EA030468B1 - 2,2-дифторпропионамидные производные бардоксолон-метила, их полиморфные формы и способы применения - Google Patents

Abstract

Изобретение в целом относится к соединению: N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-циано-2,2,6a,6b,9,9,12a-гептаметил-10,14-диоксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-октадекагидропицен-4a-ил)-2,2-дифторпропанамиду, его полиморфным формам, способам их получения и применения, их фармацевтическим композициям и наборам, и продуктам на их основе.

Description

изобретение относится к соединению, N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)11-циано-2,2,6а,6Ь,9,9,12а-гептаметил-10,14-диоксо-1,2,3,4,4а,5,6,6а,6Ь,7,8,8а,9,10,12а,14,14а,14Ьоктадекагидропицен-4a-ил)-2,2-дифторпропанамиду (или RTA 408), или его фармацевтически приемлемой соли или полиморфной форме данного соединения (такой как, например, любая из полиморфных форм, описанных выше или ниже в настоящем описании), или фармацевтической композиции, содержащей любое из вышеупомянутых соединений и фармацевтически приемлемый носитель (включая, например, фармацевтические композиции, описанные выше), для применения для лечения или предотвращения состояния, выбранного из заболевания или поражения кожи, сепсиса, дерматита, остеоартрита, рака, воспаления, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания кишечника, осложнения в результате локализованного воздействия ионизирующего излучения или воздействия ионизирующего излучения на весь организм, воспаления слизистой оболочки, острой или хронической недостаточности органа, заболевания печени, панкреатита, болезни глаз, заболевания легких или диабета. Соответственно, настоящее изобретение относится к применению вышеупомянутого соединения, полиморфной формы или фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения состояния, выбранного из заболевания или поражения кожи, сепсиса, дерматита, остеоартрита, рака, воспаления, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания кишечника, осложнения в результате локализованного воздействия ионизирующего излучения или воздействия ионизирующего излучения на весь организм, воспаления слизистой оболочки, острой или хронической недостаточности органа, заболевания печени, панкреатита, болезни глаз, заболевания легких или диабета. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения состояния, выбранного из заболевания или поражения кожи, сепсиса, дерматита, остеоартрита, рака, воспаления, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания кишечника, осложнения в результате локализованного воздействия ионизирующего излучения или воздействия ионизирующего излучения на весь организм, воспаления слизистой оболочки, острой или хронической недостаточности органа, заболевания печени, панкреатита, болезни глаз, заболевания легких или диабета, у нуждающегося в этом пациента, при этом указанный способ включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества вышеупомянутого соединения, полиморфной формы или фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации состояние представляет собой заболевание или поражение кожи, такое как дерматит, термический или химический ожог, хроническая рана, акне, алопеция, другие нарушения волосяного фолликула, врожденный буллезный эпидермолиз, солнечный ожог, осложнения солнечного ожога, нарушения пигментации кожи, связанное со старением заболевание кожи; послеоперационная рана, шрам от повреждения или ожога кожи, псориаз, дерматологическое проявление аутоиммунного заболевания или реакции "трансплантат против хозяина", рак кожи или нарушение, в которое вовлечена гиперпролиферация клеток кожи. В некоторых вариантах реализации заболевание или поражение кожи представляет собой дерматит. В некоторых вариантах реализации дерматит представляет собой аллергический дерматит, атопический дерматит, дерматит, вызванный воздействием химических веществ, или индуцированный излучением дерматит. В других вариантах реализации заболевание или поражение кожи представляет собой хроническую рану. В некоторых вариантах реализации хроническая рана представляет собой диабетическую язву, пролежень или венозную язву. В других вариантах реализации заболевание или поражение кожи представляет собой алопецию. В некоторых вариантах реализации алопеция выбрана из облысения или алопеции, индуцированной лекарственными средствами. В других вариантах реализации заболевание или поражение кожи представляет собой нарушение пигментации кожи. В некоторых вариантах реализации нарушение пигментации кожи представляет собой витилиго. В других вариантах реализации заболевание или поражение кожи представляет собой нарушение, в которое вовлечена гиперпролиферация клеток кожи. В некоторых вариантах реализации нарушение, в которое вовлечена гиперпролиферация клеток кожи, представляет собой гиперкератоз.

В других вариантах реализации состояние представляет собой аутоиммунное заболевание, такое

- 3 030468

как ревматоидный артрит, обыкновенная волчанка, болезнь Крона или псориаз. В других вариантах реализации состояние представляет собой заболевание печени, такое как жировая инфильтрация печени или гепатит.

В других вариантах реализации состояние представляет собой болезнь глаз, такую как увеит, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетический отек желтого пятна, блефарит, диабетическая ретинопатия, заболевание или нарушение эндотелия роговицы, послеоперационное воспаление, сухость глаз, аллергический конъюнктивит или форма конъюнктивита. В некоторых вариантах реализации болезнь глаз представляет собой дегенерацию желтого пятна. В некоторых вариантах реализации дегенерация желтого пятна имеет сухую форму. В других вариантах реализации дегенерация желтого пятна имеет влажную форму. В некоторых вариантах реализации заболевание или нарушение эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

В других вариантах реализации состояние представляет собой заболевание легких, такое как воспаление легких, фиброз легких, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма, муковисцидоз или идиопатический фиброз легких. В некоторых вариантах реализации ХОБЛ индуцирована сигаретным дымом.

В других вариантах реализации состояние представляет собой сепсис. В других вариантах реализации состояние представляет собой воспаление слизистой оболочки в результате лучевой терапии или химиотерапии. В некоторых вариантах реализации воспаление слизистой оболочки проявляется в ротовой полости. В других вариантах реализации состояние связано с воздействием излучения. В некоторых вариантах реализации воздействие излучения приводит к дерматиту. В некоторых вариантах реализации воздействие излучения является острым. В других вариантах реализации воздействие излучения является фракционированным.

В других вариантах реализации состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах реализации рак представляет собой карциному, саркому, лимфому, лейкоз, меланому, мезотелиому, множественную миелому или семиному. В других вариантах реализации рак представляет собой рак мочевого пузыря, крови, костей, головного мозга, молочной железы, центральной нервной системы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, пищевода, желчного пузыря, половых органов, мочеполового тракта, головы, почки, гортани, печени, легкого, мышечной ткани, шеи, слизистой оболочки полости рта или носа, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, селезенки, тонкой кишки, толстой кишки, желудка, яичка или щитовидной железы.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят до или сразу же после лечения субъекта с помощью лучевой терапии или химиотерапии, при этом химиотерапия не включает RTA 408 или его полиморфные формы. В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят как до, так и после лечения субъекта с помощью лучевой терапии, химиотерапии или того и другого. В некоторых вариантах реализации указанное лечение уменьшает побочный эффект лучевой терапии или химиотерапии. В некоторых вариантах реализации побочным эффектом является воспаление слизистой оболочки и дерматит. В некоторых вариантах реализации лечение повышает эффективность лучевой терапии или химиотерапии. В некоторых вариантах реализации химиотерапия включает введение пациенту терапевтически эффективного количества 5-фторурацила или доцетаксела.

Настоящее изобретение также предусматривает дополнительную терапию, представляющую собой комбинированное лечение. Например, в некоторых вариантах реализации способы лечения рака у субъекта, включающие введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению, могут дополнительно включать один или более видов лечения, выбранных из группы, состоящей из введения фармацевтически эффективного количества второго лекарственного средства, лучевой терапии, иммунотерапии, генной терапии и оперативного вмешательства. В некоторых вариантах реализации указанные способы могут дополнительно включать (1) приведение клетки опухоли в контакт с соединением перед приведением указанной клетки опухоли в контакт со вторым лекарственным средством, (2) приведение клетки опухоли в контакт со вторым лекарственным средством перед приведением указанной клетки опухоли в контакт с соединением или (3) приведение клетки опухоли в контакт с соединением и вторым лекарственным средством одновременно. В некоторых вариантах реализации второе лекарственное средство может быть антибиотическим, противовоспалительным, противоопухолевым, антипролиферативным, противовирусным, иммуномодулирующим или иммуносупрессивным. В других вариантах реализации второе лекарственное средство может представлять собой алкилирующий агент, модулятор андрогенных рецепторов, вещество, разрушающее цитоскелет, модулятор эстрогеновых рецепторов, ингибитор гистондеацетилазы, ингибитор ГМГ-КоАредуктазы, ингибитор пренилпротеинтрансферазы, модулятор ретиноидных рецепторов, ингибитор топоизомеразы или ингибитор тирозинкиназы. В некоторых вариантах реализации второе лекарственное средство представляет собой 5-азацитидин, 5-фторурацил, 9-цис-ретиноевую кислоту, актиномицин D, алитретиноин, полностью-транс-ретиноевую кислоту, аннамицин, акситиниб, белиностат, бевацизумаб, бексаротен, босутиниб, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, CD437, цедираниб, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дазатиниб, даунорубицин, децитабин, доцетаксел, доластатин-10, доксифлуридин, доксорубицин, доксорубицин, эпирубицин, эрлоти- 4 030468

ниб, этопозид, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, гексаметилмеламин, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, иринотекан, изотретиноин, иксабепилон, лапатиниб, LBH589, ломустин, мехлорэтамин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митоксантрон, MS-275, нератиниб, нилотиниб, нитрозомочевину, оксалиплатин, паклитаксел, пликамицин, прокарбазин, семаксаниб, семустин, бутират натрия, фенилацетат натрия, стрептозотоцин, субероиланилид гидроксамовой кислоты, сунитиниб, тамоксифен, тенипозид, тиотепу, тиогуанин, топотекан, TRAIL, трастузумаб, третиноин, трихостатин A, вальпроевую кислоту, вальрубицин, вандетаниб, винбластин, винкристин, виндезин или винорелбин.

Также предусмотрены способы лечения или предотвращения заболевания с воспалительным компонентом у субъекта, включающие введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации указанное заболевание может представлять собой, например, обыкновенную волчанку или ревматоидный артрит. В других вариантах реализации заболевание может представлять собой воспалительное заболевание кишечника, такое как болезнь Крона или язвенный колит. В других вариантах реализации заболевание с воспалительным компонентом может представлять собой сердечно-сосудистое заболевание. В других вариантах реализации заболевание с воспалительным компонентом может представлять собой диабет, такой как диабет 1 типа или 2 типа. В других вариантах реализации RTA 408, его полиморфы и фармацевтические композиции также можно применять для лечения осложнений, связанных с диабетом. Такие осложнения хорошо известны специалисту в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, например, ожирение, гипертензию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, инсульт, заболевание периферических сосудов, гипертензию, нефропатию, нейропатию, мионекроз, ретинопатию и метаболический синдром (синдром X). В других вариантах реализации заболевание с воспалительным компонентом может представлять собой заболевание кожи, такое как псориаз, акне или атопический дерматит. Введение RTA 408, его полиморфов и фармацевтических композиций в способах лечения таких заболеваний кожи может быть, но не ограничивается ими, например, топическим или пероральным.

В других вариантах реализации заболевание с воспалительным компонентом может представлять собой метаболический синдром (синдром X). Пациент с данным синдромом характеризуется наличием трех или более симптомов, выбранных из следующей группы из пяти симптомов: (1) абдоминальное ожирение; (2) гипертриглицеридемия; (3) низкий уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП); (4) высокое кровяное давление; и (5) повышенный уровень глюкозы натощак, который может находиться в диапазоне, характерном для диабета 2 типа, если указанный пациент также страдает диабетом. Каждый из данных симптомов определен в Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III, or ATP III), National Institutes of Health, 2001, NIH Publication No. 01-3670, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Пациенты с метаболическим синдромом вне зависимости от того, есть ли у них уже клинический сахарный диабет или он развивается, обладают повышенным риском развития макрососудистых и микрососудистых осложнений, перечисленных выше, которые возникают при диабете 2 типа, таких как атеросклероз и ишемическая болезнь сердца.

Другой общий способ согласно настоящему изобретению включает способ лечения или предотвращения сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации указанное сердечно-сосудистое заболевание может представлять собой, но не ограничивается ими, например, атеросклероз, кардиомиопатию, врожденный порок сердца, застойную сердечную недостаточность, миокардит, ревматическую болезнь сердца, болезнь клапанов сердца, ишемическую болезнь сердца, эндокардит или инфаркт миокарда. Для способов лечения или предотвращения сердечно-сосудистого заболевания у субъекта также предусмотрена комбинированная терапия. Такие способы, например, могут дополнительно включать введение фармацевтически эффективного количества одного или более сердечно-сосудистых лекарственных средств. Сердечно-сосудистое лекарственное средство может представлять собой, но не ограничивается ими, например, лекарственное средство, снижающее холестерин, антигиперлипидемическое средство, блокатор кальциевых каналов, антигипертензивное средство или ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы. В некоторых вариантах реализации неограничивающие примеры сердечно-сосудистых лекарственных средств включают амлодипин, аспирин, эзетимиб, фелодипин, лацидипин, лерканидипин, никардипин, нифедипин, нимодипин, нисолдипин или нитрендипин. В других вариантах реализации другие неограничивающие примеры сердечно-сосудистых лекарственных средств включают атенолол, буциндолол, карведилол, клонидин, доксазозин, индорамин, лабеталол, метилдопу, метопролол, надолол, окспренолол, феноксибензамин, фентоламин, пиндолол, празозин, пропранолол, теразозин, тимолол или толазолин. В других вариантах реализации сердечно-сосудистое лекарственное средство может представлять собой, например, статин, такой как аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин или симвастатин.

Также предусмотрены способы лечения или предотвращения нейродегенеративного заболевания у субъекта, включающие введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации указанное нейродегенеративное заболевание может быть выбрано, например, из группы, состоящей из болезни Паркинсона,

- 5 030468

болезни Альцгеймера, рассеянного склероза (PC), болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза. В конкретных вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера. В конкретных вариантах реализации нейродегенеративное заболевание представляет собой PC, такой как первично-прогрессирующий, рецидивирующе-ремиттирующий, вторичнопрогрессирующий или прогрессирующе-рецидивирующий PC. В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой, например, примата.

В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой человека.

В конкретных вариантах способов лечения или предотвращения нейродегенеративного заболевания у субъекта, включающих введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению, лечение подавляет демиелинизацию нейронов в головном мозге или спинном мозге субъекта. В некоторых вариантах реализации лечение подавляет воспалительную демиелинизацию. В некоторых вариантах реализации лечение подавляет пересечение аксонов нейронов в головном мозге или спинном мозге субъекта. В некоторых вариантах реализации лечение подавляет пересечение нейритов в головном мозге или спинном мозге субъекта. В некоторых вариантах реализации лечение подавляет апоптоз нейронов в головном мозге или спинном мозге субъекта. В некоторых вариантах реализации лечение стимулирует ремиелинизацию аксонов нейронов в головном мозге или спинном мозге субъекта. В некоторых вариантах реализации лечение восстанавливает утраченную функцию после приступа PC. В некоторых вариантах реализации лечение предотвращает новый приступ PC. В некоторых вариантах реализации лечение предотвращает инвалидность в результате приступа PC.

Один из общих аспектов настоящего изобретения предусматривает способ лечения или предотвращения нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией генов iNOS, у субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества RTA 408, полиморфных форм или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Другой общий аспект настоящего изобретения предусматривает способ ингибирования индуцируемого IFN-γ образования оксида азота в клетках субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества RTA 408, полиморфных форм или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Другой общий аспект настоящего изобретения предусматривает способ лечения или предотвращения нарушения, характеризующегося сверхэкспрессией генов COX-2, у субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества RTA 408, полиморфных форм или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Также предусмотрены способы лечения почечной болезни/болезни почек (RKD) у субъекта, включающие введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению. См. патент США 8129429, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. RKD может являться следствием, например, токсического поражения. Токсическое поражение может быть вызвано, но не ограничивается ими, например, радиофармацевтическим препаратом или лекарственным средством. Указанное лекарственное средство может быть, например, химиотерапевтическим. В некоторых вариантах реализации RKD может являться следствием ишемически-реперфузионного повреждения. В некоторых вариантах реализации RKD является следствием диабета или гипертензии. В некоторых вариантах реализации RKD может являться следствием аутоиммунного заболевания. RKD также может быть определена как хроническая RKD или острая RKD.

В некоторых способах лечения почечной болезни/болезни почек (RKD) у субъекта, включающих введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению, указанный субъект прошел или проходит диализ. В некоторых вариантах реализации субъект перенес или является кандидатом на трансплантацию почки. Субъект может представлять собой примата. Указанный примат может представлять собой человека. Субъект в данном или любом другом способе может представлять собой, например, корову, лошадь, собаку, кошку, свинью, мышь, крысу или морскую свинку.

Настоящее изобретение также предусматривает способ повышения скорости клубочковой фильтрации или клиренса креатинина у субъекта, включающий введение указанному субъекту фармацевтически эффективного количества RTA 408, полиморфных форм или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят в однократной дозе в сутки. В других вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят в более чем одной дозе в сутки. В некоторых вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят в фармацевтически эффективном количестве.

В некоторых вариантах реализации указанная доза составляет от примерно 1 мг/кг до примерно 2000 мг/кг. В других вариантах реализации доза составляет от примерно 3 мг/кг до примерно 100 мг/кг. В других вариантах реализации доза составляет примерно 3, 10, 30 или 100 мг/кг.

В других вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят топически. В некоторых вариантах реализации топическое введение осуществляют в кожу. В других вариантах реализации топическое введение осуществляют в глаз.

- 6 030468

В других вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят перорально. В других вариантах реализации фармацевтическую композицию вводят внутрь глаза.

Другие задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны исходя из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что в то время как подробное описание и конкретные примеры показывают конкретные варианты реализации настоящего изобретения, они приведены только в качестве иллюстрации, так как различные изменения и модификации в пределах существа и объема настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники исходя из данного подробного описания.

Краткое описание чертежей

Следующие чертежи составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять со ссылкой на один из данных чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов реализации, представленных в настоящем документе.

Фиг. 1 - влияние RTA 408 на индуцируемое IFNy образование оксида азота и жизнеспособность клеток в клетках RAW264.7.

Фиг. 2а и b - влияние RTA 408 на активацию антиоксидант-отвечающего элемента (ARE): (a) активность люциферазы NQO1-ARE; (b) активность люциферазы GSTA2-ARE.

Фиг. 3a-f - относительное кратное увеличение ARE Nrf2 GST после обработки клеток (a) RTA 402; (b) 63415 (RTA 408); (c) 63170; (d) 63171; (е) 63179 и (f) 63189. Графики также показывают жизнеспособность клеток, которую анализировали с использованием реагента для определения пролиферации клеток WST1 и измерением поглощения через 1 ч. Все лекарственные средства вводили в ДМСО и клетки выращивали по 10000 клеток/лунка в 384-луночных планшетах в DMEM с низким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,8 мг/мл генетицина.

Фиг. 4a-d - влияние RTA 408 на экспрессию целевого гена Nrf2 в фибробластах легких HFL1. (a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.

Фиг. 6a-d - влияние RTA 408 на экспрессию целевого гена Nrf2 в эпителиальных клетках бронхов BEAS-2B. (a) NQO1; (b) НМОХ1; (c) GCLM; (d) TXNRD1.

Фиг. 6a и b - влияние RTA 408 на уровни целевого белка Nrf2. (а) клетки SH-SY5Y; (b) клетки BV2.

Фиг. 7 - влияние RTA 408 на ферментативную активность NQO1 в клетках RAW2 64.7.

Фиг. 8 - влияние RTA 408 на общие уровни глутатиона в линии клеток-гепатоцитов AML-12.

Фиг. 9 - влияние RTA 408 на поглощение WST-1 в качестве маркера НАДФН.

Фиг. 10a-d - влияние RTA 408 на экспрессию генов, вовлеченных в синтез НДЦФН. (a) H6PD; (b) PGD; (c) ТКТ; (d) ME1.

Фиг. 11a и b - (а) влияние RTA 408 на индуцируемую TNF-α активацию репортерного гена люциферазы NF-кВ в линии клеток NIH3T3 мыши с перекрыванием жизнеспособности WST1 и жизнеспособности WST1/2; (b) индуцируемая TNF-α активация репортерного гена люциферазы NF-кВ в линии клеток NIH3T3 мыши. График показывает относительное кратное изменение в зависимости от log изменения концентрации RTA 408.

Фиг. 12 - влияние RTA 408 на индуцируемую TNF-α активацию конструкции репортерного гена люциферазы NF-кВ.

Фиг. 13a и b - (а) влияние RTA 408 на индуцируемую TNF-α активацию репортерного гена люциферазы NF-кВ в линии клеток A549 человека с перекрыванием жизнеспособности WST1 и жизнеспособности WST1/2; (b) индуцируемая TNF-α активация репортерного гена люциферазы NF-кВ в линии клеток A549 человека. График показывает относительное кратное изменение в зависимости от log изменения концентрации RTA 408.

Фиг. 14 - влияние RTA 408 на индуцируемое TNF-α фосфорилирование IxBa.

Фиг. 15a-d - влияние RTA 408 на экспрессию генов трансаминазы: (а) ALT1 (GPT1); (b) ALT2 (GPT2); (c) AST1 (GOT1); (d) AST1 (GOT2). Звездочки указывают на статистически значимое отличие от контрольной группы (*Р<0,05; **Р<0,01).

Фиг. 16 - влияние RTA 408 на уровни пирувата в культивированных мышечных клетках (*Р<0,05).

Фиг. 17 - влияние 63415 в модели воспаления легких, опосредованного липополисахаридом (ЛПС) (% изменение уровня провоспалительных цитокинов относительно введения ЛПС). Соединение 63415 вводили каждый деньх3 в моменты времени 0, 24 и 48 ч с последующим введением ЛПС через 1 ч после последней дозы 63415 самкам мышей BALB/c. Животных умерщвляли через 20 ч после введения ЛПС. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) исследовали на предмет экспрессии провоспалительных цитокинов. Соединение 63415 уменьшало уровень провоспалительных цитокинов дозозависимым образом с максимальным уменьшением TNF-α, IL-6 и IL-12 в диапазоне от 50-80%.

Фиг. 18a и b - влияние RTA 408 на воспаление легких, индуцированное ЛПС, у мышей, (а) воспалительные цитокины; (b) целевые гены Nrf2. RTA 408 вводили самкам мышей BALB/c (n=10) каждый деньх6 в моменты времени 0, 24, 48, 72, 96 и 120 ч с последующим введением ЛПС в 121 ч и животных умерщвляли в 141 ч. Анализировали экспрессию белков-провоспалительных цитокинов в BALF. Анали- 7 030468

зировали биомаркеры Nrf2 в легком. Звездочки указывают на статистически значимое отличие от контрольной группы, получавшей физиологический раствор (*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001).

Фиг. 19a и b - влияние 63415 на инфильтраты BALF при воспалении легких, индуцированном блеомицином: (а) количество клеток жидкости BAL; (b) масса тела. Соединение 63415 вводили каждый деньх39 в дни с -10 по 28 мышам C57BL/6. Блеомицин вводили в 0 день. Каждый день измеряли массу тела. Количества клеток BALF определяли при умерщвлении. Наблюдали заметное уменьшение воспалительного инфильтрата. Не наблюдали значительной положительной динамики хронического воспаления, интерстициального фиброза или числа очагов фиброза.

Фиг. 20a и b - влияние RTA 408 на фиброз легких, индуцированный блеомицином, у крыс: (а) полиморфонуклеарные клетки (ПМН); (b) гидроксипролин. Звездочки указывают на статистически значимое отличие от контрольной группы, получавшей блеомицин (*Р<0,05).

Фиг. 21 - влияние RTA 408 на целевые ферменты Nrf2 в легких крыс с фиброзом легких, индуцированным блеомицином. Звездочки указывают на статистически значимое отличие от контрольной группы, получавшей физиологический раствор (*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001).

Фиг. 22a-e - влияние RTA 408 на ХОБЛ, индуцированную сигаретным дымом, у мышей. (a) KC; (b) IL-6; (c) TNF-α; (d) IFN-γ; (e) RANTES. RTA 408 (63415) тестировали на уровнях доз, составляющих 3 мг/кг (низкий), 10 мг/кг (средний) и 30 мг/кг (высокий). В этом же исследовании тестировали аналог AIM (63355) для сравнения. Звездочки указывают на статистически значимое отличие от контрольной группы, подвергавшейся воздействию сигаретного дыма.

Фиг. 23 - влияние RTA 408 на целевые ферменты Nrf2 в легких мышей с ХОБЛ, индуцированной сигаретным дымом. Звездочки указывают на статистически значимое отличие от контрольной группы, получавшей физиологический раствор (* Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001). Крестики показывают статистически значимое отличие от мышей, которых подвергали воздействию сигаретного дыма и которым вводили носитель (t Р<0,05).

Фиг. 24a-d - влияние 63415 (RTA 408) на массу тела в модели сепсиса у мышей BALB/c. ЛПС вводили всем животных в 0 день, (a) Масса тела: 63415 (RTA 408); (b) Масса тела: RTA 405; (c) Системный ЛПС: % выживаемости: 63415 (RTA 408); (d) Системный ЛПС: % выживаемости: RTA 405. Как RTA 405, так и 63415 (RTA 408) вводили каждый деньх5 в дни с -2 по 2. Соединение 63415 (RTA 408) увеличивало выживаемость. Масса тела в зависимости от времени у мышей BALB/c, которых лечили 63415, служит в качестве модели сепсиса.

Фиг. 25 - влияние 63415 в модели воспаления слизистой оболочки полости рта, индуцированного излучением. RTA 405 или 63415 (RTA 408) вводили два раза в сутки х20 в дни с -5 по -1 и дни с 1 по 15 самцам сирийских золотистых хомяков. Излучение происходило в 0 день. Показатели воспаления слизистой оболочки находятся в диапазоне от 0 до 5 на основе клинических проявлений (0: полностью здоровый; 1-2: эритема со степенью выраженности от легкой до тяжелой; 3-5: различные степени изъязвления). Соединение 63415 уменьшало воспаление слизистой оболочки в дозе 30 и 100 мг/кг с уменьшением изъязвления до 36%.

Фиг. 26 - влияние 63415 на индукцию целевых генов Nrf2 в 14-дневном исследовании токсичности у мышей C57BL/6. мРНК целевых генов Nrf2 оценивали в печени мышей, которых лечили перорально каждый деньх14. Наблюдали значительное увеличение экспрессии мРНК для нескольких целевых генов Nrf2 и оно согласовывалось с воздействием на ткани.

Фиг. 27a и b - влияние 63415 на индукцию целевых генов Nrf2 в печени крыс: (а) целевые гены; (b) отрицательные регуляторы. мРНК целевых генов Nrf2 оценивали в печени крыс, которых лечили перорально каждый деньх14.

Фиг. 28a и b - влияние 63415 на целевые гены Nrf2 в тканях обезьян: (а) печень; (b) легкое. мРНК целевых генов Nrf2 оценивали у обезьян, которых лечили перорально каждый деньх14, с использованием технологии QuantiGene® 2.0 Plex Panomics.

Фиг. 29a и b - влияние 63415 на целевую ферментативную активность Nrf2 в печени мышей: (a) активность NQO1; (b) активность GST. Целевую ферментативную активность Nrf2 оценивали в печени мышей, которых лечили перорально каждый деньх14. Ферментативную активность NQO1 и GST индуцировали дозозависимым образом.

Фиг. 30a и b - влияние 63415 на целевую ферментативную активность Nrf2 в печени крыс: (a) активность NQO1; (b) активность GST. Целевую ферментативную активность Nrf2 оценивали в печени крыс, которых лечили перорально каждый деньх14. Ферментативную активность NQO1 и GST индуцировали дозозависимым образом.

Фиг. 31a и b - влияние 63415 на индукцию целевой ферментативной активности Nrf2 в различных тканях яванских макак: (a) активность NQO1; (b) активность GSR.

Фиг. 32a и b - концентрация RTA 408 в печени, легких и головном мозге мышей, и активность NQO1 в печени мышей после 14 дней ежедневного перорального введения, (a) распределение RTA 408 в тканях у мышей после 14 дней ежедневного перорального введения. Данные представляют собой среднее значение ±SD концентраций RTA 408 в ткани, полученной через 4 ч после введения последней дозы ис- 8 030468

следования. Числа над планками погрешностей характерны для среднего значения. (b) Корреляция содержания RTA 408 в печени мышей с ферментативной активностью NQO1. Изображали зависимость индивидуального содержания RTA 408 в печени мышей от индивидуальной ферментативной активности исходя из этих данных.

Фиг. 33a и b - концентрация RTA 408 в плазме крови, печени, легких и головном мозге крыс, и активность NQO1 в печени крыс после 14 дней ежедневного перорального введения. (а) Распределение RTA 408 в тканях у крыс после 14 дней ежедневного перорального введения. Данные представляют собой среднее значение ±SD концентраций RTA 408 в ткани, полученной через 4 ч после введения последней дозы исследования. Числа над планками погрешностей характерны для среднего значения. *Два значения были исключены из расчета средних значений из-за того, что являлись выпадающими значениями, определяемыми как значения, вызывающие несоответствие набора данных критерию нормальности Шапиро-Уилка. (b) Корреляция содержания RTA 408 в печени крыс с ферментативной активностью NQO1. Изображали зависимость индивидуального содержания RTA 408 в печени крыс от индивидуальной ферментативной активности исходя из этих данных. Ткани группы доз 100 мг/кг RTA 408 получали в 6 день, и наблюдаемая токсичность в данной группе исключала оценку ферментативной активности NQO1 печени.

Фиг. 34a и b - влияние лечения 63415 на активацию Nrf2 в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) обезьян: (a) зависимость NQO1 МКПК от концентрации в плазме крови; (b) зависимость NQO1 легкого от NQO1 МКПК.

Фиг. 35 - резюме 14-дневного исследования токсичности 63415 у обезьян. Все дозы хорошо переносились без нежелательных клинических признаков. Данные клинической биохимии позволяли предположить отсутствие очевидной токсичности.

Фиг. 36 - влияние времени дозирования на концентрацию RTA 408 в плазме крови после топического введения в глаза и перорального введения. Концентрацию RTA 408 в плазме крови также измеряли после 5 дней ежедневного топического введения RTA 408 в глаза и определяли, что она продолжала относительно согласоваться с измерениями, произведенными после первого дня.

Фиг. 37a и b - корреляция воздействия RTA 408 в плазме крови обезьяны с экспрессией мРНК NQO1 и SRXN1 в МКПК: (a) NQO1; (b) SRXN1.

Фиг. 38 - концентрация RTA 408 в различных тканях или жидкостях внутри глаза в зависимости от времени после 5 дней топического введения доз в глаза. Концентрацию RTA 408 в плазме крови также измеряли после топического введения в глаза.

Фиг. 39 - влияние RTA 408 на заболеваемость дерматитом 3 степени, вызываемым острым воздействием излучения, для разных концентраций топически вводимого RTA 408.

Фиг. 40 - влияние RTA 408 на заболеваемость дерматитом 2 степени, вызываемым острым воздействием излучения, на протяжении 30-дневного курса лечения для разных концентраций топически вводимого RTA 408.

Фиг. 41 - влияние RTA 408 на заболеваемость дерматитом 2 степени, вызываемым острым воздействием излучения, на протяжении 28-дневного курса лечения для разных концентраций перорально вводимого RTA 408.

Фиг. 42a и b - (a) анализ площади под кривой клинического показателя дерматита в зависимости от времени для каждой из различных контрольных групп, включающих всех животных, используемых в данном тесте. (b) Анализ площади под кривой клинического показателя дерматита в зависимости от длительности наличия данного показателя для каждой из различных контрольных групп, включающих только животных, которые завершили все 30 дней в исследовании.

Фиг. 43 - первый средний оцененный слепым методом показатель острого лучевого дерматита в зависимости от времени для групп, не получавших лечение, не получавших лечение с отсутствием воздействия излучения, получавших только носитель и получавших три количества RTA 408 перорально в дозе 3, 10 и 30 мг/кг. Показатель дерматита основывался на шкале, согласно которой 0 означал "совершенно здоровый", 1-2 демонстрировали эритему со степенью выраженности от мягкой до умеренной с минимальным легким шелушением, 3-4 демонстрировали эритему со степенью выраженности от умеренной до тяжелой и шелушение, и 5 демонстрировал выраженную язву.

Фиг. 44 - средний показатель острого лучевого дерматита в зависимости от времени для групп, не получавших лечение, не получавших лечение с отсутствием воздействия излучения, получавших только носитель и получавших три количества RTA 408 перорально в дозе 3, 10 и 30 мг/кг, измеряемый через день с 4 дня по 30 день. Показатель дерматита основывался на шкале, согласно которой 0 означал "совершенно здоровый", 1-2 демонстрировали эритему со степенью выраженности от мягкой до умеренной с минимальным легким шелушением, 3-4 демонстрировали эритему со степенью выраженности от умеренной до тяжелой и шелушение, и 5 демонстрировал выраженную язву.

Фиг. 45 - средний показатель острого лучевого дерматита в зависимости от времени для групп, не получавших лечение, не получавших лечение с отсутствием воздействия излучения, получавших только носитель и получавших три количества RTA 408 топически 0,01, 0,1 и 1%, измеряемый через день с 4 дня по 30 день. Показатель дерматита основывался на шкале, согласно которой 0 означал "совершенно здо- 9 030468

ровый", 1-2 демонстрировали эритему со степенью выраженности от мягкой до умеренной с минимальным легким шелушением, 3-4 демонстрировали эритему со степенью выраженности от умеренной до тяжелой и шелушение, и 5 демонстрировал выраженную язву.

Фиг. 46 - график зависимости клинических показателей дерматита, вызванного фракционированным излучением, от времени и изменения показателей дерматита для каждой группы тестирования. Показатель дерматита основывался на шкале, согласно которой 0 означал "совершенно здоровый", 1-2 демонстрировали эритему со степенью выраженности от мягкой до умеренной с минимальным легким шелушением, 3-4 демонстрировали эритему со степенью выраженности от умеренной до тяжелой и шелушение, и 5 демонстрировал выраженную язву.

Фиг. 47 - график анализа площади под кривой (ППК), демонстрирующий показатель дерматита (тяжесть х дни) для каждой из групп тестирования за весь период наблюдения. Показатели дерматита оценивали каждые два дня с 4 дня по 30 день исследования.

Фиг. 48a и b - (a) график поглощения при 595 нм для обработанной линии клеток рака предстательной железы LNCaP, демонстрирующий относительный цитотоксический эффект в отношении клеток, обработанных химиотерапевтическим агентом и RTA 408 по сравнению с одним RTA 408. (b) График поглощения при 595 нм для обработанной линии клеток рака предстательной железы DU-145, демонстрирующий относительный цитотоксический эффект в отношении клеток, обработанных химиотерапевтическим агентом и RTA 408 по сравнению с одним RTA 408.

Фиг. 49 - черно-белые варианты цветных фотографий подвергнутых визуализации мышей, показывающие активность люциферазы в опухолях для трех мышей: контрольное животное с отсутствием лечения, животное, подвергнутое только ионизирующему излучению (однократная доза, 18 Гр), и животное, подвергнутое как ионизирующему излучению (однократная доза, 18 Гр, 0 день), так и введению RTA 408 (17,5 мг/кг, интраперитонеально, один раз в сутки в дни с -3 по -1, затем однократные дозы в 1, 3 и 5 день). Цвета, указанные стрелками, показывают интенсивность, при этом интенсивность представлена красным, желтым, зеленым и синим цветом в порядке от наибольшей до наименьшей интенсивности.

Фиг. 50 - уменьшение концентраций белка в водянистой влаге для разных составов RTA 408 (темные столбики) по сравнению с литературными значениями для МаксиДекса® (0,1% дексаметазон) и мапракората (mapracorat) (светлые столбики) после проведения парацентеза.

Фиг. 51 - дозозависимое подавление NO in vivo соединением 63415. Мышам CD-1 (n=6) вводили ДМСО или AIM через желудочный зонд. ЛПС (5 мг/кг) вводили через 24 ч. Через 24 ч после введения ЛПС забирали цельную кровь для анализа NO. Ингибирование NO определяли по реакции Грисса в восстановленной депротеинизированной плазме крови.

Фиг. 52 - обширное распределение 63415 (RTA 408) в ткани мыши. Мышам перорально вводили каждый деньх3 либо 25 мг/кг 63415 (RTA 408), либо 25 мг/кг RTA 405. Кровь (плазму и цельную кровь) и ткани (головной мозг, печень, легкое и почка) забирали через 6 ч после введения последней дозы. Проводили полуколичественный анализ содержания лекарственного средства. В ЦНС наблюдали заметные уровни.

Фиг. 53 - индукция 63415 активности NQO1 в печени, легком и почке мышей. Мышам перорально вводили каждый деньх3 25 мг/кг. Ткани забирали через 6 ч после введения последней дозы и проводили анализ активности NQO1. Во многих тканях наблюдали значительную активацию NQO1.

Фиг. 54 - резюме 14-дневного исследования токсичности 63415 у мышей. Мышам C57BL/6 перорально вводили дозы каждый деньх14. Конечные точки включали выживаемость, массу тела и клиническую биохимию. Все животные доживали до 14 дня. Не происходило значительных изменений массы тела по сравнению с группой, получавшей носитель, и не было подтверждения токсичности в какой-либо дозе исходя из данных клинической биохимии.

Фиг. 55 - распределение 63415 в тканях по данным 14-дневного исследования токсичности у мышей C57BL/6. Образцы головного мозга, легких и печени забирали через 4 ч после введения последней дозы и подвергали количественному анализу на предмет содержания 63415 с использованием чувствительного метода ЖХ/МС/МС. Воздействие в дозе 10 и 100 мг/кг в легком превышало IC₅₀ in vitro для индукции NO в 55 и 1138 раз соответственно. Воздействие в дозе 10 и 100 мг/кг в головном мозге превышало IC₅₀ in vitro для индукции NO в 29 и 541 раз соответственно.

Фиг. 56 - распределение 63415 в тканях у крыс Sprague Dawley. Ткани забирали через 4 ч после введения последней дозы в 14 день или 6 день (100 мг/кг), экстрагировали и подвергали количественному анализу на предмет содержания 63415 с использованием чувствительного метода ЖХ/МС/МС. Соединение 63415 хорошо распределяется в целевые ткани. Воздействие в дозе 10 мг/кг в легком и головном мозге превышало IC50 in vitro для ингибирования NO в 294 и 240 раз соответственно.

Фиг. 57 - распределение соединения 63415 в целевых тканях у яванских макак. Ткани забирали через 4 ч после введения последней дозы в 14 день. Содержание соединения 63415 экстрагировали и количественно определяли с использованием чувствительного метода ЖХ/МС/МС.

Фиг. 58 - Фурье-Раман-спектр (3400-50 см^-1) образца PP415-P1, соответствующий аморфной форме

- 10 030468

(1 класс).

Фиг. 59 - порошковая рентгеновская (PXRD) дифрактограмма (1,5-55,5 °2θ) образца PP415-P1, соответствующая аморфной форме (1 класс).

Фиг. 60 - термограмма термогравиметрического анализа в сочетании с инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье (TG-FTIR) (25-350°C) образца PP415-P1, соответствующая аморфной форме (1 класс).

Фиг. 61 - спектр 'Н-ЯМР в ДМСОД₆ образца PP415-P1, соответствующий аморфной форме (1 класс).

Фиг. 62 - термограмма ДСК образца PP415-P1, соответствующая аморфной форме (1 класс).

Фиг. 63 - изотерма динамической сорбции паров (DVS) образца PP415-P1, соответствующая аморфной форме (1 класс).

Фиг. 64 - Фурье-Раман-спектр образца PP415-P1, соответствующий аморфной форме (1 класс), после измерения DVS (верхний) не менялся по сравнению с веществом до измерения DVS (нижний). Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 65 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P1, соответствующая аморфной форме (1 класс), после измерения DVS (верхняя) не менялась по сравнению с веществом до измерения DVS (нижняя). Дифрактограммы не были масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 66 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P40 (верхняя) соответствует дифрактограмме сольватной формы (2 класс) (нижняя, образец PP415-P19). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 67 - дифрактограммы PXRD образцов PP415-P2A (верхняя), PP415-P3a (вторая сверху), PP415P4а (средняя) и PP415-P5a (вторая снизу) для исследования стабильности, соответствующие аморфной форме (1 класс), через одну неделю не демонстрировали отличий по сравнению с исходным веществом в момент времени t₀ (нижняя, образец PP415-P1). Дифрактограммы не масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 68 - дифрактограммы PXRD образцов PP415-P2b (верхняя), PP415-P3b (вторая сверху), PP415P4b (средняя) и PP415-P5b (вторая снизу) для исследования стабильности, соответствующие аморфной форме (1 класс), через две недели не демонстрировали отличий по сравнению с исходным веществом в момент времени t₀ (нижняя, образец PP415-P1). Дифрактограммы не масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 69 - дифрактограммы PXRD образцов PP415-P2c (верхняя), PP415-P3c (вторая сверху), PP415P4c (средняя) и PP415-P5c (вторая снизу) для исследования стабильности, соответствующие аморфной форме (1 класс), через четыре недели не демонстрировали отличий по сравнению с исходным веществом в момент времени to (нижняя, образец PP415-P1). Дифрактограммы не масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 70 - Фурье-Раман-спектры (2400-50 см^-1) образцов сольватной формы (2 класс) (PP415-P7: верхний; PP415-P8: второй сверху; PP415-P9: третий сверху; PP415-P10: четвертый сверху; PP415-P11: средний; PP415-P15: четвертый снизу; PP415-P17: третий снизу; PP415-P21: второй снизу; PP415-P24: нижний). Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 71 - Фурье-Раман-спектр (1750-1000 см^-1) сольватной формы (2 класс) (PP415-P7: верхний) явно отличается от спектра аморфной формы (1 класс) (PP415-P1: нижний). Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 72 - Фурье-Раман-спектры (1750-1000 см^-1) 2 класса (образец PP415-P19: верхний), 3 класса (образец PP415-P6: второй сверху), 4 класса (образец PP415-P13: второй снизу) и 5 класса (образец PP415-P14: нижний) значительно отличаются друг от друга. Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 73 - дифрактограммы PXRD (2-32 °2θ) образцов сольватной формы (2 класс) (PP415-P7: верхняя; PP415-P8: вторая сверху; PP415-P10: третья сверху; PP415-P15: четвертая сверху; PP415-P17: средняя; PP415-P18: четвертая снизу; PP415-P19: третья снизу; PP415-P21: вторая снизу; PP415-P24: нижняя). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 74 - дифрактограммы PXRD (11-21 °2θ) некоторых образцов сольватной формы (2 класс) (PP415-P7: верхняя; PP415^8: вторая сверху; PP415-P10: средняя; PP415-P21: вторая снизу; PP415-P24: нижняя). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 75 - дифрактограммы PXRD (2-32 °2θ) 2 класса (образец PP415-P19: верхняя), 3 класса (образец PP415-P6: вторая сверху), 4 класса (образец PP415-P13: вторая снизу) и 5 класса (образец PP415-P14: нижняя) заметно отличаются. Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 76 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P7, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 77 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P21, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 78 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P24, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 79 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P29, соответствующая сольватной форме (2 класс).

- 11 030468

Фиг. 80 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P47, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 81 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P48, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 82 - Фурье-Раман-спектры (1800-700 см^-1) сольватной формы (2 класс) (нижний, образец PP415-P7) и высушенной сольватной формы (2 класс) (верхний, образец PP415-P30) схожи и демонстрируют лишь небольшие отличия, которые с трудом можно распознать на графике. Спектры масштабированы для целей сравнения.

Фиг. 83 - дифрактограмма PXRD высушенной сольватной формы (2 класс), образец PP415-P30 (верхняя) в сравнении с дифрактограммой сольватной формы (2 класс), образец PP415-P7 (нижняя). Дифрактограммы не масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 84 - термограмма TG-FTIR высушенного образца PP415-P30, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 85 - Фурье-Раман-спектр высушенного образца PP415-P18 (светло-серый) идентичен спектру исходного образца PP415-P15 (темно-серый) и они демонстрируют лишь небольшие отличия, которые с трудом можно распознать на графике. Спектры были масштабированы для целей сравнения.

Фиг. 86 - дифрактограмма PXRD высушенного образца PP415-P18 (верхняя) демонстрирует небольшие отличия от дифрактограммы исходного образца PP415-P15 (нижняя), хотя оба образца представляют собой сольватные формы (2 класс). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 87 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P18, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 88 - Фурье-Раман-спектр образца PP415-P17 (верхний) почти идентичен спектрам высушенных образцов PP415-P19 (средний) и PP415-P32 (нижний), и демонстрирует лишь небольшие отличия, которые с трудом можно распознать на графике. Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 89 - дифрактограмма PXRD высушенного образца PP415-P19 (средняя) отличается от дифрактограммы исходного образца PP415^17 (верхняя), но, тем не менее, соответствует форме 2 класса. Дифрактограмма дополнительно высушенного образца PP415-P32 (нижняя) демонстрирует более широкие пики с более низким соотношением сигнал/шум. Указанное вещество является менее кристаллическим, но, тем не менее, соответствует форме 2 класса. Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 90 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P19, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 91 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P32А, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 92 - Фурье-Раман-спектр образца PP415-P21 (верхний) идентичен спектрам высушенных образцов PP415-P28 (средний) и PP415-P34 (нижний). Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 93 - дифрактограммы PXRD высушенных образцов PP415-P28 (средняя) и P415 P34 (нижняя) демонстрируют более широкие пики с более низким соотношением сигнал/шум, что указывает на меньшую кристалличность указанных образцов по сравнению с дифрактограммой исходного образца PP415P21 (верхняя). Дифрактограммы несколько отличаются, но, тем не менее, соответствуют форме 2 класса. Они были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 94 - термограмма TG-FTIR высушенного образца PP415-P28, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 95 - термограмма TG-FTIR высушенного образца PP415-P34, соответствующая сольватной форме (2 класс).

Фиг. 96 - Фурье-Раман-спектры (2400-50 см^-1) образцов сольватной формы (3 класс) (PP415-P6: верхний; PP415-P12: средний; PP415-P20: нижний). Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 97 - Фурье-Раман-спектры (1750-1000 см^-1) образцов сольватной формы (3 класс) (PP415-P6: верхний; PP415-P12: второй сверху; PP415-P20: второй снизу) очень схожи друг с другом с лишь небольшими отличиями, например, при ~1690 см^-1, но явно отличаются от 1 класса (PP415-P1: нижний). Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 98 - дифрактограммы PXRD (2-32 °2θ) образцов сольватной формы (3 класс) (PP415-P6: верхняя; PP415-P12: средняя; PP415-P20: нижняя). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 99 - дифрактограммы PXRD (13,5-18,5 °2θ) образцов сольватной формы (3 класс) (PP415-P6: верхняя; PP415-P12: средняя; PP415-P20: нижняя) демонстрируют небольшие отличия. Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 100 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P6, соответствующая сольватной форме (3 класс).

Фиг. 101 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P12, соответствующая сольватной форме (3 класс).

Фиг. 102 - термограмма TG-FTIR высушенной сольватной формы (3 класс), образец PP415-P25.

Фиг. 103 - термограмма TG-FTIR дополнительно высушенной сольватной формы (3 класс), образец PP415-P33.

- 12 030468

Фиг. 104 - Фурье-Раман-спектры (1800-700 см^-1) сольватной формы (3 класс) (верхний, образец PP415-P6), высушенной сольватной формы (3 класс) (средний, образец PP415-P25) и дополнительно высушенной сольватной формы (3 класс) (нижний, образец PP415-P33) являются идентичными. Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 105 - дифрактограммы PXRD (4-24 °2θ) сольватной формы (3 класс) (верхняя, образец PP415P6), высушенной сольватной формы (3 класс) (средняя, образец PP415-P25) и дополнительно высушенной сольватной формы (3 класс) (нижняя, образец PP415-P33). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 106 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P13, соответствующая форме ацетонитрильного сольвата (4 класс).

Фиг. 107 - Фурье-Раман-спектры (1800-700 см^-1) формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (темно-серый, образец PP415-P13) и высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (светло-серый, образец PP415-P26) являются идентичными и полностью перекрываются. Спектры были масштабированы для целей сравнения.

Фиг. 108 - дифрактограмма PXRD высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P26 (нижняя), в сравнении с эталонной дифрактограммой формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P13 (верхняя). Дифрактограммы не были масштабированы, но были смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 109 - термограмма TG-FTIR высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P26.

Фиг. 110 - Фурье-Раман-спектры (1800-700 см^-1) формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (верхний, образец PP415^35) и высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (средний, образец PP415-P36, и нижний, образец PP415-P37) соответствуют друг другу. Спектры были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 111 - дифрактограммы PXRD (4-24 °2θ) формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (верхняя, образец PP415^35) и высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (средняя, образец PP415P36, и нижняя, образец PP415-P37) согласуются друг с другом. Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 112 - термограмма TG-FTIR высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P36.

Фиг. 113 - термограмма TG-FTIR высушенной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P37.

Фиг. 114 - изотерма DVS десольватированной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P37.

Фиг. 115 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P37, формы ацетонитрильного сольвата (4 класс), после измерения DVS (нижняя) не менялась по сравнению с указанным веществом до измерения DVS (верхняя). Дифрактограммы не были масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 116 - термограмма ДСК десольватированной формы ацетонитрильного сольвата (4 класс) (образец PP415-P37).

Фиг. 117 - термограмма ДСК смеси аморфной формы (1 класс), образец PP415-P1, с десольватированной формой ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P36, в соотношении ~1:1.

Фиг. 118 - термограмма ДСК смеси аморфной формы (1 класс), образец PP415-P1, с десольватированной формой ацетонитрильного сольвата (4 класс), образец PP415-P36 (экспериментальный номер: PP415-P39), в соотношении ~1:1. Постепенный нагрев (1 этап) прекращали на 30 мин при 173°C (2 этап), а затем возобновляли (3 этап).

Фиг. 119 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P14, соответствующая форме ТГФ сольвата (5 класс).

Фиг. 120 - Фурье-Раман-спектры (1800-1100 см^-1) формы ТГФ сольвата (5 класс) (пунктирная линия, образец PP415-P14), высушенной формы ТГФ сольвата (5 класс) (пунктирная точечная линия, образец PP415-P27) и аморфной формы (1 класс) (сплошная линия, образец PP415-P11). Спектры были масштабированы для целей сравнения и демонстрируют небольшие изменения размера, но малое соответствующее изменение формы спектра.

Фиг. 121 - дифрактограмма PXRD высушенной формы ТГФ сольвата (5 класс), образец PP415-P27 (верхняя) в сравнении с дифрактограммой формы ТГФ сольвата (5 класс), образец PP415-P14 (нижняя). Дифрактограммы не были масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 122 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P27, соответствующая высушенному ТГФ сольвату (5 класс).

Фиг. 123 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P41 (верхняя) соответствует дифрактограмме формы ТГФ сольвата (5 класс) (средняя, образец PP415-P14) и не соответствует дифрактограмме формы гептанового сольвата (2 класс) (нижняя, образец PP415-Р19). Дифрактограммы были масштабированы и

- 13 030468

смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 124 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P45 (верхняя) соответствует дифрактограмме формы ТГФ сольвата (5 класс) (средняя, образец PP415-P14) и не соответствует дифрактограмме формы гептанового сольвата (2 класс) (нижняя, образец PP415-F19). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 125 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P41 (верхняя) соответствует форме ТГФ сольвата (5 класс). После сушки образца PP415-P41 в течение 1 дня (вторая сверху, образец: PP415-P44), вещество было преимущественно аморфным. Сохранялись некоторые широкие пики с низкой интенсивностью. После дальнейшей сушки в течение ночи (вторая снизу, образец PP415-P44a) интенсивность данных широких пиков еще снижалась. Аморфная форма (1 класс) показана в качестве эталонной (нижняя, образец: PP415-P42). Дифрактограммы не были масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 126 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P44a, соответствующая аморфной форме (1 класс).

Фиг. 127 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P45 (верхняя) соответствует форме ТГФ сольвата (5 класс). После сушки образца PP415-P45 в течение 1 дня (вторая сверху, образец: PP415-P46), вещество было преимущественно аморфным. Сохранялись некоторые широкие пики с низкой интенсивностью. После сушки в общей сложности в течение 4 дней (вторая снизу, образец PP415-P46a) дифрактограмма оставалась без изменений. Аморфная форма (1 класс) показана в качестве эталонной (нижняя, образец: PP415-F42). Дифрактограммы не были масштабированы, но смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 128 - термограмма TG-FTIR образца PP415-P46a, соответствующая аморфной форме (1 класс).

Фиг. 129 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P42 (верхняя) соответствует дифрактограмме аморфной формы (1 класс) (нижняя, образец PP415-P1). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 130 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P43 (верхняя) соответствует дифрактограмме изоструктурной сольватной формы (2 класс) (нижняя, образец PP415-P19) и не соответствует дифрактограмме формы ТГФ сольвата (5 класс) (средняя, образец PP415-P14). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 131 - дифрактограммы PXRD образцов PP415-P47 (верхняя) и PP415-P48 (средняя) по существу соответствуют дифрактограмме изоструктурных сольватных форм (2 класс) (нижняя, образец PP415P19), хотя есть некоторые отличия. Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Фиг. 132 - дифрактограмма PXRD образца PP415-P49 (верхняя) соответствует дифрактограмме аморфной формы (1 класс) (нижняя, образец PP415-P1). Дифрактограммы были масштабированы и смещены в направлении оси Y для целей сравнения.

Описание иллюстративных вариантов реализации

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложено соединение:

N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-циано-2,2,6a,6b,9,9,12a-гептаметил-10,14-диоксо1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-октадекагидропицен-4a-ил)-2,2-дифторпропанамид,

также называемое в настоящем описании RTA 408, 63415 или PP415. В соответствии с другими неограничивающими аспектами настоящего изобретения также предложены полиморфные формы указанного соединения, включая сольваты указанного соединения. В соответствии с другими неограничивающими аспектами настоящего изобретения также предложены фармацевтически приемлемые соли указанного соединения. В соответствии с другими неограничивающими аспектами также предложены способы получения, фармацевтические композиции и наборы, и изделия на основе данных соединений и их полиморфных форм.

I. Определения

При употреблении в контексте химической группы: термин "водород" означает -H; термин "гидрокси" означает -OH; термин "оксо" означает =O; термин "карбонил" означает -C(=O)-; термин "карбокси" означает -C(=O)OH (также обозначается -COOH или -CO₂H); термин "галоген" независимо означает -F, -Cl, -Br или -I; термин "амино" означает -NH2; термин "гидроксиамино" означает -NHOH; термин "нитро" означает -NO2; термин "имино" означает =NH; термин "циано" означает -CN; термин "изоцианат" означает -N=C=O; термин "азидо" означает -N3; в контексте одновалентного радикала термин "фосфат" означает -OP(O)(OH)2 или его депротонированную форму; в контексте двухвалентного радикала термин "фосфат" означает -OP(O)(OH)O- или его депротонированную форму; термин "меркапто" означает -SH; и термин "тио" означает =S; термин "сульфонил" означает -S(O)2- и термин "сульфинил" означает -S(O)-. Любая неопределенная валентность у атома структуры, представленной в настоящем изобретении, неявно представляет собой атом водорода, связанный с указанным атомом.

В контексте настоящего изобретения формулы

- 14 030468

представляют собой одинаковые структуры. Когда точка изображена на атоме углерода, указанная точка показывает, что атом водорода, присоединенный к данному атому углерода, выходит за пределы плоскости.

Употребление термина в единственном числе в сочетании с термином "содержащий (включающий)" в формуле изобретения и/или настоящем описании может означать "один", но также соответствует значению "один или более", "по меньшей мере один" и "один или более одного".

В настоящем изобретении термин "примерно" употребляется для указания того, что значение включает свойственные ему изменения в пределах погрешности устройства, способа, используемого для определения данного значения, или отклонение, существующее среди субъектов исследования. При употреблении в контексте порошковой рентгеновской дифракции термин "примерно" используется для указания значения, составляющего ±0,2 °2θ от приведенного значения, предпочтительно значения, составляющего ±0,1 °2θ от приведенного значения. При употреблении в контексте дифференциальной сканирующей калориметрии или температур стеклования термин "примерно" используется для указания значения, составляющего ±10°C относительно максимума пика, предпочтительно значения, составляющего ±2°C относительно максимума пика. При употреблении в другом контексте термин "примерно" используется для указания значения, составляющего ±10% от приведенного значения, предпочтительно значения ±5% от приведенного значения. Следует понимать, что всякий раз при употреблении термина "примерно", также включено конкретное указание на точное численное значение.

Термины "содержать", "иметь" и "включать" являются не ограничивающими глаголами. Любые формы или времена одного или более данных глаголов, такие как "содержит", "содержащий", "имеет", "имеющий", "включает" и "включающий", также являются не ограничивающими. Например, любой способ, который "содержит", "имеет" или "включает" один или более этапов, не ограничивается наличием только этого одного или более этапов, а также включает другие не перечисленные этапы.

Термин "эффективный", употребляемый в настоящем описании и/или формуле изобретения, означает достаточный для достижения желаемого, ожидаемого или предполагаемого результата. Термин "эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" при употреблении в контексте лечения пациента или субъекта с помощью соединения означает такое количество указанного соединения, которое является достаточным для осуществления такого лечения заболевания при введении пациенту или субъекту.

Термин "гало в форме пика" в контексте порошковой рентгеновской дифракции будет означать широкий пик, часто простирающийся при угле °2θ >10 на порошковой рентгеновской дифрактограмме, обычно характерный для аморфного твердого вещества или системы.

Термин "гидрат" при употреблении в качестве модификатора соединения означает, что указанное соединение содержит меньше одной (например, полугидрат), одну (например, моногидрат) или больше одной (например, дигидрат) молекулы воды, связанной с каждой молекулой соединения, например, в твердых формах соединения.

В настоящем описании термин "IC₅₀" относится к ингибирующей дозе, составляющей 50% от максимального полученного ответа. Данная количественная мера показывает, сколько необходимо конкретного лекарственного средства или другого вещества (ингибитора) для ингибирования конкретного биологического, биохимического или химического процесса (или компонента процесса, т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора или микроорганизма) наполовину.

"Изомер" первого соединения представляет собой отдельное соединение, в котором каждая молекула содержит такие же составляющие атомы, что и указанное первое соединение, но при этом трехмерная конфигурация этих атомов отличается.

В настоящем описании термин "пациент" или "субъект" относится к живому организму, представляющему собой млекопитающее, такому как человек, обезьяна, корова, овца, коза, собака, кошка, мышь, крыса, морская свинка или их трансгенные виды. В некоторых вариантах реализации пациент или субъект представляет собой животное, не относящееся к человеку. В некоторых вариантах реализации пациент или субъект представляет собой примата. В некоторых вариантах реализации пациент или субъект представляет собой человека.

Неограничивающими примерами субъектов, представляющих собой людей, являются взрослые, подростки, младенцы и плоды.

В настоящем описании термин "фармацевтически приемлемый" в целом относится к тем соединениям, веществам, композициям и/или лекарственным формам, которые с медицинской точки зрения подходят для применения в контакте с тканями, органами и/или физиологическими жидкостями людей и

- 15 030468

животных, не вызывая при этом чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем, или осложнений, и соответствуют разумному соотношению польза/риск.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" означает соли соединений согласно настоящему изобретению, которые являются фармацевтически приемлемыми, как определено выше, и которые обладают желаемой фармакологической активностью. Такие соли включают соли присоединения кислоты, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.; или органическими кислотами, такими как 1,2этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 3фенилпропионовая кислота, 4,4'-метилен-бис-(3-гидрокси-2-ен-1-карбоновая кислота), 4метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновая кислота, уксусная кислота, алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, алифатические серные кислоты, ароматические серные кислоты, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, камфорсульфоновая кислота, угольная кислота, коричная кислота, лимонная кислота, циклопентанпропионовая кислота, этансульфоновая кислота, фумаровая кислота, глюкогептоновая кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, гептановая кислота, гексановая кислота, гидроксинафтойная кислота, молочная кислота, лаурилсерная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, муконовая кислота, о-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, щавелевая кислота, н-хлорбензолсульфоновая кислота, алкановые кислоты, содержащие в качестве заместителей фенил, пропионовая кислота, нтолуолсульфоновая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, винная кислота, трет-арилбутилуксусная кислота, триметилуксусная кислота и т.п. Фармацевтически приемлемые соли также включают соли присоединения основания, которые могут образовываться, когда присутствующие кислотные протоны способны реагировать с неорганическими или органическими основаниями. Приемлемые неорганические основания включают гидроксид натрия, карбонат натрия, гидроксид калия, гидроксид алюминия и гидроксид кальция. Приемлемые органические основания включают этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N-метилглюкамин и т.п.

Следует понимать, что конкретный анион или катион, составляющий часть любой соли согласно настоящему изобретению, не имеет критического значения, если указанная соль в целом является фармакологически приемлемой. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей и способов их получения и применения приведены в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P.H. Stahl & C.G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).

Термин "предотвращение" или "осуществление предотвращения" включает (1) ингибирование возникновения заболевания у субъекта или пациента, который может подвергаться риску и/или быть предрасположен к указанному заболеванию, но еще не испытывает или не демонстрирует что-либо или все из: патологии или симптоматики заболевания, и/или (2) замедление возникновения патологии или симптоматики заболевания у субъекта или пациента, который может подвергаться риску и/или быть предрасположен к указанному заболеванию, но еще не испытывает или не демонстрирует что-либо или все из: патологии или симптоматики заболевания.

Термин "пролекарство" означает соединение, которое может метаболически превращаться in vivo в ингибитор согласно настоящему изобретению. Само по себе пролекарство может также обладать или не обладать активностью в отношении конкретного целевого белка. Например, соединение, содержащее гидроксигруппу, можно вводить в виде сложного эфира, который превращается под действием гидролиза in vivo в гидроксисоединение. Подходящие сложные эфиры, которые могут превращаться in vivo в гидроксисоединения, включают ацетаты, цитраты, лактаты, фосфаты, тартраты, малонаты, оксалаты, салицилаты, пропионаты, сукцинаты, фумараты, малеаты, метилен-бис-Р-гидроксинафтоат, гентизаты, изетионаты, ди-н-толуоилтартраты, метансульфонаты, этансульфонаты, бензолсульфонаты, нтолуолсульфонаты, циклогексилсульфаматы, хинаты, сложные эфиры аминокислот и т. п. Подобным образом соединение, содержащее аминогруппу, можно вводить в виде амида, который превращается под действием гидролиза in vivo в аминосоединение.

"Стереоизомер" или "оптический изомер" представляет собой изомер конкретного соединения, в котором те же атомы связаны с теми же другими атомами, но при этом трехмерная конфигурация этих атомов отличается. "Энантиомеры" представляют собой стереоизомеры конкретного соединения, являющиеся зеркальными отображениями друг друга, как левая и правая руки. "Диастереомеры" представляют собой стереоизомеры конкретного соединения, которые не являются энантиомерами. Хиральные молекулы содержат хиральный центр, также называемый стереоцентром или стереогенным центром, который представляет собой любую "точку", хотя необязательно атом, в молекуле, содержащей такие группы, что взаимная замена любых двух групп приводит к стереоизомеру. В органических соединениях хиральный центр, как правило, представляет собой атом углерода, фосфора или серы, хотя другие атомы также могут быть стереоцентрами в органических и неорганических соединениях. Молекула может содержать несколько стереоцентров, что дает много стереоизомеров. В соединениях, стереоизомерия которых обусловлена тетраэдрическими стереогенными центрами (например, тетраэдрический углерод), общее количество гипотетически возможных стереоизомеров не будет превышать 2n, где n представляет собой число тетраэдрических стереоцентров. Молекулы с симметрией часто имеют меньше максимально

- 16 030468

возможного количества стереоизомеров. Смесь энантиомеров в соотношении 50:50 называется рацемической смесью. В качестве альтернативы, смесь энантиомеров может быть энантиомерно обогащена, так чтобы один из энантиомеров присутствовал в количестве более 50%. Как правило, энантиомеры и/или диастереомеры могут быть разделены или отделены с использованием методов, известных в данной области техники. Предполагается, что для любого стереоцентра или оси хиральности, для которой стереохимия не определена, данный стереоцентр или ось хиральности может находиться в форме R, форме S или в виде смеси форм R и S, включая рацемические и нерацемические смеси. В настоящем описании термин "по существу не содержащий других стереоизомеров" означает, что композиция содержит <15%, более предпочтительно <10%, еще более предпочтительно <5% или наиболее предпочтительно <1% другого стереоизомера (стереоизомеров).

Термин "лечение" или "осуществление лечения" включает (1) ингибирование заболевания у субъекта или пациента, испытывающего или демонстрирующего патологию или симптоматику указанного заболевания (например, прекращение дальнейшего развития патологии и/или симптоматики), (2) облегчение заболевания у субъекта или пациента, испытывающего или демонстрирующего патологию или симптоматику указанного заболевания (например, способствование регрессии патологии и/или симптоматики), и/или (3) обеспечение любого измеримого ослабления заболевания у субъекта или пациента, испытывающего или демонстрирующего патологию или симптоматику указанного заболевания.

Приведенные выше определения заменяют собой любое противоречивое определение в любом из источников, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Однако тот факт, что некоторым терминам даны определения, не означает, что любой термин, которому не дано определение, является неопределенным. Напротив, считается, что все употребляемые термины описывают настоящее изобретение так, чтобы специалист в данной области техники смог понять объем и практически использовать настоящее изобретение.

II. RTA 408 и способы синтеза

Соединение RTA 408 может быть получено в соответствии со способами, описанными в разделе "Примеры" ниже. Данные способы можно дополнительно модифицировать и оптимизировать с использованием принципов и методов органической химии, используемых специалистом в данной области техники. Такие принципы и методы описаны, например, в March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007), содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.

Следует понимать, что конкретный анион или катион, составляющий часть любой соли согласно настоящему изобретению, не имеет критического значения, если указанная соль в целом является фармакологически приемлемой. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых солей и способов их получения и применения приведены в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002), содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки.

RTA 408 также может существовать в форме пролекарства. Поскольку известно, что пролекарства усиливают многие желаемые качества фармацевтических препаратов, например, растворимость, биодоступность, изготовление и т.д., соединения, используемые в некоторых способах согласно настоящему изобретению, при необходимости могут быть доставлены в форме пролекарств. Таким образом, в объем настоящего изобретения включены пролекарства соединений согласно настоящему изобретению, а также способы доставки пролекарств. Пролекарства соединений, используемых согласно настоящему изобретению, могут быть получены путем модификации функциональных групп, присутствующих в соединении, таким образом, что данные модификации расщепляются либо в ходе обычной манипуляции, либо in vivo, с образованием исходного соединения. Соответственно, пролекарства включают, например, соединения, описанные в настоящем документе, в которых гидрокси-, амино- или карбоксигруппа связана с любой группой, которая при введении пролекарства пациенту расщепляется с образованием гидрокси, амино или карбоновой кислоты соответственно.

RTA 408 может содержать один или более асимметрично замещенных атомов углерода или азота, и может быть выделен в оптически активной или рацемической форме. Таким образом, предполагаются все хиральные, диастереомерные формы рацемические формы, эпимерные формы и все геометрические изомерные формы структуры, если точно не указана конкретная стереохимия или изомерная форма. RTA 408 может находиться в виде рацематов и рацемических смесей, отдельных энантиомеров, смесей диастереомеров и индивидуальных диастереомеров. В некоторых вариантах реализации получен отдельный диастереомер.

Хиральные центры RTA 408 согласно настоящему изобретению могут иметь S- или Rконфигурацию.

Кроме того, атомы, составляющие RTA 408 согласно настоящему изобретению, включают все изотопные формы таких атомов. В настоящем описании изотопы включают атомы, имеющие одинаковый атомный номер, но разные массовые числа. В качестве общего примера и без ограничения, изотопы водорода включают тритий и дейтерий, а изотопы углерода включают ¹³C и ¹⁴C. Подобным образом, предполагается, что один или более атомов углерода в соединении согласно настоящему изобретению могут

- 17 030468

быть заменены атомом (атомами) кремния. Кроме того, предполагается, что один или более атомов кислорода в RTA 408 могут быть заменены атомом (атомами) серы или селена.

RTA 408 и его полиморфная форма также могут обладать тем преимуществом, что они могут быть более эффективными, быть менее токсичными, быть более длительно действующими, быть более мощными, давать меньше побочных эффектов, легче абсорбироваться и/или иметь лучшие фармакокинетические характеристики (например, более высокую биодоступность при пероральном введении и/или меньший клиренс) и/или обладать другими полезными фармакологическими, физическими или химическими преимуществами по сравнению с соединениями, известными из уровня техники, для применения при показаниях, указанных в настоящем описании.

III. Полиморфные формы RTA 408

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены различные твердые формы RTA 408, включая их сольваты. Проводили предварительное исследование компонентов лекарственной формы и предварительное исследование полиморфизма и обнаружили, что RTA 408 имеет большую тенденцию к образованию сольватов. Кристаллические формы 2, 3, 4 и 5 классов соответствуют сольватам. Для описания указанных классов см. табл. 1 ниже. Попытки высушить 2 и 3 классы (две группы изоструктурных сольватов) не увенчались успехом, что указывает на прочно связанные молекулы растворителя. В некоторых вариантах реализации сушка твердого вещества 4 класса (ацетонитрильного сольвата) приводила к изоструктурной десольватированной форме. В некоторых вариантах реализации сушка твердого вещества 5 класса (ТГФ сольвата) приводила к аморфной форме 1 класса. Несольватированные формы RTA 408 включают аморфную форму (1 класс) и кристаллический десольватированный сольват 4 класса (изоструктурный с ацетонитрильным сольватом 4 класса). В некоторых вариантах реализации аморфная форма имеет высокую температуру стеклования T_g=153°C (ACp=0,72 Дж/г°С) и является лишь слегка гигроскопичной (Am=+0,4% 50^85% относительная влажность (OB)). В некоторых вариантах реализации аморфная форма стабильна в течение по меньшей мере четырех недель в условиях повышенной температуры и влажности (т.е. открытая при 40°C/~75% ОВ или закрытая при 80°C). В некоторых вариантах реализации аморфную форму (1 класс) успешно получали из вещества 2 класса в двухэтапном способе (превращение в 5 класс и последующая сушка 5 класса с получением аморфной формы), а также в прямом одноэтапном способе (осаждение из раствора ацетона в бане с холодной водой). Кристаллический десольватированный сольват 4 класса (изоструктурный сольвату 4 класса) является слегка гигроскопичным (увеличение массы ~0,7 мас.% от 50% OB до 85% OB) и имеет возможную температуру плавления на уровне 196,1°C (AH=29,31 Дж/г).

Образец аморфной формы соединения 63415, 1 класса, характеризовали путем рамановской спектроскопии с Фурье-преобразованием, PXRD, TG-FTIR, титрования по методу Карла Фишера, ¹ Н-ЯМР, ДСК и DVS (см. раздел "Примеры" для получения дополнительной информации). Обнаруживали, что образец содержал ~0,9 мас.% EtOH со следами H₂O (согласно TG-FTIR). Содержание воды, составляющее 0,5 мас.%, определяли путем титрования по методу Карла Фишера. ДСК демонстрировала высокую температуру стеклования с T_p==153°C (ACp=0,72 Дж/г^). Согласно DVS указанное вещество является слегка гигроскопичным (Am=+0,4% 50^85% OB). В экспериментах ДСК или DVS не наблюдали кристаллизацию.

Химическую стабильность аморфной формы исследовали в органических растворителях, включая ацетон, EtOAc, MeOH и MeCN, а также различных водных средах (например, 1% водн. Твин 80, 1% водн. SDS, 1% водн. CTAB) в концентрации 1 мг/мл в моменты времени 6, 24 ч, 2 дня и 7 дней. Распад >1% наблюдали только для растворов в MeCN через 7 дней и для суспензий в 1% водной среде Твин 80 (во все моменты времени при 254 нм и через 24 ч, 2 дня и 7 дней при 242 нм).

Кроме того, стабильность аморфной формы исследовали путем хранения в условиях повышенной температуры и влажности (открытая при 25°C/~62% OB и 40°C/75% OB, и закрытая при 60°C и 80°C). Через одну неделю, две недели и четыре недели хранящиеся образцы анализировали путем PXRD. Ни один из образцов не отличался от аморфного исходного вещества.

Проводили более 30 экспериментов с кристаллизацией и сушкой, включая уравновешивание суспензии, медленное охлаждение, выпаривание и осаждение. В дополнение к аморфной форме (1 класс) получали четыре новые кристаллические формы (2, 3, 4 и 5 классы).

Четыре новые формы (2, 3, 4 и 5 классы) характеризовали путем рамановской спектроскопии с Фурье-преобразованием, PXRD и TG-FTIR. Все формы соответствуют сольватам (табл. 1). Эксперименты с сушкой в вакууме или в токе N₂ проводили с целью получения кристаллической несольватированной формы 63415.

- 18 030468

Таблица 1

Краткое описание полученных классов

Класс	Характеристики	Результат экспериментов с сушкой
1 класс	аморфная форма	-
2 класс	изоструктурные сольваты (например, гептан)	неуспешная сушка
3 класс	изоструктурные сольваты (например, этанол)	неуспешная сушка
4 класс	MeCN сольват и десольватированный сольват	успешная сушка, структура не изменилась

5 класс

ТГФ сольват

сушка привела к аморфной форме

2 класс: большинство экспериментов с кристаллизацией, которые проводили, приводили к получению твердого вещества 2 класса (см. раздел "Примеры" ниже). Члены данного класса могут соответствовать изоструктурным нестехиометрическим (<0,5 экв.) сольватам (гептана, циклогексана, изопропилового эфира, 1-бутанола, триэтиламина и, возможно, других растворителей, таких как гексан, другие простые эфиры и т.д.) с прочно связанными молекулами растворителя. Рамановские спектры и дифрактограммы PXRD в пределах данного класса очень схожи друг с другом, таким образом, указанные структуры, вероятно, являются по существу идентичными и имеют лишь небольшие отличия вследствие содержания разных растворителей.

Эксперименты с сушкой на образцах 2 класса не приводили к кристаллической несольватированной форме. Даже повышенные температуры (80°C) и высокий вакуум (<1х10^-3 мбар) не могли полностью удалить прочно связанные молекулы растворителя; содержание растворителя всегда оставалось >2 мас.%. Кристалличность данных частично высушенных образцов была уменьшена, но не наблюдали ни превращения в другую структуру, ни значительной аморфизации.

3 класс: твердое вещество 3 класса может быть получено в результате нескольких кристаллизации (см. раздел "Примеры" ниже). Образцы 3 класса, вероятно, являются изоструктурными сольватами 2PrOH, EtOH и, возможно, ацетона с прочно связанными молекулами растворителя. Они могли соответствовать либо стехиометрическим полусольватам, либо нестехиометрическим сольватам с содержанием растворителя ~0,5 экв. Как и в случае 2 класса, рамановские спектры и дифрактограммы PXRD в пределах данного класса очень схожи друг с другом, что указывает на схожие структуры, содержащие разные растворители.

Подобно 2 классу эксперименты с сушкой не увенчались успехом. Очень прочно связанные молекулы растворителя могли быть лишь частично удалены (т.е. от ~5,4 до ~4,8 мас.% после вплоть до 3 дней при 1 х10^-3 мбар и 80°C). Дифрактограммы PXRD оставались неизменными.

4 класс может быть получен из системы растворителей MeCN/H₂O в соотношении 7:3 (см. раздел "Примеры" ниже). Он, наиболее вероятно, соответствует кристаллическому ацетонитрильному полусольвату. Большинство молекул растворителя можно было удалить путем сушки (в вакууме или в токе N2 при повышенных температурах) без изменения или разрушения кристаллической структуры (дифрактограмма PXRD оставалась неизменной). Таким образом, получали кристаллическую несольватированную форму (или скорее десольватированный сольват). Она является слегка гигроскопичной (увеличение массы ~0,7 мас.% от 50% OB до 85% OB) и имеет возможную температуру плавления на уровне 196,1°C (ЛИ 29,31 Дж/г).

5 класс может быть получен из системы растворителей ТГФ/^O в соотношении ~1:1. 5 класс содержит связанный ТГФ (и, возможно, H₂O). Поскольку содержание этих двух компонентов нельзя легко определить количественно по отдельности, точная природа данного кристаллического сольвата не была определена.

Сушка 5 класса приводила к значительной десольватации и превращению в направлении аморфной формы (1 класс). В некоторых вариантах реализации аморфная форма RTA 408 может быть получена путем суспендирования гептанового сольвата 2 класса в смеси ТГФ/^O в соотношении 1:1 с образованием твердого вещества 5 класса с последующей сушкой и аморфизацией.

Эксперименты с целью получения аморфной формы (1 класс) проводили с использованием исходного вещества 2 класса. Преимущественно аморфное вещество (1 класс) получали, начиная с вещества 2 класса, в двухэтапном способе через 5 класс в масштабе 100 мг и 3 г (сушка при 100 мбар, 80°C, несколько дней). Было обнаружено, что получение полностью аморфного вещества (1 класс) возможно в одноэтапном способе, избегая растворителя ТГФ, путем прямого осаждения аморфной формы (1 класс) из ацетонового раствора вещества 2 класса в бане с холодной водой.

- 19 030468

IV. Заболевания, связанные с воспалением и/или окислительным стрессом

Воспаление представляет собой биологический процесс, обеспечивающий сопротивление инфекционным или паразитным организмам и восстановление поврежденной ткани. Как правило, воспаление характеризуется локальным расширением кровеносных сосудов, покраснением, опуханием и болью, накоплением лейкоцитов в участке инфицирования или повреждения, выработкой воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-1, и выработкой активных форм кислорода или азота, таких как пероксид водорода, супероксид и пероксинитрит. На более поздних стадиях воспаления может происходить ремоделирование ткани, ангиогенез и образование рубцов (фиброз) как часть процесса заживления раны. При обычных обстоятельствах воспалительная реакция регулируется, является временной и разрешается организованным образом после того, как удается справиться с инфекцией или поражением в достаточной мере. Однако если регуляторные механизмы не сработают, острое воспаление может стать чрезмерным и опасным для жизни. В качестве альтернативы, воспаление может стать хроническим и вызывать кумулятивное повреждение тканей или системные осложнения. На основании, по меньшей мере, данных, представленных в настоящем документе, RTA 408 можно применять для лечения или предотвращения воспаления или заболеваний, связанных с воспалением.

Во многие серьезные и трудноизлечимые заболевания человека вовлечено нарушение регуляции воспалительных процессов, включая такие заболевания, как рак, атеросклероз и диабет, которые обычно не рассматривали как воспалительные состояния. В случае рака воспалительные процессы связаны с процессами, включающими образование, прогрессирование, метастазирование опухоли и резистентность к лечению. В некоторых вариантах реализации RTA 408 можно применять для лечения или предотвращения раковых опухолей, включая карциному, саркому, лимфому, лейкоз, меланому, мезотелиому, множественную миелому или семиному, или рак мочевого пузыря, крови, костей, головного мозга, молочной железы, центральной нервной системы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, пищевода, желчного пузыря, половых органов, мочеполового тракта, головы, почки, гортани, печени, легкого, мышечной ткани, шеи, слизистой оболочки полости рта или носа, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, селезенки, тонкой кишки, толстой кишки, желудка, яичка или щитовидной железы. В настоящее время понятно, что атеросклероз, который долгое время рассматривали как нарушение метаболизма липидов, является главным образом воспалительным состоянием, при котором активированные макрофаги играют важную роль в образовании и конечном разрыве атеросклеротических бляшек. Было также показано, что активация путей передачи сигнала при воспалении играет роль в развитии резистентности к инсулину, а также в повреждении периферических тканей, связанном с диабетической гипергликемией. Чрезмерная выработка активных форм кислорода и активных форм азота, таких как супероксид, пероксид водорода, оксид азота и пероксинитрит, является признаком воспалительных состояний. Существуют данные, подтверждающие нарушенную регуляцию выработки пероксинитрита при широком спектре заболеваний (Szabo et al., 2007; Schulz et al., 2008; Forstermann, 2006; Pall, 2007).

В аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, обыкновенная волчанка, псориаз и рассеянный склероз, вовлечена неадекватная и постоянная активация воспалительных процессов в пораженных тканях, происходящая в результате дисфункции механизмов распознавания "своего" и ответа в иммунной системе. При нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона, повреждение нейронов коррелирует с активацией микроглии и повышенными уровнями провоспалительных белков, таких как индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS). Хроническая недостаточность органа, такая как почечная недостаточность, сердечная недостаточность, печеночная недостаточность и хроническая обструктивная болезнь легких, тесно связана с наличием хронического окислительного стресса и воспаления, приводящих к развитию фиброза и возможной потере функции органа. Окислительный стресс в эндотелиальных клетках сосудов, которые выстилают крупные и мелкие кровеносные сосуды, может приводить к дисфункции эндотелия и, как полагают, является важным фактором, вносящим вклад в развитие системного сердечно-сосудистого заболевания, осложнений диабета, хронической болезни почек и других форм недостаточности органа, и ряда других связанных со старением заболеваний, включая дегенеративные заболевания центральной нервной системы и сетчатки.

Окислительный стресс и воспаление в пораженных тканях вовлечены во многие другие нарушения, включая воспалительное заболевание кишечника; воспалительные заболевания кожи; воспаление слизистой оболочки и дерматит, связанные с лучевой терапией и химиотерапией; заболевания глаз, такие как увеит, глаукома, дегенерация желтого пятна и различные формы ретинопатии; недостаточность и отторжение трансплантата; ишемически-реперфузионное повреждение; хроническую боль; дегенеративные состояния костей и суставов, включая остеоартрит и остеопороз; астму и муковисцидоз; судорожные расстройства; и нервно-психические состояния, включая шизофрению, депрессию, биполярное расстройство, посттравматическое стрессовое расстройство, синдромы дефицита внимания, расстройства аутистического спектра и нарушения пищевого поведения, такие как нервная анорексия. Нарушение регуляции путей передачи сигнала при воспалении считается основным фактором в патологии мышечной атрофии, включая мышечную дистрофию и различные формы кахексии.

Нарушение регуляции передачи сигнала при воспалении также вовлечено в различные опасные для жизни острые нарушения, включая острую недостаточность органа, поражающую поджелудочную желе- 20 030468

зу, почки, печень или легкие, инфаркт миокарда или острый коронарный синдром, инсульт, септический шок, травму, тяжелые ожоги и анафилаксию.

Во многие осложнения инфекционных заболеваний также вовлечено нарушение регуляции воспалительных реакций. Хотя воспалительная реакция может уничтожать инвазивные патогены, чрезмерная воспалительная реакция также может быть довольно разрушительной и в некоторых случаях может являться основной причиной повреждения инфицированных тканей. Кроме того, чрезмерная воспалительная реакция также может приводить к системным осложнениям из-за сверхвыработки воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-1. Полагают, что это является фактором, влияющим на смертность вследствие тяжелого гриппа, тяжелого острого респираторного синдрома и сепсиса.

Аберрантная или избыточная экспрессия либо iNOS, либо циклооксигеназы-2 (COX-2) вовлечена в патогенез многих заболеваний. Например, очевидно, что NO является мощным мутагеном (Tamir and Tannebaum, 1996), и что оксид азота также может активировать COX-2 (Salvemini et al., 1994). Кроме того, наблюдается заметное увеличение iNOS в опухолях толстой кишки у крыс, индуцированных канцерогеном, азоксиметаном (Takahashi et al., 1997). Было показано, что ряд синтетических тритерпеноидных аналогов олеанолевой кислоты являются мощными ингибиторами клеточных воспалительных процессов, таких как индукция IFN-γ индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и COX-2 в макрофагах мыши. См. Honda et al. (2000a), Honda et al. (2000b) и Honda et al. (2002), содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

В соответствии с одним из аспектов соединение RTA 408, описанное в настоящем документе, отчасти характеризуется способностью ингибировать выработку оксида азота, индуцируемую воздействием γ-интерферона, в макрофагальных клетках RAW 264.7. RTA 408 также характеризуется способностью индуцировать экспрессию антиоксидантных белков, таких как NQO1, и уменьшать экспрессию провоспалительных белков, таких как COX-2 и индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS). Данные свойства имеют важное значение для лечения широкого спектра заболеваний и нарушений, в которые вовлечены окислительный стресс и нарушение регуляции воспалительных процессов, включая рак, осложнения в результате локализованного воздействия ионизирующего излучения или воздействия ионизирующего излучения на весь организм, воспаление слизистой оболочки и дерматит в результате лучевой терапии или химиотерапии, аутоиммунные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, в том числе атеросклероз, ишемически-реперфузионное повреждение, острую и хроническую недостаточность органа, в том числе почечную недостаточность и сердечную недостаточность, заболевания органов дыхания, диабет и осложнения диабета, тяжелую аллергию, отторжение трансплантата, реакцию "трансплантат против хозяина", нейродегенеративные заболевания, болезни глаз и сетчатки, острую и хроническую боль, дегенеративные заболевания костей, в том числе остеоартрит и остеопороз, воспалительные заболевания кишечника, дерматит и другие заболевания кожи, сепсис, ожоги, судорожные расстройства и нервнопсихические расстройства.

В соответствии с другим аспектом RTA 408 можно применять для лечения субъекта с таким состоянием, как болезни глаз. Например, увеит, дегенерация желтого пятна (как сухая форма, так и влажная форма), глаукома, диабетический отек желтого пятна, блефарит, диабетическая ретинопатия, заболевания или нарушения эндотелия роговицы, такие как эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса, послеоперационное воспаление, сухость глаз, аллергический конъюнктивит и другие формы конъюнктивита являются неограничивающими примерами болезней глаз, которые можно лечить с помощью RTA 408.

В соответствии с другим аспектом RTA 408 можно применять для лечения субъекта с таким состоянием, как заболевания или поражения кожи. Например, дерматит, включая аллергический дерматит, атопический дерматит, дерматит, вызванный воздействием химических веществ, или индуцированный излучением дерматит; термические или химические ожоги; хронические раны, включая диабетические язвы, пролежни или венозные язвы; акне; алопеция, включая облысение или алопецию, индуцированную лекарственными средствами; другие нарушения волосяного фолликула; врожденный буллезный эпидермолиз; солнечный ожог и его осложнения; нарушения пигментации кожи, включая витилиго; связанные со старением заболевания кожи; заживление послеоперационных ран; предотвращение или уменьшение рубцевания в результате поражения, операции или ожогов кожи; псориаз; дерматологические проявления аутоиммунных заболеваний или реакции "трансплантат против хозяина"; предотвращение или лечение рака кожи; нарушения, в которые вовлечена гиперпролиферация клеток кожи, такие как гиперкератоз, являются неограничивающими примерами заболеваний кожи, которые можно лечить с помощью RTA 408.

Не являясь связанными рамками конкретной теории, полагают, что активация антиоксидантного/противовоспалительного пути Keap1/Nrf2/ARE вовлечена как в противовоспалительные, так и антиканцерогенные свойства соединения, описанного в настоящем документе.

В соответствии с другим аспектом RTA 408 можно применять для лечения субъекта с состоянием, вызванным повышенными уровнями окислительного стресса в одной или более тканях. Окислительный стресс возникает из-за аномально высоких или длительно присутствующих уровней активных форм кислорода, таких как супероксид, пероксид водорода, оксид азота и пероксинитрит (образуемый в резуль- 21 030468

тате реакции оксида азота с супероксидом). Окислительный стресс может сопровождаться либо острым, либо хроническим воспалением. Окислительный стресс может быть вызван дисфункцией митохондрий, активацией иммунных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, острым воздействием внешнего фактора, такого как ионизирующее излучение или цитотоксический химиотерапевтический агент (например, доксорубицин), травмой или другим острым поражением тканей, ишемией/реперфузией, плохим кровообращением или анемией, локальной или системной гипоксией или гипероксией, повышенными уровнями воспалительных цитокинов и других связанных с воспалением белков и/или другими анормальными физиологическими состояниями, такими как гипергликемия или гипогликемия.

В моделях многих таких состояний у животных было показано, что стимуляция экспрессии индуцибельной гемоксигеназы (HO-1), целевого гена пути Nrf2, оказывает значительный терапевтический эффект, в том числе в моделях инфаркта миокарда, почечной недостаточности, недостаточности и отторжения трансплантата, инсульта, сердечно-сосудистого заболевания и аутоиммунного заболевания (например, Sacerdoti et al., 2005; Abraham & Kappas, 2005; Bach, 2006; Araujo et al., 2003; Liu et al., 2006; Ishikawa et al., 2001; Kruger et al., 2006; Satoh et al., 2006; Zhou et al., 2005; Morse and Choi, 2005; Morse and Choi, 2002). Данный фермент расщепляет свободный гем на железо, монооксид углерода (CO) и биливердин (который затем превращается в мощную антиоксидантную молекулу, билирубин).

В соответствии с другим аспектом RTA 408 можно применять для предотвращения или лечения повреждения ткани или острой и хронической недостаточности органа вследствие окислительного стресса, усиленного воспалением. Примеры заболеваний, относящихся к данной категории, включают сердечную недостаточность, печеночную недостаточность, недостаточность и отторжение трансплантата, почечную недостаточность, панкреатит, фиброзные заболевания легких (в том числе муковисцидоз, ХОБЛ и идиопатический фиброз легких), диабет (включая осложнения), атеросклероз, ишемически-реперфузионное повреждение, глаукому, инсульт, аутоиммунное заболевание, аутизм, дегенерацию желтого пятна и мышечную дистрофию. Например, исследования позволяют предположить, что в случае аутизма повышенный уровень окислительного стресса в центральной нервной системе может вносить вклад в развитие указанного заболевания (Chauhan and Chauhan, 2006).

Имеются данные, также связывающие окислительный стресс и воспаление с развитием и патологией многих других нарушений центральной нервной системы, включая психические расстройства, такие как психоз, глубокая депрессия и биполярное расстройство; судорожные расстройства, такие как эпилепсия; болевой и сенсорный синдромы, такие как мигрень, нейропатическая боль или шум в ушах; и поведенческие синдромы, такие как синдромы дефицита внимания. См., например, Dickerson et al., 2007; Hanson et al., 2005; Kendall-Tackett, 2007; Lencz et al., 2007; Dudhgaonkar et al., 2006; Lee et al., 2007; Morris et al., 2002; Ruster et al., 2005; McIver et al., 2005; Sarchielli et al., 2006; Kawakami et al., 2006; Ross et al., 2003, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Например, повышенные уровни воспалительных цитокинов, включая TNF-a, интерферон-γ и IL-6, связаны с серьезным психическим заболеванием (Dickerson et al., 2007). Активацию микроглии также связывали с серьезным психическим заболеванием. Следовательно, понижающая регуляция воспалительных цитокинов и ингибирование чрезмерной активации микроглии могли бы давать полезный эффект у пациентов с шизофренией, глубокой депрессией, биполярным расстройством, расстройствами аутистического спектра и другими нервно-психическими расстройствами.

Соответственно, при патологиях, в которые вовлечен один только окислительный стресс или окислительный стресс, усиленный воспалением, лечение может включать введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению, такого как соединение, описанное выше или во всем настоящем документе. Лечение можно осуществлять в целях предотвращения прежде, чем возникнет прогнозируемое состояние окислительного стресса (например, трансплантация органа или проведение лучевой терапии у пациента, страдающего раком), или его можно осуществлять терапевтически в ситуациях установленного окислительного стресса и воспаления. В некоторых вариантах реализации, когда соединение согласно настоящему изобретению применяют для лечения пациента, получающего лучевую терапию и/или химиотерапию, указанное соединение согласно настоящему изобретению можно вводить до, одновременно и/или после лучевой терапии или химиотерапии, или соединение можно вводить в комбинации с другими видами терапии. В некоторых вариантах реализации соединение согласно настоящему изобретению может предотвращать и/или уменьшать тяжесть побочных эффектов, связанных с лучевой терапией или химиотерапией (с использованием другого агента), не снижая при этом противоракового действия лучевой терапии или химиотерапии. Поскольку такие побочные эффекты могут быть дозолимитирующими для лучевой терапии и/или химиотерапии, в некоторых вариантах реализации соединение согласно настоящему изобретению можно применять для того, чтобы сделать возможным введение более высоких доз и/или более частое введение доз лучевой терапии и/или химиотерапии, например, что приводит к большей эффективности лечения. В некоторых вариантах реализации соединение согласно настоящему изобретению при введении в комбинации с лучевой терапией и/или химиотерапией может повышать эффективность конкретной дозы излучения и/или химиотерапии. В некоторых вариантах реализации соединение согласно настоящему изобретению при введении в комбинации с лучевой терапией и/или химиотерапией может повышать эффективность конкретной дозы

- 22 030468

излучения и/или химиотерапии, и уменьшать (или, по меньшей мере, не добавлять) побочные эффекты излучения и/или химиотерапии. В некоторых вариантах реализации и, не являясь связанными рамками конкретной теории, данная комбинаторная эффективность может быть обусловлена ингибированием активности провоспалительного фактора транскрипции NF-кВ соединением согласно настоящему изобретению. NF-кВ часто постоянно активируется в раковых клетках, и такая активация связана с резистентностью к терапии и способствованию прогрессированию опухоли (например, Karin, 2006; Aghajan et al., 2012). Другие факторы транскрипции, которые способствуют воспалению и раку, такие как STAT3 (например, He and Karin 2011; Grivennikov and Karin, 2010), также можно ингибировать соединением согласно настоящему изобретению в некоторых вариантах реализации.

RTA 408 можно применять для лечения или предотвращения воспалительных состояний, таких как сепсис, дерматит, аутоиммунное заболевание и остеоартрит. RTA 408 также можно применять для лечения или предотвращения воспалительной боли и/или нейропатической боли, например, путем индуцирования Nrf2 и/или ингибирования NF-кВ.

RTA 408 также можно применять для лечения или предотвращения заболеваний, таких как рак, воспаление, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, аутизм, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, обыкновенная волчанка, болезнь Крона и псориаз, воспалительное заболевание кишечника, и всех других заболеваний, в патогенез которых, как полагают, вовлечена чрезмерная выработка либо оксида азота, либо простагландинов, и патологий, в которые вовлечен один только окислительный стресс или окислительный стресс, усиленный воспалением. RTA 408 можно применять для лечения или предотвращения раковых опухолей, включая карциному, саркому, лимфому, лейкоз, меланому, мезотелиому, множественную миелому или семиному, или рак мочевого пузыря, крови, костей, головного мозга, молочной железы, центральной нервной системы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, пищевода, желчного пузыря, половых органов, мочеполового тракта, головы, почки, гортани, печени, легкого, мышечной ткани, шеи, слизистой оболочки полости рта или носа, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, селезенки, тонкой кишки, толстой кишки, желудка, яичка или щитовидной железы.

Другим аспектом воспаления является выработка воспалительных простагландинов, таких как простагландин E. RTA 408 можно применять для способствования расширению кровеносных сосудов, экстравазации плазмы, локальной боли, повышенной температуры и других симптомов воспаления. Индуцибельная форма фермента COX-2 связана с их выработкой и в воспаленных тканях обнаруживают высокие уровни COX-2. Поэтому ингибирование COX-2 может облегчать многие симптомы воспаления, и ряд имеющих важное значение противовоспалительных лекарственных средств (например, ибупрофен и целекоксиб) действуют путем ингибирования активности COX-2. Было показано, что класс циклопентеноновых простагландинов (cyPG) (например, 15-дезоксипростагландин J2, также известный как PGJ2) играет роль в стимуляции организованного разрешения воспаления (например, Rajakariar et al., 2007). COX2 также связана с выработкой циклопентеноновых простагландинов. Поэтому ингибирование COX-2 может мешать полному разрешению воспаления, потенциально способствуя сохранению активированных иммунных клеток в тканях и приводя к хроническому или "тлеющему" воспалению. Данный эффект может быть ответственным за повышенную частоту сердечнососудистых заболеваний у пациентов, применяющих селективные ингибиторы COX-2 в течение длительных периодов времени.

В соответствии с одним из аспектов RTA 408 можно применять для контроля выработки провоспалительных цитокинов внутри клетки путем селективной активации регуляторных остатков цистеина (RCR) в белках, которые регулируют активность факторов транскрипции, чувствительных к окислениювосстановлению. Было показано, что активация RCR простагландинами cyPG запускает способствующую разрешению воспаления программу, в которой сильно индуцируется активность антиоксидантного и цитопротекторного фактора транскрипции Nrf2, и подавляется активность прооксидантного и провоспалительного факторов транскрипции NF-кВ и STAT. В некоторых вариантах реализации RTA 408 можно применять для увеличения выработки антиоксидантных и восстановительных молекул (NQO1, HO-1, SOD1, γ-GCS) и уменьшения окислительного стресса и выработки прооксидантных и провоспалительных молекул (iNOS, COX-2, TNF-a). В некоторых вариантах реализации RTA 408 можно применять для того, чтобы вызывать возвращение клеток, в которых происходит воспалительный процесс, в невоспалительное состояние путем способствования разрешению воспаления и ограничения чрезмерного повреждения тканей у хозяина.

А. Рак

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для индуцирования апоптоза клеток опухоли, для индуцирования дифференцировки клеток, для ингибирования пролиферации раковых клеток, для ингибирования воспалительной реакции и/или для функционирования в качестве хемопревентивного средства. Например, согласно настоящему изобретению предложены новые полиморфные формы, обладающие одним или более из следующих свойств: (1) способность индуцировать апоптоз и дифференцировать как злокачественные, так и незлокачественные клетки, (2) активность на субмикромолярном или наномолярном уровне в каче- 23 030468

стве ингибитора пролиферации многих злокачественных клеток или клеток в состоянии злокачественного перерождения, (3) способность подавлять синтез de novo индуцируемой воспалительными ферментами синтазы оксида азота (iNOS), (4) способность ингибировать активацию NF-кВ и (5) способность индуцировать экспрессию гемоксигеназы-1 (HO-1).

Уровни iNOS и COX-2 повышены в некоторых раковых опухолях и вовлечены в онкогенез, и было показано, что ингибиторы COX-2 уменьшают заболеваемость первичными аденомами толстой кишки у людей (Rostom et al., 2007; Brown and DuBois, 2005; Crowel et al., 2003). iNOS экспрессируется в супрессорных клетках миелоидного происхождения (MDSC) (Angulo et al., 2000), и было показано, что активность COX-2 в раковых клетках приводит к выработке простагландина Е₂ (PGE₂), который, как было показано, индуцирует экспрессию аргиназы в MDSC (Sinha et al., 2007). Аргиназа и iNOS представляют собой ферменты, использующие L-аргинин в качестве субстрата и образующие L-орнитин и мочевину, и L-цитруллин и NO соответственно. Было показано, что уменьшение содержания аргинина в микросреде опухоли за счет MDSC в сочетании с выработкой NO и пероксинитрита ингибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз T-клеток (Bronte et al., 2003). Было показано, что ингибирование COX-2 и iNOS уменьшает накопление MDSC, восстанавливает цитотоксическую активность ассоциированных с опухолью T-клеток и отсрочивает рост опухоли (Sinha et al., 2007; Mazzoni et al., 2002; Zhou et al., 2007).

Ингибирование путей передачи сигнала NF-кВ и JAK/STAT использовали в качестве стратегии ингибирования пролиферации эпителиальных раковых клеток и индуцирования их апоптоза. Было показано, что активация STAT3 и NF-кВ приводит к подавлению апоптоза раковых клеток и способствованию пролиферации, инвазии и метастазированию. Было показано, что многие из целевых генов, вовлеченных в данные процессы, транскрипционно регулируются как NF-кВ, так и STAT3 (Yu et al., 2007).

В дополнение к непосредственной роли в эпителиальных раковых клетках, NF-кВ и STAT3 также играют важную роль в других клетках, обнаруживаемых в микросреде опухоли. Эксперименты на моделях у животных показали, что NF-кВ необходим как в раковых клетках, так и в гемопоэтических клетках для распространения действия воспаления на инициирование и прогрессирование рака (Greten et al., 2004). Ингибирование NF-кВ в раковых и миелоидных клетках уменьшает число и размер образующихся опухолей соответственно. Активация STAT3 в раковых клетках приводит к выработке нескольких цитокинов (IL-6, IL-10), которые подавляют созревание ассоциированных с опухолью дендритных клеток (DC). Кроме того, STAT3 активируется данными цитокинами в самих дендритных клетках. Ингибирование STAT3 в моделях рака у мышей восстанавливает созревание DC, способствует противоопухолевому иммунитету и ингибирует рост опухоли (Kortylewski et al., 2005). В некоторых вариантах реализации RTA 408 и его полиморфные формы можно применять для лечения рака, включая, например, рак предстательной железы. В некоторых вариантах реализации RTA 408 и его полиморфные формы можно применять в комбинированной терапии для лечения рака, включая, например, рак предстательной железы. См., например, пример H ниже.

В. Рассеянный склероз и другие нейродегенеративные состояния

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рассеянного склероза (PC) или других нейродегенеративных состояний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона или боковой амиотрофический склероз, у пациентов. Известно, что PC представляет собой воспалительное состояние центральной нервной системы (Williams et al., 1994; Merrill and Benvenist, 1996; Genain and Nauser, 1997). Данные, полученные на основании нескольких исследований, позволяют предположить, что в патогенез болезни Альцгеймера (БА), болезни Паркинсона (БП), бокового амиотрофического склероза (ALS) и PC вовлечены воспалительные, окислительные и/или иммунные механизмы (Bagasra et al., 1995; McGeer and McGeer, 1995; Simonian and Coyle, 1996; Kaltschmidt et al., 1997). Эпидемиологические данные показывают, что постоянное применение нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), блокирующих синтез простагландинов из арахидоната, заметно снижает риск развития БА (McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997). Таким образом, агенты, блокирующие образование NO и простагландинов, можно применять в подходах к предотвращению и лечению нейродегенеративных заболеваний. Успешные терапевтические кандидаты для лечения такого заболевания, как правило, должны обладать способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер. См., например, публикацию патента США 2009/0060873, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

C. Нейровоспаление

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с нейровоспалением. Нейровоспаление заключает в себе идею о том, что микроглиальные и астроцитарные ответы и действия в центральной нервной системе имеют в своей основе подобный воспалению характер, и что данные ответы являются главными в патогенезе и прогрессировании широкого спектра неврологических нарушений. Данные идеи распространялись от болезни Альцгеймера на другие нейродегенеративные заболевания (Eikelenboom et al., 2002; Ishizawa and Dickson, 2001), на ишемические/токсические заболевания (Gehrmann et al., 1995; Touzani et al., 1999), на биологию опухолей (Graeber et al., 2002) и даже на нормальное развитие головного

- 24 030468

мозга. В нейровоспалении задействован широкий спектр сложных клеточных ответов, включающих активацию микроглии и астроцитов, и индуцирование цитокинов, хемокинов, белков системы комплемента, белков острой фазы, окислительного повреждения и родственных молекулярных процессов, и данные явления могут оказывать отрицательное влияние на функцию нейронов, что приводит к повреждению нейронов, дальнейшей активации глии и, в конечном счете, к нейродегенерации.

D. Болезни почек

В некоторых вариантах реализации RTA 408, а также его полиморфные формы можно применять для лечения пациентов с болезнями и нарушениями со стороны почек, включая почечную недостаточность и хроническую болезнь почек (ХБП), на основе, например, способов, описанных в US 8129429, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Почечная недостаточность, приводящая к недостаточному клиренсу конечных продуктов обмена веществ из крови и анормальным концентрациям электролитов в крови, представляет собой значительную медицинскую проблему во всем мире, особенно в развитых странах. Диабет и гипертензия входят в число самых важных причин хронической почечной недостаточности, также известной как хроническая болезнь почек (ХБП), которая также связана с другими состояниями, такими как обыкновенная волчанка. Острая почечная недостаточность может возникать в результате воздействия некоторых лекарственных средств (например, ацетаминофена) или токсичных химических веществ, или в результате ишемически-реперфузионного повреждения, связанного с ударом или оперативным вмешательством, таким как трансплантация, и может приводить к хронической почечной недостаточности. У многих пациентов почечная недостаточность прогрессирует до стадии, на которой пациенту для продолжения жизни необходим регулярный диализ или трансплантация почки. Обе эти процедуры высоко инвазивны и связаны со значительными побочными эффектами и проблемами качества жизни. Хотя существуют эффективные виды лечения некоторых осложнений почечной недостаточности, таких как гиперпаратиреоз и гиперфосфатемия, не было показано, что существующее лечение останавливает или отменяет прогрессирование почечной недостаточности. Таким образом, агенты, которые могут налаживать нарушенную функцию почек, символизировали бы значительный прогресс в лечении почечной недостаточности.

Воспаление вносит значительный вклад в патологию ХБП. Существует также сильная механистическая связь между окислительным стрессом и почечной дисфункцией. Путь передачи сигнала NF-кВ играет важную роль в прогрессировании ХБП, так как NF-кВ регулирует транскрипцию МСР-1, хемокина, отвечающего за привлечение моноцитов/макрофагов, приводящее к воспалительной реакции, которая, в конечно счете, повреждает почку (Wardle, 2001). Путь Keap1/Nrf2/ARE контролирует транскрипцию нескольких генов, кодирующих антиоксидантные ферменты, включая гемоксигеназу-1 (HO-1). Абляция гена Nrf2 у самок мышей приводит к развитию волчаночноподобного гломерулярного нефрита (Yoh et al., 2001). Кроме того, несколько исследований показали, что экспрессия HO-1 индуцируется в ответ на повреждение и воспаление почек, и что данный фермент и его продукты - билирубин и монооксид углерода - играют защитную роль в почке (Nath et al., 2006).

Острое повреждение почек (ОПП) может возникать после ишемии-реперфузии, лечения некоторыми фармакологическими агентами, такими как цисплатин и рапамицин, и внутривенной инъекции радиоконтрастных веществ, используемых при медицинской визуализации. Как и в случае ХБП, воспаление и окислительный стресс вносят вклад в патологию ОПП. Молекулярные механизмы, лежащие в основе нефропатии, индуцированной радиоконтрастными веществами (RCN), не совсем понятны, однако, повидимому, сочетание всех явлений, включая длительную вазоконстрикцию, нарушенную ауторегуляцию почек и непосредственную токсичность контрастных веществ, вносит вклад в почечную недостаточность (Tumlin et al., 2006). Вазоконстрикция приводит к уменьшению почечного кровотока и вызывает ишемию-реперфузию и образование активных форм кислорода. В данных условиях сильно индуцируется HO-1, и было показано, что она предотвращает ишемически-реперфузионное повреждение в некоторых других органах, включая почку (Nath et al., 2006). В частности, было показано, что индукция HO-1 выполняет защитную функцию в модели RCN у крыс (Goodman et al., 2007). Реперфузия также индуцирует воспалительную реакцию отчасти через активацию передачи сигнала NF-кВ (Nichols, 2004). В качестве терапевтической стратегии предотвращения повреждения органов было предложено прицельное воздействие на NF-кВ (Zingarelli et al., 2003).

E. Сердечно-сосудистое заболевание

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с сердечно-сосудистым заболеванием. Сердечнососудистое (СС) заболевание имеет сложную этиологию, но большинство причин связано с недостаточным или полностью нарушенным кровоснабжением органа или ткани, имеющей критическое значение. Часто такое состояние возникает в результате разрыва одной или более атеросклеротических бляшек, который приводит к образованию тромба, блокирующего кровоток в сосуде, имеющем критическое значение.

В некоторых случаях заболевания атеросклероз может быть таким обширным в кровеносных сосудах, имеющих критическое значение, что развивается стеноз (сужение артерий), и приток крови к орга- 25 030468

нам, имеющим критическое значение (включая сердце), является постоянно недостаточным. Такая хроническая ишемия может приводить к разным видам повреждения конечного органа, включая гипертрофию сердца, связанную с застойной сердечной недостаточностью.

Атеросклероз, основное нарушение, приводящее ко многим формам сердечно-сосудистого заболевания, возникает, когда физический дефект или повреждение выстилки (эндотелия) артерии запускает воспалительную реакцию, в которую вовлечена пролиферация клеток гладкой мускулатуры сосудов и инфильтрация лейкоцитов в пораженную область. В конечном счете, может образовываться сложное поражение, известное как атеросклеротическая бляшка, состоящее из вышеупомянутых клеток в сочетании с отложениями несущих холестерин липопротеинов и других веществ (см., например, Hansson et al., 2006). Несмотря на значительные полезные эффекты, обеспечиваемые современными терапевтическими видами лечения, смертность в результате сердечно-сосудистого заболевания остается высокой, и сохраняются значительные нереализованные потребности в лечении сердечно-сосудистого заболевания.

Было показано, что индукция HO-1 оказывает полезный эффект в различных моделях сердечнососудистого заболевания, и низкие уровни экспрессии HO-1 клинически коррелировали с повышенным риском сердечно-сосудистого заболевания. Поэтому RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения или предотвращения различных сердечнососудистых нарушений, включая, но не ограничиваясь ими, атеросклероз, гипертензию, инфаркт миокарда, хроническую сердечную недостаточность, инсульт, субарахноидальное кровоизлияние и рестеноз. В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять в виде комбинированной терапии с другими известными сердечнососудистыми средствами, такими как, но не ограничиваясь ими, антикоагулянты, тромболитические средства, стрептокиназа, тканевые активаторы плазминогена, оперативное вмешательство, аортокоронарное обходное шунтирование, баллонная ангиопластика, использование стентов, лекарственные средства, ингибирующие пролиферацию клеток, или лекарственные средства, понижающие уровень холестерина.

F. Диабет

В некоторых вариантах реализации RTA 408, а также его полиморфные формы можно применять для лечения пациентов с диабетом на основе, например, способов, описанных в US 8129429, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Диабет представляет собой сложное заболевание, характеризующееся неспособностью организма регулировать уровни циркулирующей глюкозы. Данная неспособность может являться следствием нехватки инсулина, пептидного гормона, который регулирует как образование, так и поглощение глюкозы в различных тканях. Дефицит инсулина нарушает способность мышечных, жировых и других тканей поглощать глюкозу должным образом, что приводит к гипергликемии (аномально высоким уровням глюкозы в крови). Чаще всего такой дефицит инсулина является следствием его недостаточной выработки в островковых клетках поджелудочной железы. В большинстве случаев это обусловлено аутоиммунной деструкцией указанных клеток, состоянием, известным как диабет 1 типа или ювенильный диабет, но также может быть обусловлено физической травмой или другой причиной.

Диабет также может возникать, когда мышечные и жировые клетки становятся менее чувствительными к инсулину и не поглощают глюкозу должным образом, что приводит к гипергликемии. Данное явление известно как резистентность к инсулину, а возникающее в связи с этим состояние известно как диабет 2 типа. Диабет 2 типа, самый распространенный тип, тесно связан с ожирением и гипертензией. Ожирение связано с воспалительным состоянием жировой ткани, которое, как считается, играет главную роль в развитии резистентности к инсулину (например, Hotamisligil, 2006; Guilherme et al., 2008).

Диабет связан с повреждением многих тканей, в значительной степени потому, что гипергликемия (и гипогликемия, которая может быть следствием избыточных или несвоевременно вводимых доз инсулина) является значимой причиной окислительного стресса. Благодаря способности защищать от окислительного стресса, в частности, путем индукции экспрессии HO-1, RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения многих осложнений диабета. Как отмечено ранее (Cai et al., 2005), полагают, что хроническое воспаление и окислительный стресс в печени являются главными факторами, вносящими вклад в развитие диабета 2 типа. Кроме того, агонисты PPAR,. такие как тиазолидиндионы, способны снижать резистентность к инсулину и, как известно, эффективны в лечении диабета 2 типа. В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять в виде комбинированной терапии с агонистами PPAR_Y, такими как тиазолидиндионы.

G. Артрит

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с формой артрита. В некоторых вариантах реализации указанными формами артрита, которые можно лечить с помощью RTA 408 и полиморфных форм согласно настоящему изобретению, являются ревматоидный артрит (РА), псориатический артрит (ПА), спондилоартропатии (СпА), включая анкилозирующий спондилоартрит (АС), реактивный артрит (РеА) и

- 26 030468

энтеропатический артрит (ЭА), ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА) и ранний воспалительный артрит.

Первые признаки ревматоидного артрита, как правило, появляются в синовиальном выстилающем слое с пролиферацией синовиальных фибробластов и их присоединением к суставной поверхности на краю сустава (Lipsky, 1998). Затем в сустав привлекаются макрофаги, T-клетки и другие воспалительные клетки, где они продуцируют ряд медиаторов, включая цитокин интерлейкин-1 (IL-1), который вносит вклад в хронические осложнения, приводящие к разрушению кости и хряща, и фактор некроза опухолей (TNF-α), который играет роль в воспалении (Dinarello, 1998; Arend and Dayer, 1995; van den Berg, 2001). Концентрация IL-1 в плазме крови значительно выше у пациентов с РА, чем у здоровых индивидуумов, причем уровни IL-1 в плазме крови коррелируют с активностью заболевания PA (Eastgate et al., 1988). Более того, уровни IL-1 в синовиальной жидкости коррелируют с различными рентгенографическими и гистологическими признаками PA (Kahle et al., 1992; Rooney et al., 1990).

Другие формы артрита включают псориатический артрит (ПА), который представляет собой хроническую воспалительную артропатию, характеризующуюся соединением артрита и псориаза. Исследования показали, что ПА имеет ряд общих генетических, патогенных и клинических признаков с другими спондилоартропатиями (СпА), группой заболеваний, которая включает анкилозирующий спондилоартрит, реактивный артрит и энтеропатический артрит (Wright, 1979). Идея о том, что ПА относится к группе СпА, недавно получила дополнительную поддержку в результате визуализирующих исследований, демонстрирующих обширный энтезит при ПА, но не при РА (McGonagle et al., 1999; McGonagle et al., 1998). В частности, было принято, что энтезит является одним из самых ранних явлений, возникающих при СпА, приводящих к ремоделированию костей и анкилозу позвоночника, а также к синовиту суставов, когда воспаленные энтезисы находятся рядом с периферическими суставами. Существуют данные о повышенных количествах TNF-α как в пораженной псориазом коже (Ettehadi et al., 1994), так и в синовиальной жидкости (Partsch et al., 1997). Недавние исследования показали положительный эффект лечения анти-TNF как при ПА (Mease et al., 2000), так и при анкилозирующем спондилоартрите (Brandt et al., 2000).

Термин "ювенильный ревматоидный артрит (ЮРА)" для наиболее распространенной формы артрита у детей используют для семейства заболеваний, характеризующихся хроническим воспалением и гипертрофией синовиальных мембран. Данный термин совпадает, но не является полным синонимом семейства заболеваний, называемых в Европе ювенильным хроническим артритом и/или ювенильным идиопатическим артритом.

Полиартикулярный ЮРА является отдельным клиническим подтипом, характеризующимся воспалением и синовиальной пролиферацией во многих суставах (четыре или более), включая мелкие суставы рук (Jarvis, 2002). Данный подтип ЮРА может быть тяжелым вследствие как поражения многих суставов, так и способности быстро прогрессировать со временем. Хотя клиническая картина является четкой, полиартикулярный ЮРА неоднороден и пациенты демонстрируют различные проявления заболевания, различный возраст возникновения заболевания, различный прогноз и терапевтический ответ. Эти различия, вероятно, отражают спектр вариации характера иммунной и воспалительной атаки, которая может происходить при данном заболевании (Jarvis, 1998).

Анкилозирующий спондилоартрит (АС) представляет собой подгруппу заболеваний в более широкой классификации спондилоартропатии. Этиология заболевания у пациентов, пораженных различными подгруппами спондилоартропатии, часто очень отличается и находится в диапазоне от бактериальных инфекций до наследования. Тем не менее, во всех подгруппах конечным результатом патологического процесса является аксиальный артрит.

АС представляет собой системное хроническое воспалительное ревматическое поражение осевого скелета с внескелетными проявлениями или без них. В основном поражаются крестцово-подвздошные сочленения и позвоночник, но также могут быть поражены тазобедренные и плечевые суставы, и реже периферические суставы или некоторые внесуставные структуры, такие как глаз, сосудистая сеть, нервная система и желудочно-кишечная система. Этиология данного заболевания еще не полностью понятна (Wordsworth, 1995; Calin and Taurog, 1998). Этиология тесно связана с аллелем HLA-B27 главного комплекса гистосовместимости I класса (MHC I) (Calin and Taurog, 1998). АС поражает индивидуумов в расцвете сил и вызывает опасения из-за своей способности вызывать хроническую боль и необратимое повреждение сухожилий, связок, суставов и костей (Brewerton et al., 1973a; Brewerton et al., 1973b; Schlosstein et al., 1973).

H. Язвенный колит

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с язвенным колитом. Язвенный колит представляет собой заболевание, вызывающее воспаление и раны, называемые язвами, в выстилке толстой кишки. Воспаление обычно возникает в прямой кишке и в нижней части толстой кишки, но может поражать всю толстую кишку. Язвенный колит также может называться колитом или проктитом. Воспаление приводит к частому опорожнению толстой кишки, что вызывает диарею. Язвы образуются в местах, где воспале- 27 030468

ние привело к уничтожению клеток, выстилающих толстую кишку, и данные язвы кровоточат и выделяют гной.

Язвенный колит представляет собой воспалительное заболевание кишечника (IBD) - общее название заболеваний, вызывающих воспаление в тонкой кишке и толстой кишке. Язвенный колит может быть трудно диагностировать, так как его симптомы схожи с другими кишечными расстройствами и с другим видом IBD - болезнью Крона. Болезнь Крона отличается от язвенного колита тем, что вызывает воспаление глубже в стенке кишечника. Кроме того, болезнь Крона обычно протекает в тонкой кишке, хотя указанное заболевание также может иметь место в ротовой полости, пищеводе, желудке, двенадцатиперстной кишке, толстой кишке, аппендиксе и анальном отверстии.

I. Болезнь Крона

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с болезнью Крона. Симптомы болезни Крона включают воспаление кишечника и развитие стеноза кишечника и кишечных свищей; при этом данные симптомы часто сопровождаются нейропатией. Как правило, назначают противовоспалительные лекарственные средства, такие как 5-аминосалицилаты (например, мезаламин) или кортикостероиды, но они не всегда эффективны (рассмотрены у Botoman et al., 1998). Иммуносупрессия циклоспорином иногда является подходящей для пациентов с резистентностью или непереносимостью кортикостероидов (Brynskov et al., 1989).

В случаях активной болезни Крона в кровообращение выделяются повышенные концентрации TNF-α и IL-6, и TNF-α, IL-1, IL-6 и IL-8 в избытке вырабатываются клетками слизистой локально (то же; Funakoshi et al., 1998). Данные цитокины могут оказывать дальнодействующее влияние на физиологические системы, включая развитие костей, кроветворение, и функцию печени, щитовидной железы и нервно-психическую функцию. Кроме того, у пациентов с болезнью Крона наблюдали дисбаланс соотношения IL-1 (^J)/IL-1 ra в сторону провоспалительного IL-1 β (Rogler and Andus, 1998; Saiki et al., 1998; Dionne et al., 1998; см. Kuboyama, 1998).

Виды лечения, предложенные для болезни Крона, включают применение различных антагонистов цитокинов (например, IL-1ra), ингибиторов цитокинов (например, Ш-^-превращающий фермент и антиоксиданты) и антител к цитокинам (Rogler and Andus, 1998; van Hogezand and Verspaget, 1998; Reimund et al., 1998; Lugering et al., 1998; McAlindon et al., 1998). В частности, с некоторым успехом пробовали лечить болезнь Крона моноклональными антителами к TNF-α (Targan et al., 1997; Stack et al., 1997; van Dullemen et al., 1995). Данные соединения можно применять в комбинированной терапии с RTA 408, полиморфными формами и способами согласно настоящему изобретению.

J. Системная красная волчанка

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с системной красной волчанкой (SLE). Системная красная волчанка (SLE) представляет собой аутоиммунное ревматическое заболевание, характеризующееся отложением в тканях аутоантител и иммунных комплексов, приводящим к повреждению тканей (Kotzin, 1996). В отличие от таких аутоиммунных заболеваний, как PC и сахарный диабет 1 типа, SLE потенциально напрямую поражает несколько систем органов и ее клинические проявления разнообразны и варьируются (рассмотрено Kotzin and О'ОсИ, 1995). Например, некоторые пациенты могут демонстрировать в основном кожную сыпь и боль в суставах, демонстрировать спонтанные ремиссии и испытывать малую потребностью в лекарственных средствах. На другом конце спектра - пациенты, демонстрирующие тяжелое и прогрессирующее поражение почек, которое требует лечения высокими дозами стероидов и цитотоксических лекарственных средств, таких как циклофосфамид (Kotzin, 1996).

Одно из антител, вырабатываемых при SLE, IgG к двухцепочечной ДНК (дцДНК), играет главную роль в развитии волчаночного гломерулонефрита (ГН) (Hahn and Tsao, 1993; Ohnishi et al., 1994). Гломерулонефрит представляет собой серьезное состояние, при котором стенки капилляров почечных клубочков, очищающих кровь, утолщаются за счет наростов на эпителиальной стороне клубочковых базальных мембран. Данное заболевание часто является хроническим и прогрессирующим, и, в конечном счете, может приводить к почечной недостаточности.

K. Синдром раздраженной толстой кишки

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с синдромом раздраженной толстой кишки (IBS). IBS представляет собой функциональное нарушение, характеризующееся болью в животе и изменением ритма дефекации. Данный синдром может возникать в периоде ранней взрослости и может быть связан со значительной нетрудоспособностью. Данный синдром не является однородным нарушением. Напротив, были описаны подтипы IBS на основе преобладающего симптома: диарея, запор или боль. При отсутствии тревожных симптомов, таких как жар, потеря массы тела и желудочно-кишечное кровотечение, требуется ограниченное обследование.

Все больше данных о происхождении IBS позволяют предположить связь между инфекционным энтеритом и последующим развитием IBS. Воспалительные цитокины могут играть некоторую роль. В

- 28 030468

опросе пациентов с наличием подтвержденного бактериального гастроэнтерита в анамнезе (Neal et al., 1997) 25% сообщали об устойчивом изменении ритма дефекации. Стойкость симптомов может быть обусловлена психологическим стрессом во время острой инфекции (Gwee et al., 1999).

Недавно полученные данные позволяют предположить, что избыточный рост бактерий в тонкой кишке также может играть роль в возникновении симптомов IBS. В одном из исследований (Pimentel et al., 2000) 157 (78%) из 202 пациентов с IBS, направленных на определение содержания водорода в выдыхаемом воздухе, получали положительные в отношении избыточного роста бактерий результаты. Из 47 субъектов, прошедших последующую проверку, 25 (53%) сообщали об уменьшении симптомов (т.е. боли в животе и диареи) при лечении антибиотиками.

L. Синдром Шегрена

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с синдромом Шегрена. Первичный синдром Шегрена (СШ) представляет собой хроническое медленно прогрессирующее системное аутоиммунное заболевание, которое поражает преимущественно женщин средних лет (соотношение женщин и мужчин составляет 9:1), хотя его также можно наблюдать во всех возрастных категориях, включая детский возраст (Jonsson et al., 2002). Указанное заболевание характеризуется лимфоцитарной инфильтрацией и деструкцией экзокринных желез, которые инфильтруются мононуклеарными клетками, включая лимфоциты CD4+, CD8+ и B-клетки (Jonsson et al., 2002). Кроме того, у одной трети пациентов наблюдают внежелезистые (системные) проявления (Jonsson et al., 2001).

При других системных аутоиммунных заболеваниях, таких как РА, были определены факторы, имеющие критическое значение для эктопических герминативных центров (GC). Было показано, что ревматоидные синовиальные ткани с GC вырабатывают хемокины CXCL13, CCL21 и лимфотоксин (LT)β (обнаруженный на B-клетках фолликулярного центра и мантийной зоны). Многовариантный регрессионный анализ данных аналитов позволил идентифицировать CXCL13 и LT-β в качестве одиночных цитокинов, предсказывающих GC при ревматоидном синовите (Weyand and Goronzy, 2003). Недавно было показано, что CXCL13 и CXCR5 в слюнных железах играют существенную роль в воспалительном процессе путем привлечения B- и T-клеток, тем самым внося вклад в лимфоидный неогенез и образование эктопических GC при синдроме Шегрена (Salomonsson et al., 2002).

M. Псориаз

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения пациентов с псориазом. Псориаз представляет собой хроническое заболевание кожи, характеризующееся шелушением и воспалением, поражающее от 2 до 2,6% населения Соединенных Штатов или от 5,8 до 7,5 млн человек. Псориаз возникает, когда клетки кожи быстро поднимаются из источника под поверхностью кожи и скапливаются на поверхности до того, как им удается созреть. Обычно данный процесс (также называемый обновлением) занимает примерно месяц, но при псориазе обновление может происходить всего лишь за несколько дней. В типичной форме псориаз приводит к появлению участков толстой красной (воспаленной) кожи, покрытой серебристыми чешуйками. Данные участки, иногда называемые бляшками, обычно чешутся или болят. Указанные бляшки чаще всего появляются на локтях, коленях, других частях ног, скальпе, нижней части спины, лице, ладонях и подошвах стоп, но они также могут появляться на коже в любой части тела. Указанное заболевание также может поражать ногти пальцев рук, ногти пальцев ног и мягкие ткани половых органов и ротовую полость.

Псориаз представляет собой поражение кожи, управляемое иммунной системой, в которое, в частности, вовлечен вид лейкоцитов, называемый T-клетками. Обычно T-клетки помогают защитить организм от инфекций и заболеваний. В случае псориаза T-клетки приводятся в действие по ошибке и становятся такими активными, что запускают другие иммунные ответы, которые приводят к воспалению и к быстрому обновлению клеток кожи.

N. Инфекционные заболевания

В некоторых вариантах реализации RTA 408, полиморфные формы и способы согласно настоящему изобретению могут подходить для лечения инфекционных заболеваний, включая вирусные и бактериальные инфекции. Как отмечено выше, такие инфекции могут быть связаны с тяжелыми местными или системными воспалительными реакциями. Например, грипп может вызывать тяжелое воспаление легких, а бактериальная инфекция может вызывать системную гипервоспалительную реакцию, включая чрезмерную выработку многочисленных воспалительных цитокинов, что является признаком сепсиса. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению могут подходить для непосредственного ингибирования репликации вирусных патогенов. Предыдущие исследования показали, что родственные соединения, такие как CDDO, могут ингибировать репликацию ВИЧ в макрофагах (Vazquez et al., 2005). Другие исследования показали, что ингибирование передачи сигнала NF-xB может приводить к ингибированию репликации вируса гриппа, и что циклопентеноновые простагландины могут ингибировать репликацию вируса (например, Mazur et al., 2007; Pica et al., 2000).

Настоящее изобретение относится к лечению или предотвращению каждого из заболева- 29 030468

ний/нарушений/состояний, указанных выше в IV разделе, с применением соединения RTA 408 или его фармацевтически приемлемой соли, или полиморфной формы указанного соединения (такой как, например, любая из полиморфных форм, описанных выше и ниже в настоящем документе), или фармацевтической композиции, содержащей любое из вышеупомянутых соединений и фармацевтически приемлемый носитель (включая, например, фармацевтические композиции, описанные выше).

V. Фармацевтические составы и пути введения

RTA 408 можно вводить различными способами, например, перорально или путем инъекции (например, подкожной, внутривенной, интраперитонеальной и т.д.). В зависимости от пути введения активные соединения могут быть покрыты веществом для защиты указанных соединений от воздействия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение. Их также можно вводить путем непрерывной перфузии/инфузии в место заболевания или раны.

Для введения RTA 408 путями, отличными от парентерального введения, может быть необходимым нанесение на указанное соединение или совместное введение соединения с веществом, предотвращающим его инактивацию. Например, терапевтическое соединение можно вводить пациенту в подходящем носителе, например, липосомах или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии CGF вода-вмасле-в-воде, а также обычные липосомы (Strejan et al., 1984).

RTA 408 также можно вводить парентерально, интраперитонеально, интраспинально или интрацеребрально. Дисперсии могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, и в маслах. В обычных условиях хранения и применения данные препараты могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения RTA 408 в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии готовят путем включения терапевтического соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительные способы получения представляют собой вакуумную сушку и сушку методом сублимации, в результате которой получают порошок активного ингредиента (т.е. терапевтического соединения), а также любого желаемого дополнительного ингредиента из его предварительно стерилизованного путем фильтрации раствора.

Соединение RTA 408 может быть приведено в полностью аморфное состояние с использованием метода прямой сушки распылением. RTA 408 можно вводить перорально, например, совместно с инертным разбавителем или усваиваемым пищевым носителем. Терапевтическое соединение и другие ингредиенты также могут быть заключены в капсулу с твердой или мягкой желатиновой оболочкой, спрессованы в таблетки или включены непосредственно в рацион питания пациента. Для терапевтического перорального введения терапевтическое соединение можно включать в состав, например, совместно со вспомогательными веществами и применять в виде принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, лепешек, капсул, включая твердые или мягкие капсулы, эликсиров, эмульсий, твердых дисперсий, суспензий, сиропов, пластин и т.п. Процентное содержание терапевтического соединения в композициях и препаратах, конечно, можно варьировать. Количество терапевтического соединения в таких терапевтически полезных композициях является таким, чтобы получить подходящую дозу.

Особенно предпочтительным является получение композиций для парентерального введения в единичной лекарственной форме для легкости введения и однородности дозы. В настоящем описании термин "единичная лекарственная форма" относится к физически раздельным объектам, подходящим для использования в качестве единичных доз для введения пациентам, которых лечат; причем каждая доза содержит заранее определенное количество терапевтического соединения, рассчитанное таким образом, чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект, совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Требования к единичным лекарственным формам согласно настоящему изобретению продиктованы и напрямую зависят от (a) уникальных характеристик терапевтического соединения и конкретного достигаемого терапевтического эффекта, и (b) ограничений в области приготовления лекарственных средств на основе такого терапевтического соединения для лечения выбранного состояния у пациента.

RTA 408 также можно вводить топически в кожу, глаз или слизистую оболочку. В некоторых вариантах реализации соединение может быть получено в лосьоне, креме, геле, масле, мази, бальзаме, растворе, суспензии или эмульсии. В качестве альтернативы, если желаемой является местная доставка в легкие, терапевтическое соединение можно вводить путем ингаляции в составе в виде сухого порошка или аэрозоля.

RTA 408, как правило, будут вводить в терапевтически эффективной дозе, достаточной для лечения состояния у конкретного пациента. Например, эффективность соединения можно оценить в системе модели у животного, которая может служить для предсказания эффективности лечения заболевания у людей, такой как системы моделей, представленные в примерах и на чертежах.

Фактическая величина дозы RTA 408 или композиции, содержащей RTA 408, вводимая субъекту,

- 30 030468

может определяться физическими и физиологическими факторами, такими как возраст, пол, масса тела, тяжесть состояния, тип вылечиваемого заболевания, предшествующее или параллельное терапевтическое воздействие, индивидуальная особенность пациента и путь введения. Данные факторы могут быть определены специалистом. Практикующий врач, ответственный за введение, как правило, определяет концентрацию активного ингредиента (ингредиентов) в композиции и соответствующую дозу (дозы) для индивидуального пациента. Лечащий врач может корректировать дозу в случае какого-либо осложнения.

Эффективное количество, как правило, будет варьироваться от примерно 0,001 до примерно 1000 мг/кг, от примерно 0,01 до примерно 750 мг/кг, от примерно 100 до примерно 500 мг/кг, от примерно 1,0 до примерно 250 мг/кг, от примерно 10,0 до примерно 150 мг/кг за одно или более введений доз каждый день в течение одного или нескольких дней (в зависимости от курса или от способа введения и от факторов, рассмотренных выше). Другие подходящие диапазоны доз включают от 1 до 10000 мг в сутки, от 100 до 10000 мг в сутки, от 500 до 10000 мг в сутки и от 500 до 1000 мг в сутки. В некоторых конкретных вариантах реализации количество составляет меньше 10000 мг в сутки с диапазоном от 750 до 9000 мг в сутки.

Эффективное количество может составлять меньше 1 мг/кг/сутки, меньше 500 мг/кг/сутки, меньше 250 мг/кг/сутки, меньше 100 мг/кг/сутки, меньше 50 мг/кг/сутки, меньше 25 мг/кг/сутки или меньше 10 мг/кг/сутки. В качестве альтернативы оно может находиться в диапазоне от 1 мг/кг/сутки до 200 мг/кг/сутки. В некоторых вариантах реализации количество может составлять 10, 30, 100 или 150 мг/кг, представленные в виде суспензии в кунжутном масле, как описано ниже в примере C1. В некоторых вариантах реализации количество может составлять 3, 10, 30 или 100 мг/кг, вводимые каждый день через желудочный зонд, как описано ниже в примерах C2 и C3. В некоторых вариантах реализации количество может составлять 10, 30 или 100 мг/кг, вводимые перорально, как описано ниже в примере C6. Например, что касается лечения пациентов, страдающих диабетом, однократная доза может представлять собой количество, понижающее уровень глюкозы в крови по меньшей мере на 40% по сравнению с пациентом, не получающим лечение. В другом варианте реализации однократная доза представляет собой количество, понижающее уровень глюкозы в крови до уровня, составляющего ±10% уровня глюкозы в крови у пациента, не страдающего диабетом.

В других неограничивающих примерах доза также может составлять от примерно 1 мкг/кг массы тела, примерно 5 мкг/кг массы тела, примерно 10 мкг/кг массы тела, примерно 50 мкг/кг массы тела, примерно 100 мкг/кг массы тела, примерно 200 мкг/кг массы тела, примерно 350 мкг/кг массы тела, примерно 500 мкг/кг массы тела, примерно 1 мг/кг массы тела, примерно 5 мг/кг массы тела, примерно 10 мг/кг массы тела, примерно 50 мг/кг массы тела, примерно 100 мг/кг массы тела, примерно 200 мг/кг массы тела, примерно 350 мг/кг массы тела, примерно 500 мг/кг массы тела до примерно 1000 мг/кг массы тела или больше за одно введение, и любой диапазон, получаемый из приведенных диапазонов. В неограничивающих примерах диапазона, получаемого из величин, приведенных в настоящем описании, может быть введена доза в диапазоне от примерно 5 мг/кг массы тела до примерно 100 мг/кг массы тела, от примерно 5 мкг/кг массы тела до примерно 500 мг/кг массы тела и т.д. на основе величин, приведенных выше.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать, например, по меньшей мере примерно 0,01% RTA 408. В других вариантах реализации RTA 408 может составлять, например, от примерно 0,01 до примерно 75% от массы единицы или от примерно 0,01 до примерно 5%, и находиться в любом диапазоне, получаемом из приведенных диапазонов. В некоторых вариантах реализации RTA 408 можно использовать в составе, таком как суспензия в кунжутном масле, в количестве 0,01, 0,1 или 1%, как описано ниже в примерах F и G. В некоторых вариантах реализации соединение RTA 408 может быть представлено в форме для топического введения в кожу или глаз с использованием фармацевтически подходящего носителя, или в виде суспензии, эмульсии или раствора в концентрации в диапазоне от примерно 0,01 до 10%. В некоторых вариантах реализации концентрация находится в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 5%. Оптимальная концентрация может варьироваться в зависимости от целевого органа, конкретного препарата и состояния, которое лечат.

Предусмотрены однократные или многократные дозы агента, включающего RTA 408. Желаемые временные интервалы для доставки многократных доз могут быть определены специалистом в данной области техники с использованием не более чем рутинного эксперимента. В качестве примера, пациентам можно вводить две дозы каждый день с приблизительно 12-часовыми интервалами. В некоторых вариантах реализации агент вводят один раз в сутки. Агент (агенты) можно вводить в установленном режиме. В настоящем описании термин "установленный режим" относится к заранее определенному обозначенному периоду времени. Установленный режим может включать одинаковые или разные по продолжительности периоды времени, при условии, что данный режим определен заранее. Например, установленный режим может включать введение два раза в день, каждый день, один раз в два дня, один раз в три дня, один раз в четыре дня, один раз в пять дней, один раз в шесть дней, один раз в неделю, один раз в месяц или один раз в установленное число дней или недель в промежутке между указанными. В качестве альтернативы, заранее определенный установленный режим может включать введение два

- 31 030468

раза в день в течение первой недели с последующим введением каждый день в течение нескольких месяцев и т.д. В других вариантах реализации настоящего изобретения предусмотрен прием агента (агентов) перорально и предусмотрено, что время приема зависит или не зависит от приема пищи. Таким образом, например, агент можно принимать каждое утро и/или каждый вечер независимо от того, когда пациент поел или будет есть.

VI. Комбинированная терапия

Помимо применения в качестве монотерапии, RTA 408 и полиморфные формы, описанные в настоящем документе, также могут найти применение в комбинированной терапии. Эффективную комбинированную терапию можно осуществлять с помощью одной композиции или фармацевтического состава, содержащего оба агента, или с помощью двух разных композиций или составов, вводимых одновременно, при этом одна композиция содержит RTA 408 или его полиморфные формы, а другая содержит второй агент (агенты). Другое терапевтическое средство может быть введено до, одновременно или после введения RTA 408 или его полиморфных форм. Терапия с использованием RTA 408 или его полиморфных форм может предшествовать или следовать после введения другого агента (агентов) с интервалами в диапазоне от минут до недель. В вариантах реализации, в которых другой агент и RTA 408 или его полиморфные формы вводят по отдельности, нужно следить за тем, чтобы не истек значительный период времени между доставкой каждого агента так, чтобы каждый агент по-прежнему смог оказывать предпочтительно комбинированное действие. В таких случаях предполагается, что RTA 408 или полиморфные формы и другой терапевтический агент будут, как правило, вводить в течение примерно 12-24 ч один после другого и более предпочтительно в течение примерно 6-12 один после другого, при этом наиболее предпочтительным является время задержки, составляющее лишь примерно 12 ч. В некоторых ситуациях может быть желательным значительное продление периода времени для лечения, однако при этом разрыв во времени между соответствующими введениями составляет от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).

Также возможно, будет желательным больше, чем одно введение RTA 408 или его полиморфных форм, или другого агента. В связи с этим, можно использовать различные комбинации. В качестве иллюстрации, где RTA 408 или его полиморфные формы обозначены "A", а другой агент обозначен "B", типичными являются следующие комбинации исходя из 3 и 4 суммарных введений:

А/В/А В/А/В В/В/А А/А/В В/А/А А/В/В В/В/В/А В/В/А/В А/А/В/В А/В/А/В А/В/В/А В/В/А/А В/А/В/А В/А/А/В В/В/В/А А/А/А/В В/А/А/А А/В/А/А А/А/В/А А/В/В/В В/А/В/В В/В/А/В

Также предусмотрены другие комбинации. Неограничивающие примеры фармакологических агентов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают любой фармакологический агент, который, как известно, является подходящим для лечения рака. В некоторых вариантах реализации предусмотрены комбинации RTA 408 или его полиморфных форм с прицельной иммунотерапией рака, генной терапией, лучевой терапией, химиотерапевтическим агентом или оперативным вмешательством. Также предусмотрена комбинация RTA 408 или его полиморфных форм с более чем одним из вышеупомянутых способов, включая более одного вида конкретной терапии. В некоторых вариантах реализации иммунотерапия может представлять собой другие антитела, прицельно воздействующие на рак, такие как, но не ограничиваясь ими, трастузумаб (Герцептин®), алемтузумаб (Кэмпас®), бевацизумаб (Авастин®), цетуксимаб (Эрибитукс®) и панитумумаб (Вектибикс®), или конъюгированные антитела, такие как ибритумомаб тиуксетан (Зевалин®), тозитумомаб (Бексар®), брентуксимаб ведотин (Адцетрис®), адо-трастузумаб эмтанзин (Кадсила™) или денилейкин дифтитокс (Онтак®). Кроме того, в некоторых вариантах реализации предусмотрено применение RTA 408 или его полиморфных форм в комбинированной терапии совместно с иммунотерапией на основе дендритных клеток, например, сипулейцел-T (Провенж®), или адаптивной T-клеточной иммунотерапией.

Кроме того, предполагается, что RTA 408 или его полиморфные формы применяют в комбинации с химиотерапевтическим агентом, таким как, но не ограничиваясь ими, антрациклины, таксаны, метотрексат, митоксантрон, эстрамустин, доксорубицин, этопозид, винбластин, карбоплатин, винорелбин, 5фторурацил, цисплатин, топотекан, ифосфамид, циклофосфамид, эпирубицин, гемцитабин, винорелбин, иринотекан, этопозид, винбластин, пеметрексед, мелфалан, капецитабин и оксалиплатин. В некоторых вариантах реализации RTA 408 или его полиморфные формы применяют в комбинации с лучевой терапией, включая, но не ограничиваясь им, использование ионизирующего излучения. В некоторых вариантах реализации эффекты противоракового терапевтического агента синергетически усиливают путем введения RTA 408 и его полиморфных форм. В некоторых вариантах реализации виды комбинированной терапии, включающие RTA 408, используют для лечения рака, включая, например, рак предстательной железы. См., например, пример H ниже.

В некоторых вариантах реализации указанные способы могут дополнительно включать (1) приведение клетки опухоли в контакт с соединением перед приведением указанной клетки опухоли в контакт со вторым химиотерапевтическим агентом, (2) приведение клетки опухоли в контакт со вторым химиотерапевтическим агентом перед приведением указанной клетки опухоли в контакт с соединением или (3)

- 32 030468

приведение клетки опухоли в контакт с соединением и вторым химиотерапевтическим агентом одновременно. В некоторых вариантах реализации второй химиотерапевтический агент может быть антибиотическим, противовоспалительным, противоопухолевым, антипролиферативным, противовирусным, иммуномодулирующим или иммуносупрессивным. В других вариантах реализации второй химиотерапевтический агент может представлять собой алкилирующий агент, модулятор андрогенных рецепторов, вещество, разрушающее цитоскелет, модулятор эстрогеновых рецепторов, ингибитор гистондеацетилазы, ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы, ингибитор пренилпротеинтрансферазы, модулятор ретиноидных рецепторов, ингибитор топоизомеразы или ингибитор тирозинкиназы. В некоторых вариантах реализации второй химиотерапевтический агент представляет собой 5-азацитидин, 5-фторурацил, 9-цис-ретиноевую кислоту, актиномицин D, алитретиноин, полностью-транс-ретиноевую кислоту, аннамицин, акситиниб, белиностат, бевацизумаб, бексаротен, босутиниб, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, CD437, цедираниб, цетуксимаб, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дазатиниб, даунорубицин, децитабин, доцетаксел, доластатин-10, доксифлуридин, доксорубицин, доксорубицин, эпирубицин, эрлотиниб, этопозид, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб озогамицин, гексаметилмеламин, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, иринотекан, изотретиноин, иксабепилон, лапатиниб, LBH589, ломустин, мехлорэтамин, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, митомицин, митоксантрон, MS-275, нератиниб, нилотиниб, нитрозомочевину, оксалиплатин, паклитаксел, пликамицин, прокарбазин, семаксаниб, семустин, бутират натрия, фенилацетат натрия, стрептозотоцин, субероиланилид гидроксамовой кислоты, сунитиниб, тамоксифен, тенипозид, тиотепу, тиогуанин, топотекан, TRAIL, трастузумаб, третиноин, трихостатин А, вальпроевую кислоту, вальрубицин, вандетаниб, винбластин, винкристин, виндезин или винорелбин.

Кроме того, предусмотрены виды комбинированной терапии для лечения сердечно-сосудистого заболевания с использованием RTA 408, полиморфных форм и фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Такие способы, например, могут дополнительно включать введение фармацевтически эффективного количества одного или более сердечно-сосудистых лекарственных средств в дополнение к RTA 408, полиморфным формам и фармацевтическим композициям согласно настоящему изобретению. Сердечно-сосудистое лекарственное средство может представлять собой, но не ограничивается ими, например, лекарственное средство, снижающее холестерин, антигиперлипидемическое средство, блокатор кальциевых каналов, антигипертензивное средство или ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы. В некоторых вариантах реализации неограничивающие примеры сердечно-сосудистых лекарственных средств включают амлодипин, аспирин, эзетимиб, фелодипин, лацидипин, лерканидипин, никардипин, нифедипин, нимодипин, нисолдипин или нитрендипин. В других вариантах реализации другие неограничивающие примеры сердечно-сосудистых лекарственных средств включают атенолол, буциндолол, карведилол, клонидин, доксазозин, индорамин, лабеталол, метилдопу, метопролол, надолол, окспренолол, феноксибензамин, фентоламин, пиндолол, празозин, пропранолол, теразозин, тимолол или толазолин. В других вариантах реализации сердечнососудистое лекарственное средство может представлять собой, например, статин, такой как аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин или симвастатин.

VII. Примеры

Для демонстрации предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения в заявку включены следующие примеры. Специалисты должны принять во внимание, что методики, описанные в нижеследующих примерах, представляют собой методики, которые, как было обнаружено автором изобретения, хорошо функционировали при осуществлении изобретения, и, таким образом, могли рассматриваться в качестве основы предпочтительных способов его осуществления. Вместе с тем, в свете настоящего описания специалисты должны принять во внимание, что в конкретные описанные варианты реализации можно внести большое количество изменений и при этом получить сходный или аналогичный результат, не выходя за рамки настоящего изобретения.

- 33 030468

Реагенты и условия: (a) (PhO)₂PON₃ (ДФФА), Et₃N, толуол, 0°C в течение 5 мин, затем кт в течение ночи, ~94%; (b) бензол, 80°C в течение 2 ч; (c) HCl, CH₃CN, кт в течение 1 ч; (d) CH₃CF₂CO₂H, DCC, DMAP, CH₂Cl₂, кт в течение ночи, 73% от RTA 401 (4 этапа).

Соединение 1. В реактор к раствору толуола (400 мл) добавляли RTA 401 (который можно получить в соответствии со способами, описанными, например, в работах Honda, et al., 1998; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Yates et al., 2007; и патентах США 6326507 и 6974801, которые включены в настоящий документ посредством ссылки) (20,0 г, 40,6 ммоль) и Et3N (17,0 мл, 122,0 ммоль) и охлаждали до 0°C при перемешивании. Дифенилфосфорилазид (ДФФА) (13,2 мл, 61,0 ммоль) добавляли при перемешивании при 0°C в течение 5 мин, и смесь непрерывно перемешивали при комнатной температуре в течение ночи (проверка ВЭЖХ-МС показала отсутствие остаточного RTA 401). Реакционную смесь непосредственно наносили на колонку с силикагелем и очищали колоночной хроматографией (силикагель, от 0 до 5% EtOAc в CH2Cl2), получая соединение 1 (19,7 г, ~94%, частично преобразованное в соединение 2) в виде белой пены.

Соединение 2. Соединение 1 (19,7 г, ~38,1 ммоль) и бензол (250 мл) добавляли в реактор и нагревали до 80°C при перемешивании в течение 2 ч (проверка ВЭЖХ-МС показала отсутствие остаточного соединения 1). Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, получая неочищенное соединение 2 в виде твердого остатка, который использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Соединение 3. Неочищенное соединение 2 (<38,1 ммоль) и CH₃CN (200 мл) добавляли в реактор и охлаждали до 0°C при перемешивании. Добавляли HCl (12 н., 90 мл) при 0°C в течение 1 мин и непрерывно перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 1 ч (проверка ВЭЖХ-МС показала отсутствие остаточного соединения 2). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли при перемешивании 10% NaOH (~500 мл). Затем добавляли при перемешивании насыщенный раствор NaHCO₃ (1 л). Водную фазу экстрагировали EtOAc (2x500 мл). Объединенную органическую фазу промывали H₂O (200 мл), насыщенным раствором NaCl (200 мл), высушивали над Na2SO4 и концентрировали, получая неочищенное соединение 3 (16,62 г) в виде светло-желтой пены, которую использовали для следующей стадии без очистки.

RTA 408. Неочищенный амин 3 (16,62 г, 35,9 ммоль), CH₃CF₂CO₂H (4,7388 г, 43,1 ммоль) и CH₂Cl₂ (360 мл) добавляли в реактор с перемешиванием при комнатной температуре. Затем добавляли дициклогексилкарбодиимид (DCC) (11,129 г, 53,9 ммоль) и 4-(диметиламино)пиридин (DMAP) (1,65 г, 13,64 ммоль) и непрерывно перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи (проверка ВЭЖХМС показала отсутствие остаточного соединения 3). Реакционную смесь фильтровали для удаления твердых побочных продуктов, фильтрат непосредственно загружали на колонку с силикагелем и дважды очищали колоночной хроматографией (силикагель, от 0 до 20% EtOAc в гексане), получая соединение RTA 408 (16,347 г, 73% от RTA 401 за 4 этапа) в виде белой пены:

^!Н-ЯМР (400 МГц, CD₃Cl) δ 8,04 (с, 1H), 6,00 (с, 1H), 5,94 (с, ш, 1H), 3,01 (д, 1Н, J=4,8 Гц), 2,75-2,82 (м, 1H), 1,92-2,18 (м, 4H), 1,69-1,85 (м, 7H), 1,53-1,64 (м, 1H), 1,60 (с, 3H), 1,50 (с, 3H), 1,42 (с, 3H), 1,111,38 (м, 3H), 1,27 (с, 3H), 1,18 (с, 3H), 1,06 (с, 3H), 1,04 (с, 3H), 0,92 (с, 3H); m/z 555 (М+1).

B. Фармакодинамика

Сводная информация по исследованиям in vitro и in vivo с целью оценки основных фармакодинамических эффектов RTA 408 приводится ниже.

1. Влияние RTA 408 на Keap1-Nrf2 и NF-кВ in vitro

Ингибирование IFNy-индуцированной продукции NO AIM является №й-зависимым (Dinkova Kostova, 2005). Макрофаги мыши RAW264.7 высевали в 96-луночные планшеты из расчета 30000 клеток/лунку в трех повторностях на среду RPMI 1640 с добавкой 0,5% FBS и инкубировали при 37°C с 5% CO₂. На следующий день клетки предварительно обрабатывали ДМСО (носителем) или RTA 408 в течение 2 ч с последующей обработкой 20 нг/мл IFNy мыши в течение 24 ч. Уровень нитритов (NO₂ ^-) в среде измеряли в качестве суррогата оксида азота с помощью реактива Грисса (№ по каталогу G2930, Promega) в соответствии с инструкциями изготовителя, так как нитрит является первичным стабильным продуктом распада NO. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью реагента для пролиферации клеток WST-1 (№ по каталогу 11644807001, Roche Applied Science) в соответствии с инструкциями изготовителя. Значения IC₅₀ определяли на основе подавления IFNy-индуцированной продукции NO, нормированного на жизнеспособность клеток. Обработка RTA 408 приводила к зависимому от дозы подавлению и№/-индуцированной продукции NO при среднем значении IC₅₀ 3,8±1,2 нМ. Результаты типичного эксперимента показаны на фиг. 1. Установлено, что значение IC50 для RTA 408 было на 45-65% ниже, чем значения IC₅₀ для соединений 63170 (8±3 нМ), 63171 (6,9±0,6 нМ), 63179 (11±2 нМ) и 63189 (7±2 нМ). 63170, 63171, 63179 и 63189 являются соединениями формул:

- 34 030468

RTA 408 тестировали в двух разных анализах на основе люциферазных репортеров для оценки активации ARE. Первый протестированный люциферазный репортер находился под контролем единственного ARE, происходящего от промотора гена NQO1 человека, что обеспечивало количественную оценку эндогенной активности фактора транскрипции Nrf2 в культивируемых клетках млекопитающих. Экспрессию люциферазы светляка (Firefly) с люциферазной репортерной плазмиды NQO1-ARE контролировали по связыванию Nrf2 со специфической энхансерной последовательностью, соответствующей элементу антиоксидантного ответа (ARE), выявленному в промоторной области гена NADPH: хиноноксидоредуктазы 1 человека (NQO1) (Xie et al., 1995). Люциферазную репортерную плазмиду NQO1-ARE конструировали путем инсерции последовательности человека NQO1-ARE (5'CAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCTG-3') в вектор pLuc-MCS с помощью сайтов клонирования HindIII/XhoI (GenScript Corp., Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США). Клетки линии гепатомы человека HuH-7, поддерживаемые в среде DMEM (Invitrogen) с 10% FBS и по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина, временно трансфицировали с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen) люциферазной репортерной плазмидой NQO1-ARE и плазмидой pRL-TK, конститутивно экспрессирующей люциферазу Renilla и используемой в качестве внутреннего контроля для нормировки уровня трансфекции. Через 30 ч после трансфекции клетки обрабатывали RTA 408 в течение 18 ч. Активность люцифераз светляка и Renilla анализировали с помощью анализа люциферазы Dual-Glo Luciferase Assay (№ по каталогу Е2920, Promega), сигнал люминесценции измеряли на люминометре L-Max II (Molecular Devices). Активность люциферазы светляка нормировали по активности Renilla и рассчитывали кратность индукции нормированной активности Firefly по сравнению с контролем-носителем (ДМСО). На фиг. 2a показана индукция активности люциферазы в зависимости от дозы RTA 408 в указанной линии клеток. Значения представляют собой среднее по трем независимым экспериментам. Для двукратного усиления транскрипции с NQO1 ARE в клетках HuH-7 требовалось на 20% меньше RTA 408 (12 нМ), чем 63189 (14,9 нМ). Аналогичным образом, для двукратного усиления транскрипции с NQO1 ARE в клетках HuH-7 требовалось в 2,1-2,4 раза меньше RTA 408, чем 63170 (25,2 нМ) и 63179 (29,1 нМ) соответственно.

Влияние RTA 408 на активацию люциферазных репортеров также оценивали в репортерной линии клеток AREc32. Эта линия клеток происходит от клеток карциномы молочной железы человека MCF-7 и стабильно трансфицирована репортерным геном люциферазы светляка под транскрипционным контролем восьми копий последовательности GSTA2 ARE крысы (Wang, et al., 2006, включенный в настоящий документ посредством ссылки). После обработки RTA 408 в течение 18 ч активность люциферазы светляка измеряли с помощью системы анализа люциферазы ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega, № по каталогу Е6110) согласно инструкциям производителя. В линии репортерных клеток AREc32 наблюдали дозозависимый ответ (фиг. 2b). После обработки 15,6 нМ RTA 408 систем репортерного анализа NQO1-ARE и GSTA2-ARE наблюдали 2-кратную индукцию активности люциферазы. При взгляде на результаты исследования люциферазной активности GSTA2-ARE (AREc32), влияние 63415 (RTA 408) на индукцию GSTA2-ARE можно непосредственно сравнить с RTA 402, 63170, 63171, 63179 и 63189 с ис- 35 030468

следованием жизнеспособности WST1 (фиг. 3a-f). По сравнению со значениями RTA 402, соединение 63415 продемонстрировало самую быструю индукцию GSTA2-ARE-опосредованной транскрипции пяти сравниваемых соединений, причем для 4-кратной индукции в люциферазном репортерном анализе требовалась концентрация 93 нМ. Все другие соединения продемонстрировали аналогичную степень индукции, но при гораздо более высокой концентрации - для достижения 4-кратной индукции люциферазной активности с помощью 63170 требовалась концентрация 171 нМ, с помощью 63171-133 нМ, с помощью 63179-303 нМ, а с помощью 63189-174 нМ. Эти значения соответствуют 1,86 - (63415), 3,40 (63170), 2,65 - (63171), 6,05 - (63179) и 3,47 - (63189) кратному увеличению количества активного соединения, необходимого для достижения указанной активности, по сравнению с RTA 402.

Кроме того, продемонстрировано, что RTA 408 повышало уровень транскрипта известных геновмишеней Nrf2 в линиях эмбриональных фибробластов легких человека HFL1 и клеток эпителия бронхов человека BEAS-2B. Клетки HFL1 культивировали в среде F-12K с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки BEAS-2B культивировали в среде DMEM/F-12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки высевали на 6-луночные чашки при плотности 2,5х10⁵ клеток/лунку. На следующий день клетки обрабатывали ДМСО (носителем) или RTA 408 (7,8, 15,6, 31,3, 62,5 или 125 нМ) в течение 18 ч. В каждую лунку вносили одинаковое количество носителя. После обработки среду удаляли, а клетки собирали с помощью буфера RLT (Qiagen). Лизаты гомогенизировали с помощью колонок QIAShredder (Qiagen, № по каталогу 79654) и выделяли РНК с помощью наборов RNeasy Mini kits (Qiagen, № по каталогу 74104). Для обратной транскрипции РНК (1 мкг) объединяли с праймером Oligo(dT)12-18 и H2O при конечном объеме 23,25 мкл. Смесь нагревали до 70°C в течение 10 мин и затем помещали на лед. Мастер-микс, содержащий 8 мкл 5 X буфера для 1-й цепи (1^st strand buffer), 2 мкл 1 мг/мл БСА, 2 мкл 20 мМ ДТТ, 4 мкл смеси 5 мМ dNTP, 0,25 мкл RNaseOUT™ и 0,5 мкл обратной транскриптазы Superscript® II, добавляли к смеси РНК и инкубировали при 42°C в течение 1 ч. Реакционную смесь инактивировали нагреванием до 70°C на 10 мин. Реакционную смесь разбавляли H2O в соотношении 1:3 до использования в количественной ПЦР. 2,5 мкл разбавленной реакционной смеси для обратной транскрипции объединяли с одним набором ПЦР-праймеров (конечная концентрация 0,36 мкМ), флуорофором 2Х iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, № по каталогу 170-8885) и H2O при конечном объеме 20 мкл. Последовательности ПЦРпраймеров представляли собой: глутамат-цистеинлигаза, модификаторная субъединица (GCLM), прямой праймер 5'-GCTGTGGCTACTGCGGTATT-3' (SEQ ID NO: 1), обратный праймер 5'ATCTGCCTCAATGACACCAT-3' (SEQ ID NO: 2); гемоксигеназа-1 (НМОХ1) прямой праймер 5'TCCGATGGGTCCTTACACTC-3' (SEQ ID NO: 3), обратный праймер 5'-TAGGCTCCTTCCTCCTTTCC-3' (SEQ ID NO: 4); хинон-NAD(P)H-дегидрогеназа 1 (NQO1) прямой праймер 5'AAAACACTGCCCTCTTGTGG-3' (SEQ ID NO: 5), обратный праймер 5'-GTGCCAGTCAGCATCTGGTA3' (SEQ ID NO: 6); рибосомный белок S9 (RPS9) прямой праймер 5'GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3' (SEQ ID NO: 7), обратный праймер 5'GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3' (SEQ ID NO: 8); тиоредоксинредуктаза 1 (TXNRD1) прямой праймер 5'-ATTGCCACTGGTGAAAGACC-3' (SEQ ID NO: 9), обратный праймер 5'ACCAATTTTGTTGGCCATGT-3' (SEQ ID NO: 10). Все праймеры ранее проверяли на специфичность и эффективность амплификации. кДНК амплифицировали при следующих циклических условиях: (95°C в течение 3 мин, 44 цикла по 95°C в течение 30 с, 60°C в течение 15 с, 72°C в течение 15 с, с последующей кривой плавления от 55 до 95°C с шагом 0,5°C). Относительную распространенность каждого генамишени Nrf2 определяли с помощью сравнительного ^-способа (ΔΔΟτ). ПЦР проводили в трех повторностях для каждого образца. В вышеописанных условиях провели два независимых эксперимента. Обработка фибробластов легких HFL1 RTA 408 в течение 18 ч привела к увеличению экспрессии некоторых генов-мишеней Nrf2, в том числе NQO1, НМОХ1, GCLM и TXNRD1, согласно измерению с помощью количественной ПЦР (фиг. 4a-d). Для всех протестированных генов индукция RTA 408 зависела от дозы и выявлялась уже при концентрации 15,6 нМ. Обработка клеток эпителия бронхов BEAS-2B RTA 408 в течение 18 ч привела к аналогичному увеличению всех оцениваемых генов-мишеней Nrf2 в зависимости от дозы (фиг. 5a-d). RTA 408 также повышало экспрессию генов-мишеней Nrf2 в здоровых мезангиальных клетках человека (nHMC), линии клеток микроглии BV2 мыши и линии клеток нейробластомы человека SH-SY5Y в аналогичных концентрациях.

Уровни белка мишеней Nrf2 NQO1 и НМОХ1 измеряли в клетках SH-5Y5Y и BV-2 с помощью вестерн-блоттинга после обработки RTA 408. Клетки SH-SY5Y высевали на 6-луночные планшеты при плотности 4х10⁵ клеток/лунку. Клетки BV-2 высевали на 6-луночные планшеты при плотности 2,5х10⁴

- 36 030468

клеток/лунку. Через 24 (BV-2) или 48 (SH-SY5Y) ч после посева клетки обрабатывали RTA 408 в течение 24 ч. После обработки клетки дважды промывали холодным PBS и собирали в лизирующий буфер. Клетки обрабатывали ультразвуком, фрагменты удаляли центрифугированием (10 мин при 18000 rcf, Beckman Coulter, центрифуга microfuge 18). Общий белок в надосадочной жидкости количественно оценивали с помощью белкового реагента Bio-Rad с использованием БСА в качестве стандарта. Равные количества общего клеточного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГ, белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны блокировали в течение 1 ч в TBST (1xTBS с 0,1% Tween-20), содержащем 5% молоко, 3 раза промывали TBST и инкубировали с первичным антителом в течение ночи при 4°C. Антитело NQO1 приобрели в Abcam (#АВ2346); антитело HMOX1 (HO-1) - в Santa Cruz (#sc-10789); антитело против актина - в Millipore (#MAB 1501). После промывки TBST в TBST+5% молоко добавляли вторичные антитела на 1 ч при комнатной температуре. Вторичные антитела козы AffiniPure против IgG кролика или мыши приобрели в Jackson ImmunoResearch (№ по каталогу 111-035-144 и 115-035-146, соответственно). Мембраны промывали в TBST, проявляли ECL и экспонировали на рентгеновскую пленку. Обработка RTA 408 также повышала уровень белка NQO1 в клетках SH-SY5Y в зависимости от дозы (фиг. 6a). Белок HMOX1 не обнаруживался в необработанных или обработанных RTA 408 клетках SH-SY5Y. В клетках BV2 обработка RTA 408 повышала уровень белка NQO1 и HMOX1 в концентрациях до 125 нМ (фиг. 6b). Значение ЕС₅₀ для индукции экспрессии белков Nrf2 в клетках SK-N-SH с помощью RTA 408 (56,4 нМ) было на 45-65% ниже, чем значения ЕС₅₀ для 63171 (122 нМ), 63189 (102 нМ) и 63179 (126 нМ). Аналогичное количество требовалось для 63170 (54,6 нМ).

ЕС50 измеряли с помощью внутриклеточного вестерн-блоттинга NQO1, при котором клетки инкубировали с оцениваемым соединением в течение трех суток. После инкубирования с исследуемым соединением клетки подвергали реакции с антителом мыши против NQO1, а на следующий день - с антителом IRDye-800CW против IgG мыши. Сигналы мишеней визуализировали и анализировали.

В соответствии с индукцией генов-мишеней Nrf2 и соответствующих белковых продуктов, обработка макрофагов мыши RAW264.7 в течение 24 ч повышала ферментативную активность NQO1 в зависимости от дозы, причем повышение проявлялось при концентрации 7,8 нМ (фиг. 7). Ферментативную активность NQO1 измеряли с помощью модифицированного анализа по Prochaska (Prochaska and Santamaria, Anal Biochem. 169:328-336, 1988, включенного в настоящий документ посредством ссылки).

Указанные данные, полученные на нескольких линиях клеток, совместно показывают, что обработка RTA 408 повышала транскрипционную активность, контролируемую элементами антиоксидантного ответа, повышала экспрессию генов-мишеней Nrf2 и увеличивала активность NQO1, продукта генамишени Nrf2.

3. Влияние RTA 408 на маркеры восстановительного потенциала клеток

Глутатион и NADPH являются критическими факторами, необходимыми для поддержания клеточного восстановительного потенциала. Продемонстрировано, что несколько генов, участвующих в синтезе глутатиона (например, GCLC и GLCM) и NADPH [например, гексозо-6-фосфатдегидрогеназа (H6PD) и яблочный фермент 1 (ME1)], регулируются Nrf2 (Wu, 2011). Влияние RTA 408 на общий уровень глутатиона оценивали в линии гепатоцитов мыши AML-12 с помощью комплекта для анализа глутатиона GSH-Glo™ Glutathione Assay kit (Promega, № по каталогу V6912) согласно инструкциям производителя. Обработка клеток AML-12 в течение 24 ч RTA 408 повышала общий уровень глутатиона в зависимости от дозы (фиг. 8). Показанные данные получены в ходе двух независимых экспериментов. 2-кратное повышение общего глутатиона наблюдали уже при концентрациях RTA 408 15,6 нМ. Значение EC₅₀, полученное на модели мыши RAW264.7 для индукции уровня глутатиона RTA 408 (9,9 нМ), было на 22-57% ниже, чем значения EC₅₀ для 63170 (12,1 нМ), 63171 (23,2 нМ) и 63189 (16 нМ).

Влияние RTA 408 на уровни NADPH, измеренное путем поглощения редокс-чувствительного красителя WST-1 (Roche Applied Science, № по каталогу 11644807001), оценивали в клетках HCT-116. Поглощение WST-1 обычно используют для оценки жизнеспособности клеток путем измерения гликолитической продукции NAD(P)H жизнеспособными клетками. Таким образом, в ситуациях, где продукция NADPH увеличивается при отсутствии влияния на жизнеспособность клеток, поглощение WST-1 также увеличивается (Berridge et al., 1996, включенная в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, показано, что несколько ключевых генов, участвующих в продукции NADPH, регулируются Nrf2 (Thimmulappa et al., 2002; Wu, et al., 2011, включенные в настоящий документ посредством ссылки). Обработка RTA 408 в течение 24 ч повышала поглощение WST-1 в зависимости от дозы (фиг. 9), что указывало на повышение уровня NADPH.

В данном исследовании также оценивали влияние RTA 408 на экспрессию генов, участвующих в пути синтеза NADPH. Клетки HCT-116 обрабатывали RTA 408 в течение 24 ч и измеряли уровни мРНК H6PD, фосфоглюконатдегидрогеназы (ПГД), транскетолазы (ТКТ) и ME1 с помощью количественной ПЦР. Клетки HCT-116 высевали на 6-луночные чашки при плотности 3x10⁵ клеток/лунку. На следующий день клетки обрабатывали ДМСО (носителем), 10 нМ RTA 408 или 50 нМ RTA 408 в течение 24 ч. В каждую лунку вносили одинаковое количество носителя. После обработки среду удаляли, а клетки собирали с помощью буфера RLT (Qiagen). Лизаты гомогенизировали с помощью колонок QIAShredder (Qiagen,

- 37 030468

№ по каталогу 79654) и выделяли РНК с помощью наборов RNeasy Mini kits (Qiagen, № по каталогу 74104). Для обратной транскрипции РНК (1 мкг) объединяли с праймером Oligo(dT)i_2-18 и H₂O при конечном объеме 23,25 мкл. Смесь нагревали до 70°C в течение 10 мин и затем помещали на лед. Мастермикс, содержащий 8 мкл 5Х буфера для 1-й цепи (1st strand buffer), 2 мкл 1 мг/мл БСА, 2 мкл 20 мМ ДТТ, 4 мкл смеси 5 мМ dNTP, 0,25 мкл RNaseOUT™ и 0,5 мкл обратной транскриптазы Superscript® II, добавляли к смеси РНК и инкубировали при 42°C в течение 1 ч. Реакционную смесь инактивировали нагреванием до 70°C на 10 мин. Реакционную смесь разбавляли H2O в соотношении 1:3 до использования в количественной ПЦР. 2,5 мкл разбавленной реакционной смеси для обратной транскрипции объединяли с одним набором ПЦР-праймеров (конечная концентрация 0,36 мкМ), флуорофором 2Х iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, № по каталогу 170-8885) и H₂O при конечном объеме 20 мкл. Последовательности ПЦР-праймеров представляли собой: рибосомный белок S9 (RPS9) прямой праймер 5'GATGAGAAGGACCCCACGGCGTCTG-3' (SEQ ID NO: 7), обратный праймер 5'GAGACAATCCAGCAGCCCAGGAGGG-3' (SEQ ID NO: 8); гексозо-6-фосфатдегидрогеназа (H6PD) прямой праймер 5'-GAGGCCGTGTACACCAAGAT-3' (SEQ ID NO: 11), обратный праймер 5'AGCAGTGGGGTGAAAATACG-3' (SEQ ID NO: 12);

Фосфоглюконатдегидрогеназа (PGD) прямой праймер 5'-AAGGCACTCTACGCTTCCAA-3' (SEQ ID NO: 13), обратный праймер 5'-AGGAGTCCTGGCAGTTTTCA-3' (SEQ ID NO: 14); Транскетолаза (ТКТ) прямой праймер 5'-CATCTCCGAGAGCAACATCA-3' (SEQ ID NO: 15), обратный праймер 5'TTGTATTGGCGGCTAGTTCC-3' (SEQ ID NO: 16); яблочный фермент 1 (ME1) прямой праймер 5'TATATCCTGGCCAAGGCAAC-3' (SEQ ID NO: 17), обратный праймер 5'GGATAAAGCCGACCCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 18). Все праймеры ранее проверяли на специфичность и эффективность амплификации. кДНК амплифицировали при следующих циклических условиях: (95°C в течение 3 мин, 44 цикла по 95°C в течение 30 с, 60°C в течение 15 с, 72°C в течение 15 с, с последующей кривой плавления от 55 до 95°C с шагом 0,5°C). Относительную распространенность каждого генамишени определяли с помощью сравнительного CT-способа (AACT). ПЦР проводили в трех повторностях для каждого образца. В вышеописанных условиях провели два независимых эксперимента. Обработка RTA 408 приводила к повышению экспрессии генов, участвующих в синтезе NADPH, в зависимости от дозы (фиг. 10a-d).

Таким образом, обработка RTA 408 повышала уровень общего глутатиона в гепатоцитах AML-12 и поглощение WST-1 - маркера продукции NADPH - в клетках HCT-116. Указанное наблюдение коррелировало с повышением экспрессии нескольких ключевых ферментов, участвующих в синтезе NADPH.

4. Влияние RTA 408 на сигнальный путь NF-кВ, индуцированный ФНОа

NF-kB - это фактор транскрипции, играющий центральную роль в регуляции многих иммунных и воспалительных реакций. Показано, что RTA 402 и другие AIM ингибируют провоспалительный сигнальный путь NF-kB в различных линиях клеток (Shishodia, 2006; Ahmad, 2006; Yore, 2006). Влияние RTA 408 и соединений 63171, 63179, 63170 и 63189 на репортер NF-kB-Luc исследовали на линии клеток мыши NIH3T3/NF-kB-1uc (Panomics). Линия клеток NIH3T3/NF-kB-1uc поддерживает хромосомную интеграцию репортерного конструкта на основе люциферазы светляка, регулируемую восемью копиями элемента ответа NF-kB. Влияние указанных соединений можно количественно определить путем измерения значения IC₅₀. NF-kB. RTA 408 демонстрировало IC₅₀, равную 1,2 мкМ, что при нормировке по жизнеспособности составляло IC₅₀ 1,4 мкМ. Четыре других соединения продемонстрировали значения IC₅₀ NIH3T3/NF-kB 1,7, 0,2, 1,1 и 1,1 мкМ, которые при нормировке по жизнеспособности составляли значения IC₅₀ 1,8, 0,6, 1,1 и 1,0 мкМ соответственно. RTA 408 и его влияние на NF-kB наносили на график в зависимости от дозировки; относительная кратность изменения, а также WST1 и WST1/2 показаны на фиг. 11a и b. Влияние RTA 408 на ФНОа-индуцируемый сигнальный путь NF-kB сигнализации оценивали в клетках HeLa/NF-KB-Luc, линии клеток аденокарциномы шейки матки человека, стабильно трансфицированных люциферазным репортерным конструктом под контролем нескольких элементов транскрипционного ответа NF-kB. Клетки HeLa/NF-KB-Luc предварительно обрабатывали в течение 1 ч RTA 408, а затем ФНО-а (10 нг/мл) в течение еще 5 ч. После обработки измеряли люминесценцию и определяли влияние предварительной обработки RTA 408 на ФНО-а-индуцированную люциферазную активность. Средние результаты и стандартные отклонения по трем независимым экспериментам показаны на фиг. 12. RTA 408 ингибировало ФНО-а-индуцированную активацию NF-кВ в зависимости от дозы со значением IC₅₀ 517±83 нМ. Аналогичные результаты наблюдались в другой NF-кВ-репортерной линии клеток (A549/NF-kB-Luc), где RTA 408 ингибировало ФНО-а-индуцированную активацию NF-кВ со значением IC₅₀ 627 нМ (в диапазоне 614-649 нМ). RTA 408 в 1,6-1,8 раза эффективнее ингибировало экспрессию репортера на основе промотора NF-кВ в клетках HeLa/NF-KB-Luc, чем 63189 (854 нМ) и 63170 (953 нМ) соответственно. Дальнейшие эксперименты с линией клеток человека А549 продемонстрировали IC50 для RTA 408, равное 1,7 мкМ, которое после нормировки по жизнеспособности составило 1,7 мкМ. IC₅₀ RTA 408 продемонстрировало аналогичную активность с 63189, 63179, 63171 и 63170, для которых были показаны значения IC50 1,1, 1,4, 2,0 и 1,0 соответственно. При нормировке этих значений по

- 38 030468

жизнеспособности анализ продемонстрировал значения IC50 1,2, 1,5, 2,1 и 1,1 мкМ соответственно. Кратное изменение NF-кВ в зависимости от концентрации RTA 408 вместе с кривыми WST1 и WST1/2 нанесли на график; оно показано на фиг. 13a и b.

Влияние RTA 408 на ФНО-а-индуцированное фосфорилирование IxBa, ключевой этап активации пути NF-кВ, также оценивали в клетках HeLa. Клетки HeLa предварительно обрабатывали RTA 408 в течение 6 ч, а затем ФНО-а (20 нг/мл) в течение 5 мин. Уровни общего и фосфорилированного IixBa оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Первичные антитела против IxBa приобрели в Santa-Cruz (sc371), антитела против pIxBa приобрели в Cell Signaling (9246), антитела против актина приобрели в Millipore (MAB 1501). Конъюгированные с пероксидазой и прошедшие аффинную очистку вторичные антитела козы против IgG кролика и конъюгированные с пероксидазой прошедшие аффинную очистку вторичные антитела козы против IgG мыши приобрели в Jackson ImmunoResearch. Белковые пятна проявляли с помощью ECL и экспонировали на рентгеновскую пленку. В соответствии с результатами люциферазного репортерного анализа, RTA 408 ингибировало ФНО-а-индуцированное фосфорилирование IxBa в зависимости от дозы (фиг. 14).

Кроме того, продемонстрировали, что RTA 408 ингибировало другие провоспалительные сигнальные пути, например, IL-6-индуцированное фосфорилирование передатчика сигнала и активатора транскрипции 3 (STAT3) и остеокластогенез, индуцированный рецептором активатора лиганда NF-кВ лиганда (RANKL). В клетках HeLa предварительная обработка 1 мкМ RTA 408 в течение 6 ч ингибировала фосфорилирование STAT3, индуцированное IL-6. Моноклональные антитела против STAT3 (124H6) и фосфо-STAT3 (Tyr705) приобрели в Cell Signaling Technology. Конъюгированные с пероксидазой и прошедшие аффинную очистку антитела козы против IgG кролика и конъюгированные с пероксидазой прошедшие аффинную очистку антитела козы против IgG мыши приобрели в Jackson ImmunoResearch. Остеокластогенез является многоэтапным процессом дифференцировки, который запускается при связывании RANKL с его рецептором RANK на клетках кроветворного происхождения. Это приводит к активации NF-кВ и МАРК, которые, в свою очередь, усиливают транскрипцию остеокласт-специфических геновмишеней, включая тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (TRAP). Влияние RTA 408 на RANKLиндуцированный остеокластогенез оценивали в линии макрофагов мыши RAW264.7. Клетки RAW264.7 высевали на 24-луночные планшеты при плотности 5000 клеток/лунку. На следующий день клетки обрабатывали RTA 408 в течение 2 ч, а затем - 50 нг/мл рекомбинантного RANKL мыши (R&D systems). Обработанные клетки инкубировали в течение четырех дней для дифференцировки в остеокласты. Дифференцировку в остеокласты оценивали путем измерения активности TRAP. Вкратце, 90 мкл кондиционированной клеточной культурой среды удаляли из каждой тестируемой лунки и распределяли в трех повторностях в лунки (30 мкл/лунку) 96-луночного планшета. Затем в каждую лунку вносили 170 мкл буфера для анализа TRAP (Kamiya Biomedical) и инкубировали планшет при 37°C в течение 3 ч. После инкубирования определяли поглощение при 540 нм с помощью спектрофотометра для считывания планшетов Spectramax М2. RTA 408 ингибировало RANKL-индуцированную активность TRAP и формирование остеокластов в зависимости от дозы с IC₅₀ ~5-10 нМ.

5. Влияние RTA 408 на экспрессию генов, кодирующих трансаминазные ферменты

Повышение уровня трансаминаз наблюдали в 28-дневных исследованиях токсичности RTA 408 у крыс и, в гораздо меньшей степени, у обезьян. Аналогичные результаты наблюдали после перорального введения родственного AIM (бардоксолон-метила) в организме человека (Pergola, 2011). Одна из гипотез для объяснения этого эффекта состоит в том, что AIM прямо или косвенно повышают экспрессию генов трансаминаз в отсутствие клеточной токсичности. Для оценки возможного влияния обработки RTA 408 на уровни мРНК трансаминаз гепатоциты мыши AML-12 обрабатывали RTA 408 в течение 18 ч и измеряли уровни мРНК генов, кодирующих трансаминазы, с помощью количественной ПЦР. Клетки AML-12 высевали на 6-луночные чашки для культивирования из расчета 3х10⁵ клеток на лунку, используя 2 мл среды на лунку. На следующий день клетки обрабатывали ДМСО (носителем) или 250 нМ и 500 нМ RTA 408 в течение 18 ч при 37°C. В каждую лунку вносили 0,1% ДМСО. Были проведены три независимых повторных эксперимента. После обработки среду удаляли, а клетки собирали с помощью буфера RLT (Qiagen). Лизаты гомогенизировали с помощью колонок QIAShredder (Qiagen, № по каталогу 79654) и выделяли РНК с помощью наборов RNeasy Mini kits (Qiagen, № по каталогу 74104). Для обратной транскрипции РНК (1 мкг) объединяли с праймером Oligo(dT)12-18 и H₂O при конечном объеме 23,25 мкл. Смесь нагревали до 70°C в течение 10 мин и затем помещали на лед. Мастер-микс, содержащий 8 мкл 5Х буфера для 1-й цепи (1st strand buffer), 2 мкл 1 мг/мл БСА, 2 мкл 20 мМ ДТТ, 4 мкл смеси 5 мМ dNTP, 0,25 мкл RNaseOUT™ и 0,5 мкл обратной транскриптазы Superscript® II, добавляли к смеси РНК и инкубировали при 42°C в течение 1 ч. Реакционную смесь инактивировали нагреванием до 70°C на 10 мин. Реакционную смесь разбавляли H2O в соотношении 1:3 до использования в количественной ПЦР. 2,5 мкл разбавленной реакционной смеси для обратной транскрипции объединяли с одним набором ПЦРпраймеров (конечная концентрация 0,36 мкМ), флуорофором 2Х iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, № по каталогу 170-8885) и H2O при конечном объеме 20 мкл. Последовательности ПЦР-праймеров представляли собой: рибосомный белок L19 (Rp119) прямой праймер 5'-TCAGGCTACAGAAGAGGCTTGC-3'

- 39 030468

(SEQ ID NO: 19), обратный праймер 5'-ACAGTCACAGGCTTGCGGATG-3' (SEQ ID NO: 20); хинонNAD(P)H-дегидрогеназа 1 (Nqo1) прямой праймер 5'-TCGGGCTAGTCCCAGTTAGA-3' (SEQ ID NO: 21), обратный праймер 5'-AAAGAGCTGGAGAGCCAACC-3' (SEQ ID NO: 22); глутамат-пируваттрансаминаза 1 (Gpt1 или Alt1) прямой праймер 5'-CACGGAGCAGGTCTTCAACG-3' (SEQ ID NO: 23), обратный праймер 5'-AGAATGGTCATCCGGAAATG-3' (SEQ ID NO: 24); глутамат-пируваттрансаминаза 2 (Gpt2 или Alt2) прямой праймер 5'-CGCGGTGCAGGTCAACTACT-3' (SEQ ID NO: 25), обратный праймер 5'-CCTCATCAGCCAGGAGAAAA-3' (SEQ ID NO: 26); глутамат-оксалоацетаттрансаминаза 1 (Got1 или Ast1) прямой праймер 5'-GGCTATTCGCTATTTTGTGT-3' (SEQ ID NO: 27), обратный праймер 5'-GACCAGGTGATTCGTACAAT-3' (SEQ ID NO: 28); глутамат-оксалоацетаттрансаминаза 2 (Got2 или Ast2) прямой праймер 5'-AGAGTCCTCTTCAGTCATTG-3' (SEQ ID NO: 29), обратный праймер 5'-ATGATTAGAGCAGATGGTGG-3' (SEQ ID NO: 30). Все праймеры ранее проверяли на специфичность и эффективность амплификации. кДНК амплифицировали при следующих циклических условиях: (95°C в течение 3 мин, 44 цикла по 95°C в течение 30 с, 60°C в течение 15 с, 72°C в течение 15 с, с последующей кривой плавления от 55 до 95°C с шагом 0,5°C). Относительную распространенность каждого гена-мишени определяли с помощью сравнительного CT-способа (AACT). ПЦР проводили в трех повторностях для каждого образца. Обработка RTA 408 повышала уровни мРНК аланинтрансаминазы 1 (Alt1 или Gpt1) и аспартаттрансаминазы 1 (Ast1 или Got1) (фиг. 15a, c). RTA 408 не влияло на уровни мРНК аланинтрансаминазы 2 (Alt2 или Gpt2) и снижало уровни мРНК аспартаттрансаминазы 2 (Ast2 или Got2) (фиг. 15b, d). Эти результаты показывают, что RTA 408 в протестированных концентрациях (250 или 500 нМ) влияло на экспрессию генов трансаминаз in vitro.

6. Влияние RTA 408 на уровни интермедиатов гликолиза

Исследования на мышах с диабетом показали, что бардоксолон-метил увеличивает стимулируемое инсулином поглощение глюкозы, специфическое для мышц (Sana, 2010). У людей более высокий процент пациентов, получающих бардоксолон-метил, сообщал о мышечных судорогах по сравнению с пациентами, получавших плацебо (Pergola, 2011). О мышечных спазмах также сообщали пациенты с сахарным диабетом после введения инсулина, что указывает на возможную связь с метаболизмом глюкозы в мышцах. Влияние RTA 408 на гликолитический метаболизм оценивали путем оценки уровня лактата и пирувата в культивируемых мышечных клетках грызунов C2C12. Для измерения уровня лактата дифференцированные мышечные трубочки C2C12 обрабатывали 1 мкМ или 2 мкМ RTA 408 или инсулина в течение 3 ч при 37°C. Буфер удаляли и сохраняли для измерения уровня внеклеточного лактата. Перед измерением лактата остатки клеток осаждали центрифугированием (10 мин при 14000 об/мин). Для измерения внутриклеточного лактата клетки суспендировали в 0,1% Triton X-100 в PBS и анализировали путем сдвига с помощью иглы 25 калибра. Клеточный лизат центрифугировали (10 мин при 14000 об/мин, 4°C), и в супернатанте измеряли лактат. Внутриклеточный и внеклеточный лактат измеряли с помощью набора для анализа лактата (BioVision, № по каталогу K607-100). Аналогично обработке инсулином, обработка дифференцированных мышечных трубочек C2C12 1 мкМ или 2 мкМ RTA 408 в течение 3 ч значительно увеличивала уровень внутриклеточного и внеклеточного лактата в зависимости от дозы.

Для измерения уровня пирувата дифференцированные мышечные трубочки C2C12 обрабатывали 250 или 500 нМ RTA 408 или 100 нМ инсулина в течение 18 ч. После обработки лекарственным препаратом среду удаляли и промывали клетки PBS. Клетки лизировали в буфере для анализа пирувата (набор для анализа пирувата, BioVision, № по каталогу K609-100). Клеточный лизат центрифугировали (10 мин при 14000 об/мин, 4°C) и в супернатанте измеряли уровень пирувата. Обработка дифференцированных мышечных трубочек C2C12 250 нМ или 500 нМ RTA 408 в течение 18 ч также значительно (P<0,0001, отмечено звездочками) повышала внутриклеточные уровни пирувата в зависимости от дозы (фиг. 16). Совместно указанные результаты показывают, что RTA 408 в протестированных концентрациях может повлиять на интермедиаты гликолиза в мышцах in vitro; однако неясно, как результаты, полученные в указанной системе in vitro при протестированных концентрациях RTA 408, связаны с потенциальным воздействием на метаболизм глюкозы при клинически значимых дозах в организме человека.

7. Оценка оттока RTA 408 по MRP-1 in vitro

Одной из характеристик лекарства-кандидата является коэффициент оттока соединения. Отток соединения измеряет, насколько легко соединение транспортируется через мембрану. Белок MRP-1, или белок множественной лекарственной устойчивости 1, является одним из семейства белков, которые помогают облегчить транспорт органических анионов и других низкомолекулярных соединений через клеточные мембраны. Более высокий коэффициент оттока обычно означает, что лекарство-кандидат легче транспортируется через мембрану наружу и менее доступно для регуляции внутриклеточных процессов. Аналогичные белки также регулируют транспорт соединений через гематоэнцефалический барьер. Экспериментально определенный коэффициент оттока MRP-1 для RTA 408 (1,3) был примерно в десять раз ниже, чем для 63170 (10) и 63171 (11,2) и более чем в 40 раз ниже, чем для 63179 (56,5) и 63189 (57,1). Безотносительно к теоретическим представлениям, RTA 408 может не являться хорошим субстратом для MRP-1 и/или кандидатом для оттока через гематоэнцефалический барьер, опосредованного пгликопротеином. В некоторых вариантах реализации RTA 408 может использоваться для лечения рас- 40 030468

стройств центральной нервной системы (ЦНС).

C. Защитные эффекты RTA 408 в животных моделях заболеваний легких

RTA 408 тестировали на нескольких животных моделях заболевания легких для оценки его потенциальной эффективности в легких. Для всех исследований RTA 408 ежедневно перорально вводили в кунжутном масле в дозах от 3 до 150 мг/кг. В большинстве случаев RTA 408 начинали вводить за несколько дней до индукции реакции повреждения легких.

1. ЛПС-индуцированное воспаление легких у мышей

RTA 408 тестировали в двух исследованиях ЛПС-индуцированного воспаления легких у мышей. В первом исследовании, предназначенном для поиска предварительного диапазона доз, RTA 408 (30, 100 или 150 мг/кг) перорально вводили ежедневно в течение трех дней, а через 1 ч после конечной дозы вводили ЛПС. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) собирали через 20 ч после введения ЛПС (через 21 ч после конечной дозы RTA 408) и оценивали уровни провоспалительных маркеров (например, IL6, IL-12p40, ФНО-α и RANTES) с использованием технологии Luminex™ Обработка RTA 408 привела к значительному снижению IL-12p40 при всех дозах и ФНО-α при дозах 100 и 150 мг/кг (фиг. 17). Во втором исследовании RTA 408 (10, 30 или 100 мг/кг) вводили ежедневно в течение шести дней, а через 1 ч после конечной дозы вводили ЛПС. В данном исследовании наблюдали значительное снижение массы тела при дозе 100 мг/кг, начиная с 3 суток. Значительное снижение ФНО-α наблюдали при дозе 10 мг/кг, а значительное снижение ИЛ 12p40, ФНО-α и RANTES наблюдали при дозе 30 мг/кг (фиг. 18a). Дальнейшая оценка легких мышей в данном исследовании выявила значимое участие соответствующих генов-мишеней Nrf2, включая значительную индукцию ферментативной активности NQO1 (путем измерения скорости снижения 2, 6-дихлорфенолиндофенола) и увеличение общего GSH (GSH-Glo™, Promega, Мэдисон, штат Висконсин, США) в дозе 10 и 30 мг/кг (фиг. 18b).

2. Блеомицин-индуцированный фиброз легких

Влияние RTA 408 также оценивали на моделях блеомицин-индуцированного фиброза легких у мышей и крыс. В первом предварительном исследовании RTA 408 (10, 30 или 100 мг/кг) ежедневно вводили мышам через желудочный зонд в течение 39 дней с провокационной пробой блеомицина (интраназально) на 10 день. В последний день приема собирали ткань легких и выполняли ее гистологический анализ для оценки степени воспаления и интерстициального фиброза. В этой модели при всех протестированных дозах RTA 408 не наблюдали статистически значимых эффектов (фиг. 19a и b). Дополнительную оценку выполняли с помощью модели легочного фиброза мыши, которая подробно описана в Лавлесском институте респираторных исследований. В данном исследовании крысам интратрахеально вводили провокационную пробу блеомицина или физиологического раствора в день 0. После провокационной пробы животные ежедневно получали RTA 408 (3, 10 или 30 мг/кг) в день через желудочный зонд в течение 28 дней. Введение дозы 30 мг/кг останавливали на 14 сутки в результате чрезмерного обезвоживания и диареи у животных. У остальных животных на 28 сутки собирали жидкость бронхоальвеолярного лаважа для оценки провоспалительных инфильтратов с помощью проточной цитометрии и анализировали уровень гидроксипролина в ткани легких с помощью ЖХ-МС и гистопатологического анализа. Провокационная проба с применением сульфата блеомицина вызывала значительное высвобождение нейтрофилов и повышение растворимого коллагена в BALF, а также повышение гидроксипролина в легких. Обработка RTA 408 в дозе 3 и 10 мг/кг значительно подавляла инфильтрацию полиморфноядерных (ПМН) клеток в легкие, а также приводила к значимому снижению (~10-20%) отложения гидроксипролина (фиг. 20a и b).

Важно отметить, что гистологическая оценка показала значительное уменьшение отложения коллагена согласно трихромному окрашиванию у крыс, получавших RTA 408. В то время как блеомицинконтрольные животные в основном демонстрировали умеренное окрашивание, у животных, получавших 10 мг/кг RTA 408, преимущественно было минимально или легкое окрашивание (табл. 2).

Таблица 2

Влияние RTA 408 на отложение коллагена в легких крыс согласно интенсивности трихромного окрашивания

Интенсивность	Блеомицин-	RTA 408	RTA 408
окрашивания3	контроль	(3 мг/кг)	(10 мг/кг)
Минимальная	0	0	3
Легкая	1	0	4
Умеренная	7	7	1

Значения представляют собой интенсивность окрашивания у животных с интерстициальным трихромным окрашиванием в областях блеомицин-индуцированных изменений легких.

Дальнейшая оценка легких крыс в этом исследовании также выявила значимое участие соответствующих генов-мишеней Nrf2, согласно анализу Quantigene Plex 2.0 Multiplex (Affymetrix, Санта-Клара, штат Калифорния, США) (фиг. 21). RTA 408 значительно и в зависимости от дозы повышало ферментативную активность NQO1, Txnrd, Gsr и Gst в легких крыс, подвергавшихся воздействию блеомицина, демонстрируя активацию Nrf2 посредством RTA 408 в условиях данного заболевания. Активность фер- 41 030468

мента NQO1 оценивали путем измерения скорости снижения ДХФИФ. Активность ферментов Txnrd, Gsr и Gst измеряли с помощью коммерчески доступных наборов от Cayman Chemical (Анн-Арбор, штат Мичиган, США).

3. ХОБЛ, вызванная дымом сигарет, у мышей

RTA 408 также тестировали на модели ХОБЛ, вызванной дымом сигарет, у мышей. Мыши ежедневно получали RTA 408 (3, 10 или 30 мг/кг) через желудочный зонд в течение двух недель и подвергались воздействию дыма сигарет пять дней в неделю в течение периода приема RTA 408. В конце исследования ткань легких и BALF собирали для анализа воспалительных инфильтратов и цитокинов. В данном эксперименте введение нескольких доз RTA 408 уже при дозах 3 мг/кг приводило к значительному подавлению провоспалительных цитокинов, в том числе КС (функциональной гомолог IL-8 человека у мыши) и ФНО-α, согласно измерению с помощью технологии LUMINEX™ Сводные результаты данного исследования представлены на фиг. 22a-e. Для сравнения в том же исследовании тестировали аналог

Дальнейшая оценка легких мышей в данном исследовании также выявила значимое участие соответствующих генов-мишеней Nrf2 (фиг. 23). Активность фермента NQO1 в легких, измеряемая как скорость снижения ДХФИФ, значительно снижалась под воздействием дыма сигарет; введение RTA 408 купировало это снижение. Активность фермента Txnrd также индуцировалась за счет дозы RTA 408 30 мг/кг. В целом активность фермента Gsr не изменялась, а активность фермента Gst снижалась с обработкой; оба указанные явления, вероятно, являлись следствием временного ответа на эти ферменты. Активность ферментов Txnrd, Gsr и Gst измеряли с помощью коммерчески доступных наборов от Cayman Chemical (Анн-Арбор, штат Мичиган, США).

4. Овальбумин-индуцированная астма у мышей

Потенциальную активность RTA 408 также оценивали в рамках экспериментального исследования в модели овальбумин-индуцированной астмы у мышей. Мышей сенсибилизировали путем в/б инъекции овальбумина и гидроксида алюминия в 0 и 14 сутки и интраназально вносили провокационную пробу овальбумина в физиологическом растворе на 14, 25, 26, и 27 сутки. Мыши ежедневно получали RTA 408 (3, 10 или 30 мг/кг) через желудочный зонд в 1-13 и 15-27 сутки. После сенсибилизации и провокационной пробы с применением овальбумина у мышей, обработанных носителем, было значительное увеличение общего количества лейкоцитов по сравнению с мышами, обработанными положительным контролем (дексаметазон). У мышей, обработанных носителем, также наблюдали увеличение количества T-клеток и B-клеток. Обработка RTA 408 в дозе 30 мг/кг значительно снижала число и процент B-клеток в дыхательных путях. RTA 408 (3 и 30 мг/кг) также значительно снижало количество, но не средний процент макрофагов, обнаруженных в дыхательных путях. Эти наблюдения указывают на потенциальную эффективность в данной модели.

5. Влияние RTA 408 на ЛПС-индуцированный сепсис у мышей

Сепсис индуцировали в день 0 путем в/б инъекции ЛПС (21 мг/кг), выживаемость продолжалась до 4 суток. RTA 408 (10, 30 или 100 мг/кг) ежедневно вводили с помощью желудочного зонда с -2 по 2 сутки. В контрольной группе, получавшей носитель, 60% животных выжили до 4 суток (выше ~40% выживаемости, ожидаемой в этой модели). В экспериментальных группах, получавших RTA 408, 80% животных в группе, получавшей дозу 10 мг/кг, и 90% животных в группе, получавшей дозу 30 мг/кг, дожили до 4 суток (фиг. 24c и d). В группе, получавшей дозу 100 мг/кг, 90% животных дожили до 4 суток при единственном смертельном случае, произошедшем в 4 сутки. Хотя эти эффекты, вызванные RTA 408, свидетельствуют о высокой эффективности в этой модели, относительно высокий коэффициент выживаемости в контрольной группе исключает статистически значимое различие между контрольной группой и группой, получавшей RTA 408. Кроме того, представлены результаты, полученные с помощью соединения RTA 405 (фиг. 24a и b). RTA 405 является соединением формулы

- 42 030468

6. Действие RTA 408 против мукозита слизистой оболочки полости рта, вызванного радиацией

Воздействие острой радиации, направляемой в щечный мешок хомяка, приводило к эффектам, аналогичным тем, которые наблюдались при язвенном мукозите слизистой оболочки человека. Эти эффекты включают умеренный или тяжелый мукозит, характеризующийся тяжелой эритемой и расширением кровеносных сосудов, эрозией поверхностной слизистой оболочки и образованием язв. Провели единственное исследование для оценки влияния RTA 408 в этой модели. В день 0 каждый хомяк получал дозу острой радиации 40 Гр, направленную в левый щечный мешок. RTA 408 (10, 30 или 100 мг/кг) вводили перорально два раза в день со дня -5 до дня -1, и со дня 1 до дня 15. Начиная с 6 суток и до 28 суток с шагом через сутки оценивали мукозит слизистой рта с помощью стандартной 6-балльной шкалы. RTA 408, как в дозе 30, так и 100 мг/кг, вызывало значительное снижение продолжительности язвенного мукозита (фиг. 25). Кроме того, также наблюдали уменьшение процентной доли животных с оценкой мукозита >3 в зависимости от дозы. Тем не менее, введение RTA 408 в дозе 30 или 100 мг/кг вызывало значительное снижение массы тела облученных хомяков в зависимости от дозы. В связи с потерей свыше 20% массы тела двух из восьми хомяки в группе, получавшей дозу 100 мг/кг, подвергли эвтаназии на 2 сутки.

7. Влияние RTA 408 на индукцию биомаркеров Nrf2 in vivo

Как описано выше, основной молекулярной мишенью RTA 408 является Nrf2, центральный регулятор транскрипции антиоксидантной защиты клетки. Активация Nrf2 вызывает положительную регуляцию батареи цитопротекторных генов, в том числе NQO1, ферментов, участвующих в синтезе GSH [т.е. каталитической и модификаторной субъединицы глутамат-цистеинлигазы (Gclc и Gclm)], ферментов, участвующих в детоксикации (т.е. глутатион-5-трансфераз [Gst]), и белков транспорта из клетки [т.е. белков множественной лекарственной устойчивости (Mrp)]. Индукция этих генов приводит к согласованным действиям клетки с целью защиты от окислительных факторов, выражающихся в повышенной антиокислительной емкости, индукции синтеза глутатиона и конъюгации и экспорта потенциально вредных молекул из клетки. В дополнение к конечным показателям эффективности и экспрессии геновмишеней Nrf2, оцениваемым в различных животных моделях, описанных выше, также оценивали способность RTA 408 индуцировать экспрессию генов-мишеней Nrf2 с помощью тканей, полученных от здоровых мышей, крыс и обезьян, обработанных RTA 408.

В рамках 14-дневных исследований не связанной с GLP токсичности RTA 408 у мышей, крыс и обезьян собирали ткани для целей измерения уровней мРНК и ферментативной активности выбранных генов-мишеней Nrf2. Для мышей и крыс образцы печени собирали через 4 ч после последней дозы в 14 сутки. Для обезьян кровь (для выделения МКПК), ткани печени, легких и головного мозга собирали через 24 ч после введения последней дозы в 14 сутки. Ферментативную активность NQO1, Gst и глутатионредуктазы (Gsr), как описано выше, измеряли в тканевых гомогенатах. Уровни мРНК определяли с помощью технологии Quantigene Plex 2.0 в соответствии с протоколом производителя, который включает гибридизационный анализ с использованием магнитных гранул XMap® Luminex® для прямого количественного определения мРНК мишеней. Кроме того, концентрации RTA 408 измеряли в плазме и тканях с помощью ЖХ/МС/МС на масс-спектрометре TQD (Waters, Милфорд, штат Массачусетс, США).

RTA 408, как правило, повышало экспрессию различных генов-мишеней Nrf2 в зависимости от дозы при дозах 10, 30 и 100 мг/кг (фиг. 26, фиг. 27a, фиг. 28a и b). Положительная регуляция транскрипции генов-мишеней Nrf2 за счет RTA 408 также приводила к функциональному усилению антиоксидантного ответа, о чем свидетельствовало увеличение ферментативной активности NQO1, Gst и Gsr в печени грызунов, а также печени и легких обезьян (фиг. 29a и b, фиг. 30a и b, фиг. 31a и b). Кроме того, у грызунов воздействие RTA 408 на печень коррелирует с уровнем активности фермента NQO1, прототипа генамишени Nrf2 (фиг. 32b, фиг. 33b). У обезьян уровень экспрессии мРНК NQO1 и сульфиредоксина 1 (SRXN1) в МКПК коррелировал с воздействием RTA 408 на плазму (фиг. 37a и b). В целом RTA 408 повышало уровень мРНК и активность мишеней Nrf2, и такое повышение обычно коррелировало с воздействием на ткани и плазму, что указывает на возможность использования мишеней Nrf2 в качестве биомаркеров активации Nrf2 (фиг. 34a и b) и их возможную пригодность для оценки фармакологической активности RTA 408 у здоровых людей.

D. Безопасная фармакология

Для RTA 408 выполнена GLP-совместимая программа безопасной фармакологии. Она включала исследования сердечно-сосудистой системы in vitro и in vivo (на обезьянах), а также исследования дыхательной системы и центральной нервной системы у крыс.

1. Оценка влияния RTA 408 на клонированные каналы hERG, экспрессированные в клетках HEK293

Данное исследование выполнено с целью оценки влияния RTA 408 на быстро активируемый калиевый ток выпрямления внутрь клетки (I_Kr), проводимый каналами hERG (ген человека, связанный с ethera-go-go), стабильно экспрессируемыми в линии клеток эмбриональной почки человека (HEK293). Влияние RTA 408 на hERG-опосредованный калиевый ток оценивали с помощью электрофизиологических способов локальной фиксации потенциала на целой клетке. Установлено, что при анализе hERG QPatch Kv11.1 значение IC₅₀ RTA 408 составляло 12,4 мкМ. Это значение было в 2,5-3 раза выше, чем значения

- 43 030468

для 63170 (4,9 мкМ) и 63189 (3,8 мкМ) соответственно. Значение IC₅₀ RTA 408 было аналогично значению для 63171 (15,7 мкМ).

2. Оценка влияния RTA 408 на сердечно-сосудистую систему у яванских макаков

Выполнено единственное исследование с целью оценки потенциального влияния RTA 408 на сердечно-сосудистую систему у бодрствующих свободно движущихся макаков. Одинаковым четырем самцам и четырем самкам яванских макаков вводили носитель (кунжутное масло) и RTA 408 в дозах 10, 30 и 100 мг/кг в соответствии с планом опыта по схеме латинского квадрата, причем одно животное/пол/вариант процедуры каждую неделю получали лечение с последующим 14-дневным периодом вымывания между приемами, пока каждое животное не получало все процедуры. Носитель и RTA 408 вводили всем животным через желудочный зонд в объеме дозы 5 мл/кг.

Животных оборудовали телеметрическими передатчиками для измерения температуры тела, давления крови, частоты сердечных сокращений и оценки электрокардиограммы (ЭКГ). Температуру тела, систолическое, диастолическое и среднее артериальное давление крови, частоту сердечных сокращений и параметры ЭКГ (продолжительность QRS и RR, интервалы PR и QT) непрерывно контролировали в течение от по меньшей мере 2 ч до введения дозы до по меньшей мере 24 ч после введения дозы. Записи ЭКГ печатали в установленных временных точках с данными сердечнососудистого мониторинга и качественно оценивали с участием ветеринара-кардиолога, сертифицированного советом. Перед первым введением в рамках исследования у необработанных животных непрерывно контролировали сердечнососудистые конечные показатели в течение по меньшей мере 24 ч, и эти данные использовали при вычислении скорректированного интервала QT на протяжении всего исследования.

Наблюдения за заболеваемостью, смертностью, травмами и доступностью пищи и воды проводили по меньшей мере два раза в день для всех животных. Клинические наблюдения проводили до введения дозы, приблизительно через 4 ч после введения дозы, и после завершения периода сердечно-сосудистого мониторинга. Массу тела измеряли и записывали в день перед каждым введением дозы.

RTA 408 в дозах 10, 30 и 100 мг/кг не приводило к смертности, неблагоприятным клиническим признакам или к значимым изменениям массы тела, температуры тела, давления крови или качественных или количественных (интервалы PR, RR, QRS, QT) параметров ЭКГ (фиг. 35; табл. 45). В группе, получавшей дозу 100 мг/кг, наблюдали небольшое (в среднем 1,6%), но статистически значимое увеличение скорректированного интервала QT; однако данные отдельных животных не показывали последовательного увеличения QTc, что указывало бы на эффект, связанный с тестируемым соединением. Следовательно, в связи с малой величиной изменения и отсутствием последовательной реакции у отдельных животных, эти незначительные увеличения QTc не считались связанными с обработкой RTA 408. Таким образом, пероральное введение RTA 408 не оказывало влияния на сердечнососудистую систему у яванских макаков при дозах вплоть до 100 мг/кг включительно.

3. Нейроповеденческая оценка RTA 408 у крыс

Потенциальную острую нейроповеденческую токсичность RTA 408 оценивали на крысах. Три экспериментальные группы из 10 самцов и 10 самок CD® [Crl:CD®(SD)] крыс получали RTA 408 в дозах 3, 10 или 30 мг/кг. Еще одну группу из 10 животных/пол использовали в качестве контроля; она получала носитель (кунжутное масло). Носитель или RTA 408 однократно вводили всем группам через желудочный зонд в 1 сутки в дозе 10 мл/кг.

Наблюдения за заболеваемостью, смертностью, травмами и доступностью пищи и воды проводили два раза в день для всех животных. Наблюдения за клиническими признаками проводили до введения дозы в 1 сутки и после каждой функциональной неэкспериментальной оценки батареи (FOB). Оценки FOB проводили перед введением дозы (-1 сутки) и примерно через 4 и 24 ч после введения дозы. Массу тела измеряли и записывали перед введением дозы в 1 сутки.

RTA 408 в дозах 3, 10 и 30 мг/кг не приводило к смертности, неблагоприятным клиническим наблюдениям или влиянию на любой из протестированных нейроповеденческих показателей. Незначительное сокращение прироста массы тела наблюдалось примерно через 24 ч после введения дозы в группе, получавшей дозу 30 мг/кг, что потенциально могло быть связано с тестируемым соединением. По отношению к основным нейроповеденческим конечным показателям, оцениваемым в данном исследовании, RTA 408 не приводило к нежелательным воздействиям у крыс в дозах до 30 мг/кг включительно.

4. Пульмонологическая оценка RTA 408 у крыс

Потенциальное действие RTA 408 на функцию легких оценивали на крысах. Три экспериментальные группы из восьми самцов и восьми самок CD® [Crl:CD®(SD)] крыс получали RTA 408 в дозах 3, 10 или 30 мг/кг. Еще одну группу из 8 животных/пол использовали в качестве контроля; она получала носитель (кунжутное масло). Носитель или RTA 408 однократно вводили всем группам через желудочный зонд в 1 сутки в дозе 10 мл/кг.

Наблюдения за смертностью, заболеваемостью, травмами и доступностью пищи и воды проводили два раза в день для всех животных. Клинические наблюдения проводили до введения дозы, примерно через 4 ч после введения дозы и после завершения 8-часового периода мониторинга легких. Массу тела измеряли и записывали в день введения RTA 408. Функцию легких (частоту дыхания, дыхательный объ- 44 030468

ем и минутный объем) отслеживали в течение не менее 1 ч до введения дозы для установления исходного уровня и по меньшей мере через 8 ч после введения дозы.

RTA 408 в дозах 3, 10 и 30 мг/кг не приводило к смертности, неблагоприятным клиническим наблюдениям или влиянию на любой из оцениваемых показателей легких. Таким образом, по отношению к основным конечным показателям легких, оцениваемым в данном исследовании, RTA 408 не приводило к нежелательным воздействиям у крыс в дозах до 30 мг/кг включительно.

E. Доклинический обзор

1. Фармакокинетика

Оценку ФК- и метаболических свойств RTA 408 исследовали как in vitro, так и in vivo. Исследования in vitro проводили с целью определить связывание RTA 408 с белками плазмы и разделение крови/плазмы, ингибирование и индукцию цитохрома P450 (CYP450) и идентифицировать метаболиты, образуемые микросомами печени мышей, крыс, обезьян и человека. Данные, относящиеся к поглощению и распределению RTA 408 in vivo в результате многократного введения, получили в основном за счет мониторинга уровня препарата в плазме и выбранных тканях в ходе токсикологических исследований. Чувствительные и селективные биоаналитические способы на основе жидкостной хроматографии-массспектрометрии (ЖХ/МС/МС) использовали для измерения концентрации RTA 408 в плазме, крови и тканях с соответствующей точностью. Измерения проводили на масс-спектрометрах TQD и QToF (Waters).

а. Всасывание

Поглощение и системное фармакокинетическое поведение RTA 408 изучали у мышей, крыс и обезьян после одно -и многократного (ежедневного) перорального введения. После перорального введения суспензии в дозах от 10 до 100 мг/кг максимальные концентрации наблюдали в течение 1-2 ч у мышей и в течение 1-24 ч у крыс и обезьян. Системное воздействие RTA 408 было наиболее высоким у крыс, а у мышей и обезьян наблюдали его более низкие уровни. Кажущийся конечный период полувыведения RTA 408, наблюдаемый после перорального приема, как правило, находился в диапазоне от 6 до 26 ч, однако в некоторых случаях кажущаяся затянувшаяся фаза поглощения исключала вычисление окончательной оценки периода полувыведения.

Системное воздействие RTA 408 в целом было аналогичным у самцов и самок. Воздействие RTA 408 после повторяющегося ежедневного перорального приема, как правило, было несколько выше (в <2 раза), чем воздействие, наблюдаемое после однократного приема. Введение RTA 408 в диапазоне доз от 3 до 100 мг/кг в суспензии, как правило, приводило к увеличению системного воздействия в зависимости от дозы. Вместе с тем, введение более высоких доз (100-800 мг/кг у обезьян; 500-2000 мг/кг у крыс) не приводило аналогичному повышению воздействия, что указывало на насыщение поглощения при дозах выше 100 мг/кг. После перорального введения неоптимизированного (с рыхлым наполнителем) капсульного состава RTA 408 (3 мг/кг) обезьянам нормированное по дозе системное воздействие, как правило, было несколько ниже, чем наблюдали при вводе суспензии.

Поглощение и системное фармакокинетическое поведение RTA 408 изучали на крысах с использованием однократного и повторного местного введения. Введение RTA 408 в диапазоне от 0,01 до 3% продемонстрировало более низкие концентрации в плазме крови по сравнению с аналогичным пероральным приемом. Системное воздействие RTA 408, как правило, увеличивалось в зависимости от дозы. Препарат для местного применения приготавливали в форме суспензии в кунжутном масле.

Глазное поглощение и системное фармакокинетическое поведение RTA 408 оценивали на кроликах. RTA 408 местно наносили на глаз раз в день в течение пяти дней. Глазное введение продемонстрировало меньшую концентрацию RTA 408 в плазме по сравнению с RTA 408 при пероральном введении (фиг. 36). Количество RTA 408 в плазме даже после пяти последовательных дней продемонстрировало лишь только небольшое изменение по сравнению с концентрацией после первого введения дозы по сравнению с RTA 408 при пероральном введении, где концентрации в плазме были почти в 100 раз выше (фиг. 36).

b. Распределение

Связывание белков плазмы с RTA 408 оценивали на мышах, крысах, кроликах, собаках, карликовых свиньях, обезьянах и в плазме человека при концентрациях RTA 408 10-2000 нг/мл с использованием ультрацентрифугирования. RTA 408 активно связывался с белками плазмы. Связывание с белками плазмы у доклинических видов колебалось от 93% (мыши) до >99% (карликовые свиньи), причем у токсикологических видов (крысы и обезьяны) связывание составляло 95%, а у человека - 97%. Доказательства зависимости связывания белков от концентрации отсутствовали у любого из протестированных видов. Результаты экспериментов по распределению в крови-плазме показали, что RTA 408, как правило, в основном линейно распределялось во фракции плазмы крови, и отношения кровь:плазма составляли <1,0 для всех видов и всех протестированных концентраций.

Распределение RTA 408 в тканях исследовали после перорального введения мышам, крысам и обезьянам. В 14-дневных исследованиях токсичности без соблюдения GLP выбранные ткани (печени, легких и головного мозга) однократно собирали (через 4 ч для крысы и мыши; через 24 ч для обезьяны) после введения последней дозы в рамках исследования и анализировали на содержание RTA 408, используя ЖХ/МС/МС. RTA 408 легко распределяется в легких, печени и головном мозге. Концентрации RTA 408 в легких через 4 ч у мышей и крыс были аналогичны или немного выше (в <2 раза), чем концентрации в

- 45 030468

плазме, в то время как через 24 ч у обезьян концентрации RTA 408 в легких были в 6-16 раз выше, чем концентрации в плазме. Аналогичную картину наблюдали для головного мозга. В отличие от этого, концентрации RTA 408 в печени мышей и крыс через 4 ч были в 5-17 раз выше, чем в плазме, а у обезьян через 24 ч - в 2-5 раз выше, чем в плазме.

Фармакодинамические эффекты RTA 408 в тканях оценивали у мышей, крыс и обезьян путем мониторинга индукции генов-мишеней Nrf2 в тех же тканях, собранных для оценки воздействия лекарственного средства в 14-дневных исследованиях токсичности. Индукция генов-мишеней Nrf2 с помощью RTA 408 приводила к увеличению антиоксидантного ответа, о чем свидетельствовало увеличение ферментативной активности NQO1, глутатиона-трансферазы (Gst) и глутатионредуктазы (Gsr) в исследованных тканях в зависимости от дозы. Активность ферментов измеряли, как описано выше. Кроме того, у грызунов содержание RTA 408 в печени коррелировало с уровнем активности фермента NQO1, прототипа гена-мишени Nrf2. У обезьян уровень экспрессии мРНК в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) для NQO1 и сульфиредоксина 1 (SRXN1) коррелировал с воздействием RTA 408 на плазму (фиг. 37a и b). В целом RTA 408 индуцировало биомаркеры Nrf2 у грызунов и обезьян, и такая индукция обычно хорошо коррелировала с воздействием RTA 408 на ткани и плазму.

При введении RTA 408 кроликам посредством глазного местного применения, наиболее высокие концентрации соединения обнаруживались в роговице, сетчатке или радужной оболочке, в то время как в стекловидном теле, внутриглазной жидкости и плазме содержались значительно более низкие концентрации RTA 408 (фиг. 38).

с. Метаболизм

Метаболизм RTA 408 исследовали после инкубирования RTA 408 in vitro в течение 60 мин с микросомами печени мышей, крыс, обезьян и человека в реакционной смеси, содержащей никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH)-регенерирующую систему и дифосфатуридинглюкуронозилтрансферазу (UGT).

Интенсивный обмен RTA 408 наблюдали в микросомах приматов, причем в конце 60-минутного инкубирования с микросомами как обезьяны, так и человека оставалось <10% исходного соединения. В отличие от этого, степень метаболизма в микросомах грызунов была ниже, и в конце инкубирования оставалось >65% исходного соединения. Отсутствие доступных стандартов для различных потенциальных метаболитов RTA 408 исключало количественную оценку наблюдаемых метаболитов. С качественной точки зрения, аналогичная картина метаболитов RTA 408 наблюдалась у различных видов и включала пики с массами, соответствующими восстановлению и гидроксилированию RTA 408, а также глюкуронидации RTA 408 или его восстановленных/гидроксилированных метаболитов. Уникальных для человека метаболитов не наблюдали, и все пики после инкубирования с микросомами человека наблюдались также у одного или нескольких доклинических видов. В частности, на основе данных микросомального анализа in vitro, все метаболиты человека присутствовали у крыс или обезьян, выбранных видов грызунов и видов для исследования токсичности, не относящихся к грызунам.

d. Фармакокинетическое межлекарственное взаимодействие

Возможность ингибирования цитохром P450 (CYP450)-опосредованного метаболизма с помощью RTA 408 оценивали с помощью объединенных микросом печени человека и стандартных субстратов для специфических ферментов CYP450. RTA 408 непосредственно ингибировало CYP2C8 и CYP3A4/5 со значениями K для каждого фермента приблизительно 0,5 мкМ. Для других протестированных ферментов (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19 или CYP2D6) значимого ингибирования не наблюдали, при максимальной протестированной концентрации (3 мкМ) ингибирование составляло <50%. Кроме того, доказательства метаболизм-зависимого ингибирования любого из протестированных ферментов были незначительны или отсутствовали. Будущие исследования возможности CYP3A4/5-опосредованных межлекарственных взаимодействий могут основываться на указанных данных и потенциально высоких концентрациях, которые могут локально достигаться в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) после перорального введения.

Возможность индуцировать экспрессию фермента CYP450 с помощью RTA 408 оценивали с использованием культуры гепатоцитов человека. В условиях, когда прототипы индукторов вызывали ожидаемое увеличение активности CYP, RTA 408 (в концентрации до 3 мкМ) не являлось индуктором ферментативной активности CYP1A2, CYP2B6 или CYP3A4 в культуре гепатоцитов человека. Активность ферментов CYP1A2, CYP2B6 и CYP3A4 измеряли с помощью мониторинга преобразования субстрата в выделенных микросомах в фенацетин, бупропион и тестостерон соответственно.

F. Влияние RTA 408 на острый лучевой дерматит

Проверяли действие RTA 408 в качестве местного или перорального средства профилактики острых лучевых дерматитов. Самцов мышей BALB/c подвергали воздействию 30-Гр дозы радиации в день 0 (табл. 3). Крысам вводили кунжутное масло (носитель) или RTA 408 с -5 до -1 сутки и с 1 по 30 сутки. RTA 408 вводили перорально в дозах 3, 10 и 30 мг/кг в кунжутном масле и местно в процентной композиции 0,01, 0,1 и 1% в кунжутном масле. Дерматит слепо оценивали ежедневно с 4 по 30 сутки. На 12 сутки наблюдали типичный пик дерматита и умерщвляли 4 мышей через 4 ч после введения дозы. Остальных мышей умерщвляли на 30 сутки через 4 ч после введения дозы. Плазму, а также образцы облу- 46 030468

ченной кожи для анализа мРНК и гистологического исследования собирали в 12 и 30 сутки.

Таблица 3

Дизайн исследования для модели острого лучевого дерматита

Группа	Количество животных	Излучение (День 0)	Лечение	График лечения
1	9 самцов	-	Без лечения	-
2	10 самцов	30 Гр	Без лечения	-
3	14 самцов	3 0 Гр	Контрольноситель (кунжутное масло)	С -5 до -1 сутки и с 1 по 30 сутки
4	14 самцов	3 0 Гр	RTA 408 0,01% или 3 мг/кг	С -5 до -1 сутки и с 1 по 30 сутки
5	14 самцов	3 0 Гр	RTA 408 - 0,1% или 10 мг/кг	С -5 до -1 сутки и с 1 по 30 сутки

б

14 самцов

3 0 Гр

RTA 408 - 1% или 30 мг/кг

С -5 до -1 сутки и с 1 по 30 сутки

В экспериментальных группах, где мышей лечили с применением RTA 408, частота дерматита, повидимому, слегка уменьшилась в плане тяжести при пероральном или местном введении RTA 408 (фиг. 39-42). Кроме того, кривые графиков средней клинической балльной оценки дерматита для экспериментальных групп в зависимости от времени демонстрировали некоторые изменения при пероральном или местном введении RTA 408 по сравнению с экспериментальными группами, не получавшими лечения (фиг. 43-45), особенно в том случае, когда RTA 408 вводили перорально. Кроме того, как видно в табл. 4 и 5, приведенных ниже, процент мышей, страдающих от дерматита с клинической оценкой выше 3, был значительно ниже у мышей, получавших RTA 408 перорально, в то время как процент мышей, страдающих от дерматита с клинической оценкой выше 2, был несколько ниже в экспериментальных группах, получавших RTA 408 путем местного нанесения.

Таблица 4

Процент мышей на экспериментальную группу с клинической оценкой дерматита выше 2, получавших местное лечение с применением RTA 408

		День 12	День 14	День 16	День 18	День 20	День 22	День 24	День 26	День 28	День 30	% животныхдней >= 2	животныхдней >= 3
1	без облучения, без лечения	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0
2	облученные, без лечения	0, 0	50, 0	83,3	83,3	83,3	100, 0	66, 7	50, 0	50, 0	50, 0	35, б	0, 0
3	облученные, кунжутное масло	21,4	45, 0	60, 0	50, 0	40, 0	40, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	16, б	0, 0
4	облученные, RTA 408 0, 01%	0, 0	0, 0	20, 0	50, 0	10, 0	40, 0	40, 0	40, 0	20, 0	10, 0	14,4	0, 0
5	облученные, RTA 408 - 0,1%	7,1	10, 0	20, 0	80, 0	60, 0	40, 0	30, 0	10, 0	0, 0	0, 0	16, 3	0, 0
б	облученные, RTA 408 - 1,0%	10,7	20, 0	10, 0	70, 0	30, 0	10, 0	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0	9, 7	0, 0

- 47 030468

Таблица 5

Процент мышей на экспериментальную группу с клинической оценкой дерматита выше 3, получавших пероральное лечение с применением RTA 408

		День 16	День 18	День 20	День 22	День 24	День 26	День 28	у животныхдней >= 2	% животныхдней >= 3
1	без облучения, без лечения	0	0	0	0	0	0	0	0, 0	0, 0
2	облученные, без лечения	20	40	20	20	20	20	20	39, 0	8,8
3	облученные, кунжутное масло	35	50	40	30	20	0	0	45, 6	10, 9
4	облученные, RTA 408 - 3 мг/кг	10	10	0	0	0	0	0	32,5	1,3
5	облученные, RTA 408 - 10 мг/кг	10	25	30	0	0	0	0	33, 8	4, 1
6	облученные, RTA 408 - 30 мг/кг	10	20	10	0	0	0	0	28,8	2,5

G. Влияние RTA 408 на дерматит при фракционированном облучении

При местном введении RTA 408 измеряли влияние RTA 408 на ослабление эффектов дерматита при фракционированном облучении. Мышам линии BALB/c ежедневно вводили RTA 408 в виде препарата для местного применения с -5 до 30 суток в трех дозах от 0,01 до 1%. Мышей облучали в 0-2 и 5-7 сутки; мыши получали шесть 10-Гр доз в день. Клинические оценки дерматита для мышей определяли вслепую каждые два дня с 4 суток до конца исследования. На фиг. 46 показан график изменения средней клинической балльной оценки для каждой группы в зависимости от времени. На графике показано статистически значимое улучшение балльной оценки у мышей, получавших состав для местного применения, содержавший 0,1-1% RTA 408. Параметры исследования и лечения находятся в табл. 6.

Таблица 6

Условия исследования дерматита, вызванного фракционированным облучением

Группа	Количество животных	Облучение (0-2, 5-7 сутки)	Лечение	График лечения
1	9 самцов	-	Без лечения	-
2	14 самцов	6x10 Гр	Без лечения	-
3	18 самцов	6x10 Гр	Контрольноситель (кунжутное масло)	Ежедневно с -5 до 30 суток
4	18 самцов	6x10 Гр	RTA 408 0, 01%	Ежедневно с -5 до 30 суток
5	18 самцов	6x10 Гр	RTA 408 0, 1%	Ежедневно с -5 до 30 суток
6	18 самцов	6x10 Гр	RTA 408 - 1%	Ежедневно с -5 до 30 суток

При анализе средних клинических оценок, показанных на фиг. 46, выполнили расчет площади под кривой (ППК), что позволило получить данные о тяжести дерматита по сравнению с его продолжительностью. Анализ ППК позволил выполнить прямое сравнение между различными группами мышей и влиянием различных процентных концентраций RTA 408 (фиг. 47 и табл. 7). Введение составов RTA 408 для местного применения снижало поражения 2 и 3 категории с 60 и 33%, когда мыши получали только носитель, до 21 и 6% при применении RTA 408 в 1% концентрации соответственно. Другая композиция RTA продемонстрировала некоторую активность, но она была не столь значительна, как активность при применении 1% состава.

- 48 030468

Таблица 7

Процент балльной оценки дерматита для каждой экспериментальной группы

Группа	% дней >2	% дней >3
Без облучения, без лечения	0%	0%
Облучение, без лечения	66%	31%
Облучение, кунжутное масло	60%	33%
Облучение, RTA 408 (0,01%)	54%	29%
Облучение, RTA 408 (0,1%)	40%	13%
Облучение, RTA 408 (1%)	21%	6%

H. Синергетические эффекты RTA 408 и агентов для лечения рака на рост опухоли

Исследование влияния RTA 408 в комбинации с традиционными химиотерапевтическими агентами проводили для определения эффективности потенциального лечения. Исследования in vitro проводили для определения влияния RTA 408 на две разные линии клеток рака предстательной железы, LNCaP и DU-145. Как можно видеть на фиг. 48a, обработка линий клеток рака предстательной железы (LNCaP) 5фторурацилом in vitro демонстрировала статистически значимое увеличение цитотоксичности в комбинации с RTA 408 в дозах 0,125-0,5 мкМ. При использовании линии клеток предстательной железы DU145 и доцетаксела RTA 408 статистически значимо усиливало цитотоксичность химиотерапевтического агента при дозах RTA 408 от 0,125 до 0,75 мкМ, как показано на фиг. 48b. Приведенные данные подтверждают концепцию, что RTA 408 может действовать синергически с агентами для лечения рака и в некоторых вариантах реализации может использоваться для повышения эффективности лечения онкологических пациентов.

После успешного получения результатов анализа in vitro провели пробный анализ in vivo с использованием линий рака предстательной железы человека LNCaP/C4-2B и DU145, модифицированных с целью экспрессии люциферазы светляка (называемых далее по тексту C4-2B-Luc и DU145-Luc, соответственно). Следует отметить, что обе из этих линий клеток росли независимо от андрогенов. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Клетки собирали с помощью TrypLE Express (Invitrogen), промывали в PBS и подсчитывали. Клетки ресуспендировали в PBS из расчета конечной концентрации 3х10⁶ клеток на 30 мкл (если не указано иное) и распределяли по отдельным пробиркам. Matrigel (BD Bioscience) со сниженным количеством факторов роста размораживали в течение ночи при 4°C и переносили в пробирки аликвотами по 30 мкл. Растворы клетки/Matrigel переносили в виварий и смешивали непосредственно перед инъекцией в соотношении 1:1. Каждая мышь (n=1 в каждой группе из трех животных) получала одну подкожную инъекцию опухолевых клеток. Опухоли формировались в течение 4 недель. После этого одно животное лечили RTA 408 (17,5 мг/кг, в/б) раз в день в течение 3 дней (с -3 до -1 суток). На следующий день (день 0) животных, получавших RTA 408, и еще одно животное лечили одной 18-Гр дозой ионизирующей радиации в области таза, куда были имплантированы опухоли. Мышь, предварительно получавшая RTA 408, получала три дополнительные дозы RTA 408 (17,5 мг/кг, в/б) через день в течение следующей недели. Третье животное не получало лечения и использовалось в качестве положительного контроля. Прогрессирование опухоли контролировали еженедельно путем визуализации в реальном времени. Для обнаружения опухолевых клеток, экспрессирующих люциферазу, мышам в/б вводили D-люциферин за 5 мин до визуализации в соответствии с протоколом производителя (Caliper LifeScience). Перед визуализацией мышей анестезировали путем ингаляции изофлурана и визуализировали на системе IVIS Lumina XR (Caliper LifeScience). Для стандартизации определяли минимальное время экспозиции, необходимое для визуализации контрольной опухоли, и всех животных обследовали в указанных условиях. На 7 сутки у животных, получавших облучение, не наблюдалось заметного уменьшения размера опухоли по сравнению с контролем, в то время как у животного, получавшего как RTA 408, так и облучение, изображение опухоли имело меньший размер. На 14 и 21 сутки у контрольных животных было продемонстрировано дальнейшее развитие и рост опухоли, в то время как у животного, получившего дозу ионизирующей радиации, было продемонстрировано некоторое улучшение, особенно в 21 сутки. С другой стороны, животное, получавшее RTA 408 и ионизирующую радиацию, демонстрировало отсутствие прогрессирования с 7 до 14 суток и отсутствие видимой опухоли на 21 сутки. Прогрессирование опухоли за неделю можно видеть на фиг. 49. Данные, полученные in vitro и in vivo, показывают, что RTA 408, по-видимому, дополняет активность различных агентов для лечения рака, тем самым повышая их эффективность.

I. Влияние RTA 408 на модель воспаления глаз

Изучение влияния RTA 408 на воспаление глаз проводили с использованием кроликов линии New Zealand albino. Кроликов делили на 5 групп по 12 кроликов, которые получали три различные концентрации RTA 408 (0,01, 0,1 и 1%), глазные капли Voltarene® в концентрации 0,1% и носитель (кунжутное масло). Каждый кролик получил три инстилляции в течение 60 мин до парацентеза и две инстилляции в течение 30 мин после парацентеза. Объем каждой инстилляции составлял 50 мкл; инстилляцию проводили в оба глаза. Внутриглазную жидкость 6 животных на момент времени собирали через 30 мин и по- 49 030468

вторно через 2 ч после парацентеза. Воспаление количественно определяли по концентрации белка во внутриглазной жидкости. Как показано на фиг. 50, RTA 408 продемонстрировало снижение белка во внутриглазной жидкости, аналогичное наблюдаемому при максимальной концентрации любого из других эталонных соединений (MaxiDex или мапракорат) уже при 0,01% концентрации RTA 408 в составе. Влияние увеличения концентрации RTA 408, по-водимому, было незначительным, поскольку все концентрации RTA 408, по-видимому, демонстрировали относительно аналогичное влияние (в пределах ошибки) на снижение концентрации белка во внутриглазной жидкости.

J. Скрининг полиморфизма

Исследование по получению предварительного препарата и изучению полиморфизма проводили для соединения 63415. В рамках этого исследования выполняли предварительную программу исследования полиморфизма с целью выявления наиболее стабильной безводной формы при комнатной температуре и возможных гидратов с достаточно высокой вероятностью. Выполняли в общей сложности 30 экспериментов по кристаллизации, в том числе эксперименты по установлению фазового равновесия, высушиванию и другим методикам. Характеристики всех полученных твердых веществ оценивали путем спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием. Характеристики всех новых форм оценивали с помощью порошковой рентгеновской дифракции и ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии и, необязательно, с помощью ДСК и динамической сорбции паров.

Кроме того, получили и охарактеризовали аморфную форму. Для получения аморфной формы выполнили несколько экспериментов с использованием различных методик и подходов. Характеристики аморфной формы оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием, порошковой рентгеновской дифракции, ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии, ДСК, динамической сорбции паров и титрованием по Карлу-Фишеру. Стабильность аморфной формы тестировали при повышенной влажности и температуре в течение четырех недель.

1. Исходный материал и номенклатура

В качестве исходных материалов использовали две партии 63415 (табл. 8). В настоящем документе 63415 также называется PP415. Все образцы, полученные или образованные во время этого проекта, получили уникальный идентификационный код вида PP415-Px, где Px относится к номеру образца/эксперимента (x=1, 2, ..., n).

Таблица 8

Исходные материалы

Образец	Материал	Количество	Получено
РР415-Р1	63415, № партии: 014166-1; MW = 554,7 г/моль, C33H44F2N2O3	5, 0 г	25 марта 2011 г.
РР415-Р40	63415, № партии: 2 08369-DC; MW = 554,7 Г/МОЛЬ, C33H44F2N2O3	5, 0 г	2 7 мая 2011 г.

2. Соединение 63415, № партии 0414-66-1 (PP415-P1): аморфная форма

63415, партия # 0414-66-1, характеристики исходного материала оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием, порошковой рентгеновской дифракции, ТГИК-Фурье-спектроскопии, ДСК, динамической сорбции паров и титрованием по Карлу-Фишеру, ¹Н-ЯМР и измерения приблизительной растворимости. Результаты обобщены в табл. 9.

Таблица 9

Оценка характеристик исходного материала 63415 (PP415-P1)

Метод	Результаты
Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием	будет использоваться в качестве эталона
Порошковая рентгеновская дифракция	картина без острых пиков, материал является аморфным
ТГ-ИК-Фурьеспектроскопил	~0,9 масс.% (~0,1 экв.) Этанол со следами Н2О от 25°С до 200°С, разложение при Т>290°С
Карл-Фишер	0, 5 масс . % Н2О

- 50 030468

^-ЯМР	в соответствии со структурой, ~0,08 экв. Этанол
дек	1-е сканирование при нагревании: температура стеклования Тд=152,7°С (АСр=0,72 Дж/г°С) ; 2-е сканирование при нагревании: температура стеклования Тд=149,7°С (АСр=0,45 Дж/г°С)
Динамическая сорбция паров	слегка гигроскопичен; Аш=+0,4% (50%^85% отн. влаж.); спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковая рентгеновская дифракция без изменений

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием (фиг. 58) использовали в качестве эталонного спектра исходного материала. Порошковая рентгеновская дифракция (фиг. 59) демонстрировала картину без острых пиков. Широкое гало при ~10-20 °2Θ характерно для аморфных материалов.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 60) показана постепенная потеря ~0,9 мас.% этанола (т.е. ~0,1 экв.) со следами H₂O от 25 до 200°C. Разложение начиналось при !>290°C.

С помощью титрования по Карлу Фишеру определили содержание воды 0,5 мас.%.

¹Н-ЯМР-спектр (фиг. 61) соответствовал структуре и показывал содержание этанола ~0,08 экв., согласующееся с ТГ-ИК-Фурье-термограммой.

На ДСК-термограмме (фиг. 62) показано стеклование аморфного материала при первом сканировании с нагреванием при T_g=152,7°C (AC_p=0,72 Дж/г °C). При втором сканировании после резкого охлаждения стеклование происходило при T_g=149,7°C (AC_p=0,45 Дж/г °C).

На изотерме динамической сорбции паров (фиг. 63) показано, что при понижении относительной влажности от 50 до 0% происходила постепенная потеря 1,0% массы; равновесие достигалось при 0% относительной влажности. При увеличении относительной влажности до 95% происходил постепенный прирост 2,1% массы (по сравнению с массой при 0% относительной влажности); равновесие достигалось при 95% относительной влажности. При понижении относительной влажности от 95 до 50% конечная масса была на 0,2% ниже исходной массы. Увеличение массы на 0,4% при 85% относительной влажности (по отношению к исходной массе) классифицировало образец как слегка гигроскопичный.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием (фиг. 64) и картина порошковой рентгеновской дифракции (фиг. 65) образца после измерения динамической сорбции паров не содержали изменений по сравнению со спектром и картиной образца перед измерением.

Приблизительную растворимость исходного материала PP415-P1 измеряли в двенадцати растворителях и четырех смесях растворителей при комнатной температуре с помощью ручного разбавления в сочетании с визуальным наблюдением (табл. 10). Вследствие экспериментальной ошибки, присущей этим способам, значения растворимости следует рассматривать как приблизительные и использовать исключительно для планирования экспериментов кристаллизации. Все смеси растворителей приведены в объемном соотношении (об./об.).

Таблица 10

Приблизительная растворимость исходного материала PP415-P1 (аморфного)

Растворитель	Растворимость S [мг/мл]
толуол	S>200
ДХМ	S>200
EtOAc	S>210
ацетон	S>230
MeCN	S>230
ДМФ	S>210
МеОН	S<210
EtOHa	105<S<210
2РгОН	16<S<19
DEE	S>ld

- 51 030468

гептан	S<1
Н2О	S<1
2РгОН/Н2О ( 9 : 1) ь	7,9<S<8,5
MeCN/H2O (2:3)с	S<1
EtOAc/гептан (1:1)а	100<S<200
толуол/DEE (1:1)а	S>220

^a наблюдали осаждение через ~1 сут.; ^b активность воды a(H2O) ~0,7 при 25°C; ^c активность воды a(H2O) >0,9 при 50°C;

^d вначале неполное растворение (S<1), однако твердый остаток полностью растворялся в течение ночи (S>1).

3. Соединение 63415, № партии 2083-69-DC (PP415-P40): класс 2

63415, № партии 2083-69-DC, представляло собой гептановый сольват. Характеристики указанного материала (PP415-P40) оценивали с помощью порошковой рентгеновской дифракции и признали соответствующими 2 классу (фиг. 66).

Класс 2, вероятно, соответствует изоструктурным нестехиометрическим (<0,5 экв.) сольватам (гептана, циклогексана, изопропилового эфира, 1-бутанола, триэтиламина и, возможно, других растворителей, например, гексана и других простых эфиров) с прочно связанным растворителем.

Небольшие пики, видимые на дифрактограмме PP415-P40 при 7,9 °2Θ и 13,8 °2Θ, не соответствовали пикам 3, 4 или 5 классов. Их происхождение на данный момент неясно.

4. Химическая стабильность аморфной формы

Химическую стабильность аморфной формы исследовали в различных растворителях в течение семи суток.

Получили растворы/суспензии с концентрацией 1 мг/мл в четырех органических растворителях (ацетоне, MeOH, MeCN, EtOAc) и трех водных средах с поверхностно-активными веществами (1% водный раствор ДСН, 1% водный раствор Твин-80, 1% водный раствор CTAB).

Для каждого растворителя получили четыре отдельных раствора/суспензии, уравновешенные в течение 6 ч, 24 ч, 2 сут. и 7 сут., а затем анализировали их с помощью ВЭЖХ.

Относительная процентная площадь, полученная из ВЭЖХ-хроматограмм, приведена в табл. 11. Соединение, по-видимому, было несколько нестабильным в разбавителе (0,1% муравьиной кислоты в MeCN); в течение последовательности (т.е. в течение ~24 ч) процентная площадь эталонного образца (PP415-P1, введенного в начале и в конце последовательности) снизилась с 99,9 до 99,3% при 254 нм и с 99,9 до 99,5% при 242 нм. Это могло повлиять на образцы, измеренные в конце последовательности (установленной в следующем порядке: 7 сут., 2 сут., 24 ч, 6 ч), и полученная процентная площадь могла быть занижена.

Таблица 11

Эксперименты по химической стабильности аморфной формы 63415 (PP415-P1) ^a

	при 254 нм	при 242 нм
Растворитель	7 сут.	2 сут.	24 ч	6 ч	7 сут.	2 сут.	24 ч	6 ч
ацетон	99,6%	99,6%	99,6%	99,6%	99,7%	99,7%	99,6%	99,6%
EtOAc	99,8%	99,8%	99,8%	99,7%	99,8%	99,9%	99,8%	99,7%
MeOH	99,8%	99,8%	99,7%	99,8%	99,8%	99,9%	99,7%	99,8%
MeCN	97,7%	99,5%	99,3%	99,4%	97,4%	99,5%	99,3%	99,3%
Твин l%b	97,7%	97,1%	95,1%	97,6%	98,7%	98,7%	96,2%	99,1%
ДСН 1%C	99,7%	99,6%	99,7%	99,7%	99,8%	99,7%	99,7%	99,7%
СТАВ 1%	99,3%	99,4%	99,4%	99,6%	99,3%	99,4%	99,4%	99,7%

^a при третьей длине волны (210 нм) интенсивность сигнала была слабой, а отношение сигнал-шум велико, поэтому интегрирование не выполняли;

^b суспензии, не весь материал растворялся во все моменты времени; ^c суспензии, не все твердое вещество растворялось в моменты времени 24 и 6 ч.

Для растворов в MeCN через семь суток и суспензий в 1% водном Твин-80 наблюдали >1% разложение (во все моменты времени при 254 нм и через 24 ч, 2 сут. и 7 сут. при 242 нм).

- 52 030468

5. Стабильность аморфной формы при хранении

Для получения дополнительной информации о ее основных свойствах и физической стабильности аморфную форму 63415 подвергали хранению при повышенной температуре и относительной влажности.

Образцы аморфной формы (исходного материала PP415-P1) хранили в открытом виде при 25°C/~62% относительной влажности (над насыщенным водным раствором NH₄NO₃) м 40°C/~75% относительной влажности (над насыщенным водным раствором NaCl) и в закрытом сосуде при 60 и 80°C (табл. 12). В моменты времени 0, 1, 2 и 4 нед. образцы оценивали с помощью порошковой рентгеновской дифракции и сравнивали с исходным материалом PP415-P1.

Таблица 12

Эксперименты по стабильности аморфной формы 63415 (PP415-P1) при хранении

Образец	Условия	Момент времени	Результат порошковой рентгеновской дифракции
РР415Р2а	открытое 25°С,/~62% влажности	состояние, относительной	1	нед.	аморфное
РР415Р2Ь	открытое 25°С/~62%	состояние, относительной	2	нед.	аморфное
влажности
РР415Р2с	открытое 25°С/~62% влажности	состояние, относительной	4	нед.	аморфное
РР415РЗа	открытое 25°С/~75% влажности	состояние, относительной	1	нед.	аморфное

РР415РЗЬ	открытое состояние, 25°С/~75% относительной влажности	2 нед.	аморфное
РР415РЗс	открытое состояние, 25°С/~75% относительной влажности	4 нед.	аморфное
РР415Р4а	закрытое состояние, 60°С	1 нед.	аморфное
РР415Р4Ь	закрытое состояние, 60°С	2 нед.	аморфное
РР415Р4с	закрытое состояние, 60°С	4 нед.	аморфное
РР415Р5а	закрытое состояние, 80°С	1 нед.	аморфное
РР415Р5Ь	закрытое состояние, 80°С	2 нед.	аморфное
РР415Р5с	закрытое состояние, 80°С	4 нед.	аморфное

Через одну неделю (момент времени 1 нед., фиг. 67), через две недели (момент времени 2 нед., фиг. 68), через четыре недели (момент времени 4 нед., фиг. 69) все четыре образца все еще были аморфными, поскольку порошковая рентгеновская дифрактограмма продемонстрировала отсутствие различий по сравнению с исходным материалом в момент времени 0 нед.

6. Эксперименты по кристаллизации и сушке

а. Эксперименты по кристаллизации

Эксперименты по установлению фазового равновесия, кристаллизации из горячих растворов и испарению проводились, начиная с аморфной формы с целью выявления с достаточно высокой вероятностью наиболее стабильной при комнатной температуре безводной формы и возможных гидратов. Все полученные материалы оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием; выбранные образцы также оценивали с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

- 53 030468

Спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием группировали в классы по сходству положений их пиков. Исходный образец (PP415-P1, см. табл. 8) классифицировали вместе с продуктами кристаллизации. Спектры в пределах класса не являлись строго идентичными, но аналогичными. Могли существовать небольшие различия и сдвиги пиков. Учитывая только спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием, трудно определить, принадлежат ли спектры одного класса к одной и той же полиморфной форме.

После определения пиков порошковых рентгеновских дифрактограмм дифрактограммы классифицировали по кластерам с помощью программного обеспечения PANalytical X'Pert (Highscore Plus). Эти кластеры определяли дифрактограммы с высоким сходством. Тем не менее, в пределах кластера существовали небольшие, но существенные различия. Таким образом, дифрактограммы в кластере не обязательно соответствовали одним и тем же полиморфным модификациям, но представляли собой различные формы с очень сходными молекулярными структурами. Классы комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием во всех случаях соответствовали кластерам порошковой рентгеновской дифракции.

b. Эксперименты по уравновешиванию суспензии

Эксперименты по уравновешиванию суспензии проводили в одном растворителе и одиннадцати смесях растворителей (табл. 13). Полученные суспензии ~100 мг PP415-P1 в 0,2-2,0 мл выбранных растворителей встряхивали в течение 4-15 дней при температуре 22-24°C. Твердые вещества извлекали и оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием; большинство из них оценивали также с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

Таблица 13

Эксперименты по уравновешиванию суспензии, начиная с аморфной формы (PP415-P1)

Образец	Растворитель/ Смесь	Класс спектров комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием	Кластер порошковой рентгеновской дифракции
РР415-Р6	2РгОН	3	3
РР415-Р7	1:2 EtOAc/гептан	2	2
РР415-Р8	1:2 ацетон/гексан	2	2
РР415-Р9	1:3 толуол/DEE	2d	-
РР415-Р10	1:3 МеОН/ТВМЕ	2	2
РР415-Р11	1:2 МЕК/циклогексан	2d	-
РР415-Р12	9:1 EtOH/H2Oa	3	3
РР415-Р13	7:3 MeCN/H2Ob	4d	4
РР415-Р14	~1:1 ТГФ/Н2ОС	5d	5
РР415-Р29	1:2 EtOAc/TOA	2	2
РР415-Р31	9:1 ПЭГ/Н2О	1	1
РР415-Р35	7:3 MeCN/H2Ob	4d	4

активность воды: ^a a(H2O) ~0,5 при 50°C; ^b a(H2O) ~0,85 при 50°C; ^c a(H₂O) >0,99 при 64°C; ^d спектр содержит сигналы растворителя.

с. Кристаллизация из горячих растворов

Горячие растворы PP415-P1 получали в одном растворителе и четырех смесях растворителей (табл. 14). При медленном охлаждении до 5°C со скоростью ~0,2 К/мин в трех случаях наблюдали осадки (-P20, -P21, -P24). В двух случаях (-P22, P23) твердое вещество не осаждалось даже после хранения при 4-5°C в течение двух дней. При этом растворитель выпаривали в потоке азота при комнатной температуре. Твердые вещества извлекали и оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием, и те вещества, спектры которых отличались от аморфного исходного материала 1 класса спектров комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием, также оценивали с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

- 54 030468

Таблица 14

Эксперименты по медленному охлаждению, начиная с аморфной формы (PP415-P1)

Образец	Растворитель/ Смесь	Условия	Класс спектров комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием	Кластер порошковой рентгеновской дифракции
РР415Р20	~2:1 ацетон/ Н2О	55°С 5°С	Зь	3
РР415Р21	~1:5 EtOH/ циклогексан	75°С 5°С	2	2
РР415Р22	-1: 3 MeCN/толуол	75°С 5°Са	1ь	-
РР415Р23	1:3 EtOAc/ диоксан	75°С 5°Са	1ь	-
РР415Р24	IBuOH	75°С 5°С	2Ь	2

осадок после медленного охлаждения и перемешивания при

a

5°C в течение 2 дней отсутствовал; выпаривание растворителя в потоке N2 при комнатной температуре; ^b спектр содержит сигналы растворителя.

d. Эксперименты по выпариванию/осаждению

Чистые растворы PP415-P1 получали в трех смесях растворителей (табл. 15). Затем медленно выпаривали растворители при комнатной температуре в условиях окружающей среды. Тем не менее, в двух из трех экспериментов (-P15 и -P17) до начала испарения выпадал белый твердый осадок. Полученные твердые вещества оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием и порошковой рентгеновской дифракции.

Таблица 15

Эксперименты по медленному выпариванию с аморфной формой (PP415-P1)

Образец	Растворитель/ Смесь	Класс спектров комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием	Кластер порошковой рентгеновской дифракции
РР415Р15	1:2 ДХМ/IРЕ	2а	2
РР415Р16	1:2 МеОН/толуол	1а	-
РР415Р17	1:3 EtOAc/ гептан	2а	2

спектр содержит сигналы растворителя.

е. Эксперименты по высушиванию

По меньшей мере один образец каждого класса высушивали в вакууме с целью десольватации сольватов и получения несольватированных кристаллических форм 63415 (табл. 16). Затем высушенные материалы оценивали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием, порошковой рентгеновской дифракции и ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.

Таблица 16

Эксперименты по высушиванию, проведенные на образцах, полученных

в ходе экспериментов по кристаллизации

Образец	Исходный материал (класс)	Условия	Результат
РР415Р18	РР415-Р15 (2)	кт, 2-10 мбар, ~2 ч	2
РР415Р19	РР415-Р17 (2)	кт, 2-10 мбар, ~2 ч	2

- 55 030468

РР415Р25	РР415-Р6 (3)	кт, ~3 мбар, ~5 сут. ; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 40-50°С, 5-20 мбар, -1 сут.	3
РР415Р26	РР415-Р13 (4)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 40-50°С, 5-20 мбар, -1 сут.	4
РР415Р27	РР415-Р14 (5)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 40-50°С, 5-20 мбар, -1 сут.	1а
РР415Р28	РР415-Р21 (2)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 40-50°С, 5-20 мбар, -1 сут.	2Ь
РР415РЗО	РР415-Р7 (2)	50-70°С, 1-10 мбар, 3 сут.	2
РР415Р32	РР415-Р19 (2)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	2Ь
РР415РЗЗ	РР415-Р25 (3)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	3
РР415Р34	РР415-Р28 (2)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	2Ь
РР415Р36	РР415-Р35 (4)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	4е
РР415Р37	РР415-Р35 (4)	80°С, поток N2, 3 сут.	4е
РР415Р44а	РР415-Р41 (5)	80°С, 100 мбар, 2 сут.	1а
РР415Р46а	РР415-Р45 (6)	80°С, 100 мбар, 4 сут.	1а

десольватация успешна, значительное снижение содержания растворителей, образец в основном аморфный; только несколько широких пиков при порошковой рентгеновской дифракции;

^b образец менее кристаллический, согласно широким пикам при порошковой рентгеновской дифракции; ^c десольватация успешна, значительное снижение содержания растворителя, образец по-прежнему кристаллический; изменения в структуре отсутствуют.

- 56 030468

7. Оценка характеристик новых форм (классов)

а. Сводная информация о новых классах

Кроме аморфной формы 63415, в данном исследовании получили четыре новые кристаллические формы (табл. 17).

Таблица 17

Сводная информация о полученных классах

Класс	Характеристики	Результат экспериментов по высушив анию
Класс 1	аморфная форма	-
Класс 2	изоструктурные сольваты (например, гептан)	высушивание неудачно
Класс 3	изоструктурные сольваты (например, этанол)	высушивание неудачно
Класс 4	сольват MeCN и десольватированный сольват	высушивание успешно, структура без изменений
Класс 5	сольват ТГФ	высушивание приводило к получению аморфной формы

Класс 2. Большинство экспериментов по кристаллизации приводило к получению твердого материала 2 класса. Эти образцы, вероятно, соответствовали изоструктурным, нестехиометрическим (<0,5 экв.) сольватам (гептана, циклогексана, изопропилового эфира, 1-бутанола, триэтиламина и, возможно, гексана и других простых эфиров и т.д.) с прочно связанными молекулами растворителя. Спектры комбинационного рассеяния и порошковые рентгеновские дифрактограммы в пределах данного класса очень похожи друг на друга, таким образом, структуры могут быть практически идентичны, за исключением небольших различий, обусловленных использованием различных растворителей.

Эксперименты по высушиванию образцов 2 класса не приводили к получению кристаллической несольватированной формы. Даже при повышенных температурах (80°C) и в глубоком вакууме (<1x10^-3 мбар) не удавалось удалить прочно связанные молекулы растворителя полностью; всегда оставалось >2 мас.% растворителя. Кристалличность этих образцов снижалась, но превращения в другую структуру или существенной аморфизации не наблюдали.

Класс 3. Твердое вещество 3 класса получали при нескольких экспериментах по кристаллизации. Образцы 3 класса, вероятно, являются изоструктурными сольватами 2PrOH, этанола и, вероятно, ацетона с прочно связанными молекулами растворителя. Они могли соответствовать стехиометрическим гемисольватам или нестехиометрическим сольватам с содержанием растворителя ~0,5 экв. Как и в случае 2 класса, спектры комбинационного рассеяния и порошковые рентгеновские дифрактограммы в пределах этого класса были очень похожи друг на друга, что указывало на аналогичные структуры, содержащие различные растворители.

Аналогично 2 классу, эксперименты по высушиванию также не увенчались успехом. Очень прочно связанные молекулы растворителя можно было удалить лишь частично (от ~5,4 до ~4,8 мас.%, до 3 сут. при 1 x 10^-3 мбар и 80°C). Порошковая рентгеновская дифрактограмма оставалась неизменной.

Класс 4. Материал 4 класса получали только из системы растворителей 7:3 MeCN/H₂O. Он, скорее всего, соответствовал кристаллическому гемисольвату ацетонитрила.

При высушивании (в вакууме или потоке N2 при повышенных температурах) можно было удалить большую часть растворителя без изменения или разрушения кристаллической структуры (порошковая рентгеновская дифрактограмма оставалась неизменной). Таким образом, получали кристаллическую несольватированную форму (или, скорее, десольватированный сольват). Он был слегка гигроскопичен (прирост массы ~0,7 мас.% при повышении относительной влажности от 50 до 85%) и имел возможную температуру плавления 196,1°C (AH=29,31 Дж/г).

Класс 5. Класс 5 также получали только из одной системы растворителей (~1:1 ТГФ/H^); он содержал связанный ТГФ (и, возможно, H₂O). Поскольку содержание двух указанных компонентов невозможно количественно определить по отдельности, точную природу указанного кристаллического сольвата определить не удалось.

Высушивание класса 5 приводило к полной десольватации и преобразованию в аморфную форму (класс 1). Одним из возможных способов получения аморфной формы из материала 2 класса является преобразование 2 класса до 5 класса с последующим высушиванием и аморфизацией.

b. Класс 1 - аморфная форма

Класс 1, аморфную форму 63415, получали в нескольких экспериментах по кристаллизации (табл. 18). Большинство экспериментов по кристаллизации приводило к получению кристаллического материала 2, 3, 4 или 5 классов.

Исходный материал, PP415-P1, был аморфным и принадлежал к 1 классу. Выполняли дальнейшие

- 57 030468

эксперименты, полностью направленные на получение аморфной формы (1 класса).

Таблица 18

Эксперименты по кристаллизации, приведшие к получению твердого материала 1 класса

Образец	Способ	Растворитель	Характеристика	Высушивание
РР415Р31	сусп. уравн.	9:1 ПЭГ/Н2О	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	-
РР415Р22	медленное охлаждение3	~1: 3 MeCN/толуол	виз. набл., спектроскопия комбинационного рассеяния	-

РР415Р23	медленное охлаждение	1:3 EtOAc/ диоксан	виз. набл., спектроскопия комбинационного рассеяния	-
РР415Р16	выпар./ осажд.	1:2 МеОН/толуол	виз. набл., спектроскопия комбинационного рассеяния	-

осадок после медленного охлаждения и перемешивания при 5°C в течение 2 дней отсутствовал; выпаривание растворителя в потоке N₂ при комнатной температуре.

с. Класс 2 - изоструктурные сольваты (например, гептана)

Большинство экспериментов по кристаллизации приводило к получению твердого материала 2

класса (табл. 19). Кроме того, одну партию гептанового сольвата 2 класса, PP415-P40, использовали в качестве исходного материала (см. табл. 8).

Спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием 2 класса очень похожи друг на друга (фиг. 70), но имели небольшие различия. Они существенно отличались от спектра аморфного исходного материала 1 класса (фиг. 71) и от спектров 3, 4 и 5 классов (фиг. 72).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы 2 класса (фиг. 73) подтвердили кристалличность материалов. Дифрактограммы образцов были очень похожи друг на друга, но имели небольшие различия (фиг. 74). Дифрактограммы 2 класса сильно отличались от дифрактограмм 3, 4 и 5 классов (фиг. 75).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P7 (фиг. 76) показана потеря ~7,5 мас.% EtOAc и гептана в две стадии при повышении температуры от ~100 до 290°C и разложение при T>290°C. Перед ТГИК-Фурье-экспериментами образцы подвергали краткосрочному высушиванию (в течение ~5 мин) в вакууме (10-20 мбар) для удаления избытка несвязанного растворителя. Потеря EtOAc и гептана происходила совместно в одном и том же интервале температур; оба указанные растворителя, по-видимому, были прочно связаны со структурой материала. Теоретическое содержание EtOAc (так как = 76°C) в гемисольвате составляло 7,4 мас.%, теоретическое содержание гептана (так как = 98°C) в гемисольвате составляло 8,3 мас.%. К сожалению, содержание обоих указанных компонентов невозможно количественно определить по отдельности.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P21 (фиг. 77) показана потеря ~5,8 мас.% циклогексана в две стадии при повышении температуры от ~140 до ~250°C и разложение при T>250°C. При температуре кипения циклогексана (81°C), растворители, по-видимому, были прочно связаны со структурой материала. Теоретическое содержание циклогексана в гемисольвате составляло 7,1 мас.%. Таким образом, образец PP415-P18, возможно, соответствовал нестехиометрическому сольвату циклогексана (с содержанием растворителя <0,5 экв).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P24 (фиг. 78) показана потеря ~16,6 мас.% 1BuOH в одну стадию при повышении температуры от ~50 до ~160°C, дальнейшая потеря 1BuOH (6,6 мас.%) на второй стадии от 160 до 230°C и разложение при температурах T>230°C. При температуре кипения 1BuOH (117°C) растворитель, по меньшей мере, на второй стадии, по-видимому, был прочно связан со структурой материала. Теоретическое содержание 1BuOH в гемисольвате составляло 6,3 мас.%.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P29 (фиг. 79) показана потеря ~5, 1 мас.% EtOAc и ТЭА при повышении температуры от ~50 до ~220°C, большая часть которой происходила на этапе повышения от 180 до 210°C. Разложение происходило при температурах Т>220°С Потеря EtOAc и TEA происходила совместно в одном том же интервале температур; оба растворителя, по-видимому, были

- 58 030468

прочно связаны со структурой материала (при температуре кипения EtOAc (77°C) и ТЭА (89°C)).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P47 (фиг. 80) показана типичная двустадийная потеря массы для материала 2 класса (в общей сложности ~7,9 мас.% EtOAc) при температурах до 240°C, что указывало на очень прочную связь молекул растворителя.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P48 (фиг. 81) показана потеря ~3,5 мас.% этилформиата и воды, вначале постепенная, а затем с четким переходом между 180°C и 200°C. Возможно, имела место дальнейшая потеря этилформиата, сопутствующая разложению при T>240°C.

Таким образом, все образцы 2 класса могли соответствовать нестехиометрическим (<0,5 экв.) изоструктурным сольватам с прочно связанными молекулами растворителя. Поскольку спектры комбинационного рассеяния и порошковые рентгеновские дифрактограммы в пределах данного класса были очень похожи друг на друга, структуры моли быть практически идентичны друг другу, за исключением небольших искажений размеров элементарной ячейки или небольших изменений положений атомов в пределах элементарной ячейки вследствие различного размера и формы встроенных молекул растворителя.

Таблица 19

Эксперименты по кристаллизации, приведшие к получению твердого материала 2 класса

Образец	Способ	Растворитель	Характеристика	Высушивание
РР415Р7	су СП . уравн.	1:2 EtOAc/ гептан	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	X
РР415Р8	сусп. уравн.	1:2 ацетон/ гексан	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	-

- 59 030468

РР415Р9	cycn. уравн.	1:3 толуол/ DEE	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	-
РР415Р10	cycn. уравн.	1:3 МеОН/ ТВМЕ	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	-
РР415Pll	cycn. уравн.	1:2 МЕК/ циклогексан	Спектроскопия комбинационного рассеяния	-
PP415P29	cycn. уравн.	EtOAc/ТЭА	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	-
PP415P15	выпар./ осажд.	1:2 ДХМ/1РЕ	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	X
PP415P17	выпар./ осажд.	1:3 EtOAc/ гептан	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	X

- 60 030468

РР415Р21	медленное охлаждение	~1:5 EtOH/ циклогексан	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	X
РР415Р24	выпар./ осажд.	IBuOH	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	-
РР415Р43а	выпаривание	(8:2) ТГФ/гексан	Порошковая рентгеновская дифракция	-
РР415Р47а	выпаривание	EtOAc	Порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	-
РР415Р48а	выпаривание	этилформиат	Порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	-

исходный материал: PP415-P40, класс 2; во всех других экспериментах в качестве исходного материала использовали PP415-P1, класс 1.

d. Эксперименты по высушиванию образцов 2 класса

Несколько образцов 2 класса высушивали в вакууме (и в некоторых случаях при повышенных температурах) и с целью их десольватации и получения безводной формы 63415. Подробности и характеристики высушенных образцов представлены ниже в табл. 20.

Тем не менее, даже при высушивании в течение трех дней при 80°C и в вакууме при <1х10^-3 мбар не удалось полностью удалить прочно связанные молекулы растворителя; остаточное содержание растворителя составило >2 мас.% (см. образцы -P32 и -P34). На порошковых рентгеновсих дифрактограммах показана пониженная степень кристалличности этих образцов, однако преобразования в другие структуры не наблюдали.

- 61 030468

Таблица 20

Эксперименты по высушиванию образцов 2 класса

Исходный материал	Высушивание	Высушенный материал
Образец	Содержание растворителя	Условия	Образец	Содержание растворителя	Класс
РР415-Р7	EtOAc/гептан (—7,5%)	50-70°С, 1-10 мбар, 3 сут.	РР415-Р30	гептан (~2,5%)	2
РР415-Р15	IPE (неизвестно)	кт, 2-10 мбар, ~2 ч	РР415-Р18	IPE (-7,0%)	2
РР415-Р17	EtOAc(?)/гептан (неизвестно)	кт, 2-10 мбар, ~2 ч	РР415-Р19	гептан (~7,6%)	2
РР415-Р19	гептан (~7,6%)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	РР415-Р32	гептан (—2,2%)	2а
РР415-Р21	циклогексан (—5,8%)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 40-50°С, 5-20 мбар, ~1 сут.	РР415-Р28	циклогексан (-3,0%)	2а
РР415-Р28а	циклогексан (—3,0%)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	РР415-Р34	циклогексан (-2,3%)	2а

^а согласно порошковой рентгеновской дифракции, несколько меньшая степень кристалличности.

Таким образом, сольваты 2 класса, по-видимому, содержали очень прочно связанные молекулы растворителя. Их было трудно десольватировать или преобразовать/перевести в аморфную форму.

e. PP415-P7^PP415-P30

Твердый материал образца PP415-P7, 2 класса, полученный в ходе эксперимента по уравновешиванию суспензии в смеси 1:2 этилацетат/гептан, высушивали (как и PP415-P30) в вакууме в течение нескольких дней (1-10 мбар, 50-70° C).

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием высушенного материала 2 класса (PP415-P30) демонстрировал небольшие отличия от исходного спектра (образец PP415-P7, фиг. 82), но все еще соответствовал 2 классу.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма высушенного материала 2 класса (PP415-P30) демонстрировала несколько более широкие, менее интенсивные пики (фиг. 83), но все еще соответствовала 2 классу.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме высушенного образца PP415-P30 (фиг. 84) показана потеря ~2,5 мас.% гептана (и некоторого количества EtOAc) в две стадии при повышении температуры с ~50 до ~250°C и разложение при T>250°C. По сравнению с ТГ-ИК-Фурье-термограммой образца PP415-P7 (фиг. 76), сохранилась двухэтапная потеря растворителя, но общее количество растворителя в образце снизилось с ~7,5 мас.% в PP415-P7 до ~2,5 мас.% в PP415-P30.

Таким образом, попытка десольватации указанного сольвата при повышенных температурах (5070°C) и в вакууме 1-10 мбар) привела лишь к частичной потере растворителя.

f. PP415-P15^PP415-P18

Твердый материал образца PP415-P15, 2 класса, полученный в ходе эксперимента по осаждению из смеси 1:2 ДХМ/IPE, высушивали (как и PP415-P18) в вакууме (~2-20 мбар) при комнатной температуре в течение ~2 ч.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием PP415-P18 был идентичен спектру образца PP415-P15 (фиг. 85), оба из которых соответствовали 2 классу.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма PP415-P18 демонстрировала небольшие отличия от дифрактограммы PP415-P15 (фиг. 86). PP415-P18 по-прежнему соответствовал 2 классу.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 87) показана потеря ~7,0 мас.% IPE в две стадии при повышении температуры от ~140 до ~250°C и разложение при T>250°C. При температуре кипения IPE (67°C) растворители, по-видимому, были прочно связаны со структурой материала. Теоретическое содержание IPE в гемисольвате составляло 8,4 мас.%.

К сожалению, ТГ-ИК-Фурье-термограмму материала перед стадией высушивания не записали. Однако поскольку растворитель, по-видимому, был очень прочно связан со структурой материала, и в спектрах комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковых рентгеновских дифрактограммах не наблюдали изменений (или наблюдали только небольшие изменения), предполагается, что высушивание не оказало существенного влияния на структуру или содержание растворителя.

g. PP415-P17^PP415-P19^PP415-P32

Твердый материал образца PP415-P17, 2 класса, полученный в ходе эксперимента по осаждению из смеси 1:3 EtOAc/гексан, высушивали (как и PP415-P19) в вакууме (~2-20 мбар) при комнатной температуре в течение ~2 ч.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием PP415-P19 был идентичен спектру

- 62 030468

образца PP415-P17 (фиг. 88); изменений не наблюдали, и оба указанных образца соответствовали 2 классу.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма PP415-P19 слегка отличалась от дифрактограммы PP415-P17 (фиг. 89), но все еще соответствовала 2 классу.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 90) показана потеря ~7,6 мас.% гептана в две стадии при повышении температуры от ~140 до ~270°C и разложение при T>270°C. При температуре кипения гептана (98°C) растворители, по-видимому, были прочно связаны со структурой материала. Теоретическое содержание гептана в гемисольвате составляло 8,3 мас.%.

С использованием того же образца провели еще один эксперимент по высушиванию (80°C, <1х10^-3 мбар, 3 сут.), как и для PP415-P32.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием не изменился (фиг. 88). Порошковая рентгеновская дифрактограмма по-прежнему соответствовала 2 классу (фиг. 89), но образец обладал меньшей степенью кристалличности (поскольку пики были шире и обладали более низким соотношением сигнал/шум).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 90) показана потеря ~2,2 мас.% гептана, большая часть которой произошла на этапе с 170 до 200°C, и разложение при T>250°C.

Таким образом, содержание гептана снизилось лишь с 7,6 до 2,2 мас.%, что подтверждало прочность связывания молекул растворителя.

h. PP415-P21^PP415-P28^PP415-P34

Твердый материал образца PP415-P21, 2 класса, полученный в ходе эксперимента по медленному охлаждению в смеси 1:5 EtOH/циклогексан, высушивали (как и PP415-P28) в вакууме в течение нескольких дней (2-20 мбар, от кт до 60°C).

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием высушенного материала 2 класса (PP415-P28) демонстрировал небольшие отличия от спектра 2 класса (образец PP415-P21, фиг. 92), но все еще соответствовал 2 классу.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма высушенного материала 2 класса (PP415-P28) демонстрировала более широкие, менее интенсивные пики по сравнению с дифрактограммой PP415-P21 (фиг. 93), что указывало на меньшую степень кристалличности высушенного образца. Тем не менее, дифрактограмма все еще соответствовала 2 классу.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме высушенного образца PP415-P28 (фиг. 94) показана потеря ~3,0 мас.% циклогексана в две стадии при повышении температуры со ~140 до ~250°C и разложение при T>250°C. По сравнению с ТГ-ИК-Фурье-термограммой образца PP415^21 (фиг. 77), сохранилась двухэтапная потеря растворителя, но общее количество растворителя в образце снизилось с ~5,8 мас.% в PP415-P21 до ~3,0 мас.% в PP415-P28.

Таким образом, десольватация указанного сольвата, по-видимому, привела лишь к частичной потере растворителя, параллельной частичной потере кристалличности.

Дальнейшее высушивание указанного образца (при 80°C, <1х10^-3 мбар, 3 сут.) проводили аналогично PP415-P34.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием не изменился (фиг. 92). Порошковая рентгеновская дифрактограмма по-прежнему соответствовала 2 классу (фиг. 93), но образец обладал меньшей степенью кристалличности (поскольку пики были шире и обладали более низким соотношением сигнал/шум).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 95) показана потеря ~2,3 мас.% циклогексана в две стадии при повышении температуры с 25 до 270°C, и разложение при T>270°C.

Таким образом, содержание циклогексана снизилось лишь с 3,0 до 2,3 мас.%, что подтверждало прочность связывания молекул растворителя.

i. Класс 3 - изоструктурные сольваты (например, этанола)

Несколько экспериментов по кристаллизации привели к получению твердого материала 3 класса, оценивавшегося с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием, порошковой рентгеновской дифрактограммы и ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии (табл. 21).

Спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием 3 класса были очень похожи друг на друга (фиг. 96), но имели небольшие различия (фиг. 97). Спектры 3 класса значительно отличались от спектра аморфного исходного материала 1 класса (фиг. 98) и от спектров 2, 4 и 5 классов (фиг. 72).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы 3 класса (фиг. 99) подтвердили кристалличность материалов. Дифрактограммы трех образцов были похожи друг на друга, однако обладали небольшими, но существенными различиями (фиг. 100). Дифрактограмма 3 класса сильно отличалась от дифрактограмм кристалличности 2, 4 и 5 классов (фиг. 75).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P6 (фиг. 100) показана потеря ~5,4 мас.% 2PrOH при повышении температуры с 25 до 250°C, большая часть которой произошла на стадии с ~170 до 190°C. Разложение начиналось при T>250°C. Перед экспериментами с использованием ТГ-ИК-Фурьеспектроскопии образцы подвергали краткосрочному высушиванию (в течение ~5 мин) в вакууме (10-20

- 63 030468

мбар) для удаления избытка несвязанного растворителя. Теоретическое содержание 2PrOH (так как = 82°C) в гемисольвате составляло 5,1 мас.%.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме образца PP415-P12 (фиг. 101) показана потеря ~4,9 мас.% этанола (со следовыми количествами воды) при повышении температуры с 25 до 250°C, большая часть которой произошла на стадии с ~160 до 190°C. Разложение начиналось при T>250°C. Теоретическое содержание этанола (так как = 78°C) в гемисольвате составляло 4,0 мас.%.

Таким образом, образцы 3 класса, вероятно, являлись изоструктурными сольватами 2PrOH, этанола и, вероятно, ацетона с прочно связанным растворителем. Они могли соответствовать стехиометрическим гемисольватам. В то же время нельзя исключить, что эти формы являлись нестехиометрическими сольватами.

Поскольку спектры комбинационного рассеяния и порошковые рентгеновские дифрактограммы в пределах данного класса были очень похожи друг на друга, структуры моли быть практически идентичны, за исключением небольших искажений размеров элементарной ячейки или небольших изменений положений атомов в пределах элементарной ячейки вследствие встраивания различных молекул растворителя.

Таблица 21

Эксперименты по кристаллизации, приведшие к получению твердого материала 3 класса

Образец	Способ	Растворитель/ Смесь	Оценка характеристик	Высушивание
РР415Р6	уравн. суспензии	2РгОН	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	X
РР415Р12	уравн. суспензии	9:1 EtOH/H2O	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	-
РР415Р20	медленное охлаждение	~2:1 ацетон/Н20	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция	-

j. Эксперименты по высушиванию образцов 3 класса

Один из образцов 3 класса (PP415-P6), полученный в ходе эксперимента по уравновешиванию суспензии в 2PrOH, высушивали (как и PP415-P25) в вакууме в течение нескольких дней (2-20 мбар, от кт до 60°C, табл. 22).

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме указанного высушенного материала 3 класса, образца PP415-P25 (фиг. 102), показана потеря ~5,4 мас.% 2PrOH при повышении температуры с 50 до 250°C, большая часть которой произошла на стадии повышения с 170 до 190°C, еще одна потеря ~1,0 мас.% 2PrOH при повышении температуры с 290 до 320°C, и разложение при Т>320°С. По сравнению с ТГ-ИК-Фурьетермограммой исходного образца 3 класса PP415-P6 (фиг. 103) с содержанием растворителя ~5,4 мас.% 2PrOH значительного снижения содержания растворителя, по-видимому, не произошло.

В дальнейшем указанный материал высушивали (как и PP415-P33, табл. 22) в течение трех дней в глубоком вакууме и при повышенных температурах (<1х10^-3 мбар, 80°C) с целью десольватации сольвата и получения несольватированной, безводной формы 63415.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме следующего высушенного материала 3 класса, образца PP415-P33 (фиг. 103) показана потеря ~4,2 мас.% 2PrOH при повышении температуры с 50 до 210°C, большая часть

- 64 030468

которой произошла на стадии повышения с 160 до 190°C, еще одна потеря ~0,5 мас.% 2PrOH при повышении температуры с 210 до 290°C, и разложение при Т>290°С

По сравнению с содержанием растворителя в образцах PP415-P6 и PP415-P25 содержание растворителя снизилось только с ~5,4 до ~4,8 мас.%.

Таблица 22

Эксперименты по высушиванию образцов 3 класса

Исходный материал	Высушивание	Высушенный материал
Образец	Содержание растворителя	Условия	Образец	Содержание растворителя	Класс
РР415-Р6	2PrOH (-5,4%)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 510 мбар, 2x1 ч; 40-50°С, 5-20 мбар, ~1 сут.	РР415-Р25	2РгОН (-5,4%)	3
РР415-Р25	2РгОН (-5,4%)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	РР415-РЗЗ	2РгОН (-4,8%)	3

Спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием 3 класса (образца PP415-P6), высушенного материала 3 класса (образца PP415-P25) и следующего высушенного материала 3 класса (образца PP415-P33) были идентичны и не изменились (фиг. 104).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы 3 класса (образца PP415-P6) и следующего высушенного материала 3 класса (образца PP415-P33) не демонстрировали существенных различий, в то же время было несколько небольших сдвигов и отличий от дифрактограммы изначально высушенного материала 3 класса (образца PP415-P25, фиг. 105). Все дифрактограммы соответствовали 3 классу.

Поскольку высушивание не оказывало большого влияния на содержание растворителя, не удивительно, что спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковые рентгеновские дифрактограммы высушенных материалов не демонстрировали различий по сравнению с невысушенным материалом.

Таким образом, 3 класс являлся классом изоструктурных сольватов (2PrOH, этанола и, вероятно, ацетона) с очень прочно связанными молекулами растворителя, которые можно было удалить лишь частично (с ~5,4 до ~4,8 мас.%) при используемых условиях высушивания (до 3 сут. при 1х10^-3 мбар и 80°C).

k. Класс 4 - сольват ацетонитрила

Класс 4 получали только из смеси растворителей 7:3 MeCN/H₂O (табл. 23). Эксперимент, в результате которого получили материал 4 класса (PP415-P13), повторяли аналогично PP415-P35 для получения дополнительного количества материала для дальнейших исследований высушивания.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием (фиг. 72) и картина порошковой рентгеновской дифракции (фиг. 75) 4 класса (образца PP415-P13) значительно отличались от спектров и дифрактограмм 2, 3 и 5 классов.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме 4 класса (образца PP415-P13, фиг. 106) показана потеря ~3,4 мас.% MeCN (со следовыми количествами воды) при повышении температуры с 25 до 270°C, большая часть которой произошла на стадии с ~180 до 210°C. Разложение начиналось при T>270°C. Перед экспериментами с использованием ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии образцы подвергали краткосрочному высушиванию (в течение ~5 мин) в вакууме (10-20 мбар) для удаления избытка несвязанного растворителя. Теоретическое содержание MeCN (так как = 81°C) в гемисольвате составляло 3,6 мас.%.

- 65 030468

Таблица 23

Эксперименты по кристаллизации, приведшие к получению твердого материала 4 класса

Образец	Способ	Растворитель	Оценка характеристик	Высушивание
РР415Р13	уравновешивание суспензии	7:3 MeCN/H2O	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	X
РР415Р35	уравновешивание суспензии	7:3 MeCN/H2O	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	X

1. Эксперименты по высушиванию материалов 4 класса

Образцы 4 класса, полученные в ходе эксперимента по уравновешиванию суспензии в смеси ~7:3 MeCN/H₂O, высушивали в вакууме в течение нескольких суток или в потоке азота (табл. 24).

Таблица 24

Эксперименты по высушиванию образцов 4 класса

Исходный материал	Высушивание	Высушенный материал
Образец	Содержание растворителя	Условия	Образец	Содержание растворителя	Класс
РР415Р13	MeCN (-3,4%)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 4050°С, 5-20 мбар, ~1 сут.	РР415Р26	MeCN (-2,8%)	4
РР415Р35	MeCN (-2,9%)	80°С, <1х10_3 мбар, 3 сут.	РР415Р36	MeCN/H2Oa (-0,6%)	4
РР415Р35	MeCN (-2,9%)	80°С, поток N2, 3 сут.	РР415Р37	MeCN/H2Oa (-0,9%)	4

растворители, возможно, содержали MeCN и H₂O, однако опредеa

ление было затруднено вследствие их небольшого количества.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием высушенного материала 4 класса (PP415-P26) был идентичен спектру 4 класса (PP415-P13, фиг. 107).

Порошковая рентгеновская дифрактограмма высушенного материала 4 класса (PP415-P26) демонстрировала лишь очень небольшие отличия от дифрактограммы 4 класса образца PP415-P13 (фиг. 108). Некоторые пики выглядели более выраженными, а интенсивности пиков - повышенными. Аморфизации не наблюдали. Дифрактограмма PP415-P26 соответствовала 4 классу.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме высушенного материала 4 класса, образца PP415-P26 (фиг. 109) показана потеря ~2,8 мас.% MeCN при повышении температуры со ~170 до ~250°C и разложение при T>300°C. По сравнению с ТГ-ИК-Фурье-термограммой образца PP415-P13 (фиг. 106), содержание растворителя в образце снизилось с 3,4 до 2,8 мас.%.

Таким образом, образец, по-видимому, являлся частично десольватированным сольватом. Ввиду

- 66 030468

недостатка материала, оставшегося для второго эксперимента по высушиванию с последующей оценкой характеристик, эксперимент PP415-P13 повторяли (аналогично PP415-P35). Получали дополнительное количество материала 4 класса и выполняли два эксперимента по высушиванию с использованием указанного свежеполученного материала:

PP415-P36: высушивание в вакууме (<1х10^-3 мбар) при 80°C в течение трех суток;

PP415-P37: высушивание в потоке N2 при 80°C в течение трех суток.

Спектры комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием указанных высушенных образцов 4 класса (PP415-P36 и -Р37) соответствовали спектру 4 класса (т.е. PP415-P35, фиг. 110).

Порошковые рентгеновские дифрактограммы (фиг. 111) материала 4 класса (образца PP415-P35) и высушенных образцов 4 класса (образцов PP415-P36 и PP415-P37) были идентичны. Высушенные образцы являлись кристаллическими.

На ТГ-ИК-Фурье-термограммах этих высушенных образцов 4 класса (фиг. 112 для PP415-P36 и фиг. 113 для PP415-P37) показано лишь небольшое содержание растворителя (MeCN и/или H₂O) ~0,6 и ~0,9 мас.% для PP415-P36 и Р37-РР415, соответственно, в две стадии при повышении температуры с 25 до 280°C. Растворители, возможно, содержали MeCN и Н₂О, однако определение было затруднено вследствие их небольшого количества. Разложение начиналось при T>280°C.

Таким образом, большую часть растворителя из данного сольвата можно было удалить без разрушения кристаллической структуры. Получили кристаллическую несольватированную форму (или, скорее, десольватированный сольват).

m. Дальнейшая оценка характеристик высушенного и десольватированного материала 4 класса

Высушивание материала 4 класса (сольвата MeCN) приводило к получению десольватированного сольвата с содержанием растворителя, пониженным до <1 мас.% (ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия).

Изменений в структуре при десольватации не произошло (спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковая рентгеновская дифракция). Значительной потери кристалличности не наблюдали.

Таким образом, получили единственную известную на сегодняшний день несольватированную кристаллическую форму 63415.

Дальнейшие характеристики этого десольватированного материала 4 класса оценивали с помощью ДСК и динамической сорбции паров.

На изотерме динамической сорбции паров (фиг. 114) показано, что во время начального уравновешивания при 50% относительной влажности происходил прирост массы ~0,4 мас.%. Во время измерения происходила постепенная обратимая потеря массы ~1,3 мас.% при понижении относительной влажности от 50 до 0%. Достигалось равновесие. При повышении относительной влажности до 95% наблюдался постепенный прирост массы ~0,8 мас.% (по сравнению с равновесной массой при относительной влажности 50%). Достигалось равновесие. После снижения относительной влажности до 50% конечная масса была на 0,1 мас.% ниже уравновешенной исходной массы. Увеличение массы на ~0,7 мас.% при повышении относительной влажности с 50 до 85% классифицировало образец как слегка гигроскопичный.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма образца после измерения не изменялась по сравнению с дифрактограммой до измерения (фиг. 115).

На ДСК-термограмме образца десольватированного материала 4 класса (фиг. 116) показано отсутствие стеклования, характерного для аморфной формы, которое должно было наблюдаться при ~150°C, вместо этого присутствовал острый эндотермический пик с максимумом при T=196,1°C (ΔΗ=29,31 Дж/г), вероятно, соответствующий плавлению, и отсутствие разложения вплоть до 270°C.

Кроме того, был проведен ДСК-эксперимент со смесью ~1:1 аморфного материала 1 класса и десольватированного материала 4 класса с целью исследования возможности преобразования и кристаллизации аморфного материала в десольватированный материал 4 класса; указанное событие ожидалось (если вообще могло произойти) выше температуры стеклования аморфной формы T_g==150°C) и ниже плавления десольватированного материала 4 класса (T_m=196°C).

На ДСК-термограмме смеси (фиг. 117) показано эндотермическое событие с пиком при T=156,7°C (ΔΗ=1,47 Дж/г) и второе эндотермическое событие с пиком при 197,0°C (ΔΗ=14,1 Дж/г). Первое событие могло относиться к аморфному материалу (стеклование при T_g==150°C). Второе событие могло соответствовать плавлению десольватированного материала 4 класса при T_m=196°C. Теплота плавления (ΔΗ=14,1 Дж/г) смеси хорошо коррелировала с половиной теплоты плавления (ΔΗ=29,3 Дж/г) чистого десольватированного материала 4 класса.

Экзотермических событий в диапазоне температур между стеклованием и плавлением, соответствующих возможной кристаллизации аморфного материала, не наблюдали. Таким образом, преобразование аморфной формы в десольватированную форму 4 класса, по-видимому, в указанные сроки не происходило.

В еще одном ДСК-эксперименте с использованием смеси ~1:1 аморфного материала 1 класса и десольватированного материала 4 класса нагревание остановили при 173°C (между стеклованием и плавлением), чтобы дать время для возможной кристаллизации.

- 67 030468

На ДСК-термограмме смеси (фиг. 118) показано эндотермическое событие с пиком при T=161,4°C (ΔΙΙ 0,31 Дж/г) и второе эндотермическое событие с пиком при 201,4°C (ΔΉ=11,4 Дж/г). Как и в первом эксперименте, теплота плавления второго пика не увеличилась; указаний на преобразование аморфной формы в десольватированный материал 4 класса не наблюдали.

Искривленный исходный уровень (с -50 до 150°C), скорее всего, являлся артефактом (вследствие изогнутой крышки держателя образца).

n. Класс 5 - сольват ТГФ

Класс 5 получили только из смеси растворителей 1:1 ТГФ/HgO (табл. 25).

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием (фиг. 71) и картина порошковой рентгеновской дифракции (фиг. 75) 5 класса значительно отличались от спектров и дифрактограмм 2, 3 и 4 классов.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме 5 класса (образца PP415-P14, фиг. 119) показана потеря ~36,1 мас.% ТГФ и H2O при повышении температуры от 25 до 200°C, большая часть которой происходила на этапе повышения от ~100 до 130°C. Перед ТГ-ИК-Фурье-экспериментами образцы подвергали краткосрочному высушиванию (в течение ~5 мин) в вакууме (10-20 мбар) для удаления избытка несвязанного растворителя. Потеря ТГФ и H₂O происходила совместно в одном и том же интервале температур. Разложение начиналось при T>300°C. Теоретическое содержание ТГФ (так как = 66°C) в гемисольвате составляло 28,1 мас.%. К сожалению, поскольку содержание двух указанных компонентов невозможно количественно определить по отдельности, точное состояние сольватации определить не удалось.

Представлена подробная информация об эксперименте и оценке характеристик образцов PP415-P41 и PP415-P45.

Таблица 25

Эксперименты по кристаллизации, приведшие к получению твердого материала 5 класса

Образец	Способ	Растворитель	Оценка характеристик	Высушивание
РР415Р14	уравновешивание суспензии	1:1 ТГФ/Н2О	Спектроскопия комбинационного рассеяния, порошковая рентгеновская дифракция, ТГИК-Фурьеспектроскопия	X
РР415Р41ь	уравновешивание суспензии	1:1 ТГФ/Н2О	Порошковая рентгеновская дифракция	X
РР415Р45ь,с	уравновешивание суспензии	1:1 ТГФ/Н2О	Порошковая рентгеновская дифракция	X

^b исходный материал: PP415-P40, класс 2; во всех других экспериментах в данной таблице в качестве исходного материала использовали PP415P1, класс 1.

^c эксперимент с использованием 3 г вместо 100 мг.

о. Эксперименты по высушиванию образцов 5 класса

Образец 5 класса (PP415-P14), полученный в ходе эксперимента по уравновешиванию суспензии в смеси ~1:1 ТГФ/HgO, высушивали (как и PP415-P27) в вакууме в течение нескольких дней (2-20 мбар, от кт до 60°C, табл. 26).

- 68 030468

Таблица 26

Эксперименты по высушиванию образцов 5 класса

Исходный материал	Высушивание	Высушенный материал
Образец	Содержание растворителя	Условия	Образец	Содержание растворителя	Класс
РР415Р14	ТГФ и Н2О (~36 масс.%)	кт, ~3 мбар, ~5 сут.; 60°С, 5-10 мбар, 2x1 ч; 4050°С, 5-20 мбар, ~1 сут.	РР415Р27	(-0,3 масс.%)	1 ( + 5)а

^a в основном аморфный, лишь несколько широких пиков с низким соотношением сигнал/шум.

Спектр комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием высушенного материала (PP415-P27) отличался от спектра 5 класса (PP415-P14, фиг. 120) и из-за расширенных пиков больше напоминал спектр 1 класса аморфного исходного материала PP415-Р1.

Порошковая рентгеновская дифрактограмма высушенного материала 5 класса (PP415-P27) демонстрировала лишь несколько широких пиков низкой интенсивности с низким соотношением сигнал/шум, что указывало на низкую степень кристаллизации образца (фиг. 121). Некоторые из пиков могли соответствовать 5 классу, в то время как другие, т.е. пик при 7,35 °2Θ, являлись новыми или сдвинутыми.

На ТГ-ИК-Фурье-термограмме высушенного материала 5 класса (фиг. 122) показана потеря ~0,3 мас.% при повышении температуры с 25 до 290°C и разложение при T>290°C. Образец был безводным.

Таким образом, при высушивании в вакууме материал терял растворитель, а также большую часть кристалличности.

8. Эксперименты по получению аморфной формы

Эксперименты с целью получения аморфной формы 1 класса проводили с использованием материала 2 класса (PP415-P40, табл. 8) в качестве исходного материала. Испытывали несколько стратегий и способов:

Преобразование материала 2 класса в материал 5 класса с последующим высушиванием материала 5 класса с целью получения аморфной формы 1 класса.

Получение аморфной формы 1 класса непосредственно из материала 2 класса (при возможности), используя растворители ICH 3 класса.

Из материала 2 класса с помощью двустадийного способа через получение материала 5 класса получили в основном аморфный материал в масштабе 100 мг и 3 г.

Дальнейшие эксперименты проводили с целью упростить процедуру до одностадийного способа для исключения растворителя ICH 2 класса ТГФ и для получения полностью аморфного материала. Обнаружено, что наиболее перспективным способом являлось осаждение из раствора ацетона на холодной водяной бане. Указанный прямой способ давал намного лучшие результаты, чем двустадийный способ через материал 5 класса.

а. Получение аморфной формы через материал 5 класса

Эксперименты по кристаллизации с использованием материала 2 класса PP415-P40 в качестве исходного материала проводили с целью преобразования сольвата гептана в материал 5 класса (вероятно, сольват ТГФ), с последующим высушиванием материала 5 класса и получением аморфного материала (табл. 27).

Материал 5 класса считался хорошим интермедиатом, поскольку он легче поддавался десольватированию и аморфизации, чнм материалы 2 или 3 класса.

Таблица 27

Сводная информация об экспериментах, направленных на получение аморфной формы 1 класса через материал 5 класса

Стадия	Образец	Способ	Условия	Результаты
1	РР415Р41	уравн. суспензии	1:1 ТГФ/Н2О, 24°С, 3 сут.	5 класс

- 69 030468

	РР415Р45	уравн. суспензии	1:1 ТГФ/Н2О, кт 1 сут.	5 класс
2	РР415Р44а	высушивание	100 мбар, 80°С, 2 сут.	класс 1а; 0,9 масс.% ТГФ
	РР415Р4ба	высушивание	100 мбар, 80°С, 4 сут.	класс 1а; 0,4 масс.% Н2О

^a в основном аморфный, лишь несколько широких пиков с низким соотношением сигнал/шум.

b. Этап 1: преобразование материала 2 класса в материал 5 класса

Преобразование сольвата гептана 2 класса в сольват ТГФ 5 класса успешно провели путем суспендирования материала 14415-140 (сольвата гептана) в смеси (1:1) ТГФ/II₂O и уравновешивания суспензии при кт. (PP415-P41, масштаб 100 мг). Полученный твердый материал соответствовал сольвату ТГФ 5 класса (фиг. 123).

Первый эксперимент по повышению масштаба с мг до г (х30, т.е. масштаб 3 г) провели аналогично PP415-P41: исходный сольват гептана 2 класса (PP415-P40) уравновешивали в ТГФ/^O (1:1) в течение суток и успешно преобразовывали в сольват ТГФ 5 класса (PP415-P45, фиг. 124).

c. Этап 2: амортизация материала 5 класса путем высушивания

Материал 5 класса (сольват ТГФ) высушивали при повышенной температуре (80°C) в вакууме (~100 мбар), учитывая условия, которые можно было использовать на сайте API MFG.

После высушивания материала PP415-P41, полученного в эксперименте с масштабом 100 мг, в течение суток при 80°C и 100 мбар, он преобразовывался главным образом в аморфный материал (PP415P44, фиг. 125). Порошковая рентгеновская дифрактограмма демонстрировала лишь несколько широких пиков низкой интенсивности. После дополнительного высушивания (80°C, 100 мбар) в течение ночи интенсивность указанных широких пиков еще больше снижалась (PP415-P44a). ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия указанного материала демонстрировала постепенную потерю ~0,9 мас.% ТГФ (со следовыми количествами воды) при повышении температуры с 25 до 280°C и разложение при T>300°C (фиг. 126). Материал PP415-P45, полученный в эксперименте с масштабом 3 г, также высушивали при 80°C и 100 мбар (аналогично PP415-T46). Он преобразовывался в течение ночи в главным образом аморфный материал с лишь несколькими широкими пиками низкой интенсивности (фиг. 127). Через в общей сложности четыре дня высушивания (80°C, 100 мбар) указанные широкие пики по-прежнему присутствовали (-P46a, фиг. 128). ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия указанного материала демонстрировала отсутствие ТГФ, но постепенную потерю ~0,4 мас.% воды при повышении температуры с 25 до 250°C, и разложение при T>250°C (фиг. 129).

d. Прямое получение аморфной формы

Получение аморфной формы из материала 2 класса с помощью двустадийного способа через получение материала 5 класса было в основном (но не полностью) успешным. Поэтому дальнейшие эксперименты проводили с целью упростить процедуру до одностадийного способа для исключения использования растворителя ICH 2 класса ТГФ и для получения полностью аморфного материала (табл. 28).

Аморфную форму 1 класса получали непосредственно из материала 2 класса в эксперименте по выпариванию раствора материала 2 класса в ТГФ в потоке N2 (PP415-P42, фиг. 129).

С целью имитации не полностью высушенного сольвата гептана/гексана со значительным количеством остаточного растворителя выполнили выпаривание раствора материала 2 класса в смеси 8:2 ТГФ/гексан (гексан использовали вместо гептана для аналогичной температуры кипения в смеси растворителей). Однако полученное твердое вещество соответствовало материалу 2 класса, класса изоструктурных сольватов, а не 5 класса (PP415-P43, фиг. 130).

Для исключения использования растворителя ICH 2 класса ТГФ эксперименты по выпариванию проводили в растворителях ICH 3 класса.

Выпаривание раствора 2 класса в EtOAc в потоке N₂ приводило к получению кристаллического материала с порошковой рентгеновской дифрактограммой, соответствующей 2 классу (PP415-R47, фиг. 130). На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 80) показана типичная для 2 класса двустадийная потеря массы (в общей сложности ~7,9 мас.% EtOAc) при температурах до 240°C, что указывало на очень прочную связь молекул растворителя.

Выпаривание в этилформиате также приводило к получению кристаллического материала 2 класса, а не аморфной формы (PP415-P48, фиг. 131). На ТГ-ИК-Фурье-термограмме (фиг. 78) показана потеря ~3,5 мас.% этилформиата, вначале постепенная, а затем с четким переходом между 180°C и 200°C. Возможно, имела место дальнейшая потеря этилформиата, сопутствующая разложению при T>240°C.

В то же время материал 2 класса успешно преобразовали в аморфную форму 1 класса путем добавления раствора в ацетоне на холодную (5°C) водяную баню (PP415-P49, фиг. 132).

- 70 030468

Указанный прямой способ получения аморфной формы давал лучшие результаты и являлся более перспективным, чем двустадийный процесс.

Таблица 28

Сводная информация об экспериментах, направленных на получение аморфной формы непосредственно из исходного материала 2 класса

Образец	Способ	Растворитель	Условия	Результат
РР415Р42	выпаривание	ТГФ	ПОТОК N2, 1 сут.	1 класс
РР415Р43	выпаривание	8:2 ТГФ/гексан	ПОТОК N2, 1 сут.	2 класс
РР415Р47	выпаривание	EtOAc	ПОТОК N2, 1 сут.	2 класс
РР415Р48	выпаривание	этилформиат	ПОТОК N2, 1 сут.	2 класс

РР415Р49

осаждение

ацетон

баня Н2О при 5°С

1 класс

9. Приборы - типичные условия измерения

Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием. Bruker RFS100 с программным обеспечением OPUS 6,5; Nd:YAG возбуждение при 1064 нм, Ge детектор, диапазон 3500-100 см^-1;

типичные условия измерения: номинальная мощность лазера 100-300 мВт, 64-128 сканирований, разре-1

шение 2 см .

Порошковая рентгеновская дифракция: Stoe Stadi P; детектор Mythen1K; Cu-Ka-радиация; стандартные условия измерения: пропускание; мощность трубки 40 кВ и 40 мА; изогнутый Ge монохроматор; размер шага 0,02 °2Θ, время шага 12 с или 60 с, диапазон сканирования 1,5-50,5 °2Θ или 1,0-55 °2Θ; режим детектора: пошаговое сканирование; шаг детектора 1 °2Θ или 6 °2Θ; стандартная пробоподготовка: 10-20 мг образца помещали между двумя ацетатными пленками; держатель образца: держатель образца Stoe для пропускания; образец вращали во время измерения.

ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия. Термомикровесы Netzsch Thermo-Microbalance TG 209 со спектрометром Bruker FT-IR Spectrometer Vector 22; алюминиевый тигель (с микроотверстием), атмосфера N₂, скорость нагревания 10 К/мин, диапазон 25-250°C или 25-350°C.

ДСК. ДСК Perkin Elmer 7; золотые тигли (закрытые или с микроотверстием), образец заполняли в среде N₂, скорость нагревания 10 К/мин, диапазон от -50 до 250°C или 350°C, периодическое быстрое охлаждение (при -200 К/мин) до -50°C между сканированиями.

Динамическая сорбция паров. Projekt Messtechnik Sorptions Prufsystem SPS 11-100n или Surface Measurement Systems DVS-1. Образец помещали на алюминиевый или платиновый держатель в верхней части микровесов и позволяли уравновеситься в течение 2 ч при 50% относительной влажности до осущетвления заранее заданной программы изменения влажности:

(1) 50^0% относительной влажности (5%/ч); 5 ч при 0% относительной влажности;

(2) 0^95% относительной влажности (5%/ч); 5 ч при 95% относительной влажности;

(3) 95^50% относительной влажности (5%/ч); 2 ч при 50% относительной влажности.

Гигроскопичность классифицировали на основании прироста массы при 85% относительной влажности по сравнению с исходной массой следующим образом: сильно гигроскопичный (адсорбирует достаточно воды для образования жидкости), очень гигроскопичный (прирост массы >15%), гигроскопичный (прирост массы <15%, но >2%), слегка гигроскопичный (прирост массы <2%, но >0,2%) или негигроскопичный (прирост массы <0,2%).

Растворители. Для всех экспериментов использовали растворители аналитического качества Fluka, Merck или ABCR.

Определение приблизительной растворимости. Приблизительную растворимость определяли путем пошагового разбавления суспензии приблизительно 10 мг вещества в 0,05 мл растворителя. Если вещество не растворялось при добавлении в общей сложности >10 мл растворителя, растворимость обозначали как <1 мг/мл. Вследствие экспериментальной ошибки, присущей этому способу, значения растворимости следует рассматривать как приблизительные и использовать исключительно для планирования экспериментов кристаллизации.

Определение химической стабильности. Получали четыре образца по 1,0 мг материала PP415-P1 в 1,0 мл соответствующего растворителя. Полученные суспензии/растворы уравновешивали на качалке Eppendorf Thermomixer Comfort с контролируемой температурой в течение 7 сут., 2 сут., 24 ч и 6 ч при 25°C и скорости встряхивания 500 об/мин. При необходимости твердую фазу отделяли фильтрующим центрифугированием (0,5-мкм ПВДФ-мембрана). Фильтраты разводили в разбавителе (0,1% муравьиной

- 71 030468

кислоты в MeCN) до концентраций <0,2 мг/мл (неизвестных и, вероятно, более низких, чем концентрации суспензий) и исследовали с помощью способа ВЭЖХ, приведенного в табл. 29.

В качестве эталона материал PP415-P1 разводили в разбавителе до концентрации 0,25 мг/мл и добавляли в начале и конце последовательности ВЭЖХ.

Результаты ВЭЖХ.

Таблица 29

Способ ВЭЖХ, использованный для определения химической стабильности

Колонка	Zorbax Eclipse XDB-C18, 3x150 мм, 5 мкм (СС19)
Элюент А	Н2О+0,1% муравьиная кислота
Элюент В	MeCN+0,1% муравьиная кислота
Градиент	0 нг 10,0 мин 15,0 мин 15,1 мин 20,0 мин	50% А 10% А 0% А 50% А 50% А	50% В 90% В 100% В 50% В 50% В
Поток	0,75 мл/мин
Вводимый объем	10 мкл
Длина волны	254 нм, 242 нм, 210 нм
Время обнаружения	2 0 мин
Время прогона	2 0 мин
Температура колонки	25°С
Время удерживания	8,9-9,0 мин

Методики:

ппк

Сокращения

ДСК

DVS

FT Raman

Фурье-преобразованием

анализ площади под кривой

дифференциальная сканирующая калориметрия динамическая сорбция паров

спектроскопия комбинационного рассеяния с

^-ЯМР

спектроскопия ядерного магнитного резонанса

протонов

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

PXRD порошковая рентгеновская дифракция

ТГ-ИК-Фурье (TG-FTIR) термогравиметрия в сочетании

с инфракрасной спектроскопией с Фурье-преобразованием

- 72 030468

Химические соединения:

IBuOH 1-бутанол

СТАВ цетилтриметиламмоний-бромид

ДХМ дихлорметан

DEE диэтиловый эфир

ДМФ ΝφΝ-диметилформамид

EtOAc этилацетат

EtOH этанол

IPE изопропиловый эфир

MeCN ацетонитрил

МЕК метилэтилкетон

МеОН метанол

ПЭГ пропиленгликоль

ПТФЭ политетрафторэтилен, тефлон

2РгОН 2-пропанол, изопропанол

ДСН додецилсульфат натрия

ТВМЕ трет-бутилметиловый эфир

ТЭА триэтиламин

ТГФ тетрагидрофуран

Твин-80 сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена (80) полисорбат-80

Гены, белки и биологические параметры:

AIM антиоксидантный модулятор воспаления

Akrlcl 1 член 1 семейства альдо-кеторедуктаз

ЩФ щелочная фосфатаза

АЛТ аланинтрансфераза

ARE элемент антиоксидантного ответа

ACT аспартаттрансфераза

ППК площадь под кривой

BAL бронхоальвеолярный лаваж

BALF жидкость бронхоальвеолярного лаважа

Bil билирубин

- 73 030468

BUN

ХОБЛ

ЦОГ-2

Cr

CYP450

Eh-1

G6PD

Gclc

субъединица

Gclm

субъединица

Ggtl

Glrx

Glu

GOT

GPT1

Gpx3

GSH

GSR

GSs

GST

GSTal

GSTpl

Гр

H6PD

hERG

HMOX1

HO-1

IFNy

ИЛ

iNOS

азот мочевины в крови

хроническая обструктивная болезнь легких циклооксигеназа-2

креатин

цитохром Р450

эпоксидгидролаза 1

глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа

глутамат-цистеинлигаза, каталитическая

глутамат-цистеинлигаза, модификаторная

гамма-глутамилтрансфераза

глутаредоксин-1

глюкоза

глутамат-оксалоацетаттрансаминаза

глутамат-пируваттрансаминаза

глутатионпероксидаза 3

глутатион

глутатионредуктаза

глутатионсинтетаза

глутатион S-трансфераза

глутатион S-трансфераза альфа 1

глутатион S-трансфераза пи 1

грей

гексозо-б-фосфатдегидрогеназа

ген человека, связанный с калиевым каналом гемоксигеназа (раскрывающая цикл) 1

гемоксигеназа

интерферон-гамма

интерлейкин

индуцибельная синтаза оксида азота

ΙκΒα альфа-ингибитор ядерного фактора энхансера

гена легкого каппа-полипептида в В-лимфоцитах

КС белок мыши, родственный IL-8

Keapl Kelch-подобный ЕСН-связанный белок-1

- 74 030468

лпс	липополисахарид
МЕ1	яблочный фермент 1
МРСЕ	микроядерные полихроматические эритроциты
MRP	белок, связанный с metG
Мгр	белок множественной устойчивости к

лекарственным препаратам

NADPH	никотинамидадениндинуклеотидфосфат,
восстановленный
NFkB	ядерный фактор энхансера легкой каппа-цепи

активированных В-клеток

N0	оксид азота
NQO1	NAD(Р)Н-хинон-оксидоредуктаза 1
Nrf2	аналог 2 эритроидного ядерного фактора
ρ-ΙκΒα	фосфорилированный 1кВсс
МКПК	мононуклеарные клетки периферической крови
РСЕ	полихроматические эритроциты
PGD	фосфоглюконатдегидрогеназа
ΡΜΝ	полиморфноядерный
RANTES	белок, экспрессируемый и секретируемый

регулируемыми и нормальными Т-клетками

S0D1	супероксиддисмутаза 1
SRXN1	сульфиредоксин-1
TG	общие глицериды
ТКТ	транскетолаза
ФНОа	фактор некроза опухолей альфа
Тхп	тиоредоксин
TXNRD1	тиоредоксинредуктаза 1
хСТ	11 член 7 семейства переносчиков

растворенных веществ

Разное:
API	активный фармацевтический ингредиент
aq.	водный
τ. к.	температура кипения
крист.	кристаллический
разл.	разложение
сут.	сутки (суток)
экв.	эквивалент
уравн.	уравновешивание
выпар.	выпаривание
ч	час(ы)
мат. :	материал
мин	минута(ы)
т.п.	температура плавления
MS	молекулярные сита
част.	частично
осажд.	осаждение
о. в.	относительная влажность
об/мин	оборотов в минуту
кт	комнатная температура (~25°С)
S/N	сигнал/шум (соотношение)

- 75 030468

раст. растворитель

сусп. суспензия

Т температура

Т_g температура стеклования

теор. теоретический

виз. набл. визуальное наблюдение

нед. неделя (недель)

масс.% массовый процент

Дополнительные таблицы.

Таблица 30

Список образцов и проведенных экспериментов

Образец	Экспериментальное описание	Способы анализа	Результат/замечания
		Спектроскопия	Спектроскопия
		комбинационного	комбинационного рассеяния с
		рассеяния с	Фурье-преобразованием:
		Фурье-	используется в качестве
		преобразованием:	эталона для Р1
		РР415Р1.0	Порошковая рентгеновская
		РР415Р1.1	дифракция: аморфное
		Порошковая	соединение, картина пиков,
	получили ~5 г 63415, № партии 0141-	рентгеновская	характерная для кристаллов,
РР415-Р1	66-1, 25 марта 2011 г.; М = 554,7	дифракция: 117а	отсутствует
	г/моль, C33H44F2N2O3	ТГ-ИК-Фурье-	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
		спектроскопия:	потеря ~0,9 масс.% (~0, 1
		а4285	экв.) EtOH со следовыми
		1Н-ЯМР: МагЗО-	количествами Н2О с 25°С до
		2011-ktr/30	200°С, разложение при Т>290°С
		ДСК: d_9840	±Н-ЯМР: в соответствии со
		Динамическая	структурой, ~0,08 экв.
		сорбция паров:	Этанол
		#0305_02	ДСК: 1-е сканирование:

						Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-	Тд=152,7°С (ЛСр=0,72 Дж/г°С) ; 2-е сканирование: Тд=149,7°С (ЛСр=0,45 Дж/г°С) Динамическая сорбция паров: слегка гигроскопическое; Лш=+0,4% (50%^85% о.в.); общий прирост массы 2,1 масс.% при изменении относительной влажности от
преобразованием
после динамической сорбции паров: PP415Pl_aDVS Порошковая рентгеновская дифракция после
0% до 95%. Спектроскопия комбинационного рассеяния с
						динамической	Фурье-преобразованием и
						сорбции паров:	порошковая рентгеновская
						179а	дифракция после динамической
							сорбции паров: без изменений
	хранили	материал	РР415-Р1	при 2 5°С в	Порошковая	Порошковая рентгеновская
	открытом виде		над	насыщенным	рентгеновская	дифракция: все образцы
	раствором NH4NO3	(т.е.	при ~62%	дифракция: 132а	аморфные, соответствовали Р1
РР415-Р2					(-Р2а) 191а (-
	о . в . ) ;	образцы	исследовали через 1
	нед. (РР415-Р2а)	, 2	нед.	(РР415-Р2Ь)	Р2Ь) 262а (-Р2с)
	и 4 нед.	. (РР415-Р2с)

- 76 030468

РР415-РЗ	хранили материал РР415-Р1 при 40°С в открытом виде над насыщенным раствором NaCl (т.е. при ~75% о.в.); образцы исследовали через 1 нед. (РР415-РЗа) , 2 нед. (РР415-РЗЬ) и 4 нед. (РР415-РЗс).	Порошковая рентгеновская дифракция: 133а (-РЗа) 192а (РЗЬ) 263а (-РЗс)	Порошковая дифракция: аморфные, соо1]	рентгеновская все образцы гветствовали Р1
	хранили материал РР415-Р1 при 6О°С в	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	закрытом контейнере; образцы	рентгеновская	дифракция:	все образцы
РР415-Р4	исследовали через 1 нед. (РР415-Р4а),	дифракция: 134а	аморфные, соответствовали Р1
	2 нед. (РР415-Р4Ь) и 4 нед. (РР415-	(-Р4а) 193а (-
	Р4с) .	Р4Ь) 264а (-Р4с)
	хранили материал РР415-Р1 при 80°С в	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	закрытом контейнере; образцы	рентгеновская	дифракция:	все образцы
РР415-Р5	исследовали через 1 нед. (РР415-Р5а),	дифракция: 135а	аморфные, соответствовали Р1
	2 нед. (РР415-Р5Ь) и 4 нед. (РР415-	(-Р5а) 194а (-
	Р5с) .	Р5Ь) 265а (-Р5с)
РР415-Р6	суспендировали 97,7 мг РР415-Р1 в 0,4 мл 2РгОН; получали белую суспензию; уравновешивали суспензию при 22°С, встряхивая при 400 об/мин; поэтапно добавляли в общей сложности 0,5 мл растворителя в ближайшие пару дней;	Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием: РР415Р6.0 Порошковая	Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием: соответствует 3 классу Порошковая рентгеновская дифракция: соответствует 3 классу

	через 15 сут. выделяли твердый	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	материал фильтрационным	дифракция: 225а	потеря ~5,4 масс.% 2РгОН при
	центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-	ТГ-ИК-Фурье-	изменении температуры с 25°С
	мембраны); материал исследовали с	спектроскопия:	до 250°С, большая часть
	помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковой рентгеновской дифракции; материал высушивали в течение 5 мин в вакууме (10-20 мбар); материал исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурьеспектроскопии.	а4323	которой произошла на стадии с ~170°С до 190°С; разложение начиналось при Т>250°С
	суспендировали 104,3 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	0,6 мл смеси 1:2 EtOAc/гептан;	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	получали белую суспензию;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	уравновешивали суспензию при 22°С,	Фурье-	соответствует 2 классу
	встряхивая при 400 об/мин; поэтапно	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
РР415-Р7	добавляли в общей сложности 0,2 мл	РР415Р7.0	дифракция: соответствует 2
	смеси растворителей в ближайшие пару	Порошковая	классу
	дней; через 15 сут. выделяли твердый	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	материал фильтрационным	дифракция: 227а	потеря ~7,5 масс.% EtOAc и
	центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-	ТГ-ИК-Фурье-	гептана в две стадии при
	мембраны); материал исследовали с	спектроскопия:	изменении температуры с
	помощью спектроскопии комбинационного	а4338	~100°С до 290°С; разложение

- 77 030468

	рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковой рентгеновской дифракции; материал высушивали в течение 5 мин в вакууме (10-20 мбар); материал исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурьеспектроскопии.		начиналось при	Т>290°С
	суспендировали 102,0 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	0,4 мл смеси 1:2 ацетон/гексан;	комбинационного	комбинационного	рассеяния	с
	получали белую суспензию;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	уравновешивали суспензию при 22°С,	Фурье-	соответствует 2	классу
	встряхивая при 400 об/мин; поэтапно	преобразованием:	Порошковая	рентгеновская
	добавляли в общей сложности 0,2 мл	РР415Р8.0	дифракция: соответствует	2
РР415-Р8	смеси растворителей в ближайшие пару	Порошковая	классу
	дней; через 15 сут. выделяли твердый	рентгеновская
	материал фильтрационным	дифракция: 228а
	центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-
	мембраны); материал исследовали с
	помощью спектроскопии комбинационного
	рассеяния с Фурье-преобразованием и
	порошковой рентгеновской дифракции.
	суспендировали 102,6 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
РР415-Р9	0,4 мл смеси 1:3 толуол/диэтиловый	комбинационного	комбинационного	рассеяния	с
	эфир; получали белую суспензию;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:

	уравновешивали суспензию при 22°С,	Фурье-	соответствует 2 классу,
	встряхивая при 400 об/мин; поэтапно	преобразованием:	содержит сигналы
	добавляли в общей сложности 0,2 мл смеси растворителей в ближайшие пару дней; через 15 сут. выделяли твердый материал фильтрационным центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭмембраны); материал исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием.	РР415Р9.0	растворителя
	суспендировали 102,5 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	0,2 мл смеси 1:3 МеОН/ТВМЕ; получали	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	прозрачный раствор; уравновешивали	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	раствор при 22°С, встряхивая при 400	Фурье-	соответствует 2 классу
	об/мин; через 1 сут. наблюдали густую	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	суспензию; добавляли 0,2 мл смеси	РР415Р10.0	дифракция: соответствует 2
РР415-Р10	растворителей; продолжали уравновешивать суспензию при 22°С, встряхивая при 400 об/мин; через в общей сложности 15 сут. выделяли твердый материал фильтрационным центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭмембраны); материал исследовали с	Порошковая рентгеновская дифракция: 229а	классу

- 78 030468

	помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковой рентгеновской дифракции.
	суспендировали 97,1 мг РР415-Р1 в 0,4	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл смеси 1:2 МЕК/циклогексан;	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	получали белую суспензию;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	уравновешивали суспензию при 22°С,	Фурье-	соответствует 2 классу,
	встряхивая при 400 об/мин; через 15	преобразованием:	содержит сигналы
РР415-Р11	сут. выделяли твердый материал фильтрационным центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-мембраны); материал исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием.	РР415Р11.0	растворителя
	суспендировали 98,6 мг РР415-Р1 в 0,2	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл смеси 9:1 EtOAc/H2O; получали	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	белую суспензию; уравновешивали	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	суспензию при 22°С, встряхивая при	Фурье-	соответствует 3 классу
РР415-Р12	400 об/мин; поэтапно добавляли в	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	общей сложности 0,2 мл смеси	РР415Р12.0	дифракция: соответствует 3
	растворителей в ближайшие пару дней;	Порошковая	классу
	через 15 сут. выделяли твердый	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	материал фильтрационным	дифракция: 230а	потеря ~4,9 масс.% EtOH (со

	центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-	ТГ-ИК-Фурье-	следовыми количествами воды)
	мембраны) ; материал исследовали с	спектроскопия :	при изменении температуры с
	помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковой рентгеновской дифракции; материал высушивали в течение 5 мин в вакууме (10-20 мбар); материал исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурьеспектроскопии.	а4324	25°С до 250°С, большая часть которой произошла на стадии со ~160°С до 190°С; разложение начиналось при Т>250°С
	суспендировали 95,9 мг РР415-Р1 в 0,2	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл смеси 7,3 MeCN/H2O; получали две	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	прозрачные раздельные фазы;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	уравновешивали раствор при 22°С,	Фурье-	соответствует 4 классу,
	встряхивая при 400 об/мин; через 1	преобразованием:	содержит сигналы
	сут. наблюдали густую суспензию;	РР415Р13.0	растворителя
РР415-Р13	добавляли 0,2 мл смеси растворителей;	Порошковая	Порошковая рентгеновская
	продолжали уравновешивать суспензию	рентгеновская	дифракция: соответствует 4
	при 22°С, встряхивая при 400 об/мин;	дифракция: 231а	классу
	через в общей сложности 15 сут.	ТГ-ИК-Фурье-	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	выделяли твердый материал	спектроскопия :	потеря ~3,4 масс.% MeCN (со
	фильтрационным центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-мембраны); материал исследовали с помощью спектроскопии	а4321	следовыми количествами воды) при изменении температуры с 25°С до 270°С, большая часть

- 79 030468

	комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием и порошковой рентгеновской дифракции; высушивали материал в течение 5 мин в вакууме (10-20 мбар); материал исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.		которой произошла на стадии со ~180°С до 210°С; разложение начиналось при Т>270°С
	суспендировали 95,8 мг РР415-Р1 в 0,2	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл смеси 9:1 ТГФ/Н2О; получали две	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	прозрачные раздельные фазы;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	уравновешивали раствор при 22°С,	Фурье-	соответствует 5 классу,
	встряхивая при 400 об/мин; через 1	преобразованием:	содержит сигналы
	сут. наблюдали одну прозрачную фазу;	РР415Р14.0	растворителя
	добавляли 0,2 мл Н2О; наблюдали белый	Порошковая	Порошковая рентгеновская
	осадок; уравновешивали суспензию при	рентгеновская	дифракция: соответствует 5
РР415-Р14	22°С, встряхивая при 400 об/мин;	дифракция: 232а	классу
	через в общей сложности 15 сут.	ТГ-ИК-Фурье-	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	выделяли твердый материал	спектроскопия:	потеря ~36,1 масс.% ТГФ и Н2О
	фильтрационным центрифугированием	а4322	при изменении температуры с
	(0,20 мкм ПТФЭ-мембраны); материал		25°С до 200°С, большая часть
	исследовали с помощью спектроскопии		которой произошла на стадии
	комбинационного рассеяния с Фурье-		с ~100°С до 130°С; разложение
	преобразованием и порошковой		начиналось при Т>300°С
	рентгеновской дифракции; высушивали

	материал в течение 5 мин в вакууме (10-20 мбар); материал исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.
	растворяли 100,6 мг РР415-Р1	в 0, 2 мл	Спектроскопия	Спектроскопия
	смеси 1:2 ДХМ/1 РЕ;	получали	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	прозрачный раствор;	наблюдали	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	осаждение белого твердого	вещества	Фурье-	соответствует 2 классу,
	через <1 мин; добавляли 0,2	мл смеси	преобразованием:	содержит сигналы
	растворителей; накрывали	флакон	РР415Р15.0	растворителя
	однослойной тканью и	оставляли	Порошковая	Порошковая рентгеновская
РР415-Р15	растворитель испаряться в	условиях	рентгеновская	дифракция: соответствует 2
	окружающей среды; через несколько часов получали влажный белый твердый материал; исследовали твердое вещество с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием и порошковой рентгеновской дифракции.	дифракция: 137а	классу
	растворяли 100,3 мг РР415-Р1	в 0, 2 мл	Спектроскопия	Спектроскопия
	сме си 1:2 Me ОН/толуол;	получали	комбинационного	комбинационного рассеяния с
РР415-Р16	прозрачный раствор; накрывали флакон	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	однослойной тканью и	оставляли	Фурье-	соответствует 1 классу,
	растворитель испаряться в	условиях	преобразованием:	содержит пики растворителя -

- 80 030468

	окружающей среды; через несколько суток получали стекловидный материал; исследовали материал с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием.	РР415Р16.0	толуола
	растворяли 101,0 мг РР415-Р1 в 0,3 мл	Спектроскопия	Спектроскопия
	смеси 1:3 EtOAc/гептан; получали	комбинационного	комбинационного	рассеяния с
	прозрачный раствор; наблюдали	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	осаждение белого твердого вещества	Фурье-	соответствует	2 классу,
	через <1 мин; добавляли 0,2 мл смеси	преобразованием:	содержит	сигналы
	растворителей; накрывали флакон	РР415Р17.0	растворителя
	однослойной тканью и оставляли	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
РР415-Р17	растворитель испаряться в условиях	рентгеновская	дифракция: соответствует 2
	окружающей среды; через несколько	дифракция: 138а	классу
	часов получали влажный белый твердый
	материал; исследовали твердое
	вещество с помощью спектроскопии
	комбинационного рассеяния с Фурье-
	преобразованием и порошковой
	рентгеновской дифракции.
	высушивали материал РР415-Р15 в	Спектроскопия	Спектроскопия
РР415-Р18	вакууме (2-20 мбар) при комнатной	комбинационного	комбинационного	рассеяния с
	температуре в течение ~2 ч;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:

	исследовали сухое,	бело	е твердое	Фурье-	соответствует 2 классу
	вещество с помощью	спектроскопии	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	комбинационного рассеяния	с Фурье-	РР415Р18.0	дифракция: соответствует	2
	преобразованием,		порошковой	Порошковая	классу
	рентгеновской дифракции	и ТГ-ИК-	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	Фурье-спектроскопии.			дифракция: 149а	потеря ~7,0 масс.% IPE в	две
				ТГ-ИК-Фурье-	стадии при изменении
				спектроскопия:	температуры с ~140°С	до
				а4301	~250°С; разложение	при
					Т>250°С
	высушивали материал	РР415-Р17 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме (2-20 мбар)	при	комнатной	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	температуре в течение	-2 ч;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	исследовали сухое,	белое твердое	Фурье-	соответствует 2 классу
	вещество с помощью	спектроскопии	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	комбинационного рассеяния	с Фурье-	РР415Р19.0	дифракция: соответствует	2
РР415-Р19	преобразованием,		порошковой	Порошковая	классу
	рентгеновской дифракции	и ТГ-ИК-	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	Фурье-спектроскопии.			дифракция: 150а	потеря ~7,6 масс.% гептана в
				ТГ-ИК-Фурье-	две стадии при изменении
				спектроскопия:	температуры с ~140°С	до
				а4302	~270°С; разложение	при

- 81 030468

			Т>270°С
	суспендировали 98,8 мг РР415-Р1 в 2,0	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл Н20; суспензию нагревали до 50°С;	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	медленно и поэтапно добавляли 4,0 мл	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	ацетона; получали прозрачный раствор;	Фурье-	соответствует 3 классу,
	раствор нагревали до 55°С и выдерживали при 55°С в течение 3 0 мин; медленно охлаждали в течение 4 ч	преобразованием: РР415Р20.0 Порошковая	содержит сигналы растворителя Порошковая рентгеновская
РР415-Р20	10 мин до 5°С (со скоростью ~0,2 К/мин); выделяли твердое вещество путем вакуумной фильтрации (размер пор Р4); исследовали твердое вещество с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием и порошковой рентгеновской дифракции.	рентгеновская дифракция: 22 ба	дифракция: соответствует 3 классу
	суспендировали 100,9 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	2,0 мл циклогексана; суспензию	комбинационного	комбинационного рассеяния с
РР415-Р21	нагревали до 70°С; медленно и	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	поэтапно добавляли 0,5 мл	Фурье-	соответствует 2 классу
	циклогексана и 0,5 мл этанола;	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	указанная суспензия загустевала за	РР415Р21.0	дифракция: соответствует 2

	счет дополнительного осаждения в ходе	Порошковая	классу
	добавления растворителя; суспензию	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	нагревали до 7 5°С и выдерживали при	дифракция: 218а	потеря ~5, 8 масс.%
	75°С в течение 30 мин; медленно	ТГ-ИК-Фурье-	циклогексана в две стадии
	охлаждали в течение 5 ч до 5°С (со	спектроскопия:	при изменении температуры с
	скоростью ~0,23 К/мин); выделяли твердое вещество путем вакуумной фильтрации (размер пор Р4); исследовали твердое вещество с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковой рентгеновской дифракции; высушивали материал в течение 5 мин в вакууме (10-20 мбар); исследовали материал с помощью ТГ-ИК-Фурьеспектроскопии.	а432б	~140°С до ~250°С; разложение при Т>250°С
	суспендировали 151,1 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	1,5 мл толуола; суспензию нагревали	комбинационного	комбинационного рассеяния с
РР415-Р22	до 70°С; получали прозрачный раствор;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	добавляли 0,5 мл MeCN; раствор	Фурье-	соответствует 1 классу,
	нагревали до 7 5°С и выдерживали при	преобразованием:	содержит сигналы
	75°С в течение 30 мин; медленно	РР415Р22.0	растворителя

- 82 030468

	охлаждали в течение 5 ч до 5°С (при ~0,23 К/мин); наблюдали прозрачный раствор без осадка; прозрачный раствор перемешивали при 5°С в течение 2 суток; осадка не наблюдали; выпаривали растворитель в потоке N2 при комнатной температуре; получали стекловидное вещество; исследовали его с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием.
РР415-Р23	суспендировали 150,6 мг РР415-Р1 в 1,5 мл диоксана; суспензию нагревали до 70°С; получали прозрачный раствор; добавляли 0,5 мл EtOAc; раствор нагревали до 75°С и выдерживали при 75°С в течение 30 мин; медленно охлаждали в течение 5 ч до 5°С (при ~0,23 К/мин); наблюдали прозрачный раствор без осадка; прозрачный раствор перемешивали при 5°С в течение 2 суток; осадка не наблюдали;	Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием: РР415Р23.0	Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием: соответствует 1 классу, содержит сигналы растворителя

	выпаривали растворитель в потоке N2 при комнатной температуре; получали стекловидное вещество; исследовали его с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием.
	суспендировали 99,4 мг РР415-Р1 в 0,3	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл IBuOH; суспензию нагревали до	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	70°С; получали прозрачный раствор;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	наблюдали медленное осаждение белого	Фурье-	соответствует 2 классу,
	твердого вещества; добавляли 0,5 мл	преобразованием:	содержит сигналы
	IBuOH; успокаивали суспензию;	РР415Р24.0	растворителя
	нагревали суспензию до 75°С и	Порошковая	Порошковая рентгеновская
	выдерживали при 7 5°С в течение 3 0	рентгеновская	дифракция: соответствует 2
РР415-Р24	мин; медленно охлаждали в течение 5 ч до 5°С (со скоростью ~0,23 К/мин); выделяли твердое вещество путем вакуумной фильтрации (размер пор Р4); исследовали твердое вещество с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием и порошковой рентгеновской дифракции; высушивали материал в течение 5 мин в	дифракция: 219а ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия: а4325	классу ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия: потеря ~16,6 масс.% IBuOH на стадии с ~50°С до ~160°С, дальнейшая потеря IBuOH (6,6 масс.%) на второй стадии с ~160°С до 230°С; разложение при Т>230°С

- 83 030468

	вакууме (10-20 мбар); исследовали материал с помощью ТГ-ИК-Фурьеспектроскопии.
	высушивали материал РР415-Р25 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме: при 60°С и ~5 мбар в течение	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	~1 ч; при кт и ~3 мбар в течение 4,5	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	сут.; при 60°С и ~10 мбар в течение 1	Фурье-	соответствует 3 классу
	ч; при 40-50°С и 5-20 мбар в течение	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	~20 ч; исследовали твердое вещество с	РР415Р25.0	дифракция: соответствует 3
	помощью спектроскопии комбинационного	Порошковая	классу
	рассеяния с Фурье-преобразованием,	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
РР415-Р25	порошковой рентгеновской дифракции и	дифракция: 258а	потеря ~5,4 масс.% 2РгОН при
	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.	ТГ-ИК-Фурье-	повышении температуры с 50°С
		спектроскопия :	до 250°С, большая часть
		а4337	которой произошла на стадии
			повышения со 170°С до 190°С,
			еще одна потеря ~1,0 масс.%
			2РгОН при повышении
			температуры с 290°С до 320°С;
			разложение при Т>320°С.
РР415-Р26	высушивали материал РР415-Р13 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме: при 60°С и ~5 мбар в течение	комбинационного	комбинационного рассеяния с

	~1 ч; при кт и ~3 мбар в течение 4,	. 5	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	сут.; при 60°С и ~10 мбар в течение	1	Фурье-	соответствует 4 классу
	ч; при 40-50°С и 5-20 мбар в течение	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	~20 ч; исследовали твердое вещество	с	РР415Р26.0	дифракция: соответствует 4
	помощью спектроскопии комбинационного	Порошковая	классу
	рассеяния с Фурье-преобразованием,	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	порошковой рентгеновской дифракции	и	дифракция: 259а	потеря ~2,8 масс.% MeCN при
	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.		ТГ-ИК-Фурье-	повышении температуры со
			спектроскопия:	170°С до 250°С; разложение
			а4335	при Т>300°С
	высушивали материал РР415-Р14	в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме: при 60°С и ~5 мбар в течение	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	~1 ч; при кт и ~3 мбар в течение 4,	. 5	рассеяния с	Фурье-преобразованием: по-
	сут.; при 60°С и ~10 мбар в течение	1	Фурье-	видимому, соответствует
			преобразованием:	смеси 1 и 5 класса
	ч; при ди-си с и о-ти моар в течение
	~20 ч; исследовали твердое вещество		РР415Р27.0	Порошковая рентгеновская
	с
РР415-Р27			Порошковая	дифракция: образец лишь
	помощью спектроскопии комбинационного
			рентгеновская	частично кристаллический;
	рассеяния с Фурье-преооразованием,
	порошковой рентгеновской дифракции		дифракция: 260а	несколько широких пиков
	и
	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.		ТГ-ИК-Фурье-	соответствуют 5 классу;
			спектроскопия:	таким образом, соответствует
			а4336	смеси аморфного 1 класса и 5
				класса

- 84 030468

			ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия: потеря ~0,3 масс.% при повышении температуры с 25°С до 290°С; разложение при Т>290°С
	высушивали материал РР415-Р21 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме: при 6О°С и ~5 мбар в течение	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	~1 ч; при кт и ~3 мбар в течение 4,5	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	сут.; при 6О°С и ~10 мбар в течение 1	Фурье-	соответствует 2 классу
	ч; при 40-50°С и 5-20 мбар в течение	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	~20 ч; исследовали твердое вещество с	РР415Р28.0	дифракция: соответствует 2
	помощью спектроскопии комбинационного	Порошковая	классу, образец менее
РР415-Р28	рассеяния с Фурье-преобразованием,	рентгеновская	кристаллический, на что
	порошковой рентгеновской дифракции и	дифракция: 261а	указывают расширенные пики
	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.	ТГ-ИК-Фурье-	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
		спектроскопия:	потеря ~3,0 масс.%
		а4334	циклогексана в две стадии
			при изменении температуры с
			~140°С до ~250°С; разложение
			при Т>250°С
РР415-Р29	суспендировали 132,2 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	0,8 мл смеси 1:2 EtOAc/ТЭА; наблюдали	комбинационного	комбинационного рассеяния с

	изменение появления	твердой фазы;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	перемешивали и	обрабатывали	Фурье-	соответствует 2 классу
	ультразвуком;	уравновешивали	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	суспензию при 24°С,	встряхивая при	РР415Р29.0	дифракция: соответствует 2
	500 об/мин; через 4	сут. выделяли	Порошковая	классу
	твердый материал	филь трационным	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	центрифугированием (0,20-мкм ПТФЭ-	дифракция: 282а	потеря ~5, 1 масс.% EtOAc и
	мембраны); материал	исследовали с	ТГ-ИК-Фурье-	ТЭА при изменении
	помощью спектроскопии	комбинационного	спектроскопия :	температуры с ~50°С до
	рассеяния с Фурье-преобразованием и	а434б	~220°С, большая часть которой
	порошковой рентгеновской дифракции;		произошла на стадии со 18 0°С
	материал высушивали в	течение 5 мин в		до 210°С; разложение при
	вакууме (10-20 мбар); материал		Т>220°С
	исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурье-
	спектроскопии.
	высушивали материал	РР415-Р7 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме при 50-70°С	и 1-10 мбар в	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	течение 3 сут.; исследовали твердое	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
РР415-Р30	вещество с помощью	спектроскопии	Фурье-	соответствует 2 классу
	комбинационного рассеяния с Фурье-	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	преобразованием,	порошковой	РР415Р30.0	дифракция: соответствует 2
	рентгеновской дифракции и ТГ-ИК-	Порошковая	классу
	Фурье-спектроскопии.		рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:

- 85 030468

		дифракция: 290а	потеря ~2,1 масс.% гептана
		ТГ-ИК-Фурье-	(и некоторого количества
		спектроскопия:	EtOAc) в две стадии при
		а4347	изменении температуры с ~50°С
			до ~250°С; разложение при
			Т>250°С
	суспендировали 137,6 мг РР415-Р1 в 2	Спектроскопия	Спектроскопия
	мл смеси 9:1 Н2О/ПЭГ 4 00; получали	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	белую суспензию; уравновешивали	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	суспензию при 24°С, встряхивая при	Фурье-	соответствует 1 классу
	4 00 об/мин; через 5 сут. выделяли	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
РР415-Р31	твердый материал вакуумной фильтрацией; трижды промывали твердое	РР415Р31.0 Порошковая	дифракция: аморфное, соответствует 1 классу
	вещество небольшим количеством Н2О;	рентгеновская
	материал исследовали с помощью	дифракция: 320а
	спектроскопии комбинационного
	рассеяния с Фурье-преобразованием и
	порошковой рентгеновской дифракции.
РР415-Р32	высушивали материал РР415-Р19 в вакууме при 80°С и <1х1СГ3 мбар; через 1 сут. материал исследовали с помощью ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии (а4362);	Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием:	Спектроскопия комбинационного рассеяния с Фурье-преобразованием: соответствует 2 классу Порошковая рентгеновская

	продолжали высушивание; через в общей	РР415Р32.0	дифракция: соответствует	2
	сложности 3	сут. материал исследовали	Порошковая	классу, менее кристаллично
	с помощью	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии	рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия
	(а4365),	спектроскопии	дифракция: 331а	Р32: потеря ~2,8 масс	. %
	комбинационного рассеяния с Фурье-	(Р32А)	гептана (25-250°С) , большая
	преобразованием и порошковой	ТГ-ИК-Фурье-	часть которой произошла	на
	рентгеновской дифракции как Р32А.	спектроскопия:	стадии со 170°С до 200°	С;
			а4362(Р32) а4365	разложение при Т>250°С
			(Р32А)	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия
				Р32А: потеря ~2,2 масс	. %
				гептана (25-250°С) , большая
				часть которой произошла	на
				стадии со 170°С до 200°	С;
				разложение при Т>250°С
	высушивали	материал РР415-Р19 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме при	80°С и <1х1СГ3 мбар; через	комбинационного	комбинационного рассеяния	с
	3 сут. исследовали материал с помощью	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
РР415-РЗЗ	спектроскопии комбинационного	Фурье-	соответствует 3 классу
	рассеяния	с Фурье-преобразованием,	преобразовакием:	Порошковая рентгеновская
	порошковой	рентгеновской дифракции и	РР415РЗЗ.0	дифракция: соответствует	3
	ТГ-ИК-Фурье	-спектроскопии.	Порошковая	классу
			рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:

- 86 030468

		дифракция: 332а ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия: а43бб	потеря ~4,2 масс.% 2РгОН (50-210°С) , большая часть которой произошла на стадии повышения со 1бО°С до 190°С, еще одна потеря ~0,5 масс.% 2РгОН (210-290°С) ; разложение при Т>290°С.
	высушивали материал РР415-Р19 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме при 80°С и <1х1СГ3 мбар; через	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	3 сут. исследовали материал с помощью	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	спектроскопии комбинационного	Фурье-	соответствует 2 классу
	рассеяния с Фурье-преобразованием,	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	порошковой рентгеновской дифракции и	РР415Р34.0	дифракция: соответствует 2
РР415-Р34	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.	Порошковая	классу, менее кристаллично
		рентгеновская	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
		дифракция: 333а	потеря ~2,3 масс.%
		ТГ-ИК-Фурье-	циклогексана в две стадии
		спектроскопия:	при изменении температуры с
		а43б7	25°С до 270°С; разложение при
			Т>270°С
	суспендировали 158,4 мг РР415-Р1 в	Спектроскопия	Спектроскопия
РР415-Р35	0,2 мл смеси MeCN/H2O; получали две	комбинационного	комбинационного рассеяния с

	прозрачные раздельные фазы;	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	уравновешивали раствор при 24°С,	Фурье-	соответствует 4 классу,
	встряхивая при 400 об/мин; через 3	преобразованием:	содержит сигналы
	сут. наблюдали густую суспензию;	РР415Р35.0	растворителя
	добавляли 0,1 мл смеси растворителей;	Порошковая	Порошковая рентгеновская
	продолжали уравновешивать суспензию	рентгеновская	дифракция: соответствует 4
	при 24°С, встряхивая при 400 об/мин;	дифракция: 32 ба	классу
	через в общей сложности 5 сут.	ТГ-ИК-Фурье-	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	выделяли твердый материал	спектроскопия :	потеря ~2,9 масс.% MeCN при
	фильтрационным центрифугированием (0,20 мкм ПТФЭ-мембраны); материал исследовали с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния с Фурьепреобразованием; высушивали материал в течение 10 мин в вакууме (10-20 мбар); материал исследовали с помощью порошковой рентгеновской дифракции и ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.	а43б3	повышении температуры с 25°С до 250°С; разложение при Т>250°С
	высушивали материал РР415-Р35 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	вакууме при 80°С и <1х1СГ3 мбар; через	комбинационного	комбинационного рассеяния с
РР415-Р36	3 сут. исследовали материал с помощью	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	спектроскопии комбинационного	Фурье-	соответствует 4 классу
	рассеяния с Фурье-преобразованием,	преобразованием:	Порошковая рентгеновская

- 87 030468

	порошковой рентгеновской дифракции и ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии.	РР415Р36.0 Порошковая рентгеновская дифракция: 339а ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия: а4369	дифракция: соответствует 4 классу ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия: потеря ~0,6 масс.% (вероятно, Н2О и/или MeCN) в две стадии при изменении температуры с 25°С до 280°С; разложение при Т>2 8 0°С
	высушивали материал РР415-Р35 в	Спектроскопия	Спектроскопия
	потоке N2 при 80°С; через 3 сут.	комбинационного	комбинационного рассеяния с
	исследовали материал с помощью	рассеяния с	Фурье-преобразованием:
	спектроскопии комбинационного	Фурье-	соответствует 4 классу
	рассеяния с Фурье-преобразованием,	преобразованием:	Порошковая рентгеновская
	порошковой рентгеновской дифракции,	РР415Р37.0	дифракция: соответствует 4
	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопии, ДСК и	Порошковая	классу
РР415-Р37	динамической сорбции паров.	рентгеновская дифракция: 340а ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия: а4370 ДСК: d 9907 Динамическая сорбция паров:	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия: потеря ~0,9 масс.% (вероятно, Н2О и/или MeCN) в две стадии при изменении температуры с 25°С до 280°С; разложение при Т>280°С ДСК: острый эндотермический

		dvsll7 6 Порошковая рентгеновская дифракция после динамической сорбции паров: 363а	пик при Т=196,1°С (ΔΗ=29,31 Дж/г); без разложения вплоть до 270°С Динамическая сорбция паров: слегка гигроскопическое; Лш=+0,7% (50%^85% о.в.); общий прирост массы 2,1 масс.% при изменении относительной влажности от 0% до 95%. Порошковая рентгеновская дифракция после динамической сорбции паров: соответствует 4 классу
РР415-Р38	ДСК-эксперимент: объединяли 1,275 мг РР415-Р1 и 1,344 мг РР415-Р36; уравновешивали в течение 3 мин в атмосфере N2; нагревали образец от 50°С до 270°С со скоростью 10 К/мин.	ДСК: d_9917	ДСК
РР415-Р39	ДСК-эксперимент: объединяли 2,17 мг РР415-Р1 и 2,20 мг РР415-Р36; смешивали твердые вещества шпателем; уравновешивали в течение 3 мин в	ДСК: d_9923	ДСК

- 88 030468

	атмосфере N2; нагревали образец от 50°С до 173°С со скоростью 10 К/мин; выдерживали при 173°С в течение 30 мин; нагревали от 173°С до 270°С со скоростью 10 К/мин.
	получали ~5 г 63415, № партии: 2 083-	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
РР415-Р40	69-DC 27 мая 2011 г.; М = 554,7 г/моль, C33H44F2N2O3	рентгеновская дифракция: 390а	дифракция: классу	соответствует 2
	суспендировали 101,3 мг РР415-Р40 в	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
РР415-Р41	0,20 мл смеси ТГФ/Н2О (1:1); получали белую суспензию; уравновешивали суспензию при 2 4°С; через 3 сут. выделяли твердое вещество фильтрационным центрифугированием (0,2-мкм ПТФЭ-мембраны); высушивали твердый материал в вакууме в течение 5 мин; материал исследовали с помощью порошковой рентгеновской дифракции.	рентгеновская дифракция: 400а	дифракция: классу	соответствует 5
	растворяли 104,6 мг РР415-Р40 в 0,20	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
РР415-Р42	мл ТГФ; получали прозрачный раствор; выпаривали растворитель в потоке N2 в течение ночи; получали белое твердое	рентгеновская дифракция: 405а	дифракция: класс)	аморфное (1

	вещество; исследовали твердое вещество с помощью порошковой рентгеновской дифракции.
	растворяли 101,8 мг РР415-Р40 в 0,20	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	мл смеси ТГФ/гексан (8:2); получали	рентгеновская	дифракция:	соответствует 2
	прозрачный раствор; выпаривали	дифракция: 429а	классу
РР415-Р43	растворитель в потоке N2 в течение
	ночи; получали белое твердое
	вещество; исследовали твердое
	вещество с помощью порошковой
	рентгеновской дифракции.
	высушивали материал РР415-Р41 в	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	вакууме (~100 мбар) при 80°С; через 1	рентгеновская	дифрактограмма: оба образца
	сут. исследовали твердое вещество с	дифракция: 474а,	в основном аморфны (1
	помощью порошковой рентгеновской	482а	класс), несколько широких
РР415-Р44	дифракции (474а); продолжали высушивание в течение ночи; повторно	ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия:	пиков низкой ТГ-ИК-Фурье-	интенсивности. спектроскопия:
	исследовали твердое вещество с	а4401	~0, 9 масс	.% ТГФ при
	помощью порошковой рентгеновской		повышении температуры с 25°С
	дифракции (482а) и ТГ-ИК-Фурье-		до 2 8 0°С;	разложение при
	спектроскопии.		Т>300°С
РР415-Р45	суспендировали 3,03 г РР415-Р40 в 6,0	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	мл смеси ТГФ/Н2О (1:1); получали	рентгеновская	дифракция:	соответствует 5

- 89 030468

	белую суспензию;	уравновешивали	дифракция: 471а	классу
	суспензию при кт;	через 1 сут.
	выделяли твердое	вещество из
	небольшой аликвоты	филь трационным
	центрифугированием и	исследовали с
	помощью порошковой	рентгеновской
	дифракции; выделяли	твердое вещество
	из всего образца вакуумной
	фильтрацией; высушивали образец в
	течение 10 мин в вакууме (—10 мбар).
	высушивали материал	РР415-Р45 в	Порошковая	Порошковая рентгеновская
	вакууме (—100 мбар) при 80°С; через 1	рентгеновская	дифрактограмма: оба образца
	сут. исследовали твердое вещество	дифракция: 481а,	в основном аморфны (1
	после высушивания в	течение ночи с	496а	класс), несколько широких
	помощью порошковой	рентгеновской	ТГ-ИК-Фурье-	пиков низкой интенсивности.
РР415-Р46	дифракции (481а),	: продолжали	спектроскопия:	ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия:
	высушивание; через 4	сут. исследовали	а4410	~0,4 масс.% Н2О при повышении
	твердое вещество как РР415-Р4ба с		температуры с 2 5°С до 2 50°С;
	помощью порошковой	рентгеновской		разложение при Т>250°С
	дифракции (496а)	и ТГ-ИК-Фурье-
	спектроскопии.
	растворяли 101,8 мг	РР415-Р40 в 0,4	Порошковая	Порошковая рентгеновская
РР415-Р47
	мл EtOAc; получали прозрачный	рентгеновская	дифракция: соответствует 2

	раствор; выпаривали растворитель в потоке N2 в течение ночи; получали белое твердое вещество; исследовали твердое вещество с помощью порошковой рентгеновской дифракции и ТГ-ИКФурье-спектроскопии.	дифракция: 492а ТГ-ИК-Фурьеспектроскопия : а4412	классу ТГ-ИК-Фурье-спектроскопия: ~6,2 масс.% EtOAc при повышении температуры с 25°С до 17 0°С, 1,7 масс.% EtOAc при повышении температуры со 170°С до 240°С; разложение при Т>240°С
	растворяли 101,1 мг РР415-Р40 в 0,4	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	мл этилформиата; получали прозрачный	рентгеновская	дифракция:	соответствует 2
	раствор; выпаривали растворитель в	дифракция: 493а	классу
РР415-Р48	потоке N2 в течение ночи; получали	ТГ-ИК-Фурье-	ТГ-ИК-Фурье-	спектроскопия: этилформиата при
белое твердое вещество; исследовали	спектроскопия :	~3,5 масс.%
	твердое вещество с помощью порошковой	а4413	повышении температуры с 25°С
	рентгеновской дифракции и ТГ-ИК-		до 2 0 0°С;	разложение при
	Фурье-спектроскопии.		Т>200°С
	растворяли 205,3 мг РР415-Р40 в 0,3	Порошковая	Порошковая	рентгеновская
	мл ацетона; получали прозрачный	рентгеновская	дифракция:	аморфное (1
	раствор; по каплям добавляли Н2О	дифракция: 593 а	класс)
РР415-Р49	(охлажденную до 5°С) до 30,0 мл;
	получали разбавленную белую
	суспензию; перемешивали разбавленную

суспензию при 5°С в течение ночи; получали более густую белую суспензию; выделяли твердое вещество вакуумной фильтрацией (размер пор Р4); получали 188,3 мг белого твердого вещества; исследовали твердое вещество с помощью порошковой рентгеновской дифракции.

- 90 030468

Параметры фиг. 51

Таблица 31

Соединение	Уровни NOx	(% по сравнению с ЛПС-контролем)
	13 мг/кг	25 мг/кг	50 мг/кг
RTA 405 *	44%	26%	18%
63415	30%	18%	16%

Таблица 32

Основные показатели ADMET in vivo - ключевые основные анализы и конечные показатели ADMET

Анализ	Ключевые конечные показатели
14-дневная токсичность у мышей	Переносимость, масса тела, биохимический анализ крови Распределение в тканях Экспрессия мРНК гена-мишени Nrf2 и активация ферментов в печени

	Переносимость, масса тела, биохимический анализ крови и ограниченное
14-дневная	гистопатологическое исследование
токсичность у крыс	Распределение к тканях и плазме ТК
	Экспрессия мРНК гена-мишени Nrf2 и активация ферментов в печени
	Переносимость, масса тела, биохимический анализ крови и ограниченное
14-дневная	гистопатологическое исследование
токсичность у	Распределение к тканях и плазме ТК
обезьян	Экспрессия мРНК гена-мишени Nrf2 и активация ферментов в различных тканях
	и МКПК

Таблица 33

Параметры фиг. 54

	Носитель	63415
Доза (мг/кг)	0	10	30	100
АЛТ (МЕ/л)	100	39	63	91
ACT (МЕ/л)	156	98	147	167
ЩФ (МЕ/л)	120	131	110	98
Общий билирубин (мг/дл)	<0,2	<0,2	<0,2	<0,2
АМК (мг/дл)	17	15	15	15
Сг (мг/дл)	<0,2	<0,2	<0,2	<0,2
Glu (мг/дл)	288	307	285	273

- 91 030468

Таблица 34

63415 давало отрицательный результат при исследовании генотоксичности при микроядерном исследовании in vivo

Лечение (п=5/группу)	РСЕ/общие эритроциты (Среднее + /- СО)	Изменение по сравнению с контролем (%)	Количество МРСЕ/1000 РСЕ (Среднее +/- СО)	Оценка количества МРСЕ/1000 РСЕ
Момент времени 24 ч
Кунжутное масло	0,588+0,04	-	0,2+0,27	2/10000
125 мг/кг	0,543+0,03	-8	0,3+0,27	3/10000
250 мг/кг	0,520+0,06	-12	0,3+0,27	3/10000
500 мг/кг	0,426+0,07	-28	0,0+0,00	0/10000
1000 мг/кг	0,498+0,05	-15	0,2+0,27	2/10000
1500 мг/кг	0,499+0,06	-15	0,4+0,22	4/10000
2000 мг/кг	0,531+0,05	-10	0,2+0,27	2/10000
Момент времени 48 ч
Кунжутное масло	0,526+0,05	-	0,3+0,27	3/10000
125 мг/кг	0,453+0,03	-14	0,2+0,27	2/10000
250 мг/кг	0,391+0,02	-26	0,2+0,27	2/10000
500 мг/кг	0,339+0,05	-36	0,3+0,45	3/10000

1000 мг/кг	0,344+0,04	-35	0,1+0,22	1/10000
1500 мг/кг	0,376+0,05	-39	0,4+0,42	4/10000
2000 мг/кг	0,360+0,03	-32	0,1+0,22	1/10000

Таблица 35

Параметры фиг. 35

Лечение	День	АЛТ (МЕ/л)	ACT (МЕ/л)	ЩФ (МЕ/л)	Общий билирубин (мг/дл)	АМК (мг/дл)	Сг (мг/дл)	Общий белок (г/дл)	Альбумин (г/дл)	Глюкоза (мг/дл)	Холестерин (мг/дл)	тг (мг/дл)
Носитель	BL	30	29	320	0,15	23	0,63	7,2	4,1	87	124	52
День 14	37	37	345	0,23	18	0,63	6,9	4,1	63	130	64
10 мг/кг	BL	46	32	351	0,18	35	0,78	7,4	4	74	146	51
День 14	46	38	382	0,23	27	0,68	7,2	4	39	144	82
30 мг/кг	BL	32	32	409	0,18	23	0,7	7,3	4,2	85	125	47
День 14	47	43	416	0,2	20	0,58	7,2	4	53	122	64
100 мг/кг	BL	32	35	381	0,15	24	0,7	6,9	4	96	137	37
День 14	43	37	390	0,18	24	0,55	6	3,2	32	93	61

Таблица 36

Активность 63415 и 63355 in vitro

	63415	63355
1С50 N0 (нМ) , RAW264.7	4,0+1	0,63+0,06
IC50 WST-1 (нМ) , RAW264.7	125	150
NQO1-ARE (кратное изменение НиН7 при 62,5 нМ)	5,3+1,0	6,5+0,9

- 92 030468

Таблица 37

Параметры фиг. 52

Соединение	Плазма	Цельная кровь	Головной мозг	Печень	Легкие	Почки
RTA 405 (нМ)	130	1165	93	1143	1631	2357
63415 (нМ)	51	679	1081	985	533	1604

Таблица 38

Параметры фиг. 53

Соединение	Печень	Легкие	Почки
RTA 405	1,93	1,48	8,25
63415	10, 9	1,75	10, 9

Все соединения, полиморфные формы, составы и способы, описанные в настоящем документе и формуле изобретения, можно выполнить и осуществить без излишних экспериментов в свете настоящего описания. Хотя соединения, полиморфные формы, составы и способы настоящего изобретения описаны в виде предпочтительных вариантов реализации, специалистам в данной области техники понятно, что в указанные соединения, полиморфные формы, составы и способы, а также в этапы или последовательность этапов способов, описанных в настоящем документе, можно внести изменения без отхода от концепции и рамок настоящего изобретения. Конкретнее, очевидно, что агенты, описанные в настоящем документе, можно заменить определенными химически и физиологически родственными агентами, достигая тех же или аналогичных результатов. Все подобные аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, должны считаться входящими в рамки и концепцию настоящего изобретения, определяемые прилагаемой формулой изобретения.

Ссылки

Следующие ссылки в той степени, в которой в них предложены примерные процедуры или другие подробные описания, дополнительные к описаниям, представленным в настоящем изобретении, полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки.

Патент США 6326507.

Патент США 6974801.

Патент США 7915402.

Патент США 7943778.

Патент США 8124799.

Патент США 8129429.

Патентная публикация США 2009/0060873.

- 93 030468

Abraham and Kappas, Free Radical Biol. Med., 39:1-25,

2005.

Aghajan et al., J Gastroenterol Hepatol., Suppl 2:10-14,

2012 .

Ahmad et. al. , Cancer Res., 68:2920-2926, 2008.

Ahmad et. al., J. Biol. Chem., 281:35764-9, 2006.

Angulo et al. , Eur. J. Immunol., 30:1263-1271, 2000.

Araujo et. al., J. Immunol., 171(3):1572-1580, 2003.

Arend and Dayer, Arthritis Rheum., 38:151-160, 1995.

Bach, Hum. Immunol., 67(6):430-432, 2006.

Bagasra et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1204112045, 1995.

Blake et. al. Am J Respir Cell Mol Biol, 42:524-36, 2010. Berridge et al., Biochemica, 4: 14-19, 1996.

Botoman et al., Am. Fam. Physician, 57(1):57-68, 1998. Brandt et al., Arthritis Rheum., 43:1346-1352, 2000. Brewerton et al., lancet., 1:904-907, 1973a.

Brewerton et al., lancet., 1:956-957, 1973b.

Bronte et al., Trends Immunol., 24:302-306, 2003.

Brown and DuBois J. Clin. Oncol., 23:2840-2855, 2005. Brynskov et al. , N. Engl. J. Med., 321(13):845-850, 1989. Cantin et. al. , J Clin Invest, 79:1665-73, 1987.

Cai et al., Nat. Med., 11(2):183-190, 2005.

- 94 030468

Calin and Taurog, In: The Spondylarthritides, Calin et al.

(Eds.), Oxford, UK. Oxford University Press, 179, 1998.

Car et. al., Am J Resplr Crlt Care Med, 149:655-9, 1994. Cernuda-Morollon et. al., J Biol Chem, 276:35530-6, 2001. Chan and Kan, Proc Natl Acad Sci USA, 96:12731-6, 1999. Chauhan and Chauhan, Pathophysiology, 13(3):171-181. 2006. Chen and Kunsch, Curr Pharm Des, 10:879-91, 2004.

Cho et. al., Am J Resplr Cell Mol Biol, 26:175-82, 2002. Crowell et al., Mol. Cancer Ther., 2:815-823, 2003. Cuzzocrea et. al., Mol Pharmacol, 61:997-1007, 2002. Dickerson et. al. , Prog Neuropsychopharmacol Biol.

Psychiatry, March 6, 2007.

Dinarello, Int. Rev. Immunol., 16:457-499, 1998. Dinkova-Kostova et. al. , Proc. Natl. Acad. Sol. USA,

102 (12) :4584-4589, 2005.

Dionne et al., Clin. Exp. Imunol., 112(3):435-442, 1998. Douglas et. al. , Am U Resplr Crlt Care Med, 158:220-5,

1998 .

Dudhgaonkar et. al. , Eur. U. Pain, 10(7):573-9, 2006. Eastgate et al., Lancet, 2(8613):706-9, 1988.

Eikelenboom et al., Glia, 40(2):232-239, 2002.

Ettehadi et al., Clin. Exp. Immunol., 96(1):146-151, 1994. Fischer et. al. , . Int U Chron Obstruct Pulmon Dis, 6:41321, 2011.

Forstermann, Biol. Chem., 387:1521, 2006.

Funakoshi et al., Digestion, 59(1):73-78, 1998.

Gebel et. al., Toxicol Sci, 115:238-52, 2010.

Gehrmann et al., Glia, 15(2):141-151, 1995.

Genain and Nauser, U. Mol. Med., 75:187-197, 1997.

Goodman et al., Kidney Int., 72(8):945-953, 2007.

Graeber et al., Glia, 40(2):252-259, 2002.

Greten et al., Cell, 118:285-296, 2004.

Grivennikov and Karin, Cytokine Growth Factor Rev. ,

21(1):11-19, 2010.

Guilherme et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9(5):367-77,

2008 .

- 95 030468

Gwee et al. , Gut., 44(3):400-406., 1999.

Hallgren et. al., Am Rev Resplr Dis, 139:373-7, 1989.

Hahn and Tsao, In: Dubois' Lupus Erythematosus, 4^th Ed,

Wallace and Hahn (Eds.), Lea and Febiger, Philadelphia, 195201, 1993.

Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties , and Use, Stahl and Wermuth Eds.), Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002.

Hanson et. al., BMC Medical Genetics, 6(7), 2005.

Hansson et al. , Annu. Rev. Pathol. Meeh. Dis., 1:297-329,

2006.

Hayden and Ghosh, Cell, 132:344-62, 2008.

He and Karin, Cell Res., 21(1):159-168, 2011.

Honda et. al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:1027-1030,

2002 .

Honda et. al. , Bioorg. Med. Chem. Lett., 16(24):6306-6309,

Honda et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7:1623-1628,

Honda et. al. , Bioorg. Med. Chem. Lett., 8(19):2711-2714,

Honda et. al. , Bioorg. Med. Chem. Lett., 9(24):342 9-3434,

Honda et. al., J. Med. Chem., 43:4233-4246, 2000a.

Honda et. al., J. Med. Chem., 43:1866-1877, 2000b. Hotamisligil, Nature, 444(7121):860-7, 2006.

Iizuka et. al., Genes Cells, 10:1113-25, 2005.

Ikezaki et. al., Food Chem Toxicol, 34:327-35, 1996.

Ishii et. al., J Immunol, 175:6968-75, 2005.

Ishikawa et. al., Circulation, 104(15):1831-1836, 2001. Ishizawa and Dickson, J. Neuropathol. Exp. Neurol.,

60(6):647-657, 2001.

2006.

1997 .

1998 .

1999.

Jarvis, Curr. Opin. Rheumatol., 10(5):459-467, 1998. Jarvis, Pediatr. Ann., 31(7):437-446, 2002.

Jonsson et al., Oral Dis., 8(3):130-140, 2002.

Jonsson et al., Trends Immunol., 22(12):653-654, 2001. Kahle et al., Ann. Rheum. Dis., 51:731-734, 1992.

- 96 030468

Kaltschmidt et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:26422647, 1997.

Karin, Nature, 441(7092):431-436, 2006.

Kawakami et. al., Brain Dev., 28(4):243-246, 2006.

Kawamoto et. al., J Biol Chem, 275:11291-9, 2000. Kendall-Tackett, Trauma Violence Abuse, 8(2):117-126,

2007 .

Kensler et. al. , Annu Rev Pharmacol Toxicol, 47:89-116,

2007 .

Kikuchi et. al., Respir Res, 11:31, 2010.

Kim et. al., Mutat Res, 690:12-23, 2010.

King et. al., Am J Respir Crit Care Med, 184:92-99, 2011. Kinnula et. al. , Am J Respir Crit Care Med, 172:417-22,

2005.

Klingsberg et. al., Respirology, 15:19-31, 2010. Kortylewski et al., Nat. Med., 11:1314-1321, 2005.

Kotzin and O'Dell, In: Samler's Immunologic Diseases, 5^th

Ed., Frank et al. (Eds.), Little Brown & Co., Boston, 667-697,

1995.

Kotzin, Cell, 85:303-306, 1996.

Kruger et. al. , J. Pharmacol. Exp. Ther., 319(3):11441152, 2006.

Kuboyama, Kurume Med. J., 45(1):33-37, 1998.

Lee et. al., Mol Cell, 36:131-40, 2009.

Lee et. al., Glia., 55(7):712-22, 2007.

Lencz et. al., Mol. Psychiatry, 12(6):572-80, 2007.

Levonen et. al., Biochem J, 378:373-82, 2004.

Li and Kong, Mol Carcinog, 48:91-104, 2009.

Liby et. al., Cancer Res., 65(11):4789-4798, 2005.

Liby et. al., Mol. Cancer Ther., 6(7):2113-9, 2007b.

Liby et. al., Nat. Rev. Cancer, 7(5):357-356, 2007a.

Lipsky, In: Harrison's principles of internal medicine,

Fauci et al.(Eds.), 14^th Ed., NY, McGraw-Hill, 1880-1888, 1998. Liu et. al., FASEB J., 20(2):207-216, 2006.

Lu et. al. , J. Clin. Invest., 121(10):4015-29, 2011. Lugering et al., Ital. J. Gastroenterol. Hepatol.,

- 97 030468

30 (3) :338-344, 1998.

Malhotra et. al. , Am J Respir Crit Care Med, 178:592-604,

2008 .

March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 2007.

Mazur et al. , Cell Microbiol., 9(7):1683-94, 2007.

Mazzoni et al. , J. Immunol., 168:689-695, 2002.

McAlindon et al., Gut, 42(2):214-219, 1998.

McGeer and McGeer, Brain Res. Brain Res. Rev., 21:195-218,

1995.

McGeer et al., Neurology, 19:331-338, 1996.

McGonagle et al., Arthritis Rheum., 41:694-700, 1998. McGonagle et al. , Curr. Opin. Rheumatol., 11:244-250,

1999.

McIver et. al., Pain, 120(1-2):161-9, 2005.

Mease et al., Lancet, 356:385-390, 2000.

Merrill and Benvenist, Trends Neurosci., 19:331-338, 1996. Mochizuki et. al. , Am J Respir Crit Care Med, 171:1260-6,

2005.

Morbidity & Mortality: 2009 Chart Book on Cardiovascular, Lung, and Blood Diseases. National Heart, Lung, and Blood Institute, 2009.

Morris et. al., J. Mol. Med., 80(2):96-104, 2002.

Morse and Choi, Ahn. J. Respir. Crit. Care Med., 172 (6) :660-670, 2005.

Morse and Choi, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 27(1):816, 2002.

Nath et al., Neurology, 66(1):149-150, 2006.

Neal et al., BMJ., 314(7083):779-782, 1997.

Nichols, Drug News Perspect., 17(2):99-104, 2004.

Ohnishi et al., Int. Immunol., 6:817-830, 1994.

Ogushi et. al., J Med Invest, 44:53-8, 1997.

Pall, Med. Hypoth., 69:821-825, 2007.

Parambil et. al., Chest, 128:3310-5, 2005.

Partsch et al., Br. J. Rheumatol., 24:518-523, 1997.

Pergola et. al., N Engl J Med, 365:327-336, 2011.

- 98 030468

Pica et al. , Antlmlcrob Agents Chemother., 44(1):200-4,

2000.

Pimentel et al. , Am. J. Gastroenterol. , 95(12):3503-3506,

2000.

Place et. al. , Clin. Cancer Res., 9(7):2798-806, 2003. Prochaska and Santamaria, Anal Biochem., 169:328-336,

1988 .

Rajakariar et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(52):20979-84, 2007.

Rangasamy et. al. , J Clin Invest, 114:1248-59, 2004. Rangasamy et. al., J Exp Med, 202:47-59, 2005.

Reimund et al. , Eur. J. Clin. Invest., 28(2):145-150,

1998 .

Renauld, J Clin Pathol, 54:577-89, 2001.

Rogler and Andus, World J. Surg., 22(4):382-389, 1998. Rooney et al., Rheumatol. Int., 10:217-219, 1990.

Ross et. al. , Am. J. Clin. Pathol., 120(Suppl) :S53-71,

2003.

Ross et. al. , Expert Rev. Mol. Diagn., 3(5):573-585, 2003. Rossi et. al., Nature, 403:103-8, 2000.

Rostom et al. , Ann. Intern. Med., 146, 376-389, 2007. Ruster et. al., Scand. J. Rheumatol., 34(6):460-3, 2005. Sacerdoti et. al. , Curr Neurovasc Res., 2(2):103-111,

2005.

Saha et. al., J Biol Chem, 285:40581-92, 2010.

Saiki et al. , Scand. J. Gastroenterol., 33(6):616-622,

1998 .

Salomonsson et al. , Scand. J. Immunol., 55(4):336-342,

2002 .

Salvemini et. al. , J. Clin. Invest., 93(5):1940-1947,

1994.

Sarchielli et. al., Cephalalgia, 26(9):1071-1079, 2006. Satoh et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(3):768-773,

2006.

Schlosstein et al. , NE J. Medicine, 288:704-706, 1973. Schulz et. al., Antioxid. Redox. Sig., 10:115, 2008.

- 99 030468

Selman et. al. , Ann Intern Med, 134:136-51, 2001.

Sheppard, J Clin Invest, 107:1501-2, 2001.

Shishodia et. al., Clin Cancer Res, 12:1828-38, 2006. Simonian and Coyle, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 36:83106, 1996.

Singh et. al., Free Rad Biol Med, 46:376-386, 2009.

Sinha et al. , Cancer Res., 67:4507-4513, 2007.

Sporn et. al. , J Nat Prod, 74:537-45, 2011.

Sriram et. al., Pulm Pharmacol Ther, 22:221-36, 2009.

Stack et al., lancet, 349(9051):521-524, 1997.

Standiford et. al., Chest, 103:121S, 1993.

Standiford et. al., J Immunol, 151:2852-63, 1993.

Stewart et al. , Neurology, 48:626-632, 1997.

Straus et. al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:4844-9, 2000. Strejan et. al., J. Neuroimmunol., 7:27, 1984.

Strieter, Am J Respir Crit Care Med, 165:1206-7, 2002.

Suh et. al., Cancer Res., 58:717-723, 1998.

Suh et. al., Cancer Res., 59(2):336-341, 1999.

Sussan et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106:250-5, 2009. Szabo et. al. , Nature Rev. Drug Disc., 6:662-680, 2007. Takahashi et. al., Cancer Res., 57:1233-1237, 1997.

Tamir and Tannebaum, Biochim. Biophys. Acta, 1288:F31-F36,

1996.

Taniguchi et. al., Eur Respir U, 35:821-9, 2010.

Targan et al., N. Engl. U. Med., 337(15):1029-1035, 1997. Thimmulappa et al., Cancer Research, 62: 5196-5203, 2002. Third Report of the National Cholesterol Education Program

Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III, or ATP III), National Institutes of Health, 2001, NIH Publication No. 01-3670.

Touzani et al., U. Neuroimmunol., 100(1-2):203-215, 1999. Tumlin et al., Am. J. Cardiol., 98(6A):14K-20K, 2006. van den Berg, Semin. Arthritis Rheum., 30(5S-2):7-16,

2001.

van Dullemen et al., Gastroenterol., 109(1):129-135, 1995.

- 100 030468

van Hogezand and Verspaget, Drugs, 56(3):299-305, 1998.

Vazquez et al. , J. Virol., 79(7):4479-91, 2005.

Wakabayashi, et. al. , Antioxid Redox Signal, 13:1649-63,

2010.

Wang et al., Cancer Res., 66:10983-10994, 2006.

Wardle, Nephrol. Dial. Transplant., 16(9):1764-8, 2001.

Weyand and Goronzy, Ann. NY Acad. Sci., 987:140-149, 2003.

Williams et al., Clin. Neurosci., 2(3-4):229-245, 1994.

Wordsworth, In: Genes and Arthritis, Brit. Medical

Bulletin, 51:249-266, 1995.

Wright, Clin. Orthop. Related Res., 143:8-14, 1979.

Wu et. al., Toxicol Sci, 123:590-600, 2011.

Xie et. al., J. Biol. Chem., 270(12):6894-6900, 1995.

Yates et al., Mol. Cancer Ther, 6(1):154-162, 2007.

Yore et. al., Mol Cancer Ther, 5:3232-9, 2006.

Yoh et al., Kidney Int., 60(4):1343-1353, 2001.

Yu et al. , Nat. Rev. Immunol., 7:41-51, 2007.

Zhou et al., Am. J. Pathol., 166(1):27-37, 2005.

Zhou et al., Cancer Sci., 98:882-889, 2007.

Zingarelli et al., J. Immunol., 171(12):6827-6837, 2003.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Reata Pharmaceuticals, Inc.

<120> 2,2-ДИФТОРПРОПИОНАМИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ БАРДОКСОЛОН-МЕТИЛА, ИХ ПОЛИ МОРФНЫЕ ФОРМЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> REAT.P0073WO

<150> 61/780,444

<151> 2013-03-13

<150> 61/775,288

<151> 2013-03-08

<150> 61/687,669

<151> 2012-04-27

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 1

gctgtggcta ctgcggtatt

<210> 2 <211> 20 <212> ДНК

20

- 101 030468

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 2

atctgcctca atgacaccat 20

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 3

tccgatgggt ccttacactc 20

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 4

taggctcctt cctcctttcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 5

aaaacactgc cctcttgtgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 6

gtgccagtca gcatctggta 20

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 102 030468

<223> Синтетический праймер

<400> 7

gatgagaagg accccacggc gtctg 25

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 8

gagacaatcc agcagcccag gaggg 25

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 9

attgccactg gtgaaagacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 10

accaattttg ttggccatgt 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 11

gaggccgtgt acaccaagat 20

<210> <211> <212> <213>	12 20 ДНК Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетический	праймер
<400>	12

- 103 030468

agcagtgggg tgaaaatacg 20

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 13

aaggcactct acgcttccaa 20

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 14

aggagtcctg gcagttttca 20

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 15

catctccgag agcaacatca 20

<210> 16

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 16

ttgtattggc ggctagttcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 17

tatatcctgg ccaaggcaac 20

- 104 030468

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 18

ggataaagcc gaccctcttc 20

<210> 19

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 19

tcaggctaca gaagaggctt gc 22

<210> 20

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 20

acagtcacag gcttgcggat g 21

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 21

tcgggctagt cccagttaga 20

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 22

aaagagctgg agagccaacc 20

<210>	23
<211>	20
<212>	ДНК

- 105 030468

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 23

cacggagcag gtcttcaacg 20

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 24

agaatggtca tccggaaatg 20

<210> 25

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 25

cgcggtgcag gtcaactact 20

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 26

cctcatcagc caggagaaaa 20

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 27

ggctattcgc tattttgtgt 20

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

- 106 030468

<223> Синтетический праймер

<400> 28

gaccaggtga ttcgtacaat 20

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 29

agagtcctct tcagtcattg 20

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический праймер

<400> 30

atgattagag cagatggtgg 20

1. Соединение формулы

Claims (3)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение формулы

   при этом указанная полиморфная форма имеет порошковую рентгеновскую дифрактограмму (CuKq), содержащую гало в форме пика при угле 2Θ примерно 14°.
2. 4. Полиморфная форма по п.3, где порошковая рентгеновская дифрактограмма (CuKq) дополнительно содержит плечевой пик при угле 2Θ примерно 8°.
3. 5. Полиморфная форма по п.3, где порошковая рентгеновская дифрактограмма (CuK(x) является, по существу, такой, как показано на