ES2629019T3 - Derivado de tiazinamida y composición farmacéutica y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Derivado de tiazinamida que tiene una estructura de fórmula I,**Fórmula** o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que, R1 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-6 átomos de carbono; y R2 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 átomos de carbono o alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 átomos de carbono y está sustituido con fenilo.

Description

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DESCRIPCION

Derivado de tiazinamida y composicion farmaceutica y uso de los mismos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un derivado de tiazinamida, a una composicion farmaceutica que contiene el compuesto y a un metodo o uso de los mismos para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad provocada por lesiones progresivas del sistema nervioso, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica (ALS), accidente cerebrovascular isquemico o hemorragico, etc. Dado que la causa de la enfermedad es compleja y el mecanismo patogeno no esta muy claro, en la actualidad no hay ningun producto terapeutico eficaz.

FKBP, que se denomina asf debido a su union al inmunosupresor FK506, es un mediador importante que permite que FK506 ejerza su funcion inmunosupresora, sin embargo, aun no se ha explicado completamente su funcion fisiologica. En 1992, Steiner J.P. et al. encontraron que la concentracion de FKBP (familia de FKBP) en el cerebro y el sistema nervioso periferico era mucho mayor que en los tejidos inmunitarios, lo cual conduce a la especulacion de que hay una cierta relacion entre FKBP y el sistema nervioso. Los resultados de investigacion de Dawson, et al. mostraron que FK506 podfa bloquear la excitotoxicidad nerviosa provocada por la activacion del receptor de NMDA por glutamato. Se especula que FK506 podna aumentar la fosforilacion de oxido mtrico sintasa (NOS) tras la inhibicion de calcineurina, e inhibir la actividad catalttica de NOS, impidiendo por tanto que las neuronas se vean danadas por NO. Ademas, las investigaciones han mostrado que GAP43, que estaba estrechamente relacionado con las neuronas, tambien era un sustrato de calcineurina. La regeneracion de nervio facial y nervio ciatico lesionados siempre va acompanada por un aumento evidente del nivel de ARNm de GAP43, mientras tanto, el nivel de ARNm de FKBP aumenta correspondientemente. Los resultados de investigacion indicaron que FKBP podna tener una cierta relacion con el crecimiento de nervios, y finalmente inspiraron a la gente a buscar compuestos de moleculas pequenas organicas, que pudieran fomentar el crecimiento de nervios, a partir de ligandos de FKBP, y por tanto los FKBP tambien se denominaron neuroinmunofilinas.

Animados por la opinion antes mencionada, en 1994, el estudio de Lyons, et al. mostro que el inmunosupresor FK506 tema una actividad in vitro significativa de fomentar el crecimiento de nervios, e iniciaron la investigacion de promotor de crecimiento de nervios de moleculas pequenas organicas. Aunque el mecanismo de fomentar el crecimiento y la proteccion de nervios mediante los ligandos de la familia de FKBP no se ha entendido completamente, cada vez mas investigaciones mostraron que FKBP participaban y mediaban en el proceso. Las evaluaciones biologicas, incluyendo pruebas in vitro (crecimiento de ganglio de la rafz dorsal embrionaria del pollo, diferenciacion de celulas PC12, lesiones oxidativas de cepas de celulas nerviosas, etc.) y una variedad de modelos de animales (un modelo de lesion del nervio ciatico periferico en rata, un modelo de degeneracion de nervios perifericos en rata diabetica, un modelo de animal de enfermedad de Parkinson, un modelo de animal de enfermedad de Alzheimer y similares), mostraron que algunos compuestos disenados y sintetizados basandose en la estructura de FKBP teman efectos significativos de fomentar el crecimiento y la proteccion de nervios. El compuesto tfpico es GPI1485 de Guilford Pharmaceuticals Inc., segun la empresa, se han completado las investigaciones clmicas de fase II de GPI1485 como producto terapeutico para la prevencion o el tratamiento de enfermedad de Parkinson y accidente cerebrovascular, y las investigaciones clmicas de fase III estan en curso. Simultaneamente, siguen surgiendo un gran numero de compuestos con alta actividad, permitiendo por tanto que los FKBP pasen a ser dianas importantes de los productos farmaceuticos para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa.

La solicitud de patente china n.° 01142744.2 (Substituted heza azacyclo compounds and their use as neuroregulator (compuestos de hexa-azaciclo sustituidos y su uso como neurorregulador)) y la solicitud de patente estadounidense relacionada n.° 2005/0130958 dan a conocer ligandos de FKBP con una estructura totalmente nueva y que pueden fomentar la regeneracion de nervios, de los que el compuesto 4 es un compuesto optimo. Sin embargo, las investigaciones mostraron que el compuesto tema una escasa permeabilidad de la barrera hematoencefalica, y debido al bajo punto de fusion y a estar en estado oleoso a temperatura normal, el compuesto no era adecuado para la preparacion de productos farmaceuticos para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa. Dicho compuesto 4 tambien se da a conocer en Nie et al. (Science in China Series B: Chemistry, vol. 50, n.° 3, 2007, 405-417).

Por tanto, existe una necesidad de hallar y desarrollar un compuesto novedoso con permeabilidad potenciada de la barrera hematoencefalica y util en la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa.

Sumario de la invencion

La presente invencion tiene el objetivo de proporcionar un nuevo derivado de tiazinamida, una composicion farmaceutica que contiene el compuesto y un metodo o uso de los mismos para la prevencion o el tratamiento de

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enfermedad neurodegenerativa.

El primer aspecto de la presente invencion proporciona un derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I,

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o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que,

Ri es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-6 atomos de carbono; y

R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono o alquilo lineal o ramificado que tiene 14 atomos de carbono sustituido con fenilo.

En una realizacion, la presente invencion proporciona un derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que,

Ri es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono; y

R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono o alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono sustituido con fenilo.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que,

R1 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono; y

R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que,

R1 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono; y

R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono sustituido con fenilo.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que,

R1 es isobutilo; y

R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono o alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono sustituido con fenilo.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona un derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos:

acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico, ester etflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico, ester propflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico, ester isopropflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico, ester bendlico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico, o la sal, el solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.

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El segundo aspecto de la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica, que comprende el compuesto mencionado en cualquier realizacion de dicho primer aspecto y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

En una realizacion, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica, en la que, ademas del compuesto segun cualquier realizacion de dicho primer aspecto, la composicion tambien comprende otros principios activos farmaceuticos apropiados, y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

El tercer aspecto de la presente invencion proporciona un uso del compuesto segun cualquier realizacion de dicho primer aspecto en la preparacion de un medicamento, en el que el medicamento se usa para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa provocada por lesion fisiologica o ffsica o lesiones progresivas.

En una realizacion, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica, neuropatfa relacionada con inmunodeficiencia adquirida, esclerosis multiple cerebroespinal, accidente cerebrovascular o lesion cerebral relacionada con estimulacion ffsica y diversas enfermedades neurodegenerativas que afectan al sistema nervioso central o periferico.

El cuarto aspecto de la presente invencion proporciona el compuesto segun cualquier realizacion del primer aspecto, en el que el compuesto se usa para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa provocada por lesion fisiologica o ffsica o lesiones progresivas.

En una realizacion, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica, neuropatfa relacionada con inmunodeficiencia adquirida, esclerosis multiple cerebroespinal, accidente cerebrovascular o lesion cerebral relacionada con

estimulacion ffsica y diversas enfermedades neurodegenerativas que afectan al sistema nervioso central o periferico.

El quinto aspecto de la presente invencion proporciona un metodo para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa provocada por lesion fisiologica o ffsica o lesiones progresivas en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto segun cualquier realizacion del primer aspecto o la composicion farmaceutica del segundo aspecto.

En una realizacion, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica, neuropatfa relacionada con inmunodeficiencia adquirida, esclerosis multiple cerebroespinal, accidente cerebrovascular o lesion cerebral relacionada con

estimulacion ffsica y diversas lesiones neurodegenerativas que afectan al sistema nervioso central o periferico.

El compuesto de la presente invencion puede prepararse mediante el metodo tal como se muestra en la siguiente ruta de reaccion:

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Cuando se describe el compuesto de la presente invencion, la composicion farmaceutica que contiene el compuesto, y el metodo para prevenir o tratar la enfermedad neurodegenerativa provocada por lesion fisiologica o ffsica o lesiones progresivas del sujeto usando el compuesto, los siguientes terminos tal como se usan en el presente documento tienen los siguientes significados. Si los terminos tal como se usan no se definen espedficamente, los terminos tienen los significados tal como los entienden generalmente los expertos en la tecnica.

El termino “alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-6 atomos de carbono” se refiere al alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 atomos de carbono, los grupos a modo de ejemplo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, etc.

De manera similar, el termino “alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono” se refiere al alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1, 2, 3 o 4 atomos de carbono, los grupos a modo de ejemplo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, etc.

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El termino “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a la sal del compuesto de la presente invencion que es farmaceuticamente aceptable y tiene la actividad farmacologica del compuesto original. La sal dada a conocer en el presente documento incluye aquellas derivadas de acidos inorganicos y organicos. Los ejemplos de acidos inorganicos incluyen acido clorlddrico, acido bromlddrico, acido sulfurico, acido nftrico, acido fosforico, etc.; los ejemplos de acidos organicos incluyen acido acetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentilpropionico, acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido succmico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido naftalenosulfonico, acido canforsulfonico, acido glucoheptonico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salidlico, acido estearico, acido muconico, etc. La sal tambien incluye aquellas formadas mediante sustitucion de protones acidos en el compuesto original por iones de metales, tales como iones de metales alcalinos o iones de metales alcalinoterreos; y compuestos de coordinacion formados por el compuesto original con bases organicas, los ejemplos de las bases organicas incluyen etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, etc.

El termino “solvato”, a menos que se especifique de otro modo, se refiere a una sustancia formada por complejacion del compuesto de la presente invencion mediante un disolvente farmaceuticamente aceptable. El disolvente farmaceuticamente aceptable comprende agua, etanol, acido acetico, etc. El solvato comprende aquellos solvatos estequiometricos y no estequiometricos, preferiblemente hidrato. El compuesto de la presente invencion puede cristalizarse o recristalizarse en agua o diversos disolventes organicos. En este caso, pueden formarse diversos solvatos.

El termino “sujeto” comprende mairnferos o ser humano, preferiblemente ser humano.

El termino “una cantidad eficaz” se refiere a una dosis del compuesto que es suficiente para prevenir o tratar la enfermedad cuando se administra al sujeto que lo necesita. La “cantidad eficaz” puede ajustarse segun el compuesto, la enfermedad y la gravedad de la misma, asf como la edad, el peso corporal del sujeto tratado, etc.

El termino “tratamiento” se refiere a mejorar o eliminar uno o mas smtomas de una enfermedad de un sujeto.

El termino “prevencion” se refiere a reducir el riesgo de que un sujeto padezca una enfermedad, concretamente puede prevenirse al menos uno de los smtomas clmicos de una enfermedad para un sujeto que puede estar en contacto con o ser propenso a la enfermedad y no padece o muestra los smtomas de la enfermedad.

El termino “excipientes farmaceuticamente aceptables” se refiere a cualquier excipiente que se use convencionalmente en el campo de las preparaciones farmaceuticas. La seleccion de excipientes espedficos dependera de los metodos de administracion para tratar al paciente o los tipos de enfermedad y estados patologicos particulares. Por ejemplo, los excipientes farmaceuticamente aceptables comprenden diluyentes, transportadores, cargas, aglutinantes, humectantes, agentes disgregantes, potenciadores de la absorcion, tensioactivos, transportadores de adsorcion, lubricantes y similares convencionales en el campo farmaceutico. Si es necesario, pueden anadirse agentes saborizantes, conservantes, edulcorantes y similares en la composicion farmaceutica. El metodo de preparacion de una composicion farmaceutica apropiada para un modo de administracion espedfico esta dentro del alcance del conocimiento de los expertos en el campo farmaceutico.

La composicion farmaceutica de la presente invencion puede administrarse de cualquier manera y en cualquier forma comunmente usada en la tecnica. Por ejemplo, la composicion farmaceutica de la presente invencion puede administrarse de una manera seleccionada de las siguientes: administracion oral, inhalacion de pulverizacion, administracion rectal, administracion nasal, administracion vaginal, administracion topica, administracion parenteral, tal como inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal o intracraneal, preferiblemente administracion oral, inyeccion intramuscular e inyeccion intraperitoneal o intravenosa.

La composicion farmaceutica de la presente invencion puede producirse en forma de una dosis unitaria para administracion. Las formas de dosificacion pueden ser formas de dosificacion lfquidas o formas de dosificacion solidas. Las formas de dosificacion lfquidas pueden ser del tipo de disolucion, tipo coloidal, tipo de emulsion o tipo de suspension y similares. Las formas de dosificacion solidas pueden ser comprimidos, polvo, supositorios, granulos o capsulas y similares. Otras formas de dosificacion comprenden aerosoles, implantes, parches o linimentos y similares.

En terminos generales, se ha demostrado que es ventajoso que la dosificacion del compuesto de la presente invencion sea de aproximadamente 1-1000 mg cada 24 h, preferiblemente 5-500 mg ya sea para uso en seres humanos o veterinario. Si resulta apropiado, la dosificacion diaria puede administrarse en varias veces usando multiples unidades de dosificacion para lograr los efectos deseados. El contenido del compuesto de la presente invencion en la unidad de dosificacion puede ser de 1-200 mg, preferiblemente 1-100 mg. Sin embargo, la dosificacion de administracion espedfica depende del tipo y el peso corporal del sujeto que va a tratarse, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad, el tipo de la preparacion, el modo de administracion del producto farmaceutico, el periodo de administracion o los intervalos de tiempo y similares.

Segun la presente invencion, el compuesto de formula I puede penetrar a traves de la barrera hematoencefalica, y es mejor que el compuesto 4 en la solicitud de patente china n.° 01142744.2, dando por tanto como resultado una

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mayor biodisponibilidad. Ademas, en comparacion con el compuesto 4 en la solicitud de patente china n.° 01142744.2, el compuesto de formula I es un cristal blanco, por tanto puede procesarse facilmente. El compuesto es un producto cristalino estable con alto punto de fusion, cuyo producto solido esta suelto y tiene buena fluidez. Por tanto, el compuesto de formula I es adecuado para la preparacion y el procesamiento industriales a gran escala, en particular para el procesamiento farmaceutico que requiere calor o produce calor, tal como trituracion, secado por calentamiento, secado en lecho fluidizado, esterilizacion a alta temperatura y alta presion y similares. Ademas, el compuesto de la presente invencion tiene un efecto significativamente mejor en comparacion con el compuesto 4 en la solicitud de patente de invencion china n.° 01142744.2 en la evaluacion de la eficacia frente a isquemia cerebral incompleta de raton.

Basandose en los experimentos completados por los inventores y los resultados de los mismos, se espera que el compuesto de la presente invencion pueda fomentar el crecimiento y la regeneracion de nervios en diversos estados de neuropatfa, incluyendo enfermedad neurologica que esta relacionada con neurodegeneracion, y neuropatfas provocadas por diversas lesiones ffsicas (tales como lesion o choque mecanicos) o enfermedades (tales como diabetes o enfermedad de deficiencia autoinmunitaria adquirida), por tanto puede usarse para la prevencion o el tratamiento de enfermedad neurodegenerativa, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica o accidente cerebrovascular.

Descripcion detallada de las realizaciones

Las siguientes realizaciones son realizaciones a modo de ejemplo usadas para ilustracion adicional y no deben interpretarse como limitacion de la presente invencion.

El punto de fusion de un compuesto se midio mediante un aparato de punto de fusion RY-1, y el termometro no se calibro. Se midio la 1H-RMN mediante un instrumento de RMN ARX-400. Se midieron espectros de masas mediante un instrumento de EM VG-ZabSpec. A menos que se indique de otro modo, todos los disolventes usados para reacciones se sometieron a un tratamiento previo convencional.

Ejemplo 1: 2-hidroxietil-cistema

Se anadieron 109 g (0,9 mol) de L-cistema a un matraz de fondo redondo de 2000 ml, se disolvieron con 1000 ml de agua destilada, se enfriaron hasta 10°C en un bano de hielo, y se neutralizaron hasta pH~7 con 24 ml de disolucion de NaOH 1 M. Se llevaron 100 ml de oxido de etileno, que se habfa enfriado previamente, a 10°C y se anadieron a la mezcla anterior, se hizo reaccionar la mezcla durante 1 h mientras se mantema la temperatura a 10°C, despues se aumento la temperatura hasta temperatura ambiente y se continuo la reaccion durante otras 1,5 h.

Se extrajo la mezcla con 400 ml X 4 de etil eter para retirar el oxido de etileno sin reaccionar. Se elimino la fase acuosa mediante destilacion por debajo de 60°C, se obtuvo un solido amarillo, se recristalizo en agua y etanol en una razon de 85 ml: 350 ml, se filtro, se lavo abundantemente con etanol al 95% para proporcionar el compuesto objetivo como solido en copos blanco, en el que el p.f. (punto de fusion) fue de 195-196°C, el peso fue de aproximadamente 100 g y el rendimiento es del 67,5%.

1H-RMN (400 MHz, D2O) 8: 3,96131 (dd, 1H, Ji=4,272 Hz, J2=7,816 Hz), 3,80680-3,77293 (m, 2H), 3,17887 (dd, 1H, Ji=4,268 Hz, J2=14,814 Hz), 3,08224 (dd, 1H, Ji=7,480 Hz, J2=14,814 Hz), 2,80103 (t, 2H, J= 6,036 Hz).

Ejemplo 2: clorhidrato de 2-cloroetil-cistema

Se anadieron 44 g de 2-hidroxietil-cistema a un matraz de fondo redondo de 1000 ml, se disolvieron en 600 ml de acido clortndrico concentrado, se calentaron hasta que la temperatura exterior fue de 90-95°C, se agitaron y se hicieron reaccionar durante 7 h. Tras la reaccion, se refrigero el sistema y se dejo reposar durante la noche, y se precipito una gran cantidad de solido de tipo agujas del sistema. Se elimino el disolvente mediante filtracion con succion, se seco el solido obtenido de manera natural para dar un solido de color blanco grisaceo en el que el p.f. es de 185-186°C, el peso es de aproximadamente 40 g y el rendimiento es de mas del 70%. 1H-RMN (400 MHz, D2O) 8: 4,30477-4,26952 (m, 1H), 3,81913-3,78409 (m, 2H), 3,25903 (dd, 1H, Ji=4,444 Hz, J2=14,984 Hz), 3,18877 (dd, 1H, Ji=7,352 Hz, J2=15,072 Hz), 3,04410-3,00625 (m, 2H).

Ejemplo 3: clorhidrato de acido (3R)-tiomorfolin-3-carboxflico

Se disolvieron 20 g de clorhidrato de 2-cloroetil-cistema en agua, se anadio gota a gota una disolucion acuosa de NaHCO3 que contema 7,2 g de NaHCO3 en un bano de hielo, tras la adicion, se agito completamente la mezcla para la neutralizacion, se extrajo con acetato de etilo tres veces, se combinaron las fases organicas y se secaron con Na2SO4.

Se elimino el disolvente a presion reducida, se anadieron 400 ml de metanol absoluto y se agito el sistema a temperatura ambiente durante 5 dfas. Se elimino el disolvente a presion reducida y se recristalizo el residuo en metanol y etil eter para dar aproximadamente 6 g de un solido casi blanco, en el que el p.f. es de 160-161°C. 1H- RMN (400 MHz, DMSO-d6) 8: 10,0898 (s.a., 2H), 4,4214 (dd, 1H, Ji=3,52 Hz, J2= 8,56 Hz), 3,7833 (s, 3H), 3,49863,4766 (m, 1H), 3,2246-3,0606 (m, 3H), 2,9897-2,9593 (m, 1H), 2,8763-2,8622 (m, 1H); EM (FAB) m/z: 162,0 (M-

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35,5), 102,0, 74,0.

Ejemplo 4: acido (3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carboxflico

Se suspendieron 13,0 g de clorhidrato de acido (3R)-tiomorfolin-3-carbox^lico en 120 ml de diclorometano, se enfriaron hasta 0°C, se anadieron lentamente por goteo 30 ml de trietilamina, se agito la mezcla durante 1 h, despues se anadieron lentamente por goteo 120 ml de disolucion de 13,5 g de cloruro de p-toluenosulfonilo disueltos en diclorometano, se hizo reaccionar la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 24 h, se filtro para retirar un precipitado blanco, se lavo sucesivamente el filtrado con disolucion saturada de bicarbonato de sodio y agua, se seco con sulfato de sodio anhidro, se retiro el agente de secado, se elimino el diclorometano mediante destilacion para obtener un solido blanco, se recristalizo en acetato de etilo y ciclohexano para obtener 19,4 g de cristales blancos, en los que el rendimiento fue del 93,5%, el p.f. fue de 87-88°C y la rotacion espedfica [a]o24,5=-78,1° (c 2,00, CH2Cl2). 1H-RMN (400 MHz, CDCh) 8: 7,66938 (d, 2H, J=7,352 Hz), 7,29941 (d, 2H, J=8,036 Hz), 5,06654 (t, 1H, J=3,436 Hz), 4,04908-3,99999 (m, 1H), 3,63087 (s, 3H), 3,45333-3,38197 (m, 1H), 3,06102-3,02157 (m, 1H), 3,00305-2,95904 (m, 1H), 2,82287-2,74967 (m, 1H), 2,42975 (s, 3H), 2,40451-2,36514 (1H).

Ejemplo 5: ester etflico del acido (2S)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico

Se anadieron 6 ml (0,042 mol) de TEA a una mezcla de 4,2 g (0,14 mol) de acido (3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)- tiomorfolin-3-carboxflico, 3,0 g (0,017 mol) de clorhidrato de ester etflico de L-leucina, 3,2 g (0,014 mol) de DCC y 1,7 g (0,014 mol) de DMAP en 200 ml de CH2Cl2, y se hizo reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 24 h. Tras la reaccion, se retiro el solido mediante filtracion con succion, se elimino el disolvente mediante evaporacion, se disolvio el residuo con una cantidad apropiada de acetato de etilo, se filtro para retirar la materia insoluble, se diluyo con acetato de etilo, se lavo sucesivamente con disolucion al 10% de NaHCO3 y disolucion saturada de NaCl, se seco con Na2SO4. Se retiro el agente de secado, se elimino el acetato de etilo mediante evaporacion, se separo el residuo mediante columna de cromatograffa ultrarrapida (eluyente: CH2Ch:CH3Cl = 1:1), para obtener 4,0 g de material oleoso.

1H-RMN (400 MHz, CDCh): 8 7,77337-7,75377 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,37582-7,264111 (d, 2H, J=8,4 Hz), 6,79090 (d, 1H, J=8,644 Hz), 4,79698-4,58466 (m, 2H), 4,31444-4,08398 (m, 3H), 3,31989-3,11674 (m, 2H), 2,53154-2,45847 (m, 5H), 2,24620-2,21545 (m, 1H), 1,69352-1,65150 (m, 7H), 0,97759-0,94891 (m, 10H); EM (EI) m/z: 443,4, 397,2,

369.2, 263,1, 256,1, 155,0, 139,2, 101,1.

Ejemplo 6: ester etflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico

Segun el ejemplo 5, se obtuvo ester etflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3- carbonil]-amino}-pentanoico como un cristal blanco a partir de clorhidrato de ester etflico de D-leucina, en el que el rendimiento fue del 83,5%, el p.f. fue de 93-95°C y la rotacion espedfica [a]o24,5=-35,4°. 1H-RMN (400 MHz, CDCh): 8 7,77337-7,75377 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,37582-7,264111 (d, 2H, J=8,4 Hz), 6,79090 (d, 1H, J=8,644 Hz), 4,796984,58466 (m, 2H), 4,31444-4,08398 (m, 3H), 3,31989-3,11674 (m, 2H), 2,53154-2,45847 (m, 5H), 2,24620-2,21545 (m, 1H), 1,69352-1,65150 (m, 7H), 0,97759-0,94891 (m, 10H); EM (EI) m/z: 443,4, 397,2, 369,2, 263,1, 256,1, 155,0,

139.2, 101,1.

Ejemplo 7: ester propflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}- pentanoico

Segun el ejemplo 5, se obtuvo ester propflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3- carbonil]-amino}-pentanoico como un cristal blanco a partir de clorhidrato de ester propflico de D-leucina, en el que el rendimiento fue del 87,5%, el p.f. fue de 96-98°C y la rotacion espedfica [a]o24,5=-38,1°. 1H-RMN (400 MHz, CDCh): 8 7,76337-7,74277 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,37782-7,35712 (d, 2H, J=8,4 Hz), 6,76390-6,74745 (d, 1H, J=8,644 Hz), 4,79598-4,70066 (m, 2H), 4,28444-4,08098 (m, 3H), 3,54489-3,53274 (t, 1H, J=2,6 Hz), 3,14892 (d, 1H, J=13,676), 2,56954-2,42247 (m, 5H), 2,23720-2,19945 (m, 1H), 1,70552-1,62350 (m, 5H), 0,95459-0,93291 (m, 9H); EM (EI) m/z: 457,3, 397,2, 369,3, 256,2, 174,0, 118,1, 101,1.

Ejemplo 8: ester isopropflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}- pentanoico

Segun el ejemplo 5, se obtuvo ester isopropflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3- carbonil]-amino}-pentanoico como un cristal blanco a partir de clorhidrato de ester isopropflico de D-leucina, en el que el rendimiento fue del 91,5%, el p.f. fue de 89-91°C y la rotacion espedfica [a]o24, =-43,9°. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): 8 7,76237-7,74077 (d, 2H J=8,208 Hz), 7,37382-7,26511 (d, 2H, J=8,208 Hz), 6,75090 (d, 1H, J=8,944 Hz), 5,40112 (m, 1H), 4,79298-4,25166 (m, 3H), 3,54989-3,53674 (t, 1H, J=12,31110), 3,15292-3,11800 (d, 1H, J=13,676 Hz), 2,56054-2,46247 (m, 4H), 2,23220-2,20345 (m, 1H), 1,62552-1,43450 (m, 4H), 1,26202-1,24745 (m, 6H), 0,94659-0,93191 (m, 6H); EM (EI) m/z: 457,3, 397,2, 369,2, 256,2, 154,7, 101,1.

Ejemplo 9: ester bendlico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}- pentanoico

Segun el ejemplo 5, se obtuvo ester bendlico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3- carbonil]-amino}-pentanoico como un cristal blanco a partir de clorhidrato de ester bendlico de D-leucina, en el que el rendimiento fue del 83,5%, el p.f. fue de 91-93°C y la rotacion espedfica [a]D24,5=-33,1°. 1H-RMN (400 MHz, CDCls): 8 7,75237-7,71377 (d, 2H, J=1,2 Hz), 7,36382-7,26322 (m, 7H), 6,73090 (m, 1H), 5,18600-5,11600 (2H, m), 5 4,78698-4,75466 (m, 2H), 4,24244-4,10298 (m, 1H), 3,37689-3,09274 (m, 2H), 2,52054-2,44547 (m, 5H), 2,06820

2,04745 (m, 1H), 1,66552-1,25450 (m, 3H), 0,92259-0,90691 (m, 6H); EM (EI) m/z: 505,6, 475,1, 457,6, 434,7, 399,0, 370,8, 336,7, 308,3, 272,4, 232,6, 148,8, 106,5.

Ejemplo 10: acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico

Segun el ejemplo 5, se obtuvo acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}- 10 pentanoico como un cristal blanco a partir de D-leucina, en el que el rendimiento fue del 77,5%, el p.f. fue de 87- 89°C y la rotacion espedfica [a]D24,--86,7°. 1H-RMN (400 MHz, CDCls): 8 7,75237-7,71377 (d, 2H, J=1,2 Hz), 7,36382-7,26322 (m, 7H), 6,73090 (m, 1H), 5,18600-5,11600 (2H, m), 4,78698-4,75466 (m, 2H), 4,24244-4,10298 (m, 1H), 3,37689-3,09274 (m, 2H), 2,52054-2,44547 (m, 5H), 2,06820-2,04745 (m, 1H), 1,66552-1,25450 (m, 3H), 0,92259-0,90691 (m, 6H); EM (EI) m/z: 505,6, 475,1, 457,6, 434,7, 399,0, 370,8, 336,7, 308,3, 272,4, 232,6, 148,8, 15 106,5.

Ejemplo 11: evaluacion de la actividad neurotrofica del compuesto

La actividad neurotrofica del compuesto de la presente invencion puede reflejarse en una variedad de modelos biologicos in vitro, tales como un modelo de cultivo libre de suero in vitro de ganglios de la rafz dorsal embrionaria de pollo. Se usaron embriones de pollo incubados durante 8 d, y se expusieron medula espinal y ganglios a los dos 20 lados a un microscopio de diseccion en entorno esteril. Se cogieron los ganglios de la rafz dorsal uno a uno con pinzas, se inocularon en frascos de cultivo en los que se habfa dispuesto colageno de cola de rata segun 56 ganglios de la rafz dorsal por frasco, se prepararon dos frascos por dosis, y se cultivaron a 37°C, el 5% de CO2, durante 1 h en una incubadora para determinar la adherencia, despues se les anadio medio de cultivo libre de suero, DMEM, que contema NGF (0,15 ng/ml) y el compuesto de la presente invencion, mientras que al grupo de control 25 solo se le anadio el medio de cultivo y la misma dosis de NGF. Tras cultivarse en la incubadora durante 48 h, se observo el crecimiento de la neurita alrededor de ganglios de la rafz dorsal con un microscopio de contraste de fase invertido y se puntuo segun la longitud y densidad de la neurita, en el que 0 puntos representa ausencia de neurita; 1 punto representa que la neurita era escasa; 2 puntos representan que la neurita era relativamente larga o densa; y 3 puntos representan que la neurita era larga y densa. En la tabla 1 se muestra la puntuacion del crecimiento de 30 neurita de ganglio de la rafz dorsal embrionaria de pollo con el fomento del compuesto de la presente invencion con diferentes dosificaciones, en la que cada puntuacion es un promedio de cinco ganglios de la rafz dorsal.

Tabla 1: Resultados de evaluacion de actividad de compuestos en fomentar rafz dorsal embrionaria de pollo

Grupo

Puntuacion media

Medio de cultivo + NGF (0,15 ng/ml) (grupo de control)

0,33

Ejemplo 5 (1 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

0,65

Ejemplo 5 (100 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

1,55

Ejemplo 6 (1 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

1,23

Ejemplo 6 (100 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

1,88

Ejemplo 7 (1 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

1,46

Ejemplo 7 (100 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

1,95

Ejemplo 8 (1 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

1,68

Ejemplo 8 (100 pM) + NGF (0,15 ng/ml)

2,25

Ejemplo 12: evaluacion de la farmacodinamia in vivo de compuestos para accidente cerebrovascular 1. Esquema experimental

35 El ejemplo, que tomo ratones Kunming como sujetos de experimentacion, investigo la proteccion de la administracion preventiva del compuesto de la presente invencion frente a isquemia cerebral incompleta de ratones, mediante administracion intravenosa e intragastrica, en el modelo de oclusion bilateral de arteria carotida de raton con baja tension arterial (BCAO-LBP), midiendo la puntuacion de funcion neurologica y el contenido de MDA en el cerebro.

40 2 Metodos experimentales

2.1 Preparacion de farmacos

2.1.1 Preparacion de CMC-Na al 0,7%: el dfa antes del uso, se pesaron 0,7 g (700 mg) de polvo seco de CMC-Na, se anadieron a 100 ml de agua destilada, se calento la mezcla y se agito moderadamente, y se dejo reposar durante la noche para mezclarse de manera completa y uniforme tras disolverse completamente, se conservo mediante

45 sellado.

5

10

15

20

25

30

35

40

2.1.2 Preparacion de farmaco para administracion intragastrica: se preparo el compuesto de la presente invencion como 30 mg/kg usando CMC-Na al 0,7%, se mezclo de manera completa y uniforme con sonicacion para proporcionar una disolucion de 1,5 mg/ml. Se realizo la administracion intragastrica (i.g.) segun 0,2 ml/10 g.

2.1.3 Preparacion de DMSO al 10%: Se transfirieron 1000 |il de DMSO (analtticamente puro) a 9 ml de N.S. con una micropipeta y se mezclaron de manera uniforme. Se preparo cuando era necesario.

2.1.4 Preparacion de farmaco para administracion intravenosa: en primer lugar se disolvio el compuesto de la presente invencion con una pequena cantidad de DMSO, se anadio N.S. para alcanzar el volumen requerido tras varios minutos y se mezclo de manera completa y uniforme para dar la disolucion de 1 mg/ml (la concentracion final del DMSO era del 10%), se preparo cuando era necesario. Se inyecto la disolucion en la vena caudal segun 0,1 ml/10 g, en la que la dosificacion en ratones era de 10 mg/kg.

2.2 Grupo y administracion

2.2.1 Observacion del efecto contra la isquemia cerebral de compuestos de la presente invencion mediante administracion intragastrica

Se dividieron 28 ratones que se habfan adaptado al entorno de laboratorio durante una semana, en grupos equilibrados segun el peso corporal, se les administro por via i.g. respectivamente CMC-Na al 0,7% o el compuesto de la presente invencion, una vez al dfa durante 3 d en continuo. Los grupos espedficos fueron los siguientes:

grupo de operacion simulada: 4 ratones, con disolucion de CMC-Na al 0,7% por via i.g.

grupo de modelo de isquemia cerebral: 12 ratones, con disolucion de CMC-Na al 0,7% por via i.g.

grupo de farmaco: 12 ratones, con disolucion de compuestos de la presente invencion por via i.g. por separado, en el que la dosificacion era de 30 mg/kg.

2.2.2 Observacion del efecto contra la isquemia cerebral de compuestos de la presente invencion mediante administracion intravenosa

Se dividieron 28 ratones que se habfan adaptado al entorno de laboratorio durante una semana, en grupos equilibrados segun el peso corporal, se les administro por via i.v. DMSO al 10% o el compuesto de la presente invencion, respectivamente, una vez al dfa durante 3 d en continuo. Los grupos espedficos fueron los siguientes:

grupo de operacion simulada: 4 ratones, con disolucion de DMSO al 10% por via i.v.

grupo de modelo: 12 ratones, con disolucion de DMSO al 10% por via i.v.

grupo de farmaco: 12 ratones, con disolucion de compuestos de la presente invencion por via i.v. por separado, en el que la dosificacion era de 10 mg/kg.

2.3 Determinacion de isquemia cerebral global incompleta y contenido de MDA en el cerebro de los ratones

2.3.1 Ligamiento de arteria carotida bilateral de raton: se sometio el raton a sangna orbital (aproximadamente el 30% del volumen de sangre total del raton) para reducir la tension arterial 1 h tras la ultima administracion, despues se fijo el raton a una placa para cirugfa en una posicion supina, y se realizo una incision en el centro del cuello. Se expuso la arteria carotida comun con separacion roma, y se prepararon 2 suturas debajo de cada extremo de la arteria expuesta, y se ligaron ambos extremos de la arteria, respectivamente. Cuando se completo el ligamiento para la tercera sutura, se inicio el cronometro, despues se corto la arteria carotida comun entre los dos ligamientos, y se cosio la incision con sutura. En el grupo de operacion simulada, se separo la arteria carotida comun sin ligamiento. Se libero el raton rapidamente tras la operacion, se observo y se registro el comportamiento en 6 h y la hora de la muerte del raton (se puntuo mediante un metodo ciego segun la siguiente tabla). Se extrajo el cerebro rapidamente tras la muerte, se extirpo el cerebelo, y se determino el contenido de MDA en el cerebro completo mediante un metodo de TBA. El raton que no murio tras 6 h, se sacrifico y se extrajo el cerebro.

2.3.2 Puntuacion de funcion neural: la norma de puntuacion se muestra en la tabla 2.

Tabla 2: Tabla de evaluacion del comportamiento neurologico

(1) Colocar el raton en el suelo 4 puntos

(Si se producen simultaneamente varios de los siguientes comportamientos, registrar el comportamiento mas grave; si el raton no se mueve, empujarle suavemente en el trasero para estimular al raton a que se mueva) Actividades normales 0 puntos

Trayectoria de deambular curva, pero sin dar vueltas (sin aparicion del fenomeno de parte trasera) 1 punto Dar vueltas, con aparicion del fenomeno de parte trasera (registrar el sentido de rotacion, sentido de las agujas del reloj o contrario a las agujas del reloj)

Dar vueltas 1-2 veces__________________________________________________________________1 punto

5

10

15

20

25

Dar vueltas 3-5 veces

2 puntos

Dar vueltas mas de 5 veces Rodar (registrar el sentido de rodamiento, izquierda o derecha)

3 puntos

Rodar 1-2 veces

1 punto

Rodar 3-5 veces

2 puntos

Rodar mas de 5 veces

3 puntos

Hemiplejfa (registrar el sentido de hemiplejfa, izquierda o derecha)

4 puntos

(2) Actividades anomalas

8 puntos

Distoma (movimientos de torsion involuntarios, que dan como resultado posturas que son persistentes y con

frecuencia raras), crisis epilepticas (perdida de conciencia repentina, caerse al suelo, hipsocinesis de cabeza y

rigidez de extremidades) y miocloma (convulsiones) Excitacion (saltar)

1 punto

Saltar 1-2 veces

1 punto

Saltar 3-5 veces

2 puntos

Saltar mas de 5 veces

3 puntos

Estacionario o respiracion sibilante ocasional (si se produce hemiplejfa, registrar la hemiplejfa) 4 puntos: muerte inmediatamente tras una operacion (en el plazo de 10 min)

2 puntos

(3) Perdida de reflejos

1 punto

Reflejos auriculares (el raton agita la cabeza cuando se toca el canal auditivo del raton)

1 punto Total 13 puntos

2.3.3 Determinacion del contenido de MDA en el cerebro de ratones

Se extrajo el cerebro de un raton, se peso, se preparo en homogeneizado de cerebro al 15% con N.S., se extrajeron 1,2 ml del homogeneizado y se pusieron en un bano de agua a 37°C durante 1 h (con agitacion una vez cada 10 min), despues se extrajo del agua, se le anadieron 0,6 ml de acido tricloroacetico al 20%, se mezclo uniformemente y se dejo reposar durante 10 min, se centrifugo a 2000 r durante 10 min, a 1,2 ml de fluido sobrenadante se le anadieron 0,6 ml de TBA al 0,67%, y se pusieron en un bano de agua en ebullicion durante 10 min, despues se enfrio y se determino el valor de DO a 532 nm.

3. Analisis estadfstico

Se representaron los datos experimentales mediante x ± EEM, se aplico el software estadfstico SPSS13.0, se evaluo la homogeneidad de varianza mediante analisis de la varianza de un solo factor. Se sometio a prueba la homogeneidad de varianza mediante MDS, se sometio a prueba la no homogeneidad de varianza mediante la prueba T3 de Dunnett, se compararon las diferencias significativas entre los grupos y P < 0,05 represento una significacion estadfstica. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3: Resultados de la evaluacion del contenido de MDA y la puntuacion de comportamiento neurologico de compuestos en ratones BCAO-LBP (x ± EEM )

Tratamiento (i.g.)

n Contenido de MDA (nmol/g) Puntuacion de deficit neural

Control

4 33,15 + 2,75 0,00 + 0,00

Medio

11 40,94 + 1,754* 3,92 + 0,25**

Ejemplo 5 (30 mg/kg)

12 36,09 + 1,85 3,62 + 0,31

Ejemplo 6 (30 mg/kg)

12 30,87 + 0,95### 3,08 + 0,40

Ejemplo 7 (30 mg/kg)

11 34,90 + 1,65## 2,91 + 0,28

Ejemplo 8 (30 mg/kg)

12 33,27 + 1,91## 2,67 + 0,31#

*p<0,05, en comparacion con el grupo de control; **p<0,01, en comparacion con el grupo de control; #p<0,05, en comparacion con el grupo de medio; ##p<0,01, en comparacion con el grupo de medio; ###p<0,001, en comparacion con el grupo de medio; analizado con ANOVA seguido por MDS con SPSS 13.0 que se usa para el analisis.

Ejemplo 12: Evaluacion de la permeabilidad de la barrera hematoencefalica e investigaciones sobre la permeabilidad de membrana de celulas MDCK-MDR1 de los compuestos

1. Esquema experimental

Las celulas MDCK-MDR1 son celulas en monocapa con alta expresion de un transportador de P-gp tras transfectar genes de MDR1 en MDCK (celulas epiteliales de rinon caninas Madin-Darby). Debido a la compacidad de las celulas en monocapa y la alta expresion de una protema de eflujo farmaceutica, las celulas tienen una similitud con la estructura de la barrera hematoencefalica (BHE), y pueden usarse como uno de los modelos para evaluar la permeabilidad de la BHE. Dado que los compuestos de la presente invencion se dirigfan al sistema nervioso central y necesitaban penetrar la BHE, se aplicaron las celulas MDCK-MDR1 para investigar la permeabilidad de la membrana, y se evaluo de manera preliminar la permeabilidad de la BHE.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2 Metodos experimental

2.1 Preparacion de disoluciones

Preparacion de una disolucion de cultivo: cuando se usa, a DMEM se le anadieron FBS al 10%, glutamina al 1%, 100 U ml-1 de disolucion de antibioticos dobles de penicilina y estreptomicina, aminoacidos no esenciales al 1% y

1.2 mg-L'1 de G418.

Preparacion de una disolucion de digestion: se pesaron 1 g de tripsina y 80 mg de EDTA, se les anadieron 400 ml de disolucion tampon de fosfato, se filtraron con una membrana de filtro de 0,22 |im para eliminar bacterias, y se almacenaron a -20°C para su uso posterior.

Preparacion de una disolucion madre de glutamina: a 2,92 g de glutamina se les anadieron 100 ml de disolucion tampon de PBS, se filtraron con una membrana de filtro de 0,22 |im para eliminar bacterias, se envasaron en subdivisiones de 1 ml y se almacenaron a -20°C para su uso posterior.

Preparacion de una disolucion madre de penicilina y estreptomicina: a 0,8 millones de U de penicilina se les anadieron 20 ml de solucion salina; a 1 millon de U de estreptomicina se les anadieron 25 ml de solucion salina; se mezclaron uniformemente las dos disoluciones en una razon de 1:1, se filtraron con una membrana de filtro de 0,22 |im para eliminar bacterias, se envasaron en subdivisiones de 1 ml, y se almacenaron a -20°C para su uso posterior.

Preparacion de una disolucion HBSS: se anadieron 8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 0,0475 g de Na2HPO4H2O, 0,06 g de KH2PO4 y 6 g de Hapes a agua ultrapura para su disolucion, se ajusto el valor de pH a 7,2-7,4, se anadio agua hasta 1 l, se filtro con membrana de filtro de 0,22 |im para eliminar bacterias, y se almaceno a -20°C para su uso posterior.

2.2 Cultivo celular

Se descongelaron rapidamente celulas MDCK-MDR1 crioconservadas, en un bano de agua a 37°C. Se anadieron las celulas tras la descongelacion a un medio de cultivo DMEM que contema FBS al 10%, se cultivaron en una incubadora a 37°C, el 5% de CO2, con una humedad relativa del 90%, y se sustituyo el medio de cultivo cada dos dfas. Tras un crecimiento de 1-2 dfas para la fusion celular, se digirieron las celulas a 37°C, con la disolucion de digestion mixta de tripsina al 0,25%-EDTA (0,2%), y se subcultivaron segun una determinada razon, en la que las celulas usadas para el experimento son celulas de la generacion 40~60.

Cuando se fusionaron el 80% de las celulas, se suspendieron las celulas con un medio de cultivo completo y se inocularon en una placa Millicell segun 1X106 ml-1. Se cambio la disolucion de cultivo una vez cada dos dfas, despues una vez cada dfa tras 1 semana. Tras cultivarse durante 5 dfas, las celulas estaban listas para el experimento de transporte cuando la resistencia alcanza una meseta (> 200 Qcm2).

2.3 Control de calidad de celulas en monocapa MDCK-MDR1:

2.3.1 Medicion de la resistencia electrica transepitelial (TEER)

Cuando se midio la resistencia electrica transepitelial, en primer lugar se sumergio el electrodo en disolucion de cultivo de DMEM y se equilibro durante 24 h, despues se extrajo el electrodo y se sumergio en alcohol al 70% y se esterilizo durante 15 min, despues se puso a temperatura ambiente, se seco de manera natural, y se puso adicionalmente en la disolucion de cultivo de DMEM esteril y se equilibro durante 15 min. Durante el experimento, se insertaron secuencialmente los dos extremos del electrodo en los banos superior e inferior de cada pocillo de una placa de cultivo Millicell de 24 pocillos para detectar la resistencia, se midio cualquier punto en cada pocillo tres veces, se registro la resistencia, se midio simultaneamente la resistencia de un pocillo de blanco y se calculo la resistencia electrica transepitelial (TEER) segun la siguiente formula:

TEER = (Rt-R0) x S

donde, Rt es la resistencia medida; R0 es la resistencia del pocillo de blanco; y S es el area de membrana efectiva.

2.3.2 Control de calidad de compuesto positivo:

Se tomo Rho-123 (rodamina 123) como compuesto de control de calidad positivo, se diluyo hasta 5 |imolT1 con HBSS, en primer lugar se extrajo el medio de cultivo en los pocillos mediante succion antes del experimento, se lavaron los pocillos con disolucion HBSS a 37°C dos veces, despues se incubaron en una incubadora a 37°C, se anadio Rho-123 a los banos superiores, se anadio disolucion HBSS a los banos inferiores, y se incubaron los pocillos en un agitador a temperatura constante. Se recogio la disolucion en los banos inferiores a los 0, 30, 90 y 120 min y se almaceno a -20°C para su medicion posterior. Se detecto la cantidad de penetracion de Rho-123 en los banos inferiores mediante un espectrofotometro de fluorescencia, en el que se fijo la longitud de onda de transmision a 430 nm y se fijo la longitud de onda de excitacion a 530 nm. El valor de Papp de Rho-123 en el experimento

concuerda con informes de la bibliograffa.

2.4 Experimento de transporte farmaceutico

Se empapo la placa Millicell inoculada con celulas con disolucion HBSS a 37°C durante un tiempo apropiado antes de la prueba, y se lavo ligeramente para eliminar el material adherido a las superficies de las celulas. Permeabilidad 5 desde la superficie de la cavidad hasta la superficie basal: se anadieron 0,35 ml de disolucion HBSS que contema farmaco desde el lado apical (AP), mientras que se anadieron 1,2 ml de disolucion HBSS de blanco desde el lado basolateral (BL), se pusieron a 37°C, se agitaron a 50 rmin-1, se tomaron muestras de 50 |il de la fase inferior a los 0, 30, 90 y 120 min por separado, y se complemento con el mismo volumen de disolucion HBSS de blanco. Se repitio cada concentracion en tres pocillos, a la muestra se le anadieron con precision 50 |il de disolucion de patron 10 interno y 350 |il de acetato de etilo, se agito y se mezclo uniformemente, se centrifugo a 12000 rpm durante 5 min, se extrajeron 300 |il de sobrenadante, se volatilizo hasta sequedad, se redisolvio con 50 |il de acetonitrilo y se extrajeron 10 |il para toma de muestras y determinacion. Permeabilidad desde la superficie basal hasta la superficie de la cavidad: se anadio farmaco desde el lado basolateral (BL), mientras que se anadio la disolucion HBSS de blanco desde el lado apical (AP), y las etapas siguientes fueron las mismas que aquellas en la prueba de 15 permeabilidad desde la superficie de la cavidad hasta la superficie basal.

El coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) del farmaco reflejo la capacidad de penetrar a traves de las celulas en monocapa del farmaco y la velocidad y grado de absorcion del farmaco, que pueden calcularse mediante la siguiente formula:

P

“PP

A Q

A t • A ■ C

20 donde, AQ era la cantidad de penetracion del farmaco en un periodo de tiempo At, A era el area de superficie de las

celulas, concretamente el area (0,6 cm2) de una membrana de soporte en el modelo, y C0 era la concentracion inicial. La unidad de la Papp se representaba comunmente mediante cmh-1 o cms-1.

2.5 Deteccion de muestras

Se detecto la muestra mediante CL/EM. Se cuantifico la concentracion de cada muestra con una curva patron 25 (50 nM-10000 nM).

3. Resultados experimentales

Farmacos

Papp (x10-6)

Rodamina 123

4,89

Ejemplo 6

19,2

Ejemplo 7

49,8

Ejemplo 8

39,5

Ejemplo 9

12,4

Ejemplo 10

34,1

Ejemplo 5

8,38

Claims (7)

1.

5

2.

10

3.

15

4.

20

5.

25

6.

REIVINDICACIONES

Derivado de tiazinamida que tiene una estructura de formula I,

imagen1

o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que,

Ri es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-6 atomos de carbono; y

R2 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono o alquilo de cadena lineal o

ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono y esta sustituido con fenilo.

Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que,

R1 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono; y

R2 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono o alquilo de cadena lineal o

ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono y esta sustituido con fenilo,

o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.

Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que,

R1 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono; y R2 es un alquilo de cadena lineal o ramificada con 1-4 atomos de carbono, o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.

Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que,

R1 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono; y

R2 es alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono y esta sustituido con fenilo,

o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.

Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que,

R1 es isobutilo; y

R2 es un alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono o alquilo de cadena lineal o ramificada que tiene 1-4 atomos de carbono y esta sustituido con fenilo,

o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.

Compuesto segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos:

acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico,

ester etflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-pentanoico,

ester propflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-

pentanoico,

ester isopropflico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}- pentanoico,

ester bendlico del acido (2R)-4-metil-2-{[(3R)-4-(tolueno-4-sulfonil)-tiomorfolin-3-carbonil]-amino}-

pentanoico,

5 8.

9.

10 10.

15

o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo.

Composicion farmaceutica que comprende el compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo y uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

Compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso como medicamento.

Compuesto o sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso segun la reivindicacion 8, en el que el medicamento se usa para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa provocada por lesion fisiologica o ffsica o lesiones progresivas.

Compuesto o sal, solvato o hidrato farmaceuticamente aceptable del mismo para su uso segun la reivindicacion 9, en el que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrofica, neuropaffa relacionada con inmunodeficiencia adquirida, esclerosis multiple cerebroespinal, accidente cerebrovascular o lesion cerebral relacionada con estimulacion ffsica y diversas enfermedades neurodegenerativas que afectan al sistema nervioso central o periferico.