ES2627523T3 - Cebadores con fosfato y base modificados en PCR específica de alelo - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana, existiendo la diana en forma de varias secuencias variantes, comprendiendo el procedimiento: (a) hibridar un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido con al menos una variante de la secuencia diana; en el que el primer oligonucleótido es al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana y el segundo oligonucleótido es al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana y tiene al menos un nucleótido selectivo complementario de una única variante de la secuencia diana; en el que dicho segundo oligonucleótido comprende tanto un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico como un fosfato modificado que tiene una estructura:**Fórmula** en la que A y B representan una cadena de nucleótidos, D es OH o CH3 y Acc es un aceptor de electrones o un aceptor de electrones sustituido con un residuo R en el que R es un sustituyente orgánico, en la que Acc se selecciona del grupo que consiste en CN, SO2-R', en el que R' comprende al menos un alquilo aminosustituido, un arilo opcionalmente sustituido o un heterociclo opcionalmente sustituido y un heterociclo N+ de seis miembros con al menos un átomo de N alquilado en posición orto o para, estando dicho heterociclo seleccionado del grupo que consiste en piridinio, pirimidinio y quinolinio; (b) proporcionar condiciones adecuadas para la extensión de oligonucleótidos por una polimerasa de ácidos nucleicos; (c) extender dicho primer oligonucleótido y dicho segundo oligonucleótido por dicha polimerasa de ácidos nucleicos, en el que dicha polimerasa de ácidos nucleicos es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido eficientemente cuando dicho oligonucleótido hibrida con una variante de la secuencia diana que es complementaria de al menos dicho nucleótido selectivo y sustancialmente menos eficientemente cuando dicho segundo oligonucleótido hibrida con una variante de la secuencia diana que no es complementaria de al menos dicho nucleótido selectivo.

Description

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posiciones 1 y 5, o por ejemplo 1, 2 o 3 nucleótidos en dirección 5' del nucleótido del extremo 3'. En algunos modos de realización, el nucleótido con una base modificada aparece tanto en el extremo 3' como en otras partes del oligonucleótido.
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Cebadores para detectar la mutación G719S en el gen EGFR humano
Las reacciones de amplificación mostradas a continuación se llevaron a cabo usando una sonda de detección (SEQ ID NO: 2) y un cebador directo (SEQ ID NO: 1) comunes a dianas tanto naturales como mutantes. El cebador inverso en cada reacción se muestra en la tabla 1 como: SEQ ID NO: 3, un cebador común a la diana tanto mutante como natural; o SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, cebadores que se están emparejados correctamente con la secuencia diana mutante G719S y emparejados erróneamente con la diana natural en la posición de la base del extremo 3'.
Las dianas usadas en estas reacciones son o bien la mezcla de ADN genómico natural humano (proporcionada por Clontech) o una construcción plasmídica mutante que contiene un inserto de la secuencia G719S de 500 pb en un vector plasmídico pUC19 (proporcionada por IDT como un minigen).
El ADN mutante o natural se amplificó en reacciones que consistieron en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), cloruro de potasio 80 mM, dATP 160 µM, dCTP 160 µM, dGTP 160 µM, dUTP 320 µM, 0,1 µM tanto de cebador selectivo como del común, sonda 0,05 µM, aptámero NTQ21-46A 200 nM, polimerasa mutante Z05-D 40 nM, 10 unidades de Z05 y EDTA 0,1 mM, DMSO al 1,25 %, glicerol al 2,11 % y acetato de magnesio 2,5 mM. Las dianas mutantes o naturales estaban presentes a concentraciones iniciales de aproximadamente 40 000 copias por reacción.
La amplificación y el análisis se realizaron usando el instrumento LightCycler 480. Las reacciones se sometieron a termociclación usando el siguiente perfil: los 5 minutos iniciales se mantienen a 50 °C, seguidos por 2 ciclos de 95 °C (10 segundos) a 62 °C (30 segundos) y 80 ciclos de 93 °C (10 segundos) a 62 °C (30 segundos). Los datos de fluorescencia se recogieron al inicio de cada etapa de reasociación a 62 °C durante la PCR de 80 ciclos.
Se demostró que los cebadores modificados con pABSA, de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, son más discriminantes que el N4
cebador no modificado con pABSA (SEQ ID NO: 4). Además, el cebador que contiene tanto -para-tercbutilbencilcitosina (tbbdC) como pABSA, SEQ ID NO: 7, mostró la mayor discriminación. La discriminación se mide como una función del delta de Ct entre la amplificación de la diana mutante frente a la natural de igual número de copias (40 000 c). Un mayor delta de Ct se interpreta como una mayor discriminación de la amplificación entre los alelos mutante y natural.
Tabla 1
SEQ ID NO:
Secuencia MUT Ct WT Ct Delta Ct
1
AGCCTCTTACACCCAGTGGAGAA Cebador común directo
2
EAGCTCTCTTGQAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTP E = Treoninol-Hex, Q = BHQ-2, P = fosfato Sonda de detección común
3
CCAGACCATGAGAGGCCCTG Cebador común inverso 33,7 30,3 -3,4
4
TGTCGAACGCACCGGAGCT Cebador mutante inverso no modificado con introducción de emparejamiento erróneo de T:G cerca del extremo 5' 21,6 30,5 8,9
5
GTGCCGAACGCACCGGA-GCT Cebador mutante inverso modificado con pABSA Modificación con pABSA entre el 3.er y el 4.º nucleótido desde el extremo 3' 22 32,2 10,2
6
GTGCCGAACGCACCGGA-GTT Cebador mutante inverso modificado con pABSA con introducción de emparejamiento erróneo de T:G cerca del extremo 3' Modificación con pABSA entre el 3.er y el 4.º nucleótido desde el extremo 3' 24,8 42,0 17,2
14
7
GTGCCGAACGCACCGGFGC-T Cebador mutante inverso modificado con pABSA F = tbbdC (también un emparejamiento erróneo de C:T introducido) Modificación con pABSA entre el 1.er y el 2.º nucleótido desde el extremo 3' 34,9 61,5 26,6
8
GTGCCGAACGCACCGGAGC-T Cebador mutante inverso modificado con pABSA Modificación con pABSA entre el 1.er y el 2.º nucleótido desde el extremo 3' 22,6 36,6 14,0
Ejemplo 2
Cebadores para detectar la mutación L858R en el gen EGFR humano
Las reacciones de amplificación mostradas a continuación se llevaron a cabo usando una sonda de detección (SEQ ID NO: 10) y un cebador directo (SEQ ID NO: 9) comunes a dianas tanto naturales como mutantes. El cebador
5 inverso en cada reacción es: SEQ ID NO: 11, un cebador común a la diana tanto mutante como natural, o SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, cebadores que están emparejados correctamente con la secuencia diana mutante L858R y emparejados erróneamente con la diana natural en la posición de la base del extremo 3'.
Las dianas usadas en estas reacciones son o bien la mezcla de ADN genómico natural humano (proporcionada por Clontech) o una construcción plasmídica mutante que contiene un inserto de la secuencia L858R de 500 pb en un
10 vector plasmídico pUC19 (proporcionada por IDT como un minigen).
El ADN mutante o natural se amplificó en reacciones que consistieron en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), cloruro de potasio 80 mM, dATP 160 µM, dCTP 160 µM, dGTP 160 µM, dUTP 320 µM, 0,1 µM tanto de cebador selectivo como del común, sonda 0,05 µM, aptámero NTQ21-46A 200 nM, polimerasa mutante Z05-D 40 nM, 10 unidades de Z05 y EDTA 0,1 mM, DMSO al 1,25 %, glicerol al 2,11 % y acetato de magnesio 2,5 mM. Las dianas mutantes o naturales
15 estaban presentes a concentraciones iniciales de aproximadamente 40 000 copias por reacción.
La amplificación y el análisis se realizaron usando el instrumento LightCycler 480. Las reacciones se sometieron a termociclación usando el siguiente perfil: los 5 minutos iniciales se mantienen a 50 °C, seguidos por 2 ciclos de 95 °C (10 segundos) a 62 °C (30 segundos) y 80 ciclos de 93 °C (10 segundos) a 62 °C (30 segundos). Los datos de fluorescencia se recogieron al inicio de cada etapa de reasociación a 62 °C durante la PCR de 80 ciclos.
20 Se demostró que los cebadores modificados con pABSA, de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 son más discriminantes que el cebador no modificado con pABSA (SEQ ID NO: 12). Además, los cebadores que contienen tanto N4-etilcitosina como pABSA (SEQ ID NO: 13, 14) mostraron la mayor discriminación. La discriminación se mide como una función del delta de Ct entre la amplificación de la diana mutante frente a la natural de igual número de copias (40 000 c). Un mayor delta de Ct se interpreta como una mayor discriminación entre los alelos mutante y natural.
25 Tabla 2
SEQ ID NO:
Secuencia MUT Ct WT Ct Delta Ct
9
GTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAAC Cebador directo común
10
FTACTGGTGAAQAACACCGCAGCATGTP Sonda de detección común F = treoninol Fam, Q = BHQ-2, P = fosfato
11
CTGGTCCCTGGTGTCAGGAAAA Cebador común inverso 22,9 23 0,1
12
GCGCCCAGCAGTTTGGCCC Cebador mutante inverso Con emparejamiento erróneo de G:T introducido cerca del extremo 5' 22,2 26,3 4,1
13
GCACCCAGCAGTTTG-GJAC Modificación con pABSA entre el 4.º y el 5.º nucleótido desde el extremo 3' J = N4-etil-dC, con emparejamiento erróneo de AG introducido cerca del extremo 3' 28,7 41 12,3
14
GCACCCAGCAGTTTGGJA-C Modificación con pABSA entre la 1.ª y 2.ª base, J = N4-etil-dC, con emparejamiento erróneo de AG introducido cerca del extremo 3' 32,7 41,5 8,8
15
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