 PXRD 불변

FT-라만 스펙트럼(도 58)을 출발 물질에 대한 표준 스펙트럼으로서 사용할 것이다. PXRD(도 59)는 예리한 피크 패턴을 보이지 않는다. ∼10-20 °2θ에서 넓은 할로는 비결정성 물질의 특징이다.

TG-FTIR 써모그램(도 60)은 25 내지 200 ℃에서 미량의 H₂O와 함께 ∼0.9 중량% EtOH(즉 ∼0.1 당량)의 점진적인 손실을 나타낸다. 분해는 T>290 ℃에서 시작한다.

0.5 중량%의 수 함량이 칼-피셔 적정에 의해 측정되었다.

¹H-NMR 스펙트럼(도 61)은 상기 구조와 일치하며 상기 TG-FTIR 써모그램과 일치하게, ∼0.08 당량의 EtOH를 나타낸다.

DSC 써모그램(도 62)은 첫 번째 가열 스캔에서 T_g = 152.7 ℃(ΔC = 0.72 J/g℃)에서 비결정성 물질의 유리 전이를 나타낸다. 급냉(quench cooling) 후 두 번째 스캔에서, 상기 유리 전이는 T_g = 149.7 ℃(ΔC = 0.45 J/g℃)에서 발생한다.

DVS 등온선(도 63)은, 상대 습도가 50% r.h.에서 0% r.h.으로 강하시 1.0 중량%의 점진적인 질량 손실이 발생하였고; 평형이 0% r.h.에서 도달되었음을 나타낸다. 상기 상대 습도가 95% r.h.으로 증가시, 2.1 중량%의 점진적인 질량 증가(0% r.h.에서의 질량에 비해)가 발생하였고; 평형은 95% r.h.에서 도달되었다. 상기 상대 습도가 95% r.h.에서 50% r.h.으로 강하시 최종 질량은 출발 질량의 0.2 중량% 이하였다. 85% r.h.에서 0.4 중량%의 질량 증가(출발 물질에 비해)는 상기 샘플을 약간 흡습성인 것으로서 분류한다.

상기 샘플의 DVS 측정후 FT-라만 스펙트럼(도 64) 및 PXRD 패턴(도 65)은 상기 측정전 샘플의 상기 스펙트럼 및 패턴에 비해 변하지 않는다.

상기 PP415-P1 출발 물질의 대략적인 용해도를, 12 개의 용매 및 4 개의 용매 혼합물 중에서 실온에서 육안 검사와 병행된 수동 희석에 의해 측정하였다(표 10). 상기 방법 중에 내재하는 실험 오차로 인해, 상기 용해도 값을 거친 추정치로서 간주하고자 하며 오직 결정화 실험의 설계에만 사용해야 한다. 모든 용매 혼합물들을 부피 기준 비로서(v/v) 나열한다.

PP415-P1(비결정성) 출발 물질의 대략적인 용해도

용매	용해도 S [ mg / mL ]
톨루엔	S > 200
DCM	S > 200
EtOAc	S > 210
아세톤	S > 230
MeCN	S > 230
DMF	S > 210
MeOH	S < 210
EtOHa	105 < S < 210
2PrOH	16 < S < 19
DEE	S ≥ 1d
헵탄	S < 1
H2O	S < 1
2PrOH / H2O (9:1)b	7.9 < S < 8.5
MeCN / H2O (2:3)c	S < 1
EtOAc / 헵탄 (1:1)a	100 < S < 200
톨루엔 / DEE (1:1)a	S > 220

^a ~ 1일 후 관찰된 침전;

^b 수 활성(H₂O) ~ 0.7 (25 ℃에서);

^c 수 활성(H₂O) > 0.9 (50 ℃에서); ^d 처음에는 불완전 용해(S < 1), 그러나 밤새 고체 잔사가 완전히 용해됨 (S > 1).

3. 화합물 63415, 배치 # 2083-69-DC(PP415-P40): 부류 2

63415, 배치 # 2083-69-DC는 헵탄 용매이다. 상기 물질(PP415-P40)은 PXRD에 의해 특성화되었으며 부류 2에 상응하는 것으로 밝혀졌다(도 66).

부류 2는 단단히 결합된 용매와 함께, 등구조, 비-화학량론적(<0.5 당량) 용매화물(헵탄, 사이클로헥산, 아이소프로필 에테르, 1-부탄올, 트라이에틸 아민, 및 가능하게는 다른 용매, 예를 들어 헥산 및 다른 에테르의)에 상응하는 듯하다.

7.9 °2θ 및 13.8 °2θ에서 PP415-P40의 패턴에서 볼 수 있는 작은 피크들은 부류 3, 4 또는 5의 피크에 상응하지 않는다. 이들의 기원은 상기 지점에서 명확하지 않다.

4. 비결정성 형태의 화학적 안정성

비결정성 형태의 화학적 안정성을 7일의 기간에 걸쳐 상이한 용매 중에서 조사하였다.

1 ㎎/㎖ 농도의 용액/현탁액을 4 개의 유기 용매(아세톤, MeOH, MeCN, EtOAc) 및 3 개의 수성 계면활성제 매질(1% 수성 SDS, 1% 수성 트윈 80, 1% 수성 CTAB) 중에서 제조하였다.

4 개의 별도의 용액/현탁액을 각각의 용매에 대해 제조하고, 6시간, 24시간, 2일 및 7일 동안 평형화하고 후속으로 HPLC에 의해 분석하였다.

상기 HPLC 크로마토그램으로부터 획득한 상대 면적%를 표 11에 제공한다. 상기 화합물은 상기 희석제(MeCN 중의 0.1% 포름산) 중에서 다소 불안정한 것으로 보이며; 상기 시퀀스 동안(즉 ∼24 시간 이내에) 기준 샘플의 면적%(PP415-P1, 상기 시퀀스의 시작 및 끝에서 실행되었다)는 254 ㎚에서 99.9%에서 99.3%로, 242 ㎚에서 99.9%에서 99.5%로 감소하였다. 상기 효과로 인해, 상기 시퀀스의 끝을 향해 측정된 샘플(하기의 순서로 놓임: 7일, 2일, 24시간, 6 시간)은 영향을 받을수도 있으며, 상기 획득된 면적%는 과소평가될 수도 있다.

63415(PP415-P1)^a의 비결정 형태에 대한 화학적 안정성 실험

	254 nm 에서				242 nm 에서
용매	7 d	2 d	24 h	6 h	7 d	2 d	24 h	6 h
아세톤	99.6%	99.6%	99.6%	99.6%	99.7%	99.7%	99.6%	99.6%
EtOAc	99.8%	99.8%	99.8%	99.7%	99.8%	99.9%	99.8%	99.7%
MeOH	99.8%	99.8%	99.7%	99.8%	99.8%	99.9%	99.7%	99.8%
MeCN	97.7%	99.5%	99.3%	99.4%	97.4%	99.5%	99.3%	99.3%
트윈 1%b	97.7%	97.1%	95.1%	97.6%	98.7%	98.7%	96.2%	99.1%
SDS 1%c	99.7%	99.6%	99.7%	99.7%	99.8%	99.7%	99.7%	99.7%
CTAB 1%	99.3%	99.4%	99.4%	99.6%	99.3%	99.4%	99.4%	99.7%

^a 세 번째 파장(210 nm)에서, 신호 강도는 약했으며 신호 대 소음비는 크고, 따라서 적분이 수행되지 않았다

^b 현탁액, 모든 시점 동안 모든 물질이 용해되지는 않았다

^c 현탁액, 24 시간 및 6 시간 시점 동안 모든 고체가 용해되지는 않았다

분해≥1%가 7일 후 MeCN 중의 용액에 대해서, 및 1% 수성 트윈 80 매질 중의 현탁액에 대해서(254 ㎚에서 모든 시점에서, 및 242 ㎚에서 24시간, 2일 및 7일 후에) 관찰되었다.

5. 비결정성 형태의 보관 안정성

63415의 비결정성 형태의 근본적인 성질 및 물리적 안정성에 대해서 더 잘 알기 위해서, 상기 형태를 상승된 온도 및 상대 습도에서의 보관에 의해 압박하였다.

상기 비결정성 형태(PP415-P1 출발 물질)의 샘플들을 25 ℃/∼62% r.h.(NH₄NO₃의 포화된 수용액에 대해서) 및 40 ℃/∼75% r.h.(NaCl의 포화된 수용액에 대해서)에서 개방하고 60 ℃ 및 80 ℃에서 폐쇄시켜 보관하였다(표 12). 시점 0 w, 1 w, 2 w 및 4 w에서 상기 샘플들을 PXRD에 의해 검사하고 출발 물질 PP415-P1과 비교하였다.

63415(PP415-P1)의 비결정성 형태에 대한 보관 안정성 실험

샘플	조건	시점	PXRD 결과
PP415-P2a	개방, 25 ℃ / ~62% r.h.	1 w	비결정성
PP415-P2b	개방, 25 ℃ / ~62% r.h.	2 w	비결정성
PP415-P2c	개방, 25 ℃ / ~62% r.h.	4 w	비결정성
PP415-P3a	개방, 40 ℃ / ~75% r.h.	1 w	비결정성
PP415-P3b	개방, 40 ℃ / ~75% r.h.	2 w	비결정성
PP415-P3c	개방, 40 ℃ / ~75% r.h.	4 w	비결정성
PP415-P4a	폐쇄, 60 ℃	1 w	비결정성
PP415-P4b	폐쇄, 60 ℃	2 w	비결정성
PP415-P4c	폐쇄, 60 ℃	4 w	비결정성
PP415-P5a	폐쇄, 80 ℃	1 w	비결정성
PP415-P5b	폐쇄, 80 ℃	2 w	비결정성
PP415-P5c	폐쇄, 80 ℃	4 w	비결정성

1 주일(시점 1 w, 도 67), 2 주일(시점 2 w, 도 68), 및 4 주일(시점 4 w, 도 69) 후에, 4 개의 샘플은 모두, 분말 X-선 회절그림이 시점 0 w에서 출발 물질에 비해 차이를 나타내지 않으므로, 여전히 비결정성이었다.

6. 결정화 및 건조 실험

a. 결정화 실험

상 평형화, 고온 용액으로부터의 결정화, 및 증발 실험을, 합당하게 높은 확률로 실온에서 가장 안정한 무수 형태 및 가능하게는 수화물을 확인하기 위해서, 상기 비결정성 형태로부터 출발하여 수행하였다. 수득된 모든 물질은 FT-라만 분광학에 의해 특성화되었으며; 선택된 샘플들도 또한 PXRD에 의해 특성화되었다.

상기 FT-라만 스펙트럼들을 그들의 피크 위치의 유사성에 따라 부류들로 분류하였다. 원래 샘플(PP415-P1, 표 8 참조)은 결정화 산물과 함께 분류되었다. 그러나 한 부류 내의 스펙트럼들은 엄격하게 동일하지는 않지만, 유사하다. 작은 차이 및 피크 이동이 존재할 수도 있다. FT-라만 스펙트럼만을 고려할 때, 하나의 부류의 스펙트럼들이 동일한 다형태에 속하는지를 결정하는 것은 어렵다.

상기 PXRD 패턴 중의 피크들을 측정하고 이어서 상기 패턴들을 PANalytical X'Pert(하이스코어 플러스(Highscore Plus)) 소프트웨어를 사용하여 집단들로 분류하였다. 이들 집단은 고도의 유사성을 갖는 패턴들로 간주된다. 그러나, 하나의 집단내에 작지만 현저한 차이가 존재한다. 따라서, 하나의 집단내의 패턴들은 반드시 동일한 다형체에 상응하는 것은 아니지만, 매우 유사한 분자 구조를 갖는 상이한 형태들을 나타낸다. FT-라만 부류들은 모든 경우에 PXRD 집단에 상응한다.

b. 현탁액 평형화 실험

현탁액 평형화 실험을 하나의 용매 및 11 개의 용매 혼합물 중에서 수행하였다(표 13). 0.2 내지 2.0 ㎖의 상기 선택된 용매 중의 PP415-P1 ∼100 ㎎의 현탁액을 제조하고 22 내지 24 ℃에서 4 내지 15일 동안 진탕시켰다. 고체를 회수하고 FT-라만 분광학에 의해 특성화하였으며; 대부분 PXRD에 의해 또한 특성화되었다.

비결정성 형태(PP415-P1)로부터 출발하는 현탁액 평형화 실험

샘플	용매/혼합물	FT -라만 부류	PXRD 집단
PP415-P6	2PrOH	3	3
PP415-P7	1:2 EtOAc/헵탄	2	2
PP415-P8	1:2 아세톤/헥산	2	2
PP415-P9	1:3 톨루엔/DEE	2d	--
PP415-P10	1:3 MeOH/TBME	2	2
PP415-P11	1:2 MEK/사이클로헥산	2d	--
PP415-P12	9:1 EtOH/H2Oa	3	3
PP415-P13	7:3 MeCN/H2Ob	4d	4
PP415-P14	~1:1 THF/H2Oc	5d	5
PP415-P29	1:2 EtOAc/TEA	2	2
PP415-P31	9:1 PEG/H2O	1	1
PP415-P35	7:3 MeCN/H2Ob	4d	4

수 활성: ^a a(H₂O) ~ 0.5, 50 ℃에서; ^b a(H₂O) ~ 0.85, 50 ℃에서; ^c a(H₂O) > 0.99, 64 ℃에서;

^d 스펙트럼은 용매 신호를 함유한다

c. 고온 용액으로부터 결정화

PP415-P1의 고온 용액을 하나의 용매 및 4 개의 용매 혼합물 중에서 제조하였다(표 14). ∼0.2 K/분의 속도로 5 ℃로 서서히 냉각시, 3 개의 경우(-P20, -P21, -P24)에서 침전이 관찰되었다. 2 개의 경우(-P22, -P23)에서는, 심지어 2일 동안 4 내지 5 ℃에서 보관후에 조차 고체가 침전되지 않았다. 여기에서, 상기 용매는 실온에서 N₂ 흐름 하에 증발되었다. 상기 고체를 회수하고 FT-라만 분광학에 의해 특성화하였으며, 상기 비결정성 출발 물질, FT-라만 부류 1과 상이한 스펙트럼을 갖는 것들에 대해서는, 또한 PXRD에 의해 특성화하였다.

비결정성 형태(PP415-P1)로부터 시작하는 느린 냉각 실험

샘플	용매/혼합물	조건	FT -라만 부류	PXRD 집단
PP415-P20	~2:1 아세톤/H2O	55 ℃ →5 ℃	3b	3
PP415-P21	~1:5 EtOH/사이클로헥산	75 ℃ →5 ℃	2	2
PP415-P22	~1:3 MeCN/톨루엔	75 ℃ →5 ℃a	1b	--
PP415-P23	1:3 EtOAc/다이옥산	75 ℃ →5 ℃a	1b	--
PP415-P24	1BuOH	75 ℃ →5 ℃	2b	2

^a 5 ℃에서 2 일 동안 느린 냉각 및 교반 후에 침전 안됨; 실온에서 N₂ 흐름 하에 용매 증발됨.

^b 스펙트럼은 용매 신호를 함유한다

d. 증발/침전 실험

PP415-P1의 등명한(clear) 용액을 3 개의 용매 혼합물 중에서 제조하였다(표 15). 이어서 상기 용매들을 주변 조건 하에 실온에서 서서히 증발시켰다. 그러나, 상기 3 개의 실험 중 2 개(-P15 및 -P17)에서 증발이 시작되기 전에 백색 고체가 침전되었다. 상기 수득된 고체를 FT-라만 분광학 및 PXRD에 의해 검사하였다.

비결정성 형태(PP415-P1)에 대한 느린 증발 실험

샘플	용매/혼합물	FT -라만 부류	PXRD 집단
PP415-P15	1:2 DCM/IPE	2a	2
PP415-P16	1:2 MeOH/톨루엔	1a	--
PP415-P17	1:3 EtOAc/헵탄	2a	2

^a 스펙트럼은 용매 신호를 함유한다

e. 건조 실험

각 부류의 하나 이상의 샘플을, 용매화물을 탈용매화시키고 63415의 비-용매화된 결정성 형태를 획득할 목적으로 진공 하에서 건조시켰다(표 16). 상기 건조된 물질은 FT-라만, PXRD 및 TG-FTIR에 의해 추가로 특성화되었다.

결정화 실험으로부터 수득된 샘플들 상에서 수행된 건조 실험

샘플	출발 물질(부류)	조건	결과
PP415-P18	PP415-P15 (2)	r.t., 2-10 mbar, ~2 h	2
PP415-P19	PP415-P17 (2)	r.t., 2-10 mbar, ~2 h	2
PP415-P25	PP415-P6 (3)	r.t., ~3 mbar, ~5 d; 60 ℃, 5-10 mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20 mbar, ~1 d	3
PP415-P26	PP415-P13 (4)	r.t., ~3 mbar, ~5 d; 60 ℃, 5-10 mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20 mbar, ~1 d	4
PP415-P27	PP415-P14 (5)	r.t., ~3 mbar, ~5 d; 60 ℃, 5-10 mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20 mbar, ~1 d	1a
PP415-P28	PP415-P21 (2)	r.t., ~3 mbar, ~5 d; 60 ℃, 5-10 mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20 mbar, ~1 d	2b
PP415-P30	PP415-P7 (2)	50-70 ℃, 1-10 mbar, 3 d	2
PP415-P32	PP415-P19 (2)	80 ℃, <1×0-3 mbar, 3 d	2b
PP415-P33	PP415-P25 (3)	80 ℃, <1×0-3 mbar, 3 d	3
PP415-P34	PP415-P28 (2)	80 ℃, <1×0-3 mbar, 3 d	2b
PP415-P36	PP415-P35 (4)	80 ℃, <1×10-3 mbar, 3 d	4c
PP415-P37	PP415-P35 (4)	80 ℃, N2 flow, 3 d	4c
PP415-P44a	PP415-P41 (5)	80 ℃, 100 mbar, 2 d	1a
PP415-P46a	PP415-P45 (6)	80 ℃, 100 mbar, 4 d	1a

^a 성공적인 탈용매화, 용매 함량의 현저한 감소, 주로 비결정성인 샘플; PXRD에서 단지 몇 개의 넓은 피크

^b 덜 결정성인 샘플, PXRD에서 보다 넓은 피크에 의해 지시된 바와 같이

^c 성공적인 탈용매화, 용매 함량의 현저한 감소, 여전히 결정성인 샘플; 구조상 변화 없다

7. 새로운 형태(부류)의 특성화

a. 새로운 부류의 요약

63415의 비결정성 형태 외에, 4 개의 새로운 결정성 형태를 본 연구에서 획득하였다(표 17).

수득된 부류들의 요약

부류	특징	건조 실험의 결과
부류 1	비결정성 형태	--
부류 2	등구조 용매화물(예를 들어 헵탄)	건조가 성공적이지 않음
부류 3	등구조 용매화물(예를 들어 에탄올)	건조가 성공적이지 않음
부류 4	MeCN 용매화물 & 탈용매화된 용매화물	건조가 성공적이고, 구조가 불변함
부류 5	THF 용매화물	건조가 비결정성 형태를 생성시킴

부류 2: 대부분의 결정화 실험들은 부류 2의 고체 물질을 생성시켰다. 이들 샘플은 단단히 결합된 용매 분자와 함께 등구조의 비-화학량론적(<0.5 당량) 용매화물(헵탄, 사이클로헥산, 아이소프로필 에테르, 1-부탄올, 트라이에틸아민, 및 가능하게는 헥산 및 다른 용매 등의)에 상응하는 듯 하다. 상기 부류 내의 라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴은 서로 매우 유사하며, 따라서 상기 구조들은, 혼입된 상이한 용매들로 인한 단지 작은 차이와 함께, 본질적으로 동일하다고 해도 좋다.

부류 2 샘플에 대한 건조 실험은 결정성의 비-용매화된 형태를 생성시키지 않았다. 상승된 온도(80 ℃) 및 고 진공(<1 x 10^-3 mbar) 조차 상기 단단히 결합된 용매 분자를 완전하게 제거할 수 없었으며; >2 중량%의 용매 함량은 항상 남아있었다. 이들 샘플의 결정도는 감소하지만, 상이한 구조로의 변환도 실질적인 비결정화도 관찰되지 않았다.

부류 3: 부류 3의 고체 물질을 다수의 결정화 실험들로부터 수득하였다. 부류 3의 샘플은 단단히 결합된 용매 분자를 갖는 2PrOH, EtOH 및 추정상 아세톤의 등구조 용매화물인 듯하다. 이들은 ∼0.5 당량의 용매 함량을 갖는 화학량론적 반용매화물 또는 비-화학량론적 용매화물에 상응한다. 부류 2의 경우와 같이, 상기 부류 내의 라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴은 서로 매우 유사하며, 이는 상이한 용매들을 포함하는 유사한 구조들을 가리킨다.

부류 2와 유사하게, 건조 실험이 또한 성공적이지 못했다. 매우 단단히 결합된 용매 분자는 단지 부분적으로 제거될 수 있었다(1 x 10^-3 mbar 및 80 ℃에서 3 일까지 ∼5.4 중량% 내지 ∼4.8 중량%). PXRD 패턴은 불변인 채로 있었다.

부류 4: 부류 4의 물질을 오직 7:3 MeCN/H₂O 용매 시스템으로부터 수득하였다. 상기는 아마도 결정성 아세토나이트릴 반용매화물에 매우 상응하는 듯하다.

건조(승온에서 진공 또는 N₂ 흐름 하에서)에 의해 상기 용매의 대부분을, 상기 결정 구조의 변화 또는 파괴없이 제거할 수 있었다(RXRD는 불변인 채로 있었다). 따라서, 결정성, 비-용매화된 형태(또는 다소 탈용매화된 용매화물)가 수득되었다. 상기는 약간 흡습성이고(50% r.h. 내지 85% r.h.에서 ∼0.7 중량%의 질량 증가) 196.1 ℃(ΔH = 29.31 J/g)에서 가능한 융점을 갖는다.

부류 5: 부류 5를 단지 하나의 용매 시스템(∼1:1 THF/H₂O)으로부터 수득하였으며 상기 부류는 결합된 THF(및 아마도 H₂O)를 함유한다. 상기 두 성분의 함량을 별도로 정량화할 수 없기 때문에, 상기 결정성 용매화물의 정확한 성질을 측정할 수 없다.

부류 5의 건조는 완전한 탈용매화 및 상기 비결정성 형태(부류 1)로의 변환을 생성시켰다. 부류 2 물질로부터 상기 비결정성 형태를 제조하는 한 가지 가능한 공정은 부류 2에서 부류 5로의 변환에 이은 건조 및 비결정화이다.

b. 부류 1 - 비결정성 형태

부류 1, 63415의 비결정성 형태를 몇몇 결정화 실험들로부터 수득하였다(표 18). 대부분의 결정화 실험은 부류 2, 3, 4 또는 5의 결정성 물질을 생성시켰다.

출발 물질, PP415-P1은 비결정성이며 부류 1에 속한다. 오직 상기 비결정성 형태(부류 1)의 제조만을 목적으로 하는, 추가의 실험을 수행하였다.

부류 1의 고체 물질을 생성시키는 결정화 실험

샘플	방법	용매	특성화	건조
PP415-P31	현탁액 평형화	9:1 PEG/H2O	라만, PXRD	--
PP415-P22	느린 냉각a	~1:3 MeCN/톨루엔	vis. obs., 라만	--
PP415-P23	느린 냉각	1:3 EtOAc/다이옥산	vis. obs., 라만	--
PP415-P16	증발/침전	1:2 MeOH/톨루엔	vis. obs., 라만	--

^a 5 ℃에서 2일 동안 느린 냉각 및 교반 후에 침전 없음; 실온에서 N₂ 흐름 하에 용매 증발됨

c. 부류 2 - 등구조 용매화물(예를 들어 헵탄)

대부분의 결정화 실험들은 부류 2의 고체 물질을 생성시켰다(표 19). 또한, 부류 2 헵탄 용매화물의 한 배치, PP415-P40을 출발 물질로서 사용하였다(표 8 참조).

부류 2의 FT-라만 스펙트럼은 서로 분명히 유사하지만(도 70), 작은 차이를 보인다. 이들은 상기 비결정성 출발 물질, 부류 1의 스펙트럼(도 71) 및 부류 3, 4 및 5의 스펙트럼(도 72)과 현저하게 상이하다.

부류 2의 PXRD 패턴(도 73)은 상기 물질의 결정도를 입증한다. 상기 샘플들의 패턴들은 서로 매우 유사하지만, 작은 차이를 보인다(도 74). 상기 부류 2 패턴은 부류 3, 4 및 5의 패턴들과 분명히 상이하다(도 75).

샘플 PP415-P7의 TG-FTIR 써모그램(도 76)은 ∼100 ℃ 내지 290 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼7.5 중량% EtOAc 및 헵탄의 손실 및 온도 T > 290 ℃에서 분해를 보인다. 상기 TG-FTIR 실험 전에, 상기 샘플들을 진공(10 내지 20 mbar) 하에서 짧게(∼5 분간) 건조시켜 과잉의, 결합되지 않은 용매를 제거하였다. EtOAc 및 헵탄 모두의 손실이 동일한 온도 범위에서 함께 발생하며; 상기 두 용매는 모두 상기 구조내에 단단히 결합된 것으로 보인다. 반용매화물의 이론적인 EtOAc 함량(b.p. = 76 ℃)은 7.4 중량%이고, 반용매화물의 헵탄 함량(b.p. = 98 ℃)은 8.3 중량%이다. 불행하게도, 상기 두 성분의 함량을 별도로 정량화할 수 없다.

샘플 PP415-P21의 TG-FTIR 써모그램(도 77)은 ∼140 ℃ 내지 ∼250 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼5.8 중량% 사이클로헥산의 손실 및 온도 T > 250 ℃에서 분해를 보인다. 81 ℃에서 사이클로헥산의 비점과 함께, 상기 용매는 상기 구조내에 단단히 결합된 것으로 보인다. 반용매화물의 이론적인 사이클로헥산 함량은 7.1 중량%이다. 따라서, 샘플 PP415-P18은 가능하게는 비-화학량론적인 사이클로헥산 용매화물(<0.5 당량 용매 함량을 갖는다)에 상응한다.

샘플 PP415-P24의 TG-FTIR 써모그램(도 78)은 ∼50 ℃ 내지 ∼160 ℃에서 한 단계에서 ∼16.6 중량% 1BuOH의 손실, 160 ℃ 내지 230 ℃에서 두 번째 단계에서 1BuOH(6.6 중량%)의 추가적인 손실 및 온도 T > 230 ℃에서 분해를 보인다. 117 ℃에서 1BuOH의 비점과 함께, 적어도 상기 두 번째 단계의 용매는 상기 구조내에 단단히 결합된 것으로 보인다. 반용매화물의 이론적인 1BuOH 함량은 6.3 중량%이다.

샘플 PP415-P29의 TG-FTIR 써모그램(도 79)은 ∼50 ℃ 내지 ∼220 ℃에서(이 중 대부분은 180 ℃ 내지 210 ℃에서 한 단계로) ∼5.1 중량% EtOAc 및 TEA의 손실을 보인다. 분해는 온도 T > 220 ℃에서 발생한다. EtOAc 및 TEA 모두의 손실은 동일한 온도 범위에서 함께 발생하며; 이 두 용매는 모두 상기 구조내에 단단히 결합된 듯하다(77 ℃에서 EtOAc 및 89 ℃에서 TEA의 비점을 갖는다).

샘플 PP415-P47의 TG-FTIR 써모그램(도 80)은 240 ℃ 이하의 온도에서 부류 2에 대한 전형적인 2-단계 질량 손실(총 ∼7.9 중량%의 EtOAc)을 보이며, 이는 매우 단단히 결합된 용매 분자를 가리킨다.

샘플 PP415-P48의 TG-FTIR 써모그램(도 81)은, 처음에는 점진적으로 및 이어서 180 ℃ 내지 200 ℃에서 분명한 단계로 ∼3.5 중량% 에틸 포메이트 및 물의 질량 손실을 보인다. T > 240 ℃에서 분해와 동반하여 에틸 포메이트의 추가적인 손실이 있을 수도 있다.

따라서, 부류 2의 샘플들은 모두 용매 분자가 단단히 결합된, 비-화학량론적인(<0.5 당량), 등구조 용매화물에 상응한다. 상기 부류내의 라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴이 서로 매우 유사하므로, 상기 구조들은 상기 통합된 용매 분자의 상이한 크기 및 모양에 기인한 단위 셀 치수의 단지 작은 왜곡 또는 상기 단위 셀내 원자 위치의 작은 변화와 함께, 서로 본질적으로 동일할 수 있다.

부류 2의 고체 물질을 생성시키는 결정화 실험

샘플	방법	용매	특성화	건조
PP415-P7	현탁액 평형화	1:2 EtOAc/헵탄	라만, PXRD, TG-FTIR	x
PP415-P8	현탁액 평형화	1:2 아세톤/헥산	라만, PXRD	--
PP415-P9	현탁액 평형화	1:3 톨루엔/DEE	라만, PXRD	--
PP415-P10	현탁액 평형화	1:3 MeOH/TBME	라만, PXRD	--
PP415-P11	현탁액 평형화	1:2 MEK/사이클로헥산	라만	--
PP415-P29	현탁액 평형화	EtOAc/TEA	라만, PXRD, TG-FTIR	--
PP415-P15	증발/침전	1:2 DCM/IPE	라만, PXRD	x
PP415-P17	증발/침전	1:3 EtOAc/헵탄	라만, PXRD	x
PP415-P21	느린 냉각	~1:5 EtOH/사이클로헥산	라만, PXRD, TG-FTIR	x
PP415-P24	증발/침전	1BuOH	라만, PXRD, TG-FTIR	--
PP415-P43a	증발	(8:2) THF/헥산	PXRD	--
PP415-P47a	증발	EtOAc	PXRD, TG-FTIR	--
PP415-P48a	증발	에틸 포메이트	PXRD, TG-FTIR	--

^a 출발 물질: PP415-P40, 부류 2; 모든 다른 실험에서 PP415-P1, 부류 1을 출발 물질로서 사용하였다

d. 부류 2의 샘플에 대한 건조 실험

부류 2의 다수의 샘플을 진공(및 일부는 승온에서) 하에서 63415의 무수 형태를 수득하기 위한 목적으로 탈용매화시키고자 건조시켰다. 상기 건조된 샘플에 대한 세부사항 및 특성화를 하기 표 20에 제공한다.

그러나, 80 ℃ 및 진공 < 1 x 10^-3 mbar에서 3일 동안 건조시키더라도 상기 단단히 결합된 용매 분자를 완전히 제거할 수 없었으며; >2 중량%의 용매 함량이 남았다(샘플 -P32 및 -P34 참조). PXRD 패턴은 이들 샘플의 감소된 결정도를 보이지만, 상이한 구조로의 변환은 관찰되지 않았다.

부류 2 샘플에 대한 건조 실험

출발 물질		건조	건조된 물질
샘플	용매 함량	조건	샘플	용매 함량	부류
PP415-P7	EtOAc/헵탄 (~7.5%)	50-70 ℃, 1-10　mbar, 3 d	PP415-P30	헵탄 (~2.5%)	2
PP415-P15	IPE (알지 못함)	r.t., 2-10 mbar, ~2　h	PP415-P18	IPE (~7.0%)	2
PP415-P17	EtOAc(?)/헵탄 (알지 못함)	r.t., 2-10 mbar, ~2 h	PP415-P19	헵탄 (~7.6%)	2
PP415-P19	헵탄 (~7.6%)	80 ℃, <1×10-3 mbar, 3 d	PP415-P32	헵탄 (~2.2%)	2a
PP415-P21	사이클로헥산 (~5.8%)	r.t., ~3 mbar, ~5　d; 60 ℃, 5-10　mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20　mbar, ~1 d	PP415-P28	사이클로헥산 (~3.0%)	2a
PP415-P28a	사이클로헥산 (~3.0%)	80 ℃, <1×10-3 mbar, 3 d	PP415-P34	사이클로헥산 (~2.3%)	2a

^a PXRD에 따르면 다소 덜 결정성임

따라서, 상기 부류 2 용매화물은 매우 단단히 결합된 용매 분자를 갖는 것으로 보인다. 상기 용매화물들을 탈용매화하거나 또는 변환/비결정화하는 것은 어렵다.

e. PP415 - P7 → PP415 - P30

1:2 EtOAc/헵탄 중에서 현탁액 평형화 실험으로부터 수득된, 샘플 PP415-P7, 부류 2의 고체 물질을 수일 동안 진공 하에서 건조시켰다(1-10 mbar, 50 내지 70 ℃)(PP415-P30으로서).

상기 건조된 부류 2 물질(PP415-P30)의 FT-라만 스펙트럼은 원래 스펙트럼(샘플 PP415-P7, 도 82)으로부터 작은 차이를 보이지만 여전히 부류 2에 상응한다.

상기 건조된 부류 2 물질(PP415-P30)의 PXRD 패턴은 약간 더 넓고, 덜 강한 피크(도 83)를 보이지만 여전히 부류 2에 상응한다.

상기 건조된 샘플 PP415-P30의 TG-FTIR 써모그램(도 84)은 ∼50 ℃ 내지 ∼250 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼2.5 중량% 헵탄(및 약간의 EtOAc)의 손실 및 온도 T > 250 ℃에서 분해를 보인다. 상기 샘플 PP415-P7의 TG-FTIR(도 76)에 비해, 상기 두 단계의 용매 손실은 보존되나, 상기 샘플 중의 용매의 총량은 PP415-P7에서의 ∼7.5 중량%에서 PP415-P30에서의 ∼2.5 중량%로 감소하였다.

따라서, 승온(50 내지 70 ℃) 및 1 내지 10 mbar의 진공에서 상기 용매화물을 탈용매화시키고자 하는 시도는 단지 용매의 부분적인 손실만을 야기하였다.

f. PP415 - P15 → PP415 - P18

1:2 DCM/IPE 중의 침전 실험으로부터 수득한 샘플 PP415-P15, 부류 2의 고체 물질을 진공(∼2 내지 20 mbar)하에 실온에서 ∼2 시간 동안 건조시켰다(PP415-P18로서).

상기 PP415-P18의 FT-라만 스펙트럼은 샘플 PP415-P15의 스펙트럼(도 85)과 동일하며, 이들은 모두 부류 2에 상응한다.

상기 PP415-P18의 PXRD 패턴은 PP415-P15의 패턴(도 86)에 대해 작은 차이를 보인다. PP415-P18은 여전히 부류 2에 상응한다.

TG-FTIR 써모그램(도 87)은 ∼140 ℃ 내지 ∼250 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼7.0 중량% IPE의 손실 및 온도 T > 250 ℃에서 분해를 보인다. 67 ℃의 IPE 비점과 함께, 상기 용매는 상기 구조내에 단단히 결합된 것으로 보인다. 반용매화물의 이론적인 IPE 함량은 8.4 중량%이다.

불행하게도, TG-FTIR은 상기 건조 단계 전에 상기 물질을 기록하지 않았다. 그러나, 상기 용매는 상기 구조에 매우 단단히 결합된 것으로 보이며 상기 FT-라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴에서 차이가 관찰되지 않기 때문에(또는 단지 작게 관찰되기 때문에), 상기 건조는 구조 또는 용매 함량에 중요한 영향을 미치지 않는 것으로 추정된다.

g. PP415-P17 → PP415-P19 → PP415-P32

1:3 EtOAc/헵탄 중의 침전 실험으로부터 수득한 샘플 PP415-P17, 부류 2의 고체 물질을 진공(∼2 내지 20 mbar)하에 실온에서 ∼2 시간 동안 건조시켰다(PP415-P19로서).

상기 PP415-P19의 FT-라만 스펙트럼은 샘플 PP415-P17의 스펙트럼(도 88)과 동일하며; 변화를 관찰할 수 없고, 이들은 모두 부류 2에 상응한다.

상기 PP415-P19의 PXRD 패턴은 PP415-P17의 패턴(도 89)과 약간 상이하지만, 여전히 부류 2에 상응한다.

TG-FTIR 써모그램(도 90)은 ∼140 ℃ 내지 ∼270 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼7.6 중량% 헵탄의 손실 및 온도 T > 270 ℃에서 분해를 보인다. 98 ℃의 헵탄의 비점과 함께, 상기 용매는 상기 구조내에 단단히 결합한 것으로 보인다. 반용매화물의 이론적인 헵탄 함량은 8.3 중량%이다.

추가의 건조 실험(80 ℃, <1 x 10^-3 mbar, 3일)을 PP415-P32와 동일한 샘플 상에서 수행하였다.

FT-라만 스펙트럼은 변하지 않은 채로 있었다(도 88). 상기 PXRD 패턴은 여전히 부류 2에 상응하지만(도 89), 상기 샘플은 덜 결정성이었다(상기 피크가 보다 넓고 보다 낮은 S/N 비를 갖기 때문에).

TG-FTIR 써모그램(도 90)은, 대부분 170 ℃ 내지 200 ℃ 한 단계에서 ∼2.2 중량% 헵탄의 손실 및 온도 T > 250 ℃에서의 분해를 보인다.

따라서, 상기 헵탄 함량은 단지 7.6 중량%에서 2.2 중량%로 감소하였으며, 이는 상기 용매 분자의 단단한 결합을 입증한다.

h. PP415 - P21 → PP415 - P28 → PP415 - P34

∼1:5 EtOAc/사이클로헥산 중의 느린 냉각 실험으로부터 수득한 샘플 PP415-P21, 부류 2의 고체 물질을 진공(2 내지 20 mbar, 실온 내지 60 ℃)하에서 수일 동안 건조시켰다(PP415-P28로서).

상기 건조된 부류 2 물질(PP415-P28)의 FT-라만 스펙트럼은 부류 2(샘플 PP415-P21, 도 92)의 스펙트럼과 작은 차이를 보이지만, 여전히 부류 2에 상응한다.

상기 건조된 부류 2 물질(PP415-P28)의 PXRD 패턴은 PP415-P21의 패턴(도 93)에 비해 보다 넓고, 덜 강한 피크를 보이며, 이는 상기 건조된 샘플이 덜 결정성임을 가리킨다. 그러나, 상기 패턴은 여전히 부류 2에 상응한다.

상기 건조된 샘플 PP415-P28의 TG-FTIR 써모그램(도 94)은 ∼140 ℃ 내지 ∼250 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼3.0 중량% 사이클로헥산의 손실 및 온도 T > 250 ℃에서 분해를 보인다. 샘플 PP415-P21의 TG-FTIR(도 77)에 비해, 상기 두 단계의 용매 손실은 보존되지만, 상기 샘플 중 용매의 총량은 PP415-P21에서의 ∼5.8 중량%에서 PP415-P28에서의 ∼3.0 중량%로 감소하였다.

따라서, 상기 용매화물의 탈용매화는 결정도의 부분 손실과 나란히, 단지 용매의 부분 손실만을 야기하는 것으로 보인다.

상기 샘플의 추가의 건조(80 ℃, <1 x 10^-3 mbar, 3일)를 PP415-P34로서 수행하였다.

FT-라만 스펙트럼은 변하지 않은 채로 있었다(도 92). 상기 PXRD 패턴은 여전히 부류 2에 상응하지만(도 93), 상기 샘플은 덜 결정성이었다(상기 피크가 보다 넓고 보다 낮은 S/N 비를 갖기 때문에).

TG-FTIR 써모그램(도 95)은 25 ℃ 내지 270 ℃에서 2 개의 단계에서 ∼2.3 중량% 사이클로헥산의 손실 및 온도 T > 270 ℃에서 분해를 보인다.

따라서, 상기 사이클로헥산 함량은 단지 3.0 중량%에서 2.3 중량%로 감소하였으며, 이는 상기 용매 분자의 단단한 결합을 입증한다.

i. 부류 3 - 등구조 용매화물(예를 들어 에탄올)

다수의 결정화 실험은 부류 3의 고체 물질을 생성시켰으며 FT-라만 분광학, PXRD, 및 TG-FTIR에 의해 특성화되었다(표 21).

상기 부류 3의 FT-라만 스펙트럼은 서로 분명히 유사하지만(도 96) 작은 차이를 나타낸다(도 97). 상기 부류 3의 스펙트럼은 상기 비결정성 출발 물질, 부류 1의 스펙트럼(도 98) 및 부류 2, 4 및 5의 스펙트럼(도 72)과 현저하게 상이하다.

상기 부류 3의 PXRD 패턴(도 99)은 상기 물질의 결정도를 입증한다. 상기 3 개 샘플의 패턴은 서로 유사하지만, 작지한 현저한 차이를 나타낸다(도 100). 상기 부류 3 패턴은 부류 2, 4 및 5의 결정성 패턴(도 75)과 명백하게 상이하다.

상기 샘플 PP415-P6의 TG-FTIR 써모그램(도 100)은, 25 ℃ 내지 250 ℃에서(이 중 대부분은 ∼170 ℃ 내지 190 ℃에서 한 단계로) ∼5.4 중량% 2PrOH의 손실을 보인다. 분해는 T > 250 ℃에서 시작한다. 상기 TG-FTIR 실험 전에, 상기 샘플들을 진공(10 내지 20 mbar)에서 짧게(∼5 분 동안) 건조시켜 과잉의, 결합되지 않은 용매를 제거하였다. 반용매화물의 이론적인 2PrOH(b.p. = 82 ℃) 함량은 5.1 중량%이다.

상기 샘플 PP415-P12의 TG-FTIR 써모그램(도 101)은, 25 ℃ 내지 250 ℃에서(이 중 대부분은 ∼160 ℃ 내지 190 ℃에서 한 단계로) ∼4.9 중량% EtOH(미량의 물과 함께)의 손실을 보인다. 분해는 T > 250 ℃에서 시작한다. 반용매화물의 이론적인 EtOH(b.p. = 78 ℃) 함량은 4.0 중량%이다.

따라서, 부류 3의 샘플은 단단히 결합된 용매 함량과 함께, 2PrOH, EtOH, 및 추정상 아세톤의 등구조 용매화물인 것처럼 보인다. 이들은 화학량론적 반용매화물에 상응한다. 그러나, 이들 형태가 비-화학량론적 용매화물인 것을 제외할 수 없다.

상기 부류 내의 라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴은 서로 매우 유사하기 때문에, 상기 구조들은 상이한 용매 분자의 통합에 기인한 단위 셀 치수의 단지 작은 왜곡 또는 상기 단위 셀내 원자 위치의 작은 변화와 함께, 서로 본질적으로 동일할 수 있다.

부류 3의 고체 물질을 생성시키는 결정화 실험

샘플	방법	용매/혼합물	특성화	건조
PP415-P6	현탁액 평형화	2PrOH	라만, PXRD, TG-FTIR	X
PP415-P12	현탁액 평형화	9:1 EtOH/H2O	라만, PXRD, TG-FTIR	--
PP415-P20	느린 냉각	~2:1 아세톤/H2O	라만, PXRD	--

j. 부류 3의 샘플에 대한 건조 실험

2PrOH 중의 현탁액 평형화 실험으로부터 수득한 부류 3(PP415-P6)의 샘플 중 하나를 진공 하에서 수일 동안 건조시켰다(2 내지 20 mbar, 실온 내지 60 ℃, 표 22)(PP415-P25로서).

상기 건조된 부류 3 물질, 샘플 PP415-P25의 TG-FTIR 써모그램(도 102)은 50 ℃ 내지 250 ℃(이 중 대부분은 170 ℃ 내지 190 ℃에서 한 단계로)에서 ∼5.4 중량% 2PrOH의 손실, 290 ℃ 내지 320 ℃에서 ∼1.0 중량% 2PrOH의 또 다른 손실, 및 온도 T > 320 ℃에서의 분해를 보인다. ∼5.4 중량% 2PrOH의 용매 함량을 갖는 원래 부류 3 샘플 PP415-P6의 TG-FTIR(도 103)에 비해, 상기 용매 함량은 현저하게 감소한 것으로 보이지는 않는다.

상기 물질을, 상기 용매화물을 탈용매화시키고 63415의 비-용매화된 무수 형태를 수득할 목적으로, 고 진공 및 승온에서(80 ℃, <1 x 10^-3 mbar) 3일 동안 추가로 건조시켰다(PP415-P33으로서, 표 22).

상기 추가로 건조된 부류 3 물질, 샘플 PP415-P33(도 103)의 TG-FTIR 써모그램은 50 ℃ 내지 210 ℃(이 중 대부분은 160 ℃ 내지 190 ℃에서 한 단계로)에서 ∼4.2 중량% 2PrOH의 손실, 210 ℃ 내지 290 ℃에서 ∼0.5 중량% 2PrOH의 또 다른 손실, 및 온도 T > 290 ℃에서의 분해를 보인다.

상기 샘플들 PP415-P6 및 PP415-P25의 용매 함량에 비해, 상기 용매 함량은 단지 ∼5.4 중량%에서 ∼4.8 중량%로 감소되었다.

부류 3의 샘플들에 대한 건조 실험

출발 물질		건조	건조된 물질
샘플	용매 함량	조건	샘플	용매 함량	부류
PP415-P6	2PrOH (~5.4%)	r.t., ~3 mbar, ~5　d; 60 ℃, 5-10 mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20 mbar, ~1 d	PP415-P25	2PrOH (~5.4%)	3
PP415-P25	2PrOH (~5.4%)	80 ℃, <1×10-3 mbar, 3 d	PP415-P33	2PrOH (~4.8%)	3

상기 부류 3(샘플 PP415-P6), 부류 3의 건조된 물질(샘플 PP415-P25) 및 부류 3의 추가로 건조된 물질(샘플 PP415-P33)의 FT-라만 스펙트럼은 동일하며 변화를 나타내지 않는다(도 104).

부류 3(샘플 P415-P6) 및 부류 3의 추가로 건조된 물질(샘플 PP415-P33)의 PXRD 패턴은 어떠한 현저한 차이도 나타내지 않은 반면, 부류 3의 초기에 건조된 물질(샘플 PP415-P25, 도 105)의 패턴과는 몇몇 작은 이동 및 차이가 존재한다. 모든 패턴은 부류 3에 상응한다.

상기 건조가 상기 용매 함량에 큰 영향을 미치지 않았기 때문에, 상기 건조된 물질들의 FT-라만 스펙트럼 및 PXRD 패턴이 상기 건조되지 않은 물질에 비해 차이를 나타내지 않은 것은 놀라운 일이 아니다.

따라서, 부류 3은 여기에서 적용된 건조 조건(1 x 10^-3 mbar 및 80 ℃에서 3일이하)에 의해 단지 부분적으로만 제거될 수 있었던(∼5.4 중량%에서 ∼4.8 중량%) 매우 단단히 결합된 용매 분자를 갖는 등구조 용매화물들(2PrOH, EtOH 및 추정상 아세톤)의 부류이다.

k. 부류 4 - 아세토나이트릴 용매화물

부류 4를 오직 7:3 MeCN/H₂O 용매 혼합물로부터만 수득하였다(표 23). 부류 4(PP415-P13)를 생성시킨 실험을 PP415-P35로서 반복하여 추가의 건조 연구를 위한 보다 많은 물질을 제조하였다.

부류 4(샘플 PP415-P13)의 FT-라만 스펙트럼(도 72) 및 PXRD 패턴(도 75)은 부류 2, 3 및 5의 스펙트럼 및 패턴과 현저하게 상이하다.

부류 4(샘플 PP415-P13, 도 106)의 TG-FTIR 써모그램은 25 ℃ 내지 270 ℃(이 중 대부분은 ∼180 ℃ 내지 210 ℃에서 한 단계로)에서 ∼3.4 중량% MeCN(미량의 물과 함께)의 손실을 보인다. 분해는 T > 270 ℃에서 시작한다. 상기 TG-FTIR 실험 전에, 상기 샘플들을 진공(10 내지 20 mbar) 하에서 짧게(∼5 분 동안) 건조시켜 과잉의, 결합되지 않은 용매를 제거하였다. 반용매화물의 이론적인 MeCN(b.p. = 81 ℃) 함량은 3.6 중량%이다.

부류 4의 고체 물질을 생성시키는 결정화 실험

샘플	방법	용매	특성화	건조
PP415-P13	현탁액 평형화	7:3 MeCN/H2O	라만, PXRD, TG-FTIR	X
PP415-P35	현탁액 평형화	7:3 MeCN/H2O	라만, PXRD, TG-FTIR	X

l. 부류 4에 대한 건조 실험

∼7:3 MeCN/H₂O 중에서 현탁액 평형화 실험으로부터 수득한 부류 4의 샘플들을 수일 동안 진공 하에서 또는 N₂ 흐름 하에서 건조시켰다(표 24).

부류 4의 샘플들에 대한 건조 실험

출발 물질		건조	건조된 물질
샘플	용매 함량	조건	샘플	용매 함량	부류
PP415-P13	MeCN (~3.4%)	r.t., ~3 mbar, ~5 d; 60 ℃, 5-10 mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20　mbar, ~1 d	PP415-P26	MeCN (~2.8%)	4
PP415-P35	MeCN (~2.9%)	80 ℃, <1×10-3 mbar, 3 d	PP415-P36	MeCN/H2Oa (~0.6%)	4
PP415-P35	MeCN (~2.9%)	80 ℃, N2 흐름, 3 d	PP415-P37	MeCN/H2Oa (~0.9%)	4

^a 가능하게는MeCN 및 H₂O 용매 함량, 그러나 양이 적어서 측정하기 어렵다

상기 건조된 부류 4 물질(PP415-P26)의 FT-라만 스펙트럼은 부류 4(PP415-P13, 도 107)의 스펙트럼과 동일하다.

상기 건조된 부류 4 물질(PP415-P26)의 PXRD 패턴은 부류 4, 샘플 PP415-P13의 패턴과 단지 매우 작은 차이를 보인다(도 108). 일부 피크는 보다 양호하게 분리된 것으로 보이며, 피크 강도가 이동하였다. 비결정화는 관찰되지 않는다. PP415-P26의 패턴은 부류 4에 상응한다.

상기 건조된 부류 4 물질, 샘플 PP415-P26의 TG-FTIR 써모그램(도 109)은 170 ℃ 내지 250 ℃에서 ∼2.8 중량% MeCN의 손실 및 온도 T > 300 ℃에서 분해를 보인다. 샘플 PP415-P13의 TG-FTIR(도 106)에 비해, 상기 샘플의 용매 함량은 3.4 중량%에서 2.8 중량%로 감소하였다.

따라서, 상기 샘플은 부분적으로 탈용매화된 용매화물인 것으로 보인다. 후속의 특성화와 함께 두 번째 건조 실험을 위해 충분한 물질이 남아있지 않았기 때문에, 실험 PP415-P13을 반복하였다(PP415-P35로서). 부류 4의 보다 많은 물질을 제조하였으며 2 개의 건조 실험을 상기 새로 제조된 물질과 함께 수행하였다:

·PP415-P36: 진공(<1 x 10^-3 mbar) 하에 80 ℃에서 3일 동안 건조

·PP415-P37: 80 ℃에서 N₂ 하에 3일 동안 건조

이들 건조된 부류 4 샘플(PP415-P36 및 -P37)은 부류 4(즉 PP415-P35, 도 110)의 스펙트럼에 상응한다. 부류 4 물질(샘플 PP415-P35) 및 부류 4의 건조된 샘플(샘플 PP415-P36 및 PP415-P37)의 PXRD 패턴(도 111)은 동일하다. 상기 건조된 샘플들은 결정성이다.

이들 부류 4의 건조된 샘플들의 TG-FTIR 써모그램(PP415-P36의 경우 도 112 및 PP415-P37의 경우 도 113)은 25 ℃ 내지 280 ℃에서 2 개 단계로, 각각 PP415-P36 및 PP415-P37에 대해서 ∼0.6 중량% 및 ∼0.9 중량%의 단지 작은 용매 함량(MeCN 및/또는 H₂O)만을 보인다. 용매 함량은 가능하게는 MeCN 및 H₂O이나, 양이 적어서 측정하기 어렵다. 분해는 온도 T > 280 ℃에서 시작한다.

따라서, 상기 용매화물의 용매의 대부분은 결정 구조의 파괴 없이 제거될 수 있었다. 결정성, 비-용매화된 형태(또는 다소 탈용매화된 용매화물)가 수득되었다.

m. 건조되고 탈용매화된 부류 4의 추가의 특성화

부류 4(MeCN 용매화물)의 건조는 <1 중량%까지 감소된 용매 함량을 갖는 탈용매화된 용매화물을 생성시켰다(TG-FTIR).

탈용매화시 구조 변화는 발생하지 않았다(FT-라만 및 PXRD). 결정도의 현저한 상실이 관찰되지 않았다.

따라서, 63415의 비-용매화된, 결정성 형태(지금까지 공지된 유일한 것)가 수득되었다.

상기 탈용매화된 부류 4 물질은 DVS 및 DSC에 의해 추가로 특성화되었다.

DVS 등온선(도 114)은 50% r.h.에서 초기 평형화 시간 동안 ∼0.4 중량%의 질량 증가가 발생하였음을 보인다. 상기 측정 중에, 상대 습도가 50% r.h.에서 0% r.h.으로 강하될 때 ∼1.3 중량%의 점진적인, 가역적인 질량 손실이 발생하였다. 평형에 도달하였다. 상기 상대 습도를 95% r.h.으로 증가시켰을 때, ∼0.8 중량%의 점진적인 질량 증가가 관찰되었다(50% r.h.에서의 평형화 질량에 비해). 평형에 도달하였다. 상기 상대 습도를 50% r.h.까지 강하시킨 후에, 최종 질량은 상기 평형화된 출발 질량의 0.1 중량% 이하로 남아있었다. 50%r.h.에서 85% r.h.으로의 상대 습도의 증가시 ∼0.7 중량%의 질량 증가는 상기 샘플을 약간 흡습성으로서 분류시켰다.

상기 측정 후 상기 샘플의 PXRD 패턴은 상기 측정 전의 패턴에 비해 변하지 않는다(도 115).

탈용매화된 부류 4 물질의 샘플의 DSC 써모그램(도 116)은 비결정성 형태에 기여할 수 있는 유리 전이(∼150 ℃에서 예상되었다)가 없음을 보이며, 대신에 T = 196.1 ℃(ΔH = 29.31 J/g)에서 최대인 예리한 흡열 피크(추정상 융점에 상응한다)를 보이고 270 ℃ 이하에서 분해를 보이지 않는다.

또한, DSC 실험을 상기 탈용매화된 부류 4 물질과 상기 비결정성 물질, 부류 1의 ∼1:1 혼합물을 사용하여 수행하여, 상기 비결정성 물질이 상기 탈용매화된 부류 4로 변형되고 결정화되는지[이는 상기 비결정성 형태의 유리 전이 온도(T_g ∼ 150 ℃) 이상 및 상기 탈용매화된 부류 4의 융점(T_m ∼ 196 ℃) 이하에서 발생(적어도 발생한다면)할 것으로 예상되는 사건이다]의 여부를 조사하였다.

상기 혼합물의 DSC 써모그램(도 117)은 T = 156.7 ℃(ΔH = 1.47 J/g)에서 피크를 갖는 흡열 사건 및 197.0 ℃(ΔH = 14.1 J/g)에서 피크를 갖는 제 2 흡열 사건을 나타낸다. 상기 제 1 사건은 상기 비결정성 물질(T_g =

150 ℃에서 유리 전이)에 기인할 수 있었다. 상기 제 2 사건은 T_m

196 ℃에서 탈용매화된 부류 4의 용융에 상응할 수 있었다. 상기 혼합물의 융합열(ΔH = 14.1 J/g)은 순수한 탈용매화된 부류 4의 융합열(ΔH = 29.3 J/g)의 절반과 매우 상관있다.

상기 비결정성 물질의 가능한 결정화에 상응하는 상기 유리 전이와 용융간의 온도 범위에서는 흡열 사건을 관찰할 수 없었다. 따라서, 상기 탈용매화된 부류 4로의 비결정성 형태의 변환은 상기 시간의 척도에서는 발생하지 않는 것으로 보였다.

상기 비결정성 물질, 부류 1과 상기 탈용매화된 부류 4 물질의 ∼1:1 혼합물에 의한 더욱 또 다른 DSC 실험에서, 상기 가열을 173 ℃(상기 유리 전이와 상기 용융 사이)에서 멈추어 가능한 결정화를 위한 시간을 허용하였다.

상기 혼합물의 DSC 써모그램(도 118)은 T = 161.4 ℃(ΔH = 0.31 J/g)에서 피크를 갖는 흡열 사건 및 201.4 ℃(ΔH = 11.4 J/g)에서 피크를 갖는 제 2 흡열 사건을 나타낸다. 상기 첫 번째 실험에서와 같이, 상기 제 2 피크의 융합열은 증가하지 않았으며; 상기 비결정성 형태의 상기 탈용매화된 부류 4로의 변환의 표시는 볼 수 없었다.

곡선모양의 기준선(-50 ℃ 내지 150 ℃)은 아마도 인공물인 듯하다(굽은 샘플 홀더 뚜껑에 기인한다).

n. 부류 5 - THF 용매화물

부류 5를 오직 1:1 THF/H₂O 용매 혼합물로부터 수득하였다(표 25).

부류 5의 FT-라만 스펙트럼(도 71) 및 PXRD 패턴(도 75)은 부류 2, 3 및 4의 스펙트럼 및 패턴과 현저하게 상이하다.

부류 5의 TG-FTIR 써모그램(샘플 PP415-P14, 도 119)은 25 ℃ 내지 200 ℃(대부분은 ∼100 ℃ 내지 130 ℃에서 한 단계로)에서 ∼36.1 중량% THF 및 H₂O의 손실을 보인다. 상기 TG-FTIR 실험 전에, 상기 샘플들을 진공(10 내지 20 mbar) 하에서 짧게(∼5 분 동안) 건조시켜 과잉의, 결합되지 않은 용매를 제거하였다. THF 및 H₂O 모두의 손실은 함께 동일한 온도 범위에서 발생한다. 분해는 온도 T > 300 ℃에서 시작한다. 삼중용매화물의 이론적인 THF(b.p. = 66 ℃) 함량은 28.1 중량%이다. 불행하게도, 상기 두 성분들의 함량을 별도로 정량화할 수 없기 때문에, 정확한 용매화 상태를 측정할 수 없다.

샘플 PP415-P41 및 PP415-P45의 실험 및 특성화에 대한 세부사항을 제공한다.

부류 5의 고체 물질을 생성시키는 결정화 실험

샘플	방법	용매	특성화	건조
PP415-P14	현탁액 평형화	1:1 THF/H2O	라만, PXRD, TG-FTIR	X
PP415-P41b	현탁액 평형화	1:1 THF/H2O	PXRD	X
PP415-P45b ,c	현탁액 평형화	1:1 THF/H2O	PXRD	X

^b 출발 물질: PP415-P40, 부류2; 상기 표의 다른 모든 실험들에서, PP415-P1, 부류 1이 출발 물질로서 사용되었다

^c 100-mg 규모 대신에 3-g 규모

o. 부류 5에 대한 건조 실험

∼1:1 THF/H₂O 중에서 현탁액 평형화 실험으로부터 수득한 부류 5(PP415-P14)의 샘플들을 수일 동안 진공 하에서 건조시켰다(PP415-P27로서)(2 내지 20 mbar, 실온 내지 60 ℃, 표 26).

부류 5의 샘플들에 대한 건조 실험

출발 물질		건조	건조된 물질
샘플	용매 함량	조건	샘플	용매 함량	부류
PP415-P14	THF & H2O (~36 wt.-%)	r.t., ~3 mbar, ~5　d; 60 ℃, 5-10　mbar, 2×1 h; 40-50 ℃, 5-20　mbar, ~1 d	PP415-P27	-- (~0.3 wt.-%)	1 (+5)a

^a 주로 비결정성, 낮은 S/N 비를 갖는 단지 몇 개의 넓은 피크

상기 건조된 물질(PP415-P27)의 FT-라만 스펙트럼은 부류 5(PP415-P14, 도 120)의 스펙트럼과 상이하며, 그의 확장된 피크와 함께, 부류 1, 비결정성 출발 물질, PP415-P1의 스펙트럼을 좀 더 닮았다.

상기 건조된 부류 5 물질(PP415-P27)의 PXRD 패턴은 낮은 S/N 비와 함께, 단지 약간의 넓고, 낮은 강도 피크들만을 나타내며, 이는 상기 샘플의 불량한 결정도를 가리킨다(도 121). 상기 피크들 중 일부는 부류 5에 상응할 수 있지만, 다른 것들은, 즉 7.35 °2θ에서 새롭거나 이동된다.

상기 건조된 부류 5 물질의 TG-FTIR 써모그램(도 122)은 25 ℃ 내지 290 ℃에서 ∼0.3 중량%의 질량 손실 및 온도 T > 290 ℃에서 분해를 보인다. 상기 샘플은 무수성이다.

따라서, 진공 하에서 건조에 의해, 상기 물질은 그의 용매 함량을 상실하였고 또한 그의 결정도를 많이 상실하였다.

8. 비결정성 형태를 제조하기 위한 실험

비결정성 형태, 부류 1을 제조할 목적으로 실험을 출발 물질로서 부류 2 물질(PP415-P40, 표 8)을 사용하여 수행하였다. 여러 전략 및 방법들이 시도되었다:

·부류 2를 부류 5로 변환시킨 다음 부류 5를 건조시켜 비결정성 형태, 부류 1을 수득한다.

·비결정성 형태, 부류 1을, 가능하다면 ICH 부류 3 용매를 사용하여 부류 2로부터 직접 제조한다.

주로 비결정성인 물질을 100-㎎ 및 3-g 규모로 부류 5를 통해 2-단계 과정으로 부류 2 물질로부터 출발하여 제조하였다.

추가의 실험을, 상기 과정을 1-단계 과정을 단순화하고, ICH 부류 2 용매 THF를 피하고, 완전히 비결정성인 물질을 수득할 목적으로 수행하였다. 가장 유망한 방법은 냉수욕에서 아세톤 용액으로부터의 침전인 것으로 밝혀졌다. 이러한 직접적인 방법은 부류 5를 통한 2-단계 방법보다 훨씬 더 양호한 결과를 제공한다.

a. 부류 5를 통한 비결정성 형태의 제조

출발 물질로서 부류 2, PP415-P40을 사용하는 결정화 실험을, 상기 헵탄 용매화물을 부류 5로 변환시킨 다음(THF 용매화물과 같이), 부류 5를 건조시켜 비결정성 물질을 수득할 목적으로 수행하였다(표 27).

부류 5는 부류 2 또는 3보다 탈용매화 및 비결정화시키기 용이하므로, 양호한 중간 단계인 것으로 생각된다.

부류 5 물질을 통한, 비결정성 형태, 부류 1의 제조를 목적으로 하는 실험들의 요약

단계	샘플	방법	조건	결과
1	PP415-P41	현탁액 평형화	1:1 THF/H2O, 24 ℃, 3 d	부류 5
	PP415-P45	현탁액 평형화	1:1 THF/H2O, r.t. 1 d	부류 5
2	PP415-P44a	건조	100 mbar, 80 ℃, 2 d	부류1a; 0.9 중량-% THF
	PP415-P46a	건조	100 mbar, 80 ℃, 4 d	부류 1a; 0.4 중량-% H2O

^a 주로 비결정성, 낮은 S/N 비를 갖는 단지 몇 개의 넓은 피크

b. 단계 1: 부류 2의 부류 5로의 변환

헵탄 용매화물, 부류 2의 THF 용매화물, 부류 5로의 변환은, 상기 PP415-P40(헵탄 용매화물) 물질을 (1:1) THF/H₂O 혼합물에 현탁하고 상기 현탁액을 실온에서 평형화함으로써(PP415-P41, 100 ㎎-규모) 성공적으로 수행되었다. 생성되는 고체 물질은 THF 용매화물, 부류 5에 상응한다(도 123).

상기 ㎎-규모에서 g-규모(x30, 즉 3-g 규모)로의 첫 번째 규모확대 실험을 PP415-P41과 유사하게 수행하였다: 상기 부류 2 헵탄 용매화물 출발 물질(PP415-P40)을 하룻동안 THF/H₂O(1:1) 중에서 평형화하고 부류 5, THF 용매화물(PP415-P45, 도 124)로 성공적으로 변환시켰다.

c. 단계 2: 건조에 의한 부류 5 물질의 비결정화

부류 5 물질(THF 용매화물)을 API MFG 부위에서 사용될 수 있는 조건을 고려하면서 진공(∼100 mbar) 하에 승온(80 ℃)에서 건조시켰다.

상기 100-㎎ 규모 실험의 물질, PP415-P41을 하룻동안 80 ℃ 및 100 mbar에서 건조시킨 후에, 상기 물질은 주로 비결정성 물질(PP415-P44, 도 125)로 변환되었다. 상기 PXRD 패턴은 단지 낮은 강도의 약간 넓은 피크들만을 보인다. 밤새 추가로 건조(80 ℃, 100 mbar)시킨 후에, 이들 넓은 피크의 강도는 더욱 감소된다(PP415-P44a). 상기 물질의 TG-FTIR은 25 ℃에서 280 ℃에서 점진적으로 ∼0.9 중량% THF(미량의 물과 함께)의 손실 및 온도 T > 300 ℃에서의 분해를 보인다(도 126).

상기 3-g 규모 실험의 물질, PP415-P45를 또한 80 ℃ 및 100 mbar에서 건조시켰다(PP415-P46으로서) 상기 물질은 단지 낮은 강도의 약간 넓은 피크들만을 갖는, 주로 비결정성 물질로 밤새 변환되었다(도 127). 총 4일의 건조(80 ℃, 100 mbar) 후에, 이들 넓은 피크는 여전히 존재한다(-P46a, 도 128). 상기 물질의 TG-FTIR은 THF 함량은 없으나, 25 ℃ 내지 250 ℃에서 점진적으로 ∼0.4 중량% 물의 손실 및 온도 T > 250 ℃에서의 분해를 보인다(도 129).

d. 직접적인 비결정성 형태의 획득

부류 5를 통한 2-단계 과정에서 부류 2 물질로부터 출발하는 비결정성 형태의 제조는 주로, 완전히는 아니지만, 성공적이었다. 따라서, 추가의 실험을, 상기 과정을 1-단계 과정으로 단순화하고, ICH 부류 2 용매 THF의 사용을 피하고, 완전히 비결정성인 물질을 수득할 목적으로 수행하였다(표 28).

상기 비결정성 형태, 부류 1을, N₂ 흐름 하에 THF 중의 부류 2 용액의 증발 실험에서 부류 2 물질로부터 직접 제조하였다(PP415-P42, 도 129).

상당량의 나머지 용매와 함께 불완전하게 건조된 헵탄/헥산 용매화물을 시뮬레이션하고자, 8:2 THF/헥산 용액 중의 부류 2 용액의 증발을 수행하였다(헥산을, 상기 용매 혼합물 중에서 유사한 비점을 갖도록 하기 위해 헵탄 대신에 사용하였다). 그러나, 상기 생성되는 고체는 부류 5가 아닌, 등구조 용매화물의 부류인 부류 2에 상응한다(PP415-P43, 도 130).

상기 ICH 부류 2 용매화물 THF를 피하기 위해서, 증발 실험을 ICH 부류 3 용매 중에서 수행하였다.

N₂ 흐름 하에 EtOAc 중의 부류 2 용액의 증발은 부류 2(PP415-P47, 도 130)에 상응하는 PXRD 패턴을 갖는 결정성 물질을 생성시켰다. 상기 TG-FTIR(도 80)은 240 ℃ 이하의 온도에서 부류 2-전형적인 2-단계 질량 손실(총 ∼7.9 중량% EtOAc)을 나타내며, 이는 매우 단단히 결합된 용매 분자를 가리킨다.

에틸 포메이트 중에서의 증발이 또한 결정성 부류 2 물질을 제공하였으며 비결정성 형태는 제공하지 않았다(PP415-P48, 도 131). 상기 TG-FTIR(도 78)은, 처음에는 점진적으로 이어서 180 ℃ 내지 200 ℃에서 분명한 단계로 ∼3.5 중량% 에틸 포메이트의 질량 손실을 나타낸다. T > 240 ℃에서 분해와 동시에 추가적인 에틸 포메이트의 손실이 있을 수도 있다.

그러나, 부류 2 물질은, 아세톤 용액을 저온(5 ℃) 수욕에 가함으로써 비결정성 형태, 부류 1로 성공적으로 변환되었다(PP415-P49, 도 132).

이러한 상기 비결정성 형태의 제조를 위한 직접적인 방법은 보다 양호한 결과를 제공하며, 상기 2-단계 과정보다 더 유망한 경로이다.

부류 2 출발 물질로부터 직접 비결정성 형태를 수득함을 목적으로 하는 실험의 요약

샘플	방법	용매	조건	결과
PP415-P42	증발	THF	N2 흐름, 1 d	부류 1
PP415-P43	증발	8:2 THF/헥산	N2 흐름, 1 d	부류 2
PP415-P47	증발	EtOAc	N2 흐름, 1 d	부류 2
PP415-P48	증발	에틸 포메이트	N2 흐름, 1 d	부류 2
PP415-P49	침전	아세톤	H2O 욕, 5 ℃	부류 1

9. 장비 - 전형적인 측정 조건

FT-라만 분광학: OPUS 6.5 소프트웨어를 갖는 브루커(Bruker) RFS100; Nd:YAG 1064-㎚ 여기, Ge 검출기, 3500-100 ㎝^-1 범위; 전형적인 측정 조건: 100-300 mW 공칭 레이저 파워, 64-128 스캔, 2 ㎝^-1 해상도.

PXRD: 스토 스타디(Stoe Stadi) P; 마이텐(Mythen)1K 검출기; Cu-Kα 조사; 표준 측정 조건: 투과; 40 kV 및 40 mA 튜브 파워; 곡선 Ge 단색화 장치; 0.02 °2θ 단계 크기, 12s 또는 60s 단계 시간, 1.5-50.5 °2θ 또는 1.0-55 °2θ 주사 범위; 검출기 모드: 단계 스캔; 1 °2θ 또는 6 °2θ 검출기 단계; 표준 샘플 제조: 10 내지 20 ㎎ 샘플을 2 개의 아세테이트 호일 사이에 놓았다; 샘플 홀더: 스토(Stoe) 투과 샘플 홀더; 상기 샘플을 상기 측정 동안 회전시켰다.

TG-FTIR: 브루커 FT-IR 광도계 벡터 22를 갖는 넷취 써모-마이크로밸런스(Netzsch Thermo-Microbalance) TG 209; 알루미늄 도가니(미세구멍이 있음), N₂ 분위기, 10 K/분 가열속도, 25-250 ℃ 또는 25-350 ℃ 범위.

DSC: 퍼킨 엘머 DSC 7; 금 도가니(폐쇄되거나 미세구멍이 있음), 샘플을 N₂ 분위기에 충전시킴, 10 K/분 가열속도, -50 내지 250 ℃ 또는 350 ℃ 범위, 때때로, 스캔 사이에서 -50 ℃로의 급냉(-200 K/분에서).

DVS: 프로젝트 메스테크닉 솝션스 프뤼프시스템(Projekt Messtechnik Sorptions Prufsystem) SPS 11 - 100n 또는 표면 측정 시스템스 DVS-1. 상기 샘플을 미량천칭의 상부의 알루미늄 또는 백금 홀더상에 놓고, 상기 예비-한정된 습도 프로그램의 출발 전에 50% r.h.에서 2 시간 동안 평형화시켰다:

(1) 50 → 0% r.h. (5%/h); 0% r.h.에서 5 시간

(2) 0 → 95% r.h. (5%/h); 95% r.h.에서 5 시간

(3) 95 → 50% r.h. (5%/h); 50% r.h.에서 2 시간

흡습성을 하기와 같이 초기 질량에 대한 85% r.h.에서의 질량 증가를 기준으로 분류하였다: 조해성(액체를 형성하기에 충분한 물이 흡착됨), 매우 흡습성(≥15%의 질량 증가), 흡습성(<15%이지만 ≥2%의 질량 증가), 약간 흡습성(<2%이지만 ≥0.2%의 질량 증가), 또는 비-흡습성(<0.2%의 질량 증가).

용매: 모든 실험들에 대해서, 플루카, 메르크, 또는 ABCR 분석 등급 용매가 사용되었다.

대략적인 용해도 측정: 대략적인 용해도를 0.05 ㎖의 용매 중의 물질 약 10 ㎎의 현탁액의 단계적 희석에 의해 측정하였다. 상기 물질이 총 >10 ㎖ 용매의 첨가에 의해 용해되지 않았으면, 상기 용해도를 <1 ㎎/㎖로서 나타낸다. 상기 방법에 내재된 실험 오차로 인해, 상기 용해도 값을 거친 추정치로서 간주하고자 하며, 이를 오직 결정화 실험의 설계에만 사용해야 한다.

화학적 안정성 측정: 1.0 ㎖의 각각의 용매 중의 PP415-P1 물질 1.0 ㎎의 4 개의 샘플을 제조하였다. 생성되는 현탁액/용액을 온도-조절식 에펜도르프 써모믹서 컴포트(Eppendorf Thermomixer Comfort) 진탕기에서 500 rpm의 진탕 속도로 25 ℃에서 7일, 2일, 24시간 및 6시간 동안 평형화하였다. 필요한 경우, 상기 고체상을 필터 원심분리(0.5-㎛ PVDF 멤브레인)에 의해 분리시켰다. 상기 여액을 희석제(MeCN 중의 0.1% 포름산)로 ≤0.2 ㎎/㎖ 농도(알지 못하며 현탁액의 경우에 더 낮은 듯함)로 희석하고 표 29에 제공된 HPLC 방법을 사용하여 검사하였다. 기준으로서, 상기 PP415-P1 물질을 상기 희석제 중에서 0.25 ㎎/㎖의 농도로 희석하고 상기 HPLC 시퀀스의 시작 및 끝에 가하였다.

HPLC 결과

화학적 안정성 측정에 사용된 HPLC 방법

컬럼	조르박스 이클립스(Zorbax Eclipse) XDB-C18, 3×150 mm, 5 ㎛ (CC19)
용출제 A	H2O + 0.1% 포름산
용출제 B	MeCN + 0.1% 포름산
구배	0 분 10.0 분 15.0 분 15.1 분 20.0 분	50% A 10% A 0% A 50% A 50% A	50% B 90% B 100% B 50% B 50% B
흐름	0.75 mL/분
주입 부피	10 ㎕
파장	254 nm, 242 nm, 210 nm
포착 시간	20 분
실행 시간	20 분
컬럼 온도	25 ℃
체류 시간	8.9-9.0 분

10. 약어

AUC 곡선 아래 면적 분석

DSC 시차 주사 열량 측정

DVS 동적 증기 수착

FT Raman 퓨리에-변환 라만 분광학

1H-NMR 양성자 핵 자기 공명 분광학

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

PXRD 분말 X-선 회절

TG-FTIR 퓨리에 변환 적외선 분광학과 결합된 열중량분석

화학물질:

1BuOH 1-부탄올

CTAB 세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드

DCM 다이클로로메탄

DEE 다이에틸 에테르

DMF N,N-다이메틸포름아미드

EtOAc 에틸 아세테이트

EtOH 에탄올

IPE 아이소프로필 에테르

MeCN 아세토나이트릴

MEK 메틸 에틸 케톤

MeOH 메탄올

PEG 프로필렌 글리콜

PTFE 폴리테트라플루오로에틸렌, 테플론

2PrOH 2-프로판올, 아이소프로판올

SDS 나트륨 도데실 설페이트

TBME 3급-부틸 메틸 에테르

TEA 트라이에틸아민

THF 테트라하이드로퓨란

Tween 80 폴리옥시에틸렌(80) 솔비탄 모노올리에이트 또는 폴리솔 베이트 80

유전자, 단백질, 및 생물학적 매개변수들:

AIM 산화방지성 염증 변경인자 (modulator)

Akr1c1 알도-케토 리덕타제 군 1, 구성원 c1

ALP 알칼리성 포스파타제

ALT 알라닌 트랜스아미나제

ARE 산화방지성 반응 요소

AST 아스파테이트 트랜스아미나제

AUC 곡선 아래 면적

BAL 기관지폐포 세척

BALF 기관지폐포 세척액

Bil 빌리루빈

BUN 혈액 유레아 질소

COPD 만성 폐쇄성 폐 질환

COX-2 사이클로옥시게나제-2

Cr 크레아틴

CYP450 시토크롬 P450

Eh-1 에폭사이드 하이드롤라제 1

G6PD 글루코스-6 포스페이트 데하이드로게나제

Gclc 글루타메이트-시스테인 리가제, 촉매 서브유닛

Gclm 글루타메이트-시스테인 리가제, 변형인자 서브유닛

Ggt1 감마-글루타밀트랜스퍼라제

Glrx 글루타레독신-1

Glu 글루코스

GOT 글루탐산-옥살로아세트산 트랜스아미나제

GPT1 글루탐산-피루베이트 트랜스아미나제

Gpx3 글루타치온 퍼옥시다제 3

GSH 글루타치온

GSR 글루타치온 리덕타제

GSs 글루타치온 신세타제

GST 글루타치온 S-트랜스퍼라제

GSTa1 글루타치온 S-트랜스퍼라제 알파 1

GSTp1 글루타치온 S-트랜스퍼라제 파이 1

Gy 그레이

H6PD 헥소스-6-포스페이트 데하이드로게나제

hERG 인간 에테르 a-go-go-관련 유전자

HMOX1 헴 옥시게나제(탈순환) 1

HO-1 헴 옥시게나제

IFNγ 인터페론-감마

IL 인터류킨

iNOS 유도성 산화 질소 신타제

IκBα B-세포 억제제, 알파 중의 카파 경 폴리펩타이드 유전자 인헨서의 핵 인자

KC 마우스 IL-8 관련 단백질

Keap1 켈치(Kelch)-유사 ECH 결합된 단백질-1

LPS 리포폴리사카라이드

ME1 말산 효소 1

MPCE 소핵화된 다색성 적혈구

Mrp metG-관련된 단백질

Mrps 다중약물 내성-관련된 단백질

NADPH 환원된, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페 이트,

NFκB 활성화된 B 세포의 카파-경쇄-인헨서의 핵 인자

NO 산화 질소

NQO1 NAD(P)H 퀴논 옥시도리덕타제 1

Nrf2 핵 인자(적혈구-유래된)-형 2

p- IκBα 인산화된 IκBα

PBMC 말초 혈액 단핵세포

PCE 다색성 적혈구

PGD 포스포글루코네이트 데하이드로게나제

PMN 다형핵

RANTES 조절되고 정상 T 세포 발현되고 분비된

SOD1 초과산화물 디스뮤타제 1

SRXN1 설피레독신-1

TG 총 글리세라이드

TKT 트랜스케톨라제

TNFα 종양 괴사 인자 알파

Txn 티오레독신

TXNRD1 티오레독신 리덕타제 1

xCT 용질 담체 군7, 구성원 11

기타:

API 활성 약학 성분

aq. 수성

b.p. 비점

cryst. 결정성

decomp. 분해

d 일(들)

eq. 당량

equil. 평형화

evap. 증발

h 시간(들)

mat. 물질

min 분(들)

m.p. 융점

MS 분자체

part. 부분적으로

precip. 침전

r.h. 상대 습도

rpm 분당 회전수

r.t. 실온(~25 ℃)

S/N 신호 대 소음(비)

solv. 용매

susp. 현탁액

T 온도

Tg 유리 전이 온도

theo. 이론적인

vis. obs. 육안 관찰

w 주(들)

wt.-% 중량 퍼센트

K. 추가적인 표들

본 발명에 개시되고 특허청구된 화합물, 다형태, 제형 및 방법들은 모두 본 명세에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 화합물, 다형태, 제형 및 방법을 바람직한 실시태양에 관하여 개시하였지만, 본 발명의 개념, 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 상기 화합물, 다형태, 제형 및 방법뿐만 아니라, 본 발명에 개시된 방법의 단계들 또는 단계들의 순서에 변화를 적용할 수도 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 몇몇 작용제들을, 동일하거나 유사한 결과가 성취되는 한, 본 발명에 개시된 작용제들 대신 사용할 수도 있음은 자명할 것이다. 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 상기와 같은 유사한 치환체 및 변형들은 모두 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 진의, 범위 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.

참고문헌

하기의 참고문헌들은 본 발명에 나열된 것들에 보충적인 예시적인 과정 또는 다른 세부사항들을 제공하는 정도로 본 발명에 구체적으로 인용된다.

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SEQUENCE LISTING <110> Reata Pharmaceuticals, Inc. <120> 2,2-DIFLUOROPROPIONAMIDE DERIVATIVES OF BARDOXOLONE METHYL, POLYMORPHIC FORMS AND METHODS OF USE THEREOF <130> REAT.P0073WO <150> 61/780,444 <151> 2013-03-13 <150> 61/775,288 <151> 2013-03-08 <150> 61/687,669 <151> 2012-04-27 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 1 gctgtggcta ctgcggtatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 2 atctgcctca atgacaccat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 tccgatgggt ccttacactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 taggctcctt cctcctttcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 aaaacactgc cctcttgtgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 gtgccagtca gcatctggta 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 gatgagaagg accccacggc gtctg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 8 gagacaatcc agcagcccag gaggg 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 9 attgccactg gtgaaagacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 10 accaattttg ttggccatgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 11 gaggccgtgt acaccaagat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 12 agcagtgggg tgaaaatacg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 13 aaggcactct acgcttccaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 14 aggagtcctg gcagttttca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 15 catctccgag agcaacatca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 16 ttgtattggc ggctagttcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 17 tatatcctgg ccaaggcaac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 18 ggataaagcc gaccctcttc 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 19 tcaggctaca gaagaggctt gc 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 20 acagtcacag gcttgcggat g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 21 tcgggctagt cccagttaga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 22 aaagagctgg agagccaacc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 23 cacggagcag gtcttcaacg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 24 agaatggtca tccggaaatg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 25 cgcggtgcag gtcaactact 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 26 cctcatcagc caggagaaaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 27 ggctattcgc tattttgtgt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 gaccaggtga ttcgtacaat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 agagtcctct tcagtcattg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 30 atgattagag cagatggtgg 20

Claims (109)

1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
   

   

   .
2. 제 1 항에 있어서,
   약학적으로 허용 가능한 염의 형태인 화합물.
3. 제 1 항에 있어서,
   염의 형태가 아닌 화합물.
4. 하기 화학식을 갖는 화합물의 다형태:
   

   

   
   상기에서, 상기 다형태는 약 14 °2θ에서 할로 피크를 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는다.
5. 제 4 항에 있어서,
   X-선 분말 회절 패턴(CuKα)이 약 8 °2θ에서 숄더 피크를 또한 포함하는 다형태.
6. 제 4 항에 있어서,
   X-선 분말 회절 패턴(CuKα)이 실질적으로 도 59에 도시된 바와 같은 다형태.
7. 제 4 항에 있어서,
   약 150 ℃ 내지 약 155 ℃의 T_g를 또한 갖는 다형태.
8. 제 7 항에 있어서,
   약 153 ℃의 T_g를 또한 갖는 다형태.
9. 제 7 항에 있어서,
   약 150 ℃의 T_g를 또한 갖는 다형태.
10. 제 4 항에 있어서,
    약 150 ℃ 내지 약 155 ℃에 집중된 흡열(endotherm)을 포함하는 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선을 또한 갖는 다형태.
11. 제 10 항에 있어서,
    흡열이 약 153 ℃에 집중되는 다형태.
12. 제 10 항에 있어서,
    흡열이 약 150 ℃에 집중되는 다형태.
13. 제 4 항에 있어서,
    실질적으로 도 62에 도시된 바와 같은 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선을 갖는 다형태.
14. 하기 화학식을 갖는 화합물의 다형태:
    

    

    
    상기에서, 상기 다형태는 약 5.6, 7.0, 10.6, 12.7 및 14.6 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 용매화물이다.
15. 제 14 항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴(CuKα)이 실질적으로 도 75, 맨위 패턴에 도시된 바와 같은 다형태.
16. 하기 화학식을 갖는 다형태:
    

    

    
    상기에서, 상기 다형태는 약 7.0, 7.8, 8.6, 11.9, 13.9(이중 피크), 14.2 및 16.0 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 용매화물이다.
17. 제 16 항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴(CuKα)이 실질적으로 도 75, 맨위에서부터 두 번째 패턴에 도시된 바와 같은 다형태.
18. 하기 화학식을 갖는 화합물의 다형태:
    

    

    
    상기에서, 상기 다형태는 약 7.5, 11.4, 15.6 및 16.6 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 아세토나이트릴 반용매화물이다.
19. 제 18 항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴(CuKα)이 실질적으로 도 75, 맨아래에서부터 두 번째 패턴에 도시된 바와 같은 다형태.
20. 제 18 항에 있어서,
    약 196 ℃의 T_g를 또한 갖는 다형태.
21. 제 18 항에 있어서,
    약 196 ℃에 집중된 흡열을 포함하는 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선을 또한 갖는 다형태.
22. 제 18 항에 있어서,
    실질적으로 도 116에 도시된 바와 같은 시차 주사 열량측정(DSC) 곡선을 갖는 다형태.
23. 하기 화학식을 갖는 화합물의 다형태:
    

    

    
    상기에서, 상기 다형태는 약 6.8, 9.3, 9.5, 10.5, 13.6 및 15.6 °2θ에서의 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴(CuKα)을 갖는 용매화물이다.
24. 제 23 항에 있어서,
    X-선 분말 회절 패턴(CuKα)이 실질적으로 도 75, 맨아래 패턴에 도시된 바와 같은 다형태.
25. 약제에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 4 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 다형태.
26. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제 4 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 다형태로 이루어진 활성 성분, 및
    약학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
27. 제 26 항에 있어서,
    경구, 지방내, 동맥내, 관절내, 두개내, 피내, 병변내, 근육내, 비내, 안내, 심막내, 복강내, 늑막내, 전립선내, 직장내, 척추강내, 기관내, 종양내, 탯줄내, 질내, 정맥내, 소낭내, 유리체내, 리포솜으로, 국소로, 점막으로, 비경구로, 직장으로, 결막하로, 피하로, 설하로, 국소로, 볼통과로, 경피로, 질내로, 크림 중에서, 액체 조성물 중에서, 카테터를 통해서, 세척을 통해서, 연속 주입을 통해서, 주입을 통해서, 흡입을 통해서, 주사를 통해서, 국소 전달을 통해서, 또는 국소화된 관류를 통해서 투여하기 위해 제형화되는 약학 조성물.
28. 제 27 항에 있어서,
    경구, 동맥내, 정맥내, 또는 국소 투여를 위해서 제형화되는 약학 조성물.
29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    경구 투여를 위해서 제형화되는 약학 조성물.
30. 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    경질 또는 연질 캡슐, 정제, 시럽, 현탁액, 유화액, 용액, 고체 분산액, 웨이퍼, 또는 엘릭서로서 제형화되는 약학 조성물.
31. 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용해성 및 분산성을 증대시키는 작용제를 또한 포함하는 약학 조성물.
32. 제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물 또는 다형태가 참깨 오일 중에 현탁된 약학 조성물.
33. 제 26 항 내지 제 28 항 및 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    국소 투여를 위해 제형화되는 약학 조성물.
34. 제 33 항에 있어서,
    로션, 크림, 젤, 오일, 연고, 고약, 유화액, 용액 또는 현탁액으로서 제형화되는 약학 조성물.
35. 제 34 항에 있어서,
    로션으로서 제형화되는 약학 조성물.
36. 제 34 항에 있어서,
    크림으로서 제형화되는 약학 조성물.
37. 제 34 항에 있어서,
    젤로서 제형화되는 약학 조성물.
38. 제 26 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성 성분의 양이 약 0.01 내지 약 5 중량%인 약학 조성물.
39. 제 38 항에 있어서,
    활성 성분의 양이 약 0.01 내지 약 3 중량%인 약학 조성물.
40. 제 39 항에 있어서,
    활성 성분의 양이 약 0.01 중량%인 약학 조성물.
41. 제 39 항에 있어서,
    활성 성분의 양이 약 0.1 중량%인 약학 조성물.
42. 제 39 항에 있어서,
    활성 성분의 양이 약 1 중량%인 약학 조성물.
43. 제 39 항에 있어서,
    활성 성분의 양이 약 3 중량%인 약학 조성물.
44. 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 상태의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 치료 유효량의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 제 4 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 다형태, 또는 제 26 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 상기 상태의 치료 또는 예방 방법.
45. 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 4 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 다형태, 또는 제 26 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
46. 염증 또는 산화 스트레스와 관련된 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 4 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 다형태, 또는 제 26 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 용도.
47. 상태가 염증과 관련되는, 제 44 항에 따른 방법 또는 제 45 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항에 따른 용도.
48. 상태가 산화 스트레스와 관련되는, 제 44 항에 따른 방법 또는 제 45 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항에 따른 용도.
49. 상태가 피부병 또는 피부 질환, 패혈증, 피부염, 골관절염, 암, 염증, 자가면역 질병, 염증성 장 질병, 이온화 방사선에의 국소화된 또는 전신 노출로부터의 합병증, 점막염, 급성 또는 만성 기관 부전, 간 질환, 췌장염, 눈 질환, 폐 질환 또는 당뇨병인, 제 44 항 또는 제 47 항에 따른 방법 또는 제 45 항, 제 47 항 및 제 48 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
50. 상태가 피부병 또는 피부질환인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
51. 피부병 또는 피부 질환이 피부염, 열적 또는 화학적 화상, 만성 상처, 여드름, 탈모증, 모낭의 다른 질환, 수포성 표피박리증, 일광화상, 일광화상의 합병증, 피부 착색 질환, 노화-관련된 피부 상태, 수술후 상처, 피부 손상 또는 화상으로부터의 흉터, 건선, 자가면역 질병 또는 이식편대 숙주병의 피부학적 발현, 피부암, 또는 피부세포의 과잉증식을 수반하는 질환인, 제 50 항에 따른 방법 또는 제 50 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 50 항에 따른 용도.
52. 피부병 또는 피부질환이 피부염인, 제 51 항에 따른 방법 또는 제 51 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 51 항에 따른 용도.
53. 피부염이 알러지성 피부염, 아토피성 피부염, 화학물질 노출로 인한 피부염, 또는 방사선-유발된 피부염인, 제 52 항에 따른 방법 또는 제 52 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 52 항에 따른 용도.
54. 피부병 또는 피부질환이 만성 상처인, 제 51 항에 따른 방법 또는 제 51 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 51 항에 따른 용도.
55. 만성 상처가 당뇨성 궤양, 욕창, 또는 정맥궤양인, 제 54 항에 따른 방법 또는 제 54 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 54 항에 따른 용도.
56. 피부병 또는 피부질환이 탈모증인, 제 51 항에 따른 방법 또는 제 51 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 51 항에 따른 용도.
57. 탈모증이 대머리 또는 약물-유발된 탈모증인, 제 56 항에 따른 방법 또는 제 56 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 56 항에 따른 용도.
58. 피부병 또는 피부질환이 피부 착색 질환인, 제 51 항에 따른 방법 또는 제 51 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 51 항에 따른 용도.
59. 피부 착색 질환이 백반증인, 제 58 항에 따른 방법 또는 제 58 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 58 항에 따른 용도.
60. 피부병 또는 피부질환이 피부세포의 과잉증식을 수반하는 질환인, 제 51 항에 따른 방법 또는 제 51 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 51 항에 따른 용도.
61. 피부세포의 과잉증식을 수반하는 질환이 과각화증인, 제 60 항에 따른 방법 또는 제 60 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 60 항에 따른 용도.
62. 상태가 자가면역 질병인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
63. 자가면역 질병이 류마티스성 관절염, 루푸스, 크론병, 또는 건선인, 제 62 항에 따른 방법 또는 제 62 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 62 항에 따른 용도.
64. 상태가 간 질환인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
65. 간 질환이 지방간 질환 또는 간염인, 제 64 항에 따른 방법 또는 제 64 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 64 항에 따른 용도.
66. 상태가 눈 질환인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
67. 눈 질환이 포도막염, 황반 변성, 녹내장, 당뇨성 황반 부종, 안검염, 당뇨성 망막병증, 각막 내피의 질병 또는 질환, 수술후 염증, 안구 건조증, 알러지성 결막염 또는 결막염의 한 형태인, 제 63 항에 따른 방법 또는 제 66 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 66 항에 따른 용도.
68. 눈 질환이 황반 변성인, 제 67 항에 따른 방법 또는 제 67 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 67 항에 따른 용도.
69. 황반 변성이 건성 형태인, 제 68 항에 따른 방법 또는 제 68 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 68 항에 따른 용도.
70. 황반 변성이 습성 형태인, 제 68 항에 따른 방법 또는 제 68 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 68 항에 따른 용도.
71. 각막 내피의 질병 또는 질환이 푹스 내피 각막 이영양증인, 제 67 항에 따른 방법 또는 제 67 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 67 항에 따른 용도.
72. 상태가 폐 질환인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
73. 폐 질환이 폐 염증, 폐 섬유증, COPD, 천식, 낭성 섬유증, 또는 특발성 폐 섬유증인, 제 72 항에 따른 방법 또는 제 72 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 72 항에 따른 용도.
74. 폐 질환이 폐 염증인, 제 73 항에 따른 방법 또는 제 73 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 73 항에 따른 용도.
75. 폐 질환이 폐 섬유증인, 제 73 항에 따른 방법 또는 제 73 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 73 항에 따른 용도.
76. 폐 질환이 COPD인, 제 73 항에 따른 방법 또는 제 73 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 73 항에 따른 용도.
77. COPD가 담배 연기에 의해 유발되는, 제 76 항에 따른 방법 또는 제 76 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 76 항에 따른 용도.
78. 폐 질환이 천식인, 제 73 항에 따른 방법 또는 제 73 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 73 항에 따른 용도.
79. 상태가 패혈증인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
80. 상태가 방사선 요법 또는 화학요법으로부터 발생하는 점막염인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
81. 점막염이 구강 점막염인, 제 80 항에 따른 방법 또는 제 80 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 80 항에 따른 용도.
82. 상태가 이온화 방사선에의 국소 또는 전신 노출로부터의 합병증인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
83. 이온화 방사선 노출이 피부염을 야기하는, 제 82 항에 따른 방법 또는 제 82 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 82 항에 따른 용도.
84. 이온화 방사선 노출이 급성인, 제 82 항 또는 제 83 항에 따른 방법 또는 제 82 항 또는 제 83 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 82 항 또는 제 83 항에 따른 용도.
85. 이온화 방사선 노출이 분할된, 제 82 항 또는 제 83 항에 따른 방법 또는 제 82 항 또는 제 83 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 82 항 또는 제 83 항에 따른 용도.
86. 상태가 암인, 제 49 항에 따른 방법 또는 제 49 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 49 항에 따른 용도.
87. 암이 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 흑색종, 중피종, 다발성 골수종, 또는 정상피종인, 제 86 항에 따른 방법 또는 제 86 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 86 항에 따른 용도.
88. 암이 방광, 혈액, 뼈, 뇌, 유방, 중추신경계, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 방광, 생식기, 비뇨생식관, 두부, 신장, 후두, 간, 폐, 근육 조직, 경부, 구강 또는 코 점막, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 비장, 소장, 대장, 위, 고환 또는 갑상선의 암인, 제 86 항에 따른 방법 또는 제 86 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 86 항에 따른 용도.
89. 화합물 또는 약학 조성물을 하루에 단일 용량으로 투여하는, 제 44 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
90. 화합물 또는 약학 조성물을 하루에 1 회 초과 용량으로 투여하는, 제 44 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
91. 약학 조성물을 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 2000 ㎎/㎏의 단위 용량으로 투여하는, 제 44 항 내지 제 90 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
92. 용량이 약 3 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏인, 제 91 항에 따른 방법 또는 제 91 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 91 항에 따른 용도.
93. 용량이 약 3 ㎎/㎏인, 제 92 항에 따른 방법 또는 제 92 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 92 항에 따른 용도.
94. 용량이 약 10 ㎎/㎏인, 제 92 항에 따른 방법 또는 제 92 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 92 항에 따른 용도.
95. 용량이 약 30 ㎎/㎏인, 제 92 항에 따른 방법 또는 제 92 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 92 항에 따른 용도.
96. 용량이 약 100 ㎎/㎏인, 제 92 항에 따른 방법 또는 제 92 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 92 항에 따른 용도.
97. 화합물 또는 약학 조성물을 국소로 투여하는, 제 44 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
98. 국소 투여가 피부에 대한 투여인, 제 97 항에 따른 방법 또는 제 97 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 97 항에 따른 용도.
99. 국소 투여가 눈에 대한 투여인, 제 97 항에 따른 방법 또는 제 97 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 97 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
100. 화합물 또는 약학 조성물을 경구로 투여하는, 제 44 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
101. 화합물 또는 약학 조성물을 안내로 투여하는, 제 44 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
102. 약학 조성물을, 환자를 방사선 요법 또는 화학요법으로 치료하기 전 또는 치료한 직후에 투여하며, 상기 화학요법이 제 26 항의 활성 성분을 포함하지 않는, 제 44 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 45 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 46 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
103. 약학 조성물을, 환자를 방사선 요법 또는 화학요법으로 치료하기 전후 모두 투여하는, 제 102 항에 따른 방법 또는 제 102 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 102 항에 따른 용도.
104. 치료가 방사선 요법 또는 화학요법의 부작용을 감소시키는, 제 102 항 또는 제 103 항에 따른 방법 또는 제 102 항 또는 제 103 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 102 항 또는 제 103 항에 따른 용도.
105. 부작용이 점막염 및 피부염인, 제 104 항에 따른 방법 또는 제 104 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 104 항에 따른 용도.
106. 치료가 방사선 요법 또는 화학요법의 효능을 증대시키는, 제 102 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 102 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 102 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
107. 화학요법이 환자에게 치료 유효량의 5-플루오로유라실 또는 도세탁셀을 투여함을 포함하는, 제 102 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제 102 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 화합물, 다형태 또는 약학 조성물, 또는 제 102 항 내지 제 105 항 중 어느 한 항에 따른 용도.
108. 제 44 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서,
     환자가 인간인 방법.
109. 제 44 항 내지 제 107 항 중 어느 한 항에 있어서,
     환자가 비-인간 포유동물인 방법.
     
     

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